KR20070107687A

KR20070107687A - Ｂｒ３과 결합하는 폴리펩티드, 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20070107687A
Application number: KR1020077017604A
Authority: KR
Inventors: 크리스틴 엠. 앰브로즈; 메르세데츠 발라츠; 로라 드포지; 마크 에스. 데니스; 저메인 푸; 스티븐 디. 허스트; 칭웨이 브이. 리; 헨리 비. 로우만; 플라비우스 마틴; 제랄드 알. 나까무라; 하야 세샤세이; 멜리사 스타로바스니크; 제프리 에스. 톰슨
Original assignee: 제넨테크, 인크.; 바이오젠 아이덱 엠에이 인크.
Priority date: 2004-12-31
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2007-11-07
Also published as: EP1838735A2; IL183353A0; US20080181888A1; WO2006073941A2; AP2007004034A0; CA2595112A1; EA200701211A1; WO2006073941A3; MX2007008017A; US20100280227A1; CN101120021A; WO2006073941A9; AU2005323025A1; NO20072721L; BRPI0518994A2; JP2008526205A

Abstract

본 발명은 신규한 BR3 결합 항체 및 폴리펩티드 (이에는 길항제 및 작동제 폴리펩티드가 포함된다)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 예를 들어 치료 방법, 스크리닝 방법, 진단 방법, 검정 및 단백질 정제 방법에 있어서의 BR3 결합 항체 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

BR3, BR3 결합 항체 및 폴리펩티드, 자가면역 질환, 암, 면역결핍증

Description

ＢＲ３과 결합하는 폴리펩티드, 및 그의 용도 {POLYPEPTIDES THAT BIND BR3 AND USES THEREOF}

본 발명은 BR3과 결합하는 항체 및 폴리펩티드, 및 그의 용도에 관한 것이다.

BAFF (BLyS, TALL-1, THANK, TNFSF13B, 또는 zTNF4로서 공지되기도 함)는 B 세포 생존과 성숙에 필수적인 TNF 리간드 초분자군의 구성원이다 [참고: Mackay ＆ Browning (2002) Nature Rev. Immunol. 2, 465-475]. BAFF가 트랜스제닉 (transgenic) 마우스에서 과발현하게 되면, B 세포가 과다형성되고 중증의 자가면역 질환이 발생한다 [참고: Mackay, et al. (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710; Gross, et al. (2000) Nature 404, 995-999; Khare, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3370-33752-4]. BAFF 수준은 각종 자가면역 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus), 류마티스성 관절염 및 베게너 (Wegener) 육아종증 및 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome)에 걸린 인간 환자에게서 상승한다 [참고: Cheema, G. S, et al., (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319; Groom, J., et al, (2002) J. Clin. Invest 109, 59-68; Zhang, J., et al., (2001) J. Immunol. 166, 6-10; Krumbholz et al., ANCA Workshop, Prague, Czech Republic, 2003]. 더우기, BAFF 수준은 질병 중증도와 상관이 있는데, 이는 BAFF가 이들 질병의 발병 기전에 직접적인 역할을 할 수 있다는 것을 제시해준다. 콜라겐 유도된 관절염 (CIA), 루푸스 (예를 들어, BWFl 마우스), 다발성 경화증 [예: 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)]에 걸린 동물 모델에게 BAFF를 봉쇄시키면 해당 질병이 완화되었다. 만성 이식편 대 숙주 질병 (cGVHD) 모델에서 BR3:Fc 처리하면 cGVHD와 연관된 비종대 (splenomegaly)가 상당히 억제되었는데, 이는 B 세포 활성화를 억제시킴으로써 유발된 것이 아니라 B 세포 생존을 억제함으로써 유발된 것이다 [참고: Kalled, SL et al. (2005) Curr Dir Autoimmun. 8:206-42]. 따라서, BAFF 봉쇄가 강력한 B 세포 성분을 수반한 기타 자가면역성 동물 모델에서 효능을 제공할 것으로 예상된다.

또한, CD4⁺ T 세포와 CD8⁺ T 세포 둘 다는 재조합 BAFF에 의해 공동-자극되어 유형 I 및 유형 II 사이토킨을 생성할 수 있고 CD25 발현을 증가시킬 수 있다고 보고되었다 [참고: Ng, LG, et al. 2004. J Immunol 173:807]. 추가로, BAFF-R:Fc는 BAFF-매개된 인간 T 세포 증식을 차단시켰다고 보고되었다 [참고: Huard, B, et al., (2000) J Immunol 167:6225]. 또한 추가로, B-림프계 악성 종양에 걸린 몇몇 환자에게서는 BAFF 수준이 상승되었다 [참고: Kern, C et al., (2004) Blood 103(2):679-88]. 한 보고서에 따르면, 가용성 BAFF 또는 APRIL를 부가하면 B-CLL 세포가 자발적 및 약물-유도된 세포자멸되지 못하게 보호되었고, NF-카파B 활성화 가 자극되었다. 역으로 말하면, 가용성 BCMA-Fc 또는 항-BAFF 및 항-APRIL 항체를 부가하면 B-CLL 세포자멸이 증강되었다 [Kern, C et al., 상기 참고]. BAFF는 악성 B 세포에 대한 필수 자가분비 생존 인자로서 작용할 수도 있다 [참고: Mackay F, et al., (2004) Curr Opin Pharmacol. 4(4):347-54]. 따라서, BAFF는 각종 질병 상태와 관련이 있어 왔다.

BAFF는 TNF 수용체 초분자군의 3가지 구성원, 즉 TACI, BCMA, 및 BR3 (BAFF-R로서 공지되기도 함)과 결합한다 [참고: Gross, et al., 상기 참고; 8. Thompson, J. S., et al., (2001) Science 293, 2108-2111; Yan, M., et al., (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552; Yan, M., et al., (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41; Schiemann, B., et al., (2001) Science 293, 2111-2114]. 이들 3가지 구성원 중에서, BR3 만이 BAFF에 대해 특이적이고; 나머지 2가지 구성원은 관련 TNF 계열 구성원인 APRIL과 결합하기도 한다. BAFF와 수용체 녹아웃 (knockout) 또는 돌연변이체 마우스의 표현형을 비교한 결과, BR3을 통한 신호전달이 BAFF의 B 세포 생존 기능을 매개하는 것으로 나타났다 [참고: Thompson, et al., 상기 참고; Yan, (2002), 상기 참고; Schiemann, 상기 참고]. 이와는 달리, TACI는 억제성 수용체로서 작용하는 것으로 여겨지지만 [참고: Yan, M., (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643], BCMA의 역할은 명확치 않다 [Schiemann, 상기 참고].

BR3은 B 세포 표면 상에서 발현된 184-잔기 유형 III 막관통 단백질이다 [Thompson, et al., 상기 참고; Yan, (2002), 상기 참고]. 세포내 영역은 공지된 구조 도메인 또는 단백질-단백질 상호작용 모티프와의 서열 유사성을 전혀 지니고 있지 않다. 조사 중인 몇 가지 계통은 BR3이 주요 수용체로서, 이를 통하여 BAFF-매개된 생존 신호가 B 세포에게 전달된다는 강력한 증거를 제공하였다 [참고: Kalled, S., et al., Curr Dir Autoimmun. 2005;8:206-42]. 이는 최근에 BAFF-R 녹아웃 마우스 (BAFF-R^-/- 마우스)의 발생에 의해 확증되었다 [참고: Shulga-Morkskaya, S. et al., (2004) J Immunol. 15;173(4):2331-41]. BR3은 다발성 골수종 및 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin' s Lymphoma)을 포함한 각종 질병 조직에서 발현된다 [참고; Novak, AJ (2004) Blood 104:2247-2253; Novak, AJ (2004) Blood 103:689-694].

발명의 요약

본 발명은 신규한 BR3-결합 폴리펩티드, 예를 들어 Fc 영역이 결여된 BR3 결합 이뮤노어드헤신(immunoadhesin), 항체 및 펩티드와, 본 발명의 방법에 있어서 그들의 예상치 못한 유익한 특성, 예를 들어 B 세포를 고갈시키기 위한 강력한 작용제, B 세포 증식과 생존을 자극시키기 위한 강력한 작용제, 치료적으로 사용하기 위한 강력한 작용제, 또는 진단용 또는 조사용으로 사용하기 위한 강력한 작용제로서의 그들의 용도를 제공한다.

본 발명은 다음 특성들 중의 어느 한 가지 특성, 특성의 모든 조합, 또는 특성 모두을 포함하는 BR3 결합 폴리펩티드를 제공한다: (1) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 특성; (2) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이 하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고 마우스 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 특성; (3) 특이적 잔기(들)를 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 특성; (4) 인간 BAFF에 대한 인간 BR3의 결합을 억제하는 특성; (5) 인간 효과기(effector) 세포의 존재하에 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 갖거나, 야생형 IgG와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 증가된 ADCC를 갖거나, 또는 야생형 IgG 또는 천연 서열 IgG Fc와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 감소된 ADCC를 갖는 특성; (6) 본원에 기재된 항체들 중의 어느 한 항체로부터 유래되는 특성; (7) 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드 보다 고 친화도로, 인간 Fc 신생아 수용체 (FcRn)와 결합하는 특성; 및 (8) 상기 항체로 처리하지 않은 적당한 음성 대조군 또는 기저 수준과 비교해서, 시험관내 또는 생체내 B 세포를 바람직하게는 20％ 이상 사멸 또는 고갈시키는 특성. BR3 결합 폴리펩티드에는 Fc 도메인 [예: 펩티보디 (peptibody)와 융합되는 BR3 (예를 들어, 파지 디스플레이로부터 유래됨)과 결합하는 펩티드가 포함된다.

한 양태에서, B 세포 표면 항원과 결합하지 않는 대조군 항체를 이용한 처리와 비교하거나 또는 처리 전의 기저 수준과 비교해서, 본 발명의 항체는 마우스 중의 다음 세포 집단 중의 어느 한 집단, 모든 조합 집단 또는 모든 집단에서 B 세포를 20％ 이상 고갈시킬 수 있다: (1) 혈액 중의 B 세포, (2) 림프절 중의 B 세포, (3) 비장 중의 소포 B 세포 및 (4) 비장 중의 연변층 B 세포. 기타 양태에서는, B 세포 고갈이 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 이상이다.

본 발명은 또한, 다음 특성들 중의 어느 한 가지 특성, 특성의 모든 조합, 또는 특성 모두을 포함하는 작동성 BR3 결합 폴리펩티드를 제공한다: (1) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 특성; (2) 인간 BR3 특이적 잔기(들) 상의 기능적 에피토프를 갖는 특성; (3) 시험관 내에서 B 세포 증식을 자극하는 특성; (4) 인간 BAFF에 대한 인간 BR3의 결합을 억제하는 특성; (5) 본원에 기재된 항체들 중의 어느 한 항체로부터 유래되는 특성; (6) 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드 보다 고 친화도로, 인간 Fc 신생아 수용체 (FcRn)와 결합하는 특성; 및 (7) 생체내에서 B 세포 증식 또는 B 세포 생존을 자극하는 특성. 한 양태에 따르면, 작동성 항체는 야생형 IgG1 또는 천연 IgG1 Fc 서열 또는 9.1RF 항체와 비교해서 ADCC 기능을 덜 갖고 있거나 전혀 갖고 있지 않다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 작동성 항체는 Fc 영역에 적어도 다음 치환 D265A/N297A (EU 넘버링 시스템)을 갖고 있다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 작동성 항체는 인간 IgG4의 IgG Fc 서열을 갖는다.

한 양태에 따르면, 본 발명의 BR3 결합 폴리펩티드는 잔기 F25, V33 및 A34를 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는데, 여기서 모노클로날 항체는 9.1 항체 또는 2.1 항체가 아니다. 추가의 양태에 따르면, 이러한 기능적 에피토프는 잔기 R30을 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 BR3 결합 폴리펩티드는 잔기 P21 및 A22를 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 BR3 결합 폴리펩티드는 잔기 L38 및 R39를 포함하는 인 간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는데, 여기서 항체는 9.1 항체가 아니다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 BR3 결합 폴리펩티드는 잔기 G36을 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는데, 여기서 항체는 2.1 항체가 아니다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 BR3 결합 폴리펩티드는 잔기 V29 및 L28을 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는다. 또다른 양태에 따르면, 기능적 에피토프는 L28 및 V29를 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, L38, R39, P21 및 A22 중의 어느 하나, 모든 조합 또는 모두를 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 항-BR3 항체는 길항성 BR3 결합 항체이다. 또다른 양태에 따르면, G36을 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 항-BR3 항체는 작동성 BR3 결합 항체이다.

본 발명은 표 2의 항체; 이들 항체로부터 유래된 BR3 결합 항체; 및 BR3과 결합하고, 도면에 기재된 항체 서열의 밑줄친 부분 중의 어느 하나와의 상동성 또는 서열 목록에 기재된 CDR 또는 초가변 영역과의 상동성이 70％ 이상인 H1, H2, H3, L1, L2 또는 L3 영역을 갖는 항체를 제공한다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 BR3과 결합하고, 표 2의 항체들 중의 어느 한 항체의 H1, H2 및 H3 영역 각각과의 상동성이 70％ 이상인 H1, H2 및 H3 영역을 갖는다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 BR3과 결합하고, 표 2의 항체들 중의 어느 한 항체의 L1, L2 및 L3 영역 각각과의 상동성이 70％ 이상인 L1, L2 및 L3 영역을 갖는다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 BR3과 결합하고, 표 2의 항체들 중의 어느 한 항체의 VH 도메인과의 상동성이 70％ 이상인 VH 도메인을 갖는다.

본 발명은 잔기 QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3)을 포함하는 인간화 항-BR3 항체를 제공한다. 또다른 양태에 따르면, BR3 결합 항체는 (1) 잔기 QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3); 및 (2) 잔기 RDTSKNTF (서열 210)를 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)을 포함한다. 한 양태에서, BR3 결합 항체는 서열 35-36 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 26-35를 포함하는 HVR1 및 잔기 49-65 [카바트 (Kabat) 넘버링]를 포함하는 HVR2를 추가로 포함한다. 또다른 양태에서, 항-BR3 항체는 H1 초가변 영역 (HVR1) 중에 잔기 GFTVTAYYMS (서열 214)와, H2 초가변 영역 (HVR2) 중에 잔기 GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (서열 213)를 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 LVR1 중에 잔기 KSSQSLLYSSNQNNYLA (서열 232), LVR2 중에 잔기 WASTRES (서열 233) 및 LVR3 중에 잔기 QQSQISPPT (서열 231)를 추가로 포함한다.

또다른 양태에 따르면, 항-BR3 결합 항체는 (1) QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3); 및 (2) RDTSKNTL (서열 211)를 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)을 포함한다. 한 양태에서, BR3 결합 항체는 서열 37-73의 항체 서열 중의 어느 한 서열의 잔기 26-35 및 49-65 [카바트 넘버링]를 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 LVR1 중에 잔기 KSSQSLLYSSNQNNYLA (서열 232), LVR2 중에 잔기 WASTRES (서열 233) 및 LVR3 중에 잔기 QQSQISPPT (서열 231)를 추가로 포함한다.

또다른 양태에 따르면, 항-BR3 결합 항체는 다음 서열식 I을 포함하는 L2 초가변 영역 (LVR2)을 포함한다:

W-A-X3-X4-X5-X6-S (서열 215) (서열식 I)

상기 식에서, X3은 Q 또는 S이고; X4는 H, I 또는 T이며; X5는 L 또는 R이고; X6은 D 또는 E이며, 서열식 I은 WASTRES (서열 233)이 아니다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 결합 항체는 QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3)을 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, LVR2는 서열 23 및 25로 이루어진 군에서 선택된 항체 서열의 잔기 50-56 (카바트 넘버링)을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항체는 HVR1 중에 잔기 GFTVTAYYMS (서열 214), 및 HVR2 중에 잔기 GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (서열 213)를 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 LVR1 중에 잔기 KSSQSLLYSSNQNNYLA (서열 232), 및 LVR3 중에 잔기 QQSQISPPT (서열 231)를 추가로 포함한다.

또다른 양태에 따르면, 항-BR3 결합 항체는 다음 서열식 II를 포함하는 H1 초가변 영역 (HVR1)을 포함한다:

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Y-X9-X10 (서열 216) (서열식 II)

상기 식에서, X1은 G 또는 D, S, A, V, E 또는 T이고; X2는 L, S, W, P, F, A, V, I, R, Y 또는 D이며; X3은 P, T, A, N, S, I, K, L 또는 Q이고; X4는 M, R, V, Y, G, E, A, T, L, W 또는 D이며; X5는 A, S, T, G, I, R, P, N, D, Y 또는 H이고; X6은 G, A, S, P 또는 T이며; X7은 F, H, Y, R, S, V 또는 N이고; X9는 T, I, M, F, W 또는 V이며; X10은 T, G, S 또는 A인데, 서열식 II는 GFTVTAYYMS (서열 214)이 아니다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3)을 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, HVR1은 서열 24, 26-34, 36 및 38-73으로 이루어진 군에서 선택된 항체 서열의 잔기 26-35 (카바트 넘버링)를 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 LVR2 중에 잔기 WASTRES (서열 233)을 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 LVR1 중에 잔기 KSSQSLLYSSNQNNYLA (서열 232), LVR2 중에 잔기 WASTRES (서열 233) 및 LVR3 중에 잔기 QQSQISPPT (서열 231)를 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 HVR2 중에 잔기 GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (서열 213)를 추가로 포함한다.

또다른 양태에 따르면, 본 발명의 BR3 결합 항체는 (1) QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3); 및 (2) Hu9.1-73, Hu9.1-70, Hu9.1-56, Hu9.1-51, Hu9.1-59, Hu9.1-61, Hu9.1-A, Hu9.1-B 및 Hu9.1-C로 이루어진 군에서 선택된 항체의 LVR2의 잔기 50-56 및 HVR1의 잔기 26-35를 포함하는 항체이다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 HVR2 중에 잔기 GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (서열 213)를 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 LVR1 중에 잔기 KSSQSLLYSSNQNNYLA (서열 232), 및 LVR3 중에 잔기 QQSQISPPT (서열 231)를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한, 서열 7-13 및 16-18로 이루어진 군에서 선택된 항체 서열의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함하는 HVR3을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체는 서열 7-13 및 16-18 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 26-35 및 잔기 49-65 (카바트 넘버링) 각각을 포함하는 HVR1 및 HVR2를 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체의 LVR1, LVR2 및 LVR3은 서열 3의 항체 서열의 잔기 24-34, 잔기 50-56, 및 잔기 89-97 (카바트 넘버링) 각각을 포함한다.

한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 22, 24 및 26-73 중의 어느 하나의 가변 중쇄 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 21, 23 및 25 중의 어느 하나의 가변 경쇄 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체는 서열 74의 서열을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체는 서열 76의 서열을 포함하는데, 여기서 X는 A, W, H, Y, S 또는 F이다. 한 가지 구체적 양태에 따르면, 상기 항체는 서열 75의 서열을 포함한다.

본 발명은 다음 서열식 III을 포함하는 HVR3을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다:

X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY (서열 218) (서열식 III)

상기 식에서, X1은 N, T 또는 R이고; X2는 A, S, T, L, N 또는 P이며; X3은 N, H 또는 L이고; X4는 P, Y, F, N, T 또는 L이며; X5는 Y, T 또는 D이고; X7은 A 또는 E이다. 한 양태에 따르면, 서열식 III이 TPHTYGAMDY (서열 235)가 아니다. 한 양태에 따르면, 서열식 III이 NSNFYGAMDY (서열 219)이다. 한 양태에 따르면, 상기 항체가 잔기 RDTSKNTF (서열 210) 또는 RDTSKNTL (서열 211)을 포함하는 HC-FR3을 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체의 LVR1, LVR2 및 LVR3은 서열 3의 항체 서열의 잔기 24-34, 잔기 50-56, 및 잔기 89-97 (카바트 넘버링) 각각을 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체의 HVR1 및 HVR2는 서열 4의 항체 서열의 잔기 26-35 및 잔기 49-65 (카바트 넘버링) 각각을 포함한다.

또다른 한편, 본 발명은 다음 서열식 III을 포함하는 HVR3을 포함하는 항- BR3 항체를 제공한다:

X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-MDY (서열 218) (서열식 III)

상기 식에서, X1은 N, T 또는 R이고; X2는 A, S, T, L, N 또는 P이며; X3은 N, H 또는 L이고; X4는 P, Y, F, N, T 또는 L이며; X5는 Y, T 또는 D이고; X7은 A 또는 E이며, 상기 항체는 잔기 RDTSKNTF (서열 210) 또는 RDTSKNTL (서열 211)을 포함하는 HC-FR3을 추가로 포함한다. 한 양태에 따르면, HC-FR3이 RDTSKNTF (서열 210)를 포함하는 경우, 상기 항체의 HVR3은 서열 6-9 및 16-17 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함한다. 한 양태에 따르면, HC-FR3이 RDTSKNTL (서열 211)을 포함하는 경우, 상기 항체의 HVR3은 서열 5 및 10-13 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체의 LVR1, LVR2 및 LVR3은 서열 3의 항체 서열의 잔기 24-34, 잔기 50-56, 및 잔기 89-97 (카바트 넘버링) 각각을 포함한다. 한 양태에 따르면, 상기 항체의 HVR1 및 HVR2는 서열 4의 항체 서열의 잔기 26-35 및 잔기 49-65 (카바트 넘버링) 각각을 포함한다.

한 양태에서, 서열식 III의 서열은 다음 서열식 IV이다:

X1-X2-X3-X4-X5-GAMDY (서열 218) (서열식 IV)

상기 식에서, X1은 N, T 또는 R이고; X2는 S, T, L, N 또는 P이며; X3은 N 또는 L이고; X4는 P, Y, F, N 또는 L이며; X5는 Y 또는 D이다.

한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열식 IV의 서열을 포함하는 HVR3, 및 서열 210의 서열을 포함하는 HC-FR3을 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 서 열 14의 경쇄 서열을 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 D265A/N297A (EU 넘버링) 돌연변이를 갖는 Fc 영역을 포함한다.

한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 4-13 및 16-18 중의 어느 하나의 가변 중쇄 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 3의 가변 경쇄 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체는 서열 14의 서열을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체는 서열 15의 서열을 포함한다.

본 발명은 서열 77의 가변 경쇄 서열과 서열 78의 가변 중쇄 서열, 및 그의 변이체을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 79의 가변 경쇄 서열을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 80-85 중의 어느 하나의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 80 또는 82 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 26-35 (카바트 넘버링)를 포함하는 HVR1을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 80, 84 또는 85 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 49-65 (카바트 넘버링)를 포함하는 HVR2를 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 80, 82 또는 83 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함하는 HVR3을 포함한다. 또다른 양태에서, 항-BR3 항체는 (1) 서열 81-85 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함하는 HVR3; 및 (2) RDTSKNTF (서열 210)를 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 80-85 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 26-35, 49-65 및 94-102를 포 함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 79의 항체 서열의 잔기 24-34 (카바트 넘버링)을 포함하는 LVR1을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 79의 항체 서열의 잔기 50-56 (카바트 넘버링)을 포함하는 LVR2를 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열 79의 항체 서열의 잔기 89-97 (카바트 넘버링)을 포함하는 LVR3을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 항-BR3 항체의 LVR1, LVR2 및 LVR3은 서열 79의 잔기 24-34, 50-56 및 89-97 (카바트 넘버링) 각각을 포함한다.

한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 78 및 80-85 중의 어느 하나의 가변 중쇄 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 77 및 79의 가변 경쇄 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

본 발명은 서열 87-94 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 95-102를 포함하는 HVR3을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 본 발명은 서열 87-94, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124-127, 129 및 193 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 49-58을 포함하는 HVR2를 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 본 발명은 서열 87-94, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124-127, 129 및 193 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 24-34를 포함하는 HVR1을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 본 발명은 서열 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 128 및 194-207 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 24-34를 포함하는 LVR1을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 본 발명은 서열 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 128 및 194-207 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 50-56을 포함하는 LVR2를 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 본 발명은 서열 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 128 및 194-207 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 89-97을 포함하는 LVR3을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다. 한 양태에 따르면, LVR1, LVR2 및 LVR3은 서열 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 128 및 194-207 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 24-34, 50-56 및 89-97을 포함한다. 한 양태에 따르면, HVR1, HVR2 및 HVR3은 서열 87-94, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124-127, 129 및 193 중의 어느 하나의 항체 서열의 잔기 24-34, 49-58 및 95-102를 포함한다. 한 양태에서, 항-BR3 항체는 서열 87-94, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124-127, 129 및 193 중의 어느 하나의 VH 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 한 양태에서, 항-BR3 항체는 서열 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 128 및 194-207 중의 어느 하나의 VL 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 포함한다.

본 발명은 RVCYN-X6-LGVCAGGMDY (서열 220) (서열식 V) [여기서, X6은 R 또는 H이다]을 포함하는 HVR3을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다.

본 발명은 다음 서열식 VI을 포함하는 LVR1을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다:

RAS-X4-X5-X6-X7-X8-X9-VA (서열식 VI)

상기 식에서, X4는 Q 또는 E이고; X5는 D 또는 E이며; X6은 I 또는 E이고; X7은 S 또는 A이며, X8은 S 또는 T이고, X9는 A 또는 S이다.

본 발명은 다음 서열식 VII를 포함하는 LVR2를 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다:

X1-X2-A-S-X5-L-X7-S (서열식 VII)

상기 식에서, X1은 Y 또는 F이고; X2는 S, A 또는 G이며; X5는 N, F 또는 Y이고; X7은 F 또는 Y이다.

본 발명은 다음 서열식 VIII을 포함하는 LVR3을 포함하는 항-BR3 항체를 제공한다:

Q-X2-S-X4-X5-X6-PPT (서열식 VIII)

상기 식에서, X2는 Q 또는 H이고; X4는 G, L, R, H, Y, Q 또는 E이며; X5는 N, T, M, S, A, T, I 또는 V이고; X6은 T 또는 S이다. 한 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열식 I, II 및 III의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 항-BR3 항체는 서열식 I, II 및 III의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 서열식 V의 서열 또는 서열 220을 포함하는 HVR3을 포함한다.

본 발명은 RVCYNRLGVCAGGMDY (서열 221)를 포함하는 H3; 잔기 SGFTISSNSIH (서열 222)를 포함하는 H1; 및 AWITPSDGNTD (서열 223)를 포함하는 H2를 포함하는 항-BR3 결합 항체를 제공한다. 또다른 양태에서, 항-BR3 결합 항체는 RVCYNRLGVCAGGMDY (서열 221)를 포함하는 H3; 잔기 SGFTISSSSIH (서열 224)를 포함하는 H1; 및 AWVLPSVGFTD (서열 225)를 포함하는 H2를 포함한다.

한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 87-96, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124-127, 129 및 193 중의 어느 하나의 가변 중쇄 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다. 한 양태에 따르면, 항-BR3은 서열 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 128 및 194-207 중의 어느 하나의 가변 경쇄 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함한다.

한 양태에서, BR3 결합 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체가 인간 BR3 세포외 도메인과 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체의 가변 영역 서열을 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체의 초가변 영역 서열을 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체의 인간화 형태이다.

한 양태에서, BR3 결합 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체가 인간 BR3과 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 추가의 양태에서, 상기 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또 는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체의 가변 영역 서열을 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체의 초가변 영역 서열을 포함한다. 또다른 양태에서, 상기 항체는 3.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6622) 또는 12B12.1로서 기탁된 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 PTA-6624)에 의해 생산된 항체의 인간화 형태이다.

한 양태에서, 본 발명의 항체는 본원에서 구체적으로 기재된 항체들 중의 어느 하나와 동일한 에피토프와 결합한다. 또다른 양태에서, 본 발명의 항체는 기탁된 항체의 서열을 포함한다.

본 발명은 변경된 Fc 효과기 기능, 예를 들어 ADCC, CDC 및 FcRn 결합성을 지닌 BR3 결합 항체 및 이뮤노어드헤신을 제공한다. 한 양태에서는, 야생형 인간 IgG1과 비교해서 ADCC 활성이 증가된 항체 및 이뮤노어드헤신이 고려된다. 또다른 양태에 따르면, 야생형 인간 IgG1과 비교해서 ADCC 활성이 저하된 항체 및 이뮤노어드헤신이 고려된다. 또다른 양태에 따르면, 야생형 인간 IgG1과 비교해서 FcRn 결합 친화도가 증가된 항체 및 이뮤노어드헤신이 고려된다. 한 양태에 따르면, 상기 항체 또는 이뮤노어드헤신은 Fc 영역의 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 및 439로 이루어진 군에서 선택된 Fc 영역 내의 하나 이상의 치환을 갖는데, 이러한 Fc 영역 내의 잔기 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따른다. 한 양태에 따르면, 잔기 434는 A, W, Y, F 및 H로 이루어진 군에서 선택된 잔기이다. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체 또는 이뮤노어드헤신은 다음 치환을 갖는다: S298A/E333A/K334A. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체 또는 이뮤노어드헤신은 다음 치환을 갖는다: K322A. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체 또는 이뮤노어드헤신은 서열 134의 서열 (여기서, X는 A, W, H, Y 및 F로 이루어진 군에서 선택된 임의의 아미노산이다)을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, 상기 항체 또는 이뮤노어드헤신은 다음 치환들 중의 어느 하나 또는 모든 조합을 갖는다: K246H, H268D, E283L, S324G, S239D 및 I332E. 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이뮤노어드헤신은 적어도 다음 치환을 갖는다: D265A/N297A.

본 발명의 한 양태에 따르면, BR3 결합 폴리펩티드는 세포독성제 또는 화학요법제와 접합된다.

또다른 양태에 따르면, 항체가 모노클로날 항체이다. 또다른 양태에 따르면, 항체가 인간화 항체이다. 또다른 양태에 따르면, 항체가 인간 항체이다. 또다른 양태에 따르면, 항체가 키메라 항체이다. 또다른 양태에 따르면, 항체가 Fab, Fab', F(ab)'₂, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편; 디아보디 (diabody) 및 선형 항체로 이루어진 군에서 선택된다. 또다른 양태에 따르면, 항체가 다중-특이적 항체, 예를 들어 이중-특이적 항체이다.

또한, 전술된 양태들 중의 어느 한 양태의 항체 또는 폴리펩티드와 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 한 양태에서는, 담체가 제약상 허용 가능한 담체이다. 이들 조성물은 용품 또는 키트 내에 제공될 수 있다.

본 발명은 또한, 히스티딘 완충제 중에 항-BR3 항체를 포함하는 액상 제형을 제공한다. 한 양태에 따르면, 완충제가 히스티딘 설페이트 완충제이다. 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 제형 또는 조성물이 예비-충전된 주사기로서 패키징된다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 서열을 코딩하는 단리된 핵산을 제공하고, 이에는 항체를 발현하기 위한 발현 벡터가 포함된다.

본 발명의 또다른 국면은 전술된 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포이다. 후자의 한 가지 바람직한 양태에서는, 숙주 세포가 CHO 세포이다. 이들 항체를 생성시키는 방법이 제공되는데, 이러한 방법은 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 이러한 항체를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또다른 국면은 용기와, 이 안에 함유된 조성물 및 패키지 삽입물을 포함하는 용품인데, 상기 조성물은 전술된 양태의 항체를 포함한다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 용품은 본 발명의 BR3-결합 항체를 포함하는 진단용 키트이다.

본 발명은 또한, BR3 결합 항체, 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편을 포유류, 예를 들어 골수 이식을 받은 인간 환자, 및 자가면역 질환, 암, B 세포 신생 물, BR3 양성 암 또는 면역결핍증과 같은 질병으로 인해 고통받고 있는 인간 환자에게 투여함으로써, 본원에 기재된 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 자가면역 질환, B 세포 신생물 또는 BR3 양성 암을 치료하기 위한 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 투여될 BR3 결합 폴리펩티드 또는 항체는 바람직하게, 길항제 BR3-결합 항체 또는 폴리펩티드이거나 또는 작동제 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 아니다. 면역결핍증을 치료하기 위한 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 사용될 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 본 발명의 작동제 BR3-결합 항체 또는 폴리펩티드이다. 한 양태에 따르면, 본 발명에 따라서 치료하고자 하는 암은 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종 (소포형 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 연변층 림프종 및 외투 세포 림프종 포함)으로 이루어진 군에서 선택된다.

자가면역 질환, 암, B 세포 신생물 또는 BR3 양성 암을 치료하는 방법의 한 양태에서는, 항체가 9.1RF 항체와 비교해서 pH 6.0에서 FcRn과 결합할 수 있는 능력이 증가된 BR3-결합 항체이다. 자가면역 질환, B 세포 신생물 또는 BR3 양성 암을 치료하는 방법의 한 양태에서는, BR3 결합 항체가 9.1RF 항체와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에서 ADCC 효과기 기능이 증가된 BR3-결합 항체이다.

한 양태에서, BR3 양성 암은 B 세포 림프종 또는 백혈병이고, 이에는 비호지킨 림프종 (NHL) 또는 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 또는 소형 림프구성 림프종 (SLL)이 포함된다. 또다른 양태에 따르면, BR3 양성 암은 다발성 골수종이다. 부가 양태에서는 상기 치료 방법이 상기 환자에게 한 가지 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포 함하는데, 비호지킨 림프종 (NHL)의 경우에는 화학요법제가 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 군에서 선택된다

또한, 자가면역 질환으로 인해 고통받고 있는 환자에게, 치료 유효량의 본 발명의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 한 양태에 따르면, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 유년형 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)를 포함한 루푸스, 베게너병, 염증성 장 질환 [크론 병 (Crohn's disease) 및 궤양성 결장염 포함], 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역성 저혈소판증, 다발성 경화증, 건선, Ig 신경병증 (IgA 신병증, IgM 다발신경병증 및 IgG 신경병증 포함), 중증 근무력증, 혈관염 (ANCA-관련 혈관염 포함), 진성 당뇨병, 레이노이드 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군, 시각 신경척수염 (NMO), 천포창 (종양연관성 천포창, 심상성 천포창 및 낙엽상 천포창 포함), 다발성 근염/피부 근염 및 사구체신염으로 이루어진 군에서 선택된다. 자가면역 질환이 류마티스성 관절염인 경우, 항체는 제2의 치료제와 연계해서 투여할 수 있다. 한 양태에 따르면, 제2의 치료제가 메토트렉세이트 (methotrexate)이다.

자가면역 질환, B 세포 신생물 또는 BR3 양성 암을 치료하기 위한 방법에서는, BR3 결합 항체를 단독으로 투여하거나, 또는 제2의 치료제, 예를 들어 제2 항체, 또다른 B 세포 고갈제, 화학요법제, 면역억제제, 또는 인간 면역 반응을 조정하는 또다른 생물학적 제제 (예: 생물학적 반응 조정제)와 연계해서 투여할 수 있다. 제2 항체는 CDE20 또는 상이한 B 세포 항원, 또는 NK 또는 T 세포 항원과 결 합하는 것일 수 있다. 한 양태에서는, 항-CD20 항체가 리툭시마브 (rituximab) (리툭산 (RITUXAN)^®), m2H7 (뮤린 2H7), hu2H7 (인간화 2H7) 및 그의 모든 기능적 변이체, hu2H7.vl6 (v는 버젼을 나타낸다), v31, v96, vl14 및 vl15로 이루어진 군에서 선택된다 [참고: 예를 들어, WO 2004/056312]. 한 양태에서, 제2 항체는 방사성 표지된 항-CD20 항체이다. 기타 양태에서는, CD20 결합 항체를 세포독성제, 예를 들어 독소 또는 방사성 동위원소와 접합시킨다. 또다른 양태에서는, 제2의 치료제가 인터루킨 (예: IL-2, IL-12), 인터페론, 플루다라빈, 시클로포스파미드, TNF-알파를 표적으로 하는 항체 (예: Enbrel^®, Remicade^®, 및 Humira^®), 집락-자극 인자 (예: CSF, GM-CSF, G-CSF)로 이루어진 군에서 선택된다. 또다른 양태에서는, 제2 항체 또는 생물학적 제제가 또다른 BAFF 길항제 (예: BR3 항체, 항-BAFF 항체, TACI-Fc, BCMA-Fc 및 BR3-Fc)일 수 있다. 한 양태에 따르면, 자가면역 질환 또는 암에 대한 제2의 치료제로서 투여되는 BAFF 길항제는 ADCC 활성을 지니고 있지 않다. 또다른 양태에서는, 제2의 치료제가 항-VEGF 항체 (예: Avastin™ 항체), 항-CD64 항체, 항-C32a 항체, 항-CD16 항체, 항-INF알파 항체, 항-CD79a 항체, 항-CD70b 항체, 항-CD52 항체, 항-CD40 항체, CTLA4-Ig, 항-CD22 항체, 항-CD23 항체, 항-CD80 항체, 항-HLA-DR 항체, 항-MHCII (IA) 항체, 항-IL-7 항체, 항-IL-2 항체, 항-IL-4 항체, 항-IL-21 항체 및 항-IL-10 항체로 이루어진 군에서 선택된다. B 세포 고갈제의 구체적인 예에는 전술된 항-CD20 항체, 알렘투주마브 (Alemtuzumab) (항-CD52 항체), 및 에프라투주마브 (Epratuzumab) 또는 CMC-544 (공급처: Wyeth) (항-CD22 항체)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 또다른 양태에서는, 제2의 치료제가 B 세포를 고갈시키는 소분자, 또는 IAP 억제제이다.

또다른 국면에서, 본 발명은 다음 질병으로 인해 고통받고 있는 환자에게, 치료 유효량의 BR3 결합 항체를 투여하는 것을 포함하여, 피부근염, 베게너 육아종증, ANCA-관련 혈관염 (AAV), 재생불량성 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈 (AIHA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역성 호중구감소증, 캐슬맨 증후군 (Castleman's syndrome), 구드패스츄어 증후군 (Goodpasture's Syndrome), 고형 기관 이식체 거부, 이식편 대 숙주 질병 (GVHD), IgM 매개된 신경병증, 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 자가면역성 간염, 림프계 간질성 폐렴 (LIP), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식성) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre' Syndrome), 대혈관 혈관염, 거대 세포 [다카야스 (Takayasu)] 동맥염, 중간 혈관 혈관염, 가와사키병 (Kawasaki's Disease) 및 결절성 다발성 동맥염으로 이루어진 군에서 선택된 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 치료 유효량의 본 발명의 작동제 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하여, 포유류에게서 면역결핍증을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 BR3을 단리하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, (a) B 세포를 BR3 작동제 항체로 자극시키는 단계; (b) 후보 화합물을 투여하는 단계; 및 (c) BR3 활성, 예를 들어 B 세포 증식을 검출하는 단계를 포함하여, B 세포 증식의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, (a) B 세포를 BR3 작동제 항체로 자극시키는 단계; 및 (b) 세포의 유전자 발현 및/또는 단백질 활성 상의 변경을 검출하는 단계를 포함하여, BR3 경로의 하류 마커를 확인 및 모니터링하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 시험 대상체로부터의 생물학적 샘플을 본 발명의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; (b) 이러한 생물학적 샘플 중에서의 BR3 폴리펩티드의 수준을 검정하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 샘플 중에서의 BR3 폴리펩티드의 수준을 BR3 단백질의 표준 수준과 비교하는 단계 (이로써, BR3 단백질의 표준 수준과 비교해서 BR3 단백질이 존재하거나 BR3 단백질의 수준이 증가한 것이 BR3 결합 요법으로 치료될 자가면역 질환 또는 암의 존재에 대한 지표이다)를 포함하여, BR3 결합 요법 길항제를 사용하여 치료하고자 하는 자가면역 질환 또는 암을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 시험 샘플 또는 대상체 중에서 본 발명의 항-BR3 항체 또는 이뮤노어드헤신을 결합시키는 단계; 및 이와 같이 결합된 항체 또는 이뮤노어드헤신을 대조군 항체 또는 이뮤노어드헤신와 비교하는 단계를 포함하여, BR3 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 한 양태에서는, 상기 항체 또는 이뮤노어드헤신을 FACS 분석, 면역조직화학 검정 (IHC) 및 ELISA 검정으로 이루어진 군에서 선택된 검정에 사용한다. 비-BAFF 차단성 항-BR3 항체는 BR3이 리간드와 결합되든지 아니면 결합되지 않든 간에 BR3을 검출하는데 유리하고, 자유 BR3과 결합된 BR3을 측정하는데 유용할 수 있다.

도 1은 카바트 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된 2.1 이식된 항-BR3 항체의 가변 도메인 서열을 도시한 것이다. 진하게 표시한 문자는 인간 컨센서스 III 서열과 비교한 R71A, N73T, 및 L78A 변화를 표시한다. 밑줄친 부분은 CDR 서열을 포함하는 영역 (H1, H2, H3, L1, L2 및 L3)을 지칭한다.

도 2는 카바트 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된 9.1 이식된 항-BR3 항체의 가변 도메인 서열을 도시한 것이다. 진하게 표시한 문자는 인간 컨센서스 III 서열과 비교한 R71A, N73T, 및 L78A 변화를 표시한다. 밑줄친 부분은 CDR 서열을 포함하는 영역 (H1, H2, H3, L1, L2 및 L3)을 지칭한다.

도 3은 카바트 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된 11G9 이식된 항-BR3 항체의 가변 도메인 서열을 도시한 것이다. 밑줄친 부분은 CDR 서열을 포함하는 영역 (H1, H2, H3, L1, L2 및 L3)을 지칭한다. 진하게 표시한 문자는 인간 컨센서스 III 서열과 비교한 R71A, N73T, 및 L78A 변화를 표시한다.

도 4는 9.1 이식된 항-BR3 항체의 CDR 영역을 연질 무작위화하고 선별한 결과를 도시한 것이다. 열거된 항체의 가변 도메인은 제시된 L2 및 H1 영역 상의 잔기 변화를 제외하고는 9.1 이식된 가변 도메인 서열과 동일하다.

도 5는 마우스 VH 프레임워크 영역과 인간 "RF" 및 "RL" 프레임워크 서열을 비교하여 도시한 것이다.

도 6은 변형된 프레임워크를 지닌 이식된 Fab에 의한 항원 결합을 도시한 것이다.

도 7은 제5 회전에서 2.1-RL 및 2.1-RF CDR 수복 라이브러리로부터 선별된 서열을 도시한 것이다. 열거된 항체의 가변 도메인은 제시된 H3 영역 상의 잔기 변화를 제외하고는 2.1-RF 또는 2.1-RL 가변 도메인 서열과 동일하다.

도 8은 제5 회전에서 9.1-RL 및 9.1-RF CDR 수복 라이브러리로부터 선별된 서열을 도시한 것이다. 열거된 항체의 가변 도메인은 제시된 H1 영역 상의 잔기 변화를 제외하고는 9.1-RF 또는 9.1-RL 가변 도메인 서열과 동일하다.

도 9는 제5 회전에서 11G9-RF CDR 수복 라이브러리로부터 선별된 서열을 도시한 것이다. 열거된 항체의 가변 도메인은 제시된 H1, H2 및 H3 영역 상의 잔기 변화를 제외하고는 11G9-RF 가변 도메인 서열과 동일하다.

도 10은 선별된 항-BR3 인간화 MAb의 BIAcore 분석을 도시한 것이다.

도 11은 (A) 마우스 BR3 ECD를 갖는 폴리펩티드 또는 (B) 인간 BR3 ECD를 갖는 폴리펩티드의 양을 증가시키면서 용액 중에서 결합된 선별된 F(ab)'2 파지 클론에 대한 용액 결합성 경쟁 ELISA 결과를 도시한 것이다.

도 12는 카바트 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된 파지-유래된 항-BR3 항체로부터의 아미노산 서열을 도시한 것이다. "LN"은 잔기 95-102 사이에 포함되는 잔기 수를 지칭한다. "#"는 스크리닝 동안 해당 클론이 선별되는 횟수를 지칭한다. "클론"은 지정된 파지 클론 번호를 지칭한다. CDR-H2의 잔기 I51, P52a, G55, T57은 도시되지 않았다. 각 항체를 포함하는 나머지 잔기 (1-23, 35-49, 57-88 및 98-107)는 도 15에서 V3에 대해 기재된 바와 같다. "X"는 서열이 공지되지 않았다는 것을 표시한다.

도 13은 BAFF의 존재하에 mBR3 또는 hBR3의 세포외 도메인과 결합된 F(ab)'2 파지의 비율 (％) 및 용액 결합성 경쟁 ELISA를 사용하여 선별된 F(ab)'2 파지의 IC50 값을 도시한 것이다.

도 14는 증가된 BAFF 농도의 존재하에 mBR3-Fc 피복된 웰에 대한 F(ab)'2 파지 결합 억제를 나타낸 ELISA 검정을 도시한 것이다.

도 15는 카바트 넘버링 시스템에 따라서 넘버링된 파지-유래된 V3 항-BR3 항체의 가변 도메인 서열을 도시한 것이다.

도 16은 (A) V3-유래된 클론으로부터의 서열 및 (B) 하이브리드 mBAFF를 사용하여 BR3에 대한 결합을 차단시킨 F(ab)'2 파지의 IC50 값을 도시한 것이다. LC-CDR2의 잔기 51(A), 52(S) 및 54(L)는 도시되지 않았다.

도 17은 V3-1 유래된 클론으로부터의 잔기와 그들의 IC50 값을 도시한 것이다.

도 18은 마우스 및 인간 BR3과의 결합에 대한 친화성 개선된 V3-46s 파지 클론과 그들의 파지 IC50 값을 도시한 것이다. 제시된 아미노산은 카바트 넘버링 시스템에 따라서 서열 194-207의 잔기 27-32 ("L1"), 49-55 ("L2") 및 88-94 ("L3")이다.

도 19는 BJAB 세포에 대한 항-BR3 mAb의 경쟁적 및 직접 결합을 도시한 것이다. (A) BAFF 경쟁적 결합 검정. (B) 직접 결합 검정. 이소형 대조군은 결합을 전혀 나타내지 않았고, 검출 항체는 마우스 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b와 동등한 수준으로 결합하였다.

도 20은 BJAB 세포 (인간 BR3)에 대한 V3-lm 및 B9C11 결합성 (각각 패널 A 및 B) 및 BHK 세포 (뮤린 BR3)에 대한 V3-lm 및 B9C11 결합성 (각각 패널 C 및 D)을 이용한 경쟁적 및 직접 결합 검정의 결과를 도시한 것이다.

도 21은 항-인간 BR3 mAb 성상 확인을 위한 경쟁 ELISA를 도시한 것이다. mAb를 표시된 농도 하에 일정 량의 바이오티닐화 mAb 9.1 (패널 A), 2.1 (패널 B), 11G9 (패널 C), 또는 1E9 (패널 D)와 함께 인큐베이션하였다.

도 22는 뮤린 BR3에 대한 V3-lm, B9Cl1, 및 P1B8의 경쟁적 결합을 도시한 것이다. 바이오티닐화 V3-lm (패널 A) 및 바이오티닐화 B9C11 (패널 B)을 사용하여 경쟁 ELISAs를 수행하였다.

도 23은 항체 2.1, 11G9 및 9.1이 2명의 상이한 공여자 (각각 패널 A 및 B)로부터의 B 세포의 증식을 억제한다는 것을 도시하고 있다.

도 24는 항체 V3-lm이 (A) 항-IgM (5 ㎍/ml) + BAFF (2 ng/ml) 또는 (B) 항-IgM (5 ㎍/ml) + BAFF (10 ng/ml)에 의해 자극된 B 세포의 증식을 억제한다는 것을 도시하고 있다.

도 25는 9.1-RF가 BAFF-의존성 인간 B 세포 증식을 차단시키고, 작동시키지 않는다는 것을 도시하고 있다. (A) 항-IgM + BAFF + 9.1-RF로 처리시킨 인간 일차 B 세포. (B) 항-IgM + 9.1-RF로 처리시킨 인간 일차 B 세포.

도 26은 2.1-46이 B 세포 증식을 자극한다는 것을 도시하고 있다. (A) 항-IgM + BAFF + 2.1-46으로 처리시킨 세포. (B) 항-IgM + 2.1-46으로 처리시킨 세포.

도 27은 샷건 (shotgun) ala-스캐닝 결과를 기준으로 하여 BR3과 항체 11G9, 2.1, 9.1 및 V3-1 간의 각종 상호 작용 지점을 도식적으로 나타낸 것이다. 원안에 있는 잔기는 O-연결된 당화의 잠재적 부위를 나타낸다.

도 28은 B 세포 마커에 대항한 항체를 사용하여 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 환자의 말초혈 중에서의 B 세포 집단을 도시한 것이다. 패널 A, C 및 D는 항-CD19, 및 항-CD27 항체, 항-CD20 항체 또는 항-CD5 항체를 이용한 FACS 분석을 도시한 것이다. 패널 B는 악성 집단 중에서의 BR3 발현을 나타내는 히스토그램이다. 박스는 악성 집단을 나타낸다.

도 29는 인간화 항-BR3 항체와, (A) BJAB 세포, (B) 라모스 (Ramos) 세포 또는 (C) WIL2s 세포를 이용한 ADCC 활성 검정 결과를 도시한 것이다.

도 30은 V3-1, BR3-Fc 또는 대조군 항체로 처리한지 7일 후에 혈액 (패널 A-C), 림프절 (패널 D-F) 및 비장 (패널 G-I) 중에서의 마우스 B 세포의 유동 세포계수법 분석을 도시한 것이다.

도 31은 V3-1, BR3-Fc 또는 대조군 항체로 처리한지 1, 3, 7 및 15일 후의, (A) 1 ml의 혈액 내에 함유된 마우스 B 세포의 절대 수; (B) 림프절 중의 B 세포 백분율(％); (C) 비장 중의 소포 B 세포 (FO - CD21+CD23+)의 절대 수 또는 (D) 비장 중의 연변층 B 세포 (MZ - CD21고 CD23저)를 도시한 것이다.

도 32는 대조군 항체, BR3-Fc 또는 V3-1로 처리한지 15일 후 마우스 중에서의 B 세포 집단을 도시한 것이다. (A-1 내지 A-6) 처리 후 마우스의 비장 또는 파이어판 (Peyer's Patche) 중의 B 세포 집단의 FACS 분석; (B) 처리 후 비장 중의 혈질모세포의 히스토그램; 및 (C) 처리 후 파이어판 중의 배아 중심 세포의 히스토 그램.

도 33은 ADCC 활성과 BAFF 차단 능력을 지닌 항-BR3 항체, 비-차단성 항-BR3 항체, Fc-결함있는 돌연변이체 항-BR3 항체 또는 BR3-Fc를 사용하여 처리한지 6일 후에 BALB/c 마우스에서 혈액 중의 B 세포 감소 (패널 A)와 비장 중에서의 B 세포 감소 (패널 B)를 도시한 것이다.

도 34는 NZBxW Fl 마우스 (루푸스 신염 모델)를 항-BR3 항체, mV3-l, mBR3-Fc 및 대조군 항체로 처리한 결과를 도시한 것이다. (A)는 대조군 마우스와 비교해서 항-BR3 항체 처리된 마우스와 BR3-Fc 처리된 마우스의 병세 진행까지의 기간 감소를 도시한 것이다. (B)는 BR3-Fc (p<0.01), 대조군 (p<0.03) 및 mV3-1 (p<0.001)로 처리시킨 마우스에서 혈액 1 ml당 B 세포 수를 도시한 것이다. (C)는 BR3-Fc, 대조군 및 mCBl (p<0.00001)로 처리시킨 마우스의 비장당 총 B 세포 수를 도시한 것이다. (B) 및 (C) 중에서의 수평 선은 해당 군의 평균 수준을 표시한 것이다. 데이터는 개개 마우스 데이터 점으로서 표현하였다 (n=25).

도 35는 표시된 바와 같이 인간 PBMC 및 항-BR3 항체 또는 mBR3-Fc로 처리시킨 SCID 모델 마우스에서의 B 세포 고갈을 도시한 것이다 (4일). (A) 활성화/GC B 세포의 비율 (CD19hi/CD38int), (B) 활성화/GC B 세포의 수, (C) 형질모세포의 비율 (CD191o/CD38hi/CD139neg), (D) 형질모세포의 수 및 (E) 활성화/GC 세포의 비율 (CD19hi/CD38+).

도 36은 평형시 (pH 6.0 및 pH 7.4) 인간 또는 시노 (cyno) FcRn에 대한 9.1RF (패널 A), 9.1RF N434A (패널 B) 및 9.1RF N434W (패널 C) 항체의 결합성을 도시한 것이다. R_eq는 평형시 칩으로부터의 반응 단위 수이다.

도 37은 항-BR3 항체 또는 헤르셉틴 (Herceptin^®) 항체 (양성 대조군)에 대한 Fc 감마 수용체 결합성을 이용한 ELISA 검정을 도시한 것이다. 패널 A: FcγRI. 패널 B: FcγRIIA. 패널 C: FcγRIIB. 패널 D: FcγRIII (F158). 패널 E: FcγRIII (V158).

도 38은 1시간, 1일째, 8일째 또는 15일 째에 혈액 (패널 A) 및 림프절 (패널 B) 중에서 항-BR3 항체 (V3-1) 대 항-CD20 항체 (2H7)로의 처리 후 B 세포 수준을 분석하여 도시한 것이다.

도 39는 1일째, 8일째 및 15일 째에 소포 B 세포 (패널 A) 및 연변층 B 세포 (패널 B) 중에서 항-BR3 항체 대 항-CD20 항체 (2H7)로의 처리 후 B 세포 수준을 분석하여 도시한 것이다.

도 40은 9.1RF로 처리시킨 시노 원숭이로부터의 혈액 (패널 A) 및 조직 (패널 B) 중에서의 B 세포 고갈을 도시한 것이다. 데이터는 ATA-원숭이로부터의 것이다 (5마리 시노 원숭이는 20 mg/kg으로 처리하였고; 3마리 시노 원숭이는 2 mg/kg으로 처리하였다).

도 41은 일정 시간에 걸쳐 9.1RF 또는 9.1RF N434W로 처리시킨 시노 원숭이 혈액 중에서의 B 세포 집단 수준을 도시한 것이다: (A) CD20+/CD21+ 세포, (B) CD21+/CD27+ 세포 및 (C) CD21+/CD27- 세포.

본원에 사용된 경우의 용어 "BAFF", "BAFF 폴리펩티드", "TALL-1" 또는 "TALL-1 폴리펩티드", 및 "BLyS"는 "천연 서열 BAFF 폴리펩티드" 및 "BAFF 변이체"를 포괄한다. "BAFF"는 서열 143 또는 서열 144의 아미노산 서열들 중의 어느 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 및 천연 서열 BAFF의 생물학적 활성을 지니고 있는 그의 동족체 및 단편 및 변이체에 대해 제시된 명칭이다. BAFF의 생물학적 활성은 B 세포 생존 증진, B 세포 성숙 증진 및 BR3, BCMA 또는 TACI에 대한 결합성으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. BAFF의 변이체는 바람직하게, BAFF 폴리펩티드의 천연 서열과의 아미노산 서열 동일성이 80％ 이상 또는 100％ 까지의 모든 연속 정수, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 보다 더 바람직하게는 95％ 이상일 것이다. "천연 서열" BAFF 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 상응하는 BAFF 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, BAFF는 푸린-유형 프로테아제에 의해 세포 표면으로부터 절단시킨 후 가용성 형태로 존재한다. 이러한 천연 서열 BAFF 폴리펩티드는 천연으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 용어 "천연 서열 BAFF 폴리펩티드"에는 구체적으로, 상기 폴리펩티드의 천연 발생적 절단 또는 분비된 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생적 변이체 형태 (예: 대체 스플라이싱된 형태) 및 천연 발생적 대립유전자성 변이체가 포괄된다. 용어 "BAFF"에는 다음 문헌에 기재된 폴리펩티드가 포함된다 [참고: Shu et al, J. Leukocyte Biol, 65:680 (1999); GenBank Accession No. AF136293; WO 1998/18921 (1998년 5월 7일자로 공개됨); EP 869,180 (1998년 10월 7일자로 공개됨); WO 98/27114 (1998년 6월 25일자로 공개됨); WO 99/12964 (1999년 3월 18일자로 공개됨); WO 99/33980 (1999년 7월 8일자로 공개됨); Moore et al, Science, 285:260-263 (1999); Schneider et al, J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999) and Mukhopadhyay et al, J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)].

본원에 사용된 바와 같은 용어 "BAFF 길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 (1) 천연 서열 BAFF 폴리펩티드와 결합하거나 또는 천연 서열 BR3 폴리펩티드와 결합하여 BAFF 폴리펩티드와의 BR3 상호작용을 부분적 또는 완전히 차단시키고; (2) 천연 서열 BAFF 신호 전달을 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자가 포함된다. 천연 서열 BAFF 폴리펩티드 신호 전달은 특히, B 세포 생존 및 B 세포 성숙을 증진시킨다. BAFF 신호 전달을 억제, 차단 또는 중화시키면, 특히 B 세포 수가 감소된다. 본 발명에 따르는 BAFF 길항제는 BAFF 폴리펩티드의 한 가지 이상의 생물학적 활성을 시험관내 또는 생체내에서 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시킬 것이다. 한 양태에서는, 생물학적 활성 BAFF가 시험관내 또는 생체내에서 다음 사건들 중의 하나 또는 조합 사건을 증진시켜 준다: B 세포 생존 증가, IgG 및/또는 IgM 생성 수준 증가, 또는 B 세포 증식 자극.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "TACI 길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 (1) 천연 서열 BAFF 폴리펩티드와 결합하거나 또는 천연 서열 TACI 폴리펩티드와 결합하여 BAFF 폴리펩티드와의 TACI 상호작용을 부분적 또는 완전히 차단시키고; (2) 천연 서열 BAFF 신호 전달을 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "BCMA 길항제"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 (1) 천연 서열 BAFF 폴리펩티드와 결합하거나 또는 천연 서열 BCMA 폴리펩티드와 결합하여 BAFF 폴리펩티드와의 BCMA 상호작용을 부분적 또는 완전히 차단시키고; (2) 천연 서열 BAFF 신호 전달을 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자가 포함된다.

상기 언급된 바와 같이, BAFF 길항제는 BAFF 신호 전달을 시험관내 또는 생체내에서 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키기 위해 직접 또는 간접 방식으로 기능할 수 있다. 예를 들어, BAFF 길항제는 BAFF와 직접적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체가 BR3에 대한 BAFF 결합을 입체적으로 방해하도록 인간 BAFF의 잔기 162-275 및/또는 162, 163, 206, 211, 231, 233, 264 및 265로 이루어진 군에서 선택된 잔기의 이웃하는 잔기를 포함하는 인간 BAFF의 영역 내에서 결합하는 항-BAFF 항체가 고려된다. 또다른 예에서는, 직접적인 결합제가 BAFF 수용체, 예를 들어 TACI, BR3 및 BCMA의 세포외 도메인을 포함하거나, 또는 ECDs의 박스 내의 최소 영역 (인간 BR3의 잔기 19-35에 상응함)을 포함하는 폴리펩티드이다. 또다른 한편, BAFF 길항제는 그의 BAFF 결합성 영역에서 천연 서열 BR3의 세포외 도메인과 결합하여 시험관내, 계내 또는 생체내에서 BR3에 대한 BAFF 결합을 부분적 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 간접 길항제는 인간 BR3의 잔기 23-38을 포함하는 BR3의 특정 영역 또는 이들 잔기의 이웃하는 영역 내에서 결합하는 항-BR3 항체이므로, BAFF에 대한 인간 BR3의 결합이 입체적으로 장애된다. BAFF 길항제일 수 있는 BAFF 결합성 Fc 단백질의 기타 예는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: WO 02/66516, WO 00/40716, WO 01/87979, WO 03/024991, WO 02/16412, WO 02/38766, WO 02/092620 및 WO 01/12812]. BAFF 길항제에는 WO 02/24909의 도 20에 열거된 BAFF-결합성 서열, 및 WO 2003/024991, WO 02/092620에 기재된 서열, BAFF와 결합하는 그들 서열의 단편, 및 이들 서열을 포함하는 융합 단백질 (예: Fc 융합 단백질)이 포함된다.

본원에 사용된 경우의 용어 "BR3", "BR3 폴리펩티드" 또는 "BR3 수용체"는 "천연 서열 BR3 폴리펩티드" 및 "BR3 변이체" (이는 본원에 추가로 정의된다)를 포괄한다. "BR3"은 서열 145-149 중의 어느 하나를 포함하는 폴리펩티드 및 그의 변이체 또는 단편에 대해 제공된 명칭이다. 본 발명의 BR3 폴리펩티드는 각종 공급원, 예를 들어 인간 조직 유형, 또는 또다른 공급원으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 용어 BR3에는 WO 02/24909 및 WO 2003/14294에 기재된 BR3 폴리펩티드가 포함된다.

"천연 서열" BR3 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 상응하는 BR3 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 BR3 폴리펩티드는 천연으로부터 단리시킬 수 있거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 용어 "천연 서열 BR3 폴리펩티드"는 구체적으로, 이러한 폴리펩티드의 천연 발생적으로 절단되거나, 가용성 또는 분비된 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 천연 발생적 변이체 형태 (예: 대체 스플라이싱된 형태) 및 천연 발생적 대립유전자 변이체를 포괄한다. 본 발명의 BR3 폴리펩티드에는 인간 BR3의 아미노산 잔기 1 내지 184의 연속되는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 BR3 폴리펩티드가 포함된다.

BR3 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 막관통 도메인과 세포질 도메인이 실질적으로 없는 BR3 폴리펩티드의 형태를 지칭한다. ECD 형태의 BR3에는 BR3의 아미노산 1-77, 2-62, 2-71, 1-61, 8-71, 17-42, 19-35 또는 2-63 중의 어느 하나를 포함하는 것이 포함된다.

"BR3 변이체"는 BR3 ECD의 잔기 19-35와의 아미노산 서열 동일성이 약 60％ 이상인 BR3 폴리펩티드를 의미하고, 이는 천연 서열 BAFF 폴리펩티드와 결합된다 [참고: Gordon, N.C., et al., (2003) Biochemistry 42:5977-5983]. 임의로, BR3 변이체에는 단일 시스테인 풍부 도메인이 포함된다. 이러한 BR3 변이체 폴리펩티드에는, 예를 들어 전장 아미노산 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 뿐만 아니라 하나 이상의 내부 도메인 내에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 BR3 폴리펩티드가 포함된다. 천연 서열 BAFF 폴리펩티드와 결합하는 BR3 ECD의 단편이 또한 고려된다. 한 양태에 따르면, BR3 변이체 폴리펩티드는 인간 BR3의 잔기 19-35에 상응하는 부분에서의 아미노산 서열 동일성이 약 65％ 이상, 약 70％ 이상, 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상, 또는 약 99％ 이상일 것이다.

인간 BR3 폴리펩티드 또는 그의 명시된 단편의 잔기 중에서, BR3 변이체 폴리펩티드는 천연 BR3 폴리펩티드 서열을 포괄하지 않는다. 임의로, BR3 변이체 폴리펩티드는 길이가 약 17개 이상 아미노산이다.

용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 폴리에피토프 특이성을 지닌 항체, 단일쇄 항체, 다중-특이적 항체 및 항체 단편이 포함된다. 몇몇 양태에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어 가변 도메인 또는 CDR 내에서 항체 프레임워크와 융합되어, 항체가 BAFF와 결합하여 BR3에 대한 BAFF 결합성 또는 BAFF 신호 전달을 억제할 수 있도록 한다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 항체는 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 항체는 항체 단편일 수 있다. 이러한 항체 및 이들을 생성시키는 방법은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다. 또다른 한편, 본 발명의 항체는 동물을 본 발명의 폴리펩티드로 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드에 대항하여 유도된 항체가 고려된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항-BR3" 및 "BR3 결합성"은 상호 교환적으로 사용되고, 이는 항체 또는 폴리펩티드가 BR3 폴리펩티드와 결합한다는 것을 나타낸다. 바람직하게, 항-BR3 항체는 서열 145-149로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 BR3 폴리펩티드 상의 에피토프와 결합하고, 인간 TACI 또는 인간 BCMA와는 결합하지 않는다. 바람직하게, 항-BR3 항체는 25℃에서의 BIAcore 검정시에 Fab로서 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합한다. 한 양태에 따르면, 항체 또는 폴리펩티드는 겉보기 Kd 0.001 pM 내지 500 nM으로 BR3과 결합한다.

본 발명에 따르는 "길항성 항-BR3 항체"는 BR3 폴리펩티드와 결합하고 BR3 신호 전달을 억제하는 (예를 들어, BR3 관련 B 세포 증식 또는 B 세포 생존을 억제하거나, 또는 B 세포 증식과 생존 둘 다를 억제한다) 항체를 지칭한다.

본 발명에 따르는 "작동성 항-BR3 항체"는 BR3 폴리펩티드와 결합하고 BR3 신호 전달을 자극하는 (예를 들어, BR3 관련 B 세포 증식 또는 B 세포 생존을 자극하거나, 또는 B 세포 증식과 생존 둘 다를 자극한다) 항체를 지칭한다.

"CD20" 항원은 말초혈 또는 림프계 기관으로부터 B 세포의 90％ 초과 표면 상에서 발견되는, 분자량이 대략 35 kD인 비-당화 (non-glycosylated) 막관통 인단백질이다. CD20은 초기 프리-B 세포 발생 동안 발현되고 형질 세포 분화가 이루어질 때까지 유지되며; 인간 줄기 세포, 림프계 기원 세포 또는 정상 형질 세포 상에서는 발견되지 않는다. CD20은 악성 B 세포 뿐만 아니라 정상 B 세포 상에도 존재한다. 당해 분야의 문헌에 보고된 CD20에 대한 다른 명칭에는 "B-림프구-제한된 분화 항원" 및 "Bp35"가 포함된다. CD20 항원은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989) and Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287 (1989)].

CD20 결합 항체 및 항-CD20 항체는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이에는 해당 항체가 항원을 발현하는 세포를 표적화하는데 있어서 치료제로서 유용하고 다음에 기재된 검정에서 음성 대조군 단백질과 같은 기타 단백질과 상당히 교차-반응하지 않도록 하는데 충분한 친화도로 CD20과 결합하는 모든 항체가 포괄된다. 이중-특이적 항체 [여기서는, 항체의 하나의 암 (arm)이 CD20과 결합한다]가 또한 고려된다. 또한, CD20 결합 항체의 정의에는 전술된 항체의 기능적 단편이 포괄된다. CD20 결합 항체는 Kd <10 nM로 CD20과 결합할 것이다. 바람직한 양태에서는, 결합이 Kd <7.5 nM, 보다 바람직하게는 <5 nM, 보다 더 바람직하게는 1 내 5 nM, 가장 바람직하게는 1 nM으로 이루어진다.

CD20 항원과 결합하는 항체의 예에는 현재 "리툭시마브 (Rituximab)" ("RITUXAN^®")로 불리우는 "C2B8" [참고: 미국 특허 제5,736,137호; 본원에 참고로 도입된다]; "Y2B8" 또는 "이브리투모마브 티욱세탄 (Ibritumomab Tiuxetan)" (ZEVALIN^®)로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린 항체 [참고: 미국 특허 제5,736,137호; 본원에 참고로 도입된다]; "131I-B1" 항체 [요오드 I131 토시투모마브 (tositumomab), BEXXAR™]를 생성시키기 위해 ¹³¹I로 임의로 표지시킨 뮤린 IgG2a "B1" [또한, "토시투모마브" (공급처: Beckman Coulter)로 불리우기도 한다] [참고: 미국 특허 제5,595,721호; 본원에 참고로 도입된다]; 뮤린 모노클로날 항체 "lF5" [참고: Press et al. Blood 69 (2): 584-591 (1987)] 및 그의 변이체 (이에는 "프레임워크 패치되거나" 또는 인간화 1F5가 포함된다) [참고: W0 03/002607, Leung, S.; ATCC 기탁번호 HB-96450]; 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체 [참고: 미국 특허 제5,677,180호; 본원에 참고로 도입된다]; 인간화 2H7; huMax-CD20 (Genmab, Denmark); AME-133 (공급처: Applied Molecular Evolution); A20 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어 키메라 또는 인간화 A20 항체 (각각 cA20, hA20) [참고: US 2003/0219433, Immunomedics]; 및 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (공급처: International Leukocyte Typing Workshop) [참고: Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))]이 포함된다.

본원에서의 용어 "리툭시마브" 또는 "리툭산 (RITUXAN^®)"은 CD20 항원에 대항하여 유도되고 미국 특허 제5,736,137호 (이는 본원에 참고로 도입된다)에서 "C2B8"로 명명된, 유전공학적으로 처리시킨 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체, 및 CD20과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 그의 단편을 지칭한다.

구체적 양태에서는, 항-CD20 항체가 인간 및 영장류 CD20과 결합한다. 구체적 양태에서는, CD20과 결합하는 항체가 인간화 또는 키메라 항체이다. CD20 결합 항체에는 리툭시마브 (RITUXAN^®), m2H7 (뮤린 2H7), hu2H7 (인간화 2H7) 및 그의 모든 기능적 변이체 [이에는 hu2H7.v16 (v는 버젼을 의미한다), v31, v73, v75 뿐만 아니라 푸코스 결핍성 변이체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다], 및 WO 2004/056312에 기재된 기타 2H7 변이체가 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 인간화 2H7v.16 및 그이 변이체의 서열은 성숙한 폴리펩티드의 서열, 즉 리더 서열을 수반하지 않는다.

CD20 항체에 관한 특허 및 특허 공개공보에는 다음이 포함된다: 미국 특허 제5,776,456호, 제5,736,137호, 제5,843,439호, 제6,399,061호 및 제6,682,734호 뿐만 아니라 미국 공개특허공보 US 2002/0197255A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172 Al, US 2003/0095963 Al, US 2003/0147885 Al (Anderson et al); 미국 특허 제6,455,043Bl호 및 WO 00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez and White); WO 00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); WO 00/44788 (Braslawsky et al); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO 01/10461 (Rastetter and White); WO 01/10460 (White and Grillo-Lopez); US 2001/0018041A1, US 2003/0180292A1, WO 01/34194 (Hanna and Hariharan); US 공개특허공보 US 2002/0006404 및 WO02/04021 (Hanna and Hariharan); US 공개특허공보 US 2002/0012665 Al 및 WO 01/74388 (Hanna, N.); US 공개특허공보 US 2002/0058029 Al (Hanna, N.); US 공개특허공보 US 2003/0103971 Al (Hariharan and Hanna); US 공개특허공보 US 2002/0009444A1, 및 WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO O1/97858 (White, C); US 공개특허공보 US 2002/0128488A1 및 WO 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky et al.); WO 02/096948 (Braslawsky et al.); WO 02/079255 (Reff and Davies); 미국 특허 제6,171,586Bl호, 및 WO 98/56418 (Lam et al); WO 98/58964 (Raju, S.); WO 99/22764 (Raju, S.); WO 99/51642, 미국 특허 제6,194,551Bl호, 미국 특허 제6,242,195Bl호, 미국 특허 제6,528,624Bl호 및 미국 특허 제6,538,124호 (Idusogie et al); WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd et al.); WO O1/03734 (Grillo-Lopez et al.); US 공개특허공보 US 2002/0004587Al 및 WO 01/77342 (Miller and Presta); US 공개특허공보 US 2002/0197256 (Grewal, I.); US 공개특허공보 US 2003/0157108 Al (Presta, L.); 미국 특허 제6,565,827Bl호, 제6,090,365Bl호, 제6,287,537Bl호, 제6,015,542호, 제5,843,398호, 및 제5,595,721호 (Kaminski et al); 미국 특허 제5,500,362호, 제5,677,180호, 제5,721,108호, 제6,120,767호, 제6,652,852Bl호 (Robinson et al); 미국 특허 제6,410,391Bl호 (Raubitschek et al); 미국 특허 제6,224,866Bl호 및 WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO OO/67795 (Goldenberg); 미국 공개특허공보 US 2003/0133930 Al 및 WO 00/74718 (Goldenberg and Hansen); WO 00/76542 (Golay et al.); WO 01/72333 (Wolin and Rosenblatt); 미국 특허 제6,368,596Bl호 (Ghetie et al); 미국 특허 제6,306,393호 및 미국 공개특허공보 US 2002/0041847 Al (Goldenberg, D.); 미국 공개특허공보 US 2003/0026801A1 (Weiner and Hartmann); WO 02/102312 (Engleman, E.); 미국 공개특허공보 2003/0068664 (Albitar et al.); WO 03/002607 (Leung, S.); WO 03/049694, US 2002/0009427A1, 및 US 2003/0185796 Al (Wolin et al.); WO 03/061694 (Sing and Siegall); US 2003/0219818 Al (Bohen et al); US 2003/0219433 Al 및 WO 03/068821 (Hansen et al); US 2003/0219818A1 (Bohen et al); US 2002/0136719A1 (Shenoy et al); WO 2004/032828 (Wahl et al) (이들 각각의 문헌이 본원에 참고로 도입된다). 또한 다음 문헌을 참고할 수 있다: 미국 특허 제5,849,898호 및 EP 특허원 제330,191호 (Seed et al); 미국 특허 제4,861,579호 및 EP 332,865A2 (Meyer and Weiss); 미국 특허 제4,861,579호 (Meyer et al); WO 95/03770 (Bhat et al); US 2003/0219433 Al (Hansen et al).

CD20 항체는 있는 그대로의 (노출된) 항체 (naked antibody) 또는 세포독성 화합물, 예를 들면, 방사성 동위원소 또는 독소와 접합된 항체일 수 있다. 이러한 항체에는 방사성 동위원소에 연결되어 있는 항체 제발린 (ZEVALIN™), 이트륨-90 (공급처: IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), 및 I-131에 접합되는 Bexxar™ (공급처: Corixa, WA)가 포함된다. 인간화 2H7 변이체에는 FR에서 아미노산 치환을 갖는 변이체, 및 이식된 CDR 상의 변화를 수반한 친화 돌연변이 변이체가 포함된다. CDR 또는 FR에서 치환된 아미노산은 공여자 또는 수용체 항체에 존재하는 것으로만 제한되지 않는다. 기타 양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 증강된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및 B-세포 사멸 (본원에서 B-세포 고갈로서 지칭되기도 함)을 포함하여 효과기 기능을 개선시켜 주는 Fc 영역에서의 아미노산 잔기 변화를 추가로 포함한다. 특히, CDC 및 ADCC 활성을 개선시키기 위한 3가지 돌연변이물이 확인되었고: S298A/E333A/K334A (본원에서 삼중 Ala 돌연변이체 또는 변이체로서 지칭되기도 함); Fc 영역에서의 넘버링은 문헌 [Idusogie et al., 상기 참고 (2001); Shields et al., 상기 참고]에 기재된 바와 같이 EU 넘버링 시스템을 따른다 [Kabat et al., 상기 참고].

본 발명의 기타 항-CD20 항체에는 안정성을 개선시켜 주는 특이적 변화를 갖는 항체가 포함된다. 한 양태에서는, 키메라 항-CD20 항체가 뮤린 V 영역과 인간 C 영역을 갖는다. 이러한 특이적 키메라 항-CD20 항체 중의 하나가 리툭산 (Rituximab^®; 공급처: Genentech, Inc.)이다. 리툭시마브 및 hu2H7은 보체-의존성 세포독성 (CDC)과 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC) 둘 다를 통하여 B 세포의 용해를 매개할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열과 증가되거나 감소된 Clq 결합 능력을 지니고 있는 항체 변이체는 미국 특허 제6,194,551B1호 및 W0 99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허공보의 내용은 구체적으로 본원에 참고로 도입된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. 2000, J. Immunol. 164: 4178-4184]을 참고할 수 있다.

세포자멸 억제제 (IAP)는 세포자멸을 억제하는 단백질 계열을 지칭한다 [참고: Deveraux, et al., (1999) Genes Dev 13(3):239-252]. IAPs의 예에는 카스파제 3, 카스파제 7 및 카스파제 9 활성을 억제하는, 흑색종 IAP (ML-IAP) 및 인간 X-염색체 연결된 IAP (XIAP) 세포성 IAP 1 (cIAP-1) 및 세포성 IAP 2 (cIAP-2)가 포함된다 [참고: Deveraux et al., J Clin Immunol (1999), 19:388-398; Deveraux et al, (1998) EMBO J. 17, 2215-2223; Vucic et al., (2000) Current Bio 10:1359-1366].

IAP의 억제제 (IAP 억제제)의 예에는 XIAP, cIAP-1, cIAP-2 또는 ML-IAP에 대항하여 유도된 안티센스 올리고뉴클레오티드, IAPs와 그들의 카스파제 간의 상호 작용을 차단시키는 Smac/DIABLO-유래된 펩티드 또는 기타 분자, 및 카스파제 활성의 IAP-매개된 저해를 억제시키는 분자가 포함된다 [참고: Sasaki et al, Cancer Res., 2000, 60(20):5659; Lin et al, Biochem J., 2001, 353:299; Hu et al, Clin. Cancer Res., 2003, 9(7):2826; Arnt et al, J. Biol. Chem, 2002, 277(46):44236; Fulda et al, Nature Med., 2002, 8(8):808; Guo et al, Blood, 2002, 99(9):3419; Vucic et al, J. Biol. Chem., 2002, 277(14): 12275; Yang et al, Cancer Res., 2003, 63(4):831; WO 2005/097791, WO 2005/094818, US 2005/0197403 and US 6,673,917].

본원에서의 "B 세포 표면 마커" 또는 "B 세포 표면 항원"은 이와 결합되는 길항제를 이용하여 표적화시킬 수 있는 B 세포의 표면 상에서 발현된 항원이다. B 세포 표면 마커의 예에는 다음이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: CDlO, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD52, D53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86, CD180 (RP105), FcRH2 (IRTA4), CD79A, C79B, CR2, CCR6, CD72, P2X5, HLA-DOB, CXCR5 (BLRl), FCER2, BR3 (aka BAFF-R), TACI, BTLA, NAG14 (aka LRRC4), SLGC16270 (ala LOC283663), FcRH1 (IRTA5), FcRH5 (IRTA2), ATWD578 (aka MGC15619), FcRH3 (IRTA3), FcRH4 (IRTAl), FcRH6 (aka LOC343413) 및 BCMA (aka TNFRSF17), HLA-DO, HLA-Dr10 및 MHC 부류 II.

바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 항체에는 WO 02/24909에 기재되고 기탁된 2.1 항체와 9.1 항체가 포함되지 않는다.

한 가지 바람직한 양태에 따르면, 본원에 사용된 바와 같은 "겉보기 Kd" 또는 "겉보기 Kd 값"은 한 가지 바람직한 양태에서 BIAcore^® 검정을 수행함으로써 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다. 한 가지 바람직한 양태에서, 본 발명의 BR3-결합 항체에 대한 겉보기 Kd 값은, 예를 들어 본원의 실시예 8에 기재된 바와 같이, 어느 하나의 BR3 EDC를 센서 칩 상에 고정화시키고 Fab 형태의 항-BR3 항체를 이러한 BR3 ECD-고정화 칩 상으로 유동시키거나 또는 IgG 형태의 항-BR3 항체를 센서 칩 상에 고정화시키고 BR3 ECD를 IgG-고정화 센서 칩 상으로 유동시키는 표면 플라스몬 공명을 수행함으로써 측정한다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 상기 센서 칩은 칩 상에 커플링된 단백질이 대략 10 반응 단위 (RU)로 존재하도록 단백질로 고정화시킨다. 또다른 바람직한 양태에서는, 본 발명의 FcRn-결합 항체에 대한 겉보기 Kd 값은, 예를 들어 실시예 16에 기재된 바와 같이, FcRn 폴리펩티드를 센서 칩에 고정화시키고 항체를 이러한 칩 상으로 유동시키는 표면 플라스몬 공명을 수행함으로써 측정한다.

본 발명에 따르는 "기능적 에피토프"는 항체의 결합성에 강력한 영향을 미치는 항원의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이와 같이 강력하게 영향을 미치는 항원의 잔기들 중의 어느 하나를 돌연변이시키면 (예를 들어, 알라닌 또는 동족체 돌연변이에 의해 야생형 BR3을 돌연변이시킴), 항원에 대한 항체의 결합성이 붕괴될 것이다. 본 발명의 한 가지 바람직한 양태에서는, 항-BR3 항체 상의 기능적 에피토프 내에 포함되는 잔기는 BR3 또는 그의 일부 [예: 세포외 도메인 또는 잔기 17-42 (경우에 따라 연구 중인 영역)]의 ala 돌연변이체를 파지 디스플레이함으로써 숏-건 알라닌 스캐닝에 의해 결정할 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 기능적 에피토프는 실시예 9에 기재된 과정에 따라서 결정한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합성을 매개하고, 그의 특정한 항원에 대한 특정한 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 대신, V 도메인은 각각 9 내지 12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 불리우는 보다 짧은 극도의 가변성 영역에 의해 격리된 15 내지 30개 아미노산의 프레임워크 영역 (FRs)으로 지칭된 비교적 불변인 연장물로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FRs을 포함하는데, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 상기 FRs에 의해 아주 근접하게 함께 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 각종의 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체 참여를 나타낸다.

본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들면, V_L 내의 잔기 약 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 및 V_H 내의 잔기 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [예를 들면, V_L 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 및 V_H 내의 잔기 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3); 참고: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)]를 포함한다.

초가변 영역은 다음과 같은 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 참고]에 따라서 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 규정된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 예를 들어, 경쇄 프레임워크 1 (LC-FRl), 프레임워크 2 (LC-FR2), 프레임워크 3 (LC-FR3) 및 프레임워크 4 (LC-FR4) 영역은 항체의 잔기 1-23, 35-49, 57-88 및 98-107 (카바트 넘버링 시스템)을 각각 포함한다. 또다른 예에서, 중쇄 프레임워크 1 (HC-FRl), 중쇄 프레임워크 2 (HC-FR2), 중쇄 프레임워크 3 (HC-FR3) 및 중쇄 프레임워크 4 (HC-FR4) 영역은 항체의 잔기 1-25, 36-48, 66-92 및 103-113 (카바트 넘버링 시스템)을 각각 포함한다.

한 양태에 따르면, 9.1, 2.1 및 11G9 항체로부터 유래된 항체의 경쇄의 CDR 영역 내의 잔기 대다수에 상응하는 잔기가 도 1 내지 3에 밑줄쳐져 있다. 또다른 양태에 따르면, V3 항체로부터 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역 내의 잔기 대다수에 상응하는 잔기가 도 15에 밑줄쳐져 있다.

본원에 지칭된 바와 같은 "컨센서스 서열" 또는 컨센서스 V 도메인 서열은 공지된 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 아미노산 서열들을 비교함으로써 유래된 인공 서열이다. 이러한 비교에 근거하여, 인간 H 쇄 아군 III V 도메인 및 인간으로부터 유래된 서열의 컨센서스인 V 도메인 아미노산을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제조하였다. 컨센서스 V 서열은 공지된 어떠한 항체 결합 특이성 또는 친화성을 지니고 있지 않다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 모노클로날 항체 생성 동안 유발될 수도 있는 가능한 변이체 (이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프와 결합하는 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 이러한 모노클로날 항체에는 전형적으로, 표적과 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체가 포함되는데, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선별하는 것을 포함하는 공정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 이러한 선별 공정은 복수 개의 클론, 예를 들어 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀 (pool)로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 이와 같이 선별된 표적 결합성 서열을 추가로 변경시켜, 예를 들어 표적에 대한 친화성을 개선시키고, 표적 결합성 서열을 인간화시키며, 세포 배양액 중에서의 그의 생성을 개선시키며, 생체내에서의 그의 면역원성을 저하시키고, 다중-특이적 항체를 창출시킬 수 있으며, 상기와 같이 변경된 표적 결합성 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체이기도 하다는 것을 인지해야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도, 전형적으로 기타 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 채로 있다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 특별한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 [참고: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981], 재조합 DNA 방법 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호], 파지 디스플레이 기술 [참고: 예를 들어, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]을 포함한 각종 기술, 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 유전자 또는 인간 면역글로불린 유전자 자리의 일부 또는 전부를 갖는 동물로부터 인간 또는 인간-유사 항체를 생성시키는 기술 [참고: 예를 들어, WO 98/24893, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호 (GenPharm); 제5,545,807호; WO 97/17852, 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호, 및 Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)]에 의해 만들 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)]. 키메라 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예: Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원-결합성 아서열)이다. 몇몇 양태에서, 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체, 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 일반적으로, 항체 성능을 추가로 정련시키고 최대화하기 위해 만들어진다. 전형적으로, 인간화 항체는 1개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되지만, FR 영역에는, 예를 들어 결합 친화성을 개선시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환물이 포함될 수도 있다. 몇몇 양태에서, FR 중의 이들 아미노산 치환물의 수는 전형적으로, H 쇄 중에 6개 이하이고, L 쇄 중에는 3개 이하이다. 한 가지 바람직한 양태에서, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역 또는 인간 컨센서스 불변 서열의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]. 인간화 항체에는 항체의 항원-결합성 영역이, 예를 들어 짧은 꼬리 원숭이 (macaque)를 관심있는 항원으로 면역시킴으로써 생성된 항체로부터 유래되는 PRIMATIZED^® 항체가 포함된다. 인간화 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함한, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성시킬 수도 있다 [참고: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. 다음 문헌에 기재된 기술 또한, 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위해 이용 가능하다 [참고: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. 또한 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). PCT 공개공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제0 598 877호; 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 및 제5,939,598호].

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합성 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중-특이적 항체가 포함된다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 단단하게 비공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 이들 2개 도메인을 폴딩하면, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여해 주는 6개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 생성된다. 그러나, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.

본 발명의 BR3 결합 항체의 "기능적 단편"은 시험관내 또는 생체내 검정, 예를 들어 본원에 기재된 검정에 의해 측정된 바와 같이, B 세포의 고갈, B 세포 증식 억제 또는 BR3에 대한 BAFF 결합 억제로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 검정에서 활성이고 그들이 유래되는 본래의 완전한 쇄 분자와 실질적으로 동일한 친화도로 BR에 대한 결합성을 유지하고 있는 단편이다.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는데, 이는 항체 이소형에 따라서 다양하다. 항체 효과기 기능의 예에는 Clq 결합성 및 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다. "천연 서열 Fc 영역"은 천연상 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. Fc 서열의 예가 서열 133, 135-141에 제시되어 있고, 이에는 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형, 각각 서열 133 및 135); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역 (서열 136); 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역 (서열 137); 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 (서열 138) 뿐만 아니라 그의 천연 발생적 변이체가 포함된다. 천연 서열 뮤린 Fc 영역의 예가 서열 139-142에 제시되어 있다 (각각, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3).

"변이체 Fc 영역"은 본원에 정의된 바와 같은 한 가지 이상의 "아미노산 변형"을 통하여 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교해서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 (예: 서열 133)과의 상동성이 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상일 것이다. 또다른 양태에 따르면, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 모 폴리펩티드의 Fc 영역과의 상동성이 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 99％ 이상일 것이다.

본원에서 확인된 폴리펩티드 및 항체 서열과 관련한 "아미노산 서열 동일성 (％)" 또는 "상동성"은 서열 동일성의 일부로서의 모든 보존적 치환을 고려하여 서열을 정렬시킨 후, 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율 (％)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 수준 내의 각종 방식으로 달성할 수 있는데, 예를 들어 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈리안 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용한다. 당업자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있으며, 이에는 비교되는 전장 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 알고리즘이 포함된다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 (％) 값은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. ALIGN-2 서열 비교용 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)사에 의해 창시되었고, 원시 코드는 미국 저작권국 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서 제출함으로써 출원하였으며, 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 공급처 [Genentech, Inc., South San Francisco, California]를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교용 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.

용어 "Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 이뮤노어드헤신 (하기 정의 참고)를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따르는 잔기 447)은, 예를 들어 폴리펩티의 정제 동안 또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 공학 처리함으로써 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 (항체 포함)를 포함하는 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 폴리펩티드 집단, K447 잔기가 전혀 제거되지 않은 폴리펩티드 집단, 또는 K447 잔기를 수반한 폴리펩티드와 K447 잔기를 수반하지 않는 폴리펩티드의 혼합물을 갖는 폴리펩티드 집단을 포함할 수 있다.

본 명세서와 청구의 범위 전반에 걸쳐, 카바트 넘버링 시스템은 일반적으로, 가변 도메인 내의 특정 잔기 (대략적으로, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우에 사용된다 [참고: Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 특정 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 본원에 참고로 도입된 문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 보고된 EU 인덱스). 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 [참고: 예를 들어, 미국 가특허원 제60/640,323호, EU 넘버링에 대한 도면].

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 기재하기 위해 사용된다. 한 양태에서, 본 발명의 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)와 결합하는 것이고, 이에는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 아부류의 수용체가 포함되는데, 이에는 이들 수용체의 대립 유전자성 변이체 및 대체 스플라이싱된 형태 또한 포함된다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제성 수용체")가 포함되는데, 이는 그의 세포질성 도메인에 있어서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질성 도메인 내에 면역수용체 티로신-기재 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 [참고: M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)]. 상기 용어에는 동종이형, 예를 들어 FcγRIIA 동종이형: FcγRIIA-Phe158, FcγRIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131이 포함된다. FcRs는 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-492 (1991); Capel et al. Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al. J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]. 기타 FcRs는 앞으로 확인될 것을 포함하여, 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어에는 또한, 모계 IgGs를 태아에게 전이시키는데 책임이 있는 신생아 수용체 FcRn이 포함된다 [참고: Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)].

용어 "FcRn"은 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 지칭한다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 구조상 유사하고, β2-마이크로글로불린과 비-공유적으로 결합된 α-쇄로 이루어진다. 신생아 Fc 수용체 FcRn의 여러 가지 기능이 다음 문헌에 고찰되었다 [참고: Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766]. FcRn은 면역글로불린 IgGs를 어머니로부터 유아에게 수동 전달하고 혈청 IgG 수준을 조절하는데 있어 일정 역할을 한다. FcRn은 재이용 수용체로서 작용하여, 세포 내에서 및 세포를 가로질러 천연 형태의 세포흡수된 IgGs를 결합 및 수송할 수 있고, 이들을 디폴트 분해 경로로부터 구조할 수 있다.

문헌 [참고: WO 00/42072 (Presta) and Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]에는 FcRs에 대한 결합성이 개선되거나 저하된 항체 변이체가 기재되어 있다. 이들 공개 문헌의 내용이 본원에 구체적으로 참고로 도입된다.

인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인" ("H1" 도메인의 "Cl"로서 지칭되기도 함)은 통상적으로, 아미노산 약 118에서부터 아미노산 약 215까지 연장된다 (EU 넘버링 시스템).

"힌지 영역은 일반적으로, 인간 IgG1의 Glu216에서 부터 Pro230까지 연장하는 것으로 규정된다 [참고: Burton, Molec. Immunol.22:16l-206 (1985)]. 기타 IgG 이소형의 힌지 영역은, 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인 잔기와 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 놓아둠으로써 IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다.

Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 힌지 영역에 대해 바로 C-말단인 잔기들, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239의 연장물로서 통상 규정된다. 본 발명 이전에는, FcR 결합성이 일반적으로, IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역 내의 아미노산 잔기에 기인하였다.

인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("H2" 도메인의 "C2"로서 지칭되기도 함)은 통상적으로, 아미노산 약 231에서부터 아미노산 약 340까지 연장된다. 이러한 CH2 도메인은 그것이 또다른 도메인과 근접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄가 천연 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 이러한 탄수화물이 도메인-도메인 쌍 형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는데 도움을 줄 수 있는 것으로 추측되었다 [참고: Burton, Molec. Immunol. 22:16l-206 (1985)].

"CH3 도메인" ("H3" 도메인의 "C3"으로서 지칭되기도 함)은 Fc 영역에서 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 연장물을 포함한다 (즉, 항체 서열의 아미노산 잔기 약 341에서부터 C-말단까지, 전형적으로 IgG의 아미노산 잔기 446 또는 447까지).

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "효과기 기능"을 보유하고 있다. "효과기 기능"의 예에는 Clq 결합성; 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합성; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예: B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이 포함된다. 이러한 효과기 기능을 위해서는 일반적으로, Fc 영역이 결합성 도메인 (예: 항체 가변 도메인)과 합해야만 하고, 이는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 각종 검정을 이용하여 평가할 수 있다.

"Clq"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. Clq는 2개의 세린 프로테아제 Clr 및 Cls와 함께, 복합체 Cl을 형성하는데, 이는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 경로의 제1 성분이다. 인간 Clq는, 예를 들어 다음 공급처로부터 구입할 수 있다 [공급처: Quidel, San Diego, CA].

용어 "결합성 도메인"은 또다른 분자와 결합하는 폴리펩티드의 영역을 지칭한다. FcR의 경우, 결합성 도메인은 Fc 영역을 결합시키는데 책임이 있는 그의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 그의 알파 쇄)의 일부를 포함할 수 있다. 한 가지 유용한 결합성 도메인은 FcR 알파 쇄의 세포외 도메인이다.

"변경된" FcR 결합 친화성 또는 ADCC 활성을 지닌 변이체 IgG Fc를 수반하는 폴리펩티드는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교해서 증강되거나 저하된 FcR 결합 활성 (FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성을 지닌 것이다.

FcR에 대한 "증가된 결합성을 나타내는" 변이체 Fc는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 IgG Fc 보다 더 높은 친화도 (예를 들어, 보다 낮은 겉보기 Kd 또는 IC50 값)로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 몇몇 양태에 따르면, 모 폴리펩티드와 비교한 결합성 상의 개선은 약 3배, 바람직하게는 약 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, 500배 이하, 또는 약 25％ 내지 1000％ 개선일 수 있다. FcR에 대한 "저하된 결합성을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드 보다 더 낮은 친화도 (예를 들어, 보다 높은 겉보기 Kd 또는 IC50 값)로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 모 폴리펩티드와 비교한 결합성 상의 저하는 약 40％ 이상의 저하일 수 있다. 한 양태에서, 이와 같이 FcR에 대한 저하된 결합성을 나타내는 Fc 변이체는 FcR에 대한 인지할 만한 수준의 결합이 거의 또는 전혀 없는데, 예를 들어 본원의 실시예에서 결정된 바와 같이 천연 서열 IgG Fc 영역과 비교해서 FcR에 대한 0 내지 20％ 정도의 결합성을 나타낸다.

"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정의 세포독성 세포 [예: 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포] 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs)와 결합된 분비된 IgG로 인해, 이들 세포독성 효과기 세포가 항원-보유 표적 세포와 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 연속해서 이러한 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 이러한 세포독성 세포와 "전투 준비를 하므로", 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는데 있어 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [참고: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예를 들어 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 검정, 또는 다음 실시예에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 또다른 한편 또는 부가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [참고: Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)]에 기재된 바와 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다.

야생형 IgG Fc을 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드 보다 더 효과적으로 인간 효과기 세포의 존재하에 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 매개하거나 "증가된 ADCC를 나타내는" 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 본 검정에 사용된 변이체 Fc 영역을 수반한 폴리펩티드와 야생형 Fc 영역을 수반한 폴리펩티드 (또는 모 폴리펩티드)의 양이 본질적으로 동일한 경우에, ADCC를 매개하는데 있어 시험관 내에서 또는 생체내에서 실질적으로 보다 유효한 것이다. 일반적으로, 이러한 변이체는 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 확인할 것이지만, 예를 들어 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하는 기타 검정 또는 방법도 고려된다. 한 양태에서, 바람직한 변이체는 ADCC를 매개하는데 있어서 야생형 Fc (또는 모 폴리펩티드) 보다 약 5배 내지 약 100배, 예를 들어 약 25배 내지 약 50배 정도 더 유효하다.

"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서 표적 세포를 용해시키는 것을 지칭한다. 전통적인 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을, 그의 동족 항원과 결합하는 (적당한 아부류의) 항체와 결합시킴으로써 개시시킨다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [참고: Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.

변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 수반하고 증가되거나 저하된 Clq 결합 능력을 지닌 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 제6,194,551Bl호 및 WO 99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허 공개공보의 전문이 본원에 구체적으로 참고로 도입된다. 또한 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)].

"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 한 양태에 따르면, 상기 세포가 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되는데, PBMCs 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 그의 천연 공급원, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 혈액 또는 PBMCs로부터 단리할 수 있다.

FcRn에 대한 결합성을 측정하는 방법은 다음 실시예에 기재되어 있을 뿐만 아니라 공지되어 있다 [참고: Ghetie 1997, Hinton 2004]. 인간 FcRn 고 친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기 및 생체내에서 인간 FcRn에 대한 결합성은, 예를 들어 인간 FcRn를 발현하는 형질감염된 인간 세포주 또는 트랜스제닉 마우스에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. 한 양태에서는, 변이체 IgG Fc를 갖는 본 발명의 폴리펩티드 및 구체적으로는 항체가, 야생형 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드에 비해 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 100배 이상, 125배 이상, 150배 이상 증가된다. 구체적 양태에서는, 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 약 170배 정도 증가된다.

FcRn에 대한 결합 친화도의 경우, 한 양태에서는 상기 폴리펩티드의 EC50 또는 겉보기 Kd (pH 6.0에서)는 1 μM 미만, 보다 바람직하게는 100 nM 이하, 보다 바람직하게는 10 nM 이하이다. 한 양태에서, FcγRIII에 대한 증가된 결합 친화도의 경우 (F158; 즉, 저-친화도 이소형), EC50 또는 겉보기 Kd가 10 nM 이하이고, FcgRIII의 경우 (V158; 고-친화도 이소형), EC50 또는 겉보기 Kd는 3 nM 이하이다. 또다른 양태에 따르면, 대조군 항체 (Herceptin^® 항체)와 비교해서 Fc 수용체에 대한 항체 결합성이 저하되는 것은, 시험 항체와 대조군 항체의 결합 곡선의 중간점에서의 흡광도 비 (예: A_{450 nm (항체)}/A_{450 nm (대조군 Ab)})가 40％ 이하인 경우에, 대조군 항체에 비해 상당한 것으로 간주될 수 있다. 또다른 양태에 따르면, 대조군 항체 (Herceptin^® 항체)와 비교해서 Fc 수용체에 대한 항체 결합이 증가되는 것은, 시험 항체와 대조군 항체의 결합 곡선의 중간점에서의 흡광도 비 (예: A_{450 nm (항체)}/A_{450 nm (대조군 Ab)})가 125％ 이상인 경우에, 대조군 항체에 비해 상당한 것으로 간주될 수 있다 (예를 들어, 실시예 16 참고).

"모 폴리펩티드" 또는 "모 항체"는 그로부터 변이체 폴리펩티드 또는 항체가 유발되고 이에 대항하여 변이체 폴리펩티드 또는 항체가 비교되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체이다. 전형적으로, 모 폴리펩티드 또는 모 항체에는 본원에 기재된 Fc 영역 변형들 중의 하나 이상이 결여되고 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 변이체와 비교해서 효과기 기능 면에서 상이하다. 모 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예: 부가, 결실 및/또는 치환)을 수반하는 Fc 영역을 포함할 수 있다.

"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩티드"는 함께 공유적으로 연결된 폴리펩티드 서열의 2개 부분을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 대부분의 양태에서, 이러한 부분 각각은 천연상 서로 연합되지 않고/않거나 상이한 특성을 지닌 폴리펩티드 서열이다. 이러한 특성은 생물학적 특성, 예를 들면 시험관내 또는 생체내 활성일 수 있다. 특성은 또한, 단순한 화학적 또는 물리적 특성, 예를 들어 표적 분자에 대한 결합성, 반응의 촉매작용 등일 수 있다. 2개의 부분을 단일 펩티드 결합에 의해 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 통하여 직접 연결할 수 있다. 일반적으로, 상기 2개의 부분은 서로 동일한 판독 프레임 내에서 연결될 것이다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 항체는 이것이 생성되는 환경의 특정 구성분으로 확인되어, 이러한 환경으로부터 격리 및/또는 회수시킨 것이다. 오염 성분은 상기 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 항체 또는 폴리펩티드를 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색 (silver stain)을 이용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 단리된 항체 또는 폴리펩티드에는 재조합 세포 내의 계내 항체 또는 폴리펩티드가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체 또는 폴리펩티드는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"단리된" 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 기타 폴리펩티드-코딩 핵산은 이것이 해당 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 연합되는 한 가지 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 격리되는 핵산 분자이다. 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연상 발견되는 형태 또는 세팅 이외의 것이다. 따라서, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 특이적 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와는 구별되는데, 이것이 천연 세포에 존재하기 때문이다. 그러나, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자에는 폴리펩티드를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자가 포함되는데, 여기서는 예를 들어, 이러한 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체 위치 내에 있다.

용어 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현시키는데 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열에는, 예를 들어 프로모터, 임의의 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵성 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 증강인자를 활용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 이것이 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들어, 프리-서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동가능하게 연결되어 있거나; 프로모터 또는 증강인자는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동가능하게 연결되어 있거나; 또는 리보솜-결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키도록 위치 설정된 경우에 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된 것이고, 분비성 리더인 경우에는 연속된 판독 기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 증강인자는 연속적이지 않다. 편리한 제한 부위에서 연결시킴으로써 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용한다.

"벡터"에는 셔틀 및 발현 벡터가 포함된다. 전형적으로, 플라스미드 구조물은 플라스미드를 세균에서 복제 및 선별하기 위한 복제 기점 (예: ColE1 복제 기점) 및 선별성 마커 (예: 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성)를 각각 포함할 것이다. "발현 벡터"는 본 발명의 항체 (항체 단편 포함)를 세균 또는 진핵성 세포에서 발현하는데 필요한 제어 서열 또는 조절성 요소를 함유하는 벡터를 지칭한다. 적합한 벡터는 다음에 기재되어 있다.

본 발명의 BR3 결합 항체를 생산하는 세포에는 이러한 항체를 코딩하는핵산을 도입시킨 세균 및 진핵성 숙주 세포가 포함될 것이다. 적합한 숙주 세포는 다음에 기재되어 있다.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자에 의해 용이하게 결정할 수 있는데, 이는 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라서 실험적으로 계산한다. 일반적으로, 보다 긴 프로브는 적당한 어닐링을 위해 보다 고온을 필요로 하는 반면, 보다 짧은 프로브는 보다 저온을 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로, 상보적 가닥이 그들의 융점 아래 환경 하에 존재하는 경우에 변성 DNA가 재어닐링될 수 있는 능력에 좌우된다. 프로브와 혼성화 가능한 서열 간의 목적하는 상동성이 보다 높을 수록, 보다 높은 상대 온도를 사용할 수 있다. 그 결과, 보다 고온의 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 하는 경향이 있는 반면, 보다 저온은 이러한 경향을 감소시킨다. 혼성화 반응 엄격도에 관한 부가의 상세 내역과 설명은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)].

본원에 규정된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고도로 엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들어 50℃ 하에 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1％ 나트륨 도데실 설페이트를 이용하는 조건; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들어 포름아미드, 예를 들면 42℃ 하에 750 mM 염화나트륨, 75 mM 나트륨 시트레이트를 수반한 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜 (Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 수반한 50％ (v/v) 포름아미드를 이용하는 조건; 또는 (3) 42℃ 하에 50％ 포름아미드, 5xSSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5x 덴하르츠 (Denhardt) 용액, 초음파 처리시킨 연어 정액 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 설페이트를 이용하고, 42℃ 하에 0.2xSSC (염화나트륨/나트륨 시트레이트)에서 10분 동안 세척한 다음, 55℃ 하에 EDTA를 함유하는 0.1xSSC로 이루어진 10분 동안의 고도로 엄격한 세척을 수행하는 조건에 의해 확인할 수 있다.

"적당한 수준으로 엄격한 조건"은 문헌 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 이에는 상기 언급된 것 보다는 덜 엄격한 혼성화 조건 (예: 온도, 이온 강도 및 SDS 비율(％)) 및 세척 용액의 사용이 포함된다. 적당한 수준으로 엄격한 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM 삼나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르츠 용액, 10％ 덱스트란 설페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃ 하에 밤새 인큐베이션한 다음, 약 37 내지 50℃ 하에 1xSSC 중에서 필터를 세척한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요인들을 수용하기에 필요한 정도로 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인지하고 있을 것이다.

본원에 사용된 경우의 용어 "에피토프 태그화"는 "태그 폴리펩티드"와 융합된 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 생성되게 할 수 있는 에피토프를 제공하기에는 충분한 잔기를 갖지만, 이것이 이와 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧은 잔기를 갖는다. 태그 폴리펩티드는 바람직하게, 꽤 독특하므로 항체가 기타 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 못한다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로, 6개 이상의 아미노산 잔기, 통상적으로는 약 8개 내지 50개 아미노산 잔기를 갖는다 (바람직하게는, 약 10개 내지 20개 아미노산 잔기를 갖는다). 에피토프-태그화되는 본 발명의 폴리펩티드 및 항체가 고려된다.

본 발명의 항-BR3 폴리펩티드 또는 항체와 관련한 "생물학적으로 활성인", "생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드가 BR3과 결합한다는 것을 의미한다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 인간 BR3 폴리펩티드와 결합한다.

추가의 양태에서, 본 발명의 항-BR3 폴리펩티드 또는 항체는 다음 활성들 중의 어느 한 가지 활성, 활성의 모든 조합, 또는 활성 모두을 지니기도 한다: (1) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 활성; (2) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고 설치류 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 활성; 및 (3) 인간 BAFF에 대한 인간 BR3 결합을 억제하는 활성. 항체에 대한 목적하는 용도에 따라서, 항체는 다음 활성들 중의 어느 한 가지 활성을 추가로 포함할 수 있다: (1) 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 지닌 활성; (2) 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 증가된 ADCC를 지닌 활성; 또는 (3) 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 감소된 ADCC를 갖는 활성. 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드 보다 높은 친화도로 인간 Fc 신생아 수용체 (FcRn)와 결합한다.

본 발명의 길항제 항-BR3 폴리펩티드 또는 항체와 관련한 "생물학적으로 활성인", "생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 다음 활성들 중의 어느 한 가지 활성, 활성의 모든 조합, 또는 활성 모두을 지닌 항체 또는 폴리펩티드를 의미한다: (1) B 세포 증식을 억제하는 활성; (2) B 세포 생존을 억제하는 활성; (3) B 세포를 생체내에서 사멸 또는 고갈시키는 활성. 한 양태에 따르면, 상기 항-BR3 항체 또는 폴리펩티드로 처리하지 않은 적당한 음성 대조군 또는 기저 수준과 비교해서, B 세포 고갈이 20％ 이상이다. 또다른 양태에 따르면, 길항성 항체는 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 지니거나, 또는 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 증가된 ADCC를 지닌다.

본 발명의 작동제 항-BR3 폴리펩티드 또는 항체와 관련한 "생물학적으로 활성인", "생물학적 활성" 및 "생물학적 특징"은 상기 항체 또는 폴리펩티드가 다음 활성들 중의 어느 한 가지 활성 또는 활성 둘 다를 지닌다는 것을 의미한다: (1) B 세포 증식을 자극하는 활성; 및 (2) B 세포 생존을 자극하는 활성. 한 양태에 따르면, 작동성 항체는 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 감소된 ADCC를 지닌다.

본원에 구체적으로 기재된 아미노산 서열은 달리 명시되지 않는 한, 연속되는 아미노산 서열이다.

본원에 기재된 본 발명의 폴리펩티드 상의 변이는, 예를 들어 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 관한 기술과 지침을 사용하여 만들 수 있다. 변이는 이러한 폴리펩티드의 아미노산 서열 상의 변화를 가져다 주는, 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 지닌 또다른 아미노산으로 대체함으로써, 예를 들어 루이신을 세린으로 대체 (즉, 보존적 아미노산 대체)함으로써 비롯될 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로, 약 1 내지 5개 아미노산 범위 내일 수 있다. 허용된 변이는 서열 내의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환이 체계적으로 이루어지도록 하고, 이로써 생성된 변이체를 대상으로 하여 전장 또는 성숙한 천연 서열에 의해 나타낸 활성에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다.

본 발명 내에서 사용된 바와 같은 용어 "보존적" 아미노산 치환은 기능적 등가의 아미노산을 치환시키는 아미노산 치환을 지칭한다. 보존적 아미노산 변화로 인해, 이로써 생성되는 펩티드의 아미노산 구조 또는 기능에 있어 최소한의 변화가 일어난다. 예를 들어, 유사한 극성의 1개 이상의 아미노산이 기능적 등가물로서 작용하여, 해당 펩티드의 아미노산 서열 내에서 침묵 (silent) 변경을 유발시킨다. 일반적으로, 특정 군 내에서의 치환은 구조와 기능 면에서 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 당업자는 특정한 잔기의 역할이 그것이 존재하는 분자의 3차원적 구조 내에서의 전후 관계에 의해 결정된다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, Cys 잔기는 산화된 (디설파이드) 형태로 존재할 수 있는데, 이는 환원된 (티올) 형태 보다 덜 극성이다. Arg 측쇄의 장 지방족 부분은 그의 구조적 또는 기능적 역할에 있어 결정적인 특징을 구성할 수 있고, 이는 또다른 염기성 잔기가 아닌 비극성 잔기를 치환시킴으로써 가장 잘 보존될 수 있다. 또한, 방향족기를 함유하는 측쇄 (Trp, Tyr, 및 Phe)는 이온성-방향족 또는 "양이온-파이" 상호 작용에 참여할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 경우에는, 이들 측쇄 중의 하나를 산성 또는 전하를 띠지 않은 극성기의 한 구성원으로 치환시키는 것이 구조와 기능 면에서 보존적일 수 있다. Pro, Gly, 및 Cys (디설파이드 형태)와 같은 잔기는 주쇄 입체 형태에 대해 직접적인 효과를 나타낼 수 있으므로, 종종 구조적인 왜곡없이 치환될 수가 없다.

보존적 치환물에는 측쇄 상의 유사성에 근거한 다음 구체적 치환물과, 다음에 열거되는 예시 치환물 및 바람직한 치환물이 포함된다. 아미노산은 그들의 측쇄 특성 면에서의 유사성에 따라서 분류될 수 있다 [참고: A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]:

(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) 전하를 띠지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) 산성: Asp (D), Glu (E)

(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)

또다른 한편, 천연 발생적 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 나눌 수 있다:

(1) 소수성: 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환으로 인해서는, 이들 부류 중의 하나의 구성원이 또다른 부류의 구성원으로 교환될 것이다. 이와 같이 치환된 잔기는 또한, 보존적 치환 부위 내로 도입될 수 있거나, 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 범위 내에서의 용어 "아미노산"은 그의 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 천연 발생적 L-알파 아미노산 또는 잔기가 포함된다. 천연 발생적 아미노산에 대해 흔히 사용되고 있는 1 문자 및 3 문자 약어가 본원에 사용된다 [참고: Lehninger, A.L., Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, (1975), Worth Publishers, New York]. 상기 용어에는 D-아미노산 뿐만 아니라 화학적으로 변형된 아미노산, 예를 들어 아미노산 유사체, 단백질 내로 통상적으로 혼입되지 않는 천연 발생적 아미노산 (예: 노르루이신), 및 당해 분야에서 아미노산에 특징적인 것으로 공지된 특성을 지닌 화학적으로 합성된 화합물이 포함된다. 예를 들어, 천연 Phe 또는 Pro와 동일한 펩티드 화합물의 입체 형태적 제한을 허용해주는, 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체와 모방체는 본원에서 아미노산의 "기능적 등가물"로서 지칭된다. 아미노산의 기타 예가 다음 문헌에 열거되어 있다 [참고: Roberts and Vellaccio (The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,) Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5 p 341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983; 본원에 참고로 도입된다].

본원에 기재된 표준 고체 상 합성 기술에 의해 합성된 펩티드는, 예를 들어 아미노산과 관련된 치환을 위해 유전자에 의해 코딩된 아미노산으로 제한되지 않는다. 흔히 직면하게 되는, 유전자 코드에 의해 코딩되지 않는 아미노산에는, 예를 들어 국제공개공보 WO 90/01940에 기재된 것 뿐만 아니라, 예를 들어 Glu 및 Asp의 경우에는 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp의 경우에는 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu, 및 기타 지방족 아미노산의 경우에는 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu, 및 기타 지방족 아미노산의 경우에는 2-아미노헵타노산 (Ahe); Gly의 경우에는 2-아미노이소부티르산 (Aib); Val, 및 Leu 및 Ile의 경우에는 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys의 경우에는 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His의 경우에는 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr); Gly, Pro, 및 Ala의 경우에는 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro, 및 Ala의 경우에는 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln의 경우에는 N-에틸아스파리긴 (EtAsn); Lys의 경우에는 히드록실리신 (Hyl); Lys의 경우에는 알로히드록실리신 (AHyl); Pro, Ser, 및 Thr의 경우에는 3-(및 4)히드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu, 및 Val의 경우에는 알로-이소루이신 (AIle); Ala의 경우에는 -아미디노페닐알라닌; Gly, Pro, 및 Ala의 경우에는 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile의 경우에는 N-메틸이소루이신 (MeIle); Met 및 기타 지방족 아미노산의 경우에는 노르발린 (Nva); Met 및 기타 지방족 아미노산의 경우에는 노르루이신 (Nle); Lys, Arg 및 His의 경우에는 오르니틴 (Orn 또는 Or); Thr, Asn 및 Gln의 경우에는 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 설폭시드 (MSO); Phe의 경우에는 - 메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로 (F, Cl, Br, 및 I)페닐알라닌, 트리플루오릴페닐알라닌이 포함된다.

이러한 변이들은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-매개된 (부위-지시된) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이 유발을 이용하여 만들 수 있다. 부위-지시된 돌연변이 유발 [참고: Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발 [참고: Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선별 돌연변이 유발 [참고: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 또는 기타 공지된 기술을 클로닝된 DNA 상에서 수행하여 변이체 DNA를 생성시킬 수 있다.

스캐닝 아미노산 분석을 또한 이용하여 연속되는 서열을 따라 1개 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 특히 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 포함된다. 이러한 군 중에서 알라닌이 전형적으로 바람직한 스캐닝 아미노산인데, 이는 이것에는 베타-탄소를 벗어난 측쇄가 없어 변이체의 주쇄 입체 형태가 변경되는 경향이 덜하기 때문이다 [참고: Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 알라닌은 또한 전형적으로 바람직한데, 이는 이것이 가장 흔한 아미노산이기 때문이다. 추가로, 이는 숨겨진 위치와 노출된 위치 둘 다에서 종종 발견된다 [참고: Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환으로 인해 적당 량의 변이체가 산출되지 못하는 경우에는, 이소테릭 아미노산을 사용할 수 있다.

용어 "검출하는"에는 특정 분자의 존재 또는 부재를 결정하거나, 또는 특정 분자의 양을 정성적 또는 정량적으로 결정하는 것이 포함된다. 따라서, 상기 용어는 정성적 및 정량적 결정을 위해 본 발명의 물질, 조성물 및 방법을 사용하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 검출을 위해 사용된 특별한 기술이 본 발명의 실시에 중요하지는 않다.

예를 들어, 본 발명에 따르는 "검출하는"에는, 예를 들어 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여, 특정 분자의 존재 또는 부재, 폴리펩티드를 발현하는 세포의 수, 분자 수준 상의 변화, 또는 표적과 결합된 분자 또는 분자와 결합된 표적의 양에 있어서의 변화를 검출하는 것; 특정 분자의 생물학적 기능/활성 [예: 리간드 또는 수용체 결합 활성, 세포내 신호 전달 (예: NF-kB 활성화), 종양 세포 증식, B 세포 증식, 또는 생존 등] 상의 변화를 검출하는 것이 포함될 수 있다. 몇몇 양태에서, "검출하는"에는 분자의 야생형 수준 (예: mRNA 또는 폴리펩티드 수준)을 검출하는 것이 포함될 수 있다. 검출에는 대조군과 비교해서 10％ 내지 90％, 또는 30 내지 60％, 또는 100％ 이상의 변화 (증가 또는 감소)를 정량화하는 것이 포함될 수 있다. 검출에는 2배 내지 10배 이상, 또는 예를 들어, 100배 이상의 변화를 정량화하는 것이 포함될 수 있다. 따라서, 예를 들어 BR3 분자에 대한 언급은 그의 mRNA 또는 단백질 등을 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "BR3 분자"는 BR3 폴리펩티드; BR3 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 이소형, 단편, 유사체 또는 변이체와 실질적으로 동일한 분자를 지칭한다. 예를 들어, BR3 분자에는 포유류로부터 유래된 BR3 폴리펩티드의 이소형, 단편, 유사체 또는 변이체가 포함될 수 있는데, 이러한 BR3 분자는 BAFF와 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "BAFF 분자"는 BAFF 폴리펩티드; BAFF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 이소형, 단편, 유사체 또는 변이체와 실질적으로 동일한 분자를 지칭한다. 예를 들어, BAFF 분자에는 포유류로부터 유래된 BAFF 폴리펩티드의 이소형, 단편, 유사체 또는 변이체가 포함될 수 있는데, 이러한 BAFF 분자는 BR3과 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 치료하고자 하는 대상체는 포유류 (예: 인간, 비-인간 영장류, 랫트, 마우스, 암소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 대상체는 임상 환자, 임상 시험 자원자, 실험용 동물 등일 수 있다. 대상체는 암 또는 면역 질병이 있거나 이러한 암 또는 면역 질병에 걸릴 위험이 있는 것으로 추정될 수 있거나, 암 또는 면역 질병이 있는 것으로 진단될 수 있거나, 또는 암이 없는 것으로 확인된 대조군 대상체일 수 있다. 암 및 면역 질병에 대한 많은 진단 방법, 및 암 또는 면역 진단에 관한 임상적 묘사 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따라서 치료하고자 하는 대상체는 인간이다.

"치료하는", "치료 (처치)" 또는 "완화"는 처치를 지칭하는데, 이의 목적은 표적화된 병리적 질환이나 장애를 예방하거나 느리게 진행 (경감)시키거나, 또는 이러한 장애 증상 일부를 경감시키는 것이다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 장애가 있는 대상체 뿐만 아니라 이러한 장애를 지니기 쉬운 대상체, 또는 해당 장애를 예방시키고자 하는 대상체가 포함될 수 있다. 본 발명의 치료량의 폴리펩티드 또는 항체를 투여한 후에, 환자가 다음 중의 한 가지 이상이 부재하거나 또는 관찰 가능하고/하거나 측정 가능한 수준으로 저하된 경우에, 이러한 대상체 또는 포유류는 암에 대해 성공적으로 "치료"된 것이다: 암 세포 수를 감소시키거나 암 세포를 없애고/없애거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것 (암이 연질 조직과 뼈로 확산되는 것을 포함함)을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 특이적 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키고/시키거나; 발병률 및 사망률을 감소시키고/시키거나; 삶의 질을 개선시킨다. 본 발명의 폴리펩티드가 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는, 이것이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 이들 징후 또는 증상 감소를 환자가 느낄 수도 있다.

용어 "치료 유효량"은 특정 대상체에게서 특정 질병 또는 장애를 "완화" 또는 "치료"하는데 유효한 본 발명의 폴리펩티드의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다.

"만성" 투여는 작용제(들)를 급성 방식과는 달리 지속적인 방식으로 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)가 장기간 유지되도록 하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 수행하지는 않지만, 사실상 순환식 치료이다.

본원에 사용된 바와 같은 "담체"에는 이용된 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유류에게 무독성인 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제가 포함된다. 종종 생리상 허용 가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리상 허용 가능한 담체의 예에는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알코올, 예를 들어 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "이뮤노어드헤신"은 이종 단백질 ("부착인자")의 결합 특이성과 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능을 합한 항체-유사 분자를 지칭한다. 구조상, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 (즉, 이종인) 목적하는 결합 특이성을 지닌 아미노산 서열과, 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 부착인자 부분은 전형적으로, 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 연속되는 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 모든 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 아유형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 유용한 이뮤노어드헤신은 특정 폴리펩티드의 BAFF 결합성 부분 또는 폴리펩티드의 BR3 결합성 부분 (예: Fc 영역, TACI 수용체 세포외 도메인-Fc 또는 BCMA 세포외 도메인-Fc 또는 BR3 세포외 도메인-Fc와 융합된 막관통 또는 세포질 서열을 제외한 BAFF 수용체의 부분)을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 한 양태에서는, 본 발명의 폴리펩티드 서열을 면역글로불린 서열의 불변 도메인과 융합시킨다.

"면역결핍 질환"은 면역 반응이 저하되는 장애 또는 질환, 예를 들어 중증 복합 면역결핍증 (SCID)-X 염색체 연관성, SCID-상염색체, 아데노신 데아미나제 결핍증 (ADA 결핍증), X 염색체 연관성 무감마글로불린혈증 (XLA), 브루톤 (Bruton)형, 선천성 무감마글로불린혈증, X 염색체 연관성 소아 무감마글로불린혈증, 후천성 무감마글로불린혈증, 성인 발병 무감마글로불린혈증, 후기-발병 무감마글로불린혈증, 이상감마글로불린혈증, 저감마글로불린혈증, 일시성 소아 저감마글로불린혈증, 상세불명의 저감마글로불린혈증, 무감마글로불린혈증, 공통 가변성 면역결핍증 (CVID) (후천성), 비스코트-알드리히 (Wiskott-Aldrich) 증후군 (WAS), 고 IgM을 수반한 X 염색체 연관성 면역결핍증, 고 IgM을 수반한 비-X 염색체 연관성 면역결핍증, 선택적 IgA 결핍증, IgG 아부류 결핍증 (IgA 결핍증을 수반하거나 수반하지 않음), 정상 또는 상승된 Igs를 수반한 항체 결핍증, 흉선종을 수반한 면역결핍증, Ig 중쇄 결실증, 카파 쇄 결핍증, B 세포 림프증식성 장애 (BLPD), 선택적 IgM 면역결핍증, 열성 무감마글로불린혈증 (스위스형), 세망 이형성증 (reticular dysgenesis), 신생아 호중구 감소증, 중증의 선천성 백혈구 감소증, 면역결핍증을 수반한 흉선 림프형성 부전증-무형성증 또는 형성이상, 모세혈관 확장성 운동실조 (소뇌 운동실조, 안피부 모세혈관 확장증 및 면역결핍증), 사지단축형 저신장증 (short limbed dwarfism), X 염색체 연관성 림프증식성 증후군 (XLP), Igs를 수반한 네젤로프 증후군 (Nezelof syndrome)-복합 면역결핍증, 푸린 뉴클레오티드 포스포릴라제 결핍증 (PNP), MHC 부류 II 결핍증 [무표지 림프구 증후군 (Bare Lymphocyte Syndrome)] 및 중증 복합 면역결핍증; 또는 면역결핍증, 야누스체 (Janus) 관련 키나제 3 (JAK3) 결핍증, 디죠지 (DiGeorge) 증후군 (단리된 T 세포 결핍증) 및 관련 증후군과 연관된 질환, 예를 들어 다운 (Down) 증후군, 만성 피부점막 칸디다증, 고-IgE 증후군, 만성 육아종성 질병, 부분 백색증 및 WHIM 증후군 (사마귀, 저감마글로불린혈증, 감염증, 및 미엘로카텍시스 (myelokathexis) [고세포성 골수 내에서의 백혈구 정체]이다.

본원에서의 "자가면역 질환"은 개개인 자신의 조직이나 그의 공동-분리물 또는 발현물로부터 유발되고 자신의 조직이나 그의 공동-분리물 또는 발현물에 대항하여 유도된 질병 또는 장애, 또는 이로부터 비롯되는 질환이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예에는 관절염 [류마티스성 관절염, 예를 들어 급성 관절염, 만성 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 감염성 관절염, 라임 (Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 척추 관절염 및 유년형 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형 관절염, 만성 원발성 다발성 관절염, 반응성 관절염, 및 강직성 척추염], 염증성 과증식성 피부 질환, 건선, 예를 들어 반점상 건선, 물방울 건선, 농포성 건선, 및 손톱 건선, 피부염, 예를 들어 접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 포진성 피부염 및 아토피성 피부염, X-염색체 연관성 고 IgM 증후군, 두드러기, 예를 들어 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 예를 들면 만성 자가면역성 두드러기, 다발성 근염/피부 근염, 유년형 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 피부 경화증 (전신성 피부 경화증 포함), 경화증, 예를 들어 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS), 예를 들면 스피노-광학 (spino-optical) MS, 원발성 진행성 MS (PPMS) 및 재발 관해형 (relapsing remitting) MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 아테롬성 경화증, 동맥 경화증, 파종성 경화증 및 운동실조성 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) [예를 들어, 크론병, 자가면역 매개된 위장 질환, 결장염, 예를 들어 궤양성 결장염, 궤양성 결장염, 현미경적 (미세) 결장염, 콜라겐성 결장염, 다발성 결장염, 괴사성 소장결장염, 및 전층 결장염, 및 자가면역성 염증성 장 질환], 괴저 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 상공막염, 호흡기 장애 증후군, 예를 들어 성인 또는 급성 호흡기 장애 증후군 (ARDS), 수막염, 포도막 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역성 혈액 장애, 류마티스성 척추염, 돌발성 난청, IgE-매개성 질환, 예를 들어 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예를 들어 라스무센 (Rasmussen) 뇌염 및 (대뇌)변연 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예를 들어 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아종성 포도막염, 비-육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 후방 포도막염 또는 자가면역성 포도막염, 신 증후군을 수반한 및 수반하지 않는 사구체신염 (GN), 예를 들어 만성 또는 급성 사구체신염, 예를 들면, 원발성 GN, 면역 매개성 GN, 막성 GN (막성 신병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신병증, 막- 또는 막성 증식성 GN (MPGN) (유형 I 및 유형 II 포함), 및 신속한 진행성 GN, 알레르기성 질환, 알레르기성 반응, 습진, 예를 들어 알레르기성 또는 아토피성 습진, 천식, 예를 들어 기관지성 천식, 및 자가면역성 천식, T 세포 침윤과 만성 염증 반응과 관련된 질환, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 예를 들어 피부 SLE, 아급성 피부 홍반성 루푸스, 신생아 루푸스 증후군 (NLE), 홍반성 파종성 루푸스, 루푸스 (신염, 뇌염, 소아, 비-신, 신외, 원판상, 탈모증 포함), 유년형 (유형 I) 진성 당뇨병, 예를 들어 소아 인슐린-의존성 진성 당뇨병 (IDDM), 성인 진성 당뇨병 (유형 II 당뇨병), 자가면역성 당뇨병, 특발성 요붕증, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 육아종증, 예를 들어 림프종모양 육아종증, 베게너 육아종증, 과립구결핍증, 혈관염, 예를 들어 대혈관 혈관염 [류마티스성 다발성 근육통 및 거대 세포 (다카야스) 관절염 포함], 중혈관 혈관염 [가와사키병 (Kawasaki's disease) 및 결절성 다발성 동맥염 포함], 현미경적 다발성 동맥염, CNS 혈관염, 괴사성, 피부 또는 과민성 혈관염, 전신성 괴사 혈관염, 및 ANCA-관련 혈관염, 예를 들어 추르크-스트라우쓰 (Churg-Strauss) 혈관염 또는 증후군 (CSS), 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역성 재생불량성 빈혈, 쿠움스 (Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 (Diamond Blackfan) 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈, 예를 들어 자가면역성 용혈성 빈혈 (AIHA), 악성 빈혈 (anemia perniciosa), 애디송병 (Addison's disease), 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역성 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출과 관련된 질환, CNS 염증성 장애, 다중 기관 상해 증상, 예를 들어 패혈증, 외상 또는 출혈에 따른 이차 증후군, 항원-항체 복합체 매개성 질병, 항-사구체 기저막 질병, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병 (Bechet's 또는 Behcet's disease), 캐슬맨 증후군, 구드패스츄어 증후군, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 ( Stevens-Johnson) 증후군, 유사천포창, 예를 들어 수포성 유사천포창 및 피부 유사천포창, 천포창 (예를 들어, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 점막 유사천포창 천포창, 및 홍반성 천포창), 자가면역성 다발성 내분비병증, 라이터 (Reiter) 병 또는 증후군, 면역 복합체 신염, 항체 매개된 신염, 시각 신경척수염, 다발성 신경병증, 만성 신경병증, 예를 들어 IgM 다발성 신경병증 또는 IgM-매개성 신경병증, 저혈소판증 (예를 들어, 심근 경색 환자에 의해 발병되는 바와 같다), 예를 들어 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 및 자가면역 또는 면역 매개성 저혈소판증, 예를 들어 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP) (급성 또는 만성 ITP 포함), 고환 및 난소의 자가면역 질환, 예를 들어 자가면역성 고환염 및 난소염, 원발성 갑상선 기능저하증, 부갑상선 기능저하증, 자가면역성 내분비 질환, 예를 들어 갑상선염, 예를 들면, 자가면역성 갑상선염, 하시모토병 (Hashimoto's disease), 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염) 또는 아급성 갑상선염, 자가면역성 갑상선 질환, 특발성 갑상선 기능저하증, 그레이브병, 다분비선 증후군, 예를 들어 자가면역성 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 종양연관성 (방종양성) 증후군, 예를 들어 신경학적 종양연관성 증후군, 예를 들면, 람베르트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증 증후군 또는 이튼-람베르트 증후군, 근육 강직 증후군, 뇌척수염, 예를 들어 알레르기성 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근무력증, 예를 들어 흉선종 관련 중증 근무력증, 소뇌 변성, 신경근육긴장증, 안진전 또는 안진전 간대성근경련증 (OMS), 및 감각 신경병증, 다초점 운동 신경병증, 쉬한 (Sheehan) 증후군, 자가면역성 간염, 만성 간염, 루포이드 간염, 거대 세포 간염, 만성 활동성 간염 또는 자가면역성 만성 활동성 간염, 림프계 간질성 폐렴, 폐쇄성 세기관지염 (비-이식성) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 베르거병 (Berger's disease) (IgA 신병증), 특발성 IgA 신병증, 선형 IgA 피부병, 원발성 담즙성 간경변, 폐경화증, 자가면역성 장병증 증후군, 비열대병, 복강 질환, 비열대 스프루 (글루텐 장병증), 난치성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; Lou Gehrig's disease), 관성 동맥 질환, 자가면역성 귀 질환, 예를 들어 자가면역성 내이 질환 (AIED), 자가면역성 난청, 안전진 간대성근경련증 (OMS), 다발성 연골염, 예를 들어 난치성 또는 재발성 다발성 연골염, 폐포 단백증, 아밀로이드증, 공막염, 비-암성 림프구증가증, 모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예: 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 의미 미확정의 모노클로날 감마글로불린병증)을 포함하는 원발성 림프구증가증, 말초 신경병증, 종양연관성 증후군, 채널병증, 예를 들어 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근육병증, 국소 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비 눈병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역성 혈액 질환, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전증, 슈미츠 (Schmidt) 증후군, 부신염, 위선 위축증, 초로기 치매, 탈수초성 질환, 예를 들어 자가면역성 탈수초성 질환, 당뇨병성 신병증, 드레슬러 (Dressler) 증후군, 원형 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노이드 현상, 식도 운동장애, 손발가락 경화증 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성 자가면역성 불임, 혼합 결체 조직 질환, 샤가스병 (Chagas disease), 류마티스성 발열, 재발성 유산, 농부 폐, 다형 홍반, 심장절개 후 증후군, 쿠싱 (Cushing) 증후군, 애조가 폐 (bird-fancier's lung), 알레르기성 육아종성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트 (Alport) 증후군, 폐포염, 예를 들어 알레르기성 폐포염 및 섬유성 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 리슈만편모충증 (leishmaniasis), 키파노소마증 (kypanosomiasis), 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증 (aspergillosis), 삼프터 (Sampter) 증후군, 캐이플란 (Caplan) 증후군, 뎅기 (dengue), 심내막염, 심내막심근 섬유증, 확산성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 안내염 (눈속염증), 장기 융기성 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만 (Shulman) 증후군, 펠티 (Felty) 증후군, 사상충증, 섬모체염, 예를 들어 만성 섬모체염, 헤테로크로닉 (heterochronic) 섬모체염, 홍채섬모체염 또는 푹스 (Fuch) 섬모체염, 헤노호-쉔라인 (Henoch-Schonlein) 자반증, 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV) 감염, 에코바이러스 감염, 심근병증, 알츠하이머병, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종 후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡슈타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 감염, 유행성 이하선염, 에반 (Evan) 증후군, 자가면역성 생식선 기능상실, 시덴햄 (Sydenham) 무도병, 연쇄상구균 감염후 신염, 폐쇄 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수 매독, 맥락막염, 거대 세포 다발성 근육통, 내분비계 눈병증, 만성 과민성 폐렴, 건성 각막결막염, 표피성 각막결막염, 특발선 신 증후군, 최소 변화 신병증, 양성 가족성 및 허혈성 재관류 상해, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐색성 기도 질환, 규폐증, 아프타 (aphthae), 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애, 아스페르미오게네스 (aspermiogenese), 자가면역성 용혈, 뵈크병 (Boeck's disease), 한랭글로불린혈증, 뒤피트렌 (Dupuytren) 구축, 수정체과민성 안내염, 알레르기성 장염, 나성 결절성 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 열성 류마티스, 해먼-리치 (Hamman-Rich)병, 감각신경성 난청, 발작성 헤모글로불린혈증, 생식선 기능저하증, 국소성 회장염, 백혈구감소증, 전염성 단핵구증, 횡단성 척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신증, 교감성 안염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발성 신경근염, 괴저 농피증, 쿼베인 (Quervain) 갑상선염, 후천성 스페닉 (spenic) 위축증, 항정자 항체로 인한 불임, 비-악성 흉선종, 백반증, SCID 및 엡슈타인-바르 바이러스 관련 질환, 후천성 면역결핍증 (AIDS), 건선성 질환, 예를 들어 리슈만편모충증, 독성-쇽 증후군, 식품 독, T 세포의 침윤과 관련된 질환, 백혈구-부착 결핍증, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 백혈구 누출과 관련된 질환, 다발성 기관 상해 증후군, 항원-항체 복합체 매개된 질환, 항사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역성 다발성 내분비병증, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역성 위축성 위염, 교감성 안염, 류마티스성 질환, 혼합 결체 조직 질환, 신 증후군, 췌도염, 다내분비계 기능상실, 말초 신경병증, 자가면역성 다분비성 증후군 유형 I, 성인 특발성 부갑상선 기능저하증 (AOIH), 전체 탈모증, 확장형 심근병증, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소 침착증, 심근염, 신 증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비-화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골, 전두, 상악 또는 접형 부비동염, 호산구 관련 장애, 예를 들어 호산구증, 폐 침윤 호산구증, 호산구증-근육통 증후군, 로플러 (Loffler) 증후군,만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증, 기관지폐성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 함유하는 육아종, 아나필락시, 혈청음성 척추관절병증, 다내분비계 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤 증후군, 일과성 소아 저감마글로불린혈증, 비스코트-알드리히 증후군, 실조성 모세혈관확장증, 콜라겐 질병과 연관된 자가면역 질환, 류마티즘, 신경 질환, 허혈성 재관류 장애, 혈압 반응 저하, 혈관성 기능이상, 혈관확장증, 조직 상해, 심혈관계 허혈증, 통각과민, 뇌 허혈증, 및 혈관신생을 수반하는 질환, 알레르기성 과민증 장애, 사구체신염, 재관류 상해, 심근 또는 기타 조직의 재관류 상해, 급성 염증성 성분을 수반한 피부병, 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증 장애, 안구 및 안와 염증 장애, 과립구 수혈 관련 증후군, 사이토킨 유도된 독성, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 폐경화증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 대동맥 장애, 동맥내 과형성, 소화성 궤양, 판막염, 및 자궁내막증이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 "B 세포 고갈"은 약물 또는 항체 처치 후 동물 또는 인간에게서의 B 세포 수준이 처리 전의 B 세포 수준에 비해 저하되는 것을 지칭한다. B 세포 수준은 널리 공지된 검정, 예를 들어 본 실험 실시예에 기재된 바와 같은 검정에 의해 측정 가능하다. B 세포 고갈은 부분적이거나 전체적일 수 있다. 한 양태에서는, BR3 발현성 B 세포의 고갈이 25％ 이상이다. 어느 한 가지 기전에 의해 제한되는 것은 아니지만, 가능한 B-세포 고갈 기전에는 ADCC, CDC, 세포자멸, 칼슘 유속 조정, 또는 이들의 두 가지 이상 조합이 포함된다.

본원에서의 "B 세포 표면 마커" 또는 "B 세포 표면 항원"은 B 세포의 표면 상에 발현된 항원이다.

"B 세포 고갈제"는 말초 B 세포를 25％ 이상 저하시키는 작용제를 지칭한다. 또다른 양태에서, 말초 B 세포의 고갈은 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 이상이다. 한 가지 바람직한 양태에서, B 세포 고갈제는 백혈구와 특이적으로 결합하지만, 기타 세포 유형과는 결합하지 않는다. 또다른 양태에서, B 세포 고갈제는 B 세포와 특이적으로 결합하지만, 기타 세포 유형과는 결합하지 않는다. 한 양태에서, B 세포 고갈제는 항체이다. 한 가지 바람직한 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 또다른 양태에서, 항체는 화학요법제 또는 세포독성제와 접합시킨다. B 세포 고갈제의 구체적인 예에는 전술된 항-CD20 항체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

B 세포 신생물에는 호지킨병 [림프구 우세형 호지킨병 (LPHD) 포함]; 비호지킨 림프종 (NHL); 소포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 모발 세포 백혈병; 및 BR3-양성 신생물이 포함된다. 비호지킨 림프종에는 저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 (SL) NHL, 중간 악성도/소포 NHL, 중간 악성도 확산성 NHL, 고 악성도 면역모세포성 NHL, 고 악성도 림프아구성 NHL, 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 형질세포계 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinemia)이 포함된다. 이들 암의 재발을 치료하는 것 또한 고려된다. LPHD는 방사선 또는 화학요법 치료에도 불구하고 자주 재발하는 경향이 있는 호지킨병의 유형이고, BR3-양성 악성 세포를 특징적으로 나타낼 수 있다. CLL은 4가지 주요 유형의 백혈병 중의 하나이다. 림프구로 불리우는 성숙한 B 세포의 암인 CLL은 세포가 혈액, 골수 및 림프 조직 내에 진행성 축적되는 징후를 나타낸다. 무통성 림프종은 서서히 성장하는 불치병인데, 수 차례의 일시적 차도와 재발을 반복한 후에 환자들은 평균 6 내지 10년 정도 생존한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "비호지킨 림프종" 또는 "NHL"은 호지킨 림프종 이외의 림프계 암을 지칭한다. 호지킨 림프종은 일반적으로, 리드-슈테른베르크 (Reed-Sternberg) 세포가 호지킨 림프종에는 존재하고 비호지킨 림프종에는 존재하지 않는 것으로써, 비호지킨 림프종과 구별될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 상기 용어에 포괄되는 비호지킨 림프종의 예에는 당해 분야에 공지된 분류 도식, 예를 들어 문헌 [참고: Color Atlas of Clinical Hematology, Third Edition; A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.) (Harcourt Publishers Ltd. 2000) (특히 도 11.57, 11.58 및/또는 11.59)]에 기재된 바와 같은 개정 유럽-미국 림프종 [Revised European-American Lymphoma (REAL)] 도식에 따라서 당업자 (예: 종양학자 또는 병리학자)에 의해 그 자체로서 확인될 수 있는 것이 포함된다. 보다 구체적인 예에는 재발성 또는 난치성 NHL, 제일선 저 악성도 (front line low grade) NHL, 병기 III/IV NHL, 화학요법 내성 NHL, 전구체 B 림프아구성 백혈병 및/또는 림프종, 소 림프구성 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 프로-림프구성 백혈병 및/또는 소 림프구성 림프종, B-세포 프로-림프구성 림프종, 면역종 및/또는 림프형질세포성 림프종, 연변층 B 세포 림프종, 비장 연변층 림프종, 림프절 이외 연변층 - MALT 림프종, 림프절 연변층 림프종, 모발 세포 백혈병, 형질세포종 및/또는 형질 세포 골수종, 저 악성도/소포형 림프종, 중간 악성도/소포 NHL, 외투 세포 림프종, 소포 중심 림프종 (소포성), 중간 악성도 확산성 NHL, 확산성 대형 B-세포 림프종, 침습성 (공격성) NHL (침습성 제일선 NHL 및 침습성 재발 NHL 포함), 자기 유래 줄기 세포 이식 후에 재발하거나 이에 난치성인 NHL, 원발성 종격 (mediastinal) 대형 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 고 악성도 면역모세포성 NHL, 고 악성도 림프아구성 NHL, 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 버키트 (Burkitt) 림프종, 전구체 (말초) T-세포 림프아구성 백혈병 및/또는 림프종, 성체 T-세포 림프종 및/또는 백혈병, T 세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 프로-림프구성 백혈병, 대형 과립상 림프구성 백혈병, 균상식육종 (mycosis fungoides) 및/또는 세자리 (Sezary) 증후군, 림프절 이외 천연 킬러/T-세포 (코 유형) 림프종, 장병증 유형 T-세포 림프종, 간비장 T-세포 림프종, 피하 지방층염 (panniculitis) 유사 T-세포 림프종, 피부 림프종, 역형성 대형 세포 림프종, 혈관중심성 림프종, 소장 T 세포 림프종, 말초 T 세포 (달리 명시되지 않는 한) 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에게서의 생리적 질환을 지칭하거나 기재한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암 뿐만 아니라; B-세포 림프종 [저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중간 악성도/소포 NHL; 중간 악성도 확산성 NHL; 고 악성도 면역모세포성 NHL; 고 악성도 림프아구성 NHL; 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함]; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아성 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 다발성 골수종 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD)가 포함된다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 암은 그의 표면 상에 BR3 폴리펩티드를 발현하는 (BR3-양성) 종양을 포함한다. 또다른 양태에 따르면, BR3-발현성 암이 CLL 암이다.

구체적 양태에서, 본 발명의 항-BR3 항체 및 폴리펩티드는 비호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 소 림프구성 림프종 (SLL), 확산성 대형 B-세포 림프종 (DLBCL), 소포형 림프종 [이는 비호지킨 림프종 (NHL)의 한 유형이다], 류마티스성 관절염 및 유년형 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신염 포함), 베게너병, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군, 사구체신염 및 다발성 골수종으로 이루어진 군에서 선택된 질병들 중의 한 가지 이상 질병을 치료하는데 사용한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)가 포함된다. 한 양태에 따르면, 세포독성제는 내재화할 수 있다. 또다른 양태에 따르면, 세포독성제의 활성 부분은 1100 kD 이하이다. 한 양태에 따르면, 화학요법제가 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제 (intercalating agent), 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산 분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소 [예: 모노메틸아우리스타틴 (MMAE)] (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 다음에 기재되는 각종 항종양제 또는 항암제 또는 성장 억제제로 이루어진 군에서 선택된다. 기타 세포독성제가 다음에 기재된다.

"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 CYTOXAN^® 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성적으로 유사한 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인 (enediyne) 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (참고: Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); 디네미신 (디네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, ADRIAMYCIN^® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 (예: 미토마이신 C), 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK^® 다당류 복합체 (공급처: JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL^® 파클리탁셀 (공급처: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE™ 크레모포르-무함유, 파클리탁셀의 알부민-공학 처리시킨 나노입자 제형 (공급처: American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE^® 독세탁셀 (공급처: Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; GEMZAR^® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE^® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 (예: 레티노산); 카페시타빈; 및 상기 언급된 제제의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들면, 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERMs)가 포함되는데, 이의 예에는 타목시펜 (NOLVADEX^® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON·토레미펜; 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE^® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN^® 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR^® 보로졸, FEMARA^® 레트로졸 및 ARIMIDEX^® 아나스트로졸; 및 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상한 세포 증식에 밀접한 영향을 미치는 신호 전달 경로에 있어 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras의 발현을 억제시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제 (예: ANGIOZYME^® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN^® 백신, LEUVECTIN^® 백신 및 VAXID^® 백신; PROLEUKIN^® rIL-2; LURTOTECAN^® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX^® rmRH; 및 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

본원에 사용된 경우의 "성장 억제제"는 시험관내 및/또는 생체내에서 세포의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상의 세포 비율을 상당히 저하시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S 상 이외의 위치에서) 세포 주기 진행을 차단시키는 작용제, 예를 들어 GI 정지와 M-상 정지를 유도시키는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-상 차단제에는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), TAXOL^® 파클리탁셀 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. GI를 정지시키는 작용제가 또한 S-상 정지로까지 영향을 미치는데, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들면, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C가 있다. 추가의 정보는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakaini et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13].

"세포 사멸을 유도시키는" 항체는 생육 가능한 세포를 생육 불가능한 세포가 되도록 하는 것이다. 이 세포는 일반적으로, 상기 항체와 결합하는 항원을 발현하는 것인데, 특히 상기 세포는 상기 항원을 과발현한다. 바람직하게, 상기 세포는 암 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포일 수 있다. 시험관 내에서는 상기 세포가 SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 시험관 내에서의 세포 사멸은, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸과 구별하기 위해 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에서 결정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸을 알아보기 위한 검정은 열-불활성화 혈청을 사용하고 (즉, 보체의 부재 하에) 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 처리되지 않은 세포와 비교해서 프로피듐 요오드 (PI), 트리판 블루 [참고: Moore et al. Cytotechnology, 17: 1-11 (1995)] 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가된 바와 같은 막 완전성의 상실을 평가할 수 있다.

"세포자멸을 유도시키는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 내형질 세망의 확장, 세포 단편화 및/또는 막 소포 (세포자멸체로 불리움)의 형성에 의해 결정된 바와 같은 프로그램된 세포 사멸을 유도시키는 것이다. 세포는 상기 항체와 결합하는 항원을 발현하는 것이고, 이러한 항원을 과발현하는 것일 수 있다. 상기 세포는 종양 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포일 수 있다. 시험관 내에서는 세포가 SKBR3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 세포자멸과 연관된 세포성 사건을 평가하기 위한 각종 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합성에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 DNA 래더링을 통하여 평가할 수 있으며; DNA 단편화와 함께 핵/염색질 응축은 저이배체 세포의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게, 세포자멸을 유도시키는 항체는 이러한 항체와 결합하는 항원을 발현하는 세포를 사용하는 아넥신 결합 검정에서, 처리시키지 않은 세포와 비교해서 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 정도 유도시키는 것이다.

세포자멸을 유도시키는 항체의 예에는 항-DR5 항체 3Fl 1.39.7 (ATCC HB-12456); 3H3.14.5 (ATCC HB-12534); 3D5.1.10 (ATCC HB-12536); 및 3H3.14.5 (ATCC HB-12534) (그의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체 포함); 인간 항-DR5 수용체 항체 16E2 및 20E6 (그의 친화성 성숙된 변이체 포함) [참고: WO 98/51793; 본원에 참고로 도입된다]; 항-DR4 항체 4E7.24.3 (ATCC HB-12454); 4H6.17.8 (ATCC HB-12455); 1H5.25.9 (ATCC HB-12695); 4G7.18.8 (ATCC PTA-99); 및 5G I 1.17.1 (ATCC HB-12694) ((그의 인간화 및/또는 친화성 성숙된 변이체 포함)이 포함된다.

관심있는 항체에 의해 결합된 항원 상의 에피토프와 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 통상적인 교차-차단 검정, 예를 들어 문헌 [참고: Antibodies, A Laboratory Manual, eds. Harlow and Lane (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)]에 기재된 바와 같은 검정을 수행할 수 있다.

"접합체"는 융합 단백질을 포함한 모든 하이브리드 분자 뿐만 아니라 아미노산 또는 단백질 부분과 비-단백질 부분 둘 다를 함유하는 분자 (예: 독소-항체 접합체, 또는 페길화-항체 접합체)를 지칭한다. 접합체는 당해 분야에 공지된 각종 기술, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 고체 상 합성, 용액 상 합성, 유기 화학 합성 기술 또는 이들 기술의 조합에 의해 합성하거나 공학적으로 처리할 수 있다. 합성의 선택은 생성시키고자 하는 특별한 분자에 좌우될 것이다. 예를 들어, 천연상 전적으로 "단백질"이 아닌 하이브리드 분자는 재조합 기술과 용액 상 기술을 조합하여 합성할 수 있다.

한 양태에 따르면, 접합체는 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 재이용 수용체 결합성 에피토프와 공유적으로 연결된 관심있는 항체 또는 폴리펩티드 (특히, 항체 단편)이다. 예를 들어, 재이용 수용체 결합성 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 본 발명의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산과 동일 프레임 내에서 연결시켜, 이와 같이 공학적으로 처리시킨 핵산 분자에 의해 발현된 융합 단백질이 재이용 수용체 결합성 에피토프와 본 발명의 폴리펩티드 서열을 포함하도록 할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재이용 수용체 결합성 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 유용한 IgG 분자 (예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다 [참고: Ghetie, V et al., (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, Table 1).

또다른 양태에서, 접합체는, FcRn 수용체 또는 혈청 알부민-결합 펩티드와 결합하는 혈청 알부민 또는 혈청 알부민의 일부와 연결시키거나 (특히 항체 단편) 또는 비-단백질 중합체 (예: 폴리에틸렌 글리콜 부분)과 연결시킴으로써 형성시킬 수 있다. 이러한 폴리펩티드 서열은, 예를 들어 WO O1/45746에 기재되어 있다. 한 가지 바람직한 양태에서, 부착시키고자 하는 혈청 알부민 펩티드는 DICLPRWGCLW의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 양태에서, 본 발명에 따르는 Fab의 반감기는 이들 방법에 의해 증가된다. 혈청 알부민 결합 펩티드 서열에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Dennis, M.S., et al, (2002) JBC 277(38):35035-35043].

본원에 사용된 경우의 단어 "표지"는 항체와 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체가 검출 가능할 수 있거나 (예: 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 효소적 표지의 경우에는 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

A. 본 발명의 조성물 및 방법

본 발명은 인간 BR3과 결합하고, 임의로 또한 기타 영장류 BR3과 결합하는 항체를 제공한다. 한 양태에 따르면, H 쇄는 비-인간 종 항-인간 BR3 항체 (공여자 항체)의 H 쇄 CDR 중의 적어도 1개, 2개 또는 모두를 갖고, 수용자 항체로서 인간 컨센서스 항체의 프레임워크 잔기를 실질적으로 모두 갖는다. 공여자 항체는 마우스, 랫트, 기니아 피그, 염소, 토끼, 말, 영장류를 포함한 각종 비-인간 종으로부터 유래될 수 있지만, 전형적으로는 뮤린 항체일 것이다. 이러한 맥락에서 "실질적으로 모든"이란 인간화 항체 중의 수용자 FR 영역이 인간 컨센서스 FR 서열에 본래부터 존재하지 않은 하나 이상의 아미노산 치환물을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 이들 FR 변화물은 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다.

한 양태에서, 공여자 항체는 뮤린 9.1 항체인데, 그의 VH 및 VL 쇄 각각의 CDR 및 FR 서열을 포함한 V 영역이 서열 19 및 서열 20에 제시되었다. 한 양태에서, 인간 Fab 프레임워크에 대한 잔기는 인간 Vκ 아군 I 및 V_H 아군 III의 컨센서스 서열에 상응하거나 이러한 서열로부터 유래되었다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 인간화 BR3 항체는 뮤린 공여자 항체의 H 쇄 내의 CDR 중의 1개 이상을 갖는다. 한 양태에서, 인간 BR3과 결합하는 인간화 BR3 항체는 공여자 항체의 H 쇄의 중쇄 CDR을 포함한다.

전장 항체에서, 본 발명의 인간화 BR3 결합 항체는 인간 면역글로불린의 C 도메인과 결합된 V 도메인을 포함할 것이다 (예: 서열 132). 바람직한 양태에서, H 쇄 C 영역은 인간 IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래된다. 한 양태에 따르면, L 쇄 C 도메인은 인간 κ 쇄로부터 유래된다. 또다른 양태에 따르면, 전장 BR3 결합 항체의 Fc 서열은 서열 134인데, 여기서 X는 N, A, Y, F 및 H로 이루어진 군에서 선택된다.

BR3 결합 항체는 적어도 인간 BR3과 결합할 것이다. 한 양태에 따르면, BR3 결합 항체는 기타 영장류 BR3, 예를 들어 사이노몰구스 (cynomolgus) 및 붉은털 원숭이를 포함한 원숭이, 및 침팬지의 BR3과 결합할 것이다. 또다른 양태에 따르면, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드는 설치류 BR3 단백질 및 인간 BR3 단백질과 결합한다. 또다른 양태에서는, BR3 폴리펩티드가 마우스 BR3 폴리펩티드 서열 및 인간 BR3 폴리펩티드 서열과 결합한다.

한 양태에 따르면, 길항제 BR3 결합 항체의 생물학적 활성은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 활성들 중의 어느 한 가지 활성, 활성의 모든 조합, 또는 모든 활성이다: (1) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 활성; (2) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고 마우스 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 활성; (3) 잔기 F25, V33 및 A34를 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 활성; (4) 인간 BAFF와 인간 BR3 결합을 억제하는 활성; (5) 인간 효과기 세포의 존재하에 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 갖거나 또는 인간 효과기 세포의 존재하에 증가된 ADCC를 갖는 활성; (6) 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드 보다 고 친화도로 인간 Fc 신생아 수용체 (FcRn)와 결합하는 활성; (9) 상기 항체로 처리하지 않은 적당한 음성 대조군 또는 기저 수준과 비교해서, 시험관내 또는 생체내 B 세포를 바람직하게는 20％ 이상 사멸 또는 고갈시키는 활성; (10) 시험관내 또는 생체내에서 B 세포 증식을 억제하는 활성; 및 (11) 시험관내 또는 생체내에서 B 세포 생존을 억제하는 활성. 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체의 한 가지 양태에 따르면, 기능적 에피토프는 잔기 R30을 추가로 포함한다. 본 발명의 또다른 양태에 따르면, 기능적 에피토프는 잔기 L28 및 V29를 추가로 포함한다.

한 양태에서, B 세포 표면 항원과 결합하지 않는 대조군 항체를 이용한 처리와 비교하거나 또는 처리 전의 기저 수준과 비교해서, mIgG2A의 Fc 영역과 융합된 본 발명의 항체의 가변 도메인은 마우스 중의 다음 세포 집단 중의 어느 한 집단, 모든 조합 집단 또는 모든 집단에서 B 세포를 20％ 이상 고갈시킬 수 있다: (1) 혈액 중의 B 세포, (2) 림프절 중의 B 세포, (3) 비장 중의 소포 B 세포 및 (4) 비장 중의 연변층 B 세포. 기타 양태에서는, B 세포 고갈이 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 이상이다. 한 가지 바람직한 양태에서, 고갈은 항체로 처리한지 15일 후에 측정한다. 또다른 바람직한 양태에서는, 고갈 검정을 본원의 실시예 18 또는 19에 기재된 바와 같이 수행한다. 또다른 바람직한 양태에서는, 처리한지 15일 후에 마우스에서 말초 B 세포 집단에 의해 고갈을 측정한다.

또다른 양태에 따르면, 본 발명의 작동제 BR3 결합 항체의 생물학적 활성은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 활성들 중의 어느 한 가지 활성, 활성의 모든 조합, 또는 모든 활성이다: (1) 겉보기 Kd 값 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하로, 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 활성; (2) 잔기 F25, V33 및 A34를 포함하는 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 활성 (여기서, 모노클로날 항체는 9.1 항체 또는 2.1 항체가 아니다); (3) 시험관 내에서 B 세포 증식 또는 생존을 자극하는 활성; (4) 인간 BAFF와 인간 BR3 결합을 억제하는 활성; (5) 생체내에서 B 세포 증식 또는 생존을 자극하는 활성; 및 (6) 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드 보다 고 친화도로 인간 Fc 신생아 수용체 (FcRn)와 결합하는 활성.

목적 수준의 B 세포 고갈은 해당 질병에 좌우될 것이다. BR3 양성 암을 치료하는데 있어서는, 본 발명의 항-BR3 항체 및 폴리펩티드의 표적인 B 세포의 고갈을 최대화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, BR3 양성 B 세포 신생물을 치료하기 위해서는, 예를 들어 종양 성장 (크기), 암성 세포 유형의 증식, 전이, 특정 암의 기타 징후 및 증상을 모니터링함으로써, 당해 분야의 의사에 의해 평가될 수 있는 질병의 진행을 적어도 방지시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시키는 것이 바람직하다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 질병의 진행을 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월, 보다 바람직하게는 4개월, 보다 바람직하게는 5개월, 보다 더 바람직하게는 6개월 이상 동안 방지시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 보다 더 바람직한 양태에서는, 병의 차도 시간을 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월, 보다 바람직하게는 1년, 보다 바람직하게는 2년, 보다 바람직하게는 3년, 보다 더 바람직하게는 5년 이상 증가시키기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 가장 바람직한 양태에서는, 해당 질병을 치유하기에 충분한 정도로 B 세포를 고갈시킨다. 바람직한 양태에서는, 암 환자에게서의 B 세포 고갈이 치료 전 기저 수준의 약 75％ 이상, 보다 바람직하게는 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 및 심지어 100％이다.

자가면역 질환을 치료하기 위해서는, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드의 투여량을 조정함으로써, 개개 환자에게서 질병 및/또는 질환의 중증도에 따라서 B 세포 고갈 정도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 이로써, B 세포 고갈은 완전히 이루어질 수 있지만, 그렇치 않을 수도 있다. 총 B 세포 고갈은 초기 치료 동안에 요망되지만, 후속 치료에서는 부분 고갈 만을 달성하도록 투여량을 조정할 수 있다. 한 양태에서는, B 세포 고갈이 20％ 이상인데, 즉 치료 전의 기저 수준과 비교해서 BR3 양성 B 세포의 80％ 이하가 잔존한다. 기타 양태에서, B 세포 고갈은 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 이상이다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, B 세포 고갈이 질병의 진행을 중지시키기에 충분하고, 보다 바람직하게는 치료 중인 특정한 질병의 징후 및 증상을 완화시키기에 충분하고, 보다 더 바람직하게는 질병을 치유하기에 충분하다.

본 발명은 또한, 이중-특이적 BR3 결합 항체를 제공하는데, 이러한 항체의 하나의 암은 본 발명의 BR3 결합 항체의 인간화 H 및 L 쇄를 갖고 있고, 다른 암은 제2 항원에 대한 V 영역 결합 특이성을 지니고 있다. 구체적 양태에서, 제2 항원은 CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D 또는 기타 NK 활성화 리간드로 이루어진 군에서 선택된다.

항-BR3 항체의 적당한 입체 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 이상한 가교결합을 방지할 수도 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 항체에 가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편 등의 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환형 변이체는 모 항체 (예: 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 이로써 생성된 추가의 개발을 위해 선택된 변이체(들)는, 이들을 생성시킨 모 항체와 비교해서 개선된 생물학적 특성을 지닐 것이다. 이러한 치환형 변이체를 생성시키기 위한 편리한 방식은 파지 디스플레이를 이용하는 친화 돌연변이 방법을 포함한다. 간략하게 언급하면, 몇 가지 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 위치에 가능한 모든 아미노산 치환물을 생성시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체를, 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 필라멘트상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이한다. 이어서, 이와 같이 파지-디스플레이된 변이체를 대상으로 하여, 본원에 기재된 바와 같은 그들의 생물학적 활성 (예: 결합 친화성)에 대해 스크리닝한다. 변형시키기 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여 항원 결합성에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 또다른 한편, 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 인간 BR3 간의 접촉점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이와 이웃하는 잔기는 본원에서 상세히 설명된 기술에 따라서 치환시키기 위한 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 대상으로 하여 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한 가지 이상 관련 검정에서 탁월한 특성을 지닌 항체를 추가 개발을 위해 선별할 수 있다.

항체의 또다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 천연 당화 패턴을 변경시킨다. 변경시킨다는 것은 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/시키거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 부가하는 것을 의미한다.

항체의 당화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 부분을 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시킨 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적 당화 부위를 창출시켜 준다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

당화 부위를 항체에 부가하는 것은 (N-연결된 당화 부위의 경우에는) 상기 언급된 트리펩티드 서열 중의 하나 이상를 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행된다. 이러한 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 천연 항체 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기에 의해 치환시킴으로써 만들 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우).

항-BR3 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 방법 (천연 발생적 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 앞서 제조된 변이체 또는 항-BR3 항체의 비-변이체 버젼을 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발시킴으로써 제조하는 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, 항체의 항원-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC)를 증강시키도록 효과기 기능 측면에서 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환물을 도입함으로써 달성할 수 있다. 또다른 한편, 또는 부가적으로, 시스테인 잔기를 Fc 영역 내로 도입함으로써, 이러한 영역 내에 쇄간 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이로써 생성된 동종-이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개성 세포 사멸 및 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 지닐 수 있다 [참고: Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]. 항종양 활성이 증강된 동종-이량체성 항체는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 이종-이관능성 가교 결합제를 사용하여 제조할 수도 있다 [참고: Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]. 또다른 한편, 이중 Fc 영역을 갖도록 항체를 공학처리함으로써, 증강된 보체 용해성과 ADCC 능력을 지니도록 할 수 있다 [참고: Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)].

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 재이용 수용체 결합성 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재이용 수용체 결합성 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 책임이 있는 IgG 분자 (예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

기타 항체 변형

항체의 기타 변형이 본원에 고려된다. 예를 들어, 항체를 각종 비-단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중의 하나와 연결시킬 수 있다. 항체를, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐); 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은, 예를 들어 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

목적하는 특성을 지닌 항체에 대한 스크리닝

특정의 생물학적 특징을 지닌 항체는 본 실험 실시예에 기재된 바와 같이 선별할 수 있다. 예를 들어, BR3과 결합하는 항체는 ELISA 검정에서 BR3에 대한 결합성에 의해 선별할 수 있거나, 또는 보다 바람직하게 세포 (예: BJAB 세포주)의 표면 상에 발현된 BR3에 대한 결합성에 의해 선별할 수 있다 [실시예 5 참고].

본 발명의 항-BR3 항체의 성장 억제 효과는 본 실시예에 의해 평가할 수 있거나, 또는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 내적으로 또는 BR3 유전자로의 형질감염 후에 BR3을 발현하는 세포를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 바람직한 양태에서는, BR3을 발현하는 일차 B 세포를 증식 및 생존 검정에 사용할 수 있다 (예: 실시예 7). 또다른 예에서는, 종양 세포주 및 BR3-형질감염시킨 세포를 각종 농도로 본 발명의 항-BR3 모노클로날 항체로 수 일 (예: 2 내지 7일) 동안 처리하고, 결정 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나 몇몇 기타 비색 검정에 의해 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또다른 방법은 본 발명의 항-BR3 항체의 존재 또는 부재 하에 처리시킨 세포에 의한 ³H-티미딘 흡수를 비교하는 것일 수 있다. 항체 처리 후, 세포를 수거하고 DNA 내로 혼입된 방사능의 양을 신틸레이션 계수기에서 정량화한다. 적당한 양성 대조군에는 선별된 세포주를, 이러한 세포주의 성장을 억제하는 것으로 공지된 성장 억제성 항체로 처리한 것이 포함된다.

세포 사멸을 유도하는 항체를 선별하기 위해, 예를 들어 프로피듐 요오다이드 (PI), 트리판 블루 (trypan blue) 또는 7AAD 흡수에 의해 표시된 바와 같은 막 완전성 상실을 대조군과 비교해서 평가할 수 있다. PI 흡수 검정은 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. BR3-발현성 종양 세포를 배지 단독과 함께, 또는 예를 들어, 약 10 ㎍/ml의 적당한 모노클로날 항체를 함유하는 배지와 함께 인큐베이션한다. 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 각 처리 후, 세포를 세척하고, 35 mm 여과기-캡핑된 12 x 75 튜브 (튜브당 1ml; 처리군 당 3개 튜브) 내로 등분하여 세포 집단 (덩어리)을 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)을 공급한다. FACSCAN™ 유동 세포계수기 및 FACSCONVERT™ CellQuest 소프트웨어 (공급처: Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 결정된 바와 같이 통계상 유의적 수준의 세포 사멸을 유도시키는 항체를 세포 사멸 유도성 항체로서 선별할 수 있다.

관심있는 항체에 의해 결합된 BR3 상의 에피토프와 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 통상적인 교차-차단 검정, 예를 들어 문헌 [참고: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 검정을 수행할 수 있다. 이 검정을 사용하여 시험 항체가 본 발명의 항-BR3 항체와 동일한 부위 또는 에피토프와 결합하는지를 결정할 수 있다. 또다른 한편, 또는 부가적으로, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 에피토프 지도화를 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 서열을 알라닌 스캐닝 등에 의해 돌연변이 유발시켜 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이체 항체를 대상으로 하여, 적당한 폴딩을 보장하기 위해 폴리클로날 항체와 결합하는지를 알아보기 위해 초기 시험한다. 상이한 방법에서는, BR3의 상이한 영역에 상응하는 펩티드를, 시험 항체와의 경쟁 검정에 사용하거나, 또는 시험 항체 및 성상확인되거나 공지된 에피토프를 갖는 항체와의 경쟁 검정에 사용할 수 있다.

특이적 항-BR3 항체의 예

본 발명의 항체에는 구체적으로, 다음 표 2에 기재된 항체들 중의 어느 하나의 가변 중쇄 서열을 포함하는 항체, 및 하이브리도마 세포에 의해 생산되지 않는 그의 BR3-결합성 단편이 포함된다. 본 발명의 항체에는 구체적으로, 서열 4-13, 15-18, 22, 24, 26-73, 75-76, 78, 80-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106-107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 및 127 중의 어느 하나의 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함하는 항체, 및 그의 BR3-결합성 단편이 포함된다. 추가의 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 표 2에 기재된 항체들, 및 그의 BR3-결합성 단편들 중의 어느 하나의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 포함한다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 서열 134의 서열을 포함하는 Fc 영역을 추가로 포함하는데, 여기서 X는 N, A, W, Y, F 및 H로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이다. 또다른 양태에 따르면, 항체는 서열 76 또는 서열 131의 서열을 포함하는데,여기서, X는 N, A, W, Y, F 및 H로 이루어진 군에서 선택된 아미노산이다.

본 발명의 항체에는 서열 4-13, 15-18, 22, 24, 26-73, 75-76, 78, 80-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106-107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 및 127의 서열들 중의 어느 하나의 H3 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 70％ 이상, 또다른 한편으론 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인 H3 서열을 갖는 BR3-결합 항체, 및 이들 항체의 BR3 결합성 단편이 포함된다.

본 발명의 항체에는 도면에 기재된 항체 서열들 중의 어느 하나의 밑줄친 부분 또는 서열 목록 내에 기재된 CDR 또는 초가변 영역과 70％ 이상 동일하거나, 또다른 한편으론 아미노산 서열 동일성이 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인, H1, H2 및 H3 서열을 갖는 BR3-결합 항체가 포함된다.

본 발명의 항체에는 도면에 기재된 항체 서열들 중의 어느 하나의 밑줄친 부분 또는 서열 목록 내에 기재된 CDR 또는 초가변 영역과 70％ 이상 동일하거나, 또다른 한편으론 아미노산 서열 동일성이 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인, L1, L2 및 L3 서열을 갖는 BR3-결합 항체가 포함된다.

본 발명의 항체에는 표 2의 항체들 중의 어느 하나의 VH 도메인과의 상동성이 70％ 이상이거나, 또다른 한편으론 아미노산 서열 동일성이 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인, VH 도메인을 갖는 BR3-결합 항체가 포함된다.

본 발명의 항체에는 하이브리도마 세포에 의해 생산되지 않은 표 2의 항체 서열의 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 BR3-결합 항체가 포함된다. 본 발명의 항체에는 서열 7-13, 15-18, 36, 38-73, 78, 82-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106-107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 및 127 중의 어느 하나의 중쇄 CDR3 서열을 포함하거나, 또는 서열 7-13, 15-18, 36, 38-73, 78, 82-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106-107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 및 127 중의 어느 하나의 H3 서열로부터 유래되는 H3 서열을 포함하는 BR3-결합 항체가 포함된다. 또다른 양태에서, 본 발명의 항체는 서열 7-13, 15-18, 36, 38-73, 78, 82-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106-107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 및 127로 이루어진 군에서 선택된 서열들 중의 어느 하나의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 모든 BR3-결합 항체가 포함되거나, 또는 이러한 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 서열을 포함하는 항체로부터 유래된다. 본 발명의 항체에는 하이브리도마 세포에 의해 생산되지 않은 표 2의 항체의 중쇄 H1, H2 및 H3 서열을 포함하는 BR3-결합 항체가 포함된다.

본 발명의 항체에는 2004년 11월 17일자로 ATCC 기탁 번호 PTA-6315로서 기탁된 Hu9.1-RF-H-IgG 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체; 및 이러한 Hu9.1-RF-H-IgG 폴리펩티드 서열의 가변 영역 서열 중의 어느 하나와의 아미노산 서열 동일성이 70％ 이상, 또다른 한편으론 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 항-BR3 결합 항체가 포함된다. 본 발명의 항체에는 2004년 11월 17일자로 ATCC 기탁 번호 PTA-6316으로서 기탁된 Hu9.1-RF-L-IgG 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체; 및 이러한 Hu9.1-RF-L-IgG 폴리펩티드 서열의 가변 영역 서열과의 아미노산 서열 동일성이 70％ 이상, 또다른 한편으론 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 항-BR3 결합 항체가 포함된다.

본 발명의 항체에는 2004년 11월 17일자로 ATCC 기탁 번호 PTA-6313으로서 기탁된 Hu2.1-46.DANA-H-IgG 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체; 및 이러한 Hu2.1-46.DANA-H-IgG 폴리펩티드 서열의 가변 영역 서열과의 아미노산 서열 동일성이 70％ 이상, 또다른 한편으론 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 항-BR3 결합 항체가 포함된다. 본 발명의 항체에는 2004년 11월 17일자로 ATCC 기탁 번호 PTA-6314로서 기탁된 Hu2.1-46.DANA-L-IgG 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체; 및 이러한 Hu2.1-46.DANA-L-IgG 폴리펩티드 서열의 가변 영역 서열과의 아미노산 서열 동일성이 70％ 이상, 또다른 한편으론 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 항-BR3 결합 항체가 포함된다.

본 발명의 항체에는 2004년 11월 17일자로 ATCC 기탁 번호 PTA-6317로서 기탁된 HuV3-46s-H-IgG 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체; 및 이러한 HuV3-46s-H-IgG 폴리펩티드 서열의 가변 영역 서열과의 아미노산 서열 동일성이 70％ 이상, 또다른 한편으론 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 항-BR3 결합 항체가 포함된다. 본 발명의 항체에는 2004년 11월 17일자로 ATCC 기탁 번호 PTA-6318로서 기탁된 HuV3-46s-L-IgG 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체; 및 이러한 HuV3-46s-L-IgG 폴리펩티드 서열의 가변 영역 서열과의 아미노산 서열 동일성이 70％ 이상, 또다른 한편으론 약 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 항-BR3 결합 항체가 포함된다.

본 발명의 항체에는 ATCC 기탁 번호 PTA-6315의 중쇄 서열과, ATCC 기탁 번호 PTA-6316의 경쇄 서열을 포함하는 Hu9.1-RF-IgG 항체가 포함된다. 본 발명의 항체에는 ATCC 기탁 번호 PTA-6313의 중쇄 서열과, ATCC 기탁 번호 PTA-6314의 경쇄 서열을 포함하는 Hu2.1-45.DANA-IgG 항체가 포함된다. 본 발명의 항체에는 ATCC 기탁 번호 PTA-6317의 중쇄 서열과, ATCC 기탁 번호 PTA-6318의 경쇄 서열을 포함하는 HuV3-46s-IgG 항체가 포함된다.

한 가지 바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 천연 인간 BR3 폴리펩티드의 서열과 특이적으로 결합한다. 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 9.1-RF Ig로서 공지된 항체와 비교해서 pH 6.0 하에서의 FcRn 수용체에 대한 개선된 결합성을 지니고 있다. 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 9.1-RF Ig로서 공지된 항체와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 개선된 ADCC 기능을 지니고 있다. 또다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 9.1-RF Ig로서 공지된 항체와 비교해서 인간 효과기 세포의 존재하에 저하된 ADCC 기능을 지니고 있다.

본 발명의 모든 항체에는 신호 서열이 결여된 항체; 및 Fc 영역의 K447 잔기가 결여된 항체가 포함된다는 것을 인지해야 한다.

벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 발명은 또한, BR3 결합 항체 또는 BR3 결합 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체를 생성하기 위한 재조합 기술을 제공한다.

BR3 결합 항체 및 폴리펩티드를 재조합 생성하기 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 발현시킨다. 모노클로날 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열 분석한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

(i) 신호 서열 성분

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 선별된 이종 신호 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 BR3 결합 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더로 이루어진 군에서 선택된 원핵성 신호 서열로 대체시킨다. 효모 분비의 경우에는, 천연 신호 서열을, 예를 들어 효모 전화효소 리더, α 인자 리더 [삭카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함], 산-포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 문헌 [참고: WO 1990/13646]에 기재된 신호로 대체시킬 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 포유류 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호를 이용할 수 있다.

이러한 전구체 영역에 대한 DNA가 동일 판독 프레임 내에서, BR3 결합 항체를 코딩하는 DNA에 연결된다.

(ii) 복제 기점

발현 벡터와 클로닝 벡터 둘 다는 이러한 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 벡터가 숙주 염색체성 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있게 해주는 것이고, 이에는 복제 기점 또는 자기 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 2 μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 각종 바이러스성 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유류 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터에 필요치 않다 (SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 이는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다).

(iii) 선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 선별성 마커로 명명되기도 하는 선별 유전자를 함유한다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주는 단백질; (b) 영양요구성 결핍증을 보충해주는 단백질; 또는 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양분, 예를 들어 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 공급해 주는 단백질을 코딩한다.

선별 도식의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 중지시키기 위한 약물을 활용한다. 이종 유전자를 이용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 단백질을 생산하므로, 선별 섭생에서 살아 남는다. 이러한 우성 선별의 예들은 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.

포유류 세포에 적합한 선별성 마커의 또다른 예는 BR3 결합 항체 핵산을 흡수하기에 적격한 세포를 확인 (동정)시켜 줄 수 있는 것인데, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이 있다.

예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, 형질전환체 모두를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적당한 숙주 세포는, DHFR 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예: ATCC CRL-9096)이다.

또다른 한편, BR3 결합 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시켰거나 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드성 항생제 (예: 카나마이신, 네오마이신 또는 G418)에 대한 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장시킴으로써 선별할 수 있다 [참고: 미국 특허 제4,965,199호].

효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [참고: Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)]. 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 [참고: Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. 이때, 효모 숙주 세포 게놈 내에 trp1 병변이 존재한다는 것은 트립토판 부재 하의 성장에 의한 형질전환을 검출하는데 유효한 환경을 제공해준다. 유사하게, Leu2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)가 Leu2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로써 고려된다.

또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKDl로부터 유래된 벡터를 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용할 수 있다. 또다른 한편, 재조합 송아지 카이모신 (chymosin)을 대규모로 생성하기 위한 발현 시스템이 케이. 락티스 (K. lactis)에 대해 보고되었다 [참고: Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]. 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의해 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민을 분비시키는데 적합한 다중-카파 (copy) 발현 벡터가 또한 보고되었다 [참고: Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)].

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 BR3 결합 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵성 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 기타 공지된 세균성 프로모터도 적합하다. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, BR3 결합 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵성 유전자가, 전사가 개시되는 부위로부터의 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견된 또다른 서열은 CNCAAT 영역인데, 여기서 N은 어떠한 뉴클레오티드일 수도 있다. 대부분의 진핵성 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 존재하는데, 이는 폴리 A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 부가하기 위한 신호일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵성 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 제어된 부가의 전사 이점을 지니고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 책임이 있는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 있어 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터가 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 증강인자 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 (fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (예: 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 등의 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유류 프로모터, 예를 들어 악틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 및 열-쇽 프로모터에 의해 제어될 수 있는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 화합성이어야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 함유하기도 하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉발형 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978에 기재되어 있다. 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)]. 또다른 한편, 라우스 (rous) 육종 바이러스 장-말단 반복 서열을 프로모터로서 사용할 수 있다.

(v) 증강인자 요소 성분

고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 증강인자 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 증강인자 서열이 현재 포유류 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로는, 진핵성 세포 바이러스로부터의 증강인자가 사용될 것이다. 이의 예에는 복제 기점의 후기 측면 (bp 100-270) 상의 SV40 증강인자, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 증강인자, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 증강인자, 및 아데노바이러스 증강인자가 포함된다. 진핵성 프로모터 활성화를 위한 증강 요소에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]. 증강인자는 항체-코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터의 5' 부위에 위치한다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵성 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 핵형성 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한, 전사를 종결시키고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵성 또는 바이러스성 DNAs 또는 cDNAs의 비해독 영역의 5' 말단, 및 종종 3' 말단으로부터 통상 이용 가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 [참고: WO 94/11026; 및 이에 기재된 발현 벡터].

(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환

본원 내의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 상기 언급된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물에는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리챠 (Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적이다.

전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질은, 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요치 않는 경우, 예를 들면 치료적 항체를 세포독성제 (예: 독소)와 접합시키고 면역접합체 그 자체가 종양 세포 파괴에 있어 효능을 나타내는 경우에, 세균에서 생성시킬 수 있다. 전장 항체는 순환시 반감기가 더 크다. 이. 콜라이에서의 생성이 보다 신속하고 비용 면에서 보다 효율적이다. 항체 단편 및 폴리펩티드를 세균에서 발현하기 위해서는, 예를 들어 발현과 분비를 최적화하기 위한 신호 서열과 해독 개시 영역 (TIR)에 관해 기재되어 있는 미국 특허 제5,648,237호 (Carter et. al.), 미국 특허 제5,789,199호 (Joly et al.), 및 미국 특허 제5,840,523를 (Simmons et al.) 참고할 수 있다 (이들 특허가 본원에 참고로 도입된다). 발현 후, 항체를 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리하고, 이소형에 따라서 예를 들어, 단백질 A 또는 G 칼럼을 통하여 정제할 수 있다. 예를 들어, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 방법과 유사하게 최종 정제를 수행할 수 있다.

원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예를 들어 필라멘트상 진균 또는 효모가 BR3 결합 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모가 저급 진핵성 숙주 미생물 중에 가장 흔히 사용되는 것이다. 그러나, 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에 유용한데, 예를 들면 시조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라질리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 있다.

당화 BR3 결합 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바쿨로바이러스성 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충: caterpillar), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기: mosquito), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) (초파리: fruitfly), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 상응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 균주, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다.

면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.

그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양 하에 성장하도록 아클로닝된 인간 배아 신장주 293 세포 [참고: Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)]; 유아 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO; 참고: Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 [TM4; 참고: Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [참고: Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)이다.

숙주 세포를 항체 생성을 위해 상기 언급된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.

(viii) 숙주 세포 배양

본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma], RPMI-1640 (공급처: Sigma), 및 둘벡코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma]가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 [참고: Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102: 255 (1980); 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제(재)30,985호]. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오티드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

(ix) 항체의 정제

재조합 기술을 사용하는 경우, 항체를 주변세포질 공간에서 세포내적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비할 수 있다. 항체가 세포내적으로 생성되는 경우에는, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미세 부스러기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 [참고: Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간 내로 분비되는 항체를 단리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 해동시킨다. 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 먼저 일반적으로, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 전술된 단계들 중의 어느 단계에 포함시켜 단백질 분해를 억제시킬 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지시킬 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중의 하나이다. 단백질 A가 친화성 리간드로서 적합한지의 여부는 항체에 존재하는 모든 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 의거하여 항체를 정제할 수 있다 [참고: Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 γ3에 권장된다 [참고: Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스지만, 기타 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 이용하여 달성된 것 보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용해 준다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX™ 수지 (공급처: J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예: 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토분획 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을, 회수하고자 하는 항체에 따라서 이용하기도 한다.

예비 정제 단계(들) 후, 관심있는 항체와 오염물을 포함하는 혼합물을 대상으로 하여 pH 약 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 저염 농도 (예: 약 0 내지 0.25 M 염)에서 용출 완충제를 사용하여 저 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피할 수 있다.

항체 접합체

항체를 세포독성제, 예를 들어 독소 또는 방사성 동위원소와 접합시킬 수 있다. 특정 양태에서는, 독소가 칼리케아미신, 마이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴 E 및 이들의 유사체 또는 유도체이다.

바람직한 약물/독소에는 DNA 손상제, 미소관 중합 또는 탈중합 억제제, 및 항대사제가 포함된다. 바람직한 부류의 세포독성제에는, 예를 들어 효소 억제제, 예를 들면 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제, 및 티미딜레이트 신타제 억제제, DNA 삽입제, DNA 절단제, 토포이소머라제 억제제, 안트라사이클린 계열의 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오시드, 프테리딘 계열의 약물, 디인엔, 포도필로톡신 및 분화 유도제가 포함된다. 이들 부류 중에 특히 유용한 구성원에는, 예를 들어 메토트렉세이트, 메토프테린, 디클로로메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 시토신 아라비노시드, 멜팔란, 류로신, 류로시데인, 악티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, N-(5,5-디아세톡시펜틸)독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 1-(2-클로로에틸)-1,2-디메탄설포닐 히드라지드, N⁸-아세틸스페르미딘, 아미노프테린 메토프테린, 에스페라미신, 미토마이신 C, 미토마이신 A, 악티노마이신, 블레오마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 탈리소마이신, 포도필로톡신 및 포도필로톡신 유도체, 예를 들어 에토포시드 또는 에토포시드 포스페이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 탁솔, 탁소테레, 레티노산, 부티르산, N⁸-아세틸스페르미딘, 캄프토테신, 칼리케아미신, 브리오스타틴, 세팔로스타틴, 안사미토신, 악토신, 마이탄시노이드, 예를 들면 DM-1, 마이탄신, 마이탄시놀, N-데스메틸-4,5-데스에폭시마이탄시놀, C-19-데클로로마이탄시놀, C-20-히드록시마이탄시놀, C-20-데메톡시마이탄시놀, C-9-SH 마이탄시놀, C-14-알콕시메틸마이탄시놀, C-14-히드록시 또는 아세틸옥시메틸마이탄시놀, C-15-히드록시/아세틸옥시마이탄시놀, C-15-메톡시마이탄시놀, C-18-N-데메틸마이탄시놀 및 4,5-데옥시마이탄시놀, 아우리스타틴, 예를 들면 아우리스타틴 E, M, PHE 및 PE; 돌로스타틴, 예를 들면 돌로스타틴 A, 돌로스타틴 B, 돌로스타틴 C, 돌로스타틴 D, 돌로스타틴 E (20-에피 및 11-에피), 돌로스타틴 G, 돌로스타틴 H, 돌로스타틴 I, 돌로스타틴 1, 돌로스타틴 2, 돌로스타틴 3, 돌로스타틴 4, 돌로스타틴 5, 돌로스타틴 6, 돌로스타틴 7, 돌로스타틴 8, 돌로스타틴 9, 돌로스타틴 10, 데오-돌로스타틴 10, 돌로스타틴 11, 돌로스타틴 12, 돌로스타틴 13, 돌로스타틴 14, 돌로스타틴 15, 돌로스타틴 16, 돌로스타틴 17, 및 돌로스타틴 18; 세팔로스타틴, 예를 들면 세팔로스타틴 1, 세팔로스타틴 2, 세팔로스타틴 3, 세팔로스타틴 4, 세팔로스타틴 5, 세팔로스타틴 6, 세팔로스타틴 7, 25'-에피-세팔로스타틴 7, 20-에피-세팔로스타틴 7, 세팔로스타틴 8, 세팔로스타틴 9, 세팔로스타틴 10, 세팔로스타틴 11, 세팔로스타틴 12, 세팔로스타틴 13, 세팔로스타틴 14, 세팔로스타틴 15, 세팔로스타틴 16, 세팔로스타틴 17, 세팔로스타틴 18, 및 세팔로스타틴 19가 포함된다.

마이탄시노이드는 투불린 중합 반응을 억제함으로써 작용하는 핵분열 억제제이다. 마이탄신은 동아프리카산 관목 마이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 처음 단리하였다 [참고: 미국 특허 제3,896,111호]. 연속해서, 특정 미생물이 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생성시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: 미국 특허 제4,151,042호]. 합성 마이탄시놀 및 그의 유사체 및 유사체가, 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호 (이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 보고되었다.

마이탄신 및 마이탄시노이드를 종양 세포 항원과 특이적으로 결합하는 항체와 접합시켰다. 마이탄시노이드를 함유하는 면역접합체 및 그들의 치료적 용도가, 예를 들어 문헌 [참고: 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 Bl; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]에 기재되어 있다. 문헌 [참고: Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대항하여 유도된 모노클로날 항체 C242와 연결된 DM1로 명명된 마이탄시노이드를 포함하는 면역접합체가 기재되었다. 이러한 접합체는 배양된 결장암 세포에 대하여 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌으며, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타내었다. 문헌 [참고: Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에는 마이탄시노이드를 디설파이드 링커를 통하여, 인간 결장암 세포주 상의 항원과 결합하는 뮤린 항체 A7과 접합시키거나, 또는 HER-2/neu 종양형성 유전자와 결합하는 또다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1과 접합시켰다.

항체-마이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한 많은 연결성 기, 예를 들어 문헌 [참고: 미국 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 제0 425 235 B1호; 및 Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에 기재된 것들이 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 연결성 기에는 상기 언급된 특허에 기재된 바와 같은 디설파이드기, 티오에테르기, 산 불안정한 기, 광불안정한 기, 펩티다제 불안정한 기, 또는 에스테라제 불안정한 기가 포함되는데, 디설파이드기 및 티오에테르기가 바람직하다.

항체와 마이탄시노이드의 접합체는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예: 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 디설파이드 연쇄를 제공하는데 특히 바람직한 커플링제에는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) [참고: Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)] 및 N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)가 포함된다.

링커는 연결물 유형에 따라서 각종 위치에서 마이탄시노이드 분자에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연쇄는 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성시킬 수 있다. 이러한 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형시킨 C-14 위치, 히드록실기로 변형시킨 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 연쇄가 마이탄시놀 또는 마이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

칼리케아미신

관심있는 또다른 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자와 접합된 BR3 결합 항체를 포함한다. 칼리케아미신 계열의 항생제는 이중 가닥 DNA 절단물을 피코몰 이하 농도로 생성시킬 수 있다. 칼리케아미신 계열의 접합체를 제조하는 방법에 관해서는 미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호 (American Cyanamid Company)를 참고할 수 있다 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ^I ₁이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: Hinman et al., Cancer Research, 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research, 58: 2925-2928 (1998); 및 전술된 American Cyanamid의 미국 특허들]. 항체와 접합될 수 있는 또다른 항종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 다는 세포내 작용 부위를 갖고 있고 혈장 막을 용이하게 교차하지 않는다. 따라서, 항체 매개된 내재화를 통한 이들 작용제의 세포성 섭취는 그들의 세포독성 효과를 상당히 증강시켜 준다.

방사성 동위원소

종양을 선택적으로 파괴시키기 위해, 항체가 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 각종 방사성 동위원소가 방사성접합된 항-BR3 항체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 접합체를 진단용으로 사용하는 경우에는, 접합체가 섬광조영 연구를 위해서는 방사성 원자, 예를 들어 tc^99m 또는 I¹²³을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로서 공지되기도 함)를 위해서는 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

방사성 표지 또는 기타 표지를 공지된 방식으로 접합체에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 수소 대신, 예를 들어 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. tc^99m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹ 등의 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. IODOGEN 방법 [참고: Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57]을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 [참고: "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 기타 방법이 상세히 기재되어 있다.

각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예: 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [참고: Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다 [참고: WO 94/11026]. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시켜 주는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정한 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정한 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드 함유 링커 [참고: Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호]를 사용할 수 있다.

BR3 결합 항체의 치료적 용도

본 발명의 BR3 결합 항체는 수 많은 악성 및 비-악성 질환, 예를 들어 자가면역 질환 및 관련 질환, 및 BR3 양성 암, 예를 들어 B 세포 림프종 및 백혈병을 치료하는데 유용하다. 골수 내의 줄기 세포 (B-세포 기원 세포)에는 BR3 항원이 결여되었기 때문에, 치료 후 건강한 B 세포가 재생되어 수 개월 내에 정상 수준으로 되돌아올 수 있다.

자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환에는 관절염 (류마티스성 관절염, 유년형 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염), 건선, 아토피성 피부염을 포함한 피부염; 만성 자가면역성 두드러기, 다발성근염/피부근염, 독성 표피 괴사용해, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 장 질환 (IBD)과 연관된 반응 (크론병, 궤양성 결장염), 호흡기 장애 증후군, 성인 호흡기 장애 증후군 (ARDS), 수막염, 알레르기성 비염, 뇌염, 포도막염, 결장염, 사구체신염, 알레르기성 질환, 습진, 천식, T 세포의 침윤과 연관된 질환 및 만성 염증 반응, 아테롬성 경화증, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 (신염, 비-신성, 원판상, 탈모증 포함), 유년기 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 베게너 육아종증을 포함한 육아종증, 과립구결핍증, 혈관염 (ANCA 포함), 재생불량성 빈혈, 쿠움스 양성 빈혈, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈 (AIHA)을 포함한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 진성 적혈구계 무형성 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역성 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 누출과 관련된 질환, CNS 염증 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개성 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병, 캐슬맨 증후군, 구드패스츄어 증후군, 람버트-이튼 근무력증 증후군, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 고형 기관 이식체 거부 (고 패널 반응성 항체 역가에 대한 전처리, 조직 내에서의 IgA 침착 등 포함), 이식편 대 숙주 질병 (GVHD), 수포성 유사천포창, 천포창 (심상성 천포창, 낙엽상 천포창 포함), 자가면역성 다발성 내분비병증, 라이터병, 근육강직 증후군, 거대 세포(성) 동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신병증, IgM 다발성 신경병증 또는 IgM 매개성 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 고환 및 난소의 자가면역 질환 (자가면역성 고환염 및 난소염 포함), 원발성 갑상선 기능저하증, 자가면역성 내분비 질환 (예를 들어, 자가면역성 갑상선염 포함), 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능저하증, 애디송병, 그레이브병, 자가면역성 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비증 증후군), 인슐린-의존성 진성 당뇨병 (IDDM)으로서 지칭되기도 하는 유형 I 당뇨병 및 쉬이한 증후군; 자가면역성 간염, 림프계 간질성 폐렴 (HIV), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식성) 대 NSIP, 길랑-바레 증후군, 대혈관 혈관염 (류마티스성 다발성 근통 및 거대 세포 (다카야스) 동맥염 포함), 중간 혈관 혈관염 [가와사키병 및 결절성 다발성 동맥염 포함), 강직성 척추염, 베르거병 (IgA 신경병증), 신속하게 진행되는 사구체신염, 원발성 담즙성 간경변, 비열대 스프루 (글루텐 장병증), 한랭글로불린혈증, ALS, 관상 동맥 질환이 포함된다.

BR3 양성 암은 세포 표면 상에 BR3을 발현하는 세포의 비정상적인 증식을 포함하는 질병이다. BR3 양성 B 세포 신생물에는 BR3-양성 호지킨병 [림프구 우세형 호지킨병 (LPHD) 포함]; 비호지킨 림프종 (NHL); 소포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 모발 세포 백혈병이 포함된다. 비호지킨 림프종에는 저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 림프종 (SLL), 중간 악성도/소포 NHL, 중간 악성도 확산성 NHL, 고 악성도 면역모세포성 NHL, 고 악성도 림프아구성 NHL, 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 형질세포계 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증이 포함된다. 이들 암의 재발을 치료하는 것 또한 고려된다. LPHD는 방사선 또는 화학요법 치료에도 불구하고 자주 재발하는 경향이 있는 호지킨병의 유형이고, BR3-양성 악성 세포를 특징적으로 나타낸다. CLL은 4가지 주요 유형의 백혈병 중의 하나이다. 림프구로 불리우는 성숙 B 세포의 암인 CLL은 세포가 혈액, 골수 및 림프 조직 내에 진행성 축적되는 징후를 나타낸다.

구체적 양태에서, BR3 결합 항체 및 그의 기능적 단편은 비호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소 림프구성 림프종 (SLL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 류마티스성 관절염 및 유년형 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신염 포함), 베게너병, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 치료하는데 사용한다.

BR3 결합 항체 또는 그의 기능적 단편은, 예를 들어 재발되었거나 난치성의 저 악성도 또는 소포, BR3-양성, B-세포 NHL에 대한 단일제 치료제로서 유용하거나, 또는 다중 약물 섭생에서 기타 약물과 연계해서 환자에게 투여할 수 있다.

무통성 림프종은 서서히 성장하는 불치병인데, 수 차례의 일시적 차도와 재발을 반복한 후에 환자들은 평균 6 내지 10년 정도 생존한다. 한 양태에서, 인간화 BR3 결합 항체 또는 그의 기능적 단편을 사용하여 무통성 NHL을 치료한다.

신생물의 치료 효능 또는 치료 성공을 평가하기 위한 파라미터는 해당 질병 전문의에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 전문의는 특이적 질병의 징후 및 증상을 감소시키기 위한 방안을 찾을 것이다. 파라미터에는 평균 병세 진행까지의 기간, 병의 차도 기간 및 안정 기간이 포함될 수 있다.

다음 참고 문헌에는 림프종 및 CLL, 이들의 진단, 치료, 및 치료 효능을 측정하기 위한 표준 의학 과정이 기재되어 있다 [참고: Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; and Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000].

자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환의 치료 효능 또는 치료 성공을 평가하기 위한 파라미터는 해당 질병 전문의에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 전문의는 특이적 질병의 징후 및 증상을 감소시키기 위한 방안을 찾을 것이다. 다음의 이의 예이다.

한 양태에서, 본 발명의 항체는 류마티스성 관절염을 치료하는데 유용하다. RA는 많은 관절에 있어서의 염증, 연골 손실 및 골 침식을 유발시켜 관절 파괴를 가져오고, 궁극적으로는 관절 기능 저하를 야기시키는 것을 특징으로 한다. 부가적으로, RA는 전신 질환이기 때문에, 폐, 눈 및 골수와 같은 기타 조직에 영향을 미칠 수 있다. RA를 10년 이상 동안 앓고 있는 환자의 50％ 미만이 매일 정상적으로 활동하거나 기능할 수 있다.

본 발명의 항체를 초기 RA 환자에게서 1차 치료로서 [즉, 메토트렉세이트 (MTX)를 투약하지 않음] 및 단일제요법으로서 사용하거나 또는 예를 들어, MTX 또는 시클로포스파미드와 병용해서 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 항체를 DMARD 및/또는 MTX로는 치료하기 어려운 (난치성) 환자에 대한 2차 치료로서 및 단일제요법으로서 사용하거나 또는, 예를 들어 MTX와 병용해서 사용할 수 있다. 인간화 BR3 결합 항체는 관절 손상을 예방 및 제어하고, 구조적 손상을 지연시키며, RA 내의 염증과 관련된 통증을 감소시키고, 일반적으로 중간 수준 내지 중중의 RA 징후 및 증상들을 저하시키는데 유용하다. RA 환자는 RA를 치료하는데 사용되어 온 기타 약물을 이용한 치료에 앞서, 치료 후에, 또는 이러한 치료와 함께, 인간화 BR3 항체로 치료할 수 있다 (하기 병용 요법 참고). 한 양태에서는, 기존에 질병 완화 항류미티스약을 이용한 치료에 실패하였고/하였거나 메토트렉세이트 단독 치료에 대해 부적절한 반응을 나타낸 바 있는 환자를 본 발명의 인간화 BR3 결합 항체로 치료한다. 이러한 치료의 한 양태에서는, 환자에게 인간화 BR3 결합 항체 단독 (1일 및 15일 째에 1 g을 정맥내 주입함); BR3 결합 항체 + 시클로포스파미드 (3일 및 17일 째에 750 mg을 정맥내 주입함); 또는 BR3 결합 항체 + 메토트렉세이트를 17일 치료 섭생으로 투여한다.

RA에서의 치료 효능을 평가하기 위한 한 가지 방법은 미국 류마티스 협회 (ACR) 기준에 근거한 것인데, 이는 특히 부서지기 쉽고 팽윤된 관절 상의 개선율을 측정한다. RA 환자는 항체 치료하지 않았거나 (예를 들면, 치료 전의 기저 수준) 또는 플라시보 (위약)으로 치료한 경우와 비교해서 ACR 20 (20％ 개선)으로 스코어링될 수 있다. 항체 치료 효능을 평가하기 위한 다른 방식에는 X선 스코어링, 예를 들어 골 침식 및 관절 공간 협소화와 같은 구조적 손상을 스코어링하는데 사용되어 온 샤프 X선 스코어가 포함된다. 치료 동안 또는 치료 후 일정 기간에 건강 평가 질문서 [HAQ] 스코어, AIMS 스코어, SF-36를 기준으로 하여 장애를 예방하거나 개선시키는 것에 관해 환자를 평가할 수 있다. ACR 20 기준은 부서지기 쉬운 (통증있는) 관절 계수치와 팽윤된 관절 계수치 둘 다에 있어서의 20％ 개선과, 5가지 부가의 조치 중의 적어도 3가지에 있어서 20％ 개선을 포함할 수 있다:

1. 가시적 아날로그 규모에 의한 환자의 통증 평가 (VAS),

2. 질병 활성에 대한 환자의 포괄적인 평가 (VAS),

3. 질병 활성에 대한 의사의 포괄적인 평가 (VAS),

4. 건강 평가 질문서에 의해 측정된 환자의 자체 평가된 장애; 및

5. 급성 상 반응물 CRP 또는 ESR.

ACR 50 및 70은 유사하게 정의된다. 바람직하게는, ACR 스코어 20 이상, 바람직하게는 ACR 30 이상, 보다 바람직하게는 ACR 50 이상, 보다 더 바람직하게는 ACR 70 이상, 가장 바람직하게는 ACR 75 이상을 달성하기에 유효한 양의 본 발명의 BR3 결합 항체를 환자에게 투여한다.

건선성 관절염은 독특하면서도 별개의 방사선촬영 특징을 갖는다. 건선성 관절염의 경우, 관절 침식과 관절 공간 협소화는 또한, 샤프 스코어에 의해 평가할 수 있다. 본 발명의 인간화 BR3 결합 항체를 사용하여 관절 손상을 예방할 뿐만 아니라 상기 질환의 병 징후와 증상을 저하시킬 수 있다.

본 발명의 또다른 국면은 치료 유효량의 본 발명의 BR3 결합 항체를, SLE로 인해 고통받고 있는 환자에게 투여함으로써 루푸스 또는 SLE를 치료하는 방법이다. SLEDAI 스코어는 질병 활성의 수치적 정량화를 제공해준다. SLEDAI는 질병 활성과 상관이 있는 것으로 공지된 24가지 임상 및 실험실용 파라미터의 칭량 지수이고, 수치 범위는 0 내지 103이다 [참고: Bryan Gescuk ＆ John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521]. 이중 가닥 DNA에 대한 항체는 신장 발적 (renal flares) 및 루푸스의 기타 소견 (증상)을 유발시키는 것으로 여겨진다. 항체 치료를 받고 있는 환자를 대상으로 하여, 혈청 크레아티닌, 뇨단백 또는 뇨중 혈액 상의 상당하고도 재생 가능한 증가로서 정의되는 신장 발적 시간에 대해 모니터링할 수 있다. 또다른 한편, 또는 부가적으로, 환자를 대상으로 하여, 항핵 항체 및 이중 가닥 DNA에 대한 항체 수준을 모니터링할 수 있다. SLE에 대한 치료는 고 용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다.

척추관절병증은 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론병을 포함한 관절 질환 군이다. 치료 성공은 입증된 환자 및 의사 포괄적 평가 측정 도구에 의해 결정할 수 있다.

각종 약물을 사용하여 건선을 치료하고; 치료는 질병 중증도와 직접 관련하여 상이하다. 보다 순한 형태의 건선을 나타내는 환자는 전형적으로, 국소 치료를 활용하는데, 예를 들면, 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐을 활용하여 질병을 관리하는 반면, 중간 정도 및 중증의 건선을 나타내는 환자는 전신 요법 (예: 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB)를 이용하는 것으로 예상된다. 타르를 사용하기도 한다. 이들 요법은 안전성 측면에서의 우려, 시간 소모적 섭생 또는 불편한 치료 과정을 복합적으로 나타낸다. 더우기, 몇몇 요법은 비용이 많이 드는 장비가 요구되고 연구실 세팅 내에 전용 공간이 필요하다. 전신용 약물은 고혈압, 고지혈증, 골수 저해, 간 질환, 신장 질환 및 위장 장해를 포함한 심각한 부작용을 유발시킬 수 있다. 또한, 광요법의 사용은 피부암 발병을 증가시킬 수 있다. 국소 요법의 사용과 연관된 불편함과 불쾌함 이외에도, 광요법과 전신 치료는 요법을 수행하거나 요법을 수행하지 않은 경우에도 환자를 순환시켜야 하고, 부작용으로 인한 평생 노출을 모니터링해야 한다.

건선에 대한 치료 효능은 기저 수준 질환과 비교해서 의사의 포괄적 평가 (PGA) 변화 및 건선 부위 및 중증도 지수 (PASI) 스코어, 건선 증상 평가 (PSA)를 포함한, 상기 질병의 임상 징후 및 증상의 변화를 모니터링함으로써 평가한다. 환자를 대상으로 하여, 특정 시점에 경험한 가려움 정도를 표시하기 위해 사용되어 온 가시적 아날로그 등급에 대해 치료 전 과정에 걸쳐 주기적으로 측정할 수 있다.

환자는 치료적 항체를 처음 주입하는 것과 관련하여 주입 반응 또는 주입-관련 증상을 경험할 수도 있다. 이들 증상은 그 중증도가 다양하고, 일반적으로 의료 개입에 따라 가역적이다. 이들 증상에는 독감 유사 발열, 오한/경직, 오심, 두드러기, 두통, 기관지연축, 혈관부종이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 질병 치료 방법이 주입 반응을 최소화하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명의 또다른 국면은 BR3 결합 항체 (이러한 항체는 보체-의존성 세포독성이 저하되거나 전혀 없다)를 투여함으로써 본원에 기재된 질병을 치료하는 방법이다.

투여량

해당 분야의 전문의에게 잘 알려져 있는 투여와 관련한 요인들과 치료하고자 하는 적응증에 따라서, 본 발명의 항체를, 독성과 부작용은 최소화시키면서 상기 적응증을 치료하는데 효능이 있는 투여량으로 투여할 것이다. 암, 자가면역 질환 또는 면역결핍증을 치료하기 위한 치료상 유효 투여량은 50 mg/용량 내지 2.5 g/㎡의 범위일 수 있다. 한 양태에서는, 투여된 투여량이 약 250 mg/㎡ 내지 약 400 mg/㎡ 또는 500 mg/㎡이다. 또다른 양태에서는, 투여량이 약 250 내지 375 mg/㎡이다. 또다른 양태에서는, 투여량 범위가 275 내지 375 mg/㎡이다.

본원에 기재된 BR3 양성 B 세포 신생물 [예: 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비호지킨 림프종 (NHL), 소포형 림프종 (FL) 또는 다발성 골수종]을 치료하는 한 양태에서는, 상기 항체를 50 mg/용량 내지 2.5 g/㎡의 범위로 투여한다. B 세포 림프종, 예를 들어 비호지킨 림프종으로 인해 고통받고 있는 환자를 치료하기 위한 구체적 양태에서는, 본 발명의 항-BR3 항체 및 인간화 항-BR3 항체를 인간 환자에게 10 mg/kg 또는 375 mg/㎡의 투여량으로 투여한다. NHL를 치료하기 위한 한 가지 투여 섭생은 치료 첫째 주에는 항체 조성물 1회분을 10 mg/kg의 투여량으로 투여한 다음, 2주 간격으로 동일한 양의 항체 두번째 용량을 투여한다. 일반적으로, NHL 환자는 이러한 치료를 1년에 1회 받지만, 림프종이 재발한 경우에는 이를 반복할 수 있다. 또다른 투여 섭생에서는, 저 악성도 NHL로 인해 치료받고 있는 환자에게 4주 동안 항-BR3 항체을 투여한 다음 (매주 375 mg/㎡씩 투여), 5주째에는 항체 + 표준 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 또는 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손) 화학요법을 3회 부가 과정 동안 투여하는데, 이는 3 주기 동안 3주 마다 공급하였다.

류마티스성 관절염을 치료하기 위한 한 가지 양태에서는, 항-BR3 항체에 대한 투여량 범위가 125 mg/㎡ (1회분당 약 200 mg에 상응함) 내지 600 mg/㎡으로서, 이는 2회분으로 나누어 투여하는데, 예를 들어 제1 회분 200 mg을 1일 째에 투여한 다음, 제2 회분 200 mg을 15일 째에 투여한다. 상이한 양태에서는, 투여량이 1회분당 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 및 600 mg으로 이루어진 군에서 선택된다.

질병을 치료하는데 있어서, 본 발명의 BR3 결합 항체를 이러한 질병 전문의에 의해 결정되는 바와 같이, 만성적으로 또는 간헐적으로 환자에게 투여할 수 있다.

약물을 정맥내 주입 또는 피하 방식으로 투여한 환자는 부작용, 예를 들어 발열, 오한, 화끈감, 무력증 및 두통을 경험할 수 있다. 이러한 부작용을 완화시키거나 최소화시키기 위해, 환자에게 해당 항체의 초기 컨디셔닝 용량(들)을 투여한 다음 치료 용량을 투여할 수 있다. 컨디셔닝 용량(들)은 환자가 보다 높은 투여량을 견딜 수 있도록 적응시키기 위해 치료 용량 보다는 낮을 것이다.

(1) 야생형 인간 IgG Fc를 포함하는 항체와 비교해서 ADCC 기능이 결여되거나 ADCC 기능이 저하되거나; (2) BR3에 대한 BAFF 결합을 부분적 또는 완전히 억제할 수 있는 능력이 결여되거나; 또는 (3) 야생형 인간 IgG Fc를 포함하는 항체와 비교해서 ADCC 기능이 결여되거나 ADCC 기능이 저하되고, BR3에 대한 BAFF 결합을 부분적 또는 완전히 억제할 수 있는 능력이 결여된 본 발명의 BR3 결합 항체가, 예를 들어 BAFF와 BR3 결합을 억제하고 ADCC 기능을 지닌 항-BR3 항체를 이용한 요법에 대한 상당한 부작용을 나타내거나 이러한 부작용을 나타낼 것으로 예상되는 환자에 대한 대체 요법, 대안 요법 또는 유지 요법에서와 같이 유용할 것으로 고려된다. 예를 들어, 환자를 처음에는, BAFF와 BR3 결합을 억제하고 ADCC 기능을 지닌 항-BR3 항체로 치료한 다음, (1) 야생형 인간 IgG Fc를 포함하는 항체와 비교해서 ADCC 기능이 결여되거나 ADCC 기능이 저하되거나; (2) BR3에 대한 BAFF 결합을 부분적 또는 완전히 억제할 수 있는 능력이 결여되거나; 또는 (3) 야생형 인간 IgG Fc를 포함하는 항체와 비교해서 ADCC 기능이 결여되거나 ADCC 기능이 저하되고, BR3에 대한 BAFF 결합을 부분적 또는 완전히 억제할 수 있는 능력이 결여된 항-BR3 결합 항체로 치료할 수 있는 것으로 고려된다.

투여 경로

본 발명의 BR3 결합 항체는 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들면 볼루스로서 또는 전 기간에 걸친 연속식 주입, 피하, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 활막내, 수막강내, 또는 흡입 경로에 의해, 일반적으로 정맥내 또는 피하 투여에 의해 인간 환자에게 투여한다.

한 양태에서는, 항-BR3 항체를, 주입용 비히클로서 0.9％ 염화나트륨 용액을 수반한 정맥내 주입제로 투여한다. 또다른 양태에서는, 항-BR3 항체를 예비-충진된 주사기를 이용하여 투여한다.

병용 요법

본 발명의 BR3-결합 항체 또는 폴리펩티드는 해당 질병을 치료하기 위한 제2 치료제와 병용해서 사용할 수 있다. 제2 치료제란 용어는 대상체를 기타 부가의 요법으로 치료하는 것을 배제하지 않는다는 것을 인지해야 한다. 제2 치료제에 관한 언급은 이러한 작용제를, 또한 사용되고 있는 특이적 BR3-결합 항체 또는 폴리펩티드와 구별하기 위한 것이다. 한 양태에서는, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드를 사용하여 자가면역 질환 또는 암을 치료하고자 하는 환자를, 생물학적 반응 조정제 (BRM)와 동시에, 순차적으로 (전 또는 후), 또는 교대로 치료하여, 다중-약물 섭생에서 질병 및/또는 감염증과 싸울 수 있는 면역계의 능력을 자극하거나 복원시킬 수 있다. BRMs에는 모노클로날 항체, 예를 들어 TNF-알파 또는 IL-1을 표적으로 하는 항체 [예: Enbrel^®, Remicade^®, 및 Humira^®], 인터페론, 인터루킨 (예: IL-2, IL-12) 및 각종 유형의 집락-자극 인자 (CSF, GM-CSF, G-CSF)가 포함될 수 있다. 예를 들어, BRMs는 염증 활성을 방해할 수 있으므로, 궁극적으로는 관절 손상을 저하시킬 수 있다.

한 양태에서는, 제2 치료제가 IAP 억제제이다.

또다른 양태에서는, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드를 사용하여 자가면역 질환 또는 암을 치료하고자 하는 환자를, B 세포 고갈제와 동시에, 순차적으로 (전 또는 후), 또는 교대로 치료할 수 있다.

한 양태에서는, BR3 결합 항체를 사용하여 자가면역 질환 또는 암을 치료하고자 하는 환자를, BAFF 길항제와 동시에, 순차적으로 (전 또는 후), 또는 교대로 치료할 수 있다.

상기 언급된 암 및 신생물을 치료하기 위한 또다른 양태에서는, 환자를 다중 약물 섭생에서의 화학요법제와 같은 한 가지 이상 치료제와 연계해서 본 발명의 BR3 결합 항체로 치료할 수 있다. BR3 결합 항체는 이러한 화학요법제와 동시에, 순차적으로 (전 또는 후) 또는 교대로 투여하거나, 또는 기타 요법과 비-반응성 후에 투여할 수 있다. 림프종 치료를 위한 표준 화학요법에는 시클로포스파미드, 시타라빈, 멜팔란 및 미톡산트론 + 멜팔란이 포함될 수 있다. CHOP는 비호지킨 림프종을 치료하기 위한 가장 흔한 화학요법 섭생 중의 하나이다. 다음은 CHOP 섭생에 사용된 약물이다: 시클로포스파미드 (브랜드명 시톡산, 네오사르); 아드리아마이신 (독소루비신/히드록시독소루비신); 빈크리스틴 (온코빈: Oncovin); 및 프레드니솔론 (종종 델타손 또는 오라손으로 지칭됨). 특정한 양태에서는, BR3 결합 항체를, 이를 필요로 하는 환자에게 다음 화학요법제들 중의 하나 이상과 병용해서 투여한다: 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론. 구체적 양태에서는, 림프종 (예: 비호지킨 림프종)으로 인해 고통받고 있는 환자를 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 요법과 연계해서 본 발명의 항-BR3 항체로 치료한다. 또다른 양태에서는, 암 또는 신생물 환자를 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손) 화학요법과 병용해서 본 발명의 BR3 결합 항체로 치료할 수 있다. 구체적 양태에서는, BR3-양성 NHL로 인해 고통받고 있는 환자를 CVP와 연계해서 인간화 항-BR3 항체로 치료한다. 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 치료법의 구체적 양태에서는, BR3 결합 항체를 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 클라드리빈 2-(클로로데옥시아데노신, 2-CdA[류스타틴]), 펜토스타틴 (Nipent), 및 시클로포스파미드를 이용한 화학요법과 연계해서 투여한다.

상기 언급된 자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환을 치료하는데 있어서, 환자를, 예를 들어 다중 약물 섭생에서와 같은 제2 치료제, 예를 들면 면역억제제와 연계해서, 본 발명의 BR3 결합 항체로 치료할 수 있다. BR3 결합 항체는 면역억제제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로 투여하거나 기타 요법과의 비-반응성시 투여할 수 있다. 면역억제제는 당해 분야에 제시된 바와 같은 투여량과 동일하거나 이 보다 적은 양으로 투여할 수 있다. 바람직한 보조 면역억제제는 치료하고자 하는 질환 유형 뿐만 아니라 환자의 병력을 포함한 많은 요인들에 의해 좌우될 것이다.

보조 요법을 위해 본원에 사용된 바와 같은 "면역억제제"는 환자의 면역계를 억제하거나 은폐시키는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이러한 작용제에는 사이토킨 생성을 억제하거나, 자기 항원 발현을 하향 조절 또는 억제시키거나, 또는 MHC 항원을 은폐시키는 물질이 포함될 것이다. 이러한 작용제의 예에는 스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 [참고: 미국 특허 제4,664,077호], 아자티오프린 (또는 아자티오프린에 대한 부작용이 있는 경우에는, 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드 (이는 미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 은폐시킨다); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-개체특이형 (idiotypic) 항체; 시클로스포린 A; 사이토킨 또는 사이토킨 수용체 길항제 (항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체 포함); 항종양 괴사 인자-α 항체; 항종양 괴사 인자-β 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범 (pan)-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합성 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 [참고: 1990년 7월 26일자로 공개된 WO 90/08187]; 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 [참고: 미국 특허 제5,114,721호]; T-세포 수용체 단편 [참고: Offner et al., Science 251:430-432 (1991); WO 90/11294; and WO91/01133]; 및 T 세포 수용체 항체 [참고: EP 340,109], 예를 들면 TlOB9가 포함된다.

류마티스성 관절염을 치료하기 위해, 환자를 다음 약물들 중의 한 가지 이상과 연계해서, 본 발명의 BR3 결합 항체로 치료할 수 있다: DMARDs (질병 완화 항류마티스약) (예: 메토트렉세이트), NSAI 또는 NSAID (비-스테로이드계 소염 약물), HUMIRA^® [아달리무마브 (adalimumab); 공급처: Abbott Laboratories], ARAVA^® (레플루노미드: leflunomide), REMICADE^® [인플릭시마브 (infliximab); 공급처: Centocor Inc., of Malvern, Pa], ENBREL^® [에타네르셉트 (etanercept); 공급처: Immunex, WA], COX-2 억제제. RA에 흔히 사용되는 DMARDs는 히드록시클로로퀸, 설파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 에타네르셉트, 인플릭시마브, 아자티오프린, D-페니실라민, 금 (경구), 금 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 스타필로코쿠스성 단백질 A 면역흡착제이다. 아달리무마브는 TNF와 결합하는 인간 모노클로날 항체이다. 인플릭시마브는 TNF와 결합하는 키메라 모노클로날 항체이다. 에타네르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합성 부분으로 이루어진 "이뮤노어드헤신" 융합 단백질이다. RA의 통상적인 치료법에 대해서는, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis ＆ Rheumatism 46 (2): 328-346 (February, 2002)]. 구체적 양태에서는, RA 환자를 메토트렉세이트 (MTX)와 연계해서 본 발명의 BR3 항체로 치료한다. MTX 투여량의 한 예는 1주에 약 7.5 내지 25 mg/kg이다. MTX는 경구 및 피하 투여할 수 있다.

강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론병을 치료하기 위해서는, 환자를, 예를 들어 Remicade^® (인플릭시마브; 공급처: Centocor Inc., of Malvern, Pa.), ENBREL^® (에타네르셉트; 공급처: Immunex, WA)와 연계해서, 본 발명의 BR3 결합 항체로 치료할 수 있다.

SLE에 대한 치료에는 고 용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)가 포함된다.

건선을 치료하기 위해서는, 환자에게 BR3 결합 항체를, 국소 치료제, 예를 들어 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐과 연계하거나 또는 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB 요법과 연계해서 투여할 수 있다. 한 양태에서는, 건선 환자를 시클로스포린과 순차적으로 또는 동시에 BR3 결합 항체로 치료한다.

제약 제형 (제제)

본 발명에 따라서 사용된 BR3 결합 항체의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 항체를 임의의 제약상 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이에는 완충제, 예를 들면 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들면 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

항-BR3 항체 제형의 예는 본원에 참고로 도입된 W0 98/56418에 기재되어 있다. 또다른 제형은 2 내지 8℃ 하의 저장시 최소 2년의 저장 수명을 갖는, 항-BR3 항체 40 mg/ml, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9％ 벤질 알코올, 0.02％ 폴리솔베이트 20 (pH 5.0)을 포함하는 반복투여용 액상 제형이다. 관심있는 또다른 항-BR3 제형은 9.0 mg/ml 염화나트륨 중의 10 mg/ml 항체, 7.35 mg/ml 나트륨 시트레이트 이수화물, 0.7 mg/ml 폴리솔베이트 80, 및 멸균성 주사용 수 (pH 6.5)를 포함한다. 또다른 수성 제약 제형은 10 내지 30 mM 나트륨 아세테이트 (약 pH 4.8 내지 약 pH 5.5, 바람직하게는 pH 5.5), 약 0.01 내지 0.1％ v/v 양의 계면활성제로서의 폴리솔베이트, 약 2 내지 10％ w/v 양의 트레할로스, 및 방부제로서의 벤질 알코올 [참고: 미국 특허 제6,171,586호]을 포함한다. 피하 투여용으로 적응시킨 동결건조된 제형은 W0 97/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제형은 적합한 희석제를 사용하여 고 단백질 농도가 되도록 재구성할 수 있고, 이와 같이 재구성된 제형은 본원에서 치료하고자 하는 포유류에게 피하 투여할 수 있다.

인간화 항-BR3 항체에 대한 한 가지 제형은 10 mM 히스티딘, 6％ 슈크로스, 0.02％ 폴리솔베이트 20 (pH 5.8) 중의 12 내지 14 mg/ml의 항체이다.

구체적 양태에서, 항-BR3 항체, 특히 9.1RF, 9.1RF (N434 돌연변이체), 또는 V3-46s를 lO mM 히스티딘 설페이트, 60 mg/ml 슈크로스, 0.2 mg/ml 폴리솔베이트 20, 및 멸균성 주사용 수 (pH 5.8) 중의 항체 20 mg/ml로 제형화한다.

본원에서의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토킨 또는 면역억제제 (예를 들어, T 세포 상에서 작용하는 작용제, 예를 들면, 시클로스포린, 또는 T 세포와 결합하는 항체, 예를 들면, LFA-1과 결합하는 항체)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용하거나, 또는 전술된 이용 투여량의 약 1 내지 99％로 사용된다.

활성 성분을, 예를 들어 액적형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 길항제를 함유하는 고형 친수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테애트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.

용품 및 키트

본 발명의 또다른 양태는 자가면역 질환 및 관련 질환 및 BR3 양성 암 (예: 비호지킨 림프종)을 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 용품이다. 본 발명의 또다른 양태는 면역결핍증을 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 용품이다. 본 발명의 용품은 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 한 가지 이상의 활성제가 본 발명의 BR3 결합 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 해당 조성물이 특정한 질환을 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시해준다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 항체 조성물을 환자에게 투여하기 위한 지시사항을 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 병용 요법을 포함하는 용품 및 키트가 또한 고려된다.

패키지 삽입물은 적응증, 활용, 투여량, 투여, 금기사항 및/또는 치료 제품의 사용과 관련한 경고에 관한 정보를 함유하고 있는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 지시사항을 지칭한다. 한 양태에서는, 패키지 삽입물이 해당 조성물이 비호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용된다는 것을 표시해준다.

부가적으로, 본 발명의 용품은 제약상 허용 가능한 완충액, 예를 들어 제균성 주사용 수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충액, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.

각종 목적을 위해, 예를 들어 B-세포 사멸 검정을 위해, 세포자멸 검정용 양성 대조군으로서, 세포로부터 BR3을 정제 또는 면역침전시키는데 유용한 키트가 또한 제공된다. BR3을 단리 및 정제하는 경우에는, 키트가 비드 (예: 세파로스 비드)와 커플링된 항-BR3 항체를 함유할 수 있다. BR3를 시험관 내에서, 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 검출 및 정량화하기 위한 항체를 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 용품의 경우 처럼, 키트는 용기, 및 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 하나 이상의 항-BR3 항체를 포함하는 조성물을 보유하고 있다. 예를 들어 희석제 및 완충제, 대조군 항체를 함유하는 부가의 용기가 포함될 수도 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물에 관한 설명 뿐만 아니라 의도한 시험관내 또는 진단 용도에 관한 지시사항을 제공해줄 수 있다.

모노클로날 항체

항-BR3 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 재조합 DNA 방법 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]에 의해 제조할 수 있거나, 또는 본원 실시예 섹션에 기재된 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스, 햄스터 또는 기타 적당한 숙주 동물을 전형적으로 면역제로 면역시켜, 이러한 면역제와 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도시킨다. 또다른 한편, 림프구를 시험관 내에서 면역시킬 수 있다.

면역제에는 전형적으로, BR3 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질이 포함될 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요망되는 경우에는 말초혈 림프구 ("PBLs")를 사용하거나, 또는 비-인간 포유류 공급원이 요망되는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [참고: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103]. 불멸화 세포주는 통상적으로, 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주를 이용한다. 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 한 가지 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에게 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우에는, 하이브리도마에 대한 배양 배지가 전형적으로, HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지시키는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이다.

바람직한 불멸화 세포주는 효율적으로 융합시켜 주고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 안정한 고수준의 항체 발현을 뒷받침해주며, HAT 배지와 같은 배지에 대해 민감한 세포이다. 보다 바람직한 불멸화 세포주는, 예를 들어 공급처 [Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California 및 American Type Culture Collection, Manassas, Virginia]로부터 획득할 수 있는 뮤린 골수종 세포주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종-골수종 세포주 또한, 인간 모노클로날 항체를 생산하는 것으로 보고되었다 [참고: Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) pp. 51-63].

이어서, 하이브리도마 세포를 배양하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, BR3 폴리펩티드에 대항하여 유도된 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법, 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성 면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정한다. 이러한 기술과 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌 [참고: Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다.

목적하는 하이브리도마 세포를 확인하면, 제한 희석 과정에 의해 클론을 아클로닝시킨 다음, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 [Goding, 상기 참고]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는, 예를 들어 둘벡코 변형 이글스 배지 및 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또다른 한편, 하이브리도마 세포를 포유류 중의 복수으로서 생체내 성장시킬 수 있다.

상기 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를, 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 G-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제할 수 있다.

모노클로날 항체는 또한, 예를 들어 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 만들 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 용이하게 단리 및 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 제공된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들어 원숭이 COS 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 (이들은 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는다) 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 획득할 수 있다. 상기 DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩 서열로 치환시키거나 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., 상기 참고], 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 공유적으로 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드를 본 발명의 항체의 불변 도메인 대신 사용하거나, 또는 본 발명의 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용하여 키메라 2가 항체를 창출시킬 수 있다.

항체는 1가 항체일 수도 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 면역글로불린 경쇄와 변형된 중쇄를 재조합 발현시키는 것을 포함한다. 중쇄는 일반적으로, Fc 영역 내의 어떠한 지점에서도 절단시켜 중쇄 가교결합을 방지시킨다. 또다른 한편으론, 관련 시스테인 잔기를 또다른 아미노산 잔기로 치환시키거나 결실시켜 가교결합을 방지시킨다.

시험관내 방법이 1가 항체를 제조하는데 또한 적합하다. 항체를 분해시켜 그의 단편, 특히 Fab 단편을 생성시키는 것은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 달성할 수 있다.

인간 및 인간화 항체

항-BR3 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 인간화 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는, 전형적으로 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예: Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 기타 항원-결합성 아서열)이다. 인간화 항체에는, 수용자의 CDR로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이 포함된다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 인간화 항체는 수용자 항체 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어디에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 바람직하게, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)].

비-인간 항체를 인간화시키는 몇몇 방법이 당해 분야 및 다음 실시예에 기재되었다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입 (import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 한 양태에 따르면, 인간화는 필수적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써, 다음 문헌의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 덜한 천연 인간 가변 도메인을 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체시킨 키메라 항체 [참고: 미국 특허 제4,816,567호]이다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 CDR 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체시킨 인간 항체이다.

인간화에 대한 대체 방안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역시 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에 완전한 레퍼토리의 인간 항체를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물 (예: 마우스)를 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포계 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실로 인해, 내인성 항체 생성이 완전히 억제되는 것으로 보고되었다. 이러한 생식세포계 돌연변이체 마우스 내로 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자 어레이를 전이시키면, 항원 챌린지시 인간 항체가 생성될 것이다 [참고: Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호 (GenPharm),제5,545,807호; 및 WO 97/17852]. 또다른 한편, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자 자리를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스 내로 도입함으로써 만들 수 있는데, 여기서는 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화되었다. 챌린지시, 유전자 재배열, 어셈블리, 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 국면에 있어서 인간에게서 관찰된 바와 밀접하게 유사한 인간 항체 생성이 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호, 및 다음 과학 공보에 기재되었다 [참고: Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)].

또다른 한편, 파지 디스플레이 기술 [참고: McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 사용하여, 면역시키지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이러한 기술의 한 양태에 따르면, 항체 V 도메인 서열을 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 외피 단백질 유전자 내로 동일 프레임 내에서 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에서 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 다음 실시예 섹션에 기재된 바와 같거나 다음 문헌에 고찰된 바와 같은 각종 포맷으로 수행할 수 있다 [참고: Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]. V-유전자 절편의 몇 가지 공급원을 파지 디스플레이를 위해 사용할 수 있다. 문헌 [참고: Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역시킨 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 면역시키지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 구축할 수 있고, 다양한 항원 (자기 항원 포함) 어레이에 대한 항체는 본질적으로, 문헌 [참고: Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라서 단리시킬 수 있다 [또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참고].

앞서 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 [참고: 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호].

인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성시킬 수도 있다 [참고: Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다음 문헌의 기술이 또한 이용 가능하다 [참고: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)].

다중-특이적 항-BR3 항체

다중-특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성으르 지닌 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다 (예를 들어, 최소한 2개의 항원에 대한 결합 특이성을 지닌 이중-특이적 항체). 예를 들어, 결합 특이성 중의 하나는 BR3 폴리펩티드에 대한 것일 수 있고, 다른 하나는 기타 모든 항원에 대한 것일 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 기타 항원은 세포-표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 소단위체이다. 예를 들어, 세포-표면 단백질은 천연 킬러 (NK) 세포 수용체일 수 있다. 따라서, 한 양태에 따르면, 본 발명의 이중-특이적 항체는 BR3과 결합할 수 있고 NK 세포와 결합할 수 있으며, 임의로는 NK 세포를 활성화시킬 수 있다.

이중-특이적 항체의 제조 방법의 예가 당해 분야에 보고되었다. 전통적으로, 이중-특이적 항체의 재조합 생성 방법은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것에 기초하는데, 상기 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [참고: Millstein et al., Nature , 305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 [쿠아드로마 (quadromas)]는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중에서 1개 만이 정확한 이중-특이적 구조를 갖는다. 이러한 정확한 분자의 정제는 통상적으로 친화 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 과정이 문헌 [참고: WO 93/08829 (1993년 5월 13일자로 공개됨) 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 지닌 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열과 융합시킬 수 있다. 이러한 융합은 바람직하게, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 융합물 중의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물과, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 형질감염시킨다. 이중-특이적 항체를 생성시키는 것에 관한 추가의 상세 내역은, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)].

재조합 세포 배양물로부터 이중-특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 단리하기 위한 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중-특이적 항체를 생성시켰다 [참고: Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 항체 동종-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 이종-이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종-이량체를 생성시키기 위해 활용할 수도 있다. 문헌 [참고: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디 (diabody)" 기술은 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기전을 제공하였다. 이러한 단편은 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 쌍 형성 (짝짓기)을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인을 또다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인와 쌍 형성함으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다 [참고: Gruber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994)].

2 원자가 이상을 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중-특이적 항체를 제조할 수 있다 [참고: Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

이종-접합체 항체

이종-접합체 항체는 2개의 공유적으로 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 불필요한 세포에 표적화하고 [참고: 미국 특허 제4,676,980호], HIV 감염을 치료하는 것으로 제안되었다 [참조: WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089]. 합성 단백질 화학 분야에 공지된 방법 (이에는 가교결합제를 이용하는 방법이 포함된다)을 사용하여 항체를 시험관 내에서 제조할 수 있다는 것이 고려된다. 예를 들어, 디설파이드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 미국 특허 제4,676,980호에 기재된 것들이 포함된다.

효과기 기능 공학처리

예를 들어, 암을 치료하는데 있어서의 본 발명의 항체의 효능을 증강시키도록 효과기 기능 측면에서 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내로 도입함으로써, 이러한 영역 내에 쇄간 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이로써 생성된 동종-이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개성 세포 사멸 및 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 지닐 수 있다 [참고: Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]. 항종양 활성이 증강된 동종-이량체성 항체는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 이종-이관능성 가교 결합제를 사용하여 제조할 수도 있다 [참고: Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)]. 또다른 한편, 이중 Fc 영역을 갖도록 항체를 공학처리함으로써, 증강된 보체 용해 및 ADCC 능력을 지니도록 할 수 있다 [참고: Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)].

Fc 영역 서열 상의 돌연변이 또는 변경은 FcR 결합성 (예: Fc감마R, FcRn)을 개선시키기 위해 만들 수 있다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 ADCC, CDC, 및 천연 IgG 또는 모 항체와 비교해서 개선된 FcRn 결합성으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 변경된 효과기 기능을 지닌다. 몇 가지 유용한 특이적 돌연변이의 예가, 예를 들어 다음 문헌에 기재되었다 [참고: Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6):6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490; 및 WO 공개공보 WO 00/42072].

한 양태에 따르면, Fc 수용체 돌연변이는 Fc 영역의 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에서의 치환인데, 이러한 Fc 영역 내의 잔기 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따른 것이다. 한 가지 구체적 양태에 따르면, 상기 치환은 N434A, N434F, N434Y 및 N434H로 이루어진 군에서 선택된 434 잔기 치환이다. 또다른 양태에 따르면, 상기 치환이 D265A/N297A 돌연변이이다. 또다른 양태에 따르면, 치환이 S298A/E333A/K334A 또는 S298A/K326A/E333A/K334A이다. 또다른 양태에 따르면, 치환이 K322A이다.

천연 서열 인간 IgG Fc 영역 서열의 예인 humIgG1 (비-A 및 A 동종이형) (각각 서열 133 및 135), humIgG2 (서열 136), humIgG3 (서열 137) 및 humIgG4 (서열 138)가 기존에 보고되었다. 천연 서열 뮤린 IgG Fc 영역 서열의 예인 murIgG1 (서열 139), murIgG2A (서열 140), murIgG2B (서열 141) 및 murIgG3 (서열 142)이 또한 기존에 보고되었다.

면역접합체

본 발명은 또한, 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 독소 (예: 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

이러한 면역접합체를 생성시키는데 유용한 화학요법제가 상기 언급되었다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합성 활성 단편, 외독소 A 쇄 [슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨], 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 각종 방사성핵종이 방사성접합된 합체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re가 포함된다.

각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예: 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [참고: Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다 [참고: WO 94/11026].

또다른 양태에서는, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 제거제 (clearing agent)를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환시 제거하고, 이어서 세포독성제 (예: 방사성뉴클레오티드)와 접합되는 "리간드" (예: 아비딘)을 투여한다.

면역리포솜

본원에 기재된 항체를 면역리포솜으로서 제형화할 수도 있다. 항체를 함유하는 리포솜은 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [참고: Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기재된 방법에 의해 제조한다. 순환 시간이 증강된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포솜은 한정된 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 수득한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디설파이드 상호 교환 반응을 통하여 문헌 [참고: Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합시킬 수 있다. 화학요법제 (예: 독소루비신)가 리포솜 내에 임의로 함유된다 [참고: Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19): 1484 (1989)].

항체 및 폴리펩티드의 제약 조성물

본원에서 확인된 BR3 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 뿐만 아니라 앞서 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 기타 분자는 제약 조성물 형태로, 상기 및 하기에서 인지된 바와 같은 각종 장애를 치료하기 위해 투여할 수 있다.

리포펙틴 (lipofectin) 또는 리포솜을 또한 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 및 항체 또는 조성물을 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편을 사용하는 경우에는, 표적 단백질의 결합성 도메인과 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 근거로 하여, 표적 단백질 서열과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성할 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)].

본원에서의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 필요한 바와 같은 한 가지 이상 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 화합물을 함유할 수도 있다. 또다른 한편, 또는 또한, 본 발명의 조성물은 그의 기능을 증강시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 화학요법제 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.

활성 성분을, 예를 들어 액적형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 참고]에 기재되어 있다.

지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT^® (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 분자를 100일 이상에 걸쳐 방출시킬 수 있게 하지만, 특정의 히드로겔은 단백질을 단시간 동안 방출시킨다. 피막형성된 항체가 장시간 동안 체내에 남아있는 경우에는, 이들 항체가 37℃하 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성을 상실하게 되고 면역원성 상의 변화가 가능해질 수 있다. 그에 관여하는 기전에 따라서 안정화시키기 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 상호 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우에는, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결시키며, 적당한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 제어하며, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 발생시킴으로써 안정화를 달성할 수 있다.

진단 용도 및 영상화

BR3과 특이적으로 결합하는 표지된 항체, 및 그의 유도체 및 유사체는 본 발명의 폴리펩티드의 발현, 이상한 발현 및/또는 활성과 연관된 질병 및/또는 장애를 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 진단 목적을 위해 사용할 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에 따르면, 항-BR3 항체를 대상체 내로 주입하는 것을 포함하는 진단 검정 또는 영상화 검정에 사용된 항-BR3 항체는 BAFF와 BR3 간의 상호 작용을 차단하지 않거나, 또는 BAFF와 BR3 간의 상호 작용을 부분적으로만 차단시키는 항체이다. 본 발명은 (a) 본 발명의 하나 이상의 항체를 사용하여 개체 (개개인)의 세포 또는 체액 중에서의 BR3 폴리펩티드의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계 (상기와 같이 검정된 유전자 발현 수준이 표준 유전자 발현 수준과 비교해서 증가 또는 감소하는 것이 이상한 발현의 지표이다)를 포함하여, BR3 폴리펩티드의 이상한 발현을 검출하는 것을 제공한다.

본 발명은 (a) 본 발명의 항체를 사용하여 특정 개체 (개개인)의 세포 또는 체액 중에서의 BR3 폴리펩티드의 발현을 검정하는 단계; (b) 상기 개체의 세포 또는 체액 중에서의 BAFF 폴리펩티드의 발현을 검정하는 단계; 및 (c) BAFF 유전자 발현 수준을 표준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계 (상기와 같이 검정된 BAFF 유전자 발현 수준이 표준 유전자 발현 수준과 비교해서 증가 또는 감소하는 것과, 체액 또는 병든 조직 내에 BR3 폴리펩티드가 존재하는 것이 항-BR3 항체 또는 폴리펩티드를 이용하여 치료해야 할 장애가 있다는 지표이다)를 포함하여, 본 발명의 항-BR3 항체 또는 폴리펩티드를 이용하여 치료해야 할 장애를 진단하기 위한 진단 검정을 제공한다. 암과 관련하여, 특정 개체로부터의 생검 조직 내에 BR3이 존재하거나 또는 비교적 다량의 BR3 전사체가 존재한다는 것은 이러한 질병이 발생할 수 있는 소인을 나타낼 수 있거나, 또는 실제적 임상 증상이 나타나기 전에 해당 질병을 검출하는 수단을 제공해줄 수 있다. 이러한 유형의 보다 확정적인 진단으로, 보건 전문가는 예방적 조치 또는 공격적인 치료를 보다 초기에 이용함으로써, 암의 발생이나 추가의 진행을 예방할 수 있다.

본 발명의 항체는 당업자에 공지된 전통적인 면역조직학적 방법 [참고: 예를 들어, Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)]을 사용하여 생물학적 샘플 중에서 단백질 수준을 검정하기 위해 사용할 수 있다. 단백질 유전자 발현을 검출하는데 유용한 기타 항체에 의거한 방법에는 면역검정, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 및 방사성 면역검정 (RIA)가 포함된다. 적합한 항체 검정 표지는 당해 분야에 공지되어 있고, 이에는 효소 표지, 예를 들어 글루코스 옥시다제; 방사성 동위원소, 예를 들어 요오드 (¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I), 탄소 (¹⁴C), 황 (³⁵S), 삼중 수소 (³H), 인듐 (^115mIn, ^113mIn, ¹¹²In, ¹¹¹In), 및 테크네튬 (⁹⁹Tc, ^99mTc), 탈륨 (²⁰¹Ti), 갈륨 (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), 팔라듐 (¹⁰³Pd), 몰리브덴 (⁹⁹Mo), 크세논 (¹³³Xe), 불소 (¹⁸F), ¹⁵³Sm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁴⁷Sc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁴²Pr, ¹⁰⁵Rh, ⁹⁷Ru; 루미놀; 및 형광성 표지, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 및 바이오틴이 포함된다.

당해 분야에 공지된 기술을 적용하여 본 발명의 항체를 표지시킬 수 있다. 이러한 기술에는 이관능성 접합제를 사용하는 것이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,756,065호; 제5,714,631호; 제5,696,239호; 제5,652,361호; 제5,505,931호; 제5,489,425호; 제5,435,990호; 제5,428,139호; 제5,342,604호; 제5,274,119호; 제4,994,560호; 및 제5,808,003호; 이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다].

특정 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간에게서 BR3 분자의 발현 또는 BR3 분자의 이상한 발현과 연관된 질병 또는 장애를 진단하는 것은 이러한 포유류에서 BR3 분자를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 진단 방법이 (a) 각각 BR3 분자와 특이적으로 결합하는, 표지된 항-BR3 항체 또는 폴리펩티드의 유효량을 포유류에게 투여 (예를 들어, 비경구, 피하 또는 복강내 투여)하는 단계; (b) 이러한 투여 후 상기 표지된 분자가, BR3 분자가 발현되는 대상체 내의 부위에 우선적으로 농축될 수 있는 시간 간격 (및 결합되지 않은 표지된 분자가 배경 수준으로 제거될 수 있는 시간 간격) 동안 기다리는 단계; (c) 배경 수준을 검출하는 단계; 및 (d) 대상체 중의 표지된 분자를 검출하는 단계 (이로써, 상기 표지된 분자가 배경 수준 이상으로 검출된다는 것은 대상체가 BR3의 발현 또는 이상한 발현과 연관된 특별한 질병이나 장애가 있다는 지표이다)를 포함한다. 배경 수준은 검출된 표지 분자의 양을, 특별한 시스템에 대해 기존에 결정된 표준 값과 비교하는 것을 포함한 각종 방법에 의해 결정할 수 있다. 구체적 양태에 따르면, 본 발명의 항체를 사용하여 B 세포 계통 세포 또는 단구 계통 세포의 농도를 정량화 또는 정성화한다.

한 가지 구체적 양태에 따르면, BR3 폴리펩티드 발현 또는 과발현은 세포 표면 상에 존재하거나 또는 세포에 의해 분비된 BR3의 수준을 평가함으로써 (예를 들어, 항-BR3 항체 또는 항-BAFF 항체를 이용한 면역조직화학 검정; FACS 분석 등을 통하여 수행한다) 진단 또는 예후 검정에서 결정한다. 또다른 한편, 또는 부가적으로, BR3-코딩 핵산 또는 그의 보체에 상응하는 핵산-이용 프로브를 사용하여 형광성 계내 혼성화 [FISH; 참고: WO98/45479 (1998년 10월에 공개됨)], 서던 블롯팅 (Southern blotting), 노던 블롯팅 (Northern blotting), 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예를 들어 실시간 정량적 PCR (RT-PCR)을 통하여, 세포 중의 BR3 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 mRNA의 수준을 측정할 수 있다. 예를 들어, 항체에 의거한 검정을 사용하여 생물학적 유체 (예: 혈청)에서 쉐드 (shed) 항원을 측정함으로써 BR3 분자 또는 BAFF 분자 과발현을 연구할 수도 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,933,294호 (1990년 6월 12일자로 허여됨); WO 91/05264 (1991년 4월 18일자로 공개됨); 미국 특허 제5,401,638호 (1995년 3월 28일자로 허여됨); 및 Sias et al. J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)]. 상기 검정 이외에도, 각종 생체내 검정이 전문의에게 이용 가능하다. 예를 들어, 포유류 체내 세포를, 검출 가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지시킨 항체에 노출시킬 수 있고, 이러한 포유류 내의 세포에 대한 항체의 결합을, 예를 들어 방사능에 대한 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 미리 노출시킨 포유류로부터 취한 생검을 분석함으로써 평가할 수 있다.

검정

본 발명의 작동제 항-BR3 항체는 BR3 생물학적 경로를 직접 자극하기 위해 사용되지만, TACI 또는 BCMA 수용체 경로에 대해서는 그렇치 못하다 (즉, "BR3-특이적"). 이러한 작동제 항체를 사용하여 BR3-특이적 신호 전달 경로의 하류 마커를 확인할 수 있다. 따라서, BR3 경로의 하류 마커를 확인하기 위한 검정은 작동제 BR3 결합성, BR3-특이적 항체 또는 폴리펩티드를, 그의 세포 표면 상에 BR3을 발현하는 세포에 투여하는 단계; 및 이러한 세포의 단백질 활성 또는 유전자 발현 상의 변화를 검출하는 단계 (예: 마이크로어레이 또는 ELISA 검정)를 포함할 수 있다. 본 발명의 또다른 양태에 따르면, 작동제 항체를 사용하여 BR3 경로 특이적 억제제를 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법은, 예를 들어 BR3 결합성, BR3-특이적 항체 또는 폴리펩티드를, 그의 세포 표면 상에 BR3을 발현하는 세포에 투여하는 단계; 후보 화합물을 상기 세포에 투여하는 단계; 및 이러한 후보 화합물이 세포의 증식 또는 세포의 생존을 억제하였는지 아니면 세포의 증식과 생존 둘 다를 억제하였는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

미국 가특허원 제60/640,323호 (2004년 12월 31일자로 출원됨)을 포함한, 본원에 인용된 모든 공개문헌 (특허 및 특허원 포함)은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

다음 DNA 서열은 부다페스트 조약 하에 기탁 기관 [American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA]에 다음에 기재된 바와 같이 기탁되었다:

물질 기탁 번호 기탁일

Hu9.1-RF-H-IgG PTA-6315 2004년 11월 17일

Hu9.1-RF-L-IgG PTA-6316 2004년 11월 17일

Hu2.1-46.DANA-H-IgG PTA-6313 2004년 11월 17일

Hu2.1-46.DANA-L-IgG PTA-6314 2004년 11월 17일

HuV3-46s-H-IgG PTA-6317 2004년 11월 17일

HuV3-46s-L-IgG PTA-6318 2004년 11월 17일

뮤린 B 세포: 12B12.1 PTA-6624 2005년 4월 8일

뮤린 B 세포: 3.1 PTA-6622 2005년 4월 8일

이들 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이의 규칙 (부다페스트 조약) 하에 이루어졌다. 이로써 해당 균주는 기탁일로부터 30년 동안 살아있는 배양물로 유지되어야 한다. 이들 기탁물은 부다페스트 조약 하에 ATCC에 의해 입수 가능할 것이며, 제넨테크, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)와 ATCC 간의 협정에 따르며, 언젠가 도래하는 관련 미국 특허 허여시, 또는 미국이나 외국 특허 출원 공개시 제3자가 기탁 배양물 자손을 영구적이면서 무제한적으로 입수 가능하도록 보장해주고, 35 U.S.C. 122에 따라서 미국 특허상표청장이 인정한 자격을 획득하고 이에 따른 특허청장의 규칙 (886 OG 638를 특별히 참조한 37 C.F.R. 1.14 포함)에 의해 제3자가 배양물 자손을 입수 가능하도록 보장해준다.

본 출원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양된 경우에 사멸 또는 손실되거나 파괴된 경우에는, 즉시 살아 있는 동일한 배양 표본으로 대체시킬 것이란 조항에 합의하였다. 기탁된 물질의 입수 가능성은 각국의 특허법에 따라서 정부 기관 하에 승인된 권리에 위반하여 본 발명을 실시하기 위한 라이센스로서 간주되지 않는다.

본 실시예에 지칭된 시판용 시약은 달리 표시되지 않는 한 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. 다음 실시예 및 명세서 전반에 걸쳐 ATCC 승인 번호로써 확인된 세포의 공급처는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)이다. 달리 인지되지 않는 한, 본 발명은 재조합 DNA 기술의 표준 과정, 예를 들어 앞서 기재되고 다음 교재에 기재되는 바와 같은 과정을 이용한다 [참고: Sambrook et al., 상기 참고; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991].

본 명세서와 청구의 범위 전반에 걸쳐 사용된 단어 "포함" 또는 "포함하는"이란, 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하는 것을 의미하지만, 기타 어떠한 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 인지해야 할 것이다.

전술된 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 다음 실시예는 단지 예시 목적을 위해 제공된 것이며, 이로써 본 발명의 범위가 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재되고 제시된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 당업자에게는 명백할 것이며, 이 또한 첨부된 청구의 범위에 속한다.

실시예 1 - 재료

BR3과 결합하는 뮤린 모노클로날 항체는 응집된 인간 BR3-Fc로 면역시킨 마우스로부터 생성시켰다. 이들 항체에는 11G9, 8G4, 7B2, 1E9, 12B12, 1E9, 1Al1, 8E4, 10E2 및 12B12로서 지칭된 하이브리도마로부터 생산된 것들이 포함된다. 2.1 및 9.1로서 지칭된 뮤린 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 기존에 보고되었고 [참고: 국제특허출원 PCT/USO1/28006 (WO 02/24909)], 기탁 기관 [American Type Culture Collection (ATCC); 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA]에 ATCC 기탁 번호 3689 및 ATCC 기탁 번호 3688로서 각각 기탁되었다. 뮤린 BR3에 대해 특이적이고 인간 BR3과는 결합하지 않는 햄스터 항-마우스 BR3 항체인 B9C11 항체 뿐만 아니라 하이브리도마 3.1로부터의 항체는 공급처 [Biogen Idee, Inc.]로부터 수득하였다.

미니BR3 펩티드 [TPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR (서열 150)]는 표준 Fmoc 화학을 이용하여 파이오니어 (Pioneer) 펩티드 합성기 (공급처: PE Biosystems) 상에서 C-말단 아미드로서 합성하였다. 펩티드를 실온에서 4시간 동안 TFA 중의 5％ 트리이 소프로필 식염수로 처리함으로써 수지로부터 절단시켰다. TFA를 회전 증발시켜 제거한 후, 에틸 에테르를 부가함으로써 펩티드를 침전시킨 다음, 역상 HPLC (아세토니트릴/H₂O/0.1％ TFA)함으로써 정제하였다. 전자분무 질량 분광법에 의해 펩티드 실체를 확인하였다. 동결건조시킨 후, 산화된 펩티드를 HPLC에 의해 정제하였다. 환원된 미니BR3을 함유하는 HPLC 분획을, NH₄OH를 사용하여 pH 약 9로 조정시킨 다음, 약간 과량의 K₃Fe(CN)₆을 부가함으로써 시스테인 24와 35 사이에 디설파이드를 형성시키고, 산화된 펩티드를 HPLC에 의해 정제하였다. 이러한 HPLC 용출액을 약간 과량의 I₂로 약 4시간에 걸쳐 처리함으로써 Acm 기를 제거하였다 (제2 디설파이드 형성과 동시에 이루어짐). 산화 진행 과정을 분석적 HPLC에 의해 모니터링하고, 최종 생성물을 HPLC에 의해 다시 정제하였다. 미니BR3을 수지 상에 있는 동안 아미노-말단적으로 바이오티닐화한 다음, 변형되지 않은 펩티드에 대해 상기 언급된 바와 같이 절단 및 정제하였다.

인간 BR3 세포외 도메인 (hBR3-ECD) 및 마우스 BR3 세포외 도메인 (mBR3-ECD) 구조물은, 그들의 서열을 pET32a 발현 벡터 (공급처: Novagen) 내로 아클로닝하고, N-말단 티오레독신 (TRX)-His-태그와의 융합물에 이어 엔테로키나제 프로테아제 부위를 창출시킴으로써 세균에서 생성시켰다. 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포 (공급처: Novagen)를 30℃ 하에 성장시키고, IPTG를 이용하여 단백질 발현을 유도시켰다. TRX-BR3을 Ni-NTA 칼럼 (공급처: Qiagen) 상으로 정제하고, 이미다졸 구배로 용출시킨 다음, 엔테로키나제 (공급처: Novagen)로 절단시켰다. 이어서, BR3을 S-세파로스 칼럼 상으로 정제하고, 3 mM 산화 및 1 mM 환원 글루타치온의 존재하에 PBS (pH 7.8) 중에서 밤새 재폴딩하며, PBS에 대항하여 투석하고, 모노S 칼럼 상으로 재정제하며, 농축시킨 다음, PBS 내로 투석하였다. 사용된 인간 BR3 세포외 서열: MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQE (서열 151). 마우스 세포외 서열: MGARRLRVRS QRSRDSSVPT QCNQTECFDP LVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGT ALQPQEGS (서열 152).

인간 및 마우스 BR3-Fc 단백질은 기존에 보고된 바와 같이 [참고: Pelletier, M., et al., (2003) J. Biol. Chem. 278, 33127-33133] 중국산 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)에서 생성하였다. 마우스 BR3-Fc 서열 (mBR3-Fc)은 문헌 [참고: Yan et al., (2001) Current Biology 11, 1547-1552]에 최초로 보고되었다. 마우스 BR3-Fc 서열은 다음과 같다:

변이체 인간 BR3-Fc 융합물 (vBR3-Fc)은 일반적으로, 천연 발생적 인간 BR3 서열의 ECD 서열의 변이체 서열을 포함하는 Fc 융합 단백질에 관한 것인데, 변이체는 또한 BAFF와 결합하고 천연 인간 BR3 서열 보다는 덜 응집되는 경향이 있다.

본원에 사용된 바와 같은 인간 BAFF는 기존에 보고된 바와 같이 [참고: Gordon, N. C., et al., (2003) Biochemistry 42, 5977-5983] 발현 및 정제할 수 있다. BAFF 잔기 82-285를 코딩하는 DNA 단편을 pET15b (공급처: Novagen) 발현 벡터 내로 클로닝하여, N-말단 His-태그와의 융합물에 이어 트롬빈 절단 부위를 창출시켰다. 이. 콜라이 BL21(DE3) (공급처: Novagen) 배양물을, 50 mg/L 카르베니실린을 수반한 LB 배지에서 37℃ 하에 중간-log 상이 되도록 성장시킨 다음, 1.0 mM IPTG를 이용하여 유도시키기에 앞서 16℃로 냉각시켰다. 추가로 성장시킨지 12시간 후에 원심분리시킴으로써 세포를 수거하고 -80℃ 하에 저장하였다. 세포 펠릿을 50 mM 트리스 (Tris), pH 8.0, 및 500 mM NaCl에 재현탁시키고, 얼음 상에서 초음파 처리하였다. 원심분리시킨 후, 상등액을 Ni-NTA 아가로스 칼럼 (공급처: Qiagen) 상으로 부하하였다. 이 칼럼을 50 mM 트리스, pH 8.0, 500 mM NaCl, 및 20 mM 이미다졸로 세척한 다음, 250 mM 이미다졸을 수반한 동일한 완충액 중에서 단계 구배를 이용하여 용출시켰다. BAFF-함유 분획을 풀링하고, 트롬빈을 가한 다음, 샘플을 4℃ 하에 20 mM 트리스, pH 8.0, 및 5 mM CaC12에 대항하여 밤새 투석하였다. 단백질을 모노Q (공급처: Pharmacia) 칼럼 상에서 추가로 정제하고, 최종적으로는 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 및 5 mM MgCl₂ 중의 S-200 크기 배제 칼럼 상에서 정제하였다.

몇몇 실험에서는, 하이브리드 BAFF 분자를 사용하였다. 이러한 하이브리드 BAFF 분자는 마우스 BAFF의 잔기 128-309의 N-말단과 재조합적으로 융합된 인간 BAFF의 잔기 82-134를 포함하였다. 재조합 단백질을 상기 언급된 바와 같이 세균에서 발현시키고 정제하였다. 인간 서열을 부가한 것이 mBAFF 단백질의 발현을 도 와주었다. 기타 실험에서는, CHO 세포에서 발현된 인간 BAFF를 B 세포 증식 검정에 사용하였다.

실시예 2 - 경쟁적 ELISA 검정

경쟁적 ELISA 검정을 사용하여 인간 BR3의 세포외 도메인 및 미니BR3에 대한 항-BR3 항체의 상대 친화도를 측정하였다. 이들 실험에서는 미량역가 플레이트 (Nunc MaxiSorp) 웰 상에 흡착된 항체에 대한 바이오티닐화 BR3-ECD의 결합이, 표지되지 않은 BR3-ECD 또는 미니BR3와 경쟁하였다. BR3-ECD를 주위 온도에서 2시간 동안 10배 몰 과량의 설포-NHS-바이오틴 (공급처: Pierce)과 반응시킴으로써 바이오티닐화하였다. 항체를 실온에서 2시간 동안 피복 완충액 (50 mM 탄산나트륨 pH 9.6) 중에서 5 ㎍/mL으로 피복시킨 다음, 1시간 동안 PBS/0.05％ Tween-20/2.5％ (wt/vol) 분말상 탈지유로 차단시켰다. 스트렙타비딘-HRP를 이용하여 검출한 후 492 nm 하의 흡광도 약 1.0을 생성시키는데 요구되는 바이오틴-BR3-ECD의 양을 결정하였다. Mabs 3.1 및 12B12의 경우에 요구되는 바이오틴-BR3-ECD의 농도는 5 nM이고, 8G4 및 11G9의 경우에는 2 nM이며, 2.1 및 9.1의 경우에 요구되는 바이오틴-BR3-ECD 농드는 200 pM이었다. 이들 농도의 바이오틴-BR3-ECD 및 각종 농도의 표지되지 않은 BR3-ECD 또는 미니-BR3을 함유하는 용액을 제조하고, 이를 항체로 피복시킨 미량역가 플레이트의 개개 웰에 가하였다. 진탕시키면서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 용액을 경사 제거하고 웰을 PBS/.05％ Tween-20으로 6회 세정하였다. 스트렙타비딘-HRP (0.5 ㎍/mL)을 가하고, 30분 동안 진탕시키면서 인큐베이션한 다음, 웰을 비우고 상기 언급된 바와 같이 세정하였다. PBS, 0.01％ 과산화 수소, 및 0.8 mg/mL O-페닐렌디아민을 함유하는 용액을 가함으로써, 결합된 HRP를 검출하였다. 색상을 20분 동안 전개시킨 다음, 등 용적의 1 M 인산을 가함으로써 반응을 켄칭하였다. 492 nm 하의 흡광도를 플레이트 판독기 (공급처: Thermo LabSystems) 상에서 측정하였다. 경쟁인자 농도의 함수로서의 흡광도를, 4-파라미터 방정식 (1)을 사용함으로써 분석하여 바이오틴-BR3-ECD 결합 억제에 대한 IC50을 결정하였다:

(1) ((ml-m4)/(l+(mO/m3)^∧m2))+m4

[여기에서, ml은 경쟁인자를 이용하지 않은 흡광도이고, m4는 무한 억제제 농도 하에서의 흡광도이며, m0은 경쟁인자 농도이고, m3은 IC50 값이다].

2.1, 9.1, 8.G4 및 11G9는 전장 BR3 세포외 도메인과 유사한 친화도로 26-잔기 미니BR3과 결합하였다 (표 3). 다음에 제시되는 바와 같이, 이들 항체는 또한 BAFF에 대한 BR3 결합을 차단시켰다. 미니BR3과 결합하지 않은 3.1 및 12B12 항체는 또한 BAFF-BR3 상호 작용을 차단하지 못하였다.

실시예 3 - 인간화 항체

(a) 재료 및 방법

다음에 지칭된 잔기 번호는 카바트에 따라서 명명되었다 [참고: Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]. 1 문자 아미노산 약어를 사용하였다. DNA 축퇴는 IUB 부호를 사용하여 나타내었다 (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y = C/T).

초가변 영역을 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 상으로 직접 이식하다 -

뮤린 2.1, 11G9 및 9.1로부터의 VL 및 VH 도메인을 인간 컨센서스 카파 I (huKI) 및 인간 아군 III 컨센서스 VH (huIII) 도메인과 정렬시켰다. CDR 이식편을 만들기 위해, 다음 3가지 위치, 즉 R71A, N73T, 및 L78A에서 인간 아군 III 컨센서스 VH 도메인과 상이한 huKI 및 수용자 VH 프레임워크 [참고: Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)]을 사용하였다 (도 1 내지 3에서 진하게 표시한 문자 참고). 뮤린 2.1 (mu2.1), 11G9 (mullG9) 및 9.1 (mu9.1) 항체로부터의 초가변 영역을 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 내로 공학적으로 처리하여 직접적인 CDR-이식편 (2.l이식편, 1lG9이식편 및 9.l이식편)을 생성시켰다 (도 1 내지 3). VL 도메인에서는, 다음 영역을 인간 컨센서스 수용자에 이식하였다: 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) (카바트 넘버링 시스템). VH 도메인에서는, 위치 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 94-102 (H3) (카바트 넘버링 시스템)를 이식하였다 (도 1 내지 3). 문헌 [참고: MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]에서는 항체 및 항원 복합체 결정 구조를 분석한 결과, 중쇄의 위치 93 및 94가 접촉 영역의 일부이므로, 항체를 인간화하는 경우에 이들 위치가 CDR-H3의 정의 내에 포함되는 것이 합리적이란 사실을 밝혀내었다. 이식된 CDR-인간 프레임워크 서열을 코딩하는 핵산 서열이 파지미드 (phagemid)에 함유되었다. 이러한 파지미드는 1가 Fab-g3 디스플레이 벡터이고, phoA 프로모터의 제어 하에 2개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하였다. 제1 오픈 리딩 프레임은 수용자 경쇄의 VL 및 CH1 도메인과 융합된 stII 신호 서열로 이루어졌고, 제2 오픈 리딩 프레임은 수용자 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 융합된 stII 신호 서열에 이어 소수 파지 외피 단백질 P3으로 이루어졌다.

각 초가변 영역에 대한 별개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 쿤켈 (Kunkel) 돌연변이 유발시킴으로써 직접-이식편 변이체를 생성시켰다. DNA 서열 분석함으로써 정확한 클론을 평가하였다.

초가변 영역의 연질 무작위화 - 이식된 각 항체에 대해, 뮤린 초가변 영역 서열을 향해 편재된 (치우친) 연질 무작위화 전략을 사용하여 각 초가변 영역 내로 서열 다양성을 도입하였다. 이는 문헌 [참고: Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994)]에 처음으로 보고된 유독성 올리고뉴클레오티드 합성 전략을 이용하여 달성하였다. 돌연변이시킬 초가변 영역 내의 소정의 위치에 대해, 야생형 아미노산을 코딩하는 코돈을 뉴클레오티드의 70-10-10-10 혼합물로 유독하게 하여, 각 위치에서 평균 50％ 돌연변이율이 나타났다.

연질 무작위화 올리고뉴클레오티드는 뮤린 초가변 영역 서열을 모방하였고, 이에는 직접적인 초가변 영역 이식에 의해 규정된 동일한 영역이 포괄되었다. VH 도메인 중의 H2의 시작부 아미노산 위치 (위치 49)는 코돈 RGC를 사용함으로써 서열 다양성이 A, G, S 또는 T로 제한되었다.

파지 라이브러리의 생성 - 각 초가변 영역에 대해 고안된 무작위화 올리고뉴클레오티드 풀을 37℃ 하에 1시간 동안 660 ng의 올리고뉴클레오티드, 50 mM 트리스 pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 20 mM DTT, 및 5 U 폴리뉴클레오티드 키나제를 함유하는 6개의 20 ㎕ 반응물에서 개별적으로 인산화시켰다. 이어서, 이와 같이 인산화시킨 6개의 올리고뉴클레오티드 풀을 최종 용적 50 ㎕ 중에서 50 mM 트리스 pH 7.5, 10 mM MgCl₂ 중의 쿤켈 주형 20 ㎍과 합하였는데, 이로써 주형에 대한 올리고뉴클레오티드비가 3이 되었다. 이 혼합물을 90℃에서 4분 동안, 50℃에서 5분 동안 어닐링시킨 다음, 얼음 상에서 냉각시켰다. 어닐링된 DNA의 과도한 변성을 방지하기 위한 변형된 프로토콜을 이용하고 QIAQUICK PCR 정제용 키트 (Qiagen 키트 28106)를 사용하여, 과량의 어닐링되지 않은 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 어닐링된 혼합물 500 ㎕에 150 ㎕의 PB를 가하고, 혼합물을 2개의 실리카 칼럼 사이로 분할시켰다. 각 칼럼을 750 ㎕의 PE로 세척하고 여분의 스핀으로 칼럼을 건조시킨 후, 각 칼럼을 110 ㎕의 10 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8로 용출시켰다. 이어서, 실온에서 3시간 동안 1 ㎕ 100 mM ATP, 10 ㎕ 25 mM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 25 mM), 15 ㎕ 100 mM DTT, 25 ㎕ 10X TM 완충액 (0.5 M 트리스 pH 7.5, 0.1 M MgCl₂), 2400 U T4 리가제, 및 30 U T7 폴리머라제를 부가함으로써, 상기 어닐링 및 클린-업된 주형 (220 ㎕)을 충진시켰다.

이와 같이 충진된 생성물을 트리스-아세테이트-EDTA/아가로스 겔 상에서 분석하였다 [참고: Sidhu et al, Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)]. 3개 밴드가 통상 가시적이다: 하부 밴드는 정확하게 충진되고 연결된 생성물이고, 중간 밴드는 충진되긴 하였지만, 연결되지 않은 생성물이며, 상부 밴드는 가닥 전위된 것이다. 상부 밴드는 T7 폴리머라제의 고유 측 활성에 의해 생성되고 피하기가 어렵지만 [참고: Lechner et al., J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983)]; 이 밴드는 상부 밴드 보다 30배 덜 효율적으로 변환되고, 통상적으로 라이브러리에 기여하는 바가 거의 없다. 중간 밴드는 최종 연결 반응을 위한 5' 포스페이트의 부재에 기인한 것이고; 이 밴드는 효율적으로 변환되고, 불행하게도 주로 야생형 서열을 제공한다.

이어서, 상기 충진된 생성물을 클린-업하고 SS320 세포 내로 전기영동시키며, 문헌 [참고: Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)]에 기재된 바와 같이 M13/KO7 헬퍼 파지의 존재하에 증식시켰다. 라이브러리 크기 범위는 1 - 2 x 10⁹ 독립적 클론이었다. 초기 라이브러리로부터의 무작위 클론을 서열 분석하여 라이브러리 질을 평가하였다.

파지 선별 - 인간 BR3ecd 또는 변이체 BR3-Fc 융합물 (vBR3-Fc)을 파지 선별을 위한 표적으로서 사용하였다 [참고: Kayagaki et al. Immunity 17:515-524 (2002) and Pelletier et al. J. Biol. Chem. 278:33127-33133 (2003)]. BR3ecd 또는 vBR3-Fc를 PBS 중의 10 ㎍/ml로 맥시소르프 (MaxiSorp) 미량역가 플레이트 (Nunc) 상에 피복시켰다. 선별 제1 회전의 경우에는 8개 웰의 표적을 사용하였고; 다음 연속 회전에 대해서는 단일 웰의 표적을 사용하였다. 카세인 차단제 (공급처: Pierce)를 사용하여 웰을 1시간 동안 차단시켰다. 배양 상등액으로부터 파지를 수거하고, 1％ BSA 및 0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS (PBSBT)에 현탁시켰다. 웰에 2시간 동안 결합시킨 후, 0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS (PBST)로 광범위하게 세척함으로써, 결합되지 않은 파지를 제거하였다. 웰을 50 mM HCl, 0.5 M KCl과 함께 30분 동안 인큐베이션함으로써, 결합된 파지를 용출시켰다. Top 10 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지를 사용하여 파지를 증폭시키고, 이를 2YT, 50 ㎍/ml 카르베나실린 중에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 표적 피복된 웰로부터 용출된 파지의 역가를 비-표적 피복된 웰로부터 회수한 파지의 역가와 비교하여 증균을 평가하였다.

용액 분류 방법을 이용하여 파지 라이브러리를 또한 분류하였다 [참고: Lee, C.V., et al. (2004) J. Mol. Biol 340(5):1073-93]. 설포-NHS-LC-바이오틴 (공급처: Pierce)을 사용하여 vBR3-Fc을 바이오티닐화하였다 (b-vBR3-Fc). 미량역가 웰을 4℃ 하에 밤새 PBS 중의 10 ㎍/ml 뉴트라비딘으로 피복시킨 다음, 카세인 차단제 (공급처: Pierce)를 사용하여 1시간 동안 차단시켰다. 고정화 vBR3-Fc를 이용하는 표준 플레이트 분류 방법을 사용하여, 패닝 제1 회전을 수행하였다. 선별 제2 회전의 경우에는, 0.05％ Tween 20을 함유하는 PBS (PBST) 및 1％ BSA 중에 현탁된 200 ㎕ 파지를 2시간 동안 100 nM b-vBR3-Fc와 혼합하였다. b-vBR3-Fc와 결합된 파지를 뉴트라비딘 피복된 웰 상에 5분 동안 포획시키고, 결합되지 않은 파지는 PBST로 세척 제거하였다. 100 mM HCl를 사용하여 파지를 30분 동안 용출시키고, 중화시킨 다음, KO7 헬퍼 파지 (공급처: New England Biolabs)의 존재하에 XL1 블루 세포 (공급처: Strategene)에서 증식시켰다. 그 다음 선별 회전은 다음을 제외하고는 유사하게 수행하였다: 3 회전에서는 최종 b-vBR3-Fc 농도가 20 nM였고, 4 및 5 회전에서는 최종 b-vBR3-Fc 농도가 1 nM였다. 파지 결합을 5 회전에서 1시간 동안 확립시킨 후, 뉴트라비딘 상에 포획시키기에 앞서 64시간 동안 1 μM 비-바이오티닐화 vBR3-Fc 상기 혼합물에 가하였다.

파지 ELISA - 맥시소르프 미량역가 플레이트를 PBS 중의 10 ㎍/ml로 인간 vBR3-Fc로 밤새 피복시킨 다음, 카세인 차단제로 차단시켰다. 배양 상등액으로부터의 파지를, 1시간 동안 조직 배양 미량역가 플레이트 중에서 1％ BSA를 함유하는 PBST 중에서 일련으로 희석된 vBR3-Fc와 함께 인큐베이션한 후, 혼합물 80 ㎕을 15분 동안 표적 피복된 웰에 옮겨 결합되지 않은 파지를 포획하였다. 플레이트를 PBST로 세척하고, HRP 접합된 항-M13 (공급처: Amersham Pharmacia Biotech)을 40분 동안 가하였다 (1％ BSA를 함유하는 PBST 중의 1:5000). 플레이트를 PBST로 세척하고, 테트라메틸벤지딘 기질 (공급처: Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 부가함으로써 전개시켰다. 405 nm 하의 흡광도를 용액 중의 표적 농도 함수로서 플롯하여 IC₅₀을 결정하였다. 이를, 파지 표면 상에 디스플레이된 Fab 클론에 대한 친화성 평가치로서 사용하였다.

Fab 생성 및 친화도 결정

친화도 측정을 위해 Fab 단백질을 발현하기 위해서, 정지 코돈을 파지 디스플레이 벡터 중의 g3과 중쇄 사이에 도입하였다. 클론을 이. 콜라이 34B8 세포 내로 형질전환시키고, 30℃ 하에 AP5 배지에서 성장시켰다 [참고: Presta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)]. 세포를 원심분리시켜 수거하고, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA pH 8에 현탁시킨 다음, 미세유동화기를 사용하여 타개하였다. Fab를 단백질 G 친화 크로마토그래피로 정제하였다. BIAcore™-2000을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 친화도를 측정하였다. vBR3-Fc 또는 hBR3ecd를 CM5 센서 칩 상의 10 mM 아세테이트 pH 4.5 [각각 220 또는 100 반응 단위 (RU)]에서 고정화시키고, PBST 중의 Fab 2배 희석물 (6.25 내지 100 nM)을 주사하였다. 각 샘플을 2분 연합 및 20분 해리를 이용하여 분석하였다. 각 주사 후, 10 mM 글리신 pH 1.5을 사용하여 칩을 재생시켰다. 블랭크 유동 세포로부터 상기 RU를 공제함으로써 결합 반응을 교정하였다. 역학 분석을 위해, k_on 및 k_off를 동시에 고정시킨 1:1 랑귀르 (Languir) 모델을 사용하였다.

(b) 결과 및 토의

2.1, 11 G9 및 9.1의 인간화 - 인간화를 위해 사용된 인간 수용자 프레임워크는 헤르셉틴 항체에 대해 사용된 프레임워크에 기초한 것이고, 이는 컨센서스 인간 카파 I VL 도메인과, 인간 아군 III 컨센서스 VH 도메인의 변이체로 이루어진다. 변이체 VH 도메인은 인간 컨센서스로부터의 3가지 변화물을 갖는다: R71A, N73T 및 L78A. 뮤린 2.1, 11G9 및 9.1의 VL 및 VH 도메인을 각각 인간 카파 I 및 아군 III 도메인과 정렬하고; 각 상보성 영역 (CDR)을 확인한 다음, 이를 인간 수용자 프레임워크 내로 이식하여, 파지 상에 Fab로서 디스플레이될 수 있는 CDR 이식편을 생성시켰다. 파지 디스플레이되는 2.1, 11G9 또는 9.1 CDR 이식편을 대상으로 하여, 고정화 vBR3-Fc에 대한 결합성을 시험하는 경우에, 낮은 결합 친화도가 관찰되었다.

CDR 수복 라이브러리를 각 항체에 대해 생성시켰는데, 여기서는 각 CDR 이식편의 CDR 영역을 연질 무작위화하였다. 각 CDR 이식편 라이브러리를 선별 4 회전 동안 고정화 vBR3-Fc에 대항하여 패닝화하였다. 9.1에 상응하는 CDR 이식편에 대해서만 증균이 관찰되었다. 클론을 DNA 서열 분석용으로 골라낸 결과, CDR-L2 및 CDR-H1에서 표적화된 서열 변화물이 밝혀졌다 (도 4). vBR3-Fc 파지 ELISA를 사용하여 클론을 스크리닝하고, 발현된 Fab 단백질을 사용하여 BIAcore함으로써 선별 클론을 추가로 분석하였다. 2개의 클론 9.1-70 및 9.1-73은 키메라 9.1 Fab와 비교해서 vBR3-Fc에 대한 결합성이 개선된 것으로 나타났다 (도 10).

결합성은 CDR 수복을 이용하여 2.1-이식편 및 1lG9-이식편에서 보충되지 않았기 때문에, 본 발명자들은 뮤린 프레임워크와 수용자 프레임워크 간의 차이점을 조사하였다. 흥미롭게도, 9.1 뿐만 아니라 2.1 및 11G9는 본 발명자들이 초기에 이용한 수용자 프레임워크 보다도 더 밀접하게, 위치 71 및 78 하의 인간 컨센서스 아군 III 서열과 유사하였다 (도 5). 이로 인해, 본 발명자들은 2개의 새로운 프레임워크 "RL" 및 "RF"를 사용하여 CDR 수복을 즉시 조사하였다. 이들 프레임워크는 컨센서스에 존재하는 R71이 복원되고 위치 78이 루이신으로서의 컨센서스로 변화되거나 (RL) 또는 페닐알라닌을 도입함으로써 상기 위치에서 뮤린 프레임워크와 유사하도록 변형 (RF)된다는 점에서 수용자 프레임워크와는 상이하다. 이들 프레임워크 변화로 인해, vBR3-Fc에 대한 2.1 및 11G9 파지 결합성이 적당한 수준으로 개선되었다. RL 또는 RF 프레임워크 상으로 이식된 9.1 CDR (9.1-RL 또는 9.1-RF)은 크게 개선되었다 (도 6).

각각의 항체/프레임워크 이식편에 대한 6개 CDR 각각에서 동시에 연질 무작위화 전략을 이용하여 전술된 바와 같이 CDR 수복 라이브러리를 생성시켰다: 2.1-RL, 2.1-RF, 11G9-RL, 11G9-RF, 9.1-RL 및 9.1-RF. 이들 선별물에 대해 용액 분류 방법을 사용하여, 친화도에 의거한 파지 선별 공정의 효능을 증강시켰다. 바이오티닐화 표적 농도를 조작하고, 보다 낮은 배경까지의 파지 포획 시간을 단축시키며 바이오티닐화되지 않은 표적을 부가하여 클론을 보다 신속한 이탈 속도로 제거함으로써, 고 친화도 클론을 능숙하게 선별하였다 [참고: Lee, C.V., et al. J. Mol. Biol. (2004) 340(5):1073-93]. 상기 방법에 기재된 바와 같이 b-vBR3-Fc를 독립적으로 활용하여 12개 라이브러리를 분류하였다.

선별 5 회전을 수행한 후, 각 라이브러리로부터의 개개 클론의 DNA 서열을 분석하였다. vBR3-Fc 파지 ELISA를 사용하여 클론을 스크리닝하고, 발현된 Fab 단백질을 사용하여 BIAcore 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 선별 클론을 추가로 분석하였다. 키메라 항체의 단량체성 친화도를 충족시키거나 이를 초과하는 BR3 결합 친화도를 지닌 몇 가지 클론을 확인하였다.

9.1-RL 및 9.1-RF 라이브러리에 대한 서열 변화를 CDR-H1에 다시 집약시켰는데, 이는 이러한 CDR을 재고안하는 것이 항원 결합성을 복원하는데 중요하다는 것을 제안하였다 (도 8). 특히, 돌연변이 M34I가 종종 각종 클론들 간에 포함되었다. CDR-H1에서 종종 발견되는 기타 변화로는 A3IG 및 T28P가 있지만, CDR-H1 전반에 걸친 기타 수 많은 치환도 널리 관용되는 것으로 여겨진다. 이러한 결과로부터, 인간 프레임워크 상으로 이식된 9.1의 친화성을 수복할 수 있는 여러 가지 서열 변화가 존재하고, 상기 항체를 프레임워크 변화에 의해 (예: 9.1-RF) 또는 CDR-수복에 의해 (예: 9.1-70 및 9.1-73) 인간화시켜 초기 뮤린 항체의 친화성을 초과하는 친화성을 생성시킬 수 있다는 것이 명백하다.

11G9 라이브러리의 경우에는, CDR 수복 라이브러리에 대한 주형으로서 11G9-RF를 사용하는 경우에만 증균이 관찰될 수 있었는데, 여기서는 서열 변화가 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3에서 관찰되었다 (도 8). 그러나, 2개의 가장 높은 친화도 클론은 각각, CDR-H3에 대한 유사한 변화를 나타냈고; 양 클론은 변화 D96N, G97D 및 WlOOL를 포함하였다. 이들 클론의 친화도는 단량체성 뮤린 11G9 친화도 보다 10배 이상 초과하였다.

2.1-RL 라이브러리와 2.1-RF 라이브러리 둘 다에 대해 증균이 관찰되었다 (도 7). 흥미롭게도, CDR-H3을 표적으로 하는 유사한 서열 변화가 양 라이브러리에서 관찰되었다. 실제로, 2 가지 경우에서 CDR-H3에 대한 변화는 라이브러리들 간에 동일하였다 (94-97_NSNF 및 95-97_TLP). 이는 라이브러리 고안으로 인해 도입된 잠재적 서열 다양성이 제공된다면 놀랄 만한 일이다. 양 라이브러리에서 관찰된 통상 부류의 서열은 T94N 및 H96N을 위치 95 및 97 하에서의 기타 변화와 함께 함유하였다 (예: 94-97_NSNF, 94-97_NLNY, 및 94-97_NANY). 이들 변이체는 vBR3-Fc 또는 hBR3ecd에 대한 가장 높은 친화도를 나타내는 경향이 있다. 실제로, 클론 2.1-30 (94-97_NLNY)에 대한 친화도는 단량체성 뮤린 2.1 친화도를 능가하였다.

인간화에 대한 변화 요약

6개의 뮤린 9.1 CDR [위치 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 94-102 (H3)로서 규정됨]를 인간 컨센서스 카파 I VL 및 아군 III VH 도메인 내로 이식하면서부터 출발하여, 상기 항체를 인간화시키는 2가지 경로를 확인하였다. 첫 번째 경로는 신규한 CDR-H1 서열과 CDR-L2 상의 2가지 변화를 선별하는 것 이외에 헤르셉틴 항체에 존재하는 3가지 프레임워크 변화 (R71A, N73T 및 L78A)를 활용하였다. 이로써, 키메라 9.1 Fab의 친화도 보다 거의 2배 정도 더 높은 친화도를 지닌 인간화 변이체 (9.1-70)가 유발되었다. 두 번째 경로는 프레임워크 상의 2가지 변화 (N73T 및 L78F) 부가와, CDR에 대해 변화를 전혀 나타내지 않는 것 (9.1-RF)을 활용하였는데, 이로써 키메라 9.1 Fab의 친화도 보다 거의 2배 정도 더 높은 친화도가 또한 야기되었다.

6개의 뮤린 11G9 CDR [위치 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 94-102 (H3)로서 규정됨]를 인간 컨센서스 카파 I VL 및 아군 III VH 도메인 내로 이식하면서부터 출발하여, 상기 프레임워크 상의 2가지 변화 (N73T 및 L78F)와 CDR-H3 상의 3가지 변화 (D96N, G97D 및 WlOOL)를 부가하면, 키메라 11G9 Fab 친화도와 비교해서 10배 이상 개선된 친화도를 지닌 완전한 인간 11G9 항체 (11G9-46)가 생성되었다.

6개의 뮤린 2.1 CDR [위치 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 26-35 (H1), 49-65 (H2) 및 94-102 (H3)로서 규정됨]를 인간 컨센서스 카파 I VL 및 아군 III VH 도메인 내로 이식하면서부터 출발하여, 상기 프레임워크 상의 단일 변화 (N73T)와 CDR-H3 상의 4가지 변화 (T94N, P95L, H96N 및 T97Y)를 부가하면, 키메라 2.1 Fab 친화도와 비교해서 개선된 친화도를 지닌 완전한 인간 2.1 항체 (2.1-30)가 생성되었다.

선별된 클론을 이용한 BIAcore 결합 검정 결과가 도 10에 도시되었다.

실시예 4 - 타고난 천연 파지 라이브러리로부터 유래된 항- BR3 항체

BR3과 결합하는 부가의 항체는, 다음에 기재되는 바와 같이 중쇄 상보성-결정 영역 (CDR) 내의 용매-노출된 위치에 합성 다양성을 도입함으로서 단일 인간 프레임워크 상에 형성된 파지-디스플레이된 합성 항체 라이브러리로부터 초기에 선별하였다.

(a) 라이브러리 구축을 위한 파지미드 벡터

Fab 주형이 M13 파지 입자의 표면 상에 각각 1가 또는 2가적으로 디스플레이하도록 파지미드 pV0350-2b 및 pV0350-4를 고안하였다.

이러한 Fab 주형은 h4D5 항체에 기초하는데, 이 항체는 Her-2로서 공지된 암-관련 항원 (erbB2)을 특이적으로 인식하는 인간화 항체이다. h4D5 서열은 humAb4D5 버젼 8 ("humAb4D5-8") 서열을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응함으로써 수득하였다 [참고: Carter et al., (1992) PNAS 89:4285-4289]. h4D5 핵산 서열은 인간 컨센서스 서열 Fab 프레임워크 중의 Her-2에 대해 특이적인 마우스 모노클로날 항체로부터의 변형된 CDR 영역을 코딩한다. 구체적으로 언급하면, 상기 서열은 VH 및 CH1 도메인 (HC 영역)의 상류에 있는 카파 경쇄 (LC 영역)를 함유하고 있다. 항-Her-2 항체의 제조 방법과, 가변 도메인 서열의 실체가 미국 특허 제5,821,337호 및 제6,054,297호에 제공된다.

phoA 프로모터의 제어 하에 인간 성장 호르몬 (hGH)의 파지 디스플레이를 위해 사용되었던 기존에 언급된 파지미드 (pHGHam-gIII)를 변형시킴으로써 벡터 pV0350-2b를 구축하였다. M13 소수 외피 단백질 P3의 C-말단 도메인 (cP3)과 융합된 hGH 및 stII 분비 신호 서열을 코딩하는 phGHam-gIII 내의 오픈 리딩 프레임을, 2개의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 DNA 단편으로 대체시켰다. 제1 오픈 리딩 프레임은 h4D5 경쇄 (버젼 8)을 코딩하였고, 제2 오픈 리딩 프레임은 cP3과 융합된 h4D5 중쇄의 제1 불변 (CH1) 도메인과 가변 (VH) 도메인을 코딩하였으며; 각 단백질은 N-말단 stII 신호 서열에 의해 분비하도록 지시되었다. 중쇄 단편과 cP3 사이의 앰버 정지 코돈을 결실시켰는데, 이는 이러한 변형이 파지 상에 디스플레이된 Fab의 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 에피토프 태그를 h4D5 경쇄의 C 말단에 부가하였다 (gD 태그). 2가 디스플레이용 벡터 (pV0350-4)는, 기재된 바와 같은 cP3과 중쇄 CH1 도메인 사이에 GCN4 루이신 지퍼를 코딩하는 DNA 단편을 삽입하는 것을 제외하고는 pV0350-2b와 동일하였다. 경쇄 유전자를 3가지 위치 하에 양 파지에서 추가로 변형시켜 천연 항체 서열의 카바트 데이터베이스에 가장 흔히 발견되는 아미노산을 코딩하였는데, 구체적으로 언급하면 Arg66을 Gly로 변화시키고, Asn30 및 His91를 Ser으로 변화시켰다. 이들 변화는 Fab 발현과 파지 상에서의 디스플레이를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 다음 문헌의 방법을 사용하여 부위-지시된 돌연변이 유발을 수행하였다 [참고: Kunkel, J. D., et al., (1987) Methods Enzymol 154:367-82].

(b) 라이브러리 구축

문헌 [참고: Lee, C.V., et al., (2004) J. Immunol. Methods 284:119-132; Lee, C.V., et al., (2004) JMB 340:1073-1093]에 기재된 바와 같이 pV0350-2b 또는 pV0350-4의 "정지 주형" 버젼과 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 파지-디스플레이된 라이브러리를 생성시켰다. 정지 코돈 (TAA)을 3가지 모든 중쇄 CDR에 포매시켰다. 이들은 CDR-H1, -H2 및 -H3을 코딩하는 서열 전반에 걸쳐 어닐링시키고 무작위화를 위해 선택된 위치에서의 코돈을 맞춤 변성 코돈으로 대체시킨 변성 올리고뉴클레오티드의 혼합물에 의해 돌연변이 유발 반응하는 동안 수복되었다. 돌연변이 유발 반응물을 이. 콜라이 SS320 세포 내로 진기천공시키고, 배양물을, KO7 헬퍼 파지, 50 g/ml의 카르베니실린 및 50 g/ml의 카나마이신을 보충시킨 2YT 육즙에서 30℃ 하에 밤새 성장시켰다. 문헌 [참고: Sidhu, S.S. et al., (2000), Methods Enzymol. 328:333-363]에 기재된 바와 같이 PEG/NaCl로 침전시킴으로써 배양 배지로부터 파지를 수거하였다. 각 전기천공 반응에서는 약 10¹¹개 이. 콜라이 세포 및 약 10 ㎍의 DNA를 사용하였으며, 이로써 lxl0⁹ 내지 5xl0⁹개 형질전환체가 생성되었다.

CDR-H1 및 CDR-H2의 천연 다양성을 모방하도록 고안한 변성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 별개의 라이브러리를 만들었다 (문헌 [Lee, CV, et al., (2004), JMB, 상기 참고]의 표 1): Fab.zip 주형을 수반한 라이브러리 3 (Lib-3). 문헌 [Lee, CV, et al., (2004), 상기 참고]에 기재된 Lib-3을 참고할 수 있다. CDR-H1 및 CDR-H2에 대한 2개 내지 4개의 올리고뉴클레오티드를 합하여 천연 다양성의 적용 범위를 증가시켰다. Lib-3은 CDR-H1 및 CDR-H2 각각에 대해 올리고뉴클레오티드 H1a 및 H1b (비 2:1) 및 H2a-c (비 1:2:0.1)를 사용하였다. 이들 올리고뉴클레오티드에 관한 설명은 문헌 [Lee, CV. et al. (2004), JMB, 상기 참고]의 표 1을 참고할 수 있다.

CDR-H3 내의 위치 95-100의 경우, Lib-3은 NNS 코돈 (또는 NNK 코돈)을 함유하거나 또는 코돈 삼중자의 각 위치에 동등하지 않은 뉴클레오티드 비를 함유한 NNS 코돈의 변형된 버젼 (XYZ 코돈)을 함유하는, 확장된 CDR-H3 길이를 지닌 라이브러리 세트로 이루어진다. 이러한 NNS 코돈은 32개 코돈을 포괄하고 20개 모든 아미노산을 코딩한다. X는 38％ G, 19％ A, 26％ T 및 17％ C를 함유하였고; Y는 31％ G, 34％ A, 17％ T 및 18％ C를 함유하였으며; Z는 24％ G 및 76％ C를 함유하였다. Lib-3에 대한 CDR-H3 고안이 문헌 [Lee, CV. et al., (2004), 상기 참고]의 표 5에 기재되었다. 별개의 돌연변이 유발 반응을 수행하고, 7개 및 8개 잔기 길이를 제외하고는 각 CDR-H3 길이에 대해 전기천공시켰는데, 단 이들 잔기는 함께 전기천공시켰다.

각 라이브러리 내의 완전한 Fab의 파지 디스플레이 수준은, 무작위로 골라낸 48개 클론의 항-gD 항체에 대한 결합성을 측정함으로써 조사하였다. Lib-3의 경우, 상이한 CDR-H3 길이에 대해 유사한 디스플레이 수준이 관찰되었는데, 단 가장 긴 CDR-H3s (15 내지 19개 잔기)가 혼입된 라이브러리는 클론을 디스플레이하는 Fab의 비율이 감소하였다 (15 내지 30％). 이는 극히 긴 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우에 돌연변이 유발 효능이 감소되는 것을 반영할 수 있다.

파지 분류

F(ab)'2 (CDR-H1/H2/H3 무작위화) 합성 파지 항체 라이브러리를 사용하여, 플레이트 상에서 BR3의 마우스 세포외 도메인 (mBR3-ECD), IgG1의 Fc 영역과 융합된 마우스 BR3 세포외 도메인 (mBR3-Fc), 인간 BR3 세포외 도메인 (hBR3-ECD), 및 IgG1의 Fc 영역과 융합된 인간 BR3 세포외 도메인 (vBR3-Fc)에 대항하여 분류시켰다. 96-웰 Nunc 맥시소르프 플레이트를, 피복 완충액 (0.05M 탄산나트륨 완충액, pH 9.6) 중에서 4℃ 하에 밤새 또는 실온 하에 2시간 동안 100 ㎕/웰의 표적 항원 (mBR3-ECD, mBR3-Fc, hBR3-ECD 및 vBR3-Fc) (5 ㎍/ml)으로 피복시켰다. 플레이트를 65 ㎕ 1％ 차단성 단백질로 30분 동안 차단시킨 다음, 40 ㎕ 1％ Tween 20으로 30분 더 차단시켰다 (차단성 단백질: 제1 회전 - 소 혈청 알부민 (BSA), 제2 회전 - 오브알부민, 제3 회전 - 우유, 제4 회전 - BSA). 이어서, 파지 라이브러리를 1％ BSA 및 0.1％ Tween 20으로 3 내지 5 O.D/ml가 되도록 희석시켰다 (1 O.D = 1.13 x 10¹³ 파지/ml). 일반적으로, 파지 유입량은 다음과 같다: 제1 회전 3 내지 5 O.D/ml, 제2 회전 3 O.D/ml, 제3 회전 0.5 내지 1 O.D/ml 및 제4 회전 0.1 내지 0.5 O.D/ml. 이와 같이 희석시킨 파지를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 및 0.05％ Tween 20으로 연속해서 5회 이상 세척하였다. 상기와 같이 차단시킨 파지 라이브러리를 100 ㎕/웰로 8개의 표적 항원-피복된 웰 및 2개의 피복되지 않은 웰에 1시간 동안 실온 하에 부가하였다. 플레이트를 PBS 및 0.05％ Tween 20으로 10회 이상 동안 연속해서 세척하였다. 파지를 실온에서 20분 동안 100 ㎕/웰의 100 mM HCl로 용출시켰다. 이와 같이 용출시킨 파지 (피복된 웰로부터) 및 배경 파지 (피복되지 않은 웰로부터)를 별개의 튜브에 수집하였다. 용출된 수집물은, 1/10 용적 1M 트리스 pH 11.0을 양 튜브에 부가함으로써 중화시켰다. BSA를 최종 0.1％로 상기 용출된 파지 튜브에 가하였다. 용출시킨 파지를 62℃에서 20분 동안 가열하였다. 파지를 역가 측정하기 위해, 90 ㎕의 log 상 XL-1 (OD 600nm~0.1-0.3)을 37℃에서 30분 동안 10 ㎕ 용출된 파지 또는 배경 파지로 감염시켰다. 이어서, 이와 같이 감염된 세포를 90 ㎕ 2YT를 사용하여 10배 증분으로 일련으로 희석시켰다. 10 ㎕ 분취액의 감염된 세포를 카르베니실린 플레이트에 도말하였다.

파지를 증식시키기 위해, 대략 400 ㎕의 용출된 파지를 사용하여 37℃ 하에 30 내지 45분 동안 대략 4 ml log 상 XL-lsoup (OD 600nm~0.1-0.3)을 감염시켰다. 헬퍼 파지 KO7, 및 카르베니실린을 1 x 10¹⁰ pfu/ml KO7 및 50 ㎍/ml 카르베니실린의 최종 농도로 37℃ 하에 1시간 더 상기 감염물에 부가하였다. 이 배양물을 카르베니실린 50 ㎍/ml 및 50 ㎍/ml 카나마이신을 수반한 2TY 배지에서 37℃ 하에 밤새 (또는 17시간 이상 동안) 최종 용적 20 내지 25 ml가 되도록 성장시켰다. 그 다음날, 상기 배양물을 30℃ 하에 2시간 더 성장시켜 파지 수량을 증가시켰다.

세포를 8000 rpm으로 10분 동안 스피닝 다운 (spinning down)시킴으로써 파지를 정제하였다. 상등액을 수집하였다. 20％ PEG/2.5M NaCl을 상등액 용적의 1/5로 가하고, 혼합한 다음, 얼음 상에 5분 동안 고정시켜 두었다. 파지를 12000 rpm으로 15분 동안 펠릿 내로 스펀 다운시켰다. 상등액을 수집하고 5000 rpm으로 5분 동안 다시 스펀하였다. 펠릿을 1 ml PBS에 재현탁시키고, 12000 rpm으로 15분 동안 스펀 다운시켜 부스러기를 제거하였다. PEG/NaCl 부가하면서 출발한 단계를 상기 재현탁된 펠릿 상에서 반복하였다. 재현탁된 파지 펠릿의 OD를 270 nm 하에 판독하였다. 상기 언급된 바와 같은 파지 분류 단계를 반복함으로써, 제2, 제3 및 제4 회전의 파지 분류를 완성하였다.

ELISA 스크리닝 검정

제3 및 제4 회전으로부터의 클론을 대상으로 하여 ELISA 검정함으로써 특이성과 친화도에 대해 스크리닝하였다. 양성 클론 (결합제)은 표적 항원 (mBR3-ECD 및 hBR3-ECD)에 대해서는 배경 이상의 결합성을 지니고 있지만, 차단성 단백질 (예: 소 혈청 알부민)에 대해서는 결합성을 지니고 있지 않은 클론이다.

첫째, 384-웰 미량역가 플레이트의 웰을 4℃ 하에 밤새 또는 실온 하에 2시간 동안 웰당 20 ㎕으로 mBR3-ECD, hBR3-ECD 및 항-gD로 피복시켰다 (피복 완충액 중의 1 ㎍/ml).

BSA	mBR3-ECD
항-gD	hBR3-ECD

또다른 96-웰 플레이트에서는, 제3 및 제4 회전으로부터의 집락을, 50 ㎍/ml 카르베니실린 및 헬퍼 파지 KO7을 수반한 150 ㎕ 2YT 배지에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 이 플레이트를 2500 rpm으로 20분 동안 스펀 다운시켰다. 50 ㎕의 상등액을 피복된 웰 플레이트 중에서 120 ㎕의 ELISA 완충액 (0.5％ BSA 및 0.05％ Tween 20을 수반한 PBS)에 가하였다. 30 ㎕의 혼합물을 384-웰 피복 플레이트의 각 4분원에 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS + 0.5％ BSA 및 0.05％ Tween 20 중에 75 ㎕/웰의 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-M13 항체를 실온 하에 30분 동안 부가함으로써 결합성을 정량화하였다 [Sidhu et al., 상기 참고]. 상기 웰을 PBS - 0.05％ Tween 20으로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 100 ㎕/웰의 1:1 비의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H₂O₂) [공급처: Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)]를 상기 웰에 가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. lOO ㎕ 1M 인산 (H₃PO₄)을 각 웰에 가함으로써 상기 반응을 중지시키고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰 중의 황색의 OD를 450 nm 하에서의 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. BSA에 대한 결합성 보다 3배 더 우수하게 mBR3-ECD와 hBR3-ECD 둘 다와 결합한 클론을 선별하였다 (도 11).

이와 같이 선별된 결합제를 서열 분석하였다. 15개의 독특한 클론이 밝혀졌다 (mBR3-ECD를 분류함으로써 1개 클론이 밝혀졌고, mBR3-Fc를 분류함으로써 6개 클론이 밝혀졌으며, hBR3-ECD를 분류함으로써 8개 클론이 밝혀졌고 hBR3-Fc를 분류함으로써는 클론이 전혀 밝혀지지 않았다) (도 12).

용액 결합성 경쟁 ELISA

선별된 F(ab)'2 파지에 대한 결합 친화성을 결정하기 위해, 경쟁 ELISAs를 수행하였다.

첫째, 파지를 증식하고 정제하였다. 37℃ 하에 30분 동안 특정 클론으로 감염시킨 10 ㎕의 XL-1 세균을 카르베니실린 플레이트 상에 도말하였다. 특정 집락을 골라 내고 이를 37℃ 하에 3 내지 4시간 동안 2 mls (2YT 및 50 ㎍/ml 카르베니실린)에서 성장시켰다. 헬퍼 파지 KO7을 10¹⁰ pfu/ml의 최종 농도로 상기 배양물에 37℃ 하에 1시간 더 가하였다. 20 ml의 배지 (50 ㎍/ml 카르베니실린 및 50 ㎍/ml 카나마이신을 수반한 2YT)를 상기 배양물에 가하여 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 파지를 상기 언급된 바와 같이 정제하였다.

두 번째, 다음 경쟁 ELISA 검정에 사용하기 위해 최적일 수 있는, 정제된 파지의 농도를 결정하였다 (즉, 피복된 플레이트 상의 최대 결합 능력의 대략 90％). 96-웰 Nunc 맥시소르프 플레이트를 피복 완충액 중에서 4℃ 하에 밤새 또는 실온 하에 2시간 동안 2 ㎍/ml mBR3-ECD 또는 mBR3-Fc로 피복시켰다. 65 ㎕ 1％ BSA을 30분 동안 부가한 다음 40 ㎕ 1％ Tween 20을 30분 더 부가함으로써 상기 웰을 차단시켰다. 이어서, 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 5회 세척시켰다. F(ab)'2 파지를 ELISA 완충액 (PBS - 0.5％ BSA 및 0.05％ Tween20) 중에서 0.1 O.D./ml가 되도록 희석시킨 다음, 실온에서 15분 동안 상기 웰에 가하였다. 이어서, 이 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 3회 이상 세척하였다. 웰당 75 ㎕의 HRP-접합된 항-M13 항체 (Amersham, ELISA 완충액을 이용한 1/5000 희석물)을 가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 다시 5회 이상 세척하였다. 이어서, 100 ㎕/웰의 1:1 비의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H₂O₂) [공급처: Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)]를 상기 웰에 가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰 중의 색상의 광 밀도를 450 nm 하에서의 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. 파지 희석물을 상기 O.D. 판독치에 대항하여 플롯하였다.

세 번째, 경쟁 ELISA를 수행하였다. 96-웰 Nunc 맥시소르프 플레이트를 피복 완충액 중에서 4℃ 하에 밤새 또는 실온 하에 2시간 동안 2 ㎍/ml mBR3-ECD 또는 mBR3-Fc로 피복시켰다. 65 ㎕ 1％ BSA을 30분 동안 부가한 다음 40 ㎕ 1％ Tween 20을 30분 더 부가함으로써 상기 웰을 차단시켰다. 이어서, 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 5회 세척시켰다. 상기 결합 검정에 근거하여, 피복된 플레이트에 대한 최대 결합의 약 90％를 달성시켜 주는 파지 희석물 50 ㎕을 ELISA 완충액 중에서 웰 중의 실온 하에 2시간 동안 50 ㎕의 각종 농도의 mBR3-ECD 또는 mBR3-Fc 또는 hBR3-ECD 또는 hBR3-Fc (0.1 내지 1000 nM)와 함께 인큐베이션하였다. 상기 웰 혼합물 75 ㎕를, mBR3-ECD 또는 mBR3-Fc로 예비-피복시킨 제2의 96-웰 플레이트에 전이시키고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션함으로써, 결합되지 않은 파지를 검정하였다. 제2 플레이트의 웰을 PBS - 0.5％ Tween20으로 3회 이상 세척하였다. 웰당 75 ㎕의 HRP-접합된 항-M13 항체 (ELISA 완충액을 이용한 1/5000 희석물)을 가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 다시 5회 이상 세척하였다. 이어서, 100 ㎕/웰의 1:1 비의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H₂O₂) [공급처: Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)]를 상기 웰에 가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. lOO ㎕ 1M 인산 (H₃PO₄)을 각 웰에 가함으로써 상기 반응을 중지시키고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰 중의 색상의 광 밀도를 450 nm 하에서의 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. 경쟁인자 mBR3-ECD 또는 mBR3-Fc 또는 hBR3-ECD 또는 hBR3-Fc의 농도를 O.D. 판독치에 대항하여 플롯하였다. F(ab)'2-파지를 50％ 억제시키는 mBR3-ECD 또는 mBR3-Fc 또는 hBR3-ECD 또는 hBR3-Fc의 농도인 IC50이 친화도를 나타낸다 (도 13). V3 클론은 마우스 BR3과 인간 BR3 둘 다에 대해 고 친화도로 결합한다.

mBAFF 차단성 ELISA

이들 독특한 클론이 리간드 (BAFF)와 유사한 결합성 에피토프를 지니고 있는지를 발견하기 위해, mBAFF 차단성 ELISA를 다음과 같이 수행하였다: 96-웰 Nunc 맥시소르프 플레이트를 피복 완충액 중에서 4℃ 하에 밤새 또는 실온 하에 2시간 동안 2 ㎍/ml mBR3-Fc로 피복시켰다. 65 ㎕ 1％ BSA을 30분 동안 부가한 다음 40 ㎕ 1％ Tween 20을 30분 더 부가함으로써 상기 웰을 차단시켰다. 이어서, 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 5회 세척시켰다. ELISA 완충액 중의 각종 농도의 mBAFF-Flag 단백질을 상기 웰에서 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 독특한 서열을 지닌 F(ab)'2 파지를, mBAFF-Flag 단백질의 부재 하에 정상적으로 90％ 결합 능력을 가져다 줄 수 있는 농도에서 10분 동안 상기 웰에 부가하였다. 이 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 5회 세척하였다.

PBS + 0.5％ BSA 및 0.05％ Tween 20 중에 75 ㎕/웰의 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-M13 항체를 실온 하에 30분 동안 부가함으로써 결합성을 정량화하였다 [Sidhu et al., 상기 참고]. 상기 웰을 PBS - 0.05％ Tween 20으로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 100 ㎕/웰의 1:1 비의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H₂O₂) [공급처: Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)]를 상기 웰에 가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. lOO ㎕ 1M 인산 (H₃PO₄)을 각 웰에 가함으로써 상기 반응을 중지시키고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰 중의 용액의 OD를 450 nm 하에서의 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. 그 결과가 도 13 및 도 14에 도시되었다.

또다른 1가 포맷의 BAFF 차단성 ELISA를 또한 수행하였다. mBR3-ECD 피복된 플레이트를 사용함으로써, ELISA 완충액 중의 각종 농도의 하이브리드 BAFF 단백질을 상기 웰에서 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 독특한 서열을 지닌 F(ab)'2 파지를, 하이브리드 BAFF 단백질의 부재 하에 정상적으로 90％ 결합 능력을 가져다 줄 수 있는 농도에서 10분 동안 상기 웰에 부가하였다. 다음 단계는 상기 언급된 바와 같다. 그 결과가 도 13에 도시되었다.

도 14는 클론 3 (V3)이 BAFF-BR3 결합을 용이하게 차단시킨다는 것을 보여준다. V3의 가변 영역 서열이 도 15에 제시되었다.

V3 주쇄의 F(ab)' ₂ 포맷을 Fab 포맷으로 변화시킴

V3은 BAFF에 의한 가장 우수한 차단 활성을 지니고 있고, 또한 mBR3과 hBR3 둘 다에 대한 교차-종 결합 활성을 지니고 있기 때문에, V3은 추가의 친화도 개선을 위한 항체 후보이다. 추가의 친화성 개선을 위한 1가 친화성을 보장하기 위해, F220 올리고 (5'- TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT-3') (서열 154)를 사용하여 쿤켈 돌연변이 유발함으로써 루이신 지퍼를 제거하였다. 또한, CDR-L3을 무작위화 도식 내로 혼입시키기 위해, CDR-L3에서 다양화될 것으로 의도한 위치에 정지 코돈 (TAA)을 혼입시킨다. F9 올리고 (5'-TAT TAC TGT CAG CAA CAT TAA TAA AGG CCT TAA CCT CCC ACG TTC GGA-3') (서열 155)를 사용하여 정지 코돈을 CDR-L3 영역에 부가하였다.

친화성 개선을 위해 V3 주쇄 상에 라이브러리를 구축함

친화성 개선을 위해 경질 및 연질 무작위화 계획을 사용하였다. 경질 무작위화는 제한된 위치가 20개 모든 아미노산에 대해 무작위화되었다는 것을 의미한다. 연질 무작위화는 특정 위치에서 무작위화가 50％ 모 아미노산과 50％ 19개 기타 아미노산 또는 정지 코돈을 보유하고 있다는 것을 의미한다. 쿤켈 돌연변이 유발에 의해 V3 주쇄에 근거하여 4개의 라이브러리를 구축하였다.

V0902-1 : CDR-L1 (F111+F202=1:1)/L2 (F201+F203=1:1)/L3 (F133a:133b:133c:133d=1:1:1:1)

V0902-2 : CDR-L3 연질 (F232)/H1 연질 (F226)/L2 (F201+F203=1:1)

V0902-3 : CDR-H3 연질 (F228+F229+F230+F231=1:1:0.5:0.5)/L3 연질 (F232)

V0902-4 : CDR-L3 연질 (F232)/H1 연질 (F226)/H2 연질 (F227)

파지의 발현

이. 콜라이 균주 SS320/KO7 (KO7 감염됨)를 전기 천공에 의해 상기 언급된 돌연변이 유발된 DNA로 형질전환시켰다. 형질전환된 세균성 세포를 30℃ 하에 20시간 동안 50 ㎍/ml 카르베니실린 및 50 ㎍/ml 카나마이신을 수반한 2YT 배지에서 성장시켰다. 파지를 문헌 [참고: Sidhu et al., Methods Enzymol. (2000), 328:333-363]에 기재된 바와 같이 수거하였다. 간략하게 언급하면, 파지를 먼저, 폴리에틸렌 글리콜을 수반한 밤새 배양 배지로부터 침전시킴으로써 정제하고, 이를 PBS에 재현탁시켰다. 268 nm 하에서 파지를 판독하는 분광광도계를 이용하여 파지를 정량화하였다 (1 OD=1.13 x 10¹³/ml).

V3에 비해 친화성 개선을 달성하기 위한 파지 분류 전략

친화성 개선 선별을 위해, 파지 라이브러리를 대상으로 하여 제1 회전 동안 플레이트 분류한 다음, 용액 분류를 3 회전 수행하였다. 플레이트 분류 제1 회전에서는, 4개의 라이브러리를 mBR3-ECD 및 hBR3-ECD 피복된 플레이트 (NUNC 맥시소르프 플레이트)에 대항하여 개별적으로 분류하였다. 파지 유입량은 1％ BSA 및 0.1％ Tween 20에서 대략 3 O.D/ml이었다. 다음 단계는 상기 파지 분류 섹션에서 기재된 바와 같다. mBR3-ECD 또는 hBR3-ECD에 대항하여 라이브러리 V0902-2, V0902-3 및 V902-4로부터의 용출 파지를 증식용으로 풀링하였다.

플레이트 분류 제1 회전 후, 용액 분류 3 회전을 수행하여 선별 엄격도를 증가시켰다.

A) mBR3-ECD 및 hBR3-ECD의 바이오티닐화

바이오티닐화하기 전에, 표적 단백질을 아민 무함유 완충액 (이상적으로는, 7.0 초과 pH)에 > 0.5 mg/ml 농도로 놓아두었다. 첫째, 아미콘 울트라 (Amicon Ultra) 5K 튜브를 사용함으로써, mBR3-ECD 및 hBR3-ECD를 함유하는 완충액을 PBS으로 교환하였다. 둘째, PBS 중의 NHS-바이오틴 시약의 신선한 원액 (100X)을 만들었다. 대략 3:1 몰 비의 NHS-바이오틴 시약 대 표적 단백질을 실온에서 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 0.1 M 트리스 pH 7.5을 가하여 반응되지 않은 NHS를 실온 하에 30분 동안 켄칭하였다.

B) 96-월 Nunc 맥시소르프 플레이트를 PBS 중에서 4℃ 하에 밤새 또는 실온 하에 2시간 동안 lOO ㎕/웰의 뉴트라비딘 (5 ㎍/ml)으로 피복시켰다. 이 플레이트를 65 ㎕ 슈퍼블록 (공급처: Pierce)으로 30분 동안 차단시킨 다음, 40 ㎕ 1％ Tween20으로 30분 더 차단시켰다.

C) 플레이트 분류 제1 회전으로부터 증식시킨 1 O.D./ml 파지를 실온 하에 1시간 이상 동안 슈퍼블록 0.5％ 및 0.1％ Tween20을 함유하는 150 내지 200 ㎕ 완충액 중에서 100 nM의 바이오티닐화 mBR3-ECD 또는 hBR3-ECD와 함께 인큐베이션하였다. 이 혼합물을 슈퍼블록 5％로 5 내지 lO X가 되도록 희석시킨 다음, 온화하게 진탕시키면서 실온 하에 5분 동안 100 ㎕/웰을 뉴트라비딘 피복된 웰에 적용하여, 바이오티닐화 표적이 파지와 결합할 수 있도록 하였다. 상기 웰을 PBS - 0.05％ Tween20으로 8회 세척하였다. 배경 결합성을 결정하기 위해, 바이오티닐화시키지 않은 표적을 수반한 파지를 함유하는 대조군 웰을 뉴트라비딘-피복된 웰 상에 포획하였다. 또다른 대조군 (뉴트라비딘 결합성 대조군)으로서, 바이오티닐화 표적을 파지와 혼합하고, 뉴트라비딘으로 피복하지 않은 웰에서 인큐베이션하였다. 결합된 파지를 0.1 N HCl로 20분 동안 용출시키고, 1/10 용적의 1 M 트리스 pH l1에 의해 중화시키고 역가시킨 다음, 다음 회전을 위해 증식시켰다. 이어서, 바이오티닐화 mBR3-ECD 또는 hBR3-ECD 농도를 25 nM 및 1 nM으로 감소시키면서 용액 분류를 2 회전 이상 수행하여 엄격도를 증가시켰다. 또한, 파지 유입량을 0.5 O.D/ml 및 0.1 O.D/ml로 감소시켜 배경 파지 결합성 아래가 되도록 하였다.

고 처리량 친화성 스크리닝 ELISA (단일 스폿 경쟁)

제3 및 제4 회전 스크린으로부터 집락을 골라내고, 이를 96-웰 플레이트 (공급처: Falcon)에서 50 ㎍/ml 카르베니실린 및 1e 10/ml KO7를 수반한 150 ㎕/웰의 2YT 배지에서 37℃ 하에 밤새 성장시켰다. 동일한 플레이트로부터, XL-1 감염된 V3 파지의 집락을 대조군으로서 골라 내었다.

96-웰 Nunc 맥시소르프 플레이트를 피복 완충액 중에서 4℃ 하에 밤새 또는 실온 하에 2시간 동안 100 ㎕/웰의 mBR3-ECD (2 ㎍/ml)로 피복시켰다. 플레이트를 65 ㎕의 1％ BSA으로 30분 동안 차단시킨 다음 40 ㎕의 1％ Tween 20으로 30분 더 차단시켰다.

파지 상등액을 총 용적 100 ㎕으로 100 nM mBR3-ECD 또는 hBR3-ECD를 수반하거나 수반하지 않은 ELISA 완충액 (PBS + 0.5％ BSA, 0.05％ Tween20) 중에서 1:10으로 희석시킨 다음, F 플레이트 (NUNC)에서 실온 (RT) 하에 1시간 이상 동안 인큐베이션하였다. 75 ㎕의 혼합물을 mBR3-ECD를 수반하거나 수반하지 않거나 또는 hBR3-ECD를 수반하면서 mBR3-ECD 피복된 플레이트에 차례로 전이시켰다. 상기 플레이트를 10 내지 15분 동안 온화하게 진탕시켜 결합되지 않은 파지가 mBR3-ECD 피복된 플레이트에 포획되도록 하였다. 이 플레이트를 PBS-0.05％ Tween 20으로 5회 이상 세척하였다. ELISA 완충액 중에 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-M13 항체 (1:5000)를 부가함으로써 결합성을 정량화하고, 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 이 플레이트를 PBS-0.05％ Tween 20으로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 100 ㎕/웰의 1:1 비의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 퍼옥시다제 기질 및 퍼옥시다제 용액 B (H₂O₂) [공급처: Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)]를 상기 웰에 가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. lOO ㎕ 1M 인산 (H₃PO₄)을 각 웰에 가함으로써 상기 반응을 중지시키고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰 중의 황색의 OD를 450 nm 하에서의 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. OD 감소율 (％)을 다음 방정식에 의해 계산하였다:

OD_450nm 감소율 (％) = (경쟁인자를 수반한 웰의 OD_450nm)/(경쟁인자를 수반하지 않은 웰의 OD_450nm) * 100

V3 파지 웰의 OD_450nm 감소율 (％) (100％)과 비교해서, mBR3-ECD 및 hBR3-ECD 둘 다에 대한 OD_450nm 감소율 (％)이 50％ 미만인 클론을 골라내었다. mBR3-ECD에 대항하여 분류된, 단지 V0902-2, 3, 4 풀링된 라이브러리로부터만 14개 클론을 골라내었다. mBR3-ECD에 대항하여 분류된 V0902-1 LC 경질 무작위화 라이브러리 또는 hBR3-ECD에 대항하여 분류된 양 라이브러리로부터 표적물이 전혀 발견되지 않았다. 이들 14개 클론을 서열 분석하였다. 마지막에는, 4개의 독특한 서열 (V3-1, V3-11, V3-12 및 V3-13)이 존재하였다. 4개의 독특한 서열 모두는 V3 클론과 동일한 CDR-L1 및 CDR-H2를 갖고 있었으며, 이는 4D5 라이브러리 주형과 동일하다. V3-1, V3-11 및 V3-12는 라이브러리 V0902-3으로부터 유래되는 반면, V3-13은 라이브러리 V0902-2로부터 유래되었다. 도 16A는 L2, L3, H1 및 H3 영역의 부분 서열을 도시한 것이다.

신규한 클론의 기능적 성상 확인

BAFF 차단성 ELISA를 V3-유래된 클론 상에서 수행하여, BAFF 차단 활성을 V3 클론과 비교해서 시험하였다. 4개 클론 모두는 하이브리드 BAFF에 대한 완전한 차단 활성을 나타내었다. 이는 4개 클론 모두가 BAFF와 유사한, BR3에 대한 결합성 에피토프를 갖고 있다는 것을 시사한다.

또한, 경쟁 ELISAs를 수행하여 mBR3-ECD, hBR3-ECD 및 미니-BR3에 대한 이들 파지 클론의 친화도를 결정하였다. 미니-BR3은 BAFF에 대한 완전한 친화성을 지닌 26개 잔기 펩티드 단편이다. 차단성 ELISA 및 파지 경쟁 ELISA의 결과가 도 16B에 요약되었다.

세균성 세포에서 발현하기 위한 Fab 구조물

바이러스성 cP3 서열을 제거하고, 이들을 5'- GCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATG-3' (서열 171)을 함유하는 종결인자 서열로 대체한 다음, gD 태그를 코딩하는 서열을 제거함으로써, V3, V3-1, V3-11, V3-12 및 V3-13 파지미드를 변형시켰다 (각각 pwO276-V3, pwO276-V3-l, pwO276-V3-l1 및 pw0276-V3-12). 모든 구조물을 이. 콜라이 34B8 세포 내로 형질전환시켰다. 단일 집락을 골라내고, 이를 30℃ 하에 22시간 이상 동안 25 ㎍/ml 카르베니실린을 수반한 완전한 CRAP 배지에서 성장시켰다. 발현된 단백질을, 단백질 G 고 트랩 칼럼 (공급처: Amersham Pharmacia)을 통하여 정제하였다.

BIAcore™-2000 상에서 BIAcore 측정 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 항-BR3 Fab의 친화도를 결정하였다. 대략 150 반응 단위 (RU)에서 CM5 칩 상에 고정화된 mBR3-ECD 및 hBR3-ECD. 3 nM에서 500 nM 까지 증가 농도의 Fab 샘플을 20 ㎕/min으로 주사하고, 블랭크 유동 세포로부터 RU를 공제함으로써 mBR3-ECD 또는 hBR3-ECD 상에서의 결합 반응을 교정하였다. 역학 분석을 위해, k_on 및 k_off를 동시에 고정시킨 1:1 랑귀르 모델을 사용하였다. 겉보기 kD 값이 다음 표 4에 보고되었다:

추가의 친화성 개선을 위해 V3-1을 사용하여 라이브러리를 구축함

연질 및 보다 연질 무작위화를 사용하여 추가로 친화성을 개선시켰다. 연질 무작위화는 특정 위치에서 50％가 모 아미노산을 보유하고 있고, 기타 50％가 19개 기타 아미노산 또는 정지 코돈을 보유하고 있다는 것을 의미한다. 보다 연질 무작위화는 특정 위치에서 75％가 모 아미노산을 보유하고 있고, 기타 25％가 19개 기타 아미노산 또는 정지 코돈을 보유하고 있다는 것을 의미한다. 쿤켈 돌연변이 유발에 의해 V3-1 주쇄에 근거하여 4개의 라이브러리를 구축하였다.

V3-1에 비해 친화성 개선을 달성하기 위한 파지 분류 전략

바이오티닐화 mBR3-ECD 및 hBR3-ECD 농도를 감소시킴으로써, 용액 분류 4 회전을 4개 라이브러리 (V1008-1, V1008-2, V1008-3 및 V1008-4)에서 수행하였다. 파지 유입량은 제1 회전에서는 3 O.D/ml이고 그 다음 3 회전 동안에는 각각 1, 0.5, 0.1였다. 라이브러리 V1008-1의 경우에는, 100 nM 바이오티닐화 표적을 제1 회전에 사용하였다. 이어서, 10 nM, 10 nM 및 2 nM 바이오티닐화 표적을 그 다음 3 회전 동안 사용하였다. 나머지 3개 라이브러리 (V1008-2, V1008-3 및 V1008-4)에 대해서는, 2O nM의 바이오티닐화 표적을 제1 회전에 사용하였다. 이어서, 1 nM, 1 nM 및 0.5 nM 바이오티닐화 표적을 그 다음 3 회전 동안 사용하였다. 사용된 분류 방법은 상기 언급된 바와 같았다. 엄격도를 증가시키기 위해, 제4 회전에서 바이오티닐화 표적과 파지 라이브러리를 37℃ 하에 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 1000배 과량의 바이오티닐화되지 않은 표적을 가하고, 혼합물을 실온 하에 30분 동안 인큐베이션한 후, 바이오티닐화 물질을, 고 이탈 속도 결합제를 경쟁 제거하는 뉴트라비딘 플레이트 상에 포획시켰다.

고 처리량 친화성 스크리닝 ELISA (단일 스폿 경쟁)

본 방법은 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. 10 nM mBR3-ECD 및 hBR3-ECD를 단일 스폿 경쟁에 사용하였다.

V3-1 파지 웰의 OD_450nm 감소율 (％) (80％)와 비교해서, mBR3-ECD 및 hBR3-ECD 둘 다에 대한 OD_450nm 감소율 (％)이 50％ 미만인 클론을 골라내었다. 12개 클론을 골라내고, 서열 분석한 다음 검정하였다 (도 17). 그 결과가 도 17에 요약되었다.

클론 41과 클론 46은 가장 우수한 2개의 V3-1 친화성 개선된 변이체였다. 클론 41이 보다 많은 아스파라긴 잔기 (N)를 갖고 있기 때문에, 클론 46이 추가의 성상 확인을 위해 선택되었다. 클론 46의 CDR-H1 영역에는 잠재적 당화 분위 (N-S-S/T)가 존재한다. 이러한 잠재적 당화 부위를 없애기 위해, 위치 31에서의 CDR-H1의 3가지 단일 돌연변이체 (N31A, N31S 및 N31Q)를 만들어, 이들을 대상으로 하여mBR3-ECD 및 hBR3-ECD에 대한 그들의 결합 활성을 시험하였다. 경쟁 ELISAs를 수행하여 mBR3-ECD 및 hBR3-ECD에 대한 그들의 친화도를 결정하였다. 그 결과가 다음에 제시되었다. 이들 3가지 변이체 중에서, N31S의 친화도가 V3-46 모 클론에 가장 근접하였다 (표 5).

V3-46의 N31S 돌연변이체는 V3-46s로 재명명되었다. V3-46s의 Fab를 상기 언급된 방법에 의해 만들었다. BIAcore™-2000 상에서 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 V3-46s Fab의 친화도를 결정하였다. 그 결과가 다음 표 (표 6 및 표 7)에 요약되었다. V3-1 Fab와 비교해서, mBR3-ECD에 대한 V3-46s Fab의 작동 속도가 개선되었다. 추가로, hBR3-ECD에 대한 V3-46s Fab의 작동 속도와 이탈 속도가 V3-1에 비해 상당히 개선되었다.

추가의 친화성 개선을 위해 V3-46s 주쇄 상에서 동족체 샷건 라이브러리를 구축함

추가의 친화성 개선을 위해, 동족체 샷건 라이브러리를 만들기 위한 주형으로서 V3-46s 파지미드를 사용하였다. TAA 코돈을 모든 3가지 경쇄 CDR 내에 도입함으로써 정지 주형을 구축하였다. 목적하는 위치에서 유사한 아미노산 및 야생형 만을 코딩하는 이명법 코돈을 사용하기 위한 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 고안하였다 [참고: JMB 2002: 320 (415-418)]. 쿤켈 돌연변이 유발 방법에 의해, 정지 코돈이 수복되고 돌연변이를 목적하는 부위에 도입하였다 [참고: Kunkel et al 1987].

다음에 기재되는 바와 같은 6개 모든 CDR 동족체 샷건 올리고를 혼합함으로써 라이브러리 1109-3을 만들었다. CDR-H1, H2 및 H3의 경우에는 천연 동족체 샷건 올리고 이외에도, 본 발명자들은 BR3에 대한 초기 결합 활성이 붕괴되지 않도록 하기 위해 기타 모든 위치를 돌연변이 유발시키는 올리고 (a 및 b)를 포함하기도 하였다.

.

야생형 잔기와 그의 동족체 잔기 모두를 코딩하기 위한 코돈 활용의 예시에 관해서는 문헌 [Vajdos, et al., (2002) J. Mol. Biol. 320:415-418]의 표 1을 참고한다.

V3 -46s를 친화성 선별하기 위한 파지 분류

바이오티닐화 mBR3-ECD 및 hBR3-ECD 농도를 감소시킴으로써, 용액 분류 3 회전을 V1109-3에서 수행하였다. 파지 유입량은 제1 회전에서는 2 O.D/ml이고 그 다음 2 회전 동안에는 각각 0.5, 0.1 O.D/ml였다. 1 nM 바이오티닐화 표적을 제1 회전에 사용하였다. 이어서, 0.2 및 0.1 nM 바이오티닐화 표적을 그 다음 2 회전 동안 사용하였다. 분류 방법은 상기 언급되었다. 엄격도를 증가시키기 위해, 제3 회전에서 바이오티닐화 표적을 파지 라이브러리와 함께 37℃ 하에 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 1000배 과량의 바이오티닐화되지 않은 표적을 가하고, 혼합물을 실온 하에 30분 동안 인큐베이션한 후, 고 이탈 속도 결합제를 경쟁 제거하기 위해 뉴트라비딘 플레이트 상에 포획시켰다.

고 처리량 친화성 스크리닝 ELISA (단일 스폿 경쟁)

1 nM mBR3-ECD 및 hBR3-ECD를 상기 언급된 바와 같이 단일 스폿 경쟁에 사용하였다. 시험 웰 중의 OD_450nm 감소율 (％)을 V3-46s 파지 웰 (95％)과 비교하였다. mBR3-ECD 및 hBR3-ECD 둘 다의 존재하에 OD_450nm 감소율 (％)이 50％인 클론을 골라내었다. 14개 클론을 골라내고, 서열 분석한 다음 검정하였다.

도 18은 WT V3-46s와 비교해서 mBR3-ECD 또는 hBR3-ECD에 대한 친화성 선별된 V3-46s 클론의 파지 IC50을 도시한 것이다. 14개 클론 모두는 V3-46s (WT) 보다 mBR3-ECD 및 hBR3-ECD에 대해 더 우수한 결합제인 것으로 여겨진다. 대부분의 클론은 V3-46s-12 (이는 그의 CDR-H1 상에 변화를 가짐으로써 WT와 상이한 클론이다)를 제외하고는 WT V3-46s와 동일한 CDR-HC 서열을 갖는다 (도 18 및 서열 193 참고). 모든 클론은 도 18에 나타낸 바와 같이 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 상의 변화를 지니고 있다. 대부분의 친화성 개선된 변이체는 V3-46s 모 클론과 비교해서 2배 내지 5배 친화성 개선되었다. mBR3-ECD 및 hBR3-ECD에 대한 V3-46s-42 결합성은 6 내지 8배 증가하여 pM 범위로 되었다.

친화성 개선된 클론의 단백질 친화도를 확증하기 위해, 상기 언급된 방법에 의해 V3-46s-9 및 V3-46s-42 Fab를 만들었다. BIAcore™-3000 상에서 표면 플라스몬 공명 검정을 사용하여 상기 Fab의 친화도를 결정하였다. 그 결과가 다음 표에 요약되었다. V3-46s Fab와 비교해서, mBR3-ECD 및 hBR3-ECD에 대한 V3-46s-42 Fab의 작동 속도가 개선되었다. Kds는 파지 IC50 값과 잘 일치하였다 (하기 참고)

실시예 5 - BJAB 세포 결합 검정

인간 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주인 BJAB 세포를, 10％ FBS, 페니실린 (100 U/ml, 공급처: Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), 스트렙토마이신 (100 ㎍/ml, 공급처: Gibco), 및 L-글루타민 (10 mM)을 보충시킨 RPMI 배지에서 배양하였다. 유동 세포계수법에 의해 수용체 발현을 분석한 결과, BJAB 세포가 고 수준의 BR3을 발현하고 검출 불가능한 수준의 BCMA 및 TACI를 발현하는 것으로 입증되었다. 결합 검정을 위해, 1％ 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 찬 검정 완충액 [인산염 완충 식염수 (PBS), pH 7.4]으로 세포를 세척하였다. 세포 밀도를 1.25 x 10⁶/ml로 조정하고, 200 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 환저 폴리프로필렌 플레이트 (NUNC, Neptune, NJ; 250,000개 세포/웰)의 웰 내로 등분하였다. 상기 세포를 함유하는 플레이트를 4℃ 하에 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리시키고, 상등액을 세포 펠릿으로부터 조심스럽게 흡인 제거하였다. V3-lm (또는 mV3-1) 및 V3-lh는 마우스 IgG2a 또는 인간 IgG1의 불변 영역과 각각 융합된 V3-1 항체의 가변 영역을 지칭한다. 용어 키메라 11G9, 키메라 2.1 또는 키메라 9.1은 인간 IgG1의 불변 영역에 대한 11G9, 2.1 또는 9.1 각각의 가변 영역의 융합물을 지칭한다. 이들 실험의 경우, 전장 항체 (IgG)를 사용하였다.

직접 및 경쟁적 결합 검정을 다음과 같이 수행하였다. 직접 결합 검정의 경우에는, IgG 항체 샘플을 찬 검정 완충액 중에서 일련으로 희석시켜 300 내지 0.02 nM 범위의 농도가 되도록 하였다. 샘플 (100 ㎕)을 펠릿화 세포에 가하고, 플레이트를 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 부가의 100 ㎕ 검정 완충액을 각 웰에 가하고, 플레이트를 4℃ 하에 5분 동안 1200 rpm으로 원심분리시켰다. 상등액을 조심스럽게 흡인시킨 후, 세포를 200 ㎕ 검정 완충액으로 2회 더 세척하였다. 항-마우스 IgG Fc-HRP 또는 염소 항-인간 IgG Fc-HRP를 경우에 따라, 찬 검정 완충액 중에서 1/10,000로 희석시키고, 부가한 다음 (100 ㎕/well, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), 플레이트를 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 200 ㎕ 찬 검정 완충액으로 2회 세척한 후, 테트라메틸 벤지딘 (TMB, 공급처: Kirkegaard ＆ Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)를 가하고, 색상을 10분 동안 전개하였다. 100 마이크로리터 1 M H₃PO₄를 가하여 반응을 중지시켰다. 이어서, 620 nm 기준을 이용하여 450 nm 하의 미세플레이트 판독기 상에서 상기 플레이트를 판독하였다. 직접 결합 검정에서는, 표시된 농도의 mAb를 BJAB 세포에 가하고, 결합된 mAb를 검출하였다.

경쟁적 결합 검정에서는, 항-BR3 mAb가 세포 표면 BR3과의 결합을 놓고 바이오티닐화 BAFF와 경쟁한다. 제넨테크 (Genentech)에서 발현되고 정제된 인간 BAFF를 기존에 보고된 바와 같이 NHS-X-바이오틴 (공급처: Research Organics, Cleveland, OH)으로 바이오티닐화하였다 [참고: Rodriguez, C.F., et al., (1998) J. Immunol. Methods 219:45-55]. 항-BR3 항체를 일련으로 희석시키고, 이를 등 용적의 바이오틴-BAFF와 합하여 333 내지 0.15 nM mAb 및 10 ng/ml 바이오틴-BAFF의 최종 농도를 수득하였다. 이와 같이 희석시킨 샘플을 상기 언급된 바와 같이 96-웰 플레이트 중의 펠릿화 BJAB 세포에 가하였다. 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 200 ㎕ 찬 검정 완충액으로 2회 세척하고, 검정 완충액 중에서 1/5,000으로 희석시킨 스트렙타비딘-HRP (AMDEX, 공급처: Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 가하였다 (100 ㎕/웰). 상기 플레이트를 얼음 상에서 마지막 45분 동안 인큐베이션하였다. 찬 검정 완충액으로 2회 세척한 후, TMB를 사용하여 색상을 전개하고, H₃PO₄를 사용하여 반응을 중지시킨 다음, 상기 언급된 바와 같이 플레이트를 판독하였다.

도 19는 항체가 BJAB 세포 상에서 BR3과 결합한다는 것을 도시한 것이다. 도 20은 V3-lm이 BJABs와 직접 결합할 뿐만 아니라 (패널 B) BJAB 세포 상에 발현된 인간 BR3에 대한 BAFF 결합을 경쟁적으로 전위시킬 수 있긴 하지만 (패널 A), B9C11은 어느 한 검정 포맷에서도 인간 BR3과 결합할 수 있는 능력을 전혀 나타내지 않았다 (각각 패널 A 및 B). 이와는 달리 V3-lm과 B9C11 둘 다는 BHK 세포 상에 발현된 뮤린 BR3에 대한 BAFF 결합을 완전히 차단시켰고 (패널 C), 상기 세포와 직접적으로 결합할 수 있었다 (패널 D). V3-lm (마우스 IgG) 및 B9C11 (햄스터 IgG)를 이용한 직접 결합 검정에 대해서는 상이한 검출용 항체가 요구되었다.

BJAB 결합 검정 결과를 근거로 하여, 항체를 차단성 또는 비-차단성으로 분류할 수 있었다. 경쟁적 검정에서는, 4개의 mAb (11G9, 2.1, 9.1, 및 V3-1)이 바이오틴-BAFF의 결합을 완전히 차단시킨 반면, 기타 3가지 (1E9, 7B2, 및 8G4)는 부분적으로 억제시켰다 (도 19 및 20, 표 8). MAb 1Al1, 8E4, 10E2, 12B12 및 3.1은 비-차단성인 것으로 밝혀졌다 (도 19). 이들 비-차단성 항체 중에서, 1Al1 및 8E4가 직접 결합 검정에서 BJABs와 비교적 불량하게 결합된 반면, 10E12 및 12B12의 결합성은 기타 mAb 보다 다소 높은 최대 신호를 제공하였다. 마우스 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b 이소형 대조군은 BJABs에 대한 검출할 만한 수준의 결합을 전혀 나타내지 않았고, HRP-접합된 항-마우스 IgG Fc 검출 항체는 이들 이소형과 동등하게 결합하는 것으로 나타났다. MAb V3-lm 및 B9C11을 BJAB 및 BHK 결합 검정 둘 다에서 평가하였다 (도 20). 이들 차단성 항체 둘 다가 뮤린 BR3과 결합하긴 하지만, 단지 V3-lm 만이 인간 BR3과 결합하였다. V3-lh를 이용한 결과는 V3-lm에 대해 관찰된 바와 유사하였다.

실시예 6 - 에피토프 지도화 ELISAS

에피토프 지도화 연구를 ELISAs에 의해 수행하였는데, 여기서는 표지되지 않은 mAb의 희석 곡선이 vhBR3-Fc와의 결합을 놓고 바이오티닐화 2.1, 9.1, 11G9, 또는 1E9와 경쟁하였다 (도 21). 완전한 차단성 mAb (11G9, 2.1, 및 9.1)에 대한 결과는 11G9 결합을 위한 에피토프가 mAb 2.1 및 9.1에 대한 에피토프 사이에 공간적으로 위치하였다는 것을 제안하였는데, 단 2.1과 9.1 둘 다는 바이오티닐화 11G9의 결합을 효과적으로 전위시켰지만 서로 전위시킬 수 있는 한계 능력 만을 나타내었다. 3개의 mAb (1E9, 7B2, 및 8G4)가 경쟁적 BJAB 결합 검정에서 부분 차단제로서 성상 확인되었다. 에피토프 지도화 ELISA에서는, 이들 mAb가 중추 BAFF 차단 부위와 보다 말초적으로 결합하는 것으로 여겨졌는데, 단 이들은 11G9, 2.1, 및 9.1의 결합을 부분적으로만 억제시켰다. 최종적으로, 비-차단성 mAb인 12B12는 차단성 항체 영역으로부터 추가로 멀리 떨어진 채로 결합하는 것으로 여겨졌는데, 단 이는 부분 차단제인 1E9에 의해서만 전위될 수 있었다.

지도화 연구를 또한 수행하여, 마우스 BR3에 대한 V3-lm, B9C11, 및 P1B8의 결합성을 평가하였다. 그 결과, 2개의 차단성 mAb (V3-lm 및 B9C11)는 마우스 BR3과의 결합을 놓고 교차-경쟁할 수 있었지만, 비-차단성 mAb P1B8는 별개의 에피토프와 결합하는 것으로 입증되었다 (도 22).

다음 표는 경쟁적 BJAB 세포 결합 검정 결과를 요약한 것이다 (표 8). 수 개월에 걸쳐 수행한 검정 결과를 편집하였다. 평균 IC50은 표시된 실험 횟수 "n"으로부터 계산하였다.

n/a = 억제가 전혀 검출되지 않았거나 또는 IC50을 계산하는 것이 가능하지 않았다.

+/- = 항체는 바이오티닐화 BAFF 결합성을 부분적으로 억제하였다.

다음 표는 직접 BJAB 세포 결합 검정 결과를 요약한 것이다 (표 9). 수 개월에 걸쳐 수행한 검정 결과를 편집하였다. 대부분의 항체는 인지할 만한 수준의 용량-의존성 신호를 제공하였지만, 3개의 mAb는 단지 부분적 결합 만을 산출하였고, 2개의 mAb는 재생 가능한 방법으로, 다른 것들 보다 더 높은 최대 신호를 제공하였다. 평균 EC50은 표시된 실험 횟수 "n"으로부터 계산하였다.

n/a = 결합이 전혀 검출되지 않았거나 또는 EC50을 계산하는 것이 가능하지 않았다.

+/- = 부분 결합성.

인간화 항-BR3 항체 (IgG)는 또한 BJAB 세포 상의 BR3에 대한 BAFF 결합을 차단시켰고, BJAB 세포 상의 BR3과 결합하였다 (하기 표 10 참고).

*"h"는 인간화를 나타내고; "ch"는 키메라를 나타낸다.

실시예 7 - B 세포 증식에 대한 항-BR3 항체의 길항성 및 작동성 효과

(a) 2.1, 9.1 및 11G9는 인간 B 세포 증식을 억제한다

CD19 MACS 비드 (공급처: Miltenyi Biotec)를 사용하여 양성 선별함으로써, B 세포를 말초혈 단핵 세포로부터 단리하였다. 증식 검정의 경우, B 세포는 평저 96-웰 플레이트에서 세 번 되풀이하여 2 x 10⁵c/웰로 설정된 세포였다. 세포를 항-IgM (10 mg/ml) (공급처: Jackson Immunoresearch), mBAFF (5 ㎍/ml) 및 표시된 항-BR3 항체 또는 단백질과 함께 5일 동안 배양하였다. 사용된 항체는 hIgG1 배경 내의 키메라 항체였고, 이를 조직 배양액으로부터 정제하였다. 이어서, 세포를 배양 마지막 6시간 동안 1 mCi/웰 삼중 수소 처리된 티미딘으로 펄싱하고, 필터 상으로 수거한 다음 계수하였다. 그 결과가 도 23에 도시되었다.

(b) V3-1은 뮤린 B 세포 증식을 억제한다

비장 B 세포를 제조업자의 지시에 따라서 B 세포 단리용 키트 (공급처: Miltenyi)를 사용하여, 생후 2 내지 4개월의 항-HEL BCR 트랜스제닉 마우스 또는 C57BL/6 마우스로부터 제조하였다. 본 발명자들은 순도가 95％ 초과인 B 세포를 일관되게 획득하였다. 이러한 B 세포를, 10％ 열-불활성화 FCS, 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 5 X 10^-2 μM 베타-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.

정제된 B 세포 (최종 용적 200 ㎕ 하의 10⁵개 B 세포)를 각종 농도의 항-BR3 mAb의 부재 또는 존재하에 BAFF (2 ng/ml 또는 lO ng/ml)을 수반하거나 수반하지 않으면서, 항-마우스 IgM Ab 5 ㎍/ml (IgG, F(ab')2 단편) (공급처: Jackson ImmunoResearch Laboratories) 또는 달걀 라이소자임 (공급처: Sigma)과 함께 배양하였다. 48시간 동안의 자극 마지막 8시간 동안 ³H-티미딘 흡수량 (l μCi/웰)에 의해 증식을 측정하였다. 몇몇 실험에서는, PCR 기계를 사용하여 항-BR3 mAb 뿐만 아니라 BR3-Fc 융합 단백질을 5분 동안 예비-비등시켜 그들을 불활성화시켰다 (대조군).

도 24는 BR3-Fc와 마찬가지로, B9C11과 V3-lm 둘 다는 항-IgM 매개된 일차 뮤린 B 세포 증식 동안 BAFF 공자극 활성을 억제할 수 있다는 것을 도시하고 있다. B9C11이나 V3-lm 어떤 것도 각종 용량의 항-IgM 항체의 부재 또는 존재하에서 B 세포 증식에 대한 직접적인 효과를 전혀 나타내지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). V3-lm 및 B9C11 (비등시키지 않은 V3-lm 또는 B9C11)을 사용하여 항-HEL BCR 트랜스제닉 마우스로부터의 B 세포의 증식을 억제하는 것이 또한 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 양 항체는 이들이 스스로 정상적인 뮤린 B 세포 증식을 촉발시키지 않는 다는 점에서 작동성이 아니다.

(b) 기타 항체

제조업자의 프로토콜 (공급처: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)에 따라서 CD19 MACS 자기 비드를 사용하여 양성 선별함으로써, 인간 B 세포를 말초혈 단핵 세포로부터 단리하였다. 세포를 단리 직후에 사용하거나 또는 나중 사용을 위해 액체 질소에 동결시켰는데; 신선한 세포와 동결된 세포가 본 검정에 동등하게 수행되었다. B 세포를 청정한 평저 웰을 수반한 블랙 96-웰 플레이트 (공급처: PE Biosystems, Foster City, CA)에서 1 x 10⁵개 세포/웰로 배양하였다.

항-BR3 항체의 길항성 효과를 평가하기 위해, 세포를 100 nM 내지 1.3 pM (15 ㎍/ml - 1 ng/ml) 범위의 각종 농도의 항-BR3 항체의 존재 및 부재 하에, 가용성 재조합 BAFF (10 ng/ml) 및 F(ab')2 염소 항-인간 IgM (Fc 특이적) 항체 (4 ㎍/ml) (공급처: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)와 함께 인큐베이션하였다. 셀티터 글로 (Celltiter Glo) (공급처: Promega, Madison, WI; 재조업자의 지시에 따라서 재구성됨)를 각 검정 웰에 부가함으로써 6일 째에 B 세포 증식을 평가하였다. 이어서, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 조도계에서 판독하였다.

항-BR3 항체 (100 nM 내지 1.3 pM)를 항-IgM 항체 단독 (4 ㎍/ml)의 존재하에 또는 항-IgM + '가교 결합성' F(ab')2 염소 항-인간 IgG Fc 항체 (공급처: Pierce, Rockford, IL, 30 ㎍/ml)의 존재 및 BAFF의 부재 하에 인큐베이션함으로써, B 세포 증식을 자극할 수 있는 항-BR3 항체 작동성에 대한 잠재력을 평가하였다. 셀티터 글로를 상기 언급된 바와 같이 사용하여 6일 째에 증식을 평가하였다.

도 25는 9.1-RF가 BAFF-의존성 B 세포 증식을 차단시키고, 이를 작동시키지는 않는 다는 것을 보여준다. 도 26은 2.1-46이 항-IgM의 존재하에 B 세포 증식을 자극한다는 것을 보여주는데, 이는 이것이 작동제로서 작용한다는 것을 나타낸다.

실시예 8 - BIAcore 를 이용한 친화성 측정

재료 및 방법

실온에서 파마시아 (Pharmacia) BIAcore^® 3000 (공급처: BIAcore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 실시간 이중-특이적 상호 작용을 측정하였다 [참고: Karlsson, R., et al. (1994) Methods 6:97-108; Morton, T.A. and Myszka, D.G. (1998) Methods in Enzymology 295: 268-294]. 인간 BR3 ECD 또는 vBR3-Fc를 1급 아민기를 통하여 센서 칩 (CM5)에 고정화시켰다. 0.025 M N-히드록시석신이미드와 0.1 M N-에틸-N'(디메틸아미노프로필) 카보디이미드의 혼합물 200 ㎕를 분당 5 ㎕로 주사함으로써, 카복시메틸화 센서 칩 표면 매트릭스를 활성화시켰다. 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.5 중의 5 ㎍/ml 용액의 BR3 ECD 또는 vBR3-Fc 5 내지 10 ㎕를 분당 5 ㎕로 주사하였다. 커플링 후, 20 ㎕의 1 M 에탄올아민, pH 8.5를 주사함으로써 칩 상의 점유되지 않은 부위를 차단시켰다. 수행 완충액은 0.05％ 폴리솔베이트 20을 함유하는 PBS였다. 역학적 측정을 위해, 수행 완충액 중의 항-BR3 항체의 2배 일련의 희석액 (6.2 내지 100 nM 또는 12.5 내지 200 nM)을 30 ㎕/min의 유속으로 2분 동안 유동 세포 상으로 주사하고, 결합된 항-BR3 항체를 20분 동안 해리시켰다. 20 내지 30 ㎕의 10 mM 글리신·HCl (pH 1.5)를 주사함으로써 결합성 표면을 재생시켰다. 활성화시키긴 하였지만 BR3 ECD 또는 BR3-Fc 고정화되지 않은 유동 세포 1을 기준 세포로서 사용하였다. 유동 세포 1에 대한 항-BR3 항체의 유의적 비-특이적 결합은 전혀 없었다. 포괄적인 고정 (피팅)을 사용하여 1:1 결합 모델을 이용하여 데이터를 분석하였다. 연합 및 해리 속도 상수를 동시에 고정시켰다 (BIA평가 소프트웨어). 샘플을, 시험된 선별된 항체에 대해 증가하는 농도 순으로 수행하든지 아니면 감소하는 농도 순으로 수행하든지 간에 유사한 결과를 획득하였다.

BR3 ECD 또는 BR3-Fc에 대한 항-BR3 항체의 결합 역학은 BIAcore에 의해 측정하였다. BR3 ECD 또는 vBR3-Fc를 센서 칩 상에 고정화시키고, 일련의 항체 희석액을 유동 세포 상으로 주사하였다 (표 11 및 12). 또다른 한편으론, 항-BR3 항체를 센서 칩 상에 고정화시키고, 일련의 BR3 ECD 희석액을 유동 세포 상으로 주사하였다 (표 13). 덩어리 수송 효과를 최소화하기 위해 고 유속을 사용하였다. 인간화 Fab 및 인간화 IgG 항체의 결과를 나란히 비교하였다. 용액 중의 IgG를 사용하여 수득한 겉보기 결합 친화도는 용액 중의 Fab를 사용하여 수득한 것 보다 더 높았는데, 이는 IgG가 2가이기 때문에 결합 활성도 효과에 기인한 것으로 예상된다. 9.1, 2.1, 11G9 및 V3-1 항체 시리즈로부터의 항-BR3 항체의 겉보기 역학 파라미터가 표 11 내지 13에 제시되었다.

A. 칩 상의 BR3 ECD

칩 상의 BR3 - Fc

B. 칩 상의 항체 (용액 중의 ECD )

실시예 9 - 기능적 에피토프 지도화

다음 검정은 항-BR3 항체 결합에 있어 중요한 BR3 상의 에피토프를 기능적으로 지도화하기 위해 사용하였다.

미니BR3 샷건 스캐닝을 위한 라이브러리 구축. 기존에 보고된 바와 같이 [참고: Weiss, G.A., et al., (2000) Proc Nail Acad Sci USA 97:8950-4; Gordon, N. et al, (2003) Biochemistry 42:5977-83] 파지미드 pW1205a를 연속적으로 돌연변이 유발시킴으로써, M13 박테리오파지 상에 에피토프-태그화 미니BR3을 디스플레이하는 라이브러리를 구축하였다. 이러한 파지미드는 인간 성장 호르몬의 N-말단과 융합된 펩티드 에피토프 태그 (MADPNRFRGKDLGG)에 이어 M13 유전자-8 주요 외피 단백질을 코딩한다. pW1205a를 쿤켈 돌연변이 유발용 주형으로서 사용하여 [참고: Kunkel, J. D., et al., (1987) Methods Enzymol 154:367-82] 미니BR3 샷건 라이브러리 구축을 위한 적당한 주형을 생성시켰다. 올리고뉴클레오티드는 인간 성장 호르몬을 코딩하는 pW1205a의 단편을, 돌연변이시키고자 하는 영역의 위치에 TAA 정지 코돈을 함유하는 미니BR3의 부분 서열을 코딩하는 DNA 단편으로 대체시켰다. 생성된 2개의 새로운 주형인 주형 1 (잔기 34-42를 코딩함) 및 주형 2 (잔기 17-25를 코딩함)를 각각 사용하여 기존에 보고된 바와 같이 미니BR3 라이브러리를 구축하였다 [참고: Sidhu, H. et al., Methods Enzymol 328:333-63]. 돌연변이를 목적 부위에 동시에 도입하면서, 주형 정지 코돈을 미니BR3의 상보성 영역으로 대체시키도록 고안된 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 쿤켈 돌연변이 유발용 주형으로서, 각 "부분 미니BR3" 주형을 사용하였다. 돌연변이 부위에서, 야생형 코돈을 상응하는 샷건 알라닌 코돈으로 대체시켰다 [Weiss, 상기 참고]. 이들 2개의 라이브러리 각각은 라이브러리들 간에 공통의 돌연변이된 위치를 전혀 갖지 않는 미니BR3 내의 11 잔기에서 돌연변이를 허용하였다. 라이브러리 1은 위치 17, 18, 20-23, 25, 27, 28, 30, 및 33에서의 샷건 코돈을 코딩하는 반면, 라이브러리 2는 위치 26, 29, 31, 34, 및 36-42에서의 샷건 코돈을 코딩하였다. 각 라이브러리는 2 x 10⁹개 구성원을 함유하였는데, 이로써 이론적 다양성 (>10⁴배 과량)의 완전한 표시를 허용하였다.

라이브러리 분류 및 분석. 상기 언급된 2개의 라이브러리 각각으로부터의 파지를 대상으로 하여, 96-웰 Nunc 맥시소르프 이뮤노플레이트 상에 고정화된 항-태그 항체 (3C8:2F4, 공급처: Genentech, Inc.) (디스플레이 선별) 또는 중화 항체 9.1, 2.1, 8G4, 11G9 (기능적 선별) 및 V3-1에 대항한 결합 선별 수 회전을 수행하였다. 디스플레이 선별은 항-BR3 항체-결합성 선별을 라이브러리 구성원들 간의 발현 차이에 대해 표준화시키기 위해 포함되었다. 각 표적으로부터 용출된 파지를 이. 콜라이 XL1-블루에서 증식시키고; 증폭된 파지를 앞서의 회전에서와 동일한 표적에 대항하여 선별하기 위해 사용하였다. 선별 2 회전 후, 각 라이브러리 및 선별로부터의 48개 개개의 클론을, 카르베니실린 및 KO7 헬퍼 파지를 보충시킨 400 L의 2YT 배지에서 96-웰 포맷으로 성장시켰다. 이들 배양액으로부터의 상등액을 파지 ELISAs에 직접 사용하여, 결합을 확인하기 위해 이들을 선별시킬 수 있는 항체 표적과 결합할 수 있는 미니BR3 의 파지-디스플레이된 변이체를 검출하였다.

파지 ELISA를 일반적으로 다음과 같이 수행할 수 있다. 맥시소르프 이뮤노플레이트 (96-웰)를 실온 하에 2시간 동안 포획 표적 단백질 (항-BR3 항체)로 피복시켰다 [50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중에서 5 ㎍/ml 하의 100 ㎕]. 이어서, 상기 플레이트를 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 0.2％ BSA로 1시간 동안 차단시키고, PBS, 0.05％ Tween 20으로 8회 세척하였다. 파지 입자를 BSA 차단성 용액 내로 일련으로 희석시키고, 100 ㎕를 피복된 웰에 옮겼다. 1시간 후, 플레이트를 PBS, 0.05％ Tween 20으로 8회 세척하고, BSA 차단성 완충액 중의 100 ㎕의 1:3000 서양고추냉이 퍼옥시다제/항-M13 항체 접합체와 함께 30분 동안 인큐베이션한 다음, PBS, 0.05％ Tween 20으로 8회 세척하고 PBS로 2회 세척하였다. o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드/H₂O₂ 용액 (100 ㎕)을 사용하여 플레이트를 전개시키고, 2.5 M H₂SO₄ (50 ㎕)을 사용하여 중지시킨 다음, 492 nm 하에 흡광도를 측정하였다.

시험된 모든 클론은 그들 각각의 ELISAs에서 양성인 것으로 밝혀졌으며, 이때 이들을 기존에 보고된 바와 같이 서열 분석하였다 [Weiss, 상기 참고]. 허용 가능한 질의 서열을 해독하고 정렬하였다.

BAFF 결합성 및 디스플레이 선별에 대한 데이터는 기존에 측정하였다 [Gordon, 상기 참고]. 항-BR3 결합성 및 디스플레이 선별에 대한 데이터를 유사하게 계산하였다. 일반적으로, 항-BR3 항체 또는 항-태그 항체와의 결합을 대한 선별 2 회전을 수행한 후 서열 분석된 클론 주변에서 발견된 야생형 잔기 (wt) 및 각 ala 돌연변이물 (mut)의 발생률 (occurrence)을 표로 만들었다. 야생형 잔기의 발생률을 돌연변이체의 발생률로 나누어, 각 위치에서 각 돌연변이에 대한 wt/mut 비를 결정하였다 (제시되지 않음).

F-값을 기존에 보고된 바와 같이 계산하였다 [Weiss, 상기 참고; Gordon, 상기 참고]. 일반적으로, 표준화시킨 빈도 비 (F)를 계산하여, 디스플레이 효능을 고려하면서 BAFF 또는 항-BR3 항체-결합성에 대한 각 BR3 돌연변이의 효과를 정량화하였다: 즉, F는 [wt/돌연변이체 (BAFF 또는 항-BR3 항체 선별)]를 [wt/돌연변이체 (디스플레이 선별)]로 나눈 것이다. 해로운 돌연변이는 비가 1 미만인 반면, 유리한 돌연변이느 비가 1 초과이고; 볼드체는 10배 미만 효과를 나타낸다. 10배 초과 효과를 나타내는 돌연변이 (즉, F > 10 또는 F < 0.1)가 특히 유의적인 것으로 간주되었다.

상기 데이터는 11G9, 9.1 및 2.1이 인간 BR3과 뮤린 BR3 간의 서열 변이 영역을 활용하고 있다는 것을 나타낸다 (표 14). V3-1에 대한 기능적 에피토프는 인간 BR3과 뮤린 BR3 간에 고도로 보존되는 BAFF에 대한 기능적 에피토프를 모방하고 있다 이러한 데이터의 도식이 도 27에 도시되었다. 도 27에서 동그라미 친 잔기는 미니-BR3 서열을 벗어난 잠재적 O-연결된 당화 잔기를 나타낸다. 11G9, 2.1, 9.1 및 V3-1 항체는 결합을 위해 BR3 당화를 요구하지 않는다. 9.1 항체에 대한 기능적 에피토프에는 L38 및 R39가 포함된다. 2.1에 대한 기능적 에피토프에는 G36이 포함된다. V3-1에 대한 기능적 에피토프에는 L28 및 L29가 포함된다. 11G9에 대한 기능적 에피토프에는 P21 및 A22가 포함된다. 잔기 A34, F25 및 V33의 알라닌 스캐닝 돌연변이는 또한 상기 검정에서 BR3에 대한 9.1, 2.1, 11G9 및 V3-1 결합을 붕괴시켰는데, 이들 잔기는 파지에서 BR3의 구조적 원형 보존을 유지하는데 중요할 수 있다.

실시예 10 - CLL 발현

만성 림프구성 백혈병 (CLL) 환자로부터의 말초혈 세포를 B 세포 마커 (CD19, CD27, CD20, CD5 및 BR3)에 대항한 항체로 염색하였다 (도 28). V3-1을 사용하여 BR3을 염색하였다. 이러한 특별한 환자가 그의 B 세포 상에 CD20 발현을 전혀 나타내지는 않았지만 (CD19+ 하부 좌측), BR3은 상당한 수준으로 발현되었다 (히스토그램 피크 참조 - 패널 B). 12명의 부가의 CLL 환자로부터의 12개 샘플을 평가하였다. 이러한 12개 샘플 중에서 12개 모두가 BR3을 발현하였다. 이들 데이터는 항-BR3 항체가 이러한 적응증에 대해 치료적으로 가치가 있다는 것을 제안하고 있다.

실시예 11 - 항체-의존성 세포형 세포독성

항-BR3 키메라 모노클로날 항체를 대상으로 하여, 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 판독 정보를 사용하여 필수적으로 문헌 [참고: Shields et al., J. Biol . Chem. 276:6591-6604 (2001)]에 기재된 바와 같이, CD20 발현성 버키트 림프종 B-세포주인 BJAB 세포의 천연 킬러 세포 (NK 세포) 용해를 매개할 수 있는 그들의 능력 (ADCC 활성)에 대해 검정하였다. NK 세포는 제조업자의 프로토콜에 따라서 로세트셉 (RosetteSep^®) 인간 NK 세포 증균 칵테일 (공급처: StemCell Technologies, Vancouver, B.C.)을 사용하여 정상 인간 공여자로부터의 헤라핀 처리된 혈액 100 ml로부터 제조하였다. 이 혈액을 등 용적의 인산염 완충 식염수로 희석시키고, 15 ml의 피콜-플라크 (Ficoll-Paque™) (공급처: Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 상으로 덮은 다음, 1450 RPM 하에 20분 동안 원심분리시켰다. 층간 계면에서의 백혈구를 4개의 클린 50-mL 튜브에 분배시켰는데, 이러한 튜브는 15％ 태아 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 배지를 충진시켰다. 튜브를 1450 RPM 하에 5분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액을 경사 제거하였다. NK 세포를 검정 배지 [글리신을 수반하지 않는 F12/DMEM 50:50, 1 mM HEPES 완충액 pH 7.2, 페니실린/스트렙토마이신 (100 단위/mL; 공급처: Gibco), 글루타민, 및 1％ 열-불활성화 태아 소 혈청]에서 희석시켜 2 x lO⁶개 세포/mL가 되도록 하였다.

검정 배지 중의 일련의 항체 희석액 (0.05 mL)을 96-웰 환저 조직 배양 플레이트에 가하였다. BJAB 세포를 검정 완충액 중에서 희석시켜 4 x 10⁵/mL 농도가 되도록 하였다. BJAB 세포 (웰당 0.05 mL)를 96-웰 플레이트에서 희석된 항체와 혼합하고, 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하여 항체가 BR3과 결합하도록 하였다 (옵손화: opsonization).

0.05 mL의 NK 세포를 각 웰에 부가함으로써 ADCC 반응을 개시하였다. 대조군 웰에서는, 2％ 트리톤 X-100을 가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃ 하에 4시간 동안 인큐베이션하였다. 제조업자의 지시에 따라서 세포독성 (LDH) 검출용 키트 (Kit#1644793, 공급처: Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana.)를 사용하여 방출된 LDH 수준을 측정하였다. 0.1 mL의 LDH 현상제를 각 웰에 가한 다음, 10초 동안 혼합하였다. 이어서, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 암실에서 실온 하에 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 490 nm 하에서의 광학 밀도를 판독하고 이를 사용하여 대조군 웰에서 측정된 총 LDH로 나눔으로써 용해율 (％)을 계산하였다. 용해율을 항체 농도의 함수로서 플롯하고, 4-파라미터 곡선 피트 (KaleidaGraph)를 사용하여 EC₅₀ 농도를 결정하였다.

모든 인간화 항-BR3 항체는 1 nM 미만의 상대적 효력을 지니면서 BJAB 세포 (인간 버키트 림프종)의 NK 세포 매개된 용해를 지시하는데 있어 강력한 활성을 지니고 있었다 (도 29). BJAB 세포 대신 라모스 (Ramos) (인간 버키트 림프종) 및 WIL2s 세포 (인간 B-세포 림프종)를 사용하여 유사한 검정을 수행하였다. 도 29A 및 B는 각각, 항-BR3 항체를 사용하여 라모스 및 WIL2s 세포를 ADCC 사멸시키는 것을 도시하고 있다. 항-Her2 항체 (4D5)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 일반적으로, BR3에 대한 친화도가 보다 큰 항체는 항체-의존성 세포-사멸 검정에서 보다 강력하였다.

실시예 12 - BR3-Fc 또는 항-BR3 항체를 이용한 B 세포의 고갈

B 세포를 고갈시킬 수 있는 항-BR3 항체의 능력을 BR3-Fc와 비교하였다. 6주생 BALB/c 마우스를 0일 째에 500 ㎍ 대조군 (마우스 IgG2a), 마우스 BR3-Fc 또는 항-BR3 (V3-1) 항체로 복강내 처리하였다. 각 군으로부터의 마우스를 1, 3, 7 및 15일 째에 희생시켰다. 도 30은 처리한지 7일 째에 혈액, 림프절 및 비장 중에서의 B 세포를 유동 세포계수법으로 분석하여 도시한 것이다. 이러한 혈액, 림프절 및 비장은 BR3-Fc 처리된 동물과 대조군 처리된 동물에서 보다도 V3-1 처리된 마우스에서 보다 적은 수의 B 세포를 나타내었다 (CD21+CD23+ 및 CD21고CD23저). BR3-Fc 처리는 기존에, 대조군 Fc 처리된 동물과 비교해서 B 세포의 수를 상당히 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 동그라미 다음에 진하게 표시한 숫자는 해당 특정 영역 (동그라미) 내에 함유된 림프구의 비율을 나타낸다.

유사한 조건 하의 또다른 실험에서, 혈액, 림프절 및 비장을 FACS 분석한 결과, BR3-Fc 처리된 동물과 대조군 처리된 동물에서 보다도 V3-1 처리된 마우스에서 보다 적은 수의 B 세포를 나타내었다 (CD21+CD23+ 및 CD21고CD23저). BR3-Fc는 특히 나중에 대조군 동물과 비교해서 B 세포 수를 상당히 감소시켰다. 도 31은 1, 3, 7 및 15일 째에, 1 ml의 혈액 내에 함유된 B 세포의 절대 수; 림프절 중의 B 세포 백분율(％), 및 비장 중의 소포 (FO - CD21+CD23+) 또는 연변층 (MZ - CD21고 CD23저)의 절대 수를 도시하고 있다. 데이터는 평균 +/- 표준 오차 (n=4)로서 표현하였다.

유사한 조건 하의 또다른 실험에서, 비장 (상부 열 - IgM+Syn+) 및 배아 중심 세포 (중간 열 - B220+CD38저) 중의 형질모세포를 FACS 분석한 결과, 항-BR3 항체 (V3-1)가 몇몇 형질모세포와 배아 중심 세포를 고갈시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 32). BR3-Fc는 대조군 동물과 비교해서 형질모세포의 수를 상당히 감소시켰다. 패널 A에 인용된 숫자는 특별한 영역 내에 함유된 림프구의 비율을 나타낸다. 그래프에서 막대 데이터는 평균 +/- 표준 오차 (n=4)로서 표현하였다.

상기 데이터는 BR3-Fc (이러한 융합 단백질은 BR3에 대한 BAFF 결합을 차단시키지만, ADCC 기능을 갖고 있지 않다)로 처리한 경우 보다는 항-BR3 항체로 처리한 후에 훨씬 더 큰 정도의 B 세포 고갈이 관찰되었다는 것을 나타낸다.

실시예 13 - 최대 B 세포 감소를 위한 Fc-의존성 세포 사멸 및 BAFF 봉쇄

BALB/c 마우스를 단일 용량 lO mg/kg의 항-BR3 항체 (mV3-l), D265A/N297A 돌연변이를 수반한 mV3-1, 비-BAFF 차단성 항-BR3 항체 PIH11 또는 BR3-Fc로 처리하였다. 비장 또는 말초혈로부터의 B 세포를, 처리 후 6일 째에 유동 세포계수법으로 분석하였다. 처리 후 말초혈 B 세포 (B220+) 및 비장 소포 B 세포 (CD21+CD23+)의 절대 수를 도 33A 및 도 33B에 각각 보고하였다. 데이터를 평균 +/- 표준 오차 (n=4)로서 표현하였다. D265A/N297A Fc 돌연변이는 시험관 내에서 Fc감마RIII의 결합성을 없앤다. 이러한 결과는 비-차단성 항체, 결함있는 Fc감마 수용체-결합성을 지닌 항-BR3 항체, 및 BR3-Fc가 B 세포 집단을 감소시킬 수 있지만, Fc-의존성 세포 사멸 활성과 BAFF-차단 활성 둘 다를 지닌 항-BR3 항체가 훨씬 더 강력한 B 세포 감소제/고갈제일 수 있다는 사실을 나타낸다. 이는 양 활성, 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)과 B 세포 생존 봉쇄가 하나의 분자 내로 합해졌기 때문이다.

실시예 14 - 루푸스 마우스 모델

항-BR3 항체를 루푸스 마우스 모델에서 시험하였다. 이들 연구를 위해, 대략 8개월생 NZB/W 루푸스-경향의 양성 마우스를 0일 및 7일 째에 200 ㎍의 mIgG2a (항-gpl20)(대조군), 또는 mBR3-Fc 또는 mV3-l (항-BR3 항체)로 복강내 처리하였다. 혈액, 림프절 및 비장 중의 B 세포 (소포 - FO 및 연변층 - MZ)를 유동 세포계수법으로 분석하였다. 데이터를 개개의 마우스 데이터 점으로서 표현하였다 (n=4). BR3Fc와 유사하게, 항-BR3 항체는 이러한 자가면역 마우스 균주에서 B 세포를 감소시킬 수 있다 (데이터는 제시되지 않음).

보다 긴 연구에서는, 대략 100 mg/dl 단백뇨를 나타내는 7개월생 NZBxW Fl 마우스 (루푸스 신염 마우스 모델)을 대략 6개월 동안 300 ㎍의 mV3-l, mBR3-Fc 또는 대조군 mIgG2a 항체 (항-gpl20)으로 매주 2회 처리하였다. 각 처리 코호트 (cohort)는 25마리 마우스를 함유하였다. 모든 마우스를 대상으로 하여 병세 진행까지의 기간 상의 개선을 알아보기 위해 매월 평가하였다 (도 34A). 병세 진행까지의 기간은 생존하거나 또는 단백뇨 수준이 300 mg/dl 미만인 마우스의 비율(％)로서 측정하였다. 부가적으로, 처리한지 대략 6개월 후에, 생존하는 마우스를 희생시키고 FACS 분석으로 분석하였다. 항-BR3 항체 처리된 마우스에서의 말초 B 세포 (B220+로서 규정됨)의 평균 수는 BR3-Fc 처리된 마우스와 대조군 마우스에서 보다 더 낮았다 (도 34B). 항-BR3 항체 처리된 마우스와 BR3-Fc 처리된 마우스에서의 총 비장 B 세포 (B220+)의 평균 수는 대조군 마우스에서 보다 더 낮았다 (도 34C). 항-BR3 항체 처리된 마우스와 BR3-Fc 처리된 마우스에서의 활성화 비장 B 세포 (B220+CD69+)의 평균 수는 대조군 마우스에서 보다 더 낮았다 (데이터는 제시되지 않음). 항-BR3 항체 처리된 마우스 (p<0.00001)와 BR3-Fc 처리된 마우스 (p<0.02)에서의 비장 형질 세포/형질모세포 (CD138+)의 평균 수는 대조군 마우스에서 보다 더 낮았다 (데이터는 제시되지 않음). BR3-Fc 처리된 마우스 (p<0.02)와 항-BR3 항체 처리된 마우스 (p<0.00001)에서의 비장 배아 중심 B 세포 (B220+CD38저)의 평균 수는 대조군 마우스에서 보다도 상당히 더 낮았다 (데이터는 제시되지 않음).

실시예 15 - SCID 모델

항-BR3 항체의 B 세포 고갈 활성을 또한, 중증 복합 면역결핍증 (SCID) 모델에서 시험하였다. B 세포와 CD4 T (>90％) 세포가 자기적으로 강화된, 4천만개의 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)를 0일 째에, 거의 치사량에 가깝게 조사된 (350 rads) 6주생 scid 베이지 (beige) 마우스 내로 비장내 전이시켰다. 마우스를 0일 째에, 500 ㎍ 항-BR3 항체 (인간 IgG2a 불변 영역을 수반한 2.1 또는 V3-1), 인간 IgG2a 이소형 대조군 또는 마우스 BR3-Fc로 처리하였다. 마우스를 4일 째에 희생시키고, 그들의 비장을 대상을 하여 인간 B 세포에 대해 유동 세포계수함으로써 분석하였다. 활성화/배아 중심 (GC) B 세포 (상부)와 형질모세포 (하부) 둘 다는 항-BR3 처치에 의해 상당히 감소된 반면, BR3-Fc 처치에 의해서는 단지 활성화/GC 세포 만이 상당히 감소되었다 (도 35A-D). 군 (무리)당 10마리 개개의 마우스를 도시하고 각 군에 대해 평균을 내었다.

또다른 실험에서는, 인간 PBMCs로부터 CD8 T 세포, CD16/CD56 NK 세포 및 CD14 단구를 자기적으로 고갈시키고, 조사된 scid-베이지 마우스 내로 비장내 주사하였다 (40xl0⁶/마우스). 동일자로, 마우스를 300 ㎍/마우스 인간 항-인간 BR3 (9.1RF) 또는 이소형 ctrl (인간 IgG1)로 처리하였다. 7일 후에 마우스를 희생시키고, 유동 세포계수법을 이용하여 인간 B 세포 활성화를 그들의 비장에서 평가하였다. 활성화 및 배아 중심 B 세포 (CD19hiCD38+)의 백분율(％)은 항-BR3으로 처리된 군에서 상당히 저하되었다 (도 35E).

또다른 실험에서는, 인간 PBMCs를 표준 방법론을 이용하여 정상 인간 공여자로부터의 류코팩 (Leukopack) (공급처: Blood Centers of the Pacific, San Francisco, CA)으로부터 단리하였다. PBMCs를 40 x l0⁶/30 ㎕ PBS에 재현탁시키고, 비장내 주사 과정 동안 얼음 상에 유지시켰다. 세슘 137 공급원을 사용하여 수용자 마우스에게 거의 치사량에 가깝게 350 Rads 조사하였다. 조사한지 4시간 후에, 모든 마우스에게 비장내 주사를 통하여 30 ㎕ PBS 중의 40 x l0⁶개 인간 PBMCs를 투여하였다. 마취 하에, 수술 부위를 면도하고, 베타딘 (Betadine)과 70％ 알코올로 프렙하였다. 늑골 경계 바로 아래의 좌측 옆구리에 1 cm 피부 절개선을 만든 다음, 복벽과 복막을 절개하였다. 비장을 조심스럽게 노출시키고 이에 30 ㎕ 세포 현탁액을 주사하였다. 5-O 비크릴 (Vicryl) 및 외과용 봉합사를 각각 사용하여 근육층과 피부 절개선을 밀봉시켰다. 모든 마우스를, 세포 전이시키기 4시간 전에 0일 째에 200 ㎕ 식염수 중의 단일 300 ㎍ 용량의 Ab 용액 정맥내 주사제로 처리하였다. 폴리믹신 (Polymyxin) B llO mg/리터 및 네오마이신 1.1 g/리터를 조사 후 7일 동안 음료수에 가하였다.

실험군:

군 1: 부형제 (n=9).

군 2: 항-BR3 (9.1RF) (n=9).

군 3: 항-BR3 (9.1RF N434A) (n=9).

모든 마우스를 4일 째에 안락사시켰다. 그들의 비장 내의 B 림프구 서브세트를 유동 세포계수 분석에 의해 정량화하였다. 4일 째에 혈청 샘플 (100 ㎕)을 수집하여 종결 시점에서의 Ab 혈청 농도를 확인하였다.

인간 PBMC 유래된 B 세포는 scid/베이지 마우스 내로의 전이 후에 신속하게 확장되고 활성화되었다. 세포 전이 후 4일 째에, 비장 내의 대다수 B 세포 집단은 활성화 B 세포 CD19hi/CD38int 표현형 (항-CD19 및 항-CD38 항체)를 나타내었다. 플라시보 처리군 중의 활성화 B 세포의 평균 비율은 10.1％인 반면, 9.1RF 처리군 중의 활성화 B 세포의 평균 비율은 0.46％였다. 전이시킨 후 4일 째에 9.1RF 항체와 9.1RF N434A 항체를 대상으로 하여, B 세포 전구체를 고갈시킬 수 있는 그들의 능력 뿐만 아니라 BAFF 봉쇄에 의한 활성화 B 세포의 팽창을 억제시킬 수 있는 그들의 능력을 비교한 결과, 이들 항체는 통계상 유의적 억제 효과를 나타내었다 [플라시보 대조군과 비교해서 둔넷트 (Dunnett) 시험을 이용한, 9.1RF 및 9.1RF N434A에 대한 p 값은 둘 다 <0.0001였다). 하기 참고.

2가지 항-BR3 Ab 모두 (9.1RF 및 9.1RF N434A)는 인간-scid 생체내 모델에서 B 세포 생존을 상당히 고갈 및 억제시켰다. 이러한 모델은 생체내에서 ADCC 및 BAFF 생존 봉쇄를 시험하는 것이기 때문에, 2가지 Ab 모두는 B 세포 성분을 수반한 인간 자가면역 질환과 B 세포 악성 종양을 치료하는데 있어서 적당한 특성과 잠재력을 지니고 있다.

실시예 16 - FcRn 결합성

9.1RF IgG 항체 (서열 74 및 75)를 EU 넘버링 시스템에 따라서 잔기 N434에서 변경시켜 인간 FcRn 수용체에 대한 결합성을 증가시켰다. IgG 항체를 CHO 세포에서 생성시켰다.

BIAcore-3000 시스템 (공급처: BIAcore Inc.)을 사용하여 9.1 RF 및 그의 돌연변이체의 결합 친화도를 결정하였다. 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4를 사용하여, 인간 및 시노 FcRn를 제조업자의 지시에 따라서 아민 커플링을 통하여 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 커플링을 25℃ 하에 수행하였다. 달성된 최종 밀도는 700 내지1000 RUs였다.

25℃ 하에 유속 20 ㎕/min을 사용하여, 9.1 RF 또는 그의 돌연변이체의 3배 일련의 희석물을 pH 6 수행 완충액 (PBS pH 6, 0.05％ Tween-20) 중에서 2분 동안 주사함으로써 역학 측정을 수행하였다. 사용된 항체의 최대 농도는 1 μM였다. 해리 속도를 10분에 걸쳐 측정하였다. 결합 활성은 최소한도로 손실시키면서 10 mM 트리스 pH 9, 150 mM NaCl의 20 ㎕ 주사액을 이용하여 표면을 재생시켰다. 그 결과를 다음 표 15에 k_a, k_c 및 KD_a 값으로서 제시하였다.

25℃ 하에 유속 2 ㎕/min을 사용하여, 9.1 RF 또는 그의 돌연변이체의 3배 일련의 희석물을 수행 완충액 중에서 6분 동안 주사함으로써 평형 결합성 실험을 수행하였다. 해리를 2분 동안 지속하였다. 사용된 항체의 최대 농도는 1 μM였다. 평형 결합성 실험을 위한 수행 완충액은 PBS pH 6, 0.05％ Tween-20 또는 PBS pH 7.4, 0.0％ Tween-20였다. 10 mM 트리스 pH 9, 150 mM NaCl의 20 ㎕ 주사액을 이용하여 표면을 재생시켰다. BIA평가 v3.2 소프트웨어를 사용하여 센서그램을 평가하였다. 그 결과를 도 36에 제시하였고, 다음 표 15에 KD 값 (KD_b)으로서 제시하였다.

전반적으로, 상기 결과는 9.1RF의 N434A 및 N434W 돌연변이체가 pH 6.0 및 pH 7.0에서 9.1RF 보다 인간 FcRn 및 시노 FcRn에 대한 친화도가 더 컸다는 것을 나타낸다. 추가로, N434W 돌연변이체는 pH 6.0 및 pH 7.0에서 N434A 돌연변이체 보다 인간 FcRn 및 시노 FcRn에 대한 친화도가 더 컸다. 이러한 데이터는 어느 한 돌연변이체가 9.1RF의 Fc 서열을 갖는 항체와 비교해서, 인간 및 시노 FcRn 수용체에 대한 증가된 친화도와 보다 긴 생체내 반감기를 지닐 것이란 사실을 제안하고 있다.

실시예 17 - Fcγ 수용체 결합성

그들의 막관통 도메인과 세포내 도메인이 결여되고 그들의 C-말단에 His-태그화 글루타치온 S 트랜스퍼라제 (GST) 서열을 포함하는 인간 FcγRs (hFcgR로서 후술되기도 함)을 기존 문헌에 언급된 바와 같이 제조하였다 [참고: Shields, R.L. et al, (2001) JBC 276:6591-6604].

맥시소르프 96-웰 마이크로웰 플레이트 (Nunc, Roskilde, Denmark)를, 4℃ 하에 밤새 50 mM 탄산염 완충액, pH 9.6 중의 100 ㎕/웰로 2 ㎍/ml 항-GST (클론 8E2.1.1, 공급처: Genentech)로 피복시켰다. 플레이트를 0.05％ 폴리솔베이트를 함유하는 PBS, pH 7.4 (세척 완충액)으로 세척하고, 0.5％ BSA를 함유하는 PBS, pH 7.4로 차단시켰다 (150 ㎕/웰). 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하였다. 인간 Fcγ 수용체를, 0.5％ BSA, 0.05％ 폴리솔베이트 20을 함유하는 PBS, pH 7.4 (검정 완충액) 중에서, 0.25 ㎍/웰, 100 ㎕/웰로 상기 플레이트에 가하였다. 이 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액으로 세척하였다. 저 친화도 Fcγ수용체 IIa, IIb, III (F158) 및 고 친화도 III (V158)의 경우에는, 항체를 염소 F(ab')₂ 항-κ (Cappel, ICN Pharmaceuticals, Inc., Aurora, Ohio) 또는 항-λ (BioSource, Camarillo, CA) 항체와 함께 1:2 (w/w) 비로 1시간 동안 인큐베이션하여 항체 복합체를 형성하였다. 검정 완충액 중의 복합체를 형성한 IgG 항체의 11개의 2배 일련 희석물 (3배 일련 희석물 중의 1.17 내지 50000 ng/ml)을 상기 플레이트에 가하였다. 고 친화도 FcγRI의 경우에는, 검정 완충액 중의 복합체를 형성하지 않은 IgG 항체의 11개의 2배 일련 희석물 (3배 일련 희석물 중의 0.017 내지 1000 ng/ml)을 상기 플레이트에 가하였다. 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하였다. 퍼옥시다제 표지된 염소 F(ab')₂ 항-인간 IgG F(ab')₂ (공급처: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 검정 완충액 중에서 100 ㎕/웰로 부가함으로써, 결합된 IgG를 검출하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고, 기질 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) (공급처: Kirkegaard ＆ Perry Laboratories)을 100 ㎕/웰로 가하였다. 1 M 인산을 100 ㎕/웰으로 가함으로써 반응을 중지시켰다. 멀티스캔 아센트 (multiskan Ascent) 판독기 (공급처: Thermo Labsystems, Helsinki, Finland) 상에서 450 nm 하에서의 흡광도를 판독하였다.

표준 곡선의 중간점에서의 흡광도 (중간-OD 대 ng/ml)를 계산하였다. 4-파라미터 비선형 회귀 곡선-고정 프로그램 (공급처: KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)을 사용하여 적정 곡선으로부터 상기 중간-OD 하에서의 표준물 및 샘플의 상응하는 농도를 결정하였다. 표준물의 중간-OD 농도를 샘플의 중간-OD 농도로 나눔으로써 상대 활성을 계산하였다. 헤르셉틴^® Ab는 기존에, Fc감마 수용체와 결합하는 것으로 밝혀졌으므로, 본원에서 양성 대조군으로서 사용하였다.

모든 FcγR에 대해, 보고된 결합성 값은 FcγRII 및 FcγRIIIA의 경우에는 0.33 또는 1 ㎍/ml 하에서 취하고 FcγRI의 경우에는 2 ㎍/ml 하에서 취한, 9.1RF와 비교한 각 9.1-RF 변이체의 결합성이다. 1 보다 큰 값은 변이체의 결합성이 9.1RF와 비교해서 개선되었다는 것을 의미하는 반면, 1 미만 비는 9.1RF와 비교해서 결합성이 저하되었다는 것을 의미한다. hFcγRIII(F158) 및 hFcγRIII(V158)은 인간 IgG에 대한 저 친화도 및 고 친화도를 각각 지닌 hFcγRIII 이소형을 지칭한다.

표 16 및 도 37은 시험된 9.1 항-BR3 항체가 FcγRs와 유사하게 결합하고 ADCC를 증진시켜야 한다는 것을 보여준다.

실시예 18 - 항-CD20 및 항-BR3 항체를 이용한 B 세포 고갈

6주생 인간 CD20 트랜스제닉 양성 마우스를 200 ㎍의 mIgG2a (대조군), 또는 m2H7 (뮤린 항-인간 CD20 항체) 또는 mV3-l로 복강내 처리하였다. 항체 처리한지 1시간, 1일, 8일 및 15일 후에, 혈액 중의 B 세포를 분석하였다. 혈액, 림프절로부터의 B 세포를 유동 세포계수법으로 분석하였다. 데이터를 평균 +/- 표준 오차 (n=4)로서 표현하였다.

초기 시점 (1시간) 및 1일 째에는 항-CD20 항체가 항-BR3 항체 보다 더 많은 세포를 고갈시켰지만, 8일 및 15일 까지는 항-BR3 항체에 의한 고갈이 항-CD20 항체에 의한 고갈을 능가하였다. 도 38은 혈액 및 림프절 중에서의 B 세포 수준의 처리 후 분석을 도시한 것이다.

실시예 19 - 소포 및 연변층 B 세포의 고갈

6주생 인간 CD20 트랜스제닉 양성 마우스를 200 ㎍의 mIgG2a (대조군), 또는 m2H7 (뮤린 항-인간 CD20 항체) 또는 mV3-l로 복강내 처리하였다. mAb 처리한지 1일, 8일 및 15일 후에, 혈액 중의 B 세포를 분석하였다. 비장으로부터의 B 세포를 유동 세포계수법으로 분석하였다. 비장 중의 소포 (FO - CD21+CD23+) 또는 연변층 (MZ - CD21고 CD23저)의 절대 수를 상기 3가지 처리군들 간에 비교하였다. 데이터를 평균 +/- 표준 오차 (n=4)로서 표현하였다.

1일 째에는 항-CD20 항체가 항-BR3 항체 보다 더 많은 세포를 고갈시켰지만, 8일 및 15일 까지는 소엽 및 연변층 B 세포 둘 다에서 항-BR3 항체에 의한 고갈이 항-CD20 항체에 의한 고갈을 능가하였다 (도 39).

실시예 20 - 시노 원숭이에서의 반감기

FcRn에 대한 상이한 결합 친화도를 지닌 3가지 인간화 모노클로날 항-BR3 항체 (9.1RF, 9.1RF N434A 및 9.1RF N434W)의 약동학을 사이노몰구스 원숭이에서 비교하였다. 4 내지 5년생이고 체중이 2 내지 4 kg인 숫컷 17마리와 암컷 17마리 사이노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis)를 체중별로 무작위로 나누어 3개 군 중의 하나로 분류하였다. 군 1, 2 및 3의 동물에게는 단일 정맥내 용량 20 mg/kg의 야생형, N434A 돌연변이체 또는 N434W 돌연변이체를 각각 투여하였다. 연구 계획은 다음과 같다:

군	수/성별	시험 물질	경로	용량 수준 (mg/kg)	용량 농도 (mg/mL)	용량 용적 (mL/kg)^a
1	5/M, 5/F	야생형	정맥내	20	20	1
2	5/M, 5/F	N434A	정맥내	20	20	1
3	5/M, 5/F	N434W	정맥내	20	20	1

^a총 용량 용적 (mL)은 가장 최근의 체중을 기초로 하여 계산하였다. 용량 용적은 0.1 mL에 가장 가깝게 삽입하였다.

약동학적 분석을 위한 대략 1.0 mL의 혈액을 다음 시점에서 각 동물의 말초 정맥으로부터 수집하였다:

■ 투여전

■ 연구 1일 째에 투여 후 30분 및 6시간.

■ 연구 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99, 106, 113, 120, 127, 및 134일 째에 1회.

항-치료적 항체 분석을 위한 대략 1.0 mL의 혈액을 다음 시점에서 각 동물의 말초 정맥으로부터 수집하였다:

■ 투여전

■ 연구 15, 29, 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127 및 134일 째에 1회.

약동학적 (PK) 및 항-치료적 항체 (ATA) 분석을 위한 혈액 샘플을 혈청 분리기 튜브 내로 수집한 다음, 실온 하에 대략 30 내지 80분 동안 응고시켰다. 혈청 (대략 0.5 mL)은 원심분리시킴으로써 (실온 하에 15분 동안 2000 x g) 수득하였다. 혈청 샘플을 예비표지시킨 1.5-mL 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브 내로 옮기고 동결기 세트에서 저장하여, 분석할 때까지 드라이 아이스 상에서 패킹할 때까지 -60 내지 -80℃ 온도로 유지시켰다.

각 혈청 샘플 중에서의 각 항체 농도를 ELISA 검정에 의해 결정하였다. 혈청 중에서의 검정 정량화 하한치 (LLOQ)는 0.05 ㎍/mL였다. 이러한 하한치 아래의 값은 결단코 보고 의무가 없는 (LTR) 것으로서 기록되었다. 각 샘플 중에서의 항-치료적 항체는 브릿징 ECLA 검정을 사용하여 결정하였다.

해당 스케쥴로부터 최소한의 편차를 나타내는 공칭 용량과 샘플 수집 시간을 데이터 분석에 사용하였다. 숫컷 및 암컷 사이노몰구스 원숭이 중에서 혈청 9.1RF, 9.1RFN434A, 및 9.1RFN434W 농도의 평균 및 SD는 엑셀 (Excel) (버젼 2000, 공급처: Microsoft Corporation, Redmond, WA)을 사용하여 계산하고, 시그마플롯 (SigmaPlot) (버젼 9.0; 공급처: Systat Software, Inc., Point Richmond, CA)을 사용하여 플롯하였다. 결단코 보고 의무가 없는 혈청 농도는 모든 데이터 분석으로부터 배제시켰다. n≤2인 경우에는 SD를 계산하지 않았다. 그 결과를 3개의 유의적 수치로 제시하였다.

1 오버 y 햇 칭량 도식 (WinNonlin Version 3.2; Pharsight Corporation; Mountain View, CA)을 이용한 가우스-뉴톤 [Gauss-Newton (Levenberg and Hartley)] 2-구획 모델을 사용하여, 각 동물에 대한 PK 파라미터를 평가하였다. 군 1 (야생형; 9.1RF)에서 10마리 시노스 중의 8마리와, 군 3 (9.1RFN434W)에서 10마리 시노스 중의 5마리에게서 57일 까지 ATA가 발생하였다. 일반적으로, 특정한 시간에 ATA가 검출된다는 것은 이러한 시간 동안 또는 후에 혈청 농도의 급격한 강화와 상관이 있었는데, 이로써 말단 반감기가 보다 단축되고 약물 노출이 저하되었다. PK에 대한 ATA 반응 효과 정도를 이해하기 위해, 2가지 방법을 사용하여 각 군에 대한 평균 PK 파라미터를 계산하였다. 방법 1에서는, 각 군에서 10마리 시노스 모두로부터의 데이터를 사용하여 PK 파라미터 (평균 ± 표준 편차)를 계산하였다. 방법 2에서는, 57일 까지 항-치료적 항체를 발생하지 않은 시노스 (군 1의 경우 n=2, 군 2의 경우 n= 10, 및 군 3의 경우 n=5)만으로부터의 데이터를 사용하여 PK 파라미터를 계산하였다. 군 1 및 3에 대해 방법 1을 사용하면, 방법 2와 비교해서 말단 반감기 (t_1/2,β)와 노출 (AUC) 추정치가 보다 낮아졌다. 그러나, 상기 2가지 방법을 사용한 경우의 전반적인 결론은 유사하였다. 따라서, 본 실시예에서 보고된 평균 PK 파라미터는 방법 1을 사용하여 (예를 들어, 모든 시노스로부터의 데이터를 포함함) 계산하였다.

결과

20 mg/kg의 9.1RF (야생형 항체), 9.1RFN434A (N434A 변이체) 및 9.1RFN434W (N434W 변이체)를 단일 정맥내 볼루스 투여한 후, 혈청 농도는 2상 경향을 나타내었는데, 신속한 초기 분포 상에 이어 보다 느린 제거 상을 나타내었다 (도 1). 각 군에 대한 PK 파라미터 추정치가 표 2에 제시되었고, 이에는 각 군에서 10마리 모든 시노스로부터의 데이터가 포함된다. 9.1RF (야생형 항체)의 말단 반감기 (평균 ± SD)는 6.15 ± 2.01일이고, 10마리 시노스에서 4.24 내지 11.0일의 범위였다. 57일 까지 ATA를 발생하지 않은 2마리 시노스에서 9.1RF의 말단 반감기 (t_1/2,β)는 8.95일이었다. 9.1RFN434A (N434A 변이체)의 경우에는, 평균 말단 반감기가 14.1 ± 1.55일이었는데, 이는 9.1RF 보다 1.6 내지 2.3배 더 크다 (p<0.05). 9.1RFN434W (N434W 변이체)의 경우에는, 10마리 시노스에서 평균 ± SD 말단 반감기가 9.55 ± 2.49일이었다. 이러한 값은 10마리 시노스에서 9.1RF (야생형 항체)의 전체 평균 t₁ _/2,β 보다 상당히 더 크지만, 검출 가능한 ATA를 발생하지 않은 2마리 시노스에서 9.1RF의 평균 t_1/2,β와 극히 유사한다 (8.95일). 상기와 같이 관찰된 9.1RF (야생형 항체)와 9.1RFN434W (N434W 변이체) 간의 t_1/2,β 상의 차이에서 보면, 이들 2가지 군에서의 ATA 반응은 당혹스러운 것으로 예상된다.

9.1RF (야생형 항체)의 무한히 외삽된 농도-시간 곡선하 면적 (AUC)은 2440 ± 398 일*㎍/mL였고, 10마리 시노스에 대해 1740 내지 3140 일*㎍/mL의 범위였다. 57일 까지 ATA를 발생하지 않은 2마리 시노스에서 9.1RF의 평균 AUC는 2850 일*㎍/mL였다. 9.1RFN434A (N434A 변이체)의 경우에는, 평균 AUC가 4450 ± 685 일*㎍/mL였는데, 이는 9.1RF (야생형 항체) 보다 1.6 내지 1.8배 더 크다 (p<0.05). 9.1RF (야생형 항체)의 AUC와 9.1RFN434W의 AUC 간에는 차이가 없었다.

요약하면, 20 mg/kg의 단일 정맥내 용량을 사이노몰구스 원숭이에게 투여한 후에 9.1RF, 9.1RFN434A, 및 9.1RFN434W의 약동학을 조사하였다. 10마리 시노스 중의 8마리가 56일 까지 9.1RF에 대해 항-치료적 항체 (ATA's)를 발생한 반면, 10마리 시노스 중의 5마리가 56일 까지 9.1RFN434W에 대한 ATA's를 발생하였다. 56일 까지 9.1RFN434A에 대한 ATA's를 발생한 시노스는 전혀 없었다. 9.1RFN434A는 9.1RF (야생형 항체)와 비교해서 증가된 말단 반감기와 증가된 AUC를 나타내었다 (p<0.05). 9.1RFN434W는 9.1RF와 비교해서 말단 반감기가 약간 증가하였지만, 이와 같이 관찰된 차이에서 보면, 9.1RF와 9.1RFN434W 둘 다에 대한 항-치료적 항체 반응은 당혹스러운 것으로 예상된다.

* WT 및 9.1RFN434W 군에서 10마리 중의 8마리 및 10마리 중의 5마리에게서 항-약물 항체가 존재하는 것은 WT 및 9.1RFN434W의 PK 파라미터에 어울리지 않을 수 있다 (예를 들어, AUC 감소 및 t_1/2,β 감소)

** WT와 상이함 (p<0.05).

실시예 21 - 사이노몰구스 원숭이에서의 B 세포 고갈

항-BR3 (WT로서 지칭된 9.1RF) 및 FcRn 변이체 N434A (9.1RFN434A로서 지칭됨). 51마리 사이노몰구스 원숭이에게 WT 또는 9.1RFN434A를 다음 연구 계획 하에 투여하였다.

말초 B 세포 (총 및 B 세포 세브세트) 고갈을 시간 경과에 따라 모든 군에서 FACS에 의해 모니터링하고, 개개의 동물 기저 수준의 비율로서 표현하였다. 이러한 기저 수준 값은 각 동물에 대한 3가지 투여전 샘플링 시점의 평균이었다. 조직 B 세포 서브세트를 각 부검 시점에서 FACS 분석함으로써 분석하였다. B 세포 고갈을 알아보기 위해 분석된 조직에는 비장, 아래턱 림프절 및 장간막 림프절이 포함된다 (도 40A 및 B).

투여 후, 투여군 모두의 혈액에서 상당한 B 세포 고갈이 관찰되었다. 20 mg/kg 용량을 4회 투여한 9.1RFN434A 군과 WT에서 29일 (부검 시점) 째에 조직 B 세포가 고갈되었다. 조직 내에서의 B 세포 고갈은 WT 2 mg/kg 군에서 덜 두드러졌다. 도 41A-C는 처치 후의 B 세포 아집단을 도시하고 있다.

실시예 22 - ADCC 활성이 증가된 항-BR3 항체

B 세포 종양주에 대한 분자의 ADCC 활성을 증강시키도록, 항-BR3 항체 9.1RF의 Fc 영역 내의 아미노산 치환을 계획하였다. 부위-지시된 돌연변이 유발시킴으로써, 상기 항체의 Fc 영역을 다음과 같이 돌연변이시켰다: S298A/K326A/E333A/K334A 또는 S298A/E333A/K334A (EU 넘버링 시스템). 이러한 아미노산 치환을 구체화시킨 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성하고, 이를 문헌 [참고: Kunkel et al., Methods in Enzymology (1987) 154, 367-382]의 프로토콜에 따라서 9.1RF를 코딩하는 플라스미드의 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발을 위해 사용하였다. 변이체 서열을 디데옥시뉴클레오티드에 의거하여 서열 분석함으로써 확인하였다. 플라스미드 DNA를 기가프렙 (gigaprep) 프로토콜 (Qiagen, Inc.에 의해 기재됨)을 사용함으로써, 이. 콜라이 XL-1 블루 (공급처: Stratagene, Inc.)의 1 L 배양액 (50 ㎍/ml 카르베네실린을 함유하는 2YT 배지)로부터 정제하고, 관련 플라스미드로 형질전환시킨 다음, 200 RPM 하에 진탕시키면서 37℃ 하에 성장시켰다. CHO 세포를 일시적으로 형질감염시키기 위해 상기 정제된 플라스미드 DNA를 사용함으로써 단백질을 발현시켰다. 항체를 단백질 A-세파로스 상에서 크로마토그래피한 다음 SP-세파로스 상에서 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 1 L의 배양 상등액으로부터 정제하였다. 이와 같이 정제한 단백질의 실체를 SDS-PAGE 및 아미노 말단 서열 분석에 의해 확증하였다. 정제된 항체 모두는 분석용 겔 여과 크로마토그래피 상에 균질한 피크를 생성시켰는데, 정적 광 산란 데이터로부터 계산된 분자량은 150,000±5000이고 응집체 함량은 3％ 미만이었다. MALDI-TOF에 의해 N-연결된 올리고당류를 분석한 결과 (표 2), 재조합 항체 특유의 탄수화물 조성이 나타났다.

Fcγ 수용체에 대한 변이체 항체의 결합성은 ELISA에 의거한 검정을 사용하여 평가하였다. 인간 Fcγ 수용체 I, IIa, IIb, IIIa (F158), IIIa (V158) 및 마우스 Fcγ 수용체 I, II, 및 III의 세포외 도메인이 CHO 세포에서 His-태그화, GST 융합 단백질로서 발현되었고, 이를 문헌 [참고: Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)]에 기재된 바와 같이 정제하였다. ELISA 검정에 대해서는, 상기 융합 단백질을, 항-GST 항체로 피복시킨 미량역가 플레이트의 웰 상에 포획시켰다. 변이체 항체 희석물을 가하고, 결합시킨 다음, 상기 웰을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 보다 약하게 결합하는 항체의 경우에는, 샘플을 항-hu κ-쇄 항체의 Fab'2 단편과 복합체를 형성시킨 후, 상기 샘플을 웰에 부가하였다. 결합된 항체를 염소 항-huFab'2 항체의 HRP-커플링된, Fab'2 단편으로 검출하였다. EC₅₀ 값 (포화시 관찰된 신호의 50％를 제공해주는 항체의 농도)을 계산하기 위해 4-파라미터 방정식을 사용하여 결합성 곡선을 평가하였다. 이들 검정에서 헤르셉틴을 대조군 항체로서 사용하였고, 결합 상의 증가 배수를 EC₅₀ 값의 비 (EC₅₀헤르셉틴/EC₅₀샘플)로부터 계산하였다.

이들 데이터는 항-BR3 변이체 모두가 인간 FcγRIIIa의 Fl58 및 V158 동종이형 둘 다에 대해 증가된 친화도를 지니고 있다는 것을 보여준다. 이들 변이체 모두는 인간 FcγRI에 대한 친화도에 대해서는 중요하지 않은 변화를 나타내었다.

항-BR3 항체를 대상으로 하여, 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 판독정보를 사용하여 필수적으로 문헌 [참고: Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)]에 기재된 바와 같이, BR3 및 CD20 발현성 버키트 림프종 B-세포주인 BJAB 세포의 천연 킬러 세포 (NK 세포) 용해를 매개할 수 있는 그들의 능력 (ADCC 활성)에 대해 검정하였다. CD16의 F/V 158 동종이형에 대해 이형접합성인 공여자로부터 단리한 NK 세포를 효과기:표적 비 5:1으로 본 검정에 사용하였다. NK 세포는 제조업자의 프로토콜에 따라서 로세트셉 (RosetteSep^®) 인간 NK 세포 증균 칵테일 (공급처: StemCell Technologies, Vancouver, B.C.)을 사용하여 헤라핀 처리된 혈액 100 ml로부터 제조하였다. 이 혈액을 등 용적의 인산염 완충 식염수로 희석시키고, 15 ml의 피콜-플라크™ (공급처: Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 상으로 덮은 다음, 1450 RPM 하에 20분 동안 원심분리시켰다. 층간 계면에서의 백혈구를 4개의 클린 50-mL 튜브에 분배시켰는데, 이러한 튜브는 15％ 태아 송아지 혈청을 함유하는 RPMI 배지를 충진시켰다. 튜브를 1450 RPM 하에 5분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액을 경사 제거하였다. NK 세포를 검정 배지 [글리신을 수반하지 않는 F12/DMEM 50:50, 1 mM HEPES 완충액 pH 7.2, 페니실린/스트렙토마이신 (100 단위/mL; 공급처: Gibco), 글루타민, 및 1％ 열-불활성화 태아 소 혈청]에서 희석시켜 2 x lO⁶개 세포/mL가 되도록 하였다.

검정 배지 중의 일련의 항체 희석액 (0.05 mL)을 96-웰 환저 조직 배양 플레이트에 가하였다. BJAB 세포를 검정 완충액 중에서 희석시켜 4 x 10⁵/mL 농도가 되도록 하였다. BJAB 세포 (웰당 0.05 mL)를 96-웰 플레이트에서 희석된 항체와 혼합하고, 실온 하에 30분 동안 인큐베이션하여 항체가 BR3과 결합하도록 하였다 (옵손화).

모든 항-BR3 변이체는 1 nM 미만의 EC₅₀ 값을 제공하면서 ADCC 검정에서 활성을 지니고 있었다 (％ 사멸 대 항체 농도). Fc 치환으로 인해, EC₅₀을 저하시키고, 최대 사멸률 (％)을 증가시킴으로써 9.1에 비해 효력이 증가되었다 (데이터는 제시되지 않음). S298A/K326A/E333A/K334A 돌연변이체는 이러한 검정에서 9.1wt에 비해 3배 더 큰 ADCC 활성을 지니고 있다 (상대적 EC₅₀ 값). S298A/E333A/K334A 돌연변이체는 상기 검정에서 9.1wt에 비해 2.8배 더 큰 ADCC 활성을 지니고 있다 (상대적 EC₅₀ 값).

SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. et al. <120> Polypeptides That Bind BR3 and Uses Thereof <130> 50474/005WO2 <150> PCT/US05/47072 <151> 2005-12-23 <150> US 60/640,323 <151> 2004-12-31 <160> 236 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Thr Asp Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser 85 90 95 Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 105 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Phe Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Pro His Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser 85 90 95 Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Pro His Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Pro His Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Pro His Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Thr Leu Pro Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Ser Asn Phe Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Leu Asn Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Ala Asn Tyr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Ser His Asn Thr Gly Glu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Thr Leu Pro Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Ser Asn Phe Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 14 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val 35 40 45 Asp Asp Tyr Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asp Leu Glu Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Thr Ser Lys Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 180 185 190 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 15 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 15 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly Tyr Trp Asn Trp Val 20 25 30 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Tyr Ile Asn Tyr 35 40 45 Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile 50 55 60 Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 65 70 75 80 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Ser Asn Phe Tyr 85 90 95 Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Asn His Leu Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Pro His Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Arg Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Pro His Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 105 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ile Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 <210> 21 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Gln His Leu Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Met Ala Gly Phe 20 25 30 Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 26 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Pro Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Trp Pro Val Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Pro Ala Val Ala Pro His 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Tyr Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Gly Gly Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Glu Ser Ala Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 34 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Gly Ile Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Trp Thr Glu His Gly His 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Arg Arg Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Gly Gly Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Gly Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Thr Thr Ala Arg 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Thr Ala Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Leu Arg Gly Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Ala Val Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Arg Ala Val Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Ala Thr Gly His 20 25 30 Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Val Asp Lys Leu Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 50 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Gly Arg 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Gln Ala Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Met Thr Gly Val 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ala Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 55 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Asn Gly Arg 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Asn Gly Arg 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 57 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Trp Thr Gly Arg 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Val Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 59 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Pro Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Leu Asp Thr Ser 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Asp Gly Thr Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Asp Thr Gly His 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ser Leu Asn Gly Tyr 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 65 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Asp Tyr Gly Asn 20 25 30 Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Gly Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Ser 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ala His 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Tyr Thr Glu Asn Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Glu Gly Gly Phe 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Glu Asp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Gly Gly Thr Phe 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 75 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 75 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 76 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (435)..(435) <223> Xaa = Ala, Trp, His, Tyr, or Phe <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 77 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 <210> 78 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Leu Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 <210> 79 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 80 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 80 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 81 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 82 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Asn Phe Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Leu Asn Asp Leu Phe Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 83 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Leu Asn Asp Leu Tyr Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 84 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asn Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 85 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asn Ile Gly Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Leu Asp Gly Leu Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 87 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Ser Ser Val Arg Gly Cys Ala Gly Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 225 230 <210> 88 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Tyr Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Phe Val Met Ser Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 89 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Lys Pro Ala Gly Pro Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 90 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Thr Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Phe Pro Phe His Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 91 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Ser Ser 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Tyr Ile Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Phe His Trp Tyr Arg Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 92 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Gly Ser 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Tyr Pro Asp Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Lys Pro Ala Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 93 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 93 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Thr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Lys Val Val Ser Ser His Val Thr Asn Lys Tyr Val Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 94 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Gly Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Arg Arg Pro Trp Leu Trp Gly Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 95 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(33) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(55) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (99)..(104) <223> Xaa = any amino acid <400> 95 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Asn Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 96 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(33) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(55) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(105) <223> Xaa = any amino acid <400> 96 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Xaa Ile Ser Pro Xaa Xaa Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Leu Cys Ala Pro Xaa Xaa Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 97 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 97 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 98 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 98 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 99 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser Thr Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 100 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 100 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Asn Leu Gly Val Cys Ala Gly Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 101 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 101 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 102 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asp Arg Ala Arg Val Cys Ala Gly Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 103 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 103 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ala Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 104 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 104 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Arg Arg 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Ser Ser Val Arg Gly Cys Ala Gly Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 105 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 105 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 106 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 106 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 107 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 107 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Gly His Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Asn Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 109 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 109 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Thr His Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 110 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 110 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ala Arg Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Leu Pro Ser Ala Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 111 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 111 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Ile Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 112 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 112 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Arg Ser Ile 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Phe Asn Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 113 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 113 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Met Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 114 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 114 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn His Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 115 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 115 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 116 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 116 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Asn His 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Thr Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Leu Met Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 118 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 118 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Thr Pro Gly Val Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 119 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 119 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 120 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 120 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Arg Arg 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Thr Pro Leu Tyr Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 121 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 121 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 122 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 122 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Arg Asn Asn 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Asn Gly Val Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 123 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 123 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 124 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 124 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 125 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 125 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ala Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 126 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 126 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gln Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 127 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 127 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 128 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 128 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 129 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 129 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 225 230 <210> 130 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 130 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 <210> 131 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (442)..(442) <223> Xaa = Ala, Trp, His, Tyr, or Phe <400> 131 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 <210> 132 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 133 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 134 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (204)..(204) <223> Xaa = Ala, Trp, His, Tyr, or Phe <400> 134 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Xaa Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 <210> 135 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 136 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 137 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 138 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glx Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 139 <211> 215 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 139 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 35 40 45 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 65 70 75 80 Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 85 90 95 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 100 105 110 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 115 120 125 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 130 135 140 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 165 170 175 Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 180 185 190 Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 195 200 205 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 140 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 140 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 50 55 60 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 100 105 110 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 130 135 140 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 180 185 190 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 210 215 <210> 141 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 141 Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 50 55 60 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser His Leu Pro Ile Gln 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 100 105 110 Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln 115 120 125 Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn 130 135 140 Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp 180 185 190 Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu 195 200 205 Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 142 <211> 217 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 142 Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp 35 40 45 Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu 50 55 60 Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 100 105 110 Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln 115 120 125 Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe 130 135 140 Ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln 145 150 155 160 Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu 180 185 190 Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr 195 200 205 Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly 210 215 <210> 143 <211> 285 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu 1 5 10 15 Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro 20 25 30 Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu 35 40 45 Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val 50 55 60 Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg 65 70 75 80 Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu 100 105 110 Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn 115 120 125 Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln 130 135 140 Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys 145 150 155 160 Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser 165 170 175 Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr 180 185 190 Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met 195 200 205 Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu 210 215 220 Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly 245 250 255 Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu 260 265 270 Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 275 280 285 <210> 144 <211> 309 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 144 Met Asp Glu Ser Ala Lys Thr Leu Pro Pro Pro Cys Leu Cys Phe Cys 1 5 10 15 Ser Glu Lys Gly Glu Asp Met Lys Val Gly Tyr Asp Pro Ile Thr Pro 20 25 30 Gln Lys Glu Glu Gly Ala Trp Phe Gly Ile Cys Arg Asp Gly Arg Leu 35 40 45 Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Phe Thr Ala 50 55 60 Met Ser Leu Tyr Gln Leu Ala Ala Leu Gln Ala Asp Leu Met Asn Leu 65 70 75 80 Arg Met Glu Leu Gln Ser Tyr Arg Gly Ser Ala Thr Pro Ala Ala Ala 85 90 95 Gly Ala Pro Glu Leu Thr Ala Gly Val Lys Leu Leu Thr Pro Ala Ala 100 105 110 Pro Arg Pro His Asn Ser Ser Arg Gly His Arg Asn Arg Arg Ala Phe 115 120 125 Gln Gly Pro Glu Glu Thr Glu Gln Asp Val Asp Leu Ser Ala Pro Pro 130 135 140 Ala Pro Cys Leu Pro Gly Cys Arg His Ser Gln His Asp Asp Asn Gly 145 150 155 160 Met Asn Leu Arg Asn Ile Ile Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp 165 170 175 Ser Asp Thr Pro Thr Ile Arg Lys Gly Thr Tyr Thr Phe Val Pro Trp 180 185 190 Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys 195 200 205 Ile Val Val Arg Gln Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Ser Gln Val Leu 210 215 220 Tyr Thr Asp Pro Ile Phe Ala Met Gly His Val Ile Gln Arg Lys Lys 225 230 235 240 Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys 245 250 255 Ile Gln Asn Met Pro Lys Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala 260 265 270 Gly Ile Ala Arg Leu Glu Glu Gly Asp Glu Ile Gln Leu Ala Ile Pro 275 280 285 Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr Phe Phe Gly 290 295 300 Ala Leu Lys Leu Leu 305 <210> 145 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30 Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 45 Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu Val 85 90 95 Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser 100 105 110 Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp 115 120 125 Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala 130 135 140 Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser 145 150 155 160 Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr 165 170 175 Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln 180 <210> 146 <211> 185 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30 Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 45 Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Gly Leu Leu Phe 65 70 75 80 Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu 85 90 95 Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala 100 105 110 Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu 115 120 125 Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro 130 135 140 Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr 165 170 175 Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln Gln 180 185 <210> 147 <211> 175 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 147 Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser 1 5 10 15 Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val 20 25 30 Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His 35 40 45 Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser 50 55 60 Ala Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Val Gly Ala Pro Ala Leu Leu 65 70 75 80 Gly Leu Ile Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Ser 85 90 95 Trp Arg Trp Arg Gln Gln Leu Arg Thr Ala Ser Pro Asp Thr Ser Glu 100 105 110 Gly Val Gln Gln Glu Ser Leu Glu Asn Val Phe Val Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Thr Pro His Ala Ser Ala Pro Thr Trp Pro Pro Leu Lys Glu Asp Ala 130 135 140 Asp Ser Ala Leu Pro Arg His Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln 165 170 175 <210> 148 <211> 175 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 148 Met Gly Val Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Arg Arg Ser Arg Asp Ser 1 5 10 15 Pro Val Ser Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val 20 25 30 Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg His 35 40 45 Ala Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser 50 55 60 Gly Leu Arg Pro Asp Val Ala Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu 65 70 75 80 Gly Leu Val Leu Ala Leu Thr Leu Val Gly Leu Val Ser Leu Val Gly 85 90 95 Trp Arg Trp Arg Gln Gln Arg Arg Thr Ala Ser Leu Asp Thr Ser Glu 100 105 110 Gly Val Gln Gln Glu Ser Leu Glu Asn Val Phe Val Pro Pro Ser Glu 115 120 125 Thr Leu His Ala Ser Ala Pro Asn Trp Pro Pro Phe Lys Glu Asp Ala 130 135 140 Asp Asn Ile Leu Ser Cys His Ser Ile Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu Gln 165 170 175 <210> 149 <211> 183 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 149 Met Lys Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30 Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Ala Pro 35 40 45 Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Ser Val 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Ser Leu Pro Gly Leu Leu Phe 65 70 75 80 Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Ala Leu Val Leu 85 90 95 Val Gly Leu Val Ser Trp Arg Arg Arg Gln Arg Arg Leu Arg Gly Ala 100 105 110 Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp Lys Asp Lys Asp Glu Pro Leu 115 120 125 Asp Lys Val Ile Ile Leu Ser Pro Gly Ile Ser Asp Ala Ala Ala Pro 130 135 140 Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His 145 150 155 160 Ser Val Pro Val Pro Ala Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Val Thr 165 170 175 Thr Lys Thr Ala Gly Pro Glu 180 <210> 150 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 150 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 1 5 10 15 Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg 20 <210> 151 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Pro Cys Val Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Val Arg His Cys 20 25 30 Val Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro Ala Gly Ala 35 40 45 Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu 50 55 60 <210> 152 <211> 64 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 152 Met Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser 1 5 10 15 Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val 20 25 30 Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His 35 40 45 Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Ser 50 55 60 <210> 153 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 153 Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala Ser 1 5 10 15 Thr Gly Ala Arg Arg Leu Arg Val Arg Ser Gln Arg Ser Arg Asp Ser 20 25 30 Ser Val Pro Thr Gln Cys Asn Gln Thr Glu Cys Phe Asp Pro Leu Val 35 40 45 Arg Asn Cys Val Ser Cys Glu Leu Phe His Thr Pro Asp Thr Gly His 50 55 60 Thr Ser Ser Leu Glu Pro Gly Thr Ala Leu Gln Pro Gln Glu Gly Gln 65 70 75 80 Val Thr Gly Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro 85 90 95 Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 100 105 110 Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys 115 120 125 Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 130 135 140 Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu 145 150 155 160 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met 165 170 175 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser 180 185 190 Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 195 200 205 Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln 210 215 220 Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe 225 230 235 240 Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu 245 250 255 Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe 260 265 270 Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn 275 280 285 Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 290 295 300 Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 305 310 <210> 154 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 154 tcttgtgaca aaactcacag tggcggtggc tctggt 36 <210> 155 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 155 tattactgtc agcaacatta ataaaggcct taacctccca cgttcgga 48 <210> 156 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = a, c, g, t, unknown, or other <400> 156 acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtgtagcct ggtatcaaca gaaac 55 <210> 157 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n = a, c, g, t, unknown, or other <400> 157 acctgccgtg ccagtcagrd trktrvwanw thtctggcct ggtatcaaca gaaac 55 <210> 158 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 158 ccgaagcctc tgatttackb ggcatccavc ctctactctg gagtccct 48 <210> 159 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 159 ccgaagcttc tgatttackb ggcatccavc ctcgmatctg gagtcccttc tcgc 54 <210> 160 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = a, c, g, t, unknown, or other <400> 160 gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtcctykga cgttcggaca gggtacc 57 <210> 161 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = a, c, g, t, unknown, or other <400> 161 gcaacttatt actgtcagca atmtdmcrvt nhtccttwta cgttcggaca gggtacc 57 <210> 162 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = a, c, g, t, unknown, or other <400> 162 gcaacttatt actgtcagca asrtdmcrvt nhtcctykga cgttcggaca gggtacc 57 <210> 163 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n = a, c, g, t, unkown, or other <400> 163 gcaacttatt actgtcagca asrtdmcrvt nhtccttwta cgttcggaca gggtacc 57 <210> 164 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(33) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n = a, t, c, or g <400> 164 gcaacttatt actgtcagca annnnnnnnn nnnccgnnna cgttcggaca gggtacc 57 <210> 165 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = a, c, t, or g <220> <221> misc_feature <222> (25)..(42) <223> n = a, c, t, or g <400> 165 tgtgcagctt ctggcttcwc cnttnnnnnn nnnnnnnnnn nntgggtgcg tcaggcc 57 <210> 166 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(24) <223> n = a, c, t, or g <220> <221> misc_feature <222> (28)..(51) <223> n = a, c, t, or g <400> 166 aagggcctgg aatgggttgs tnnnatcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntatgccgat 60 agcgtcaag 69 <210> 167 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(27) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (31)..(48) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (52)..(60) <223> n = a, t, c, or g <400> 167 gccgtctatt attgtgctcg tnnnnnntgc nnnnnnnnnn nnnnnnnntg cnnnnnnnnn 60 atggactact ggggtcaag 79 <210> 168 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(60) <223> n = a, t, c, or g <400> 168 gccgtctatt attgtgctcg tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 atggactact ggggtcaag 79 <210> 169 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(27) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (31)..(45) <223> n = a, t, c, or g <400> 169 gccgtctatt attgtgctnn nnnnnnntgc nnnnnnnnnn nnnnnggctg cgcgggggca 60 atg 63 <210> 170 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(33) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (37)..(45) <223> n = a, t, c, or g <400> 170 gctcgtcggg tctgctacnn nnnnnnnnnn nnntgcnnnn nnnnnatgga ctactggggt 60 caa 63 <210> 171 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 171 gctcggttgc cgccgggcgt tttttatg 28 <210> 172 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(30) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n = a, t, c, or g <400> 172 acttattact gtcagcaann nnnnnnnnnn ccgnnnacgt tcggacaggg t 51 <210> 173 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(33) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n = a, t, c, or g <400> 173 acttattact gtcagcaann nnnnnnnnnn nnnccgnnna cgttcggaca gggt 54 <210> 174 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n = a, t, c, or g <400> 174 acttattact gtcagcaann knnknnkccg cccacgttcg gacagggt 48 <210> 175 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(33) <223> n = a, t, c, or g <400> 175 gcagcttctg gcttcwccat tnnnnnnnnn nnnatacact gggtgcgtc 49 <210> 176 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (22)..(24) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (28)..(33) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (37)..(39) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (43)..(45) <223> n = a, t, c, or g <400> 176 ctggaatggg ttgcttggrt tnnncctnnn nnnggtnnna ctnnntatgc cgatagcgtc 60 aag 63 <210> 177 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(24) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (28)..(45) <223> n = a, t, c, or g <400> 177 gtctattatt gtgctcgtnn nnnntgcnnn nnnnnnnnnn nnnnntgcgc tggtgggatg 60 <210> 178 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(24) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (28)..(36) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (49)..(57) <223> n = a, t, c, or g <400> 178 gtctattatt gtgctcgtnn nnnntgcnnn nnnnnncttg gtgtttgcnn nnnnnnnatg 60 gactactggg gtcaa 75 <210> 179 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(24) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (28)..(45) <223> n = a, t, c, or g <400> 179 gtctattatt gtgctcgtnn nnnnrstnnn nnnnnnnnnn nnnnnrstgs tgstgsgatg 60 gactactggg gt 72 <210> 180 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (19)..(21) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (25)..(42) <223> n = a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (46)..(54) <223> n = a, t, c, or g <400> 180 tattattgtg ctcgtcggnn nrstnnnnnn nnnnnnnnnn nnrstnnnnn nnnnatggac 60 tactggggtc 70 <210> 181 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 181 acctgccgtg ccagtsaaga mrttkccasc kctgtagcct ggtatcaaca gaaac 55 <210> 182 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 182 ccgaagcttc tgatttwckc cgcatcctwc ctctwctctg gagtcccttc tcgc 54 <210> 183 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 183 gcaacttatt actgtcagca skccsaartt kccccgscaa cgttcggaca gggtacc 57 <210> 184 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 184 gcagcttctg gcttcaccat tkcckcckcc kccatacact gggtgcgtca g 51 <210> 185 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 185 gcagcttctg gcttcaccat tagtkccagc kccatacact gggtgcgtca g 51 <210> 186 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 186 gcagcttctg gcttcaccat tkccagckcc tctatacact gggtgcgtca g 51 <210> 187 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 187 aagggcctgg aatgggttgc atkgrttmtc scakccrttg sttwcascga mtatgccgat 60 agcgtcaagg gc 72 <210> 188 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 188 aagggcctgg aatgggttgc ttggrttctt scatctrttg gttwcactga mtatgccgat 60 agcgtcaagg gc 72 <210> 189 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 189 aagggcctgg aatgggttgc ttkggttmtc cctkccgtgg sttttascga ctatgccgat 60 agcgtcaagg gc 72 <210> 190 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 190 actgccgtct attattgtgc aaraarartt tgctwcraca ramtcgstrt ttgckctgst 60 gstatggact actggggtca a 81 <210> 191 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 191 actgccgtct attattgtgc tcgtaragtc tgctwcaaca racttgstgt ttgckctggt 60 gstatggact actggggtca a 81 <210> 192 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 192 actgccgtct attattgtgc taracggrtt tgctacracc gcmtcggtrt ttgcgctgst 60 ggtatggact actggggtca a 81 <210> 193 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 193 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ala Ser Ser 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 194 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 194 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ala Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 195 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 195 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Ala Ser Phe Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 196 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 196 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 197 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 197 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 198 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 198 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 199 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 199 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ala Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 200 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 200 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 201 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 201 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 202 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 202 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 203 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 203 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Ala Ser Phe Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 204 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 204 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ala Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 205 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 205 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Glu Ile Ala Thr Ser 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 206 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 206 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 207 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 207 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gln Val Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 208 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 208 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 1 5 <210> 209 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 209 Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 1 5 <210> 210 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 210 Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe 1 5 <210> 211 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 211 Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu 1 5 <210> 212 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 212 Gln Val Arg Arg Ala Leu Asp Tyr 1 5 <210> 213 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 213 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly 20 <210> 214 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 214 Gly Phe Thr Val Thr Ala Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 215 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Gln or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = His, Ile, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Leu or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Asp or Glu <400> 215 Trp Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 216 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Gly, Asp, Ser, Ala, Val, Glu, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Leu, Ser, Trp, Pro, Phe, Ala, Val, Ile, Arg, Tyr, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Pro, Thr, Ala, Asn, Ser, Ile, Lys, Leu, or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Met, Arg, Val, Tyr, Gly, Glu, Ala, Thr, Leu, Trp, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ala, Ser, Thr, Gly, Ile, Arg, Pro, Asn, Asp, Tyr, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, Pro, or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Phe, His, Tyr, Arg, Ser, Val, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = Thr, Ile, Met, Phe, Trp, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa = Thr, Gly, Ser, or Ala <400> 216 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa 1 5 10 <210> 217 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Thr, Asn, or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Thr, Ser, Leu, Asn, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Leu, Asn, or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Pro, Phe, Tyr, Leu, or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Asp or Tyr <400> 217 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 218 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Asn, Thr, or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Ala, Ser, Thr, Leu, Asn, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Asn, His, or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Pro, Tyr, Phe, Asn, Thr, or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Tyr, Thr, or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ala or Glu <400> 218 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 219 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 219 Asn Ser Asn Phe Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 220 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Arg or His <400> 220 Arg Val Cys Tyr Asn Xaa Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 221 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 221 Arg Val Cys Tyr Asn Arg Leu Gly Val Cys Ala Gly Gly Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 222 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 222 Gly Phe Thr Ile Ser Ser Asn Ser Ile His 1 5 10 <210> 223 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 223 Ala Trp Ile Thr Pro Ser Asp Gly Asn Thr Asp 1 5 10 <210> 224 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 224 Gly Phe Thr Ile Ser Ser Ser Ser Ile His 1 5 10 <210> 225 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 225 Ala Trp Val Leu Pro Ser Val Gly Phe Thr Asp 1 5 10 <210> 226 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ile or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ser or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = Ala or Ser <400> 226 Arg Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Ala 1 5 10 <210> 227 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Tyr or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Ser, Ala, or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Asn, Phe, or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Phe or Tyr <400> 227 Xaa Xaa Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser 1 5 <210> 228 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Gln or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Gly, Leu, Arg, His, Tyr, Gln, or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Asn, Thr, Met, Ser, Ala, Ile, or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa =Thr or Ser <400> 228 Gln Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Pro Pro Thr 1 5 <210> 229 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 229 Arg Ala Ser Glu Asp Ile Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 230 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 230 Tyr Ala Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 231 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 231 Gln Gln Ser Gln Ile Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 232 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 232 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 233 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 233 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 234 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 234 Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 235 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 235 Thr Pro His Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 236 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 236 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala

Claims

인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고, 인간 효과기(effector) 세포의 존재하에 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 갖거나 또는 인간 야생형 IgG Fc를 포함하는 항체에 비해 인간 효과기 세포 존재하에서의 ADCC가 증가된 항체 또는 폴리펩티드.
인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고, 인간 야생형 IgG Fc를 포함하는 항체에 비해 인간 효과기 세포 존재하에서의 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)이 저하된 항체 또는 폴리펩티드.
인간 BR3 세포외 도메인과 결합하고, 생체내에서 B 세포를 사멸 또는 고갈시키는 항체 또는 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 상기 항체 또는 폴리펩티드로 처리하지 않은 음성 대조군 또는 기저 수준에 비해 생체내에서 B 세포를 20％ 이상 사멸 또는 고갈시키는 항체 또는 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 상기 항체 또는 폴리펩티드로 처리하지 않은 음성 대조군 또는 기저 수준에 비해 생체내에서 혈액 중의 B 세포를 25％ 이상, 30％ 이상, 40 ％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 또는 80％ 이상 사멸 또는 고갈시키는 항체 또는 폴리펩티드.
제4항 또는 제5항에 있어서, 인간 B 세포, 사이노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 B 세포 및 붉은털 (rhesus) 원숭이 B 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 영장류 B 세포를 고갈시킬 수 있는 항체 또는 폴리펩티드.
인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고, 야생형 또는 천연 서열 IgG Fc를 갖는 항체에 비해 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 혈청 알부민, 혈청 알부민 결합 폴리펩티드 또는 비-단백질 중합체에 접합된 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 IgG Fc 영역과 비교해서 변경된 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드.
제7항에 있어서, 야생형 IgG Fc 영역을 포함하는 항체에 비해 pH 6.0에서 인간 Fc 신생아 수용체 (FcRn)에 대한 친화성이 더 높은 변경된 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드.
잔기 L38 및 R39를 포함하는, 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 인간화 또는 인간 항체.
잔기 G36을 포함하는, 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 인간화 또는 인간 항체.
잔기 L28 및 V29를 포함하는, 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 항체.
잔기 P21 및 A22를 포함하는, 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 항체.
잔기 F25, V33, A34를 포함하고 임의로 잔기 R30을 추가로 포함하는, 인간 BR3 상의 기능적 에피토프를 갖는 인간화 또는 인간 항체.
500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하의 겉보기 Kd 값으로 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고 마우스 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃에서의 BIAcore 검정시에 Fab로서 100 μM 이하, 1 μM 이하, 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하의 겉보기 Kd 값으로 인간 BR3 세포외 도메인 서열 과 결합하는 항체 또는 폴리펩티드.
표 2의 항체 중 하나로부터 유래되고, 25℃에서의 BIAcore 검정시에 Fab로서 100 μM 이하, 1 μM 이하, 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하의 겉보기 Kd 값으로 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 항체 또는 폴리펩티드.
인간 BR3 세포외 서열과 결합하고, 표 2의 항체 중 하나의 H1, H2 및 H3 영역 각각과의 상동성이 70％ 이상인 H1, H2 및 H3 영역을 갖는 인간화 또는 인간 항체.
인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고, 표 2의 항체 중 하나의 L1, L2 및 L3 영역 각각과의 상동성이 70％ 이상인 L1, L2 및 L3 영역을 갖는 인간화 또는 인간 항체.
인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고, 표 2의 항체 중 하나의 VH 도메인과의 상동성이 70％ 이상인 인간 또는 인간화 항체.
인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하고, 서열 4-13, 15, 16-18, 20, 22, 24, 26, 28-73, 75-76, 78, 80-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 116, 118, 120, 122, 124-127 및 129-131 중 하나의 H3 서열을 포함하는 인간 또는 인간화 항체.
제22항에 있어서, 표 2에 기재된 항체 중 하나로부터의 H1, H2 및 H3 서열을 추가로 포함하는 항체.
제23항에 있어서, 표 2에 기재된 항체 중 하나로부터의 L1, L2 및 L3 서열을 추가로 포함하는 항체.
(1) QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3), 및

(2) RDTSKNTF (서열 210)를 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)

을 포함하는 항-BR3 항체.
제25항에 있어서, H1 초가변 영역 (HVR1)에 잔기 GFTVTAYYMS (서열 214)를 추가로 포함하고, H2 초가변 영역 (HVR2)에 잔기 GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (서열 213)를 추가로 포함하는 항-BR3 항체.
제25항에 있어서, 서열 6-9, 16-18, 35-36, 75-76 및 81-85 중 하나의 항체 서열에서 카바트 (Kabat) 넘버링에 따라 번호를 매긴 잔기 26-35를 포함하는 HVR1 및 잔기 49-65를 포함하는 HVR2를 추가로 포함하는 항-BR3 항체.
(1) QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3), 및

(2) RDTSKNTL (서열 211)을 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)

을 포함하는 항-BR3 항체.
제28항에 있어서, 서열 5, 11-13 및 37-73의 항체 서열 중 하나의 잔기 26-35 및 49-65 (카바트 넘버링)를 추가로 포함하는 항-BR3 항체.
(1) QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3), 및

(2) W-A-X3-X4-X5-X6-S (서열 215) (여기서, X3은 Q 또는 S이고, X4는 H 또는 I이며, X5는 L 또는 R이고, X6은 D 또는 E임)를 포함하는 L1 초가변 영역 (LVR1)

을 포함하는 항-BR3 항체.
(1) QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3), 및

(2) X1-X2-P-X4-X5-G-X7-Y-X9-S (서열 216) (여기서, X1은 G 또는 D이고, X2는 L 또는 S이며, X4는 M, R 또는 V이고, X5는 A 또는 S이며, X7은 F, H 또는 Y이고, X9는 T 또는 I임)를 포함하는 H1 초가변 영역 (HVR1)

을 포함하는 항-BR3 항체.
(1) QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3 초가변 영역 (HVR3),

(2) 서열 215의 서열을 포함하는 LVR1, 및

(3) 서열 216의 서열을 포함하는 HVR1

을 포함하는 BR3 결합 항체.
(1) 서열 X1-X2-X3-X4-X5-G-A-M-D-Y (서열 217) (여기서, X1은 T, N 또는 R이고, X2는 T, S, L, N 또는 P이며, X3은 L 또는 N이고, X4는 P, F, L, Y 또는 N이며, X5는 D 또는 Y임)를 포함하는 HVR3, 및

(2) RDTSKNTF (서열 210)를 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)

을 포함하는 항-BR3 항체.
제33항에 있어서, HVR3이 서열 6-9 및 16-18 중 하나의 항체의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함하는 것인 항-BR3 항체.
(1) 서열 X1-X2-X3-X4-X5-G-X7-M-D-Y (서열 218) (여기서, X1은 T 또는 N이고, X2는 A, T 또는 S이며, X3은 N, H 또는 L이고, X4는 P, F, Y 또는 N이며, X5는 T 또는 Y이고, X7은 A 또는 E임)를 포함하는 HVR3, 및

(2) RDTSKNTL (서열 211)을 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)

을 포함하는 항-BR3 항체.
제35항에 있어서, HVR3이 서열 5 및 10-13 중 하나의 항체의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함하는 것인 항-BR3 항체.
서열 7-13 및 16-18 중 하나의 항체 서열의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함하는 HVR3을 포함하는 BR3 결합 항체.
(1) 서열 81-83 중 하나의 항체 서열의 잔기 94-102 (카바트 넘버링)를 포함하는 HVR3, 및

(2) RDTSKNTF (서열 210)를 포함하는 중쇄 프레임워크 3 영역 (HC-FR3)

을 포함하는 항-BR3 항체.
RVCYN-X6-LGVCAGGMDY (서열 220) (여기서, X6은 R 또는 H임)를 포함하는 HVR3을 포함하는 항-BR3 항체.
제39항에 있어서, 서열 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 및 194-207 중 하나의 항체 서열의 잔기 24-34, 49-55 및 89-97 (카바트 넘버링) 각각을 포함하는 LVR1, LVR2 및 LVR3을 추가로 포함하는 항-BR3 항체.
서열 7-13, 16-18, 24, 26-73, 75-76, 78, 80-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124-127, 129 및 193 중 하나의 항체 서열의 잔기 26-35, 49-65 및 94-102 (카바트 넘버링)를 각각 포함하는 H1, H2 및 H3을 포함하는 항-BR3 항체.
잔기 QVRRALDY (서열 212)를 포함하는 H3, 잔기 GFTVTAYYMS (서열 214)를 포함하는 H1, 및 잔기 GFIRDKANGYTTEYNPSVKG (서열 213)를 포함하는 H2를 포함하는 인간화 항-BR3 항체.
잔기 RVCYNRLGVCAGGMDY (서열 221)를 포함하는 H3, 잔기 SGFTISSNSIH (서열 222)를 포함하는 H1, 및 잔기 AWITPSDGNTD (서열 223)를 포함하는 H2를 포함하는 항-BR3 항체.
RVCYNRLGVCAGGMDY (서열 221)를 포함하는 H3, 잔기 SGFTISSSSIH (서열 224)를 포함하는 H1, 및 AWVLPSVGFTD (서열 223)를 포함하는 H2를 포함하는 항-BR3 항체.
3.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6622)로서 기탁된 하이브리도마 또는 12B12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6624)로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체가 인간 BR3의 세포외 도메인과 결합하는 것을 경쟁적으로 억제할 수 있는 BR3 결합 항체.
제45항에 있어서, 3.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6622)로서 기탁된 하이브리도마 또는 12B12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6624)로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 가변 영역 서열을 포함하는 항-BR3 항체.
제45항에 있어서, 3.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6622)로서 기탁된 하이브리도마 또는 12B12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6624)로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 초가변 영역 서열을 포함하는 항-BR3 항체.
제45항에 있어서, 3.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6622)로서 기탁된 하이브리도마 또는 12B12.1 (ATCC 기탁 번호 PTA-6624)로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 인간화 형태인 항-BR3 항체.
서열 13, 15, 16-18, 22, 24, 26, 28-73, 75-76, 78, 80-85, 87-96, 98, 100, 102, 104, 106, 107, 109-110, 112, 116, 118, 120, 122, 124-127 및 129-131 중 하나의 V_H 서열을 포함하는 항체.
서열 3, 14, 21, 23, 25, 27, 74, 77, 79, 86, 97, 99, 101, 103, 105, 108, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123 및 128 중 하나의 V_L 서열을 포함하는 항체.
제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃에서의 BIAcore 검정시에 Fab로서 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 1 nM 이하의 겉보기 Kd 값으로 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 항체.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 25℃에서의 BIAcore 검정시에 Fab로서 500 nM 내지 0.001 pM의 겉보기 Kd 값으로 인간 BR3 세포외 도메인 서열과 결합하는 항체.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG의 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 및 제3항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 또는 인간 IgG3의 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이뮤노어드헤신(immunoadhesin).
제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG4의 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드.
제1항, 제3항 내지 제21항, 제25항 내지 제44항 및 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 상에서 천연 BR3 폴리펩티드에 대한 BAFF의 결합을 억제하는 항체 또는 폴리펩티드.
제1항, 제3항 내지 제21항 및 제25항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포 증식 및 B 세포 생존을 억제하는 항체 또는 폴리펩티드.
제1항, 제7항 내지 제21항 및 제25항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 B 세포를 사멸 또는 고갈시키는 항체 또는 폴리펩티드.
제3항 내지 제21항 및 제25항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 효과기 세포의 존재하에 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)을 갖거나 또는 인간 야생형 IgG1 Fc를 포함하는 항-BR3 항체에 비해 인간 효과기 세포 존재하에서의 ADCC가 증가된 항체 또는 폴리펩티드.
제3항 내지 제21항 및 제25항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 야생형 IgG1 Fc를 포함하는 항-BR3 항체에 비해 인간 효과기 세포 존재하에서의 항체-의존성 세포형 세포독성 (ADCC)이 저하된 항체 또는 폴리펩티드.
B 세포 증식 및 B 세포 생존을 자극하는 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드.
제61항에 있어서, ADCC 효과기 기능을 갖지 않는 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드.
제61항에 있어서, 인간 IgG의 Fc 영역을 포함하는 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드.
제63항에 있어서, Fc 영역이 D265A 및 N297A 돌연변이 (EU 넘버링 시스템)를 갖는 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드.
제2항에 있어서, Fc 영역이 D265A 및 N297A 돌연변이 (EU 넘버링 시스템)를 갖는 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역의 238, 239, 246, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 314, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 434, 435, 437, 438 및 439로 이루어진 군에서 선택된 위치 중 하나 또는 이들 위치의 임의의 조합 (이러한 Fc 영역 내의 잔기 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따름)에서의 아미노산이 치환되어, 야생형 IgG Fc 서열과 비교해서 ADCC, 보체-의존성 세포독성 (CDC), 및/또는 약동학적 특성이 변화되도록 변경된 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드.
제66항에 있어서, 치환이 N434A, N434Y, N434F, N434H로 이루어진 군에서 선택된 항체 또는 폴리펩티드.
제66항에 있어서, Fc 영역이 서열 134 (여기서, X는 A, W, H, Y 및 F로 이루어진 군에서 선택된 임의의 아미노산임)인 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 및 제3항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, K246H, H268D, E283L, S324G, S239D 및 I332E의 치환 중 하나 이상 또는 이들 치환의 임의의 조합을 포함하는 인간 IgG의 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이뮤노어드헤신인 폴리펩티드.
제1항 및 제3항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, S298A, K326A, E333A 및 K334A의 치환 중 하나 이상 또는 이들 치환의 임의의 조합을 포함하는 인간 IgG의 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이뮤노어드헤신인 폴리펩티드.
제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제 또는 화학요법제에 접합된 항체 또는 폴리펩티드.
제71항에 있어서, 세포독성제가 방사성 동위원소 또는 독소인 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, CHO 세포에서 생성된 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', F(ab)'₂, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 디아보디 (diabody) 및 선형 항체로 이루어진 군에서 선택된 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 다중-특이적 항체인 항체 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터.
제79항의 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제81항에 있어서, 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 또는 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포.
제82항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
제81항의 세포를 배양하는 단계, 및

상기 세포 배양물로부터 상기 항체 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계

를 포함하는, 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 또는 폴리펩티드의 생성 방법.
제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물.
제85항에 있어서, 세포독성제, 화학요법제, 생물학적 반응 조정제, 면역억제제 및 항-CD20 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부가 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
용기, 및

제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체를 포함하며 상기 용기 내에 함유된 조성물

을 포함하는 용품.
제87항에 있어서, 상기 조성물이 질환 치료에 사용될 수 있음을 표시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 용품.
제88항에 있어서, 질환이 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 비호지킨 림프종, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 확산성 대형 B 세포 림프종, 소포형 림프종 및 다발성 골수종으로 이루어진 군에서 선택된 것인 용품.
BR3 양성 암을 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, BR3 양성 암의 치료 방법.
제90항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 제1항 내지 제18항, 제22항 내지 제52항 및 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 및 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드, 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 임의의 길항제 BR3 결합 항체, 또는 표 2의 길항제 BR3 결합 항체인 방법.
B 세포 신생물 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, B 세포 신생물의 치료 방법.
제92항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 제1항 내지 제18항, 제25항 내지 제52항 및 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 및 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드, 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 임의의 길항제 BR3 결합 항체, 또는 표 2의 길항제 BR3 결합 항체인 방법.
자가면역 질환을 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 BR3 결합 항체를 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법.
제68항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 제1항 내지 제18항, 제25항 내지 제52항 및 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 및 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드, 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 임의의 길항제 BR3 결합 항체, 또는 표 2의 길항제 BR3 결합 항체인 방법.
암을 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 BR3 결합 항체를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
제96항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 제1항 내지 제18항, 제25항 내지 제52항 및 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 및 이뮤노어드헤신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 BR3 결합 항체 또는 이뮤노어드헤신, 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 임의의 길항제 BR3 결합 항체, 또는 표 2의 길항제 BR3 결합 항체인 방법.
세포 혼합 집단을, B 세포수 감소 유효량의 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 혼합 집단으로부터의 B 세포 고갈 방법.
제72항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 제1항 내지 제18항, 제25항 내지 제52항 및 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체 및 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드, 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 임의의 길항제 BR3 결합 항체, 또는 표 2의 길항제 BR3 결합 항체인 방법.
세포 혼합 집단을, 인간 효과기 세포의 존재하에서 ADCC 효과기 기능을 갖거나 또는 ADCC 효과기 기능이 증가된, B 세포수 감소 유효량의 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 혼합 집단으로부터의 B 세포 고갈 방법.
세포 혼합 집단을, 인간 효과기 세포의 존재하에서 ADCC 효과기 기능을 갖거나 또는 효과기 기능이 증가되고 세포 표면 상에서 BR3에 대한 BAFF 결합을 차단시키는, B 세포수 감소 유효량의 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 혼합 집단으로부터의 B 세포 고갈 방법.
제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 유효량의 항-CD20 항체를 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드와 순차적으로 또는 동시에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합 집단을, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드와 순차적으로 또는 동시에 항-CD20 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드의 ADCC 효과기 기능이 변경된 것인 방법.
제101항 또는 제102항에 있어서, 항-BR3 항체가 세포 표면 상에서 BR3에 대한 BAFF 결합을 차단시키는 것인 방법.
제101항 또는 제102항에 있어서, CD20 결합 항체가 리툭산^® (Rituxan^®) 항체인 방법.
제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, BAFF 길항제, 생물학적 반응 조정제, B 세포 고갈제, 세포독성제, 화학요법제 및 면역억제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 치료 유효량을 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, BAFF 길항제, 생물학적 반응 조정제, B 세포 고갈제, 세포독성제, 화학요법제 및 면역억제제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 치료 유효량을 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제107항 또는 제108항에 있어서, BAFF 길항제가 BR3-Fc, TACI-Fc, BCMA-Fc, 항-BAFF 펩티보디 (peptibody), 항-BAFF 항체 및 항-BR3 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제90항 또는 제92항에 있어서, 암이 비호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨병 (LPHD), 소포형 림프종, 다발성 골수종, ALL, CLL 및 확산성 대형 B 세포 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제90항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 9.1 항체 또는 V3-1 항체로부터 유래된 것인 방법.
제90항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 9.1 RF (서열 35)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
제90항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 V3-46s RF (서열 127) 의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
제92항에 있어서, 암이 비호지킨 림프종 (NHL)이고, 화학요법제가 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제94항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 유년형 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신병증, IgM 다발신경병증, 중증 근무력증, 혈관염, 진성 당뇨병, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제115항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염인 방법.
제108항에 있어서, 면역억제제가 메토트렉세이트인 방법.
제90항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 폴리펩티드가 세포독성제 또는 화학요법제에 접합된 것인 방법.
제119항에 있어서, 세포독성제가 방사성 동위원소 또는 독소인 방법.
제90항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 BR3 결합 항체의 결합 친화성이, 야생형 IgG Fc를 갖는 항체에 비해 증가된 것인 방법.
면역결핍증을 앓고 있는 환자에게 치료 유효량의 작동제 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 면역결핍증의 치료 방법.
제90항 내지 제101항 및 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 폴리펩티드가 2.1 항체로부터 유래된 것인 방법.
제121항에 있어서, 항체가 2.1-46의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
제121항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 서열 133 및 135-142 중 하나의 IgG Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
제121항에 있어서, BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 434 (EU 넘버링 시스템)에서 N434A, N434F, N434Y 및 N434H로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환을 수반하는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
제125항에 있어서, 인간 IgG1 Fc 영역이 서열 134 (여기서, X는 A, W, F, Y 또는 H임)인 방법.
제121항에 있어서, 작동제 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드가 천연 인간 IgG 야생형 Fc에 비해 ADCC 활성이 저하된 것인 방법.
제121항에 있어서, 항체 또는 폴리펩티드가 D265A/N297A 치환 (EU 넘버링 시스템)을 수반하는 인간 IgG1 Fc 서열을 포함하는 것인 방법.
제121항에 있어서, 작동제 BR3 결합 항체가 Hu2.1-46 또는 Hu2.1-46.DANA인 방법.
제90항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, BR3 결합 항체가 모노클로날 항체인 방법.
제90항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, BR3 결합 항체가 인간화 항체인 방법.
제90항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, BR3 결합 항체가 인간 항체인 방법.
제90항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, BR3 결합 항체가 Fab, Fab', F(ab)'₂, 단일쇄 Fv (scFv), Fv 단편, 디아보디 및 선형 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
제90항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 다중-특이적 항체인 방법.
제90항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, BR3 결합 항체가 혈청 알부민 결합 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 항체를 BR3과 접촉시키는 단계, 및

상기 항체를 회수하는 단계

를 포함하는, BR3의 단리 방법.
히스티딘 완충제 중 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 BR3 항체를 포함하는 액상 제제.
제137항에 있어서, 완충제가 히스티딘 아세테이트 완충제인 액상 제제.
(a) B 세포를 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 BR3 작동제 항체로 자극시키는 단계,

(b) 후보 화합물을 투여하는 단계, 및

(c) 세포 증식을 검출하는 단계

를 포함하는, B 세포 증식 억제제의 스크리닝 방법.
(a) B 세포를 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 BR3 작동제 항체로 자극시키는 단계, 및

(b) 세포 중 유전자 발현에 있어서의 변경을 검출하는 단계

를 포함하는, BR3 경로 하류 마커의 확인 및 모니터링 방법.
(a) 시험 대상체로부터의 생물학적 샘플을, 본 발명의 BR3 결합 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계,

(b) 상기 생물학적 샘플 중에서 BR3 폴리펩티드의 수준을 검정하는 단계, 및

(c) 상기 생물학적 샘플 중 BR3 폴리펩티드의 수준을 BR3 단백질의 표준 수준과 비교하는 단계

를 포함하고, 이때 BR3 단백질의 표준 수준에 비해 BR3 단백질이 존재하거나 BR3 단백질의 수준이 증가한 것이 BR3 결합 요법으로 치료될 자가면역 질환 또는 암의 존재에 대한 지표인, 자가면역 질환 또는 암의 진단 방법.
시험 샘플 또는 대상체 중에서 본 발명의 항-BR3 항체 또는 폴리펩티드를 결합시키는 단계, 및

상기 결합된 항체 또는 폴리펩티드를 대조군 항체 또는 폴리펩티드와 비교하는 단계

를 포함하는, BR3 폴리펩티드의 검출 방법.
제142항에 있어서, 항체 또는 폴리펩티드가 FACS 분석, 면역조직화학 검정 (IHC) 및 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)으로 이루어진 군에서 선택된 검정에 사용되는 것인 방법.