WO2012144208A1 - 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は,日本特許出願2011-092488(2011年4月18日出願)に基づく優先権を主張しており,この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は、ITM2Aタンパク質に結合する抗体、癌の診断方法、治療方法および抗癌剤に関する。
〔1〕配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するITM2Aタンパク質の断片に結合するモノクローナル抗体、
〔2〕前記断片が配列番号1で表されるアミノ酸配列の75から227番目のアミノ酸からなる断片であることを特徴とする〔1〕に記載の抗体、
〔3〕細胞傷害活性を有する〔1〕又は〔2〕に記載の抗体、
〔4〕前記細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性である〔3〕に記載の抗体、
〔5〕前記細胞傷害活性が、補体依存性細胞傷害(CDC)活性である〔3〕に記載の抗体、
〔6〕細胞傷害性物質が結合した抗体である〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体、
〔7〕インターナライズ活性を有する抗体である〔6〕に記載の抗体、
〔8〕癌細胞の増殖を抑制する抗体である〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の抗体、
〔9〕前記癌細胞が、ユーイング肉腫細胞である〔8〕に記載の抗体、
〔10〕前記ユーイング肉腫細胞が、染色体転座が観察される細胞であることを特徴とする〔9〕に記載の抗体、
〔11〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔10〕に記載の抗体、
〔12〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔8〕に記載の抗体、
〔13〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔12〕に記載の抗体、
〔14〕以下(1)から(27)のいずれかに記載の抗体;
(1)CDR1として配列番号:3に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:5に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)CDR1として配列番号:6に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:7に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖、および(2)に記載のL鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:9に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:10に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:11に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(5)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:13に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:14に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(7)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:16に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:17に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(8)CDR1として配列番号:18に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:19に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(9)(7)に記載のH鎖、および(8)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:21に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:22に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)CDR1として配列番号:24に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:25に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体、
(13)キメラ抗体である(1)から(12)に記載の抗体、
(14)ヒト化抗体である(1)から(12)に記載の抗体、
(15)配列番号28に記載のアミノ酸配列を含む(1)又は(3)記載の抗体、
(16)配列番号30に記載のアミノ酸配列を含む(2)又は(3)記載の抗体、
(17)配列番号32に記載のアミノ酸配列を含む(4)又は(6)記載の抗体、
(18)配列番号34に記載のアミノ酸配列を含む(5)又は(6)記載の抗体、
(19)配列番号36に記載のアミノ酸配列を含む(7)又は(9)記載の抗体、
(20)配列番号38に記載のアミノ酸配列を含む(8)又は(9)記載の抗体、
(21)配列番号40に記載のアミノ酸配列を含む(10)又は(12)記載の抗体、
(22)配列番号42に記載のアミノ酸配列を含む(11)又は(12)記載の抗体、
(23)キメラ抗体である(15)から(22)に記載の抗体、
(24)(1)~(23)いずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入され、かつ、その抗体と同等の活性又は同等の結合活性を有する抗体、
(25)第2の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第2の抗体は、それぞれ(1)~(23)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体、
(26)配列番号1で表されるアミノ酸配列の75から227番目のアミノ酸からなるITM2Aタンパク質の断片に対する第2の抗体の結合を阻害することができる抗体であって、前記第2の抗体は、それぞれ(1)~(23)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体、
〔15〕ヒト定常領域を有する抗体である〔1〕~〔14〕のいずれかに記載の抗体、
〔16〕キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔15〕に記載の抗体、
〔17〕糖鎖に付加するフコースが欠損した、または、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体である〔1〕~〔16〕のいずれかに記載の抗体、
〔18〕〔1〕から〔17〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物、
〔19〕〔1〕から〔17〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、
〔20〕〔1〕から〔17〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する抗癌剤、
〔21〕治療対象となる癌がユーイング肉腫である、〔20〕に記載の抗癌剤、
〔22〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔21〕に記載の抗癌剤、
〔23〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔22〕に記載の抗癌剤、
〔24〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔20〕に記載の抗癌剤、
〔25〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔24〕に記載の抗癌剤、
〔26〕〔1〕から〔17〕のいずれかに記載の抗体を投与することを含む癌を治療する方法、
〔27〕治療対象となる癌がユーイング肉腫である、〔26〕に記載の方法、
〔28〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔27〕に記載の方法、
〔29〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔28〕に記載の方法、
〔30〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔26〕に記載の方法、
〔31〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔30〕に記載の方法、
〔32〕〔1〕から〔17〕のいずれかに記載の抗体を投与することによる癌治療の奏功性を予測する方法であって、被験者から採取された生体試料中のITM2Aの発現レベルを検出する工程を含む方法、
〔33〕被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を検出することを特徴とする〔32〕に記載の方法、
〔34〕ITM2Aタンパク質の検出がITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて行なわれる〔33〕に記載の診断方法、
〔35〕治療対象となる癌がユーイング肉腫である、〔32〕から〔34〕のいずれかに記載の方法、
〔36〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔35〕に記載の方法、
〔37〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔36〕に記載の方法、
〔38〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔35〕に記載の方法、
〔39〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔38〕に記載の方法、
〔40〕被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を検出することを特徴とする、被験者における癌の存在を決定する方法、
〔41〕以下の工程を含む、被験者における癌の存在を決定する方法;
(a) 被験者から採取された試料を提供する工程、
(b) (a)の試料に含まれるITM2Aタンパク質を、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程、
〔42〕以下の工程を含む、被験者における癌の存在を決定する方法;
(a) ITM2Aタンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体を被験者に投与する工程、
(b) 前記放射性同位元素の集積を検出する工程、
〔43〕前記存在を決定する対象となる癌がユーイング肉腫である〔40〕から〔42〕のいずれかに記載の方法、
〔44〕前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする〔43〕に記載の方法、
〔45〕前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする〔44〕に記載の方法、
〔46〕前記癌細胞が血液癌の細胞である〔43〕に記載の方法、
〔47〕前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである〔46〕に記載の方法。
本発明においてITM2Aは、II型膜タンパク質である。ヒトITM2Aのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれNCBI登録番号NP_004858.1(配列番号:1)及びNM_004867.4(配列番号:2)に開示されている。また、本発明で用いられるITM2Aはスプライシングバリアントや変異体であってもよい。本発明において、ITM2Aタンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、ITM2Aタンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のITM2Aタンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例として、ITM2Aタンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。ITM2Aタンパク質の細胞外領域は配列番号:1のアミノ酸配列において75-263番目が相当する。また、別の態様において、断片の例として配列番号:1で表されるITM2Aタンパク質の75-227番目のアミノ酸からなるポリペプチドも好適な例として挙げられる。
本発明で用いられる抗ITM2A抗体は、ITM2Aタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用され得る。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルが、抗体として利用され得るが、モノクローナル抗体が好適に使用され得る。抗体のITM2Aタンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。又、本発明で用いられる抗ITM2A抗体がヒトITM2Aを認識する抗体である場合、ヒトITM2Aを特異的に認識する抗体が使用され得るし、他の動物由来のITM2A(例えば、マウスITM2A)を同時に認識する抗体も好適に使用され得る。
ヒトITM2Aのアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド
ITM2A遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド
ITM2Aタンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド
-ITM2Aのような膜タンパク質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
-免疫抗原を精製する必要が無い
P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123, 1548-1550)
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)
NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519)
MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415)
SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270)
FO(de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21)
S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978)148, 313-323)
R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133)等
グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299)
AGPC法(Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.(1987)162, 156-159)
(1) 得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をITM2Aに接触させる工程、
(2) ITM2Aと抗体が結合した複合体を検出する工程、および
(3) ITM2Aに結合する抗体を選択する工程
(1)哺乳類細胞:CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属
アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子
チミジンキナーゼ(TK)遺伝子
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子
ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等
パパイン消化:F(ab)2またはFab
ペプシン消化:F(ab’)2またはFab’
プラスミン消化:Facb
このような酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用することによって、抗体の任意の部分が欠失される。
抗体のH鎖またはVHをコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはVLをコードするDNA配列
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号:79)
Ser・Gly・Gly・Gly (配列番号:80)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号:81)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号:82)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号:83)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号:84)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser (配列番号:85)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly (配列番号:86)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n
[nは1以上の整数である]
[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、
ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、
ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、
エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ-EGS)、
ジスクシンイミジル酒石酸塩(DST)、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩(スルホ-DST)、
ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、および
ビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)など
ジフテリアトキシンA鎖(Diphtheria toxin A Chain)(Langone J.J.,et al., Methods in Enzymology (1983) 93, 307-308)
シュードモナスエンドトキシン(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine (1996) 2, 350-353)
リシン鎖(Ricin A Chain)(Fulton R.J. et al., J.Biol.Chem. (1986) 261, 5314-5319; Sivam G. et al., Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135,15-24; Wawrzynczak E.J. et al., Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Gheeite V. et al., J.Immunol.Methods (1991) 142,223-230)
無糖鎖リシンA鎖(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe P.E. et al., Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
アブリンA鎖(Abrin A Chain)(Wawrzynczak E.J. et al., Br.J.Cancer (1992) 66, 361-366; Wawrzynczak E.J.,et al. Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Sivam G.,et al. Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Thorpe P.E. et al., Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931)
ゲロニン(Gelonin)(Sivam G. et al., Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173; Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135, 15-24; WawrzynczakE.J. et al. Cancer Res., (1990) 50, 7519-7562; Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ポークウイード抗ウィルス蛋白(PAP-s; Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ブリオジン(Briodin)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
サポリン(Saporin)(Bolognesi A.,et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
モモルジン(Momordin)(Cumber A.J. et al., J.Immunol.Methods (1990) 135, 15-24; Wawrzynczak E.J. et al., Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562; Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ジアンシン32(Dianthin 32)(Bolognesi A. et al., Clin.exp.Immunol. (1992) 89, 341-346)
ジアンシン30(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8)
モデッシン(Modeccin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8)
ビスカミン(Viscumin)(Stirpe F., Barbieri L.,FEBS letter (1986) 195, 1-8)
ボルケシン(Volkesin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195, 1-8)
ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8)
トリチン(Tritin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8)
ルフィン(Luffin)(Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter (1986) 195,1-8)
トリコキリン(Trichokirin)(Casellas P., et al., Eur.J.Biochem. (1988) 176, 581-588; Bolognesi A., et al., Clin.exp.Immunol., (1992) 89, 341-346)。
グリコシル化が修飾された抗体(WO1999054342等)、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体(WO2000061739、WO2002031140、WO2006067913等)、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体(WO2002079255等)。
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で当該脾臓細胞が洗浄された後、細胞濃度を5x106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製され得る。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈することによって、補体溶液が調製され得る。
(3)標的細胞の調製
ITM2Aタンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより当該標的細胞が放射性標識され得る。ITM2Aタンパク質を発現する細胞としては、ITM2Aタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、ユーイング肉腫細胞、急性骨髄性白血病細胞、T細胞性リンパ腫細胞、T細胞性リンパ性白血病細胞等が使用され得る。放射性標識後に10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄された細胞の濃度を2x105/mlに調製することによって、当該標的細胞が調製され得る。
Aは各試料における放射活性(cpm)、
Bは1% NP-40(nacalai tesque社製)を加えた試料における放射活性(cpm)、
Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性(cpm)、
を使用することによって、細胞傷害活性(%)は(A-C)/(B-C)x100の計算式に基づいて計算され得る。
(1)CDR1として配列番号:3に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:5に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)CDR1として配列番号:6に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:7に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖、および(2)に記載のL鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:9に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:10に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:11に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(5)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:13に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:14に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(7)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:16に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:17に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(8)CDR1として配列番号:18に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:19に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(9)(7)に記載のH鎖、および(8)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:21に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:22に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)CDR1として配列番号:24に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:25に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体、
(13)キメラ抗体である(1)から(12)に記載の抗体、
(14)ヒト化抗体である(1)から(12)に記載の抗体、
(15)配列番号28に記載のアミノ酸配列を含む(1)又は(3)記載の抗体、
(16)配列番号30に記載のアミノ酸配列を含む(2)又は(3)記載の抗体、
(17)配列番号32に記載のアミノ酸配列を含む(4)又は(6)記載の抗体、
(18)配列番号34に記載のアミノ酸配列を含む(5)又は(6)記載の抗体、
(19)配列番号36に記載のアミノ酸配列を含む(7)又は(9)記載の抗体、
(20)配列番号38に記載のアミノ酸配列を含む(8)又は(9)記載の抗体、
(21)配列番号40に記載のアミノ酸配列を含む(10)又は(12)記載の抗体、
(22)配列番号42に記載のアミノ酸配列を含む(11)又は(12)記載の抗体、
(23)キメラ抗体である(15)から(22)に記載の抗体、
(24)(1)~(23)いずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入され、かつ、その抗体と同等の活性又は同等の結合活性を有する抗体、
(25)第2の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第2の抗体は、それぞれ(1)~(23)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体。
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)
(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す)
別の観点においては、本発明は、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明はITM2Aタンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤に関する。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。後に実施例で示されるように、ITM2Aの発現レベルは正常細胞では低い一方、癌細胞では亢進していることから、抗ITM2A抗体の投与によって、癌細胞特異的な細胞傷害作用が得られると考えられる。
(a) 被験者から採取された試料を提供する工程、
(b) 採取された試料に含まれるITM2Aタンパク質を、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。
単にITM2Aタンパク質が存在するか否かの測定
ITM2Aタンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
ITM2Aタンパク質の量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など
一方、定量的な検出とは、ITM2Aタンパク質の濃度の測定、ITM2Aタンパク質の量の測定などを挙げることができる。
(1) 被験者から採取された生体試料中のITM2Aの発現レベルを検出する工程、および
(2) (1)で検出されたITM2Aの発現レベルが、対照と比較して高い場合に被験者が癌を有すると判定される工程。
ラジオイムノアッセイ(RIA)、
エンザイムイムノアッセイ(EIA)、
蛍光イムノアッセイ(FIA)、
発光イムノアッセイ(LIA)、
免疫沈降法(IP)、
免疫比濁法(TIA)、
ウエスタンブロット(WB)、
免疫組織化学(IHC)法、
免疫拡散法(SRID)。
Human Exon 1.0 ST Array(Affymetrix)を用いて、ユーイング肉腫臨床サンプル、ユーイング肉腫細胞株、血液癌細胞株、および正常組織におけるITM2A mRNAの発現が測定された。発現解析には、図1に示される各サンプルのtotal RNA 1μgが用いられた。当該解析は、GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual(Affymetrix)に記載された方法に準じて実施された。データの数値化にはExon Array Computational Toolソフトウェア(Affymetrix)が用いられた。当該解析に用いる正常組織のtotal RNAとして、Clontech、Ambion、Stratagene、Cell Applications、Panomics、ChemiconおよびBiochain Instituteから購入した正常組織由来のtotal RNAが使用された。(インフォームドコンセントが得られた上で取得された)臨床癌組織の腫瘍部や正常部、癌細胞株から、Trizol(Invitrogen)またはIsogen(Nippon Gene)を用いてこれらの製品添付の方法に従ってtotal RNAが調製された。ITM2Aのコアプローブセット(プローブセットID; 4013550、4013551、4013552、4013553、4013554、4013557、4013559、4013560、4013561、4013564、4013565)の数値の平均値が発現データとして見積もられた。
(2-1)ITM2Aのクローニング
癌細胞株IM9からTrizolを用いて調製されたtotal RNAを鋳型として、SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いてcDNAが作製された。このcDNAを鋳型として、フォワードプライマー(配列番号:43)とリバースプライマー(配列番号44)を用いてITM2AがPCRによって増幅された。PCRにはPrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara Bio)が用いられ、98℃ 10秒、55℃ 15秒、68℃ 1分からなる反応サイクルが30サイクル反復された。当該PCRから生成された増幅産物が、pCR2.1-TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングされ、pCR2.1_ITM2Aが得られた。pCR2.1_ITM2Aの挿入配列をシークエンスすることによって、当該挿入配列がRefSeq Accession No. NM_004867.4で登録された配列と同じであることが確認された。
(http://www.uniprot.org/を用いた解析の結果Tyr75-Glu263であると推定された)ITM2A細胞外領域が、哺乳動物細胞用発現ベクター(pMCN2i)にクローニングされた。pMCN2iはマウスCMVプロモーター(GenBank Accession No. U68299)の制御下で挿入遺伝子が発現誘導を可能とし、ネオマイシン耐性遺伝子が組み込まれたベクターである。シグナル配列にはマウスインターロイキン3のシグナル配列が用いられた。まず、pCR2.1_ITM2Aを鋳型として、SfiIサイトを有するフォワードプライマー(配列番号:45)とNotIサイトを有するリバースプライマー(配列番号:46)を用いてITM2A細胞外領域がPCRによって増幅された。当該PCRから生成された増幅産物がpCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのSfiIとNotIを用いた消化断片が、pMCN2i_mIL3ss-mIgG2aFcベクターのSfiI-NotIサイトにクローニングされたプラスミド(pMCN2i_mIL3ss-ITM2Aoutside)が得られた。pMCN2i_mIL3ss-mIgG2aFcベクターには、EcoRI-SfiIサイトにマウスインターロイキン3シグナル配列がクローニングされており、CpoI-NotIサイトにマウスIgG2a抗体Fc領域がクローニングされている。pMCN2i_mIL3ss-ITM2AoutsideのITM2A細胞外領域を含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号:47に、アミノ酸配列が配列番号:48に示される。
ITM2A細胞外領域(Tyr75-Glu263)とマウスIgG2aのFc領域の融合タンパク(ITM2A-Fc)が作製された。まず、pCR2.1_ITM2Aを鋳型として、SfiIサイトを有するフォワードプライマー(配列番号:49)とCpoIサイトを有するリバースプライマー(配列番号:50)を用いてPCRによって増幅されたITM2A細胞外領域が、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのSfiIとCpoIを用いた消化断片が、pMCN2i_mIL3ss-mIgG2aFcベクターのSfiI-CpoIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i_mIL3ss-ITM2Aoutside-Fcが得られた。pMCN2i_mIL3ss-ITM2Aoutside-FcのITM2A-Fcを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号:51に、アミノ酸配列が配列番号:52に示される。
C末端にHAタグを付加されたITM2AがpMCN2iベクターにクローニングされた。まず、pCR2.1_ITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー(配列番号:53)とNotIサイトおよびHAタグ配列を有するリバースプライマー(配列番号:54)を用いてPCRによって増幅されたITM2Aが、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのEcoRIとNotIを用いた消化断片が、pMCN2iベクターのEcoRI-NotIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i_ITM2A-HAが得られた。pMCN2i_ITM2A-HAのITM2Aを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号:55に、アミノ酸配列が配列番号:56に示される。PvuIで消化されたpMCN2i_ITM2A-HAが、DG44細胞へエレクトロポレーションにより形質導入された。ジェネティシン(500μg/mL)で形質導入株を選抜することにより、C末端HAタグ付加ITM2Aを定常的に発現するCHO細胞株が樹立された(ITM2A_CHO)。
Balb/cマウス(メス、8週令、日本チャールス・リバー株式会社)に対し、Helios Gene Gun(Bio-Rad)を用いて7回DNA免疫が行われた(day 0、7、11、14、17、21、24)。DNA免疫にはpMCN2i_mIL3ss-ITM2Aoutsideが用いられた。DNA免疫に続いて、フロインド不完全アジュバント(Freund Incomplete Adjuvant)(BD Diagnostics)と混合された50μg のITM2A-Fcタンパク質が皮下に注射された(day 49、91、99、107)。Day 115に50μgのITM2A-Fcタンパク質がアジュバントと混合されることなく尾静脈から投与され、その3日後に摘出された脾臓を出発材料として用いてハイブリドーマが作製された。まず、摘出された脾臓細胞がマウスミエローマ細胞株P3-X63Ag8U1(P3U1、ATCC)と2:1になるように混合され、混合液に対してPEG1500(Roche Diagnostics)を徐々に加えることによって、細胞融合が行われた。ペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたRPMI1640培地(Invitrogen)を加えられた混合液が遠心分離された後、上清を除去することによってPEG1500が当該混合液から除去された。次に、HAT培地(10% ウシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン-ストレプトマイシン、1x HAT Media Supplement(Sigma)、0.5x BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement(Roche Diagnostics)が添加されたRPMI1640培地)に懸濁された細胞懸濁液が、96ウェルプレート8枚にP3U1細胞が1x 105細胞/ウェルになるように播種された。当該プレートが、37℃、5% CO2インキュベーター中で8日間インキュベートされた後、各ウェル中の培養上清を用いてスクリーニングが行われた。スクリーニングはITM2A_CHO細胞および親株CHO細胞に対する結合を、フローサイトメーター(FACS Calibur、Becton Dickinson)を用いて測定することにより行われた。ITM2A_CHO細胞に特異的に結合する抗体を産生するクローンが選択され、当該クローンから限界希釈法によりモノクローン化が行われ、ITM2Aに結合する抗体を生産するハイブリドーマが単離された。以上の実験から、抗ITM2Aモノクローナル抗体BE5-1、BE6-1、BE7-1-1、およびBE13-1が樹立された。これらの抗体のアイソタイプをIsostrip(Roche Diagnostics)を用いて測定したところ、いずれもマウスIgG1κであった。
(3-1)ITM2A部分タンパクの作製
ITM2A細胞外領域(Tyr75-Glu263)またはその一部(Tyr75-Lys182)がGST融合タンパク質として大腸菌で発現された(Tyr75-Glu263: GST-ITM2A-L、Tyr75-Lys182: GST-ITM2A-S)。当該融合タンパク質のC末端にはHisタグが付加された。まず、pCR2.1_ITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー(配列番号:57)とSalIサイトおよびHisタグ配列を有するリバースプライマー(配列番号:58、または配列番号59)を用いてPCRによって増幅されたITM2A(Tyr75-Glu263)またはITM2A(Tyr75-Lys182)が、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのEcoRIとSalIを用いた消化断片が、pGEX6P-1ベクター(GE Healthcare)のEcoRI-SalIサイトにクローニングされたプラスミド、pGEX_GST-ITM2A-L及びpGEX_GST-ITM2A-Sがそれぞれ得られた。pGEX_GST-ITM2A-Lの開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号:60に、アミノ酸配列が配列番号:61に示される。pGEX_GST-ITM2A-SのITM2Aを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号:62に、アミノ酸配列が配列番号:63に示される。
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のGST-ITM2A-L、GST-ITM2A-Sに対する結合がELISAで評価された。まず、3μg/mLの濃度のGST-ITM2A-LおよびGST-ITM2A-S溶液100 μLが、ELISA用96ウェルプレート(Nunc-Immuno Plate、Thermo Fisher Scientific)の各ウェルに添加され、GST-ITM2A-L及びGST-ITM2A-Sが当該各ウェルにコートされた。当該各ウェルが、1%ウシ血清アルブミンを含むバッファーでブロッキングされた後、同バッファーで希釈された100μL のBE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体およびBE13-1抗体の各溶液が、各ウェルに添加され、当該プレートが室温で1時間インキュベートされた。陽性対照には抗His抗体(マウスIgG1、Santa Cruz Biotechnology)、陰性対照にはマウスIgG1(BD Pharmingen)が用いられた。抗体濃度は1μg/mLから公比3.16で8段階に希釈された。二次抗体(アルカリホスファターゼ-ヤギ抗マウスIgG (Gamma)、Invitrogen)と反応後、基質(phosphatase substrate、Sigma)が加えられ、各ウェル中の反応液の発色が、405 nm - 655 nmの吸光度を測定することによって決定された。
(4-1)C末端を欠損したITM2A強制発現細胞株の作製
ITM2Aの細胞外領域にはフリン(furin)で切断されるコンセンサス配列(Arg226-Leu227-Arg228-Arg229)が存在する。そこでITM2AのMet1からLeu227までの配列の後ろにHAタグが付加されたタンパク質(ITM2A-furin)を発現する細胞株が作製された。まず、pCR2.1_ITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー(配列番号:53)とNotIサイトおよびHAタグ配列を有するリバースプライマー(配列番号:64)を用いてPCRによって増幅されたITM2A(Met1-Leu227)が、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた。クローニングの結果得られたプラスミドのEcoRIとNotIを用いた消化断片が、pMCN2iベクターのEcoRI-NotIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i_ITM2A-furin-HAが得られた。pMCN2i_ITM2A-furin-HAのITM2A-furinを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号:65に、アミノ酸配列が配列番号:66に示される。PvuIで消化されたpMCN2i_ITM2A-furin-HAがDG44細胞へエレクトロポレーションにより形質導入された。ジェネティシン(500μg/mL)で形質導入株を選抜することにより、C末端HAタグ付加ITM2A-furinを定常的に発現するCHO細胞株(ITM2A-furin_CHO)が樹立された。
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のITM2A-furinへの結合がフローサイトメトリー(FACS)で測定された。細胞として、(4-1)で作製されたITM2A-furin_CHO、(2-4)で作製されたITM2A_CHO、及び、宿主細胞CHOが用いられた。0.2%ウシ血清アルブミンおよび0.1%NaN3を添加したPBS(FACS buffer)に懸濁されたこれらの細胞懸濁液に、BE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体、BE13-1抗体、マウスIgG1または抗HA抗体(clone HA-7、マウスIgG1、Sigma)が加えられ、当該細胞懸濁液が氷上で1時間インキュベートされた。抗体濃度は10μg/mLから公比5で6段階に希釈された。細胞がFACS bufferで洗浄された後、二次抗体としてFITC標識抗マウスIgG抗体(Goat F(ab')2 Fragment Anti-mouse IgG (Fcγ)-FITC、Beckman Coulter)が添加された細胞懸濁液が氷上で1時間インキュベートされた。細胞がFACS bufferで洗浄された後、10μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI、Sigma)が添加されたFACS bufferに懸濁されフローサイトメーターによる測定に供された。測定されたデータはCELLQuestソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて解析され、PI陰性である生細胞集団が評価された。
(5-1)マウス ITM2Aのクローニング
マウス脳cDNA(Mouse MTC Panel I, Clontech)を鋳型として、フォワードプライマー(配列番号67)とリバースプライマー(配列番号68)を用いてPCRによって増幅されたマウスITM2Aが、pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされ、pCR2.1_mITM2Aが得られた。PCRにはKOD Plus(Toyobo)が用いられ、94℃ 2分で変性後、98℃ 10秒、59℃ 30秒、68℃ 1分からなる反応サイクルが30サイクル反復された。pCR2.1_mITM2Aの挿入配列をシークエンスすることによって、当該挿入配列がRefSeq Accession No. NM_008409で登録された配列と同じであることが確認された。
C末端にHAタグが付加されたマウスITM2AがpMCN2iベクターにクローニングされた。まず、pCR2.1_mITM2Aを鋳型として、EcoRIサイトを有するフォワードプライマー(配列番号:69)とNotIサイトおよびHAタグ配列を有するリバースプライマー(配列番号:70)を用いてPCRによってマウスITM2Aが増幅された。EcoRIとNotIで消化された増幅断片が、pMCN2iベクターのEcoRI-NotIサイトにクローニングされたプラスミドpMCN2i_mITM2A-HAが得られた。pMCN2i_mITM2A-HAのマウスITM2Aを含む挿入配列中の開始コドンからストップコドンまでの塩基配列が配列番号:71に、アミノ酸配列が配列番号:72に示される。PvuIで消化されたpMCN2i_mITM2A-HAがDG44細胞へエレクトロポレーションにより形質導入された。ジェネティシン(500μg/mL)で形質導入株を選抜することにより、C末端HAタグ付加マウスITM2Aを定常的に発現するCHO細胞株(mITM2A_CHO)が樹立された。
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のマウスITM2Aへの結合がFACSで評価された。細胞として、(2-4)で作製されたITM2A_CHOと(5-2)で作製されたmITM2A_CHOを用いられた。FACSを用いた結合の検出は4-2に記載された手順と同様に行われた。
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体のITM2Aに対する結合が、ウェスタンブロットを用いて検出可能であるか評価された。まず、(2-4)で作製されたITM2A_CHO、(4-1)で作製されたITM2A-furin_CHO、宿主CHO細胞の各1x107細胞がPBSで洗浄された後、1 mLのlysis buffer(50 mM Tris-HCl (pH7.4)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、Protease Inhibitor Cocktail (Sigma))を用いて溶解され全細胞ライセートが得られた。等量の2x Sample Buffer(Sigma)と混合された当該ライセートが加熱処理された後、各5μLのライセートがSDS-PAGEに供された。泳動後SDS-PAGEゲルに含まれるタンパク質等が転写されたPVDFメンブレン(Immobilon-P, Millipore)が、10μg/mLのBE5-1抗体、BE6-1抗体、BE7-1-1抗体またはBE13-1抗体、または抗HA抗体(clone F-7、Santa Cruz Biotechnology)と室温にて1時間インキュベートされた。二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体(GE Healthcare)を用い、室温にて1時間インキュベートされた。最後に、ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare)を用いて生じた発光がX線フィルムに露光されることによって、抗原抗体複合体を示すバンドが検出された。
実施例2で作製された抗ITM2Aモノクローナル抗体の可変領域の遺伝子配列が決定された。RNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いて、1x 106細胞の各抗体を産生するハイブリドーマからtotal RNAが調製された。次に、Smarter Race cDNA Amplification Kit(Clontech)を用いて当該RNAを鋳型とするcDNAが合成された。プライマーとして、マウスIgG1κ抗体の重鎖定常領域に相補的なプライマー(配列番号:73)と軽鎖定常領域に相補的なプライマー(配列番号:74)が用いられた。pCR2.1-TOPOベクターにクローニングされた増幅産物の配列が決定された。各抗体の可変領域配列が表1、可変領域のCDR配列が表2にまとめられる。
(8-1)ヒト癌細胞株におけるITM2Aの発現解析
ヒト癌細胞株におけるITM2Aの発現がFACSで測定された。抗体としてBE6-1抗体が10μg/mLの濃度で用いられ、実施例4に記載された手順と同様の方法でITM2Aの発現が測定された。二次抗体としてQifi-Kit(Dako)に付属したFITC標識抗マウスIg抗体(goat F(ab’)2)が用いられた。陰性対照としてマウスIgG1が10μg/mLの濃度で用いられた。測定の結果、ユーイング肉腫細胞株(A-673、RD-ES、SK-ES-1およびSK-N-MC)、T細胞性急性リンパ性白血病細胞株(CCRF-CEM、Jurkat、MOLT-4)、T細胞性リンパ腫細胞株(HuT78)、急性骨髄性白血病細胞株(KG-1a、TF-1a)の細胞上にITM2Aが発現していることが明らかとなった(図6)。
BE6-1抗体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)活性が測定された。ヒト癌細胞株CCRF-CEMおよびKG-1aがChromium-51(GE Healthcare)存在下で1時間培養された後に、10% ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたRPMI1640培地(以下RPMI培地)で3回洗浄された。RPMI培地を用いて、1x 105細胞/mLの細胞懸濁液が調製された。当該細胞懸濁液が96ウェルプレートの各ウェルに100μL/ウェル加えられた。次に、BE6-1抗体またはマウスIgG1がRPMI培地で希釈され50μL/ウェル加えられた。BE6-1抗体の終濃度は10、2、0.4、0.08、0.016μg/mL、マウスIgG1の終濃度は10μg/mLに調製された。当該プレートが室温にて15分間静置された後、RPMI培地で1x106細胞/mLに調製されたエフェクター細胞の細胞懸濁液が50μL/ウェル加えられた。マウスFcγレセプター III(RefSeq Accession No. NM_010188)の細胞外領域とヒトFcεレセプター I-gamma(RefSeq Accession No. NM_004106)の膜貫通領域及び細胞内領域とがインフレームで融合されたキメラタンパク質がNK-92細胞(ATCC)で定常発現する細胞(WO2008093688)が、エフェクター細胞として用いられた。当該プレートが37℃、5% CO2インキュベーターにて4時間インキュベートされた後に、100μL/ウェルの培養上清が回収され、培養上清中の放射活性(cpm)が、ガンマカウンター(1480 WIZARD 3’’、Wallac)を用いて測定された。測定値を以下の式に適用することによって、特異的クロム遊離率(%)が算出された。
特異的クロム遊離率(%)=(A-C)x100/(B-C)
上記の式において、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1% Nonidet P-40で細胞を溶解させたウェルの放射活性の平均値、Cは標的細胞のみを添加したウェルの放射活性の平均値である。実験は三重に行われ、特異的クロム遊離率の平均値と標準偏差が算出された。
トキシンが結合された二次抗体の存在下でのBE6-1抗体の細胞増殖抑制活性が測定された。トキシンが結合された二次抗体として、サポリン標識抗マウスIgG抗体(Mab-Zap、Advanced Targeting Systems)が用いられた。ヒト癌細胞株CCRF-CEMが6x103細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種された各ウェルに、BE6-1抗体(500、100、20、4ng/mL)またはマウスIgG1(500ng/mL)が加えられた。Mab-Zapは500ng/mLの濃度で各ウェルに加えられた。当該プレートが3日間インキュベートされた後、各ウェル中の細胞の増殖がWST-8(Cell Count Reagent SF、Nacalai Tesque)を用いて測定された。実験は三重に行われ、培地のみが加えられたウェルを0%、細胞のみが加えられたウェルを100%として、平均値と標準偏差が算出された。培地として、10%ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンが添加されたRPMI1640培地が用いられた。
(9-1)ユーイング肉腫臨床サンプルにおけるEWS-FLI1融合遺伝子の発現解析
ユーイング肉腫の85%の症例で、t(11;22)(q24;q12)染色体転座が観察され、EWS遺伝子の5’末端とFLI-1遺伝子の3’末端が融合した融合遺伝子(EWS-FLI1)が発現することが知られている(Cancer Lett (2007) 254, 1-10)。そこで実施例1において発現解析に用いられたサンプルを含むユーイング肉腫臨床サンプル13例(ews_2、ews_3、ews_4、ews_5、ews_6、ews_7、ews_8、ews_9、ews_10、ews_11、ews_12、ews_13、ews_15)におけるEWS-FLI1融合遺伝子の発現がPCRを用いて解析された。まず、ユーイング肉腫臨床サンプルのRNAからSuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)を用いてcDNAが合成された。次に、このcDNAを鋳型として、フォワードプライマー(配列番号75)とリバースプライマー(配列番号76)を用いてEWS-FLI1融合遺伝子がPCRによって増幅された。増幅にはKOD Plus Version 2(Toyobo)が用いられ、94℃ 2分の熱変性の後に、98℃ 10秒、68℃ 1.5分からなるサイクルが30サイクル反復された。プライマー配列は文献(N Engl J Med (1994) 331, 294-9)と同じものが用いられた。コントロールとしてキット(SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR)に付属のプライマーが用いられてβ-actinが増幅された。PCRを用いた増幅反応には、KOD Plus Version 2が用いられ、94℃ 2分の熱変性の後に、98℃ 10秒、58℃ 30秒、68℃ 30秒からなるサイクルが25サイクル反復された。なお、EWS-FLI1融合遺伝子を発現するユーイング肉腫細胞株SK-ES-1が陽性対照に用いられ、リンパ腫細胞株NK-92が陰性対照に用いられた。
ユーイング肉腫の臨床サンプルにおけるITM2A遺伝子の発現がPCRで解析された。(9-1)で合成されたcDNAを鋳型として、フォワードプライマー(配列番号77)とリバースプライマー(配列番号78)を用いてITM2AがPCRによって増幅された。増幅には、KOD Plus Version 2が用いられ、94℃ 2分の熱変性の後、98℃ 10秒、65℃ 30秒、68℃ 30秒からなるサイクルが25サイクル反復された。なお、(2-1)で作製されたpCR2.1_ITM2Aが陽性対照に用いられ、リンパ腫細胞株NK-92が陰性対照に用いられた。
Claims (47)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するITM2Aタンパク質の断片に結合するモノクローナル抗体。
- 前記断片が配列番号1で表されるアミノ酸配列の75から227番目のアミノ酸からなる断片であることを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- 細胞傷害活性を有する請求項1又は2に記載の抗体。
- 前記細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性である請求項3に記載の抗体。
- 前記細胞傷害活性が、補体依存性細胞傷害(CDC)活性である請求項3に記載の抗体。
- 細胞傷害性物質が結合した抗体である請求項1から5のいずれかに記載の抗体。
- インターナライズ活性を有する抗体である請求項6に記載の抗体。
- 癌細胞の増殖を抑制する抗体である請求項1から7のいずれかに記載の抗体。
- 前記癌細胞が、ユーイング肉腫細胞である請求項8に記載の抗体。
- 前記ユーイング肉腫細胞が、染色体転座が観察される細胞であることを特徴とする請求項9に記載の抗体。
- 前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする請求項10に記載の抗体。
- 前記癌細胞が血液癌の細胞である請求項8に記載の抗体。
- 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項12に記載の抗体。
- 以下(1)から(26)のいずれかに記載の抗体;
(1)CDR1として配列番号:3に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:4に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:5に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(2)CDR1として配列番号:6に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:7に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:8に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(3)(1)に記載のH鎖、および(2)に記載のL鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:9に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:10に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:11に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(5)CDR1として配列番号:12に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:13に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:14に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)(4)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体、
(7)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:16に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:17に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(8)CDR1として配列番号:18に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:19に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:20に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(9)(7)に記載のH鎖、および(8)に記載のL鎖を含む抗体、
(10)CDR1として配列番号:21に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:22に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:23に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体、
(11)CDR1として配列番号:24に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:25に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:26に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(12)(10)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体、
(13)キメラ抗体である(1)から(12)に記載の抗体、
(14)ヒト化抗体である(1)から(12)に記載の抗体、
(15)配列番号28に記載のアミノ酸配列を含む(1)又は(3)記載の抗体、
(16)配列番号30に記載のアミノ酸配列を含む(2)又は(3)記載の抗体、
(17)配列番号32に記載のアミノ酸配列を含む(4)又は(6)記載の抗体、
(18)配列番号34に記載のアミノ酸配列を含む(5)又は(6)記載の抗体、
(19)配列番号36に記載のアミノ酸配列を含む(7)又は(9)記載の抗体、
(20)配列番号38に記載のアミノ酸配列を含む(8)又は(9)記載の抗体、
(21)配列番号40に記載のアミノ酸配列を含む(10)又は(12)記載の抗体、
(22)配列番号42に記載のアミノ酸配列を含む(11)又は(12)記載の抗体、
(23)キメラ抗体である(15)から(22)に記載の抗体、
(24)(1)~(23)いずれかに記載の抗体のアミノ酸配列において1または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入され、かつ、その抗体と同等の活性又は同等の結合活性を有する抗体、
(25)第2の抗体が結合しうるエピトープに結合することができる抗体であって、前記第2の抗体は、それぞれ(1)~(23)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体、
(26)配列番号1で表されるアミノ酸配列の75から227番目のアミノ酸からなるITM2Aタンパク質の断片に対する第2の抗体の結合を阻害することができる抗体であって、前記第2の抗体は、それぞれ(1)~(23)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする抗体。 - ヒト定常領域を有する抗体である請求項1から14のいずれかに記載の抗体。
- キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項15に記載の抗体。
- 糖鎖に付加するフコースが欠損した、または、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体である請求項1から16のいずれかに記載の抗体。
- 請求項1から17のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
- 請求項1から17のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
- 請求項1から17のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
- 治療対象となる癌がユーイング肉腫である、請求項20に記載の抗癌剤。
- 前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする請求項21に記載の抗癌剤。
- 前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする請求項22に記載の抗癌剤。
- 前記癌細胞が血液癌の細胞である請求項20に記載の抗癌剤。
- 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項24に記載の抗癌剤。
- 請求項1から17のいずれかに記載の抗体を投与することを含む癌を治療する方法。
- 治療対象となる癌がユーイング肉腫である、請求項26に記載の方法。
- 前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする請求項28に記載の方法。
- 前記癌細胞が血液癌の細胞である請求項26に記載の方法。
- 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項30に記載の方法。
- 請求項1から17のいずれかに記載の抗体を投与することによる癌治療の奏功性を予測する方法であって、被験者から採取された生体試料中のITM2Aの発現レベルを検出する工程を含む方法。
- 被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を検出することを特徴とする請求項32に記載の方法。
- ITM2Aタンパク質の検出がITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて行なわれる請求項33に記載の方法。
- 治療対象となる癌がユーイング肉腫である、請求項32から34のいずれかに記載の方法。
- 前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする請求項36に記載の方法。
- 前記癌細胞が血液癌の細胞である請求項35に記載の方法。
- 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項38に記載の方法。
- 被験者から採取された試料におけるITM2Aタンパク質を検出することを特徴とする被験者における癌の存在を決定する方法。
- 以下の工程を含む、被験者における癌の存在を決定する方法;
(a) 被験者から採取された試料を提供する工程、
(b) (a)の試料に含まれるITM2Aタンパク質を、ITM2Aタンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。 - 以下の工程を含む、被験者における癌の存在を決定する方法;
(a) ITM2Aタンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体を被験者に投与する工程、
(b) 前記放射性同位元素の集積を検出する工程。 - 前記存在を決定する対象となる癌がユーイング肉腫である請求項40から42のいずれかに記載の診断方法。
- 前記ユーイング肉腫が、染色体転座が観察されることを特徴とする請求項43に記載の方法。
- 前記染色体転座がt(11;22)(q24;q12)であることを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記癌が血液癌である請求項40から42のいずれかに記載の方法。
- 前記血液癌が、T細胞性白血病、T細胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病、B細胞腫瘍、多発性骨髄腫のいずれかである請求項46に記載の方法。
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