JP2023519213A - Ｔｉｅ２結合剤および使用方法 - Google Patents

Ｔｉｅ２結合剤および使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｔｉｅ－２抗体およびその断片ならびにコンジュゲートと、これらの使用方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／９９３９３０号および２０２０年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０４６３１８号の優先権を主張し、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年３月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称はＰ３５８９１－ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔであり、サイズは１０７，３５４バイトである。
発明の分野
本開示の主題は、抗Ｔｉｅ２抗体を含むＴｉｅ２結合剤およびコンジュゲートならびにこれらの使用方法に関する。
背景
Ｔｉｅ２は、様々な眼障害（例えば、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓ，２０１６，Ｃｕｒｒ Ｄｉａｂ Ｒｅｐ，１６：１２６，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、２０１９，Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ，２０１９：５１４０５２１，Ｈｕｓｓａｉｎら、２０１９，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇ，２８：８６１－８６９を参照のこと）の処置のための有望な治療標的である。Ｔｉｅ２は、内皮細胞によって特異的に発現される受容体チロシンキナーゼであり、内皮安定化を促進し、血管透過性を低下させることが示されている。血管漏出は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含むがこれらに限定されないいくつかの一般的な眼障害における視覚障害の一因であることが知られている。
Ｔｉｅ２の最も広く研究されているリガンドは、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）およびアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）である。Ａｎｇ１は強力なＴｉｅ２アゴニストであり、眼血管新生および血液網膜関門（例えば、Ｎａｍｂｕら、２００４，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：８６５－８７３を参照のこと）の破壊を阻害することが示されている。Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２の状況依存性アンタゴニストであり、その発現は、ＤＭＥ、滲出型ＡＭＤ、ＤＲ、転移、敗血症および炎症を含むいくつかの眼障害に関連して増加する。とりわけ、Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２に競合的に結合し、Ａｎｇ１シグナル伝達を阻害し、内皮および血管の不安定化、血液網膜関門の破壊、および炎症をもたらす（Ｋｌａａｓｓｅｎら、２０１３，Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ，３４：１９－４８，Ｓａｈａｒｉｎｅｎら、２０１７，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，１６：６３５－６６１）。
Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２を含むＴｉｅ受容体は、１型膜貫通タンパク質受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（Ｒａｍｓａｕｅｒ，Ｍ．＆Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００２）；１１０：１６１５－１６１７）である。Ｔｉｅは、免疫グロブリンおよびＥＧＦ相同ドメインを有するチロシン（Ｔｙｏｓｉｎｅ）キナーゼ受容体を表す。Ｔｉｅ２は、全ての形成血管の内皮細胞およびマウス胚の心内膜に位置する（Ｋｏｒｈｏｎｅｎら、Ｂｌｏｏｄ（１９９２）；８０：２５４８－２５５５）。Ｔｉｅ２の外部ドメインまたは細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）は、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン（Ｉｇ１、Ｉｇ２およびＩｇ３）、３つの上皮成長因子（ＥＧＦ）ドメインおよびフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮＩＩＩ）を含む。Ｔｉｅ２のＩｇ－ＥＧＦ領域は、アンジオポエチンの認識および結合を媒介する（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）；２７８：１７２１－１７２７；Ｂａｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２００５）；１３：８２５－８３２）。
Ｔｉｅ２受容体に対する２つのリガンド：アンジオポエチン－１（Ａｎｇ１）およびアンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）が同定されている。Ｔｉｅ２アゴニストであるＡｎｇ－１は、Ｔｉｅ２のチロシンリン酸化に結合して誘導し、インビボでのその発現は、発達中の血管に近接している（Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ（１９９６）；８７：１１６１－１１６９）。Ａｎｇ－１を欠くマウスは、Ｔｉｅ２を欠くマウスで見られるものとよく似た血管新生欠損を示し、これは、Ａｎｇ－１がＴｉｅ２の主要な生理学的リガンドであり、Ｔｉｅ２が重要なインビボ血管新生作用を有することを支持している（Ｓｕｒｉら、Ｃｅｌｌ（１９９６）；８７：１１７１－１１８０）。Ａｎｇ－１は抗炎症性であり、血管の統合性を促進し、血管透過性を低下させる。Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２の天然に存在するアンタゴニストであると同定された。Ａｎｇ２のトランスジェニック過剰発現は、マウス胚における血管形成を破壊する（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：５５－６０，１９９７）。Ａｎｇ２は炎症促進性であり、ＥＣ静止を破壊し、血管透過性を増加させることができる。合わせると、研究は、Ａｎｇ１／Ａｎｇ２／Ｔｉｅ２系が血管新生において重要な役割を果たすことを裏付けている。血管新生におけるＴｉｅ２の重要な役割を考えると、Ｔｉｅ２を認識する剤、およびそのような剤を使用する方法が望ましい。さらに、Ｔｉｅ２アゴニストとして機能し、血管透過性を低下させるかまたは血管の完全性を高めることができる組成物は、特に眼障害の治療のための治療薬として大きな可能性を有する。
概要
本発明は、抗Ｔｉｅ２抗体、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片を含む組成物（例えば、コンジュゲート）、およびこれらの使用方法を提供する。
本開示の主題は、Ｔｉｅ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片、少なくとも１つ以上の抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片を含む組成物、およびこれらの使用方法を提供する。例示的な実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体はＦａｂである。
一局面において、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供され、ここで、抗Ｔｉｅ２抗体は、アミノ酸配列ＮＴＤＩＳ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｈ１、アミノ酸配列ＲＩＳＰＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ２、およびアミノ酸配列（ａ）ＲＴＲＷＡＳＸ１ＡＸ２ＤＹ（配列番号５、Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである）、（ｂ）ＲＴＲＷＡＳＷＡＭＤＹ（配列番号６）、または（ｃ）ＲＴＲＷＡＳＷＡＦＤＹ（配列番号７）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖（ＨＣ）可変ドメイン（ＶＨドメイン）およびアミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）を含むＣＤＲ－Ｌ１、アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ２、およびアミノ酸配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号６または配列番号７を含む。特定の実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は配列番号７を含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号１１のＶＨフレームワークＦＲ１配列、配列番号１２のＶＨフレームワークＦＲ２配列、配列番号１３のＶＨフレームワークＦＲ３配列、および／または配列番号１４のＶＨフレームワークＦＲ４配列を含む。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号１５のＶＬフレームワークＦＲ１配列、配列番号１６のＶＬフレームワークＦＲ２配列、配列番号１７のＶＬフレームワークＦＲ３配列、および／または配列番号１８のＶＬフレームワークＦＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ａ）Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである配列番号５、（ｂ）配列番号６、または（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。他の実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号６または配列番号７を含む。特定の実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は配列番号７を含む。さらに他の実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号２０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、ＶＬドメインは、配列番号２１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１９または配列番号２２のＶＨドメイン配列および配列番号２１のＶＬドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号２０のＶＨドメイン配列を含む。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号２１のＶＬドメイン配列を含む。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号２０のＶＨドメイン配列と配列番号２１のＶＬドメイン配列とを含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は、配列番号５５の重鎖（ＨＣ）ドメイン配列および／または配列番号２５の軽鎖（ＬＣ）ドメイン配列を含む。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は、配列番号２３の重鎖（ＨＣ）ドメイン配列および／または配列番号５６の軽鎖（ＬＣ）ドメイン配列を含む。
いくつかの局面において、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号３１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号２１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、ＶＨドメインは配列番号３１を含み、ＶＬドメインは配列番号２１を含む。他の実施形態において、ＨＣは配列番号３２を含み、ＬＣは配列番号２５を含む。
いくつかの局面において、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号３６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号２１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態において、ＶＨドメインは配列番号３６を含み、ＶＬドメインは配列番号２１を含む。他の実施形態において、ＨＣは配列番号３７を含み、ＬＣは配列番号２５を含む。
いくつかの局面において、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号８を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９を含むＣＤＲ－Ｌ２および配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、および（ａ）配列番号３８を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３９を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４０を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｂ）配列番号４３を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４５を含むＣＤＲ－Ｈ３；または（ｃ）配列番号４８を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４９を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号５０を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合断片が提供される。他の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号２１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から構成され、（ｄ）配列番号４１、（ｅ）配列番号４６または（ｆ）配列番号５１にそれぞれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２１のＬＣと、配列番号４２、配列番号４６、または配列番号５２を含むＨＣとを含む。
いくつかの局面において、配列番号６を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号８を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号９を含むＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４８を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４９を含むＣＤＲ－Ｈ２、配列番号５０を含むＣＤＲ－Ｈ３をＮ末端からＣ末端方向に含む２つのＶＨドメインおよび配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３をＮ末端からＣ末端方向に含む２つのＶＬドメインを含む、Ｔｉｅ２またはその抗原結合断片に特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの実施形態において、ＨＣは配列番号５４を含み、ＬＣは配列番号５３を含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片は、操作されたシステインを含み、操作されたシステインは、ＨＣ定常ドメインおよび／またはＬＣ定常ドメインにある。他の実施形態において、操作されたシステインは、重鎖中のＴ１２０Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｔ１８７ＣおよびＴ２０９Ｃ、ならびに軽鎖中のＱ１２４Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｑ１５５Ｃ、Ｌ２０１Ｃ、Ｔ２０６Ｃ、Ｋ１０７Ｃ、Ｋ１２６ＣおよびＫ１４９Ｃから選択され、残基番号はＥＵナンバリングに従う。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片は、ＦａｂのＨＣがアミノ酸ＣＤＫＴＨＴＳＰＰＣ（配列番号８３）で終端しているＦａｂである。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６のアミノ酸配列で終端する。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、モノクローナル抗体である。
他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、全長ＩｇＧ１または全長ＩｇＭ抗体である。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片はＴｉｅ２に結合し、ここで、Ｔｉｅ２は、配列番号１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するタンパク質である。
好ましい実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片はＦａｂである。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号２２のＶＨ配列と配列番号２１のＶＬ配列とを含む抗Ｔｉｅ２抗体と競合する抗体またはＦａｂである。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は、Ｔｉｅ２のＩｇ１ドメインに結合しない。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は、Ｔｉｅ２のＥＧＦドメインに結合しない。さらに他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は、Ｔｉｅ２のＩｇ３ドメインに結合しない。さらに他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は、Ｔｉｅ２のＦＮＩＩＩドメインに結合しない。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、カニクイザルＴｉｅ２に結合する。他の実施形態において、カニクイザルＴｉｅ２は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２に結合する抗体またはその抗原結合断片は多重特異性抗体である。他の実施形態において、多重特異性抗体はＴｉｅ２およびＶＥＧＦに結合する。他の実施形態において、多重特異性抗体はＴｉｅ２および因子Ｄに結合する。さらに他の実施形態において、多重特異性抗体はＴｉｅ２およびＡｎｇ２に結合する。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｔｉｅ２を活性化する多重特異性抗体である。他の実施形態において、多重特異性抗体はＴｉｅ２およびＶＥＧＦに結合し、多重特異性抗体はＴｉｅ２を活性化することができる。他の実施形態において、多重特異性抗体はＴｉｅ２および因子Ｄに結合し、ここで、多重特異性抗体はＴｉｅ２を活性化することができる。さらに他の実施形態において、多重特異性抗体はＴｉｅ２およびＡｎｇ２に結合し、ここで、多重特異性抗体はＴｉｅ２を活性化することができる。
一局面において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸が提供される。
一局面において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸を含む宿主細胞が提供される。
一局面において、Ｔｉｅ２に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、抗Ｔｉｅ２抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗Ｔｉｅ２抗体の発現に適した条件下で培養することを含む。他の実施形態において、方法は、宿主細胞から抗Ｔｉｅ２抗体を回収することをさらに含む。
一局面において、上記の方法によって産生される抗Ｔｉｅ２抗体が提供される。
一局面において、本明細書に開示される実施形態による、Ｔｉｅ２またはその抗原結合断片に特異的に結合する少なくとも２つの抗体と、多アーム部分とを含むコンジュゲートが提供される。好ましい実施形態において、少なくとも２つの抗Ｔｉｅ２抗体は各々Ｆａｂである。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、Ｔｉｅ２に結合する抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂと、少なくとも２つの抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに連結された多アーム部分とを含む。いくつかの実施形態において、多アーム部分は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに連結されている。他の実施形態において、多アーム部分は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに連結されている。さらに他の実施形態において、多アーム部分は、６または８の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに連結されている。さらに他の実施形態において、多アーム部分は、８の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに連結されている。好ましい実施形態において、多アーム部分は、６の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに連結されている。
一局面において、コンジュゲートは、Ｔｉｅ２に結合し、Ｔｉｅ２活性を活性化する。
いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２に結合するコンジュゲートは、ＡＫＴリン酸化を活性化する。他の実施形態において、ＡＫＴリン酸化の活性化は、インビトロアッセイにおけるリン酸化ＡＫＴタンパク質の増加によって実証される。他の実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、Ｔｉｅ２のリン酸化を活性化する。さらに他の実施形態において、Ｔｉｅ２リン酸化の活性化をインビトロで測定する。
いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２発現細胞をコンジュゲートに曝露しても、細胞中のＴｉｅ２タンパク質レベルは低下しない。他の実施形態において、曝露は、細胞中のＴｉｅ２タンパク質レベルを５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％または７５％超低下させない。他の実施形態において、曝露は、細胞中のＴｉｅ２タンパク質レベルを５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％または７５％未満低下させる。さらに他の実施形態において、曝露は、細胞内のＴｉｅ２タンパク質レベルを約２５％超および約７５％未満、約５０％超および約７５％未満、または約６０％超および約８０％未満低下させる。いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤とＴｉｅ２発現細胞とのインビトロインキュベーションの前後に、ウエスタンブロットによってＴｉｅ２タンパク質レベルを測定する。他の実施形態において、インキュベーションは、３７℃で１０～３６時間または１２～２４時間である。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片は、０．１ｕＭ～１０ｕＭ、０．０１ｕＭ～１０ｕＭ、または０．１～１００ｕＭの範囲の平衡解離定数（Ｋｄ）を有する。
いくつかの実施形態において、多アーム部分と抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片とを含むコンジュゲートは、Ｔｉｅ２の細胞－細胞接合部への移行を増加させる。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、血管透過性を低下させる。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、血管の安定性を促進し、および／または血管の統合性を上昇させる。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、Ａｎｇ１のＴｉｅ２への結合を阻害または低下させない。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、Ａｎｇ２のＴｉｅ２への結合を阻害または低下させる。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート活性は、インビトロアッセイを使用して測定される。
いくつかの実施形態において、多アーム型ポリオールは、二量体、四量体、六量体、および八量体から選択される。好ましい実施形態において、多アーム型ポリオールは六量体または八量体である。より好ましい実施形態において、多アーム型ポリオールは六量体である。
いくつかの実施形態において、ポリオールはポリ（アルキレンオキシド）ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリオールはポリ（アルキレングリコール）である。さらに他の実施形態において、ポリオールはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは官能化多アーム型ＰＥＧである。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）：
Figure 2023519213000001
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを表し、独立して、約４５～約１０００、約２０～約１０００、約１０～約１０００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１００、約１０～約５０、約１０～約３０、約２０～約３０、約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、ｎは約１～約１０の整数であり、；各Ｒ１は独立して存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、少なくとも１つのＲ２は末端反応性基である）の構造を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、１～３の整数である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、１であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。かかる実施形態において、八量体は、一般式（Ｉｂ）：
Figure 2023519213000002
（式中、各ｍは、独立して、約４５～約１０００、約２０～約１０００、約１０～約１０００、約３～約２５０、約３～約２００、約３～約１００、約１０～約５０、約１０～約３０、約２０～約３０、約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、ここで、少なくとも１つのＲ２は末端反応性基であり、上記のように抗Ｔｉｅ２抗体断片またはＦａｂに共有結合している）の構造を有する。いくつかの実施形態において、各ｍは、独立して、約１５～３５または約２０～３０の整数である。他の実施形態において、各ｍは独立して約２２の整数である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、構造
Figure 2023519213000003
を有し、ここで、Ｒ２はマレアミドである。
いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、３であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。かかる実施形態において、八量体は、一般式（Ｉｃ）：
Figure 2023519213000004
（式中、各ｍは、独立して、３～２５０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、少なくとも１つのＲ２は、末端反応性基であり、かつ上記の抗Ｔｉｅ２抗体に共有結合している）の構造を有する。いくつかの実施形態において、各ｍは、独立して１５～３５の整数である。他の実施形態において、各ｍは独立して約２２の整数である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の少なくとも２つの抗Ｔｉｅ２抗体断片またはＦａｂは、多アーム型ポリオールに共有結合している。他の実施形態において、コンジュゲートの多アーム型ポリオールは、システインアミノ酸の遊離スルフヒドリル基を介して少なくとも２つの抗Ｔｉｅ２抗体断片またはＦａｂに共有結合している。他の実施形態において、システインアミノ酸は、操作されたシステインである。さらに他の実施形態において、システインアミノ酸は抗Ｔｉｅ２定常ドメイン中にある。他の実施形態において、システインアミノ酸は、抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂの重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）のＣ末端にある。好ましい実施形態において、システインアミノ酸は、ＨＣまたはＬＣのＮ末端またはＣ末端にない。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、そのＨＣおよび／またはＬＣ中に操作されたシステインを含む抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片を含む。他の実施形態において、操作されたシステインは、ＨＣ中のＴ１２０Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｔ１８７ＣおよびＴ２０９Ｃから選択されるか、または操作されたシステインはＬＣ中のＱ１２４Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｑ１５５Ｃ、Ｌ２０１Ｃ、Ｔ２０６Ｃ、Ｋ１０７Ｃ、Ｋ１２６ＣおよびＫ１４９Ｃから選択され、操作されたシステインの残基番号はＥＵナンバリングに従う。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、リジンアミノ酸の遊離アミノ基を介して少なくとも２つの抗Ｔｉｅ２抗体断片またはＦａｂに共有結合している多アーム型ポリオールを含む。他の実施形態において、リジンアミノ酸は、抗Ｔｉｅ２抗体断片またはＦａｂの定常領域にある。さらに他の実施形態において、リジンアミノ酸は、抗Ｔｉｅ２抗体断片またはＦａｂの重鎖または軽鎖のＣ末端にある。代替的な実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、リジンの遊離アミノ基を介して少なくとも２つの抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに共有結合していない。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、インビトロにおいて生理学的条件で、１ヶ月当たり２０％未満、１５％未満、または１０％未満脱抱合する。他の実施形態において、コンジュゲートは、インビボにおいて生理学的条件で、１ヶ月当たり２０％未満、１５％未満、または１０％未満脱抱合する。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、長期間にわたって安定しており、生理学的条件で、ＴＩｅ２結合能を１カ月当たり２０％未満、１５％未満、または１０％未満喪失する。
一局面において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片と、多アーム部分とを含むコンジュゲートが提供され、多アーム部分はＩｇＭ分子を含む。他の実施形態において、ＩｇＭ分子はＪ鎖を含み、多アーム部分は５つの抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂを含み、５つの抗Ｔｉｅ２ ＦａｂのほぼそれぞれがＩｇＭ分子に連結されている。さらに他の実施形態において、ＩｇＭ分子はＪ鎖を含まず、多アーム部分は６つの抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂを含み、６つの抗Ｔｉｅ２ ＦａｂのそれぞれがＩｇＭ分子に連結されている。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、ＩｇＭバリアントが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を低減または排除するアミノ酸置換を有するＩｇＭバリアントであるＩｇＭ分子を含む。好ましい実施形態において、ＩｇＭバリアントは、ＥＵナンバリングに基づいて置換Ｐ４３６Ｇを含む。
一局面において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片と、多アーム部分とを含むコンジュゲートが提供され、多アーム部分は少なくとも２、４、６、８または１０のペプチドを含み、ペプチドのおよそ各々は抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂに共有結合している。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ配列は、残基２２１、２２２、２２３、２２４または２２５（ＥＵナンバリング）で終端する。他の実施形態において、各ペプチドは、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）ペプチドである。さらに他の実施形態において、ＮＤＫペプチドの各々は、配列番号７１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、各ＮＤＫペプチドは、そのＮ末端で抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ重鎖または軽鎖のＣ末端に連結されている。他の実施形態において、Ｆａｂ重鎖または軽鎖とペプチドとの間にリンカーが存在する。さらに他の実施形態において、リンカーはアミノ酸リンカーである。さらに他の実施形態において、アミノ酸リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、２～２０、５～１０または４～１０のアミノ酸を含む。他の実施形態において、リンカーはグリシンを含む。
いくつかの実施形態において、多アーム部分は、６または８のペプチドを含む。他の実施形態において、多アーム部分は、６のペプチドを含む。好ましい実施形態において、多アーム部分は、６のＮＤＫペプチドを含む。
一局面において、抗体またはその抗原結合断片と、多アーム部分とを含むコンジュゲートが提供され、多アーム部分はＩｇＭ分子を含む。他の実施形態において、ＩｇＭ分子はＪ鎖を含み、多アーム部分は５つの抗体断片、Ｆａｂ、またはその抗原結合断片を含み、５つの抗体断片、Ｆａｂ、またはその抗原結合断片のほぼそれぞれはＩｇＭ分子に連結されている。さらに他の実施形態において、ＩｇＭ分子はＪ鎖を含まず、多アーム部分は６つの抗体断片、Ｆａｂ、またはその抗原結合断片を含み、６つの抗体断片、Ｆａｂ、またはその抗原結合断片のそれぞれはＩｇＭ分子に連結されている。
いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、ＩｇＭバリアントが補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を低減または排除するアミノ酸置換を有するＩｇＭバリアントであるＩｇＭ分子を含む。好ましい実施形態において、ＩｇＭバリアントは、ＥＵナンバリングに基づいて置換Ｐ４３６Ｇを含む。
一局面において、抗体、抗体断片、Ｆａｂまたはその抗原結合断片と、多アーム部分とを含むコンジュゲートが提供され、多アーム部分は少なくとも２、４、６、８または１０のペプチドを含み、ペプチドのおよそ各々は抗Ｔｉｅ２抗体、抗体断片、Ｆａｂまたはその抗原結合断片に共有結合している。いくつかの実施形態において、抗体、抗体断片、Ｆａｂ、またはその抗原結合断片の配列は、残基２２１、２２２、２２３、２２４または２２５（ＥＵナンバリング）で終端する。他の実施形態において、各ペプチドは、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）ペプチドである。さらに他の実施形態において、ＮＤＫペプチドの各々は、配列番号７１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、各ＮＤＫペプチドは、そのＮ末端で抗体、抗体断片、Ｆａｂ、またはその抗原結合断片の重鎖または軽鎖のＣ末端連結されている。他の実施形態において、Ｆａｂ重鎖または軽鎖とペプチドとの間にリンカーが存在する。さらに他の実施形態において、リンカーはアミノ酸リンカーである。さらに他の実施形態において、アミノ酸リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、２～２０、５～１０または４～１０のアミノ酸を含む。他の実施形態において、リンカーはグリシンを含む。
いくつかの実施形態において、多アーム部分は、６または８のペプチドを含む。他の実施形態において、多アーム部分は、６のペプチドを含む。好ましい実施形態において、多アーム部分は、６のＮＤＫペプチドを含む。
一局面において、本開示による抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片と、薬学的に許容され得る担体、賦形剤、または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の多アーム部分に連結された複数の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂを含む抗Ｔｉｅ２結合剤と、薬学的に許容され得る担体とを含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはＴｉｅ２結合剤を含む医薬組成物は、追加の治療剤をさらに含む。他の実施形態において、追加の治療剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ｔｉｅ２抗体、および抗Ａｎｇ２抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、Ａｎｇ２アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦトラップ、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ａｎｇ２抗体および補体成分アンタゴニストから選択される。
いくつかの実施形態において、前述の医薬組成物のいずれかを医薬として使用することができる。
いくつかの実施形態において、前述の医薬組成物のいずれかは、対象の眼障害を処置するための医薬の製造に使用することができる。
いくつかの実施形態において、前述の医薬組成物のいずれかは、眼障害を有する対象の病的な血管透過性を低減または阻害するのに使用することができる。
他の局面において、前述の医薬組成物のいずれかは、対象の眼障害を処置するために使用することができる。
一局面において、それを必要とする個体を処置する方法であって、本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２抗体および／またはＴｉｅ２結合剤を患者に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２コンジュゲートを含む、本明細書に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、個体は、血管障害と診断されている。他の実施形態において、個体は、眼の血管障害と診断されている。
他の局面において、本発明は、望ましくない血管透過性に関連する障害に罹患している対象において血管透過性を阻害する方法であって、有効量の前述の抗体またはコンジュゲートのいずれか１つを対象に投与し、それにより、対象において血管透過性を阻害することを含む方法を特徴とする。
他の局面において、本発明は、望ましくない血管透過性に関連する障害を処置する方法であって、有効量の前述の抗体またはコンジュゲートのいずれか１つをかかる処置を必要とする対象に投与することを含む方法を特徴とする。
いくつかの実施形態において、個体は、Ｔｉｅ２経路に関連する障害と診断されている。
いくつかの実施形態において、個体は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、乾燥型および湿潤型（非滲出型および滲出型）を含む加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、病理学的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、緑内障、浮腫の非存在下での網膜症、および網膜血管新生からなる群から選択される眼障害と診断されている。
いくつかの実施態様において、個体は、抗ＶＥＧＦ抗体による処置を受けたことがある。他の実施形態において、個体は、抗ＶＥＧＦ抗体の治療有効性を経験せず、抗ＶＥＧＦ抗体の治療有効性の低下を経験し、および／または抗ＶＥＧＦ抗体の治療有効性の経験を停止した。
いくつかの実施形態において、方法は、第２の治療剤を個体に投与することをさらに含む。他の実施形態において、第２の治療剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ａｎｇ２抗体、抗ＶＥＧＦ／Ａｎｇ２二重特異性抗体、ＶＥＧＦアンタゴニストおよびＡｎｇ２アンタゴニストからなる群から選択される。
図１は、ＶＨライブラリーのパニングに使用されるＴｉｅ２ドメインの概略図を提供する。 図２Ａ～図２Ｂは、マウスＴｉｅ２ ＥＣＤ５ドメイン（図２Ａ）およびヒトＴｉｅ２ ＥＣＤ５ドメイン（図２Ｂ）に対する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１０、Ｔｉｅ２．１１およびＴｉｅ２．１２による結合を評価するアッセイの結果を示す。ＥＣＤ５ドメインは、Ｔｉｅ２のＩｇ１、Ｉｇ２、ＥＧＦおよびＩｇ３ドメインを含む。 図２Ａ～図２Ｂは、マウスＴｉｅ２ ＥＣＤ５ドメイン（図２Ａ）およびヒトＴｉｅ２ ＥＣＤ５ドメイン（図２Ｂ）に対する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１０、Ｔｉｅ２．１１およびＴｉｅ２．１２による結合を評価するアッセイの結果を示す。ＥＣＤ５ドメインは、Ｔｉｅ２のＩｇ１、Ｉｇ２、ＥＧＦおよびＩｇ３ドメインを含む。 図３Ａ～図３Ｂは、ヒトＴｉｅ１に対する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１０、Ｔｉｅ２．１１およびＴｉｅ２．１２（図３Ａ）ならびにＴｉｅ２．２、Ｔｉｅ２．３、Ｔｉｅ２．４、Ｔｉｅ２．５、Ｔｉｅ２．７、Ｔｉｅ２．９、Ｔｉｅ２．１５、Ｔｉｅ２．１６、Ｔｉｅ２．１７およびＴｉｅ２．２０（図３Ｂ）による結合を評価するためのアッセイの結果を示す。 図３Ａ～図３Ｂは、ヒトＴｉｅ１に対する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１０、Ｔｉｅ２．１１およびＴｉｅ２．１２（図３Ａ）ならびにＴｉｅ２．２、Ｔｉｅ２．３、Ｔｉｅ２．４、Ｔｉｅ２．５、Ｔｉｅ２．７、Ｔｉｅ２．９、Ｔｉｅ２．１５、Ｔｉｅ２．１６、Ｔｉｅ２．１７およびＴｉｅ２．２０（図３Ｂ）による結合を評価するためのアッセイの結果を示す。 図４Ａ～図４Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１２およびＴｉｅ２．２０による、Ｔｉｅ２とＡｎｇ１との間の相互作用（図４Ａ）およびＴｉｅ２とＡｎｇ２との間の相互作用（図４Ｂ）の遮断を評価するためのアッセイの結果を示す。 図４Ａ～図４Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１２およびＴｉｅ２．２０による、Ｔｉｅ２とＡｎｇ１との間の相互作用（図４Ａ）およびＴｉｅ２とＡｎｇ２との間の相互作用（図４Ｂ）の遮断を評価するためのアッセイの結果を示す。 図５Ａ～図５Ｂは、ＨＵＶＥＣ（図５Ａ）およびＲＡＥＣ（図５Ｂ）に対する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１０、Ｔｉｅ２．１１およびＴｉｅ２．１２による結合を評価するためのアッセイの結果を示す。 図５Ａ～図５Ｂは、ＨＵＶＥＣ（図５Ａ）およびＲＡＥＣ（図５Ｂ）に対する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１０、Ｔｉｅ２．１１およびＴｉｅ２．１２による結合を評価するためのアッセイの結果を示す。 図６Ａ～図６Ｂは、ＲＡＥＣ（図６Ａ）における抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．４、Ｔｉｅ２．５およびＴｉｅ２．２０によるＡＫＴリン酸化の活性化を評価し、ＡＫＴリン酸化に対する抗Ｔｉｅ２抗体の抗ＩｇＧ架橋の効果を評価するためのアッセイの結果を示す（図６Ｂ）。リン酸化ＡＫＴのレベルをウエスタンブロット分析によって決定した。 図６Ａ～図６Ｂは、ＲＡＥＣ（図６Ａ）における抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．４、Ｔｉｅ２．５およびＴｉｅ２．２０によるＡＫＴリン酸化の活性化を評価し、ＡＫＴリン酸化に対する抗Ｔｉｅ２抗体の抗ＩｇＧ架橋の効果を評価するためのアッセイの結果を示す（図６Ｂ）。リン酸化ＡＫＴのレベルをウエスタンブロット分析によって決定した。 図７Ａ～図７Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．２２、Ｔｉｅ２．２３、Ｔｉｅ２．２４、Ｔｉｅ２．２７、Ｔｉｅ２．２８、Ｔｉｅ２．３１、Ｔｉｅ２．３３、Ｔｉｅ２．３４、Ｔｉｅ２．３４、Ｔｉｅ２．３８およびＴｉｅ２．１（図７Ａ）によるＡＫＴリン酸化の活性化を評価するためのアッセイの結果を示す。図７Ｂは、ＡＫＴのリン酸化を誘導する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１の活性に対する抗Ｔｉｅ２抗体凝集または抗ＩｇＧ架橋の効果を示す。リン酸化ＡＫＴのレベルをＦＲＥＴ分析によって決定した。 図７Ａ～図７Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．２２、Ｔｉｅ２．２３、Ｔｉｅ２．２４、Ｔｉｅ２．２７、Ｔｉｅ２．２８、Ｔｉｅ２．３１、Ｔｉｅ２．３３、Ｔｉｅ２．３４、Ｔｉｅ２．３４、Ｔｉｅ２．３８およびＴｉｅ２．１（図７Ａ）によるＡＫＴリン酸化の活性化を評価するためのアッセイの結果を示す。図７Ｂは、ＡＫＴのリン酸化を誘導する抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１の活性に対する抗Ｔｉｅ２抗体凝集または抗ＩｇＧ架橋の効果を示す。リン酸化ＡＫＴのレベルをＦＲＥＴ分析によって決定した。 図８Ａ～図８Ｂは、方法（図８Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図８Ｂ）を使用した抗Ｔｉｅ２抗体のビニング研究からの結果を示す。 図８Ａ～図８Ｂは、方法（図８Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図８Ｂ）を使用した抗Ｔｉｅ２抗体のビニング研究からの結果を示す。 図９は、本開示の抗Ｔｉｅ２抗体が結合するＴｉｅ２上のエピトープ基を示す概略図である。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１（配列番号２２）、Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦ（配列番号２０）、Ｔｉｅ２．１２（配列番号３１）、Ｔｉｅ２．２４（配列番号３６）、Ｔｉｅ２．３３（配列番号４１）およびＴｉｅ２．３８（配列番号５１）（図１０Ａ）の重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦ（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．１２（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．２４（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．３３（配列番号２１）およびＴｉｅ２．３８（配列番号２１）（図１０Ｂ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１（配列番号２２）、Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦ（配列番号２０）、Ｔｉｅ２．１２（配列番号３１）、Ｔｉｅ２．２４（配列番号３６）、Ｔｉｅ２．３３（配列番号４１）およびＴｉｅ２．３８（配列番号５１）（図１０Ａ）の重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦ（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．１２（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．２４（配列番号２１）、Ｔｉｅ２．３３（配列番号２１）およびＴｉｅ２．３８（配列番号２１）（図１０Ｂ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の配列アラインメントを示す。 図１１Ａ～図１１Ｂは、ファージ提示または動物免疫化によって生成された種々の抗Ｔｉｅ２．１抗体を用いたビニングアッセイの結果を示す。図１１Ａは、共有結合的に固定化された抗体および溶液中のいくつかの抗体のリストを提供し、図１１Ｂは、溶液中の抗体の残りのリストを提供する。 図１１Ａ～図１１Ｂは、ファージ提示または動物免疫化によって生成された種々の抗Ｔｉｅ２．１抗体を用いたビニングアッセイの結果を示す。図１１Ａは、共有結合的に固定化された抗体および溶液中のいくつかの抗体のリストを提供し、図１１Ｂは、溶液中の抗体の残りのリストを提供する。 図１２Ａ～図１２Ｂは、多量体抗Ｔｉｅ２抗体のアゴニスト活性を評価する結果アッセイを示す。図１２Ａは、ＰＥＧ六量体としておよびバイエピトープＦａｂＩｇＧ（１．３８）としてＴｉｅ２．１によるＡＫＴリン酸化活性化を比較する。図１２Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体の多量体フォーマットを比較する。 図１２Ａ～図１２Ｂは、多量体抗Ｔｉｅ２抗体のアゴニスト活性を評価する結果アッセイを示す。図１２Ａは、ＰＥＧ六量体としておよびバイエピトープＦａｂＩｇＧ（１．３８）としてＴｉｅ２．１によるＡＫＴリン酸化活性化を比較する。図１２Ｂは、抗Ｔｉｅ２抗体の多量体フォーマットを比較する。 図１３Ａ～図１３Ｂは、総タンパク質のＡ２８０（図１３Ａ）およびＳＥＣプロファイル（図１３Ｂ）によって測定される、アフィニティーカラムから単離されたタンパク質の総収率に対する、Ｊ鎖の有無に関わらない、ｈｕＩｇＭ重鎖対軽鎖の様々な比の効果を示す。 図１３Ａ～図１３Ｂは、総タンパク質のＡ２８０（図１３Ａ）およびＳＥＣプロファイル（図１３Ｂ）によって測定される、アフィニティーカラムから単離されたタンパク質の総収率に対する、Ｊ鎖の有無に関わらない、ｈｕＩｇＭ重鎖対軽鎖の様々な比の効果を示す。 図１３Ｃは、因子Ｄ（ｆＤ）を標的とする眼の多価ＰＥＧフォーマットと比較したＩｇＭのレオロジー測定を示す。 図１３Ｄは、非結合ＩｇＭおよび非結合Ｆａｂの硝子体内薬物動態分析を示す。 図１３Ｅは、非結合組換えｈＩｇＭ五量体および組換えｈＩｇＭ六量体を、雌ＳＣＩＤマウスに静脈内注射したヒト血清から単離したＩｇＭと比較する、ＩｇＭの全身薬物動態分析を示す。図１３Ｅは、血清ＩｇＭレベルを示す。 図１３Ｆは、血清試料からの全体的なＮ結合型グリカンプロファイルのＬＣ－ＭＳ分析を示す。 図１３Ｇ～図１３Ｈは、ＩｇＭ多量体フォーマットの抗Ｔｉｅ２抗体を特徴付けるアッセイの結果を示す。図１３Ｇは、ＩｇＭ定常ドメインにおける変異を評価するための補体アッセイの結果を示す。図１３Ｈは、ＩｇＭ六量体形式の抗Ｔｉｅ抗体のアゴニスト活性を示す。 図１３Ｇ～図１３Ｈは、ＩｇＭ多量体フォーマットの抗Ｔｉｅ２抗体を特徴付けるアッセイの結果を示す。図１３Ｇは、ＩｇＭ定常ドメインにおける変異を評価するための補体アッセイの結果を示す。図１３Ｈは、ＩｇＭ六量体形式の抗Ｔｉｅ抗体のアゴニスト活性を示す。 図１４Ａ～図１４Ｂは、ペプチド部分を介した六量体フォーマットの抗Ｔｉｅ２抗体の設計および分析を示す。図１４Ａは、多量体設計の概略図である。図１４Ｂは、ＮＤＫペプチド、ＩｇＭおよび多アーム型ＰＥＧを介した六量体フォーマットの抗Ｔｉｅ２抗体を比較するＡＫＴリン酸化アッセイの結果を示す。 図１４Ａ～図１４Ｂは、ペプチド部分を介した六量体フォーマットの抗Ｔｉｅ２抗体の設計および分析を示す。図１４Ａは、多量体設計の概略図である。図１４Ｂは、ＮＤＫペプチド、ＩｇＭおよび多アーム型ＰＥＧを介した六量体フォーマットの抗Ｔｉｅ２抗体を比較するＡＫＴリン酸化アッセイの結果を示す。 図１５Ａ～図１５Ｂは、種々の抗Ｔｉｅ２抗体のアゴニスト活性を六量体フォーマットで評価するためのＡＫＴリン酸化アッセイの結果を示す。結果を、Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．３８、Ｔｉｅ２．３３（図１５Ａ）およびＴｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦ、Ｔｉｅ２．１２、Ｔｉｅ２．２４（図１５Ｂ）について示す。 図１５Ａ～図１５Ｂは、種々の抗Ｔｉｅ２抗体のアゴニスト活性を六量体フォーマットで評価するためのＡＫＴリン酸化アッセイの結果を示す。結果を、Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．３８、Ｔｉｅ２．３３（図１５Ａ）およびＴｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦ、Ｔｉｅ２．１２、Ｔｉｅ２．２４（図１５Ｂ）について示す。 図１６Ａ～図１６Ｃは、インビトロアッセイにおいてＴｉｅ２タンパク質の細胞レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果を評価するためのアッセイの結果を示す。図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃの各々は、ファージ提示および動物免疫化を介して生成された抗Ｔｉｅ２抗体へのＨＵＶＥＣの曝露時のＴｉｅ２レベルを比較する。図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃにおける全てのアッセイをウエスタンブロットによって分析した。 図１６Ａ～図１６Ｃは、インビトロアッセイにおいてＴｉｅ２タンパク質の細胞レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果を評価するためのアッセイの結果を示す。図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃの各々は、ファージ提示および動物免疫化を介して生成された抗Ｔｉｅ２抗体へのＨＵＶＥＣの曝露時のＴｉｅ２レベルを比較する。図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃにおける全てのアッセイをウエスタンブロットによって分析した。 図１６Ａ～図１６Ｃは、インビトロアッセイにおいてＴｉｅ２タンパク質の細胞レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果を評価するためのアッセイの結果を示す。図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃの各々は、ファージ提示および動物免疫化を介して生成された抗Ｔｉｅ２抗体へのＨＵＶＥＣの曝露時のＴｉｅ２レベルを比較する。図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃにおける全てのアッセイをウエスタンブロットによって分析した。 図１７は、Ｔｉｅ２タンパク質レベルの細胞レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果を評価するためのインビボアッセイの結果を示す。 は、内皮細胞バリア透過性に対する抗Ｔｉｅ２．１抗体の効果を研究するためのインビトロ内皮細胞アッセイのアッセイ方法（図１８Ａ）および結果（図１８Ｂ）を示す。 は、内皮細胞バリア透過性に対する抗Ｔｉｅ２．１抗体の効果を研究するためのインビトロ内皮細胞アッセイのアッセイ方法（図１８Ａ）および結果（図１８Ｂ）を示す。 図１９Ａ～図１９Ｂは、ＶＥＧＦ誘導性血管漏出に対する抗Ｔｉｅ２．１抗体の効果を研究するためのインビボ血管透過性アッセイのアッセイ方法（図１９Ａ）および結果（図１９Ｂ）を示す。 図１９Ａ～図１９Ｂは、ＶＥＧＦ誘導性血管漏出に対する抗Ｔｉｅ２．１抗体の効果を研究するためのインビボ血管透過性アッセイのアッセイ方法（図１９Ａ）および結果（図１９Ｂ）を示す。 図２０Ａ～図２０Ｂは、ＶＥＧＦ誘導性血管漏出に対する抗Ｔｉｅ２．１抗体または抗ＶＥＧＦ抗体の効果を研究するためのインビボ血管透過性アッセイのアッセイ方法（図２０Ａ）および結果（図２０Ｂ）を示す。 図２０Ａ～図２０Ｂは、ＶＥＧＦ誘導性血管漏出に対する抗Ｔｉｅ２．１抗体または抗ＶＥＧＦ抗体の効果を研究するためのインビボ血管透過性アッセイのアッセイ方法（図２０Ａ）および結果（図２０Ｂ）を示す。 図２１Ａ～図２１Ｂは、ウエスタンブロット分析によって決定されたＴｉｅ２のタンパク質レベルに対するバイエピトープ抗Ｔｉｅ２アゴニスト（抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ－ＩｇＧ１．３８）のインビボ効果（図２１Ａ）、およびＶＥＧＦ誘導性血管漏出に対する抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ－ＩｇＧ １．３８の効果を研究するためのインビボ血管透過性アッセイの結果（図２１Ｂ）を示す。 図２１Ａ～図２１Ｂは、ウエスタンブロット分析によって決定されたＴｉｅ２のタンパク質レベルに対するバイエピトープ抗Ｔｉｅ２アゴニスト（抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ－ＩｇＧ１．３８）のインビボ効果（図２１Ａ）、およびＶＥＧＦ誘導性血管漏出に対する抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ－ＩｇＧ １．３８の効果を研究するためのインビボ血管透過性アッセイの結果（図２１Ｂ）を示す。 図２２は、培養ＨＵＶＥＣにおけるＶＥ－カドヘリン（上パネル）およびＦ－アクチン（下パネル）の細胞組織化に対する抗Ｔｉｅ２アゴニストの効果を示す。 図２３は、ＩＧ１フォーマットのＴｉｅ２．１抗Ｔｉｅ２抗体のバリアントのアゴニスト活性を評価するためのＡＫＴリン酸化アッセイの結果を示す。 図２４は、非ＰＥＧコンジュゲートＴｉｅ２．１ Ｆａｂ（六量体なし）と比較して、六量体フォーマットのＴｉｅ２．１抗Ｔｉｅ２コンジュゲートのバリアントのアゴニスト活性を評価するためのＡＫＴリン酸化アッセイの結果を示す。 図２５は、カニクイザルにおける眼注射後の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ六量体コンジュゲートの薬物動態を示す。 図２６～図２７は、単量体ピークが相対定量に考慮された（図２６）および、されていない（図２７）抗Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧコンジュゲートの電気泳動図分析を示す。 図２６～図２７は、単量体ピークが相対定量に考慮された（図２６）および、されていない（図２７）抗Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧコンジュゲートの電気泳動図分析を示す。 図２８は、カニクイザル硝子体液から採取した試料中の抗Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧコンジュゲートの電気泳動図分析を示す。 図２９は、抗Ｔｉｅ２ ＰＥＧコンジュゲート六量体および五量体の相対量を示す。 図３０Ａ～図３０Ｂは、２１日間（図３０Ｂ）にわたってカニクイザルの眼から採取した試料中のＭ１００ｃ（図３０Ａ）の酸化を示すデータを提供する。 図３０Ａ～図３０Ｂは、２１日間（図３０Ｂ）にわたってカニクイザルの眼から採取した試料中のＭ１００ｃ（図３０Ａ）の酸化を示すデータを提供する。 図３１は、ｐＡＫＴ活性に対する酸化の効果を示す。 図３２～図３３は、図３３にグラフ化された正規化された値を用いて、ｐＡＫＴ活性（図３２）に対する脱抱合の効果を示す。 図３２～図３３は、図３３にグラフ化された正規化された値を用いて、ｐＡＫＴ活性（図３２）に対する脱抱合の効果を示す。 図３４は、脱抱合に対するＰＥＧ抱合部位の位置の影響を示す。 図３５Ａは、活性に対するＰＥＧ抱合部位の位置の影響を示す。 図３５Ｂは、活性に対するＰＥＧ抱合部位の位置の影響を示す。 図３６は、異なるＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＰＥＧコンジュゲートの薬物動態を示す。 図３７は、異なるＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＰＥＧコンジュゲートのインビボ安定性を比較する。 図３８Ａ～図３８Ｂは、異なるＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＰＥＧコンジュゲートの活性を比較する。図３８ＡはｐＡＫＴ活性を示し、図３８ＢはＥＬＩＳＡによる総コンジュゲートレベルを示す。 図３８Ａ～図３８Ｂは、異なるＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＰＥＧコンジュゲートの活性を比較する。図３８ＡはｐＡＫＴ活性を示し、図３８ＢはＥＬＩＳＡによる総コンジュゲートレベルを示す。 図３９は、本開示による抗Ｔｉｅ２抗体にコンジュゲートされたＰＥＧコンジュゲート六量体コア分子の構造を示す。
発明の実施形態の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で特に定義されていない限り、「含む」という用語は、「からなる）」という用語を含むものとする。
特定の値（例えば、温度、濃度、時間等）に関連して本明細書で使用される「約」という用語は、「約」という用語が指す特定の値の＋／－１％の変動を指すものとする。
本明細書の目的において「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定し得る。結合親和性を測定するための具体的な例証的説明および例示的な実施形態が以下に記載される。
「親和性成熟」抗体とは、改変等を有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の改変を有し、そのような改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。
用語「抗Ｔｉｅ２抗体」、「Ｔｉｅ２に結合する抗体」および「Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体」は、抗体がＴｉｅ２の標的化において治療剤および／または診断剤として有用であるような充分な親和性を有して、Ｔｉｅ２に結合可能である抗体を指す。一実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体が非関連非 Ｔｉｅ２タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＴｉｅ２への結合の約１０％未満である。特定の実施形態において、Ｔｉｅ２に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、異なる種のＴｉｅ２間で保存されているＴｉｅ２のエピトープに結合する。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子である。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」は、ＣＨ１ドメイン、または軽鎖定常領域でジスルフィド結合を形成するために十分なＣＨ１ドメインの一部を含むが、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含まない、重鎖定常領域を含む抗体を指す。本明細書で使用される場合、Ｆａｂは、ヒンジ領域の１つ以上のアミノ酸を含み得る。それ故に、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」という用語は、Ｆａｂ’抗体を包含する。Ｆａｂは、Ｃ末端システイン等のさらなる非天然アミノ酸を含んでいてもよく、その場合、Ｆａｂ－Ｃと称し得る。以下に考察するように、Ｆａｂ－Ｃという用語はまた、Ｃ末端に天然システインを含むヒンジ領域の天然アミノ酸を含むＦａｂを包含する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、操作されたシステインを含む（すなわち、Ｆａｂは、ＴＨＩＯＭＡＢであり得る）。いくつかの実施形態において、操作されたシステインは、非システインアミノ酸残基で置換されたＦａｂ ＨＣおよび／またはＬＣポリペプチド配列中のシステインアミノ酸残基である。
「Ｆａｂ－Ｃ」は、Ｃ末端システインを含むＦａｂを指し、これは、その残基位置で生じる天然システイン（ヒンジ領域からのシステイン等）であり得るか、または天然システインに対応しないＣ末端に付加されたシステインであり得る。
「Ｆａｂ－ＳＨ」は、遊離チオール基を有するＦａｂを指す。いくつかの実施形態において、遊離チオール基は、ＦａｂのＣ末端の最後の１０のアミノ酸に位置している。Ｆａｂ－Ｃ抗体はまた、典型的には、Ｆａｂ－ＳＨ抗体である。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する抗体、および逆に、競合アッセイにおいて、抗体がその抗原に結合するのを５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示の競合アッセイが本明細書に提供される。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の供給源または種に由来する抗体を指し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りは、異なる供給源または種に由来する。
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「コンジュゲート」という用語は、本明細書ではその最も広い定義で使用され、共に接合（ｊｏｉｎｅｄ）または連結（ｌｉｎｋｅｄ）されていることを意味する。分子は、接合されているように作用または機能する場合、「コンジュゲート」されている。「コンジュゲート」は、ポリオールを含むがこれに限定されない、１つ以上の異種性分子（複数可）にコンジュゲートされる抗体（例えばＦａｂ）である。特定の実施形態において、「コンジュゲート」は、多アーム部分に共有結合している抗体（例えば、本明細書に詳述される、抗体断片）を指す。特定の実施形態において、多アーム部分は、ポリオール、ＩｇＭ分子、または多量体（例えば、六量体）フォーマットのペプチドである。
本明細書で使用される用語「Ｔｉｅ２」は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）ならびに齧歯類（例えばマウスおよびラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然Ｔｉｅ２を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＴｉｅ２ならびに、細胞内での処理に起因する任意の形態のＴｉｅ２をも包含する。この用語は、Ｔｉｅ２の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＴｉｅ２タンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０００４５０（配列番号１）を有する。
本明細書で使用される用語「細胞毒性剤」は、細胞機能を阻害しもしくは防止し、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性剤としては、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素およびそのフラグメント、例えば核分解酵素；抗生物質；細菌、真菌、植物または動物由来の低分子毒素または酵素的活性毒素等の毒素（そのフラグメントおよび／またはバリアントを含む）；ならびに下記に開示される様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性のことで、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；およびＢ細胞活性化が含まれる。
剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療結果または予防結果を達成するために必要な薬用量および所要期間で有効な量を指す。
本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。本用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域とを含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）中において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞、およびそのような細胞の子孫を含む細胞を指す。宿主細胞としては、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞および継代の数にかかわらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるかまたは選択されるのと同じ機能または生物活性を有する変異体の子孫は、本発明に含まれる。
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリ等のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般的に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一実施形態において、ＶＬについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）におけるサブグループカッパＩである。一実施形態において、ＶＨについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（上記）におけるサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照のこと。
本明細書で使用される用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、配列が超可変であり（本明細書では「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる）、および／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。天然抗体では、Ｈ３およびＬ３が、６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３が抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる、天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の非存在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）を参照されたい。
いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用され、本明細書に包含されている。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の折衷物を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲの各々に由来する残基が、以下に示される。
Figure 2023519213000005
ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて、２６～３５（Ｈ１）、５０～６５または４９～６５（Ｈ２）、および９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、上記Ｋａｂａｔらに従ってナンバリングされる。
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置ナンバリング」という用語、およびそれらの変形は、上記Ｋａｂａｔらにおける抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、所与の抗体に対して、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによってナンバリングされた配列との相同領域での整列によって決定され得る。
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、一般的に、可変ドメインにおける残基（およそ、軽鎖の残基１～１０７および重鎖の残基１～１１３）について言及する際に使用される（例えば、上記Ｋａｂａｔら）。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基について言及する際に使用される（例えば、上記Ｋａｂａｔらで報告されるＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。本明細書で別途示されない限り、抗体の可変ドメイン中の残基番号への言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書で別途示されない限り、抗体の定常ドメイン中の残基番号への言及は、ＥＵナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８１８８８号、ＥＵナンバリングに関する図を参照されたい）。
「免疫コンジュゲート」は、細胞傷害剤を含むがこれらに限定されない、１つ以上の異種性分子にコンジュゲートされた抗体である。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照のこと。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗Ｔｉｅ２抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖および軽鎖（またはそらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター内のそのような核酸分子（複数可）および宿主細胞内の１つ以上の位置に存在するそのような核酸分子（複数可）を含む。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、かかる変異型は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ提示法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種部位（例えば、細胞毒性部位）または放射性標識に結合していない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬組成物中に存在し得る。
「天然抗体」とは、種々の構造を持つ天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖がジスルフィド結合したものを含む、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラメリック糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、これに定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（カッパ）、λ（ラムダ）と呼ばれる２種類のいずれかに割り当てられてもよい。
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌および／または警告に関する情報を含む。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、またはそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、またはアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、またはアミノ酸配列Ｂに対する、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算され：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で記載したように得られる。
「医薬製剤」という用語は、そこに含まれる有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、かつ、製剤が投与されるであろう被験者に許容できない毒性を有する追加成分を含まない製剤をいう。
「薬学的に許容され得る担体」は、対象に非毒性の、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
用語「ポリオール」は、多価アルコール化合物を広く指す。ポリオールは、例えば、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖または分岐鎖を有し得る。好ましいポリオールには、１以上のヒドロキシル位置に化学基、例えば１～４つの炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。しかしながら、当業者であれば、他のポリオール、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン－ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧについて本明細書に記載されるコンジュゲートのための技術を使用して用いることができることが理解されよう。本開示のポリオールには、当該技術分野で公知であるものおよび公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」（およびその文法的な変形語、例えば、「治療する」または「治療すること」）は、治療される個体の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過の間のいずれかに行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症または再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解または緩和、および回復または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、または疾患の進行を遅延させるために使用される。
用語「ベクター」は、本明細書では、連結している他の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクターならびに、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含む。特定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と称する。
「ポート送達システム」または「ＰＤＳ」は、長期間にわたって治療剤の送達を可能にする詰め替え可能なリザーバーを用いる眼用の移植可能な装置である。リザーバーおよび眼への薬物放出の速度を決定する放出制御要素と連通するリフィルポートを有する移植が、行われる。例えば、米国特許公開第２０１００１７４２７２号、同第８，２７７，８３０号、同第８，３９９，００６号、同第８，７９５，７１２号、および同第８，８０８，７２７号を参照のこと。
「小穴針」は、３０ゲージ針等の約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、または２２ゲージもしくはそれ以上の液体成分の注射用針を指す。いくつかの実施形態において、小穴針は、標準サイズの壁を有する。別の実施形態において、小穴針は、粘性溶液に好ましくあり得る、薄壁を有する。
ＩＩ．組成物および方法
例えば、Ｔｉｅ２のリン酸化によって実証されるように、Ｔｉｅ２機能を活性化する新規Ｔｉｅ２アゴニストが本明細書で提供される。直接的アゴニストは、Ｔｉｅ２シグナル伝達のより強力な活性化において治療上有利であり得、内因性アゴニストＡｎｇ１が少ないかまたは存在しない場合に視力改善を推進する。Ｔｉｅ２の活性化剤は、Ａｎｇ２の結合を遮断（Ａｎｇ２アンタゴニスト機能を遮断）およびＴｉｅ２に直接結合してＴｉｅ２活性を活性化し得る、例えば、Ｔｉｅ２および／またはＡｋｔのリン酸化を増加させ得るため、Ａｎｇ２の阻害剤よりも好都合であり得る。Ｔｉｅ２の活性化は、リガンドの結合時にＴｉｅ２のクラスター化を必要とすることが示されており、したがって、本明細書で提供されるＴｉｅ２アゴニストは多量体、好ましくは六量体または八量体である。本明細書に記載の多量体Ｔｉｅ２アゴニストは、インビトロまたはインビボで細胞Ｔｉｅ２レベルを有意に低下させないという追加の予想外の利点を有することができる。さらに、本明細書に記載の多量体Ｔｉｅ２アゴニストは、硝子体内注射用に製剤化することができ、有利な薬物動態およびそれによる薬力学を付与する分子サイズを有する。多量体Ｔｉｅ２アゴニストが内皮細胞膜透過性を低下させ、細胞－細胞接合を強化することを示すデータが提供される（例えば、実施例１０を参照のこと）。
一局面において、本発明は、Ｔｉｅ２に結合する抗体に部分的に基づく。特に、本明細書では、２つ以上の抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片、例えば（限定されるものではないが）抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂを含む結合剤（本明細書ではコンジュゲートとも称する）が提供される。結合剤は、細胞表面に位置するＴｉｅ２へのＴｉｅ２結合剤の結合がＴｉｅ２活性化に関連するように、４を超える（例えば、５、６、７、８、９または１０を含む）抗Ｔｉｅ２抗体、例えば４を超える抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂを含むことが好ましい場合がある。Ｔｉｅ２クラスター化は、Ｔｉｅ２への結合剤の結合時にも起こり得る。
いくつかの実施形態において、タンパク質表面上のＴｉｅ２に結合すると、細胞表面上のＴｉｅ２タンパク質レベルを有意に低下させないＴｉｅ２結合剤を有することが好都合である。いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２を活性化するＴｉｅ２結合剤は、約０．１μＭ～１０μＭの範囲のＴｉｅ２に対する親和性を有する抗Ｔｉｅ２抗体（Ｆａｂ）を含む。
Ｔｉｅ２タンパク質の活性化は、当業者に容易に公知の材料および方法を用いて、Ｔｉｅ２タンパク質のリン酸化の増加（例えば、ウエスタンブロットによって）を測定することによって、または関連するＡｋｔタンパク質のリン酸化の増加（ＡＫＴセリン／トレオニンキナーゼ１、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０１４４３１）を測定することによって、インビトロで測定することができる。特定の実施形態において、Ｔｉｅ２に結合する抗体、ならびにＴｉｅ２に結合する２以上の抗体を含む組成物が提供される。本発明の複数の抗体を含む抗体および組成物は、例えば、Ｔｉｅ２機能に関連する、特に眼の血管透過性障害の診断または処置に有用である。
Ａ．例示的な抗Ｔｉｅ２結合剤
一局面において、本発明は、Ｔｉｅ２に結合する単離された抗体を含むＴｉｅ２結合剤を提供する。いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、アームの各々が抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片にコンジュゲートまたは連結されている多アーム部分を含む。好ましい実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂである。多アーム部分の例としては、多アーム型ポリオール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ＩｇＭ、および多量体、例えば六量体ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、２以上の抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片を含むＴｉｅ２結合剤が提供され、ここで、抗Ｔｉｅ２抗体（Ｔｉｅ２結合剤の一部ではなく、任意に全長抗体としてフォーマットされている場合）は、１００μＭ未満、または５０μＭ未満、または１０μＭ未満のＫＤおよび／または１μＭを超えるＫＤ等の親和性でＴｉｅ２に結合する。親和性は、２以上の抗Ｔｉｅ２抗体を含むＴｉｅ２結合剤ではなく、抗体を使用して測定されることが理解される。いくつかの実施形態において、親和性は一価親和性である。さらに、Ｔｉｅ２活性を活性化（例えば、Ｔｉｅ２アゴニストとして機能）するＴｉｅ２結合剤およびＴｉｅ２抗体が提供される。Ｔｉｅ２の活性化は、例えば、インビトロアッセイにおいてＴｉｅ２のリン酸化の増加および／またはＡＫＴのリン酸化の増加を測定することによって測定される。いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、細胞内のＴｉｅ２タンパク質レベルを約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、または８５％を超えて下方制御しない（低下させない）。代替の実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、細胞内のＴｉｅ２タンパク質レベルを約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７５％未満低下させる。いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は血管透過性を低下させる。血管内皮細胞透過性の低下は、インビトロまたはインビボで測定することができる。いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、Ｔｉｅ２の細胞－細胞接合部への移行を増加させ、および／またはアクチンおよび／またはカドヘリンの構造的組織化を促進し得る。好ましい実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、６のアームの各々が抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂにコンジュゲートされている六量体ＰＥＧ分子を含む。あるいは、ＰＥＧ分子は８のアームを含む。いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片を２つ以上含む。本発明はまた、Ｔｉｅ２に結合する抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片を提供する。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片は、Ｔｉｅ２のＩｇ２ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸残基２３～１２０内に少なくとも部分的に存在するエピトープに対して）に結合する。
一局面において、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである、配列番号５；配列番号６；または配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；（ｆ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５または６のＣＤＲを含むＴｉｅ２またはその抗原結合断片に特異的に結合する抗体を提供する。特定の実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は配列番号７を含む。
一局面において、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、少なくとも１、少なくとも２、または３つ全てのＶＨドメインＣＤＲ配列を含む抗体を提供し、ここで、Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである。上記置換の全ての可能な組合せは、配列番号５のコンセンサス配列に包含される。一実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される、少なくとも１、少なくとも２、または３つ全てのＶＬドメインＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施形態において、ＶＬドメインは、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む ＣＤＲ－Ｌ２；および（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。
別の態様において、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである配列番号５；配列番号６；および配列番号７から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全てのＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメインおよび（ｂ）（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全てのＶＬ ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
他の態様において、本発明は、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；を含むＶＨドメインおよび（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
上記の実施形態のいずれにおいても、抗Ｔｉｅ２抗体はヒト化され得る。一実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、前記の実施形態のいずれかと同様にＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、上記の実施形態のいずれかのＣＤＲを含み、配列番号１１のＶＨフレームワークＦＲ１配列、配列番号１２のＶＨフレームワークＦＲ２配列、配列番号１３のＶＨフレームワークＦＲ３配列、および／または配列番号１４のＶＨフレームワークＦＲ４配列をさらに含む。他の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号１５のＶＬフレームワークＦＲ１配列、配列番号１６のＶＬフレームワークＦＲ２配列、配列番号１７のＶＬフレームワークＦＲ３配列、および／または配列番号１８のＶＬフレームワークＦＲ３配列を含む。
他の局面において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗原結合断片、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比較して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｔｉｅ２に結合する能力を保持する。特定の実施形態において、配列番号２０において合計で１～１０個のアミノ酸が置換、挿入、および／または欠失している。特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。任意に、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号２０のＶＨ配列を含み、これにはその配列の翻訳後改変が含まれる。特定の実施形態において、ＶＨは、以下：（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３から選択される、１、２、または３つのＣＤＲを含む。
他の局面において、抗Ｔｉｅ２抗体が提供され、ここで、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比較して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗Ｔｉｅ２抗体は、Ｔｉｅ２に結合する能力を保持する。特定の実施形態において、配列番号２１において合計で１～１０のアミノ酸が置換、挿入、および／または欠失している。特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲ内で）生じる。任意に、抗Ｔｉｅ２抗体は、配列番号２１のＶＬ配列を含み、これにはその配列の翻訳後改変が含まれる。特定の実施形態において、ＶＬは、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、および（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１、２、または３つのＨＶＲを含む。
他の局面において、抗Ｔｉｅ２抗体が提供され、ここで、抗体は、上記に提供される実施形態のいずれかにあるようなＶＨ、および上記に提供される実施形態のいずれかにあるようなＶＬを含む。一実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号２０および配列番号２１のＶＨ配列およびＶＬ配列を含み、これにはそれらの配列の翻訳後改変が含まれる。
さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗Ｔｉｅ２抗体と同一エピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の実施形態において、配列番号２０のＶＨ配列および配列番号２１のＶＬ配列を含む抗Ｔｉｅ２抗体と、同一エピトープに結合する抗体が提供される。特定の実施形態において、Ｔｉｅ２の断片内のエピトープ、例えばＴｉｅ２のＩｇ１ドメインに結合する抗体が提供され、ここで、Ｉｇ１ドメインは配列番号１のアミノ酸２３～１２０を含む。
本発明のさらなる態様において、上記の実施形態のいずれかによる抗Ｔｉｅ２抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施形態において、抗ＴＩｅ２抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。他の実施形態において、抗体は、完全長抗体、例えば、本明細書において定義されるインタクトのＩｇＧ１抗体または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
さらなる態様において、前記の実施形態のいずれかに従った抗Ｔｉｅ２抗体は、以下のセクション１～７に記載されているように、単独でまたは組み合わせて、いずれかの特徴を組み込んでもよい。
１．抗体親和性
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、１０μＭ以下、１００μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下もしくは０．００１ｎＭ以下、および／または０．０１μＭ、０．１μＭもしくは１μＭ以上（例えば、１０－５Ｍ以下、１０－６Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、例えば１μＭ～１０μＭ、例えば０．１μＭ～１０μＭ、例えば１０－６Ｍ～１０－９Ｍ、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
一実施形態において、Ｋｄは、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態において、ＲＩＡは、関心のある抗体のＦａｂバージョンとその抗原を用いて実行される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、標識されていない抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識された抗原でＦａｂを平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートで結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２９３巻第８６５～８８１頁（１９９９年）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２～５時間にわたって室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］－抗原を、関心のあるＦａｂの連続希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」第５７巻第４５９３～４５９９頁（１９９７年）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ－１２の評価と一致する）。その後、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを確実にすることができる。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。次に、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したときに、シンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）の１５０μｌ／ウェルを添加し、プレートを１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントする。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
別の実施形態よれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたアッセイは、固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で～１０応答単位（ＲＵ）で実施する。一実施形態において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、当業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で希釈し、５μＬ／分の流量で注入する前に５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）に希釈して、結合タンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応性基をブロックする。動態測定のため、Ｆａｂの２倍連続希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、およそ２５μＬ／分の流量にて２５℃で０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中に注射する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ第３．２版）を使用して、会合センサグラムおよび解離センサグラムを同時に適合することによって、算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、ＣｈｅｎらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。上述の表面プラズモン共鳴アッセイによりオン速度が１０６Ｍ－１ ｓ－１を超える場合、オン速度を、ストップフローを装備した分光測色計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光測色計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される抗原の増加した濃度の存在下でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光クエンチ技法を使用することによって決定することができる。
２．抗体断片
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片、および以下に記載する他の断片が挙げられるがこれらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の参照には、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい；また、国際公開第９３／１６１８５号を参照されたい；および米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなったＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、アミノ酸「ＣＤＫＴＨＴ」（配列番号７５）、「ＣＤＫＴＨＬ」（配列番号７６）、「ＣＤＫＴＨ」（配列番号７７）、「ＣＤＫＴ」（配列番号７８）、「ＣＤＫ」または「ＣＤ」で終端する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、配列ＣＤＫＴＨＸ（配列番号７９）で終端し、Ｘは、Ｔを除く任意のアミノ酸である。Ｃ末端における切断および／または突然変異は、熱安定性または発現を損なうことなく、Ｆａｂに対するＡＨＡ反応性を低減または排除することができ得る。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片の重鎖のＣ末端は、アミノ酸「ＣＤＫＴＨＴＣ」（配列番号８０）、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ」（配列番号８１）、「ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＳ」（配列番号８２）、「ＣＤＫＴＨＴＳＰＰＣ」（配列番号８３）、「ＣＤＫＴＨＴＡＰＰＣ」（配列番号８４）、「ＣＤＫＴＨＴＳＧＧＣ」（配列番号８５）、または「ＣＹＧＰＰＣ」（配列番号８６）で終端する。いくつかのかかる実施形態において、Ｃ末端アミノ酸中の遊離システインは、コンジュゲーション、例えば、ＰＥＧ等のポリマーの影響を受け得る。
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディおよびテトラボディは、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）にも記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。
抗体断片は、本明細書に記載されているように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
３．キメラ抗体およびヒト化抗体
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親非ヒト抗体の特異性および親和性は保持するようにヒト化される。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体由来であり、かつＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列由来である１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化された抗体およびその作製方法については、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）で総説され、さらに以下に記載されている：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトを記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（リサーフェシングを記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルの「ガイド付き選択アプローチを記載する）。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；ならびにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）。
４．ヒト抗体
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して作製され得る。ヒト抗体は一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、免疫原を、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって調製されてもよい。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号および米国特許第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；および、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。かかる動物によって産生されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変されてもよい。
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）、およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載する）が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）およびＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来のファージ提示ライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製され得る。次いで、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技法は以下に記載されている。
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、１以上の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージ提示ライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。そのような方法については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）で概説し、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）にさらに記載されている。
特定のファージ提示法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリー中でランダムに再結合され、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されているように抗原結合ファージのスクリーニングを行うことができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、天然のレパートリは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）によって記載されているように、免疫化を行わずに、広範囲の非自己抗原およびまた自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、天然ライブラリーは、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されているように、インビトロで再配列を達成することによって、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、および同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
６．多重特異性抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、結合特異性の一方は、Ｔｉｅ２に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。特定の実施形態ニオイテ、二重特異性抗体は、Ｔｉｅ２の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、Ｔｉｅ２を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化することもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））、国際公開第ＷＯ９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）），を参照されたい）、および「ノブ・イントゥ・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されるものではない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（国際公開第２００９／０８９００４号Ａ１）；２つ以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）；二重特異性抗体を作製するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）；および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；および例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載される三重特異性抗体の調製によっても作製され得る。
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を有する設計された抗体もまた、ここに含まれる。（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）
本明細書の抗体または断片には、Ｔｉｅ２および他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」もまた含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照）。
７．抗体バリアント
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終構築物が、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。
ａ）置換、挿入、および欠失バリアント
特定の実施形態において、１以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換による突然変異誘発に関して目的の部位には、ＨＶＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載されるとおりである。アミノ酸置換が目的とする抗体に導入され、生成物が所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。
Figure 2023519213000006
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
一種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般的に、さらなる試験ために選択される結果として生じるバリアント（複数可）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の修正（例えば、改善）を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有する。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージ提示に基づく親和性成熟技法を使用して、簡便に生成され得る。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が突然変異され、バリアント抗体がファージ上に提示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
抗体親和性を向上させるために、例えば、ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）を行ってもよい。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）、および／または抗原と接触する残基内で行われ得、結果として得られるバリアントＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーの構築およびそこからの再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性が、様々な方法（例えば、エラー－プローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のうちのいずれかによって、成熟させるために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）がランダム化されるＣＤＲ指向手法を含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニン走査突然変異誘発またはモデル化を用いて、特異的に同定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。
特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１以上のＣＤＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保守的な改変（例えば、本明細書で提供されるような保守的な置換）は、ＣＤＲにおいて行われてもよい。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ中の抗原接触残基の外側であってもよい。上記で提供された変異体ＶＨおよびＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＣＤＲは、改変されていないか、または１以上、２以上、または３以上のアミノ酸置換を含まない。
突然変異誘発を標的とし得る抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。このような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。バリアントを、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングしてもよい。
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体のＮ末端またはＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの融合が含まれる。
ｂ）グリコシル化バリアント
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化されている程度を増加または減少させるように変化する。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に付着される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な糖質、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸の他、二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれうる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変は、特定の改良された特性を有する抗体変異体を作成するために行われてもよい。
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体内のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、および高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって判定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列のバリエーションに起因して、２９７位から上流または下流に±３アミノ酸、すなわち２９４位から３００位の間に位置する場合もある。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠乏」抗体バリアントに関する刊行物の例としては：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；同第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；同第２００２／０１６４３２８号；同第２００４／００９３６２１号；同第２００４／０１３２１４０号；同第２００４／０１１０７０４号；同第２００４／０１１０２８２号；同第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；同第２００３／０８４５７０号；同第２００５／０３５５８６号；同第２００５／０３５７７８号；同第２００５／０５３７４２号；同第２００２／０３１１４０号；ＯｋａｚａｋｉらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。デフコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；および国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えばα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；および国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）。
さらに、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された二分岐オリゴ糖を有する抗体バリアントが提供される。そのような抗体バリアントは、低減されたフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；および国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ｃ）Ｆｃ領域バリアント
特定の実施形態において、１以上のアミノ酸改変が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域変異体が生成され得る。Ｆｃ領域変異体は、１以上のアミノ酸位置でアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、本発明は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有することにより、インビボでの抗体の半減期が重要ではあるが、特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣ等）が不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異体を企図する。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／消失を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ（ＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、Ｆｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、およびＦｃ（ＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ＩらＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照されたい）、およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９～１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，ＭらＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的または追加的に、関心のある分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルで評価することができる。また、抗体がＣ１ｑに結合することができず、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．らＢｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）、ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の決定はまた、当技術分野で知られている方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）参照）。
エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９において１つ以上の置換を含むものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５および２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲに対する結合が改善または減少したある特定の抗体バリアントが記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号，およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい。）
特定の実施形態において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、改変は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、改変された（すなわち、改善されたまたは減少したのいずれか）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらすＦｃ領域において行われる。
半減期が増大し、胎生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が向上した、母体ＩｇＧを胎児に移行する役割を果たす抗体（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃバリアントは、Ｆｃ領域残基の１つ以上：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するバリアントを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、および国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
ｄ）システイン操作抗体バリアント
特定の実施形態において、抗体の１以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン人工抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、それは、本明細書でさらに説明するように、例えば薬物部分またはリンカー－薬物部分等の他の部分に抗体をコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用され得る。特定の実施形態において、任意の１以上の下記の残基が、システインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（ＥＵナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
ｅ）抗体誘導体
特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で公知であり、容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であっても、異なった分子であってもよい。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／またはタイプは、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等の考慮事項に基づいて決定することができる。
他の実施形態において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体および非保護性部位の抱合体が提供される。一実施形態において、非保護性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００－１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であってもよく、通常の細胞に害を与えないが、抗体非保護性部位に近位の細胞が死滅する温度まで非保護性部位を加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
Ｂ．組換え方法および組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組換え法および組成物を使用して生成されてもよい。一実施形態において、本明細書に記載される抗Ｔｉｅ２抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを構成するアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしていてもよい。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む１以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、（例えば、形質転換された）以下を含む：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸と、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターとを含むベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体を作製する方法が提供され、ここで、方法は、前記のように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、および任意に宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
抗Ｔｉｅ２抗体の組換え産生のために、例えば、上記のもの等の、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。このような核酸は、従来の手順を用い（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離され、配列決定されてもよい。
抗体コードベクターのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化およびエフェクター機能が必要とされていない場合には、細菌中で産生されてもよい。バクテリアにおける抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、および同第５，８４０，５２３号を参照。（大腸菌における抗体断片の発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）発現後、本発明の抗体は、細菌細胞ペーストから可溶性画分で単離されてもよく、さらに精製されてもよい。
原核生物に加えて、糸状菌や酵母等の真核生物は、抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現宿主として適しており、その中には、グリコシル化経路が「ヒト化」された菌株や酵母株が含まれ、その結果、部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体が産生される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、およびＬｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
また、グリコシル化抗体を発現させるのに適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、昆虫細胞と組み合わせて使用することができ、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。
脊椎動物細胞も、宿主として使用することができる。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））に記載される２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）エラー! ブックマークが定義されていません。に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカ緑猿腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；水牛ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；およびＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳類宿主細胞株のレビューについては、例えば、Ｙａｚａｋｉおよび Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）。
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗Ｔｉｅ２抗体は、それらの物理的／化学的特性および／または生物学的活性について、当該技術分野において既知である様々なアッセイによって、特定され、スクリーニングされ、または特性評価されてもよい。
１．結合アッセイおよび他のアッセイ
一局面において、本発明の抗体は、その抗原結合活性について、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣｏｒｅ（登録商標）、ＦＡＣＳ、またはウエスタンブロット等の公知の方法によって試験される。
他の局面では、競合アッセイを使用して、Ｔｉｅ２への結合について配列番号２０の配列を含むＶＨおよび配列番号２１の配列を含むＶＬを含む抗Ｔｉｅ２抗体（本明細書ではＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦと称する）と競合する抗体を同定することができる。特定の実施形態において、そのような競合抗体は、配列番号２０の配列を含むＶＨおよび配列番号２１の配列を含むＶＬを含む抗Ｔｉｅ２抗体によって結合される同一エピトープ（例えば、線状エピトープまたは立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，」ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。
例示的な競合アッセイでは、固定化されたＴＩｅ２が、Ｔｉｅ２に結合する第１の標識抗体（例えば、Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ）と、ＴＩｅ２への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験されている第２の未標識抗体とを含む溶液中で、インキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、固定化されたＴｉｅ２は、第１の標識抗体を含む溶液中でインキュベートされるが、第２の非標識抗体を含む溶液中ではインキュベートされない。第１の抗体のＴｉｅ２への結合を許容する条件下でインキュベーションした後、過剰の未結合抗体を除去し、固定化されたＴＩｅ２に関連する標識の量を測定する。固定化されたＴＩｅ２に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗体がＴＩｅ２への結合について第１の抗体と競合していることを示している。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
２．活性アッセイ
一局面において、所望の生物学的活性を有するその抗ＴＩｅ２抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性には、例えば、Ｔｉｅ２またはその断片への結合、Ｔｉｅ２への結合についてＡｎｇ１および／またはＡｎｇ２と競合すること、Ｔｉｅ２タンパク質のリン酸化を活性化すること、Ａｋｔのリン酸化を活性化すること、および／または血管内皮細胞透過性の低下（インビボ、インビトロまたはエクスビボのいずれか）が含まれ得る。インビボおよび／またはインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体も提供される。特定の実施形態において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２活性化（抗Ｔｉｅ２コンジュゲート）活性を、例えばリン酸化－ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）アッセイによって決定するためのアッセイが提供され、ここで、抗Ｔｉｅ２コンジュゲートによるＡＫＴリン酸化の活性化は、コンジュゲートが活性化（アゴニスト）活性であることを示す。当業者に容易に知られているように、また、下記の実施例３に記載されるように、ＡＫＴの活性化は、例えば、リン酸化ＡＫＴに特異的な抗体を使用するリン酸化ＡＫＴのウエスタンブロット検出またはＦＲＥＴアッセイを含む様々な方法によって実証され得る。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはその抗体コンジュゲート、融合タンパク質もしくはポリマー製剤の安定性（例えば、熱安定性）を決定するためのアッセイが提供される。例えば、抗体、その抗体コンジュゲート、融合タンパク質、またはポリマー性製剤の安定性は、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、内在性タンパク質蛍光、示差走査熱量測定、分光法、光散乱（例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）および静的光散乱（ＳＬＳ）、自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）を使用して決定され得る。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２コンジュゲートの安定性を決定するためのアッセイが提供される。アッセイの安定性は、例えば、実施例１３に記載されているように、例えばキャピラリー電気泳動レーザー誘起蛍光（ＣＥ－ＬＩＦ）を使用して、本明細書に記載されているように決定することができる。
Ｄ．免疫コンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、もしくはそれらの断片）、または放射性同位体等の１つ以上の細胞傷害性薬剤と複合された本明細書における抗Ｔｉｅ２抗体を含む、免疫複合体を提供する。
Ｅ．コンジュゲート
本発明はまた、ポリオール等の１以上の異種性分子にコンジュゲートされる本明細書に提供される任意の抗Ｔｉｅ２抗体またはそのＴｉｅ２結合断片を含むコンジュゲートも提供する。
１．多アーム型ポリマー
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、多アーム型ポリマーと抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂまたはそのバリアントをコンジュゲートすることによって、本明細書に記載される抗Ｔｉｅ２抗体を誘導体化することによって行われ得る。所望のサイズでコンジュゲートを提供するか、または本明細書に記載される選択された平均分子量を有するいずれの多アーム型ポリマーが、本発明の抗体－ポリマーコンジュゲートの構築に用いるのに適していると理解されよう。
多くのポリマーは、医薬品で用いるのに適している。例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｕｓｅ，ｐｐ．４４１－４５１（１９８０）．本開示のいくつかの実施形態において、非タンパク質ポリマーは、本開示のコンジュゲートを形成するために使用される。非タンパク質ポリマーは、通常、親水性合成ポリマー、すなわち、実際には見出されないポリマーである。しかしながら、実際に存在し、組換えまたはインビトロ方法によって生成される、ポリマーはまた、天然源から単離されるポリマーであるように、有用であり得る。
いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体は、多アーム型ポリオールに、Ｆａｂまたはそのバリアントをコンジュゲートすること（例えば、共有結合すること）によって誘導体化される。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、１以上の多アーム型ポリオール、好ましくは６アーム型ポリオールに共有結合した本明細書に開示される１以上の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂまたはそのバリアントを含むコンジュゲートに関する。用いられるポリオールは、任意の水溶性ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーであり得、直鎖または分岐鎖を有し得る。好適なポリオールには、１以上のヒドロキシル位置に化学基、例えば１～４の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、それ故に、説明を簡略化するために、考察の残りの部分は、例示の実施形態に関し、用いられるポリオールがＰＥＧであり、ポリペプチドへのポリオールをコンジュゲートするプロセスは、「ＰＥＧ化」と称される。しかしながら、当業者であれば、他のポリオール、例えば、ポリ（プロピレングリコール）およびポリエチレン－ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧについて本明細書に記載されるものに類似したコンジュゲートのための技術を使用して用いることができることが理解されよう。
本開示のコンジュゲートを形成するために使用されるポリオールは、多アーム型ポリオールである。本明細書で使用される場合、「多アーム型ポリオール」は、少なくとも２つのアームを結合するコア構造を含むポリオールを指す。多アーム型ポリオールは、例えば、二量体（２アーム）、四量体（４アーム）、六量体（６アーム）、八量体（８アーム）等であり得る。いくつかの局面において、多アーム型ポリオールは、多アーム型ＰＥＧである。
抗Ｔｉｅ２抗体および抗体バリアントのＰＥＧ化に使用される多アーム型ＰＥＧの重量平均分子量は異なっていてもよく、典型的には、約５００～約３００，０００ダルトン（Ｄ）の範囲におよび得る。いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧの重量平均分子量は、約１，０００～約１０万Ｄ、約１，０００～約４万Ｄ、約１，０００～約２万Ｄ、約１，０００～約１万Ｄ、約１万～約２万Ｄ、約５，０００～約１万Ｄまたは約１，０００～５，０００Ｄである。好ましい実施形態において、ＰＥＧ化は、約６，０００Ｄの重量平均分子量を有する多アーム型ＰＥＧを用いて行われる。
タンパク質をＰＥＧ化するための種々の方法は、当該技術分野で公知である。ＰＥＧにコンジュゲートしたタンパク質を産生する具体的な方法としては、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，９３５，４６５号および米国特許第５，８４９，５３５号が挙げられ、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。典型的には、タンパク質は、タンパク質のアミノ酸残基のうちの１つ以上を介してポリマー上の末端反応性基と共有結合している。反応性基（複数可）を有するポリマーは、活性化または官能性化ポリマー（例えば、官能性化ＰＥＧ）として本明細書に示される。反応性基は、抗体または抗体変異体上の遊離スルフヒドリルまたはアミノまたは他の反応性基と選択的に反応する。多アーム型ＰＥＧポリマーは、ランダムまたは部位特異的様式のいずれかで抗体または抗体変異体上のスルフヒドリルまたはアミノまたは他の反応性基と結合し得る。しかしながら、最適結果を得るために、選択される反応性基の型および量、ならびに用いられるポリマーの型および量が、抗体上の多すぎる活性基と反応する反応性基を有することを制限し、好ましくは実質的には回避するために用いられる特定の抗体または抗体変異体に応じて異なることが理解されよう。場合によっては、これを十分に制限または回避することが可能でない場合があるため、典型的には、約０．０５～約１０００モル、またはいくつかの実施形態において、抗体濃度に応じて、抗体の１モル当たり約０．０５～約２００モルの官能化ポリマーが、用いられ得る。抗体の１モル当たりの官能化ポリマーの最終量は、最適活性を維持するための平衡であるが、可能であれば、抗体の硝子体液、網膜、および／または房水半減期を同時に最適化する。
残基は、Ｎ末端アミノ酸基等の抗体または抗体バリアント上の任意の反応性アミノ酸であり得るが、いくつかの実施形態では、反応性アミノ酸はシステインであり、これは、例えば、国際公開第９９／０３８８７号、国際公開第９４／１２２１９号、国際公開第９４／２２４６６号、米国特許第５，２０６，３４４号、米国特許第５，１６６，３２２号および米国特許第５，２０６，３４４号に示されているように、その遊離チオール基を介して官能化ポリマーの反応性基に連結されており、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。かかる実施形態において、ポリマーは、親抗体上の遊離スルフヒドリルまたはチオール基（複数可）と特異的に反応することができる少なくとも１つの末端反応性基を含み得る。かかる基としては、とりわけ、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、－ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、およびパラ－ニトロフェニルカルボネートが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーは、選択されたカップリング系の化学に適した任意のプロトコル、例えば、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第７，１２２，６３６号、およびＪｅｖｓｅｖａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｊ．、Ｖｏｌ．５、ｐｐ．１１３－１２８（２０１０）に記載されているプロトコルおよびシステムを使用して親抗体にカップリングされ得る。あるいは、反応性アミノ酸は、リジン（その遊離エプシロン－アミノ基を介して官能化ポリマーの反応性基に連結される）（例えば、国際公開第９３／００１０９号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）であり得るか、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸（アミド結合を介して重合体に連結される）であり得る。次いで、ポリマーの反応性基は、例えば、共有結合を形成するために、タンパク質のα（アルファ）およびε（エプシロン）アミンまたはスルフヒドリル基と反応させることができる。本開示が、抗体または抗体断片とポリマーとの間の任意の特定のタイプの連結を使用するコンジュゲートに限定されないことが理解されよう。
本開示のコンジュゲートを調製するのに用いるために好適な官能化多アーム型ＰＥＧは、多くの従来の反応によって生成され得る。例えば、ＰＥＧのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ－ＮＨＳ－ＰＥＧ）は、ＰＥＧ－モノメチルエーテルから、ＢｕｃｋｍａｎｎおよびＭｅｒｒ，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，Ｖｏｌ．３９，Ｉｓｓｕｅ １８２，ｐｐ．１３７９－－１３８４（１９８１）の方法に従って、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によって調製することができる。加えて、ＰＥＧ末端ヒドロキシ基は、例えば、臭化チオニルと反応させて、ＰＥＧ－Ｂｒを形成した後、過剰のアンモニアでアミノ分解して、ＰＥＧ－ＮＨ２を形成することによって、アミノ基に転換することができる。次いで、ＰＥＧ－ＮＨ２を、ウッドワード試薬Ｋ等の標準的なカップリング試薬を使用して、目的の抗体または抗体バリアントにコンジュゲートすることができる。さらに、ＰＥＧ末端－ＣＨ２ＯＨ基は、例えば、ＭｎＯ２による酸化によってアルデヒド基に変換することができる。アルデヒド基は、水素化シアノホウ素等の試薬を用いる還元性アルキル化によって抗体または抗体変異体にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）：
Figure 2023519213000007
（式中、ＰＥＧは同じまたは異なる－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－であり、ここで、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを表し、独立して、約４５～約１０００、約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり；ｌは２以上の整数であり、好ましくは２または３である）の構造を有する。
いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）の構造を有し、ｌは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。他の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉ）の構造を有し、ｌは、３であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。
一般式（Ｉ）の構造を有する多アーム型ＰＥＧは、例えば、官能化多アーム型ＰＥＧを生成するために上述の技術のうちのいずれかを用いて、抗体（例えば、抗体断片）と反応するか、またはこれにコンジュゲートするのに適している末端反応性基と結合するように官能化され得る。しかしながら、他の実施形態において、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許７，１２２，６３６号に記載されているように、多アーム型ＰＥＧは、ＰＥＧおよび連結される抗体または抗体バリアントの１以上のアミノ酸残基と反応する多官能性架橋剤を介して抗Ｔｉｅ２抗体に共有結合され得る。
他の局面において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、少なくとも１の末端反応性基を含む官能化多アーム型ＰＥＧである。末端反応性基は、本開示のコンジュゲートを形成するために、抗Ｔｉｅ２抗体に直接コンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）：
Figure 2023519213000008
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、約３～約２５０、または約５０～約２００、または約２０～３０、または約１００～約１５０の整数であり、ｎは、約１～約１０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、かつ少なくとも１つのＲ２は、末端反応性基である）の構造を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、２～３の整数である。好ましい実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。他の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、３であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。好ましい実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、図３９に示すように２である。
他の実施形態において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）：
Figure 2023519213000009
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、ｎは、約１～約１０の整数である）の構造を有する。
いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有し、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。他の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有し、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。他の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）の構造を有し、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。
他の局面において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩ）：
Figure 2023519213000010
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、ｎは、約１～約１０の整数である）の構造を有する。
いくつかの実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。他の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。他の実施形態において、多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。
他の実施形態において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶ）：
Figure 2023519213000011
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数である）の構造を有する。
一般式（Ｉ）～（ＩＶ）のうちのいずれかの構造を有する多アーム型ＰＥＧは、例えば、官能化多アーム型ＰＥＧを生成するために上述の技術のうちのいずれかを用いて、抗体（例えば、抗体断片）と反応するか、またはこれにコンジュゲートするのに適している末端反応性基と結合するように官能化され得る。しかしながら、他の実施形態において、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許７，１２２，６３６号に記載されているように、多アーム型ＰＥＧは、ＰＥＧおよび連結される抗体または抗体バリアントの１以上のアミノ酸残基と反応する多官能性架橋剤を介して抗Ｔｉｅ２抗体に共有結合され得る。
他の局面において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される多アーム型ＰＥＧは、少なくとも１の末端反応性基を含む官能化多アーム型ＰＥＧである。末端反応性基は、本開示のコンジュゲートを形成するために、抗Ｔｉｅ２抗体に直接コンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）：
Figure 2023519213000012
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、ｎは、約１～約１０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、かつ少なくとも１のＲ２は、末端反応性基である）の構造を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、１～３の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、１であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。他の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。他の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有し、ｎは、３であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。かかる実施形態において、八量体は、一般式（Ｉｂ）：
Figure 2023519213000013
（式中、ｍ、Ｒ１、およびＲ２は、上に定義されるとおりである）の構造を有する。
一般式（Ｉｂ）の構造を有する多アーム型ＰＥＧは、ジペンタエリスリトール（ＤＰ）コア構造を有し、本明細書において、ＤＰ六量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉｂ）または（Ｉｃ）の構造を有し、各Ｒ１は、存在する場合、同一または異なっており、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000014
Figure 2023519213000015
（式中、各ｉは独立して０～１０の整数であり；ｊは０～１０の整数であり；Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである）；ならびにこれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉｂ）または（Ｉｃ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000016
であり、式中、ｉ、ｊ、およびＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000017
であり、式中、ｉは、２であり；ｊは、２または３であり；Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉｂ）の構造を有し、各Ｒ２は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、－ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、およびパラ－ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000018
であり、式中、ｉおよびｊは、上記に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000019
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２である。
他の局面において、本開示のコンジュゲートを調製するために使用される官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）：
Figure 2023519213000020
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、ｎは、約１～約１０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、かつ少なくとも１つのＲ２は、末端反応性基である）の構造を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、ｎは、２～６の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、ｎは、３である。別の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。他の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。一般式（ＩＩａ）の構造を有する八量体は、ヘキサグリセリン（ＨＧ）コア構造を有し、本明細書において、ＨＧ八量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ１は、存在する場合、同一または異なっており、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000021
Figure 2023519213000022
（式中、各ｉは独立して０～１０の整数であり；ｊは０～１０の整数であり；Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである）；ならびにこれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000023
であり、式中、ｉ、ｊ、およびＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000024
であり、式中、ｉは、２であり；ｊは、２または３であり；Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ２は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、－ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、およびパラ－ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000025
であり、式中、ｉおよびｊは、上記に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000026
であり、式中、ｉは、２であり、ｊは、２である。
他の局面において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）：
Figure 2023519213000027
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、または約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、ｎは、約１～約１０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、かつ少なくとも１のＲ２は、末端反応性基である）の構造を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、ｎは、２～６の整数である。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、ｎは、２であり、多アーム型ＰＥＧは、四量体である。他の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、ｎは、４であり、多アーム型ＰＥＧは、六量体である。他の実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、ｎは、６であり、多アーム型ＰＥＧは、八量体である。一般式（ＩＩＩａ）の構造を有する八量体は、ヘキサグリセロール（ＨＧＥＯ）コア構造を有し、本明細書において、ＨＧＥＯ八量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ１は、存在する場合、同一または異なっており、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000028
Figure 2023519213000029
（式中、各ｉは独立して０～１０の整数であり；ｊは０～１０の整数であり；Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである）；ならびにこれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000030
であり、式中、ｉ、ｊ、およびＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000031
であり、式中、ｉは、２であり；ｊは、２または３であり；Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ２は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、－ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、およびパラ－ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000032
であり、式中、ｉおよびｊは、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＩＩａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000033
であり、式中、ｉは、３であり、ｊは、２である。
他の局面において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）：
Figure 2023519213000034
（式中、各ｍは、ポリオール（ＰＥＧ）の特定のアームの長さまたはサイズを示し、独立して、約４５～約１０００、または約３～約２５０、または約５０～約２００、または約１００～約１５０の整数であり、各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり、各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり、かつ少なくとも１つのＲ２は、末端反応性基である）の構造を有する。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、独立して、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せから選択される。
一般式（ＩＶａ）の構造を有する多アーム型ＰＥＧは、ブタンジオールコア構造を有し、本明細書において、ＤＸ八量体とも称される。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、各Ｒ１は、存在する場合、同一または異なっており、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000035
（式中、各ｉは独立して０～１０の整数であり；ｊは０～１０の整数であり；Ｒ２は本明細書で定義されるとおりである）；ならびにこれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ１は、連結基である。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000036
であり、式中、ｉ、ｊ、およびＲ２は、本明細書に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000037
であり、式中、ｉは、２であり；ｊは、２または３であり；Ｒ２は、本明細書に定義されるとおりである。
いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、－ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、およびパラ－ニトロフェニルカルボネートから選択される。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセテートである。いくつかの実施形態において、各Ｒ２は、独立して、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸、およびこれらの組合せから選択される、ハロアセトアミドである。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、マレイミドである。
いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、各Ｒ２は、マレイミドである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000038
であり、式中、ｉおよびｊは、上記に定義されるとおりである。いくつかの実施形態において、官能化多アーム型ＰＥＧは、一般式（ＩＶａ）の構造を有し、Ｒ１およびＲ２は、一緒になった場合に、
Figure 2023519213000039
であり、式中、ｉは、３であり、ｊは、２である。
本開示での使用に適した他の官能化多アーム型ＰＥＧは、米国特許出願公開第２０１１／０２８６９５６号明細書、および米国特許出願公開第２０１５／００７３１５５号に記載されており、これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示で用いるのに適している官能化多アーム型ＰＥＧはまた、多くの製造供給元から購入することができる。例えば、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡは、マレイミド官能化ＰＥＧ六量体および八量体（例えば、６アーム（ＤＰ）－ＰＥＧ－ＭＡＬおよび８アーム（ＴＰ）－ＰＥＧ－ＭＡＬ）を販売している。ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐ．もまた、マレイミドで官能化されたＰＥＧ八量体（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＨＧＥＯ－４００ＭＡ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＤＸ－４００ＭＡ）、および四量体（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＰＴＥ－４００ＭＡ）を販売している。
特定の実施形態において、記載される多アーム型ＰＥＧの活性誘導体は、以下の一般式（ＩＶ）：
Figure 2023519213000040
の構造を有する多アーム型ＰＥＧの活性ＮＨＳエステル誘導体であり、式中、Ｒはジペンタエリスリトールである。
１．ポリオールコンジュゲート
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示される１以上の抗Ｔｉｅ２抗体または抗体バリアントおよび１以上の多アーム型ポリオールを含むコンジュゲート（例えば、Ｔｉｅ２結合剤）に関し、ここで、コンジュゲートは、少なくとも１の抗Ｔｉｅ２ ＦａｂまたはＦａｂバリアントをポリオールに共有結合させることによって調製される。いくつかの実施形態において、多アーム型ポリオールは、ＰＥＧである。好ましい実施形態において、ＰＥＧは六量体である。他の実施形態において、ＰＥＧは、八量体である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、一般式（Ｉａ）の構造を有する。
本開示のコンジュゲートは、各多アーム型ＰＥＧにコンジュゲートされた抗Ｔｉｅ２抗体（Ｆａｂ）の数によって特徴付けられ得る。これは、本明細書において、「ｆａｂ化」または「ｆａｂ化度」と称される。各ＰＥＧにコンジュゲートされた抗Ｔｉｅ２抗体の数は、以下を含む、様々な要因に応じて異なり得る：１）ＰＥＧ内のアームの数、２）ＰＥＧ上の末端反応性基の数および／または反応性、３）ＰＥＧのコア構造、および／または、４）ペグ化反応条件。コンジュゲートを調製するために使用される高い多分散性の多アーム型ＰＥＧは、場合によっては、最終コンジュゲートの分析を複雑にし、具体的には、１ＰＥＧ当たりのＦａｂの数の精密測定をさらに困難かつ不明確にし得る。したがって、コンジュゲートを形成するために使用されるＰＥＧは、典型的には、約１～約１．３５の範囲内で多分散性（当該技術分野で既知の方法を用いて決定される）を有し、様々な実施形態において、約１～約１．２５、約１～約１．２、約１～約１．１５、約１～約１．１、約１．０５、またはさらに約１の多分散性を有する。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、６アーム型ＰＥＧを含み、ここで、少なくとも１つの抗Ｔｉｅ２抗体またはバリアントは、ＰＥＧに共有結合している。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、６アーム型ＰＥＧを含み、ここで、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６の抗Ｔｉｅ２ ＦａｂがＰＥＧに共有結合している。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、８アーム型ＰＥＧを含み、ここで、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８の抗Ｔｉｅ２ ＦａｂがＰＥＧに共有結合している。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、６アーム型ＰＥＧを含み、ここで、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６の抗Ｔｉｅ２ ＦａｂがＰＥＧに共有結合している。いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、６アーム型ＰＥＧを含み、ここで、少なくとも４～６または５～６の抗Ｔｉｅ２ ＦａｂがＰＥＧに共有結合している。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、６アーム型ＰＥＧを含み、ここで、少なくとも４～６の抗Ｔｉｅ２ ＦａｂがＰＥＧに共有結合している。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、６アーム型ＰＥＧを含み、ここで、少なくとも４～６のまたは５の抗Ｔｉｅ２ ＦａｂがＰＥＧに共有結合している。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、または（ＩＶａ）のうちのいずれか１つの構造を有する多アーム型ＰＥＧを含む。かかる実施形態において、少なくとも１つのＲ２は、本明細書に記載される抗Ｔｉｅ２抗体またはバリアントに共有結合している。いくつかの実施形態において、一般式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＶａ）のいずれか１つの構造を有する多アーム型ＰＥＧは六量体であり、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または６つ全てのＲ２基が本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂまたはバリアントに共有結合している。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、多アーム型ポリオールが親抗体上の特異的部位（複数可）に共有結合している、すなわち、ポリマー結合が、親抗体または抗体断片中の特定の領域または特定のアミノ酸残基（複数可）を標的としている種を含む。標準的な変異誘発技術は、親抗体または抗体断片中の潜在的なペグ化部位の数および／または位置を変化させるために使用することができる。したがって、アミノ酸置換がシステインおよびリジン等のアミノ酸を導入または置換する程度まで、本開示の抗Ｔｉｅ２抗体およびそのバリアントは、天然配列抗Ｔｉｅ２よりも多いまたは少ない数の潜在的なＰＥＧ化部位を含むことができる。
上に論じられるように、ポリマーの部位特異的コンジュゲーションは、最も一般的には、親抗体または抗体断片中のシステイン残基への結合によって達成される。かかる実施形態において、カップリング化学は、例えば、親抗体におけるジスルフィド架橋にはないシステイン残基の遊離スルフヒドリル基を利用し得る。
いくつかの実施形態において、親Ｆａｂ中に天然に存在する１以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーコンジュゲーションのための結合部位（複数可）として使用される。他の実施形態において、Ｐｅｄｌｅｙら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．７０，ｐｐ．１１２６－１１３０（１９９４）に記載されているように、Ｆａｂまたはバリアント上の遊離アミノ基を２－イミノ－チオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）でチオール化し、次いで、例えばマレイミド官能化ＰＥＧに結合させることができる。他の実施形態において、１以上のシステイン残基（複数可）は、特異的結合部位（複数可）をポリマーに提供する目的のために、親Ｆａｂにおける選択された部位（複数可）に操作される。
システイン操作抗体は以前に記載されている（全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号およびＪｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３３２（ｌ－２）、ｐｐ．４１－５２（２００８））。いくつかの実施形態において、システイン操作抗体は、親抗体であり得る。これらは、特定の位置、典型的には、定常領域内で、例えば、ＣＬまたはＣＨ１において、遊離システインを有する抗体断片を生成するために有用である。システインを含むように操作された親抗体は、本明細書において、「チオＭａｂ」と称され、かかるシステイン操作抗体から産生されたＦａｂ断片は、産生の方法に関わらず、本明細書において、「チオＦａｂ」と称される。以前に記載されたように（例えば、米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号およびＪｕｎｕｔｕｌａ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３３２（ｌ－２）、ｐｐ．４１－５２（２００８））、置換（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体を、新たに導入された操作されたシステインチオール基の反応性について評価する。チオール反応性値は、０～１．０の範囲内の相対的な数値であり、任意のシステイン操作抗体に関して測定され得る。反応性チオール基を有することに加えて、チオＭａｂは、それらが抗原結合能力を保持されるよう選択されるべきである。システイン操作抗体の設計、選択、および調製は、以前に詳述されている（例えば、国際公開第２０１１／０６９１０４号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、操作されたシステインは、重鎖または軽鎖の定常ドメインに導入される。したがって、システイン操作抗体は、それらの野生型の親抗体対応物の抗原結合能力を保持し、したがって、抗原に特異的に結合可能である。
いくつかの実施形態において、本開示は、抗体断片－ポリマーコンジュゲートに関し、該抗原断片は、Ｆａｂであり、ポリマーは、軽鎖および重鎖を連結する鎖間ジスルフィド結合を通常形成し得るＦａｂ断片の軽鎖または重鎖内の１つ以上のシステイン残基に結合している。
他の局面において、本開示は、抗体断片－ポリマーコンジュゲートに関し、該抗原断片は、Ｆａｂ－Ｃであり、ポリマー結合は、Ｆａｂ－Ｃ断片のヒンジ領域を標的としている。いくつかの実施形態において、抗体断片のヒンジ領域中に天然に存在する１以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーを結合するために使用される。他の実施形態において、１以上のシステイン残基（複数可）は、ポリマーの特定の結合部位（複数可）を提供するためにＦａｂ－Ｃ断片のヒンジ領域に操作されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂは、ポリマーコンジュゲーションのための１つの結合部位を提供する目的で、Ｃ末端に１つのシステインを付加することによって改変される。他の実施形態において、本明細書に記載される抗ＴＩｅ２抗体Ｆａｂは、ポリマーコンジュゲーションの２つの結合部位を提供する目的でＣ末端に４つのさらなる残基、ＣＰＰＣ（配列番号８７）を付加することによって改変される。さらに他の実施形態において、本明細書に記載される抗ＴＩｅ２抗体Ｆａｂは、ポリマーコンジュゲーションの１つの結合部位を提供する目的でＣ末端に４つのさらなる残基、ＳＰＰＣ（配列番号８８）を付加することによって改変される。
ＰＥＧ化の度合いおよび部位はまた、官能化されたＰＥＧおよびタンパク質の濃度ならびにｐＨのような反応条件を調節することによって操作され得る。ＰＥＧ化の所望の度合いに適している条件は、標準的なペグ化反応のパラメータを変動させることによって実験的に決定され得る。
抗Ｔｉｅ２ ＦａｂおよびバリアントのＰＥＧ化は、任意の好都合な方法によって行う。好適なＰＥＧ化条件は、国際公開第２０１１／０６９１０４号および国際公開第０３／０２９４２０号に記載されており、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
３．ポリオールコンジュゲートの特性評価
ＰＥＧ化タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー－質量分析法、およびインビトロ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。ｆａｂ化の度合いは、典型的には、まず、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示される。１０％ ＳＤＳ中のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、溶出緩衝液として１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣ１ ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で実施される。どの残基がＰＥＧ化されているかを示すために、トリプシンおよびＬｙｓ－Ｃプロテアーゼ等のプロテアーゼを用いたペプチドマッピングを実施することができる。したがって、ＰＥＧ化抗体および非ＰＥＧ化抗体の試料を、Ｌｙｓ－Ｃプロテアーゼ等のプロテアーゼで消化し、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣ等の技術によって分離することができる。産生されたペプチドのクロマトグラフィーパターンは、抗Ｔｉｅ２ポリペプチドについて以前に決定されたペプチドマップと比較することができる。
次いで、各ピークをピーク中のコンジュゲートのサイズを証明するために質量分析法によって分析することができる。コンジュゲーションに使用されるＰＥＧ、およびピーク中のコンジュゲートのサイズに応じて、ＰＥＧにコンジュゲートされた抗体またはその変異体の数を推測することができる。ＰＥＧ基にコンジュゲートされた断片（複数可）は、通常、注入後にはＨＰＬＣカラムに保持されておらず、クロマトグラフから消失している。クロマトグラフからのそのような消失は、少なくとも１つのＰＥＧ化可能なアミノ酸残基を含んでいるに違いない特定の断片に対するペグ化を示している。ＰＥＧ化された抗Ｔｉｅ Ｆａｂは、当技術分野で工程の方法を用いて、Ｔｉｅ２と相互作用する能力、および他の生物学的活性についてさらにアッセイすることができる。
ＰＥＧ化は、抗体薬物の物理的および化学的特性を変化させ、改善された安定性、免疫原性の低減、循環寿命の延長、ならびに眼の滞留時間の増加のような改善された薬物動態挙動をもたらし得る。
いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、対応するコンジュゲートされていない抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂと比較して、単一の硝子体内注入を介しての哺乳動物の眼（例えばヒト）中への投与後、半減期の増加を有する。いくつかの実施形態において、半減期の増加は、対応するコンジュゲートされていない抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂの半減期の少なくとも１．４倍、または少なくとも１．８倍、または少なくとも２倍である。
３．コンジュゲートとしてのＩｇＭ多量体
いくつかの実施形態において、本開示のＴｉｅ２結合剤は、例えば、ＩｇＭ ＣＨ１ドメインのＣ末端を本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２抗体のＮ末端に（ペプチド結合を介して）融合するための組換え発現方法を使用して、本明細書に記載の２以上の抗Ｔｉｅ２抗体をＩｇＭ分子のＣＨ１ドメインに連結することによって作製することができる。ＩｇＭは、抗体治療薬の実行可能なフォーマットであることが証明されている（例えば、Ｈａｎａｌａ，２０１２，ＭＡｂｓ，４：５５５－５６１を参照のこと）。ＩｇＭの「単量体」構成要素は、各々が２のＩｇドメインを含有する２つの軽鎖（ＬＣ）と、５のＩｇドメインおよび短い非構造化Ｃ末端尾部片を含有する２つの重鎖（ＨＣ）とからなる。これらの４の鎖は集合して、ＨＣ－ＬＣヘテロ二量体のホモ二量体を形成する。その後、ホモ二量体は、共有結合してそれぞれ１０および１２の結合部位を含む５のホモ二量体およびＪ鎖（ＪＣ）（五量体）または６のホモ二量体（六量体）を含む環状構造になる。理論に束縛されるものではないが、複数の可変断片（Ｆｖ）の熱結合は、ＩｇＭが実質的な親和性成熟なしに標的に結合し、それによりセンチネル適応免疫受容体として機能することを可能にする。
特定の実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体はＦａｂである。ＩｇＭタンパク質（多量体）は、Ｊ鎖の存在下では五量体が形成され（５までの抗Ｔｉｅ２抗体を含むことができる）、Ｊ鎖の非存在下では六量体が形成される（５までの抗Ｔｉｅ２抗体を含むことができる）ように、Ｊ鎖を含んでいても含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、六量体は、（六量体を形成するための）ＩｇＭ重鎖と軽鎖との種々の比、または（五量体を形成するための）Ｊ鎖に対する重鎖と軽鎖との比によって生成される。したがって、いくつかの実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤は、Ｔｉｅ２を活性化することができる多量体を形成するために、ＩｇＭタンパク質と、本明細書に記載の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６の抗Ｔｉｅ２抗体とを含む多量体である。抗Ｔｉｅ２ ＩｇＭ分子を設計し、これは、Ｔｉｅ２活性を活性化することが示された（実施例７参照）。
本明細書に記載の組換えＩｇＭフォーマットを使用して構築された抗Ｔｉｅ２多量体コンジュゲートは、単一のＦａｂと比較して分子半径が比較的大きく、硝子体液から房水および血液への分子の拡散が遅くなる可能性があるため、眼治療に有用であり得る。以下の実施例７に記載されるように、光散乱による評価により、約１２ｎＭの流体力学半径（Ｒｈ）が見出され、六量体（約１０５０ｋＤ）の予測分子量は五量体（約９５０ｋＤ）の予測分子量をわずかに超えた。
眼治療薬の眼への活性を制限するために比較的迅速な全身性クリアランスを有することが望ましい可能性があるため、組換えＩｇＭ分子の全身半減期も調査した。実施例７に示すように、組換え発現されたＩｇＭ五量体および六量体は、静脈内注射後、ヒト血清から単離されたＩｇＭよりも迅速に除去された。これらの組換えＩｇＭ分子は、血清から単離されたＩｇＭよりもＮ結合型グリカンに対するシアル酸のパーセンテージが低いことがさらに決定され、このことから、組換え抗Ｔｉｅ２ ＩｇＭ分子のクリアランス速度が、Ｎ結合型グリコシル化におけるシアル酸のレベルを改変する発現系を設計することによって制御され得ることが示唆された。
ＩｇＭは、Ｃ１ｑを強力にリクルートし、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介して標的細胞殺傷を誘導することが以前に報告されている。そのような活性は、眼治療薬にとって望ましくない可能性がある。したがって、実施例７に記載されるように、ＩｇＭバリアントであるＰ４３４Ｇ（ＥＵナンバリング）が設計され、検出可能な補体活性を全て除去したことが示された。
３．コンジュゲートとしての六量体ペプチド多量体
各抗原結合剤を、天然に多量体を形成するペプチド、例えばＮＤＫペプチドに連結させることにより、複数の抗原結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を含むコンジュゲートも本開示に包含される。いくつかの実施形態において、本開示のＴｉｅ２結合剤は、本明細書に記載の２以上の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂをペプチド多量体に結合させることによって作製することができる。ペプチド多量体は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８のペプチドから構成され、これらは、組換え発現系で発現されると、複数のペプチドが天然に折り畳まれて、単一の多アーム構造を形成する。多量体を形成するペプチドを、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその断片）が多量体を形成するペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで発現される融合タンパク質として発現させるために、日常的な分子工学技術および材料が使用される。特定の実施形態において、多量体中の複数のペプチドは同一であり、発現ベクターは、本開示において教示されるように、ペプチドのＣ末端またはＮ末端を、抗Ｔｉｅ２抗体またはその断片のＮ末端またはＣ末端にそれぞれ（ペプチド結合を介して）連結するように構築される。
特定の実施形態において、多量体ペプチドのペプチドは、ホモ六量体四級構造を有する真核生物ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）酵素の一部である。ＮＤＫ１（例えば、配列番号６９）、ＮＤＫ２（例えば、配列番号７０）、ＮＤＫ３（例えば、配列番号７１）、ＮＤＫ４（例えば、配列番号７２）、ＮＤＫ５（例えば、配列番号７３）を含む、多量体を設計するために使用することができるいくつかのＮＤＫ酵素がある。好ましい実施形態において、ＮＤＫペプチドは、例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッションＰ２２８８７由来のＮＤＫ３ペプチドである。配列番号７４は、そのＣ末端でＮＤＫ３のＮ末端に連結されたＴｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦの配列を提供する。この好ましい実施形態において、Ｆａｂ軽鎖は配列番号２１を含む。（例えば、以下の実施例８を参照されたい。）
Ｅ．診断および検出のための方法および組成物
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗Ｔｉｅ２抗体はいずれも、生物学的試料中のＴｉｅ２の存在の検出に有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の実施形態において、生物学的試料は、網膜組織（光受容体ならびに下層の網膜色素上皮（ＲＰＥ）および脈絡毛細管板）等の細胞または組織を含む。
一実施形態において、診断または検出の方法で使用するための抗Ｔｉｅ２抗体が提供される。さらなる局面において、生物学的試料中のＴｉｅ２の存在を検出する方法が提供される。特定の実施形態において、方法は、抗Ｔｉｅ２抗体のＴｉｅ２への結合を許容する条件下で、生物学的試料を本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２抗体と接触させ、抗Ｔｉｅ２抗体とＴｉｅ２との間に複合体が形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ法またはインビボ法であってもよい。一実施形態において、例えば、Ｔｉｅ２が患者の選択のためのバイオマーカである場合、抗Ｔｉｅ２抗体を使用して、抗Ｔｉｅ２抗体での治療に適格な対象を選択する。
特定の実施形態において、標識化抗Ｔｉｅ２抗体が提供される。標識には、直接検出される標識または部位（例えば、蛍光標識、発色性標識、電子密度標識、化学発光標識、放射性標識等）、および酵素反応または分子間相互作用を介して間接的に検出される部位（例えば、酵素またはリガンド等）が含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的な標識には、以下のものが含まれる：放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ、希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体のようなフルオロフォア、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ、例えば ホタルルシフェラーゼおよび細菌性ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのような複素環オキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼのような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定したフリーラジカル、およびそのようなものと結合したもの。
Ｆ．医薬製剤
本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２抗体またはＴｉｅ２コンジュゲートの医薬製剤は、所望の純度を有するそのような抗Ｔｉｅ２抗体またはＴｉｅ２コンジュゲートを、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、１以上の任意選択の薬学的に許容され得る担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ（１９８０））と混合することによって調製される。薬学的に許容され得る担体は一般的に、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾール等）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等のアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容され得る担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一局面において、ｓＨＡＳＥＧＰを、１以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号および国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。
本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応症に必要な２つ以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、ＩＬ－６；ＩＬ－６Ｒ；ＩＬ－１３；ＩＬ－１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５およびα５β１；ベタセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ－２受容体；およびＡＭＤリスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａおよびＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン－８（ＩＬ－８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；およびＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される第２の生物学的分子をさらに提供することが望ましい場合がある。追加的または代替的に、第２の生物学的分子は、ＩＬ－６；ＩＬ－６Ｒ；ＩＬ－１３；ＩＬ－１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５およびα５β１；ベタセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ－２受容体；およびＡＭＤリスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａおよびＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン－８（ＩＬ－８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；およびＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。特定の実施形態において、さらなる化合物は、ＶＥＧＦおよび／またはＡｎｇ２および／またはＩＬ－１βに結合する抗体、またはその抗原結合断片である。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションに封入されてもよい。そのような技術が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）．に開示されている。
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、これらのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成することができる。
眼疾患または症状の予防または治療のための本明細書に記載されるコンジュゲートは、典型的には、眼、眼内、および／または硝子体内注射、および／または強膜近傍注射、および／またはテノン嚢下注射、および／または上脈絡叢（ｓｕｐｅｒｃｈｏｒｏｉｄａｌ）注射、および／または点眼剤および／または軟膏の形態での局所投与によって投与される。本開示のかかる組成物は、様々な方法、例えば、Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ ２００６）のような参照文献に記載されているものを含む、化合物の硝子体液中への遅い放出を可能にする装置および／またはデポーとして硝子体内に送達され得る。一例において、装置は、ミニポンプおよび／またはマトリクスおよび／または受動拡散システムおよび／または長い時間の間、化合物を放出するカプセル化細胞（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ ２００６）の形態であり得る。局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、および病巣内投与を含むが、これらに限定されない他の投与方法も使用され得る。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。
眼、眼内、または硝子体内投与のための製剤は、当該技術分野で既知の方法によって、既知の成分を使用して調製することができる。効果的な処置のための主たる必要条件は、眼を通る適切な透過である。薬剤が局所的に送達され得る眼球の前面の疾患と異なり、網膜疾患は、より部位特異的なアプローチを必要とする。点眼薬および軟膏は、眼の後部にほとんど浸透せず、血液眼関門が、全身投与された薬物の眼組織への浸透を妨げる。したがって、通常、ＤＭＥおよびＡＭＤ等の網膜疾患を処置するための薬物送達の最適な方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の症状、および送達される薬物の特性および半減期に依存する間隔で繰り返される。眼内（例えば硝子体内）浸透のためには、通常、より小さいサイズの分子が好ましい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体およびコンジュゲートは、移植可能ポート送達系（ＰＤＳ）を用いて送達のために製剤化され得る。上述のように、ＰＤＳは、硝子体への放出がチタンフリットを含む多孔性金属膜によって制御される再充填可能な装置である。そのリザーバーは低容量であるので、いくつかの実施形態において、高タンパク質濃度が、そのＰＤＳを用いる効果的な送達に必要である。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体およびコンジュゲートは、高濃度で製剤化される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体およびコンジュゲートは、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２１０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２３０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２６０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２７０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２８０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２９０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも３００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体およびコンジュゲートは、１５０ｍｇ／ｍｌ～３５０ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌ、１７０ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ～３００ｍｇ／ｍｌまたは１７０ｍｇ／ｍｌ～２２０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化され得る。
Ｇ．治療方法および組成物
本明細書で提供される任意の抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートを治療方法で使用することができる。本明細書において実施形態のいずれかによる「個体」、「患者」、または「対象」は、ヒトであり得る。
本開示の抗Ｔｉｅ２コンジュゲートは、哺乳動物を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートは、例えば、前臨床データを得る目的で、非ヒト哺乳動物に投与される。治療される例示的な非ヒト哺乳動物には、前非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、齧歯類、および臨床試験が行われる他の哺乳類動物が含まれる。かかる哺乳類動物は、抗体で処置される疾患の確立された動物モデルであり得、または目的の抗体の毒性を試験するために使用され得る。これらの実施形態の各々において、用量増加試験は、哺乳類動物に対して実施してもよい。
抗Ｔｉｅ２コンジュゲートは、非経口、皮下、腹腔内、硝子体内、肺内および鼻腔内、ならびに局所免疫抑制処置のために所望される場合、病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、硝子体内および皮下投与が含まれる。加えて、コンジュゲートは、パルス注入によって、特に抗体またはその抗体変異体またはその断片（例えば、抗原結合断片）の用量を低下させながら好適に投与される。いくつかの実施形態において、投薬は、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、静脈内または皮下注射等の注射によって行われる。
疾患の予防または治療のため、抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートの適切な投与量は、治療される疾患の種類、その疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、これまでの治療法、患者の臨床歴および抗体への反応、ならびに主治医の判断に応じて異なる。
疾患の種類および重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によって、または連続注入によって、約１～２５ｍｇ／眼（１眼当たり０．０１５ｍｇ／ｋｇ～０．３６ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与のための初回候補投薬量である。病態に応じて数日間以上にわたる反復投与の場合、治療は、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続される。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得る。この療法の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易モニタリングされる。例示の投薬レジメンは、国際公開第９４／０４１８８号において開示されている。
一局面において、医薬として使用するための抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートが提供される。さらなる局面において、眼疾患または障害の治療に使用するための抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、治療方法に使用するための抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートが提供される。特定の実施形態において、本発明は、有効量の抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートを個体に投与することを含む、眼疾患または障害を有する個体を処置する方法において使用するための抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートを提供する。このような一実施形態において、方法は、例えば以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、本発明は、血管内皮細胞膜の完全性を増加させるおよび／または血管漏出を減少させるのに使用するための抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートを提供する。特定の実施形態において、本発明は、血管内皮細胞膜の完全性を増加させるおよび／または血管漏出を減少させるために有効な抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートを個体に投与することを含む、個体において血管内皮細胞膜の完全性を増加させるおよび／または血管漏出を減少させる方法に使用するための抗Ｔｉｅ２抗体またはコンジュゲートを提供する。上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
本明細書で使用される 用語「眼障害」という用語は、病理学的血管新生および／または萎縮に関連する任意の眼障害（本明細書では互換的に「眼状態」とも称する）を含む。眼障害は、網膜または角膜等の眼組織の構造内への新生血管の増殖および／または浸潤の変化または非調節によって特徴付けることができる。眼障害は、網膜組織（光受容体ならびにその下の網膜色素上皮（ＲＰＥ）および脈絡毛細管板）の萎縮によって特徴付けることができる。
糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、糖尿病性網膜症（ＤＲ）と称する糖尿病の合併症によって引き起こされる。この眼状態は、１型または２型糖尿病と診断された人に起こり得る。ＤＭＥは、中心窩の中心の２の円板直径内の網膜肥厚として定義され、限局性またはびまん性のいずれかであり得る。ＤＭＥは、血液網膜関門を損なう網膜微小血管変化に関連し、周囲の網膜への血漿成分の漏出を引き起こし、網膜浮腫をもたらす。
非限定的な眼障害としては、例えば、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）（例えば、焦点、非中心ＤＭＥ、およびびまん性中心関与ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、および高所ＤＲ）、浮腫の非存在下での網膜症、他の虚血関連網膜症、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、中間型ＡＭＤ、進行型ＡＭＤ、および地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）（例えば、中心（ＣＲＶＯ）および分岐（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連する疾患、角膜血管新生、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患、中心漿液性網膜症（ＣＳＲ）、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノーリー病、骨粗鬆症－偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連する網膜異常、結膜下出血、ルベオーシス、眼血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫増殖、毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、血管炎、乳頭浮腫、網膜炎、例えば、非限定的にはＣＭＶ網膜炎、眼黒色腫、網膜芽細胞腫、結膜炎（例えば、感染性結膜炎および非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天性黒内障（レーバーの先天性黒内障またはＬＣＡとしても知られる）、ブドウ膜炎（感染性および非感染性ブドウ膜炎）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼のヒストプラズマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性眼損傷、シェーグレン病、および疾患または障害が眼血管新生、血管漏出、および／または網膜浮腫もしくは網膜萎縮に関連する他の眼疾患を含むがこれらに限定されない。さらなる例示的な眼障害には、網膜分離症（網膜神経感覚層の異常な分裂）、ルベオーシス（隅角の血管新生）に関連する疾患、および線維血管組織または線維組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患（増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む）が含まれる。
角膜血管新生に関連する例示的な疾患には、限定するものではないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズオーバーウェア、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片、乾性角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡（ａｃｎｅ ｒｏｓａｃｅａ）、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイクバクテリア感染症、脂肪変性症、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、原虫感染症、カポシ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、周辺角質溶解、リウマチ性関節炎、全身性紅斑、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン症候群、類天疱瘡、角膜放射状切開、および角膜移植後拒絶反応が含まれる。
血管漏出の増加、動脈瘤および毛細血管脱落を含む、脈絡膜新生血管形成および網膜血管系の欠陥に関連する例示的な疾患には、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染症（例えば、多焦点脈絡膜）、推定眼ヒストプラズマ症、ベスト病（硝子体黄斑変性）、近視、視神経乳頭、扁平部炎、網膜剥離（例えば、慢性網膜剥離）、過粘度症候群、トキソプラスマ症、外傷およびレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。
網膜組織の萎縮に関連する例示的な疾患（光受容体およびその下のＲＰＥ）には、萎縮性または非滲出性ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮または進行性乾燥型ＡＭＤ）、黄斑萎縮（例えば、新生血管形成および／または地図状萎縮に関連する萎縮）、糖尿病性網膜症、シュタルガルト病、Ｓｏｒｓｂｙ Ｆｕｎｄｕｓジストロフィー、網膜分離症および網膜色素変性症が含まれるが、これらに限定されない。
例えば、特定の実施形態において、前述の方法のいずれかは、１以上の追加の化合物を投与することをさらに含む。特定の実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤またはそのコンジュゲートもしくはポリマー製剤は、追加の化合物と同時に投与される。特定の実施形態において、Ｔｉｅ２結合剤またはコンジュゲートもしくはポリマー製剤は、追加の化合物の前または後に投与される。特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ－１β；ＩＬ－６；ＩＬ－６Ｒ；ＩＬ－１３；ＩＬ－１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５およびα５β１；ベタセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ－２受容体；およびＡＭＤリスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａおよびＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン－８（ＩＬ－８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；およびＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される第２の生物学的分子に結合する。特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合断片である。上の実施形態のいずれかに従った（または適用される）特定の実施形態では、眼疾患は、増殖性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性および他の虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、ＣＲＶＯおよびＢＲＶＯを含む網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、および未熟児網膜症（ＲＯＰ）からなる群から選択される眼内血管新生疾患である。例えば、いくつかの例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、例えば、ＲＧ－７７１６または国際公開第２０１０／０６９５３２号もしくは国際公開第２０１６／０７３１５７号に開示される任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体またはそのバリアント）である。他の例では、場合によっては、追加の化合物は、抗ＩＬ－６抗体、例えばＥＢＩ－０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；例えば、国際公開第２０１６／０７３８９０号を参照されたい。）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ＯＰＲ－００３、ＭＥＤＩ５１１７、ＰＦ－０４２３６９２１、またはそのバリアントである。なおさらなる例において、場合によっては、追加の化合物は抗ＩＬ－６Ｒ抗体、例えばトシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、国際公開第１９９２／０１９５７９号を参照されたい）、サリルマブ、ＡＬＸ－００６１、ＳＡ２３７またはそのバリアントである。
いくつかの例では、本開示のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲート、および／またはそのポリマー製剤を、眼障害、例えば本明細書に記載の眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のための少なくとも１つの追加の治療剤と組み合わせて投与することができる。眼障害を処置するための組合せ治療のための例示的な追加の治療剤としては、限定されないが、抗血管新生剤、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ））、可溶性受容体融合タンパク質（例えば、組換え可溶性受容体融合タンパク質ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ Ｅｙｅとしても公知）；リジェネロン／アベンティス））、アプタマー（例えば、抗ＶＥＧＦ ＰＥＧ化アプタマーＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム；ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））およびＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（１－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４－（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イルオキシ）－６－メトキシ－７－（３－ピロリジン－１－イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマキサミニブ（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）およびＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ））；トリプトファニル－ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）；スクアラミン；ＲＥＴＡＡＮＥ（登録商標）（デポー懸濁液用の酢酸アカンノルタベ；Ａｌｃｏｎ，Ｉｎｃ）；コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）；ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン－ｒｕ４８６）；サブテノントリアムシノロンアセトニド；硝子体内結晶トリアムシノロンアセトニド；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ（ＡＧ３３４０；Ｐｆｉｚｅｒ））；フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン眼内インプラントを含む；Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ／Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；リノミド；インテグリンβ３機能の阻害剤；アンジオスタチン、およびこれらの組合せが挙げられる。本発明のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートと組み合わせて投与することができるこれらおよび他の治療剤は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００１７２４４号に記載されている。
眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤と組み合わせて使用することができる追加の治療剤のさらなる例としては、限定されないが、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（バーテポルフィン；非熱レーザーを用いた光線力学的療法と併せて典型的に使用される光活性化薬物）、ＰＫＣ４１２、Ｅｎｄｏｖｉｏｎ（ＮＳ３７２８；ＮｅｕｒｏＳｅａｒｃｈ Ａ／Ｓ）、神経栄養因子（例えば、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ））、ジルチアゼム、ドルゾラミド、ＰＨＯＴＯＴＲＯＰ（登録商標）、９－シス－レチナール、点眼薬（例えば、ヨウ化ホスホリン、エコーチオフェートまたは炭酸脱水酵素阻害剤）、ベオバスタット（ＡＥ－９４１；ＡＥｔｅｒｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓｉｒｎａ－０２７（ＡＧＦ－７４５；Ｓｉｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）、ニューロトロフィン（例としてのみ、ＮＴ－４／５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃａｎｄ５（Ａｃｕｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＳ－３７２１７（Ｉｎｓｐｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インテグリンアンタゴニスト（Ｊｅｒｉｎｉ ＡＧおよびＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのものを含む）、ＥＧ－３３０６（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＢＤＭ－Ｅ（ＢｉｏＤｉｅｍ Ｌｔｄ．）、サリドマイド（例えば、ＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．によって使用される）、カルジオトロフィン－１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、２－メトキシエストラジオール（Ｏｒｇａｎ／Ｏｃｕｌｅｘ）、ＤＬ－８２３４（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＮＴＣ－２００（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）、テトラチオモリブデン酸塩（ミシガン大学）、ＬＹＮ－００２（Ｌｙｎｋｅｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、微細藻類化合物（Ａｑｕａｓｅａｒｃｈ／Ａｌｂａｎｙ，Ｍｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｄ－９１２０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｐｌｃ）、ＡＴＸ－Ｓ１０（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）、ＴＧＦ－β２（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｌｔｒｉｘ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、Ａｌｌｅｒｇａｎ、ＳＵＧＥＮまたはＰｆｉｚｅｒからのもの）、ＮＸ－２７８－Ｌ（ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏｐｔ－２４（ＯＰＴＩＳ Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ）、網膜細胞神経節神経保護剤（Ｃｏｇｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｎ－ニトロピラゾール誘導体（Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＫＰ－１０２（Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シクロスポリンＡ、光線力学療法に使用される治療剤（例えば、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）；受容体標的化ＰＤＴ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｃｏ．；ＰＤＴとロスタポルフィン、Ｍｉｒａｖｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＰＤＴとタラポルフィンナトリウム、Ｎｉｐｐｏｎ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ；およびモテキサフィンルテチウム、Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、Ｎｏｖａｇａｌｉ Ｐｈａｒｍａ ＳＡ ａｎｄ ＩＳＩＳ－１３６５０，Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより試験された製品）およびこれらの組合せが挙げられる。
Ｔｉｅ２結合剤またはコンジュゲート、および／またはそのポリマー製剤は、例えば、レーザー光凝固（例えば、汎網膜光凝固（ＰＲＰ））、ドルーゼンレーザー発振、黄斑円孔手術、黄斑転座手術、埋め込み型小型望遠鏡、ＰＨＩ運動血管造影法（マイクロレーザー治療およびフィーダー血管処置としても知られる）、陽子線療法、微小刺激療法、網膜剥離および硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経乳頭温熱療法、光化学系Ｉ療法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレーシス（膜分画濾過およびレオセラピーとしても知られる）、マイクロチップ移植、幹細胞療法、遺伝子置換療法、リボザイム遺伝子療法（低酸素応答エレメントの遺伝子療法を含む、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ；Ｌｅｎｔｉｐａｋ、Ｇｅｎｅｔｉｘ；およびＰＤＥＦ遺伝子療法、ＧｅｎＶｅｃ）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞を含む、Ｄｉａｃｒｉｎ，Ｉｎｃ．；網膜細胞移植、例えば、Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ ＵＳ，Ｉｎｃ．、ＲｅＮｅｕｒｏｎ、ＣＨＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、穿刺、およびそれらの組合せを含む、眼障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のための治療または外科的手順と組み合わせて投与され得る。
いくつかの例では、本発明のＴｉｅ２結合剤もしくはコンジュゲート、および／またはそのポリマー製剤を、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のための抗血管新生剤と組み合わせて投与することができる。任意の適切な抗血管新生剤を、限定されないが、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９－２５７，２０００によって列挙されたものを含む、本発明のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態において、抗血管新生剤は、限定するものではないが、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ－２５８（以前はＥＳＢ－１００８、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体断片；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＲＧ－７７１６等の抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体；Ｒｏｃｈｅ）））、可溶性組換え受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト））、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦＲ断片、ＶＥＧＦ（例えば、ペガプタニブ）またはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子阻害剤、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパーペゴール、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ／Ａｌｌｅｒｇａｎ）、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡ、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（１－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４－（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イルオキシ）－６－メトキシ－７－（３－ピロリジン－１－イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマキサミニブ（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）およびＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ））、およびこれらの組合せを含むＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの例では、その断片に対する抗Ｔｉｅ２抗体は、ＩＬ－１β；ＩＬ－６；ＩＬ－６Ｒ；ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５およびα５β１；ベタセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲ）；ＳＴ－２受容体；および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）リスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａおよびＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ－８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；およびＴＮＦＲＳＦ１０Ａを含むがこれに限定されない第２の生物学的分子を標的とする抗体もしくはその断片、または他の治療剤と組み合わせることができる。例えば、いくつかの例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、例えば、ＲＧ－７７１６または国際公開第２０１０／０６９５３２号もしくは国際公開第２０１６／０７３１５７号に開示される任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体またはそのバリアント）である。
眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のために抗Ｔｉｅ２コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤と組み合わせて投与され得る他の適切な抗血管新生剤としては、コルチコステロイド、血管新生抑制ステロイド、酢酸アカンコルターブ、アンギオスタチン、エンドスタチン、チロシンキナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、間質由来因子（ＳＤＦ－１）アンタゴニスト（例えば、抗ＳＤＦ－１抗体）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ガンマ－セクレターゼ、Ｄｅｌｔａ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）－１αアンタゴニスト、プロテインキナーゼＣＫ２アンタゴニスト、新生血管形成部位にホーミングする幹細胞（例えば、内皮前駆細胞）を阻害する薬剤（例えば、抗血管内皮カドヘリン（ＣＤ－１４４）抗体および／または抗ＳＤＦ－１抗体）、およびこれらの組合せが挙げられる。
さらなる例では、いくつかの例では、Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のための新生血管形成に対して活性を有する剤、例えば抗炎症薬、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、ラパマイシン、ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）（エベロリムス）およびＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）（テムシロリムス））、シクロスポリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦα抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、およびゴリムマブ）または可溶性受容体融合タンパク質（例えば、エタネルセプト））、抗補体剤、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、またはこれらの組合せと組み合わせて投与することができる。
なおさらなる例では、場合によっては、Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤を、神経保護的であり、潜在的に乾燥型ＡＭＤから湿潤型ＡＭＤへの進行を低下させることができる剤、例えばデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（商品名：ＰＲＡＳＴＥＲＡ（商標）およびＦＩＤＥＬＩＮ（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロンサルフェートおよびプレグネノロンサルフェート等の薬物を含む「ニューロステロイド」と呼ばれる薬物クラスと組み合わせて投与することができる。
任意の適切なＡＭＤ治療剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）を処置するために本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤と組み合わせて追加の治療剤として投与することができ、限定するものではないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ－２５８（以前はＥＳＢ－１００８、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体フラグメント；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体、例えばＲＧ－７７１６；；Ｒｏｃｈｅ））、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト））、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパル・ペゴル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ／Ａｌｌｅｒｇａｎ）、または抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体（例えば、ＲＥＧＮ２１７６－３）、抗ＰＤＧＦ－ＢＢペグ化アプタマー（例えば、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）；Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、可溶性ＰＤＧＦＲ受容体融合タンパク質、または二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＤＥ－１２０（Ｓａｎｔｅｎ）またはＸ－８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））または二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体））；光線力学的療法と組み合わせたＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；酸化防止剤；補体系アンタゴニスト、例えば補体因子Ｃ５アンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＡＲＣ－１９０５；Ｏｐｔｈｏｔｅｃｈ）または抗Ｃ５抗体（例えば、ＬＦＧ－３１６；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、プロパージンアンタゴニスト（例えば、抗プロパージン抗体、例えば、ＣＬＧ－５６１；Ａｌｃｏｎ）、または補体因子Ｄアンタゴニスト（例えば、抗補体因子Ｄ抗体、例えば、ランパリズマブ；Ｒｏｃｈｅ））；Ｃ３ブロッキングペプチド（例えば、ＡＰＬ－２、Ａｐｐｅｌｌｉｓ）；視覚サイクル調整剤（例えば、エミクススタット塩酸塩）；スクアラミン（例えば、ＯＨＲ－１０２；Ｏｈｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）；ビタミンおよびミネラル補助剤（例えば、加齢性眼疾患試験１（ＡＲＥＤＳ１；亜鉛および／または酸化防止剤）および試験２（ＡＲＥＤＳ２；亜鉛、酸化防止剤、ルテイン、ゼアキサンチン、および／またはオメガ－３脂肪酸）に記載されているもの）；細胞ベースの治療、例えば、ＮＴ－５０１（Ｒｅｎｅｘｕｓ）；ＰＨ－０５２０６３８８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ｈｕＣＮＳ－ＳＣ細胞移植（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）、ＣＮＴＯ－２４７６（臍帯幹細胞株；Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＯｐＲｅｇｅｎ（ＲＰＥ細胞の懸濁液；Ｃｅｌｌ Ｃｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＭＡ０９－ｈＲＰＥ細胞移植（Ｏｃａｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；組織因子アンタゴニスト（例えば、ｈＩ－ｃｏｎ１；Ｉｃｏｎｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；α－アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、酒石酸ブリモニジン；Ａｌｌｅｒｇａｎ）；ペプチドワクチン（例えば、Ｓ－６４６２４０；Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）；アミロイドβ拮抗薬（例えば、抗βアミロイドモノクローナル抗体、例えばＧＳＫ－９３３７７６）；Ｓ１Ｐアンタゴニスト（例えば、抗Ｓ１Ｐ抗体、例えばｉＳＯＮＥＰ（商標）；Ｌｐａｔｈ Ｉｎｃ）；ＲＯＢＯ４アンタゴニスト（例えば、抗ＲＯＢＯ４抗体、例えばＤＳ－７０８０ａ；Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）；エンドスタチンおよびアンジオスタチンを発現するレンチウイルスベクター（例えば、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ）；およびそれらの任意の組合せを含む。いくつかの例では、ＡＭＤ治療剤（前述のＡＭＤ治療剤のいずれかを含む）を共製剤化することができる。例えば、抗ＰＤＧＦＲ抗体ＲＥＧＮ２１７６－３は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））と共製剤化することができる。いくつかの例において、そのような共製剤は、本発明のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートと組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のために光線力学療法と組み合わせてＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ベルテポルフィン）と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにＰＤＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートと組み合わせて使用され得る例示的なＰＤＧＦアンタゴニストには、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、低分子阻害剤（例えば、スクアラミン）、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）（Ｅ１００３０；Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ））等の抗ＰＤＧＦ－Ｂ ＰＥＧ化アプタマー、または二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、低分子阻害剤（例えば、ＤＥ－１２０（Ｓａｎｔｅｎ）またはＸ－８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））または二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体）が含まれる。例えば、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）は、本発明のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートの補助療法として投与することができる。ＯＨＲ－１０２は、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）またはＥＹＬＥＡ（登録商標）等のＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートを、ＯＨＲ－１０２、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）および／またはＥＹＬＥＡ（登録商標）と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにＲＴＨ－２５８と組み合わせて投与することができる。ＲＴＨ－２５８は、例えば、硝子体内注射または眼注入によって投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにアビシパル・ペゴルと組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のためにアビシパルペゴールと組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
限定されないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）またはＥＹＬＥＡ（登録商標））、コルチコステロイド（例えば、コルチコステロイドのインプラント（例えば、ＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）またはＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）（フルオシノロンアセトニド硝子体内インプラント））または硝子体内注射による投与のために製剤化されたコルチコステロイド（例えば、トリアムシノロンアセトニド））、またはそれらの組み合わせを含む任意の適切なＤＭＥおよび／またはＤＲ治療剤は、眼障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置のために、Ｔｉｅ２結合コンジュートおよび／またはそのポリマー製剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、ＤＭＥおよび／またはＤＲの処置のためにＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）と組み合わせて投与することができる。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、ＤＭＥおよび／またはＤＲの処置のためにＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）と組み合わせて投与することができる。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、ＤＭＥおよび／またはＤＲの処置のためにＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）と組み合わせて投与することができる。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、ＤＭＥおよび／またはＤＲの処置のためにＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）と組み合わせて投与することができる。
場合によっては、ＴＡＯ／ＰＲＮ処置レジメンまたはＴＡＥ処置レジメンを使用して、Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤と組み合わせてＡＭＤ治療剤（例えば、ラニビズマブまたはアフリベルセプト）を投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥおよび／またはＤＲである。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。いくつかの例では、眼障害はＧＡである。
上述したそのような併用療法は、併用投与（ここでは、２つ以上の治療剤が同一または別個の製剤中に含まれる）および別個の投与を包含し、この場合、本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートの投与は、追加の治療剤または薬剤の投与に先立って、同時に、および／またはそれに続いて、行われ得る。一実施形態において、Ｔｉｅ２結合コンジュゲートまたはポリマー製剤の投与および追加の治療剤の投与は、互いに約１、２、３、４もしくは５ヶ月以内、または約１、３もしくは４週間以内、または約１、２、３、４、５もしくは６日以内に行われる。
Ｔｉｅ２結合コンジュゲートおよび／またはそのポリマー製剤は、緑内障の処置のためにさらに企図される。緑内障は、少なくとも部分的に眼内圧（ＩＯＰ）上昇による眼の進行性損傷を特徴とする眼疾患の群である（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９））。さらに、緑内障は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死、軸索喪失および視神経乳頭の掘削された外観を特徴とする（Ａｌｗａｒｄ，「Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｌａｕｃｏｍａ」Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ，１９９８；３３９：１２９８－１３０７）。緑内障は、視力検査および「カッピング」を検出するための視神経の検眼鏡検査によって、視力喪失が起こる前に診断することができる。正常な成人の平均ＩＯＰは１５ ｍｍＨｇ～１６ ｍｍＨｇであり；正常範囲は１０～２１ｍｍＨｇである。緑内障の管理の１の形態は、局所適用された薬物を使用してＩＯＰを低下させることに基づく（「Ｇｌａｕｃｏｍａ」Ｌａｎｃｅｔ，１９９９；３５４：１８０３－１８１０）。
現在、ＩＯＰを低下させるために使用される５の主要なクラスの医薬：β－アドレナリンアンタゴニスト、アドレナリンアゴニスト、副交感神経模倣薬、プロスタグランジン様類似体および炭酸脱水酵素阻害剤が存在する。ほとんどの薬物は眼に局所的に適用されるが、それらは重度の全身性副作用を引き起こし、患者の生活の質に悪影響を及ぼす可能性がある。ＩＯＰのさらなる低下が示される場合、または投薬がＩＯＰを十分に低下させることができない場合、レーザー線維柱帯形成術が通常次のステップである。ＩＯＰが依然として十分に制御されていない場合、切開緑内障手術が適応される（Ｉｄ）。ニューロン喪失の程度を有意に減少させるにもかかわらず、ＲＧＣの喪失が継続し得るため、ＩＯＰの低下は疾患過程の停止を保証しない。医学的または外科的介入後のＩＯＰ調節と視野損失との間の関連の近年の研究は、ＩＯＰが低い場合、視野検査に反映される進行中のニューロン損失が減少し得ることを示した。緑内障性視神経症は、特定の病態生理学的変化およびその後のＲＧＣおよびそれらの軸索の死に起因すると考えられる。ＲＧＣ死の家庭は、二相性：損傷の開始に関与する一次傷害、続いて変性細胞を取り巻く厳しい環境に起因するより遅い二次変性であると考えられている。
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における、抗Ｔｉｅ２コンジュゲートの使用を提供する。一実施形態において、医薬は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）の処置用である。好ましい実施形態において、医薬は、ＤＭＥおよび／またはＤＲの処置用である。さらなる実施形態において、医薬は、眼障害を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯまたはＧＡ）を処置する方法における使用のためのものである。このような一実施形態において、方法は、例えば以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、医薬は、特に眼の血管透過性を低下させるためのものである。さらなる実施形態において、医薬は、個体に特に眼の血管透過性を低下させるために有効量の医薬を投与することを含む、個体における、特に眼における血管透過性を低下させる方法に使用するためのものである。上記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる局面において、本発明は、眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯまたはＧＡ）を処置するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、かかる眼障害（例えば、ＤＭＥ、ＤＲ、ＡＭＤ、ＲＶＯ、またはＧＡ）を有する個体に、有効量の本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートを投与することを含む。かかる一実施形態において、方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体へ投与することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる局面において、本発明は、特に個体の眼における血管透過性を低下させる方法を提供する。一実施形態において、方法は、特に眼における血管透過性を低下させるために、有効量の本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートを個体に投与することを含む。一実施形態では、「個体」は、ヒトである。
さらなる局面において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートのいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態ニオイテ、医薬製剤は、本明細書で提供される本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容され得る担体とを含む。他の実施形態において、医薬製剤は、本明細書に提供される本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートのいずれかと、例えば、上記の少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
上述したそのような併用療法は、併用投与（ここでは、２つ以上の治療剤が同一または別個の製剤中に含まれる）および別個の投与を包含し、この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤または薬剤の投与に先立って、同時に、および／またはそれに続いて、行われ得る。一実施形態において、抗Ｔｉｅ２結合コンジュゲートの投与および追加の治療剤の投与は、互いに約１ヶ月以内、または約１、２もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５もしくは６日以内に行われる。
本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲート（および任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、および鼻腔内、ならびに局所治療のために望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。投薬は、任意の適切な経路によるもの、例えば、一部には、投与が一時的であるか慢性的であるかに依存して、注射によって、例えば、静脈または皮下への注射によるものであってもよい。単回または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートは、良好な医療行為と一致した方法で製剤化され、投与され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。有効量のそのような他の作用物質は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、および上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量および投与経路によって、または本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、または適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量および任意の経路で使用される。
疾患の予防または処置について、本発明のコンジュゲートの適切な投与量は（単独で、または１以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴および抗体への応答、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。コンジュゲートは、一度に、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類および重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のコンジュゲートが、例えば、１回以上の別個の投与によるか、または連続的な注入によるかによらず、患者に投与するための初期の候補投薬量であってもよい。典型的な１日投与量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間またはそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。コンジュゲートの１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。かかる用量は、断続的に、例えば毎週または３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、または例えば約６回の用量のコンジュゲートを投与されるように）投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
上記の製剤または治療方法のいずれかは、本発明のＴｉｅ２結合コンジュゲートの代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫コンジュゲートを使用して実施され得ることが理解される。
Ｈ．製品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防および／または診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に関連付けられたラベルまたは添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態を治療、予防、および／または診断するのに有効な別の組成物と単独でまたは組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択される病態を治療するために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）製品中に含有され、本発明のＴｉｅ２結合剤またはコンジュゲートを含む組成物を含む第１の容器、および、（ｂ）製品中に含有され、さらなる細胞毒性または他の治療剤を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。製品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を治療するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書をさらに備えていてもよい。これに代えて、またはこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液およびデキストロース溶液を含む第２の（または第３の）容器をさらに備えていてもよい。他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器等、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
上記の製品はいずれも、Ｔｉｅ２結合コンジュゲートの代わりに、またはそれに加えて、本発明の免疫コンジュゲートを含み得ることが理解されよう。
Ｉ．本発明の実施形態
以下に、本発明の特定の実施形態を列挙する。
１．Ｔｉｅ２に結合する単離された抗体またはその断片であって、
（ａ）アミノ酸配列ＮＴＤＩＳ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列ＲＩＳＰＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）アミノ酸配列ＲＴＲＷＡＳＸ１ＡＸ２ＤＹ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに（ｄ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
２．ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＲＴＲＷＡＳＷＡＭＤＹ（配列番号６）を含む、先行する実施形態に記載の抗体。
３．ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＲＴＲＷＡＳＷＡＦＤＹ（配列番号７）を含む、実施形態１に記載の抗体。
４．モノクローナル抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
５．ヒト化抗体またはキメラ抗体である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
６．Ｔｉｅ２に結合する抗体断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
７．Ｆａｂ断片である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
１０．配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；および配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体。
１１．配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；および配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体。
１２．配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；および配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体。
１３．配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；および配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体。
１４．配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；および配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の抗体。
１５．配列番号２１のＶＬ配列および配列番号１９のＶＨ配列；配列番号２１のＶＬ配列および配列番号２２のＶＨ配列、または配列番号２１のＶＬ配列および配列番号２０のＶＨ配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
１６．操作されたシステインを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
１７．実施形態１６に記載の抗体であって、
操作されたシステインが、ＨＣ中のＴ１２０Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｔ１８７ＣおよびＴ２０９Ｃから選択されるか、または操作されたシステインはＬＣ中のＱ１２４Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｑ１５５Ｃ、Ｌ２０１Ｃ、Ｔ２０６Ｃ、Ｋ１０７Ｃ、Ｋ１２６ＣおよびＫ１４９Ｃから選択され、操作されたシステインの残基番号がＥＵナンバリングに従う、抗体。
１８．操作されたシステインが、ＨＣ中のＴ２０９ＣおよびＬＣ中のＴ２０６Ｃから選択される、実施形態１６または１７に記載の抗体。
１９．操作されたシステインが、ＬＣ中のＴ２０６Ｃである、実施形態１６から１８のいずれか１つに記載の抗体。
２０．操作されたシステインが、ＨＣ中のＴ２０９Ｃである、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の抗体。
２１．配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２２．配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２３．配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２４．配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２５．配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体。
２６．配列番号２５の配列を含むＬＣおよび配列番号５５の配列を含むＨＣを含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。
２７．配列番号２５の配列を含むＬＣと、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１および配列番号９２から選択される配列を含むＨＣとを含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の抗体。
２８．配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の抗体。
２９．配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の抗体。
３０．配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の抗体。
３１．配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の抗体。
３２．配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣ；および配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の抗体。
３３．配列番号５６の配列を含むＬＣと、配列番号９０、配列番号９１または配列番号２３の配列を含むＨＣとを含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の抗体。
３４．配列番号５５の配列を含むＨＣおよび配列番号２５の配列を含むＬＣを含む、Ｔｉｅ－２に特異的に結合する抗体。
３５．先行する実施形態のいずれか１つに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
３６．実施形態３８に記載の核酸を含む、宿主細胞。
３７．Ｔｉｅ－２に結合する抗体を産生する方法であって、実施形態３９に記載の宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
３８．Ｔｉｅ２に結合するコンジュゲートであって、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの抗体を含み、抗体の各々が、多量体化部分に連結されている、コンジュゲート。
３９．インビトロまたはインビボ細胞アッセイにおいてＴｉｅ２のリン酸化を活性化する、実施形態３８に記載のコンジュゲート。
４０．Ｔｉｅ－２タンパク質レベルをインビトロアッセイで、２５％未満、５０％未満または７５％未満で引き起こす、またはインビトロアッセイにおいてＴｉｅ－２タンパク質レベルの２５％超、５０％超または７５％超の低下を引き起こさない、実施形態３８または３９に記載のコンジュゲート。
４１．インビトロバリア機能アッセイによって決定される血管透過性を低下させる、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
４２．多量体化部分が、ポリオール、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む、実施形態３８～４２のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
４３．ポリオールが二量体、四量体、六量体、および八量体から選択される多アーム型ポリオールである、実施形態４２に記載のコンジュゲート。
４４．多アーム型ポリオールが六量体である、実施形態４３に記載のコンジュゲート。
４５．多アーム型ポリオールが、八量体である、実施形態４３または４４に記載のコンジュゲート。
４６．ポリオールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
４７．ポリオールが、システインアミノ酸の遊離スルフヒドリル基を介して少なくとも２つの抗体に共有結合している、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
４８．システインアミノ酸が、操作されたシステインである、実施形態４７に記載のコンジュゲート。
４９．操作されたシステインが抗体のＨＣおよび／またはＬＣ定常領域にある、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
５０．操作されたシステインが、ＨＣ中のＴ１２０Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｔ１８７ＣおよびＴ２０９Ｃからなる群から選択されるか、または
操作されたシステインが、ＬＣ中のＱ１２４Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｑ１５５Ｃ、Ｌ２０１Ｃ、Ｔ２０６Ｃ、Ｋ１０７Ｃ、Ｋ１２６Ｃ、およびＫ１４９Ｃからなる群から選択され；残基番号がＥＵナンバリングに従う、実施形態４８または４９に記載のコンジュゲート。
５１．操作されたシステインがＬＣ中のＴ２０６Ｃであり、残基番号がＥＵナンバリングに従う、実施形態４８～５０のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
５２．操作されたシステインがＨＣ中のＴ２０９Ｃであり、残基番号がＥＵナンバリングに従う、実施形態４８～５０のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
５３．ポリオールが、リジンアミノ酸の遊離アミノ基を介して少なくとも１つの抗体に共有結合している、実施形態４２～４５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
５４．リジンアミノ酸が抗体のＨＣもしくはＬＣ定常領域にあり、および／またはリジンアミノ酸が抗体の重鎖もしくは軽鎖のＣ末端にある、実施形態５３に記載のコンジュゲート。
５５．ＰＥＧが、約５００ダルトン（Ｄａ）～約３００，０００Ｄａまたは約５００Ｄａ～約２０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する、実施形態４６～５４のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
５６．ＰＥＧが、約６０００Ｄａの重量平均分子量を有する、実施形態４６～５５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
５７．ＰＥＧがジペンタエリスリトール六量体または八量体コアを含む、実施形態４６～５６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
５８．ＰＥＧが、一般式（Ｉａ）：
Figure 2023519213000041
（式中、各ｎが、１～１０の整数であり各ｍが、独立して、３～２５０の整数であり；各Ｒ１が、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり；および各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり；
少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体に共有結合している）
の構造を有する、実施形態４６～５７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
５９．ＰＥＧが、一般式（Ｉｂ）：
Figure 2023519213000042
（式中、各ｍが、独立して、３～２５０の整数であり；各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり；および各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり；
少なくとも１つのＲ２が、末端反応性基であり、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体に共有結合している）
の構造を有する、実施形態４６～５７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
６０．各ｍが独立して、１５～３５、好ましくは約２０～３０の整数である、実施形態５９に記載のコンジュゲート。
６１．実施形態１～３４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの抗体を多アーム型ポリオールに共有結合することによって調製される、実施形態４３～６０のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
６２．Ｔｉｅ－２に特異的に結合する抗体を含むコンジュゲートであって、抗体が配列番号２０のＶＨ配列および配列番号２１のＶＬ配列を含み、抗体が一般式（Ｉｂ）：
Figure 2023519213000043
（式中、各ｍが、独立して、３～２５０の整数であり；各Ｒ１は、独立して、存在しないか、または連結基であるかのいずれかであり；および各Ｒ２が、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり；
少なくとも１つのＲ２が、抗体に共有結合している）
を有するポリエチレングリコールに共有結合している、コンジュゲート。
６３．ｍが、１０～２００の整数である、実施形態６２に記載のコンジュゲート。
６４．ｍが、２０～３０の整数である、実施形態６２または６３に記載のコンジュゲート。
６５．Ｒ１が存在しないか、またはＲ１が、
Figure 2023519213000044
（式中、各ｉは独立して０～１０の整数であり；ｊは０～１０の整数であり；Ｒ２は、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せからなる群から選択される末端反応性基である））；ならびにこれらの組合せ
からなる群から選択される、実施形態５８～６４のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
６６．各Ｒ２が、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフルオロメタンスルホネート、トシレート、アジリジン、エポキシド、ピリジルジスルフィド、スクシンイミジルエステル、－ＮＨ２、アルデヒド、ハロアセテート、ハロアセトアミド、およびパラ－ニトロフェニルカルボネートから選択される反応性基である、実施形態５８～６５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
６７．Ｒ２がマレイミドである、実施形態５８～６６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
６８．請求項１～３４のいずれか１つに記載の少なくとも１つの抗体を多アーム型ポリオールに共有結合することによって調製される、実施形態４３～６７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
６９．実施形態３８～６８のいずれか１つに記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
７０．コンジュゲートの濃度が、約５０ｍｇ／ｍｌ～約３００ｍｇ／ｍｌである、実施形態６９に記載の医薬製剤。
７１．追加の治療剤をさらに含む、実施態様６９または７０に記載の医薬組成物。
７２．追加の治療剤が、ＶＥＧＦアンタゴニスト、Ａｎｇ２アンタゴニスト、ＨｔｒＡ１アンタゴニストおよびＩＬ３３アンタゴニスト、補体成分アンタゴニストおよび第２のＴｉｅ２アゴニストからなる群から選択される、実施形態７１に記載の医薬組成物。
７３．ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦトラップおよび抗ＶＥＧＦ抗体からなる群から選択される、実施形態７２に記載の医薬組成物。
７４．実施形態７９～７３のいずれか１つに記載の医薬組成物と、組成物を患者の硝子体内に送達する手段とを含み、組成物が長期間にわたってその場で有効なままである、眼送達用の長時間作用型送達装置。
７５．対象のＴｉｅ２経路媒介障害を処置する方法であって、有効量の実施形態１～３４のいずれか１つに記載の抗体、実施形態３８～６８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または実施形態６９～７３のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
７６．Ｔｉｅ２経路媒介障害が血管透過性障害である、実施形態７５に記載の方法。
７７．Ｔｉｅ２経路媒介障害が眼の症状である、実施形態７５または７６に記載の方法。
７８．眼の症状が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、乾燥型および湿潤型（非滲出型および滲出型）を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、虚血関連網膜症、病理学的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜新生血管、緑内障、および網膜新生血管から選択される、実施形態７７に記載の方法。
７９．眼の状態がＤＭＥである、実施形態７５～７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．埋込み可能ポート送達システムを使用して抗体、コンジュゲートまたは医薬製剤を投与することを含む、実施形態７５～７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．硝子体内投与によって抗体、コンジュゲートまたは医薬製剤を投与することを含む、実施形態７５～７９のいずれか１つに記載の方法。
８２．硝子体内投与が、狭口径針を通す投与である、実施形態８１に記載の方法。
８３．狭口径針が、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、または２２ゲージである、実施形態項８２に記載の方法。
８４．追加の治療剤を投与することをさらに含む、実施形態７５～８３のいずれか１つに記載の方法。
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
実施例１－天然ファージライブラリーに由来する抗Ｔｉｅ２抗体の生成
Ｔｉｅ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する抗体は、最初に、以下に記載されるように重鎖ＣＤＲ内の溶媒露出位置に合成多様性を導入することによって単一のヒトフレームワーク上に構築されたファージ提示合成抗体ライブラリから選択された。ＥＣＤならびにＥＣＤの様々なサブドメインに対してファージをスクリーニングした。
ライブラリ構築のためのファージミドベクター
ファージミドｐＶ０３５０－２ｂおよびｐＶ０３５０－４を、Ｍ１３ファージ粒子の表面上にそれぞれ一価または二価でＦａｂ鋳型を提示するように設計した。Ｆａｂ鋳型は、Ｈｅｒ－２（ｅｒｂＢ２）として知られる癌関連抗原を認識するヒト化抗体であるｈ４Ｄ５抗体に基づいていた。ｈ４Ｄ５配列は、ｈｕｍＡｂ４Ｄ５バージョン８（「ｈｕｍＡｂ４Ｄ５－８」）配列（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：４２８５－４２８９）を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得た。ｈ４Ｄ５核酸配列は、ヒトコンセンサス配列Ｆａｂフレームワーク中のＨｅｒ－２に特異的なマウスモノクローナル抗体由来の改変ＣＤＲ領域をコードする。具体的には、配列は、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＨＣ領域）の上流にカッパ軽鎖（ＬＣ領域）を含む。抗Ｈｅｒ－２抗体を作製する方法および可変ドメイン配列の同一性は、米国特許第５，８２１，３３７号および第６，０５４，２９７号に示される。
ベクターｐＶ０３５０－２ｂは、ｐｈｏＡプロモータの制御下でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のファージ提示に使用されている以前に記載されたファージミド（ｐＨＧＨａｍ－ｇＩＩＩ）を改変することによって構築された。ｓｔＩＩ分泌シグナル配列およびＭ１３マイナーコートタンパク質Ｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインに融合したｈＧＨをコードするｐｈＧＨａｍ－ｇＩＩＩのオープンリーディングフレームを、２つのオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片で置き換えた。第１のオープンリーディングフレームは、ｈ４Ｄ５軽鎖についてコードし（バージョン８）、第２のオープンリーディングフレームは、ｃＰ３に融合されたｈ４Ｄ５重鎖の可変（ＶＨ）ドメインおよび第１の定常（ＣＨ１）ドメインをコードし；各タンパク質を、Ｎ末端ｓｔＩＩシグナル配列による分泌に向けた。この改変はファージ上に提示されるＦａｂのレベルを増加させることが示されているので、重鎖断片とｃＰ３との間のアンバー終止コドンを欠失させた。エピトープタグをｈ４Ｄ５軽鎖のＣ末端に付加した（ｇＤタグ）。記載のように、重鎖ＣＨ１ドメインとｃＰ３との間にＧＣＮ４ロイシンジッパーをコードするＤＮＡ断片を挿入したことを除いて、二価提示用ベクター（ｐＶ０３５０－４）はｐＶ０３５０－２ｂと同一であった。軽鎖遺伝子を、天然抗体配列のＫａｂａｔデータベースに最も一般的に見出されるアミノ酸をコードするために、３つの位置の両方のファージミドにおいてさらに改変し、具体的には、Ａｒｇ ６６をＧｌｙに変更し、Ａｓｎ３０およびＨｉｓ９１をＳｅｒに変更した。これらの変化は、Ｆａｂ発現およびファージでの提示を増加させることが見出された。部位特異的突然変異誘発は、Ｋｕｎｋｅｌら（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７－８２）の方法を使用して行った。
オリゴヌクレオチド指向型突然変異誘発および記載されるようなｐＶ０３５０－２ｂまたはｐＶ０３５０－４の「終止テンプレート」バージョンを使用して、ファージ提示ライブラリを生成した（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．ら、（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４：１１９－１３２；Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，（２００４）ＪＭＢ ３４０：１０７３－１０９３）。終止コドン（ＴＡＡ）を３つ全ての重鎖ＣＤＲに埋め込んだ。これらは、ＣＤＲ－Ｈ１、－Ｈ２および－Ｈ３をコードする配列にわたってアニーリングし、ランダム化のために選択された位置のコドンを、調整された縮重コドンで置換した縮重オリゴヌクレオチドの混合物によって、突然変異誘発反応中に修復された。突然変異誘発反応物を大腸菌ＳＳ３２０細胞にエレクトロポレーションし、培養物を、ＫＯ７ヘルパーファージ、５０ｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した２ＹＴブロス中、３０℃で一晩増殖させた。記載されているように（Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．ら（２０００）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：３３３－３６３）、ＰＥＧ／ＮａＣｌによる沈殿によってファージを培養培地から回収した。各エレクトロポレーション反応は、約１０１１個の大腸菌細胞および約１０ ｕｇのＤＮＡを使用し、１×１０９～５×１０９個の形質転換体をもたらした。
Ｆａｂ．ｚｉｐ鋳型を用いてＣＤＲ－Ｈ１およびＣＤＲ－Ｈ２（上記のＬｅｅ，Ｃ．Ｖ．ら、（２００４）、ＪＭＢの表１）：ライブラリ３（Ｌｉｂ－３）の天然の多様性を模倣するように調整された縮重オリゴヌクレオチドを用いて、別個のライブラリーを作製した。上記のＬｅｅ，Ｃ．Ｖ．ら（２００４）に記載されているＬｉｂ－３を参照されたい。ＣＤＲ－Ｈ１およびＣＤＲ－Ｈ２の２～４つのオリゴヌクレオチドを組み合わせて、天然の多様性のカバレッジを増加させた。Ｌｉｂ－３は、それぞれＣＤＲ－Ｈ１およびＣＤＲ－Ｈ２のオリゴヌクレオチドＨ１ａおよびＨ１ｂ（比２：１）ならびにＨ２ａ～ｃ（比１：２：０１）を使用した（オリゴヌクレオチドの説明については、上記のＬｅｅ，Ｃ．Ｖ．ら（２００４）、ＪＭＢの表１を参照されたい）。
ＣＤＲ－Ｈ３の位置９５～１００について、Ｌｉｂ－３は、ＮＮＳコドン（またはＮＮＫコドン）またはコドントリプレットの各位置に不等なヌクレオチド比を含むＮＮＳコドン（ＸＹＺコドン）の改変バージョンのいずれかを含有する、伸長ＣＤＲ－Ｈ３長を有するライブラリのセットからなる。ＮＮＳコドンは３２のコドンを包含し、２０全てのアミノ酸をコードしていた。Ｘは３８％のＧ、１９％のＡ、２６％のＴおよび１７％のＣを含有しており；Ｙは３１％のＧ、３４％のＡ、１７％のＴおよび１８％のＣを含有しており；Ｚは２４％のＧおよび７６％のＣを含有していた。Ｌｉｂ－３のＣＤＲ－Ｈ３設計は、上記のＬｅｅ，Ｃ．Ｖ．ら（２００４）の表５に記載されている。別々の突然変異誘発反応を実施し、一緒にエレクトロポレーションした７および８残基の長さを除いて、各ＣＤＲ－Ｈ３の長さについてエレクトロポレーションした。
各ライブラリ中の完全なＦａｂのファージ提示レベルを、抗ｇＤ抗体に対する４８のランダムに選択したクローンの結合を測定することによって調べた。ｕＬｉｂ－３については、最も長いＣＤＲ－Ｈ３（１５～１９残基）を組み込んだライブラリがＦａｂ提示クローンのパーセンテージを低下させた（１５～３０％）ことを除いて、異なるＣＤＲ－Ｈ３長さについて同様のレベルの提示が観察された。これは、非常に長い合成オリゴヌクレオチドを使用する場合の突然変異誘発効率の低下を反映し得る。
ファージ選別
上記のＬｉｂ－３を、様々なＴｉｅ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質に対して選別した。Ｔｉｅ２ ＥＣＤは、膜遠位から膜近位まで、３つのＩｇＧドメイン（Ｉｇ１およびＩｇ２）、３つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ１～３）、第３のＩｇＧドメイン（Ｉｇ３）および３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）から構成される（例えば、図１を参照されたい）。完全な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、膜近位ＦＮ３ドメイン、またはＦＮ ３ドメインを含まないＥＣＤ（ＥＣＤ５と呼ばれる）をコードする構築物を生成した。したがって、リガンド結合ドメインＩｇ２は、ＥＣＤおよびＥＣＤ５構築物の両方によってコードされるが、ＦＮ３構築物には存在しない。コードされたタンパク質を、ヒトおよびカニクイザルのタンパク質についてはｈＩｇＧ１のＦｃ領域、マウスおよびラットのタンパク質についてはｍＩｇＧ２ａ、または全ての種についてＣ末端ＦｌａｇタグのいずれかにＣ末端で融合した。図１は、パンニングに使用されるタンパク質を示す。ヒト、マウスおよびラットＴｉｅ１受容体のための完全なＥＣＤ構築物も、Ｃ末端Ｆｃ融合物またはＦｌａｇタグの両方を用いて作製した。
Ｔｉｅ２ ＥＣＤタンパク質の発現および精製
Ｆｌａｇタグ付きＴｉｅ２ ＥＣＤを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞馴化培地から発現および精製した。１１～１４日後、馴化培地を回収し、約１０倍濃縮した。濃縮物を抗Ｆｌａｇタグカラムにロードし、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１０を含有する２５ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、結合緩衝液で洗浄した。次いで、Ｆｌａｇタグ付きタンパク質を５０ｍＭ Ｎクエン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．０で溶出し、次いで、１Ｍアルギニン、４００ｍＭコハク酸、ｐＨ９．０を使用してｐＨ５．０に中和した。溶出したタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水のサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００またはＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５のいずれか）にロードし、画分を回収し；モノマーピーク画分をプールし、濃縮し、０．２ ｕｍ濾過した。
パニングのために、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、４℃のＰＢＳ中の１００ｕｌ／ウェルの標的Ｔｉｅ２抗原（５ｕｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートを６５ｕｌの１％ブロッキングタンパク質で３０分間（分）、４０ｕｌの１％ Ｔｗｅｅｎ ２０でさらに３０分間（ブロッキングタンパク質：１回目：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２回目：カゼイン、３回目：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、４回目：カゼイン）ブロッキングした。次に、ファージライブラリーを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１％ ＢＳＡ（１ ＯＤ＝１．１３×１０１３ファージ／ｍｌ）で約３～５ＯＤ／ｍｌに希釈した。一般的に、ファージインプットは以下の通りであった：１回目３～５ＯＤ／ｍｌ、２回目３ＯＤ／ｍｌ、３回目約０．５～１ＯＤ／ｍｌおよび４回目約０．１～０．５ＯＤ／ｍｌ。希釈したファージを室温で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で少なくとも５回連続的に洗浄した。ブロッキングしたファージライブラリーを、室温で２時間（ｈｒ）、８つの標的抗原被覆ウェルおよび２つの非被覆ウェルに１００ｕｌ／ウェル添加した。プレートをＰＢＳおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で少なくとも１０回連続的に洗浄した。３回目のパニングから開始して、無関係なＦｃ含有タンパク質としての１ｕＭのオマリズマブ、Ｔｉｅ２．ＥＣＤ５、または抗体抗Ｔｉｅ２．２０（リガンドブロッキング）をファージライブラリーに１時間添加した後、２時間結合するＴｉｅ２コーティングウェルに混合物を適用した。ファージを１００μｌ／ウェルの１００ｍＭ ＨＣｌで室温にて２０分間溶出した。溶出したファージ（コーティングウェルから）およびバックグラウンドファージ（非コーティングウェルから）を別々のチューブに回収した。溶出した収集物を、１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ１１．０を両方のチューブに添加することによって中和した。溶出したファージのチューブにＢＳＡを最終０．１％まで添加した。ファージを力価測定するために、９０ｕｌの対数期ＸＬ－１（ＯＤ６００ｎｍ 約０．１～０．３）を１０ｕｌの溶出ファージまたはバックグラウンドファージに３７℃で３０分間感染させた。次に、感染細胞を９０ｕｌの２ ＹＴで１０倍ずつ連続希釈した。感染細胞の１０ｕｌアリコートをカルベニシリンプレートにプレーティングした。
複数回のパニングの間にファージを増殖させるために、約４００ｕｌの溶出ファージを使用して、約４ｍｌの対数期ＸＬ－１（ＯＤ６００ｎｍ 約０．１～０．３）に３７℃で３０～４５分間感染させた。ヘルパーファージＫＯ７およびカルベニシリンを、１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ ＫＯ７および５０ｕｇ／ｍｌカベニシリンの最終濃度で、３７℃でさらに１時間感染物に添加した。培養物を、カルベニシリン５０ｕｇ／ｍｌおよび５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ＹＴ培地で、３７℃で、４時間および３０℃で一晩（または少なくとも１８時間）、最終容量２０～２５ ｍｌまで増殖させた。翌日、細胞を８０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンすることによって、ライブラリファージを精製した。上清を回収した。２０％ ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌを上清体積の１／５で添加し、混合し、氷上で５分間静置した。ファージを１２０００ｒｐｍで１５分間ペレット化した。ペレットを再び５０００ｒｐｍで５分間回転させた。ペレットをＰＢＳ １ｍｌに再懸濁し、１２０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンして残屑を除去し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ添加で沈殿させた。ファージペレットをＰＢＳに再懸濁した。再増殖したファージペレットのＯＤを２６８ｎｍで読み取った。
スクリーニングＥＬＩＳＡアッセイ
４回目からのクローンを、ＥＬＩＳＡによってＴｉｅ２結合および特異性についてスクリーニングした。スクリーニングＥＬＩＳＡを、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをＴｉｅ２タンパク質または無関係なタンパク質で６５ｕｌ／ウェル（コーティング緩衝液中１ｕｇ／ｍｌ）で４℃で一晩コーティングすることによって行った。９６チューブプレートにおいて、４回目からのコロニーを、５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンおよびヘルパーファージＫＯ７を含む４００ｕｌの２ＹＴ培地中、３７℃で一晩増殖させた。プレートを３０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンした。３０ｕｌの培養上清を６０ｕｌのＥＬＩＳＡ緩衝液（０．５％ ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）と共にＴｉｅ２コーティングプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０および１００ｕｌ／ウェルのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗Ｍ１３抗体（０．５％ ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したＰＢＳ中１／５０００希釈）で室温にて３０分間洗浄した（上記Ｓｉｄｈｕら）。ウェルをＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した後、１：１比の３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ２）（（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ－Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を１００ｕｌ／ウェルで添加し、室温で５分間インキュベートした。ウェルあたり１００ｕｌの１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を添加することによって反応を停止させ、標準的なＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してウェルのＯＤを４５０ｎｍで決定した。
バックグラウンドより上のＴｉｅ２結合を有し、Ｔｉｅ２結合種特異性および無関係のＦｃ含有タンパク質（オマリズマブ）に対する低い結合性を有するクローンをさらに分析した。以下の表２～５は、結合データをまとめたものである。表２～５のいずれも、オマリズマブへの結合を示さなかった。
Figure 2023519213000045
Figure 2023519213000046
Figure 2023519213000047
Figure 2023519213000048
抗Ｔｉｅ２ ＩｇＧの発現および精製
所望の種特異性および低い無関係なタンパク質結合を有する上記で同定された陽性結合剤を配列決定し、抗Ｔｉｅ２重鎖の可変ドメインを、哺乳動物細胞における一過性のヒトＩｇＧ１発現のために予め設計されたベクターにクローニングした。（Ｌｅｅら、２００４ａ）。
得られた抗Ｔｉｅ２ヒトＩｇＧを、上記で作製した構築物によってコードされる重鎖および４Ｄ５軽鎖を使用した２９３一過性トランスフェクションを使用して発現させた（配列番号２５）。ＩｇＧをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーでトランスフェクション上清から精製し、Ｔｉｅ２結合確認、Ｔｉｅ１結合およびエピトープマッピングについてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ｈＩｇＧタンパク質は発現しなかったか、またはあまり発現しなかったので、８つの抗体はさらに分析しなかった。
実施例２－ファージライブラリーに由来する抗Ｔｉｅ２抗体の特徴づけ
Ｔｉｅ２結合
抗Ｔｉｅ２抗体によるＴｉｅ２結合を確認するために、上記のようにＩｇＧ１フォーマットとして調製したＴｉｅ２細胞外構築物をＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートに２ｕｇ／ｍｌで６５ｕｌ ＰＢＳ中に４℃で一晩固定したＥＬＩＳＡフォーマットを使用した。抗Ｔｉｅ２ ＩｇＧの連続希釈液を、ＰＢＳ中１％ ＢＳＡで予めブロッキングした固定化Ｔｉｅ２を有するプレートに適用し、室温で２０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、上記の方法を使用して抗ｈｕＦＣコンジュゲートＨＲＰ二次抗体で検出した。図２Ａおよび図２Ｂは、ヒトＴｉｅ２ ＥＣＤへの様々なクローンの結合を示す。
結合ＥＬＩＳＡを固定化Ｔｉｅ１タンパク質と共に使用して、Ｔｉｅ１結合を評価した。図３Ａおよび図３Ｂに提供された結果は、いくつかの抗Ｔｉｅ２抗体によるＴｉｅ１結合の欠如を示しており、これらの抗Ｔｉｅ２抗体がＴｉｅ２に特異的に結合することを実証している。
リガンド遮断
抗Ｔｉｅ２抗体のＡｎｇ１およびＡｎｇ２リガンドブロッキング活性を評価するために、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを使用した。このアッセイでは、ｈＡｎｇ ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．番号ＮＰ＿００１１３７）またはｈＡｎｇ １（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．番号ＮＰ＿０００４５０）をＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレート（２ ｕｇ／ｍｌ）に固定化し、ビオチン化ｈｕＴｉｅ２ＥＣＤ．Ｆｃを溶液中で抗Ｔｉｅ２抗体の連続希釈で平衡化させた後、未結合ビオチン－Ｔｉｅ２．ＥＣＤ．Ｆｃを固定化ｈＡｎｇ１またはｈＡｎｇ２で捕捉し、ストレプトアビジン結合ＨＲＰで検出した。これらの結果は、少なくとも抗Ｔｉｅ２抗体、Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１２およびＴｉｅ２．２０によるＡｎｇ１およびＡｎｇ２の両方の遮断を示す（図４Ａおよび図４Ｂを参照されたい）。
実施例３－抗Ｔｉｅ２抗体の機能分析
Ｔｉｅ２に特異的に結合することができるとして上記で同定された抗Ｔｉｅ２抗体をさらに分析して、Ｔｉｅ２アゴニストとして機能することができるものを同定した。Ｔｉｅ２結合が確認された抗Ｔｉｅ２ ＩｇＧの機能活性を、両方ともＴｉｅ２を発現することが知られているヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびラット大動脈内皮細胞（ＲＡＥＣ）を使用して評価した（図５Ａおよび図５Ｂ参照）。
リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）の刺激
Ｔｉｅ２活性化に関する抗Ｔｉｅ２抗体の機能を評価するために実験を行った。Ｔｉｅ２アゴニストである本開示によるＴｉｅ２コンジュゲートは、Ｔｉｅ２に結合して活性化し、その結果、ＡＫＴ酵素の下流活性化をもたらすと予想される。ＡＫＴの活性化は、以下に記載されるように、ｐＡＫＴを産生するためのＡＫＴタンパク質のリン酸化によって実証することができる。ＡＫＴのリン酸化を、リン酸化ＡＫＴに特異的な抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、または以下に記載されるようなＦＲＥＴアッセイによって決定した。
細胞および抗体：ＨＵＶＥＣをＬｏｎｚａ（カタログ番号ＣＣ－２５１７；Ｌｏｎｚａ，Ｌｔｄ．，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ＲＡＥＣをＶＥＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、増殖培地（カタログ番号ＭＣＤＢ－１３１ １０；ＶＥＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ）中で培養した。抗Ｔｉｅ２抗体をＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で調製した。ポリクローナルヤギ抗ｈＩｇＧを架橋剤として使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ．）。
ＨＵＶＥＣの調製：ＨＵＶＥＣ（ヒト血管内皮細胞）をトリプシン処理し、滅菌９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａ（登録商標）、カタログ番号３９９７）に０．４×１０５細胞／ウェルの培養培地１００μｌで播種し、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベートした。培養培地を除去し、１００μＬの予熱した血清飢餓培地（基礎培地ＥｎｄｏＧＲＯ（商標）；カタログ番号ＳＣＭＥ－ＢＭ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）をプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータ内で３時間インキュベートした後、抗Ｔｉｅ２抗体とインキュベートした。
ＲＡＥＣの調製：ＲＡＥＣ（ラット大動脈内皮細胞）を９６ウェル細胞培養プレートに１２，０００細胞／ウェルの密度で播種し、１００μｌのＥＧＭ２ ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｌｔｄ．）中で５％ ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。一晩培養した後、細胞を０．１％ ＢＳＡを含むＥＢＭ２基礎培地（Ｌｏｎｚａ，Ｌｔｄ．）中で３時間飢餓状態にした後、抗Ｔｉｅ２抗体とインキュベートした。
架橋抗Ｔｉｅ２抗体の効果を試験するために、アッセイ緩衝液（基礎培地＋０．２％ ＢＳＡ）中２０μｇ／ｍｌ架橋剤（ポリクローナルヤギ抗ｈＩｇＧ１）を、等体積の６０μｇ／ｍｌの抗Ｔｉｅ２二価抗体と混合し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、ｈＩｇＧ１と抗Ｔｉｅ２－ＩｇＧ抗体との混合物を３倍連続希釈に供した。
他のＴｉｅ２抗体を試験するために、分子をアッセイ緩衝液中で最初に高ストック濃度（典型的には３０～１０００μｇ／ｍｌ）に希釈し、続いて（典型的には２～１０倍）連続希釈した。血清飢餓培地を除去した後、これらの希釈液（５０μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で１５分間インキュベートした。溶液を除去し、リン酸化－ＡＫＴ１／２／３ Ｓｅｒ４７３ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｋｉｔ（カタログ番号６４ ＡＫＳＰＥＨ；Ｃｉｓｂｉｏ，Ｃｏｄｏｌｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）からのブロッキング緩衝液を含有する５０μｌの溶解緩衝液を細胞に添加した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で約３０～４５分間インキュベートし、使用するまで－８０℃に保つか、またはＦＲＥＴアッセイで直接使用した。
ウェスタンブロットアッセイ：ＨＵＶＥＣ細胞を１ウェルあたり１×１０６細胞でＥｎｄｏｇｒｏ培地に播種し、３７℃で１６～１８時間培養した。刺激の４～５時間前に、培養培地を０．１％ ＢＳＡ Ｅｎｄｏｇｒｏ基礎培地に交換した。細胞を関連するＴｉｅ－２アゴニストと共に３７℃で３０分間インキュベートし、冷リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で３回洗浄した。細胞を氷上に置き、Ｒｏｃｈｅ完全プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃１８６１２８１）を含有する１００ｕｌ／ウェルのＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ，、＃２０－１８８）と５分間インキュベートした。セルスクレーパーを使用してウェルから溶解物を回収し、１７，８００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（８％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＷ ８０００８５））によって評価し、続いてニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをＴＢＳ－Ｔ中の５％ ＢＳＡにより室温で１時間ブロッキング処理し、ブロッキング緩衝液中のウサギ抗ｐＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃９２７１ Ｓ）によりプローブした。ＴＢＳ－Ｔで４回洗浄した後、メンブレンをＨＲＰ抗ウサギＩｇ（１：１万）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＡ９３４Ｖ））によりＲＴで１時間プローブした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔにより３回洗浄し、ＥＣＬ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３２１３２）と室温で５分間インキュベートし、その後、ブロットをフィルムに暴露した。
ＦＲＥＴアッセイ：細胞溶解物（１５μｌ）を氷上で解凍し、次いで、３８４ウェルマイクロプレート（カタログ番号７８４０８０；Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）で、リン酸化－ＡＫＴ Ｓｅｒ４７３キットからの各リン酸化－ＡＫＴ ｄ２抗体およびリン酸化－ＡＫＴ Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体の５μｌの１：４０希釈物と混合し、プレートを室温で４時間または４℃で一晩インキュベートし、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、ソフトウェアバージョン：５．０１ Ｒ２）で６２０ｎｍおよび６６５ｎｍで読み取った。データは、各個々のウェルについて、アクセプターおよびドナー発光シグナルの比×１０４として計算した。
Ｔｉｅ２活性を活性化することができる抗Ｔｉｅ－２抗体を同定するために、上記で詳述したように同定されたＴｉｅ－２に結合する抗体をヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）抗体としてフォーマット化し、Ｔｉｅ２活性化の下流にあるＡＫＴのリン酸化を刺激する（ｐＡＫＴを生成する）その能力について試験した。ＲＡＥＣを組換え抗Ｔｉｅ２抗体（ｈＩｇＧ１）：Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．４、Ｔｉｅ２．５、Ｔｉｅ２．１６およびＴｉｅ２．２０で１０分間処理した。細胞溶解物をｐＡＫＴのウエスタンブロット（ＷＢ）分析に供した。図６Ａは、抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１およびＴｉｅ２．２０のインキュベートが、このインビトロ細胞ベースアッセイにおいてＡＫＴのリン酸化を増加させ、Ｔｉｅ２．１はＴｉｅ２．２０よりも強いＴｉｅ２アゴニスト効果を有することを示す。
次に、抗Ｔｉｅ２抗体のアゴニスト活性に対する架橋の効果を評価する実験を行った。抗ｈＩｇＧ１架橋抗体を、ｐＡＫＴアッセイにおいてＴｉｅ２．１またはＴｉｅ２．２０と共にインキュベートした。図６Ｂに示すように、Ｔｉｅ２．１の架橋は、増加したＡＫＴリン酸化によって決定されるように、Ｔｉｅ２を活性化するその能力をさらに増加させた。
さらなるアゴニスト性抗Ｔｉｅ２抗体を同定するために、ＨＴＲＦベースアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）も使用した。ＲＡＥＣを組換え抗Ｔｉｅ２抗体（ｈＩｇＧ１）で１０分間処理し：細胞溶解物をｐＡＫＴのＨＴＲＦ分析（ｃｉｓｂｉｏ）に供した。図７Ａに示すように、ｐＡＫＴレベルを有意に増加させる（Ｔｉｅ２アゴニストとして作用する）ことが見出された抗体には、少なくともＴｉｅ２．２４、Ｔｉｅ２．３１、Ｔｉｅ２．３２、Ｔ２．３３、Ｔｉｅ２．３８およびＴｉｅ２．１が含まれ、Ｔｉｅ２．１は強い活性を有する。
抗Ｔｉｅ２ ＩｇＧ（完全長）抗体による結合時のＴｉｅ２活性化のレベルは、反応混合物内のＩｇＧ分子の非特異的凝集に部分的に起因し得ると考えられた。図７Ｂに示すように、凝集体のパーセンテージがより低いＴｉｅ２．１抗体調製物（例えば、０．１５％）と比較して、凝集体のパーセンテージがより高いＴｉｅ２．１抗体調製物（例えば、３．５％）は、より強いアゴニスト活性を示した。図７Ｂはさらに、架橋抗ｈＩｇＧ１がＴｉｅ２．１のアゴニスト活性を増強したことを示す。理論に拘束されるものではないが、抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体によるＴｉｅ２の活性化は、Ｔｉｅ２結合抗体の架橋によって促進され得ると考えられる。
実施例４－天然ファージライブラリーに由来する抗Ｔｉｅ２抗体のビニング
Ｔｉｅ２受容体タンパク質への抗Ｔｉｅ２抗体の結合をさらに特徴付け、共有エピトープを有する抗体を同定するために、ファージＥＬＩＳＡおよびＯｃｔｅｔ測定の両方を使用して抗Ｔｉｅ２抗体のビニングを行った。
ファージＥＬＩＳＡについて、ｈｕＴｉｅ２ＥＣＤ．Ｆｃタンパク質をＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートに２ｕｇ／ｍｌで６５ｕｌのＰＢＳ中に４℃で一晩固定化した。ＩｇＧとしてフォーマットされた抗Ｔｉｅ２抗体Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．２０、Ｔｉｅ２．３４、または抗Ｔｉｅ２抗体１３Ｈ１０（米国特許第６，３６５，１５４号に記載されている抗Ｔｉｅ２受容体アゴニスト抗体）の連続希釈物を、ＰＢＳ中の１％ ＢＳＡで予めブロッキングした固定化ｈｕＴｉｅ２ＥＣＤ．Ｆｃを含むプレートに適用し、室温で１時間インキュベートした。抗Ｔｉｅ２ファージをＯＤ２６８ｎｍ／ｍＬ ０．１で室温で１５分間添加した。プレートを次いで洗浄し、上記の方法を使用して抗Ｍ１３コンジュゲートＨＲＰ二次抗体で検出した。連続希釈抗体の減少に伴うシグナルの増加は、試験ファージ抗体が連続希釈抗体と競合することを示し、それらが同じ部位またはエピトープに結合することを示す。
上記のＥＬＩＳＡによって決定されるようなエピトープビニングを、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用するＯｃｔｅｔエピトープビニングアッセイおよび標準的なサンドイッチ形式ビニングアッセイによって確認した。具体的には、ストレプトアビジンバイオセンサ（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をビオチン化ｈＴｉｅ２．ＥＣＤ．Ｆｃタンパク質（１０ｕｇ／ｍＬ）でコーティングし、次いでベンチマーク抗Ｔｉｅ２ ｈＩｇＧ１（５０ｕｇ／ｍＬ Ａｂ１、Ａｂ２０、１３Ｈ１０）に曝露し、続いて第２の（試験）抗Ｔｉｅ２ ｈＩｇＧ１に曝露した。データは、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏのデータ分析ソフトウェアを使用して処理した。第２の（試験）抗体によるさらなる結合は、占有されていないエピトープ（非競合物質）を示し、一方、結合がないことは、エピトープブロッキング（競合物質）を示す。Ａｂ２０（Ｔｉｅ２．２０）について得られたデータを用いた実験の例示を図８Ａおよび図８Ｂに提供する。他の抗Ｔｉｅ２抗体についてのデータは示されていない。
ＥＬＩＳＡおよびＯｃｔｅｔビニングアッセイ分析の結果をまとめて図９に示し、これは、どの抗Ｔｉｅ２抗体が互いに競合し、同一または類似のエピトープに結合する可能性が高いかを示す。具体的には、上記の結合アッセイは、ファージ由来抗体Ｔｉｅ２．１（Ａｂ１）、Ｔｉｅ２．１２（Ａｂ１２）、Ｔｉｅ２．２４（Ａｂ２４）およびＴｉｅ２．３３（Ａｂ３３）が全てＴｉｅ２ ＩｇＧ２ドメインに結合し、Ｔｉｅ２に対するＡｎｇ１およびＡｎｇ２の結合を遮断し、Ｔｉｅ２アゴニストであることを実証した（例えば、ＡＫＴおよび／またはＴｉｅ２のリン酸化を増強し、および／または血管内皮膜の完全性を上昇させる）。
合わせると、結果は、本明細書に記載の抗Ｔｉｅ２抗体によって結合された少なくとも３つのエピトープクラスがあることを示している。これらの少なくとも３つのエピトープクラスを図９に示す。
抗Ｔｉｅ２ ＩｇＧ抗体の親和性決定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、選択した抗Ｔｉｅ２ ｈＩｇＧの一価親和性を決定した。抗ヒトＦｃをＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に共有結合的に固定化して抗Ｔｉｅ２抗体の非共有結合的捕捉を可能にし、ヒトまたはラットＴｉｅ２ ＥＣＤ．ｆｌａｇの結合を、多サイクル動態実験フォーマットを用いて２５℃でリアルタイムでモニタリングした。サイクル間で、表面を３ Ｍ ＭｇＣｌ２で再生した。一価の親和性を、１：１結合モデルをデータに当てはめるためにＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して動態分析によって決定した。結果を表６にまとめている。
Figure 2023519213000049
実施例５－抗Ｔｉｅ２抗体のインビボ生成
ファージ提示に加えて、治療用途に有用であり得る抗Ｔｉｅ２抗体の生成を動物免疫によって行った。
ウサギ免疫化ニュージーランドホワイトウサギをヒトおよびカニクイザルＴｉｅ２（配列番号１、残基２３～４４２）のＥＣＤで免疫化し、公開された文献、例えばＳｅｅｂｅｒら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（２）、２０１４参照に関する改変プロトコルを使用して単一Ｂ細胞を単離した。Ｂ細胞培養上清を、ヒト、ラットおよびカニクイザルＴｉｅ２ならびに無関係な対照タンパク質への結合についてＥＬＩＳＡによってアッセイし、ＨＵＶＥＣ細胞への結合についてＦＡＣＳによってアッセイした。Ｔｉｅ２特異的Ｂ細胞を溶解し、直ちに－８０℃で凍結し、分子クローニングまで保存した。ウサギＢ細胞由来の各モノクローナル抗体の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を、先に記載したように、抽出したｍＲＮＡ由来の発現ベクターにクローニングした、例えば、Ｓｅｅｂｅｒら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（２），２０１４参照。個々の組換えウサギ抗体をＥｘｐｉ ２９３細胞で発現させ、続いてプロテインＡで精製した。精製した抗Ｔｉｅ２抗体を、機能活性アッセイと動態スクリーニングに供した。
ラット免疫化ラットを同様の方法で免疫化し、ハイブリドーマを、改変融合パートナを用いて作製した（例えば、Ｐｒｉｃｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１；３４３（１）：２８－４１（２００９）参照）。種々の条件を最適化して、個々のＩｇＧ＋ｈｕＴｉｅ２＋ハイブリドーマを単一のウェルへのソーティングを可能にし、次いで、ソーティング後にさらなる培養を行った。得られたハイブリドーマ上清を、ヒト、マウスおよびカニクイザルＴｉｅ２ならびに無関係な対照タンパク質への結合についてＥＬＩＳＡによってアッセイし、ＨＵＶＥＣ細胞への結合についてＦＡＣＳによってアッセイし、陽性試料を、その後の機能的および動態特性評価のためにプロテインＡを使用して精製した。
抗ＩｇＧ架橋剤を用いたラットおよびウサギクローンの機能的スクリーニング。
上記のようにラットおよびウサギの免疫化から生成された抗体を、Ｔｉｅ２アゴニズムの下流でのｐＡＫＴ誘導に関して特徴付けた。
細胞および抗体：ヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞
をＬｏｎｚａ（カタログ番号ＣＣ－２５１７；ロット番号００００３２１０４６）から購入し、ラット大動脈内皮細胞（ＲＡＥＣ）をＶＥＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、増殖培地（ＶＥＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＮＣ，ＣＡＴ＃ＭＣＤＢ－１３１ １０）中で培養した。抗Ｔｉｅ２抗体をＧｅｎｅｎｔｅｃｈで調製した。架橋剤として使用される種特異的抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入した。
ＨＵＶＥＣの調製：ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、滅菌９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３９９７）に０．４×１０５細胞／ウェルの培養培地１００μｌで播種し、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベートした。培養培地を除去し、１００μＬの予熱した血清飢餓培地（基礎培地ＥｎｄｏＧＲＯ（商標）；カタログ番号ＳＣＭＥ－ＢＭ）をプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータ内で３時間インキュベートした後、Ｔｉｅ－２アゴニストとインキュベートした。
ＲＡＥＣの調製：ＲＡＥＣを９６ウェル細胞培養プレートに１２，０００細胞／ウェルの密度で播種し、１００μｌのＥＧＭ２ ＭＶ培地中で５％ ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。一晩培養した後、細胞を０．１％ ＢＳＡを含むＥＢＭ２基礎培地中で３時間飢餓状態にした後、Ｔｉｅ－２アゴニストとインキュベートした。
架橋抗Ｔｉｅ２抗体の効果を試験するために、アッセイ緩衝液（ＧＮＥ培地調製設備からの基礎培地＋０．２％ ＢＳＡ）中の２０μｇ／ｍｌの架橋剤を、等体積の６０μｇ／ｍｌの抗Ｔｉｅ２二価抗体と混合し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、抗体を３倍の連続希釈に供した。
他のＴｉｅ２アゴニストを試験するために、分子をアッセイ緩衝液中で最初に高ストック濃度（典型的には３０～１０００μｇ／ｍｌ）に希釈し、続いて（典型的には２～１０倍）連続希釈した。血清飢餓培地を除去した後、これらの希釈液（５０μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で１５分間インキュベートした。溶液を除去し、ｐＡＫＴ Ｓｅｒ４７３キット（Ｃｉｓｂｉｏ、参照番号６４ ＡＫＳＰＥＨ）からのブロッキング緩衝液を含有する５０ｕｌの溶解緩衝液を細胞に添加した。プレートを穏やかに振盪しながら室温で約３０～４５分間インキュベートし、使用するまで－８０℃冷凍庫に保つか、またはＦＲＥＴアッセイで直接使用した。
ＦＲＥＴアッセイ：細胞溶解物（１５μｌ）を氷上で解凍し、次いで、３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，カタログ番号７８４０８０）で、ｐＡＫＴ Ｓｅｒ４７３キットからの各リン酸化－ＡＫＴ ｄ２抗体およびリン酸化－ＡＫＴ Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体の５μｌの１：４０希釈物と混合し、プレートを室温で４時間または４℃冷蔵庫で一晩インキュベートし、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、ソフトウェアバージョン：５．０１ Ｒ２）で６２０ｎｍおよび６６５ｎｍで読み取った。データは、各個々のウェルについて、アクセプターおよびドナー発光シグナルの比×１０４として計算した。
組換え抗体の生成
抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを遺伝子合成によって作製し、ＩｇＧ１抗体の重鎖発現および軽鎖発現のための哺乳動物ベクターにそれぞれ挿入した。いくつかの可変ドメイン配列を編集して、明らかな不対システイン残基およびＮＸ［Ｓ／Ｔ］Ｎ－グリコシル化モチーフを除去した。組換え抗体を、抗体の重鎖および軽鎖をコードする哺乳動物発現ベクターによるＥｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって作製した。重鎖および軽鎖を別々のベクター上にコードし、１：２の比の重鎖発現ベクター対軽鎖発現ベクターを使用してトランスフェクトした。抗体をアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。いくつかの場合において、抗体は、ＳＥＣに基づくさらなる精製工程を受けた。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ ２００機器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、組換えヒトおよびカニクイザルＴｉｅ２への結合について抗体をスクリーニングした。端的に言えば、ヒト抗体捕捉チップを、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５チップ、ヒト抗体捕捉キット、およびアミンカップリングキット（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して作製した。流速１０μｌ／分、接触時間２０秒を使用して５μｇ／ｍｌに希釈した抗体を捕捉した。捕捉された抗体に対する３００ｎＭおよび１５００ｎＭの組換えヒトおよびカニクイザルＴｉｅ２細胞外ドメインの結合を、５０μｌ／分の流速、６０秒の接触時間および１２０秒の解離時間を用いて、単一サイクル動態法を用いて３７℃で分析した。サイクル間に、３０μｌ／分で３０秒間注入した３Ｍ ＭｇＣｌ２を使用してチップを再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを評価した。パラメータＲＩを０に設定した１：１結合モデルを用いて動態定数を得た。Ｆａｂ－ＮＤＫフォーマットにおける二次活性スクリーニングのために、選択された抗体（表７Ａ～７Ｂ；ｃｈはウサギＡｂを示し；ＴＥＫはラットＡｂを示す）を進めた（以下の実施例８参照）。
Figure 2023519213000050
Figure 2023519213000051
ＨＴＰエピトープビニング
動物免疫化によって生成された抗体、および実施例１に記載される選択されたファージ由来抗体をｈＩｇＧ１骨格に再フォーマットし、ビニングを、ＤＡｖ６．１９．３、ＩＢＩＳ ＳＵＩＴ、ＳｐｒｉｎｔＸおよびＣａｒｔｅｒｒａ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｔｏｏｌソフトウェアを備えたＣＦＭ ２／ＭＸ ９６ ＳＰＲシステム（Ｗａｓａｔｃｈ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、現在はＣａｒｔｅｒｒａ）を使用して行った。抗体を、１０ ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ４．５固定化緩衝液を使用するアミンカップリングによってＳＰＲセンサープリズムＣＭＤ ２００Ｍ（Ｘａｎｔｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ）に固定化した。固定化を、ＣＦＭ２機器を用いて行い、次いで、センサープリズムを、ＳＰＲに基づく競合分析のためにＩＢＩＳ ＭＸ９６機器に移した。固定化された抗体を、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を使用して、最初に１μＭの組換えヒトＴｉｅ２細胞外ドメインに曝露し、次いで、溶液中の２０ｕｇ／ｍｌの抗体に曝露した。結果を図１１Ａ～図１１Ｂに示し、いくつかの異なるＴｉｅ２サンドウィッチプロファイルを示す。図１１Ａ～１１Ｂの結果は、典型的には、分析された抗体パネル内の複数（例えば、少なくとも８）の異なるＴｉｅ２エピトープの存在を実証するものと解釈される。興味深いことに、データは、Ｔｉｅ２．１、Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ（実施例１１で後述）、Ｔｉｅ２．１２およびＴｉｅ２．２４は、全てＴｉｅ２アゴニストとして機能することができ、これらが共にビニングすることを示す。
実施例６－ＰＥＧコンジュゲート抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ多量体の生成
実施例３において上に示されるように、抗Ｔｉｅ２抗体によるＴｉｅ２の活性化は、結合した抗Ｔｉｅ２抗体の架橋によって促進される。したがって、最適な治療有効性を有する多量体構成を決定するために、多量体Ｔｉｅ２結合組成物を設計および生成した。
使用した多量体化の１つの方法は、各アームが単一の抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ分子に連結またはコンジュゲートされているコアとしての多アーム型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の使用であった。高い親和性でＴｉｅ２に特異的に結合し、Ｔｉｅ２アゴニストとして機能する（Ｔｉｅ２と相互作用するとＡＫＴのリン酸化を活性化する）ことが示されたＴｉｅ２．１ Ｆａｂを使用して、様々な多量体構成を試験した。具体的には、Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂを、重鎖のＣ末端がアミノ酸残基ＳＰＰＣ（配列番号８９）を含むように改変して、ＰＥＧ部分がコンジュゲートされ得るリンカーおよびシステインを提供した。この「Ｔｉｅ２．１－ＳＰＰＣ」Ｆａｂを、様々な数のアームおよびアーム長さを有するＰＥＧ－マレイミド骨格にコンジュゲートした（多アーム型ＰＥＧ－マレイミドは、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ、Ｐｌａｎｏ、ＴＸから入手した。）。
Ｆａｂ精製および脱ブロッキング
全てのクロマトグラフィー樹脂はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから供給された。
Ｆａｂを大腸菌で発現させた。大腸菌ペレットを、２５ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．５（ＥＱ）に１．５ Ｌ／Ｋｇ再懸濁し、１０００ｂａｒで２回マイクロ流動化した。ＰＥＩを最終濃度０．４％までゆっくり添加し、次いで、４°Ｃで一晩撹拌した。次いで、懸濁液を１５，０００ｇで６０分間遠心分離し、上清を０．２２ ｕｍ濾過した。次いで、大腸菌濾液を、３０ ｍｌ／分のＥＱで平衡化した１．２Ｌ Ｇａｍｍａｂｉｎｄ Ｐｌｕｓ（ＧＢＰ）カラムにロードし、次いで、０．１％ ＴＸ１１４および０．１％ ＴＸ１００を含有する２ＣＶのＥＱで３０ ｍｌ／分、４ＣＶのＥＱで５ ｍｌ／分で洗浄した。これに続いて、２ＣＶのＥＱで３０ ｍｌ／分、次いで２ＣＶの２５ｍＭコハク酸塩ｐＨ６．０で３０ ｍｌ／分、０．１５Ｍ酢酸で３０ ｍｌ／分で溶出した。溶出液をカラムから１ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０でｐＨ５．０になるまで中和した。
あるいは、大腸菌濾液を、３５ ｍｌ／分のＥＱで平衡化した１．７ＬのＣａｐｔｏ Ｌカラムに負荷し、次いで、２ ＣＶのＥＱで５０ｍｌ／分で洗浄し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００を含有する５ＣＶのＥＱで４ｍｌ／分で洗浄し、次いで、２ ＣＶのＥＱで５０ｍｌ／分で洗浄し、次いで、２５ ｍＭコハク酸塩ｐＨ ６．０で５０ ｍｌ／分で洗浄し、０．１５ Ｍ酢酸で５０ ｍｌ／分で溶出した。溶出液をカラムから１ Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０でｐＨ５．０になるまで中和した。
中和したＧＢＰまたはＣａｐｔｏ Ｌ溶出液を２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．０（Ａ）で１～３倍に希釈し、陽イオン交換樹脂（ＳＰＨＰ）にロードした。カラムを、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有する２ＣＶ（Ａ）５ＣＶ（Ａ）、続いて２ＣＶ（Ａ）で洗浄し、次いで、画分を回収しながら、１Ｍ ＮａＣｌ（Ｂ）を含有する１０ＣＶの０～２０％勾配の（Ａ）で勾配溶出した。Ｆａｂピークを含む画分をプールした。
精製したＦａｂプールを、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．５を用いてｐＨ ８．０に調整し、ＥＤＴＡを２ｍＭの最終濃度まで添加した。Ｆａｂを還元させるために、５０倍モル過剰のＤＴＴを溶液に添加し、次いで、２２℃で一晩インキュベートし、質量分析により添加物除去を確認した。
１０％酢酸でｐＨを５．２に調整した後、還元されたＦａｂをＳＰＨＰに結合させ、１０ＣＶの２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．０で洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０で溶出した。溶出したＦａｂプールを１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．５）でｐＨ ８．０にし、２ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、１５倍モル過剰のＤＨＡＡを使用して再酸化を進行させた。１．５時間後、Ｆａｂを質量分析により再酸化についてチェックし；必要に応じて、さらに１０倍モル過剰のＤＨＡＡを添加し、試料を１時間インキュベートし、再検査した。次いで、再酸化したＦａｂを１０％酢酸でｐＨを５にし、上記のようにＳＰＨＰカラムで精製したが、２０ＣＶの１０～６０％勾配（Ｂ＝２５ ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ５．０；で溶出し、主要ピークは１０ｋＤに濃縮され、０．２ｕｍ濾過した。他のＦａｂは、本質的に同じ方法で精製および脱ブロッキングすることができる。
六量体コンジュゲートおよび精製
Ｔｉｅ２．１－ＳＰＰＣを、２５ｍＭ ＮａＯＡＣ、ｐＨ ５．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ中、約１０ ｍｇ／ｍＬの濃度でＪｅｎＫｅｍ製の６ＫＤａ ＰＥＧ六量体にコンジュゲートした。室温に平衡化した後、ＪｅｎＫｅｍ製の６ＫＤａ ＰＥＧ六量体を、３ｍＭの濃度まで２５ｍＭの酢酸Ｎ（ｐＨ５．０）に再懸濁した。ｐＨは、ｐＨ６以下に維持して、マレイミド開環を回避した。ＰＥＧを可溶化し、これを９：１（Ｆａｂ：ＰＥＧ）のモル比でＴｉｅ２．１－ＳＰＰＣ脱ブロッキングＦａｂに添加した。次いで、混合物を、穏やかに一晩撹拌しながら室温で放置した。コンジュゲート後、Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ ＰＥＧ六量体を、２０ ｍＭ Ｈｉｓ－アセテート、ｐＨ ５．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－２００カラムでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製し、この精製工程により、コンジュゲート混合物から過剰なＦａｂおよび凝集が除去された。還元および非還元のＮｕＰａｇｅ ４～１２％ビストリスゲルを実行して、どのコンジュゲート画分をさらに精製して六量体を濃縮するかを決定した。コンジュゲート画分をプールし、ＧＥ製のＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ強カチオン交換樹脂を使用するカチオン交換（ＣＥＸ）によってさらに精製し、６つのＦａｂ／ＰＥＧを濃縮した。ＣＥＸ工程を２５ ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ５．０中で行い、４４．５ ＣＶで緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂは２５ｍＭ ＮａＯＡＣ、ｐＨ ５．０、３００ ｍＭ ＮａＣｌである）中２０％～３３．４％の勾配、１０分で３３．４％～５０％Ｂの勾配を用いて溶出し、最後に１００％Ｂで溶出した。異なる画分の少数の異なるミニプールを上記のようにゲル上で実行し、データを使用してどの画分をプールするかを決定する。ミニプール３をプールし、次いで、ＰＢＳ、ｐＨ７．２に４０ ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
次いで、最終試料を、緩衝液として０．２Ｍ ＫＰＯ４、０．２５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ６．２、１５％イソプロピルアルコール中のＴＳＫｇｅｌ Ｇ ３０００ ＳＷ ｘｌカラムを使用して分析ＳＥＣで実行して、存在する凝集のパーセンテージを決定した。これはまた、前述のようにゲル上で実行した。
ＦａｂＩｇＧ精製
ＣＨＯ馴化培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、次いでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）Ｓ２００カラムで精製した。あるいは、アフィニティー溶出を希釈し、陽イオン交換（ＳＰＨＰ）にロードし、次いで洗浄し、塩勾配で溶出した。次いで、精製されたモノマーピークを濃縮し、製剤緩衝液中に透析し、０．２ ｕｍ滅菌濾過した。
ＦａｂＩｇＧと六量体ｐＡＫＴ活性の比較
Ｔｉｅ２．１．３８は、Ｔｉｅ２を活性化するバイエピトープＦａｂ－ＩｇＧである（ＨＣは本明細書において配列番号５４として提供され、ＬＣは本明細書において配列番号５３として提供される。ＰＥＧ－六量体フォーマット（ＳＰＰＣを介してＨＣのＣ末端に連結された６ｋＤａのＰＥＧ）およびＴｉｅ２．１．３８（ＩｇＧフォーマットによって提供される架橋）におけるＴｉｅ２．１の能力を評価するために実験を行った。Ｔｉｅ２．１－ＰＥＧ－六量体では、より高い効力活性化が見られた（図１２Ａ）。
多アーム型ＰＥＧを介して多量体化された抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂのアゴニスト活性
１０μｇ／ｍｌのＰＥＧ－多量体をＲＡＥＣと共にインキュベートし、ｐＡＫＴレベルの変化を記載のように評価した（実施例３）。より多くのアームおよび／またはより短いアームでのより高い活性への傾向があり、６アーム、６ ｋＤａコアおよび８アーム、２０ ｋＤａコアがほぼ最大の活性を示す（図１２Ｂ）。
実施例７－ＩｇＭフォーマットを使用した抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂの多量体化
抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂを多量体化する他の方法を、ＩｇＭフォーマットを使用して開発した。Ｔｉｅ２．１由来のＶＨをコードするＤＮＡをＩｇＭ ＣＨ１に融合した。理論に束縛されるものではないが、複数の可変断片（Ｆｖ）の熱結合は、ＩｇＭが実質的な親和性成熟なしに標的に結合することを可能にすると考えられている（Ｂｏｅｓ，２０００，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３７：１１４１－１１４９）．。
ＩｇＭ発現および精製の最適化
ヒトＩｇＭ（ｈｕＩｇＭ）を、製造業者によって推奨されるようにＥｘｐｉ２９３細胞の３０ｍｌ培養物中で発現させた（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの「Ｅｘｐｉ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ，」公開番号ＭＡＮ ０００７８１４を参照されたい）。種々の比率のＩｇＭ重鎖対軽鎖（六量体）または重鎖対軽鎖対Ｊ鎖（五量体）を細胞にトランスフェクトした。収集した上清を、Ｃａｐｔｏ Ｌ樹脂（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の推奨に従って使用してアフィニティー精製した（例えば、Ｌｏｍｂａｎａら、２０１９，ｍＡｂｓ，１１：１１２２－１１３８を参照）。タンパク質の全収率をＡ２８０によって評価し、純度をＷａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＳＥＣ ４５０オングストロームカラムを使用する分析ＳＥＣによって評価した。図１３Ａは、アフィニティーカラムから単離されたタンパク質の総収率に対する、ｈｕＩｇＭ重鎖対軽鎖対Ｊ鎖（含まれる場合）の様々な比の影響を示す。
六量体最適化は、１：１または２：１の比率のプラスミドＤＮＡでＬＣおよびＨＣを含有するプラスミドを細胞にトランスフェクトすることによって進めた。各比は同様の総タンパク質収量をもたらした（３０ ｍｌの発現から２．５～３ｍｇ）が、生成物の品質は１：１の比で改善され、ＬＣ－二量体の存在量は減少した。Ｊ鎖をトランスフェクトに含めることによって推定五量体の発現を行った。４：４：１ ＬＣ：ＨＣ：ＪＣの最適比は、発現と生成物品質の両方を最大化した（図１３Ａ－１３Ｂ）。特に、最適化された条件におけるＪＣと比較して高いレベルのＬＣおよびＨＣ ＤＮＡは、最終的なＩｇＭ五量体における１０：１０：１鎖比に近似する。
五量体および六量体ＩｇＭの発現のために最適化された鎖比を有して、ヒトおよびマウスの六量体および五量体ＩｇＭの発現および精製をスケールアップした。約２０ｍｇ／Ｌの精製六量体または五量体ＩｇＭを、ＣＨＯ細胞から２段階精製によって単離した。一時的な収率は、このプロセスの下で発現されるＩｇＧに典型的なものよりも３～４倍低いが、眼用薬物の低い材料要件と組み合わせた比較的容易な精製は、製造の実現可能性を促進するはずである。ヒトＩｇＭの鎖組成を、還元種および脱グリコシル化種のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＬＣ－ＭＳによって確認し、存在する場合にはＬＣ、ＨＣおよびＪＣの存在を示した。サイズ排除クロマトグラフィーは、五量体および六量体マウスＩｇＭならびに六量体ヒトＩｇＭについて単分散ピークを示した。五量体ヒトＩｇＭは、両方ともＪ鎖を含有し、ＳＥＣによる高い見かけ上のＭＷを有する２つの密接に関連するピークでＳＥＣから溶出された。光散乱による評価により、六量体（約１０５０ｋＤａ）の予測分子量が五量体（約９５０ｋＤａ）の予測分子量をわずかに超える約１２ｎＭの流体力学半径（Ｒｈ）が見出された（以下の表９）。
Figure 2023519213000052
旋回半径と流体力学的半径との比（Ｒｇ／Ｒｈ）は、平均約０．７７５の球状分子、およびより細長い種がより高くなる傾向にある分子形状に対するいくつかの洞察を提供する。単分散ＩｇＭは、予想される構造と一致して０．８５～０．９１の範囲であった。ＩｇＭネガティブ染色のポリマー同一性をさらに評価するために、ＴＥＭおよび参照なしの２Ｄ分類を使用して、予想される幾何学的形状と一致するように見えるＩｇＭ粒子の構造を記載した。推定ヒト五量体に対応する２つのピークの間に明らかな差は観察されなかった。ヒトＩｇＭ六量体ピークをさらなる調査のために選択した。１１０のＴＥＭ顕微鏡写真を手動で収集し、合計１５００の粒子を得た。Ｒｅｌｉｏｎ ｓｕｉｔｅ（Ｓｃｈｅｒｅｓ，２０１５，Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，１８９：１１４－１２２）を使用した３回の参照なしの２Ｄ分類の後、粒子の大部分が六量体構造に組織化されることが見出された。少数の粒子（２％未満）が五量体に精製された。ＩｇＭ五量体（ＣｚａｊｋｏｗｓｋｙおよびＳｈａｏ，２００９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０６：１４９６０－１４９６５）に対する以前の構造的調査と一致して、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインは、画像の平面に直交するステム様ドメインを形成すると考えられる。さらに、同じＦｃに結合したＦａｂの対は同一平面上にあるように見えるが、隣接するＦｃ上のＦａｂはオフセットされているという何らかの指標がある。部分的なオフセットは、六量体が立体的に混雑した環境に全ての鎖を収容することを可能にし得る。これらのデータに基づいて、製造の純度の改善およびＪＣの欠如のために、ヒト六量体ＩｇＭが好ましい治療足場として選択され、これは共に製造を単純化し、インビボでの多量体Ｉｇ受容体媒介結合を考慮する必要性を排除する。
眼投与のためのＩｇＭの特徴付け
次に、ニュージーランドシロウサギをモデルシステムとして使用して、眼用途に対するＩｇＭの適合性を調査した。ウサギにおけるＰＫパラメータは、以前にカニクイザルおよびヒトにおける結果と相関していた。ＩｇＭの薬物動態評価を妨害する抗薬物抗体のリスクを最小限に抑えるために、完全ウサギＩｇＭ六量体（細胞内エピトープを標的とするウサギＦｖを有するウサギＩｇＭ Ｆｃ）を生成した。頻繁な反復注射を避けるために、注射されるタンパク質の量、したがって濃度が最大化される。したがって、タンパク質の粘度はかなり重要である。ＩｇＭ六量体の粘度を、以前に調査された他の多価化合物（Ｓｈａｔｚら、２０１９，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，１４：ｅ ０２１８６１３－ｅ ０２１８６１３）、具体的には、それぞれ８および４のＦａｂで終端する８アーム型４０ｋＤａ分岐ＰＥＧおよび４アーム型２０ｋＤａ分岐ＰＥＧの両方に対して評価した（図１３Ｃ）。３種全ての粘度計の読み取り値は、予想される対数線形応答を示す。患者の疼痛またはシリンジへの過度の背圧（約１０～５０ｃＰ）を伴わない硝子体内投与に有利な粘度の下、他のフォーマットと比較して約２倍の質量のＩｇＭを投与することができる。
ｒａｂＩｇＭのＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析により、Ｆａｂについて以前に観察された２．５ｎＭの半径よりもかなり大きい１２．９＋／－１．１ｎＭの流体力学的半径が見出された。分子サイズのこの増加の機能的結果を評価するために、ウサギＦａｂおよびＩｇＭをＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８で標識し、０．５ｍｇまたは１．２ｍｇをそれぞれニュージーランドホワイトウサギに硝子体内投与した。寿命定量的蛍光測定を２８日間にわたって行い、２つの治療剤のそれぞれの耐久性が明らかになった（図１３Ｄ）。この実験では、Ｆａｂは３．５日の半減期を示し、ウサギ硝子体中の他のＦａｂについて観察された約３．４日の典型的な半減期に匹敵した（Ｃｒｏｗｅｌｌら、２０１９、Ｔｒａｎｓ Ｖｉｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ、８：１－９）。ＩｇＭは、そのより大きなサイズと一致して、７．８日間の実質的に長期の曝露を示した。
急速な全身性クリアランスが眼に対する眼治療剤の活性を制限するのに役立つので、ＩｇＭの全身曝露も興味深い。血清または腹水から単離されたＩｇＭの以前の調査は、数日間（例えば、Ｍａｉｏｒｅｌｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）、１９９３、１１：３８７～３９２）の半減期を報告しているが、組換え産生された材料は、はるかに迅速に消失する（例えば、Ｒａｓｃｈｅら、２０１５，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，１００：３７７－３８４）。これらの知見を確認するために、非結合組換えヒトＩｇＭ五量体および六量体のＰＫを、ヒト血清から単離されたＩｇＭと比較した（図１３Ｅ）。ＳＣＩＤマウスへの静脈内注射後、組換えＩｇＭ五量体および六量体は迅速に除去され（それぞれ０．２５日および０．５０日のｔ１／２）、単離されたＩｇＭはより長期の曝露を示した（ｔ１／２＝２．１～２．９日）。急速なクリアランスは、異なるグリカン占有率またはＩｇＭの組成に起因し得ると仮定される。ヒト五量体あたり最大５１、ヒト六量体あたり６０のＮ結合型グリカンが存在する。この理論を支持して、グリカン分析は、ヒト血清から精製されたＩｇＭ上のグリカンの７５％が、それぞれ組換え六量体および五量体の２４％および２９％に対して少なくとも１つのシアル酸を含有することを示した（図１３Ｆ）。
ｈｕＩｇＭ変異体の補体活性を最小限に抑えるためのタンパク質工学。
ＩｇＭは、Ｔｉｅ－２アゴニストにとって望ましくない可能性がある十分に確立された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有する。潜在的ＣＤＣを減少させるｈＩｇＭ Ｆｃ変異体を同定するために、リツキシマブ（抗ＣＤ２０抗体）由来の可変領域をｈＩｇＭの定常領域に融合した。リツキシマブＩｇＧは、ＣＤＣを誘導することが周知である。このリツキシマブ－ＩｇＭを、選択されたＦｃ変異と共に、ｈＩｇＭ六量体として発現させ、精製した。ＩｇＭの影響を研究するために、補体活性を本質的に記載のように評価した（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ，２２，１６３－１７１（１９９７）参照）。簡潔には、１／５ヒト補体希釈物（最終体積１００μＬ）の存在下で、ＩｇＭの３倍連続希釈物を５万個のＷｉｌ－２Ｓ細胞に添加し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ）５０ ｕＬをプレートに添加し、それらを３７℃でさらに５時間インキュベートした。プレートを室温に１０分間冷却し、９６ウェル蛍光光度計を使用して５３０ ｎＭで励起し、５９０ ｎＭで発光する蛍光を読み取り、蛍光の減少はＣＤＣ媒介性細胞溶解を示した。４つの部位（Ｎ１７１Ｑ、Ｎ３３２Ｑ、Ｎ３９５Ｑ、Ｎ５６３Ｑ）を、コンセンサスＮ結合型グリコシル化モチーフ（図１３Ｇ）における突然変異で評価した。
これらの突然変異は、製造可能性または全身ＰＫを改善し得るが、ＣＤＣに影響を及ぼさなかった。さらに、マウスＩｇＭについてＣＤＣを減少させることが示されたＳ４０６Ｎ変異（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６５（１８）、１０５０６－１０５１３，（１９９０）を参照）は、ヒトＩｇＭに影響を及ぼさなかった。重要なことに、Ｐ４３４Ｇ変異体はＣＤＣ活性を完全に無効にし、ＩｇＭ六量体を眼治療薬として有用にした。
ＩｇＭおよびＰＥＧ－六量体活性の比較
眼投与に対するＩｇＭの適合性を特徴付けて、本発明者らは次に、関連するシグナル伝達経路を活性化するそれらの能力を調べることに目を向けた。Ｔｉｅ２標的化ＩｇＭ六量体を発現させ、Ｔｉｅ２の下流でリン酸化－ＡＫＴシグナル伝達を駆動する能力について分析した。ラット大動脈内皮細胞を、漸増用量の内皮標的化Ｔｉｅ２．１－ｈＩｇＭ六量体、Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ六量体（ＰＥＧ六量体にコンジュゲートされたＳＰＰＣで終端させたＴｉｅ２．１ Ｆａｂ）または非標的化抗ＣＤ２０ ｈＩｇＭ六量体のいずれかで１５分間処理し、溶解し、細胞内リン酸化－ＡＫＴレベルを均一な時間分解蛍光を用いて評価した。細胞リン酸化－ＡＫＴレベルの増加は、Ｔｉｅ２．１－ｈＩｇＭおよびＴｉｅ２．１ ＰＥＧ六量体についてのみ見られた（図１３Ｈ）。架橋の非存在下では、対応するＩｇＧについて活性は見られなかった（データは示さない）。興味深いことに、Ｔｉｅ２．１ ｈＩｇＭ六量体およびＴｉｅ２．１ ＰＥＧ六量体はピコモル濃度で活性であったが、ｐＡＫＴ産生は高濃度で部分的に抑制される。細胞表面上の六量体の過飽和は、Ｔｉｅ２のクラスター化の程度を減少させ、結果として下流のシグナル伝達を減少させると推測される。それでも、１００ ｎＭのＩｇＭ（約１００ｕｇ／ｍｌ）において、最大活性の約３０％が達成された。これらのデータは、Ｔｉｅ２．１六量体がタンパク質濃度において少なくとも３桁にわたってＴｉｅ２シグナル伝達を駆動する可能性が高いことを示唆している。
実施例８－Ｔｉｅ２アゴニスト抗体の同定および比較のための代用六量体フォーマットの開発
候補抗体スクリーニング方法のスループットおよび関連性を高めるために、Ｆａｂ重鎖のＣ末端を六量体の構成サブユニットのＮ末端に遺伝的に融合することによって、抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂの六量体多アーム型ＰＥＧへのコンジュゲートの代用物として使用することができるホモ六量体タンパク質を検索および同定した（図１４Ａを参照）。そのような融合タンパク質は、精製されたＦａｂの化学的コンジュゲートを必要とせずにインビトロ分析のためのＦａｂ六量体の産生を促進すると推論された。さらに、そのような融合タンパク質は、潜在的な新しい抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体候補のインビトロ活性評価のためのＰＥＧ－Ｆａｂ六量体のインビトロ代替物として使用することができる。
真核生物のヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）酵素は、露出したＮ末端（Ｍｏｒｅｒａら、１９９４、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２４３：８７３～８９０）を有するホモ六量体四級構造（Ｌａｓｃｕら、２０００、Ｊ Ｂｉｏｅｎｅｒｇ Ｂｉｏｍｅｍｂｒ、３２：２２７～２３６）を有する。さらに、システインを含まず、高度に熱安定性のＮＤＫ配列が報告されている（Ａｋａｎｕｍａら、２０１３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１１０：１１０６７～１１０７２）。この酵素ファミリーに由来するアミノ酸配列の試験ＦａｂのＣ末端への遺伝子融合は、ＰＥＧ－Ｆａｂ六量体と同様の幾何形状を有するＦａｂ六量体の発現および精製を可能にし得るが、日常的な発現および精製方法により適しており、例えばＨＵＶＥＣ ｐＡＫＴアッセイにおける複数の候補抗体の細胞ベースの活性分析を容易にすることが推論された。
Ｆａｂ－ＮＤＫ融合タンパク質の設計および生成
したがって、Ｔｉｅ２．１または陰性対照抗体（ｇＤ．５Ｂ６）のいずれかをコードするＦａｂの重鎖Ｃ末端が５の異なる候補ＮＤＫ配列のうちの１つに遺伝的に融合されたＦａｂ－ＮＤＫ融合タンパク質のパネルを作製した。ＮＤＫ配列を文献（表１０）から選択し、以下に記載されるように改変し、ＮＤＫ配列に融合したＦａｂ重鎖をコードする発現ベクターを遺伝子合成によって構築した。重鎖発現ベクターの軽鎖発現ベクターに対する比は２：１、１：１および１：２であり、それぞれ列ヘッダＨ２Ｌ１、Ｈ１Ｌ１およびＨ１Ｌ２によって示されている。表１０は、融合タンパク質収率を提供する。
Figure 2023519213000053
 ＊配列番号はＮＤＫペプチド配列のみのためのものである
いずれの場合も、Ｆａｂ ＨＣはアミノ酸ＫＴＨＴ（ＥＵナンバリングあたりアミノ酸２２２～２２５）を含み、そこで終端し、４のグリシン残基からなる短いリンカー配列をＦａｂ重鎖とＮＤＫ配列との間に挿入してさらなる可撓性を提供した。ＮＤＫ配列はまた、触媒活性を不活化することが文献で報告されている変異である、Ｎ末端メチオニン残基の除去およびヒスチジン１１８のフェニルアラニンへの変異によって編集した（Ｐｏｓｔｅｌ ａｎｄ Ｆｅｒｒｏｎｅ，１９９４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９：８６２７－８６３０）。Ｆａｂ軽鎖を、さらなる改変なしに別々の発現ベクター上にコードした。
Ｅｘｐｉ２９３細胞をＦａｂ－ＮＤＫ重鎖および軽鎖発現ベクターでコトランスフェクトし、カッパ軽鎖を含む抗体断片の精製用に設計されたアフィニティークロマトグラフィー樹脂Ｃａｐｔｏ Ｌ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して生成物を精製した。Ｆａｂ－ＮＤＫ３およびＦａｂ－ＮＤＫ５融合タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製のために選択し、得られた試料の純度を、リン酸系ランニング緩衝液（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．０）およびＴＳＫ ３０００カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって確認した。
Ｆａｂ－ＮＤＫ３またはＦａｂ－ＮＤＫ５としてフォーマットされたＴｉｅ２．１の流体力学的半径を多角度光散乱（ＭＡＬＳ）によって決定し、結果を以下の表１１に要約する。Ｆａｂ－ＮＤＫ３またはＦａｂ－ＮＤＫ５としてフォーマットされたＴｉｅ２．１の流体力学的半径は、Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－Ｆａｂ六量体について別々に決定されたものと有利に比較することは明らかである。
Figure 2023519213000054
Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ－ＮＤＫ構築物の機能評価
次いで、Ｆａｂ－ＮＤＫ３およびＦａｂ－ＮＤＫ５フォーマットを、実施例３に記載の方法を使用してＨＵＶＥＣ ｐＡＫＴアッセイでＴｉｅ２活性化について評価した。Ｔｉｅ２．１および陰性対照抗体を、Ｆａｂ－ＮＤＫ３およびＦａｂ－ＮＤＫ５フォーマットでＨＵＶＥＣ ｐＡＫＴアッセイにおいてＴｉｅ２活性化について評価した。結果を図１４Ｂに示す。
Ｆａｂ－ＮＤＫ３およびＦａｂ－ＮＤＫ５フォーマットのＴｉｅ２．１は、ＰＥＧ－Ｆａｂ六量体フォーマットのＴｉｅ２．１と同様の応答プロファイルを示した。陰性対照抗体は、Ｆａｂ－ＮＤＫ３フォーマットで評価した場合、緩衝液および陰性対照ＰＥＧ－Ｆａｂ六量体等の他の陰性対照と同様の応答プロファイルを示したが、Ｆａｂ－ＮＤＫ５フォーマットで評価した場合、陰性対照抗体はいくつかの濃度でｐＡＫＴシグナル伝達を引き起こした。したがって、本発明者らは、新しい抗Ｔｉｅ２抗体の二次スクリーニングのために、より一般的にはＰＥＧ－Ｆａｂ六量体のインビトロ代替物としてＦａｂ－ＮＤＫ３フォーマットを使用することにした。
ＨＵＶＥＣ ｐＡＫＴアッセイにおけるＴｉｅ２アゴニズムについてのタンパク質六量体のスクリーニング。
代用六量体Ｆａｂ－ＮＤＫ３フォーマットの抗Ｔｉｅ２抗体を、ＨＵＶＥＣ細胞におけるｐＡＫＴシグナル伝達の活性化についてスクリーニングした。２つの例外を除いて、抗体を、３０μｇ／ｍｌの最高濃度からの３倍希釈からなり、３桁を超える規模をカバーする８つの濃度で評価した。２つの例外は、試料の入手可能性によるものであり、より低い濃度でのみ評価されたＴＥＫ－１０５３と、Ｆａｂ－ＮＤＫ３フォーマットで生成することができなかったｃｈ１８Ｅ７とからなった。図１４Ａによって実証されるように、Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ－ＰＥＧ六量体の活性は、Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ－ＮＤＫ分子の活性と非常に類似しており、ＮＤＫ六量体コンジュゲートが六量体ＰＥＧコンジュゲートの代用物として有効であることが確認される。したがって、ＮＤＫ六量体フォーマットは、多量体としての抗Ｔｉｅ２の種々の抗体Ｆａｂのアゴニスト活性を評価するために有用である（例えば、図１４Ａおよび図１４Ｂを参照）。
実施例９－Ｔｉｅ２の細胞レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果
本明細書で詳細に記載されるように、抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体の治療的使用は、Ｔｉｅ２受容体タンパク質への抗体の結合に部分的に依存する。したがって、細胞試料または動物への抗Ｔｉｅ２の投与がＴｉｅ２タンパク質レベルに何らかの影響を及ぼすかどうかを決定するために実験を行った。上記のように生成された抗Ｔｉｅ２抗体を含む組成物を評価し、ＨＵＶＥＣを使用してインビトロで細胞Ｔｉｅ２レベルの低下を誘導するそれらの能力について比較した。
Ｔｉｅ２レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果のインビトロ分析。
ＨＵＶＥＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＣＥ ００１）を、Ｅｎｄｏｇｒｏ培地中の６ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０６個で播種した。抗Ｔｉｅ２抗体を１０ｕｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、３７℃で１６～１８時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８６１２８１）のカクテルを補充した１００ｕｌのＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０－１８８）中で氷上で溶解した。細胞溶解物を１４，０００ ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、抗Ｔｉｅ２ウエスタンブロット（ＷＢ）分析に供した。マウス抗Ｔｉｅ２一次抗体（ＢＤ、カタログ番号５５７０３９）と二次検出抗体（ＨＲＰ抗マウスＩｇ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）を用いて、標準的なＷＢ分析を行った。結果を図１６Ａ～図１６Ｃに示す。図１６Ａに見られるように、動物免疫化によって生成された抗Ｔｉｅ２抗体（ラット抗体ＴＥＫ－１Ａ５、ＴＥＫ－１６６、ＴＥＫ－５３５、ＴＥＫ－１２４８、ＴＥＫ－６９、ＴＥＫ ２３３－Ｖ２およびウサギ抗体ｃｈ１Ｂ７．Ｃ９０Ｑ、ＣＨ６Ｈ６．３）は、六量体フォーマットで評価した場合にＷＢによって検出されるＴｉｅ２レベルを有意に減少させた。対照的に、抗Ｔｉｅ２結合剤Ｔｉｅ２．１２、Ｔｉｅ２．２４、Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦおよびＴｉｅ２．１－ＰＥＧ－六量体は、Ｔｉｅ２タンパク質レベルのはるかに小さい減少を引き起こした（図１６Ａ～図１６Ｃ）。
Ｔｉｅ２レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果のインビボ分析。
インビボアッセイにおいてＴｉｅ２レベルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の効果を評価するために、８～９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）にＩＰ注射によって２０ ｍｇ／ｋｇのＴｉｅ２アゴニストを投与した。マウスを抗Ｔｉｅ２抗体投与後の異なる時点でＣＯ２下で安楽死させた。マウス肺組織を切開し、急速凍結後に－８０℃で保存した。約２０ｍｇのマウス肺組織を、プロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８６１２８１）のカクテルを含有する１ ｍｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０－１８８）中でホモジナイズした。遠心分離による清澄化後、二次検出抗体としてＨＲＰ 抗－マウス（ｍｏｕｅ）ＩｇＧ Ａｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＮＡ９３１Ｖ）とともにマウス抗Ｔｉｅ２（ＢＤ、カタログ番号５５７０３９）を用いて組織溶解液をＷＢ分析に供した。化学発光（ＥＣ）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３２１３２）を使用してＷＢメンブレンを現像した。図１７に示すように、Ｔｉｅ２タンパク質レベルの減少に対するＦａｂ ２．１ ＰＥＧ六量体抗体の効果は、抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ－ＩｇＧ１．３８によって誘発される効果よりもはるかに小さかった。
実施例１０－抗Ｔｉｅ２抗体の保護効果
内皮完全性に対する抗Ｔｉｅ２アゴニストの効果
Ｔｉｅ２を活性化する保護効果は、内皮バリアの破壊を減少させることであると仮定される。ＨＵＶＥＣ透過性アッセイを使用して、本開示の抗Ｔｉｅ２アゴニスト抗体Ｔｉｅ２．１の内皮細胞（ＥＣ）漏出を測定した。アッセイ方法を図１８Ａに示す。
ＨＵＶＥＣ細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＣＥ００１）を、完全Ｅｎｄｏｇｒｏ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＭＥ００２）中、２４トランスウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＥＣＭ ６４４）のウェルあたり０．１×１０６個で播種した。３日後、培養培地を基礎Ｅｎｄｏｇｒｏ培地に交換し、続いて１６時間インキュベートした。次いで、アゴニスト性Ｔｉｅ２抗体、１０ｕｇ／ｍｌを添加した。３０分間または１６～１８時間のインキュベート後、ＦＩＴＣ－デキストラン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＦＤ４０）、５０ ｕｌの５ ｍｇ／ｍｌを各インサートに添加した。異なる時点で各ウェルのレシーバトレイから５０ｕｌの培地を採取し、マイクロプレートリーダー（励起フィルター：４８５ ｎｍ、発光フィルター５３５ ｎｍ）によって測定した。
図１８Ｂに示される結果は、Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ六量体が、ＨＵＶＥＣ細胞を飢餓誘導性漏出から保護するのに有効であったことを示している。アゴニスト性Ｔｉｅ２リガンドである組換えＡｎｇ１を陽性対照として使用した。
Ｔｉｅ２アゴニストの全身投与によるインビボ血管透過性アッセイ
５～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に、腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）注射によってＴｉｅ２アゴニストを投与した。１８時間後、１％のエバンスブルー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０６３３４）をＩＶ注射によって与えた。１０分後、マウスをイソフルラン下で麻酔し、ＶＥＧＦ（自社製）をマウスの耳に注射した。ＶＥＧＦ注射の３０分後、動物をＣＯ２によって安楽死させ、マウスの耳を切除した。耳組織に溢出したエバンスブルーをホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４７６７０－１Ｌ－Ｆ）で抽出し、６２０ｎｍで分光光度的に定量した。アッセイ方法を図１９Ａに示す。図１９Ｂに示すように、Ｔｉｅ２．１－ＰＥＧ－六量体は、耳組織へのエバンスブルーの漏出を低減する。
Ｔｉｅ２アゴニストの局所投与によるインビボ血管透過性アッセイ
５～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に１％のエバンスブルー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０６３３４）を投与し、ＩＶ注射によって与えた。１０分後、マウスをイソフルラン下で麻酔し、抗ＶＥＧＦ Ｇ６．３１またはＴｉｅ２アゴニストであるＨｅｘｍｅｒ ＰＥＧ Ｆａｂ ２．１をＶＥＧＦ（自社製）と共にマウスの耳に皮内注射した。３０分後、動物をＣＯ２によって安楽死させ、マウスの耳を切除した。耳組織に溢出したエバンスブルーをホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４７６７０－１Ｌ－Ｆ）で抽出し、６２０ｎｍで分光光度的に定量した。アッセイプロトコルを図２０Ａに示す。図２０Ｂは、Ｔｉｅ２．１－ＰＥＧ－六量体がＶＥＧＦ誘導性血管透過性を低下させることができることを示す。
Ｔｉｅ２アゴニストの全身投与によるインビボ血管透過性アッセイ
５～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に、腹腔内によって抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ－ＩｇＧ １．３８を投与した。７日後、肺組織を採取し、ウエスタンブロットによってＴｉｅ２タンパク質レベルについて分析した（図２１Ａ）。
５～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に、腹腔内によって抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ－ＩｇＧ １．３８を投与した。４～２４時間後、１％のエバンスブルー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０６３３４）をＩＶ注射によって与えた。１０分後、マウスをイソフルラン下で麻酔し、ＶＥＧＦ（自社製）またはＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ３０１２）をマウスの耳に注射した。ＶＥＧＦまたはＬＰＳ注射の３０分後、マウスをＣＯ２によって安楽死させ、マウスの耳を切除した。耳組織に溢出したエバンスブルーをホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４７６７０－１Ｌ－Ｆ）で抽出し、６２０ｎｍで分光光度的に定量した。図２１Ｂは、抗Ｔｉｅ２．１．３８ ＩｇＧ抗体がＶＥＧＦ誘導性血管透過性を減少させたことを示す。
ＶＥ－カドヘリンおよびＦ－アクチンに対する抗Ｔｉｅ２アゴニストの効果
ＨＵＶＥＣ細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＣＥ００１）を、完全Ｅｎｄｏｇｒｏ培地中の４ウェルチャンバースライド上に０．２×１０６／ウェルで播種した。３日後、培養培地を基礎Ｅｎｄｏｇｒｏ培地に交換した。３時間のインキュベート後、１０ｕｇ／ｍｌのＴｉｅ２アゴニスト抗体を添加した。抗体処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１５７１０－Ｓ）を用いて室温（ＲＴ）で２０分間固定した。固定した細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－ＰＢＳを用いて室温で１０分間透過処理した。ブロッキング緩衝液（１０％正常ロバ血清＋ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）で室温で１時間ブロッキングした後、細胞をマウス抗ヒトＶＥ－カドヘリン（ＢＤ、カタログ番号５５５６６１）と共に１：２５０の希釈で４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６３３ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ ２２２８４）をＦ－アクチン染色に使用した。スライドをＰＢＳ－ＴによりＲＴで５回洗浄し、次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４９ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５－５０５－１５０）と１：５００希釈で暗所においてＲＴで２時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ－Ｔ、で４回洗浄し、続いてＰＢＳで２回、室温で洗浄した。次いで、スライドを、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ９５４２－１ＭＧ）、５ｍｇ／ｍｌの１：１万希釈で、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｐ３６９３０）をマウントしてＲＴで１０分間染色した。Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像を得た。図２２は、抗Ｔｉｅ２ Ｔｉｅ２．１－ＰＥＧ－六量体またはＴｉｅ１．１．３８への曝露が、動的細胞－細胞接合部から線状細胞－細胞接合部への変化（上パネル）、およびＦ－アクチンストレスファイバーの減少および皮質アクチンの増加（下パネル）をもたらすことを示す。
実施例１１－治療用Ｔｉｅ２結合分子の設計
安定性、例えば、化学的安定性および酸化安定性は、実行可能な治療剤にとって重要である。固有の生物製剤の安定性の特徴は、最適な製造、保存およびインビボ半減期を有し得る治療剤を設計するときに理解されるべきである。
化学的安定性
タンパク質発達性およびインビボ安定性の両方について化学的安定性を評価するために、Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ（配列番号９０を有するＨＣ、配列番号２５を有するＬＣ）を低イオン強度ヒスチジン緩衝液に緩衝液交換し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４に緩衝液交換し、１ ｍｇ／ｍｌに濃縮し、またはポリソルベートを含む高イオン強度アルギニン緩衝液に緩衝液交換し、１５０ ｍｇ／ｍｌに濃縮した（例えば、Ｘｕら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１８，１５：４５２９－４５３７を参照）。試料を４０℃（ヒスチジン緩衝液）または３７℃（ＰＢＳ）で２週間インキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびイメージング毛細管等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）によって主要ピークの消失および追加のピークの出現を分析した。熱ストレスを受けた材料を、トリプシン、キモトリプシンおよび／またはＬｙｓＣによって消化し、ＣＤＲ残基を含有するペプチドを、アスパラギン脱アミドおよび／またはアスパラギン酸異性化の証拠についてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。
これらの条件下で、ヒスチジン緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのＴｉｅ２．１ Ｆａｂは、ＳＥＣによる主要ピークの損失を示さず、ｉＣＩＥＦによる主要ピークの１．３％の損失を示した。１５０ｍｇ／ｍｌでは、それぞれ０．３％および３．０％の損失を示した。ＰＢＳストレス下では、主要ピークの０．１％および９．６％が失われた。ＣＤＲ中の全ての検出可能なアスパラギンおよびアスパラギン酸は、試験条件下で改変レベルの０．２％未満の変化を示した。
Ｔｉｅ２．１の酸化安定性
タンパク質発達性およびインビボ安定性の両方について酸化安定性を評価するために、Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ（上記と同じ）を低イオン強度ヒスチジン緩衝液に緩衝液交換し、２，２’－アゾ－ビス－（２－アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）（例えば、Ｘｕら、２０１８，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，１５：４５２９－４５３７を参照）でストレスを与えた。ストレスを受けた材料を、トリプシン、キモトリプシンおよび／またはＬｙｓＣによって消化し、ＣＤＲ残基を含有するペプチドを、メチオニンおよび／またはトリプトファン酸化の証拠についてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。
これらの条件下で、Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂは、Ｗ９８およびＷ１００ａの酸化の３９．３％の増加およびＭ１００ｃの酸化の３．１％の増加を示した。
酸化安定性が改善されたバリアントの設計
Ｔｉｅ２．１ Ｗ９８およびＷ１００ａの複数のバリアントを発現させ、ｈＩｇＧ１フォーマットで精製した。抗Ｔｉｅ－２バリアントをヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃと架橋し、混合物を２０ｕｇ／ｍｌおよび７ｕｇ／ｍｌの最終濃度でラット大動脈内皮細胞に二連で添加した。リン酸化－ＡＫＴレベルの変化を上記のように評価し（実施例３）、リン酸化－ＡＫＴシグナルの平均変化としてプロットした。
図２３は、Ｔｉｅ－２の下流のリン酸化－ＡＫＴシグナル伝達を駆動するＴｉｅ２．１ ｈＩｇＧ１のトリプトファン９８および１００ａバリアントの影響を示す。Ｗ９８で試験された突然変異は、この２５のセットの下で活性を維持しなかった。単一の点で、Ｗ１００ａにおけるいくつかの変異が活性を維持していると考えられた。具体的には、少なくともバリアントＴｉｅ２．１．Ｗ１００ａＬ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＫ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＭ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００１Ｆ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＹ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＲ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＮ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＮ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＱ、Ｔｉｅ２．１．Ｗ１００ａＨは、リン酸化－ＡＫＴシグナル伝達を活性化する能力を維持する（Ｔｉｅ２アゴニストとして作用する）。
２つのＷ１００ａバリアント（Ｗ１００ａＬおよびＷ１００ａＫ）を、Ｃ末端ＳＰＰＣ配列を有するＦａｂとして発現させ、記載のように６アーム型の６ｋＤａ ＰＥＧコアにコンジュゲートした（実施例６）。様々な濃度のＰＥＧ－六量体を初代ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＡＣＢＲＩ １８１，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）と共にインキュベートし、リン酸化－ＡＫＴレベルの変化を記載のように評価した（実施例３）。Ｗ１００ａＬおよびＷ１００ａＫの両方が、より低い濃度でわずかに低下した活性を示す（図２４）。
実施例１２－抗Ｔｉｅ２抗体コンジュゲートのインビボ研究
カニクイザルを用いた非臨床試験を行って、抗Ｔｉｅ２抗体コンジュゲートの投与に耐える対照の能力を評価し、有害作用が発生したかどうかを決定した。６ ｋＤａのＰＥＧ－マレイミド六量体コアを有するＴｉｅ２．１ Ｆａｂ－ＳＰＰＣ（配列番号８９を有するＨＣおよび配列番号２５を有するＬＣ）を、２匹のメスカニクイザルの両眼に２週間毎に（合計３回）、５０ｕｌ硝子体内（ＩＴＶ）注射（２ ｍｇ用量）によって投与した。用量は、認定獣医眼科医によって投与された。臨床投与を模倣するために、眼を下側頭四分円で投与した。動物を５週間観察し、耐性評価は、包括的な臨床眼科評価（細隙灯生物学的顕微鏡検査、倒像検眼鏡検査および眼圧測定）、眼の臨床的および解剖学的病理に基づいた。
この５週間のＩＴＶ反復投与研究は、サルにおける６ｋＤａのＰＥＧ－マレイミドヘキサマーコアを有するＴｉｅ２．１ Ｆａｂ－ＳＰＰＣによる投与が十分に忍容されることを示した。一過性眼炎症は３日目にピークに達し、８日目までに減少し、反復投与により減少した。眼組織病理評価で認められた最小からわずかな単核炎症細胞浸潤は、ヒト化タンパク質に対する免疫原性応答と一致していた。
実施例１３－抗Ｔｉｅ２抗体コンジュゲートのインビボ研究
他の前臨床試験では、２ ｍｇ／眼の単回硝子体内（ＩＴＶ）両側注射後のオスカニクイザルにおいて、抗Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体の眼ＰＫを試験した。この研究を、硝子体液、房水および血清中のＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体のレベルを測定するために行った。さらに、インビボでのＴｉｅ２．１ Ｆａｂ分子の酸化および分子のエクスビボ活性に対する酸化の影響について硝子体試料を評価した。動物の世話は、動物福祉法、実験動物の管理と使用に関する指針、および実験動物福祉局（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ ｏｆ Ｃｏｖａｎｃｅ）に従った。
抗ｇＤ Ｆａｂ六量体－ＳＰＰＣを対照群とし、同じ用量レベル（２ ｍｇ／眼）でも試験した。別の動物群に、Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体を４ ｍｇ／動物でＩＶ経路により投与した。体重２～４ ｋｇおよび約２～４歳のナイーブなオスカニクイザルを投与群に割り当てた。ＩＴＶ投与群については、各眼への単回ＩＴＶ注射を介して麻酔をかけた動物に試験品および対照品を投与し、最大２１日間観察した。眼投与量の投与は、獣医眼科医によって、右目のほぼ７時の位置および左目のほぼ５時の位置で行った。注入量は５０μＬ／眼に制限した。ＩＴＶ投与後、動物を、ＰＫ推定のための眼試料（硝子体液および房水）の収集のために、１日目（投与後４時間）、２日目（試験品群のみ）、７日目、１４日目および２１日目に安楽死させた（２匹の動物／群／時点）。ＰＫ推定のために、０．２５時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３日、５日、７日、１０日、１４日および２１日に、全ての生存動物から血清分離チューブに血液試料も採取した。ＩＶ群の場合、用量を伏在静脈を介して投与し、ＰＫ推定のために非終末血液試料を０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１４日および２１日に収集した（眼試料なし）。血液試料を収集後６０分間静置し、スピンダウンして結成を２Ｄバーコード付きチューブにデカントして入れた。
ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して薬物濃度についてアッセイするまで、全ての血清試料を－７０℃で保存した。Ｎｕｎｃ（登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、コート緩衝液（０．０５ Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．６）で希釈した０．５μｇ／ｍＬのヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．４）で３回洗浄し、室温で１～２時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で処理した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、試料希釈剤（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／５ ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２５％ ＣＨＡＰＳ／０．３５Ｍ ＮａＣｌ／１５ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で希釈した試料をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ｐｐｍプロクリン／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４）で１００ ｎｇ／ｍＬに希釈し、ウェルに添加した。プレートをシェーカー上で室温にて１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））を用いて２０分間展開し、引き続いて１ Ｍリン酸を用いて反応を停止させた。吸光度を、６２０ ｎｍの参照波長に対して４５０ｎｍで測定した。試料の濃度は、標準曲線の４パラメータ適合から外挿した。報告可能なアッセイ範囲は０．１６～５ ｎｇ／ｍＬであった（ＬＬＯＱはカニクイザル血清については２ｎｇ／ｍＬ、房水および硝子体液については１６ｎｇ／ｍＬである）。
抗薬物抗体（ＡＤＡ）推定のための血清試料もまた、－７日、７日、１ ４日および２１日に全ての群から収集した。ＡＤＡを、抗Ｔｉｅ２六量体または抗ｇＤ六量体をＮｕｎｃ（登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）３８４ウェルプレート上のコート緩衝液（０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ ９．６）中１ｕｇ／ｍＬで直接コーティングすることによって決定し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．４）で３回洗浄し、室温で１～２時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で処理した。プレートを再度洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、試料希釈剤（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／５ ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２５％ ＣＨＡＰＳ／０．３５Ｍ ＮａＣｌ／１５ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で希釈した試料をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ｐｐｍプロクリン／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４）で８０ｎｇ／ｍＬに希釈し、ウェルに添加した。プレートをシェーカー上で室温にて１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））を用いて２０分間展開し、引き続いて１ Ｍリン酸を用いて反応を停止させた。吸光度を、６２０ ｎｍの参照波長に対して４５０ｎｍで測定した。カットポイントは、ナイーブな個々の動物の分布に基づいて統計的に導出される。結果は、各試料の力価を報告し、これは、試料ＯＤがカットポイントＯＤを横切る希釈の対数である。このアッセイのための最小希釈は、１：１００であった。２．０未満の対数力価は、最小希釈でのカットポイントを下回ることを意味し、したがって、動物は陰性である。
上記の群に加えて、眼コンボ群もこの研究で試験し、抗ｇＤ Ｆａｂ六量体およびＴｉｅ２．１ ＰＥＧ六量体をＩＴＶ注射によって共に投与した（１０分間隔；Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ六量体、引き続いて抗ｇＤ Ｆａｂ六量体）。この群の目的は、試験物質の投与前に、対照群の眼ＰＫに対する潜在的な影響を評価することであった。両化合物を単剤群（すなわち、２ ｍｇ／眼）と同じ用量レベルで投与し、これらの群の用量体積を１００μＬ／眼（両化合物を含む）に制限した。
抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂ六量体濃度のレベルを抗Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡで決定した。Ｎｕｎｃ（登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、コート緩衝液（０．０５ Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．６）で希釈した１．０μｇ／ｍＬの組換えヒトＴｉｅ２（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．４）で３回洗浄し、室温で１～２時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で処理した。プレートを再度洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、試料希釈剤（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／５ ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２５％ ＣＨＡＰＳ／０．３５Ｍ ＮａＣｌ／１５ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で希釈した試料をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ｐｐｍプロクリン／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４）で１００ ｎｇ／ｍＬに希釈し、ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて２０分間展開し、引き続いて１ Ｍリン酸を用いて反応を停止させた。吸光度を、６２０ ｎｍの参照波長に対して４５０ｎｍで測定した。試料の濃度は、標準曲線の４パラメータ適合から外挿した。報告可能なアッセイ範囲は０．３１～１０ｎｇ／ｍＬであった（ＬＬＯＱはカニクイザル血清については６ｎｇ／ｍＬ、房水および硝子体液については３１ｎｇ／ｍＬである）。
抗ｇＤ Ｆａｂ六量体濃度のレベルを抗ｇＤ ＥＬＩＳＡで決定した。Ｎｕｎｃ（登録商標）ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、コート緩衝液（０．０５ Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．６）で希釈した１．０μｇ／ｍＬの組ｇＤ（社内製造、Ｒｅｑ３６１９３７）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ ７．４）で３回洗浄し、室温で１～２時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で処理した。プレートを再度洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、試料希釈剤（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／５ ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２５％ ＣＨＡＰＳ／０．３５Ｍ ＮａＣｌ／１５ｐｐｍプロクリン、ｐＨ ７．４）で希釈した試料をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、検出抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／１５ｐｐｍプロクリン／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４）で１００ ｎｇ／ｍＬに希釈し、ウェルに添加した。プレートをシェーカー上で室温にて１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））を用いて２０分間展開し、引き続いて１ Ｍリン酸を用いて反応を停止させた。吸光度を、６２０ ｎｍの参照波長に対して４５０ｎｍで測定した。試料の濃度は、標準曲線の４パラメータ適合から外挿した。報告可能なアッセイ範囲は０．３１～１０ｎｇ／ｍＬであった（ＬＬＯＱはカニクイザル血清については６ｎｇ／ｍＬ、房水および硝子体液については３１ｎｇ／ｍＬである）。
マトリクスにわたる濃度－時間データのＰＫ分析を、名目上の時間および用量を用いて非コンパートメント分析法（Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン６．４、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて行った。Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体および抗ｇＤ Ｆａｂ六量体の両方が、眼コンパートメントにおいて同等のＰＫプロファイルを示した。硝子体液中の半減期は両方の化合物について約５日間であり、房水では約４日間であった（表１２）。これは、Ｓｈａｔｚら（２０１６，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，１３：２９９６－３００３）およびＣｒｏｗｅｌｌら（２０１９，Ｔｒａｎｓｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ８（６）：１）によって提案されたサイズに基づく眼動態と一致しており、著者らは、ＩＴＶ注射後の生物製剤の眼ＰＫが主に分子サイズ、すなわちＲｈによって影響されることをウサギにおいて示している（Ｓｈａｔｚら、２０１６、前述）。
図２５は、オスカニクイザルにおける単回硝子体内または静脈内投与後の抗Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ六量体および抗ｇＤ Ｆａｂ六量体の薬物動態プロファイルを提供する。
表１２は、オスカニクイザルにおける単回硝子体内または静脈内投与後の抗Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ六量体および抗ｇＤ Ｆａｂ六量体の薬物動態プロファイルを提供する。
Figure 2023519213000055
興味深いことに、抗ｇＤ六量体ＦａｂのＰＫは、４～５日の範囲の半減期を有する血清を含む全てのマトリクスにわたって同等であった。これとは対照的に、抗Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ六量体は、眼コンパートメント対血清コンパートメントにおいて異なるＰＫプロファイルを有していた、すなわち、眼ＰＫ（半減期４～５日）と比較して比較的速い全身ＰＫ（血清半減期約２．３日）であった。理論に束縛されるものではないが、この研究における観察結果（ＩＴＶ投与後の抗Ｔｉｅ２．１ Ｆａｂ六量体の速い全身ＰＫ）は、一般に標的媒介薬物配置（ＴＭＤＤ）と呼ばれる、ＰＫへの影響をもたらす薬物－標的相互作用に起因し得る。眼コンパートメントに加えて、標的（Ｔｉｅ２）は血管組織で発現されることが知られている。眼組織と比較して、血管組織の豊富な性質のために、ＴＭＤＤの影響は、眼コンパートメントとは対照的に血清コンパートメントでより明らかである可能性が高い。血清試料のＡＤＡ分析は、最小のＡＤＡが試験品と対照品の両方で観察され、血清ＰＫに対するＡＤＡの明らかな影響はないことを示した。眼動態に対する影響を評価するためにＡＤＡ試料を収集しなかった。この研究では、眼マトリクス中のＰＫに対するＡＤＡの影響を調査しなかった。ＩＶボーラス投与後の血清中のＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体のＰＫもまた、約０．３日間の半減期によって示されるように比較的速かった。ＩＶおよびＩＶＴ投与後の血清半減期のこの差は、ＩＴＶ投与後のＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体についての血清中のフリップフロップ動態の発生を明確に実証した。Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体の絶対的生物学的利用可能性は、ＩＴＶ投与後に２９％であった。この研究におけるＩＴＶ投与群の結果は、ＩＴＶ後の血清ＰＫが、新規フォーマットのための眼ＰＫを常に適切に表しているとは限らないことを示唆している。したがって、血清ＰＫに加えて、特に新規なフォーマットおよび作用機序についての眼ＰＫの調査は、眼治療剤の分子選択において重要である。
コンボ群（抗ｇＤ Ｆａｂ六量体＋Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体同時投与）からの両化合物のＰＫは、マトリクス全体にわたって、それらのそれぞれの単剤処置群に匹敵した（データは示さない）。共投与は、いずれのマトリクスにおいても、いずれの化合物のＰＫにも顕著な影響を及ぼさなかった。
インビボ研究からの試料におけるインビボＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体脱コンジュゲート産物の定量
脱コンジュゲート産物の下限定量
カニクイザルへのＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体の硝子体内投与後に生成したＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体脱コンジュゲート産物を、キャピラリー電気泳動レーザー誘起蛍光（ＣＥ－ＬＩＦ）を用いて定量した。Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体およびその分解物の定量下限を評価するために、Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体、Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－五量体および非コンジュゲートＴｉｅ２．１ Ｆａｂ単量体標準を作製し、１：１：１質量比で混合し、５００μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲の異なる濃度でＰＢＳ緩衝液またはＶＨマトリクスのいずれかに添加した。試料は、以前に報告されたプロトコルをわずかに改変して使用して調製した（Ｓａｌａｓ－Ｓｏｌａｎｏら、２００６，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，７８：６５８３－６５９４）。簡潔には、試料を最初に１：１の体積比でｐＨ ６．７のＮａ３ＰＯ４と混合した。次いで、１５０ｍＭ Ｎ－エチルアンレイミド（ＮＥＭ）を含む４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を試料混合物に添加し、７０℃で５分間インキュベートした。室温に冷却した後、３－（２－フロイル）キノロン－２－カルボキシアルデヒド（ＦＱ）色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、引き続いてシアン化カリウムを添加した。混合物を、５０℃１０分間インキュベートした。室温に冷却した後、試料をＰＡ ８００＋キャピラリー電気泳動装置（Ｓｃｉｅｘ）にロードした。ＣＥ－ＬＩＦ法は、インビボ試料に対する感度を最大化するために試料注入時間をわずかに改変して以前に記載された（Ｍｉｃｈｅｌｓら、２００７，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，７９：５９６３－５９７１）。ＬＩＦ検出のために、励起波長は４８８ ｎｍであり、検出波長は６００ ｎｍであった。
図２６に示すように、緩衝液スパイクイン実験では、六量体、五量体および単量体は、全てのスパイクイン濃度から重ねられた電気泳動図で十分に分離された。
各種の存在のパーセンテージは、積分ピーク面積を使用して計算した。異なるスパイクイン濃度を有するインタクトＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体、Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－五量体およびＴｉｅ２．１ Ｆａｂ単量体の、１：１：１質量比の緩衝液中への相対的パーセンテージを以下の表１３に示す（他のマイナー種は示さない）。
Figure 2023519213000056
これらのデータは、六量体、五量体および単量体Ｆａｂを１０μｇ／ｍＬまで一貫して（この場合、１：１：１に近い比で）定量できることを示唆している。マトリクスタンパク質の干渉のために、単量体ピークは、図２７に示すようにＶＨスパイクイン実験の相対定量に考慮されなかった。しかしながら、六量体および五量体ピークは十分に分離されており、それらの大きなサイズおよびその後の泳動時間のために、重ねられた電気泳動図上で認識できないマトリクス干渉を示した。
２種の相対存在量を積分ピーク面積を使用して計算した場合、五量体に対するインタクトな六量体の比は、以下の表１４に示すように一貫して１：１に近かった。
Figure 2023519213000057
カニクイザル薬物動態試料中の抗Ｔｉｅ２六量体およびその分解物の相対定量
Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体およびその分解物を、上記のカニクイザル研究からの試料において測定した。ＰＫ試料を、１日目、３日目、８日目、１５日目、および２２日目を含むいくつかの時点で、カニクイザルの硝子体液（ＶＨ）組織から収集した。収集した試料を上記と同様に処理した。異なる時点で収集したＰＫ試料からの重ねたＣＥ－ＬＩＦ電気泳動図を図２８に示し、これは異なる時点からのＴｉｅ２．１－ＰＥＧ－六量体ＰＫ試料を重ねている。
インタクトな六量体ピークおよび分解性五量体ピークを、積分されたピーク面積を用いて定量化し、下記の表１５に示した（他のマイナー種が定量化されたが、データは示さない）。
Figure 2023519213000058
抗Ｔｉｅ２六量体および五量体の相対存在量を、図２９に示される異なる時点に対してプロットした。これらの結果は、出発物質中にいくらかの五量体が存在し、インビボで脱コンジュゲートが起こり、五量体の相対存在量がさらに増加したが、８日目頃に安定化したことを示唆した。
カニクイザル試料から得られたＴｉｅ２．１－ＰＥＧ六量体の分析的特徴付け
カニクイザル由来の試料を分析して、Ｔｉｅ２．１コンジュゲートの酸化を評価した。Ｔｉｅ２．１コンジュゲートのアミノ酸残基レベルで存在する酸化の検出および定量を以下のように決定した。Ｔｉｅ２．１コンジュゲートを含有する４０ｕＬの生物学的マトリックス（例えば硝子体液）を８０ｕＬの変性溶液（８Ｍ尿素、２５ｍＭ １，４－ジチオスレイトール、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、全て水に可溶化）と混合した。混合物を、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、１０ ｕＬの５００ｍＭヨードアクタミドを混合物に添加し、混合物を暗所において２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、濃度０．１ｍｇ／ｍＬ（水中）の１０ｕＬのＡｓｐ－Ｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を混合物に添加した。さらに、１８０ｕＬの水を混合物に添加した。次いで、混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、濃度０．２ｍｇ／ｍＬ（水中）の１０ｕＬのトリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を混合物に添加した。混合物を、３７℃で３時間撹拌した。３５ｕＬの混合物を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ ＭＳに連結したＷａｔｅｒｓ Ｎａｎｏａｃｑｕｉｔｙ ＬＣに注入した。次いで、収集した生データを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒソフトウェアを使用して分析した。ソフトウェアを使用して、アミノ酸レベルでの改変（例えば、酸化）を、高分解能質量データおよびＣＩＤ断片化データの組合せによって同定した。具体的には、＋１６Ｄａ（または整数倍）の質量シフトを観察することによって酸化を同定した。タンデムＭＳ（ＣＩＤ断片化モード）を使用してペプチド配列決定によって特異的位置を決定した。データは、インビボ酸化の特定の位置が図３０ＡのＭ１００ｃであることを示した（配列番号２２の位置１０７のＭとして本明細書にも開示される）。カニクイザル由来の試料のこの分析では、トリプトファン残基の酸化は観察されなかった。
さらに、メチオニン酸化は、ＣＩＤ断片化後の特徴的な－６４Ｄａの質量シフトを観察することによって確認された。酸化種に関連するイオン強度をナイーブ（未酸化種）のイオン強度で割ることによって、ＭＳによって定量を決定した。２つの異なるカニクイザルの眼における驚くほど高度のＭ１００ｃの酸化を示す定量データを図３０Ｂに示す。Ｍ１００ｃのこの程度の酸化はインビトロで観察されなかったため、これらのデータは予想外であった（実施例１１参照）。
インビトロでのＴｉｅ２．１の活性に対するＭ１００ｃ酸化の効果。
Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ ｃの酸化がこの抗Ｔｉｅ２分子の機能低下を引き起こし得ることを確認するために、Ｔｉｅ２．１を酸化条件に供して、Ｍ１００ｃで酸化されたこれらの分子を生成させた。抗Ｔｉｅ２ Ｆａｂおよび六量体の調製物を２０ｍＭ酢酸ヒスチジン、ｐＨ５．５に緩衝液交換した。両方の試料を１ｍｇのタンパク質／ｍｌに希釈した。３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素を水で希釈して、５％（ｗ／ｖ）ストック溶液を得た。過酸化水素原液を各試料に添加して、０．０６％（ｗ／ｖ）の最終Ｈ２Ｏ２濃度を得た。各試料の別々のアリコートに、対照としての役割を果たすために、等量の緩衝液を添加した。全ての試料を光から保護し、５℃で１５時間インキュベートした。２０倍モル過剰のＬ－メチオニンを添加し、続いてＰＤ－１０カラムを使用して脱塩することによって酸化反応をクエンチした。六量体の酸化の程度は、上記のＬＣ－ＭＳ法を使用して約６５％であると決定された。様々な濃度の酸化六量体、緩衝液処理（非酸化）六量体および様々な対照を、前述のｐＡＫＴアッセイによって評価した。酸化は、図３１に示すように、酸化材料の活性を約５０％低下させることが見出された。
カニクイザル硝子体液から単離された六量体の比活性
六量体機能に対するインビボ酸化の影響を理解するために、活性Ｔｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体の量を、カニクイザルの硝子体試料の活性をカニクイザルの硝子体単離物に投与した投与溶液の標準曲線と比較することによって決定した。これらの数を、ＥＬＩＳＡ（上記）によって見出された濃度と比較した。図３２は、ＥＬＩＳＡによって決定されるＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体の量およびｐＡＫＴアッセイによって決定されるその分子の総活性を示す。図３３は、カニクイザル硝子体試料から単離されたＴｉｅ２．１ ＰＥＧ－六量体の比活性を示す。正規化された活性（活性濃度／総濃度）は、カニクイザル硝子体において２１日間にわたって比活性の漸進的喪失を示し、最終時点で４７％の残存活性をもたらす。
実施例１４－安定なＴｉｅ２．１Ｍ １００ｃバリアントの選択
ＶＨ残基Ｍ１００ｃが１９の代替天然アミノ酸のそれぞれによって置換されたＴｉｅ２．１の１９のバリアントをコードするヒトＩｇＧ１重鎖発現ベクターを、遺伝子合成を使用して作製した。Ｔｉｅ２．１バリアントを、所望の重鎖および軽鎖配列をコードする発現ベクターを用いたＥｘｐｉ２９３細胞の一過性コトランスフェクトによってＩｇＧフォーマットで発現させ、抗体タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
組換えヒトおよびカニクイザルＴｉｅ２のＴｉｅ２．１ ｈＩｇＧ１バリアントへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ ２００機器（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。ヒト抗体捕捉チップは、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアミンカップリングキット（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて調製した。ランニング緩衝液（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）で５μｇ／ｍｌに希釈した抗体を、接触時間２０秒、流速１０μｌ／分を用いて非共有結合的に捕捉した。３００ｎＭおよび１５００ｎＭの組換えＴｉｅ２への結合を、接触時間６０秒、解離時間１２０秒および流速５０μｌ／分の単一サイクル動態法を用いて３７℃で分析した。サイクルの間に、３０μｌ／分の流量で３ Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間注入することによって表面を再生した。抗体捕捉レベルおよび検体結合レベルの値は、レポートポイント表（Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアｖ３．０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。抗体捕捉レベルについてセンサーグラムを正規化し、次いで、観察されたＴｉｅ２結合シグナルの大きさを比較することによって、結果を分析した。結果は、分析物結合応答（任意の応答単位で測定）を抗体捕捉レベル（任意の応答単位で測定）で割ることによって計算された正規化結合シグナルとして示される。Ｔｉｅ２．１およびＴｉｅ２．１バリアントによる組換えＴｉｅ２ ＥＣＤへの結合のＳＰＲ分析の結果を提供する２つの実験の結果を示す。表１６：実験Ａ；表１７：実験Ｂ
Figure 2023519213000059
Figure 2023519213000060
Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦの設計
ＳＰＲによるＶＨ．Ｍ１００ｃバリアントの最初のスクリーニングは、いくつかの異なるアミノ酸がＴｉｅ２への結合を保持しながら残基ＶＨ．Ｍ１００ｃを置換できることを示している（上記参照）。ヒト生殖系列抗体配列は、ファージ由来抗体Ｔｉｅ２．１のＶＨ．Ｍ１００ｃに対応する位置にメチオニン（Ｍ）またはフェニルアラニン（Ｆ）のいずれかを頻繁に含む（ｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇ，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３３：Ｄ２５６－Ｄ２６１）。したがって、本発明者らは、バリアントＴｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦが他のバリアントよりも抗薬物免疫応答を誘発する可能性が低いと推論し、このバリアントをより綿密に分析した。
Ｔｉｅ２．１．Ｍ１００ ｃＦの高分解能親和性評価
Ｍ１００ｃＦ変異が、ヒトおよびカニクイザルＴｉｅ２に対して類似または改善された親和性を有する抗体をもたらしたことを確認するために、上記のＳＰＲ実験を、結果の分解能を改善することを意図したいくつかの改変と共に繰り返した。Ｔｉｅ２．１およびＴｉｅ２．１バリアントｈＩｇＧ１抗体を０．５μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ１５、３０および４５秒の接触時間を使用して非共有結合的に捕捉し、試験した抗体のそれぞれについて３つの異なる表面密度を生じさせた。組換えヒトおよびカニクイザルＴｉｅ２への結合を、６０秒の接触時間、６０秒の解離時間、１００μｌ／分の流速および５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、６２５ ｎＭ、３１３ ｎＭおよび１５６ｎＭのＴｉｅ２濃度を有する高性能多サイクル動態フォーマットを使用して分析した。５μＭ、２．５μＭおよび１．２５μＭのＴｉｅ２濃度を２回注射した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア ｖ３．０（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結果を評価した。３つ全ての表面密度からの結果を、複数のＲｍａｘおよびＲＩパラメータを０に設定した１：１結合モデルを使用して一緒に分析した。Ｔｉｅ２．１およびＴｉｅ２．１．Ｍ１００ｃＦの両方へのヒトＴｉｅ２結合について、高い信頼度（Ｒｍａｘ１、Ｒｍａｘ２、Ｒｍａｘ３、ｋａおよびｋｄについてＴ値１００超）で速度定数を得た（表１８）。
Figure 2023519213000061
同じデータセットの定常状態分析は、動態分析によって得られたものと同様のＫＤ値をもたらした（表１８）。組換えカニクイザルＴｉｅ２への結合について、ｋａ、ｋｄおよびＫＤについて同様の値が観察された（表１９）。
Figure 2023519213000062
実施例１５－バリアント抗Ｔｉｅ２ ＰＥＧコンジュゲートの分析
本明細書で提供される開示は、多アーム部分にコンジュゲートされ、Ｔｉｅ２活性を活性化することができる抗Ｔｉｅ２．１抗体を含む組成物が、眼障害の治療等において有益な活性および治療価値を有することを実証しているが、安定性を含む最適な特性を有するコンジュゲートを同定することが望ましい。このため、異なるＴｉｅ２．１ ＰＥＧ六量体コンジュゲートを設計および試験して、異なるコンジュゲート部位の効果を評価した。この実施例では、６ｋＤａのＰＥＧ－六量体マレイミドを、Ｆａｂタンパク質内の戦略的位置にシステインを含有するように操作されたＴｉｅ２．１ Ｆａｂ（ＴｈｉｏＦａｂ）にコンジュゲートした。
示された位置の重鎖または軽鎖のアミノ酸残基を置換することによってシステインを導入した（例えば、ＨＣ Ｔ１２０Ｃは、位置１２０のＴｈｒがＣｙｓに変化するようにＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦのＨＣを操作したことを意味する）。「ＳＰＰＣ」は、Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦの位置２２６～２２９位（ＥＵナンバリング）の残基ＣＰＰＣをＳＰＰＣに変更するように重鎖Ｃ１ドメインのＣ末端を操作したＴｈｉｏＦａｂ分子を示す。
バリアントＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＴｈｉｏＦａｂ分子を、図３９に示すコア構造を有する市販のマレイミド官能化６アーム型ＰＥＧ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．６ ＡＲＭ（ＤＰ）－ＭＡＬ－６０００）とコンジュゲートした。
バリアントＴｉｅ２．１Ｍ１００ ｃＦコンジュゲートを調製し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で３７℃で４週間保存した。免疫組織化学は、実施例１３に記載の通り行った。２１日間にわたる各コンジュゲートの脱コンジュゲートパーセント。結果を図３４に示す。
これらのコンジュゲートのそれぞれの活性を、実施例３に記載されるようにＨＵＶＥＣ ｐＡＫＴアッセイを使用して測定し、結果を図３５Ａおよび図３５Ｂに示す。
実施例１６－バリアント抗Ｔｉｅ２ ＰＥＧコンジュゲートのインビボ安定性
上記のバリアント抗Ｔｉｅ２ ＰＥＧコンジュゲートのインビボ安定性を研究するために、単回用量研究におけるカニクイザルへの投与のために３つを選択した。３つのコンジュゲートは、Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ Ｆａｂ－ＳＰＰＣ、Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ ｃＦ、ＬＣＴ２０６Ｃ、およびＴｉｅ２．１Ｍ１００ ｃＦ、ＨＣ Ｔ２０９Ｃであった。具体的には、両側注射を２ｍｇ／眼で投与した。合計１８匹の動物を３群に含めた：群１：Ｔｉｅ２．１ Ｍ１００ｃＦ Ｆａｂ－ＳＰＰＣを投与した６匹の動物；群２：Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ、ＬＣ Ｔ２０６Ｃを投与した６匹の動物；群３：Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ、ＨＣ Ｔ２０９Ｃを投与した６匹の動物。評価には、コンジュゲート安定性分析に加えて、眼および血清ＰＫ、血清ＡＤＡ、および血圧（群１の２匹の動物）が含まれた。
血清、硝子体液および房水試料中のＰＫプロファイルを図３６に提供し、ＰＫパラメータを表２０に報告する。
Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＨＣ－Ｔ２０９Ｃ Ｆａｂ－ＰＥＧ六量体について房水中で観察されたＣｍａｘがわずかに低い等のわずかな差があるが、全体的な眼ＰＫ（硝子体内および房水内）は、試験した３つ全てのコンジュゲート間でほぼ同等である。３つ全てのコンジュゲートは、眼コンパートメントにおいて比較的長い滞留時間を示し（ｔ１／２は３．２０～３．７６日の範囲であった）、サル硝子体液において報告された典型的なＦａｂ ｔ１／２（約２～３日）と比較して比較的高いｔ１／２を有しており（Ｃｒｏｗｅｌｌら（２０１９，Ｔｒａｎｓｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ８（６）：１））、これは、眼コンパートメントにおける六量体コンジュゲートのサイズに基づくＰＫを示す。
ＴｈｉｏＦａｂコンジュゲート（Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＬＣ－Ｔ２０６Ｃ Ｆａｂ－ＰＥＧ六量体およびＴｉｅ２．１Ｍ１００ｃＦ ＨＣ－Ｔ２０９Ｃ Ｆａｂ－ＰＥＧ六量体）の血清ＰＫは、ＳＰＰＣコンジュゲート（Ｔｉｅ２．１Ｍ１００ ｃＦ ＳＰＰＣ Ｆａｂ－ＰＥＧ六量体）よりも優れている。コンジュゲート方法の違いによるインビボ安定性の違いは、コンジュゲート間のこの全身ＰＫの違いの駆動因子である可能性がある。フリップフロップ動態は、ＩＴＶ投与後の３つ全ての試験コンジュゲートについて血清中で（血清ＰＫに基づいて）生じている可能性があると考えられ、硝子体液からの薬物放出が、血清コンパートメント中のＰＫを駆動している可能性がある律速段階であり得ることを示している。
Figure 2023519213000063
０、７および２１日目のインタクトのコンジュゲートのパーセンテージを測定した動物から採取した硝子体液試料を使用して、ＴｈｉｏＦａｂコンジュゲートの安定性を評価した。結果を図３７に示す。
試料中のコンジュゲートの活性も、０、７および２１日目に測定した。ｐＡｋｔ活性は、実施例３に記載のように、ｐＡｋｔ ＦＲＥＴアッセイで硝子体液を試験することによって測定した。活性六量体を、ｐＡｋｔ ＦＲＥＴアッセイにおける標準曲線の使用によって定量化した。図３８Ａおよび図３９Ａに示すように、全てのコンジュゲートは、２１日目まで硝子体液中でエクスビボ活性を保持した。
Figure 2023519213000064
Figure 2023519213000065
Figure 2023519213000066
Figure 2023519213000067
Figure 2023519213000068
Figure 2023519213000069
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明および実施例によって、ある程度詳細に説明してきたが、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許および科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (48)

  1. Ｔｉｅ２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）アミノ酸配列ＮＴＤＩＳ（配列番号３）を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）アミノ酸配列ＲＩＳＰＳＤＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４）を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｃ）アミノ酸配列ＲＴＲＷＡＳＸ１ＡＸ２ＤＹ（配列番号５）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、Ｘ１がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、ＨもしくはＷであり、かつ／またはＸ２がＦ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｉ、ＫもしくはＨである重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ならびに（ｄ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｆ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号１０）を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
    を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記ＣＤＲ－Ｈ３が、アミノ酸配列ＲＴＲＷＡＳＷＡＭＤＹ（配列番号６）を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記ＣＤＲ－Ｈ３がアミノ酸配列ＲＴＲＷＡＳＷＡＦＤＹ（配列番号７）を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片および／またはキメラ抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. Ｔｉｅ２に結合するＦａｂ断片である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 配列番号２１のＶＬ配列および配列番号２０のＶＨ配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  9. 操作されたシステインを含み、
    前記操作されたシステインが、ＨＣ中のＴ１２０Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｔ１８７ＣおよびＴ２０９Ｃから選択される；または
    前記操作されたシステインが、ＬＣ中のＱ１２４Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｑ１５５Ｃ、Ｌ２０１Ｃ、Ｔ２０６Ｃ、Ｋ１０７Ｃ、Ｋ１２６ＣおよびＫ１４９Ｃから選択され、
    前記操作されたシステインの残基番号が、ＥＵナンバリングに従う、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  10. 前記操作されたシステインが、前記ＨＣ中のＴ２０９Ｃおよび前記ＬＣ中のＴ２０６Ｃから選択される、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  11. 前記操作されたシステインが、前記ＬＣ中のＴ２０６Ｃである、請求項９または１０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  12. 前記操作されたシステインが、前記ＨＣ中のＴ２０９Ｃである、請求項９または１０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  13. 配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣおよび配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  14. 配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣおよび配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  15. 配列番号２５の配列を含むＬＣおよび配列番号５５の配列を含むＨＣを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  16. ＨＣ定常領域が２２１位（ＥＵナンバリング）で終結する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  17. 配列番号５５のＨＣ配列および配列番号２５のＬＣ配列を含む、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
  18. 配列番号２３のＨＣ配列および配列番号５６のＬＣ配列を含む、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
  19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸。
  20. 請求項１９に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  21. Ｔｉｅ２に結合するコンジュゲートであって、請求項１～１８のいずれか一項に記載の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの抗体またはその抗原結合断片を含み、前記抗体またはその抗原結合断片の各々が、多量体化部分に連結されている、コンジュゲート。
  22. インビトロアッセイにおいて、２５％未満、５０％未満または７５％未満のＴｉｅ２タンパク質レベルの低下を引き起こす、請求項２１に記載のコンジュゲート。
  23. インビトロアッセイにおいて、２５％超、５０％超または７５％超のＴｉｅ２タンパク質レベルの低下を引き起こさない、請求項２１または２２に記載のコンジュゲート。
  24. 前記多量体化部分が、ポリオール、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  25. 前記多量体化部分がポリオールを含み、前記ポリオールが二量体、四量体、六量体、および八量体から選択される多アーム型ポリオールである、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  26. 前記多アーム型ポリオールが六量体である、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. 前記ポリオールが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  28. 前記ポリオールが、操作されたシステインアミノ酸の遊離スルフヒドリル基を介して前記少なくとも２つの抗体またはその抗原結合断片に共有結合しており、前記操作されたシステインが、
    ＨＣ中のＴ１２０Ｃ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１７８Ｃ、Ｔ１８７ＣおよびＴ２０９Ｃからなる群から選択される；または
    前記操作されたシステインが、ＬＣ中のＱ１２４Ｃ、Ｒ１４２Ｃ、Ｑ１５５Ｃ、Ｌ２０１Ｃ、Ｔ２０６Ｃ、Ｋ１０７Ｃ、Ｋ１２６Ｃ、およびＫ１４９Ｃからなる群から選択され、
    残基番号がＥＵナンバリングに従う、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  29. 前記操作されたシステインが前記ＬＣ中のＴ２０６Ｃであり、前記残基番号がＥＵナンバリングに従う、請求項２８に記載のコンジュゲート。
  30. 前記操作されたシステインが前記ＨＣ中のＴ２０９Ｃであり、前記残基番号がＥＵナンバリングに従う、請求項２８に記載のコンジュゲート。
  31. 前記ポリオールが、リジンアミノ酸の遊離アミノ基を介して前記少なくとも１つの抗体に共有結合している、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  32. 前記ＰＥＧが、約５００ダルトン（Ｄａ）～約３００，０００Ｄａの重量平均分子量を有する、請求項２７～３１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  33. 前記ＰＥＧが、一般式（Ｉｂ）：
    Figure 2023519213000070
    （式中、各ｍは、独立して、３～２５０の整数であり；各Ｒ１は、独立して、存在しないかまたは連結基であるかのいずれかであり；各Ｒ２は、独立して、水素または末端反応性基のいずれかであり；
    少なくとも１つのＲ２は、末端反応基であり、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片に共有結合している）
    の構造を有する、請求項２７～３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  34. 少なくとも１つのＲ１が連結基であり、Ｒ１およびＲ２が、一緒になった場合に、
    Figure 2023519213000071
    （式中、各ｉは独立して０～１０の整数であり；ｊは０～１０の整数であり；Ｒ２は、チオール反応性基、アミノ反応性基、およびこれらの組合せからなる群から選択される末端反応性基である）；ならびにこれらの組合せ
    から選択される、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  35. 少なくとも１つのＲ２がマレアミドであり、前記抗体またはその抗原結合断片に共有結合している、請求項３３または請求項３４に記載のコンジュゲート。
  36. 各Ｒ２がマレアミドである、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  37. Ｔｉｅ２に結合するコンジュゲートであって、
    配列番号５５を有するＨＣおよび配列番号２５を有するＬＣを含むＦａｂを含み；
    式１（ｂ）
    Figure 2023519213000072
    （式中、各ｍは独立して２０～３０の整数であり、Ｒ１およびＲ２は一緒になって構造
    Figure 2023519213000073
    を有し、Ｒ２はマレアミドである）
    の構造を有するポリオールにコンジュゲートしており、
    前記ポリオールが残基Ｃ２０９（ＥＵナンバリング）でＦａｂ ＨＣに連結している、コンジュゲート。
  38. 請求項２１～３７のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  39. さらなる治療剤をさらに含み、前記さらなる治療剤が、ＶＥＧＦアンタゴニスト、Ａｎｇ２アンタゴニスト、ＨｔｒＡ１アンタゴニストおよびＩＬ３３アンタゴニスト、補体成分アンタゴニストおよび第２のＴｉｅ２アゴニストからなる群から選択される、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 請求項３８または３９に記載の医薬組成物と、前記組成物を患者の硝子体内に送達する手段とを含み、前記組成物が長期間にわたってその場で有効なままである、眼送達用の長時間作用型送達装置。
  41. 処置を必要とする対象におけるＴｉｅ２経路媒介障害を処置する方法であって、有効量の請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２１～３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項３７もしくは３８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  42. 前記Ｔｉｅ２経路媒介障害が血管透過性障害である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記Ｔｉｅ２経路媒介障害が眼の症状である、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記眼の症状が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、乾燥型および湿潤型（非滲出型および滲出型）を含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、虚血関連網膜症、病理学的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜新生血管、緑内障、および網膜新生血管から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記眼の症状がＤＭＥである、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 医薬として使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体または請求項２１～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  47. 処置を必要とする対象におけるＴｉｅ２経路媒介障害および／または眼障害の処置において使用するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体または請求項２１～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  48. 処置を必要とする対象におけるＴｉｅ２経路媒介障害および／または眼障害を処置するための医薬の製造における、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体または請求項２１～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲートの使用。
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