CN105934443A - 抗h7病毒抗体治疗h7n9流感 - Google Patents

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L·斯维姆
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本发明提供有效结合、中和及治疗甲型流感H7N9病毒的抗甲型流感病毒抗体、包含这类抗体的组合物和使用前者的方法。

Description

抗H7病毒抗体治疗H7N9流感
相关申请
本申请要求2014年1月27日提交的美国临时专利申请号61/931,949的权益，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
序列表
本申请含有已经通过电子方式以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。2015年1月13日创建的所述ASCII副本命名为P5782R1-WO_SL.txt并且大小为51,106比特。
技术领域
本发明提供有效结合、中和及治疗甲型流感H7N9病毒的抗甲型流感病毒抗体、包含这类抗体的组合物和使用前者的方法。
背景技术
甲型流感H7N9病毒是正常情况下在禽类当中循环并且在亚洲家鸡群体中地方性流行的流感病毒亚群之一。直至最近，此流感病毒尚未在人类中见到。一种与人类重度感染相关的新型重配甲型禽流感H7N9病毒在2013年初首次在中国报道。(参见，例如，Gao等人,(2013)NEJM 368:1888-1897)。2013年春季期间这种禽流感病毒感染在人类中首次暴发导致132例确认的病例和44例死亡。认为大部分感染个体通过与感染的家禽直接接触而接触病毒。
迄今，尚未观察到甲型禽流感H7N9病毒的持久人际传播。然而，使用雪貂(彼此通过咳嗽和打喷嚏像人一样传染)的研究显示，一个从人类分离的甲型流感H7N9病毒株可以通过呼吸道飞沫出现雪貂-至-雪貂传播。
这种病毒的大流行潜力显然令人忧虑。随着流感病毒持续变化，不能排除鸟类H7N9流感病毒具有人际传播及这类传播可能导致全球大流行的可能性。如果H7N9流感病毒获得有效人际传播的能力，则全球暴发可以出现，因为人类缺少针对这种类型病毒的保护性免疫反应。因此，需要有效在人类中治疗并预防甲型流感H7N9病毒感染的新治疗药。
本发明满足这种需求并且提供治疗甲型禽流感H7N9病毒感染的其他益处。
发明概述
本发明提供抗血凝素(抗HA)抗体、包含抗血凝素抗体的组合物和使用这些抗体的方法。本发明的抗血凝素抗体有效中和甲型流感H7N9病毒；本发明的抗血凝素抗体是抗甲型流感H7N9病毒抗体、尤其抗H7血凝素抗体。
发明人已经发现结合H7HA蛋白并有效中和甲型流感H7N9病毒的宽泛中和性人抗体。本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体有效结合例如来自甲型流感H7N9病毒分离株A/上海/1/2013和A/安徽/1/2013的H7HA。额外地，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体有效中和重配H7N9甲型流感病毒株，A/上海/2/2013IDCDC RG32A。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(本发明的分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六个高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且其中轻链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链由SEQ ID NO:76的氨基酸序列组成，并且轻链由SEQ ID NO:77的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ IDNO:81的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
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(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链由SEQ ID NO:80的氨基酸序列组成，并且轻链由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含列SEQ ID NO:72的氨基酸序；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含列SEQ ID NO:72的氨基酸序；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ IDNO:85的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链，其中轻链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链，其中重链包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含列SEQ ID NO:72的氨基酸序；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或中和甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链由SEQ ID NO:84的氨基酸序列组成，并且轻链由SEQ ID NO:85的氨基酸序列组成。
本发明也提供编码本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的分离核酸。本发明也提供载体，所述载体包含编码本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的核酸。本发明也提供包含本发明核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型，例如，重组载体如表达载体。可以使用多种宿主细胞的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明还提供一种产生本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的方法。例如，本发明提供用于产生抗甲型流感H7N9病毒(如本文定义，其包括全长抗体及其片段)的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码抗甲型流感H7N9病毒或其片段的本发明的重组载体，从而产生该抗体或其片段。在一些实施方案中，该方法包括培养包含编码本发明抗甲型流感H7N9病毒(或其片段)的核酸的宿主细胞，从而表达该核酸。该方法还可以包括从宿主细胞培养物或宿主细胞培养基回收抗甲型流感H7N9病毒或其片段。
本发明也提供包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体和可药用载体的药物制剂。药物制剂还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦(peramivir)；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
本发明也提供包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物。组合物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
本发明也提供一种用于预防甲型流感H7N9病毒感染的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防甲型流感H7N9病毒感染的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的药物组合物。本发明还提供一种用于治疗甲型流感H7N9病毒感染的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种用于治疗甲型流感H7N9病毒感染的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的药物组合物。本发明还提供一种用于抑制甲型流感H7N9病毒感染的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供一种用于抑制或中和甲型流感H7N9病毒感染的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的药物组合物。
包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物也可以用于制造药物。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。在某些实施方案中，药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
本发明也提供一种用于抑制甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物，因而抑制甲型流感病毒感染。本发明也提供一种用于治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物，因而治疗甲型流感H7N9病毒感染。本发明也提供一种用于预防甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物，因而预防甲型流感H7N9病毒感染。本发明也提供一种用于中和甲型流感H7N9病毒的方法，所述方法包括提供有效量的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物，因而中和甲型流感H7N9病毒感染。
本发明也提供一种用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的包含本发明抗甲型流感H7N9病毒抗体的组合物，并向该患者施用有效量的额外治疗药，因而抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。在一些实施方案中，额外的治疗药是神经氨酸酶抑制剂，如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦。在其他实施方案中，额外的治疗药是另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体。在其他实施方案中，额外的治疗药是另一种抗血凝素抗体。在另外的其他实施方案中，额外的治疗药是抗M2抗体。在这类联合治疗的多个方面，治疗药在大致相同的时间施用、同时施用或依次或连续施用。在具体的实施方案中，抗神经氨酸酶抑制剂在施用本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体之前施用。
在另一个方面，本发明提供本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。在某些实施方案中，药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的核酸在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。药物也可以用于中和甲型流感H7N9病毒感染。在某些实施方案中，药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的表达载体在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。药物也可以用于中和甲型流感H7N9病毒感染。在某些实施方案中，药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的宿主细胞在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。药物也可以用于中和甲型流感H7N9病毒感染。在某些实施方案中，药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的制造品在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。药物也可以用于中和甲型流感H7N9病毒感染。在某些实施方案中，药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
在另一个方面，本发明提供本发明的试剂盒在制造药物中的用途。该药物可以用于抑制、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。药物也可以用于中和甲型流感H7N9病毒感染。在某些实施方案中，药物还可以包含额外的治疗药(例如，神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦；另一种抗体如另一种抗甲型流感H7N9病毒抗体、另一种抗血凝素抗体或抗M2抗体等)。
在多个方面，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体结合H7血凝素。在一些方面，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体结合甲型流感H7N9病毒的H7血凝素。在其他方面，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体结合H7血凝素并且中和甲型流感H7N9病毒。在一些实施方案中，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体在体外、在体内或者在体外及体内中和甲型流感H7N9病毒。
附图简述
图1A、图1B和图1C分别阐述通过ELISA显示mAb1、mAb2和mAb3与H7血凝素结合的数据。
图2A、图2B和图2C分别阐述甲型流感H7N9病毒株A/上海/2/2013IDCDC RG32A被mAb1、mAb2和阴性对照抗体在体外中和的数据。
图3A和图3B显示mAb1的重链、轻链、重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图4A和图4B显示mAb2的重链、轻链、重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图5A和图5B显示mAb3的重链、轻链、重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图6显示mAb1、mAb2和mAb3的重链高变区和轻链高变区(即，CDR)的氨基酸序列。
图7显示来自甲型流感H7N9病毒A/安徽/1/2013的H7血凝素的核酸序列。
图8显示来自甲型流感H7N9病毒A/上海/1/2013的H7血凝素的核酸序列。
本发明实施方案的详细描述
定义
出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，它包含源自如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有序列构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10个或更小、9个或更小、8个或更小、7个或更小、6个或更小、5个或更小、4个或更小、3个或更小、或2个或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人类共有构架序列相同。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总计强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“抗血凝素抗体”和“与血凝素结合的抗体”指这样的抗体，所述抗体以足够亲和力结合血凝素，从而该抗体可用作靶向血凝素、包括靶向流感病毒血凝素的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗血凝素抗体与不相关的非血凝素蛋白结合的程度小于该抗体与血凝素结合的程度的约10％，如通过放射免疫测定(RIA)所测量。在某些实施方案中，与血凝素结合的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如从10-8M至10-13M、例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗血凝素抗体与来自甲型流感病毒不同毒株、亚型和分离株的血凝素之间保守的血凝素表位结合。
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段还指除完整抗体之外的分子，所述分子包含完整抗体的结合血凝素并中和甲型流感病毒的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
“与参考抗体结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中阻断参考抗体与其抗原结合达50％或更多的抗体，并且反过来，参考抗体在竞争测定法中阻断该抗体与其抗原结合达50％或更多。本文提供示例性竞争测定法。
术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“类”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗药或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、长春碱类生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、佐柔比星或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如细菌源、真菌源、植物源或动物源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；和下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指在必要的剂量和时间段有效实现所需治疗性或预防性结果的量。
术语“Fc区”在本文中用来限定免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该定义包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EUindex。
“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文包括具有与最初转化细胞中所筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变后代。
“人抗体”是这样的抗体，其拥有对应于人或人细胞产生，或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人类共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结域的下述每个区域，所述区域在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)在本文中根据上文Kabat等人编号。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括含于细胞内的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码抗血凝素抗体的分离核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或独立载体中的这类核酸分子和在宿主细胞中一个或多个位置处存在的这类核酸分子。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”指具有不定结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1，CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。
术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。
相对于参考多肽序列，将“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与给定氨基酸序列B、同给定氨基酸序列B或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非另外说明，否则如本文所用的术语“血凝素”指来自任何流感病毒来源的任何天然血凝素。本术语涵盖“全长”、未加工的血凝素”以及因流感病毒或流感病毒感染的细胞中加工过程产生的任何形式的血凝素。本术语还涵盖天然存在的血凝素变体，例如，剪接变体或等位变体。如本文所用术语“血凝素”包括H7血凝素。
如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发(例如，预防甲型流感H7N9病毒感染的出现或复发)，减少(例如，减少)或减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合至抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入已经将该载体引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
组合物和方法
在一个方面，本发明部分地基于抗甲型流感H7N9病毒抗体及其用途。在某些实施方案中，提供与H7血凝素结合的抗体。本发明的抗体例如用于诊断、治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。
A.针对甲型禽流感H7N9病毒的示例性抗体
在一个方面，本发明提供与H7血凝素结合的分离抗体。在某些实施方案中，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体结合H7血凝素。在其他实施方案中，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体在体外中和甲型流感H7N9病毒。在其他实施方案中，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体在体内中和甲型流感H7N9病毒。在另外的其他实施方案中，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体减少甲型流感H7N9病毒感染、预防甲型流感H7N9病毒感染、抑制甲型流感H7N9病毒感染或治疗甲型流感H7N9病毒感染。在一些实施方案中，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体预防、抑制或减少血凝素介导的流感病毒膜和感染细胞内体膜之间的融合(因此预防、抑制或减少病毒RNA进入感染细胞的细胞质，因此预防、抑制或减少流感病毒感染的进一步传播)。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；并且
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ IDNO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且其中轻链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个、三个、四个、五个和/或六高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和LVR-L3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个轻链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(b)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(c)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种包含至少一个、两个和/或三个重链高变区(HVR)序列的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；和
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ IDNO:81的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的分离的抗血凝素抗体(分离的抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
在以上实施方案的任一项中，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体是人源化的。在一个实施方案中，抗甲型流感H7N9病毒抗体包含如以上实施方案的任一项中的HVR，并且还包含接纳体人类构架，例如，人免疫球蛋白构架或人类共有构架。
在另一个方面，本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体包含与选自SEQ ID NO:74和78的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗甲型流感H7N9病毒抗体保留与H7血凝素结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:74或78中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗血凝素抗体(抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含在SEQ ID NO:74或78中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供抗甲型流感H7N9病毒抗体，其中所述抗体包含与选自SEQ IDNO:75和79的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有置换(例如，保守性置换)、插入或缺失，但是包含该序列的抗甲型流感H7N9病毒抗体保留与H7血凝素结合的能力。在某些实施方案中，已经在SEQ ID NO:75或79中置换、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施方案中，置换、插入或缺失出现在HVR外部的区域内(即，在FR中)。任选地，抗血凝素抗体(抗甲型流感H7N9病毒抗体)包含在SEQ ID NO:75或79中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供一种抗甲型流感H7N9病毒抗体，其中该抗体包含如上文提供的任一个实施方案中的VH和如上文提供的任一个实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:74或78和SEQ ID NO:75或79中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰。
在又一个方面，本发明提供一种抗体，所述抗体与本文提供的抗甲型流感H7N9病毒抗体结合相同的表位。例如，在某些实施方案中，提供结合与抗甲型流感H7N9病毒抗体结合的表位相同的抗体，所述抗甲型流感H7N9病毒抗体包含SEQ ID NO:75的VH序列和SEQ IDNO:75的VL序列；或SEQ ID NO:78的VH序列和SEQ ID NO:79的VL序列。
在本发明的又一个方面，根据任一个以上实施方案的抗甲型流感H7N9病毒抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗甲型流感H7N9病毒抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双体抗体(diabody)或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，该抗体是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。
在又一个方面，根据任一个以上实施方案的抗甲型流感H7N9病毒抗体可以单独或以组合方式含有如下文1-7部分中所述的任一特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如，从10-9M至10- 13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过放射标记抗原结合测定法(RIA)测量Kd。在一个实施方案中，RIA用Fab形式的目的抗体及其抗原进行。例如，通过以下方式测量Fab对抗原的溶液结合亲和力：在未标记抗原的滴定系列存在下用最低浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原(参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立该测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/mL抗Fab捕获抗体(Cappel Labs)包被过夜并随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(大约23℃)封闭2至5小时。在不吸附性平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的连续稀释物(例如，与Presta等人,CancerRes.57:4593-4599(1997)中评估抗VEGF抗体Fab-12一致)混合。随后将目的Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续较长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以便在室温孵育(例如，1小时)。随后移除溶液并将平板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20()洗涤8次。当平板已经干燥时，添加150μl/孔闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将平板在TOPCOUNT TMγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合作用的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定法中。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法测量Kd。例如，使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定法在25℃采用固定化抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)进行。在一个实施方案中，根据供应商说明书，以盐酸N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后以5μl/分钟的流速上样以实现偶联蛋白的大约10个响应单位(RU)。注射抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃以大约25μL/分钟的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中Fab的2倍连续稀释物(0.78nM至500nM)。使用简单一对一Langmuir结合模型(评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)，计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为koff/kon比。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定法显示缔合速率超过106M-1s-1，则可以使用荧光猝灭技术测定缔合速率，其中在如光谱仪(如配备止流法(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌型比色皿的8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的增加浓度的抗原存在下，所述荧光猝灭技术在25℃测量在PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段和下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著,(Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段的讨论，见美国专利号5,869,046。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中描述。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过多种技术产生，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)，如本文所述。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合其片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。一般，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人类抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生HVR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如还在Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中综述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的构架区(参见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的构架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术或使用本文所述的技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述技术的美国专利号5,770,429；描述K-M 技术的美国专利号7,041,870，和描述Veloci技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。借助人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还在Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中描述。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
也可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体。这类可变结构域序列随后可以与所需的人恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选出人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有所需活性或多种活性的抗体，分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并对这类文库筛选拥有所需结合特征的抗体的多种方法。这类方法例如综述于Hoogenboom等人,引自Methods in Molecular Biology178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中并且例如还在McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,引自Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编著,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中描述。
在某些噬菌体展示法中，VH基因和VL基因库分别由聚合酶链反应(PCR)克隆并且在噬菌体文库中随机重组，其中随后可以对所述噬菌体文库筛选结合抗原的噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体一般将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或展示为Fab片段。来自免疫来源的文库在不要求构建杂交瘤的情况下提供针对免疫原的高亲和力抗体。备选地，可以(例如，从人)克隆天然库以在不进行任何免疫的情况下，提供针对广泛类型非自身抗原的抗体和还针对自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列以编码高度可变的CDR3区并实现体外重排的PCR引物，合成地产生天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公布例如包括：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一针对血凝素，并且另一种特异性针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合血凝素的2个不同表位。双特异性抗体也可以用来使细胞毒剂局限至表达血凝素的细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“结-扣”工程化(例如，参见美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，参见美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，参见Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，参见Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991))中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“八抗体(Octopus antibody)”(参见，例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重功能FAb”或“DAF”，其包含与血凝素以及另一种不同抗原结合的抗原结合位点(例如参见，US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能想要改善该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
a)置换变体、插入变体和缺失变体
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。表1中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体中并且对产物筛选所需的活性，例如，保留/改善的抗原结合作用、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
原始残基 示例性置换 优选的置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物活性(例如，结合亲和力)。
可以在HVR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在HVR“热点”(即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom等人,引自Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编著，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR指导的方案，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机诱变。可以特别地鉴定参与抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以在一个或多个HVR内部出现，只要这类改变不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以例如是在HVR中的抗原接触残基外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或者不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，测定抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从1个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，针对ADEPT的酶)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合。
糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状低聚糖，所述低聚糖通常借助N连接连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。例如参见，Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。低聚糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状低聚糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以修饰本发明抗体中的低聚糖以产生某些特性改善的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有糖结构的抗体变体，所述糖结构缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过以下方式确定岩藻糖的量：相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处糖链内部岩藻糖的平均量，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297指位于Fc区内约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸附近，即，位置294和位置300之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类岩藻糖化变体可以具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“缺乏岩藻糖的”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括在蛋白质岩藻糖化方面缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1，Presta,L；和WO 2004/056312A1，Adams等人,特别地在实施例11)中，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见，例如，Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
还可以提供具有双分低聚糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状低聚糖由GlcNAc对分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的例子例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)中描述。也提供与Fc区连接的低聚糖中有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S)中描述。
C)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的有利候选物，其中抗体的体内半寿期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞-NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子在美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(见，例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能减少的抗体包括置换了一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在US 2005/0014934 A1(Hinton等人)中描述了半寿期增加和新生Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(美国专利号7,371,826)。
还见涉及Fc区变体其他例子的Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，“硫代MAb”，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸置换以下残基的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以例如美国专利号7,521,541中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的疗法中等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和非蛋白质部分的缀合物，其中所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并包括，但不限于这样的波长，所述波长不伤害普通细胞，但是使非蛋白质部加热至杀伤临近于抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗血凝素抗体的分离核酸。这种核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含这种核酸的载体(例如，表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在这样一个实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经被转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种产生抗血凝素抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体条件下培养如上文提供的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码抗体的核酸，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗血凝素抗体，将编码抗体的核酸(例如，如上文所述)分离并插入一种或多种载体中用于宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，轻易地分离这种核酸并将其测序。
克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，可以将抗体以可溶性级分形式从细菌细胞糊状物中分离并且可以进一步纯化抗体。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
表达糖基化抗体的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述的293或293T细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如在例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝脏细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞，如在例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。关于适于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著,Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
c.测定法
可以通过本领域已知的多种测定法，鉴定、筛选或表征本文提供的抗血凝素抗体的物理/化学特性和/或生物学活性。
结合测定法和其他测定法
在一个方面，例如，通过已知的方法如ELISA、蛋白质印迹法等，测试本发明抗体的抗原结合活性。
在另一个方面，竞争测定法可以用来鉴定与本文所述的任何抗甲型流感H7N9病毒(抗H7血凝素)抗体竞争结合H7血凝素的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合与本文所述的抗甲型流感H7N9病毒抗体(例如，包含SEQ ID NO:74的VH序列和SEQ ID NO:74的VL序列；或SEQ ID NO:78的VH序列和SEQ ID NO:79的VL序列的抗甲型流感H7N9病毒抗体)相同的表位(例如，线性或构象表位)。用于定位与抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols(表位定位法)”,引自Methods in MolecularBiology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。
在示例性竞争测定法中，将固定的血凝素在溶液中孵育，所述溶液包含与血凝素结合的第一标记抗体和正在测试与第一抗体竞争结合血凝素的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的血凝素在包含第一标记抗体但是不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与血凝素结合的条件下孵育后，移除过多的未结合的抗体，并且测量与固定的血凝素结合的标记物的量。如果与固定的血凝素结合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质降低，则这表示第二抗体正在与第一抗体竞争结合血凝素。见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性测定法
在一个方面，提供了用于鉴定具有生物活性的抗甲型流感H7N9病毒抗体及其片段的测定法。生物活性可以包括，例如，与甲型流感HyN9病毒血凝素特异性结合、中和甲型流感H7N9病毒等。还提供在体内和/或在体外具有这种生物活性的抗体和包含这类抗体或其片段的组合物。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试这种生物活性。关于此类测定法的示例性描述，参见实施例4、5、6、7、8和9。
D.免疫缀合物
本发明也提供了包含与一种或多种细胞毒剂如化疗药或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合的本文抗甲型流感H7N9病毒抗体的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于类美登素(maytansinoid)(见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0 425235B1)；澳瑞司他汀如单甲基澳瑞司他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；刺孢霉素或其衍生物(见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等人,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类如柔红霉素或多柔比星(见Kratz等人,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷如多西紫杉醇、紫杉醇、拉罗他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和ortataxel；单端孢霉烯族化合物；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族类化合物。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，mri)，再次如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒剂的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那样制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒剂在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
免疫缀合物或ADC在本文中明确地构思，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和可商业获得的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自PPierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利诺伊州，美国)。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任一种抗甲型流感H7N9病毒抗体可用于检测H7血凝素或甲型流感H7N9病毒在生物样品中的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量性或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织，例如，肺、上呼吸道、鼻道、血液、痰，或包括通过鼻拭子或咽拭子获得的生物样品。
在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的抗甲型流感H7N9病毒抗体。在又一个方面，提供一种检测H7血凝素或甲型流感H7N9病毒在生物样品中存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括：使生物样品与如本文所述的抗甲型流感H7N9病毒抗体在允许抗甲型流感H7N9病毒抗体与H7血凝素结合的条件下接触，并且检测是否形成抗甲型流感H7N9病毒抗体和H7血凝素复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗甲型流感H7N9病毒抗体用来选择适于用甲型流感H7N9病毒抗体治疗的受试者，例如其中H7血凝素是选择患者的生物标记物。
可以使用本发明抗体诊断的示例性病症包括甲型流感H7N9病毒感染，包括儿童、婴儿、成人和老年人中以及鸟类中的甲型流感H7N9病毒感染。
在某些实施方案中，提供标记的抗甲型流感H7N9病毒抗体。标记物包括但不限于直接检测到的标记物或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联，生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。
F.药物制剂
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液剂形式的如本文所述的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体，抗甲型流感H7N9病毒抗体)的药物制剂：将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利申请公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。水质抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以根据正在治疗的特定适应症需要而含有多于一种有效成分，优选地是具有互补活性但并未相互不利影响的的那些有效成分。例如，可能想要进一步提供神经氨酸酶抑制剂、抗血凝素抗体、抗M2抗体等。这种有效成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
有效成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或乳浊液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有抗体的固态疏水性聚合物半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过借助无菌滤膜过滤轻易地实现无菌性。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒)可以用于治疗方法中。
在一个方面，提供了作为药物使用的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)。在其他方面，提供用于治疗、预防或抑制甲型流感H7N9病毒感染的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法中的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)。在某些实施方案中，本发明提供抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)用于治疗具有甲型流感病毒感染的个体的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗药，例如，如下文描述的治疗药。在其他实施方案中，本发明提供了防止、抑制或减少血凝素介导的甲型流感H7N9病毒包膜和感染细胞内体膜之间融合，因此防止病毒RNA进入感染细胞的细胞质并预防感染进一步传播的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)。在某些实施方案中，本发明提供在预防、抑制或治疗个体中甲型流感H7N9病毒感染的方法中使用的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)，所述方法包括向个体施用有效量的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)以预防、抑制或治疗甲型流感H7N9病毒感染。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”优选地是人。
在又一个方面，本发明提供抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗甲型流感H7N9病毒感染。在又一个实施方案中，该药物用于治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法中，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染的个体施用有效量的药物。在一个这种实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的至少一种额外治疗药，例如，如下文描述的治疗药。在又一个实施方案中，该药物用于防止、抑制或减少血凝素介导的甲型流感H7N9病毒包膜和感染细胞内体膜之间融合，因此防止病毒RNA进入感染细胞的细胞质并预防感染进一步传播。在又一个实施方案中，该药物用于预防、抑制或治疗个体中甲型流感H7N9病毒感染的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的药物以预防、抑制或减少甲型流感H7N9病毒感染。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
在又一个方面，本发明提供一种用于治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法。在一个实施方案中，该方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染的个体施用有效量的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)。在这样一个实施方案中，该方法还包括向该个体施用有效量的如本文描述的至少一种额外治疗药。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是人。
本发明提供有效抑制、预防或治疗个体(例如，受试者或患者)中甲型流感H7N9病毒感染的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)。在一些方面，本发明的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体，抗甲型流感H7N9病毒抗体)有效预防性治疗个体以防止甲型流感H7N9病毒感染该个体。
在一些方面，适于用本发明抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体，抗甲型流感H7N9病毒抗体)治疗的个体是患有或疑似具有甲型流感H7N9病毒感染的个体。在一些实施方案中，这类个体包括婴儿、儿童、成人和老年人。在一些实施方案中，该个体在具有甲型流感H7N9病毒感染的情况下住院。在其他实施方案中，具有甲型流感H7N9病毒感染的个体患有一种或多种共病，例如，免疫缺陷、妊娠、肺部疾病、心脏病、肾疾病或共感染(例如，细菌性感染或病毒性感染，如细菌性或病毒性肺炎)。
在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)治疗个体降低了甲型流感H7N9病毒感染严重程度、减少甲型流感H7N9病毒感染时间长度或减少甲型流感H7N9病毒感染性。在其他方面，用本发明的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)治疗甲型流感H7N9病毒感染提供了额外的益处，包括住院时间长度缩减、减少或避免使用重症监护室(ICU)的需求、减少或避免辅助通气或机械通气的需求、减少或避免补充用氧的需求和降低死亡率。在一些方面，住院时间长度缩减是1天、2天、3天、4天、5天、或超过5天。在一些方面，重症监护室使用需求减少是1天、2天、3天、4天、5天或超过5天。在一些方面，辅助通气或机械通气需求减少是1天、2天、3天、4天、5天或超过5天。在一些方面，补充氧需求减少是1天、2天、3天、4天、5天、或超过5天。在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体减少甲型流感H7N9病毒感染的疾病症状，例如，发热、鼻炎、冷颤、咽喉痛、肌肉疼痛、身体疼痛、头痛、咳嗽、鼻充血、虚弱或乏力、眼刺激或眼流泪和周身不适。
在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)治疗个体缩减了至呼吸功能正常化的时间，如缩减至呼吸速率正常化的时间或缩减至氧饱和度正常化的时间。在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体治疗个体缩减返回正常氧饱和度(例如，氧饱和度返回约92％或更高)的时间，如在不施用补充氧的情况下在24小时范围内测量。在其他方面，用本发明的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)治疗个体缩减了至生命体征如心率、血压、呼吸速率和体温正常化的时间。
在一些方面，用本发明的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)治疗个体改善病毒学终点，例如，流感病毒H7N9滴度。病毒滴度可以通过本领域技术人员已知的多种方式测量，例如，病毒曲线下面积(AUC)，如通过例如qPCR或组织培养感染量所(TCID50)测量。在一些方面，治疗导致病毒AUC减少大于或等于50％，如通过qPCR或TCID50所测量。
在本发明的多个方面，在症状初起后(例如，在病情初起后)约12小时处、约24小时处、约36小时处、约48小时处、约60小时处、约72小时处、约84小时处和约96小时处施用时，本文提供的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体，抗甲型流感H7N9病毒)有效治疗甲型流感H7N9病毒感染。在其他方面，在症状初起后约24小时和48小时之间(例如，个体在24小时和48小时之间具有症状)施用时、在症状初起后约48小时和72小时之间时施用或在症状初起后约72小时和96小时之间时施用时，本文提供的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体，抗甲型流感H7N9病毒抗体)有效治疗甲型流感H7N9病毒感染。在本发明的某些实施方案中，本发明的抗血凝素抗体(例如，抗H7血凝素抗体、抗甲型流感H7N9病毒抗体)有效治疗或减少甲型流感H7N9病毒感染并且延长现行医护标准(例如，奥司他韦)的治疗窗口期超出症状初起后48小时。
在又一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何抗血凝素抗体的药物制剂，例如，用于前述任一个治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗血凝素抗体和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗血凝素抗体和至少一种额外治疗药，例如，如下文描述。
本发明的抗体可以在疗法中单独或与其他药物组合使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种额外治疗药共施用。在某些实施方案中，额外治疗药是神经氨酸酶抑制剂(例如，扎那米韦、磷酸奥司他韦、帕拉米韦、金刚烷胺、金刚乙胺)、抗M2抗体、某种抗血凝素抗体等。在一些方面，与单独用任一种药物治疗相比，对具有甲型流感H7N9病毒感染的个体，用本发明抗血凝素抗体与神经氨酸酶抑制剂的共施用治疗提供协同治疗效果。
上文所示的这类联合疗法涵盖联合施用(其中在相同或独立的制剂中包含两种或更多种治疗剂)，和独立施用，在这种情况下，本发明抗体的施用可以在施用额外的治疗药或治疗药类之前、同时和/或之后进行。在一个实施方案中，抗血凝素抗体的施用和额外治疗药的施用彼此相隔约1个月内，或约1周、2周或3周内，或约1、2、3、4、5或6日内、或约1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20或24小时内进行。
本发明的抗体(和任何额外的治疗药)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内，以及如果局部治疗需要则病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了各种给药方案，包括但不限于单次或在各种时间点多次施用、快速浓注施用和冲击输注。
本发明的抗体将以符合良好医学实践的方式配制、定剂量和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该抗体不需要与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种药物一起配制，但是任选地与它们一起配制。这类其他药物的有效量取决于该制剂中存在的抗体的量、疾病类型或疗法和上文讨论的其他因素。这些药物通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和过程，抗体是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的决定。将抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至约45mg/kg(例如，约1.0mg/kg至约15mg/kg)抗体可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。抗体的示例性剂量将处于约1.0mg/kg至约45mg/kg、约1.0mg/kg至约30mg/kg、约1.0mg/kg至约15mg/kg、约1.0mg/kg至约10mg/kg或约1.0mg/kg至约5mg/kg范围内。因此，可以向患者施用约1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、30mg/kg或45mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类种剂量可以断续地施用，例如，每日、每两日、每三日等。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。也可以按固定剂量给药，例如，200mg、400mg、600mg、800mg、1000mg、1200mg、1400mg、1500mg、1600mg、1800mg、2000mg、2200mg、2400mg、2500mg、2600mg、2800mg、3000mg、3200mg、3400mg、3600mg等。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
可以理解，前述任一种制剂或治疗方法可以使用本发明免疫缀合物替代抗血凝素抗体或除抗血凝素抗体之外还使用本发明免疫缀合物来实施。
H.制造物
在本发明的另一个方面，提供一种制造物，所述制造物含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造物包括容器和或在该容器上或与之结合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是静脉内输液袋或是具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的小药瓶)。组合物中的至少一种活性物质是本发明的抗体。标签或包装插页说明该组合物用于治疗选择的病状。另外，制造物可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒剂或治疗药。在本发明这个实施方案中的制造物还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装插页。备选或额外地，该制造物可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
可以理解，替代抗血凝素抗体或除抗血凝素抗体之外，前述任一者制造物可以包含本发明的免疫缀合物。
III实施例
以下是本发明方法和组合物的例子。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1.通过噬菌体展示鉴定抗血凝素抗体
如先前所描述，使用从外周血单核细胞(PBMC)构建的噬菌体展示文库，通过噬菌体展示法鉴定本文所述的抗流感病毒mAb3，其中所述外周血单核细胞分离自用季节性流感病毒疫苗如下接种的人供体。(参见通过引用方式完整并入本文的美国专利申请系列号14/077,414)。
实施例2.浆母细胞富集和扩充
使用如先前所描述的浆母细胞富集和扩充技术鉴定本文所述的抗甲型流感H7N9病毒mAb1和抗甲型流感H7N9病毒mAb2。(参见Nakamura等人(2013)Cell Host&Microbe 14:93-103和美国专利申请系列号14/077,414，所述文献各自通过引用的方式完整并入本文)。
从太平洋血液中心(San Francisco，CA)获得来自正常人供体的leukopac，其中所述正常人供体在他们捐赠血液之前7日接受季节性流感疫苗(Novartis批号111796P1)。使用标准方法从leukopac分离外周血单核细胞细胞(PBMC)。六至八周龄雌性SCID/beige小鼠从Charles River Laboratories(Hollister,CA)购买并且在Genentech根据美国实验动物学会护理指南圈养及维持。全部实验研究均根据实验室动物护理和使用指南及适用法律和法规，在Genentech Lab Animal Research研究机构动物护理和使用委员会的批准下在AAALACi认证的设施中实施。在提供书面知情同意书并且从西部机构审查委员会给予伦理批准后从健康的人供体获得Leukopac或血液。
如下使用脾内(intraspenic)PBMC移植，进行体内抗原驱动型浆母细胞富集和扩充。分离的PBMC与血凝素抗原(每一百万个B细胞0.1-2μg)一起重悬并在37℃孵育30分钟(PBMC/抗原预混)。在这次孵育之后，洗涤PBMC以移走未结合的抗原。为了富集产生交叉反应性血凝素抗体的浆母细胞，特别地选择用于PBMC/抗原预混和单细胞分选的血凝素抗原变体与流感疫苗内部所含的血凝素抗原变体不同。因此，这项研究中使用的血凝素抗原包括来自甲型流感病毒分离株A/NWS/1933的H1血凝素、来自甲型流感病毒分离株A/中国香港/8/1968的H3血凝素和来自甲型流感病毒分离株A/荷兰/219/2003的H7血凝素。使用标准分子生物学技术在Genentech产生血凝素抗原。
使用铯137源，用350拉德对6-8周龄雌性SCID/beige小鼠(Charles RiverLaboratories，Hollister，CA)进行亚致死照射。在照射之后，添加多粘菌素B(110mg/L)和新霉素(1.1g/L)添加至饮用水持续7日。在照射后4小时，将每只小鼠的左侧胁腹剃毛并用(Purdue Pharma,Stamford,CT)和70％乙醇做好准备。使用无菌外科手术法，在麻醉下进行外科手术。紧邻每只小鼠的肋缘下方形成一个1cm皮肤切口，随后形成腹壁和腹膜的切口。小心地暴露每只小鼠的脾并且用重悬于30μL PBS中的50×106个人PBMC注射。分别使用5-O缝线(Ethicon，Somerville，NJ)和外科钉(surgical staple)，闭合肌肉层中和皮肤中的切口。为了抗原特异性细胞分选实验，在移植后8日处死小鼠，并收获它们的脾。
将获得自小鼠的脾细胞的单细胞悬液用限定人IgG+浆母细胞为CD38high/IgG+表达的抗人单克隆抗体CD38PECy7(BD Biosciences,San Jose,CA)和IgG Dylight(JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)的混合物染色。为了鉴定分离的脾细胞悬液内部的血凝素交叉反应性浆母细胞，将细胞用来自甲型流感病毒分离株A/NWS/1933的血凝素H1和来自甲型流感病毒分离株A/中国香港/8/1968的血凝素H3染色，其中使用Lightning-标记试剂盒(Innova Biosciences，Cambridge，UK)，将所述血凝素事先分别与FITC或PE缀合。
随后在碘化丙啶死细胞拒染存在下，在Aria高速细胞分选仪上(BD Biosciences，San Jose，CA)分析样品，并且将抗血凝素特异性浆母细胞以单细胞方式分选至含有50μl补充有5％低IgG胎牛血清(Gibco,Grand Island,NY)的RPMI细胞培养基的96孔组织培养平板中。
实施例3.从单个浆母细胞克隆IgG
对(上文描述的)血凝素H1和H3交叉反应性人浆母细胞进行单细胞分选。将单个浆母细胞直接分选至含有具有5％低IgG胎牛血清的50μl RPMI的U底96孔微量孔平板中。将平板以600x g(Beckman Coulter,Brea,CA)离心5分钟，并通过抽吸小心地移除培养基。按照相同程序在90μl PBS中将细胞重悬并且洗涤2次。
为了产生编码可变重链和轻链的cDNA，将每个细胞重悬于6μl逆转录酶(RT)反应混合物中，所述反应混合物含有2单位RNaseout(Invitrogen，Grand Island，NY)、0.5mM 4种dNTP(Perkin Elmer，Waltham，MA)、1.5mM MgCl2、37.5mM KCl、10mM DTT(二硫苏糖醇)、0.25％Nonidet P40(US Biological,Marblehead,MA)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)、25mM Tris pH 8.3、0.25pmol的IgG1-4恒定区、κ链恒定区和λ链恒定区特异性寡核苷酸(下文显示)和40U Superscript III(Invitrogen，Grand Island，NY)。
IgG1-4恒定GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG(SEQ ID NO：1)
κ恒定：CTCAGCGTCAGGGTGYTGCTGAG(SEQ ID NO：2)
λ恒定：GGGTKTGGTSGTCTCCAC(SEQ ID NO：3)
将反应分别在45℃、50℃和55℃孵育3x30分钟间隔。在孵育之后，将反应混合物用TE缓冲液(10mm Tris HCl，1mM EDTA)稀释至15μl。进行初始聚合酶链反应(PCR)以使用来自以上的2μl稀释的RT混合物和Advantage-GC 2聚合酶混合物(Clontech，Mountain View，CA)，按照制造商提供的方案扩增IgG重链、κ链和λ链。使用下文显示的基于可变重链和可变轻链种系和恒定区序列的简并寡核苷酸，进行聚合酶链反应扩增。
IGVH1a CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC(SEQ ID NO：4)
IGVH1b CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC(SEQ ID NO：5)
IGVH2 CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC(SEQ ID NO：6)
IGVH3 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGG(SEQ ID NO：7)
IGVH4 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC(SEQ ID NO：8
IGVH5 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(SEQ ID NO：9)
IGVH6 CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCC(SEQ ID NO：10)
IGVH7 CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGG(SEQ ID NO：11)
IGKV1 GHCATCCRGWTGACCCAGTCTC(SEQ ID NO：12)
IGKV2 GATRTTGTGATGACYCAGWCTC(SEQ ID NO：13)
IGKV3 GAAATWGTRWTGACRCAGTCTC(SEQ ID NO：14)
IGKV4 GACATCGTGATGACCCAGTCTCC(SEQ ID NO：15)
IGKV5 GAAACGACACTCACGCAGTCTC(SEQ ID NO：16)
IGKV6 GAWRTTGTGMTGACWCAGTCTC(SEQ ID NO：17)
IGLV1 CAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC(SEQ ID NO：18)
IGLV2 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(SEQ ID NO：19)
IGLV3 TCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC(SEQ ID NO：20)
IGLV4 CAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(SEQ ID NO：21)
IGLV5 CAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC(SEQ ID NO：22)
IGLV6 AATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC(SEQ ID NO：23)
IGLV7 CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC(SEQ ID NO：24)
IGLV8 CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC(SEQ ID NO：25)
IGLV9 CAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC(SEQ ID NO：26)
HC301.5恒定 GCAGCCCAGGGCSGCTGTGC(SEQ ID NO：27)
κ102恒定 GCACACAACAGAGGCAGTTCCAG(SEQ ID NO：28)
λ202恒定 CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG(SEQ ID NO：29)
重链和轻链PCR扩增反应分别如下分成两个反应：重链家族VH.1、2、3(引物IGVH1a、IGVH1b、IGVH2、IGVH3)和VH.4、5、6、7(引物IGVH4、IGVH5、IGVH6和IGVH7)；κ链家族VK.1、2、3(引物IGKV1、IGKV2和IGKV3)和VK.4、5、6(引物IGVK4、IGVK5和IGVK6)；和λ链家族VL.1、2、3、4、5(IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4和IGLV5)和VL.6、7、8、9(引物IGLV6、IGLV7、IGLV8和IGLV9)。降落PCR扩增方案用于温度循环。
在反应之后，将PCR扩增产物用核酸外切酶(Exo)和虾碱性磷酸酶(SAP)处理以从每个PCR扩增反应移除过多的核苷酸和引物(U.S.Biologicals，Marblehead，MA)。使用Sanger测序法，对初始PCR扩增产物直接测序以确定重链和轻链的可变序列。使用种系匹配的重链和轻链可变寡核苷酸，进行第二巢式PCR扩增，目的是使用以下寡核苷酸引物插入哺乳动物信号和恒定区克隆序列。
sVH1a：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGG(SEQ ID NO：30)
sVH2：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGATCACCT(SEQID NO：31)
sVH3vv：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAG(SEQID NO：32)
sVH3gl：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGG(SEQ ID NO：33)
sVH4：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGCAGG(SEQ ID NO：34)
sVH5：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGGTGCA(SEQ IDNO：35)
sVH6：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTACAGC(SEQID NO：36)
sVH7：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCA(SEQ IDNO：37)
sVK1：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG(SEQ ID NO：38)
sVK2：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGATATTGTGATGACTCAGTCTCACTCTCCCTGC(SEQ ID NO：39)
sVK3：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTG(SEQ ID NO：40)
sVK4：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTG(SEQ ID NO：41)
sVK5：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC(SEQ ID NO：42)
sVK6：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCG(SEQ ID NO：43)
sVL1：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC(SEQ ID NO：44)
sVL2：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(SEQ ID NO：45)
sVL3：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCATCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC(SEQ ID NO：46)
sVL4：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(SEQ ID NO：47)
sVL5：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC(SEQ ID NO：48)
sVL6：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAAATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC(SEQ ID NO：49)
sVL7：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC(SEQ ID NO：50)
sVL8：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC(SEQ ID NO：51)
wVL9：
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC(SEQ ID NO：52)
重链恒定：GCCAGGGGGAAGACCGATG(SEQ ID NO：53)
κ恒定区：
CTGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACACAACAGAAGCAGTTCCAGATTTCAACTGCTC(SEQ IDNO：54)
λ恒定区：CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG(SEQ ID NO：55)
根据制造商的推荐，使用含有GC的PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio，Shiga，日本)建立PCR扩增反应。在PCR扩增反应后，将扩增产物用如上文所述的Exo/SAP处理。使用无限制性核酸内切酶方法，将编码重链可变区和轻链可变区的PCR扩增产物插入哺乳动物表达载体中。使用Kunkel诱变方案，使20μl PCR扩增产物复性到IgG1链、κ链和λ链的单链DNA人模板上。(参见Kunkel(1985)PNAS 82：488-492)。通过DNA测序证实正确插入的构建体。使用Fugene转染试剂(RocheDiagnostic，Indianapolis，IN)，将含有编码重链和轻链的核酸的质粒共转染入293T人胚肾细胞用于瞬时表达，并如下文实施例4中所述那样分析表达和结合作用。
实施例4.H7血凝素ELISA筛选测定法
进行以下研究，研究抗流感mAb1、抗流感mAb2和抗流感mAb3结合H7 HA的能力。
编码来自A/上海/1/2013(图7；SEQ ID NO：86))和来自A/安徽/1/2013(图8；SEQID NO：87)的H7 HA的核酸由来自华盛顿Bothell的Blue Heron Biotech，An OriGene公司合成。将编码H7 HA蛋白的核酸亚克隆至哺乳动物表达载体pRK.sm(GenentechInc)中，之后转染和表达。在酶联免疫吸附测定检测之前，将H7HA蛋白作为293T细胞表面上的全长蛋白质表达。
为了产生全长HA裂解物，使用磷酸钙方法，将10cm培养皿(Corning目录号430167)中的293T细胞用表达H7HA的质粒转染。48小时后，将细胞用1mL裂解缓冲液(50mM Tris，pH8，5mM乙二胺四乙酸pH 8，150mM NaCl，1％Triton X-100(EMD，目录号9410)，外加蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche，目录号11836153001)在室温处理20分钟。将裂解物在14,000转/分钟离心10分钟。将上清液贮存在-80℃并且用于ELISA研究中。
对于ELISA研究，将Nunc Maxisorp 96孔板(目录号#439454)用PBS中的5ug/ml雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素(Sigma目录号#L-8275)在室温包被6小时。随后将平板用洗涤缓冲液(PBS，pH 7.4，+0.05％Tween-20(EMD，目录号1296))洗涤并且在封闭缓冲液(PBS，pH 7.4，+0.5％BSA(牛血清白蛋白，Gibco目录号#15260))中室温孵育1小时。随后洗涤平板并且与分析稀释液(PBS，pH7.4，+0.5％BSA+0.05％Tween-20)中的293T细胞裂解物(1:300)在4℃孵育过夜。随后洗涤平板并且在室温与分析稀释液中的连续稀释抗体孵育1.5小时。
在后续洗涤步骤后，将平板在室温与分析稀释液中的按1:30000稀释的山羊抗人-IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch，目录号#109-036-098)或按1:20000稀释的山羊抗鼠-IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch，目录号#115-035-071)孵育1小时。将平板洗涤并且在室温与TMB底物(KPL，目录号50-65-00)孵育5-10分钟；随后添加1M磷酸以终止反应。在BioTek Synergy2平板读数仪上以Gen5软件在450nM测量吸光度。用Prism软件进行与H7HA结合的抗体的数据分析和作图。
对全部三种抗体进行ELISA测定法以检验与来自A/上海/1/2013和A/安徽/1/2013的H7HA蛋白结合。作为阴性对照，通过ELISA检验全部三种抗体与不含有H7HA蛋白的裂解物的结合作用。抗流感mAb1(图1A)、抗流感mAb2(图1B)和抗流感mAb3(图1C)均显示与所检验的两种H7HA蛋白特异性结合。对全部三种抗体均观察到与阴性对照裂解物非常最小的结合活性，甚至在检验的最高抗体浓度(25,000ng/ml)也是如此。(参见图1A、1B和1C)。用S型剂量-反应曲线拟合ELISA结合数据以计算每种抗体的结合IC50值和95％置信区间。(参见下表2)。
表2
这些结果显示在这个测定法中，全部三种检验的抗体均可以与来自A/上海/1/2013和A/安徽/1/2013(2013年中国甲型禽流感H7N9病毒暴发期间分离的两种首次人甲型流感H7N9病毒株)的H7HA蛋白特异性结合。
实施例5.体外中和甲型流感H7N9病毒
如下研究检验了本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体在体外中和甲型流感H7N9病毒的能力。
体外中和研究在Virapur LLC,San Diego,CA的BSL3设施内部实施。甲型流感H7N9病毒株A/上海/2/2013IDCDC RG32A用于体外中和研究中。为了检验中和作用，将大约100个感染单位的病毒与每种抗体按范围从200至1.56μg/ml的浓度混合并且允许孵育1小时。随后将病毒/抗体混合物置于在透明平底96孔板中培养的单层汇合的MDCK细胞上。一式三份检验每种抗体浓度。允许病毒在抗体存在下在37℃感染MDCK细胞68至72小时。感染后，移除抗体病毒溶液并且将MDCK细胞固定并用结晶紫染色以显示感染的和未感染的MDCK单层。含有完整未感染的MDCK细胞单层的孔以结晶紫着染成深蓝色；显示感染的MDCK单层的孔未以结晶紫着染成深蓝色。
显示最强烈H7HA结合能力的抗甲型流感病毒mAb1和抗甲型流感病毒mAb2能够在200至25μg/ml的抗体浓度完全阻断甲型流感H7N9病毒性感染(图2A和图2B)。抗血凝素抗体(在HVR-L3中位置6处含有Trp残基替代Tyr残基的mAb 81.39)，先前显示有效中和Grp2甲型流感病毒(参见美国专利申请系列号14/077,414，所述文献通过引用的方式完整并入本文)在这个测定法中并未有效中和甲型流感H7N9病毒(数据未显示)，这表明本发明的抗甲型流感H7N9病毒抗体具有意料之外的有效中和甲型流感H7N9病毒的益处。
作为阴性对照，还检验不与H7HA结合的抗体阻断甲型流感H7N9病毒感染性的能力。这种阴性对照抗体甚至在检验的最高抗体浓度(200μg/ml)也未显示体外中和能力(图2C)。在这个测定法中mAb1(抗Flu1)和mAb2(抗Flu2)的最低抑制浓度值(MIC)是25μg/ml，而不能确定阴性对照抗体的MIC(表3)。
表3
这些结果显示本发明的单克隆抗体能够在体外以剂量-依赖性方式中和甲型流感H7N9病毒。这些结果表明，本发明的抗体有效治疗和预防甲型流感H7N9病毒感染。
实施例6.抗甲型流感H7N9病毒抗体在小鼠和雪貂中的体内效力
小鼠和雪貂甲型流感病毒感染模型经常用来检验抗流感治疗药的预防效力和治疗效力。将雪貂视为人甲型流感病毒感染在临床上有关的动物模型。(参见Matsuoka等人,(2009)Current Protocols in Microbiology，第15章，第15G 12单元)。
抗甲型流感H7N9病毒抗体在小鼠和雪貂中的体内效力如下进行。将DBA/2J小鼠(Jackson Lab，Bar Harbor，ME)或)或雄性雪貂(蒙眼貂(Mustela putorius furo))用按照最小LD100剂量稀释于流感培养基(DMEM，0.2％BSA，2μg/mlTPCK处理的胰蛋白酶)中的50μl各种甲型流感H7N9病毒进化鼻内感染。允许流感病毒感染进展24-72小时，之后静脉内施用抗体。
在甲型流感H7N9病毒感染72小后，将多种量的抗体按200μl PBS中的各种剂量(例如，45mg/kg、15mg/kg、5mg/kg、1.5mg/kg和0.6mg/kg)静脉内施用至小鼠和雪貂。每日监测小鼠和雪貂的体况和存活，并且还每日称重，直至感染后21日。
确定在甲型流感H7N9病毒感染后24、48和72小时施用多种抗体量的小鼠和雪貂的存活百分数(随时间推移，按天计)。这个结果显示本发明的单克隆抗体有效治疗各种甲型流感H7N9病毒感染。另外，这些数据显示当甲型流感H7N9病毒感染后直至至少72小时施用时，本发明的单克隆抗体有效治疗甲型流感H7N9病毒感染。
实施例7.抗甲型流感H7N9抗体和奥司他韦在小鼠和雪貂中的体内效力
为了在小鼠和雪貂中比较抗甲型流感H7N9抗体相对于磷酸奥司他韦的效力，进行以下研究。将6周龄的Balb/c小鼠(Charles River实验室，Hollister，CA)用100x致死剂量的50μl甲型流感H7N9病毒鼻内感染。用鼻内剂量的甲型流感H7N9病毒按例如1x103pfu攻击雄性雪貂(蒙眼貂)。在感染后48小时，将抗甲型流感H7N9抗体作为200μl PBS中的单剂量(例如，大约45mg/kg、15mg/kg、5mg/kg、1.5mg/kg或0.6mg/kg)或对照IgG静脉内施用。在这些实验中，由2mg每日二次给药(BID)五日组成的奥司他韦给药方案与甲型流感H7N9病毒抗体的单次给药方案比较。
确定每个处理组中的死亡率百分数。这个结果显示与奥司他韦相比，本发明的抗甲型流感H7N9抗体更有效地治疗小鼠和雪貂中的甲型流感H7N9病毒感染。
实施例8.有和无奥司他韦共施用情况下抗甲型流感H7N9病毒抗体在小鼠和雪貂中的体内效力
如果在症状发作后48小时内给予，奥司他韦的施用有效减少人甲型流感病毒感染。不幸地，奥司他韦在已经出现症状超过48小时的患者中显示最低效力。因此，进行以下实验以检验共施用抗甲型流感H7N9病毒抗体和奥司他韦是否显示胜过单独任一种治疗药的改进效力。如实施例7中所述，使用小鼠或雪貂流感感染模型进行这些实验。简而言之，将雌性BALB/c小鼠(Charles River实验室)以100x致死量的甲型流感H7N9病毒感染，并且将雄性雪貂(蒙眼貂)用甲型流感H7N9病毒鼻内给药例如按1x103pfu攻击，72小时后，静脉内使用单次亚有效剂量的抗甲型流感H7N9抗体、对照IgG、每日两次2mg奥司他韦，或单剂量抗甲型流感H7N9抗体和奥司他韦治疗的组合持续5天。
确定每个处理组中的死亡率百分数。进行对比以确定在使用与奥司他韦(神经氨酸酶抑制剂)组合使用的抗甲型流感H7N9病毒抗体的联合疗法期间是否出现协同效应。
这些结果显示，在甲型流感H7N9病毒感染后24、48和72小时施用时，具有广泛中和作用的本发明抗血凝素抗体在治疗雪貂中的甲型流感病毒H7N9感染方面具有高度保护性并且表现得比奥司他韦更好。
实施例9.预防性治疗
本发明的抗体是用于预防性治疗甲型流感H7N9病毒感染。这类治疗为面临暴露于甲型流感H7N9病毒或感染甲型流感H7N9病毒的风险的个体提供预防性疗法。在预防性体内动物模型中检验抗甲型流感H7N9病毒抗体以确立它们对人类中甲型流感H7N9病毒暴发提供预防性治疗反应的能力。在小鼠和雪貂中可获得几个体内H7N9动物模型，伴随从轻微病情至死亡的一系列临床结果。在感染之前向这些动物按5至50mg/ml之间的浓度静脉内递送这些抗体，这用来评估它们缓和与甲型流感H7N9病毒相关的感染及重度病情的预防性活性。
统计分析
使用JMP第9.0.2版软件(SAS Institute)计算统计结果。使用对数秩检验比较存活率实验。将P值<0.05视为显著。使用Graphpad Prism第5.0版软件绘制IC50曲线并计算IC50值。
虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入。

Claims (19)

1.一种预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:74的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:75的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
8.一种预防或治疗甲型流感H7N9病毒感染的方法，所述方法包括向具有甲型流感H7N9病毒感染或面临这种风险的受试者施用治疗有效量的抗体，其中抗体包含三个重链高变区(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)和三个轻链高变区(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)，其中：
(a)HVR-H1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；
(b)HVR-H2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
(c)HVR-H3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；
(d)HVR-L1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列；
(e)HVR-L2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列；并且
(f)HVR-L3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的方法，其中抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQID NO:79的氨基酸序列。
11.根据权利要求8所述的方法，其中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，并且轻链可变区包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。
12.根据权利要求8所述的方法，其中抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
13.根据权利要求8所述的方法，其中抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
14.根据权利要求8所述的方法，其中抗体包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，并且轻链包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用额外的治疗药，其中额外的治疗药是神经氨酸酶抑制剂、抗血凝素抗体或抗M2抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中神经氨酸酶抑制剂是奥司他韦、扎那米韦或帕拉米韦。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体在制造用于治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染的药物中的用途。
18.包含根据权利要求1-14中任一项所述的抗体的组合物，用于治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。
19.包含根据权利要求1-14中任一项所述的抗体和可药用载体的药物组合物，用于治疗或预防甲型流感H7N9病毒感染。
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