KR20220157445A - Tie2-결합제 및 사용방법 - Google Patents

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KR20220157445A
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민훙 옌
구 장
니컬러스 존 애거드
대니얼 마리 디카라
필립 이. 하스
줄리 큐. 항
에린 엘. 크리스텐슨
로버트 폴 모스
세라 새노워
비탈 시바
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 Tie-2 항체 및 이의 단편, 접합체 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

TIE2-결합제 및 사용방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 24일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/993930호 및 2020년 6월 30일에 출원된 제63/046318호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록이 포함되어 있으며 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 3월 17일에 생성된 ASCII 사본의 파일명은 P35891-WO_SeqList.txt이고 크기는 107,354바이트이다.
발명의 분야
본원에 개시된 발명은 항-Tie2 항체를 포함하는 Tie2-결합제 및 접합체 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
배경
Tie2는 다양한 안구 장애의 치료를 위한 유망한 치료 표적이다(예: Campochiaro and Peters, 2016, Curr Diab Rep, 16:126, Whitehead 외, 2019, J Diabetes Res, 2019:5140521, Hussain 외, 2019, Expert Opin Investig Drug, 28:861-869 참조). Tie2는 내피 세포에 의해 특이적으로 발현되는 수용체 티로신 키나제이며 내피 안정화를 촉진하고 혈관 투과성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 혈관 누출은 당뇨병성 황반부종(DME), 당뇨병성 망막병증(DR) 및 연령 관련 황반변성(AMD)을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않는) 여러 일반적인 안구 장애에서 시각 장애의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
가장 광범위하게 연구된 Tie2의 리간드는 안지오포이에틴 1(Ang1) 및 안지오포이에틴 2(Ang2)이다. Ang1은 강력한 Tie2 작용제이고 안구 혈관신생 및 혈액-망막 장벽의 파괴를 억제하는 것으로 나타났다(예를 들어, Nambu 외, 2004, Gene Therapy, 11:865-873 참조). Ang2는 Tie2의 상황 의존성 길항제로서, DME, 습성 AMD, DR, 전이, 패혈증 및 염증을 비롯한 여러 안구 장애와 관련하여 그 발현이 증가한다. 무엇보다도 Ang2는 Tie2에 경쟁적으로 결합하고 Ang1 신호 전달을 억제하여 내피 및 혈관 불안정화, 혈액 망막 장벽 파괴 및 염증을 유발한다(Klaassen 외, 2013, Prog Retin Eye Res, 34:19-48, Saharinen 외, 2017, Nat Rev Drug Discov, 16:635-661).
Tie1 및 Tie2를 포함한 Tie 수용체는 제1형 막횡단 단백질 수용체 티로신 키나제(RTK)이다(Ramsauer, M. & D'Amore, PAJ Clin. Invest. (2002);110:1615-1617). Tie는 면역글로불린 및 EGF 상동성 도메인이 있는 티로신 키나제 수용체를 나타낸다. Tie2는 모든 형성 혈관의 내피 세포 및 마우스 배아의 심장내막에 위치한다(Korhonen 외, Blood(1992);80:2548-2555). Tie2의 엑토도메인 또는 세포외 도메인("ECD")은 3개의 면역글로불린(Ig) 도메인(Ig1, Ig2 및 Ig3), 3개의 표피 성장 인자(EGF) 도메인 및 피브로넥틴 유형 III 도메인(FNIII)을 포함한다. Tie2의 Ig-EGF 영역은 안지오포이에틴 인식 및 결합을 매개한다(Fiedler, U. 외, J. Biol. Chem. (2003);278:1721-1727; Barton, WA, 외, Structure (2005); 13:825~832).
Tie2 수용체에 대한 두 개의 리간드: 안지오포이에틴-1(Ang1) 및 안지오포이에틴-2(Ang2)가 확인되었다. Tie2 작용제인 Ang-1은 Tie2에 결합하여 이의 티로신 인산화를 유도하며, 이의 생체 내 발현은 혈관 발달과 매우 근접해 있다(Davis 외, Cell(1996);87: 1161-1169). Ang-1이 결핍된 마우스는 Tie2 결핍 마우스에서 보이는 것과 유사한 혈관신생 결핍을 나타내며, 이는 Ang-1이 Tie2에 대한 1차 생리학적 리간드이고 Tie2가 중요한 생체내 혈관신생 작용을 갖는다는 것을 뒷받침한다(Suri 외, Cell(1996); 87:1171-1180). Ang-1은 항염증제이며 혈관 무결성을 촉진하고 혈관 투과성을 감소시킨다. Ang2는 Tie2에 대한 자연 발생 길항제인 것으로 확인되었다. Ang2의 형질전환 과발현은 마우스 배아에서 혈관 형성을 방해한다(Maisonpierre 외, Science 277: 55-60, 1997). Ang2는 염증을 유발하고 EC 정지를 방해하고 혈관 투과성을 증가시킬 수 있다. 종합하면, 연구들은 Ang1/Ang2/Tie2 시스템이 혈관신생에서 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침한다. 혈관신생에서 Tie2의 중요한 역할을 감안할 때, Tie2를 인식하는 제제 및 이러한 제제를 사용하는 방법이 필요하다. 더욱이, Tie2 작용제로 기능하고 혈관 투과성을 감소시키거나 혈관 완전성을 향상시킬 수 있는 조성물은 특히 안구 장애의 치료를 위한 치료제로서 큰 가능성을 갖는다.
요약
본 발명은 항-Tie2 항체, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물(예를 들어, 접합체), 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 발명은 Tie2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 최소 하나 이상의 항-Tie2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 예시적인 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 Fab이다.
한 양상에서, Tie2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공되며, 여기서 항-Tie2 항체는 NTDIS (서열 번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, RISPSDGNTYYADSVKG (서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (a) RTRWASX1AX2DY (서열 번호 5) (여기서 X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y L, Q, I, K, 또는 H임), (b) RTRWASWAMDY (서열 번호 6), 또는 (c) RTRWASWAFDY (서열 번호 7)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄(HC) 가변 도메인(VH 도메인); RASQDVSTAVA (서열 번호 8)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SASFLYS (서열 번호 9)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 QQSYTTPPT (서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄(LC) 가변 도메인(VL 도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7을 포함한다. 특정 실시형태에서, CDR-H3은 서열 번호 7을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 11의 VH 프레임워크 FR1 서열, 서열 번호 12의 VH 프레임워크 FR2 서열, 서열 번호 13의 VH 프레임워크 FR3 서열, 및/또는 서열 번호 14의 VH 프레임워크 FR4 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 15의 VL 프레임워크 FR1 서열, 서열 번호 16의 VL 프레임워크 FR2 서열, 서열 번호 17의 VL 프레임워크 FR3 서열, 및/또는 서열 번호 18의 VL 프레임워크 FR3 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (a) 서열 번호 5(여기서 X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y L, Q, I, K, 또는 H임), (b) 서열 번호 6, 또는 (c) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CDR-H3은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7을 포함한다. 특정 실시형태에서, CDR-H3은 서열 번호 7을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, VH 도메인은 서열 번호 20에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고 VL 도메인은 서열 번호 21에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 19의 VH 도메인 서열 또는 서열 번호 21의 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 20의 VH 도메인 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 21의 VL 도메인 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 20의 VH 도메인 서열 및 서열 번호 21의 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 55의 중쇄(HC) 도메인 서열 및 서열 번호 25의 경쇄(LC) 도메인 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 23의 중쇄(HC) 도메인 서열 및 서열 번호 56의 경쇄(LC) 도메인 서열을 포함한다.
일부 양상들에서, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, Tie2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 일부 실시형태에서, VH 도메인은 서열 번호 31에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열 번호 21에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, VH 도메인은 서열 번호 31을 포함하고 VL 도메인은 서열 번호 21을 포함한다. 다른 실시형태에서, HC는 서열 번호 32를 포함하고 LC는 서열 번호 25를 포함한다.
일부 양상들에서, 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, Tie2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 일부 실시형태에서, VH 도메인은 서열 번호 36에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, VL 도메인은 서열 번호 21에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, VH 도메인은 서열 번호 36을 포함하고 VL 도메인은 서열 번호 21을 포함한다. 다른 실시형태에서, HC는 서열 번호 37을 포함하고 LC는 서열 번호 25를 포함한다.
일부 양상들에서, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인; 및 (a) 서열 번호 38을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 39를 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 40을 포함하는 CDR-H3; (b) 서열 번호 43을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 44를 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 45를 포함하는 CDR-H3; 또는 (c) 서열 번호 48을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 49를 포함하는 CDR-H2, 및 서열 번호 50을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, Tie2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 다른 실시형태에서, VL 도메인은 서열 번호 21에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; VH 도메인은 각각 (d) 서열 번호 41; (e) 서열 번호 46; 또는 (f) 서열 번호 51에 최소 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열인 (a), (b), 또는 (c)로 구성된다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 21의 LC 및 서열 번호 42, 서열 번호 46 또는 서열 번호 52를 포함하는 HC를 포함한다.
일부 양상들에서, N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열 번호 6을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 8을 포함하는 CDR-H2, 서열 번호 9를 포함하는 CDR-H3, 서열 번호 48을 포함하는 CDR-H1, 서열 번호 49를 포함하는 CDR-H2, 서열 번호 50을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 2개의 VH 도메인, 및 N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 2개의 VL 도메인을 포함하는, Tie2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 일부 실시형태에서, HC는 서열 번호 54를 포함하고 LC는 서열 번호 53을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 조작된 시스테인을 포함하고, 여기서 조작된 시스테인은 HC 불변 도메인 및/또는 LC 불변 도메인에 존재한다. 다른 실시형태에서, 조작된 시스테인은 중쇄의 T120C, G166C, G178C, T187C, 및 T209C, 및 경쇄의 Q124C, R142C, Q155C, L201C, T206C, K107C, K126C 및 K149C로부터 선택되고, 여기서 잔기 번호는 EU 넘버링에 따른다. 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab의 HC가 아미노산 CDKTHTSPPC(서열 번호 83)에서 끝나는 Fab이다. 일부 실시형태에서, Fab는 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 84, 서열 번호 85, 또는 서열 번호 86의 아미노산 서열에서 끝난다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 단클론 항체이다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 인간화, 키메라 또는 인간 항체이다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 전장 IgG1 또는 전장 IgM 항체이다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 Tie2에 결합하고, 여기서 Tie2는 서열 번호 1에 최소 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 단백질이다.
바람직한 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 Fab이다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 22의 VH 서열 및 서열 번호 21의 VL 서열을 포함하는, 항-Tie2 항체와 경쟁하는 항체 또는 Fab이다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 Tie2의 Ig1 도메인에 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 Tie2의 EGF 도메인에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 Tie2의 Ig3 도메인에 결합하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 Tie2 단백질의 FNIII 도메인에 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사이노몰구스 원숭이 Tie2에 결합한다. 다른 실시형태에서, 사이노몰구스 원숭이 Tie2는 서열 번호 2의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, Tie2에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다중특이성 항체이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 항체는 Tie2 및 VEGF에 결합한다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 항체는 Tie2 및 인자 D에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 다중특이성 항체는 Tie2 및 Ang2에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 Tie2를 활성화하는 다중특이성 항체이다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 항체는 Tie2 및 VEGF에 결합하며, 여기서 다중특이성 항체는 Tie2를 활성화할 수 있다. 다른 실시형태에서, 다중특이성 항체는 Tie2 및 인자 D에 결합하며, 여기서 다중특이성 항체는 Tie2를 활성화할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 다중특이성 항체는 Tie2 및 Ang2에 결합하고, 여기서 다중특이성 항체는 Tie2를 활성화할 수 있다.
한 양상에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
한 양상에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
한 양상에서, Tie2에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 항-Tie2 항체의 발현에 적합한 조건 하에 항-Tie2 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 항-Tie2 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
한 양상에서, 상기 방법에 의해 생산된 항-Tie2 항체가 제공된다.
한 양상에서, 본원에 개시된 실시형태에 따른 Tie2에 특이적으로 결합하는 최소 2개의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 및 다중 팔 모이어티를 포함하는 접합체가 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 최소 2개의 항-Tie2 항체 각각은 Fab이다.
일부 실시형태에서, 접합체는 Tie2에 결합하는 항-Tie2 Fab, 및 다중 팔 모이어티를 포함하며, 여기서 다중 팔 모이어티는 최소 2개의 항-Tie2 Fab에 연결된다. 일부 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 최소 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 항-Tie2 Fab에 연결된다. 다른 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 항-Tie2 Fab에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6 또는 8개의 항-Tie2 Fab에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 8개의 항-Tie2 Fab에 연결된다. 바람직한 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6개의 항-Tie2 Fab에 연결된다.
한 양상에서, 접합체는 Tie2에 결합하여 이의 활성을 활성화한다.
일부 실시형태에서, Tie2에 결합하는 접합체는 AKT 인산화를 활성화시킨다. 다른 실시형태에서, AKT 인산화의 활성화는 시험관내 분석에서 인산화된 AKT 단백질의 증가에 의해 입증된다. 다른 실시형태에서, Tie2 결합제는 Tie2의 인산화를 활성화시킨다. 또 다른 실시형태에서, Tie2 인산화의 활성화는 시험관내에서 측정된다.
일부 실시형태에서, Tie2-발현 세포를 접합체에 노출시키는 것은 세포 내 Tie2 단백질 수준을 감소시키지 않는다. 다른 실시형태에서, 이러한 노출은 세포 내 Tie2 단백질 수준을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 75% 초과만큼 감소시키지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 노출은 세포 내 Tie2 단백질 수준을 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 75% 미만만큼 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 노출은 세포에서 Tie2 단백질 수준을 약 25% 초과 및 약 75% 미만, 약 50% 초과 및 약 75% 미만, 또는 약 60% 초과 및 약 80% 미만만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, Tie2 단백질 수준은 Tie2-발현 세포와 Tie2 결합제의 시험관내 인큐베이션 전후에 웨스턴 블롯에 의해 측정된다. 다른 실시형태에서, 인큐베이션은 37℃에서 10 내지 36시간 또는 12 내지 24시간 동안이다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 0.1 uM 내지 10 uM, 0.01 uM 내지 10 uM, 또는 0.1 내지 100 uM 범위의 평형 해리 상수(Kd)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 다중 팔 모이어티 및 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 접합체는 Tie2의 세포-세포 접합으로의 전위(translocation)를 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 접합체는 혈관 투과성을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 접합체는 혈관 안정성을 촉진하고/하거나 혈관 완전성을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 접합체는 Tie2에 대한 Ang1의 결합을 억제하거나 감소시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 접합체는 Tie2에 대한 Ang2의 결합을 억제하거나 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 접합체 활성은 시험관내 분석을 사용하여 측정된다.
일부 실시형태에서, 다중 팔 폴리올은 이량체, 4량체, 6량체 및 8량체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 다중 팔 폴리올은 6량체 또는 8량체이다. 보다 바람직한 실시형태에서, 다중 팔 폴리올은 6량체이다.
일부 실시형태에서, 폴리올은 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체이다. 다른 실시형태에서, 폴리올은 폴리(알킬렌 글리콜)이다. 또 다른 실시형태에서, 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 일부 실시형태에서, PEG는 작용기화된 다중 팔 PEG이다.
일부 실시형태에서, PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 갖는다:
Figure pct00001
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 20 내지 약 1000, 약 10 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 3 내지 약 200, 약 3 내지 약 100, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 30, 약 20 내지 약 30, 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; n은 약 1 내지 약 10의 정수이고; 각 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 여기서 최소 하나의 R2는 말단 반응기이다. 일부 실시형태에서, R2는 티올 반응기, 아미노 반응기, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수이다.
일부 실시형태에서, PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 1이고, 다중 팔 PEG는 4량체이다.
일부 실시형태에서, PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2이고, 다중 팔 PEG는 6량체이다. 이러한 실시형태에서, 6량체는 화학식 (Ib)의 구조를 갖는다:
Figure pct00002
(Ib)
여기서 각각의 m은 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 20 내지 약 1000, 약 10 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 3 내지 약 200, 약 3 내지 약 100, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 30, 약 20 내지 약 30, 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; 각 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 여기서 최소 하나의 R2는 말단 반응기이고 상기 기재된 바와 같이 항-Tie2 항체 단편 또는 Fab에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 각각의 m은 독립적으로 약 15 내지 35 또는 약 20 내지 30의 정수이다. 다른 실시형태에서, 각각의 m은 독립적으로 약 22의 정수이다.
일부 실시형태에서, R1 및 R2는 함께 구조
Figure pct00003
를 가지며, 여기서 R2는 말레아미드이고;
일부 실시형태에서, PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 3이고, 다중 팔 PEG는 8량체이다. 이러한 실시형태에서, 8량체는 화학식 (Ic)의 구조를 갖는다:
Figure pct00004
(Ic)
여기서 각각의 m은 독립적으로 3-250의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 여기서 최소 하나의 R2는 말단 반응기이고 상기 기재된 바와 같이 항-Tie2 Fab에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 각각의 m은 독립적으로 15 내지 35의 정수이다. 다른 실시형태에서, 각각의 m은 독립적으로 약 22의 정수이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 2개 이상의 항-Tie2 항체 단편 또는 Fab는 다중 팔 폴리올에 공유적으로 연결된다. 다른 실시형태에서, 접합체의 다중 팔 폴리올은 시스테인 아미노산의 유리 설프하이드릴 기를 통해 최소 2개의 항-Tie2 항체 단편 또는 Fab에 공유적으로 연결된다. 다른 실시형태에서, 시스테인 아미노산은 조작된 시스테인이다. 또 다른 실시형태에서, 시스테인 아미노산은 항-Tie2 불변 도메인에 있다. 다른 실시형태에서, 시스테인 아미노산은 항-Tie2 Fab의 중쇄(HC) 또는 경쇄(LC)의 C-말단에 있다. 바람직한 실시형태에서, 시스테인 아미노산은 HC 또는 LC의 N-말단 또는 C-말단에 있지 않다.
일부 실시형태에서, 접합체는 그 HC 및/또는 LC에 조작된 시스테인을 포함하는 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조작된 시스테인은 HC의 T120C, G166C, G178C, T187C, 및 T209C로부터 선택되고; 또는 조작된 시스테인은 LC의 Q124C, R142C, Q155C, L201C, T206C, K107C, K126C 및 K149C로부터 선택되고; 여기서 조작된 시스테인의 잔기 번호는 EU 넘버링에 따른다.
일부 실시형태에서, 접합체는 리신 아미노산의 유리 아미노 기를 통해 최소 2개의 항-Tie2 항체 단편 또는 Fab에 공유적으로 연결된 다중 팔 폴리올을 포함한다. 다른 실시형태에서, 리신 아미노산은 항-Tie2 항체 단편 또는 Fab의 불변 영역에 있다. 또 다른 실시형태에서, 리신 아미노산은 항-Tie2 항체 단편 또는 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 있다. 대안적인 실시형태에서, Tie2 결합제는 리신의 유리 아미노기를 통해 최소 2개의 항-Tie2 Fab에 공유적으로 연결되지 않는다.
일부 실시형태에서, 접합체는 시험관내 생리학적 조건에서 월 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만으로 탈접합된다. 다른 실시형태에서, 접합체는 생체내 생리학적 조건에서 월 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만으로 탈접합된다.
일부 실시형태에서, 접합체는 생리학적 조건에서 월 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만의 Tie2 결합 능력의 손실로 연장된 기간에 걸쳐 안정하다.
한 양상에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 다중 팔 모이어티를 포함하는 접합체가 제공되며, 여기서 다중 팔 부분은 IgM 분자를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgM 분자는 J 사슬을 포함하고 다중 팔 모이어티는 5개의 항-Tie2 Fab를 포함하며, 여기서 대략 5개의 항-Tie2 Fab 각각은 IgM 분자에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, IgM 분자는 J 사슬을 포함하지 않고 다중 팔 모이어티는 6개의 항-Tie2 Fab를 포함하고, 여기서 6개의 항-Tie2 Fab 각각은 IgM 분자에 연결되어 있다.
일부 실시형태에서, 접합체는 아미노산 치환을 갖는 IgM 변이체인 IgM 분자를 포함하고, 이로써 IgM 변이는 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 감소 또는 제거한다. 바람직한 실시형태에서, IgM 변이체는 EU 넘버링에 기초한 치환 P436G를 포함한다.
한 양상에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 다중 팔 모이어티를 포함하는 접합체가 제공되며, 여기서 다중 팔 모이어티는 최소 2, 4, 6, 8 또는 10개의 펩티드를 포함하고, 여기서 대략 펩티드 각각은 항-Tie2 Fab에 공유적으로 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 항-Tie2 Fab 서열은 잔기 221, 222, 223, 224 또는 225(EU 넘버링)에서 끝난다. 다른 실시형태에서, 펩티드 각각은 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제(NDK) 펩티드이다. 또 다른 실시형태에서, NDK 펩티드 각각은 서열 번호 71에 최소 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NDK 펩티드 각각은 이의 N-말단 말단에서 항-Tie2 Fab 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 단부에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 Fab 중쇄 또는 경쇄와 펩티드 사이에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 링커이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 2 내지 20, 5 내지 10 또는 4 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 글리신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6 또는 8개의 펩티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6개의 펩티드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6개의 NDK 펩티드를 포함한다.
한 양상에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 다중 팔 모이어티를 포함하는 접합체가 제공되며, 여기서 다중 팔 모이어티는 IgM 분자를 포함한다. 다른 실시형태에서, IgM 분자는 J 사슬을 포함하고 다중 팔 모이어티는 5개의 항체 단편, Fab 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 대략 5개의 항체 단편, Fab 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 IgM 분자에 연결되어 있다. 또 다른 실시형태에서, IgM 분자는 J 사슬을 포함하지 않고 다중 팔 모이어티는 6개의 항체 단편, Fab 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 6개의 항체 단편, Fab 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 IgM 분자에 연결되어 있다.
일부 실시형태에서, 접합체는 아미노산 치환을 갖는 IgM 변이체인 IgM 분자를 포함하고, 이로써 IgM 변이는 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 감소 또는 제거한다. 바람직한 실시형태에서, IgM 변이체는 EU 넘버링에 기초한 치환 P436G를 포함한다.
한 양상에서, 항체, 항체 단편, Fab, 또는 이의 항원 결합 단편 및 다중 팔 모이어티를 포함하는 접합체가 제공되고, 여기서 다중 팔 모이어티는 최소 2, 4, 6, 8 또는 10개의 펩티드를 포함하고, 여기서 대략 펩티드 각각은 항체, 항체 단편, Fab, 또는 이의 항원 결합 단편에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 항체, 항체 단편, Fab, 또는 이의 항원 결합 단편 서열은 잔기 221, 222, 223, 224 또는 225(EU 넘버링)에서 끝난다. 다른 실시형태에서, 펩티드 각각은 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제(NDK) 펩티드이다. 또 다른 실시형태에서, NDK 펩티드 각각은 서열 번호 71에 최소 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, NDK 펩티드 각각은 이의 N-말단에서 항체, 항체 단편, Fab, 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 단부에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 Fab 중쇄 또는 경쇄와 펩티드 사이에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 아미노산 링커이다. 또 다른 실시형태에서, 아미노산 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 2 내지 20, 5 내지 10 또는 4 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 글리신을 포함한다.
일부 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6 또는 8개의 펩티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6개의 펩티드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 6개의 NDK 펩티드를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명에 따른 항-Tie2 항체 또는 이의 단편 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 다중 팔 모이어티에 연결된 복수의 항-Tie2 Fab, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항-Tie2 결합제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 Tie2 결합제를 포함하는 약학 조성물은 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 추가 치료제는 항-VEGF 항체, 항-Tie2 항체, 및 항-Ang2 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가 치료제는 Ang2 길항제, VEGF 길항제, VEGF 트랩, 항-VEGF 항체, 항-Ang2 항체, 및 보체 성분 길항제로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 임의의 선행 약학 조성물이 의약으로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 임의의 선행 약학 조성물은 대상체에서 안구 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 임의의 선행 약학 조성물은 안구 장애를 갖는 대상체에서 병리학적 혈관 투과성을 감소 또는 억제하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, 임의의 선행 약학 조성물은 대상체에서 안구 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
한 양상에서, 환자에게 본원에 기재된 항-Tie2 항체 및/또는 Tie2 결합제를 투여하는 것을 포함하는 치료를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 항-Tie2 접합체를 포함하는 본원에 기재된 약학 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개체는 혈관 장애를 진단받았다. 다른 실시형태에서, 개체는 눈의 혈관 장애를 진단받았다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 바람직하지 않은 혈관 투과성과 관련된 장애에 걸린 대상체에서 혈관 투과성을 억제하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 대상체에게 유효량의 전술한 항체 또는 접합체 중 어느 하나를 투여하여 대상체의 혈관 투과성을 억제하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 바람직하지 않은 혈관 투과성과 관련된 장애를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 전술한 항체 또는 접합체 중 어느 하나의 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 개체는 Tie2 경로와 관련된 장애를 진단받았다.
일부 실시형태에서, 개체는 당뇨병성 황반 부종(DME), 건성 및 습성(비삼출성 및 삼출성) 형태를 포함하는 연령 관련 황반변성(AMD), 맥락막 신생혈관(CNV), 포도막염, 당뇨병성 망막병증, 허혈-관련 망막병증, 병리학적 근시, 폰 히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 각막 신생혈관, 녹내장, 부종이 없는 망막병증, 및 망막 신생혈관으로 이루어진 군으로부터 선택된 눈 장애를 진단받았다.
일부 실시형태에서, 개체는 항-VEGF 항체로 치료를 받았다. 다른 실시형태에서, 개체는 항-VEGF 항체의 치료 효능을 경험하지 않았고, 항-VEGF 항체의 감소된 치료 효능을 경험하고/하거나 항-VEGF 항체의 치료 효능을 경험하는 것을 중단하였다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 개체에게 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 제2 치료제는 항-VEGF 항체, 항-Ang2 항체, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이성 항체, VEGF 길항제 및 Ang2 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도면의 간단한 설명
도 1. VH 라이브러리를 패닝하는 데 사용되는 Tie2 도메인들의 개략도를 제공한다.
도 2A-2B는 항-Tie2 항체 Tie2.1, Tie2.10, Tie2.11 및 Tie2.12에 의한 마우스 Tie2 ECD5 도메인(도 2A) 및 인간 Tie2 ECD5 도메인(도 2B)에 대한 결합을 평가하기 위한 분석 결과를 보여준다. ECD5 도메인은 Tie2의 Ig1, Ig2, EGF 및 Ig3 도메인을 포함한다.
도 3A-3B는 인간 Tie1에 대한 항-Tie2 항체 Tie2.1, Tie2.10, Tie2.11, 및 Tie2.12(도 3A) 및 Tie2.2, Tie2.3, Tie2.4, Tie2.5, Tie2.7, Tie2.9, Tie2.15, Tie2.16, Tie2.17 및 Tie2.20(도 3B)에 의한 결합을 평가하기 위한 분석 결과를 보여준다.
도 4A-4B는 항-Tie2 항체 Tie2.1, Tie2.12, 및 Tie2.20에 의한 Tie2와 Ang1(도 4A) 사이의 상호작용 및 Tie2와 Ang2(도 4B) 사이의 상호작용의 차단을 평가하기 위한 분석의 결과를 보여준다.
도 5A-5B는 HUVEC(도 5A) 및 RAEC(도 5B)에 대한 항-Tie2 항체 Tie2.1, Tie2.10, Tie2.11 및 Tie2.12에 의한 결합을 평가하기 위한 분석 결과를 보여준다.
도 6A-6B는 RAEC에서 항-Tie2 항체 Tie2.1, Tie2.4, Tie2.5 및 Tie2.20에 의한 AKT 인산화의 활성화를 평가하고(도 6A) AKT 인산화에 대한 항-Tie2 항체의 항-IgG 교차 결합 효과를 평가(도 6B)하기 위한 분석 결과를 보여준다. 인산화된 AKT의 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되었다.
도 7A-7B는 항-Tie2 항체 Tie2.1, Tie2.22, Tie2.23, Tie2.24, Tie2.27, Tie2.28, Tie2.31, Tie2.33, Tie2.34, Tie2.34, Tie2.38 및 Tie2.1에 의한 AKT 인산화의 활성화를 평가하기 위한 분석 결과를 보여준다 (도 7A). 도 7B는 AKT의 인산화를 유도하는 항-Tie2 항체 Tie2.1의 활성에 대한 항-Tie2 항체 응집 또는 항-IgG 교차 결합의 효과를 보여준다. 인산화된 AKT의 수준은 FRET 분석에 의해 결정되었다.
도 8A-8B는 방법(도 8A) 및 ELISA를 사용한 항-Tie2 항체의 비닝 연구 결과(도 8B)를 도시한다.
도 9는 본 발명의 항-Tie2 항체가 결합하는 Tie2 상의 에피토프 그룹들을 도시하는 개략도이다.
도 10A 및 10B는 항-Tie2 항체 Tie2.1(서열 번호 22), Tie2.1.M100cF(서열 번호 20), Tie2.12(서열 번호 31), Tie2.24(서열 번호 36), Tie2.33(서열 번호 41) 및 Tie2.38(서열 번호 51)의 중쇄 가변 영역(VH) (도 10A) 및 항-Tie2 항체 Tie2.1 (서열 번호 21), Tie2.1.M100cF (서열 번호 21), Tie2.12 (서열 번호 21), Tie2.24 (서열 번호 21), Tie2.33 (서열 번호 21) 및 Tie2.38 (서열 번호 21)의 경쇄 가변 영역(VL)(도 10B)의 아미노산 서열의 서열 정렬을 보여준다.
도 11A-11B는 파지 디스플레이 또는 동물 면역화를 통해 생성된 다양한 항-Tie2.1 항체를 사용한 비닝 분석 결과를 도시한다. 도 11A는 공유적으로 고정화된 항체 및 용액 중 이들 여러 항체들의 목록을 제공하는 반면, 도 11B는 용액 중의 나머지 항체들의 목록을 제공한다.
도 12A-12B는 다량체 항-Tie2 항체의 작용제 활성을 평가하는 결과 분석을 보여준다. 도 12A는 PEG 6량체로서 및 이중-에피토프 FabIgG(1.38)로서 Tie2.1에 의한 AKT 인산화 활성화를 비교한다. 도 12B는 항-Tie2 항체의 다량체 형식을 비교한다.
도 13A - 13B는 총 단백질의 A280에 의해 측정된 친화도 컬럼으로부터 단리된 단백질의 총 수율에 대한 J-사슬 유무에 따른 다양한 huIgM 중쇄 대 경쇄 비율의 효과(도 13A) 및 SEC 프로파일(도 13B)을 보여준다.
도 13C는 인자 D(fD)를 표적화하는 안구 다가 PEG 형식과 비교한 IgM의 유동학 측정을 보여준다.
도 13D는 비-결합 IgM 및 비-결합 Fab의 유리체 약동학 분석을 나타낸다.
도 13E는 암컷 SCID 마우스에 정맥내 주사된 인간 혈청으로부터 단리된 IgM과 비결합 재조합 hIgM 5량체 및 재조합 hIgM 6량체를 비교하는 IgM의 전신 약동학 분석을 보여준다. 도 13E는 혈청 IgM 수준을 나타낸다.
도 13F는 혈청 샘플로부터의 전체적인 N-연결 글리칸 프로파일의 LC-MS 분석을 보여준다.
도. 13G - 13H는 IgM 다량체 형식에서 항-Tie2 항체를 특성화하기 위한 분석 결과를 보여준다. 도 13G는 IgM 불변 도메인에서 돌연변이를 평가하기 위한 보체 분석 결과를 보여준다. 도 13H는 IgM 6량체 형식에서 항-Tie 항체의 작용제 활성을 도시한다.
도 14A - 14B는 펩티드 모이어티를 통한 6량체 형식의 항-Tie2 항체의 설계 및 분석을 보여준다. 도 14A는 다량체 설계의 개략도이다. 도 14B는 NDK 펩티드, IgM 및 다중 팔 PEG를 통한 6량체 형식의 항-Tie2 항체를 비교하는 AKT 인산화 분석 결과를 보여준다.
도 15A - 15B는 6량체 형식에서 다양한 항-Tie2 항체의 작용제 활성을 평가하기 위한 AKT 인산화 분석 결과를 보여준다. 결과는 Tie2.1, Tie2.38, Tie2.33(도 15A) 및 Tie2.1, Tie2.1.M100cF, Tie2.12, Tie2.24(도 15B)에 대해 표시된다.
도 16A - 16C는 시험관내 분석에서 Tie2 단백질의 세포 수준에 대한 항-Tie2 항체의 효과를 평가하기 위한 분석 결과를 보여준다. 각각의 도 16A, 도 16B, 및 도 16C는 파지 디스플레이 및 동물 면역화를 통해 생성된 항-Tie2 항체에 대한 HUVEC의 노출 시 Tie2 수준을 비교한다. 도 16A, 도 16B, 및 도 16C의 모든 분석은 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 17은 Tie2 단백질 수준의 세포 수준에 대한 항-Tie2 항체의 효과를 평가하기 위한 생체내 분석 결과를 나타낸다.
도 18A - 18B는 내피 세포 장벽 투과성에 대한 항-Tie2.1 항체의 효과를 연구하기 위한 시험관내 내피 세포 분석의 분석 방법(도 18A) 및 결과(도 18B)를 도시한다.
도 19A - 19B는 VEGF-유도 혈관 누출에 대한 항-Tie2.1 항체의 효과를 연구하기 위한 생체내 혈관 투과성 분석의 분석 방법(도 19A) 및 결과(도 19B)를 도시한다.
도 20A - 20B는 VEGF-유도 혈관 누출에 대한 항-Tie2.1 항체 또는 항-VEGF 항체의 효과를 연구하기 위한 생체내 혈관 투과성 분석의 분석 방법(도 20A) 및 결과(도 20B)를 도시한다.
도 21A - 21B는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 Tie2의 단백질 수준에 대한 이중-에피토프 항-Tie2 작용제(항-Tie2 Fab-IgF 1.38)의 생체내 효과(도 21A) 및 생체내 혈관 투과성의 결과를 예시한다. VEGF-유도된 혈관 누출에 대한 항-Tie2 Fab-IgG 1.38의 효과를 연구하기 위한 생체내 혈관 투과성 분석 결과(도 21B)를 도시한다.
도 22는 배양된 HUVEC에서 VE-카드헤린(상부 패널) 및 F-액틴(하부 패널)의 세포 조직에 대한 항-Tie2 작용제의 효과를 보여준다.
도 23은 IG1 형식에서 Tie2.1 항-Tie2 항체의 변이체의 작용제 활성을 평가하기 위한 AKT 인산화 분석의 결과를 보여준다.
도 24는 6량체 형식의 Tie2.1 항-Tie2 접합체의 변이체의 작용제 활성을 PEG-접합되지 않은 Tie2.1 Fab(6량체 없음)와 비교하여 평가하는 AKT 인산화 분석의 결과를 보여준다.
도 25는 사이노몰구스 원숭이에서 안구 주사 후 항-Tie2 Fab 6량체 접합체의 약동학을 나타낸다.
도. 26 - 27은 단량체 피크가 상대 정량에 포함된(도 26) 및 포함되지 않은(도 27) 항-Tie2.1 PEG 접합체의 전기영동도 분석을 보여준다.
도 28은 사이노몰구스 유리체액으로부터 채취한 샘플에서 항-Tie2.1 PEG 접합체의 전기영동도 분석을 보여준다.
도 29는 항-Tie2 PEG 접합체 6량체 및 5량체의 상대량을 보여준다.
도 30A-30B는 21일 동안 사이노몰구스 원숭이의 눈에서 채취한 샘플에서 M100c(도 30A)의 산화를 나타내는 데이터를 제공한다(도 30B).
도 31은 pAKT 활성에 대한 산화 효과를 나타낸다.
도 32 - 33은 pAKT 활성(도 32)에 대한 탈접합의 효과를 보여주며, 정규화된 값은 도 33에 그래프로 나타낸다.
도 34는 탈접합에 대한 PEG 접합 부위 위치의 효과를 도시한다.
도 35A는 활성에 대한 PEG 접합 부위 위치의 효과를 보여준다.
도 35B는 활성에 대한 PEG 접합 부위 위치의 효과를 보여준다.
도 36은 상이한 Tie2.1M100cF PEG 접합체의 약동학을 보여준다.
도 37은 상이한 Tie2.1M100cF PEG 접합체의 생체내 안정성을 비교한다.
도 38A - 38B는 상이한 Tie2.1M100cF PEG 접합체의 활성을 비교한다. 도 38A는 pAKT 활성을 보여주며, 도 38B는 ELISA를 통한 총 접합체 수준을 보여준다.
도 39는 본 발명에 따른 항-Tie2 항체에 접합된 PEG 접합체 6량체 코어 분자의 구조를 나타낸다.
본 발명의 실시형태들의 상세한 설명
I. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, “~를 포함하는”이라는 용어는 “~로 이루어진”이라는 용어를 포함해야 한다.
특정 값(예를 들어, 온도, 농도, 시간 및 기타)과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 “약”은 용어 “약”이 나타내는 특정 값의 +/- 1%의 변동을 지칭할 것이다.
본원의 목적과 관련하여 “수용체 인간 프레임워크”는 하기 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 “유래된” 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 실시형태들에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
“친화도”는 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 짝(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 본 명세서에 기재된 “결합 친화도”는 결합쌍(예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 의미한다. 분자 X가 이의 짝 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 해당 분야에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정 될 수 있다. 결합 친화도를 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시형태는 아래에 기재되어 있다.
“친화도 성숙된” 항체는 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에 하나 이상의 변경을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 이러한 변경이 있는 항체를 지칭하며, 이러한 변경은 항원에 대한 항체의 친화도를 개선한다.
용어 “항-Tie2 항체”, “Tie2에 결합하는 항체” 및 “Tie2에 특이적으로 결합하는 항체”는 항체가 Tie2를 표적으로 하는데 있어서 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할만큼 충분한 친화도로 Tie2에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 관련없는, 비-Tie2 단백질에 대한 항-Tie2 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역분석 (RIA)으로 측정시 Tie2에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태들에서, Tie2에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 또는 그 미만, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 특정 실시형태들에 있어서, 항-Tie2 항체는 상이한 종의 Tie2에서 보존되는 VEGF의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 항체 구조를 포함한다.
“항체 단편”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “전장 항체”, “온전한 항체” 및 “전 항체 (whole antibody)”는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다.
본원에 사용된 “Fab”는 CH1 도메인, 또는 경쇄 불변 영역과 이황화 결합을 형성하기에 충분한 CH1 도메인의 부분을 포함하지만, CH2 도메인 또는 CH3 도메인은 함유하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 Fab는 힌지 영역의 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 용어 “Fab”는 Fab' 항체를 포함한다. Fab는 C-말단 시스테인과 같은 추가의 비천연 아미노산을 포함할 수 있으며, 이 경우 Fab-C로 지칭될 수 있다. 하기에 논의되는 바와 같이, 용어 Fab-C는 또한 C-말단의 천연 시스테인을 포함하는 힌지 영역의 천연 아미노산을 포함하는 Fab를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fab는 조작된 시스테인을 포함한다(즉, Fab는 THIOMAB일 수 있음). 일부 실시형태에서, 조작된 시스테인은 비-시스테인 아미노산 잔기에 대해 치환된 Fab HC 및/또는 LC 폴리펩티드 서열 내의 시스테인 아미노산 잔기이다.
“Fab-C”는 C-말단 시스테인을 갖는 Fab를 지칭하며, 이는 해당 잔기 위치에서 나타나는 천연 시스테인(예를 들어, 힌지 영역의 시스테인)일 수 있거나 천연 시스테인에 해당하지 않는 C-말단에 첨가된 시스테인일 수 있다.
“Fab-SH”는 유리 티올 기를 갖는 Fab를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유리 티올 기는 Fab의 C-말단의 마지막 10개 아미노산에 위치한다. Fab-C 항체는 일반적으로 Fab-SH 항체이기도 하다.
참조 항체와 “동일한 에피토프에 결합하는 항체”는 경쟁 분석에서 참조 항체의 그 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하며, 반대로, 참조 항체는 경쟁 분석에서 이러한 항체의 그 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 분석이 본원에서 제공된다.
용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종들로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종들로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 “분류”는 그 중쇄가 갖는 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
용어 “접합체”는 함께 결합되거나 연결된 것을 의미하는 가장 넓은 정의에 따라 본원에서 사용된다. 분자들이 결합된 것처럼 작용하거나 작동할 때 이들은 “접합”된다. “접합체”는 폴리올을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체(예를 들어, Fab)이다. 특정 실시형태에서, “접합체”는 다중 팔 모이어티에 공유 결합된 항체(예를 들어, 본원에 상세히 기술된 바와 같은 항체 단편)를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 다중 팔 모이어티는 폴리올, IgM 분자, 또는 다량체(예를 들어, 6량체) 형식의 펩티드이다.
본원에서 사용되는 용어 “Tie2”은, 달리 지시가 없는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 천연 Tie2를 지칭한다. 이 용어는 “전장”의, 비처리 Tie2, 뿐만 아니라 세포에서 처리된 임의의 형태의 Tie2을 포함한다. 이 용어는 또한 Tie2의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 Tie2 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 참조 번호: NP_000450(서열 번호 1)을 갖는다.
본원에 사용된 용어 “세포독성제”는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입 물질); 성장 억제제; 효소, 예를 들어, 핵산분해효소 및 이의 단편; 항생제; 독소, 예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 소분자 독소, 이의 단편 및/또는 변이체 포함; 그리고 아래에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
“효과기 기능”은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 이는 항체 아이소형에 따라 달라진다. 항체 효과기 기능들의 예에는 다음이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균 작용; 세포 표면 수용체들 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 그리고 B 세포 활성화.
제제, 예를 들어, 약학 제형의 “유효량”은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 그리고 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 “Fc 영역”은 불변 영역의 최소 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다.
“프레임워크” 또는 “FR”은 초가변 영역 (HVR) 잔기들 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 “숙주 세포”, “숙주 세포주”, 및 “숙주 세포 배양물”은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 “형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 이러한 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 배제한다.
“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별에 있어서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열들의 하위그룹들은 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에서와 같은 하위그룹이다. 한 실시형태에서, VL의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 한 실시형태에서, VH의 경우, 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에서와 같은 하위그룹 III이다.
“인간화” 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시형태들에 있어서, 인간화 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVR들 (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 “인간화 형태”, 예를 들어, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs)과 3개의 초가변 영역(HVR들)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007).참조) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VH 또는 VL 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, Portolano 외, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991) 참조.
본 출원에서 사용되는 용어 “초가변 영역(hypervariable region)”, “HVR” 또는 “HV”는 서열에서 초가변적(또한 본원에서 “상보성 결정 영역” 또는 “CDR”로 지칭됨)이고, 및/또는 구조적으로 특정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6 개 HVR의 가장 큰 다양성을 나타내며, H3은 특히 항체에 대해 미세한 특이성을 부여하는데 있어서 독특한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, Xu 외, Immunity 13:37-45(2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)를 참조한다. 실제로 중쇄로만 구성된 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄가 없을 때 기능적이고 안정적이다. 예를 들어, Hamers-Casterman 외, Nature 363:446-448(1993); Sheriff 외, Nature Struct. Biol. 3:733-736(1996)을 참조하라.
다수의 HVR 설명들이 사용되고 있으며 본원에 포함된다. Kabat 상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기초하며 가장 일반적으로 사용된다(Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). Chothia는 대신 구조 루프의 위치를 지칭한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). AbM HVR은 Kabat CDRs과 코티아 구조 루프 사이의 절충(compromise)을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 이용된다. “접촉” HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기들을 하기에 나타낸다.
루프 Kabat AbM Chothia 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B(Kabat 넘버링)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35(Chothia 넘버링)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
HVR은 다음과 같은 “연장된 HVR들”을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2) 및 89-97 또는 89-96(L3) 및 VH에서 26-35(H1), 50-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102(H3). 가변 도메인 잔기들은 이들 정의 각각에 대해 상기 Kabat 외의 문헌에 따라 넘버링된다.
용어 “Kabat에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링” 또는 “Kabat와 같은 아미노산 위치 넘버링”, 및 이의 변형은 Kabat 외, 상기 문헌들에서 항체 컴파일에 관한 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 체계를 의미한다. 이 넘버링 체계를 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 삽입에 상응하도록 몇개 더 적은 수의 아미노산을, 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a)와 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(가령, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등등)를 포함할 수 있다. Kabat의 잔기 넘버링은 “표준” Kabat 넘버링 서열과 항체의 서열의 상동성 영역을 정렬하여 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다.
가변 도메인 내에 잔기(대략, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때, Kabat 넘버링 체계가 일반적으로 이용된다(예를 들면, 상기 Kabat 외의 문헌 참조). “EU 넘버링 체계” 또는 “EU 색인”(예를 들면, 상기 Kabat 외의 문헌에서 보고된 EU 색인)은 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 잔기를 지칭할 때 이용된다. “Kabat에서와 같은 EU 색인”은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인에서 잔기 번호에 대한 언급은 Kabat 넘버링 체계에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인에서 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0181888, EU 넘버링에 대한 도면 참조).
“면역접합체”는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
“개체” 또는 “대상체”는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태들에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
“단리된” 항체는 자연 환경의 구성요소에서 분리된 항체이다. 일부 실시형태들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토는 예로써, Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참조한다.
“단리된” 핵산은 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어 있는 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
“항체를 인코딩하는 단리된 핵산”, 예를 들어, 항-Tie2 항체는, 단일 벡터 또는 별도의 벡터에 있는 이러한 핵산 분자를 포함하는, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “단클론 항체”는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 즉, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 모집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 “단클론(monoclonal)”은 실질적으로 동질성 항체 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
“네이키드(naked) 항체”는 이종 모이어티(예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 이러한 네이키드 항체는 약학 제형으로 존재할 수 있다.
“천연 항체”는 다양한 구조의 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 이종4량체 당단백질로써, 약 150,000 달톤이며, 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 포함하며, 이들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있다. 도메인 N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VH), 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역 (VL), 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 (κ및 람다 (λ라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
“약품 설명서(package insert)”라는 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 치료 제품의 상용 패키지에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하는 데 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 “아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)”는, 서열들을 정렬하고 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기들과 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기들의 백분율로 정의되며, 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 해당 분야의 기술 범위에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 구현하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에서 제작되었으며 소스 코드는 미국 워싱턴 D.C., 20559에 소재한 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재한 Genentech, Inc.사로부터 공개적으로 이용가능하거나 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 체제에서 사용되도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이것과, 또는 이에 대항한 소정의 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 아래와 같이 계산된다:
100 x 분율 X/Y
이때 X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록되는 아미노산 잔기의 수를 말하며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기 수가 된다. 아미노산 서열 A의 길이는 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않은 것으로 인정된다. 달리 특정 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 전 단락에서 설명된 바와 같이 수득된다.
용어 “약학 제형 (pharmaceutical formulation)”이란 내부에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 제재를 지칭하며, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가능한 독성을 주는 추가 성분들은 포함하지 않는다.
“약학적으로 허용되는 담체”는 활성 성분 이외에 약학 제형 안에 있는 성분을 말하며, 대상체에게 비독성이다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “폴리올”은 다가 알코올 화합물을 광범위하게 의미한다. 폴리올은 예를 들어, 임의의 수용성 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체일 수 있으며 선형 또는 분지형 사슬을 가질 수 있다. 바람직한 폴리올은 하나 이상의 하이드록실 위치에서 1 내지 4개의 탄소를 갖는 알킬기와 같은 화학 작용기로 치환된 것을 포함한다. 전형적으로, 폴리올은 폴리(알킬렌 글리콜), 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 그러나, 당업자는 예를 들어, 폴리(프로필렌 글리콜) 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체와 같은 다른 폴리올이 PEG에 대해 본원에 기재된 접합 기술을 사용하여 사용될 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 폴리올은 당업계에 잘 알려진 것들 및 상업적으로 구입가능한 공급원으로부터와 같이 공개적으로 구입가능한 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 “치료(treatment)”(및 이의 문법적 변화형, 이를 테면 “치료하다(treat)” 또는 “치료하는(treating)”)라는 것은 치료될 개체의 자연적인 과정을 변경시키려는 시도에 있어서의 임상적 시술과정을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리학 과정 동안 실행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태들에 있어서, 본 발명의 항체는 질환 또는 질환의 발달을 지연 또는 질환의 진행을 느리게 하는데 이용된다.
본원에 사용된 용어 “벡터”는 이것이 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어에는 자가-복제 핵산 구조체로서의 벡터 그리고 그것이 도입되는 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 “발현 벡터”로 지칭된다.
“포트 전달 시스템” 또는 “PDS”는 눈에 이식 가능한 장치로서 장기간에 걸쳐 치료제를 전달할 수 있는 재충전 가능한 저장소가 있다. 이식물은 저장소와 소통하는 리필 포트 및 눈으로의 약물 방출 속도를 결정하는 방출 제어 요소를 갖도록 구성된다. 예를 들어, US20100174272, 8,277,830; 8,399,006; 8,795,712; 및 8,808,727을 참조하라.
“소-구경 바늘”은 30 게이지 바늘과 같은 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 또는 22 게이지 이상의 유체 조성물의 주사용 바늘을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 소-구경 바늘은 표준 크기의 벽을 갖는다. 다른 실시예에서, 소-구경 바늘은 얇은 벽을 가지며, 이는 점성 용액에 바람직할 수 있다.
II. 조성물 및 방법
예를 들어, Tie2의 인산화에 의해 입증된 바와 같이 Tie2 기능을 활성화하는 신규한 Tie2 작용제가 본원에서 제공된다. 직접 작용제는 Tie2 신호전달의 보다 강력한 활성화에 있어서 치료적으로 유리할 수 있으며, 내인성 작용제 Ang1이 부족하거나 없는 경우 시력 개선을 유도한다. Tie2의 활성화제는, Ang2의 결합을 차단하고(Ang2 길항제 기능을 차단함) Tie2에 직접 결합하여 Tie2 활성을 활성화, 예를 들어, Tie2 및/또는 Akt의 인산화를 증가시킬 수 있기 때문에 Ang2의 억제제보다 유리할 수 있다. Tie2의 활성화는 리간드의 결합 시 Tie2의 클러스터링을 필요로 하는 것으로 나타났으며, 따라서 본원에서 제공된 Tie2 작용제는 다량체, 바람직하게는 6량체 또는 8량체이다. 본원에 기재된 다량체 Tie2 작용제는 시험관내 또는 생체내에서 세포 Tie2 수준을 유의하게 감소시키지 않는다는 예상치 못한 추가 이점을 가질 수 있다. 더욱이, 본원에 기술된 다량체 Tie2 작용제는 유리체내 주사용으로 제형화될 수 있고 유리한 약동학 및 그에 따른 약력학을 부여하는 분자 크기를 가질 수 있다. 다량체 Tie2 작용제가 내피 세포막 투과성을 감소시키고 세포-세포 접합부를 강화한다는 것을 보여주는 데이터가 제공된다(예를 들어, 실시예 10 참조).
한 양상에서, 본 발명은 부분적으로 Tie2에 결합하는 항체에 기초한다. 특히, 하나 이상의 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 항-Tie2 Fab(그러나 이에 제한되지 않음)를 포함하는 결합제(본원에서 접합체라고도 함)가 제공된다. 결합제가 4개 초과(예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 포함)의 항-Tie2 항체, 예를 들어, 4개 초과의 항-Tie2 Fab를 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 그 결과 세포 표면에 위치한 Tie2에 대한 Tie2 결합제의 결합은 Tie2 활성화와 관련이 있다. Tie2 클러스터링은 또한 결합제가 Tie2에 결합될 때 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 표면 상의 Tie2에 결합시 세포 표면 상의 Tie2 단백질 수준의 유의한 감소를 야기하지 않는 Tie2 결합제를 갖는 것이 유리하다. 일부 실시형태에서, Tie2를 활성화하는 Tie2 결합제는 Tie2에 대한 친화도가 약 0.1uM 내지 10uM 범위인 항-Tie2 항체(Fab)를 포함한다.
Tie2 단백질의 활성화는 Tie2 단백질의 인산화 증가를 측정하거나(예를 들어, 웨스턴 블롯에 의해) 관련 Akt 단백질(AKT 세린/트레오닌 키나제 1, 예를 들어, GenBank 접근 번호 NP_001014431)의 인산화 증가를 통상의 기술자에게 용이하게 알려진 재료 및 방법을 사용하여 측정함으로써 시험관 내에서 측정할 수 있다. 특정 실시형태에서, Tie2에 결합하는 항체, 뿐만 아니라 Tie2에 결합하는 둘 이상의 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 다중 항체를 포함하는 항체 및 조성물은 특히 눈의, 예를 들어, Tie2 기능과 관련된 혈관 투과성 장애의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항-Tie2 결합제
한 양상에서, 본 발명은 Tie2에 결합하는 단리된 항체를 포함하는 Tie2 결합제를 제공한다. 일부 실시형태에서, Tie2 결합제는 다중 팔 모이어티를 포함하며, 여기서 각각의 팔은 항-Tie2 항체 또는 이의 단편에 접합되거나 연결된다. 바람직한 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 항-Tie2 Fab이다. 다중 팔 모이어티의 예는 다중 팔 폴리올(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), IgM, 및 다량체, 예를 들어, 6량체 펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 둘 이상의 항-Tie2 항체 또는 이의 단편을 포함하는 Tie2 결합제가 제공되고, 여기서 항-Tie2 항체 (Tie2 결합제의 일부가 아니지만 임의로 전장 항체로서 포맷된 경우)는 100 uM 미만, 또는 50 uM 미만 또는 10 uM 미만의 KD 및/또는 1 uM 초과의 KD와 같은 친화도로 Tie2에 결합한다. 친화도는 둘 이상의 항-Tie2 항체를 포함하는 Tie2 결합제가 아니라 항체를 사용하여 측정되는 것으로 이해된다. 일부 실시형태에서, 친화도는 1가 친화도이다. 추가로, Tie2 활성을 활성화하는 (예를 들어, Tie2 작용제로서 기능하는) Tie2 결합제 및 Tie2 항체가 제공된다. Tie2의 활성화는, 예를 들어, 시험관내 분석에서 Tie2의 인산화 증가 및/또는 AKT 인산화 증가를 측정함으로써 측정된다. 일부 실시형태에서, Tie2 결합제는 세포 내 Tie2 단백질 수준을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75% 또는 85% 초과만큼 하향조절(감소)시키지 않는다. 대안적 실시형태에서, Tie2 결합제는 세포 내 Tie2 단백질 수준을 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 75% 미만만큼 감소시킨다. 일부 실시형태에서, Tie2 결합제는 혈관 투과성을 감소시킨다. 혈관 내피 세포 투과성의 감소는 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, Tie2 결합제는 Tie2의 세포-세포 접합으로의 전위를 증가시키고/시키거나 액틴 및/또는 카드헤린의 구조적 조직화를 촉진할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, Tie2 결합제는 6개의 팔 각각이 항-Tie2 Fab에 접합된 6량체 PEG 분자를 포함한다. 대안적으로, PEG 분자는 8개의 팔을 포함한다. 일부 실시형태에서, Tie2 결합제는 본원에 기재된 바와 같은 둘 이상의 항-Tie2 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 Tie2에 결합하는 항-Tie2 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 Tie2의 Ig2 도메인에 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 잔기 23 내지 120 내에 적어도 부분적으로 존재하는 에피토프에) 결합한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 5; 서열 번호 6; 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 (여기서, X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y L, Q, I, K, 또는 H임); (d) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3로부터 선택된 최소 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR들을 포함하는, Tie2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시형태에서, CDR-H3은 서열 번호 7을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 (여기서 X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y, L, Q, I, K, 또는 H임)으로부터 선택된 최소 1, 최소 2, 또는 3개 모두의 VH 도메인 CDR 서열들을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 치환들의 모든 가능한 조합이 서열 번호 5의 공통 서열에 포함된다. 한 실시형태에서, CDR-H3은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CDR-H3은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 최소 1, 최소 2, 또는 3개 모두의 VL 도메인 CDR 서열들을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시형태에서, VL 도메인은 (a) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 번호 5 (여기서 X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y, L, Q, I, K, 또는 H임); 서열 번호 6; 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택된 최소 1, 최소 2, 또는 3개 모두의 VH CDR을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (c) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택된 최소 1, 최소 2, 또는 3개 모두의 VL CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호 5 (여기서 X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y, L, Q, I, K, 또는 H임), 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 실시형태에서, VH 도메인은 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 VL 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
임의의 상기 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 인간화될 수 있다. 한 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 상기 실시형태 중 어느 하나와 같은 CDR들을 포함하고, 인간 수용체 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 임의의 상기 실시형태에서와 같은 CDR을 포함하고, 서열 번호 11의 VH 프레임워크 FR1 서열, 서열 번호 12의 VH 프레임워크 FR2 서열, 서열 번호 13의 VH 프레임워크 FR3 및/또는 서열 번호 14의 VH 프레임워크 FR4 서열을 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 서열 번호 15의 VL 프레임워크 FR1 서열, 서열 번호 16의 VL 프레임워크 FR2 서열, 서열 번호 17의 VL 프레임워크 FR3 서열, 및/또는 서열 번호 18의 VL 프레임워크 FR3 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 항-Tie2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항-Tie2 항체는 Tie2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 20에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, CDR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, 항-Tie2 항체는 서열 번호 20의 VH 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2: 및 (c) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 양상에서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-Tie2 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 최소 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 그 서열을 포함하는 항-Tie2 항체는 Tie2에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시형태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호 21에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태들에서, HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 치환, 삽입 또는 결실이 발생한다. 선택적으로, 항-Tie2 항체는 서열 번호 21의 VL 서열을 포함하며, 이 서열의 번역후 변형도 포함된다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3에서 선택된 1, 2, 또는 3개 HVR들을 포함한다.
또 다른 양상에서, 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시형태에서와 같은 VL을 포함하는 항-Tie2 항체가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 항체는 이들 서열의 번역후 변형을 포함하여 각각 서열 번호 20 및 서열 번호 21의 VH 및 VL 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-Tie2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 서열 번호 20의 VH 서열 및 서열 번호 21의 VL 서열을 포함하는 항-Tie2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시형태에서, Tie2의 단편 내의 에피토프, 예를 들어, Ig1 도메인이 서열 번호 1의 아미노산 23-120을 포함하는 Tie2의 Ig1 도메인에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 임의의 상기 실시형태에 따른 항-Tie2 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 단클론 항체이다. 한 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어, 온전한, 예를 들어, IgG1, 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 분류 또는 아이소형이다.
또 다른 양상에서, 상기 실시형태들 중 어느 하나에 따른 항-Tie2 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같이, 상기 특징들을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 10 μM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM, 및/또는 ≥ 0.01 μM, 0.1 μM, 또는 1 μM (예를 들어, 10-5M 이하, 10-6M 이하, 10-8 M 이하, 예를 들어, 1 μM 내지 10 μM, 예를 들어, 0.1 μM 내지 10 μM, 예를 들어, 10-6 M 내지 10-9 M, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 가진다.
한 실시형태에서, Kd는 방사표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 한 실시형태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 형태 및 이의 항원을 이용하여 수행된다. 예를 들면, 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화도는 일련의 역가들의 비표지 항원의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 다음, 항-Fab 항체-피복된 플레이트와 결합된 항원을 포집함으로써 측정된다 (예컨대, Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) 참조). 분석 조건을 설정하기 위해 MICROTITER® 다중 웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50mM 소듐 카보네이트(pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체(Cappel Labs)로 밤새 코팅한 다음, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 실온(약 23°C)에서 2 내지 5시간 동안 차단시켰다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합된다 (예로써, Presta 외, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치). 관심 Fab는 그 다음 하룻밤 동안 배양되고; 그러나, 평형에 확실하게 이를 수 있도록 더 오랜 기간(예로써, 약 65 시간) 동안 배양이 지속될 수 있다. 그 이후, 상기 혼합물은 실온 배양 (예로써, 1 시간 동안)을 위하여 포획 플레이트로 이전된다. 그런 다음 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®) 으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면 150 μl/웰의 섬광제 (MICROSCINT-20 TM; Packard)를 추가하고 플레이트를 TOPCOUNT™ 감마 카운터(Packard)에서 10분 동안 계수한다. 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위하여 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab 농도가 선택된다.
또 다른 실시형태에 따르면, KD는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 측정된다. 예를 들면, BIACORE® -2000 또는 BIACORE ® -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용한 분석은 25℃에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 ~10 반응 단위(RU)로 수행한다. 한 실시형태에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화된다. 항원은 pH 4.8, 10 mM 소듐 아세테이트로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된 후, 5 μl/분의 유속으로 주사되어 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질에 도달한다. 항원 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 그룹을 차단한다. 동역학 측정을 위하여, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)은 25℃에서, 약 25 μl/분의 유속으로 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제가 있는 PBS (PBST)에서 주사된다. 결합과 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써, 단순 일대일 Langmuir 결합 모델 (BIACORE® Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 결합 속도 (kon)와 해리 속도 (koff)가 산출된다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 koff/kon로 산출된다. 예를 들어, Chen 등, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) 참조. 결합 속도가 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106M-1 s-1을 초과하는 경우, 분광기, 예컨대 정지-유동이 구비된 분광광도계(Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정시 증가하는 항원 농도의 존재하에서 PBS(pH 7.2) 중의 20nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기법을 이용함으로써 결합 속도를 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시형태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 기타 단편들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 항체 단편들에 대한 검토는 Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003)를 참조한다. scFv 단편들의 검토는 예로써, Pluckth
Figure pct00005
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315(1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제5,571,894 및 5,587,458을 또한 참조한다. 구조 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의는 미국 특허 제5,869,046을 참조하라.
일부 실시형태에서, Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 아미노산 “CDKTHT”(서열 번호 75), “CDKTHL”(서열 번호 76), “CDKTH”(서열 번호 77), “CDKT”(서열 번호78), “CDK” 또는 “CD”로 끝난다. 일부 실시형태에서, Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 서열 CDKTHX(서열 번호 79)로 끝나고, 여기서 X는 T를 제외한 임의의 아미노산이다. C 말단에서의 절단 및/또는 돌연변이는 열안정성 또는 발현을 손상시키지 않으면서 Fab에 대한 AHA 반응성을 감소 또는 제거할 수 있을 것이다. 일부 실시형태에서, Fab 단편의 중쇄의 C-말단은 아미노산 “CDKTHTC”(서열 번호 80), “CDKTHTCPPC”(서열 번호 81), “CDKTHTCPPS”(서열 번호 82), “CDKTHTSPPC”(서열 번호 83), “CDKTHTAPPC”(서열 번호 84), “CDKTHTSGGC”(서열 번호 85), 또는 “CYGPPC”(서열 번호 86)로 끝난다. 일부 이러한 실시형태에서, C-말단 아미노산 내의 유리 시스테인은 예를 들어, PEG와 같은 중합체에 접합될 수 있다.
디아바디는 2가 또는 이중 특이성일 수 있는 2개의 항원 결합 부위가 있는 항체 단편이다. 예를 들어, EP404097; WO 1993/01161; Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)을 참조하라. 트리아바디 및 테트라바디 또한 Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시형태들에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해 소화, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 대장균 또는 파지)에 의한 생산을 포함한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567; 및 Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 한 추가 예에서, 키메라 항체는 분류 또는 하위분류가 모 항체의 분류로부터 변화되어 있는 “분류 전환된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시형태들에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 가변적 도메인을 포함하는데, HVR들, 예로써, CDR들, (또는 이의 부분들)는 비-인간 항체로부터 유도되고, FRs (또는 이의 부분들)은 인간 항체 서열로부터 유도된다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 불변 영역의 최소한 일부분을 또한 포함할 것이다. 일부 실시형태들에 있어서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예로써, HVR 잔기가 유도된 항체)의 대응 잔기로 대체되어, 예로써, 항체 특이성 또는 친화도가 복원 또는 개선된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 논의되어 있으며, 예를 들어, Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); Queen 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 외, Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 이식을 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (“표면노출잔기변형(resurfacing)”을 기재); Dall'Acqua 외, Methods 36:43-60 (2005) (“FR 셔플링”을 기재); 및 Osbourn 외, Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka 외, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링으로의 “유도된 선별” 접근법을 기재)에 상세히 기재되어 있다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: “최적-적합 (best-fit)” 방법을 이용하여 선별된 프레임워크 영역 (예로써, Sims 외, J. Immunol. 151:2296 (1993) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변적 영역의 특정 하위 집단의 인간항체의 공통 서열로부터 유도된 프레임워크영역 (예로써, Carter 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 그리고 Presta 외, J. Immunol., 151:2623 (1993) 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (예로써, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유도된 프레임워크 영역(예로써, Baca 외, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 외, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참조).
4. 인간 항체
특정 실시형태에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 공격에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 일반적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하는, 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전체 또는 일부를 포함한다. 이러한 유전자삽입 마우스에서 상기 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화 되어 있다. 유전자삽입 동물로부터 인간 항체를 획득하는 방법은 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)을 참조하라. 또한, 예를 들어, XENOMOUSETM 기술을 기재하는 미국 특허 제6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 기재하는 미국 특허 제5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 기재하는 미국 특허 제7,041,870, 그리고 VelociMouse® 기술을 기재하는 미국 특허출원 공개공보 US 2007/0061900)를 참조하라. 그러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터 얻은 인간 가변 영역은 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마 기반 방법으로도 만들 수 있다. 인간 단클론 항체를 만들기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 설명된 바 있다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 외, J. Immunol., 147: 86 (1991)참조) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체가 Li 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법들은 예를 들면, 미국 특허 제7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma 기술)은 또한 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그런 다음 이러한 가변 도메인 서열은 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 하기에서 설명된다.
5. 라이브러리-유래 항체들
본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리들을 생성하고 이러한 라이브러리들을 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 해당 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예로써, Hoogenboom 외, in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 설명되며, 그리고 예로써, McCafferty 외, Nature 348:552-554; Clackson 외, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 외, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 외, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee 외, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 그리고 Lee 외, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에서 상세히 설명된다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리들은, Winter 외, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 기재된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고 파지 라이브러리들에서 무작위로 재조합된 후, 항원-결합 파지에 대해 스크리닝 될 수 있다. 파지는 일반적으로 항체 단편들을 단일 사슬 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 표시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 Griffiths 외, EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재된 바와 같이 (예를 들어, 인간으로부터) 복제되어, 면역화 없이 광범위한 자가 항원 및 자가 항원들에 대한 하나의 항체 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재된 바와 같이 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 절편들을 복제하고 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조될 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 간행물은 예를 들면: 미국 특허 제5,750,373, 및 미국 특허출원 공개공보 제2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
특정 실시형태들에서, 본 발명의 항체는 다중특이성 항체, 예를 들면, 이중특이성 항체다. 다중특이성 항체는 최소 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 특정 실시형태들에서, 결합 특이성 중 하나는 Tie2에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시형태들에서, 이중특이성 항체는 Tie2의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 Tie2를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 만드는 기술은 상이한 특이성을 보유한 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker 외, EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 및 “놉-인-홀 (knob-in-hole)” 조작기술 (예로써, U.S. 특허 제. 5,731,168 참조)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 만들기 위해 정전기 조정 효과를 조작하여 (WO　2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합하여 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980, 및 Brennan 외, Science, 229: 81 (1985) 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생산하여 (예를 들어, Kostelny 외, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참조); “디아바디” 기술을 사용하여 이중특이성 항체 단편들을 제조하여 (예를 들어, Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 그리고 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체들을 사용하여 (예를 들어, Gruber 외, J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 그리고 예를 들어, Tutt 외, J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조하여 제조될 수 있다.
“옥토퍼스 항체”를 포함하여 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체도 본 발명에 포함된다(예를 들어, US　2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 Tie2, 뿐만 아니라 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 “이중 작용 FAb” 또는 “DAF”를 포함한다 (예를 들어, US　2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체들
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 상기 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 내부에 적절한 변형을 도입시킴으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 보유하는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합이라도 이루어질 수 있다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 실시형태들에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환들을 표 1에서 “바람직한 치환”이라는 제목으로 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화가 표 1의 “예시적 치환”이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 분류를 참조하여 이하에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입하고 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 생성물을 스크리닝할 수 있다.
표 1
Figure pct00006
아미노산은 다음과 같이 공통적인 측쇄 성질들에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 측쇄 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 분류들 중 하나의 구성원을 또 다른 분류로 바꾸게 될 것이다.
치환적 변이체의 한 가지 유형은 모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기의 치환 (예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)과 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선별된 생성된 변이체(들)은 모 항체와 비교하였을 때, 특정 생물학적 성질들(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어, 개선)을 가지거나 및/또는 모 항체의 특정 생물학적 성질들을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는 예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되며, 변이체 항체는 파지 상에서 디스플레이되며, 그리고 특정 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 CDR에서 변경 (예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR에서 “핫스팟(hotspot)”, 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이 되는 코돈에 의해 인코드되는 잔기 (즉, Chowdhury Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기들에서 생성될 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대하여 검사된다. 제2 라이브러리를 구축하고, 재선별함에 의한 친화도 성숙은 예컨대, Hoogenboom 외. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시형태에서, 다양성은 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내부로 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 에러-프론 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의해 도입된다. 이어서 제2 라이브러리가 생성된다. 그런 다음 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 가진 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 CDR-지시된 접근법을 포함하는데, 이때 몇개 CDR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 식별될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 표적이 되는 경우가 많다.
특정 예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 CDR들에서 나타날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예컨대, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 CDR들에 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, CDR들의 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시형태에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는데 유용한 방법은 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”로 지칭되며, Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 기재되어 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점을 동정한다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로서 표적되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 이들을 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 효소에 항체의 N- 또는 C-말단을 융합 (예컨대, ADEPT의 경우) 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 항체의 N- 또는 C-말단을 융합하는 것을 포함한다.
b) 당화 변이체
특정 실시형태들에서, 본원에서 제공된 항체는 이 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 이루어질 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포들에 의해 만들어지는 천연 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결부에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고사카라이드를 전형적으로 포함한다. 예를 들어, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예로써, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 상기 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 “스템(stem)”에 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.
한 실시형태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%가 될 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들면, WO　2008/077546에서 설명된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석에 의해 측정하여, Asn 297에 부착된 모든 당구조 (예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)의 합에 대한, Asn297에서 당 사슬 내부의 평균 푸코스 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ± 3의 아미노산, 가령, 위치 294와 300 사이에 또한 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화는 개선된 ADCC 기능을 보유할 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 공보 제2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참조. “탈푸코실화” 또는 “푸코스-결핍” 항체 변이체들과 관련된 문헌들의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki 외, J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 외, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 외 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO　2004/056312 A1, Adams 외, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki 외 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107 참조)가 포함된다.
항체의 Fc 영역의 이촉각성 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 양분된 올리고당을 가진 항체 변이체들이 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 변이체들의 예들은 예로써, WO 2003/011878 (Jean-Mairet 외.); 미국 특허 제6,602,684 (Umana 외.); 그리고 미국 2005/0123546 (Umana 외.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에 최소한 한 개의 갈락토스 잔기를 가진 항체 변이체들이 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체들은 개선된 CDC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체들은 예로써, WO 1997/30087 (Patel 외.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 그리고 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 설명된다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)를 포함할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본 발명은 모든 효과기 기능이 아닌 일부를 보유하는 항체 변이체를 고려하는데, 이는 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 또한 특정 효과기 기능(가령, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 응용분야에 있어서 바람직한 후보가 되게 한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 FcγR 결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인, NK 세포는 오로지 FcγRIII만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 실시예는 미국 특허 제5,500,362 (예컨대, Hellstrom, I. 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 설명되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유동 세포측정을 위한 ACTI™비-방사능활성 세포독성 분석 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 그리고 CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예컨대, Clynes 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 상기 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 예로써, WO　2006/029879와 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다 (예를 들면, Gazzano-Santoro 외. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외. Blood. 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004) 참고). 또한 FcRn 결합과 생체내 제거율/반감기 결정은 해당 분야에 공지된 방법들을 이용하여 또한 실시될 수 있다 (예컨대, Petkova, S.B. 외. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참고).
감소된 효과기 기능을 가진 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 또는 그 이상의 치환을 가진 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 “DANA” Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 번호 7,332,581).
FcRs에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 항체 변이체들이 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조.)
특정 실시형태들에 있어서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기는 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태들에 있어서, Fc 영역 안에 예로써, 미국 특허 제6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 외 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (예를 들어, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 변경이 만들어진다.
태아로 모계 IgGs의 전달을 담당하는, 증가된 반감기와 신생아의 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체들(Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 그리고 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))은 US2005/0014934A1 (Hinton 외)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환들을 가진 Fc 영역을 내부에 포함한다. 이러한 Fc 변이체들에는 다음 중 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환을 갖는 것들이 포함된다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434의 하나 이상에서 치환, 예컨대 Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제7,371,826호)
Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260; 미국 특허 제5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참조.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시형태들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, “thioMAbs”를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 나타난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이러한 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 예를 들어, 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 특정 실시형태들에 있어서, 다음과 같은 임의의 하나 또는 그 이상의 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(EU 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 제7,521,541에서 설명된 것과 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
일정한 실시형태에서, 본원에서 제공된 항체는 해당 분야에서 공지되고 쉽게 이용가능한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티들은 수용성 중합체들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체들의 비-제한적 예들에는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥세인, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조에 있어 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자들일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정 성질들 또는 기능들, 상기 항체 유도체가 특정 조건하에서 치료에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 방사선에 노출시켜 선별적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백질성 모이어티의 접합체들이 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브다 (Kam 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사능은 임의의 파장일 수 있으며, 그리고 정상 세포들에게는 해를 주지 않으나 상기 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포들은 사멸되는 온도에서 비단백질성 모이어티에 열을 가하는 파장을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본원에 기재된 항-Tie2 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 추가 실시형태에 있어서, 이러한 핵산이 포함된 하나 또는 그 이상의 벡터(예로써, 발현 벡터)가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 실시형태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예를 들어, 다음에 의해 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)다. 한 실시형태에서, 항-Tie2 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 이 때 상기 방법은 상기에서 제공된, 상기 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 그리고 선택적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-Tie2 항체의 재조합 생산을 위하여, 예컨대, 상기 기재한 항체를 인코드하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포 안에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터 안으로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 과정에 의해(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고, 시퀀싱된다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편들 및 폴리펩티드 발현과 관련하여 예컨대, 미국 특허 제5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523호를 참고하라. (대장균(E. coli)에서 항체 단편들의 발현을 설명하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 또한 참고) 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 추가로 정제될 수 있다.
원핵세포 이외에도, 진핵 미생물, 이를 테면 섬유성 곰팡이 또는 효모는 항체-인코딩 벡터의 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 당화 경로가 “인간화되고”, 결과적으로 부분적으로 또는 온전하게 인간 당화 패턴을 가진 항체가 생산되는 곰팡이 및 효모 균주가 포함된다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li 외, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) 참조.
당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포들은 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 또한 유도된다. 무척추동물 세포들의 예로는 식물 및 곤충 세포들이 포함된다. 스포도프테라 푸르기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포들의 형질감염을 위하여 곤충 세포들과 병용될 수 있는 많은 베큘로바이러스 균주들이 확인되었다.
식물 세포 배양물 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429호를 참고하라 (유전자삽입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 을 설명).
척추동물 세포들 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 개조시킨 포유동물 세포주들이 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham 외, J. Gen Virol. 36:59 (1977)에 설명된 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 설명된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2), 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather 외, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 설명된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR-CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 (Urlaub 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토는 예컨대, Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)를 참고하라.
C. 분석
본원에 제공된 항-Tie2 항체들은 해당 분야에 공지된 다양한 분석법에 의해 그 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
1. 결합 분석 및 기타 분석
한 양상에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, ELISA, BIACore® , FACS 또는 웨스턴 블롯과 같은 공지된 방법에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 테스트된다.
또 다른 양상에서, 경쟁 분석은 Tie2에 대한 결합에 대해 서열 번호 20의 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 21의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-Tie2 항체(본원에서는 Tie2.1M100cF라고 함)와 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 이러한 경쟁 항체는 서열 번호 20의 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 21의 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-Tie2에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들어, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 예시적 방법이 Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에 제공된다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 Tie2는 Tie2 (예를 들어, Tie2.1M100cF)에 결합하는 표지된 제1 항체 및 Tie2에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 테스트 될, 표지되지 않은 제2 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상층액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 Tie2는 표지된 제1 항체를 포함하지만 표지되지 않은 제2 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션된다. Tie2에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 인큐베이션한 후, 과량의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정된 Tie2와 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 Tie2와 결합된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 테스트 샘플에서 실질적으로 감소하면, 이는 제2 항체가 Tie2에 대한 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 참조.
2. 활성 분석
한 양상에서, 원하는 생물학적 활성을 갖는 이의 항-Tie2 항체를 확인하기 위한 분석이 제공된다. 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외에서 생물학적 활성에는, 예를 들어, Tie2 또는 이의 단편에 결합, Tie2에 대한 결합을 위해 Ang1 및/또는 Ang2와 경쟁, Tie2 단백질의 인산화를 활성화, Akt의 인산화를 활성화 및/또는 혈관 내피 세포 투과성의 감소가 포함될 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체 또한 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 테스트된다.
일부 실시형태에서, Tie2-활성화(항-Tie2 접합체) 활성을 결정하기 위한, 예를 들어, 포스포-AKT(pAKT) 분석에 의한 분석이 제공되며, 여기서 항-Tie2 접합체에 의한 AKT 인산화의 활성화는 접합체가 활성화시키는 (작용제) 활성을 가짐을 나타낸다. 당업자에 의해 용이하게 공지되고 하기 실시예 3에 기재된 바와 같이, AKT의 활성화는 예를 들어, 인산화된 AKT에 특이적인 항체를 사용한 인산화된 AKT의 웨스턴 블롯 검출을 비롯한 다양한 방법에 의해 또는 FRET 분석에 의해 입증될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 항체, 또는 이의 항체 접합체, 융합 단백질, 또는 중합체 제형의 안정성(예를 들어, 열안정성)을 결정하기 위한 분석이 제공된다. 예를 들어, 항체, 또는 항체 접합체, 융합 단백질, 또는 이의 중합체 제제의 안정성은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 시차 주사 형광측정법(DSF), 원형 이색성(CD), 내인성 단백질 형광, 시차 주사 열량계, 분광학, 광산란(예를 들어, 동적 광산란(DLS) 및 정적 광산란(SLS)), 자가 상호작용 크로마토그래피(SIC)을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 접합체의 안정성을 결정하기 위한 분석이 제공된다. 분석의 안정성은 예를 들어, 모세관 전기영동 레이저 유도 형광(CE-LIF)을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 실시예 13에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위 원소와 같은 하나 이상의 세포독성제에 접합된 본원의 항-Tie2 항체를 포함하는 면역 접합체를 제공한다.
E. 접합체
본 발명은 또한 폴리올과 같은 하나 이상의 이종 분자에 접합된 본원에 제공된 임의의 항-Tie2 항체 또는 이의 Tie2-결합 단편을 포함하는 접합체를 제공한다.
1. 다중 팔 중합체
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 항-Tie2 Fab 또는 이의 변이체를 다중 팔 중합체와 접합시킴으로써 본원에 기재된 항-Tie2 항체를 유도체화함으로써 제조될 수 있다. 원하는 크기를 갖는 접합체를 제공하거나 본원에 기재된 바와 같이 선택된 평균 분자량을 갖는 임의의 다중 팔 중합체가 본 발명의 항체-중합체 접합체를 구성하는데 사용하기에 적합하다는 것이 이해될 것이다.
많은 중합체가 의약품에 사용하기에 적합하다. 예를 들어, Davis 외, Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp. 441-451 (1980) 참조. 본 발명의 일부 실시형태에서, 비-단백질성 중합체를 사용하여 본 발명의 접합체를 형성한다. 비단백질성 중합체는 일반적으로 친수성 합성 중합체, 즉, 자연에서 달리 발견되지 않는 중합체이다. 그러나 자연에 존재하고 재조합 또는 시험관내 방법에 의해 생산된 중합체도 천연 출처에서 단리된 중합체와 같이 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-Tie2 Fab는 Fab 또는 이의 변이체를 다중 팔 폴리올에 접합(예를 들어, 공유 연결)함으로써 유도체화된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 다중 팔 폴리올, 바람직하게는 6-팔 폴리올에 공유 연결된 본원에 개시된 하나 이상의 항-Tie2 Fab 또는 이의 변이체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 사용된 폴리올은 임의의 수용성 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체일 수 있고 선형 또는 분지형 사슬을 가질 수 있다. 적합한 폴리올은 하나 이상의 하이드록실 위치에서 1 내지 4개의 탄소를 갖는 알킬기와 같은 화학 작용기로 치환된 것을 포함한다. 전형적으로, 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 폴리(알킬렌 글리콜)이고, 따라서 설명의 편의를 위해 나머지 논의는 사용된 폴리올이 PEG인 예시적인 실시형태 및 접합 방법에 관한 것이며, 폴리펩티드에 대한 폴리올의 접합은 “페길화”로 지칭된다. 그러나, 당업자는 예를 들어, 폴리(프로필렌 글리콜) 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체와 같은 다른 폴리올이 PEG에 대해 본원에 기재된 것들과 유사한 접합 기술을 사용하여 사용될 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 접합체를 형성하기 위해 사용된 폴리올은 다중 팔 폴리올이다. 본원에 사용된 “다중 팔 폴리올”은 최소 2개의 팔이 부착된 코어 구조를 포함하는 폴리올을 지칭한다. 다중 팔 폴리올은, 예를 들어, 이량체(2개의 팔), 4량체(4개의 팔), 6량체(6개의 팔), 8량체(8개의 팔) 등일 수 있다. 일부 양상에서, 다중 팔 폴리올은 다중 팔 PEG이다.
항-Tie2 항체 및 항체 변이체의 페길화에 사용되는 다중 팔 PEG의 중량 평균 분자량은 다양할 수 있고, 일반적으로 약 500 내지 약 300,000 달톤(D) 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중 팔 PEG의 중량 평균 분자량은 약 1,000 내지 약 100,000 D, 약 1,000 내지 약 40,000 D, 약 1,000 내지 약 20,000 D, 약 1,000 내지 약 10,000 D, 약 10,000 내지 약 20,000 D, 약 5,000 내지 약 10,000 D 또는 약 1,000 내지 5,000 D이다. 바람직한 실시형태에서, 페길화는 중량 평균 분자량이 약 6,000 D인 다중 팔 PEG로 수행된다.
단백질을 페길화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. PEG에 접합된 단백질을 생산하는 구체적인 방법은 미국 특허 제4,179,337호 미국 특허 제4,935,465호 및 미국 특허 제5,849,535호에 기술된 방법을 포함하며, 이들 문헌 모두는 그 전문이 참고로 본원에 포함된다. 전형적으로, 단백질은 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기를 통해 중합체 상의 말단 반응기에 공유 결합된다. 반응성 기(들)를 갖는 중합체는 본원에서 활성화되거나 작용기화된 중합체(예를 들어, 작용기화된 PEG)로서 지정된다. 반응성 기는 항체 또는 항체 변이체 상의 유리 설프하이드릴 또는 아미노 또는 기타 반응성 기와 선택적으로 반응한다. 다중 팔 PEG 중합체는 무작위 또는 부위 특이적 방식으로 항체 또는 항체 변이체 상의 설프하이드릴 또는 아미노 또는 기타 반응성 기에 커플링될 수 있다. 그러나, 최적의 결과를 얻기 위해, 사용되는 중합체의 유형 뿐만 아니라 선택된 반응기의 유형 및 양은 제한하기 위해 사용되는 특정 항체 또는 항체 변이체에 따라 달라질 것이며, 바람직하게는 반응기가 항체 상의 너무 많은 활성 작용기들과 반응하는 것을 실질적으로 방지할 것이다. 일부 경우에 이를 충분히 제한하거나 방지하는 것이 불가능할 수 있기 때문에, 일반적으로 항체 농도에 따라 항체 1몰당 약 0.05 내지 약 1000몰, 또는 일부 실시형태에서는 약 0.05 내지 약 200몰의 작용기화된 중합체가 사용될 수 있다. 항체 1몰당 작용기화된 중합체의 최종 양은 최적 활성을 유지하는 동시에 가능하다면 항체의 유리체액, 망막 및/또는 방수 반감기를 최적화하는 잔부량이다.
잔기는 N-말단 아미노산 기와 같은 항체 또는 항체 변이체 상의 임의의 반응성 아미노산일 수 있지만, 일부 실시형태에서, 반응성 아미노산은 시스테인이며, 이는 예를 들어, WO 99/03887, WO 94/12219, WO 94/22466, 미국 특허 제5,206,344, 미국 특허 제5,166,322, 및 미국 특허 제5,206,344에 나타낸 바와 같은 유리 티올기를 통해 작용기화된 중합체의 반응성 기에 연결되고, 상기 문헌들 모두는 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 이러한 실시형태에서, 상기 중합체는 모 항체 상의 유리 설프하이드릴 또는 티올 기(들)와 특이적으로 반응할 수 있는 최소 하나의 말단 반응기를 포함할 수 있다. 이러한 기는 그 중에서도 말레이미드, 설프하이드릴, 티올, 트리플루오로메탄설포네이트, 토실레이트, 아지리딘, 에폭사이드, 피리딜 디설파이드, 숙신이미딜 에스테르, -NH2, 알데하이드, 할로아세테이트, 할로아세트아미드, 및 파라-니트로페닐 카보네이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 중합체는 선택된 커플링 시스템의 화학적 성질에 적합한 임의의 프로토콜, 예를 들어, 미국 특허 제4,179,337호 7,122,636호, 및 Jevsevar, 외, Biotech J., Vol. 5, pp. 113-128(2010)에 기재된 프로토콜 및 시스템을 사용하여 모 항체에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 반응성 아미노산은 유리 엡실론-아미노 기를 통해 작용기화된 중합체의 반응성 기에 연결된 리신(예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 WO 93/00109 참조), 또는 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으며, 이것은 아미드 결합을 통해 중합체에 연결된다. 그러면 중합체의 반응성 그룹은 예를 들어, 단백질의 α(알파) 및 ε엡실론) 아민 또는 설프하이드릴 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 본 발명은 항체 또는 항체 단편과 중합체 사이의 임의의 특정 유형의 연결부(linkage)를 이용하는 접합체에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 접합체를 제조하는데 사용하기에 적합한 작용기화된 다중 팔 PEG는 수많은 통상적인 반응에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, PEG(M-NHS-PEG)의 N-하이드록시숙신이미드 에스테르는 Buckmann과 Merr, Makromol의 방법. Chem., Vol. 182, pp. 1379-1384(1981)에 따라 N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와의 반응에 의해 PEG-모노메틸 에테르로부터 제조될 수 있다. 또한, PEG 말단 하이드록시기는 예를 들어, 티오닐 브로마이드와 반응하여 PEG-Br을 형성한 후 과량의 암모니아로 아미노분해하여 PEG-NH2를 형성함으로써 아미노기로 전환될 수 있다. 그런 다음 PEG-NH2는 우드워드 시약 K와 같은 표준 커플링 시약을 사용하여 관심 항체 또는 항체 변이체에 접합될 수 있다. 또한, PEG 말단-CH2OH기는 예를 들어, MnO2를 사용한 산화에 의해 알데하이드 기로 전환될 수 있다. 알데하이드기는 시아노보로하이드라이드와 같은 시약을 사용한 환원성 알킬화에 의해 항체 또는 항체 변이체에 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체를 제조하는데 사용되는 다중 팔 PEG는 화학식 (I)의 구조를 갖는다:
Figure pct00007
여기서 PEG는 동일하거나 상이한 -(CH2CH2O)m-이고, 여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; l은 ≥2의 정수, 바람직하게는 2 또는 3이다.
일부 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (I)의 구조를 가지며, 여기서 l은 2이고 다중 팔 PEG는 6량체이다. 또 다른 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (I)의 구조를 가지며, 여기서 l은 3이고 다중 팔 PEG는 6량체이다.
화학식 (I)의 구조를 갖는 다중 팔 PEG는, 예를 들어, 상기 기재된 임의의 기술을 사용하여 항체(예를 들어, 항체 단편)와 반응하거나 이에 접합하기에 적합한 말단 반응기를 부착하도록 작용기화되어, 작용기화된 다중 팔 PEG를 생성할 수 있다. 그러나, 다른 실시형태에서, 다중 팔 PEG는, 예를 들어, US Pat. 미국 특허 제7,122,636호에 기술된 바와 같이, PEG 및 연결될 항체 또는 항체 변이체의 하나 이상의 아미노산 잔기와 반응하는 다작용기성 가교결합제를 통해, 항-Tie2 항체에 공유적으로 연결될 수 있으며, 상기 문헌들은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
다른 양상에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용된 다중 팔 PEG는 최소 하나의 말단 반응기를 포함하는 작용기화된 다중 팔 PEG이다. 말단 반응기는 항-Tie2 항체에 직접 접합되어 본 발명의 접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 갖는다:
Figure pct00008
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 20 내지 약 30, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; n은 약 1 내지 약 10의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 최소 하나의 R2는 말단 반응기이다. 일부 실시형태에서, R2는 티올 반응기, 아미노 반응기, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2 내지 3의 정수이다. 바람직한 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2이고 다중 팔 PEG는 6량체이다. 또 다른 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 3이고 다중 팔 PEG는 8량체이다. 바람직한 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 도 39에서 보는 바와 같이 n이 2인 화학식 (Ia)의 구조를 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용되는 다중 팔 PEG는 화학식 (II)의 구조를 갖는다:
Figure pct00009
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; n은 약 1 내지 약 10의 정수이다.
일부 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (II)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2이고 다중 팔 PEG는 4량체이다. 또 다른 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (II)의 구조를 가지며, 여기서 n은 4이고 다중 팔 PEG는 6량체이다. 또 다른 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (II)의 구조를 가지며, 여기서 n은 6이고 다중 팔 PEG는 8량체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용되는 다중 팔 PEG는 화학식 (III)의 구조를 갖는다:
Figure pct00010
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; n은 약 1 내지 약 10의 정수이다.
일부 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (III)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2이고 다중 팔 PEG는 4량체이다. 또 다른 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (III)의 구조를 가지며, 여기서 n은 4이고 다중 팔 PEG는 6량체이다. 또 다른 실시형태에서, 다중 팔 PEG는 화학식 (III)의 구조를 가지며, 여기서 n은 6이고 다중 팔 PEG는 8량체이다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용되는 다중 팔 PEG는 화학식 (IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00011
(IV)
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이다.
화학식 (I) 내지 (IV) 중 어느 하나의 구조를 갖는 다중 팔 PEG는, 예를 들어, 상기 기재된 임의의 기술을 사용하여 항체(예를 들어, 항체 단편)와 반응하거나 이에 접합하기에 적합한 말단 반응기를 부착하도록 작용기화되어, 작용기화된 다중 팔 PEG를 생성할 수 있다. 그러나, 다른 실시형태에서, 다중 팔 PEG는, 예를 들어, US Pat. 미국 특허 제7,122,636호에 기술된 바와 같이, PEG 및 연결될 항체 또는 항체 변이체의 하나 이상의 아미노산 잔기와 반응하는 다작용기성 가교결합제를 통해, 항-Tie2 항체에 공유적으로 연결될 수 있으며, 상기 문헌들은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
다른 양상에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용된 다중 팔 PEG는 최소 하나의 말단 반응기를 포함하는 작용기화된 다중 팔 PEG이다. 말단 반응기는 항-Tie2 항체에 직접 접합되어 본 발명의 접합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 갖는다:
Figure pct00012
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; n은 약 1 내지 약 10의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 최소 하나의 R2는 말단 반응기이다. 일부 실시형태에서, R2는 티올 반응기, 아미노 반응기, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 1 내지 3의 정수이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 1이고 다중 팔 PEG는 4량체이다. 또 다른 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2이고 다중 팔 PEG는 6량체이다. 또 다른 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며, 여기서 n은 3이고 다중 팔 PEG는 8량체이다. 이러한 실시형태에서, 6량체는 화학식 (Ib)의 구조를 갖는다:
Figure pct00013
(Ib)
여기서 m, R1, 및 R2는 상기 정의된 바와 같다.
다음 화학식 (Ib)의 구조를 갖는 다중 팔 PEG는 디펜타에리트리톨(DP) 코어 구조를 가지며, 본원에서는 DP 6량체로도 지칭된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ib) 또는 (Ic)의 구조를 갖고, 여기서 각각의 R1은 존재하는 경우 동일하거나 상이하고, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00014
;
Figure pct00015
;
Figure pct00016
;
Figure pct00017
;
Figure pct00018
;
Figure pct00019
;
Figure pct00020
;
Figure pct00021
;
Figure pct00022
;
Figure pct00023
;
Figure pct00024
;
Figure pct00025
;
Figure pct00026
;
Figure pct00027
; 및
Figure pct00028
; 및 이의 조합으로부터 선택되며; 여기서 각각의 i는 독립적으로 0-10의 정수이고; j는 0-10의 정수이고; R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 각각의 R1은 연결기이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ib) 또는 (Ic)의 구조를 갖고, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00029
이고, i, j, 및 R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00030
이고, 여기서 i는 2이고; j는 2 또는 3이고, R2는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ib)의 구조를 가지며, 여기서 각각의 R2는 말레이미드, 설프하이드릴, 티올, 트리플루오로메탄설포네이트, 토실레이트, 아지리딘, 에폭사이드, 피리딜 디설파이드, 숙신이미딜 에스테르, -NH2, 알데하이드, 할로아세테이트, 할로아세트아미드 및 파라-니트로페닐 카보네이트로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세테이트, 아이오도아세테이트, 클로로아세테이트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세테이트이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세트아미드, 아이오도아세트아미드, 클로로아세트아미드, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세트아미드이다. 일부 실시형태에서, R2는 말레이미드이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 구조를 가지며, 여기서 각각의 R2는 말레이미드이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00031
이고, i 및 j는 상기 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00032
이고, i는 2이고 j는 2이다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 접합체를 제조하기 위해 사용되는 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 갖는다:
Figure pct00033
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; n은 약 1 내지 약 10의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 최소 하나의 R2는 말단 반응기이다. 일부 실시형태에서, R2는 티올 반응기, 아미노 반응기, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2이고 다중 팔 PEG는 4량체이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 3이다. 또 다른 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 4이고 다중 팔 PEG는 6량체이다. 또 다른 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 6이고 다중 팔 PEG는 8량체이다. 화학식 (IIa)의 구조를 갖는 8량체는 헥사글리세린(HG) 코어 구조를 가지며, 본원에서 HG 8량체로도 지칭된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 갖고, 여기서 각각의 R1은 존재하는 경우 동일하거나 상이하고, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00034
;
Figure pct00035
;
Figure pct00036
;
Figure pct00037
;
Figure pct00038
;
Figure pct00039
;
Figure pct00040
;
Figure pct00041
;
Figure pct00042
;
Figure pct00043
;
Figure pct00044
;
Figure pct00045
;
Figure pct00046
;
Figure pct00047
; 및
Figure pct00048
; 및 이의 조합으로부터 선택되며; 여기서 각각의 i는 독립적으로 0-10의 정수이고; j는 0-10의 정수이고; R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 각각의 R1은 연결기이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 갖고, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00049
이고, i, j, 및 R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00050
이고, 여기서 i는 2이고; j는 2 또는 3이고, R2는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 각각의 R2는 말레이미드, 설프하이드릴, 티올, 트리플루오로메탄설포네이트, 토실레이트, 아지리딘, 에폭사이드, 피리딜 디설파이드, 숙신이미딜 에스테르, -NH2, 알데하이드, 할로아세테이트, 할로아세트아미드 및 파라-니트로페닐 카보네이트로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세테이트, 아이오도아세테이트, 클로로아세테이트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세테이트이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세트아미드, 아이오도아세트아미드, 클로로아세트아미드, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세트아미드이다. 일부 실시형태에서, R2는 말레이미드이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 각각의 R2는 말레이미드이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00051
이고, i 및 j는 상기 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIa)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00052
이고, i는 2이고 j는 2이다.
또 다른 양상에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 갖는다:
Figure pct00053
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 또는 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; n은 약 1 내지 약 10의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 최소 하나의 R2는 말단 반응기이다. 일부 실시형태에서, R2는 티올 반응기, 아미노 반응기, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 2이고 다중 팔 PEG는 4량체이다. 또 다른 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 4이고 다중 팔 PEG는 6량체이다. 또 다른 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 n은 6이고 다중 팔 PEG는 8량체이다. 화학식 (IIIa)의 구조를 갖는 8량체는 헥사글리세롤(HGEO) 코어 구조를 가지며, 본원에서는 HGEO 8량체로도 지칭된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 갖고, 여기서 각각의 R1은 존재하는 경우 동일하거나 상이하고, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00054
;
Figure pct00055
;
Figure pct00056
;
Figure pct00057
;
Figure pct00058
;
Figure pct00059
;
Figure pct00060
;
Figure pct00061
;
Figure pct00062
;
Figure pct00063
;
Figure pct00064
;
Figure pct00065
;
Figure pct00066
;
Figure pct00067
; 및
Figure pct00068
; 및 이의 조합으로부터 선택되며; 여기서 각각의 i는 독립적으로 0-10의 정수이고; j는 0-10의 정수이고; R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 각각의 R1은 연결기이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 갖고, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00069
이고, i, j, 및 R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00070
이고, 여기서 i는 2이고; j는 2 또는 3이고, R2는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 각각의 R2는 말레이미드, 설프하이드릴, 티올, 트리플루오로메탄설포네이트, 토실레이트, 아지리딘, 에폭사이드, 피리딜 디설파이드, 숙신이미딜 에스테르, -NH2, 알데하이드, 할로아세테이트, 할로아세트아미드 및 파라-니트로페닐 카보네이트로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세테이트, 아이오도아세테이트, 클로로아세테이트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세테이트이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세트아미드, 아이오도아세트아미드, 클로로아세트아미드, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세트아미드이다. 일부 실시형태에서, R2는 말레이미드이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 각각의 R2는 말레이미드이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00071
이고, i 및 j는 상기 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IIIa)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00072
이고, i는 3이고 j는 2이다.
또 다른 양상에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IVa)의 구조를 갖는다:
Figure pct00073
여기서 각각의 m은 폴리올(PEG)의 특정 팔의 길이 또는 크기를 나타내고 독립적으로 약 45 내지 약 1000, 또는 약 3 내지 약 250, 또는 약 50 내지 약 200, 또는 약 100 내지 약 150의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고; 최소 하나의 R2는 말단 반응기이다. 일부 실시형태에서, R2는 티올 반응기, 아미노 반응기, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 (IVa)의 구조를 갖는 다중 팔 PEG는 부탄디올 코어 구조를 가지며, 본원에서는 DX 8량체로도 지칭된다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IVa)의 구조를 갖고, 여기서 각각의 R1은 존재하는 경우 동일하거나 상이하고, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00074
;
Figure pct00075
;
Figure pct00076
;
Figure pct00077
;
Figure pct00078
;
Figure pct00079
;
Figure pct00080
;
Figure pct00081
;
Figure pct00082
;
Figure pct00083
;
Figure pct00084
;
Figure pct00085
;
Figure pct00086
;
Figure pct00087
; 및
Figure pct00088
; 및 이의 조합으로부터 선택되며; 여기서 각각의 i는 독립적으로 0-10의 정수이고; j는 0-10의 정수이고; R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 각각의 R1은 연결기이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IVa)의 구조를 갖고, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00089
이고, i, j, 및 R2는 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00090
이고, 여기서 i는 2이고; j는 2 또는 3이고, R2는 본원에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 각각의 R2는 말레이미드, 설프하이드릴, 티올, 트리플루오로메탄설포네이트, 토실레이트, 아지리딘, 에폭사이드, 피리딜 디설파이드, 숙신이미딜 에스테르, -NH2, 알데하이드, 할로아세테이트, 할로아세트아미드 및 파라-니트로페닐 카보네이트로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세테이트, 아이오도아세테이트, 클로로아세테이트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세테이트이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R2는 독립적으로 브로모아세트아미드, 아이오도아세트아미드, 클로로아세트아미드, 및 이들의 조합으로부터 선택된 할로아세트아미드이다. 일부 실시형태에서, R2는 말레이미드이다.
일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IVa)의 구조를 가지며, 여기서 각각의 R2는 말레이미드이다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IVa)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00091
이고, i 및 j는 상기 정의된 바와 같다. 일부 실시형태에서, 작용기화된 다중 팔 PEG는 화학식 (IVa)의 구조를 가지며, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때
Figure pct00092
이고, i는 3이고 j는 2이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 작용기화된 다중 팔 PEG는 미국 특허 출원 공개공보 제2011/0286956호, 및 미국 특허 출원 공개공보 제2015/0073155호에 기술되어 있으며, 이들 둘 모두는 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
본 발명에 사용하기에 적합한 작용기화된 다중 팔 PEG는 또한 다수의 공급업체로부터 구입할 수 있다. 예를 들어, 미국의 JenKem Technology는 말레이미드 작용기화된 PEG 6량체 및 8량체(예를 들어, 6ARM(DP)-PEG-MAL 및 8ARM(TP)-PEG-MAL)를 판매한다. NOF America Corp.는 또한 말레이미드 작용기화된 PEG 8량체(예를 들어, Sunbright® HGEO-400MA; Sunbright® DX-400MA) 및 4량체(예를 들어, Sunbright® PTE-400MA)를 판매한다.
특정 실시형태에서, 기재된 바와 같은 다중 팔 PEG의 활성 유도체는 다음 화학식 (IV)의 구조를 갖는 다중 팔 PEG의 활성 NHS 에스테르 유도체이다:
Figure pct00093
(IV)
여기서 R은 디펜타에리트리톨이다.
1. 폴리올 접합체
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 개시된 하나 이상의 항-Tie2 항체 또는 항체 변이체 및 하나 이상의 다중 팔 폴리올을 포함하는 접합체 (예를 들어, Tie2 결합제)에 관한 것으로, 여기서 접합체는 최소 하나의 항-Tie2 Fab 또는 Fab 변이체를 폴리올에 공유적으로 연결시켜 제조된다. 일부 실시형태에서, 다중 팔 폴리올은 PEG이다. 바람직한 실시형태에서, PEG는 6량체이다. 다른 실시형태에서, PEG는 8량체이다. 일부 실시형태에서, PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 갖는다.
본 발명의 접합체는 각각의 다중 팔 PEG에 접합된 항-Tie2 항체(Fab)의 수로 특성화 될 수 있다. 이것은 본원에서 “항체화(fabylation)” 또는 “항체화 정도”로 언급된다. 각 PEG에 접합된 항-Tie2 Fab의 수는 다음을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다: 1) PEG의 팔 수; 2) PEG 상의 말단 반응기의 수 및/또는 반응성; 3) PEG의 코어 구조; 및/또는 4) 페길화 반응 조건. 접합체를 제조하는 데 사용되는 다중 팔 PEG의 높은 다분산성은 일부 경우에 최종 접합체의 분석을 복잡하게 할 수 있으며, 특히 PEG당 Fab 수의 정확한 측정을 더욱 어렵고 불확실하게 만든다. 따라서, 접합체를 형성하기 위해 사용된 PEG는 전형적으로 약 1 내지 약 1.35의 범위 내의 다분산도(당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정됨)를 가질 것이고, 다양한 실시형태에서 약 1 내지 약 1.25, 약 1 내지 약 1.2, 약 1 내지 약 1.15, 약 1 내지 약 1.1, 약 1.05, 또는 심지어 약 1의 다분산도를 가질 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 6-팔 PEG를 포함하고, 여기서 최소 하나의 항-Tie2 Fab 또는 변이체는 PEG에 공유적으로 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 6-팔 PEG를 포함하고, 여기서 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 또는 최소 6개의 항-Tie2 Fab가 PEG에 공유적으로 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 8-팔 PEG를 포함하고, 여기서 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 최소 6, 최소 7 또는 최소 8개의 항-Tie2 Fab가 공유적으로 PEG에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 6-팔 PEG를 포함하고, 여기서 최소 4, 최소 5, 또는 최소 6개의 항-Tie2 Fab가 PEG에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 4-6개 또는 5-6개의 항-Tie2 Fab가 PEG에 공유적으로 연결된 6-팔 PEG를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 4-6개의 항-Tie2 Fab가 PEG에 공유적으로 연결된 6-팔 PEG를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 4 내지 6개 또는 5개의 항-Tie2 Fab가 PEG에 공유적으로 연결된 6-팔 PEG를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 화학식 (Ia), (IIa), (IIIa), 또는 (IVa) 중 어느 하나의 구조를 갖는 다중 팔 PEG를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 최소 하나의 R2는 본원에 기재된 항-Tie2 Fab 또는 변이체에 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 화학식 (Ia), (IIa), (IIIa), 또는 (IVa) 중 어느 하나의 구조를 갖는 다중 팔 PEG는 6량체이고, 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5개, 또는 6개 모두의 R2기는 본원에 기재된 항-Tie2 Fab 또는 변이체에 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 다중-팔 폴리올이 모 항체 상의 특정 부위 또는 특정 부위들에 공유적으로 부착된 종들을 포함한다; 즉, 중합체 부착은 모 항체 또는 항체 단편의 특정 영역 또는 특정 아미노산 잔기 또는 잔기들을 표적으로 한다. 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 모 항체 또는 항체 단편에서 잠재적인 페길화 부위의 수 및/또는 위치를 변경할 수 있다. 따라서, 아미노산 치환이 시스테인 및 리신과 같은 아미노산을 도입하거나 대체하는 한, 본 발명의 항-Tie2 항체 및 이의 변이체는 천연 서열 항-Tie2보다 더 많거나 더 적은 수의 잠재적인 페길화 부위를 함유할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 중합체의 부위 특이적 접합은 모 항체 또는 항체 단편의 시스테인 잔기에 대한 부착에 의해 가장 일반적으로 달성된다. 이러한 실시형태에서, 커플링 화학은, 예를 들어, 모 항체에서 이황화 가교에 있지 않은 시스테인 잔기의 유리 설프하이드릴 기를 이용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 모 Fab에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 시스테인 잔기(들)는 중합체 접합을 위한 부착 부위(들)로서 사용된다. 다른 실시형태에서, Fab 또는 변이체 상의 유리 아미노기는 2-이미노-티올란(트라우트 시약)으로 티올화된 다음, 예를 들어, Pedley, 외, Br. J. Cancer, Vol. 70, pp. 1126-1130 (1994)에 기재된 바와 같이 말레이미드-작용기화 PEG에 커플링될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기(들)는 중합체에 대한 특정 부착 부위 또는 부위들을 제공할 목적으로 모 Fab 내의 선택된 부위 또는 부위들 내부에 조작된다.
시스테인 조작된 항체는 이전에 기술된 바 있다(미국 특허출원 공개공보 2007/0092940 및 Junutula, JR, 외, J. Immunol Methods, Vol. 332(l-2), pp. 41-52 (2008), 이들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시형태에서, 시스테인 조작된 항체는 모 항체일 수 있다. 이들은 특정 위치, 일반적으로 불변 영역, 예를 들어, CL 또는 CH1에 유리 시스테인을 갖는 항체 단편을 생성하는 데 유용하다. 시스테인을 함유하도록 조작된 모 항체는 본원에서 “ThioMab”으로 지칭되고, 생산 방법에 관계없이 이러한 시스테인 조작된 항체로부터 생성된 Fab 단편은 본원에서 “ThioFab”으로 지칭된다. 이전에 기술된 바와 같이(예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 2007/0092940 및 Junutula, JR, 외, J. Immunol Methods, Vol. 332(l-2), pp. 41-52(2008) 참조), 대체된(“조작된”) 시스테인(Cys) 잔기를 갖는 돌연변이체는 새로 도입되고 조작된 시스테인 티올 기의 반응성에 대해 평가된다. 티올 반응성 값은 0에서 1.0 범위의 상대적인 수치 용어이며 임의의 시스테인 조작된 항체에 대해 측정할 수 있다. 반응성 티올 기를 갖는 것 이외에도 ThioMab은 항원 결합 능력을 유지하도록 선택해야 한다. 시스테인 조작된 항체의 설계, 선택 및 제조는 이전에 상세히 설명되었다(예를 들어, 본원에 참고로 포함된 WO 2011/069104 참조). 일부 실시형태에서, 조작된 시스테인은 중쇄 또는 경쇄의 불변 도메인 내부로 도입된다. 이와 같이, 시스테인 조작된 항체는 이들의 야생형인, 모 항체 대응물의 항원 결합 능력을 보유하고, 그 자체로 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 항체 단편-중합체 접합체에 관한 것으로서, 여기서 항체 단편은 Fab이고, 중합체는 일반적으로 경쇄와 중쇄를 연결하는 사슬간 이황화 결합을 형성하게 되는 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄 내 하나 이상의 시스테인 잔기에 부착된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 항체 단편-중합체 접합체에 관한 것으로서, 여기서 항체 단편은 Fab-C이고, 중합체 부착은 Fab-C 단편의 힌지 영역에 표적화된다. 일부 실시형태에서, 항체 단편의 힌지 영역에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 시스테인 잔기(들)는 중합체를 부착하는 데 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 중합체에 대한 특정 부착 부위 또는 부위들을 제공할 목적으로 Fab-C 단편의 힌지 영역 내부에 조작된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항-Tie2 Fab는 중합체 접합을 위한 하나의 부착 부위를 제공할 목적으로 C-말단 단부에 하나의 시스테인을 첨가함으로써 변형된다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 항-Tie2 Fab는 중합체 접합을 위해 2개의 부착 부위를 제공할 목적으로 C-말단 단부에 4개의 추가 잔기, CPPC(서열 번호 87)를 부가함으로써 변형된다. 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 항-Tie2 Fab는 중합체 접합을 위해 1개의 부착 부위를 제공할 목적으로 C-말단 단부에 4개의 추가 잔기, SPPC(서열 번호 88)를 부가함으로써 변형된다.
페길화의 정도와 부위는 pH 뿐만 아니라 작용기화된 PEG 및 단백질의 상대 농도와 같은 반응 조건을 조정하여 조작할 수도 있다. 원하는 페길화 정도에 적합한 조건은 표준 페길화 반응의 매개변수를 변화시켜 경험적으로 결정할 수 있다.
항-Tie2 Fab 및 변이체의 페길화는 임의의 편리한 방법으로 수행된다. 적합한 페길화 조건은 WO 2011/069104 및 WO 03/029420에 기재되어 있으며, 이들 문헌 모두는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
3. 폴리올 접합체의 특성화
페길화된 단백질은 SDS-PAGE, 겔 여과, NMR, 펩티드 매핑, 액체 크로마토그래피-질량 분광광도법 및 시험관내 생물학적 분석으로 특성화될 수 있다. 항체화의 정도는 일반적으로 SDS-PAGE에 의해 먼저 표시된다. 10% SDS에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 일반적으로 10mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl에서 용리 완충액으로 실행된다. 어떤 잔기가 페길화되었는지 입증하기 위해 트립신 및 Lys-C 프로테아제와 같은 프로테아제를 사용하는 펩티드 매핑을 수행할 수 있다. 따라서, 페길화된 항체 및 페길화되지 않은 항체의 샘플은 Lys-C 프로테아제와 같은 프로테아제로 분해될 수 있고 생성된 펩티드는 역상 HPLC와 같은 기술에 의해 분리될 수 있다. 생성된 펩티드의 크로마토그래피 패턴은 항-Tie2 폴리펩티드에 대해 이전에 결정된 펩티드 맵과 비교될 수 있다.
그런 다음 각 피크를 질량 분광법으로 분석하여 피크의 접합체 크기를 확인할 수 있다. 접합에 사용된 PEG 및 피크의 접합체 크기에 따라 PEG에 접합된 항체 또는 이의 변이체의 수를 추정할 수 있다. PEG 기에 접합된 단편(들)은 일반적으로 주입 후 HPLC 컬럼상에 유지되지 않고 크로마토그래피에서 사라진다. 크로마토그래피로부터의 이러한 소실은 최소 하나의 페길화 가능한 아미노산 잔기를 포함해야 하는 특정 단편에 대한 페길화의 표시이다. 페길화된 항-Tie Fab는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 Tie2 및 기타 생물학적 활성과 상호작용하는 능력에 대해 추가로 분석될 수 있다.
페길화는 항체 약물의 물리적 및 화학적 특성을 변화시키고 안정성 향상, 면역원성 감소, 순환 수명 연장 및 안구 체류 시간 증가와 같은 개선된 약동학적 거동을 가져올 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 단일 유리체내 주사를 통해 포유동물 눈 (예를 들어, 인간)에 투여된 후 상응하는 비접합된 항-Tie2 Fab와 비교하여 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기의 증가는 상응하는 비접합된 항-Tie2 Fab의 반감기의 최소 1.4배, 또는 최소 1.8배, 또는 최소 2배이다.
3. 접합체로서의 IgM 다량체
일부 실시형태에서, 본 발명의 Tie2 결합제는, 예를 들어, IgM CH1 도메인의 C-말단을 본원에 기재된 바와 같은 항-Tie2 항체의 N 말단에 (펩티드 결합을 통해) 융합하기 위한 재조합 발현 방법을 사용하여, 본원에 기재된 둘 이상의 항-Tie2 항체를 IgM 분자의 CH1 도메인에 연결함으로써 제조될 수 있다. IgM은 항체 치료제를 위해 이용가능한 형식인 것으로 입증되었다(예를 들어, Hanala, 2012, MAbs, 4:555-561 참조). IgM의 '단량체' 구성요소는 각각 2개의 Ig 도메인을 포함하는 2개의 경쇄(LC)와 5개의 Ig 도메인과 짧은 구조화되지 않은 C-말단 꼬리 조각을 포함하는 2개의 중쇄(HC)로 구성된다. 이 4개의 사슬이 모여서 HC-LC 이종이량체의 동종이량체를 형성한다. 후속적으로 이러한 동종이량체는 각각 10개 및 12개의 결합 부위를 포함하는 5개의 동종이량체 및 J-사슬(JC)(5량체) 또는 6개의 동종이량체(6량체)를 포함하는 고리 구조에 공유적으로 회합된다. 이론에 얽매이지 않고, 다중 가변 단편(Fvs)의 열렬한 결합은 IgM이 실질적인 친화도 성숙 없이 표적에 결합할 수 있게 하고, 그리하여 센티넬 적응 면역 수용체로 작용할 수 있게 한다.
특정 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 Fab이다. IgM 단백질(다량체)은 J 사슬을 포함하거나 포함하지 않을 수 있으므로, J 사슬의 존재시 5량체가 형성되고(최대 5개의 항-Tie2 항체를 포함할 수 있음), J 사슬의 부재시 6량체가 형성된다(최대 5개의 항-Tie2 항체를 포함할 수 있음). 일부 실시형태에서, 6량체는 IgM 중쇄 대 경쇄의 비율(6량체를 형성하기 위해) 또는 J-사슬에 대한 중쇄 대 경쇄의 비율(5량체를 형성하기 위해)을 변화시켜 생성된다. 따라서, 일부 실시형태에서, Tie2 결합제는 Tie2를 활성화할 수 있는 다량체를 형성하기 위해 IgM 단백질 및 본원에 기재된 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 또는 최소 6개의 항-Tie2 항체를 포함하는 다량체이다. 항-Tie2 IgM 분자가 설계되었으며 Tie2 활성을 활성화하는 것으로 나타났다(실시예 7 참조).
본원에 기술된 바와 같은 재조합 IgM 형식을 사용하여 구성된 항-Tie2, 다량체 접합체는 단일 Fab에 비해 상대적으로 큰 분자 반경으로 인해 안구 치료에 유용할 수 있으며, 잠재적으로 유리체액 외부로부터 방수 및 혈액 내부로의 더 느린 분자 확산을 가져온다. 아래 실시예 7에 기술된 바와 같이, 광산란으로 평가시 대략 12nM의 유체역학적 반경(Rh)을 발견하였으며, 6량체에 대한 예상 분자량(~1050kD)이 5량체에 대한 분자량(~950kD)을 약간 초과하였다.
또한 눈에 대한 안구 치료제의 활성을 제한하기 위해 비교적 빠른 전신 청소율을 갖는 것이 바람직할 수 있기 때문에 재조합 IgM 분자의 전신 반감기를 조사했다. 실시예 7에서 보는 바와 같이, 재조합적으로 발현된 IgM 5량체 및 6량체는 인간 혈청에서 단리된 IgM보다 정맥내 주사 후 더 빠르게 제거되었다. 이들 재조합 IgM 분자가 혈청에서 분리된 IgM보다 N-연결 글리칸에 대해 더 낮은 비율의 시알산을 갖는 것으로 추가로 결정되었으며, 이는 재조합 항-Tie2 IgM 분자의 청소율이 N-연결된 당화에서 시알산의 수준을 변형시키는 발현 시스템을 설계함으로써 제어될 수 있음을 시사한다.
IgM은 C1q를 강력하게 동원하고 보체 의존적 세포독성(CDC)을 통해 표적 세포 사멸을 유도하는 것으로 이전에 보고되었다. 이러한 활성은 안구 치료제에 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 실시예 7에 기재된 바와 같이, IgM 변이체, P434G(EU 넘버링)가 설계되었으며 이는 검출가능한 모든 보체 활성을 제거한 것으로 나타났다.
3. 접합체로서의 6량체 펩티드 다량체
또한, 자연적으로 다량체를 형성하는 펩티드, 예를 들어, NDK 펩티드에 각각의 항원 결합제를 연결함으로써 다중 항원 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함하는 접합체가 본 발명에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 Tie2 결합제는 본원에 기재된 둘 이상의 항-Tie2 Fab를 펩티드 다량체에 연결함으로써 제조될 수 있다. 펩티드 다량체는 재조합 발현 시스템에서 발현될 때 다중 펩티드가 자연적으로 폴딩되어 단일의 다중 팔 구조를 형성하는 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 최소 6, 최소 7, 또는 최소 8개의 펩티드로 구성된다. 통상적인 분자 공학 기술 및 재료를 사용하여, 다량체를 형성하게 될 이러한 펩티드를 융합 단백질로서 발현하며, 이러한 융합 단백질에서 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)은 다량체를 형성하는 상기 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 발현된다. 특정 실시형태에서, 다량체 내의 다수의 펩티드는 동일하고, 발현 벡터는 이러한 펩티드의 C-말단 또는 N-말단을 각각 본 발명에 개시된 항-Tie2 항체 또는 이의 단편의 N-말단 또는 C-말단에 (펩티드 결합을 통해) 연결하도록 구조화된다.
특정 실시형태에서, 다량체 펩티드의 펩티드들은 호모-6량체 4차 구조를 갖는 진핵생물 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제(NDK) 효소의 일부들이다. NDK1(예를 들어, 서열 번호 69), NDK2(예를 들어, 서열 번호 70), NDK3(예를 들어, 서열 번호 71), NDK4(예를 들어, 예를 들어, 서열 번호 72), NDK5(예를 들어, 서열 번호 73)을 비롯하여, 다량체를 설계하는데 사용될 수 있는 몇 가지 NDK 효소가 존재한다. 바람직한 실시형태에서, NDK 펩티드는 예를 들어, UniProt 수탁 P22887로부터 유래된 NDK3 펩티드이다. 서열 번호 74는 그 C-말단에서 NDK3 N-말단에 연결된 Tie2.1.M100cF의 서열을 제공한다. 이 바람직한 실시형태에서, Fab 경쇄는 서열 번호 21을 포함한다. (예를 들어, 아래 실시예 8 참조.)
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 임의의 항-Tie2 항체는 생물학적 샘플에서 Tie2의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에 사용된 용어 “검출”은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어, 망막 조직(광수용체 및 기저 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막모세혈관층)을 포함한다.
한 실시형태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-Tie2 항체가 제공된다. 추가 양상에서, 생물학적 샘플에서 Tie2의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태들에서, 이러한 방법은 생물학적 샘플을 Tie2에 대한 항-Tie2 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 본원에 기재된 항-Tie2 항체와 접촉시키고, 항-Tie2 항체와 Tie2 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법 일 수 있다. 한 실시형태에서, 항-Tie2 항체는 예를 들면, Tie2가 환자의 선별을 위한 생물마커인 경우에, 항-Tie2 항체를 이용한 요법에 적격인 개체를 선별하는 데 이용된다.
특정 실시형태들에서, 표지된 항-Tie2가 제공된다. 표지에는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티(형광, 발색, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지와 같은), 뿐만 아니라 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호 작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 세균성 루시페라제(미국 특허 제4,737,456), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토실라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 과산화수소를 사용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어, 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼, 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
F. 약학 제형
본원에 기재된 항-Tie2 항체 또는 Tie2 접합체의 약학 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항-Tie2 항체 또는 Tie2 접합체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., 1980) 동결 건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이며, 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부탈 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르치놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 그리고 m-크레졸); 낮은 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로블린; 친수성 중합체 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 그리고 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트 물질 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체 (예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 세포간(insterstitial) 약물 분산 물질, 예를 들어, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20(HYLENEX® , Baxter International, Inc.)을 포함한다. rHuPH20를 포함하는 특정 예시적인 sHASEGP 및 이를 이용하는 방법은 미국 공개 특허 출원 제2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 양상에서, sHASEGP는 하나 또는 그 이상의 추가 글리코사미노글리카나제, 예를 들어, 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958에 기재되어 있다.수용액 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 둘 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; Ang2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5 및 α5β1; 베타셀룰린; 아펠린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험과 유전적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터루킨-8(IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 제2 생물학적 분자는, IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; Ang2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5 및 α5β1; 베타셀룰린; 아펠린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험과 유전적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터루킨-8(IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A로 이루어진 군으로부터 선택된 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 실시형태에서, 추가 화합물은 VEGF 및/또는 Ang2 및/또는 IL-1베타, 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 항체이다. 이러한 활성 성분은 의도한 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐 또는 마크로에멀젼(macroemulsions)안에 포집될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.
서방형 제재가 제조될 수 있다. 서방형 제재의 적합한 예들에는 상기 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐 형태로 존재한다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균이다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 구현될 수 있다.
안구 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위해 본원에 기재된 접합체는 전형적으로 안구, 안내 및/또는 유리체내 주사, 및/또는 공막옆 주사, 및/또는 테논하 주사, 및/또는 맥락막상 주사 및/또는 점안액 및/또는 연고 형태의 국소 투여에 의해 투여된다. 본 발명의 이러한 조성물은 다양한 방법, 예를 들어, Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis (2006년 3월)와 같은 참고문헌에 기재된 것을 포함하여, 유리체 내부로 화합물의 느린 방출을 허용하는 장치 및/또는 데포로서 유리체내 전달될 수 있다. 한 예에서, 장치는 최소 펌프 및/또는 매트릭스 및/또는 수동 확산 시스템 및/또는 장기간 동안 화합물을 방출하는 캡슐화된 세포의 형태일 수 있다(Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, and Pearson, editors, Taylor & Francis(2006년 3월)). 국소, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비강내 및 병변내 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 투여 방법이 또한 사용될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다.
안구, 안구내 또는 유리체내 투여를 위한 제형은 해당 분야에 공지된 성분을 사용하여 그리고 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 주된 요건은 눈을 통한 적절한 침투이다. 약물이 국소적으로 전달될 수 있는 눈 앞쪽의 질병과 달리 망막 질병은 보다 부위별 접근이 필요하다. 점안액과 연고는 눈의 뒤쪽을 거의 관통하지 않으며 혈액 안구 장벽은 전신 투여 약물이 안구 조직으로 침투하는 것을 방해한다. 따라서 DME 및 AMD와 같은 망막 질환을 치료하기 위한 약물 전달을 위해 일반적으로 선택되는 방법은 직접 유리체내 주사이다. 유리체 내 주사는 일반적으로 환자의 상태, 전달되는 약물의 특성 및 반감기에 따라 일정한 간격으로 반복된다. 안구내(예를 들어, 유리체내) 침투의 경우, 일반적으로 더 작은 크기의 분자가 바람직하다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 및 접합체는 이식가능한 포트 전달 시스템(PDS)을 사용한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 이전에 언급한 바와 같이, PDS는 유리체로의 방출이 티타늄 프릿을 포함하는 다공성 금속 막에 의해 제어되는 재충전 가능한 장치이다. 저장소는 낮은 부피를 가지기 때문에, 일부 실시형태에서, PDS를 통한 효과적인 전달을 위해 높은 단백질 농도가 요구된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 및 접합체는 고농도로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 및 접합체는 최소 150 mg/ml, 최소 160 mg/ml, 최소 170 mg/ml, 최소 180 mg/ml, 최소 190 mg/ml, 최소 200 mg/ml, 또는 최소 210 mg/ml, 또는 최소 220 mg/ml, 또는 최소 230 mg/ml, 또는 최소 240 mg/ml, 또는 최소 250 mg/ml, 또는 최소 260 mg/ml, 또는 최소 270 mg/ml, 또는 최소 280 mg/ml, 또는 최소 290 mg/ml, 또는 최소 300 mg/ml의 농도로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 및 접합체는 150 mg/ml 내지 350 mg/ml, 150 mg/ml 내지 300 mg/ml, 170 mg/ml 내지 300 mg/ml, 200 mg/ml 내지 300 mg/ml, 또는 170 mg/ml 내지 220 mg/ml의 농도로 제형화될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-Tie2 항체 또는 접합체가 치료 방법에 사용될 수 있다. 본원의 임의의 실시형태에 따른 “개체”, “환자” 또는 “대상체”는 인간일 수 있다.
본 발명의 항-Tie2 접합체는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-Tie2 접합체는 예를 들어, 전임상 데이터를 수득할 목적으로 비인간 포유동물에게 투여된다. 치료될 예시적인 비인간 포유동물은 비인간 영장류, 개, 고양이, 돼지, 설치류 및 전임상 연구가 수행되는 기타 포유동물을 포함한다. 이러한 포유동물은 항체로 치료할 질병에 대해 확립된 동물 모델일 수 있거나 관심 항체의 독성을 연구하는 데 사용될 수 있다. 이들 각각의 실시형태에서, 용량 증량 연구가 포유동물에 대해 수행될 수 있다.
항-Tie2 접합체는 비경구, 피하, 복강내, 유리체내, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 면역억제 치료에 필요한 경우 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 유리체내 및 피하 투여가 포함된다. 또한, 접합체는 펄스 주입에 의해, 특히 항체, 이의 항체 변이체 또는 이의 단편(예를 들어, 항원 결합 단편)의 용량을 감소시키면서 적절하게 투여된다. 일부 실시형태에서, 투여는 부분적으로 투여가 단기인지 만성인지에 따라 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.
질환의 예방 또는 치료에 있어서, 항-Tie2 항체 또는 접합체의 적절한 투여량은 치료되는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1-25 mg/눈 (눈 당 0.015 mg/kg - 0.36 mg/kg)의 항체는, 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 수일 또는 보다 장기에 걸친 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라, 치료는 질환 증세가 바람직하게 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터된다. 예시적인 투여 요법은 WO 94/04188에 개시되어 있다.
한 양상에서, 의약으로서 사용하기 위한 항-Tie2 항체 또는 접합체가 제공된다. 추가 양상에서, 안구 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-Tie2 항체 또는 접합체가 제공된다. 특정 실시형태들에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-Tie2 항체 또는 접합체가 제공된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유효량의 항-Tie2 항체 또는 접합체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 안구 질환 또는 장애를 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-Tie2 항체 또는 접합체를 제공한다. 이러한 한 실시형태에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 유효량의 최소 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시형태에서, 본 발명은 혈관 내피 세포막 완전성을 증가시키고/시키거나 혈관 누출을 감소시키는데 사용하기 위한 항-Tie2 항체 또는 접합체를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 개체에게 혈관 내피 세포막 완전성을 증가시키고/하거나 혈관 누출을 감소시킴에 효과적인 항-Tie2 항체 또는 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 혈관 내피 세포막 완전성을 증가시키고/시키거나 혈관 누출을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 항-Tie2 항체 또는 접합체를 제공한다]. 상기 임의의 실시형태들에 따른 “개체”는 바람직하게는 인간이다.
본원에 사용된 용어 “안구 장애”는 병리학적 신생혈관 및/또는 위축과 관련된 임의의 안구 장애(본원에서 호환적으로 “안구 병태”로도 지칭됨)를 포함한다. 안구 장애는 망막 또는 각막과 같은 안구 조직의 구조 내부로의 변경되거나 조절되지 않는 새로운 혈관의 증식 및/또는 침범을 특징으로 할 수 있다. 안구 장애는 망막 조직(광 수용체 및 기저 망막 색소 상피(RPE) 및 맥락막모세혈관층)의 위축을 특징으로 할 수 있다.
당뇨병성 황반부종(DME)은 당뇨병성 망막병증(DR)이라고 하는 당뇨병의 합병증으로 인해 발생한다. 이러한 눈 병태는 제1형 또는 제2형 당뇨병 진단을 받은 사람들에게서 발생할 수 있다. DME는 중심와 중심의 2 디스크 직경 이내에서의 망막 비후로 정의되며 국부성 또는 확산성 일 수 있다. DME는 망막 미세혈관 변화와 관련되어 혈액-망막 장벽을 손상시켜 혈장 성분이 주변 망막으로 누출되어 망막 부종을 유발한다.
비-제한적 안구 장애는, 예를 들어, 당뇨병성 황반 부종(DME)(예를 들어, 초점, 비-중심 DME 및 미만성 중심 관련 DME), 망막 병증, 당뇨병성 망막증(DR)(예를 들어, 증식성 DR(PDR), 비증식성 DR(NPDR) 및 고 지대 DR), 부종 부재하의 망막병증, 기타 허혈 관련 망막병증, AMD(예를 들어, 습성 AMD, 건성 AMD, 중간 AMD, 진행성 AMD 및 지도모양 위축(GA)), 황반 변성, ROP, 망막 정맥 폐색(RVO)(예를 들어, 중앙(CRVO) 및 분지(BRVO) 형태), CNV(예를 들어, 근시 CNV), 각막 혈관 신생, 각막 혈관 신생과 관련된 질환, 망막 혈관 신생, 망막/맥락막 혈관 신생과 관련된 질환, 중심 장액성 망막 병증(CSR), 병리적 근시, 폰 히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, FEVR, 코우츠병, 노리 병, 골다공증-가성 신경교종 증후군(OPPG)과 관련된 망막 이상, 결막하 출혈, 피부홍조, 안구 신생혈관 질환, 신혈관 녹내장, 색소성 망막염(RP), 고혈압성 망막 병증, 망막 혈관종 증식, 황반 모세혈관 확장증, 홍채 혈관 신생, 안구 내 혈관 신생, 망막 변성, 낭포성 황반 부종(CME), 혈관염, 유두 부종, 망막염(CMV 망막염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음), 안구 흑색종, 망막 모세포종, 결막염(예를 들어, 감염성 결막염 및 비감염성(예를 들어, 알레르기성 결막염), 레버 선천성 흑암시(레버 선천성 흑암시 또는 LCA라고도 공지됨), 포도막염(감염성 및 비감염성 포도막염을 포함), 맥락 막염(예를 들어, 다초점 맥락 막염), 안구 히스토플라스마증, 안검염, 안구 건조증, 외상성 안구 손상, 쇼그렌 병 및 기타 안과 장애들을 포함하고, 상기 질환 또는 장애는 안구 혈관 신생, 혈관 누출 및/또는 망막 부종 또는 망막 위축과 관련이 있다. 또 다른 예시적인 안구 장애는 망막 층간분리증(망막 감각신경층의 비정상적 분할), 피부홍조와 관련된 질환(각의 신생 혈관) 및 모든 형태의 증식성 유리체 망막 병증을 포함한 섬유 혈관 또는 섬유 조직의 비정상적인 증식으로 인한 질환을 포함한다.
각막 신생혈관형성과 관련된 예시적인 질환은 유행병 각결막염, 비타민 A 결핍, 콘택트 렌즈 과도착용, 아토피성 각막염, 상윤부 각막염, 익상편 건성 각막염, 쇼그렌 증후군, 여드름 장미증, 필렉테눌로시스, 매독, 마이코박테리아 감염, 지질 변성, 화학적 화상, 박테리아 궤양, 진균 궤양, 단순 포진 감염, 대상포진 감염, 원생동물 감염, 카포시 육종, 잠식성 각막궤양, 테리엔 변연 변성, 변연 표피박리, 류마티스성 관절염, 전신 낭창, 다발동맥염, 외상, 베게너 유육종증, 공막염, 스티븐 존슨 증후군, 방사상 각막절개, 및 각막 이식 거부를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈관 누출 증가, 동맥류 및 모세 혈관 탈락을 포함한 맥락막 신생 혈관 형성 및 망막 혈관계의 결함과 관련된 예시적인 질환은 당뇨병성 망막 병증, 황반 변성, 겸상 적혈구 빈혈, 유육종, 매독, 탄성섬유 가성 황색종, 페제트병, 정맥 폐색, 동맥 폐쇄, 경동맥 폐색 질환, 만성 포도막염/유리체염, 마이코박테리아 감염, 라임 병, 전신성 홍반성 루푸스, 미숙아 망막 병증, 망막 부종(황반 부종을 포함), 일스병, 베체트 병, 망막염 또는 맥락막염을 유발하는 감염(예를 들어, 다초점 맥락막), 추정된 안구 히스토플라스마증, 베스트 병(유리 체형 황반 변성), 근시, 시신경 유두 소와, 평면부염, 망막 박리(예를 들어, 만성 망막 박리), 과다점성 증후군, 톡소플라스마증, 외상 및 레이저 치료후 합병증을 포함하지만, 이제 제한되는 것은 아니다.
망막 조직의 위축(광수용체 및 기저 RPE)과 관련된 예시적인 질환은 위축성 또는 삼출성 AMD(예를 들어, 지도모양 위축 또는 진행성 건성 AMD), 황반 위축(예를 들어, 혈관 신생과 관련된 위축 및/또는 지도모양 위축), 당뇨병성 망막병증, 스타가르트 병, 소르스비 안저 이영양증, 망막 층간분리증 및 색소성 망막염을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 임의의 전술한 방법은 하나 이상의 추가 화합물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 Tie2-결합제 또는 접합체 또는 이의 중합체 제형은 추가 화합물(들)과 동시에 투여된다. 특정 실시형태에서, 상기 Tie2-결합제 또는 접합체 또는 이의 중합체 제형은 추가 화합물(들) 이전 또는 이후에 투여된다. 특정 실시형태들에서, 추가적인 화합물은 IL-1β; IL-6; IL-6R; IL-13; IL-13R; PDGF; 안지오포이에틴; Ang2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5 및 α5β1; 베타셀룰린; 아펠린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체; ST-2 수용체; 및 AMD 위험과 유전적으로 연결된 단백질, 예컨대 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; 인터루킨-8(IL-8); CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 생물학적 분자에 결합한다. 특정 실시형태들에서, 추가 화합물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 상기 임의의 실시형태들에 따른(또는 이에 적용되는) 특정 실시형태들에서, 안구 장애는 증식성 망막 병증, 맥락막 혈관 신생(CNV), 연령-관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 및 기타 허혈 관련 망막 병증, 당뇨병성 황반 부종, 병리적 근시, 폰 히펠-린다우 병, 눈의 히스토플라스마증, 망막 정맥 폐색(RVO)(CRVO 및 BRVO를 포함), 각막 신생혈관 형성, 망막 신생혈관 혈성 및 미숙아 망막 병증(ROP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 안내구 신생 혈관 질환이다. 예를 들어, 일부 경우에, 추가 화합물은 이중특이성 항체(예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이성 항체, 예컨대 RG-7716 또는 WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에 개시된 임의의 이중특이성 항-VEGF/항-Ang2 이중특이성 항체) 또는 이의 변이체이다. 다른 예에서, 일부 경우에, 추가 화합물은 항-IL-6 항체, 예를 들어, EBI-031(Eleven Biotherapeutics; 예를 들어, WO 2016/073890 참조), 실툭시맙(SYLVANT®), 올로키주맙, 클라자키주맙, 시루쿠맙, 엘실리모맙, OPR-003, MEDI5117, PF-04236921, 또는 이의 변이체이다. 또 다른 추가 예에서, 일부 경우에, 추가 화합물은 항-IL-6R 항체, 예를 들어, 토실리주맙(ACTEMRA®)(예를 들어, WO 1992/019579 참조), 사릴루맙, ALX-0061, SA237, 또는 이의 변이체이다.
일부 경우에, 본 발명의 Tie2-결합제 또는 접합체 또는 이의 중합체 제형은 안구 장애, 예를 들어, 본원에 기재된 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD(예를 들어, 습식 AMD), RVO 또는 GA)의 치료를 위한 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 안구 장애의 치료를 위한 병용 요법을 위한 예시적인 추가 치료제는, 항-혈관 형성제, 예를 들어, 예를 들어, 항-VEGF 항체(예를 들어, 항-VEGF Fab LUCENTIS®(라니비주맙))를 포함하는 VEGF 길항제, 가용성 수용체 융합 단백질(예를 들어, 재조합 가용성 수용체 융합 단백질 EYLEA®(애플리버셉트, VEGF 트랩 아이(Trap Eye)로도 공지됨; Regeneron/Aventis)), 앱타머(예를 들어, 항-VEGF 페길화 앱타머 MACUGEN®(페갑타닙 소듐; NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals)) 및 VEGFR 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린(AZD2171), 바탈라닙(PTK787), 세막사미닙(SU5416; SUGEN) 및 SUTENT®(수니티닙)); 트립토파닐-tRNA 합성 효소(TrpRS); 스쿠알라민; RETAANE®(데포 현탁용 아네코르타브 아세테이트; Alcon, Inc.); 콤브레타스타틴 A4 전구 약물(CA4P); MIFEPREX®(미페프리스톤(mifepristone)-ru486); 서브테논 트리암시놀론 아세토나이드; 유리체내 결정질 트리암시놀론 아세토나이드; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제(예를 들어, 프리노마스타트(Prinomastat, AG3340; Pfizer); 플루오시놀론 아세토나이드(플루오시놀론 안구내 임플란트 포함; Bausch & Lomb/Control Delivery Systems); 리노미드; 인테그린 β3 기능 억제제; 안지오스타틴 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 Tie2-결합제 또는 접합체와 병용 투여될 수 있는 이들 및 다른 치료제는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 US 2014/0017244에 기재되어 있다.
안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위한, Tie2-결합제 또는 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형과 병용 될 수 있는 추가 치료제의 추가적인 예는 VISUDYNE®(버테포르핀, 비열 레이저를 사용한 광역학 요법과 함께 일반적으로 사용되는 광-활성화 약물), PKC412, 엔도비온(Endovion, NS 3728; NeuroSearch A/S), 신경영양 인자(예를 들어, 신경교 유도 신경영양 인자(GDNF) 및 섬모 신경영양 인자(CNTF)), 딜티아젬, 도르졸아미드, PHOTOTROP® , 9-시스-레티날, 안약(예를 들어, 요오드화 포스포린, 에코티오페이트 또는 탄산 탈수효소 억제제), 베오바스타트(AE- 941; AEterna Laboratories), Inc., Sirna-027(AGF-745; Sima Therapeutics, Inc.), 뉴로트로핀(예시로서만 NT-4/5, Genentech 포함), Cand5(Acuity Pharmaceuticals), INS -37217(Inspire Pharmaceuticals), 인테그린 길항제(Jerini AG 및 Abbott Laboratories 포함), Eg-3306(Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E(BioDiem Ltd.), 탈리도마이드(예를 들어, EntreMed, Inc.에서 사용됨), 카디오트로핀-1(Genentech), 2-메톡시에스트라디올(Allergan/Oculex), DL-8234(Toray Industries), NTC-200(Neurotech), 테트라티오몰리브데이트(미시간 대학교), LYN-002(Lynkeus Biotech), 미세 조류 화합물(Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120(Celltech Group plc), ATX-S10(Hamamatsu Photonics), TGF-베타 2(Genzyme/Celtrix), 티로신 키나제 억제제(예를 들어, Allergan, SUGEN, 또는 Pfizer), NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24(OPTIS France SA), 망막 세포 신경절 신경 보호제(Cogent Neurosciences), N-니트로피라졸 유도체(Texas A&M University System), KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals), 시클로스포린 A, 광역학 요법에 사용되는 치료제(예를 들어, VISUDYNE® ; 수용체-표적 PDT, Bristol-Myers Squibb, Co.; PDT 주사용 포르피머 나트륨; 베르테포르핀(verteporfin), QLT Inc .; PDT 보유 로스타포르핀, Miravent Medical Technologies; PDT, PDT 보유 탈라포르핀 소듐, Nippon Petroleum; 및 모텍사핀 루테튬, Pharmacyclics, Inc.), 안티센스 올리고뉴클레오티드(예를 들어, Novagali Pharma SA 및 ISIS-13650, Ionis Pharmaceuticals에 의해 테스트된 제품 포함), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
Tie2-결합제 또는 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위한 요법 또는 수술 절차, 예를 들어, 레이저 광응고(예를 들어, 범망막 광응고(PRP)), 드루젠 레이저, 황반 구멍 수술, 황반 전좌 수술, 이식형 소형 망원경, PHI-모션 혈관 조영술(마이크로 레이저 요법 및 영양 혈관 치료라고도 공지됨), 양성자 빔 요법, 미세 자극 요법, 망막 박리 및 유리체 수술, 공막 누름 조각, 황반하 수술, 동공 열요법, 광계 I 요법, RNA 간섭 사용(RNAi), 체외 유동술(막 차등 여과 및 유동술 요법이라고도 공지됨), 마이크로 칩 이식, 줄기 세포 요법, 유전자 대체 요법, 리보자임 유전자 요법(저산소 반응 요소에 대한 유전자 요법 포함, 옥스포드 바이오메디카(Oxford Biomedica); 렌티팍(Lentipak), 제네틱스(Genetix); 및 PDEF 유전자 치료, 젠벡(GenVec)), 광 수용체/망막 세포 이식(이식 가능한 망막 상피 세포를 포함, 디아크린(주)(Diacrin, Inc.)); 망막 세포 이식, 예컨대 Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, CHA Biotech), 침술 및 이들의 조합과 병용 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 Tie2-결합제 또는 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 항-혈관신생제와 병용 투여될 수 있다. Carmeliet 외, Nature 407:249-257, 2000에 나열된 것들을 비롯한(그러나 이에 제한되는 것은 아님) 임의의 적합한 항-혈관신생제가 본 발명의 Tie2-결합제 또는 접합체와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 상기 항-혈관신생 제제는 VEGF 길항제로서, 이는 항-VEGF 항체(예를 들어, 항-VEGF Fab LUCENTIS®(라니비주맙), RTH-258(이전의 ESBA-1008, 항-VEGF 단일 사슬 항체 단편; Novartis), 또는 이중특이성 항-VEGF 항체(예를 들어, 항-VEGF/항-안지오포에이틴 2 이중 특이적 항체, 예컨대 RG-7716; Roche), 가용성 재조합 수용체 융합 단백질(예를 들어, EYLEA®(애플리버셉트)), VEGF 변이체, 가용성 VEGFR 단편, VEGF(예를 들어, 페갑타닙) 또는 VEGFR을 차단할 수있는 앱타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제, 항-VEGF DARPin®(예를 들어, 아비시파르 페골, Molecular Partners AG/Allergan), VEGF 또는 VEGFR의 발현을 억제하는 작은 간섭 RNA, VEGFR 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린(AZD2171), 바탈라닙(PTK787), 세막사미니브(SU5416; SUGEN) 및 SUTENT®(수니티닙) 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 경우에, 항-Tie2 항체 또는 이의 단편은 항체 또는 이의 단편 또는 제2 생물학적 분자를 표적으로 하는 기타 치료제와 조합될 수 있으며, 이러한 치료제에는 IL-1β; IL-6; IL-6R; PDGF(예를 들어, PDGF-BB); 안지오포이에틴; 안지오포이에틴 2; Tie2; S1P; 인테그린 αvβ3, αvβ5, 및 α5β1; 베타셀룰린; 아펠린/APJ; 에리트로포이에틴; 보체 인자 D; TNFα; HtrA1; VEGF 수용체(예를 들어, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, mbVEGFR, 또는 sVEGFR); ST-2 수용체; 및 연령 관련 황반 변성(AMD) 위험과 유전적으로 연결된 단백질, 예를 들어, 보체 경로 성분 C2, 인자 B, 인자 H, CFHR3, C3b, C5, C5a, 및 C3a; HtrA1; ARMS2; TIMP3; HLA; IL-8; CX3CR1; TLR3; TLR4; CETP; LIPC; COL10A1; 및 TNFRSF10A가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 일부 경우에, 추가 화합물은 이중특이성 항체(예를 들어, 항-VEGF/항-Ang2 이중특이성 항체, 예컨대 RG-7716 또는 WO 2010/069532 또는 WO 2016/073157에 개시된 임의의 이중특이성 항-VEGF/항-Ang2 이중특이성 항체) 또는 이의 변이체이다.
안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)를 치료하기 위한, 항-Tie2 접합체 및/또는 이의 중합체 제형과 병용 투여될 수 있는 다른 적합한 항-혈관신생제는 코르티코 스테로이드, 혈관 억제 스테로이드, 아네코르타브 아세테이트, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 티로신 키나제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 억제제, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3(IGFBP3), 기질 유래 인자(SDF-1) 길항제(예를 들어, 항-SDF-1 항체), 색소 상피 유래 인자(PEDF), 감마-세크레타제, 델타-유사 리간드 4, 인테그린 길항제, 저산소증 유도 인자(HIF)-1α 길항제, 단백질 키나제 CK2 길항제, 신생 혈관화 부위로 돌아가는(예를 들어, 항-혈관 내피 카드데린(CD-144) 항체 및/또는 항-SDF-1 항체) 줄기 세포 억제제(예를 들어, 내피 전구 세포), 및 이들의 조합을 포함한다.
추가의 예에서, 일부 경우에, Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 혈관 신생에 대해 활성을 갖는 제제, 예를 들어, 항-염증 약물, 라파마이신(mTOR) 억제제의 포유류 표적(예를 들어, 라파마이신, AFINITOR®(에베로리무스) 및 TORISEL®(템시롤리무스)), 사이클로스포린, 종양 괴사 인자(TNF) 길항제(예를 들어, 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 및 골리무맙) 또는 가용성 수용체 융합 단백질(예를 들어, 에타너셉트)), 항-보체 제제, 비-스테로이드성 항염증제(NSAID), 또는 이들의 조합과 병용 투여될 수 있다.
또 다른 추가 예에서, 일부 경우에, Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 신경보호성이고 예를 들어, 건성 AMD가 습성 AMD로 진행하는 것을 잠재적으로 감소시킬 수 있는 제제, 예를 들어, “뉴로스테로이드”라는 약물 분류와 병용 투여될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 디하이드로에피안드로스테론(DHEA)(상품명: PRASTERA™및 FIDELIN®), 디하이드로에피안드로스테론 설페이트 및 프레그네놀론 설페이트와 같은 약물을 포함한다.
임의의 적합한 AMD 치료제는 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO, 또는 GA)의 치료를 위한 본 발명의 Tie-2 결합 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형과 병용하여 추가 치료제로서 투여될 수 있으며, 여기에는 VEGF 길항제, 예를 들어, 항-VEGF 항체(예를 들어, LUCENTIS®(라니비주맙), RTH-258(이전의 ESBA-1008, 항-VEGF 단일 사슬 항체 단편; Novartis), 또는 이중특이성 항-VEGF 항체(예를 들어, 항-VEGF/항-안지오포에이틴 2 이중특이성 항체, 예를 들어, RG-7716; Roche)), 가용성 VEGF 수용체 융합 단백질(예를 들어, EYLEA®(애플리버셉트)), 항- VEGF DARPin®(예를 들어, 아비시파르 페골; Molecular Partners AG/Allergan), 또는 항-VEGF 앱타머(예를 들어, MACUGEN®(페갑타닙 소듐)); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 길항제, 예를 들어, 항-PDGF 항체, 항-PDGFR 항체(예를 들어, REGN2176-3), 항-PDGF-BB 페길화된 앱타머(예를 들어, FOVISTA® ; Ophthotech/Novartis ), 가용성 PDGFR 수용체 융합 단백질, 또는 이중 PDGF/VEGF 길항제(예를 들어, 소분자 억제제(예를 들어, DE-120(Santen) 또는 X-82(TyrogeneX)) 또는 이중특이성 항-PDGF/항-VEGF 항체)); VISUDYNE®(베르테포르핀)과 광역학 요법 병용; 항산화제; 보체 시스템 길항제, 예를 들어, 보체 인자 C5 길항제(예를 들어, 소분자 억제제(예를 들어, ARC-1905; Opthotech) 또는 항-C5 항체(예를 들어, LFG-316; Novartis), 프로퍼딘 길항제(예를 들어, 항-프로퍼딘 항체, 예를 들어, CLG-561; Alcon), 또는 보체 인자 D 길항제(예를 들어, 항-보체 인자 D 항체, 예를 들어, 람팔리주맙; Roche)); C3 차단 펩티드(예를 들어, APL-2, Appellis); 시각 주기 조절제(예를 들어, 에믹수스타트 염산염); 스쿠알라민(예를 들어, OHR-102; O시간 Pharmaceutical); 비타민 및 미네랄 보충제(예를 들어, 연령 관련 안구 질환 연구 1(AREDS1, 아연 및/또는 항산화제) 및 연구 2(AREDS2, 아연, 항산화제, 루테인, 제아잔틴 및/또는 오메가-3 지방산)에 기재된 것들); 세포 기반 요법, 예를 들어, NT-501(Renexus); PH-05206388(Pfizer), huCNS-SC 세포 이식(StemCells), CNTO-2476(제대 줄기 세포주, Janssen), OpRegen(RPE 세포 현탁액, Cell Cure Neurosciences) 또는 MA09-hRPE 세포 이식(Ocata Therapeutics) ); 조직 인자 길항제(예를 들어, hI-con1; Iconic Therapeutics); 알파-아드레날린성 수용체 작용제(예를 들어, 브리모니딘 타르트레이트; Allergan); 펩티드 백신(예를 들어, S-646240; Shionogi); 아밀로이드 베타 길항제(예를 들어, 항-베타 아밀로이드 단클론 항체, 예를 들어, GSK-933776); S1P 길항제(예를 들어, 항-S1P 항체, 예를 들어, iSONEP™Lpath Inc); ROBO4 길항제(예를 들어, 항-ROBO4 항체, 예를 들어, DS-7080a; Daiichi Sankyo); 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 렌티바이러스 벡터(예를 들어, RetinoStat); 및 이들의 임의의 조합이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 경우에, AMD 치료제(이전의 AMD 치료제들을 포함)는 공동 제형화될 수 있다. 예를 들어, 항-PDGFR 항체 REGN2176-3은 애플리버셉트(EYLEA®)와 공동 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 공동 제형은 본 발명의 Tie2-결합제 또는 접합체와 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다.
Tie2-결합 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 LUCENTIS®(라니비주맙)와 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
Tie2-결합 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 EYLEA®(애플리버셉트)와 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
Tie2-결합 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 MACUGEN®(페갑타닙 소듐)과 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위한 광역학 요법과 병용하여 VISUDYNE®(베르테포르핀)과 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
Tie2-결합 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 PDGF 길항제와 병용 투여될 수 있다. 본 발명의 Tie2-결합 접합체와 병용될 수 있는 예시적인 PDGF 길항제는 항-PDGF 항체, 소분자 억제제(예를 들어, 스쿠알라민), 항-PDGF-B 페길화된 앱타머, 예컨대 FOVISTA®(E10030; 옵소텍/노바티스), 이중 PDGF/VEGF 길항제(예를 들어, 소분자 억제제(예를 들어, DE-120(Santen) 또는 X-82(TyrogeneX)) 또는 이중 특이적 항-PDGF/항-VEGF 항체)를 포함한다. 예를 들어, FOVISTA®는 본 발명의 Tie2-결합제 또는 접합체에 대한 보조 요법으로서 투여될 수 있다. OHR-102는 LUCENTIS® 또는 EYLEA® 와 같은 VEGF 길항제와 병용 투여될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 Tie2-결합제 또는 접합체는 OHR-102, LUCENTIS® 및/또는 EYLEA® 와 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
Tie2-결합 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 RTH-258과 병용 투여될 수 있다. RTH-258은, 예를 들어, 유리체내 주사 또는 안구 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
Tie2 결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 아비시파르 페골과 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
Tie2 결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 아비시파르 페골과 병용 투여될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
다음을 포함하는(그러나, 이에 제한되는 것은 아님) 임의의 적합한 DME 및/또는 DR 치료제는 안구 질환(예를 들어, DME, DR, DME, RVO 또는 GA)의 치료를 위해 Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형과 병용 투여될 수 있다: VEGF 길항제(예를 들어, 루센티스® 또는 아일리아®), 코르티코 스테로이드(예를 들어, 코르티코스테로이드 임플란트(예를 들어, 오저덱스(OZURDEX)®(덱사메타손 유리체내 임플란트) 또는 일루비엔(ILUVIEN)®(플루오시놀론 아세토나이드 유리체내 임플란트)), 유리체내 주사(예를 들어, 트리암시놀론 아세토나이드)에 의한 투여를 위해 제형화된 코르티코스테로이드 또는 이들의 조합. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다.
Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 DME 및/또는 DR(예를 들어, NPDR 또는 PDR)의 치료를 위해 LUCENTIS®(라니비주맙)와 병용 투여될 수 있다.
Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 DME 및/또는 DR(예를 들어, NPDR 또는 PDR)의 치료를 위해 EYLEA®(애플리버셉트)와 병용 투여될 수 있다.
Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 DME 및/또는 DR의 치료를 위해 OZURDEX®(덱사메타손 유리체내 임플란트)와 병용 투여될 수 있다.
Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형은 DME 및/또는 DR의 치료를 위해 ILUVIEN®(덱사메타손 유리체내 임플란트)와 병용 투여될 수 있다.
일부 경우들에서, TAO/PRN 치료 요법 또는 TAE 치료 요법은 AMD 치료제(예를 들어, 라니비주맙 또는 애플리버셉트)를 Tie2-결합 접합체 및/또는 이의 중합체 제형과 병용으로 투여하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 안구 장애는 DME 및/또는 DR이다. 일부 경우에, 안구 장애는 AMD(예를 들어, 습성 AMD)이다. 일부 경우에, 안구 장애는 GA이다.
상기의 이러한 병용 요법은 병용 투여(두 가지 또는 그 이상의 요법제가 동일한 또는 별도 제제 안에 함유됨), 및 별도 투여를 포함하고, 이 경우, 상기 본 발명의 Tie2-결합 접합체의 투여는 추가적인 요법제 및/또는 요법제들의 투여 이전, 동시 및/또는 이후에 일어난다. 한 실시형태에서, Tie2-결합 접합체, 또는 중합체 제형의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1, 2, 3, 4 또는 5개월 이내, 또는 약 1, 3 또는 4주 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 이내 발생한다.
Tie2-결합 접합체, 및/또는 이의 중합체 제형은 추가로 녹내장의 치료를 위해 고려된다. 녹내장은 안압 상승(IOP)으로 인해 최소 부분적으로 눈의 진행성 손상을 특징으로 하는 일련의 안구 질환이다(Merck Manual of Diagnosis and Therapy(1999)). 추가로, 녹내장은 망막 신경절 세포(RGC) 사멸, 축삭 손실 및 시신경 머리의 함몰된 외형을 특징으로 한다(Alward, “Medical Management of Glaucoma,” N Eng J Med, 1998; 339:1298-1307). 녹내장은 시야 검사와 “부항”을 감지하기 위한 시신경의 검안경 검사를 통해 시력 상실이 발생하기 전에 진단할 수 있다. 정상 성인의 평균 IOP는 15~16mmHg이고; 정상 범위는 10~21mmHg이다. 녹내장 관리의 한 형태는 국소 적용 약물을 사용하여 IOP를 낮추는 것을 기반으로 한다(“Glaucoma,” Lancet, 1999; 354:1803-1810).
현재 IOP를 낮추는 데 사용되는 약물에는 다음과 같은 5가지 주요 분류가 있다: β-아드레날린성 길항제, 아드레날린성 작용제, 부교감신경 흥분제, 프로스타글란딘 유사 유사체 및 탄산 탈수효소 억제제. 대부분의 약물은 눈에 국소적으로 적용되지만 심각한 전신 부작용을 일으킬 수 있으며 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. IOP의 추가 저하가 나타나거나 약물이 IOP를 충분히 낮추지 못하는 경우 일반적으로 레이저 섬유주 성형술이 다음 단계이다. IOP가 여전히 적절하게 조절되지 않으면 절개 녹내장 수술이 지시된다(Id). IOP를 낮추는 것은 뉴런 손실의 정도를 상당히 감소시킴에도 불구하고 RGC의 손실이 계속될 수 있기 때문에 질병 진행의 중단을 보장하지 않는다. 의학적 또는 외과적 개입 후 IOP 조절과 시야 상실 사이의 연관성에 대한 최근 연구에 따르면 시야 검사에 반영되는 지속적인 신경 손실은 IOP가 낮으면 감소할 수 있다. 녹내장성 시신경병증은 특정 병태생리학적 변화와 RGC와 그 축삭의 후속적인 사멸로 인해 발생하는 것으로 보인다. RGC 사멸 과정은 2단계: 손상 시작의 원인인 1차 손상에 이어, 퇴행하는 세포를 둘러싼 적대적인 환경으로 인한 더 느린 2차 변성인 것으로 생각된다.
추가 양상에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 조제에 있어서 항-Tie2 접합체의 용도를 제공한다. 한 실시형태에서, 의약은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO, 또는 GA)의 치료를 위한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 의약은 DME 및/또는 DR의 치료를 위한 것이다. 추가 실시형태에서, 의약은 유효량의 의약을 안구 장애를 갖는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO, 또는 GA)를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 이러한 한 실시형태에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 유효량의 최소 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 실시형태에서, 의약은 특히 눈에서 혈관 투과성을 감소시키기 위한 것이다. 추가 실시형태에서, 의약은 특히 눈에서 혈관 투과성을 감소시키기 위해 의약의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서, 특히 눈에서 혈관 투과성을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시형태 중 어느 하나의 “개체”는 인간 일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO, 또는 GA)의 치료 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 이러한 안구 장애(예를 들어, DME, DR, AMD, RVO, 또는 GA)를 갖는 개체에게 유효량의 본 발명의 Tie2-결합 접합체를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 한 실시형태에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같은 유효량의 최소 하나의 추가 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 실시형태 중 어느 하나의 “개체”는 인간 일 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 특히 개인의 눈에서 혈관 투과성을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 상기 방법은 특히 눈에서 혈관 투과성을 감소시키기 위해 유효량의 본 발명의 Tie2-결합 접합체를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, “개체”는 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에서 제공된 임의의 본 발명의 Tie2-결합 접합체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시형태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 본 발명의 tie2-결합 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 본 발명의 tie2-결합 접합체 및 예를 들어, 상기 기재된 최소 하나의 추가 치료제를 포함한다.
상기의 이러한 병용 요법은 병용 투여(두 가지 또는 그 이상의 요법제가 동일한 또는 별도 제제 안에 함유됨), 및 별도 투여를 포함하고, 이 경우, 상기 본 발명의 항체의 투여는 추가적인 요법제 및/또는 요법제들의 투여 이전, 동시 및/또는 이후에 일어난다.한 실시형태에서, 항-Tie2 접합체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내, 또는 약 1, 2 또는 3주 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 발생한다.
Tie2-결합 접합체 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 국소 치료의 경우 필요에 따라 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 부분적으로 투여가 단기인지 만성인지에 따라 임의의 적합한 경로에 의해, 예컨대, 주사, 예를 들어, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
본 발명의 tie2 결합 접합체는 모범 의료 관행과 합치하는 양상으로 제형화, 투약, 및 투여된다. 이와 관련하여 고려해야 할 요소에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요소가 포함된다. 항체는 꼭 그럴 필요는 없지만, 문제의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 선택적으로 제형화된다. 이러한 다른 물질들의 유효량은 제형에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 그리고 상기에서 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 설명된 투여 경로로 동일한 투여량으로 이용되거나, 또는 본원에서 논의된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 판단된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 이용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본 발명의 접합체의 적절한 용량(단독으로 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 접합체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 접합체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 상기 접합체는 한 번에 또는 일련의 치료일정에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따르면, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg - 10 mg/kg)의 접합체는 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 상기 언급된 요소들에 따라, 하나의 전형적인 일일 투여량의 범위는 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상이 될 수 있다. 수일 또는 보다 장기에 걸친 반복된 투여를 위하여, 병태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증세가 바람직하게 억제될 때까지 지속될 것이다. 상기 접합체의 한 가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위 일 것이다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg 또는 10mg/kg(또는 이의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들면 상기 환자는 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면 약 6회 용량의 접합체를 제공받는다). 초기에는 보다 높은 부하 용량, 후속하여 보다 낮은 하나 이상의 용량이 투여될 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 본 발명의 Tie2-결합 접합체 대신에 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조 물품
본 발명의 또 다른 양상에서, 상기 설명된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질들을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 상기 제조 물품은 용기 및 용기 위에 또는 용기에 결합된 라벨 또는 약품 설명서를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니, 등등을 포함한다. 용기는 다양한 재료들, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 그리고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물에서 최소 하나의 활성제는 본 발명의 Tie2 결합제 또는 접합체이다. 라벨 또는 약품 설명서에는 이 조성물이 선택된 병태 치료에 이용된다는 것이 명시되어 있다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기, 여기에서 상기 조성물은 본 발명의 Tie2 결합제 또는 접합체를 포함하고; 그리고 (b) 조성물이 포함된 제2 용기, 여기에서 상기 조성물은 또 다른 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다. 발명의 본 실시형태에서 제조물품은 이 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있음이 표시된 약품 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 한편, 또는 추가적으로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충액, 가령, 주사(BWFI)용 정균수, 포스페이트-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액이 포함된 제2(또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 제조 물품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여 상업적으로 그리고 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 Tie2-결합 접합체 대신에 또는 이에 추가하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
I. 본 발명의 구체적인 실시형태
다음에서, 본 발명의 구체적인 실시형태들이 나열된다.
1. Tie2에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 단편으로서, 여기서 항체는:
(a) 아미노산 서열 NTDIS(서열 번호 3)를 포함하는 CDR-H1, (b) 아미노산 서열 RISPSDGNTYYADSVKG(서열 번호 4)를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 아미노산 서열 RTRWASX1AX2DY(서열 번호 5)를 포함하는 CDR-H3(여기서 X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y L, Q, I, K 또는 H임)을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 8)를 포함하는 CDR-L1, (e) 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 9)를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 아미노산 서열 QQSYTTPPT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 항체.
2. 전술한 실시형태에 있어서, CDR-H3은 아미노산 서열 RTRWASWAMDY(서열 번호 6)를 포함하는, 항체.
3. 실시형태 1에 있어서, CDR-H3은 아미노산 서열 RTRWASWAFDY(서열 번호7)를 포함하는, 항체.
4. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 단클론 항체인, 항체.
5. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 인간화 또는 키메라 항체인, 항체.
6. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, Tie2에 결합하는 항체 단편인, 항체.
7. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, Fab 단편인, 항체.
10. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체.
11. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 96%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 96%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체.
12. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체.
13. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체.
14. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체.
15. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 항체는: 서열 번호 21의 VL 서열 및 서열 번호 19의 VH 서열; 서열 번호 21의 VL 서열 및 서열 번호 22의 VH 서열; 또는 서열 번호 21의 VL 서열 및 서열 번호 20의 VH 서열을 포함하는, 항체.
16. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 항체는 조작된 시스테인을 포함하는, 항체.
17. 실시형태 16에 있어서, 여기서
조작된 시스테인은 HC의 T120C, G166C, G178C, T187C, 및 T209C로부터 선택되고; 또는 조작된 시스테인은 LC의 Q124C, R142C, Q155C, L201C, T206C, K107C, K126C 및 K149C로부터 선택되고; 여기서 조작된 시스테인의 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 항체.
18. 실시형태 16 또는 17 중 어느 하나에 있어서, 조작된 시스테인은 HC의 T209C 및 LC의 T206C로부터 선택되는, 항체.
19. 실시형태 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 조작된 시스테인은 LC의 T206C인, 항체.
20. 실시형태 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 조작된 시스테인은 HC의 T209C인, 항체.
21. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 25의 아미노산 서열에 최소 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 아미노산 서열에 최소 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
22. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 25의 아미노산 서열에 최소 96%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 아미노산 서열에 최소 96%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
23. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 25의 아미노산 서열에 최소 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 아미노산 서열에 최소 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
24. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 25의 아미노산 서열에 최소 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 아미노산 서열에 최소 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
25. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 25의 아미노산 서열에 최소 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 아미노산 서열에 최소 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
26. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열 번호 25의 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
27. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 항체가 서열 번호 25의 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 및 서열 번호 92로부터 선택된 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
28. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 56의 아미노산 서열에 최소 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 23의 아미노산 서열에 최소 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
29. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 56의 아미노산 서열에 최소 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 23의 아미노산 서열에 최소 96%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
30. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 56의 아미노산 서열에 최소 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 23의 아미노산 서열에 최소 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
31. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 56의 아미노산 서열에 최소 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 23의 아미노산 서열에 최소 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
32. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 56의 아미노산 서열에 최소 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 23의 아미노산 서열에 최소 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
33. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 항체는 서열 번호 56의 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 90, 서열 번호 91, 또는 서열 번호 23의 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체.
34. Tie-2에 특이적으로 결합하는 항체로서, 서열 번호 55의 서열을 포함하는 HC 및 서열 번호 25의 서열을 포함하는 LC를 포함하는, 항체.
35. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
36. 실시형태 38의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
37. Tie-2에 결합하는 항체의 생산 방법으로서, 항체 발현에 적합한 조건 하에 실시형태 39의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
38. Tie2에 결합하는 접합체로서, 여기서 접합체는 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나에 따른 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 최소 6, 최소 7, 또는 최소 8개의 항체를 포함하고, 이러한 항체 각각은 다량체화 모이어티에 연결되는, 접합체.
39. 실시형태 38에 있어서, 접합체는 시험관내 또는 생체내 세포 분석에서 Tie2의 인산화를 활성화시키는, 접합체.
40. 실시형태 38 또는 39에 있어서, 접합체는 시험관내 분석에서 Tie2 단백질 수준을 25% 미만, 50% 미만 또는 75% 미만만큼 감소시키거나; 또는 접합체는 시험관내 분석에서 Tie-2 단백질 수준을 25% 초과, 50% 초과, 또는 75% 초과만큼 감소시키지 않는, 접합체.
41. 실시형태 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 접합체는 시험관내 장벽 기능 분석에 의해 결정시 혈관 투과성을 감소시키는, 접합체.
42. 실시형태 38 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 다량체화 모이어티는 폴리올, 폴리펩티드, 및/또는 펩티드를 포함하는, 접합체.
43. 실시형태 42에 있어서, 폴리올은 이량체, 4량체, 6량체 및 8량체로부터 선택되는 다중 팔 폴리올인, 접합체.
44. 실시형태 43에 있어서, 다중-팔 폴리올은 6량체인, 접합체.
45. 실시형태 43 또는 44에 있어서, 다중-팔 폴리올은 8량체인, 접합체.
46. 실시형태 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 접합체.
47. 실시형태 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 폴리올은 시스테인 아미노산의 유리 설프하이드릴 기를 통해 최소 2개의 항체에 공유적으로 연결되는, 접합체.
48. 실시형태 47에 있어서, 시스테인 아미노산은 조작된 시스테인인, 접합체.
49. 실시형태 48에 있어서, 조작된 시스테인은 항체의 HC 및/또는 LC 불변 영역에 있는, 접합체.
50. 실시형태 48 또는 49에 있어서, 조작된 시스테인은 HC의 T120C, G166C, G178C, T187C, 및 T209C로 이루어진 군으로부터 선택되고; 또는
조작된 시스테인은 LC의 Q124C, R142C, Q155C, L201C, T206C, K107C, K126C 및 K149C로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 접합체.
51. 실시형태 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 조작된 시스테인은 LC의 T206C이고, 여기서 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 접합체.
52. 실시형태 48 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 조작된 시스테인은 HC의 T209C이고, 여기서 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 접합체.
53. 실시형태 42 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 폴리올은 리신 아미노산의 유리 아미노 기를 통해 최소 하나의 항체에 공유적으로 연결된, 접합체.
54. 실시형태 53에 있어서, 리신 아미노산은 항체의 HC 또는 LC 불변 영역에 있고/있거나 리신 아미노산은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 있는, 접합체.
55. 실시형태 46 내지 54 중 어느 하나에 있어서, PEG는 약 500 달톤(Da) 내지 약 300,000 Da 또는 약 500 Da 내지 약 20,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는, 접합체.
56. 실시형태 46 내지 55 중 어느 하나에 있어서, PEG는 약 6000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는, 접합체.
57. 실시형태 46 내지 56 중 어느 하나에 있어서, PEG는 디펜타에리트리톨 6량체 또는 8량체 코어를 포함하는, 접합체.
58. 실시형태 46 내지 57 중 어느 하나에 있어서, PEG는 화학식 (Ia)의 구조를 가지며:
Figure pct00094
여기서 n은 1-10의 정수이고; 각각의 m은 독립적으로 3-250의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고;
여기서 최소 하나의 R2는 말단 반응기이고 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 항체에 공유적으로 연결된, 접합체.
59. 실시형태 46 내지 57 중 어느 하나에 있어서, PEG는 화학식 (Ib)의 구조를 가지며:
Figure pct00095
여기서 각각의 m은 독립적으로 3-250의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고;
여기서 최소 하나의 R2는 말단 반응기이고 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나의 항체에 공유적으로 연결된, 접합체.
60. 실시형태 59에 있어서, 각각의 m은 독립적으로 15 내지 35, 바람직하게는 약 20 내지 30의 정수인, 접합체.
61. 실시형태 43 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 접합체는 다중-팔 폴리올에 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 최소 하나의 항체를 공유 연결함으로써 제조되는, 접합체.
62. Tie-2에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 접합체로서, 항체는 서열 번호 20의 VH 서열 및 서열 번호 21의 VL 서열을 포함하고, 여기서 항체는 화학식 (Ib)의 구조를 갖는 폴리에틸렌 글리콜에 공유적으로 연결되고:
Figure pct00096
여기서 각각의 m은 독립적으로 3-250의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고;
여기서 최소 하나의 R2는 말단 반응기이고 항체에 공유적으로 연결된, 접합체.
63. 실시형태 62에 있어서, m은 10 내지 200의 정수인, 접합체.
64. 실시형태 62 또는 63에 있어서, m은 20 내지 30의 정수인, 접합체.
65. 실시형태 58 내지 64 중 어느 하나에 있어서, R1은 부재하거나 또는 R1은:
Figure pct00097
;
Figure pct00098
;
Figure pct00099
;
Figure pct00100
;
Figure pct00101
;
Figure pct00102
;
Figure pct00103
;
Figure pct00104
;
Figure pct00105
;
Figure pct00106
;
Figure pct00107
;
Figure pct00108
;
Figure pct00109
;
Figure pct00110
; 및
Figure pct00111
; 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 각각의 i는 독립적으로 0-10의 정수이고; j는 0-10의 정수이고; R2는 티올 반응기, 아미노 반응기 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 말단 반응기인, 접합체.
66. 실시형태 58 내지 65 중 어느 하나에 있어서, R2는 말레이미드, 설프하이드릴, 티올, 트리플루오로메탄설포네이트, 토실레이트, 아지리딘, 에폭사이드, 피리딜 디설파이드, 숙신이미딜 에스테르, -NH2, 알데하이드, 할로아세테이트, 할로아세트아미드 및 파라-니트로페닐 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 말단 반응기인, 접합체.
67. 실시형태 58 내지 66 중 어느 하나에 있어서, R2는 말레이미드인, 접합체.
68. 실시형태 43 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 접합체는 다중-팔 폴리올에 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 최소 하나의 항체를 공유 연결함으로써 제조되는, 접합체.
69. 실시형태 38 내지 68 중 어느 하나의 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
70. 실시형태 69에 있어서, 접합체의 농도는 약 50 mg/ml 내지 약 300 mg/ml인, 약학 조성물.
71. 실시형태 69 또는 70에 있어서, 추가 치료제를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
72. 실시형태 71에 있어서, 추가 치료제는 VEGF 길항제, Ang2 길항제, HtrA1 길항제, 및 IL33 길항제, 보체 성분 길항제, 및 제2 Tie2 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
73. 실시형태 72에 있어서, VEGF 길항제는 VEGF 트랩 및 항-VEGF 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
74. 실시형태 79 내지 73 중 어느 하나의 약학 조성물 및 이러한 조성물을 환자에게 유리체내 전달하기 위한 수단을 포함하는 안구 전달용 장시간 작용 전달 장치로서, 조성물은 해당 부위에서 장기간 동안 유효하게 유지되는, 안구 전달용 장시간 작용 전달 장치.
75. 실시형태 1 내지 34 중 어느 하나의 항체, 실시형태 38 내지 68 중 어느 하나의 접합체, 또는 실시형태 69 내지 73 중 어느 하나의 약학 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Tie2 경로 매개 장애를 치료하는 방법.
76. 실시형태 75에 있어서, Tie2 경로 매개 장애는 혈관 투과성 장애인, 방법.
77. 실시형태 75 또는 76에 있어서, Tie2 경로 매개 장애는 눈 병태인, 방법.
78. 실시형태 77에 있어서, 눈 병태는 당뇨병성 황반 부종(DME), 당뇨병성 망막병증, 건성 및 습성(비삼출성 및 삼출성) 형태를 포함하는 연령 관련 황반 변성(AMD), 맥락막 신생혈관(CNV), 포도막염, 허혈 관련 망막병증, 병리학적 근시, 폰 히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 각막 신생혈관, 녹내장 및 망막 신생혈관으로부터 선택되는, 방법.
79. 실시형태 75 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 눈 병태는 DME인, 방법.
80. 실시형태 75 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 이식가능한 포트 전달 시스템을 사용하여 항체, 접합체 또는 약학 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
81. 실시형태 75 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 유리체내 투여에 의해 항체, 접합체 또는 약학 제형을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
82. 실시형태 81에 있어서, 유리체내 투여는 소-구경 바늘을 통한 것인, 방법.
83. 실시형태 82에 있어서, 소-구경 바늘은 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 또는 22 게이지인, 방법.
84. 실시형태 75 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 개체에게 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예들이다. 다양한 다른 실시예들이 전술한 일반적인 설명에 따라 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1 - 나이브 파지 라이브러리로부터 유래된 항-Tie 2 항체의 생성
Tie2의 세포외 도메인(ECD)에 결합하는 항체는 아래에 설명된 바와 같이 중쇄 CDR 내의 용매 노출 위치에 합성상의 다양성을 도입함으로써 단일 인간 프레임워크에 구축된 파지-디스플레이 합성 항체 라이브러리로부터 처음에 선택되었다. 이러한 파지는 ECD 및 ECD의 다양한 하위도메인에 대해 스크리닝되었다.
라이브러리 구축을 위한 파지미드 벡터
파지미드 pV0350-2b 및 pV0350-4는 M13 파지 입자의 표면에 Fab 템플릿을 각각 1가 또는 2가로 디스플레이하도록 설계되었다. Fab 템플릿은 h4D5 항체를 기반으로 했으며, 이 항체는 Her-2로 알려진 암 관련 항원을 인식하는 인간화 항체(erbB2)이다. h4D5 서열은 humAb4D5 버전 8(“humAb4D5-8”) 서열을 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 얻었다(Carter 외, (1992) PNAS 89:4285-4289). h4D5 핵산 서열은 인간 공통 서열 Fab 프레임워크에서 Her-2에 특이적인 마우스 단클론 항체로부터 변형된 CDR 영역을 인코딩한다. 구체적으로, 이 서열은 VH 샹류에 카파 경쇄(LC 영역) 및 CH1 도메인(HC 영역)을 포함한다. 항-Her-2 항체의 제조 방법 및 가변 도메인 서열들의 동일성은 미국 특허 제5,821,337호 및 제6,054,297호에 제공되어 있다.
벡터 pV0350-2b는 phoA 프로모터의 제어하에 인간 성장 호르몬(hGH)의 파지 디스플레이에 사용되었던, 이전에 설명된 파지미드(pHGHam-gIII)를 변형하여 제작되었다. M13 마이너 코트 단백질 P3의 C-말단 도메인(cP3)에 융합된 hGH 및 stII 분비 신호 서열을 인코딩하는 phGHam-gIII의 오픈 리딩 프레임은 2개의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA 단편으로 대체되었다. 제1 오픈 리딩 프레임은 h4D5 경쇄(버전 8)에 대해 인코딩되었으며 제2 오픈 리딩 프레임은 cP3에 융합된 h4D5 중쇄의 가변(VH) 및 제1 불변(CH1) 도메인에 대해 인코딩되었고; 각 단백질은 N-말단 stII 신호 서열에 의해 분비되도록 지시되었다. 중쇄 단편과 cP3 사이의 앰버 정지 코돈은 결실되었는데, 이는 이 변형이 파지상에 디스플레이되는 Fab의 수준을 증가시키는 것으로 나타났기 때문이다. h4D5 경쇄(gD 태그)의 C 말단에 에피토프 태그를 추가했다. 2가 디스플레이용 벡터(pV0350-4)는 기재된 바와 같이 중쇄 CH1 도메인과 cP3 사이에 GCN4 류신 지퍼를 인코딩하는 DNA 단편의 삽입을 제외하고는 pV0350-2b와 동일하였다. 경쇄 유전자는 천연 항체 서열의 Kabat 데이터베이스에서 가장 일반적으로 발견되는 아미노산을 인코딩하기 위해 3개의 위치에서 두 파지미드 모두에서 추가로 변형되었다; 구체적으로, Arg66은 Gly로 변경되었고 Asn30 및 His91은 Ser으로 변경되었다. 이러한 변화는 Fab 발현을 증가시키고 파지에 디스플레이하는 것으로 밝혀졌다. Kunkel 외의 방법을 사용하여 부위 지정 돌연변이유발을 수행했다 (Kunkel, JD, 외, (1987) Methods Enzymol 154:367-82).
설명된 바와 같이 pV0350-2b 또는 pV0350-4의 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발 및 “정지 템플릿” 버전을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리들을 생성하였다(Lee, CV, 외, (2004) J. Immunol. Methods 284:119-132; Lee, CV, 외, (2004) JMB 340:1073-1093). 정지 코돈(TAA)은 3개의 중쇄 CDR 모두에 삽입되었다. 이들은 돌연변이유발 반응 동안 CDR-H1, -H2 및 -H3를 인코딩하는 서열에 대해 어닐링되고 무작위화를 위해 선택된 위치의 코돈들을 맞춤형 축퇴 코돈으로 대체한 축퇴 올리고뉴클레오티드의 혼합물에 의해 복구되었다. 돌연변이유발 반응을 대장균 SS320 세포에 전기천공하고, 배양물을 KO7 헬퍼 파지, 50g/ml의 카르베니실린 및 50g/ml의 카나마이신이 보충된 2YT 액체배지에서 30℃에서 밤새 성장시켰다. 기재된 바와 같이 PEG/NaCl을 사용한 침전에 의해 배양 배지로부터 파지를 수확하였다(Sidhu, SS 외, (2000), Methods Enzymol. 328:333-363). 각 전기천공 반응은 ~1011개의 대장균 세포와 ~10 ug의 DNA를 사용하여 1×109-5×109개의 형질전환체를 생성했다.
CDR-H1 및 CDR-H2의 천연 다양성을 모방하도록 맞춤화된 축퇴 올리고뉴클레오티드들로 별도의 라이브러리를 만들었으며(상기 Lee, CV, 외, (2004), JMB의 표 1): 라이브러리 3(Lib-3)은 Fab.zip 템플릿으로 만들었다. Lib-3은 상기 Lee, CV, 외, (2004)에 기재된 내용을 참조하라. CDR-H1 및 CDR-H2에 대한 2 내지 4개의 올리고뉴클레오티드를 조합하여 천연 다양성의 커버리지를 증가시켰다. Lib-3은 각각 CDR-H1 및 CDR-H2에 대해 올리고뉴클레오티드 H1a 및 H1b(비율 2:1) 및 H2a-c(비율 1:2:0.1)를 사용했다(올리고뉴클레오티드에 대한 설명에 관하여 상기 Lee, C.V. 외(2004), JMB의 표 1 참조).
CDR-H3의 95-100번 위치의 경우, Lib-3은 NNS 코돈(또는 NNK 코돈) 또는, 코돈 삼중항의 각 위치에서 동일하지 않은 뉴클레오티드 비율을 포함하는 NNS 코돈의 변형된 버전(XYZ 코돈)을 포함하는 연장된 CDR-H3 길이의 일련의 라이브러리들로 구성된다. NNS 코돈은 32개의 코돈을 포함하였으며 20개 아미노산 모두에 대해 인코딩되었다. X는 38% G, 19% A, 26% T 및 17% C를 함유하고; Y는 31% G, 34% A, 17% T 및 18% C를 함유하고; Z는 24% G 및 76% C를 함유하였다. Lib-3에 대한 CDR-H3 설계는 상기 Lee, CV 외, (2004)의 표 5에 기재되어 있다. 함께 전기천공된 길이 7 및 8개 잔기를 제외하고 각각의 CDR-H3 길이에 대해 별도의 돌연변이유발 반응을 수행하고 전기천공하였다.
항-gD 항체에 대한 48개의 무작위로 선택된 클론의 결합을 측정함으로써 각 라이브러리에서 완전한 Fab의 파지 디스플레이 수준을 조사하였다. Lib-3의 경우, 가장 긴 CDR-H3(15-19개 잔기)를 통합하는 라이브러리가 감소된 비율(15-30%)의 Fab 디스플레이 클론을 가졌다는 점을 제외하고, 다른 CDR-H3 길이에 대해 유사한 수준의 디스플레이가 관찰되었다. 이것은 매우 긴 합성 올리고뉴클레오티드를 사용할 때 감소된 돌연변이유발 효율을 반영할 수 있다.
파지 분류
상기 설명한 Lib-3은 다양한 Tie2 세포외 도메인(ECD) 단백질에 대해 분류되었다. Tie2 ECD는 막 원위로부터 막 근위까지 3개의 IgG 도메인(Ig1 및 Ig2), 3개의 EGF 도메인(EGF1-3), 제3 IgG 도메인(Ig3) 및 3개의 피브로넥틴 유형 III 도메인(FN3)으로 구성된다(예를 들어, 도 1 참조). 전체 세포외 도메인(ECD), 막-근위 FN3 도메인, 또는 FN3 도메인이 없는 ECD(ECD5라고 함)를 인코딩하기 위한 구조체가 생성되었다. 따라서 리간드 결합 도메인 Ig2는 ECD 및 ECD5 구조체 둘 모두에 의해 인코딩되지만 FN3 구조체에는 없다. 인코딩된 단백질은 C-말단에서 인간 및 cyno 단백질의 경우 hIgG1의 Fc 영역 또는 뮤린 및 래트 단백질의 경우 mIgG2a, 또는 모든 종의 경우 C-말단 플래그 태그에 융합되었다. 도 1은 패닝에 사용된 단백질을 도시한다. 인간, 뮤린 및 래트 Tie1 수용체에 대한 전체 ECD 구조체들 또한 C-말단 Fc 융합 또는 플래그 태그 둘 모두를 사용하여 생성되었다.
Tie2 ECD 단백질의 발현 및 정제
플래그 태그된 Tie2 ECD는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 조건화 배지에서 발현되고 정제되었다. 11-14일 후, 컨디셔닝된 배지를 수확하고 대략 10배 농축했다. 농축물을 항-플래그-태그 컬럼에 로딩하고 0.1% Triton X-114 및 0.1% Triton X-110을 함유하는 25mM TRIS, 150mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.5, 결합 완충액으로 세척했다. 그 다음, 플래그-태그된 단백질을 50mM N 시트레이트, 150mM NaCl, pH 3.0으로 용리시킨 다음, 1M 아르기닌, 400mM 숙신산, pH 9.0을 사용하여 pH 5.0으로 중화시켰다. 용리된 단백질을 포스페이트 완충 식염수에서 크기 배제 컬럼(Superdex 200 또는 Superdex 75)에 로딩하고 분획을 수집했다; 단량체 피크 분획을 풀링하여(pooled) 농축시키고 0.2 um 여과하였다.
패닝을 위해 96웰 Nunc Maxisorp 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS에서 100 ul/웰의 표적 Tie2 항원(5 ug/ml)으로 코팅했다. 플레이트를 30분(min) 동안 65ul 1% 차단 단백질 및 추가 30분 동안 40ul 1% Tween20으로 차단했다(차단 단백질: 1차 라운드: 소 혈청 알부민(BSA), 2차 라운드: 카제인, 3차 라운드: 소 혈청 알부민(BSA), 4차 라운드: 카제인). 다음으로, 파지 라이브러리를 0.1% Tween 20이 포함된 1% BSA(1 OD = 1.13 x 1013 파지/ml)로 ~3-5 OD/ml로 희석했다. 일반적으로, 파지 주입은 다음과 같았다: 1차 라운드 3-5 OD/ml, 2차 라운드 3 OD/ml, 3차 라운드 ~ 0.5 - 1 OD/ml 및 4차 라운드 ~ 0.1 - 0.5 OD/ml. 희석된 파지를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰들을 PBS 및 0.05% Tween 20으로 연속적으로 최소 5회 세척하였다. 블로킹된 파지 라이브러리 100 ul/웰을 8개의 표적 항원이 코팅된 웰과 2개의 코팅되지 않은 웰에 실온에서 2시간(hr) 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS 및 0.05% Tween 20으로 최소 10회 연속적으로 세척하였다. 3차 라운드 패닝부터 시작하여, 무관한 Fc 함유 단백질로서 1uM 오말리주맙, Tie2.ECD5 또는 항체 항-Tie2.20(리간드 차단) 1시간 동안 파지 라이브러리에 첨가한 후 Tie2 코팅된 웰 결합에 2시간 동안 혼합물을 적용했다. 파지를 실온에서 20분 동안 100 ul/웰의 100 mM HCl로 용리시켰다. (코팅된 웰로부터 얻은) 용리된 파지 및 (코팅되지 않은 웰로부터 얻은) 배경 파지를 별도의 튜브에 수집했다. 용리된 수집물을 1/10 부피의 1 M Tris pH 11.0을 두 튜브에 첨가하여 중화시켰다. 용리된 파지의 튜브에 BSA를 최종 0.1% 첨가하였다. 파지를 적정하기 위해 90 ul의 로그 파지 XL-1(OD 600 nm ~0.1 - 0.3)을 37℃에서 30분 동안 10 ul의 용리된 파지 또는 배경 파지로 감염시켰다. 다음으로, 감염된 세포를 90 ul 2YT로 10배 증분으로 연속 희석하였다. 감염된 세포의 10 ul 분취량을 카르베니실린 플레이트에 플레이팅하였다.
패닝 라운드들 사이에 파지를 전파하기 위해, 약 400ul의 용리된 파지를 사용하여 37℃에서 30 - 45분 동안 ~4 ml 로그 상 XL-1(OD 600 nm ~0.1 - 0.3)을 감염시켰다. 헬퍼 파지 KO7과 카베니실린을 1 x 1010 pfu/ml KO7 및 50 ug/ml 카베니실린의 최종 농도로 37℃에서 추가로 1시간 동안 감염에 첨가했다. 배양액을 카르베니실린 50ug/ml 및 50ug/ml 카나마이신이 포함된 2YT 배지에서 37℃, 4시간 그리고 30℃에서 밤새(또는 최소 18시간) 최종 부피 20~25ml로 성장시켰다. 다음날, 라이브러리 파지를 8000rpm에서 10분 동안 세포를 원심분리시켜 정제하였다. 상청액을 수집하였다. 20% PEG/2.5M NaCl을 상청액 부피의 1/5로 첨가하고 혼합하고 5분 동안 얼음 위에 두었다. 파지를 15분 동안 12000rpm에서 펠렛화하였다. 펠릿을 5000rpm에서 5분 동안 다시 원심분리시켰다. 펠렛을 1 ml PBS에 재현탁하고 12000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켜 파편을 제거하고 PEG/NaCl 첨가로 침전시켰다. 파지 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. 재현탁된 파지 펠릿의 OD는 268 nm에서 판독되었다.
스크리닝 ELISA 분석
4차 라운드의 클론들을 Tie2 결합 및 특이성에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. 4℃에서 밤새 웰당 65 ul(코팅 완충액 중 1 ug/ml)의 Tie2 단백질 또는 관련 없는 단백질로 96-웰 마이크로역가 플레이트의 웰들을 코팅하여 스크리닝 ELISA를 수행했다. 96-튜브 플레이트에서 4차 라운드의 콜로니를 50ug/ml 카르베니실린 및 헬퍼 파지 KO7이 포함된 400ul 2YT 배지에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 플레이트를 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 배양 상청액 30 ul를 60 ul의 ELISA 완충액(0.5% BSA 및 0.05% Tween20을 포함하는 PBS)과 함께 Tie2 코팅된 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS - 0.05% Tween20 및 100 ul/웰의 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-M13 항체(PBS에 1/5000 희석 + 0.5% BSA 및 0.05% Tween20)로 실온에서 30분 동안 세척했다(상기 Sidhu 외의 문헌). 웰들을 PBS - 0.05% Tween20으로 세척한 후 1:1 비율의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 퍼옥시다제 기질과 퍼옥시다제 용액 B(H2O2)((KirkegaardPerry Laboratories (Gaithersburg, MD))) 100 ul/웰을 각 웰에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 웰당 100 ul 1M 인산(H3PO4)을 첨가하여 반응을 중단하고 450 nm에서 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 웰의 OD를 측정했다.
배경 위에 Tie2 결합을 가지며 Tie2 결합 종 특이성 및 관련 없는 Fc 함유 단백질(오말리주맙)에 대한 낮은 결합을 보유하는 클론들을 추가로 분석했다. 아래 표 2-5는 결합 데이터를 요약한 것이다. 표 2-5의 어느 것도 오말리주맙에 대한 결합을 나타내지 않았다.
표 2
Figure pct00112
표 3
Figure pct00113
표 4
Figure pct00114
표 5
Figure pct00115
항-Tie2 IgG 발현 및 정제
원하는 종 특이성 및 관련 없는 단백질의 낮은 결합을 갖는 상기 동정된 양성 결합제를 시퀀싱하고 항-Tie2 중쇄의 가변 도메인을 포유동물 세포에서 일시적인 인간 IgG1 발현을 위해 미리 설계된 벡터에 클로닝하였다. (Lee 외, 2004a).
생성된 항-Tie2 인간 IgG는 상기 생성된 구조체들에 의해 인코딩된 중쇄 및 4D5 경쇄(서열 번호 25)를 사용하여 293 일시적 형질감염을 사용하여 발현되었다. IgG를 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 형질감염 상청액으로부터 정제하고 Tie2 결합 확인, Tie1 결합 및 에피토프 매핑에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. hIgG 단백질이 발현되지 않았거나 제대로 발현되지 않았기 때문에 8개의 항체는 더 이상 분석되지 않았다.
실시예 2 - 파지 라이브러리로부터 유래된 항-Tie 2 항체의 특성화
Tie2 결합
항-Tie2 항체에 의한 Tie2 결합을 확인하기 위해, ELISA 형식을 사용하였는데, 여기서 상기 설명한 바와 같이 IgG1 형식으로 제조된 Tie2 세포외 구조체들을 65 ul PBS에서 2 ug/ml로 Maxisorp 면역 플레이트에 4℃에서 밤새 고정화시켰다. PBS 중 1% BSA로 미리 차단하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 고정화된 Tie2가 있는 플레이트들에 항-Tie2 IgG의 연속 희석액을 처리했다. 플레이트들을 세척하고 상기 방법을 사용하여 항-huFC-접합된 HRP 2차 항체로 검출하였다. 도 2A 및 도 2B는 인간 Tie2 ECD에 대한 다양한 클론의 결합을 보여준다.
Tie1 결합을 평가하기 위해 고정된 Tie1 단백질과 함께 결합 ELISA를 또한 사용하였다. 도 3A 및 도 3B에 제공된 결과는, 몇몇 항-Tie2 항체에 의한 Tie1 결합의 결여를 나타내며, 이는 이들 항-Tie2 항체가 Tie2에 특이적으로 결합함을 입증한다.
리간드 차단
항-Tie2 항체의 Ang1 및 Ang2 리간드 차단 활성을 평가하기 위해 경쟁 ELISA 형식을 사용했다. 이 분석에서, hAng2(GenBank 접근 번호 NP_001137) 또는 hAng1(GenBank 접근 번호 NP_000450)을 Maxisorp 면역플레이트(2 ug/ml)에 고정시키고 비오틴화된 huTie2ECD.Fc를 항-TTie2 항체들의 연속 희석액으로 용액에서 평형화시킨 후, 결합되지 않은 비오틴-Tie2.ECD.Fc를 고정화된 hAng1 또는 hAng2로 포획하고 스트렙타비딘-접합된 HRP로 검출하였다. 이들 결과는 최소 항-Tie2 항체, Tie2.1, Tie2.12 및 Tie2.20에 의한 Ang1 및 Ang2 둘 모두의 차단을 나타낸다(도 4A 및 도 4B 참조).
실시예 3 - 항-Tie2 항체의 기능적 분석
Tie2에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 상기 동정된 항-Tie2 항체를 추가로 분석하여 Tie2 작용제로서 기능할 수 있는 항체들을 동정하였다. Tie2 결합이 확인된 항-Tie2 IgG들의 기능적 활성을, 모두 Tie2를 발현하는 것으로 알려진 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 래트 대동맥 내피 세포(RAEC)를 사용하여 평가하였다(도 5A 및 5B 참조).
포스포-AKT(pAKT)의 자극
Tie2 활성화와 관련하여 항-Tie2 항체의 기능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. Tie2 작용제인 본 발명에 따른 Tie2 접합체는 Tie2에 결합하고 이를 활성화시켜 AKT 효소를 하류 활성화 시킬 것으로 예상된다. AKT의 활성화는 하기 기술된 바와 같이 pAKT를 생성하기 위한 AKT 단백질의 인산화에 의해 입증될 수 있다. AKT의 인산화는 인산화된 AKT에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 또는 아래 기술된 FRET 분석에 의해 결정되었다.
세포 및 항체: HUVEC는 Lonza(Catalog #CC-2517; Lonza, Ltd., Basel, 스위스)사로부터 구입했다. RAEC는 VEC Technologies사로부터 구입하고 성장 배지(카탈로그 #MCDB-131 10; VEC Technologies, Inc., Rensselaer, NY)에서 배양했다. 항-Tie2 항체는 Genentech, Inc.사(South San Francisco, CA)에서 제조되었다. 다클론 염소 항-hIgG를 가교결합제로 사용하였다(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA).
HUVEC의 제조: HUVEC(인간 혈관 내피 세포)를 트립신 처리하고 100μl 배양 배지에서 0.4 x105개 세포/웰로 멸균 96웰 플레이트(Corning® Costar®, Catalog #3997)에 씨딩하고 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 배양했다. 배양 배지를 제거하고 100μL 예열된 혈청 기아 배지(Basal Medium EndoGROTM; 카탈로그 #SCME-BM, MilliporeSigma)를 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 3시간 동안 37℃5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한 후, 항-Tie2 항체와 함께 인큐베이션하였다.
RAEC 제조: RAEC(래트 대동맥 내피 세포)를 96-웰 세포 배양 플레이트에 12,000개 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 100 μl EGM2 MV 배지(Lonza, Ltd.)에서 37°C, 5% CO2에서 밤새 배양했다. 밤새 배양한 후, 세포는 3시간 동안 0.1% BSA가 포함된 EBM2 기본 배지(Lonza, Ltd.)에서 기아 상태로 두었으며 그 후 항-Tie2 항체와 함께 인큐베이션하였다.
가교 결합 항-Tie2 항체의 효과를 테스트하기 위해 분석 완충액(기본 배지 + 0.2% BSA) 중 20μg/ml 가교 결합제(다클론 염소 항-hIgG1)를 동일한 부피의 60 μg/ml 항-Tie2 2가 항체와 혼합하고 1시간 동안 RT에서 배양하였다. 인큐베이션 후, hIgG1과 항-Tie2-IgG 항체의 혼합물을 3배 연속 희석시켰다.
다른 Tie2 항체를 테스트하기 위해, 분자들을 분석 완충액에서 초기에 높은 스톡 농도(일반적으로 30-1000μg/ml)로 희석한 다음(일반적으로 2-10배) 연속 희석했다. 혈청 기아 배지를 제거한 후 이러한 희석액(50μl)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션했다. 용액을 제거하고 포스포-AKT1/2/3 Ser473 세포 키트 (카탈로그 #64AKSPEH; Cisbio, Codolet, 프랑스)의 차단 완충액을 포함하는 용해 완충액 50μl를 세포에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 약 30-45분 동안 부드럽게 진탕하면서 인큐베이션하고, FRET 분석에 직접 사용될 때까지 또는 사용될 때까지 -80°C에서 유지시켰다.
웨스턴 블롯 분석: HUVEC 세포를 Endogro 배지에서 웰 당 1 x 106개 세포로 플레이팅하고 37°C에서 16-18시간 동안 배양했다. 배양 배지는 자극 전 4-5시간 동안 0.1% BSA Endogro 기본 배지로 교체되었다. 세포를 37°C에서 30분 동안 관련 Tie-2 작용제와 함께 인큐베이션하고 pH 7.4의 냉온 포스페이트 완충 식염수로 3회 세척했다. 세포를 얼음 위에 두고 Roche사의 완전 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Thermo Scientific, #1861281)를 함유하는 100 ul/웰의 RIPA 완충액(Sigma, #20-188)과 함께 5분 동안 인큐베이션했다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 웰로부터 용해물을 수확하고 17,800 x g에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 SDS-PAGE(8% NuPAGE Bis-Tris(Invitrogen, NW800085))로 평가한 후 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 실온에서 1시간 동안 TBS-T 중의 5% BSA로 차단하고, 차단 완충액에서 토끼 항-pAKT(Cell Signaling Technologies, #9271S)를 사용하여 탐침했다. TBS-T로 4회 세척한 후, 막들을 HRP 항-토끼 Ig(1:10,000)(GE Healthcare, NA934V)로 RT에서 1시간 동안 탐침했다. 막을 TBS-T로 3회 세척하고 실온에서 ECL 시약(Thermo Scientific, 32132)과 함께 5분 동안 인큐베이션 한 다음, 블롯을 필름에 노출시켰다.
FRET 분석: 세포 용해물(15μl)을 얼음 위에서 해동한 다음, 384웰 마이크로플레이트(카탈로그 #784080; Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC)에서 포스포-AKT Ser473 키트의 포스포-AKT d2 항체 및 포스포-AKT 크립테이트 항체 각각의 1:40 희석액 5 μl와 혼합하고, 이 플레이트들을 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 밤새 인큐베이션하고 CLARIOstar(BMG LABTECH, 소프트웨어 버전: 5.01 R2)에서 620 nm 및 665 nm에서 판독했다. 데이터는 각 개별 웰에 대한 수용체(acceptor) 및 공여체 방출 신호 X 104의 비율로 계산되었다.
Tie2 활성을 활성화할 수 있는 항-Tie2 항체를 동정하기 위하여, 상기 설명한 바와 같이 동정된 Tie-2에 결합하는 항체를 인간 IgG1(hIgG1) 항체로 포맷하고 Tie2 활성화의 하류인 AKT의 인산화를 자극하는 (pAKT를 생성하는) 능력에 대해 테스트했다. RAEC를 재조합 항-Tie2 항체(hIgG1): Tie2.1, Tie2.4, Tie2.5, Tie2.16 및 Tie.2.20으로 10분 동안 처리했다. 세포 용해물을 pAKT의 웨스턴 블롯(WB) 분석하였다. 도 6A는 항-Tie2 항체 Tie2.1 및 Tie2.20의 인큐베이션이 이러한 시험관내 세포-기반 분석에서 AKT의 인산화를 증가시켰고, Tie2.1은 Tie2.20보다 더 강한 Tie2 작용제 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
다음으로, 항-Tie2 항체의 작용제 활성에 대한 가교결합의 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 항-hIgG1 가교결합 항체는 pAKT 분석에서 Tie2.1 또는 Tie2.20과 함께 인큐베이션되었다. 도 6B에서 보는 바와 같이, Tie2.1의 가교결합은 AKT 인산화 증가에 의해 측정된 바와 같이 Tie2를 활성화하는 능력을 추가로 증가시켰다.
추가적인 작용제 항-Tie2 항체를 동정하기 위하여, HTRF 기반 분석(Cisbio)도 사용되었다. RAEC는 10분 동안 재조합 항-Tie2 항체(hIgG1)로 처리되었. 세포 용해물은 pAKT의 HTRF 분석(cisbio)을 거쳤다. 도 7A에서 보는 바와 같이, pAKT 수준을 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀진 항체(Tie2 작용제로 작용)에는 최소 Tie2.24, Tie2.31, Tie2.32, T2.33, Tie2.38 및 Tie2.1이 포함되며, Tie2.1은 강한 활성을 가진다.
항-Tie2 IgG(전장) 항체에 의한 결합 시 Tie2 활성화 수준은 부분적으로 반응 혼합물 내 IgG 분자의 비특이적 응집으로 인한 것일 수 있는 것으로 간주되었다. 도 7B에서 보는 바와 같이, 응집물 백분율이 더 낮은(예를 들어, 0.15%) Tie2.1 항체 제제에 비해 응집물 백분율이 더 높은(예를 들어, 3.5%) Tie2.1 항체 제제가 더 강한 작용제 활성을 나타내었다. 도 7B는 가교결합 항-hIgG1이 Tie2.1의 작용제 활성을 향상시켰음을 추가로 보여준다. 이론에 얽매이지 않고, 항-Tie2 작용제 항체에 의한 Tie2의 활성화는 Tie2-결합 항체의 가교결합에 의해 촉진될 수 있는 것으로 여겨진다.
실시예 4 - 나이브 파지 라이브러리로부터 유래된 항-Tie2 항체의 비닝
Tie2 수용체 단백질에 대한 항-Tie2 항체의 결합을 추가로 특성화하고 공유 에피토프를 갖는 항체를 동정하기 위해 파지 ELISA 및 Octet 측정 둘 모두를 사용하여 항-Tie2 항체의 비닝을 수행하였다.
파지 ELISA의 경우, huTie2ECD.Fc 단백질을 4℃에서 밤새 65 ul PBS에서 2 ug/ml로 Maxisorp 면역 플레이트에 고정시켰다. IgG로 포맷된 항-Tie2 항체 Tie2.1, Tie2.20, Tie2.34, 또는 항-Tie2 항체 13H10(미국 특허 제6,365,154에 기술된 항-Tie2 수용체 작용제 항체)의 연속 희석물을 PBS 중 1% BSA로 사전에 차단시키고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 고정화된 huTie2ECD.Fc와 함께 플레이트에 처리하였다. 항-Tie2 파지를 실온에서 15분 동안 0.1의 OD268nm/mL로 첨가하였다. 그 다음 플레이트를 세척하고 상기 방법을 사용하여 항-M13-접합된 HRP 2차 항체로 검출하였다. 연속 희석된 항체가 감소함에 따른 신호의 증가는 테스트 파지 항체가 연속 희석된 항체와 경쟁한다는 것을 나타내며, 이는 이들이 동일한 부위 또는 에피토프에 결합함을 시사한다.
상기 ELISA에 의해 결정된 에피토프 비닝은 Octet RED384(Pall Forte Bio Corporation, Menlo Park, CA)를 사용한 Octet 에피토프 비닝 분석 및 표준 샌드위치 형식 비닝 분석에 의해 확인되었다. 구체적으로, 스트렙타비딘 바이오센서들(Pall Forte Bio Corporation)를 비오틴화된 hTie2.ECD.Fc 단백질(10 ug/mL)로 코팅한 다음 벤치마크 항-Tie2 hIgG1(50 ug/mL Ab1, Ab20, 13H10)에 노출시키고, 그 후 제2(테스트) 항-Tie2 hIgG1에 노출시켰다. 데이터는 Forte Bio사의 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 처리되었다. 제2(테스트) 항체에 의한 추가 결합은 비어 있는 에피토프(비경쟁자)를 나타내는 반면, 결합이 없음은 에피토프 차단(경쟁자)을 나타낸다. Ab20(Tie2.20)에 대해 얻은 데이터를 사용한 실험의 예시가 도 8A 및 8B에 제공되어 있다. 다른 항-Tie2 항체에 대한 데이터는 나타내지 않는다.
ELISA 및 Octet 비닝 분석 결과를 요약하여 도 9에 도시하는데, 이는 어떤 항-Tie2 항체가 서로 경쟁하고 동일하거나 유사한 에피토프에 결합할 가능성이 있는지를 보여준다. 구체적으로, 상기 설명한 결합 분석은 파지 유래 항체 Tie2.1(Ab1), Tie2.12(Ab12), Tie2.24(Ab24) 및 Tie2.33(Ab33)이 모두 Tie2 IgG2 도메인에 결합하여 Ang1 및 Ang2의 Tie2에 대한 결합을 차단하며 Tie2 작용제임(예를 들어, AKT 및/또는 Tie2의 인산화 향상 및/또는 혈관 내피막 완전성 증가)을 입증한다.
누적적으로, 상기 결과는 본원에 기재된 항-Tie2 항체들에 의해 결합된 최소 3개의 에피토프 분류가 존재함을 나타낸다. 이들 최소 3개의 에피토프 분류는 도 9에 도시되어 있다.
항-Tie2 IgG 항체의 친화도 결정
선택된 항-Tie2 hIgG의 1가 친화도는 Biacore T200 기기(GE Life Sciences)를 사용하여 결정되었다. 항-인간Fc를 시리즈 S CM5 Biacore 센서 칩에 공유적으로 고정화시켜 항-Tie2 항체의 비공유 포획을 가능하게 하고 인간 또는 래트 Tie2ECD.flag의 결합을 다중 주기 동역학 실험 형식을 사용하여 25℃에서 실시간으로 모니터링했다. 주기들 사이에 표면을 3M MgC2로 재생시켰다. 1가 친화도는 1:1 결합 모델을 데이터에 적합시키는 Biacore 평가 소프트웨어(GE Life Sciences)를 사용하여 동역학 분석에 의해 결정되었다. 결과를 표 6에 요약한다.
표 6
Figure pct00116
실시예 5 - 항-Tie2 항체의 생체내 생성
파지 디스플레이에 더하여, 치료 용도로 유용할 수 있는 항-Tie2 항체를 동물 면역화에 의해 생성하였다.
토끼 면역화. 뉴질랜드 백색 토끼를 인간 및 cyno Tie2의 ECD(서열 번호 1, 잔기 23-442)로 면역화하고 단일 B 세포들을 공개된 문헌과 관련된 수정된 프로토콜(예를 들어, Seeber 외, PLoS ONE 9(2), 2014 참조)을 사용하여 단리했다. B 세포 배양 상청액을 인간, 래트 및 사이노Tie2 및 관련 없는 대조군 단백질에 대한 결합에 대해 ELISA로 분석하였으며, HUVEC 세포에 대한 결합에 대해 FACS로 분석하였다. Tie2 특이적 B 세포를 분자 클로닝까지 저장하기 위해 -80°C에서 즉시 동결하여 용해시켰다. 토끼 B 세포의 각 단클론 항체의 가변 영역(VH 및 VL)은 전술한 바와 같이 추출된 mRNA의 발현 벡터로 클로닝되었다(예를 들어, Seeber 외, PLoS ONE 9(2), 2014 참조). 개별 재조합 토끼 항체들을 Expi293 세포에서 발현시킨 후 단백질 A로 정제했다. 정제된 항-Tie2 항체를 기능적 활성 분석 및 동역학적 스크리닝하였다.
래트 면역화. 래트를 유사한 방식으로 면역화하고 변형된 융합 파트너를 사용하여 하이브리도마를 생성했다(예를 들어, Price 외, J Immunol Methods 31;343(1):28-41 (2009) 참조). 개별 IgG+ huTie2+ 하이브리도마를 단일 웰들에 분류할 수 있게 하는 다양한 조건들을 최적화한 다음, 분류 후 추가 배양하였다. 생성된 하이브리도마 상청액을 인간, 뮤린, 및 사이노Tie2 및 관련 없는 대조군 단백질에 대한 결합에 대해 ELISA로 분석하였고, HUVEC 세포에 대한 결합에 대해 FACS로 분석하였으며, 후속 기능 및 동역학 특성화를 위해 단백질 A를 사용하여 양성 샘플을 정제하였다.
항-IgG 가교결합제를 사용한 래트 및 토끼 클론들의 기능적 스크리닝.
전술한 바와 같이 래트 및 토끼의 면역화로부터 생성된 항체를 Tie2 작용제의 하류 pAKT 유도와 관련하여 특성화하였다.
세포 및 항체: 인간 제대 정맥 내피(HUVEC) 세포는 Lonza사(카탈로그 #CC-2517; 로트# 0000321046)로부터 구입한 반면 래트 대동맥 내피 세포(RAEC)는 VEC Technologies사로부터 구입하고 성장 배지(VEC Technologies, INC, 카탈로그# MCDB-131 10)에서 배양했다.
항-Tie2 항체는 Genentech사에서 제조되었다. 가교 링커로 사용된 종 특이적 항체는 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.사로부터 구입했다.
HUVEC의 제조: HUVEC를 트립신 처리하고 100μl 배양 배지에서 0.4 x105개 세포/웰로 멸균 96웰 플레이트(Costar 카탈로그#3997)에 씨딩하고 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션했다. 배양 배지를 제거하고 100μL 예열된 혈청 기아 배지(Basal Medium EndoGROTM; 카탈로그#SCME-BM)를 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 3시간 동안 37℃5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한 후, Tie-2 작용제와 함께 인큐베이션하였다.
RAEC의 제조:RAEC를 96웰 세포 배양 플레이트에 12,000개 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 100μl EGM2 MV 배지에서 37°C, 5% CO2에서 밤새 배양했다. 밤새 배양한 후, 세포들을 0.1% BSA가 포함된 EBM2 기본 배지에서 3시간 동안 기아 상태로 둔 다음, Tie-2 작용제와 함께 인큐베이션하였다.
가교 결합된 항-Tie2 항체를 테스트하기 위해 분석 완충액(GNE 배지 제조 시설의 기초 배지 + 0.2% BSA)에 20μg/ml의 가교 결합제를 60μg/ml에서 동일한 부피의 항-Tie2 2가 항체와 혼합하고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 항체를 3배 연속 희석하였다.
다른 Tie2 작용제를 테스트하기 위해, 분자를 먼저 분석 완충액에서 높은 스톡 농도(일반적으로 30-1000μg/ml)로 희석한 다음 연속 희석(일반적으로 2-10배)하였다. 혈청 기아 배지를 제거한 후 이러한 희석액(50μl)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션했다. 용액을 제거하고 pAKT Ser473 키트(Cisbio, 참조# 64AKSPEH)의 차단 완충액을 포함하는 용해 완충액 50ul를 세포에 첨가했다. 플레이트를 RT에서 30-45분 동안 부드럽게 진탕하면서 인큐베이션하고 사용할 때까지 또는 FRET 분석에 직접 사용할 때까지 -80°C 냉동고에 보관했다.　
FRET 분석: 세포 용해물(15ul)을 얼음 위에서 해동한 다음 384웰 마이크로플레이트(Greiner Bio-One North America, Inc., 카탈로그#784080)에서 pAKT Ser473 키트의 포스포-AKT d2 항체 및 포스포-AKT 크립테이트 항체 각각의 1:40 희석액 5 μl와 혼합하고, 이 플레이트들을 RT에서 4시간 동안 또는 4°C 냉장고에서 밤새 인큐베이션하고 CLARIOstar(BMG LABTECH, 소프트웨어 버전: 5.01 R2)에서 620nm 및 665nm에서 판독했다. 데이터는 각 개별 웰에 대한 수용체(acceptor) 및 공여체 방출 신호 X 104의 비율로 계산되었다.
재조합 항체 생성.
항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 DNA를 유전자 합성에 의해 생성하고 각각 IgG1 항체 중쇄 및 경쇄 발현을 위해 포유동물 벡터에 삽입하였다. 일부 가변 도메인 서열들은 페어링되지 않은 명백한 시스테인 잔기 및 NX[S/T] N-당화 모티프를 제거하기 위해 편집되었다. 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 포유동물 발현 벡터로 Expi293 세포를 일시적으로 형질감염시켜 재조합 항체들을 생산하였다. 중쇄 및 경쇄는 별도의 벡터에 인코딩되었고 중쇄 발현 벡터 대 경쇄 발현 벡터의 1:2 비율을 사용하여 형질감염되었다. 항체를 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 어떤 경우에는 항체가 SEC에 기반한 추가 정제 단계를 거쳤다.
항체들을 Biacore T200 기기(GE Life Sciences)를 사용하여 재조합 인간 및 cyno Tie2에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 간단히 설명하면, 시리즈 S CM5 칩, 인간 항체 포획 키트 및 아민 커플링 키트(GE Life Sciences)를 사용하여 인간 항체 포획 칩을 생성하였다. 5μg/ml로 희석된 항체들을 10μl/분의 유속과 20초의 접촉 시간을 사용하여 포획하였다. 포획된 항체에 대한 300nM 및 1500nM 재조합 인간 및 cyno Tie2 세포외 도메인의 결합을 37˚에서 유속 50μl/분, 접촉 시간 60초 및 해리 시간 120초의 단일 주기 동역학 방법을 사용하여 분석했다. 주기들 사이에, 칩을 30μl/분으로 30초 동안 주입되는 3M MgCl2를 사용하여 재생시켰다. 데이터는 Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Life Sciences)를 사용하여 평가되었다. 매개변수 RI가 0으로 설정된 1:1 결합 모델을 사용하여 동역학 상수를 얻었다. 선택된 항체(표 7A-7B; ch는 토끼 Ab를 나타내고, TEK는 래트 Ab를 나타냄)는 Fab-NDK 형식의 2차 활성 스크리닝에 넘겼다(아래 실시예 8 참조).
표 7A
Figure pct00117
Figure pct00118
표 7B
Figure pct00119
Figure pct00120
HTP 에피토프 비닝.
동물 면역화에 의해 생성된 항체 및 실시예 1에 기재된 선택 파지 유래 항체를 hIgG1 백본으로 재포맷하고 SprintX 및 Carterra 에피토프 툴 소프트웨어인 DA v6.19.3, IBIS SUIT가 장착된 CFM2/MX96 SPR 시스템(Wasatch Microfluidics, 현재 Carterra)을 사용하여 비닝을 수행했다. 항체는 10mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 고정 완충액을 사용하여 아민 커플링에 의해 SPR 센서 프리즘 CMD 200M(Xantec Bioanalytics)에 고정화되었다. CFM2 기기로 고정을 수행한 다음 SPR 기반 경쟁 분석을 위해 센서 프리즘을 IBIS MX96 기기로 옮겼다. 고정된 항체를 먼저 1μM 재조합 인간 Tie2 세포외 도메인에 노출시킨 다음 HBS-EP 실행 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4, 1mM EDTA)을 사용하여 용액 중 20ug/ml 항체에 노출시켰다. 결과를 도 11A-11B에 나타내며, 이는 여러 다른 Tie2 샌드위치 프로파일을 나타낸다. 도 11A-11B의 결과는 일반적으로 분석된 항체 패널 내 다수(예를 들어, 최소 8개)의 상이한 Tie2 에피토프들의 존재를 입증하는 것으로 해석될 것이다. 흥미롭게도, 이 데이터는 모두 Tie2 작용제로 기능할 수 있는 Tie2.1, Tie2.1M100cF(나중에 실시예 11에서 설명됨), Tie2.12 및 Tie2.24가 함께 비닝됨을 보여준다.
실시예 6 - PEG-접합된 항-Tie2 Fab 다량체 생성
상기 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 항-Tie2 항체에 의한 Tie2의 활성화는 결합된 항-Tie2 항체의 가교결합에 의해 촉진된다. 따라서, 다량체 Tie2-결합 조성물은 최적의 치료 효능을 가지게 될 다량체 배열을 결정하기 위해 설계되고 생성되었다.
사용된 다량체화의 한 방법은 각 팔이 단일 항-Tie2 Fab 분자에 연결되거나 접합되어 있는 코어로서 다중 팔 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 사용하는 것이었다. 높은 친화도로 Tie2에 특이적으로 결합하고 Tie2 작용제(Tie2와의 상호작용 시 AKT의 인산화를 활성화함)로 기능하는 것으로 나타난 Tie2.1 Fab를 사용하여 다양한 다량체 배열을 테스트했다. 구체적으로, Tie2.1 Fab는 중쇄의 C-말단이 아미노산 잔기 SPPC(서열 번호 89)를 포함하여, PEG 모이어티가 접합될 수 있는 링커 및 시스테인을 제공하도록 변형되었다. 이 “Tie2.1-SPPC” Fab는 다양한 수의 팔과 팔 길이를 갖는 PEG-말레이미드 백본에 접합되었다(다중 팔 PEG-말레이미드는 JenKem Technology USA, Plano, TX로부터 구입했다).
Fab 정제 및 탈차단
모든 크로마토그래피 수지는 GE Healthcare에서 공급되었다.
Fab는 대장균i에서 발현되었다. 대장균 펠릿을 25mM TrisHCl, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.5(EQ)에 1.5L/Kg 재현탁시키고 1000bar에서 2회 고압균질처리(microfluidized)하였다. PEI를 0.4%의 최종 농도로 천천히 첨가한 다음 4℃에서 밤새 교반하였다. 이어서, 현탁액을 15,000g에서 60분 동안 원심분리하고 상청액 0.22um를 여과하였다. 그런 다음 대장균 여과액을 30ml/분의 EQ에서 평형화된 1.2L Gammabind Plus(GBP) 컬럼에 로딩한 다음, 2 CV의 EQ로 30ml/분, 0.1% TX114 및 0.1% TX100을 포함하는 4 CV EQ로 5 ml/분으로 세척하였다. 그 다음 2 CV의 EQ로 30ml/분, pH 6.0 25mM 석시네이트 2CV로 30ml/분으로 세척하고 0.15M 아세트산으로 30ml/분으로 용리를 수행했다. 용출물이 컬럼을 빠져나올 때 1M Tris pH 9.0을 사용하여 pH 5.0으로 중화시켰다.
대안적으로, 대장균 여과액을 35ml/의 EQ로 평형화된 1.7L Capto L 컬럼에 로딩한 다음, 0.1%(v/v) Triton X114 및 0.1%(v/v) Triton X100를 함유하는 5CV의 EQ로 4ml/분, 이후 2CV의 EQ로 50ml/분, 그 후 pH 6.0 25mM 석시네이트로 50ml/분으로 세척하고, 0.15M 아세트산으로 50ml/분으로 용리시켰다. 용출물이 컬럼을 빠져나올 때 1M Tris pH 9.0을 사용하여 pH 5.0으로 중화시켰다.
중화된 GBP 또는 Capto L 용리액을 20mM 소듐 아세테이트, pH 5.0(A)으로 1 내지 3배 희석하고 양이온 교환 수지(SPHP)에 로딩하였다. 컬럼을 0.1% Triton X114 및 0.1% Triton X100을 포함하는 2CV(A) 5CV(A)로, 이후 2CV(A)로 세척한 다음, 1M NaCl (B)를 포함하는 10CV의 0-20% 구배의 (A)로 구배 용리하고 분획을 수집하였다. Fab 피크를 함유하는 분획들을 풀링하였다.
정제된 Fab 풀을 1M Tris pH 8.5를 사용하여 pH 8.0으로 조정하고 EDTA를 2mM의 최종 농도로 첨가하였다. Fab를 감소시키기 위해 50배 몰 과량의 DTT를 용액에 첨가한 다음 22℃에서 밤새 인큐베이션하고 질량 분광법으로 부가물 제거를 확인하였다.
10% 아세트산으로 pH를 5.2로 조정한 후, 환원된 Fab를 SPHP에 결합시키고, pH 5.0 25mM 소듐 아세테이트 10 CV로 세척하고, 50mM Tris, 150mM NaCl pH 8.0으로 용리시켰다. 용리된 Fab 풀은 1M Tris, pH 8.5로 pH 8.0이 되었고, 2mM EDTA가 첨가되었고 15배 몰 과량의 DHAA를 사용하여 재산화가 진행되었다. 1.5시간 후 Fab를 질량 분광법으로 재산화에 대해 확인하였고; 필요한 경우 추가로 10배 몰 과량의 DHAA를 첨가하고 샘플을 1시간 동안 인큐베이션하고 다시 확인했다. 그 다음, 재산화된 Fab를 10% 아세트산을 사용하여 pH 5로 조정하고 상기와 같이 SPHP 컬럼에서 정제하였으나, 20 CV 10-60% 구배(B = 25mM 소듐 아세테이트, 300mM 소듐 클로라이드, pH 5.0)로 용리하였으며, 주요 피크는 10kD 농축 및 0.2um 여과였다. 다른 Fab는 본질적으로 동일한 방식으로 정제 및 탈차단될 수 있다.
6량체 접합 및 정제
Tie2.1-SPPC는 25mM NaOAC, pH 5.0, 150mM NaCl, 2mM EDTA에서 JenKem의 6KDa PEG 6량체에 약 10mg/mL 농도로 접합되었다. 실온으로 평형화된 후, JenKem의 6KDa PEG 6량체를 25mM NaAcetate pH 5.0에 3mM 농도로 현탁시켰다. pH는 말레이미드가 개환하지 않도록 하기 위해 pH 6 미만으로 유지되었다. 일단 PEG가 용해되면, 이를 9:1(Fab:PEG)의 몰비로 Tie2.1-SPPC 탈차단 Fab에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 밤새 부드럽게 진탕하면서 실온에 두었다. 접합 후, Tie2.1 Fab PEG 6량체를 20mM His-아세테이트, pH 5.5, 150mM NaCl에서 Superdex-200 컬럼에서의 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제했으며, 이러한 정제 단계는 접합 혼합물로부터 과잉 Fab 및 응집을 제거한다. NuPage 4-12% Bis tris 겔 환원 및 비환원을 실행하여 6량체를 농축시키기 위해 추가로 정제할 접합체 분획을 결정했다. 접합체 분획들을 풀링하고 GE의 SP 세파로즈 고 성능 강력 양이온 교환 수지를 사용하여 양이온 교환(CEX)에 의해 추가로 정제하여 6 Fab/PEG를 농축시켰다. CEX 단계는 25mM 아세트산나트륨 pH 5.0에서 실행되었고, 44.5 CV 중의 완충액 B (완충액 B는 25mM NaOAC, pH 5.0, 300mM NaCl)에서 20% 내지 33.4%까지의 구배로, 10분에 33.4%-50%까지의 B 구배를 사용하여 용리되었고, 최종적으로 100% B로 용리하였다. 서로 다른 분획들의 몇 가지 다른 미니풀들을 상기와 같이 겔에서 실행시키고 데이터를 사용하여 풀링할 분획들을 결정한다. 미니풀 3을 풀링한 다음 PBS, pH 7.2에서 40mg/mL로 배합하였다.
그런 다음 최종 샘플을 0.2M KPO4, 0.25M KCl, pH 6.2, 완충액으로서 15% 이소프로필 알코올에서 TSKgel G3000SW xl 컬럼을 사용하여 분석 SEC에서 실행하여 존재하는 응집의 백분율을 결정했다. 이 또한 앞에서 설명한 대로 겔에서 실행되었다.
FabIgG 정제
CHO 조건화 배지를 MabSelect Sure 친화성 컬럼(GE Healthcare)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC) S200 컬럼으로 정제했다. 대안적으로 친화성 용리물을 희석하고 양이온 교환(SPHP)에 로딩한 다음 세척하고 염 구배를 사용하여 용리시켰다. 이어서 정제된 단량체 피크를 농축시키고 배합 완충액(formulation buffer)으로 투석하고 0.2 um 멸균 여과하였다.
FabIgG 및 6량체 pAKT 활성의 비교
Tie2.1.38은 Tie2를 활성화시키는 바이에피토프 Fab-IgG이다(HC는 본원에서 서열 번호 54로 제공되고, LC는 본원에서 서열 번호 53으로 제공됨). PEG-6량체 형식의 Tie2.1 (SPPC를 통해 HC의 C-말단에 연결된 6kDa PEG) 및 Tie2.1.38(IgG 형식에 의해 가교결합이 제공됨)의 능력을 평가하기 위한 실험이 수행되었다. Tie2.1-PEG-6량체에서 더 높은 효능(potency) 활성화가 관찰되었다(도 12A).
다중 팔 PEG를 통해 다량체화된 항-Tie2 Fab의 작용제 활성
10μg/ml의 PEG-다량체를 RAEC와 함께 인큐베이션하고 pAKT 수준의 변화를 설명한 바와 같이(실시예 3) 평가하였다. 팔이 더 많아짐에 따라 및/또는 팔이 더 짧아짐에 따라 활성이 더 높아지는 경향이 있으며 6-팔의 6kDa 코어 및 8-팔의 20kDa 코어는 거의 최대 활성을 나타낸다(도 12B).
실시예 7 - IgM 형식을 사용한 항-Tie2 Fab의 다량체화
항-Tie2 Fab를 다량체화하는 또 다른 방법은 IgM 형식을 사용하여 개발되었다. Tie2.1의 VH를 인코딩하는 DNA가 IgM CH1에 융합되었다. 이론에 얽매이지 않고, 다중 가변 단편(Fvs)의 열렬한 결합은 IgM이 실질적인 친화도 성숙 없이 표적에 결합할 수 있게 하는 것으로 여겨진다(Boes, 2000, Mol Immunol, 37:1141-1149).
IgM 발현 및 정제의 최적화.
인간 IgM(huIgM)은 제조사가 권장하는 바에 따라 Expi293 세포들의 30ml 배양물에서 발현되었다(예를 들어, ThermoFisher Scientific사의 “Expi293 발현 시스템, 사용자 가이드”, 발행 번호 MAN0007814 참조). 다양한 IgM 중쇄 대 경쇄(6량체) 또는 중쇄 대 경쇄 대 J-사슬(5량체) 비율을 세포 내로 형질감염시켰다. 수확된 상청액은 제조사가 권장하는 바에 따라 Capto L 수지(GE healthcare)를 사용하여 친화도 정제되었다(예를 들어, Lombana 외, 2019, mAbs, 11:1122-1138 참조). 단백질의 총 수율을 A280에 의해 평가하였고 순도는 Waters Xbridge BEH SEC 450 옹스트롬 컬럼을 사용하여 분석 SEC에 의해 평가되었다. 도 13A는 친화성 컬럼으로부터 단리된 단백질의 총 수율에 대한 다양한 huIgM 중쇄 대 경쇄 대 J-사슬(포함되는 경우) 비율의 영향을 보여준다.
LC 및 HC를 1:1 또는 2:1 비율의 플라스미드 DNA로 함유하는 플라스미드로 세포를 형질감염시켜 6량체 최적화를 진행했다. 각 비율은 유사한 총 단백질 수율을 나타내었지만 (30ml 발현에서 2.5-3mg), 존재하는 LC-이량체가 감소된 양으로 존재하는 1:1 비율에서 제품 품질이 개선된 것으로 나타났다. 추정상의 5량체 발현은 형질감염에 J-사슬을 포함시켜 수행되었다. 4:4:1의 LC:HC:JC의 최적 비율은 발현 및 제품 품질 모두를 최대화했다(도 13A-13B). 특히, 최적화된 조건에서 JC에 비해 높은 수준의 LC 및 HC DNA는 최종 IgM 5량체에서 대략 10:10:1 사슬 비율이다.
5량체 및 6량체 IgM의 발현을 위해 최적화된 사슬 비율을 가지므로, 인간 및 뮤린 6량체 및 5량체 IgM의 발현 및 정제 규모가 확장되었다. 약 20 mg/L의 정제된 6량체 또는 5량체 IgM이 CHO 세포로부터 2단계 정제를 통해 단리되었다. 이 과정에서 발현되는 IgG에 대한 일시적인 수율이 일반적인 수율보다 3-4배 낮다 하더라도, 안과 약물에 대한 낮은 재료 요건들과 함께 정제가 비교적 쉽기 때문에 제조 실현가능성은 용이해질 것이다. 인간 IgM의 사슬 조성은 LC, HC 및 JC(존재하는 경우)의 존재를 보여주는, 환원 및 탈당화된 종들의 SDS-PAGE 및 LC-MS에 의해 확인되었다. 크기 배제 크로마토그래피는 5량체 및 6량체 뮤린 IgM 및 6량체 인간 IgM에 대한 단분산 피크를 보여주었다. 5량체 인간 IgM은 SEC로부터 두 개의 밀접하게 관련된 피크들로 용리되었으며 두 피크 모두 J-사슬을 포함하고 SEC에 의해 높은 겉보기 MW를 나타낸다. 광산란으로 평가하여, 약 12nM의 유체역학적 반경(Rh)을 발견했으며, 6량체에 대한 예상 분자량(~1050kDa)이 5량체에 대한 분자량(~950kDa)을 약간 초과하였다(아래 표 9).
표 9
Figure pct00121
유체역학적 반경에 대한 회전 반경의 비율(Rg/Rh)은 분자 모양에 대한 통찰력을 제공하는데, 구형 분자는 평균이 ~0.775이고 더 긴 종들은 이 보다 더 높은 경향이 있다. 단분산 IgM은 예상한 구조와 일치하게 0.85-0.91 범위였다. IgMs 음성 얼룩의 중합체 정체성(identity)을 추가로 평가하기 위해 TEM 및 참조 없는 2D 분류를 사용하여 IgM 입자들의 구조를 설명하였으며, 이는 이들의 예상 기하와 일치하는 것으로 보인다. 추정 상의 인간 5량체에 해당하는 2개의 피크들 사이에는 명백한 차이가 관찰되지 않았다. 추가 조사를 위해 인간 IgM 6량체 피크를 선택했다. 110개의 TEM 현미경 사진을 수동으로 수집하여 총 1500개의 입자를 생성했다. Relion 제품군(Scheres, 2015, J Struct Biol, 189:114-122)을 사용하여 3회의 참조 없는 2D 분류를 수행한 후 대부분의 입자가 6량체 구조로 구조화되어 있음이 발견되었다. 소수의 입자들(<2%)은 5량체로 정제되었다. IgM 5량체에 대한 기존의 구조 조사와 일관되게(Czajkowsky and Shao, 2009, Proc Natl, Acad Sci USA, 106:14960-14965) CH3 및 CH4 도메인은 이미지 평면에 대해 직교하는 줄기 유사 도메인을 형성하는 것으로 보인다. 또한, 동일한 Fc에 부착된 Fab 쌍들은 동일 평면에 나타나는 반면, 인접한 Fc들의 Fab는 오프셋된다는 몇개의 표시가 존재한다. 부분 오프셋을 사용하면 6량체가 입체적으로 복잡한 환경에서 모든 사슬들을 수용하게 할 수 있다. 이러한 데이터에 기초하여, 향상된 생산 순도 및 JC의 부재로 인해 인간 6량체 IgM이 바람직한 치료 스캐폴드로 선택되었으며, 상기 두 가지 이유는 제작을 단순화하고 생체내 중합체-Ig 수용체 매개 결합을 고려할 필요가 없게 한다.
안구 투여를 위한 IgM의 특성화
다음으로, 뉴질랜드 백색 토끼를 모델 시스템으로 사용하여 안구에 사용하기 위한 IgM의 적합성을 조사했다. 토끼의 PK 매개변수는 이전에 사이노몰구스 원숭이 및 인간에서의 결과와 상관관계가 있었다. 항-약물 항체들이 IgM의 약동학적 평가를 방해할 위험을 최소화하기 위해 완전한 토끼 IgM 6량체(세포내 에피토프를 표적으로 하는 토끼 Fv들을 갖는 토끼 IgM Fc)가 생성되었다. 빈번한 반복 주입을 피하기 위해 주입되는 단백질의 양과 농도를 최대화한다. 따라서, 단백질 점도는 상당한 관심 대상이다. IgM 6량체의 점도는 이전에 연구된(Shatz 외, 2019, PLoS ONE, 14:e0218613-e0218613) 다른 다가 화합물, 특히, 각각 8개 및 4개 Fab로 끝나는, 8개 팔의 40 kDa 분지형 PEG 및 4개 팔의 20kDa 분지형 PEG 모두에 대비하여 평가되었다(도 13C). 3가지 종 모두에 대한 점도계 판독값은 예상한 로그 선형 응답을 보여준다. 환자의 통증이나 주사기의 과도한 배압(~10-50 cP) 없이 유리체내 투여에 도움이 되는 점도에서 IgM 질량의 약 2배를 다른 형식들과 비교하여 투여할 수 있다.
rabIgM을 SEC-MALS 분석하여 이전에 Fab에 대해 관찰된 2.5nM 반경보다 상당히 더 큰 12.9 +/- 1.1nM의 유체역학적 반경을 발견했다. 이러한 분자 크기 증가의 기능적 결과를 평가하기 위해 토끼 Fab 및 IgM을 Alexafluor 488로 표지하고 각각 0.5mg 또는 1.2mg을 뉴질랜드 백색 토끼에게 유리체내 투여했다. 28일에 걸쳐 수명을 정량적으로 형광 측정하여 2가지 치료제 각각의 지속성(durability)을 나타냈다(도 13D). 이 실험에서 Fab는 3.5일의 반감기를 보여주었으며, 이는 토끼 유리체에서 다른 Fab에 대해 관찰된 ~3.4일의 일반적인 반감기와 비등하였다(Crowell 외, 2019, Trans Vis Sci Tech, 8:1 -9). IgM은 더 큰 크기와 일관되게, 7.8일의 실질적으로 연장된 노출을 보여주었다.
IgM의 전신 노출 또한 관심 대상인데, 왜냐하면 신속한 전신 제거는 눈에 대한 안구 치료제의 활성을 제한하는 데 도움이 되기 때문이다. 혈청 또는 복수액에서 단리된 IgM에 대한 기존의 조사들에서는 수 일의 반감기를 보고한 바 있으나(예를 들어, Maiorella 외, Biotechnology(NY), 1993, 11:387-392), 재조합으로 생산된 물질은 훨씬 더 신속하게 제거된다(예를 들어, Rasche 외, 2015, Haematologica, 100:377-384). 이러한 발견을 확인하기 위해, 비결합 재조합 인간 IgM 5량체 및 6량체의 PK를 인간 혈청에서 단리된 IgM과 비교하였다(도 13E). SCID 마우스에 정맥 주사한 후, 재조합 IgM 5량체 및 6량체는 신속하게 제거된 반면(각각 0.25 및 0.50일의 t1/2), 단리된 IgM은 더 장기간의 노출을 나타내었다(t1/2 = 2.1-2.9일). IgM의 차등적인 글리칸 점유 또는 조성으로 인해 신속한 제거가 발생할 수 있다는 가설이 세워진다. 인간 5량체당 최대 51개의 N-연결 글리칸이 있고 인간 6량체당 최대 60개가 있다. 이 이론을 뒷받침하기 위해, 글리칸 분석은 인간 혈청으로부터 정제된 IgM 상의 글리칸의 75%가 최소 하나의 시알산을 함유한 반면, 재조합 6량체 및 5량체는 각각 24% 및 29% 함유함을 보여주었다(도 13F).
huIgM 돌연변이체의 보체 활성을 최소화하기 위한 단백질 조작.
IgM은 Tie-2 작용제에 바람직하지 않을 수 있는 잘 확립된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 가지고 있다. 잠재적으로 CDC를 감소시키게 될 hIgM Fc-돌연변이체를 동정하기 위해, 리툭시맙(항-CD20 항체)의 가변 영역들을 hIgM의 불변 영역들에 융합시켰다. 리툭시맙 IgG는 CDC를 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 선택된 Fc 돌연변이와 함께 이러한 리툭시맙-IgM을 hIgM 6량체로 발현시키고 정제하였다. IgM의 영향을 연구하기 위해, 본질적으로 설명된 바와 같이 보체 활성을 평가했다(예를 들어, Gazzano-Santoro 외, J Immunol Meth, 22, 163-171 (1997) 참조). 간단히 말해서, IgM의 3배 연속 희석액을 1/5 인간 보체 희석액(최종 부피 100uL)의 존재하에 50,000 Wil-2S 세포에 첨가하고 혼합물을 37°C에서 2h 동안 인큐베이션했다. Alamar Blue(Aldrich사) 50 uL를 플레이트에 첨가하고 37°C에서 추가로 5h 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 10분 동안 RT로 냉각시키고, 530nM에서 여기 및 590nM에서 방출하는 96웰 형광계를 사용하여 형광을 판독하였으며, 형광의 감소는 CDC 매개 세포 용해를 나타낸다. 4개 부위(N171Q, N332Q, N395Q, N563Q)를 공통 N-연결 당화 모티프에서의 돌연변이들과 함께 평가하였다(도 13G).
이들 돌연변이는 제작가능성 또는 전신 PK를 향상시킬 수 있지만 CDC에는 영향을 미치지 않았다. 추가로, 뮤린 IgM에 대한 CDC를 감소시키는 것으로 나타난 S406N 돌연변이(예를 들어, Wright 외, J Biol Chem, 265(18), 10506-10513, (1990) 참조)는 인간 IgM에 영향을 미치지 않았다. 중요한 것은, P434G 돌연변이체는 CDC 활성을 완전히 제거하였으므로, IgM 6량체가 안구 치료제로 유용하게 되었다.
IgM 및 PEG-6량체 활성의 비교.
안구 투여에 대한 IgM들의 적합성을 특성화한 후, 우리는 다음으로 관련 신호전달 경로를 활성화시키는 이들의 능력을 조사했다. Tie2 표적화된 IgM 6량체를 발현하고 Tie2의 하류에서 포스포-AKT 신호전달을 구동시키는 이들의 능력에 대해 분석했다. 래트 대동맥 내피 세포들을 15분 동안 내피-표적화된 Tie2.1-hIgM 6량체, Tie2.1 PEG 6량체(PEG-6량체에 접합된 SPPC로 끝나는 Tie2.1 Fab) 또는 표적화되지 않은 항-CD20 hIgM 6량체의 용량을 증가시켜 처리하고, 용해시키고, 세포내 포스포-AKT 수준을 균질한 시간 분해 형광법을 사용하여 평가하였다. 세포 포스포-AKT 수준의 증가는 Tie2.1-hIgM 및 Tie2.1 PEG 6량체에서만 관찰되었다(도 13H). 가교결합의 부재시 상응하는 IgG에 대한 활성은 나타나지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 흥미롭게도, Tie2.1hIgM 6량체 및 Tie2.1 PEG 6량체는 피코몰 농도에서 활성인 반면, pAKT 생성은 고농도에서 부분적으로 억제된다. 세포 표면에서 6량체들의 과포화는 Tie2의 클러스터링 정도를 감소시키고 결과적으로 하류 신호전달을 감소시키는 것으로 추측된다. 여전히, 100nM IgM(약 100ug/ml)에서 최대 활성의 약 30%가 달성되었다. 이러한 데이터는 Tie2.1 6량체가 최소 3자릿수 이상의 단백질 농도에서 Tie2 신호전달을 유도할 가능성이 있음을 시사한다.
실시예 8 - Tie2 작용제 항체의 동정 및 비교를 위한 대용 6량체 형식의 개발
후보 항체 스크리닝 방법의 처리량 및 관련성을 높이기 위해, 항-Tie2 Fab를 6량체 다중 팔 PEG에 접합시키기 위한 대용물로서 사용될 수 있는 동종-6량체 단백질을, 이러한 Fab 중쇄의 C-말단을 6량체의 구성요소 서브유닛의 N-말단에 유전적으로 융합시킴으로써 조사하고 동정하였다 (도 14A 참조). 이러한 융합 단백질은 정제된 Fab를 화학적으로 접합시킬 필요없이 시험관내 분석을 위한 Fab 6량체의 생산을 용이하게 할 것이라고 추론되었다. 또한, 이러한 융합 단백질은 잠재적인 새로운 항-Tie2 작용제 항체 후보들의 시험관내 활성 평가를 위해 PEG-Fab 6량체에 대한 시험관내 대용물로 사용될 수 있다.
진핵생물의 뉴클레오사이드 다이포스페이트 키나제(NDK) 효소는 동종-6량체 4차 구조를 가지며 (Lascu 외, 2000, J Bioenerg Biomembr, 32:227-236) 노출된 N-말단을 갖는다(Mor
Figure pct00122
ra 외, 1994, J Mol Biol, 243:873-890). 또한, 시스테인이 없고 열안정성이 높은 NDK 서열들이 보고된 바 있다(Akanuma 외, 2013, Proc Natl Acad Sci USA, 110:11067-11072). 이 효소 계열로부터 유래된 아미노산 서열들을, 테스트 Fab의 C-말단에 대해 유전적으로 융합시키면, PEG-Fab 6량체와 유사한 기하 구조를 가지지만 통상의 발현 및 정제 방법에 더 적합한 Fab 6량체를 발현 및 정제할 수 있다고 추론되었으며, 이는 예를 들어, HUVEC pAKT 분석에서 다수의 후보 항체들의 세포 기반 활성 분석을 용이하게 한다.
Fab-NDK 융합 단백질의 설계 및 생성.
그리하여 Tie2.1 또는 음성 대조군 항체(gD.5B6)를 인코딩하는 Fab의 중쇄 C-말단이 5개의 상이한 후보 NDK 서열들 중 하나에 유전적으로 융합되어 있는 Fab-NDK 융합 단백질들의 패널이 생성되었다. NDK 서열들을 문헌으로부터 선택하고(표 10), 아래 기재된 바와 같이 변형시키고, NDK 서열들에 융합된 Fab 중쇄를 인코딩하는 발현 벡터들을 유전자 합성을 통해 제작하였다. 중쇄 발현 벡터 대 경쇄 발현 벡터의 비율은 2:1, 1:1 및 1:2이며 각각 H2L1, H1L1 및 H1L2의 열 제목으로 표시한다. 표 10은 융합 단백질 수율을 제공한다.
표 10
Figure pct00123
*서열 번호는 NDK 펩티드 서열들에 대해서만 나타낸다
각각의 경우에 Fab HC는 아미노산 KTHT(EU 넘버링에 따라 아미노산 222-225)를 포함하고 이것으로 끝났으며, 추가적인 가요성을 제공하기 위해, Fab 중쇄와 NDK 서열들 사이에 4개의 글리신 잔기로 구성된 짧은 링커 서열이 삽입되었다. NDK 서열들은 또한 N-말단 메티오닌 잔기의 제거에 의해 그리고 촉매 활성을 비활성화시키기 위해 문헌에 보고된 돌연변이인 히스티딘 118의 페닐알라닌으로의 돌연변이에 의해 편집되었다(Postel and Ferrone, 1994, J Biol Chem, 269:8627-8630). Fab 경쇄는 추가 변형 없이 별도의 발현 벡터에 인코딩되었다.
Expi293 세포를 Fab-NDK 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 공동 형질감염시키고, 카파 경쇄를 함유하는 항체 단편의 정제를 위해 고안된 친화성 크로마토그래피 수지 Capto L 수지(GE Healthcare)를 사용하여 생성물들을 정제하였다. Fab-NDK3 및 Fab-NDK5 융합 단백질은 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하기 위해 선택되었고, 생성된 샘플의 순도는 포스페이트 기반 실행 완충액(200mM KH2PO4, 250mM KCl, pH 7.0) 및 TSK3000 컬럼(Tosoh Biosciences)을 사용하여 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 확인되었다.
Fab-NDK3 또는 Fab-NDK5로 포맷된 Tie2.1의 유체역학적 반경은 다각도 광 산란법(multi-angle light scattering, MALS)에 의해 결정되었고 그 결과는 아래 표 11에 요약되어 있다. Fab-NDK3 또는 Fab-NDK5로 포맷된 Tie2.1의 유체역학적 반경은 Tie2.1 PEG-Fab 6량체에 대해 별도로 결정된 것과 유리하게 비교된다는 것은 분명하다.
표 11
Figure pct00124
Tie2.1 Fab-NDK 구조체들의 기능적 평가
그런 다음 Fab-NDK3 및 Fab-NDK5 형식을 실시예 3에 기재된 방법을 사용하여 HUVEC pAKT 분석에서 Tie2 활성화에 대해 평가하였다. Tie2.1 및 음성 대조군 항체는 Fab-NDK3 및 Fab-NDK5 형식의 HUVEC pAKT 분석에서 Tie2 활성화에 대해 평가되었다. 결과는 도 14B에 제공된다.
Fab-NDK3 및 Fab-NDK5 형식의 Tie2.1은 PEG-Fab 6량체 형식의 Tie2.1과 유사한 반응 프로파일을 보여주었다. 음성 대조군 항체는 Fab-NDK3 형식으로 평가할 때 완충액 및 음성 대조군 PEG-Fab 6량체와 같은 다른 음성 대조군과 유사한 반응 프로파일을 나타내었지만 Fab-NDK5 형식으로 평가할 때 이러한 음성 대조군 항체는 일부 농도에서 pAKT 신호전달을 일으켰다. 따라서 우리는 새로운 항-Tie2 항체의 2차 스크리닝을 위해 Fab-NDK3 형식을 사용하기로 결정했으며 더 일반적으로는 PEG-Fab 6량체에 대한 시험관 내 대용물로 사용하기로 결정했다.
HUVEC pAKT 분석에서 Tie2 작용에 대한 단백질 6량체 스크리닝.
HUVEC 세포에서 pAKT 신호전달의 활성화에 대해 대용 6량체 Fab-NDK3 형식의 항-Tie2 항체들을 스크리닝했다. 2가지 예외를 제외하고 항체들은 8가지 농도에서 평가되었으며, 이는 최고 농도 30μg/ml로부터 3배 희석으로 구성되며 3자릿수 이상을 포함한다. 2가지 예외는 샘플 이용가능성으로 인한 것이며 더 낮은 농도에서만 평가되었던 TEK-1053과 Fab-NDK3 형식으로 생성할 수 없었던 ch18E7이 그것이다. 도 14A에 의해 입증된 바와 같이, Tie2.1 Fab-PEG 6량체의 활성은 Tie2.1 Fab-NDK 분자의 활성과 매우 유사하여, NDK 6량체 접합체가 6량체 PEG 접합체에 대한 대용물로서 효과적임을 확인시켜 준다. 따라서, NDK 6량체 형식은 다량체로서 다양한 항-Tie2 항체 Fab들의 작용제 활성을 평가하는 데 유용하다(예를 들어, 도 14A 및 도 14B 참조).
실시예 9 - Tie2의 세포 수준에 대한 항-Tie2 항체의 효과
본원에 상세히 기재된 바와 같이, 항-Tie2 작용제 항체들의 치료적 사용은 부분적으로 Tie2 수용체 단백질에 대한 항체의 결합에 의존한다. 따라서, 세포 샘플 또는 동물에 대한 항-Tie2의 투여가 Tie2 단백질 수준에 임의의 영향을 미치는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 생성된 항-Tie2 항체들을 포함하는 조성물들을 상기 기재된 바와 같이 평가하고 HUVEC를 사용하여 시험관내에서 세포 Tie2 수준의 감소를 유도하는 이들의 능력에 대해 비교하였다.
Tie2 수준에 대한 항-Tie2 항체의 효과에 대한 시험관내 분석.
HUVEC(Millipore, 카탈로그#SCCE001)를 Endogro 배지에서 6웰 플레이트에 웰 당 1x106개로 씨딩했다. 항-Tie2 항체들을 10ug/ml의 최종 농도로 첨가하고 37℃에서 16-18시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포들을 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척하고, 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제의 칵테일(Thermo Scientific, 카탈로그#1861281)이 보충된 100ul RIPA 완충액(Sigma, 카탈로그#20-188)에서 얼음 위에서 용해시켰다. 세포 용해물들을 10분 동안 4°C에서 14,000rpm으로 원심분리한 후, 항-Tie2 웨스턴 블롯(WB) 분석을 수행했다. 마우스 항-Tie2 1차 항체(BD, 카탈로그#557039) 및 2차 검출 항체(HRP 항-마우스 Ig, GE Healthcare, 카탈로그#NA931V)를 사용하여 표준 WB 분석을 수행했다. 그 결과를 도 16A - 16C에 나타내었다. 도 16A에 도시된 바와 같이, 동물 면역화에 의해 생성된 항-Tie2 항체(래트 항체 TEK-1A5, TEK-166, TEK-535, TEK-1248, TEK-69, TEK233-V2 및 토끼 항체 ch1B7.C90Q, CH6H6.3)는 6량체 형식으로 평가할 때 WB에서 검출된 바와 같이 Tie2 수준을 유의하게 감소시켰다. 대조적으로, 항-Tie2 결합제 Tie2.12, Tie2.24, Tie2.1.M100cF 및 Tie2.1-PEG-6량체는 Tie2 단백질 수준에서 훨씬 더 작은 감소를 유발했다(도 16A - 16C).
Tie2 수준에 대한 항-Tie2 항체의 효과에 대한 생체내 분석.
생체내 분석에서 Tie2 수준에 대한 항-Tie2 항체의 효과를 평가하기 위해, 8-9주령 C57BL/6 마우스(Charles River)에 20 mg/kg의 Tie2 작용제를 IP 주사를 통해 투여하였다. 마우스들을 항-Tie2 항체 투여 후 상이한 시점에서 CO2하에 안락사시켰다. 마우스 폐 조직들을 해부하고 급속 동결 후 -80°C에서 보관했다. 약 20mg의 마우스 폐 조직을 프로테이나제 및 포스파타제 억제제의 칵테일(Thermo Scientific, 카탈로그#1861281)을 함유하는 1ml의 얼음처럼 차가운 RIPA 완충액(Sigma, 카탈로그#20-188)에서 균질화하였다. 원심분리에 의한 정화 후, 2차 검출 항체로서 HRP 항-마우스 IgG Ab(GE Healthcare, 카탈로그#NA931V)와 함께 마우스 항-Tie2(BD, 카탈로그#557039)를 사용하여 조직 용해물들의 WB 분석을 수행했다. WB 막은 화학발광(EC) 시약들(Thermo Scientific, 카탈로그#32132)을 사용하여 개발되었다. 도 17에 도시된 바와 같이, Tie2 단백질 수준의 감소에 대한 Fab2.1 PEG 6량체 항체의 효과는 항-Tie2 Fab-IgG 1.38에 의해 유발된 효과보다 훨씬 적다.
실시예 10 - 항-Tie2 항체의 보호 효과
내피 완전성에 대한 항-Tie2 작용제의 효과
Tie2 활성화의 보호 효과는 내피 장벽의 파괴를 감소시키는 것으로 가정된다. HUVEC 투과성 분석을 사용하여 현재 개시된 항-Tie2 작용제 항체, Tie2.1의 내피 세포(EC) 누출을 측정하였다. 분석 방법은 도 18A에 도시되어 있다.
HUVEC 세포(Millipore, 카탈로그# SCCE001)를 완전한 Endogro 배지(Millipore, 카탈로그# SCME002)에서 24 트랜스웰 플레이트(Millipore, 카탈로그#: ECM644)에 웰 당 0.1x106개로 씨딩했다. 3일 후 배양 배지를 기본 Endogro 배지로 교체하여 16시간 인큐베이션하였다. 그 다음, 작용성 Tie2 항체, 10 ug/ml를 첨가하였다. 30분 또는 16-18시간의 인큐베이션 후, FITC-덱스트란(Sigma, 카탈로그# FD40), 50 ul의 5 mg/ml를 각 삽입물에 첨가하였다. 서로 다른 시점에서 각 웰의 수용기 트레이에서 50ul의 배지를 취하여 마이크로플레이트 판독기(여기 필터: 485nm, 방출 필터 535nm)로 측정했다.
결과는 도 18B에 제시되어 있는데, Tie2.1 PEG 6량체가 HUVEC 세포를 기아-유도 누출로부터 보호하는 데 효과적임을 보여준다. 작용제 Tie2 리간드인 재조합 Ang1을 양성 대조군으로 사용하였다.
Tie2 작용제의 전신 투여를 이용한 생체내 혈관 투과성 분석.
5-8주령의 Balb/c 마우스들(Charles River)에게 복강내(IP) 또는 정맥내(IV) 주사를 통해 Tie2 작용제를 투여했다. 18시간 후, 1%의 에반스 블루(Sigma, 카탈로그#206334)를 IV 주사를 통해 제공했다. 10분 후, 마우스들을 이소플루란으로 마취하고, VEGF(자체 생산)를 마우스 귀에 주사하였다. VEGF 주사 30분 후, 동물을 CO2로 안락사시키고 마우스 귀를 절제하였다. 귀 조직들로 유출된 에반스 블루를 포름아미드(Sigma, 카탈로그#47670-1L-F)로 추출하고 620 nm에서 분광광도계로 정량하였다. 분석 방법은 도 19A에 도시되어 있다. 도 19B에 도시된 바와 같이, Tie2.1-PEG-6량체는 귀 조직들로의 에반스 블루의 누출을 감소시킨다.
Tie2 작용제의 국소 투여를 이용한 생체내 혈관 투과성 분석.
5-8주령 Balb/c 마우스들(Charles River)에게 IV 주사를 통해 1%의 에반스 블루(Sigma, 카탈로그#206334)를 투여했다. 10분 후, 마우스들을 이소플루란하에 마취시키고, 항-VEGF G6.31 또는 Tie2 작용제인 6량체 PEG Fab2.1을 VEGF(자체 생산)와 함께 마우스 귀에 피내 주사하였다. 30분 후, 마우스를 CO2로 안락사시키고 마우스 귀를 절제하였다. 귀 조직들로 유출된 에반스 블루를 포름아미드(Sigma, 카탈로그#47670-1L-F)로 추출하고 620 nm에서 분광광도계로 정량하였다. 분석 프로토콜은 도 20A에 도시되어 있다. 도 20B는 Tie2.1-PEG-6량체가 VEGF-유도된 혈관 투과성을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
Tie2 작용제의 전신 투여를 이용한 생체내 혈관 투과성 분석.
5~8주령의 Balb/c 마우스들(Charles River)에게 항-Tie2 Fab-IgG 1.38을 복강 내를 통해 투여했다. 7일 후, 폐 조직들을 수확하고 웨스턴 블롯으로 Tie2 단백질 수준에 대해 분석하였다(도 21A).
5 내지 8주령의 Balb/c 마우스들(Charles River)에게 항-Tie2 Fab-IgG 1.38을 복강 내를 통해 투여했다. 4시간 내지 24시간 후, 1%의 에반스 블루(Sigma, 카탈로그#206334)를 IV 주사를 통해 제공했다. 10분 후, 마우스들을 이소플루란으로 마취하고, VEGF(자체 생산) 또는 LPS(Sigma, 카탈로그#L3012)를 마우스 귀에 주사하였다. VEGF 또는 LPS 주사 30분 후, 마우스들을 CO2로 안락사시키고 마우스 귀를 절제하였다. 귀 조직들로 유출된 에반스 블루를 포름아미드(Sigma, 카탈로그#47670-1L-F)로 추출하고 620 nm에서 분광광도계로 정량하였다. 도 21B는 항-Tie2.1.38 IgG 항체가 VEGF-유도된 혈관 투과성을 감소시켰음을 보여준다.
VE-카드헤린 및 F-액틴에 대한 항-Tie2 작용제의 효과.
HUVEC 세포(Millipore, 카탈로그#SCCE001)를 완전한 Endogro 배지의 4웰 챔버 슬라이드에 웰 당 0.2x106개로 씨딩했다. 3일 후, 배양 배지를 기본 Endogro 배지로 교체하였다. 3시간의 인큐베이션 후, 10ug/ml Tie2 작용제 항체를 첨가하였다. 항체 처리 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척하고 실온(RT)에서 20분 동안 3% 파라포름알데하이드(PFA)(Electron Microscopy Sciences, 카탈로그#15710-S)로 고정시켰다. 고정된 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 3회 세척하고 RT에서 10분 동안 0.1% Triton-PBS로 투과시켰다. 차단 완충액(10% 정상 당나귀 혈청 + PBS + 0.1% Triton-X100)으로 RT에서 1시간 동안 차단한 후, 세포들을 1:250으로 희석하여 마우스 항-인간 VE-카드헤린(BD, 카탈로그#555661)과 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션했다. Alexa Fluor™633 팔로이딘(Invitrogen, 카탈로그#A22284)을 F-액틴 염색에 사용했다. 슬라이드들을 RT에서 PBS-T로 5회 세척한 다음 1:500 희석한 Alexa Fluor 549 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch, 카탈로그#715-505-150)로 RT의 암실에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 슬라이드를 PBS-T로, 4회, 이후 PBS로, 2회 RT에서 세척했다. 그런 다음 슬라이드를, Prolong Gold 변색 방지 시약(Invitrogen, 카탈로그#P36930)을 함유하고 1:10000으로 희석한 5mg/ml의 DAPI(Sigma, 카탈로그# D9542-1MG)로 RT에서 10min 동안 염색하였다. Leica 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 얻었다. 도 22는 항-Tie2 Tie2.1-PEG-6량체 또는 Tie1.1.38에 대한 노출이 동적 세포-세포 접합부로부터 선형 세포-세포 접합부까지 변화시켰으며 (상부 패널) F-액틴 스트레스 섬유를 감소시키고 피질 액틴을 증가시켰음(하단 패널)을 보여준다.
실시예 11 - 치료용 Tie2 결합 분자의 설계
안정성, 예를 들어, 화학적 안정성 및 산화 안정성은 생존가능 치료제에 중요하다. 최적의 제조, 보관 및 생체 내 반감기를 가질 수 있는 치료제를 설계할 때 고유한 생물학적 제제의 안정성 특성을 이해해야 한다.
화학적 안정성.
단백질 발달성 및 생체내 안정성 모두에 대한 화학적 안정성을 평가하기 위해, Tie2.1 Fab(서열 번호 90을 갖는 HC, 서열 번호 25를 갖는 LC)를 낮은 이온 강도 히스티딘 완충액으로 완충제 교환하고 1 mg/ml로 농축시키거나, 포스페이트 완충 식염수(PBS) pH 7.4로 완충제 교환하고 1mg/ml로 농축하거나, 또는 폴리소르베이트를 포함하는 높은 이온 강도 아르기닌 완충액으로 완충제 교환하고 150mg/ml로 농축시켰다(예를 들어, Xu 외, Mol Pharm, 2018, 15:4529 -4537 참조). 샘플들을 40º히스티딘 완충액) 또는 37℃(PBS)에서 2주 동안 배양하고 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 이미지화된 모세관 등전점 집속법(iCIEF)으로 주요 피크의 소멸 및 추가 피크의 출현에 대해 분석했다. 열-스트레스 받은 물질들을 또한 트립신, 키모트립신 및/또는 LysC로 분해시키고 CDR 잔기를 함유하는 펩티드들은 아스파라긴 탈아미드화 및/또는 아스파라긴산 이성질화의 증거에 대해 LC-MS/MS로 분석되었다.
이러한 조건하에서, 히스티딘 완충액 중 1 mg/ml의 Tie2.1 Fab는 SEC로 분석시 주요 피크의 소실이 없었고 iCIEF로 분석시 주요 피크의 1.3% 소실을 보여주었다. 150 mg/ml에서는, 각각 0.3% 및 3.0% 소실을 보였다. PBS 스트레스 하에서 주요 피크들의 0.1% 및 9.6%가 소실되었다. CDR에서 검출가능한 모든 아스파라긴과 아스파라긴산은 테스트된 조건하에서 0.2% 미만 변형 수준 변화를 보였다.
Tie2.1의 산화안정성
단백질 발달성과 생체 내 안정성 모두에 대한 산화 안정성을 평가하기 위해, Tie2.1 Fab(상기와 동일)를 낮은 이온 강도의 히스티딘 완충액으로 완충제 교환하고 2,2'-아조-비스-(2-아미디노프로판) 다이하이드로클로라이드(AAPH)로 스트레스를 가했다 (예를 들어, Xu 외, 2018, Mol Pharm, 15:4529-4537 참조). 스트레스를 받은 물질들을 또한 트립신, 키모트립신 및/또는 LysC로 분해시키고 CDR 잔기를 포함하는 펩티드는 메티오닌 및/또는 트립토판 산화의 증거에 대해 LC-MS/MS로 분석되었다.
이러한 조건하에서 Tie2.1 Fab는 W98 및 W100a 산화의 39.3% 증가 및 M100c 산화의 3.1% 증가를 보여주었다.
산화 안정성이 향상된 변이체 설계
Tie2.1 W98 및 W100a의 여러 변이체들이 hIgG1 형식으로 발현 및 정제되었다. 항-Tie-2 변이체들을 염소 항-인간 IgG Fc와 가교결합시키고, 혼합물을 20 ug/ml 및 7 ug/ml 최종 농도에서 래트 대동맥 내피 세포에 이중으로 첨가하였다. 포스포-AKT 수준의 변화를 상기 설명한 바와 같이 평가하고(실시예 3) 포스포-AKT 신호의 평균 변화로서 플롯팅했다.
도 23은 Tie-2의 하류에서 포스포-AKT 신호전달을 유발하는 것에 대한 Tie2.1 hIgG1의 트립토판 98 및 100a 변이체의 영향을 보여준다. W98에서 테스트된 돌연변이들은 이 25개 세트에서 활성을 유지하지 않았다. 단일 지점에서 W100a의 여러 돌연변이들이 활성을 유지하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 최소 변이체 Tie2.1.W100aL, Tie2.1.W100aK, Tie2.1.W100aM, Tie2.1.W1001F, Tie2.1.W100aY, Tie2.1.W100aR, Tie2.1.W100aN, Tie2.1.W100aN, .W100aN, Tie2.1.W100aQ, Tie2.1.W100aH는 포스포-AKT 신호전달(Tie2 작용제로 작용)을 활성화하는 능력을 유지한다.
2개의 W100a 변이체(W100aL 및 W100aK)는 C-말단 SPPC 서열을 갖는 Fab로서 발현되었고 설명한 바와 같이(실시예 6) 6개 팔의, 6kDa PEG-코어에 접합되었다. 다양한 농도의 PEG-6량체를 1차 인간 망막 미세혈관 내피 세포(ACBRI 181, Cell Systems Inc., Kirkland, WA)와 함께 인큐베이션하고, 포스포-AKT 수준의 변화를 설명한 바와 같이(실시예 3) 평가했다. W100aL 및 W100aK 모두 더 낮은 농도에서 약간 감소된 활성을 나타낸다(도 24).
실시예 12 - 항-Tie2 항체 접합체의 생체내 연구
사이노몰구스 원숭이에 대한 비임상 연구를 수행하여 항-Tie2 항체 접합체의 투여를 견딜 수 있는 대상체의 능력을 평가하고 임의의 부작용이 발생했는지를 결정하였다. 6kDa PEG-말레이미드 6량체 코어를 갖는 Tie 2.1 Fab-SPPC(서열 번호 89를 갖는 HC 및 서열 번호 25를 갖는 LC)를 수컷 사이노몰구스 원숭이 2마리의 양쪽 눈에 2주마다(총 3회) 50 ul 유리체내(ITV) 주사 (2mg 용량)로 투여하였다. 투약은 전문의 자격이 있는 수의 안과 의사에 의해 투여되었다. 임상 투여를 모방하기 위해 눈의 아래관자 사분면(infero-temporal quadrant)에 투여했다. 동물들을 5주 동안 관찰하였으며 내약성 평가는 포괄적인 임상 안과적 평가(세극등 생체현미경, 간접 검안경 및 안압 측정), 눈의 임상 및 해부학적 병리학을 기반으로 하였다.
이러한 5주 ITV 반복 투여 연구는 이들 원숭이에서 6kDa PEG-말레이미드 6량체 코어가 있는 Tie 2.1 Fab-SPPC를 사용한 투여가 내약성이 좋다는 것을 보여주었다. 일시적인 안구 염증은 3일차에 최고였으며 8일차까지 감소하고 반복 투여에 따라 감소했다. 안구 조직병리학적 평가에서 언급된 최소 내지 경미한 단핵 염증 세포 침윤물은 인간화 단백질에 대한 면역원성 반응과 일치했다.
실시예 13 - 항-Tie2 항체 접합체의 생체내 연구
또 다른 전임상 연구에서 항-Tie2.1 PEG-6량체의 안구 PK를 2 mg/눈으로 단일 유리체내(ITV) 양측 주사 후 수컷 사이노몰구스 원숭이에서 연구하였다. 본 연구는 유리체액, 방수 및 혈청에서 Tie2.1 PEG-6량체의 수준을 측정하기 위해 수행되었다. 추가로, 생체내 Tie2.1 Fab 분자의 산화 및 이 분자의 생체외 활성에 대한 산화의 효과에 대해 유리체내 샘플들을 평가하였다. 동물 진료는 동물복지법, 실험동물의 관리 및 이용에 관한 지침, Covance의 실험동물복지진흥원에 따라 이루어졌다.
항-gD Fab 6량체-SPPC가 대조군으로 사용되었으며 이 또한 동일한 용량 수준(2 mg/눈)으로 테스트되었다. 별도의 동물 그룹에 Tie2.1 PEG-6량체를 IV 경로로 4 mg/동물로 투여하였다. 체중이 2 내지 4kg이고 대략 2 내지 4연령인 나이브 수컷 사이노몰구스 원숭이를 투여 그룹에 할당했다. ITV 투여 그룹의 경우, 테스트 및 대조 품목을 마취된 동물의 각 눈에 단일 ITV 주사를 통해 투여하고 최대 21일 동안 관찰하였다. 안구 용량 투여는 오른쪽 눈에 대략 7시 위치, 왼쪽 눈에 대략 5시 위치에 수의 안과 의사에 의해 수행되었다. 주사 부피는 50 μL/눈으로 제한되었다. ITV 투여 후, PK 추정을 위한 안구 샘플(유리체액 및 방수) 수집을 위해 1일차(투여 후 4시간), 2일차(테스트 품목 그룹만), 7일차, 14일차 및 21일차에 동물들을 안락사시켰다(2마리 동물/그룹/시점). 또한 PK 추정을 위해 모든 생존 동물로부터 혈액 샘플들을 0.25시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일 및 21일차에 혈청 분리장치 튜브들에 수집하였다. IV 그룹의 경우, 용량을 복재정맥을 통해 투여하고 PK 추정을 위해 0.083시간, 0.25시간, 0.5시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 10일, 14일, 21일차에 비말단 혈액 샘플을 채취하였다(안구 샘플은 없음). 혈액 샘플들을 수집 후 60분 동안 방치하고 원심분리시켜 혈청을 2D 바코딩된 튜브에 따라내었다.
모든 혈청 샘플은 인간 IgG ELISA를 사용하여 약물 농도에 대해 분석될 때까지 -70°C에서 보관되었다. Nunc® MaxiSorp™384-웰 플레이트(Nalge Nunc International, Rochester, NY)를 코팅 완충액(0.05M 카보네이트/바이카보네이트 완충액 pH 9.6)에 희석시킨 0.5 μg/mL 양 항-인간 IgG 항체 (Binding Site, San Diego, CA, USA)로 코팅하고 4°C에서 밤새 인큐베이션했다. 플레이트를 세척 완충액(PBS 완충액 중 0.5% Tween-20, pH 7.4)으로 3회 세척하고 RT에서 1 내지 2시간 동안 차단 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin, pH 7.4)으로 처리했다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 샘플 희석제(PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20/5mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35M NaCl/15ppm Proclin, pH 7.4)에 희석시킨 샘플들을 웰에 첨가하고 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척한 후, 검출 항체, 염소 항-인간 IgG(H+L)-홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA)를 분석 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin/0.05% Tween 20, pH7.4)에 100ng/mL로 희석하고 웰에 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 진탕기에서 인큐베이션한 다음 세척 완충액으로 6회 세척하고 TMB 퍼옥시다제 기질(Moss Inc., Pasadena, Maryland)을 사용하여 20분 동안 전개시킨 1M 인산을 전개시켜 다음 반응을 중단시켰다. 흡광도는 620 nm의 기준 파장에 대해 450 nm에서 측정되었다. 샘플들의 농도는 표준 곡선의 4-매개변수 적합으로부터 외삽되었다. 기록가능한 분석 범위는 0.16 - 5ng/mL이다(LLOQ는, cyno 혈청의 경우 2ng/mL, 방수 및 유리체액의 경우 16ng/mL).
또한 항-약물 항체(ADA) 추정을 위한 혈청 샘플들을 모든 그룹으로부터 -7일, 7일, 14일 및 21일차에 수집하였다. ADA는 Nunc® MaxiSorp™384-웰 플레이트(Nalge Nunc International, Rochester, NY)에 코팅 완충액(0.05M 카보네이트/바이카보네이트 완충액 pH 9.6) 중 1ug/mL의 항-Tie2 6량체 또는 항-gD 6량체를 직접 코팅하여 결정하였으며 및 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액(PBS 완충액 중 0.5% Tween-20, pH 7.4)으로 3회 세척하고 RT에서 1 내지 2시간 동안 차단 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin, pH 7.4)으로 처리했다. 플레이트를 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 다음, 샘플 희석제(PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20/5mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35M NaCl/15ppm Proclin, pH 7.4)에 희석시킨 샘플들을 웰에 첨가하고 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척한 후, 검출 항체, 염소 항-인간 IgG(Fcγ)-홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 분석 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin/0.05% Tween 20, pH7.4)에 80ng/mL로 희석하고 웰에 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 진탕기에서 인큐베이션한 다음 세척 완충액으로 6회 세척하고 TMB 퍼옥시다제 기질(Moss Inc., Pasadena, Maryland)을 사용하여 20분 동안 전개시킨 1M 인산을 전개시켜 다음 반응을 중단시켰다. 흡광도는 620 nm의 기준 파장에 대해 450 nm에서 측정되었다. 컷포인트는 나이브 개별 동물들의 분포를 기반으로 통계적으로 유도된다. 결과는 각 샘플에 대한 역가를 보고하며, 이는 해당 희석의 로그값이고, 여기서 샘플 OD가 컷포인트 OD를 가로지른다. 이 분석의 최소 희석은 1:100이다. <2.0의 로그 역가는, 최소 희석에서 컷포인트 미만을 의미하며, 그러므로 해당 동물은 음성이다.
상기 언급한 그룹들 외에도 항-gD Fab 6량체와 Tie2.1 PEG-6량체를 함께 ITV 주사로 투여(10분 간격; Tie2.1 PEG-6량체, 이후 항-gD Fab 6량체)한 안구 콤보 그룹도 이 연구에서 테스트되었다. 이 그룹의 목적은 테스트 품목의 사전 투여에 따른, 대조군의 안구 PK에 대한 잠재적 영향을 평가하는 것이었다. 두 화합물 모두 단일 제제 그룹에서와 동일한 용량 수준(즉, 2 mg/눈)으로 투여되었고 이들 그룹의 용량 부피는 100 μL/눈(두 화합물 포함)으로 제한되었다.
항-Tie2 Fab 6량체 농도의 수준은 항-Tie2 ELISA로 결정되었다. Nunc® MaxiSorp™384-웰 플레이트(Nalge Nunc International, Rochester, NY)를 코팅 완충액(0.05M 카보네이트/바이카보네이트 완충액 pH 9.6)에 희석시킨 1.0 μg/mL 재조합 인간 Tie2 (Abcam, Cambridge, MA)로 코팅하고 4°C에서 밤새 인큐베이션했다. 플레이트를 세척 완충액(PBS 완충액 중 0.5% Tween-20, pH 7.4)으로 3회 세척하고 RT에서 1 내지 2시간 동안 차단 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin, pH 7.4)으로 처리했다. 플레이트를 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 다음, 샘플 희석제(PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20/5mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35M NaCl/15ppm Proclin, pH 7.4)에 희석시킨 샘플들을 웰에 첨가하고 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척한 후, 검출 항체, 염소 항-인간 IgG(H+L)-홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA)를 분석 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin/0.05% Tween 20, pH7.4)에 100ng/mL로 희석하여 웰에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 진탕기에서 인큐베이션했다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고 TMB 퍼옥시다제 기질(Moss Inc., Pasadena, Maryland)을 사용하여 20분 동안 전개시킨 1M 인산을 전개시켜 다음 반응을 중단시켰다. 흡광도는 620 nm의 기준 파장에 대해 450 nm에서 측정되었다. 샘플들의 농도는 표준 곡선의 4-매개변수 적합으로부터 외삽되었다. 기록가능한 분석 범위는 0.31 - 10ng/mL이다(LLOQ는, cyno 혈청의 경우 6ng/mL, 방수 및 유리체액의 경우 31ng/mL).
항-gD Fab 6량체 농도의 수준은 항-gD ELISA로 결정되었다. Nunc® MaxiSorp™384-웰 플레이트(Nalge Nunc International, Rochester, NY)를 코팅 완충액(0.05M 카보네이트/바이카보네이트 완충액 pH 9.6)에 희석시킨 1.0 μg/mL gD (자체 제작, Req 361937)로 코팅하고 4°C에서 밤새 인큐베이션했다. 플레이트를 세척 완충액(PBS 완충액 중 0.5% Tween-20, pH 7.4)으로 3회 세척하고 RT에서 1 내지 2시간 동안 차단 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin, pH 7.4)으로 처리했다. 플레이트를 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 다음, 샘플 희석제(PBS/0.5% BSA/0.05% Tween 20/5mM EDTA/0.25% CHAPS/0.35M NaCl/15ppm Proclin, pH 7.4)에 희석시킨 샘플들을 웰에 첨가하고 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척한 후, 검출 항체, 염소 항-인간 IgG(H+L)-홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA)를 분석 완충액(PBS/0.5% BSA/15ppm Proclin/0.05% Tween 20, pH7.4)에 100ng/mL로 희석하고 웰에 첨가하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 진탕기에서 인큐베이션한 다음 세척 완충액으로 6회 세척하고 TMB 퍼옥시다제 기질(Moss Inc., Pasadena, Maryland)을 사용하여 20분 동안 전개시킨 1M 인산을 전개시켜 다음 반응을 중단시켰다. 흡광도는 620 nm의 기준 파장에 대해 450 nm에서 측정되었다. 샘플들의 농도는 표준 곡선의 4-매개변수 적합으로부터 외삽되었다. 기록가능한 분석 범위는 0.31 - 10ng/mL이다(LLOQ는, cyno 혈청의 경우 6ng/mL, 방수 및 유리체액의 경우 31ng/mL).
매트릭스 전반에 걸친 농도-시간 데이터의 PK 분석은 명목 시간 및 용량에 따라 비구획 분석 방법(Phoenix WinNonlin 버전 6.4, Pharsight Corp, Mountain View, CA)을 사용하여 수행되었다. Tie2.1 PEG-6량체 및 항-gD Fab 6량체 모두 안구 구획에서 비등한 PK 프로파일을 나타냈다. 두 화합물에 대한 반감기는 유리체액에서 약 5일이었고 방수에서 약 4일이었다(표 12). 이것은 Shatz 외, (2016, Mol Pharm, 13:2996-3003) 및 Crowell 외, (2019, Transl Vis Sci Technol 8(6):1)에 의해 제안된 크기 기반 안구 동역학과 일치하며 여기서 저자들은 토끼에서 ITV 주사 후 생물학적 제제의 안구 PK가 주로 분자 크기, 즉 Rh에 의해 영향을 받는다는 것을 보여주었다(상기 Shatz 외, 2016).
도 25는 수컷 사이노몰구스 원숭이에서 단일 유리체내 또는 정맥내 투여 후 항-Tie2.1 Fab 6량체 및 항-gD Fab 6량체의 약동학적 프로파일을 제공한다.
표 12는 수컷 사이노몰구스 원숭이에서 단일 유리체내 또는 정맥내 투여 후 항-Tie2.1 Fab 6량체 및 항-gD Fab 6량체의 약동학적 매개변수들을 상세히 기재한다.
표 12
Figure pct00125
IV - 정맥내; ITV - 유리체내; NA - 해당 없음.
Cmax, AUC 및 CL은 값 ± SE로 기재됨(가능한 경우).
그룹 1에는 항-gD Fab 6량체 (40 mg/mL)가 투여되었다.
그룹 2에는 항-Tie 2.1 Fab 6량체(40mg/mL)가 투여되었다.
그룹 3에는 항-gD Fab 6량체 (4 mg/mL)가 투여되었다.
흥미롭게도, 항-gD 6량체 Fab의 PK는 반감기가 4일에서 5일 사이인 혈청들을 포함하여 모든 매트릭스에 걸쳐 비등했다. 이와 대조적으로, 항-Tie2.1 Fab 6량체는 안구 대 혈청 구획에서 뚜렷히 구분되는 PK 프로파일을 가졌다, 즉, 안구 PK(반감기 4 내지 5일)에 비해 상대적으로 빠른 전신 PK(혈청 반감기 약 2.3일)를 가졌다. 이론에 얽매이지 않고, 본 연구의 관찰결과(ITV 투여 후 항-Tie2.1 Fab 6량체의 빠른 전신 PK)은, 일반적으로 표적 매개 약물 배치(TMDD)라 불리는, PK에 영향을 주는 약물-표적 상호작용에 기인할 수 있다. 안구 구획 외에도 표적(Tie2)은 혈관 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 안구 조직과 비교하여, 혈관 조직이 풍부한 특성으로 인해, TMDD의 영향은 안구 구획이 아닌 혈청 구획에서 더 분명할 수 있다. 혈청 샘플의 ADA 분석은 최소 ADA가 테스트 및 대조군 품목 모두에서 관찰되었으며 혈청 PK에 대해 ADA의 영향이 명백히 없음을 보여주었다. 안구 동역학에 대한 영향을 평가하기 위해 ADA 샘플을 수집하지 않았다. 안구 매트릭스 내 PK에 대한 ADA의 영향은 이 연구에서 조사되지 않았다. 또한 IV 볼루스 투여 후 혈청에서 Tie2.1 PEG-6량체의 PK는 대략 0.3일의 반감기로 표시된 바와 같이 비교적 더 빨랐다. IV 및 IVT 투여 후 혈청 반감기의 이러한 차이는 ITV 투여 후 Tie2.1 PEG-6량체에서 혈청 내 플립-플롭 동역학(flip-flop kinetics)의 발생을 분명히 입증했다. Tie2.1 PEG-6량체의 절대 생체이용률은 ITV 투여 후 29%였다. 이 연구에서 ITV 투여 그룹의 결과는 ITV 이후의 혈청 PK가 새로운 형식에 대한 안구 PK를 항상 적절하게 나타내는 것은 아닐 수 있음을 시사한다. 따라서, 혈청 PK 외에도, 특히 새로운 형식 및 작용 기전에 대한 안구 PK의 조사가 안구 치료제용 분자 선택에 중요하다.
콤보 그룹(항-gD Fab 6량체 + Tie2.1 PEG 6량체 공동 투여)의 두 화합물의 PK는 매트릭스 전체에서 각각의 단일 제제 치료 그룹과 비등했다(데이터는 도시되지 않음). 공동 투여는 모든 매트릭스에서 두 화합물들 중 어느 하나의 PK에도 주목할만한 영향을 미치지 않았다.
생체 내 연구의 샘플들에서 생체 내 Tie2.1 PEG-6량체 탈접합 생성물 정량
탈접합 생성물의 하한 정량.
Tie2.1 PEG-6량체를 사이노몰구스 원숭이에게 유리체내 투여한 후 생성된 Tie2.1 PEG-6량체 탈접합 생성물들을 모세관 전기영동 레이저 유도 형광(CE-LIF)을 사용하여 정량화했다. Tie2.1 PEG-6량체 및 그 분해물의 정량 하한을 평가하기 위해 Tie2.1 PEG-6량체, Tie2.1 PEG-5량체 및 비접합 Tie2.1 Fab 단량체 표준물들을 제조하고, 1:1:1 질량비로 혼합하고, 500 μg/mL 내지 10 μg/mL 범위의 다양한 농도의 PBS 완충액 또는 VH 매트릭스에 스파이크하였다. 샘플들은 약간 변형된 이전에 보고된 프로토콜을 사용하여 제조되었다(Salas-Solano 외, 2006, Anal Chem, 78:6583-6594). 간단히 말해서, 샘플은 먼저 1:1의 부피비로 pH 6.7에서 Na3PO4와 혼합되었다. 그런 다음 4% 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 150mM N-에틸말레이미드(NEM)를 샘플 혼합물에 첨가하고 70°C에서 5분 동안 인큐베이션했다. 실온으로 냉각한 후, 3-(2-퓨로일)퀴놀론-2-카르복스알데하이드(FQ) 염료(ThermoFisher Scientific)를 첨가한 다음 포타슘 시아나이드를 첨가하였다. 그런 다음 샘플 혼합물을 50˚에서 10분 동안 인큐베이션했다. 실온으로 냉각한 후, 샘플들을 PA 800 플러스 모세관 전기영동 기기(Sciex)에 로딩하였다. CE-LIF 방법은 이전에 설명되었으며(Michels 외, 2007, Anal Chem, 79:5963-5971), 생체 내 샘플에 대한 감도를 최대화하기 위해 샘플 주입 시간을 약간 수정하였다. LIF 검출의 경우 여기 파장은 488 nm이고 검출 파장은 600 nm였다.
도 26에 도시된 바와 같이, 완충액 스파이크-인 실험에서, 6량체, 5량체 및 단량체는 모든 스파이크-인 농도로부터 얻은 중첩된 전기영동그림 상에서 잘 분리되었다.
적분된 피크 면적을 사용하여 각 종들의 존재비 백분율(%)을 계산했다. 1:1:1 질량비 완충액에서의 상이한 스파이크-인 농도에 따른, 온전한 Tie2.1 PEG-6량체, Tie2.1 PEG-5량체 및 Tie2.1 Fab 단량체의 상대 백분율이 하기 표 13에 제시되어 있다(다른 미량의 종들은 표시되지 않음).
표 13
Figure pct00126
이러한 데이터는 6량체, 5량체 및 단량체 Fab가 10μg/mL까지 일관되게 정량화될 수 있음을 시사한다(이 경우 1:1:1에 가까운 비율). 매트릭스 단백질 간섭 때문에, 단량체 피크는 도 27에 도시된 바와 같이 VH 스파이크-인 실험의 상대적 정량화에 포함되지 않았다. 그러나 6량체와 5량체 피크는 잘 분리되었으며 이들의 큰 크기 그리고 이후의 이동 시간 덕분에 중첩된 전기영동그림에서 눈에 띄지 않는 매트릭스 간섭을 보여주었다.
적분 피크 면적을 사용하여 두 종들의 상대 존재비를 계산했을 때, 5량체 대비 온전한 6량체의 비율은 아래 표 14에서 보는 바와 같이 일관되게 1:1에 근접하였다.
표 14
Figure pct00127
cyno 약동학 샘플에서 항-Tie2 6량체 및 그 분해물들의 상대적 정량.
Tie2.1 PEG-6량체 및 이의 분해물들은 상기 설명한 사이노몰구스 원숭이 연구의 샘플들에서 측정되었다. 1일, 3일, 8일, 15일 및 22일차를 포함한 여러 시점에서 cyno 원숭이의 유리체액(VH) 조직으로부터 PK 샘플들을 수집하였다. 수집된 샘플은 상기 설명한 것과 동일한 방식으로 처리되었다. 상이한 시점에서 수집된 PK 샘플들로부터 얻은 오버레이된 CE-LIF 전기영동그림이 도 28에 도시되어 있으며, 이 도면에는 상이한 시점들의 Tie2.1-PEG-6량체 PK 샘플들이 오버레이되어 있다.
온전한 6량체 피크 및 분해물 5량체 피크를 적분 피크 면적을 사용하여 정량화하고 아래 표 15에 나타내었다(다른 미량의 종들은 정량화했지만 데이터는 나타내지 않음).
표 15
Figure pct00128
항-Tie2 6량체 및 5량체 상대 존재비를 도 29에 도시된 상이한 시점에 대해 플롯팅하였다. 이러한 결과는 출발 물질에 약간의 5량체가 있었고 생체 내에서 탈접합이 발생하여 오량체의 상대 존재비가 더 증가했지만 8일차에 안정화되었음을 시사했다.
사이노몰구스 샘플에서 얻은 Tie2.1-PEG 6량체의 분석적 특성화.
Tie2.1 접합체의 산화를 평가하기 위해 사이노몰구스 원숭이의 샘플들을 분석하였다. Tie2.1 접합체의 아미노산 잔기 수준에 존재하는 산화의 검출 및 정량은 다음과 같이 결정하였다. Tie2.1 접합체를 함유하는 40 uL 생물학적 매트릭스(예를 들어, 유리체액)를 80 uL의 변성 용액(denaturing solution)(8M 우레아, 25mM 1,4-디티오트레이톨, 100mM 암모늄 바이카보네이트, 모두 물에 용해가능)과 혼합하였다. 혼합물을 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 10 uL의 500mM 아이오도악타미드를 혼합물에 첨가하고 혼합물을 25℃암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 0.1 mg/mL 농도(물에서)의 10 uL Asp-N(Promega)을 혼합물에 첨가하였다. 추가로, 180 uL의 물을 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.2 mg/mL 농도(물에서)의 10 uL 트립신/Lys-C(Promega)를 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 35 uL의 혼합물을 Thermo Orbitrap Elite MS에 연결된 Waters Nanoacquity LC에 주입하였다. 수집된 원시 데이터는 Thermo Fisher Scientific BioPharma Finder 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 소프트웨어를 사용하여, 아미노산 수준에서의 변형(예를 들어, 산화)을 고해상도 질량 데이터와 CID 단편화 데이터를 조합하여 확인하였다. 구체적으로, +16 Da(또는 정수배)의 질량 이동을 관찰함으로써 산화를 확인하였다. 탠덤 MS(CID 단편화 모드)를 사용한 펩티드 시퀀싱을 통해 구체적인 위치를 결정했다. 데이터는 생체내 산화의 특정 위치가, 도 30A의 M100c에 있었음을 보여주었다 (또한 본 명세서에서 서열 번호 22의 위치 107에서 M으로 개시됨). 사이노몰구스 원숭이로부터 얻은 샘플의 이러한 샘플 분석에서 트립토판 잔기의 산화가 관찰되지 않았다.
또한, CID 단편화 후 특징적인 -64 Da 질량 이동을 관찰함으로써 메티오닌 산화를 확인하였다. 산화된 종들과 관련된 이온 강도를 나이브(산화되지 않은 종)의 이온 강도로 나누어 MS를 통해 정량을 측정했다. 정량 데이터는 도 30B에 도시되어 있으며, 이 도면은 2개의 상이한 사이노몰구스 원숭이의 눈에서 놀라울 정도로 높은 M100c의 산화 정도를 보여준다. M100c의 산화 정도가 시험관 내에서 관찰되지 않았기 때문에 이러한 데이터는 예상치 못한 것이었다(실시예 11 참조).
시험관내 Tie2.1의 활성에 대한 M100c 산화의 효과.
Tie2.1 M100c의 산화가 이러한 항-Tie2 분자 기능을 감소시킬 수 있음을 확인하기 위해, Tie2.1에 산화 조건을 적용하여 M100c에서 산화된 이들 분자를 생성했다. 항-Tie2 Fab 및 6량체의 제조물을 20mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5로 완충제 교환하였다. 두 샘플들 모두 1mg의 단백질/ml로 희석되었다. 30%(w/v) 과산화수소를 물에 희석하여 5%(w/v) 스톡 용액을 제공했다. 과산화수소 스톡 용액을 각 샘플에 첨가하여 0.06%(w/v)의 최종 H2O2 농도를 제공했다. 각 샘플의 개별 분취량에 동일한 부피의 완충액을 스파이크하여 대조군으로 사용했다. 모든 샘플들을 빛으로부터 보호하고 5℃에서 15시간 동안 인큐베이션했다. 20배 몰 과량의 L-메티오닌을 첨가하여 산화 반응을 퀀칭한 다음 PD-10 컬럼을 사용하여 탈염시켰다. 6량체의 산화 정도는 전술한 LC-MS 방법을 사용하여 약 65%인 것으로 결정되었다. 다양한 농도의 산화된 6량체, 완충액 처리된(산화되지 않은) 6량체 및 다양한 대조군을 이전에 설명한 pAKT 분석에 의해 평가했다. 산화는 도 31에서 보는 바와 같이 산화된 물질의 활성을 대략 50%만큼 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
cyno 유리체액으로부터 단리된 6량체의 특이적 활성.
6량체 기능에 대한 생체내 산화의 영향을 이해하기 위해, 활성 Tie2.1 PEG-6량체의 양은 cyno 유리체 샘플들의 활성 대 cyno 유리체 단리물에 투여된 투여 용액의 표준 곡선을 비교하여 결정되었다. 이 수치들을 (상기 설명한) ELISA에 의해 발견된 농도와 비교하였다. 도 32는 ELISA에 의해 결정된 Tie2.1 PEG-6량체의 양 및 pAKT 분석에 의해 결정된 해당 분자의 총 활성을 나타낸다. 도 33은 사이노몰구스 유리체 샘플로부터 단리된 Tie2.1 PEG-6량체의 비 활성(specific activity)을 나타낸다. 정규화된 활성(활성 농도/총 농도)은 상기 cyno 유리체에서 21일에 걸쳐 비 활성의 점진적인 소실을 보여주며, 그 결과 최종 시점에서 47%의 활성이 남아 있게 된다.
실시예 14 - 안정한 Tie2.1 M100c 변이체의 선택
VH 잔기 M100c가 19개의 대체 천연 아미노산 각각으로 대체된, Tie2.1의 19개 변이체들을 인코딩하는 인간 IgG1 중쇄 발현 벡터들을 유전자 합성을 사용하여 생성하였다. Tie2.1 변이체들은 원하는 중쇄 및 경쇄 서열들을 인코딩하는 발현 벡터로 Expi293 세포들을 일시적으로 동시-형질감염시켜 IgG 형식으로 발현되었으며, 항체 단백질들을 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
Tie2.1 hIgG1 변이체에 대한 재조합 인간 및 cyno Tie2의 결합은 Biacore T200 기기(GE Life Sciences)에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 평가되었다. 시리즈 S CM5 칩(GE Life Sciences), 인간 항체 포획 키트 및 아민 커플링 키트를 사용하여 인간 항체 포획 칩을 제조하였다. 실행 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 1mM EDTA, pH 7.4)에서 5μg/ml로 희석된 항체들은 20초의 접촉 시간 및 10μl/분의 유속을 사용하여 비공유적으로 포획되었다. 300 nM 및 1500 nM 재조합 Tie2에 대한 결합은 접촉 시간 60초, 해리 시간 120초 및 유속 50μl/분으로 단일 주기 동역학 방법을 사용하여 37°C에서 분석되었다. 주기들 사이에, 30μl/분의 유속으로 3M MgCl2를 30초 주입하여 표면을 재생시켰다. 항체 포획 수준 및 분석물 결합 수준에 대한 값은 리포트 포인트 테이블 (Report Point Table)(Biacore 평가 소프트웨어 v3.0, GE Life Sciences)에서 얻었다. 센서그램을 항체 포획 수준에 대해 정규화한 다음, 관찰된 Tie2 결합 신호의 크기를 비교함으로써 결과들을 분석하였다. 결과는 분석물 결합 반응(임의의 반응 단위로 측정)을 항체 포획 수준(임의의 반응 단위로 측정)으로 나누어 계산된 정규화된 결합 신호로 나타낸다. Tie2.1 및 Tie2.1 변이체에 의한 재조합 Tie2 ECD에 대한 결합의 SPR 분석 결과를 제공하는 2개 실험들의 결과를 나타낸다. 표 16: 실험 A; 표 17: 실험 B.
표 16
Figure pct00129
표 17
Figure pct00130
Tie2.1.M100cF의 설계.
SPR에 의한 VH.M100c 변이체의 초기 스크리닝은 여러 다른 아미노산이 Tie2에 대한 결합을 유지하면서 잔기 VH.M100c를 대체할 수 있음을 나타낸다(상기 참조). 인간 생식세포 항체 서열들은 종종 파지 유래 항체 Tie2.1의 VH.M100c에 해당하는 위치에 메티오닌(M) 또는 페닐알라닌(F)을 포함한다(www.IMGT.org, Giudicelli 외, 2005, Nucleic Acids Res, 33:D256-D261). 따라서 우리는 변이체 Tie2.1.M100cF가 다른 변이체들보다 항-약물 면역 반응을 유발할 가능성이 낮을 수 있다고 추론하고 이 변이체를 더 면밀히 분석했다.
Tie2.1.M100cF의 고해상도 친화성 평가.
M100cF 돌연변이가 인간 및 cyno Tie2에 대해 유사하거나 개선된 친화도를 갖는 항체를 생성한다는 것을 확인하기 위해, 결과의 분해능을 개선하기 위해 의도된 다수의 변형들을 사용하여 상기 기재된 SPR 실험을 반복하였다. Tie2.1 및 Tie2.1 변이체 hIgG1 항체들을 0.5μg/ml로 희석하고 15초, 30초 및 45초 각각의 접촉 시간을 사용하여 비공유적으로 포획하여, 테스트된 각 항체에 대해 3가지 다른 표면 밀도를 생성했다. 재조합 인간 및 cyno Tie2에 대한 결합은 60초의 접촉 시간, 60초의 해리 시간, 100μl/분의 유속 및 5μM, 2.5μM, 1.25μM, 625nM, 313nM 및 156nM의 Tie2 농도를 사용하여 고성능 다중 주기 동역학 형식을 사용하여 분석되었다. 5 μM, 2.5 μM 및 1.25 μM의 Tie2 농도를 2회 주입했다. 결과는 Biacore T200 평가 소프트웨어 v3.0(GE Life Sciences)을 사용하여 분석되었다. 3가지 표면 밀도 모두로부터 얻은 결과는 다중 Rmax와 RI 매개변수가 0으로 설정된 1:1 결합 모델을 사용하여 함께 분석되었다. Tie2.1 및 Tie2.1.M100cF 둘 모두에 대한 인간 Tie2 결합에 대해 높은 신뢰도(Rmax1, Rmax2, Rmax3, ka 및 kd에 대한 T 값 > 100)로 동역학 상수들을 얻었다(표 18).
표 18
Figure pct00131
동일한 데이터 세트들의 정상 상태 분석은 동역학적 분석을 통해 얻은 것들과 유사한 KD 값들을 생성했다(표 18). ka, kd 및 KD에 대한 유사한 값들이 재조합 cyno Tie2에 대한 결합에서 관찰되었다(표 19).
표 19
Figure pct00132
실시예 15 - 변이체 항-Tie2 PEG 접합체의 분석
본원에 제공된 내용은 다중 팔 모이어티에 접합되고 Tie2 활성을 활성화할 수 있는 항-Tie2.1 항체를 포함하는 조성물이 눈 장애를 치료하는 것과 같은 유익한 활성 및 치료적 가치를 갖는다는 것을 입증하지만, 안정성을 포함한 최적의 성질들을 가지는 접합체를 동정하는 것이 바람직하다. 이러한 이유로, 다른 Tie2.1 PEG 6량체 접합체를 설계하고 테스트하여 다양한 접합 부위들의 효과를 평가하였다. 이 실시예에서, 6kDa PEG-6량체 말레이미드는 Fab 단백질 내의 전략적 위치들에 시스테인을 함유하도록 조작된 Tie2.1 Fab(ThioFabs)에 접합되었다.
표시된 위치에서 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 잔기를 교체하여 시스테인을 도입했다(예를 들어, HC T120C는 Tie2.1M100cF의 HC가 위치 120의 Thr이 Cys로 변경되도록 조작되었음을 의미한다). “SPPC”는 중쇄 C1 도메인의 C 말단이 Tie2.1M100cF의 위치 226-229(EU 넘버링)의 잔기 CPPC가 SPPC로 변경되도록 조작된 ThioFab 분자를 나타낸다.
변이체 Tie2.1M100cF ThioFab 분자는 도 39에 도시된 코어 구조를 갖는 상업적으로 구입가능한 말레이미드-작용기화된 6-팔 PEG(JenKem Technology, No. 6ARM(DP)-MAL-6000)와 접합되었다.
변이체 Tie2.1M100cF 접합체들을 제조하고 4주 동안 37℃에서 1 mg/ml의 농도로 보관되었다. 실시예 13에 기재된 바와 같이 탈접합을 측정하였다. 21일에 걸쳐 각 접합체의 탈접합 퍼센트를 측정하였다. 결과는 도 34에 제공된다.
이들 접합체 각각의 활성을 실시예 3에 기재된 바와 같이 HUVEC pAKT 분석을 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 35A 및 35B에 나타내었다.
실시예 16 - 변이체 항-Tie2 PEG 접합체의 생체내 안정성
상기 기재된 변이체 항-Tie2 PEG 접합체의 생체내 안정성을 연구하기 위해, 단일 용량 연구에서 사이노몰구스 원숭이에게 투여하기 위해 3개를 선택하였다. 3개의 접합체는 Tie2.1M100cF Fab-SPPC, Tie2.1M100cF, LC T206C 및 Tie2.1M100cF, HC T209C였다. 구체적으로, 양측 주사가 2 mg/눈으로 투여되었다. 총 18마리의 동물이 3개의 그룹에 포함되었다: 그룹 1: Tie2.1M100cF Fab-SPPC가 투여된 6마리의 동물; 그룹 2: Tie2.1M100cF, LC T206C가 투여된 6마리의 동물; 그룹 3: Tie2.1M100cF, HC T209C가 투여된 6마리의 동물. 평가에는 접합체 안정성 분석 이외에 안구 및 혈청 PK, 혈청 ADA 및 혈압(그룹 1의 동물 2마리)이 포함되었다.
혈청, 유리체액 및 방수 샘플들의 PK 프로파일들이 도 36에 제공되며 PK 매개변수들은 표 20에 보고되어 있다.
Tie2.1M100cF HC-T209C Fab-PEG 6량체의 경우 방수에서 약간 더 낮은 Cmax가 관찰된 것과 같은 사소한 차이가 존재하지만, (유리체액 및 방수 내) 전체 안구 PK는 테스트된 3개 모두의 접합체 간에 대체로 비등하다. 3개의 접합체 모두는 안구 구획들에서 상대적으로 더 긴 체류 시간을 보였고(t1/2 범위는 3.20 내지 3.76일임) 원숭이 유리체액에서 보고된 전형적인 Fab t1/2에 비해 상대적으로 더 높은 t1/2(~2-3일, Genentech사의 ITV 연구에서 사이노몰구스 원숭이의 Fab를 사용한 과거 데이터에 기반(Crowell 외, (2019, Transl Vis Sci Technol 8(6):1))를 가졌으며, 이는 안구 구획들에서 6량체 접합체들의 크기 기반 PK를 나타낸다.
혈청 PK of ThioFab 접합체들(Tie2.1M100cF LC-T206C Fab-PEG 6량체 및 Tie2.1M100cF HC-T209C Fab-PEG 6량체)의 혈청 PK는 SPPC 접합체 (Tie2.1M100cF SPPC Fab-PEG 6량체) 보다 우수하다. 접합 방법의 차이로 인한 생체 내 안정성의 차이는 접합체 간의 이러한 전신 PK 차이의 유발 요인이 될 수 있다. ITV 투여 후 3가지 테스트 접합체들 모두에서 플립-플롭 동역학은 혈청(혈청 PK 기준)에서 발생할 수 있는 것으로 보이며 유리체액으로부터의 약물 방출이 혈청 구획에서 PK를 구동할 수 있는 속도 제한 단계일 수 있음을 설명한다.
표 20
Figure pct00133
Cmax 및 AUC는 값 ± SE로 기재되어 있다.
그룹 1: 항-Tie2.1_M100cF_SPPC_Fab-PEG 6량체
그룹 2: 항-Tie2.1_M100cF_LCT206C_Fab-PEG 6량체
그룹 3: 항-Tie2.1_M100cF_HCT209C_Fab-PEG 6량체
*: 유리체액의 경우 CL, 방수 및 혈청의 경우 CL/F
a: Cmax는 t1/2의 계산에 사용되었다.
ThioFab 접합체의 안정성은 0, 7 및 21일차에 온전한 접합체의 백분율을 측정한 동물들로부터 채취한 유리체액 샘플을 사용하여 평가되었다. 결과는 도 37에 제시되어 있다.
샘플에서의 접합체들의 활성을 또한 0, 7 및 21일차에 측정하였다. pAkt 활성은 실시예 3에 기재된 바와 같이 pAkt FRET 분석에서 유리체액을 테스트함으로써 측정하였다. 활성 6량체는 pAkt FRET 분석에서 표준 곡선을 사용하여 정량화되었다. 도 38A 및 39A에 도시된 바와 같이, 모든 접합체는 21일차까지 유리체액에서 생체외 활성을 유지하였다.
서열 표
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
전술한 발명들을 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예를 예로 들어 상세히 설명하였으나, 이러한 예시 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 그 전체가 참조문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> TIE2-BINDING AGENTS AND METHODS OF USE <130> P35891-WO <150> 62/993930 <151> 2020-03-24 <150> 63/046318 <151> 2020-06-30 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 689 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Thr Met Thr Arg Ala Met Glu Glu Ala Leu Phe Gln His Phe 1 5 10 15 Met His Gln Lys Leu Gly Ile Ala Tyr Ala Ile His Lys Pro Phe Pro 20 25 30 Phe Phe Glu Gly Leu Leu Asp Asn Ser Ile Ile Thr Lys Arg Met Tyr 35 40 45 Met Glu Ser Leu Glu Ala Cys Arg Asn Leu Ile Pro Val Ser Arg Val 50 55 60 Val His Asn Ile Leu Thr Gln Leu Glu Arg Thr Phe Asn Leu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Val Thr Leu Phe Ser Gln Ile Asn Leu Arg Glu Tyr Pro Asn Leu 85 90 95 Val Thr Ile Tyr Arg Ser Phe Lys Arg Val Gly Ala Ser Tyr Glu Trp 100 105 110 Gln Ser Arg Asp Thr Pro Ile Leu Leu Glu Ala Pro Thr Gly Leu Ala 115 120 125 Glu Gly Ser Ser Leu His Thr Pro Leu Ala Leu Pro Pro Pro Gln Pro 130 135 140 Pro Gln Pro Ser Cys Ser Pro Cys Ala Pro Arg Val Ser Glu Pro Gly 145 150 155 160 Thr Ser Ser Gln Gln Ser Asp Glu Ile Leu Ser Glu Ser Pro Ser Pro 165 170 175 Ser Asp Pro Val Leu Pro Leu Pro Ala Leu Ile Gln Glu Gly Arg Ser 180 185 190 Thr Ser Val Thr Asn Asp Lys Leu Thr Ser Lys Met Asn Ala Glu Glu 195 200 205 Asp Ser Glu Glu Met Pro Ser Leu Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Ala 210 215 220 Ser Asp Asn Leu Ile Pro Gln Ile Arg Asp Lys Glu Asp Pro Gln Glu 225 230 235 240 Met Pro His Ser Pro Leu Gly Ser Met Pro Glu Ile Arg Asp Asn Ser 245 250 255 Pro Glu Pro Asn Asp Pro Glu Glu Pro Gln Glu Val Ser Ser Thr Pro 260 265 270 Ser Asp Lys Lys Gly Lys Lys Arg Lys Arg Cys Ile Trp Ser Thr Pro 275 280 285 Lys Arg Arg His Lys Lys Lys Ser Leu Pro Gly Gly Thr Ala Ser Ser 290 295 300 Arg His Gly Ile Gln Lys Lys Leu Lys Arg Val Asp Gln Val Pro Gln 305 310 315 320 Lys Lys Asp Asp Ser Thr Cys Asn Ser Thr Val Glu Thr Arg Ala Gln 325 330 335 Lys Ala Arg Thr Glu Cys Ala Arg Lys Ser Arg Ser Glu Glu Ile Ile 340 345 350 Asp Gly Thr Ser Glu Met Asn Glu Gly Lys Arg Ser Gln Lys Thr Pro 355 360 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Val Trp Lys Arg Glu Lys Ala Ser Lys Ile 85 90 95 Asn Gly Ala Tyr Phe Cys Glu Gly Arg Val Arg Gly Glu Ala Ile Arg 100 105 110 Ile Arg Thr Met Lys Met Arg Gln Gln Ala Ser Phe Leu Pro Ala Thr 115 120 125 Leu Thr Met Thr Val Asp Lys Gly Asp Asn Val Asn Ile Ser Phe Lys 130 135 140 Lys Val Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala Val Ile Tyr Lys Asn Gly Ser 145 150 155 160 Phe Ile His Ser Val Pro Arg His Glu Val Pro Asp Ile Leu Glu Val 165 170 175 His Leu Pro His Ala Gln Pro Gln Asp Ala Gly Val Tyr Ser Ala Arg 180 185 190 Tyr Ile Gly Gly Asn Leu Phe Thr Ser Ala Phe Thr Arg Leu Ile Val 195 200 205 Arg Arg Cys Glu Ala Gln Lys Trp Gly Pro Glu Cys Asn Arg Leu Cys 210 215 220 Thr Val Cys Val Asn Asn Gly Val Cys His Glu Asp Thr Gly Glu Cys 225 230 235 240 Ile Cys Pro Pro Gly Phe Met Gly Arg Thr Cys Glu Lys Ala Cys Glu 245 250 255 Arg His Thr Phe Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Cys Ser Gly Gln Asp 260 265 270 Gly Cys Lys Ser Tyr Val Phe Cys Leu Pro Asp Pro Tyr Gly Cys Ser 275 280 285 Cys Ala Thr Gly Trp Lys Gly Leu 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naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Xaa Ala Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 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35 40 45 Ala Glu His Arg Glu Lys Pro Phe Phe Ser Ala Leu Val Asp Tyr Ile 50 55 60 Thr Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Leu Glu Gly Lys Asn Ala Val 65 70 75 80 Glu Val Val Arg Lys Met Val Gly Ala Thr Asn Pro Lys Glu Ala Ala 85 90 95 Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Gly Leu Asp Val Gly Lys Asn Val 100 105 110 Ile Phe Ala Ser Asp Ser Pro Glu Ser Ala Glu Arg Glu Ile Ser Leu 115 120 125 Phe Phe Lys Asp Glu Glu Leu Val Glu Trp 130 135 <210> 70 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 70 Glu Arg Thr Phe Val Met Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu 1 5 10 15 Ile Gly Glu Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Lys Gly Phe Lys Ile Val 20 25 30 Ala Met Lys Leu Met Arg Ile Ser Gln Glu Leu Ala Glu Lys His Tyr 35 40 45 Ala Glu His Arg Glu Lys Pro Phe Phe Ser Gly Leu Val Asp Phe Ile 50 55 60 Thr Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Leu Glu Gly Lys Asn Val Val 65 70 75 80 Glu Val Val Arg Lys Met Ile Gly Ala Thr Asn Pro Lys Glu Ala Ala 85 90 95 Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Gly Met Ser Val Gly Lys Asn Val 100 105 110 Ile Phe Gly Ser Asp Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Glu Ile Ser Leu 115 120 125 Phe Phe Lys Asp Glu Glu Leu Val Glu Trp 130 135 <210> 71 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 71 Ser Thr Asn Lys Val Asn Lys Glu Arg Thr Phe Leu Ala Val Lys Pro 1 5 10 15 Asp Gly Val Ala Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Ala Arg Tyr Glu 20 25 30 Lys Lys Gly Phe Val Leu Val Gly Leu Lys Gln Leu Val Pro Thr Lys 35 40 45 Asp Leu Ala Glu Ser His Tyr Ala Glu His Lys Glu Arg Pro Phe Phe 50 55 60 Gly Gly Leu Val Ser Phe Ile Thr Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val 65 70 75 80 Phe Glu Gly Lys Gly Val Val Ala Ser Ala Arg Leu Met Ile Gly Val 85 90 95 Thr Asn Pro Leu Ala Ser Ala Pro Gly Ser Ile Arg Gly Asp Phe Gly 100 105 110 Val Asp Val Gly Arg Asn Ile Ile Phe Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser 115 120 125 Ala Asn Arg Glu Ile Ala Leu Trp Phe Lys Pro Glu Glu Leu Leu Thr 130 135 140 Glu Val Lys Pro Asn Pro Asn Leu Tyr Glu 145 150 <210> 72 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 Ala Asn Ser Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln 1 5 10 15 Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe 20 25 30 Arg Leu Val Gly Leu Lys Phe Leu Gln Ala Ser Glu Asp Leu Leu Lys 35 40 45 Glu His Tyr Thr Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Thr Gly Leu Val 50 55 60 Lys Tyr Met His Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala 85 90 95 Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly 100 105 110 Arg Asn Ile Ile Phe Gly Ser Asp Ser Val Lys Ser Ala Glu Lys Glu 115 120 125 Ile Ser Leu Trp Phe Gln Pro Glu Glu Leu Val Glu Tyr Lys Ser Cys 130 135 140 Ala Gln Asn Trp Ile Tyr Glu 145 150 <210> 73 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 Ala Asn Leu Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln 1 5 10 15 Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe 20 25 30 Arg Leu Val Ala Met Lys Phe Leu Arg Ala Ser Glu Glu His Leu Lys 35 40 45 Gln His Tyr Ile Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Pro Gly Leu Val 50 55 60 Lys Tyr Met Asn Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu 65 70 75 80 Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala 85 90 95 Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly 100 105 110 Arg Asn Ile Ile Phe Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys Glu 115 120 125 Ile His Leu Trp Phe Lys Pro Glu Glu Leu Ile Asp Tyr Lys Ser Cys 130 135 140 Ala His Asp Trp Val Tyr Glu 145 150 <210> 74 <211> 386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asn Lys Val Asn Lys Glu 225 230 235 240 Arg Thr Phe Leu Ala Val Lys Pro Asp Gly Val Ala Arg Gly Leu Val 245 250 255 Gly Glu Ile Ile Ala Arg Tyr Glu Lys Lys Gly Phe Val Leu Val Gly 260 265 270 Leu Lys Gln Leu Val Pro Thr Lys Asp Leu Ala Glu Ser His Tyr Ala 275 280 285 Glu His Lys Glu Arg Pro Phe Phe Gly Gly Leu Val Ser Phe Ile Thr 290 295 300 Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Phe Glu Gly Lys Gly Val Val Ala 305 310 315 320 Ser Ala Arg Leu Met Ile Gly Val Thr Asn Pro Leu Ala Ser Ala Pro 325 330 335 Gly Ser Ile Arg Gly Asp Phe Gly Val Asp Val Gly Arg Asn Ile Ile 340 345 350 Phe Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Asn Arg Glu Ile Ala Leu Trp 355 360 365 Phe Lys Pro Glu Glu Leu Leu Thr Glu Val Lys Pro Asn Pro Asn Leu 370 375 380 Tyr Glu 385 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 75 Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 Cys Asp Lys Thr His Leu 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 77 Cys Asp Lys Thr His 1 5 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 Cys Asp Lys Thr 1 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any amino acid other than Thr <400> 79 Cys Asp Lys Thr His Xaa 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 Cys Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Cys 1 5 10 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 Cys Tyr Gly Pro Pro Cys 1 5 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 Cys Pro Pro Cys 1 <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 88 Ser Pro Pro Ser 1 <210> 89 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys 225 230 <210> 90 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Trp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 <210> 91 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> Xaa is Met, Leu, Lys, Phe, Tyr, Arg, Asn, Gln, His, of Trp <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> Xaa is Phe, Tyr, Leu, Gln, Ile, Lys, or His <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Xaa Ala Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 <210> 92 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> Xaa is Met, Leu, Lys, Phe, Tyr, Arg, Asn, Gln, His, of Trp <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> Xaa is Phe, Tyr, Leu, Gln, Ile, Lys, or His <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr 20 25 30 Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ser Pro Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Arg Trp Ala Ser Xaa Ala Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Cys Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Claims (48)

  1. Tie2에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체 또는 이의 단편은:
    (a) 아미노산 서열 NTDIS(서열 번호 3)를 포함하는 CDR-H1, (b) 아미노산 서열 RISPSDGNTYYADSVKG(서열 번호 4)를 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 아미노산 서열 RTRWASX1AX2DY(서열 번호 5)를 포함하는 CDR-H3(여기서 X1은 M, L, K, F, Y, R, N, Q, H 또는 W이고/이거나 X2는 F, Y, L, Q, I, K 또는 H임)을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 (d) 아미노산 서열 RASQDVSTAVA(서열 번호 8)를 포함하는 CDR-L1, (e) 아미노산 서열 SASFLYS(서열 번호 9)를 포함하는 CDR-L2, 및 (f) 아미노산 서열 QQSYTTPPT(서열 번호 10)를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, CDR-H3은 아미노산 서열 RTRWASWAMDY(서열 번호 6)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, CDR-H3은 아미노산 서열 RTRWASWAFDY(서열 번호 7)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체, 인간화 항체, 항체 단편 및/또는 키메라 항체인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, Tie2에 결합하는 Fab 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 21의 아미노산 서열에 최소 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열에 최소 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열 번호 21의 VL 서열 및 서열 번호 20의 VH 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 조작된 시스테인을 포함하고, 여기서
    조작된 시스테인은 HC의 T120C, G166C, G178C, T187C 및 T209C로부터 선택되거나; 또는
    조작된 시스테인은 LC의 Q124C, R142C, Q155C, L201C, T206C, K107C, K126C 및 K149C에서 선택되고;
    여기서 조작된 시스테인의 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 청구항 9에 있어서, 조작된 시스테인은 HC의 T209C 및 LC의 T206C로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서, 조작된 시스테인은 LC의 T206C인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 청구항 9 또는 10에 있어서, 조작된 시스테인은 HC의 T209C인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 25의 아미노산 서열에 최소 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 아미노산 서열에 최소 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 25의 아미노산 서열에 최소 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 아미노산 서열에 최소 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열 번호 25의 서열을 포함하는 LC 및 서열 번호 55의 서열을 포함하는 HC를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, HC 불변 영역은 위치 221(EU 넘버링)에서 끝나는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. Tie-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체는 서열 번호 55의 HC 서열 및 서열 번호 25의 LC 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. Tie-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 항체는 서열 번호 23의 HC 서열 및 서열 번호 56의 LC 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
  20. 청구항 19의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  21. Tie2에 결합하는 접합체로서, 여기서 접합체는 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 따른 최소 2, 최소 3, 최소 4, 최소 5, 최소 6, 최소 7, 또는 최소 8개의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 다량체화 모이어티에 연결되는, 접합체.
  22. 청구항 21에 있어서, 접합체는 시험관내 분석에서 25% 미만, 50% 미만 또는 75% 미만의 Tie2 단백질 수준 감소를 유발하는, 접합체.
  23. 청구항 21 또는 22에 있어서, 접합체는 시험관내 분석에서 25% 초과, 50% 초과 또는 75% 초과의 Tie-2 단백질 수준 감소를 유발하지 않는, 접합체.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 모이어티는 폴리올, 폴리펩티드, 및/또는 펩티드를 포함하는, 접합체.
  25. 청구항 21 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 다량체화 모이어티는 폴리올을 포함하고, 여기서 폴리올은 이량체, 4량체, 6량체 및 8량체로부터 선택된 다중 팔(multi-armed) 폴리올인, 접합체.
  26. 청구항 25에 있어서, 다중 팔 폴리올은 6량체인 접합체.
  27. 청구항 24 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 접합체.
  28. 청구항 24 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올은 조작된 시스테인 아미노산의 유리 설프하이드릴 기를 통해 최소 2개의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 공유적으로 연결되고, 여기서 조작된 시스테인은 HC의 T120C, G166C, G178C, T187C, 및 T209C로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
    조작된 시스테인은 LC의 Q124C, R142C, Q155C, L201C, T206C, K107C, K126C 및 K149C로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 접합체.
  29. 청구항 28에 있어서, 조작된 시스테인은 LC의 T206C이고, 여기서 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 접합체.
  30. 청구항 28에 있어서, 조작된 시스테인은 HC의 T209C이고, 여기서 잔기 번호는 EU 넘버링에 따르는, 접합체.
  31. 청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 폴리올은 리신 아미노산의 유리 아미노 기를 통해 최소 1개의 항체에 공유적으로 연결되는, 접합체.
  32. 청구항 27 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 약 500 달톤(Da) 내지 약 300,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는, 접합체.
  33. 청구항 27 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 하기 화학식 (Ib)의 구조를 가지며:
    Figure pct00142

    여기서 각각의 m은 독립적으로 3-250의 정수이고; 각각의 R1은 독립적으로 부재하거나 연결기이고; 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 말단 반응기이고;
    여기서 최소 1개의 R2는 말단 반응기이고 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 공유적으로 연결되는, 접합체.
  34. 청구항 33에 있어서, 최소 1개의 R1은 연결기이고, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해질 때:
    Figure pct00143
    ;
    Figure pct00144
    ;
    Figure pct00145
    ;
    Figure pct00146
    ;
    Figure pct00147
    ;
    Figure pct00148
    ;
    Figure pct00149
    ;
    Figure pct00150
    ;
    Figure pct00151
    ;
    Figure pct00152
    ;
    Figure pct00153
    ;
    Figure pct00154
    ;
    Figure pct00155
    ;
    Figure pct00156
    ; 및
    Figure pct00157
    ; 및 이의 조합으로부터 선택되고; 여기서 각각의 i는 독립적으로 0-10의 정수이고; j는 0-10의 정수이고; R2는 티올 반응기, 아미노 반응기 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 말단 반응기인, 접합체.
  35. 청구항 33 또는 34에 있어서, 최소 1개의 R2는 말레아미드이고 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 공유적으로 연결되는, 접합체.
  36. 청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R2는 말레아미드인, 접합체.
  37. Tie2에 결합하는 접합체로서:
    하기 화학식 1(b)의 구조를 갖는 폴리올에 접합되는, 서열 번호 55를 갖는 HC 및 서열 번호 25를 갖는 LC를 포함하는 Fab를 포함하고:
    Figure pct00158
    ;
    여기서 각각의 m은 독립적으로 20-30의 정수이고, 여기서 R1 및 R2는 함께 취해져 구조
    Figure pct00159
    를 가지며, 여기서 R2는 말레아미드이고;
    여기서 폴리올은 잔기 C209(EU 넘버링)에서 Fab HC에 연결되는, 접합체.
  38. 청구항 21 내지 37항 중 어느 한 항의 접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, 추가 치료제를 추가로 포함하고, 여기서 추가 치료제는 VEGF 길항제, Ang2 길항제, HtrA1 길항제, 및 IL33 길항제, 보체 성분 길항제, 및 제2 Tie2 작용제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  40. 청구항 38 또는 39의 약학 조성물 및 이러한 조성물을 환자에게 유리체강내 전달하기 위한 수단을 포함하는 안구 전달용 장시간 작용 전달 장치로서, 여기서 이러한 조성물은 해당 부위에서 장기간 동안 유효하게 유지되는, 안구 전달용 장시간 작용 전달 장치.
  41. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 청구항 21 내지 36 중 어느 한 항의 접합체, 또는 청구항 37 또는 38의 약학 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, Tie2 경로 매개 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 Tie2 경로 매개 장애를 치료하는 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, Tie2 경로 매개 장애는 혈관 투과성 장애인, 방법.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, Tie2 경로 매개 장애는 눈 병태인, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 눈 병태는 당뇨병성 황반 부종(DME), 당뇨병성 망막병증, 건성 및 습성(비삼출성 및 삼출성) 형태를 포함하는 연령 관련 황반 변성(AMD), 맥락막 신생혈관(CNV), 포도막염, 허혈 관련 망막병증, 병리학적 근시, 폰 히펠-린다우병, 눈의 히스토플라스마증, 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 각막 신생혈관, 녹내장 및 망막 신생혈관으로부터 선택되는, 방법.
  45. 청구항 43 또는 44에 있어서, 눈 병태는 DME인, 방법.
  46. 의약으로서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 21 내지 39 중 어느 한 항의 접합체.
  47. Tie2 경로 매개 장애 및/또는 안구 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 Tie2 경로 매개 장애 및/또는 안구 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 21 내지 39 중 어느 한 항의 접합체.
  48. Tie2 경로 매개 장애 및/또는 안구 장애의 치료를 필요로 하는 대상체의 Tie2 경로 매개 장애 및/또는 안구 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 21 내지 39 중 어느 한 항의 접합체의 용도.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL296528A (en) * 2020-03-24 2022-11-01 Genentech Inc Tie2 binding agents and methods of use

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5144088A (en) 1991-04-26 1992-09-01 Aristech Chemical Corporation Manufacture of neopentyl glycol (I)
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
ZA936128B (en) 1992-08-21 1995-02-20 Genentech Inc Method for treating a LFA-1 mediated disorder
CA2149048A1 (en) 1992-11-25 1994-06-09 George N. Cox Modified insulin-like growth factors
EP0708655A1 (en) 1993-04-07 1996-05-01 Amgen Boulder Inc. Methods of using insulin-like growth factor binding proteins
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
ATE455171T1 (de) 1995-09-21 2010-01-15 Genentech Inc Varianten des menschlichen wachstumshormons
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
DE69838552T2 (de) 1997-07-14 2008-05-21 Bolder Biotechnology, Inc., Louisville Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
JP2001521909A (ja) 1997-10-31 2001-11-13 ジェネンテク・インコーポレイテッド 糖タンパク質グリコフォームを含む方法及び組成物
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
US6376653B1 (en) * 1998-09-28 2002-04-23 Smithkline Beecham Plc Tie2 antagonist antibodies
US6365154B1 (en) 1998-09-28 2002-04-02 Smithkline Beecham Corporation Tie2 agonist antibodies
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270149T3 (en) 1999-04-09 2016-05-09 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCEDURE TO CONTROL THE ACTIVITY OF IMMUNOLOGICAL FUNCTIONAL MOLECULE.
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
NZ581474A (en) 2001-08-03 2011-04-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
US20040186051A1 (en) 2001-10-02 2004-09-23 Kelley Robert F Apo-2 ligand variants and uses thereof
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
WO2003085102A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellule avec inhibition ou suppression de l'activite de la proteine participant au transport du gdp-fucose
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
KR20040040782A (ko) 2002-11-08 2004-05-13 선바이오(주) 신규한 헥사-암 폴리에틸렌글리콜과 유도체 및 그의합성방법
KR20070055625A (ko) 2002-12-16 2007-05-30 제넨테크, 인크. 이뮤노글로불린 변이체 및 이들의 용도
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
LT2348051T (lt) 2003-11-05 2019-02-25 Roche Glycart Ag Cd20 antikūnai su padidintu fc receptoriaus prisijungimo giminingumu ir efektorine funkcija
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
WO2005097832A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
KR100891620B1 (ko) 2004-04-13 2009-04-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｐ-셀렉틴 항체
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
BRPI0518994A2 (pt) 2004-12-31 2008-12-02 Biogen Idec Inc anticorpos ou polipeptÍdeos que se ligam a br3, seus usos e formulaÇÕes lÍquidas
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
WO2008049227A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Sunnybrook Health Sciences Center Multimeric tie 2 agonists and uses thereof in stimulating angiogenesis
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CN101724144A (zh) 2008-11-03 2010-06-09 北京键凯科技有限公司 新型的多臂聚乙二醇及其制备方法和应用
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
WO2010078063A1 (en) 2009-01-02 2010-07-08 Alcon Research, Ltd. In-situ refillable ophthalmic implant
AU2010208046B2 (en) 2009-01-29 2014-10-02 Forsight Vision4, Inc. Posterior segment drug delivery
CN107337734A (zh) 2009-12-04 2017-11-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 多特异性抗体、抗体类似物、组合物和方法
KR20140054303A (ko) 2011-08-19 2014-05-08 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-Ｔｉｅ２ 항체 및 이의 용도
JP6051998B2 (ja) 2012-03-30 2016-12-27 日油株式会社 マルチアーム型ポリエチレングリコール誘導体、その中間体及び製造方法
EP3495387B1 (en) 2012-07-13 2021-09-01 Roche Glycart AG Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
EP3170841A4 (en) 2014-07-15 2018-01-10 Astellas Pharma Inc. NOVEL ANTI-HUMAN Tie2 ANTIBODY
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
RS59805B1 (sr) 2014-11-07 2020-02-28 Sesen Bio Inc Unapređena il-6 antitela
WO2019235856A1 (ko) 2018-06-07 2019-12-12 기초과학연구원 Tie2에 결합하는 항체 및 이의 용도
CA3101506A1 (en) 2018-06-07 2019-12-12 Institute For Basic Science Anti-tie2 antibodies and use thereof
IL296528A (en) * 2020-03-24 2022-11-01 Genentech Inc Tie2 binding agents and methods of use

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