RS61883B1

RS61883B1 - Varijante antitela

Info

Publication number: RS61883B1
Application number: RS20210628A
Authority: RS
Inventors: Esther Furrer
Original assignee: Tillotts Pharma Ag
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2021-06-30
Also published as: SMT202100313T1; CN111094344A; CN118146386A; SI3456736T1; US11472872B2; CY1124244T1; US20200277367A1; KR102755345B1; WO2019057567A1; JP7674434B2; US20230295288A1; PT3456736T; DK3456736T3; KR20200052305A; EP3684809A1; EP3456736A1; PL3456736T3; EP3456736B1; HUE054261T2; JP2020533996A

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na modifikovana antitela koja imaju unapređenu rezistentnost prema proteolitičkoj degradaciji i izmenjene efektorske funkcije i/ili farmakokinetička svojstva. Antitela su korisna u terapeutskom tretmanu različitih poremećaja, posebno inflamatornih stanja. STANJE TEHNIKE

[0002] Monoklonska antitela su dobila rastući značaj kao terapeutski reagensi u kliničkoj medicini tokom poslednjih 20 godina. Tokom mnogih godina, napori da se unaprede antitela su usmereni na smanjenje njihove potencijalne imunogenosti, dovodeći do humanizovanih ili čak potpuno humanih antitela. Drugi pristup ima za cilj da optimizuje antitela unapređivanjem njihovih efektorskih funkcija. Dok su direktni efekti posredovani sa varijabilnim regionom antitela za vezivanje antigena, indirektni efekti su posredovani sa konstantnim Fc regionom. Napori da bi se poboljšale efektorske funkcije se uglavnom koncentrišu na modulaciju Fc regiona. Dodatno, unapređenje polu-života u serumu terapeutskih antitela je poželjno, što može da smanji količinu željenih antitela, i može da poveća njihovu pogodnost za pacijente produžavanjem intervala lečenja.

[0003] Za terapeutske primene, imunoglobulin G (IgG) je poželjna klasa izbora iz nekoliko razloga; IgG-e je lako prečistiti, relativno su stabilni za skladištenje, mogu da se daju intravenozno, imaju produžen biološki polu-život in vivo i sposobni da učestvuju u širokom opegu bioloških efektorskih funkcija kao što je aktivacija citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC) i regrutovanje efektorskih ćelija preko različitih interakcija Fc-receptora (ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela; ADCC). Od pet klasa imunoglobulina, IgG ispoljava najduži biološki polu-život zbog njegove jedinstvene interakcije sa receptorom za reciklovanje IgG, neonatalnim Fc receptorom (FcRn). Jedna od poznatih funkcija receptora je da se IgG zaštiti od katalitičke degradacije. Razvijena kokristalna struktura FcRn-Fc je pokazala da se interakcija sa Fc dešava u IgG regionu zglob-CH2-CH3. Ova interakcija se dešava u strogom pH-definisanom načinu na kiseloj pH od 6.0-6.5 u endozomima. Vezani molekuli IgG se recikluju nazad do ćelijske površine gde su oslobođeni na fiziološkoj pH od 7.4 u krvotok, pri čemu molekuli IgG koji se ne nalaze u kompleksu su osuđeni na degradaciju u lizozomima. Ovo recikliranje je mehanizam za produžni polu-život IgG; modulacija interakcije FcRn-IgG će prema tome omogućiti specifičnu kontrolu polu-života gama imunoglobulina u serumu i Fc-kombinovanih proteina.

[0004] U zavisnosti od primene može biti poželjno da se poveća ili smanji vreme boravka IgG u serumu. Za terapeutsku primenu poželjan je duži polu-život kako će biti potrebne manje doze i manje injekcija. Nekoliko pristupa za povećanje poli-života je ispitivano uključujući upotrebu polietilen glikola (PEG), dobijanje albumina- ili Fc-kombinovanih proteina i ojačanja interakcije FcRn-IgG. PEGilovani farmaceutici su bili u kliničkoj upotrebi od 1990 i PEGilovanje je uspostavljena tehologija za produženje rezistantnosti leka u krvi. S obzirom da se humani albumi iz seruma (HSA) takođe reciklira sa FcRn preko pH-zavisne interakcije, nekoliko proteina spojenih sa albuminom da se pojača stabilnost i poluživot su takođe bili proizvedeni. Dodatno, fragmenti antitela kombinovani sa albuminom ili albuminvezujućim domenima su pokazali produženo vreme rezistencije u serumu u prekliničkim ispitivanjima. Dobijanje Fc-kombinovanih proteina je druga strategija koja će obezbediti proteine ili peptide sa svojstvima sličnim sa intaktnim antitelima.

[0005] Modifikacije Fc regiona koje su bile ispitivane su date pregledom u Saxena (2016) Frontiers in Immunology, Vol. 7, Article 580. Različite Fc mutacije su dalje opisane u WO 1998/023289 A1, WO 2000/042072 A2, WO 2010/106180 A2 i WO 2014/108198 A1.

[0006] WO 2012/087746 A1 i Kinder et al. (2013) The Journal Of Biological Chemistry Vol.288, No.43, pp. 30843-30854 su ispitivali različite mutacije u Fc regionu anitela za unapređenje rezistencije prema proteolitičkoj degradaciji.

[0007] Biancheri et al. (2015) Gastroenterology, 149, pp. 1564-1574 se odnosi na proteoliičku degradaciju TNF-neutralizujućih antitela sa određenim proteazama in vivo.

[0008] Rajpal et al. (2014) "Therapeutic Fc-Fusion Proteins", Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany, pp.1-44 prikazuje nekoliko mutacija u Fc regionu za povećanje polu-života antitela.

[0009] Postoji potreba za antitelima sa unapređenim efektorskim funkcijama, farmakokineticima i/ili rezistenciji prema proteolitičkoj degradaciji.

SUŠTINA PRONALASKA

[0010] Pronalazači su u ovoj prijavi pronašli da kombinacija specifičnih mutacija u Fc regionu antitela omogućava poželjna svojstva antitelu, uključujući unapređenu otpornost prema proteoličkoj degradaciji i povećanim afinitetom za FcRn na pH6. Antitela koja imaju mutacije imaju unapređena farmakokinetička svojstva. Dodato, antitela ispoljavaju superiorne efektorske funkcije u poređenju sa nemodifikovanim antitelima i/ili poznatim antitelima kao što je infliksimab (IFX).

[0011] Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na predmet koji je definisan sledećim stavkama [1] do [88]:

[1] IgG1 antitelo koje se sastoji iz domena za vezivanje TNFa i FcRn vezujućeg mesta, gde aminokiselinska sekvenca antitela obuhvata

(i) aminokiseline 233P, 234V, 235A, i deleciju na položaju aminokiseline 236;

(ii) aminokiselinu 434A ili aminokiseline 252Y, 254T i 256E; i

(iii) aminokiseline 239D, 330L i 332E

u Fc regionu humanog IgG; i pri čemu antitelo obuhvata (i) VLdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID N0:10, i (ii) VHdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:9.

[2] Antitelo prema stavci [1], gde je antitelo modifikovano antitelo koje ima supstitucije E233P, L234V i L235A i deleciju G236.

[3] Antitelo prema stavci [2], u kome antitelo dalje ima supstituciju N434A.

[4] Antitelo prema stavci [2], gde antitelo dalje ima supstitucije M252Y, S254T i T256E.

[5] Antitelo prema stavci [1], gde je antitelo modifikovano antitelo koje ima supstitucije S239D, A330L i I332E.

[6] Antitelo prema stavci [1], gde aminokiselinska sekvenca antitela se sastoji iz aminokiselina 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E i 434A, i delecije aminokiseline na poziciji 236.

[7] Antitelo prema stavci [6], gde je antitelo modifikovano antitelo koje ima supstitucije E233P, L234V, L235A, S239D, A330L, 1332E i N434A, i deleciju G236.

[8] Antitelo prema stavci [6] ili [7], koje se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO:29.

[9] Antitelo prema stavci [1], gde aminokiselinska sekvenca antitela se sastoji iz aminokiselina 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E, 252Y, 254T i 256E, i delecije na poziciji aminokiseline 236.

[10] Antitelo prema stavci [9], gde je antitelo modifikovano antitelo koje ima supstitucije E233P, L234V, L235A, S239D, A330L, I332E, M252Y, S254T i T256E, i deleciju G236.

[11] Antitelo prema stavci [9] ili [10], koje se sastoji iz aminokiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO:28.

[12] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima afinitet prema humanom FcRn na pH 6 koji je veći od onog za infliksimab.

[13] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima afinitet prema humanom FcRn na pH 6 koji je karakterisan sa konstantom disocijacije KDmanjom od 500 nM.

[14] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima afinitet prema humanom FcRn na pH 6 koji je karakterisan sa konstantom disocijacije KDmanjom od 400 nM.

[15] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima afinitet prema humanom FcRn na pH 6 koji je karakterisan sa konstantom disocijacije KDmanjom od 300 nM.

[16] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima afinitet prema humanom FcRn na pH 6 koji je karakterisan sa konstantom disocijacije KDmanjom od 200 nM.

[17] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima afinitet prema humanom FcRn na pH 6 koji je karakterisan sa konstantom disocijacije KDu opsegu od 5 nM do 500 nM, ili od 10 nM do 400 nM, ili od 25 nM do 300 nM, ili od 50 nM do 200 nM, ili od 75 nM do 175 nM.

[18] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu pomenuta KDkarakteriše afinitet prema humanom FcRn na pH 6 je određena površinskom plazmonskom rezonancijom (SPR).

[19] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima afinitet prema humanom FcRn na pH 7.4 koji je karakterisan sa konstantom disocijacije KDvećom od 10 µM.

[20] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu pomenuta KDarakteriše afinitet prema humanom FcRn na pH 7.4 je određena površinskom plazmonskom rezonancom (SPR).

[21] Antitelo prema bilo kojoj od stavki [1] do [18], gde je njegov afinitet prema humanom FcRn na pH 7.4 tako nizak da KDvrednost ne može da bude određena sa SPR.

[22] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za humani TNFα sa KDmanjom od 200 pM.

[23] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za humani TNFα sa KDmanjom od 100 pM.

[24] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za humani TNFα sa KDmanjom od 50 pM.

[25] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za humani TNFα sa KDmanjom od 25 pM.

[26] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za humani TNFα sa KDmanjom od 10 pM.

[27] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je transportovano kroz polarizovan ćelijski monosloj sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani.

[28] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je transportovano kroz polarizovan ćelijski monosloj sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani u većoj količini u odnosu na kontrolno antitelo koji se sastoji iz lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:1 i težak lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljeno u SEQ ID NO:2.

[29] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je transportovano kroz polarizovani ćelijski monosloj sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani u većoj količini od infliksimaba.

[30] Antitelo prema stavki [28] ili [29], gde se pomenuta količina odnosi na masu antitela transportovanog kroz polarizovan ćelijski monosloj tokom četiri sata.

[31] Antitelo prema bilo kojoj od stavki [27] do [30], gde količina antitela transportovanog kroz polarizovani ćelijski monosloj je veća od dva puta količine matičnog imunoglobulina transportovanog kroz polarizovani ćelijski monosloj, pri čemu se matični imunoglobulin razlikuje od pomenutog antitela samo u tome što njegov Fc region ima aminokiseline samo divljeg tipa.

[32] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde veći procenat antitela u odnosu na infliksimab je transportovan kroz polarizovani ćelijski monosloj sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani u prisutvu desetostrukog viška imunoglobulina u kompeticiji, gde se procenat odnosi na ukupnu masu imunoglobulina transportovanih kroz polarizovani ćelijski monosloj.

[33] Antitelo prema stavki [32], gde procenat antitela transportovanog kroz polarizovani ćelijski monosloj je veći od dva puta procenta matičnog imunoglobulina transportovanog kroz polarizovani ćelijki monosloj, gde se pomenuti matični imunoglobulin razlikuje od pomenutog antitela samo u tome što njegov Fc region ima aminokiseline samo divljeg tipa.

[34] Antitelo prema bilo kojoj od stavki [27] do [33], gde je pomenuti polarizovani ćelijski monosloj monosloj polarizovanih T84 ćelija.

[35] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za CD16a(V) sa KDmanjom od 500 nM, ili manjom od 300 nM, ili manjom od 200 nM, ili manjom od 100 nM.

[36] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za CD16a(F) sa KDmanjom od 10 µM, ili manjom od 1 µM.

[37] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za CD16b(NA2) sa KDmanjom od 10 µM, ili manjom od 5 µM, ili manjom od 1 µM.

[38] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje ima ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).

[39] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno za indukovanje CD14+CD206+ makrofaga.

[40] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno za indukovanje CD14 CD206 makrofaga na nivou jednakom sa ili većem od infliksimaba.

[41] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno za suprimiranje T-ćelijske proliferacije.

[42] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno za suprimiranje T-ćelijske proliferacije na stepenui jednakom sa ili većem od onog za infliksimab.

[43] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je ne-fukozilovano antitelo ili antitelo sa smanjenom fukozilacijom.

[44] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se sastoji iz VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:9 i VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:10.

[45] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se sastoji iz lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:1 i teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:11, SEQ ID 12, ili SEQ ID NO:13.

[46] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde se pomenuto antitelo vezuje za humani TNFa.

[47] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde se pomenuto antitelo ne vezuje značajno za TNFβ.

[48] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde se pomenuto antitelo

(i) vezuje za humani TNFα sa konstantnom disocijacije (KD) manjom od 125 pM;

(ii) ima unakrsnu reaktivnost sa Macaca mulatta TNFα i sa Macaca fascicularis TNFα;

(iii) ima veću potenciju od infliksimaba, kao što je određeno sa L929 testom; i/ili

(iv) je sposobno za vezivanje sa TNFαTrimeru stehiometriji (antitelo : TNFαTrimer) od najmanje 2.

[49] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za TNFα iz Macaca mulatta sa KDof koja je manja od 1 nM.

[50] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje se vezuje za TNFα iz Macaca fascicularis sa KDkoja je manja od 1 nM.

[51] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde jačina antitela da inhibira apoptozu indukovanu sa TNFa u odnosu na onu kod infliksimaba (relativna jačina), određena u L929 testu, je veća od 3, i gde je pomenuta relativna jačina odnos IC50vrednosti u ng/mL infliksimaba u L929 testu prema IC50vrednosti u ng/mL antitela u L929 testu.

[52] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde je temperatura topljenja varijabilnog domena antitela u scFv formatu, određeno sa diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom, najmanje 65°C.

[53] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde je temperatura topljenja varijabilnog domena antitela u scFv formatu, određeno sa diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom, je najmanje 68°C.

[54] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde je temperatura topljenja, određeno sa diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom, najmanje 70°C.

[55] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde je antitelo sposobno za blokiranje interakcije između humanog TNFα i TNF receptora I (TNFRI).

[56] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, gde je antitelo sposobno za blokiranje interakcije između humanog TNFα i TNF receptora II (TNFRII).

[57] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno za inhibiranje ćelijske proliferacije mononuklearnih ćelija perifere krvi u reakciji pomešanih limfocita.

[58] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije interleukina-1β i CD14<+>monocita.

[59] Antitelo prema stavki [58], gde IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije interleukina-1β je manja od 1 nM.

[60] Antitelo prema stavki [59], gde pomenuta IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije interleukina-1β, na molarnoj osnovi, koja je niža od one za adalimumab.

[61] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je sposobno za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije TNFα iz CD14<+>monocita.

[62] ] Antitelo prema stavki [61], gde IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije TNFa je manja od 1 nM.

[63] Antitelo prema stavki [62], gde pomenuta IC50vrednost za inhibiranje LPS-indukovane sekrecije TNFα, na molarnoj osnovi, je niža od one za adalimumab.

[64] Antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki, koje je rezistentnije na proteolitičko degradiranje u odnosu na antitelo divljeg tipa.

[65] Antitelo prema stavki [64], gde je pomenuto antitelo divljeg tipa infliksimab.

[66] Antitelo prema stavki [64], gde je pomenuto antitelo divljeg tipa imunoglobulin koji se razlikuje od pomenutog antitela samo u tome što njegov Fc region ima samo aminokiseline divljeg tipa.

[67] Antitelo prema stavki [64], gde pomenuto antitelo divljeg tipa sadrži laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:1 i težak lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:2.

[68] Antitelo prema bilo kojoj od stavki [64] do [67], gde pomenuta proteolitička degradacija uključuje degradaciju sa matriksnom metaloproteinazom 3 (MMP-3).

[69] Antitelo prema bilo kojoj od stavki [64] do [68], gde pomenuta proteolitička degradacija uključuje degradaciju sa imunoglobulin G-degradirajućim enzimom S. pyogenes (IdeS).

[70] Antitelo prema bilo kojoj od stavki [64] do [69], gde pomenuta proteolitička degradacija uključuje degradaciju sa Endoproteinazom Glu-C iz Staphylococcus aureus soj V8 (GluC).

[71] Nukelinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kojoj od prethodnih stavki.

[72] Vektor ili plazmid koji se sastoji iz nukleinske kiseline prema stavci [71].

[73] Ćelija koja se sastoji iz nukleinske kiseline prema stavci [60] ili vektor ili plazmid prema stavci [72].

[74] Postupak za dobijanje antitela prema bilo kom od zahteva [1] do [70], koji se sastoji iz kultivisanja ćelije prema stavci [71] u medijumu pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira antitelo, i dobijanja antitela iz ćelija ili iz medijuma.

[75] Antitelo kao što je definisano u bilo kojoj od stavki [1] do [70] za upotrebu u postupku lečenja inflamatornog poremećaja ili poremećaja povezanog sa TNFα.

[76] Antitelo za upotrebu prema stavki [75], gde pomenuti inflamatorni poremećaj je izabran iz liste bolesti i poremećaja navedenih u Odeljku "Poremećaji koje treba lečiti" u tekstu ispod.

[77] Antitelo za upotrebu prema stavki [75], gde pomenuti inflamatorni poremećaj je inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta.

[78] Antitelo za upotrebu prema stavki [77], gde pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je inflamatorna bolest creva.

[79] Antitelo za upotrebu prema stavki [77] ili [78], gde pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je Kronova bolest.

[80] Antitelo za upotrebu prema stavki [79], gde pomenuta Kronova bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji iz ilealne, debelog creva, ileodebelog creva, i/ili izolovane gornje Kronove bolesti (želudačne, duodenalne i/ili jejunalne) i uključujući ponašanje bez stezanja/bez prodiranja, sa stezanjem, prodiranjem i ponašanje perinanalne bolesti, dozvoljavajući bilo koju kombinaciju lokalizacije i ponašanja bolesti prema bilo kom od gorepomenutog.

[81] Antitelo za upotrebu prema stavki [77] ili [78], gde pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je ulcerativni kolitis.

[82] Antitelo za upotrebu prema stavki [81], gde pomenuti ulcerativni kolitis je izabran iz grupe koja se sastoji iz ulcerativnog proktitisa, sigmoiditisa, proktosigmoiditisa, levostranog kolitisa, panulcerativnog kolitisa, i puhitisa.

[83] Antitelo za upotrebu prema stavki [77] ili [78], gde pomenuti inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta je mikroskopski kolitis.

[84] Antitelo za upotrebu prema stavki [75], gde je pomenuti inflamatorni poremećaj artritis.

[85] Antitelo za upotrebu prema stavki [75] ili [84], gde je pomenuti inflamatorni poremećaj reumatoidni artritis.

[86] Antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od stavki [75] do [85], gde pomenuti postupak obuhvata oralnu primenu antitela subjektu.

[87] Antitelo za upotrebu prema bilo kojoj od stavki [75] do [85], gde pomenuti postupak obuhvata lokalnu primenu antitela.

[88] Farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz antitela prema bilo kojoj od stavki [1] do [70].

OPIS NACRTA

[0012]

Slika 1: Jačina varijanti anti-TNFα antitela za neuralizovanje TNFa u L929 testu. Predstavljene su krive doznog odgovora za varijante TNFα antitela i referentni infliksimab.

Slika 2: Transport anti-TNFα IgG varijanti kroz polarizovane T84 ćelije. Količine varijanti anti-TNFa antitela i Infliksimaba (IFX) sa apikalnog prema bazolateralnom rezervoaru na 4 h nakon dodavanja. Predstavljeno kao ng/cm2. Stupci sa greškom označavaju SD dva do četiri individualna monosloja. Slika 3: Transport anti-TNFα IgG varijanti kroz polarizovane T84 ćelije u prisustvu viška količine mijeloma IgG. Količine anti-TNFα IFX i Ab varijanti transportovane sa apikalnog prema bazolateralnom rezervoaru u prisustvu 10-strukog viška IgG humanog mijeloma na 4 h nakon dodavanja. Predstavljeno kao ng/cm2. Stupci sa greškom ukazuju na SD tri do četiri individualna monosloja.

Slika 4: ADCC aktivnost. Indukcija ADCC sa anti-TNFα varijantama antitela i Ab-wt.

Slika 5: Indukcija CD14 CD206<+>makrofaga sa svakim jedinjenjem u odnosu na indukciju IFX. Sažeto prikazani podaci 4 nezavisna eksperimenta. Stupci predstavljaju srednje vrednosti, stupci sa greškama predstavljaju SEM.

Slika 6: Supresija T-ćelijske proliferacije sa svakim jedinjenjem u odnosu na IFX. Sažeto prikazani podaci 3 nezavisna eksprerimenta. Stupci predstavljaju srednje vrednosti, stupci sa greškama predstavljaju SEM.

Slika 7: Rezistentnost na proteolitičku degradaciju sa MMP-3.

Slika 8: Rezistentnost na proteolitičku degradaciju sa IdeS.

Slika 9: Rezistentnost na proteolitičku degradaciju sa GluC.

Slika 10: Šematski prikaz mutageneze usmerene na mestu.

DETALJAN OPIS

[0013] Predmetni pronalazak se odnosi na IgG1 antitelo koje je sposobno da se veže za TNFa i sastoji se iz modifikovanog Fc regiona. Antitelo ima pojačanu rezistenciju prema proteolitičkoj degradaciji. Dalje, antitelo ima visok afinitet prema humanom FcRn na pH 6 i nizak afinitet prema humanom FcRn na pH 7.4. Aminokiselinska sekvenca antitela se sastoji iz aminokiselina 233P, 234V, 235A, i delecija na poziciji aminokiseline 236 (EU numerisanje). Antitelo se dalje sastoji iz ili aminokiseline 434A ili aminokiselina 252Y, 254T i 256E (EU numerisanje). Dodatno, antitelo se sastoji iz aminokiselina 239D, 330L i 332E (EU numerisanje). Osim toga, antitelo se sastoji iz (i) VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:10 i (ii) VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:9.

[0014] Kroz predmetnu specifikaciju i zahteve, sistem Kabat numerisanja se generalno koristi kada se odnosi na ostatak u varijabilnom domenu (približno, ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU sistem numerisanja" ili "EU indeks" se generalno koristi kada se odnosi na konstantni region teškog lanca imunoglobulina (npr., EU indeks prijavljen u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ovde jasno uključeni referencom). Osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, reference na brojeve ostataka u varijabilnom domenu antitela označavaju numerisanje ostataka sa Kabat sistemom numerisanja. Osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, reference na numerisane ostatke u konstantnom domenu antitela znače numerisanje ostataka sa EU sistemom numerisanja (videti npr., WO 2006/073941).

Antitelo

[0015] U kontekstu predmetne prijave, termin "antitelo" je korišćen kao sinonim za "imunoglobulin" (Ig), koji je definisan kao protein koji pripada klasi IgG, IgM, IgE, IgA, ili IgD (ili bilo kojoj njihovoj podklasi), i uključuje sva konvencionalno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente. Prema predmetnoj prijavi, antitelo je IgG1 antitelo. U kontekstu predmetnog pronalaska, "funkcionalni fragment" antitela/imunoglobulina je definisan kao fragment za vezivanje antigena ili drugog derivata u matičnom antitelu koji u suštini zadržava jedno ili više svojstava takvog matičnog antitela. "Antigenvezujući fragment" ili "domen za vezivanje antigena" antitela/imunoglobulina je definisan kao fragment (npr., varijabilni region IgG) koji zadržava region za vezivanje antigena. "Antigen-vezujući region" antitela obično se nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona antitela, tj., CDR-1, -2, i/ili -3 regiona. Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da budu deo bi- ili multifukcionalnih konstrukata.

[0016] Poželjno antitelo je monoklonalno antitelo. Termin "monoklonalno antitelo" kao što se ovde koristi nije ograničeno na antitela proizvedena korišćenjem tehnologije hibridoma. Termin "monoklonalno antitelo" se odnosi na antitelo koje je dobijeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski, ili fagni klon, i ne na postupak kojim je proizveden. Monoklonalna antitela se mogu dobiti korišćenjem različitih postupaka poznatih iz oblasti tehnike uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih, i tehnologija fagnog prikaza, ili njihovih kombinacija. (Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.).

1

[0017] U drugim izvođenjima, uključujući izvođenja koja se odnose na in vivo upotrebu anti-TNFa antitela kod ljudi, himerna, primatizovan, humanizovana, ili humana antitela se mogu koristiti. U poželjnom izvođenju, antitelo je humano antitelo ili je humanizovano antitelo, poželjnije monoklonalno humano antitelo ili je monoklonalno humanizovano antitelo.

TNFα-vezujući domen

[0018] Antitelo iz pronalaska specifično vezuje TNFα. Kao što se ovde koristi, antitelo "specifično prepoznaje", ili "specifično se vezuje za" humani TNFα, gde je antitelo sposobno da razlikuje između humanog TNFα i jednog ili više referentnih molekula. Poželjno, IC50vrednost za vezivanje svakog od referentnih molekula je bar 1,000 puta veća od IC50vrednosti za vezivanje za TNFα. U svom najopštijem obliku (i gde se ne pominje definisana referenca), "specifično vezivanje" se odnosi na sposobnost antitela da napravi razliku između humanog TNFα i nesrodnog biomolekula, kao što je određeno, na primer, u skladu sa postupcima testova za određivanje specifičnosti poznatim u oblasti tehnike. Takvi postupci sadrže, ali nisu ograničeni na, „Western“ blotove i ELISA testove. Na primer, standardni ELISA test se može izvesti. Obično, određivanje specifičnosti vezivanja je izvedeno korišćenjem ne kao jednog referentnog biomolekula, već seta od tri do pet nesrodnih biomolekula, kao što je mleko u prahu, BSA, transferin ili slično. U jednom izvođenju, specifično vezivanje se odnosi na sposobnost antitela da razlikuje između humanog TNFα i humanog TNFβ.

[0019] Antitelo iz pronalaska se sastoji iz VLdomena i VHdomena. VLdomen sadrži CDR1 region (CDRL1), CDR2 region (CDRL2), CDR3 region (CDRL3) i regione okvira čitanja. VHdomen sadrži CDR1 region (CDRH1), CDR2 region (CDRH2), CDR3 region (CDRH3) i regione okvira čitanja.

[0020] Termin "CDR" se odnosi na jedan od šest hipervarijabilnih regiona unutar varijabilnih domena antitela koji glavno doprinose vezivanju antigena. Jedna od najčešće korišćenih definicija za šest CDRs je obezbeđena od strane Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Kao što se ovde koristi, Kabatova definicija CDRs se samo primenjuje na CDR1, CDR2 u CDR3 lakog lanca varijabilnog domena (CDR L1, CDR L2, CDR L3, ili L1, L2, L3), kao i za CDR2 i CDR3 teškog lanca varijabilnog domena (CDR H2, CDR H3, ili H2, H3). CDR1 teškog lanca varijabilnog domena (CDR H1 ili H1), međutim, kao što se ovde koristi je is definisan sa sledećim ostacima (Kabat numerisanje): Počinje sa pozicijom 26 i završava se pre pozicije 36.

[0021] Antitelo iz pronalaska se sastoji iz (i) VLdomena koji se sastoji iz CDR1 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:3, CDR2 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:4, i CDR3 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:5, i (ii) VHdomena koji se sastoji iz CDR1 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:6, CDR2 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:7, i CDR3 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:8.

[0022] Antitelo iz pronalaska se sastoji iz (i) VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:9, i (ii) VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:10.

[0023] Dalje, ovde je opisano antitelo koje se sastoji iz (i) VLdomena koji sadrži CDR1 region koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:14, CDR2 region koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:15, i CDR3 region koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:16, i (ii) VHdomen koji se sastoji iz CDR1 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:17, CDR2 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:18, i CDR3 regiona koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:19.

[0024] Dalje, ovde je opisano antitelo koje se sastoji iz VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:20. Antitelo iz predmetnog pronalaska može da sadrži VLdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:21 ili SEQ ID NO:22. Dalje, antitelo iz predmetnog pronalaska može da sadrži (i) VHdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:21, i (ii) VLdomen koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:21 ili SEQ ID NO:22.

[0025] Antitelo iz pronalaska ima visok afinitet prema TNFα. Termin "KD," se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Obično, antitelo iz pronalaska se vezuje za humani TNFα sa ravnotežnom konstantnom disocijacije (KD) manjom od približno 2x10<-10>M,poželjno manjom od 1.5x10<-10>M, poželjno manjom od 1.25x10<-10>M, poželjnije manjom od 1x10<-10>M, najpoželjnije manjom od 7.5x10<-11>M ili još manjom od 5x10<-11>M, kao što je određeno korišćenjem tehologije površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIACORE instrumentu. Posebno, određivanje KDje izvedeno kao što se opisuje u Primeru 1.

Modifikacije Fc regiona

[0026] "Modifikovani Fc region" sastoji se iz aminokiselinske sekvence koja je različita od prirodne sekvence u Fc regionu na osnovu bar jedne "aminokiselinske modifikacije" ili "mutacije" kao što je ovde definisano. Poželjno, modifikovani Fc region se sastoji iz modifikovanog FcRn vezujućeg mesta koje ima bar jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa nativnom sekvencom FcRn vezujućeg mesta ili sa FcRn vezujućim mestom matičnog antitela, npr. od oko jedne do oko deset aminokiselinskih supstitucija, i poželjno od oko jedne do oko pet aminokiselinskih supstitucija u nativnoj sekvenci FcRn vezujućeg mesta ili u FcRn vezujućem mestu matičnog antitela. Alternativno, antitelo može da ima modifikaciju izvan FcRn vezujućeg mesta koja pogađa afinitet prema FcRn, npr. sa strukturnim promenama. Obično, afinitet prema humanom FcRn na pH 6 je povećan zbog modifikacija. Poželjno je da afinitet prema humanom FcRn na pH 7.4 nije u suštini pogođen sa modifikacijom. Modifikacije se mogu generisati postipcima iz oblasti tehnike poznatim per se, npr. sa mutagenezom koja je usmerena prema mestu kao što je opisano u "Antibody Engineering - Methods and Protocols", editovano od stane Patrick Chames, 2nd ed., 2012, Chapter 31 (ISBN 978-1-61779-973-0).

[0027] Aminokiselinska sekvenca antitela iz pronalaska sadrži aminokiselinu prolin na poziciji 233, aminokiselinu valin na poziciji 234, i aminokiselinu alanin na poziciji 235, i dalje ima deleciju aminokiseline na poziciji 236 (EU numerisanje). Ovo je ovde naznačeno sa "233P/234V/235A/236del". Nativna aminokiselina na poziciji 233 ne-modifikovanih humanih IgG antitela je glutaminska kiselina (E). Nativna aminokiselina na poziciji 234 ne-modifikovanih humanih IgG antitela je leucin (L). Nativna aminokiselina na poziciji 235 ne-modifikovanih humanih IgG antitlea je leucin (L). Nativna aminokiselina na poziciji 236 ne-modifikovanih humanih IgG antitela je glicin (G). Prema tome, antitelo iz pronalaska se može dobiti uvođenjem mutacija E233P, L234V, L235A i G236del u antitelo. Ovo je ovde naznačeno sa E233P/L234V/L235A/G236del. Poželjno, antitelo iz pronalaska se može dobiti ili je dobijeno supstitucijom prolina za glutaminsku kiselinu na poziciji 233, substitucijom valina za leucin na poziciji 234, supstitucijom alanina za leucin na poziciji 235, i delecijom glicina na poziciji 236.

[0028] Aminokiselinska sekvenca antitela iz pronalaska dalje sadrži (i) aminokiselinu alanin na poziciji 434, ili (ii) aminokiselinu tirozin na poziciji 252, aminokiselinu treonin na poziciji 254 i aminokiselinu glutaminska kiselina na poziciji 256. Ovo je naznačeno sa 434A i 252Y/254T/256E ovde, redom. Nativna aminokiselina na poziciji 434 ne modifikovanih humanih IgG antitela je asparagin (N). Nativna aminokiselina na poziciji 252 ne-modifikovanih humanih IgG antitela je metionin (M). Nativna aminokiselina na poziciji 254 ne-modifikovanih humanih IgG antitela je serin (S). Nativna aminokiselina na poziciji 256 ne-modifikovanih humanih IgG antitela je treonin (T). Prema tome, antitelo iz pronalaska se može dobiti uvođenjem drugih mutacija N434A ili M252Y/S254T/T256E u antitelo.

[0029] Što jeste, aminokiselinska sekvenca antitela iz pronalaska se sastoji iz 233P/234V/235A/236del/434A ili 233P/234V/235A/236del/252Y/254T/256E. Ova aminokiselinska sekvenca može da se dobije uvođenjem mutacija E233P/L234V/L235A/ G236del/N434A ili E233P/L234V/L235A/G236del/M252Y/S254T/T256E u aminokiselinsku sekvencu antitela, npr. u Fc regionu antitela koji ima ne-modifikovanu ili aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa.

[0030] Preostala aminokiselinska sekvenca Fc regiona može da bude identična sa nativnom aminokiselinskom sekvencom uobičajenog humano IgG. Moguće je, međutim, da aminokiselinska sekvenca antitela sadrži jednu ili više dodatnih mutacija ili supstitucija prema nativnoj aminokiselinskoj sekvenci Fc regiona nativnog antitela, sve dok antitelo još uvek ima aktivnost za vezivanje TNFα, aktivnost za vezivanje FcRn na pH 6.0 i jednu ili više efektorskih funkcija.

[0031] Aminokiselinska sekvenca antitela ima aminokiseline 239D/330L/332E, koja se poželjno može dobiti ili je dobijena uvođenjem supstitucija S239D/A330L/I332E..

[0032] U poželjnom izvođenju, aminokiselinska sekvenca antitela iz pronalaska se sastoji iz 233P/234V/235A/236del/239D/330L/332E/434A. Ovo antitelo može da se dobije uvođenjem mutacija E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/l332E/N434A u aminokiselinsku sekvencu antitela, npr. Fc regiona antitela koji ima ne-modifikovanu ili aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa [0033] U drugom poželjnom izvođenju, aminokiselinska sekvenca antitela iz pronalaska sadrži 233P/234V/235A/236del/239D/330L/332E/252Y/254T/256E. Ovo antitelo se može dobiti uvođenjem mutacija E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/I332E/ M252Y/S254T/T256E u aminokiselinsku sekvencu antitela, npr. antitela Fc regiona koji ima ne-modifikovanu ili aminokiselinsku sekvencu divljeg tipa.

[0034] U poželjnom izvođenju, Fc region antitela iz pronalaska, uključujući region zgloba, obuhvata ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO:28, i SEQ ID NO:29.

[0035] U jednom izvođenju, težak lanac antitela iz pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:2, pri čemu su uvedene mutacije E233P/L234V/L235A/236del/ S239D/A330L/I332E/N434A. Poželjno ovo antitelo dalje sadrži laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:1.

[0036] U drugom izvođenju, težak lanac antitela iz pronalaska ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:2, pri čemu su uvedene mutacije E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/I332E/M252Y/S254T/T256E. Poželjno ovo antitelo dalje sadrži laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:1.

[0037] U poželjnom aspektu iz pronalaska, antitelo iz pronalaska je ne-fukozilovano antitelo ili antitelo koje ima smanjenu fukozilaciju.

1

[0038] Termin "antitelo sa redukovanom fukozilacijom", kao što je ovde korišćen, odnosi se na antitelo u kome je manje od 90% N-glikana antitela fukozilovano. U oblasti tehnke su poznati postupci za određivanje procenta fukozilacije. U jednom izvođenju, manje od 75%, ili manje od 50%, ili manje od 25% N-glikana antitela je fukozilovano. Najpoželjnije, manje od 10% N-glikana antitela je fukozilovano. U posebnom izvođenju, N-glikani antitela iz pronalaska ne sadrže bilo koju fukozu.

[0039] Poželjno, manje od 90% N-glikana na N297 (EU numerisanje) antitela su fukozilovani. U drugom izvođenju, manje od 75%, ili manje od 50%, ili manje od 25% N-glikana na N297 (EU numerisanje) antitela su glukozilovani. Najpoželjnije, manje od 10% N-glikana na N297 (EU numerisanje) antitela su fukozilovani.

[0040] U drugom izvođenju, N-glikani na N297 antitela ne sadrže bilo koju fukozu.

[0041] Ne-fukozilovana antitela, nekada naznačena sa afukuozilovana antitela, mogu da se dobiju različitim postupcima. Na primer, sinergičko izbacivanje gena za α1,6-fukoziltransferazu (FUT8) i GDP-manoza 4,6-dehidratazu (GMD) u CHO ćelijama mogu da se koriste za proizvodnju varijanti monoklonskih antitela koja su potpuno afukozilovana i ADCC-pojačana (videti, npr., Imai-Nishiya et al. (2007) BMC Biotechnol.7, 84). Postupak koji koristi nukleaze sa cinkanim prstima (ZFNs) cepaju FUT8 gen u regionu koji kodira katalitičko jezgro α1,6-fukoziltransferase i prema tome narušava odgovarajuću enzimsku funkciju u CHO ćelijama mogu da se koriste za proizvodnju monoklonskih antiteka kojima u potpunosti nedostaje jezgro fukoze (videti, npr., Malphettes et al. (2010) Biotechnol. Bioeng.106, 774-783).

[0042] Antitela sa smanjenom fukozilacijom mogu da se dobiju dodavanjem supstrata mamca (eng. decoy substrate) kao što je 2-deoksi-2-fluoro-2-fukoza u medijum kulture (videti, npr., Dekker et al. (2016) Sci Rep 6:36964), što dovodi do smanjenog uključivanja fukoze u IgG-Fc glikane.

[0043] U drugom izvođenju, antitelo iz pronalaska ima visok sadržaj sijalinske kiseline. Povećanje u sijalizaciji može da bude postignuto, npr. istovremenom transfekcijom sintaze citidin monofosfatsijalinka kiselina (CMP-SAS), citidin monofosfat-sijalinska kiselina transporter (CMP-SAT), i α 2,3-sialiltransferaza (videti, npr., Son et al. (2011) Glycobiology 21, 1019-1028).

Afinitet prema FcRn

[0044] Afinitet na pH 6 prema humanom FcRn antitela iz pronalaska je visok. Visoko afinitetno vezivanje antitela prema humanom FcRn na pH 6 je obično karakterisano sa KDvrednosti koja je manja od 500 nm. Poželjno, KDvrednost visokoafinitetnog vezivanja na pH 6 je manja od 400 nm, ili je manja od 300 nm, ili je manja od 200 nm. Na primer, KDvrednost koja karakteriše afinitet na pH 6 može da bude u opsegu od 5 do 500 nM, ili 10 do 400 nM, ili 25 do 300 nM, ili 50 do 200 nM, ili 100 do 175 nM.

[0045] U poželjnom izvođenju, afinitet antitela iz pronalaska prema humanom FcRn na pH 6 je veći u odnosu na afinitet infliksimaba prema humanom FcRn at pH 6.0.

[0046] Afinitet antitela iz pronalaska prema humanom FcRn je poželjno određen površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), na primer kao što je opisano u Primeru 4 ove prijave.

[0047] Antitelo iz predmetnog pronalaska ima obično nizak afinitet prema humanom FcRn na pH 7.4. Nizak afinitet je karakterisan sa KDvrednosti većom od 1 µM. Poželjno, nizak afinitet prema humanom FcRn na pH 7.4 je karakterisan sa KDvrednosti većom od 2 µM, ili većom od 5 µM, ili većom od 10 µM.

[0048] U posebnom izvođenju, nizak afinitet na pH 7.4 je tako nizak da KDvrednost ne može da bude određena sa SPR.

[0049] U posebnom izvođenju, odnos (i) KDvrednosti za vezivanje antitela iz pronalaska za humani FcRn na pH 7.4 prema (ii) KDvrednost za vezivanje za humani FcRn na pH 6.0, je najmanje 50. Poželjno, ovaj odnos je najmanje 100, ili najmanje 150, ili je najmanje 200.

Funkcionalna svojstva antitela

[0050] Antitelo iz pronalaska je efikasno transportovan kroz monosloj polarizovanih ćelija sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani. Obično, transport kroz polarizovan ćelijski monosloj je u većoj 2 količini u odnosu na infliksimab, pri čemu se količina antitela u infliksimabu odnosi na masu/cm polarizovanog ćelijskog monosloja. Količina antitela transportovanog kroz polarizovani ćelijski monosloj, u odnosu na količinu infliksimaba transportovanog kroz polarizovani ćelijski monosloj, je najmanje 110%, poželjno najmanje 120%, poželjnije najmanje 130%, ili najmanje 140%, ili najmanje 150% (gde je količina transportovanog infliksimaba podešena do 100%).

[0051] Dalje, antitelo je specifično transportovano kroz polarizovan ćelijski monosloj sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani u prisustvu viška imunoglobulina u kompeticiji. Ovde je ovo naznačeno kao specifičan transport.

[0052] Procent ukupne mase imunoglobulina transportovanih kroz polarizovan ćelijski monosloj je veći od procenta infliksimaba transportovanog kroz polarizovan ćelijski monosloj sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani u prisustvu 10-strukog viška imunoglobulina u kompeticiji. Procent antitela iz pronalaska transportovanih kroz polarizovan ćelijski monosloj u prisustvu 10-strukog viška nesrodnih imunoglobulina, u odnosu na procenat infliksimaba transportovanog kroz polarizovani ćelijski monosloj u prisustvu 10-strukog viška nesrodnih antitela, je najmanje 120%, ili najmanje 130%, ili najmanje 140%, ili najmanje 150% (infliksimab je podešen da bude 100%).

[0053] Poželjno, polarizovani ćelijski monosloj je monosloj polarizovanih T84 ćelija. Test transporta koji imitira proces transcitoze može da se izvede kao što je opisano u Primeru 5 ove prijave.

[0054] Antitelo iz pronalaska se vezuje za CD16a(V), CD16a(F) i CD16b(NA2).

[0055] Antitelo iz pronalaska se obično vezuje za CD16a(V) sa KDmanjom od 1 µM, poželjno manjom od 500 nM, poželjnije manjom od 100 nM.

[0056] Antitelo iz pronalaska se obično vezuje za CD16a(F) sa KDmanjom od 10 µM, poželjno manjom od 1 µM.

[0057] Antitelo iz pronalaska se obično vezuje za CD16b(NA2) sa KDmanjom od 10 µM, poželjno manjom od 1 µM.

[0058] Antitelo iz pronalaska je dalje sposobno da indukuje CD14 CD206<+>makrofage. Nivo indukcije je poželjno uporediv sa, jednak sa, ili je veći od onog za infliksimab.

[0059] Antitelo iz pronalaska je dalje sposobno da suprimira proliferaciju T ćelija. Stepen supresije proliferacije T ćelija je poželjno uporediv sa, jednak sa, ili je veći od onog za infliksimab.

1

Farmaceutske kompozicije i tretman

[0060] Tretman bolesti obuhvata lečenje pacijenata koji su već dijagnostikovani da imaju bilo koji oblik bolesti u bilo kom kliničkom stadijumu ili ispoljavanju; odlaganje početka ili evolucija ili pogoršanje ili pogoršanje simptoma ili znakova bolesti; i/ili prevencija i/ili smanjenje težine bolesti.

[0061] "Subjekt" ili "pacijent" kome se daje anti-TNFα antitelo može da bude sisar, kao što je neprimat (npr., krava, svinja, konj, mačka, pas, pacov, itd.) ili primat (npr., majmun ili čovek). U određenim aspektima, čovek je pedijatrijski pacijent. U drugim aspektima, čovek je odrasli pacijent.

[0062] Ovde su opisane kompozicije koje se sastoje iz anti-TNFα antitela i, po potrebi jednog ili više dodatnih terapeutskih sredstava, kao što su dole opisani drugi terapeutski agensi. Kompozicije su obično dopremljene kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koje uključuju farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova kompozicija može da bude u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog postupka davanja pacijentu).

[0063] Anti-TNFα antitela mogu da se daju pacijentu različitim načinima davanja kao što je oralno, transdermalno, subkutanozno, intranazalno, intravenozno, intramuskularno, intratekalno, topikalno ili lokalno, npr. mukozno. Najpogodniji način za davanje u bilo kom navedenom slučaju zavisiće od određenog antitela, subjekta, i prirode i težine bolesti i fiziološkog stanja subjekta. U jednom izvođenju, anti-TNFα antitelo se daje intravenozno.

[0064] U posebno poželjnom izvođenju, antitelo iz pronalaska se daje oralno. Ukoliko je davanje oralnim načinom davanja antitelo je poželjno IgG, najpoželjnije IgG1.

[0065] Anti-TNFa antitelo može da se nalazi u farmaceutskoj kompoziciji u koncentraciji dovoljnoj da se dozvoli intravenozno davanje od 0.5 mg/kg telesne težine do 20 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, koncentracija antitela koje je pogodno za upotrebu u ovde opisanim kompozicijama i postupcima uključuje, ali nije ograničena na, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, ili koncentracija koja je opsega između bilo koje od gore navedenih vrednosti, npr., 1 mg/kg do 10 mg/kg, 5 mg/kg do 15 mg/kg, ili 10 mg/kg do 18 mg/kg.

[0066] Efikasna doza anti-TNFa antitela može da bude opsega od oko 0.001 do oko 750 mg/kg po jednom (npr., bolus) davanju, višestrukim davanjima ili kontinuiranim davanjima, ili da se postigne koncentracija u serumu od 0.01-5000 µg/ml po jednom (npr., bolus) davanju, višestrukim davanjima ili kontinuiranom davanju, ili bilo koji efikasan opseg ili njegova vrednost u zavisnosti od stanja koje se leči, načina davanja i starosti, težine i stanja subjekta. U slučaju oralnog davanja, koncentracija u serumu može da bude veoma niska ili čak ispod granice detekcije. U određenim izvođenjima, svaka doza može da bude opsega od oko 0.5 mg do oko 50 mg po kilogramu telesne težine ili od oko 3 mg do oko 30 mg po kilogramu telesne težine. Antitelo može da bude formulisano kao vodeni rastvor.

[0067] U posebno poželjnom izvođenju, antitelo iz pronalaska se daje oralno. Ukoliko je davanje oralnim načinom davanja antitelo je poželjno IgG, najpoželjnije IgG1. Ukoliko je antitelo davano oralnim putem, dnevna doza antitela je obično u opsegu od oko 0.01 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne težine, ili oko 0.05 mg/kg do oko 50 mg/kg telesne težine, ili oko 0.1 mg/kg do oko 25 mg/kg telesne težine, ili oko 0.15 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0.16 mg/kg do oko 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0.2 mg/kg do oko 2 mg/kg telesne težine, ili oko 0.2 mg/kg do oko 1 mg/kg telesne težine, Generalno, povoljne doze su doze od 1 do 200 mg dnevno, poželjno 5 do 100 ili 10 do 50 mg dnevno.

1

[0068] Farmaceutske kompozicije mogu pogodno da se nalaze u jediničnim doznim oblicima koji sadrže prethodno određenu količinu anti-TNFa antitela po dozi. Takva jedinica može da sadrži 0.5 mg do 5 g, na primer, ali bez ograničenja, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, ili bilo koji opseg između bilo koje od prethodno navedenih vrednosti, na primer 10 mg do 1000 mg, 20 mg do 50 mg, ili 30 mg do 300 mg. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti najrazličitijih oblika u zavisnosti od, npr., stanja koje se leči ili načina davanja.

[0069] Određivanje efikasne doze, ukupnog broja doza, i dužine tretmana anti-TNFα antitelom je u okviru sposobnosti stručnjaka iz oblasti tehnike, i može da se odredi korišćenjem standardne studije eskalacije doze.

[0070] Terapeutske formulacije anti-TNFa antitela pogodne u ovde opisanim postupcima mogu da se dobiju za skladištenje kao liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa po potrebi farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima uobičajeno korišćenim u oblasti tehnike (od kojih su ovde svi naznačeni sa "nosači"), tj., puferska sredstva, sredstva za stabilizovanje, konzervansi, izotonifikatori, ne-jonski deterdženti, antioksidansi, i drugi razni aditivi. Videti, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed.

1980). Takvi aditivi moraju biti netoksični za recipijente u korišćenim dozama i koncentracijama.

[0071] Puferska sredstva pomažu u održavanju pH u opsegu što je približno fiziološkim uslovima. Mogu da predstavljaju koncentraciju opsega od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodna puferska sredstva uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli kao što su citratni puferi (npr., smeša mononatrijum citrata-dinatrijum citrata, smeše limunske kiseline-trinatrijum citrata e, smeše limunske kiseline-mononatrijum citrata, itd.), citratno-fosftatnih pufera, sukcinatnih pufera (npr., smeša sukcinske kiseline-mononatrijum sukcinata, smeše sukcinske kiseline-natrijum hidroksida, smeša sukcinske kiseline-dinatrijum sukcinata, itd.), tartaratnih pufera (npr., smeša vinske kiseline-natrijum tartarat, smeša vinske kiseline-kalijum tartarata, smeša vinske kiseline-natrijum hidroksida, itd.), fumaratni puferi (npr., smeša fumarne kiseline-mononatrijum fumarata, smeša fumarne kiselinedinatrijum fumarata, smeša mononatrijum fumarata-dinatrijum fumarata, itd.), gukonatni puferi (npr., smeša glukonske kiseline-natrijum glukonata, smeša glukonske kiseline-natrijum hidroksida, smeša glukonske kiseline-kalijum glukonata, itd.), oksalatni pufer (npr., smeša oksalne kiselinenatrijum oksalata, smeša oksalne kiseline-natrijum hidroksida, smeša oksalne kiseline-kalijum oksalata, itd), laktatni puferi (npr., smeša mlečne kiseline-natrijum laktata, smeša mlečne kiselinenatrijum hidroksida, smeša mlečne kiseline-kalijum laktata, itd.) i acetatnih pufera (npr., smeša sirćetne kiseline-natrijum acetata, smeša sirćetne kiseline-natrijum hidroksida, itd.). Dodatno, mogu da se koriste fosfatni puferi, histidinski puferi i trimetilaminske soli kao što je Tris.

[0072] Farmaceutska kompozicija iz pronalaska može dalje da se sastoji iz bar jedne soli, npr. natrijum hlorida. Koncentracija soli je poželjno opsega od 100 mM do 200 mM, npr. oko 150 mM.

[0073] Konzervansi mogu da se dodaju kako bi se odložio mikrobijalni rast, i mogu da se dodaju u količinama u opsegu od 0.2%- 1% (mas/v). Pogodni konzervansi uključuju fenol, benzil alkohol, metakrezol, metil paraben, propil paraben, oktadecil-dimetilbenzil amonijum hlorid, benzalkonijum halogenidi (npr., hlorid, bromid, i jodid), heksametonijum hlorid, i alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, cikloheksanol, i 3-pentanol. Izotonifikatori ponekad poznati kao "stabilizatori" mogu da se dodaju da bi se osigurala izotoničnost tečnih kompozicija i uključuju polihidrične šećerne alkohole, poželjno trihidrične ili više šećerne alkohole, kao što su glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenasa koji mogu da budu u opsegu u funkciji od sredstva za punjenje do aditiva koji solubilizuje terapeutsko sredstvo ili pomaže da se spreči denaturacija ili vezivanje za zid kontejnera. Tipični stabilizatori mogu da budu polihidrični šećerni alkoholi (gore numerisani); aminokiseline kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin,

1

asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, npr., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što je laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinozitol, galaktitol, glicerol i slično, uključujući ciklitole kao što je inozitol; polietilen glikol; aminokiselinski polimeri; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što je urea, glutation, lipoinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tio sulfat; polipeptidi niske molekulske težine (npr., peptidi sa 10 ostataka ili manje); proteini kao što je albumin iz humanog seruma, albumin iz goveđeg seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, koa što su polivinilpirolidon monosaharidi, kao što je ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharida kao što su laktoza, maltoza, saharoza i trisaharidi kao što je rafinoza; i polisaharidi kao što je dekstran. Stabilizatori mogu da se nalaze u opsegu od 0.1 do 10,000 težine po delu težine aktivnog proteina.

[0074] Ne-jonski surfaktanti ili deterdženti (takođe poznati kao "sredstva za vlaženje") mogu da se dodaju da se pomogne rastvaranju terapeutskog sredstva kao i da se terapeutski protein zaštiti od teloženja indukovanog mešanjem, koje takođe omogućava formulaciji da bude izložena to smicanju površine pod stresom bez uzrokovanja denaturacije proteina. Pogodni ne-jonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 80, itd.), polioksamere (184, 188 itd.), Pluronic polioli, polioksietilen sorbitan monoetri (TWEEN®-20, TWEEN®-80, itd.). Ne-jonski surfaktanti mogu da se nalaze u opsegu od oko 0.05 mg/ml do oko 1.0 mg/ml, ili u opsegu od oko 0.07 mg/ml do oko 0.2 mg/ml.

[0075] Dodatni različiti ekscipijensi uključuju sredstva za dobijanje mase (npr., skrob), helatna sredstva (npr., EDTA), antioksidanse (npr., askorbinsku kiselinu, metionin, vitamin E), inhibitore proteaze i korastvarače.

[0076] Ovde navedena formulacija može takođe da sadrži drugo terapeutsko sredstvo pored anti-TNFa antitela. Primeri pogodnih terapeutskih sredstava su obezbeđeni u tekstu ispod.

[0077] Dozni raspored može da se razlikuje od jednom mesečnog do dnevnog u zavisnosti od brojnih kliničkih faktora, uključujući tip bolesti, težinu bolesti, i osetljivost pacijenta prema anti-TNFα antitelu. U specifičnim izvođenjima, anti-TNFα antitelo se daje dnevno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, svakog drugog dana, svakih 5 dana, jednom nedeljno, svakih 10 dana, svake dve nedelje, svake tri nedelje, svake četiri nedelje ili jednom mesečno, ili u bilo kom opsegu između bilo koje dve od prethodno navedenih vrednosti, na primer od svaka četiri dana do svakog meseca, od svakih 10 dana do svake dve nedelje, ili od dva do tri puta nedeljno, itd.

[0078] Doza anti-TNFα antitela koja je namenjena davanju razlikovaće se u zavisnosti od određenog antitela, subjekta, i prirode i težine bolesti, fizičkog stanja subjekta, terapeutskog režina (npr., da li je korišćeno drugo terapeutsko sredstvo), i odabranog načina davanja; odgovarajuća doza se može brzo odrediti od strane stručnjaka iz oblasti tehnike.

[0079] Stručnjak iz oblasti tehnike će prepoznati da optimalni kvantitet i razdvajanje individualnih doza anti-TNFα antitela će biti određeno prirodnom i stepenom stanja koje se leči, oblikom, načinom i mestom davanja, i godinama i stanjem određenog subjekta koji se leči, i na kraju će lekar definisati odgovarajuće doze koje će se koristiti. Ova doza može da se ponovi često koliko je potrebno. Ukoliko se razviju neželjeni efekti količina i/ili učestalost doziranja može da bude izmenjeno ili smanjeno, u skladu sa normalnom kliničkom praksom.

Poremećaji koje treba lečiti

[0080] Pronalazak se odnosi na postupak lečenja ili prevencije bolesti čoveka povezane sa TNFα kod subjekta, koji se sastoji iz davanja subjektu antitela kao što je ovde definisano. Termin "poremećaj koji je povezan sa TNFα" ili "bolest koja je povezana sa TNFα" se odnosi na bilo koji poremećaj, početak,

1

progresiju ili trajanje simptoma ili stanja bolesti koje zahtevaju učestvovanje TNFα. Primer poremećaja povezanih sa TNFα uključuje, ali nisu ograničeni na, hronična i/ili autoimuna stanja inflamacije generalno, imunski posredovanih inlamatornih poremećaja generalno, inflamatorne bolesti CNS-a, inflamatornih bolesti koje pogađaju oči, zglobove, kožu, mukozne membrane, centralni nervni sistem, gastrointestinalni trakt, urinarni trakt ili pluća, stanja uveitisa generalno, retinitis, HLA-B27+ uveitis, Behčetovu bolest, sindrom suvog oka, glaukom, Sjögren-ov sindrom, diabetes mellitus (uklj. diabetsku neuropatiju), insulinsku rezistenciju, stanja artritisa generalno, reumatoidni artritis, osteoartritis, reaktivni artritis i Reiter-ov sindrom, juvenilni artritis, ankilozirajući spondilitis, multiple skleroza, Žilijen-Barov sindrom, mijastenija gravis, amiotrofna lateralna skleroza, sarkoidoza, glomerulonefritis, hronična bolest bubrega, cistitis, psorijaza (uklj. psorijazni artritis), zapaljenje apokrinih znojnih žlezda (hidradenitis suppurativa), panikulitis, pioderma gangrenozum, SAPHO sindrom (sinovitis, akne, pustuloza, hiperostoza i osteitis), akne, Sweet-ov sidrom, pemfigus, Kronova bolest (uklj. ekstratestinalne manifestacije), ulcerativni kolitis, bronhijalna astma, hipersenzitivni pneumonitis, opšte alergije, alergijski rinitis, alergijski sinuzitis, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), plućna fibroza, Wegener-ova granulomatoza, Kawasaki sindrom, arteritis džinovskih želija, Čarg-Štrausov vaskulitis, poliarteritis nodoza, opekotina, bolest grafta protv domaćina, reakcije domaćina protiv grafta, epizode odbacivanja nakon transplantacije organa ili koštane srži, sistemska i lokalna stanja vaskulitisa generalno, sistemski i kutanozni lupus eritematoides, polimiozitis i dermatomiozitis, skleroderma, pre-eklampsija, akutni i hronični pankreatitis, virusni hepatitis, alkoholni hepatitis, posthirurška inflamacija kao što je nakon operacije oka (npr. katarakta (zamena očnog sočiva) ili operacija glaukoma), operacija zgloba (uklj. artroskopsku operaciju), operacija na strukturama koje su povezane sa zglobom (npr. ligamenti), oralna i/ili dentalna operacija, minimalno invazivne kardiovaskularne procedure (npr. PTCA, aterektomija, postavljanje stenta), laparoskopija i/ili endoskopski intra-abdominalni i ginekološki postupci, endoskopski urološki postupci (npr. operacija prostate, ureteroskopija, cistoskopija, intersticijalni cistitis), ili perioperativna inflamacija (prevencija) generalno, bulozni dermatitis, neutrofilni dermatitis, toksična epidermalna nekroliza, pustularni dermatitis, cerebralna malarija, hemolitični uremijski sindrom, odbacivanje alografta, zapaljenje srednjeg uha, ujed zmije, eritem nodozum, mijelodisplastični sindromi, primarni sklerozni holangitis, seronegativna spondilarteropatija, autoimuna hematolitička anemija, orofacijalna granulamatoza, inflamatorni stomatitis (pyostomatitis vegetans), aftozni stomatitis, geografski jezik, migratorni stomatitis, Alzhajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Huntingtonova bolest, Belova paraliza, Creutzfeld-Jakobova bolest i neuro-degenerativna stanja u opštem smislu.

[0081] Osteoliza povezana sa kancerom, inflamacija povezana sa kancerom, bol povezan sa kancerom, kaheksija povezana sa kancerom, metastaze na kostima, akutni i hronični oblici bola, bez obzira da li su uzrokovani sa centralnim ili perifernim efektima TNFα i da li su klasifikovani kao inflamatorni, nociceptivni ili neuropatski oblici bola, šijatikus, bol u zadnjem delu leđa, sindrom karpalnog tunela, sindrom kompleksnog regionalnog bola (CRPS), giht, postherpetska neuralgija, fibromijalgija, stanja lokalnog bola, sindromi hroničnog bola zbog metastatskog tumora, dismenoreja.

[0082] Posebni poremećaji koje treba lečiti uključuju opšta stanja atritisa, reumatoidni artritis, osteoartritis, reaktivni artritis, juvenilni artritis; psorijaza uklj. psorijazni artritis; inflamatornu bolest creva, uključujući Kronovu bolest, ulcerativni kolitis uklj. proktitis, sigmoiditis, proktosigmoiditis, kolitis leve strane, ekstenzivni kolitis i pankolitis, nedefinisani kolitis, mikroskopski kolitis uklj. kolagenozni i limfocitni kolitis, kolitis u bolesti vezivnih tkiva, diverzijski kolitis, kolitis u divertikularnoj bolesti, eozinofilni kolitis i puhitis.

[0083] Najpoželjnije, antitelo iz pronalaska je korišćeno za lečenje inflamacije, posebno Kronove bolesti, ulcerativnog kolitisa ili mikroskopskog kolitisa. Kronova bolest može da bude bolest ileuma, debelog creva, ileokolonska ili izolovana gornja Kronova bolest (želudačna, dvanaestopalačna i/ili jejunalna) uključujući ne-strikturno/ne-prodirujuće, strikturno, prodirujuće i ponašanje perianalne

1

bolesti, omogućavanjem bilo koje kombinacije lokalizacije i ponašanja bolesti bilo kog od gore pomenutih. Ulcerativni kolitis može biti ulcetativni proktitis, proktosigmoiditis, kolitis leve strane, panulcerativni kolitis i puhitis.

Kombinovana terapija i drugi aspekti

[0084] Poželjno, pacijent koji je tretiran sa njegovim anti-TNFa antitelom je takođe tretiran sa drugim konvencionalnim lekom. Na primer, pacijent koji pati od inflamatorne bolesti creva, posebno ukoliko ima umerenu dosrednju bolest se obično takođe leči sa mesalazinom ili njeegovim derivatima ili prolekovima, kortikosteroidima, npr. budesonidom ili prednisolonom (oralni ili i.v.), imunosupresantima, npr. azatioprinom/6-merkaptopurinom (6-MP) ili metotreksatom, ciklosporinom ili takrolimusom. Drugi lekovi koji mogu da se istovremeno daju pacijentima uključuju druga anti-TNFα antitela (npr. infliksimab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol, golimumab), antagoniste integrina (npr. natalizumab, vedolizumab), anti-IL-23 antitela (npr. MEDI2070), anti-β7 antitela (npr. etrolizumab), JAK inhibitore u JAK/STAT putu (npr. tofacitinib), i druge. Drugi lekovi koji se mogu istovremeno davati pacijentu uključuju imunosupresante (npr. azatioprin/6-MP ili metotreksat ili oralni ciklosporin) da bi se održala stabilna i duža remisija. Još drugi aspekt iz pronalaska je upotreba anti-TNFα antitela kao što je ovde definisano gore u tekstu za smanjenje inflamacije.

[0085] Još drugi aspekt iz pronalaska je anti-TNFα antitelo kao što je ovde definisano gore u tekstu za uporebu u smanjenju inflamacije kod pacijenta koji pati od inflamatornog stanja.

[0086] Dalji aspekt ovog pronalaska je postupak za lečenje inflamatornog stanja, koji se sastoji iz davanja pacijentu kome je potrebno efikasne količine anti-TNFα antitela kao što je ovde definisano gore u tekstu. Inflamatorno stanje je poželjno jedno od stanja opisanih gore u tekstu.

[0087] Dalji aspekt ovog pronalaska je postupak za prevenciju inflamatornog stanja, koji se sastoji iz davanja pacijentu kome je potrebno efikasne količine anti-TNFα antitela kao što je ovde definisano gore u tekstu. Inflamatorno stanje je poželjno jedno od stanja opisanih gore u tekstu.

[0088] Dalje, ovde je opisan postupak za unapređenje transcitoze antitela usmerenog protiv TNFα, koij se sastoji iz uvođenja supstitucija E233P, L234V i L235A, delecije G236 i uvođenja sledećih supstitucija (a) ili (b):

(a) M252Y, S254T i T256E

(b) N434A;

i po potrebi drugog uvođenja jedne ili više drugih ovde opisanih supstitucija; tako da se dobije modifikovano antitelo koje ima unapređenu transcitozu. Modifikovano antitelo je poželjno antitelo kao što je ovde opisano gore u tekstu.

[0089] Dalje, ovde je opisan postupak za produženje polu-života u plazmi antitela usmerenog protiv TNFα, koji se sastoji iz uvođenja supstitucija E233P, L234V i L235A, delecije G236 i uvođenja sledećih supstitucija (a) or (b):

(a) M252Y, S254T i T256E

(b) N434A;

2

po potrebi drugog uvođenja jedne ili više drugih ovde opisanih supstitucija; tako da se dobije modifikovano antitelo koje ima produžen polu-život u plazmi. Modifikovano antitelo je poželjno antitelo kao što je ovde gore u tekstu opisano. Polu-život u plazmi može biti povećan za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, u odnosu na polu-život u plazmi ne-modifikovanog antitela (tj., odgovarajuće matično antitelo kome nedostaju navedene mutacije).

[0090] Dalje je ovde opisan postupak za poboljšanje rezistencije protiv proteolitičkog degradiranja antitela usmerenog prema TNFα, koji se sastoji iz uvođenja supstitucija E233P, L234V i L235A, delecije G236 i uvođenja sledećih supstitucija

(a) ili (b):

(a) M252Y, S254T i T256E

(b) N434A;

i dalje po potrebi uvođenja jednog ili više drugih ovde opisanih supstitucija; tako da se dobije modifikovano antitelo sa unapređenom rezistencijom prema proteolitičkom degradiranju. Modifikovano antitelo je poželjno antitelo kao što je ovde gore opisano.

Tabela 1. Pregled sekvenci u listi sekvenci.

(nastavak)

Primeri

Varijante antitela

[0091] Nekoliko varijanti anti-TNFα antitela (ovde naznačenog sa "matičnim antitelom" ili "At-wt") je dobijeno uvođenjem supstitucija u Fc regionu aminokiselinske sekvence antitela. Laki lanac At-wt ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:1, i težak lanac At-wt ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:2. Mutacije su uvedene uspostavljenim postupcima mutagene usmerene prema mestu. Ukratko, mutacije su uvedene pomoću PCR-om. Prednji prajmer je dizajniran da sadrži namenjenu mutaciju dok je reverzni prajmer dizajniran tako da sadrži 5’ krajeve dva prajmera vezana kraj sa krajem (ali se ne preklapaju) (Slika 10). PCR je pokrenut u 25 ciklusa (98°C za 10 s, 64°C za 30s, 72°C za 3 min). Pre nanošenja PCR proizvoda na agarozni gel, ne-mutirani PCR templejt je uklonjen iz ukupnih PCR proizvoda korišćenjem restrikcionog enzima Dpnl. Nakon prešićavanja PCR proizvoda na gelu lepljivi krajevi su spojeni da bi se dobio cirkularni plazmid koji je transformisan u kompetentne ćelije E.coli. Nakon inkubacije preko noći nekoliko kolonija je izabrano, plazmidna DNK je izolovana i sekvencirana da se potvrdi da je mutacija ugrađena..

Tabela 2: Generisane varijante antitela anti-TNFa antitela (EU numerisanje)

Primer 1. Afinitet prema TNFα

Postupak:

[0092] Afinitet prema TNFα je izmeren sa Biacore. CM5 čip je pripremljen korišćenjem standardnih Biacore postupaka imobilizacije amina. Nakon insercije CM5 čipa sistem je prajmovan i zatim je normalizovan sa BIA-normalizujućim rastvorom (Biacore Preventative Maintenance Kit 2). Čip je dodat u sistem sa fosfatno puferisanim slanim rastvorom Tween-20 (PBS-T) puferom za pokretanje; pre imobilizacije površina čipa je prajmovana sa tri injekcije 50 mM NaOH. Protein A je imobilizovan na površini čipa. Za ovo, protein je razblažen do 5 µg/mL u 10 mM acetatnom puferu na pH 4.5 i ubrizgan je tako da se dobije vezani odgovor ∼1000 RU’s u sve 4 protočne ćelije. Da bi se uklonio ne-kovalentno vezani materijal sa svih protočnih ćelija čipa, sprovedena su tri ispiranja 50 mM NaOH u trajanju 15 sekundi. Na Protein A čipu, antitelo je uhvaćeno u protočnim ćelijama 2 i 4, sa protočnim ćelijama 1 i 3 korišćenim za referentno oduzimanje. Ispitivana antitela su razblažena u PBS-T do 10 nM i 2.5-7.5 uL je ubrizgano da se dobije 120 RU uhvaćenog antitela. Analit TNFα je pripremljen u koncentraciji od 500 µg/mL u vodi prema instrukcijama dobavljača i dalje je razblažen u puferu za razdvajanje PBS-T. Kinetika jednog ciklusa je korišćena za procenu afiniteta u stabilnom stanju. Za svaku analizu jednog ciklusa ciklus titracije koncentracija 5 analita su ubrizani preko liganda i nakon toga je merena disocijacija kompleksa. Površina je regenerisana korišćenjem glicina pH 1.7. Korišćen je postupak dvostrukog referenciranja u kome podaci sa površine hvatanja vezane za ligand (fc 2 i 4) oduzimani sa referentnih površina gde ligand nije bio uhvaćen (fc 1 i 3 redom). Injekcije blanka ili pufera su nanošene svakih 3-4 ciklusa i zatim su oduzimane iz ciklusa ubrizgavanja analita, da bi se korigovale male promene u površini hvatanja liganda. Ponovljene injekcije analita na početku i kraju svakog analitičkog pokretanja su korišćene za proveru degradiranja uzorka, ili promenama u performansi instrumenta. Sve analize su izvedene na 25°C i uzorci su inkubirani na 10°C tokom eksperimentalnih izvođenja. Svaki eksperiment je izveden najmanje tri puta. Model vezivanja 1-prema-1 je korišćen za uklapanje dobijenih kinetičkih podataka.

Rezultati:

[0093] Sva antitela su ispoljila slične kinetike vezivanja prema TNFα što ukazuje da bilo koja uvedena modifikacija nije dovela do značajnih promena u regionu za vezivanje antigena.

Tabela 3: Kinetike vezivanja varijanti humanog IgG1 sa TNFα kao što je određeno sa SPR

Primer 2. Jačina

Postupak:

[0094] L929 ćelije su inkubirane sa 0.25 ng/mL TNFα i 1 µg/bunariću aktinomicina D u prisustvu serijskih razblaženja varijanti anti-TNFα antitela. Nakon inkubacije od 20 h na 37°C/5% CO2, proliferativni odgovori su mereni korišćenjem MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijuma i reagensom za kuplovanje elektrona (fenazin etosulfat, PES). MTS je konvertovan u proizvod formazana sa enzimima dehidrogenazama koje se nalaze u metabolički aktivnim ćelijama. Količina proizvoda formazana kao što je mereno apsorbancijom na 492 nm je bila direktno proporcionalna sa brojem živih ćelija u kulturi.

Rezultati:

2

[0095] Rezultati su prikazani na Slici 1. Uvođenje mutacija u Fc region anti-TNFα antitela nije imalo uticaja na jačinu.

Primer 3. Afinitet prema Fcγ receptorima (CD16a, CD16b)

Postupak:

[0096] Afinitet prema TNFα je izmeren sa Biacore. CM5 čip je pripremljen korišćenjem standardnih Biacore postupaka imobilizacije amina. Nakon insercije CM5 čipa sistem je prajmovan i zatim je normalizovan sa BIA-normalizujućim rastvorom (Biacore Preventative Maintenance Kit 2). Čip je dodat u sistem sa PBS-T puferom za pokretanje; pre imobilizacije površina čipa je prajmovana sa tri injekcije 50 mM NaOH. FcγRs su imobilizovani na površini čipa korišćenjem sistema za hvatanje Hisobeleživačem. anti-His obeleženi čip je dobijen prema Biacore kit instrukcijama, sa ∼12000 RU’s antitela deponovanog na sve 4 protočne ćelije. Da bi se uklonio ne-kovalentno vezani materijal sa svih protočnih ćelija čipa, sprovedena su tri ispiranja, tri ispiranja od 30 sekundi sa 10 mM glicinom pH 1.5. Receptori Fcγ su razblaženi u PBS-T do opsega 0.5-2 µg/mL, sa 2.5-5.0 µL ubrizganim na čip generisanjem nivoa hvatanja između 60 i 200 RU’s. Antitela su razblažena u PBS-T pre analize. Kinetika jednog ciklusa je korišćena za procenu afiniteta u stabilnom stanju. Za svaku analizu jednog ciklusa ciklus titracije koncentracija 5 antitela je ubrizana preko preko FcγR liganda i nakon toga je merena disocijacija kompleksa. Površina je regenerisana korišćenjem preporučenog rastvora, 10 mM glicina pH 1.5 za anti-His površinu hvatanja.Korišćen je postupak dvostrukog referenciranja u kome podaci sa površine hvatanja vezane za ligand (fc 2 i 4) oduzimani sa referentnih površina gde ligand nije bio uhvaćen (fc 1 i 3 redom). Injekcije blanka ili pufera su nanošene za svaki ciklus titracije antitela i zatim su oduzimane iz ciklusa ubrizgavanja analita, da bi se korigovale male promene u površini hvatanja liganda. Sve analize su izvedene na 25°C i uzorci su inkubirani na 10°C tokom eksperimentalnih izvođenja. Svaki eksperiment je izveden najmanje tri puta.

Rezultati:

[0097] Uvođenje mutacija nije imalo uticaja na afinitet prema CD16a(V), CD16a(F) i CD16b. Međutim, neke varijante antitela ispoljile su povećano vezivanje sa CD16a. Posebno At-A-DLE-PVAΔG je imalo unapređeno vezivanje sa nisko afinitetnim CD16a receptorom i prema CD16b.

[0098] Tabela 4: Afinitet prema Fcγ receptorima CD16a(V), CD16a(F) i CD16b kao što je određeno sa SPR. Prikazana je srednja vrednost i standardna devijacija afiniteta su izračunati na osnovu dva ili više nezavisnih eksperimenata.

[0099] SPR je izvedena korišećenjem Biacore 3000 instrumenta sa CM5 senzorskim čipovima spojenim sa anti-TNFα IgG1 antitelima (-500 jedinice rezonancije (RU)) korišćenjem hemije za kuplovanje amina kao što je opisano od strane proizvođača. Kuplovanje je sprovedeno ubrizgavanjem 2.0 ug/mL svakog proteina u 10 mM natrijum acetatu, pH 4.5, korišćenjem kita za kuplovanje amina (GE Healthcare). HBS-P pufer pH 7.4 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% surfaktant P20) ili fosfatni pufer pH 6.0 (67 nM fosfatni pufer, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20) su korišćeni kao pufer za izvođenje i razblaživanje. Kinetike vezivanja su određene ubrizgavanjem titriranih količina (1000 - 31.2 nM) monomernog Hisobeleženog humanog FcRn (hFcRn) preko imobilizovanih antitela na pH 7.4 ili pH 6.0. Svi SPR eksperimenti su sprovedeni na 25°C sa brzinom protoka od 40 ul/min. Podaci vezivanja su bili podešeni na nulu, i referentna vrednost je oduzeta. Model vezivanja liganda Langmuir 1:1 obezbeđen od strane BIAevaluation softvera (verzija 4.1) je korišćen da bi se odredile kinetike vezivanja.

[0100] Rezultati su pokazali da se divlji tip antitela At-wt vezuje strogo od pH zavisno prema hFcRn. Sve dizajnirane varijante antitela imaju veći afinitet prema FcRn na pH 6.0, ali drže njihovu zavisnost od pH i nisu se vezivali za receptor na pH 7.4. Sve varijante antitela su pokazale unapređen vezivanje sa FcRn u poređenju sa infliksimabom koji sadrži divlji tip Fc regiona IgG1.

Primer 5. Transcitoza

Postupak:

2

[0101] Transwell filteri (1.12 cm ) sa kolagenom obloženim politetrafluoroetilenskim (PTFE) membranama sa veličinom pora od 0.4 µm su inkubirani O/N u kompletnom medijumu za rast nakon čega je zasejano 1.0 x 10<6>T84 ćelija po bunariću. Transepitelijani električni otpor (TEER) je dnevno praćen korišćenjem MILLICELL-ERS-2 volt-ohm metra. Kulture su gajene tokom 4 - 5 dana pre dostizanja konfluentnosti sa TEER vrednosti ∼1000 - 1300 Ω x cm2. Pre eksperimenata monoslojevi su izgladnjivani tokom 1 h u Hank-ovom balansiranom slanom rastvoru (HBSS). Zatim, 400 nM varijanti antitela ili samog IFX alone ili zajedno sa 4000 nM IgG humanog mijeloma sa irelevantnom specifičnosti je dodato u apikalnu Transwell komoru. Uzorci su sakupljeni sa bazolateralnog rezervoara 0 i 4 h nakon davanja. Koncentracije antitela u bazolateralnom rezervoaru su određene pmoću ELISA. Ukratko, Maxisorp ploče sa 96 bunarića su obložene O/N sa ili rekombinantnim TNFα ili anti-humanim Fc specifičnim antitelom iz koze, oba razblažena do 1 µg/ml u PBS-u. Nakon toga, ploče su blokirane sa PBS koji se sastoji iz 4% obranog mleka za 2 h na RT nakon čega sledi ispiranje 4 puta sa PBS koji se sastoji iz 0.05% Tween 20. Uzorci koji su sakupljeni tokom eksperimenata transcitoze su dodati u bunariće i inkubirani su tokom 2 h na RT pre ispiranja kao što je gore navedeno. Uhvaćene varijante antitela, IFX ili ukupni IgG su detektovani korišćenjem alkalnom fosfatazom (ALP)-konjugovanog antihumanog Fc specifičnog antitela iz koze. Vezivanje je vizuelizovano dodavanjem 100 µml ALP-supstrata i apsorpcija na 405 nm spektru je zabeležena. Količina varijante antitela, IFX i ukupnog transportovanog IgG su izračunate sa standardnih kriva od svake individualne varijante antitela.

2

Transcitoza varijanti antitela kroz polarizovane humane epitelijalne ćelije

Rezultati:

[0102] Modifikovane varijante anti-TNFa antitela su ispitivane za transcitozu kroz ćelijski monosloj i upoređene su sa wt antitela ili sa IFX kao drugim humanim IgG1 anti-TNFα antitelom. Rezultati su prikazani na Slici 2. Divlji tip anti-TNFa antitela je transportovan sa apikalne prema bazolateralnom rezervoaru. Od panela modifikovanih varijanti antitela za unapređeno vezivanje FcRn, pokazano je da je At-YTE-DLE-PVAΔG bilo više oslobođeno na bazolateralnoj strani u poređenju sa At-wt. U proeđenju sa IFX, drugo IgG1 antitelo sa wt Fc regionom, At-A-DLE-PVAΔG je transportovano oko 1.8-puta efikasnije.

Transcitoza varijanti antitela kroz polarizovane humane epitelijalne ćelije u prisusutvu konkurentskog IgG

Rezultati:

[0103] Ukupna količina transportovanog imunoglobulina kroz polarizovani T84 ćelijski monosloj sa apikalne prema bazolateralnom rezervoaru kada su varijante anti-TNFα antitela inkubirane sa 10-strukim viškom IgG humanog imunoglobulina na 4 h nakon dodavanja je bila uporediva za sva antitela. Međutim, povećani afinitet prema FcRn na pH 6.0 doveo je do značajno većeg procenta specifičnog transporta anti-TNFα kroz ćelijski monosloj takoše u prisustvu viška konkurentskog humanog IgG sa irelevantnom specifičnosti. Rezultati su prikazani na Slici 3.

Primer 6. ADCC

Postupak:

[0104] Korišćen je ADCC reporter bioassay core kit od Promega. Ukratko, mTNFα CHO-K1 ciljane ćelije na 1 x 105/mL su zasejane na belim (providno dno) pločama za kulturu tkiva, 100 µL po bunariću. Ploče su inkubirane O/N na 37°C/5% CO2. U danu 2, 95 µL test medijuma je uklonjeno i zamenjeno je sa 25 µL modifikovanim Jurkat efektorskim ćelijama u konc. 3 x 106/mL. Ploče su zatim inkubirane 6 h na 37°C/5% CO2. BioGloTM reagens je pripremljen pred kraj inkubacije. Ploče su ekvilibrisane prema RT tokom 10 - 20 min pre dodavanja 75 µL BioGloTM reagensa po bunariću. Nakon 5 - 10 min inkubiranja u mraku, merena je luminiscencija.4-PL model je korišćen za uklapanje podataka.

Rezultati:

[0105] Rezultati (videti Sliku 4) su pokazali da je svako od anti-TNFα antitela indukovalo ADCC ali različitih jačina. U poređenju sa antitelom divljeg tipa At-wt, At-A-AEA-PVAΔG je pokazalo sličnu ADCC aktivnost, dok su druge varijante antitela pokazala povećanu ADCC. Specifično je At-A-DLE-PVAΔG imalo značajno povećanu ADCC.

Primer 7. Indukcija regulatornih makrofaga

Postupak:

[0106] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz slojeva istaloženih leukocita i trombocita zdravih donora. Ćelije su izolovane centrifugiranjem na gradijentu Fikola. Ćelije iz dva indicidualna donora su pomešane u jednakim brojevima i 2 x 10<5>ćelija smeše je zasejano u ploče sa

2

96 bunarića u ukupnoj zapremini od 100 µL/bunariću. Ćelije su inkubirane 48 h na 37°C/5% CO2. Nakon 48 h, varijante anti-TNFa antitela ili IFX su dodate da bi se dostigla finalna koncentracija od 10 µg/mL. Svako jedinjenje je dodavano u replikatima od pet ili šest. Finalna zapremina je bila 150 µL/bunariću. Kao kontrola je korišćen IgG1 iz humanog seruma (Sigma #I5154). Nakon dodavanja jedinjenje, reakcije pomešanih limfocita (MLRs) su kultivisane dodatnih 4 dana na 37°C/5% CO2. Nakon toga, ploče su isprane korišćenjem PBS/5 mM EDTA (PBS/EDTA) i inkubirane su sa 50 µL/bunariću PBS/ EDTA tokom 20 min na RT. Ploče su centrifugirane i tečnost je odlivena. Antitelo je razblaženo u PBS/EDTA (anti-CD14-PE, anti-CD206-APC, oba razblažena 1:10). Ćelije su resuspendovane u 50 µL rastvorenog antitela i inkubirane su 20 min na (sobnoj temperaturi) RT. Nakon toga, ćelije su isprane sa PBS/EDTA i resuspendovane su u 50 µL PBS/EDTA. Obojeni uzorci su analizirani sa FACS Fortessa korišćenjem FACSDiva softvera. Analiza je sprovedena korišćenjem FlowJo softvera.

Rezultati:

[0107] Indukcija regulatornih makrofaga je analizirana u četiri nezavisne MLRe i bila je uspešna u svim eksperimentima (u poređenju IFX sa IgG kontrolom). Rezultati su prikazani na Slici 5. Nivoi indukcije sa IFX mogu da budu različiti između eksperimenata zbog činjenice da je svaki eksperiment izveden korišćenjem razlitih donora sa inter-individualnom varijacijom. Sve ispitane varijante anti-TNFα antitela indukovale su CD14+CD206<+>regulatorne makrofage sa malim varijacijama između jedinjenja. At-A-DLE-PVAΔG je indukovao više regulatornih marofaga u odnosu na IFX.

Primer 8. Inhibicija proliferacije T-ćelija

Postupak:

[0108] PBMC su izolovane iz slojeva istaloženih leukocita i trombocita zdravih donora. Ćelije su izolovane centrifugiranjem na gradijentu Fikola. Ćelije iz dva indicidualna donora su pomešane u jednakim brojevima i 2 x 10<5>ćelija smeše je zasejano u ploče sa 96 bunarića u ukupnoj zapremini od 100 µL/bunariću. Ćelije su inkubirane 48 h na 37°C/5% CO2. Nakon 48 h, varijante anti-TNFa antitela ili IFX su dodate da bi se dostigla finalna koncentracija 10 µg/mL. Svako jedinjenje je dodato u replikatima od pet ili šest. Finalna zapremina je bila 150 µL/bunariću. IgG1 iz humanog seruma (Sigma #I5154) je korišćen kao kontrola. Nakon dodavanja jedinjenja, reakcije pomešanih limfocita (MLRs) su gajene u kulturi dodatnih 2 dana na 37°C/5% CO2. Nakon toga, timidin obeležen tricijumom (3H timidin, 0.5 mikroKiri/bunariću) je dodat u kulture. Kulture su dalje inkubirane 18 h na 37°C/5% CO2. Uzorci su sakupljeni korišćenjem Microbeta Filtermat 96 cell harvester i analizirani su korišćenjem Microbeta MicroplateCounter opremljenim sa jednim detektorom. Uzorci su brojeni tokom 10 sekundi/bunariću i konvertovani su u intenzitete po minuti (cpm).

Rezultati:

[0109] Inhibicija proliferacije T-ćelija je merena u tri nezavisne MLR i definisana je kao uspešna ukoliko je IFX kao pozitivna kontrola indukovala supresiju. Nivoi supresije od strane IFX u individualnim eksperimentima mogu se razlikovati verovatno zbog varijanse u indukovanju regulatornog makrofaga. U svakom eksperimentu, potencijal varijanti anti-TNFα antitela za supresiju proliferacije T-ćelija je izračunat u odnosu na IFX pozitivnu kontrolu. Antitelo At-A-DLE-PVAΔG je pokazalo značajno pojačanu supresiju u poređenju sa IFX dok je supresija od strane At-YTE-DLE-PVAΔG bila uporediva sa IFX (videti Sliku 6).

2

Primer 9. Stabilnost proteaze

Postupci:

[0110] Analiza je sprovedena u redukujućim i neredukujućim uslovima. Odgovarajući pufer za uzorke od PerkinElmer kompleta reagensa za ekspresiju proteina sa i bez redukcionog sredstva DTT je korišćen za zaustavljanje reakcije (tj. kao sredstva za zaustavljanje).

[0111] Da bi mogli da razlikuju varijante, količina proteaze po IgG je izabrana prema sledećem da bi vremenski profili degradacije mogli da se dobiju između 30 h. Analiza je sprovedena korišćenjem sistema elektroforeze zasnovanog na mikročipu.

Digestija IdeS

[0112] Da bi se dobio radni rastvor (ws), jedan alikvot IdeS je rekonstituisan u 100 mL Milli-Q vode. IdeS ws i uzorci su kombinovani u odnosu 1:1 (v/v) i intenzivno homogenizovani. Rastvor je inkubiran na 37 °C, uzorci su povučeni na 5, 10, 30, 60 minuta i zaustavljeni sa jednim od reagenasa za zaustavljanje. Molarni odnos proteaza/IgG: 4:1.

Digestija GluC

[0113] Da bi se dobio radni rastvor (ws), štok GluC je razblažen sa 2X GluC reakcionim puferom do koncentracije 50 µg/mL. GluC ws i uzorci su kombinovani u odnosu 1:1 (v/v) i intenzivno homogenizovani. Rastvor je inkubiran 37 °C, uzorci su povučeni na 2, 6, 24, 30 h i zaustavljeni sa jednim od reagenasa za zaustavljanje. Molarni odnos IgG/proteaza: 4:1.

Digestija MMP-3

[0114] Štok himotripsina je rastovoren sa puferom za ispitivanje MMP do 50 µg/mL. MMP-30.186 mg/mL je dodat sa razblaženim himotripsinom u odnosu 1:1 (v/v) i inkubiran je na 37 °C tokom 30 minuta. Aktivacija je zaustavljena sa PMSF u finalnoj koncentraciji 2 mM. Da bi se dobio radni rastvor (ws), aktivirana MMP-3 je razblažena u puferu za ispitivanje MMP do 3.72 µg/mL.

[0115] MMP-3 ws i uzorci su kombinovani u odnosu 1:1 (v/v) i intenzivno su homogenizovani. Rastvor je inkubiran na 37 °C, uzorci su povučeni nakon 2, 6, 24, 30 h i zaustavljeni sa jednim od reagenasa za zaustavljanje. Molarni odnos IgG/proteaza: 98:1.

Rezultati:

[0116] Ispitane varijante antitela su pokazale odličnu rezistentnost prema proteolitičkom degradiranju od strane MMP-3 i IdeS, i dobru rezistentnost prema degradaciji od strane GluC (videti Slike 7-9).

2

1

�

4

�

4

1

2

4

�

2

�

Claims

Patentni zahtevi

1. IgG1antitelo koje se sastoji iz domena za vezivanje TNFα i FcRn vezujućeg mesta, gde aminokiselinska sekvenca antitela se sastoji iz, u vezi sa EU sistemom numerisanja,

(i) aminokiseline 233P, 234V, 235A, i deleciju aminokiseline na poziciji 236;

(ii) (ii) aminokiselinu 434A ili aminokiseline 252Y, 254T i 256E; i

(iii) (iii) aminokiseline 239D, 330L i 332E;

u Fc regionu humanog IgG; i gde se antitelo sastoji iz (i) VLdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO:10, i (ii) VHdomena koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO:9.

2. Antitelo prema zahtevu 1, gde se aminokiselinska sekvenca antitela sastoji iz aminokiselina 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E i 434A, i delecije na poziciji aminokiseline 236.

3. Antitelo prema zahtevu 1, gde se aminokiselinska sekvenca antitela sastoji iz aminokiselina 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E, 252Y, 254T i 256E, i delecije na poziciji aminokiseline 236.

4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je transportovano kroz polarizovani ćelijski monosloj sa apikalne strane prema bazolateralnoj strani u većoj količinu u odnosu na kontrolno antitelo koje se sastoji iz lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:1 i teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je predstavljena u SEQ ID NO:2.

5. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva.

6. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju inflamatornog stanja.

7. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, gde je inflamatorno stanje inflamatorni poremećaj gastrointestinalnog trakta.

8. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, gde pomenuti tretman obuhvata oralno davanje efikasne količine pomenutog antitela.

9. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, gde se pomenuto antitelo primenjuje lokalno.

10. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4.