KR20230087414A - 항-Trop-2 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCS), 상기 ADCS를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

항-Trop-2 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCS), 상기 ADCS를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-Trop-2 항체를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다. 이러한 ADC를 포함하는 조성물, 이의 제조 및 사용 방법이 본원에 제공된다.

Description

항-Trop-2 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADCS), 상기 ADCS를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 5월 3일 출원된 국제출원 PCT/CN2020/088565 및 2021년 4월 13일에 출원된 국제출원 PCT/CN2021/086849에 대해 우선권을 주장하며, 이들 각각의 개시 내용이 전체적으로 본원에 참조로 인용되었다.
본 발명은 항-Trop-2 항체를 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)(ADC), 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
ADC는 약물을 특이적 세포, 예컨대 암 세포에 적중시킴으로써, 단독으로 사용되는 경우 상당한 독성이 있는 약물의 전달을 허용할 수 있다. SN-38 (7-에틸-10-하이드록시 캄토테신)은 국소이성질화효소 I 억제제인 이리노테칸 (CPT-11)의 활성 성분인 캄토테신이다. SN-38과 항-Trop-2 항체를 포함하는 ADC를 개발하려는 노력이 있어 왔다. Trop-2 (영양막 세포-표면 항원; 상피 당단백-1, 즉 EGP-1이라고도 불림)는 여러 상피 암에 의해 상당히 발현되는 당단백이다. SN-38과 Trop-2에 관련된 추가의 배경지식은 예를 들면 문헌(Ocean et al., Cancer 123:3843-54 (2017)) 및 여기에 인용된 참조문헌에서 참고할 수 있다.
유리한 안전 프로필을 유지하면서 효과적인 SN-38을 포함하는 항-Trop-2 ADC를 제공하는 것은 지금까지 어려운 과제였다. 예를 들면, 상기 문헌(Ocean et al.)은 IMMU-132 (사시투주맙 고비테칸; ADC-CL2A-SN38로도 불림) ADC를 사용한 임상 실험을 보고한다. 상기 ADC가 '고무적인 전반적 반응'을 제공함을 특징으로 하였지만, 8mg/kg과 10mg/kg의 용량을 각각 투여받은 환자 81명 중 80명 및 97명 중 89명에서 높은 빈도의 부작용이 나타났다 (문헌(Ocean et al.)의 표 2 및 이어지는 내용 참고). 주목할 만한 점은 ADC-CL2A-SN38 중 링커가 'SN-38이 약 1일의 반감기로 혈청에서 상기 접합체로부터 해리되는 것'을 허용함이 보고된 바 있는데, 이는 높은 부작용 빈도를 설명해주거나 또는 이에 기여할 수 있다 (Govindan et al., Mol Cancer Ther 12:968-978 (2013)). CL2A-SN38 링커-약물 모이어티의 화학 구조는 다음과 같다 (상기 항체에 접합되기 위해 사용되는 반응성 말레이미드로 묘사된다).
Figure pct00001
SN-38을 포함하는 또 다른 ADC인 ADC-CL2E-SN38은 pH-민감 탄산염 결합 대신 카보네이트-함유 링커를 사용하고, ADC-CL2A-SN38보다는 SN38에 대한 상이한 부착 지점을 갖는다. CL2E 링커를 가진 접합체는 혈청 반감기가 87.5일로 보고되었으나, 이것 역시 '체내에서 효능의 축소'를 보여주는 것으로 보고되어, '덜 안정적인 CL2A-연결 SN-38보다 못한 것'으로 여겨졌다 (Govindan et al., supra, p. 972 and 977).
본원에서 상기 ADC에 효능을 위해 충분한 표적상 방출을 허용하면서, 암 세포에서 떨어진 곳에서 SN-38의 바람직하지 않은 방출을 완화하는 링커를 사용함으로써, SN-38을 포함하는 항-Trop-2 ADC로의 치료 이후 안전성을 개선하고/하거나 부작용 사례의 빈도를 감소시키는 것이 고안되었다.
따라서, 본 발명은 링커 모이어티를 통해 SN-38에 접합된 항-Trop-2 항체를 포함하는 화학식 (I)의 ADC를 제공한다. 화학식 (I)의 ADC 화합물은 더 큰 안정성을 제공하고 분명히 다른 SN-38 ADC보다 더 나은 독성을 제공할 수 있다. 본원에 기술된 ADC 화합물의 개선된 활성은 화학식 (I)의 링커 모이어티에서 기인한 것으로, 이는 표적 Trop-2-발현 세포에서 SN-38의 선택적 방출을 허용한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 ADC는(예를 들면, 실시예 B3의 예시적 조건과 같은 중성 pH에서, 또는 실시예 B4의 예시적 조건과 같은 체내에서) ADC-CL2A-SN38보다 더 큰 안정성을 보여주고/주거나 ADC-CL2E-SN38보다 더 큰 체내 효능을 보여준다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 ADC는 ADC-CL2A-SN38 대비 개선된 안정성(예를 들면, 부작용의 빈도 감소)을 보여주고/주거나 ADC-CL2E-SN38보다 더 큰 체내 효능을 보여준다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 ADC는(예를 들면, 실시예 B3의 예시적 조건과 같은 중성 pH에서, 또는 실시예 B4에서와 마찬가지로 체내에서) ADC-CL2A-SN38보다 더 큰 안정성을 보이고 ADC-CL2A-SN38 대비 개선된 안전성(예를 들면, 부작용의 빈도 감소)을 보이고, 추가로 ADC-CL2E-SN38보다 더 큰 체내 효능을 보일 수 있다.
하기 구현예들이 포함된다.
구현예 1은 화학식 (I)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 항체-약물 접합체(ADC)이다.
Figure pct00002
여기서,
Ab는 항-Trop-2 항체이고;
q는 1 내지 20의 범위의 값이고;
L1은 항-Trop-2 항체에 결합된 링커이고;
L2는 -(CH2)p-이고, 여기서, p는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
L3은 하나의 결합 또는 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-6 알킬이다.
구현예 2는 구현예 1에 따른 ADC이며, L1은 항-Trop-2 항체의 황에 결합된 링커이다.
구현예 3은 구현예 1 또는 2에 따른 ADC이며, -L1-L2-는
Figure pct00003
이다.
구현예 4는 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 ADC이며, q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.
구현예 5는 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 ADC이며, q는 1 내지 10의 범위의 값이다.
구현예 6은 구현예 5에 따른 ADC이며, q는 6 내지 8의 범위의 값이다.
구현예 7은 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 ADC이며, p는 4, 5 또는 6이다.
구현예 8은 구현예 7에 따른 ADC이며, p는 5이다.
구현예 9는 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 ADC이며, L3은 하나의 결합이다.
구현예 10은 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 ADC이며, L3은 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이다.
구현예 11은 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 ADC이며, R1은 C1-4 알킬이다.
구현예 12는 구현예 11에 따른 ADC이며, R1은 C1-3 알킬이다.
구현예 13은 구현예 12에 따른 ADC이며, R1은 메틸이다.
구현예 14는 구현예 12에 따른 ADC이며, R1은 에틸이다.
구현예 15는 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 ADC이며, R2는 C1-4 알킬이다.
구현예 16은 구현예 15에 따른 ADC이며, R2는 C1-3 알킬이다.
구현예 17은 구현예 16에 따른 ADC이며, R2는 메틸이다.
구현예 18은 구현예 16에 따른 ADC이며, R2는 에틸이다.
구현예 19는 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 따른 ADC이며, R1과 R2는 동일하다.
구현예 20은 구현예 1 내지 13 및 구현예 15 내지 17 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIa) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00004
구현예 21은 구현예 20에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIa-1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00005
구현예 22는 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIb) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00006
구현예 23은 구현예 22에 따른 ADC로, 상기 ADC는 화학식 (IIb-1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00007
구현예 24는 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIc) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00008
구현예 25는 구현예 24에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIc-1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00009
구현예 26은 구현예 20에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIIa) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00010
구현예 27은 구현예 26에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIIa-1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00011
구현예 28은 구현예 22에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIIb) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00012
구현예 29는 구현예 28에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIIb-1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00013
구현예 30은 구현예 22에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIIc) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00014
구현예 31은 구현예 30에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IIIc-1) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00015
구현예 32는 구현예 1에 따른 ADC이며, 상기 ADC는 화학식 (IV) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다.
Figure pct00016
구현예 33은 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1, 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2, 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3, 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1, 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2, 및 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3을 포함한다.
구현예 34는 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 항-Trop-2 항체는 서열번호: 7과의 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 갖는 VL을 포함한다.
구현예 35는 구현예 1 내지 34 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 항-Trop-2 항체는 서열번호: 8과의 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 갖는 VH를 포함한다.
구현예 36는 구현예 1 내지 35 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 7의 서열을 갖는 VL을 포함한다.
구현예 37은 구현예 1 내지 36 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 8의 서열을 갖는 VH를 포함한다.
구현예 38은 구현예 1 내지 37 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 항-Trop-2 항체는 카파 경쇄를 포함한다.
구현예 39는 구현예 1 내지 38 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 항-Trop-2 항체는 IgG 항체이고, 임의로 상기 항-Trop-2 항체는 IgG1 항체이다.
구현예 40은 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 상기 항-Trop-2 항체는 인간 Trop-2와 결합하고, 임의로 상기 인간 Trop-2는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는다.
구현예 41은 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 ADC이며, 치료법에 사용하기 위한 것이다.
구현예 42는 구현예 41에 따른 ADC이며, Trop-2-발현 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
구현예 43은 피험체에서 Trop-2-발현 암을 치료하는 방법으로, Trop-2-발현 암의 치료를 필요로 하는 피험체에게 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 ADC를 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 44는 약제의 제조를 위한 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 ADC의 용도이다.
구현예 45는 Trop-2-발현 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 ADC의 용도이다.
구현예 46은 구현예 42, 43 또는 45 중 어느 하나에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 상피 세포-유래 암이다.
구현예 47은 구현예 46에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 암종이다.
구현예 48은 구현예 47에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 암종은 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 신장 세포 암종, 제자리 유관 암종, 침습성 유관 암종, 또는 선암이다.
구현예 49는 구현예 46 내지 48 중 어느 하나에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 고체 종양을 포함한다.
구현예 50은 구현예 46 내지 49 중 어느 하나에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 전이성이다.
구현예 51은 구현예 46 내지 50 중 어느 하나에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 재발된 암이다.
구현예 52는 구현예 42, 43 및 45 내지 51 중 어느 하나에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 췌장암, 위암, 유방암, 흑색종, 신장암, 결장직장암, 자궁내막암, 전립선암, 요로상피암, 교모세포종, 폐암, 자궁경부암, 식도암 또는 난소암이다.
구현예 53은 구현예 52에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 췌장암이다.
구현예 54는 구현예 52에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 위암이다.
구현예 55는 구현예 52에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 유방암이다.
구현예 56은 구현예 55에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 Trop-2-발현 암은 삼중 음성 유방암이다.
구현예 57은 구현예 52 내지 56 중 어느 하나에 따른 용도, 방법 또는 용도를 위한 ADC이며, 상기 암은 전이성이다.
구현예 58은 구현예 1에 따른 ADC를 제조하는 방법으로, 항-Trop-2 항체를 화학식 (P-I)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 반응시키는 단계를 포함하는 방법이다.
Figure pct00017
여기서,
B는 상기 항-Trop-2 항체와 결합을 형성할 수 있는 반응성 모이어티이고;
L2는 -(CH2)p-이며, p는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
L3은 하나의 결합 또는 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이고;
R1과 R2는 각각 독립적으로 C1-6 알킬이다.
구현예 59는 구현예 58에 따른 방법이며, B는 상기 항-Trop-2 항체의 설프하이드릴과 결합을 형성할 수 있는 반응성 모이어티이다.
구현예 60은 구현예 58 또는 59에 따른 방법이며, B는 N-말레이미도이다.
구현예 61은 구현예 58 내지 60 중 어느 하나에 따른 방법이며, 상기 ADC는 구현예 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 ADC이다.
구현예 62는 구현예 58 내지 61 중 어느 하나에 따른 방법이며, p는 4, 5 또는 6이다.
구현예 63은 구현예 62에 따른 방법이며, p는 5이다.
구현예 64는 구현예 58 내지 63 중 어느 하나에 따른 방법이며, R1은 C1-4 알킬이다.
구현예 65은 구현예 64에 따른 방법이며, R1은 C1-3 알킬이다.
구현예 66은 구현예 65에 따른 방법이며, R1은 메틸이다.
구현예 67은 구현예 65에 따른 방법이며, R1은 에틸이다.
구현예 68은 구현예 58 내지 67 중 어느 하나에 따른 방법이며, R2는 C1-4 알킬이다.
구현예 69는 구현예 68에 따른 방법이며, R2는 C1-3 알킬이다.
구현예 70는 구현예 69에 따른 방법이며, R2는 메틸이다.
구현예 71은 구현예 69에 따른 방법이며, R2는 에틸이다.
구현예 72는 구현예 58 내지 71 중 어느 하나에 따른 방법으로, R1과 R2는 동일하다.
구현예 73은 구현예 58 내지 72 중 어느 하나에 따른 방법이며, L3은 하나의 결합이다.
구현예 74는 구현예 58 내지 72 중 어느 하나에 따른 방법이며, L3은 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이다.
구현예 75는 구현예 58 내지 66, 68 내지 70, 73 및 74 중 어느 하나에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIa)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00018
구현예 76은 구현예 75에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIa-1)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00019
구현예 77은 구현예 58 내지 74 중 어느 하나에 다른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIb)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00020
구현예 78은 구현예 77에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIb-1)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00021
구현예 79는 구현예 58 내지 74 중 어느 하나에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIc)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00022
구현예 80은 구현예 79에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIc-1)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00023
구현예 81은 구현예 58 내지 74 중 어느 하나에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIIa)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
Figure pct00024
구현예 82는 구현예 81에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIIa-1)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00025
구현예 83은 구현예 58 내지 74 중 어느 하나에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIIb)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00026
구현예 84는 구현예 83에 다른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIIb-1)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00027
구현예 85는 구현예 75에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIIc)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00028
구현예 86은 구현예 85에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IIIc-1)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00029
구현예 87은 구현예 58에 따른 방법이며, 상기 분자는 화학식 (P-IV)의분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00030
도 1은 A) BxPC-3(Trop-2 +) 세포; B) MDA-MB-468(Trop-2 +) 세포; 및 C) L-540(Trop-2 -) 세포를 사용한 항-Trop-2-화합물 1(삼각형으로 표현됨)과 항-Trop-2-화합물 2(원형으로 표현됨)의 시험관내 효능 연구의 결과를 보여준다.
도 2는 A) BxPC-3(Trop-2 +) 세포; B) MDA-MB-468(Trop-2 +) 세포; 및 C) L-540(Trop-2 -) 세포를 사용한 항-Trop-2-화합물 1(삼각형으로 표현됨)과 항-Trop-2-화합물 3(네모로 표현됨)의 시험관내 효능 연구의 결과를 보여준다.
도 3은 A) BxPC-3(Trop-2 +) 세포; B) MDA-MB-468(Trop-2 +) 세포; 및 C) L-540(Trop-2 -) 세포를 사용한 항-Trop-2-화합물 1(삼각형으로 표현됨)과 항-Trop-2-화합물 4(원형으로 표현됨)의 시험관내 효능 연구의 결과를 보여준다.
도 4는 A) BxPC-3(Trop-2 +) 세포; B) MDA-MB-468(Trop-2 +) 세포; 및 C) L-540(Trop-2 -) 세포를 사용한 항-Trop-2-화합물 1(삼각형으로 표현됨)과 항-Trop-2-화합물 5(네모로 표현됨)의 시험관내 효능 연구의 결과를 보여준다.
도 5는 A) BxPC-3(Trop-2 +) 세포; B) MDA-MB-468(Trop-2 +) 세포; 및 C) L-540(Trop-2 -) 세포를 사용한 항-Trop-2-화합물 1(삼각형으로 표현됨)과 항-Trop-2-화합물 6(네모로 표현됨)의 시험관내 효능 연구의 결과를 보여준다.
도 6a는 누드 마우스의 MDA-MB-468 이종이식편에서 항-Trop-2-화합물 1(2mg/kg: 회색 빈 원형으로 표현됨; 5mg/kg: 검은색 빈 원형으로 표현됨)과 ADC-CL2A-SN38(2mg/kg: 회색 빈 삼각형으로 표현됨; 5mg/kg: 검은색 빈 삼각형으로 표현됨)의 체내 효능 연구의 결과를 보여준다. PBS/담체(색칠된 원형으로 표현됨)와 항-Trop-2 항체 단독(5mg/kg, 색칠된 마름모형)이 대조군으로 사용되었다. ***P < 0.001, PBS/담체에 대한 던넷(Dunnett) 다중 비교 시험으로 양방항 ANOVA(two way Anova); 데이터 = 평균 + SEM, N = 6.
도 6b는 항-Trop-2-화합물 1(3mg/kg: 빈 마름모형으로 표현됨; 10mg/kg: 빈 원형으로 표현됨)과 ADC-CL2A-SN38(3mg/kg: 회색 빈 삼각형(거꾸로)으로 표현됨); 10mg/kg: 검은색 빈 삼각형으로 표현됨)의 체내 효능 연구의 결과를 보여준다. PBS/담체(색칠된 원형으로 표현됨)와 항-Trop-2 항체 단독(3mg/kg, 회색으로 색칠된 삼각형으로 표현됨; 10mg/kg: 검은색으로 색칠된 삼각형으로 표현됨)이 대조군으로 사용되었다. ***P < 0.001, 항체 대조군에 대한 던넷 다중 비교 시험으로 양방항 ANOVA; 데이터 = 평균 + SEM, N = 6-8. 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 누드 마우스에서 MDA-MB-468 이종이식편 종양 성장을 유의미하게 억제시켰음을 입증한다.
도 7은 누드 마우스의 NCI-N87 이종이식편에서 항-Trop-2-화합물 1(5mg/kg: 빈 마름모형으로 표현됨; 15mg/kg: 빈 원형으로 표현됨)과 ADC-CL2A-SN38(5mg/kg: 회색 빈 삼각형으로 표현됨(거꾸로); 15mg/kg: 검은색 빈 삼각형으로 표현됨)의 체내 효능 연구의 결과를 보여준다. PBS/담체(색칠된 원형으로 표현됨)와 항-Trop-2 항체 단독(5mg/kg, 회색으로 색칠된 삼각형으로 표현됨(거꾸로); 15mg/kg, 검은색으로 색칠된 삼각형으로 표현됨)이 대조군으로 사용되었다. *P < 0.05, ***P < 0.001, PBS/담체에 대한 던넷 다중 비교 시험으로 양방항 ANOVA; 데이터 = 평균 + SEM, N = 8. 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 누드 마우스에서 NCI-N87 이종이식편 종양 성장을 유의미하게 억제시켰음을 입증한다.
도 8은 누드 마우스의 BxPC3 이종이식편에서 항-Trop-2-화합물 1(3mg/kg: 빈 마름모형으로 표현됨; 10mg/kg: 빈 원형으로 표현됨; 25mg/kg, 빈 삼각형(거꾸로)으로 표현됨)과 ADC-CL2A-SN38(10mg/kg: 빈 삼각형으로 표현됨)의 체내 효능 연구의 결과를 보여준다. PBS/담체(색칠된 원형으로 표현됨)와 항-Trop-2 항체 단독(10mg/kg, 색칠된 마름모형으로 표현됨)이 대조군으로 사용되었다. ***P < 0.001, **P < 0.01, PBS/담체에 대한 던넷 다중 비교 시험으로 양방항 ANOVA; 데이터 = 평균 + SEM, N = 6. 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 누드 마우스의 BxPC3 이종이식편 종양 성장을 유의미하게 억제시켰음을 입증한다.
도 9는 168 시간의 경과에 따른 PBS에서의 ADC-CL2A-SN38과 항-Trop-2-화합물 1의 안정성 연구의 결과를 예시한다. 유리 약물 방출의 검출이 370nm에서 모니터링되었다. 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 이와 같은 시간 경과에 따라 유의미한 양의 유리 화합물 1을 방출하지 않으며, ADC-CL2A-SN38보다 상당히 더 안정적임을 입증한다.
도 10은 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mouse)를 사용한 혈장 안정성 연구를 예시한다. 미접합된 항-Trop-2(원형으로 표현됨), 상기 ADC 항-Trop-2-화합물 1(네모로 표현됨)의 총 항체 함량, 및 500시간의 시간 경과에 따른 ADC 항-Trop-2-화합물 1(삼각형으로 표현됨)의 농도(μg/mL)가 항-Trop-2-화합물 1이 안정적이며 상기 ADC에서 상기 약물을 유의미하게 방출하지 않음을 보여준다.
본 명세서는 본 개시의 예시적 구현예와 응용을 기술한다. 하지만, 본 발명은 이들 예시적 구현예 및 응용에 또는 상기 예시적 구현예 및 응용이 작동하는 방식 또는 본원에 기술된 방식에 제한되지 않는다. 용어 '또는'은 포괄적인 의미로 사용되는데, 즉, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, '및/또는'과 동등하다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 바와 같이, 단수 형태 'a', 'an', 및 'the' 및 임의의 단어의 임의의 단수 사용은, 명백하고 분명하게 하나의 참조물에 제한되는 것이 아니라면, 복수의 참조물을 포함함이 알려져 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 '포함하다', '~에 포함되다' 및 이들의 문법적 변형들은 비제한적인 것으로, 목록에서 이들의 언급은 나열된 항목에 치환되거나 또는 첨가될 수 있는 다른 항목들의 배제에 관한 것이 아니다. 본 명세서의 단면 분할은 독자의 편의를 위해서만 제공되는 것으로, 논의된 요소들의 임의의 조합을 제한하는 것은 아니다. 참조에 의해 인용된 물질과 본원에 제공되며 명백히 기술된 내용 사이에 모순 또는 불일치가 있는 경우, 상기 명백히 기술된 내용이 우위를 차지한다.
정의
'친화도'는 하나의 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합부위와 이의 결합 대상체(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 힘을 가리킨다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 '결합 친화도'는 결합쌍의 구성원들(예를 들면, 항체와 항원)의 1:1 상호작용을 반영한 내재적 결합 친화도를 가리킨다. 분자 X의 이의 대상체 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있다. 친화도는 당해기술에 알려진 일반 방법, 예컨대 본원에 기술된 것들에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 구현예가 하기에 기술되어 있다.
'친화도 성숙' 항체는, 변형을 전혀 소유하지 않은 부모 항체와 비교하여, 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에 하나 이상의 변형이 있는 항체를 가리키는데, 이와 같은 변형은 항원에 대한 상기 항체의 친화도의 개선을 야기한다.
용어 '항-Trop-2 항체' 및 'Trop-2에 결합되는 항체'는 상기 항체가 Trop-2를 표적화할 때 치료제로서 유용할 수 있도록 충분한 친화도로 Trop-2와 결합할 수 있는 항체를 가리킨다. 일 구현예에서, 관련 없는, 비-Trop-2 단백질에 대한 항-Trop-2 항체의 결합의 정도는, 예를 들면, 방사면역 검정법(RIA)에 의해 측정된 바에 따르면, Trop-2에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, Trop-2에 결합되는 항체는 해리 상수(Kd)가 ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤ 10nM, ≤ 5 Nm, ≤ 4nM, ≤ 3nM, ≤ 2nM, ≤ 1nM, ≤ 0.1nM, ≤ 0.01nM, 또는 ≤ 0.001nM(예를 들면, 10-8M 이하, 예를 들면, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들면, 10-9M 내지 10-13M)이다. 특정 구현예에서, 항-Trop-2 항체가 상이한 종들의 Trop-2 중에서 보존된 Trop-2의 에피토프에 결합된다.
상기 용어 '항체'는 본원에서 가장 광범위하게 사용되어, 다양한 항체 구조, 예컨대 비제한적으로, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체) 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 항체 절편을 포함한다.
'항체 절편'은 본연의 항체 이외에 본연의 항체의 일부를 포함하고 상기 본연의 항체가 결합되는 항원에 결합되는 분자를 가리킨다. 항체 절편의 예에는, 비제한적으로, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 이중체; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 및 항체 절편에서 형성된 다중특이성 항체가 포함된다.
용어 '암' 및 '암성'은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 질환을 가리키거나 또는 기술한다. 암의 예에는, 비제한적으로, 흑색종, 암종, 림프종(예를 들면, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함된다. 특정 비제한적 예에는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암, 폐의 편평세포 암종, 복막의 암, 간세포 암, 위암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 요로 상피 암, 식도암, 외음부 암, 갑상선 암, 간 암종, 백혈병 및 기타 림프세포증식 장애 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
용어 '키메라' 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 원천 또는 특정 종에서 유래된 반면, 상기 중쇄 및/또는 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 원천 또는 상이한 종에서 유래된 것인 항체를 가리킨다.
항체의 '부류'는 이의 중쇄가 소유한 불변 영역 또는 불변 부위의 유형을 가리킨다. 항체의 주요 부류는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 5가지이고, 이들 중 여러 개는 하위부류(아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 상기 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에 사용된 용어 '세포독성 제제'는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 가리킨다. 세포독성 제제는, 비제한적으로, 방사선 방사성 동위원소(예를 들면, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료 제제 또는 약물(예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알카로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입성 제제); 성장 억제 제제; 효소 및 이의 절편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소, 예컨대 이들의 절편 및/또는 변이체; 및 하기에 개시된 다양한 항종양 또는 항암 제제를 포함한다.
'화학치료 제제'는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료 제제의 예에는 알킬화 제제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXAN®); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타신온); 델타-9-테트라하이드로카나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파촌; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄토테신, 스코포렉틴 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 포도필로독소; 포도필린 산; 테니포사이드; 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘레우테로빈; 팬크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 무스타드; 나이트로소우레아스, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제(예를 들면, 칼리키아미신, 특히 칼리키아미신 감마 1I 및 칼리키아미신 오메가I1(예를 들면 문헌(Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) 참조); 다인마이신, 예컨대 다인마이신 A; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련된 크로모프로테인 에네디인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오스라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(예컨대, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시톡신루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀 산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항 대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티암이프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 레티난; 로니다이닌; 마이탄사이노이드, 예컨대 마이탄사인 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 나이트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로소산트론; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센( trichothecenes)(특히 T-2 독소, 베르라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드('Ara-C'); 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀(TAXOL®; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 파클리탁셀의 ABRAXANE™ 크레모포르-비함유 알부민-조작 나노입자 제형(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) 및 도세탁셀(TAXOTERE®; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 겜시타빈(GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 레우코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미놉테린; 이반드로네이트; 국소이성질화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈(XELODA®); 상기의 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라, 상기의 것들 중 둘 이상의 조합, 예컨대 CHOP,사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합된 요법의 약어; CVP, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합된 요법에 대한 약어; 및 FOLFOX, 5-FU 및 레우코보린과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATIN™)으로의 처리 요법에 대한 약어가 포함된다.
'효과기 기능'은 항체의 Fc 부위에서 기인될 수 있는 생물학적 활성들을 가리키고, 이는 항체 아이소타입에 따라 달라진다. 항체 효과기 기능에는 C1q 결합 및 보완 의존 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존 세포-중재 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
제제, 예를 들면, 약학적 제형의 '유효량'은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해, 필요한 용량으로 및 필요한 기간 동안, 효과적인 양을 가리킨다.
용어 '에피토프'는 항체가 결합되는 항원 분자 상의 특정 자리를 가리킨다.
본원의 용어 'Fc 부위'는 적어도 불변 부위의 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어에는 천연 서열 Fc 부위 및 변이체 Fc 부위가 포함된다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 부위가 Cys226, 또는 Pro230에서 상기 중쇄의 카복실-말단으로까지 연장된다. 하지만, Fc 부위의 C-말단 라이신(Lys447)이 존재할 수도 또는 존재하지 않을 수도 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 부위 또는 불변 부위의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)에 기술된 EU 지수라고도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
'프레임워크(framework)' 또는 'FR'은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 영역 잔기를 가리킨다. 가변 영역의 FR는 일반적으로 4개의 FR 영역, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 이에 따르면, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 '전장 항체', '본연의 항체' 및 '전체 항체'는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같이 Fc 부위를 함유한 중쇄를 갖는 항체를 가리킨다.
용어 '숙주 세포', '숙주 세포주', 및 '숙주 세포 배양물'이 상호교환 가능하게 사용되며, 외인성 핵산이 도입된 세포를 가리키는데, 여기에는 이와 같은 세포의 자손이 포함된다. 숙주 세포는 '형질전환체' 및 '형질전환된 세포"를 포함하고, 이는 원시 형질전환된 세포 및, 계대배양의 수와 상관 없이, 그것에서 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이체를 함유할 수 있다. 돌연변이 자손 원래 형질전환된 세포에서 선별 또는 선택된 바와 같이 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
'인간 항체'는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비-인간 원천에서 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 것을 소유한 것이다. 인간 항체에 대한 이와 같은 정의는 특이적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다.
'인간 공통 프레임워크'는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택 시 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 공통 기본들이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 영역 서열들의 하위그룹에서 이루어진다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3)에서와 마찬가지의 하위그룹이다. 일 구현예에서, 상기 VL의 경우, 하위그룹은 앞서 Kabat et al.에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 일 구현예에서, 상기 VH의 경우, 하위그룹은 앞서 Kabat et al.에서와 같은 하위그룹 III이다.
'인간화된' 항체는 비-인간 HVR의 아미노산 잔기와 인간 FR의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 가리킨다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 두 개의 가변 영역을 모두 실질적으로 포함하며, 여기서 HVR(예를 들면, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 항체의 그것들에 상응하고, FR 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 그것들과 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체에서 유래된 항체 불변 부위의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 '인간화된 형태', 예를 들면,비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 가리킨다.
본원에 사용된 용어 '초가변 영역' 또는 'HVR'는 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 정의된 고리('초가변 고리')를 형성하는 항체 가변 영역의 부위들 각각을 가리킨다. 일반적으로, 천연 4쇄 항체는 HVR 6개를 포함하는데, VH에서 3개(H1, H2, H3) 및 VL에서 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR는 일반적으로 초가변 고리 및/또는 '상보성 결정 부위'(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자가 가장 높은 서열 가변성을 가지며 및/또는 항원 인식에 관여된다. 예시적인 초가변 고리는 아미노산 잔기 26~32(L1), 50~52(L2), 91~96(L3), 26~32(H1), 53~55(H2) 및 96~101(H3)에서 발생한다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). 예시적 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)는 L1의 아미노산 잔기 24~34에서, L2의 50~56에서, L3의 89~97에서, H1의 31~35B에서, H2의 50~65에서, 및 H3의 95~102에서 발생한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). VH에서 CDR1의 제외를 포함하여, CDR는 일반적으로 초가변 고리를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR는 또한 항원과 접촉하는 잔기인 '특이성 결정 잔기' 즉 'SDR'을 포함한다. SDR는 축약된(abbreviated)-CDR, 즉 a-CDR라고 불리는 부위 내에 함유된다. 예시적 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)는 L1의 아미노산 잔기 31~34에서, L2의 50~55에서, L3의 89~96에서, H1의 31~35B에서, H2의 50~58에서, 그리고 H3의 95~102에서 발생한다 (Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)). 달리 표시되지 않는 한, 가변 영역에서 HVR 잔기 및 기타 잔기(예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 전술된 문헌(Kabat et al.)에 따라 넘버링된다.
'항체-약물 접합체' 즉 'ADC'는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체로, 여기에는 비제한적으로 세포독성 제제가 포함된다.
'개인' 또는 '대상체'는 포유류이다. 포유류에는, 비제한적으로, 비제한적으로, 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 유인원(예를 들면, 인간 및 비-인간 유인원, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)가 포함된다. 특정 구현예에서, 상기 개인 또는 대상체는 인간이다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 성인, 청소년, 어린이, 또는 유아이다. 일부 구현예에서, 용어 '개인' 또는 '환자'가 사용되며, '대상체'와 상호교환되는 것이다.
본원에 사용되는 용어 'Trop-2'는 달리 표시되지 않는 한, 임의의 척추 동물, 예를 들면 포유류, 예컨대 유인원(예를 들면 인간, 시노몰구스 원숭이(시노)) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)에서 유래된 임의의 천연 Trop-2를 가리킨다. 상기 용어는 세포에서의 처리 결과로 생성된 임의의 형태의 Trop-2 뿐만 아니라 '전장' 미처리 Trop-2를 포함한다. 상기 용어는 또한 Trop-2의 자연발생적 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체, 대립형질 변이체 및 동형을 포함한다. 예시적인 인간 Trop-2 단백질의 아미노산 서열이 서열번호: 9에 나타나 있다.
용어 'Trop-2-발현 암'은 세포 표면 상에 Trop-2를 발현하는 세포를 포함하는 암을 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 '단일클론 항체'는 실질적으로 동종 항체의 집단에서 획득된 항체를 가리키며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개인 항체는 동일하거나 및/또는 동일한 에피토프와 결합하되, 예를 들면, 자연발생적인 돌연변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제의 생산 중에 발생되는 가능한 변이 항체는 제외되고, 이와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)를 겨냥하는 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자를 겨냥한다. 따라서, 변형자 '단일클론'은 항체의 특성을 실질적으로 동종의 항체 집단에서 획득된 것으로 표시하고, 임의의 특정 방법에 의해 상기 항체의 생산을 요구하는 것으로 여겨지지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 상기 단일클론 항체는 다양한 기법, 예컨대, 비제한적으로, 하이브리도마 법, 재조합 DNA법, 파아지-디스플레이 법 및 인간 면역글로불린 좌(loci)의 전부 또는 일부를 함유한 유전자 이식 동물을 활용한 방법에 의해 제조될 수 있고, 이와 같은 방법 및 단일클론 항체를 제조하기 위한 기타 예시적 방법들이 본원에 기술되어 있다.
'천연 항체'는 다양한 구조를 가진 자연발생적인 면역글로불린 분자를 가리킨다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 이황화 결합이 형성된 동일한 경쇄 2개 및 동일한 중쇄 2개로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종 사량체 당단백이다. N-말단부터 C-말단까지, 각 중쇄는 가변 중쇄 영역 또는 중쇄 가변 영역이라 불리는 가변 부위(VH)를 구비하고, 이어서 불변 영역 3개(CH1, CH2 및 CH3)를 구비한다. 이와 유사하게, N-말단부터 C-말단까지, 각 경쇄는 가변 경쇄 영역 또는 경쇄 가변 영역이라 불리는 가변 부위(VL)를 구비하고, 이어서 불변 경쇄(CL) 영역을 구비한다. 항체의 경쇄는 이의 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 두 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
용어 '패키지 삽입물'은 치료 제품의 상용 패키지에 관례적으로 포함되고, 상기 치료 제품의 사용과 관련하여 징후, 용법, 용량, 투여법, 병용치료, 사용 금지 사유 및/또는 경고와 관련된 정보를 함유한 설명문을 가리키는 데 사용된다.
기준 폴리펩타이드 서열과 관련한 '아미노산 서열 동일성 백분율(%)'은 서열들을 정렬하고, 필요하다면, 이격을 도입함으로써 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후, 기준 폴리펩타이드 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 당해기술에 속하는 다양한 방식, 예를 들면, 국소(local) 상동 알고리즘 (Smith and Waterman, Add. APL. Math. 2:482, 1981) 및 전체(global) 상동 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970)과 같은 적합한 알고리즘을 구현하는 상용화된 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 달성될 수 있다. 당업자들은 서열들을 정렬하기 위한 적절한 매개변수들, 예컨대 비교되는 서열들의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 결정할 수 있다. 본원에 사용되는 '서열 동일성의 백분율' 또는 '퍼센트(%) [서열] 동일성'은 서열 2개 사이의 국소 정렬의 길이로 규정되는 비교창에 걸쳐 최적으로 국소정렬된 서열 2개를 비교함으로써 결정된다(이는 또한 상동성 백분율 또는 '퍼센트(%) 상동성'이라 간주될 수도 있다). 상기 비교창에서의 아미노산 서열은, 상기 두 서열의 최적의 정렬을 위한 기준 서열과 비교하여, 첨가 또는 결실(예를 들면, 이격 또는 돌출)을 포함할 수 있다. 두 서열 사이의 국소 정렬은 상기 정렬을 수행하기 위해 사용되는 알고리즘에 따른 기준에 따라 충분히 유사하다고 간주되는 각 서열의 부분들만을 포함한다. 동일성 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생되는 위치의 수를 결정하고, 일치되는 위치의 수를 비교창에서의 위치의 총수로 나누고, 그 결과에 100을 곱함으로써 계산된다. 예를 들면, 비교를 위해 식별된 바 있는 2개의 서열의 최적의 정렬을 결정하기 위해 GAP 및 BESTFIT가 활용될 수 있다. 전형적으로, 간격 가중치의 기본값으로 5.00이, 간격 가중치 길이의 기본값으로 0.30이 사용된다.
용어 '약학적 제형'은 유효성을 위해 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 허락하는 형태로 존재하고, 상기 제형이 투여될 대상체에 허용불가한 독성이 있는 추가의 성분을 함유하지 않은 제제를 가리킨다.
'약제학적으로 허용되는 운반체'는 활성 성분 이외의, 대상체에 비독성인, 약학적 제형 중 성분을 가리킨다. 약제학적으로 허용되는 운반체에는, 비제한적으로, 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제가 포함된다.
'약제학적으로 허용되는 염'은 약제학적으로 허용되는 염을 가리킨다. 본원에 기술된 화합물은 약제학적으로 허용되는 염으로 투여될 수도 있다.
본원에 사용된 '치료'(및 이의 다양한 문법적 변형들, 예컨대 '치료하다', 또는 '치료하는')는 치료받는 개인의 자연적인 과정을 변경하기 위한 노력의 일환의 임상적 개입을 가리키고, 질병 예방을 위해 또는 임상적 병리의 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는, 비제한적으로, 질병 발생 또는 재발의 ㅂ방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 축소, 전이 금지, 질병 진행율의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 ADC가 질병의 발병을 '지연시키기 위해 또는 질병의 진행을 늦추기 위해 사용될 수 있다.
용어 '가변 부위' 또는 '가변 영역'은 항체를 항원에 결합시키는 데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 영역을 가리킨다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각 영역은 보존된 프레임워크 부위(FR) 4개 및 초가변 영역(HVR) 3개를 포함한다.(예를 들면, 문헌(Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007))을 참조한다) 단일 VH 또는 VL 영역은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 더 나아가, 특정 항원과 결합하는 항체가 상기 항원과 결합하는 항체의 VH 또는 VL 영역을 사용하여 상보적 VL 또는 VH 영역의 라이브러리를 각각 선별함으로써, 단리될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887(1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991))을 참조한다.
본원에 사용되는 용어 '벡터'는 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 상기 용어는 벡터가 도입된 바 있는 숙주 세포의 게놈에 편입된 벡터 뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조체로서 상기 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터들은 본원에서 '발현 벡터'라고 불린다.
본원에서 사용된 용어 'C1-6 알킬'은 1 내지 6개의 탄소 원자를 가진 선형 사슬 또는 분기형, 포화 또는 불포화 탄화수소를 가리킨다. 대표적인 선형 사슬 C1-6 알킬 작용기에는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸 및 n-헥실이 포함되고; 대표적인 분기형 C1-6 알킬 작용기에는, 비제한적으로, 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸, 2-메틸부틸이 포함되고; 대표적인 불포화 C1-6 알킬 작용기에는, 비제한적으로, 비닐, 알릴, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부테닐, 1-펜테닐, -2 펜테닐, -3 메틸 1 부테닐, -2 메틸 2 부테닐, -2,3 디메틸 2 부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-부티닐이 포함된다. 구체적으로 명시되지 않는 한, C1-6 알킬이 미치환된 작용기를 가리키는 것임이 이해된다.
본원에 사용되는 용어 'C1-4 알킬'은 탄소 원자가 1 내지 4개인 선형 사슬 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소를 가리킨다. 대표적인 'C1-4 알킬' 작용기에는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸이 포함되고; 대표적인 분기형 C1-4 알킬 작용기에는, 비제한적으로, 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸이 포함되고; 대표적인 불포화 C1-4 알킬 작용기에는, 비제한적으로, 비닐, 알릴, 1-부테닐, 2-부테닐 및 이소부틸레닐이 포함된다. 구체적으로 명시되지 않는 한, C1-4 알킬은 미치환된 작용기를 가리킴이 이해된다.
'링커'는 항체를 약물 모이어티에 공유결합으로 부착시키는 공유 결합 또는 원자사슬을 포함하는 화학적 모이어티를 가리킨다. 다양한 구현예에서, 링커는 2가 라디칼을 포함한다. 다양한 구현예에서, 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
용어 '보호 작용기'는 화합물 상의 다른 기능적 작용기와 반응을 일으키는 반면, 특정 기능성을 차단 또는 보호하기 위해 공통되게 활용되는 치환기를 가리킨다. 예를 들면, '아미노-보호 작용기'는 화합물에서 아미노 기능성을 차단 또는 보호하는 아미노 작용기에 부착되는 치환기이다. 적합한 아미노-보호 작용기에는, 비제한적으로, 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐(BOC), 벤질옥시카르닐(CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐(Fmoc)이 포함된다. 보호 작용기 및 이의 용도의 일반적인 설명을 위해, T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991, 또는 이후 판을 참조해 볼 수 있다.
본원에 사용된 '실질적인' 및 그 밖의 문법적 형식은 의도된 목적을 위해 충분히 효과가 있음을 의미한다. 용어 '실질적인'은 따라서 당해 기술의 숙련가에 의해 기대되지만, 전반적인 성능에 눈에 띄게 영향을 미치지 않는 절대적 또는 완벽한 상태, 치수, 측정치, 결과 등에서의 사소하고 무의미한 변형을 허용한다. 수치값 또는 매개 변수, 또는 수치값으로 표현될 수 있는 특징과 관련하여 사용될 때, '실질적인'은 10퍼센트 이내를 의미한다.
개요
항체-약물 접합체(ADC)는 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달을 허용하고, 일부 구현예에서 그 안에서의 세포내 축적을 허용하는데, 여기서 미접합된 약물의 전신 투여가 정상 세포에 허용불가 수준의 독성을 야기할 수 있다(Polakis P.(2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387). ADC는 항원-발현 종양 세포에 강력한 세포독성 약물을 표적화함으로써 항체와 세포독성 약물 양쪽 모두의 특성을 조합하는 표적화된 화학요법 분자로(Theicher, B.A.(2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), 이로써 효능을 극대화하고 표적을 벗어난 독성을 최소화함으로써 치료 지수를 향상시킨다.(Carter, P.J. and Senter P.D.(2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V.(2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107.
본 발명은 링커 모이어티를 통해 약물 모이어티 SN-38에 접합된 항-Trop-2 항체를 포함하는 ADC를 제공한다. 상기 항-Trop-2 항체는 Trop-2-발현 암 세포에 결합될 수 있고, 상기 암 세포로의 ADC의 선택적 흡수를 허용한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 ADC가 SN-38을 유효량만큼 종양 조직에 임의로 전달하는 데 사용되는 동안, SN-38을 항-Trop-2 항체에 접합하는 데 상이한 링커가 사용되는 다른 ADC와 연관된 독성은 회피한다. 본원에 기술된 ADC 화합물은 항암 활성을 가진 것들을 포함한다.
일 측면에서, 항-Trop-2 항체를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)가 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 항-Trop-2 항체를 포함하는 ADC를 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 본원에 개시된 ADC를 사용하여, 암, 예컨대 Trop-2-발현 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
I. 조성물
항체-약물 접합체
일 측면에서, 항-Trop-2 항체(Ab), 상기 약물 모이어티 SN-38 및 공유결합으로 상기 항-Trop-2 항체를 SN-38에 부착시키는 링커 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (I)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00031
여기서,
Ab는 항-Trop-2 항체이고;
q는 1 내지 20의 범위의 값이고;
L1이 항-Trop-2 항체에 결합된 링커이고;
L2가 -(CH2)p-로, p가 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
L3이 하나의 결합 또는 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이고;
R1 및 R2가 각각 독립적으로 C1-6 알킬이다.
일부 구현예에서, L1은 항-Trop-2 항체의 황에 결합된 링커이다. 일부 구현예에서, L1은
Figure pct00032
이다. 일부 구현예에서, -L1-L2-는
Figure pct00033
이다.
일부 구현예에서, q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 구현예에서, q는 1 내지 10의 범위의 값이다. 일부 구현예에서, q는 6 내지 8의 범위의 값이다. 일부 구현예에서, q는 6 내지 7의 범위의 값이다. 일부 구현예에서, q는 7 내지 8의 범위의 값이다. 일부 구현예에서, q는 6, 7 또는 8이다. 일부 구현예에서, q는 6이다. 일부 구현예에서, q는 7이다. 일부 구현예에서, q는 8이다.
일부 구현예에서, p는 4, 5 또는 6이다. 일부 구현예에서, p는 4이다. 일부 구현예에서, p는 5이다. 일부 구현예에서, p는 6이다. 일부 구현예에서, p는 7 또는 8이다. 일부 구현예에서, p는 7이다. 일부 구현예에서, p는 8이다.
일부 구현예에서, L3은 하나의 결합이다. 다른 구현예에서, L3은 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분 및 알킬렌 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분과 아릴렌 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 알킬렌 부분 및 아릴렌 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분과 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 알킬 부분 및 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 아릴렌 부분, 및 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 알킬렌 부분, 아릴렌 부분 및 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 최대 24개의 -(CH2CH2O)- 단위를 포함한다.
일부 구현예에서, R1은 C1-4 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 C1-3 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 메틸이다. 일부 구현예에서, R1은 에틸이다. 일부 구현예에서, R1은 프로필, 예컨대 n-프로필 또는 iso-프로필이다. 일부 구현예에서, R1은 부틸, 예컨대 n--부틸 또는 tert-부틸이다. 다른 구현예에서, R1은 펜틸 또는 헥실이다.
일부 구현예에서, R2는 C1-4 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 C1-3 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 메틸이다. 일부 구현예에서, R2는 에틸이다. 일부 구현예에서, R2는 프로필, 예컨대 n-프로필 또는 iso-프로필이다. 일부 구현예에서, R2는 부틸, 예컨대 n--부틸 또는 tert-부틸이다. 다른 구현예에서, R2는 펜틸 또는 헥실이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2는 동일하다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 메틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 에틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 프로필이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 부틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 펜틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 헥실이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2는 상이하다. 일부 구현예에서, R1은 메틸이고 R2는 에틸이다. 일부 구현예에서, R1은 에틸이고 R2는 메틸이다. 일부 구현예에서, R1은 메틸이고 R2는 C2-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 C2-6 알킬이고 R2는 메틸이다.
일부 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (IIa)으로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변이에서, L3은 하나의 결합이고,
Figure pct00034
상기 ADC는 화학식 (IIa-1)으로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00035
일부 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (IIb)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이고, 상기 ADC는
Figure pct00036
화학식 (IIb-1)으로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00037
일부 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (IIc)으로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이고 상기
Figure pct00038
ADC는 화학식 (IIc-1)으로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00039
일부 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (IIIa)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이고 상기 ADC
Figure pct00040
는 화학식 (IIIa-1)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00041
일부 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (IIIb)으로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이고
Figure pct00042
상기 ADC는 화학식 (IIIb-1)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00043
일부 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (IIIc)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이고 상기
Figure pct00044
ADC는 화학식 (IIIc-1)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00045
본원의 설명에서, 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이, 마치 모든 각각의 설명의 조합이 구체적으로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, 다른 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면과 조합될 수 있음이 이해된다. 예를 들면, 화학식 (I)의 L1와 관련하여 본원에 제공된 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이, 마치 모든 각각의 조합이 구체적으로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, L2, L3, p, R1, R2 및 Ab 및 q의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면과 조합될 수 있다. 또한, 해당되는 경우, 화학식 (I)의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 본원에서 상세히 설명된 다른 화학식에 동일하게 적용되고, 마치 모든 각각의 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 모든 화학식에 대해 별도로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, 동등하게 기술됨이 이해된다. 예를 들면, 해당되는 경우, 화학식 (I)의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 본원에 상세히 설명된 임의의 화학식, 예컨대 화학식 (IIa), (IIa-1), (IIb), (IIb-1), (IIc), (IIc-1), (IIIa), (IIIa-1), (IIIb), (IIIb-1), (IIIc) 및 (IIIc-1)에 동등하게 적용되며, 마치 모든 각각의 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 모든 화학식에 대해 별도로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, 동등하게 기술되었다.
일 구현예에서, 상기 ADC는 화학식 (IV)로 이루어지거나 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00046
약물 로딩
약물 로딩은 화학식 (I) 및 이의 변형의 분자 중 항-Trop-2 항체당 약물 모이어티(즉, SN-38)의 평균 개수인 q로 표현된다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개 약물 모이어티의 범위에 속할 수 있다. 화학식 (I)의 ADC, 및 이의 임의의 구현예, 변형 또는 측면은 1 내지 20개의 범위의 약물 모이어티와 접합된 항체의 집합체를 포함한다. 접합 반응에서 ADC를 제조할 때 항체당 약물 모이어티의 평균 개수는 질량 분광계, ELISA 검정 및 HPLC와 같은 기존 수단에 의해 규명될 수 있다. q의 측면에서 ADC의 정량적 분배가 또한 결정될 수 있다. 일부 예에서, q가 다른 약물 로딩을 구비한 ADC의 특정 값인 동종 ADC의 분리, 정제 및 특징규명이 역상 HPLC 또는 전기영동법와 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 ADC의 경우, q는 상기 항체 상의 부착 자리의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들면, 상기 부착이 본원에 기술된 특정 예시적 구현예에서와 같이, 시스테인 티올인 경우, 항체가 단 하나 또는 여러 시스테인 티올 작용기를 가질 수도 있고, 또는 링커가 그것을 통해 부착될 수 있는 단 하나 또는 여러 충분한 반응성의 티올 작용기를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, ADC에 대한 평균 약물 로딩은 1 내지 약 10, 또는 약 6 내지 약 8의 범위에 속한다.
특정 구현예에서, 약물 모이어티의 이론적인 최대치보다 더 적은 양이 접합 반응 중 항체에 접합된다. 항체는 예를 들면, 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 라이신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 수많은 유리 반응성 시스테인 티올을 함유하지 않으며; 사실은 항체 중 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화 다리로 존재한다. 특정 구현예에서, 항체는 부분적 또는 전체적 환원 조건하에, 디티오스레이톨(DTT) 또는 트리카보닐에틸포스파인(TCEP)과 같은 환원제로 환원되어, 반응성 시스테인 티올 작용기를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 변성 조건 하에서 반응성 핵친화성 작용기, 예컨대 라이신 또는 시스테인을 드러낸다. ADC의 로딩(loading)(약물/항체 비 또는 "dar")은 상이한 방식들, 예를 들면, (i) 항체에 대해 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 과도한 몰을 제한함으로써, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한함으로써, 및(iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적 환원 조건에 의해 조절될 수 있다.
둘 이상의 핵친화성 작용기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하는 경우, 수득된 생성물이 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티가 분배된 ADC 화합물의 혼합물임이 이해되어야 한다. 항체당 약물의 평균 개수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 상기 혼합물에서 계산될 수 있다. 개별 ADC 분자는 질량 분광계에 의해 혼합물에서 식별되고 HPLC에 의해, 예를 들면 소수성 상호작용 크로마토그래피로 분리될 수 있다(예를 들면, McDonagh et al(2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004 참조). 특정 구현예에서, 단일 로딩 값을 가진 동종 ADC가 전기영동법 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물에서 단리될 수 있다.
항-Trop-2 항체
i. 예시적인 항체 및 항체 서열
일부 구현예에서, 상기 ADC는 Trop-2에 결합되는 항체를 포함한다. Trop-2는 Trop-2 발현의 기준선 수치에서 독립적으로 여러 암 유형에서 상향조절되는 것으로 보고된 바 있다. 본원에 기술된 상기 ADC 화합물은 항-Trop-2 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 시스테인 잔기의 황을 통해 약물에 결합된다. 예시적 항-Trop-2 항체는 미국 특허 제7,238,785호에 개시된 hRS7 항체, 또는 이의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 적어도 하나의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 적어도 두 개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 적어도 3개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 적어도 4개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 적어도 5개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 적어도 6개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 하나의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 2개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 3개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 4개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 5개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 ADC는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3에서 선택되는 6개의 HVR를 포함하는 항-Trop-2 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1, 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2, 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3, 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1, 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2, 및 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 7과의 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 갖는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 7의 서열을 갖는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 7과 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Trop-2 항체는 Trop-2에 결합되는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호: 7에서 치환, 삽입 및/또는 결실된 바 있다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 7에서 치환, 삽입 및/또는 결실된 바 있다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖의 부위(즉, FR에서)에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 7의 VL 서열을 포함하고, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 8과의 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 갖는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 8의 서열을 갖는 VH를 포함한다. 특정 구현예에서, 서열번호: 8과 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 VH 서열은 기준 서열 대비 치환(예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Trop-2 항체는 Trop-2에 결합되는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호: 8에서 치환, 삽입 및/또는 결실된 바 있다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 5개의 아미노산이 서열번호: 8에서 치환, 삽입 및/또는 결실된 바 있다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실이 HVR 바깥 부위(즉, FR에서)에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 8의 VH 서열을 포함하고, 상기 서열의 번역후 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 카파 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 IgG1 항체이다.
일부 구현예에서, 항-Trop-2 항체가 인간 Trop-2와 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 인간 Trop-2는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 구현예들 중 임의의 것에서, 항-Trop-2 항체는 인간화된 것이다. 일 구현예에서, 항-Trop-2 항체는 상기 구현예들 중 임의의 것에서와 같이 HVR를 포함하고, 추가로 인간 억셉터 프레임워크, 예를 들면 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 인간 억셉터 프레임워크는 인간 VL 카파 1(VLKI) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VHIII이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항-Trop-2 항체는(a) 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1;(b) 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2;(c) 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3;(d) 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1;(e) 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2; 및(f) 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 항-Trop-2 항체는 단일클론 항체, 예컨대 키메라, 인간화된, 또는 인간 항체이다. 일 구현예에서, 항-Trop-2 항체는 항체 절편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 이중체, 또는 F(ab')2 절편이다. 또 다른 구현예에서, 상기 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들면, IgG1 항체 또는 기타 항체 클래스 또는 본원에 정의된 바와 같은 아이소타입이다.
ii. 항체 친화도
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-Trop-2 항체가 ≤ 10nM, 또는 ≤ 5nM, 또는 ≤ 4nM, 또는 ≤ 3nM, 또는 ≤ 2 nM의 친화도로 인간 Trop-2와 결합한다. 일부 구현예에서, 항-Trop-2 항체는 ≥ 0.0001nM, 또는 ≥ 0.001nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 인간 Trop-2와 결합한다. 당업자에게 알려진 표준 검정법을 사용하여 결합 친화도를 측정할 수 있다. 예를 들면, 항-Trop-2 항체가 ≤ 10nM, 또는 ≤ 5nM, 또는 ≤ 4nM, 또는 ≤ 3nM, 또는 ≤ 2 nM의 '친화도로 결합되는지' 여부가 비-선형 곡선 적합(fitting) 프로그램(예를 들면, Munson et al., Anal Biochem, 107: 220-239, 1980 참조)을 활용하는 표준 스캣차드 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 해리 상수(Kd)가 ≤ 1μM, ≤ 100nM, ≤ 10nM, ≤ 1nM, ≤ 0.1nM, ≤ 0.01nM, 또는 ≤ 0.001 nM이고, 임의로 ≥ 10-13 M(예를 들면 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)이다.
일부 구현예에서, Kd는 관심 대상의 항체의 Fab 형태 및 하기 검정법에 의해 기술된 바와 같은 이의 항원으로 수행된 방사성표지 항원 결합 검정법(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도가 일련의 미표지 항원의 적정의 존재 하에 최소한의 농도의(125I)-표지된 항원으로 Fab의 평형을 유지시키고, 이어서 항-Fab 항체-코팅 접시로 결합된 항원을 포획함으로써(예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) 참조), 측정된다. 상기 검정의 조건을 성립시키기 위해, MICROTITER® 다중웰 접시(Thermo Scientific)가 50mM 탄산나트륨(pH 9.6) 중 포획하는 항-Fab 항체(Cappel Labs) 5μg/ml로 밤새 코팅되고, 차후에 실온(대략 23℃)에서 2~5시간 동안 PBS 중 2%(w/v) 소혈청 알부빈으로 차단된다. 비흡착 접시(Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원이 일련의 과심대상의 Fab로 이루어진 일련의 희석액들과 혼합된다(예를 들면, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599(1997)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치됨). 이어서, 관심대상의 Fab는 밤새 배양되는데, 하지만, 상기 배양은 반드시 평형에 도달하도록 더 긴 기간(예를 들면, 최대 약 65시간) 동안 지속될 수 있다. 이후에, 상기 혼합물은 실온에서 배양하기 위해(예를 들면, 1시간 동안) 포획 접시로 옮겨진다. 상기 용액은 이어서 제거되고, 상기 접시는 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20®)로 8회 세척된다. 상기 접시가 건조되면, 150μL/웰의 섬광시약(scintillant)(MICROSCINT-20 TM; Packard)이 첨가되고, 상기 접시는 10분 동안 TOPCOUNT TM 감마 계수기(Packard) 상에서 계수된다. 20% 이하의 최대 결합을 제공하는 여러 농도의 Fab가 경쟁적 결합 검정법에서의 사용을 위해 선택된다.
또 다른 구현예에 따르면, Kd는 ~10 반응 단위(RU)의 부동성 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정법을 사용하여 측정된다. 요약하면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)이 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화된다. 항원은 5μL/분의 유량으로 주입하기 전 pH 4.8의 10mM 아세트산나트륨으로 5μg/ml(~0.2μM)로 희석되어 대략 10개 반응단위(RU)의 결속된 단백질을 달성한다. 항원의 주입 후, 1M 에탄올아민이 주입되어 미반응 작용기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, 대략 25μL/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20™) 계면활성제(PBST)가 있는 PBS 중 Fab의 2배 연속 희석액들(0.78nM 내지 500nM)이 주입된다. 회합율(kon) 및 해리율(koff)이 동시에 회합 및 해리 센서그램을 적합화함으로써, 단순한 1:1 랭뮤어 결합 모델(BIACORE ® Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산된다. 상기 평형 해리 상수(Kd)는 koff/kon 비율로 계산된다. 예를 들면, 문헌(Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999))을 참조한다. 만약 온율(on-rate)이 상기 표면 플라즈몬 공명 검정법에 의해 106 M-1s-1를 초과하는 경우, 상기 온레이트는 25℃에서 분광계, 예컨대 정지-유동 장착 분광계(Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS(pH 7.2) 중 20nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기 = 295nm; 방출= 340nm, 16nm 대역 통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 감쇄(fluorescent quenching) 기법을 사용함으로써 결정될 수 있다.
iii. 항체 절편
특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 항체 절편이다. 항체 절편에는, 비제한적으로, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 절편, 그리고 하기에 기술된 기타 절편이 포함된다. 특정 항체 절편의 검토를 위해, 문헌(Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003))을 참조할 수 있다. scFv 절편의 검토를 위해, 예를 들면, 문헌(Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994))을 참조할 수 있고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 5,571,894 및 5,587,458를 참조할 수 있다. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 체내 반감기가 증가하는 Fab 및 F(ab')2 절편의 논의를 위해, 미국 특허 제5,869,046호를 참조할 수 있다.
이중체는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원 결합 자리를 가진 항체 절편이다. 예를 들면, 문헌(EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993))을 참조한다. 삼중체 및 사중체가 또한 문헌(Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003))에 기술되었다.
단일-영역 항체는 항체의 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 절편이다. 특정 구현예에서, 단일-영역 항체는 인간 단일-영역 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들면, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조).
항체 절편은 다양한 기법, 예컨대 본원에 기술된 바와 같이, 비제한적으로 재조합 숙주 세포(예를 들면 대장균 또는 파지)에 의한 생산 뿐만 아니라 본연의 항체의 단백질 가수분해 소화에 의해 제조될 수 있다.
iv. 키메라 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들면, 문헌(미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)))에 기술되었다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 부위(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 유인원, 예컨대 원숭이에서 유래된 가변 부위)와 인간 불변 부위를 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 하위클래스가 부모 항체의 것에서 바뀐 '클래스 교체' 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 절편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체가 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소시키고, 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들면, CDR, (또는 이의 부분들)가 비-인간 항체에서 유래되고, FR(또는 이의 부분들)가 인간 항체 서열에서 유래되는 것인 하나 이상의 가변 영역을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 부위의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체 중 일부 FR 잔기가 비-인간 항체(예를 들면, 상기 HVR 잔기가 유래된 항체)에서 유래된 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 또는 향상시킨다.
인간화된 항체 및 이들을 제조하는 방법이 예를 들면, 문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))에서 검토되었고, 예를 들면 문헌(Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호 및 제7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34(2005)(SDR(a-CDR) 이식을 기술함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498(1991)('재표면화'을 기술함); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60(2005)('FR 섞기'를 기술함); and Osbourn et al., Methods 36:61-68(2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(FR 섞기에 대한 '유도 선택'을 기술함))에 추가로 기술되었다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 부위는, 비제한적으로, 최적의 적합(best-fit) 방법(예를 들면, 문헌(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)) 참조)을 사용하여 선택된 프레임워크 부위; 경쇄 또는 중쇄 가변 부위의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유래된 프레임워크 부위(예를 들면, 문헌(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)) 참조); 인간 성숙(체세포에서 변이된) 프레임워크 부위 또는 인간 생식계 프레임워크 부위(예를 들면, 문헌(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)) 참조); 및 FR 라이브러리를 선별함에서 유래된 프레임워크 부위(예를 들면, 문헌(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)) 참조)를 포함한다.
v. 인간 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해기술에 알려진 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌(van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74(2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008))에 기술되었다.
인간 항체는 항원 시험대(challenge)에 반응하여 인간 가변 부위를 갖는본연의 인간 항체 또는 본연의 항체를 생산하도록 변형된 바 있는 유전자 이식 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이와 같은 동물은 전형적으로 내생 면역글로불린좌를 대체하거나 또는 염색체 밖에 존재하거나 동물의 염색체에 임의로 통합되는 인간 면역글로불린좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이와 같은 유전자 이식 마우스에서, 상기 내생 면역글로불린좌는 일반적으로 불활성화되어 있다.유전자 이식 동물에서 인간 항체를 획득하기 위한 방법을 검토하기 위해 문헌(Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005))을 참조할 수 있다. 또한, 예를 들면, XENOMOUSE™ 기술을 설명하는 미국 특허 번호 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HuMab® 기술을 설명하는 미국 특허 번호 제5,770,429호; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 미국 특허 번호 제7,041,870호, 및 미국 특허 출원 공보 번호 US 2007/0061900, VelociMouse® 기술을 설명함) 참조할 수 있다. 이와 같은 동물에 의해 생성된 본연의 항체에서 유래된 인간 가변 부위는, 예를 들면, 상이한 인간 불변 부위와 조합으로써, 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종 세포주가 기술된 바 있다(예를 들면, 문헌(Kozbor J. Immunol., 133: 3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86(1991)) 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006))에 기술되었다. 추가의 방법에는 예를 들면, 미국 특허 번호 제7,189,826호(하이브리도마 세포주에서 단일클론 인간 IgM 항체의 생산에 대한 기술) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268(2006)(인간-인간 하이브리도마에 대한 기술)에 기술된 것이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술(Trioma Technology) 역시 문헌(Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937(2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91(2005))에 기술되었다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리에서 선택된 Fv 클론 가변 영역 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이와 같은 가변 영역 서열은 이어서 바람직한 인간 불변 영역과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리에서 인간 항체를 선택하기 위한 기법들이 아래 기술되어 있다.
vi. 라이브러리-유래 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 항체 라이브러리에서 유래된다. 항체는 원하는 활성 또는 활성들이 있는 항체용 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 그와 같이 원하는 결합 특징을 소유한 항체용 라이브러리를 선별하기 위한 다양한 방법이 당해기술에 알려져 있다. 이와 같은 방법이 예를 들면, 문헌(Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되었고, 추가로 예를 들면 문헌(McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628(1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597(1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310(2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093(2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472(2004); and Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004))에 기술되었다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이는 이어서 문헌(Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994))에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별될 수 있다. 파지는 전형적으로 단쇄 Fv(scFv) 절편 또는 Fab 절편 중 하나로서, 항체 절편을 디스플레이한다. 면역화된 원천에서 유래된 라이브러리는 하이브리도마 구성의 필요성 없이 상기 면역원에 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 상기 본연의 레퍼토리는 클로닝되어(예를 들면, 인간에서 유래) 문헌(Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734(1993))에 의해 기술된 바와 같이, 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 항체의 단일 원천을 제공할 수 있다. 최종적으로, 천연 라이브러리는 또한 줄기 세포의 재배열되지 않은 V-유전자 단편을 클로닝하고, 이어서 무작위 서열을 함유한 PCR 프라이머를 사용하여 문헌(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388(1992))에 기술된 바와 같이, 상당한 가변 CDR3 부위를 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성한다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술한 특허 공보에는 예를 들면: 미국 특허 번호 제5,750,373호, 및 미국 특허 공보 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호가 포함된다.
항체 또는 인간 항체 라이브러리에서 단리된 항체 절편은 본원의 인간 항체 또는 인간 항체 절편으로 간주된다.
vii. 다중특이성 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 다중특이성 항체, 예를 들면, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 자리를 위한 결합 특이성을 가진 단일클론 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 ㅎ하나는 Trop-2를 위한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이성 항체는 Trop-2의 2개의 상이한 에피토프에 결합될 수 있다. 이중특이성 항체가 또한 사용되어 Trop-2를 발현하는 세포에 세포독성 제제를 위치시킬 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 절편으로서 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기법에는, 비제한적으로, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍들의 재조합 공통발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537(1983)), WO 93/08829, and Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655(1991) 참조), 및 '구멍 속 손잡이(knob-in-hole)' 조작(예를 들면, 미국 특허 번호 제5,731,168호 참조)이 포함된다. 다중 특이성 항체 또한 항체 Fc-헤테로다이머 분자를 제조하기 위한 정전기 운전 효과를 조작함으로써(WO　2009/089004A1); 둘 이상의 항체 또는 절편을 가교결합함으로써(예를 들면, 미국 특허 번호 제4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81(1985) 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생산함으로써(예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553(1992) 참조); 이중특이성 항체 절편을 제조하기 위한 '이중체' 기술을 사용함으로써(예를 들면, Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448(1993) 참조); 및 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용함으로써(예를 들면 Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994) 참조); 및 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60(1991)에 기술된 바와 같이, 삼중특이성 항체를 제조함으로써, 제조될 수 있다.
셋 이상의 기능성 항원 결합 자리를 가진 조작된 항체, 예컨대 '문어(Octopus) 항체'가 또한 본원에 포함된다(예를 들면 US　2006/0025576A1 참조).
본원에 항체 또는 절편은 또 다른 상이한 항원 뿐만 아니라 Trop-2에 결합되는 항원 결합 자리를 포함하는 '이중 작용 FAb' 즉 'DAF를 포함한다(예를 들면, US　2008/0069820 참조).
viii. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 상기 항체의 아미노산 서열 변이체가 고안되었다. 예를 들면, 상기 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성들을 개선하는 것이 바람직할 것이다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변형을 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이와 같은 변형은 예를 들면, 상기 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실, 및/또는 그것으로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 임의의 결실, 삽입 및 치환의 조합이 만들어져 최종 작제물에 도달할 수 있는데, 단 상기 최종 작제물이 바람직한 특징, 예를 들면, 항원-결합을 소유할 경우이다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 항-Trop-2 항체는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 치환성 돌연변이 유발을 위한 관심대상 자리는 HVR 및 FR를 포함한다. 보존적 치환이 '바람직한 치환'이라는 표제어 하에 표 1이 나타나 있다. 더욱 실질적인 변경이 '예시적 치환'이라는 표제어 하에 표 1에 제공되고, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술된 바와 같다. 아미노산 치환은 관심대상의 항체로 도입되어, 상기 생성물들이 바람직한 활성, 예를 들면, 보유된/개선된 항원 결합, 축소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별될 수 있다.
Figure pct00047
아미노산은 공통된 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향성에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환성 변이체의 일 유형은 부모 항체(예를 들면, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 수득 변이체(들)은 부모 항체 대비 특정한 생물학적 특성(예를 들면, 친화도 증가, 면역원성 감소)의 수정(예를 들면, 개선)이 있을 것이고, 및/또는 부모 항체의 특정한 생물학적 특성을 실질적으로 보유하고 있을 것이다. 일 예시적인 치환성 변이체는 친화도 성숙 항체로, 이는 예를 들면, 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기법, 예컨대 본원에 기술된 것들을 사용하여, 간편하게 생성될 수 있다. 요약하면, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이며고, 상기 변이체 항체가 파지 상에 표시되고, 특정 생물학적 활성(예를 들면 결합 친화도)에 대해 선별된다.
변경(예를 들면, 치환)이 예를 들면, 항체 친화도를 개선하기 위해, HVR에서 제조될 수 있다. 이와 같은 변경은 HVR '핫스폿', 즉 체세포 성숙 과정 중 고주파수로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기(예를 들면, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196(2008) 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있는데, 수득된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험 대상이 된다. 이차 라이브러리를 구축하고, 그것에서 재선택함에 의한 친화도 성숙이 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 17 8:1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기술되었다. 친화도 성숙의 일부 구현예에서, 다양성이 다양한 방법들 중 임의의 것(예를 들면, 오류-경향 PCR, 사슬 섞기, 또는 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 도입된다. 그러고 나서, 이차 라이브러리가 형성된다. 상기 라이브러리는 이어서 원하는 친화도를 가진 임의의 항체 변이체를 식별하기 위해 선별된다. 다양성을 도입하기 위한 또다른 방법은 HVR-유도(HVR-directed) 방법을 포함하는데, 여기서 여러 HVR 잔기(예를 들면, 1회에 4~6개의 잔기)가 무작위로 선택된다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여, 구체적으로 식별될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 그와 같은 변경이 항체의 항원과의 결합 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들면, 본원에 제공된 보존적 치환)은 HVR에서 이루어질 수 있다. 이와 같은 변경은 HVR '핫스폿' 즉, SDR의 밖에서 이루어질 수 있다. 앞서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 하나, 둘 또는 셋 의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 부위의 식별을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells(1989) Science, 244:1081-1085에서 기술된 바에 따르면, '알라닌 스캐닝 돌연변이유발'이라 불린다. 이와 같은 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들(예를 들면, 전하를 띤 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)의 그룹이 중성의 또는 음전하를 띤 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 식별 및 교체되어 상기 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받았는지 여부를 결정할 수 있다. 추가의 치환이 최초 치환에 대한 기능적 민감도를 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조가 사용되어 상기 항체와 항원 사이의 접점이 식별된다. 이와 같은 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환의 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 함유하는지 여부를 판별하기 위해 선별될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내부 삽입 뿐만 아니라, 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유한 폴리펩타이드에 이르기까지의 길이의 범위에 속하는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 항체가 포함된다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들면, ADEPT의 경우) 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에 상기 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
b) 당화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-Trop-2 항체가 변경되어 상기 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시킨다. 항체에 당화 자리의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 당화 자리가 형성되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써, 간편하게 달성될 수 있다.
상기 항체가 Fc 부위를 포함하는 경우, 그것에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 일반적으로 N-연결에 의해 Fc 부위의 CH2 영역의 Asn297에 부착되는 분기형 이중안테나 올리고당을 포함한다. 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32(1997)를 참조. 상기 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들면, 이중안테나 올리고당 구조의 '줄기'에서 글루코사민(GlcNAc)에 부착된 푸코오스를 비롯하여, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 중 상기 올리고당의 변형이 일정한 개선된 특성이 있는 항체 변이체를 형성하기 위해 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, Fc 부위에(직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 이와 같은 항체 중 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코오스의 양은, 예를 들면 WO　2008/077546에 기술된 바에 따르면, MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된 바와 같이, Asn 297에 부착된 모든 당 구조물의 총합(예를 들면, 복합, 하이브리드, 및 고-만노스 구조) 대비, Asn297에 당 사슬 내의 푸코오스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 부위의 약 위치 297(Fc 부위 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 가리키는데; 하지만, Asn297은 또한 항체 중 작은 서열 변이 때문에, 위치 297의 상류 또는 하류의 ± 3 아미노산위 위치, 즉, 위치 294 및 300에 위치될 수 있다. 이와 같은 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 공부 번호 제US 2003/0157108호(Presta, L.); 제US 2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) 참조. '탈푸코실화' 또는 '푸코오스 부족' 항체 변이체와 관련된 공보의 예에는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol . 336:1239-1249(2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614(2004)가 포함된다. 탈푸코실화 항체를 제조할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화에 부족한 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986); 미국 특허출원 번호 제US 2003/0157108 A1호, Presta, L; 및 WO　2004/056312 A1, Adams et al., 특히, 실시예 11), 및 녹아웃 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전이효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614(2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688(2006); 및 WO2003/085107 참조)가 포함된다.
예를 들면, 상기 항체의 Fc 부위에 부착된 이중안테나 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분된 것인 이등분된 올리고당이 있는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이와 같은 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이와 같은 항체 변이체의 예가 예를 들면, WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 제6,602,684호(Umana et al.); 및 제US 2005/0123546호(Umana et al.)에 기술되었다. 상기 Fc 부위에 부착된 올리고당 중 적어도 하나의 갈락토오스 잔기가 있는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이와 같은 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기술되었다.
c) Fc 부위 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항-Trop-2 항체의 Fc 부위에 도입됨으로써, Fc 부위 변이체가 생성된다. 상기 Fc 부위 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 부위 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 부위)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 체내에서 상기 항체의 반감기가 중요하지만, 특정 효과기 기능(예컨대 상보 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용을 위해 바람직한 후보로 만드는 전체가 아닌 일부 효과기 기능을 소유하는 항체 변이체를 고안한다. 시험관내 및/또는 체내 세포독성 검정법이 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체(FcR) 결합 검정법이 상기 항체에 FcγR 결합이 결여되었으나(따라서, ADCC 활성이 결여되었을 가능성이 있음), FcRn 결합 능력이 보유되도록 하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 중재하기 위한 일차 세포, 즉 NK 세포가 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단일세포구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현이 문헌(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991))의 464쪽 표3에 요약되었다. 관심대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정법의 비제한적인 예가 미국 특허 번호 제5,500,362호(예를 들면 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986), and Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502(1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361(1987) 참조)에 기술되었다. 대안적으로, 비방사성 검정법이 활용될 수 있다(예를 들면, 유동 세포 분석법을 위한 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정법(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정법(Promega, Madison, WI)) 참조). 이와 같은 검정법을 위한 유용한 효과기 세포에는 말초 혈액단구핵 세포(PBMC) 및 자연살해(NK) 세포가 포함된다. 대안적으로, 또는 추가로, 관심대상의 분자의 ADCC 활성이 예를 들면, 예컨대 Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)에 개시된 동물 모형에서, 체내에서 평가될 수 있다. C1q 결합 검정법은 또한 상기 항체가 C1q와 결합할 수 없기 때문에 CDC 활성이 부족함을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402 중 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보완 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정법이 수행될 수 있다(예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052(2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743(2004) 참조). FcRn 결합 및 체내 청소/반감기 결정이 또한 당해 기술에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769(2006) 참조).
효과기 기능이 감소된 항체는 Fc 부위 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329(미국 특허 번호 제6,737,056호) 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다. 이와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에서의 치환을 갖는 Fc 돌연변이체, 예컨대 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 'DANA' Fc 돌연변이체(미국 특허 번호 제7,332,581호)를 포함한다.
FcR에 개선된 또는 축소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기술되었다(예를 들면, 미국 특허 번호 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)에 참조).
모체 IgGs의 태아로의 이전에 책임이 있고, 반감기가 증가되고 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체(Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249(1994))가 US2005/0014934A1(Hinton et al.)에 기술되었다. 상기 항체는 FcRn에 대한 Fc 부위 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 부위를 포함한다. 이와 같은 Fc 변이체는 하기 Fc 부위 잔기들 중 하나 이상에서 치환이 이루어진 것을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들면, Fc 부위 잔기 434의 치환(미국 특허 번호 제7,371,826호).
또한 Fc 부위 변이체의 다른 예들과 관련하여, Duncan & Winter, Nature 322:738-40(1988); 미국 특허 번호 제5,648,260호; 미국 특허 번호 제5,624,821호; 및 WO 94/29351을 참조할 수 있다.
ix. 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항-Trop-2 항체는 당해 기술에 알려지고 손쉽게 구할 수 있는 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티에는 비제한적으로 수용성 중합체가 포함된다. 수용성 중합체의 비제한적인 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/무수 말레인산 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체 중 하나), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 비제한적으로 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서 이의 안정성 때문에 제조에 이점이 있을 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고. 분기형 또는 미분기형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있는데, 둘 이상의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 개수 및/또는 유형은 비제한적으로, 개선하려는 항체의 특정 특성 또는 기능, 상기 항체 유도체가 규정된 조건 하의 치료에 사용될 것인지 여부 등에 따라 결정될 수 있다.
x. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,816,567호에 기술된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 당업자는 항체 발현을 위한 적합한 숙주 세포에 친숙할 것이다. 예시적 숙주 세포에는 진핵 세포, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)가 포함된다.
항-Trop-2 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들면, 앞서 기술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되어 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 이와 같은 핵산은 종래의 절차(예를 들면, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합될 수 있는올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써)를 사용하여 쉽게 단리 및 서열화될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 및 발현을 위한 적합한 숙주 세포에는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들면, 항체는 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요치 않은 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 절편 및 폴리펩타이드의 발현과 관련하여, 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,648,237호, 제5,789,199호 및 제5,840,523호를 참조할 수 있다(또한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254(대장균(E. coli.)에서 항체 절편의 발현을 기술함)을 참조). 발현 후, 상기 항체는 용해성 분획에서 박테리아 세균 페이스트에서 단리될 수도 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵 생물과 더불어, 진핵 미생물, 예컨대 사상성 진균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주로, 예컨대 당화 경로가 '인간화'되어, 결과적으로 부분적으로 또는 전적으로 인간 당화 패턴이 있는 항체의 생산을 초래하는 진균 및 효모 균주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414(2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215(2006) 참조.
당화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다중세포 생물체(무척추동물 및 척추동물)에서 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 담배거세미 나방종(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큐로바이러스 균주가 식별된 바 있다.
식물 세포 배양물 또한 숙주로 활용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호 및 제6,417,429호(유전자 이식 식물에서 항체를 생산하는 PLANTIBODIES™을 기술함) 참조.
척추 동물 세포 역시 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 증식하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예들은 SV40(COS-7)에 의해 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59(1977)에 기술된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)에 기술된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)에 기술된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980)); 및골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)를 참조할 수 있다.
xi. 검정법
본원에 기술된 항-Trop-2 항체는 당해기술에 알려진 다양한 검정법에 의해 이들의 물리적/화학적 특성들 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별, 선별 또는 특징규명이 이루어질 수 있다.
일 측면에서, 항체는 예를 들면, 알려진 방법에 의해, 예컨대 ELISA, BIACore®, FACS, 또는 웨스턴 블롯에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 검사를 받는다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정법이 사용되어 Trop-2와 결합을 위해 본원에 기술된 항원들 중 임의의 것과 경쟁하는 항체가 식별될 수 있다. 특정 구현예에서, 이와 같이 경쟁하는 항체는 본원에 기술된 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 것(예를 들면, 선형 또는 형태학적(conformational) 에피토프)에 결합된다. 항체가 결합되는 에피토프를 매핑하는 예시적인 상세한 방법이 Morris(1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66(Humana Press, Totowa, NJ)에 제공되었다.
예시적인 경쟁 검정법에서, 부동화된 Trop-2가 Trop-2에 결합되는 제1 표지 항체 및, Trop-2에 결합하는 것에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력을 시험받게 될 제2 미표지 항체를 포함하는 용액에서 배양된다. 상기 제2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 부동화된 Trop-2는 상기 제1 표지 항체를 포함하지만 상기 제2 미표지 항체를 포함하지 않는 용액에서 배양된다. 제1 항체의 Trop-2 결합에 대해 허용적인 조건 하에서 배양 후, 과잉의 미결합 항체가 제거되고, 부동화된 Trop-2와 연관된 표지의 양이 측정된다. 만약 부동화된 Trop-2와 연관된 표지의 양이 대조군 대비 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우, 이는 제2 항체가 Trop-2와의 결합을 놓고 제1 항체와 경쟁을 벌이고 있음을 보여준다. 특정 구현예에서, 부동화된 Trop-2는 세포의 표면 상에 또는 이의 표면 상에서 의 세포 발현 Trop-2를 발현하는 세포에서 획득된 막 제제에 존재한다. Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 참조.
II. 항체-약물 접합체의 제조 방법
화학식 (I)의 ADC는 당업자에게 알려진 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 활용하는 여러 경로, 예컨대(1) 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성하기 위한 2가 링커 시약(L)과 항체의 핵친화성 작용기의 반응, 이어서 약물 모이어티(즉, SN-38 모이어티)와의 반응; 및(2) 공유 결합을 통해 D-L을 형성하기 위한 2가 링커 시약(L)과 약물 모이어티 D(즉, SN-38 모이어티)의 핵친화성 작용기의 반응, 이어서 항체의 핵친화성 작용기와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 후자의 경로를 통한 ADC의 예시적인 제조 방법이 미국 특허 번호 제7,498,298호에 기술되었다.
항체 상의 핵친화성 작용기는, 비제한적으로, (i) N-말단 아민 작용기, (ii) 측쇄 아민 작용기, 예를 들면 라이신, (iii) 측쇄 티올 작용기, 예를 들면 시스테인, 및(iv) 상기 항체가 당화되는 설탕 히드록실 또는 아미노 작용기를 포함한다. 아민, 티올 및 히드록실 작용기는 핵친화성이고 반응하여 링커 모이어티 및 하기 링커 시약 상에 전기친화 작용기와 함께 공유 결합을 형성할 수 있다:(i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포메이트, 및 산 할라이드;(ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아마이드; 및(iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 작용기. NHS 에스테르와 더불어, 세포 표면 라이신에 접합을 위해 사용되는 기능성 작용기는, 비제한적인 예로서, 펜타플루오로페닐, 테트라플루오로페닐, 테트라플루오로벤젠설포테이트, 나이트로페닐, 아이소시아네이트, 아이소티오시아네이트 및 설포닐클로라이드.
특정 항체는 환원가능한 내부사슬 이황화, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 환원제 예컨대 DTT(디티오스레이톨) 또는 트리카보닐에틸포스파인(TCEP)으로 처리함으로써 링커 시약과의 접합에 반응성을 갖도록 만들 수 있는데, 이로써 상기 항체는 온전히 또는 부분적으로 환원된다. 각 시스테인 브릿지는 따라서, 이론적으로는, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 핵친화성 작용기가 예를 들면, 라이신 잔기를 2-이미노티올란(트라우트(Traut's) 시약)과 반응시킴으로써, 라이신 잔기의 변형을 통해 항체에 도입될 수 있고, 결과적으로 아민이 티올로 전환된다. 반응성 티올 작용기가 또한 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써(예를 들면, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조함으로써), 항체에 도입될 수 있다. 반응성 티올과 반응할 수 있는 기능성 작용기의 비제한적인 예에는, 비제한적으로, 말레이미드, 피리딜디티오, 브로모아세틸, 이오도아세틸, 브로모벤질, 아이오도벤질, 및 4-(시아노에티닐)벤질이 포함된다.
본원에 기술된 ADC는 또한 항체 상의 전자친화성 작용기, 예컨대 알데하이드 또는 케톤 카보닐 작용기와, 링커 시약 또는 약물 상의 핵친화성 작용기 사이의 반응에 의해 생산될 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 핵친화성 작용기에는, 비제한적으로, 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티도세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라자이드가 포함된다. 일 구현예에서, 항체는 링커 시약 또는 약물 상의 핵친화성 치환체와 반응할 수 있는 전자친화적 모이어티를 도입하기 위해 변형된다. 또 다른 구현예에서, 당화된 항체의 당은, 예를 들면 페리오데이트 산화 시약으로, 산화되어 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민 작용기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤 작용기를 형성한다. 수득된 이민 쉬프( Schiff) 염기성 작용기는 안정적인 연결을 형성하거나, 또는 예를 들면 보로하이드라이드 시약에 의해 환원되어 안정적인 아민 연결을 형성한다. 일 구현예에서,당화된 항체의 탄수화물 부분과 갈락토오스 산화효소 또는 소듐 메타-페리오데이트 둘 중 하나와의 반응이 상기 약물(Hermanson, Bioconjugate Techniques) 상의 적합한 작용기와 반응할 수 있는 항체에서 카보닐(알데하이드 및 케톤) 작용기를 수득할 수 있다. 또 다른 구현예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유한 항체가는 소듐 메타-페리오데이트와 반응하여, 결과적으로 제1 아미노산 대신 알데하이드를 생산할 수 있다(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). 이와 같은 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응될 수 있다.
약물 모이어티 상의 예시적 핵친화성 작용기에는, 비제한적으로, 하기의 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 전자친화적 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는, 아민, 티올, 히드록실, 하이드라자이드, 옥심, 하이드라진, 티도세미카르바존, 하이드라진 카르복실레이트, 및 아릴하이드라자이드 작용기가 포함된다: (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아마이드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 작용기.
또 다른 구현예에서, 항체가 종양 사전 표적화에서 활용되기 위한 '수용체'(예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있는데, 여기서 상기 항체-수용체 접합체가 환자에게 투여되고, 이어서 청소 시약(clearing agent)을 사용하여 순환에서 미결합 접합체를 제거하고, 이어서 세포독성 제제(예를 들면, 약물 또는 방사성 뉴클레오타이드)에 접합되는 '리간드'(예를 들면, 아비딘)를 투여한다.
일 측면에서, 화학식 (I)의 ADC는 항-Trop-2 항체(Ab)를 화학식 (P-I)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
Figure pct00048
여기서,
B는 상기 항-Trop-2 항체와 결합을 형성할 수 있는 반응성 모이어티이고;
L2는 -(CH2)p-로, p는 4, 5, 6, 7, 또는 8이고;
L3은 하나의 결합 또는 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-6 알킬이다.
일부 구현예에서, B은 상기 항-Trop-2 항체의 설프하이드릴과 결합을 형성할 수 있는 반응성 모이어티이다. 일부 구현예에서, B는 N-말레이미도이다. 일부 구현예에서, B는
Figure pct00049
이다. 일부 구현예에서, B-L2-는
Figure pct00050
이다.
일부 구현예에서, p는 4, 5, 또는 6이다. 일부 구현예에서, p는 4이다. 일부 구현예에서, p는 5이다. 일부 구현예에서, p는 6이다. 일부 구현예에서, p는 7 또는 8이다. 일부 구현예에서, p는 7이다. 일부 구현예에서, p는 8이다.
일부 구현예에서, L3은 하나의 결합이다. 다른 구현예에서, L3은 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분과 알킬렌 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분과 아릴렌 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 알킬렌 부분, 및 아릴렌 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분과 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 알킬 부분, 및 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 아릴렌 부분, 및 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 폴리옥시에틸렌 부분, 알킬렌 부분, 아릴렌 부분, 및 아마이드 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌계 2가 링커는 최대 24개의 -(CH2CH2O)- 단위를 포함한다.
일부 구현예에서, R1은 C1-4 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 C1-3 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 메틸이다. 일부 구현예에서, R1은 에틸이다. 일부 구현예에서, R1은 프로필, 예컨대 n-프로필 또는 iso-프로필이다. 일부 구현예에서, R1은 부틸, 예컨대 n--부틸 또는 tert-부틸이다. 다른 구현예에서, R1은 펜틸 또는 헥실이다.
일부 구현예에서, R2는 C1-4 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 C1-3 알킬이다. 일부 구현예에서, R2는 메틸이다. 일부 구현예에서, R2는 에틸이다. 일부 구현예에서, R2는 프로필, 예컨대 n-프로필 또는 iso-프로필이다. 일부 구현예에서, R2는 부틸, 예컨대 n--부틸 또는 tert-부틸이다. 다른 구현예에서, R2는 펜틸 또는 헥실이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2는 동일한다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 메틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 에틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 프로필이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 부틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 펜틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 헥실이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2는 상이하다. 일부 구현예에서, R1은 메틸이고 R2는 에틸이다. 일부 구현예에서, R1은 에틸이고 R2는 메틸이다. 일부 구현예에서, R1은 메틸이고 R2는 C2-6 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 C2-6 알킬이고 R2는 메틸이다.
일부 구현예에서, 화학식 (P-I)의 분자는 화학식 (P-IIa)의 분자, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이다.
Figure pct00051
상기 분자는 화학식 (P-IIa-1)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00052
일부 구현예에서, 상기 분자는 화학식 (P-IIb)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이다.
Figure pct00053
상기 분자는 화학식 (P-IIb-1)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00054
일부 구현예에서, 상기 분자는 화학식 (P-IIc)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이다.
Figure pct00055
상기 분자는 화학식 (P-IIc-1)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00056
일부 구현예에서, 상기 분자는 화학식 (P-IIIa)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이다.
Figure pct00057
상기 분자는 화학식 (P-IIIa-1)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00058
일부 구현예에서, 상기 분자는 화학식 (P-IIIb)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이다.
Figure pct00059
상기 분자는 화학식 (P-IIIb-1)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00060
일부 구현예에서, 상기 분자는 화학식 (P-IIIc)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일 변형에서, L3은 하나의 결합이다.
Figure pct00061
상기 분자는 화학식 (P-IIIc-1)으로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00062
일부 구현예에서, 상기 분자는 화학식 (P-IV)로 이루어진 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
Figure pct00063
전술된 제조 방법에서, 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이, 마치 모든 각각의 설명의 조합이 구체적으로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, 다른 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면과 조합될 수 있음이 이해된다. 예를 들면, 화학식 (P-I)의 L2와 관련하여 본원에 제공된 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이, 마치 모든 각각의 조합이 구체적으로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, L3, p, R1, R2 및 B의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면과 조합될 수 있다. 또한, 해당되는 경우, 화학식 (P-I)의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 본원에서 상세히 설명된 다른 화학식에 동일하게 적용되고, 마치 모든 각각의 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 모든 화학식에 대해 별도로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, 동등하게 기술됨이 이해된다. 예를 들면, 해당되는 경우, 화학식 (P-I)의 모든 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 본원에 상세히 설명된 임의의 화학식, 예컨대 화학식 (P-IIa), (P-IIa-1), (P-IIb), (P-IIb-1), (P-IIc), (P-IIc-1), (P-IIIa), (P-IIIa-1), (P-IIIb), (P-IIIb-1), (P-IIIc) 및(P-IIIc-1)에 동등하게 적용되며, 마치 모든 각각의 설명, 변형, 구현예, 또는 측면이 모든 화학식에 대해 별도로 그리고 개별적으로 나열된 바와 같이, 동등하게 기술되었다.
III. 약학적 제형
본원에 기술된 ADC의 약학적 제형은 원하는 정도의 순도를 가진 ADC를 동결건조 제형 또는 수용액 형태의 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용되는 운반체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980))와 혼합함으로써 제조된다. 약제학적으로 허용되는 운반체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고, 비제한적으로 하기를 포함한다: 완충액 예컨대 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트 제제, 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들면 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG).
본원의 예시적인 약제학적으로 허용되는 운반체에는 추가로 체간(insterstitial) 약물 분산제, 예컨대 용해성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백(sHASEGP), 예를 들면, 인간 용해성 PH-20 히알루로니다아제 당단백, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)이 포함된다.　특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법, 예컨대 rHuPH20이 미국 특허 공보 번호 제2005/0260186호와 제2006/0104968호에 기술되었다.　일 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적 동결건조 ADC 제형이 미국 특허 번호 제6,267,958호 기술되었다. 수성 ADC 제형에는 미국 특허 번호 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기술된 것이 포함되는데, 후기 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원에 제공된 제형은 또한 치료 중인 특정 징후에 필요한 경우, 둘 이상의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 것들을 함유한다
활성 성분들은 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합반응에 의해 제조된 마이크로캡슐 예를 들면, 각각 콜로이드성 약물 전달 체계(예를 들면, 리포좀, 알부민 소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼 중 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 포함될 수 있다. 이와 같은 기법은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)에 개시되었다.
지속방출형 제제가 제조될 수 있다. 지속방출형 제제의 적합한 예에는 ADC를 함유한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이와 같은 매트릭스는 형태가 있는 물품, 예를 들면 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다.
체내 투여를 위해 사용되는 제형은 일반적으로 살균상태이다. 살균은 예를 들면, 살균 여과막을 통한 여과에 의해 손쉽게 달성될 수 있다.
IV. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 ADC는 여러 방법들, 예를 들면, 치료 방법에 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본원에 제공된 상기 ADC가 Trop-2-발현 세포의 증식을 억제하는 방법에 사용되는데, 상기 방법은 세포 표면 상에서 ADC의 항-Trop-2 항체의 결합을 위해 허용되는 조건 하에서 상기 세포를 ADC에 노출시킴으로써, 상기 세포의 증식을 억제하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 시험관내 또는 체내 방법이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 신생물 B 세포, 예컨대 림프종 세포 또는 백혈병 세포이다.
시험관내에서 세포 증식의 억제는 Promega(Madison, WI)에서 구매할 수 있는 CellTiter-Glo™ 발광 세포 생존능 검정법을 사용하여 검정될 수 있다. 상기 검정은존재하는 ATP의 정량을 기준으로 생존가능 세포의 수를 측정하는데, 이는 대사적으로 활성 세포의 지표이다. Crouch et al.(1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, US Pat. No. 6602677 참조. 상기 검정법은 96- 또는 384-웰 형식으로 수행될 수 있어서, 자동화 고처리량 스크리닝(HTS)로 처리할 수 있다. Cree et al.(1995) AntiCancer Drugs 6:398-404 참조. 상기 검정 절차는 배양된 세포에 직접적으로 단일 시약(CellTiter-Glo® 시약)을 첨가하는 단계를 수반한다. 이는 세포 용해 및 루시퍼라아제 반응에 의해 생산된 발광 신호의 생성을 야기한다. 상기 발광 신호는 존재하는 ATP의 양에 비례하고, 이는 직접적으로 배양액 중 존재하는 생존가능 세포의 수에 비례한다. 데이터는 광도계 또는 CCD 카메라 화상 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 출력이 상대적 광 단위(RLU)로 표현된다.
또 다른 측면에서, 약제으로 사용하기 위한 ADC가 제공된다. 추가의 측면에서, 치료 방법에 사용하기 위한 ADC가 제공된다. 특정 구현예에서, 암을 치료하는 데 사용하기 위한 ADC가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 암은 Trop-2의 과잉 발현과 연관이 있다. 특정 구현예에서, Trop-2-발현 암을 가진 개인을 치료하는 방법에 사용하기 위한 ADC가 본원에 제공되는데, 상기 방법은 ADC의 유효량을 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 하나의 구현예에서, 상기 방법은 추가로 예를 들면, 하기에 기술되는 것과 같은 적어도 하나의 추가의 치료제를 상기 개인에게 유효량만큼 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 약제의 제조 및 제제에서 ADC의 사용을 허용한다. 일 구현예에서, 상기 약제은 Trop-2-발현 암의 치료를 위한 것이다. 하나의 추가적 구현예에서, 상기 약제은 Trop-2-발현 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것으로, 상기 방법은 Trop-2-발현 암을 가진 개인에게 상기 약제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 일 구현예에서, 상기 방법은 추가로 예를 들면, 하기에 기술된 바와 같이, 적어도 하나의 추가의 치료제를 상기 개인에게 유효량만큼 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 Trop-2-발현 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 상피 세포-유래 암이다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 암종이다. 일부 구현예에서, 상기 암종은 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 신장 세포 암종, 제자리 유관 암종, 침습성 유관 암종, 또는 선암이다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 고체 종양을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 전이성이다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 재발된 암이다.
일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 췌장암, 위암, 유방암, 흑색종, 신장암, 결장직장암, 자궁내막암, 전립선암, 요로상피암, 교모세포종, 폐암, 자궁경부암, 식도암, 또는 난소암이다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 췌장암이다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 위암이다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2-발현 암은 유방암이다. 일부 구현예에서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암이다. 이들 구현예들 중 임의의 것에서, 상기 암은 전이성 암일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 암은 재발된 암이다.
일부 구현예에서, Trop-2 발현 암은 항-Trop-2 면역조직화학(IHC) 또는 제자리 혼성화(ISH) 점수가 '0'보다 큰 암으로, 이는 종양 세포의 >90%에서 아주 약한 염색 또는 무염색에 상응한다. 또다른 구현예에서, Trop-2 발현 암은 1+, 2+ 또는 3+ 레벨에서 Trop-2를 발현하는데, 여기서 1+는 신생물 세포의 >50%에서의 약한 염색에 상응하고, 2+는 신생물 세포의 >50%에서의 중간치 염색에 상응하고, 3+는 신생물 세포의 >50%에서의 강한 염색에 상응한다. 일부 구현예에서, Trop-2 발현 암은 Trop-2 mRNA를 검출하는 역-전사효소 PCR(RT-PCR)에 따라 Trop-2를 발현하는 암이다. 일부 구현예에서, 상기 RT-PCR는 정량적 RT-PCR이다.
일부 구현예에서, Trop-2 발현 암을 가진 개인을 치료하는 방법이 제공되는데, 여기서 Trop-2 발현 암은 제1 치료제에 저항한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같이 ADC를 상기 개인에게 유효량만큼 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 Trop-2 발현 암은 췌장암, 위암, 삼중 음성 유방암을 포함하는 유방암, 자궁경부암, 식도암, 또는 난소암에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 치료제는 SN-38 이외의 제1 세포독성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 치료제는 Trop-2를 제외한 항원과 결합하는 제1 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 제1 치료제는 Trop-2와 제1 세포독성 제제 이외의 항원과 결합하는 제1 항체를 포함하는 제1 ADC이다.
상기 구현예들 중 임의의 것에 따른 '개인'은 인간일 수 있다.
추가의 측면에서, 예를 들면, 상기 치료 방법 중 임의의 것에 사용하기 위해, 본원에 제공된 ADC 중 임의의 것을 포함하는 약학적 제형이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 약학적 제형은 본원에 제공되는 임의의 ADC와 약제학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약학적 제형은 본원에 제공된 임의의 ADC와 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
본원에 기술된 ADC는 치료 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 임의의 ADC는 적어도 적어도 하나의 추가의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 치료 요법이 ADC의 투여와 조합될 수 있는데, 여기에는 비제한적으로 방사선 요법 및/또는 골수 및 말초혈관 이식, 및/또는 세포독성 제제가 포함된다. 일부 구현예에서, 세포독성 제제는 하나의 제제 또는, 제제들의 조합, 예컨대, 예를 들면, 사이클로포스파미드, 하이드록시다우노루비신, 아드리아마이신, 독소루비신, 빈크리스틴(Oncovin™), 프레드니솔론, CHOP(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합), 또는 CVP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합)이다.
앞에서 언급된 이와 같은 병용 요법은 병행 투여(둘 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형에 포함됨) 및 개별 투여를 포함하며, 어떤 경우이든지, ADC의 투여는 상기 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 발생할 수 있다. 본원에 기술된 ADC는 또한 방사선 요법과 병행하여 사용될 수 있다.
본원에 기술된 ADC(그리고 임의의 추가의 치료제)는 임의의 적합한 수단, 예컨대 비경구, 폐내, 및 비강내로, 국소 치료가 바람직한 경우, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하투여가 포함된다. 복용은 임의의 적합한 경로, 예를 들면 주사, 예컨대 투여가 일시적인지 또는 만성적인지의 여부에 따라, 정맥 주사 또는 피하 주사로 이루어진다. 다양한 복용 일정, 예컨대 비제한적으로 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 맥박 주입이 본원에서 고려된다. 본 개시의 ADC는 바람직한 의료 시행에 일치하는 방식으로 제형화되고, 복용 및 투여될 것이다. 본 맥락에서 고려할 요인들에는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 상기 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의료진에게 알려진 기타 요인들이 포함된다. 상기 ADC는 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용 중인 하나 이상의 제제와 임의로 제형화된다(반드시 그럴 필요는 없다). 그와 같은 다른 제제의 유효량은 상기 제형에 존재하는 ADC의 양, 장애 또는 치료 유형, 및 앞서 논의된 기타 요인에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 동일한 용량으로 그리고 투여 경로로 사용되거나, 또는 본원에 기술된 용량의 약 1 내지 99%로 또는 경험적으로나 임상적으로 적절하다고 판단되는 용량과 경로로 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 기술된 바와 같이 ADC의 적절한 용량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 병용하여 사용될 때)은 치료 대상 질병의 유형, ADC의 유형, 상기 질병의 중증도 및 진행과정, 상기 ADC가 예방 목적으로 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 환자의 임상적 기록 및 ADC에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 상기 ADC는 1회 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 상기가 질병의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들면, 하나 이상의 별도 투여에 의해서든, 또는 연속적인 주입에 의해서든, 상기 환자에게 투여를 위한 최초 후보 용량은 약 1μg/kg 내지 15mg/kg(예를 들면 0.1mg/kg-10mg/kg)의 ADC일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 복용량은, 앞서 언급된 요인들에 따라, 약 1μg/kg 내지 100mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 여러 날 또는 더 오래 동안 반족적인 투여를 하는 경우, 상황에 따라서, 상기 치료는 일반적으로 질병 증상의 원하는 억제가 나타날 때까지 지속될 것이다. ADC의 하나의 예시적 복용량은 약 0.05mg/kg 내지 약 10mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg 또는 10mg/kg(또는 이들의 조합) 중 하나 아싱의 복용량이 상기 환자에게 투여될 수 있다. 이와 같은 용량은 간헐적으로, 예를 들면 매주 또는 3주에 한 번씩 투여될 수 있다(예를 들면, 상기 환자가 상기 상기 항체의 약 2번 내지 20번, 또는 예를 들면 약 6번 용량을 투여받도록). 초기에 더 높은 로딩 용량에 이어서, 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 하지만, 다른 용량 요법이 유용할 수도 있다. 본 요법의 진행은 종래의 기법과 검정법으로 쉽게 모니터링된다.
V. 제조 품목
추가의 측면에서, 앞서 기술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 유용한 물질을 함유한 제조 품목이 본원에 제공된다. 상기 제조 품목은 용기와 용기 상에 또는 그것과 관련된 라벨 또는 포장 내용물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들면, 병, 바이얼, 주사, IV 용액주머니 등이 포함된다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 제조될 수 있다. 상기 용기는 단독 조성물 또는 상기 장애를 치료, 예방 및/또는 진단하는 데 효과적인 또다른 조성물과 조합된 조성물을 포함하고, 살균 접근포트를 구비할 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥 용액 주머니 또는 피하 주사기 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 구비한 바이얼일 수 있음). 상기 조성물 중 적어도 하나의 활성 제제는 본원에 기술된 ADC이다. 상기 라벨 또는 포장 내용물은 상기 조성물이 선택된 질환을 치료하는 데 사용됨을 표시한다. 아울러, 제조품목은 (a) 내부에 조성물을 함유한 제1 용기(상기 조성물은 본원에 기술된 ADC를 포함함; 및(b) 내부에 조성물을 함유한 제2 용기(상기 조성물은 추가의 세포독성 제제 또는 그렇지 않으면 치료 제제를 포함함)를 포함한다. 본 발명의 본 구현예에서의 제조 품목은 추가로 상기 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 사용될 수 있음을 표시하는 포장 내용물을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 제조품목은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대, 주사를 위한 제균 작용수(BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 관점 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질들, 예컨대 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
본 설명 및 예시적 구현예는 제한적인 것으로 받아들여져서는 안 된다. 본 명세서와 첨부된 청구항의 목절을 위해, 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서와 청구항에 사용되는 양, 백분율 또는 비례 및 기타 수치값을 표현하는 모든 수는, 이들이 이미 그렇게 수정되지 않은 정도로, 모든 경우에, 용어 '약'에 의해, 수정되는 것으로 이해되어야 한다. '약'은 기술된 대상체 물질의 특성에 실질적으로 영향을 미치는 않는 정도의 변형, 예를 들면, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 내를 가리킨다. 이에 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 본 명세어와 첨부된 청구항에 명시된 수치 매개변수는 획득하고자 하는 바람직한 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한 청구항의 범위에 등가물의 원칙의 적용을 제한하려는 의도가 아니라, 각각의 수치 매개변수는 적어도 보고된 유의미한 수치의 관점에서, 그리고 일반적인 반올림 기법을 적용함으로써 고려되어야 한다.
실시예
하기 실시예들은 개시된 구현예를 묘사하기 위해 제공되는 것으로, 어떤 식으로든 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 고려되어서는 안 된다.
본 실시예에 기술된 화학 반응은 본 개시의 수 많은 다른 화합물을 제조하기 위해 쉽게 개조될 수 있고, 본 개시의 화합물을 제조하기 위한 대안적인 방법이 본 개시의 범위에 속하는 것으로 간주된다. 예를 들면, 본 개시에 다른 예시되지 않은 화합물의 합성이 당업자에게 명백한 수정, 예를 들면,기술된 것과 다른 당해기술에 알려진 다른 적합한 시약을 활용함으로써, 또는 반응 조건, 시약 및 출발 물질의 경로 수정을 수행함으로써, 성공적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 또는 당해기술에 알려진 다른 반응은 본 개시의 다른 화합물을 제조하기 위해 적용가능성이 있는 것으로 인식될 것있다.
하기 약어들은 본 응용을 위해 적절할 수 있다.
약어
BOC 또는 Boc: tert-부톡시카르보닐
DCM: 메틸렌 클로라이드
DIEA: 디아이소프로필에틸아민
DMF: N,N'-디메틸포름아마이드
DMSO: 디메틸 술폭사이드
FBS: 소태아 혈청
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐
Fmoc-AAN-PAB-PNP: 9-플루오레닐메틸옥시카보닐-알라닐-알라닐-아스파라기닐-(4-아미노벤질)-(4-나이트로페닐)카보네이트
Fmoc-Ala-PAB-PNP: 9-플루오레닐메틸옥시카보닐-알라닐-(4-아미노벤질)-(4-나이트로페닐)카보네이트
h: 시간(들)
HIC: 소수성 상호작용 크로마토그래피
HMW: 고분자량
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
LC/MS: 액체 크로마토그래피-질량 분광분광계
LC-MS/MS: 이중 질량 분광계를 구비한 액체 크로마토그래피
LLOQ: 정량화의 하한치
m 또는 min: 분(들)
Mal-C6-OH: 6-말레이미도카프로 산
Mal-C6-VA-PAB-PNP: 6-말레이미도카프로일-발리닐-알라닐-(4-아미노벤질)-(4-나이트로페닐)카보네이트
PAB: p-아미노벤질
PBS: 인산염-완충 식염수
PG: 프로필렌 글리콜
(PNP)2CO: 비스(4-나이트로페닐)카보네이트
PyAOP:(7-아자벤조트리아졸-1-일록시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
RP-HPLC: 역상 HPLC
SEC: 크기 배제 크로마토그래피
TCEP: 트리스(2-카복시에틸)포스핀
TFA: 트리플루오아세트산
THF: 테트라하이르로푸란
합성 실시예
실시예 S1: 화합물 1의 합성
Figure pct00064
화합물 9(Sigma-Aldrich Cat. #: H0165-50MG; 392mg, 1mmol)를 DMSO(3mL)와 DMF(3mL)의 혼합물에 용해시키고, 이어서 DMF(3mL) 중 (PNP)2CO(912mg, 3mmol)의 용액을 첨가하였다. 수득된 혼합물을 얼음수조에서 냉각시켰다. 그런 다음, DIEA(174μL, 1mmol)를 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 200mL의 디에틸 에테르에 첨가하였다. 수득된 침전물을 수거하여 에테르(100mL)로 세정하고 건조하여 10(333mg, 60%)을 수득하였다.
DMSO(1mL) 중 10(55.7mg, 0.1mmol)의 용액에 DMF(2mL) 중 11(미국 특허 번호 제9,814,784호에 기술된 절차대로 합성됨)(TFA 염, 80mg, 0.1mmol)을 첨가하였다. 이어서, DIEA(35μL, 0.2mmol)을 첨가하였고, 수득된 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. HPLC(물/아세토나이트릴 중 0.1% TFA)로 수득된 물질의 정제를 수행하였고, 수거된 분획을 동결건조하여 1(84.6mg, 77%)을 수득하였다.
실시예 S2: 화합물 13의 합성
Figure pct00065
DMF(10mL) 중 9(534mg, 1.36mmol)와 비스(4-나이트로페닐) 카보네이트(900mg, 2.96mmol)의 혼합물에 DIEA(0.237mL, 1.36mmol)를 첨가하였다. 상기 수득된 반응 혼합물을 실온에서 9가 소비될 때까지 교반하였다. 상기 반응은 LC/MS로 모니터링하였다. 이어서, N-Boc-N,N'-디메틸에틸렌디아민(640mg, 3.40mmol)을 첨가하고, 이어서 DIEA(0.525mL, 3.00mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 예비 HPLC로 화합물 12를 획득하였다(400mg).
화합물 12를 1시간 동안 DCM(5mL) 중 25% TFA로 처리하였다. 진공하에 상기 용매를 제거하고, 추가의 정제 없이 미정제 13을 사용하였다.
실시예 S3: 화합물 2의 합성
Figure pct00066
DMF(2mL) 중 13(31mg, 0.042mmol), Fmoc-GGG-OH(17.4mg, 0.042mmol) 및 PyAOP(22mg, 0.126mmol)의 혼합물에 DIEA(25 uL, 1.36mmol)를 첨가하였다. 수득된 반응 혼합물을 13이 소비될 때까지 실온에서 교반하였다. 상기 반응을 LC/MS로 모니터링하였다. 이어서, 피페리딘(200μL)을 첨가하고, 이어서 수득된 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 예비 HPLC로 화합물 15를 수득하였다(25mg).
DMF(2mL) 중 15(25mg, 0.028mmol), Mal-C6-OH(6.7mg, 0.028mmol) 및 PyAO(15 mdg, 0.028mmol)의 혼합물에 DIEA(15μL, 0.084mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 예비 HPLC로 화합물 2를 수득하였다.
실시예 S4: 화합물 3의 합성
Figure pct00067
DMF(1mL) 중 13(31mg, 0.042mmol) 및 Fmoc-AAN-AB-PNPd(31mg, 0.042mmol)의 혼합물에 DIEA(15μL, 0084mmol)를 첨가하였다. 수득된 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고, 이어서 피페리딘(50μL)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 15분 동안 실온에서 교반하였다. 예비 HPLC로 화합물 17을 수득하였다(16mg).
DMF(2mL) 중 17(16mg, 0.014mmol), Mal-C6-OH(4.6mg, 0.022mmol) 및 PyAO(11.4dmg, 0.022mmol)의 혼합물에 DIEA(16μL, 0.088mmol)를 첨가하였다. 수득된 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 예비 HPLC로 화합물 3을 수득하였다.
실시예 S5: 화합물 4의 합성
Figure pct00068
2(실시예 S3)를 제조하기 위해 요약된 합성에 따라 그리고 상기 도식에 구체적으로 나타낸 바에 따라, 화합물 4(10mg, 20%)를 합성하였다.
실시예 S6: 화합물 5의 합성
Figure pct00069
3(실시예 S4)를 제조하기 위해 요약된 합성에 따라 그리고 Mal-C6-VA-PAB-PNP를 사용하여 상기 도식에 구체적으로 나타낸 바에 따라, 화합물 5(8mg, 25%)를 합성하였다.
실시예 S7: 화합물 6의 합성
Figure pct00070
3(실시예 S4)를 제조하기 위해 요약된 합성에 따라 그리고 Fmoc-Ala-PAB-PNP를 사용하여 상기 도식에 구체적으로 나타낸 바에 따라, 화합물 6(12mg, 23%)을 합성하였다.
실시예 S8: 항체-약물 접합체(ADC) 항-Trop-2-화합물 1의 제조
본 실시예에서 사용된 항-Trop-2 항체는 미국 특허 번호 제7,238,785호에 기술된 hRS7 항체의 항체 서열을 갖는다. 친화도 정제된 항-Trop-2 항체를 3~10mg/mL 농도로 EDTA(4mM)와 인산나트륨 완충액(50mM, pH 7.0-7.2)으로의 완충액 교환을 수행하였다. 본 항체 스톡의 일부에 새로 제조된 TCEP(10mM) 수성 용액을 최대 20배 몰 과잉으로 첨가하였다. 수득된 혼합물을 밤새 4~8℃에서 배양하였다. 겔 여과 크로마토그래피 또는 여러 차례의 원심분리 여과에 의해 과잉 TCEP를 제거하였다. 회복되어 환원된 항체의 UV-Vis 정량화를 수행하고, 이어서 충분한 유리 티올 대 항체(SH/Ab) 몰비를 확인하였다. 요약하면, 인산나트륨(50mM, pH 7.0-7.2, 4mM EDTA) 중 새로 제조된 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)의 1mM 분취를 동일한 체적의 정제된 항체 용액과 혼합하였다. 412nm에서의 결과적인 흡광도를 측정하였고, 여기 계수 14,150 M-1cm1을 사용하여 환원된 시스테인 함량을 계산하였다. 결과적인 SH/Ab는 ~8로 측정되었고, 이는 사슬간(interchain) 시스테인 티올 잔기의 완전한 환원을 가리킨다.
화합물 1의 항-Trop-2 항체로의 접합을 개시하기 위해, 우선 1을 3:2 아세토나이트릴/물 혼합물에 5mM의 농도로 용해시켰다. 이어서 프로필렌 글리콜(PCG)을 환원된 정제 항-Trop-2 항체의 분취에 첨가하여, 새로 제조된 1의 용액을 12~15배 몰 과잉으로 첨가하기 전에 최종 농도 10~30%(v/v) PG를 수득하였다. 철저한 혼합 및 ≥1.5시간 동안 주변 온도에서의 배양 후, 미정제 접합 반응을 HIC-HPLC로 분석하여 280nm 파장 검출에서 반응 완료(출발 항체 피크의 사라짐)를 확인하였다. 이어서, PBS로 평형을 맞춘 Superdex 200pg 컬럼(GE Healthcare)이 장착된 AKTA 시스템을 사용하는 AKTA 겔 여과 크로마토그래피로 ADC 항-Trop-2-화합물 1의 정제를 수행하였다. UV-VIS 및 HIC-HPLC를 근거로 상기 약물 대 항체 비율(DAR)을 6~8로 계산하였다. 수득된 정제 샘플의 HIC-HPLC는 추가로 <1%(미검출)의 출발 항체 물질을 표시한다. 낮은 퍼센트(<5%)의 HMW 응집물의 확인 또한 분석적 SEC-HPLC를 사용하여 판단하였다. 최종 특징 규명 후, 물 중 살균 트레할로오스 및 Tween-80의 용액의 분취를 PBS 중 정제된 ADC 항-Trop-2-화합물 1에 첨가하여 최종 조성물 6% 트레할로오스/0.02% Tween-80/94% PBS(v/v/v)를 수득하였다. 이어서, 이들 혼합물을 액체 질소에서 빠르게 냉동시켜, 다음 사용 시까지 -80℃로 보관하였다.
실시예 S9: 항체-약물 접합체(ADCs) 항-Trop-2-화합물 2, 항-Trop-2-화합물 3, 항-Trop-2-화합물 4, 항-Trop-2-화합물 5, 항-Trop-2-화합물 6 및 ADC-CL2A-SN38의 제조
1 대신 각각 2, 3, 5, 또는 6을 사용하는 실시예 S8에 요약된 바와 같이, 추가의 ADC 항-Trop-2-화합물 2, 항-Trop-2-화합물 3, 항-Trop-2-화합물 4, 항-Trop-2-화합물 5 및 항-Trop-2-화합물 6를 제조하였다. 비교 ADC 분자인 ADC-CL2CA-SN38을 1 대신 SN38 모이어티를 사용하는 실시예 S8(J. Med. Chem., 2008, 51, 6916-6926에 요약된 절차대로 제조됨)에 요약된 바와 같이 제조하였다.
생물학적 실시예
실시예 B1: 항체-약물 접합체(ADC) 항-Trop-2-화합물 2, 항-Trop-2-화합물 3, 항-Trop-2-화합물 4, 항-Trop-2-화합물 5, 및 항-Trop-2-화합물 6의 시험관내 효능
ADC 항-Trop-2-화합물 1, 항-Trop-2-화합물 2, 항-Trop-2-화합물 3, 항-Trop-2-화합물 4, 항-Trop-2-화합물-5 및 항-Trop-2-화합물 6의 시험관내 효능을 하기 세포주를 사용하여 평가하였다: BxPC(췌장암), MDA-MB-468(유선암/유방암) 및 L-540(호킨 림프종). 시험관내 검정을 하기와 같이 수행하였다. 세포를 384-웰 백색 투명바닥 플레이트(세포주 당 2개 플레이트)의 웰에 12.5μL로 플레이팅(MDA-MB-468 및 BxPC-3의 경우 375 세포/웰; L-540의 경우 2,500 세포/웰)하고 2~4시간 동안 37℃에서 유지시켰다. 이어서, 미사용 웰에만 25μL 배지를 첨가하였다. 별도로, 2Х 최종 농도로 작업 용액(working solutions)을 제조하였다. 12.5μL의 각각의 작업 용액을 첨가하여 세포를 처리하고, 상기 세포를 37℃에서 120시간 동안 유지하였다. 이어서 CTG(CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 검정, Promega)로, 세포 생존율을 측정하였다.
항-Trop-2-화합물 1, 항-Trop-2-화합물 2, 항-Trop-2-화합물 3, 항-Trop-2-화합물 4, 항-Trop-2-화합물 5 및 항-Trop-2-화합물 6의 세포 생존율이 도1~도5에 표시되었다. 상기 데이터는 검사된 ADC가 대략 46 내지 340 nM의 범위의 EC50 값의 시험관내 효능을 가짐을 입증한다.
실시예 B2: 항체-약물 접합체(ADC) 항-Trop-2-화합물 1 및 ADC-CL2A-SN38의 체내 효능
종양 세포 접종 및 종양의 성립
인간 종양 세포주 MDA-MB-468(삼중 음성 유방암), NCI-N87(위암) 및 BxPC-3(췌장암)을 10% FBS RPMI 1640 배지로 배양 및 확장하였다. 상기 세포를 0.05% 트립신으로 수확하였다. 이어서, 각 종양 세포주(총 0.1mL, 1:1 비율의 PBS 및 마트리겔)의 5x106 세포를 각 마우스(Charles River의 Nu/Nu 마우스의 6주령 암컷)의 오른쪽 상부 옆구리에 피하 주사로 주입하였다. 접종 후 5~7일부터 디지털 캘리퍼를 사용하는 종양 체적 측정에 의해 종양 성장을 모니터링하고, 종양 체적이 ~100 내지 250㎣에 도달할 때까지 매주 1~2회 추적조사하였다.
치료
일단 종양이 원하는 체적의 단계로 올라가면, 동물을 무작위로 추출하여 아주 큰 종양 또는 작은 종양을 가진 마우스를 도태시켰다. 무작위로 마우스를 그룹당 6~8마리가 되도록 대조군 또는 실험군으로 배당하였다. 이어서, 마우스를 PBS/담체, 항-Trop-2 항체, 또는 ADC 화합물 항-Trop-2-화합물 1 및 ADC-CL2A-SN38 중 하나로 처리하였다. 상기 처리는 2, 3, 5, 10, 15, 및 25 mkg의 용량의 상이한 조합으로 주 2회 꼬리 정맥 주사로 이루어졌는데, 각각 0.2mL의 체적으로 총 4회 처리하였다.
종양 성장 측정
종양 성장 반응을 주 1회 또는 2회 모니터링하였다. 전체 실험 기간 동안 주 1회 또는 2회 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 체적을 측정하였다. 상기 체적은 하기 식을 사용하여 계산하였다.
체적(㎣) = [길이(mm) x 폭(mm)2] / 2.
하기 식을 사용하여 TGI %(종양 성장 억제의 백분율)를 계산하였다.
TGI % = {1 - [TVtd - TVt0]/CVtd - CVt0]} x 100
여기서,
TV = 처리군의 종양 체적
CV = 대조군의 종양 체적
td = 최초 치료 후 일수
t0 = 0일차 처리.
종양 부하가 IACUC 프로토콜 한계치(2000㎣)에 도달할 때 또는 사전결정된 시간에 CO2 질식에 의해 마우스를 희생시켰다.
결과
MDA-MB-468 이종이식편
상이한 용량 요법으로 진행된 2개의 연구에서 누드 마우스 중 MDA-MB-468 s.c 이종이식편에서 ADC 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38의 효능을 평가하였다. 하나의 연구에서, 대조군인 PBS/담체 및 항-CD38 항체 단독(5mg/kg Co)(도 6a)과 비교하여, 2mg/kg 및 5mg/kg i.v biw x 4로 ADC 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38의 처리가 이루어졌다. 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38은 MDA-MB-468 종양 성장의 아주 강력한 그리고 용량의존적인 억제를 보여주었다. 5mg/kg에서, 항-Trop-2-화합물 1 및 ADC-CL2A-SN38 모두 MDA-MB-468 종양 성장을 완전히 억제하였고 종양 크기를 각각 28.8% 및 56.6% 감소시켰다. 더 낮은 용량인 2mg/kg의 처리에서는, ADC 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38이 여전히 종양 성장의 강한 억제를 입증하였고 최초 처리 후 36일까지, 각각 지속적인 95.4% 및 88.6%의 TGI를 나타내었다.
제2 연구에서, 3mg/kg 및 10mg/kg, i.v biw x 4 로의 용량 요법을 시험하였다. 항-Trop-2-화합물 1 과 ADC-CL2A-SN38 모두 3mg/kg 및 10mg/kg의 용량으로의 처리에서 90~100%의 TGI와 종양 크기의 감소로 강력한 억제가 자명하였다 (도 6b). 본 연구에서, 억제 효과는 최초 처리 후 ~100일까지 지속되었다. 상기 데이터는 ADC 항-Trop-2-화합물 1이 누드 마우스에서 MDA-MB-468 이종이식편 종양 성장을 유의미하게 억제하였음을 보여준다.
NCI-N87 이종이식편
PBS/담체 및 항-Trop-2 항체 단독의 대조군과 비교하여, 5mg/kg 및 15mg/kg i.v biw x 4의 용량 요법으로 누드 마우스에서의 NCI-N87 s.c 이종이식편에서 ADC 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38의 효능을 평가하였다 (도 7). 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38 모두가 용량 의존적인 방식으로 종양 성장을 억제함을 보여준다. 15mg/kg에서, 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38은 최초 처리 후 22일차에 각각 66.6% 및 99.7%의 TGI로 종양 성장을 유의미하게 억제하였다. 5mg/kg에서, 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38은 NCI-N87 이종이식편 모형에서 약 45.0%의 유의미하지 않은 종양 성장 억제를 보여주었다. 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 누드 마우스에서 NCI-N87 이종이식편 종양 성장을 유의미하게 억제했음을 보여준다.
BxPC3 이종이식편
ADC-CL2A-SN38(10g), PBS/담체 및 항-Trop-2 항체 단독(10mg/kg)과 비교하여, 누드 마우스에서 3mg/kg, 10mg/kg 및 25mg/kg i.v biw x 4의 용량 용법으로 BxPC3 s.c 이종이식편에서 항-Trop-2-화합물 1의 효능을 평가하였다 (도 8). 항-Trop-2-화합물 1의 세 가지 용량 모두 초기 치료 후 21일차에 TGI 85~100%까지 종양 성장을 억제하였다. 항-Trop-2-화합물 1 처리의 용량 반응이 BxPC3 이종이식편 모형에서는 관찰되지 않았다. 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 누드 마우스에서 BxPC3 이종이식편 종양 성장을 유의미하게 억제하였음을 보여준다.
상기 이종이식편 연구의 종양 성장 억제(TGI)가 표 2에 제시되었다.
Figure pct00071
실시예 B3: ADC 항-Trop-2-화합물 1의 시험관내 안정성
중성 인산염 완충액과 15% 아이소프로파놀을 함유하는 등용매 용리 조건 하에서 분석 SEC(Tosoh TSKgel G3000SW-Xl 컬럼)을 사용하여 시간 경과에 따라 ADC-CL2A-SN38에 대한 고분자량(HMW) 응집물 및 쪼개진/방출된 약물-링커 절편 모두의 존재를 모니터링하였다. 280nm 흡광도(단백질 및 약물-링커의 검출을 위해) 및 370nm(약물-함유 종만의 검출) 모두에서 샘플을 모니터링하였다. 최초 시점은 정제 도중 주요 피크 용리 후 <1시간으로 정의되고, 일상적인 최종 처리에 필요한 시간을 포함한다. 상기 최종 처리 단계는, 모두 실온에서 수행되는데, > 2mg/mL으로의 부분 농축(원심분리 초여과), 6% 트레할로오스/PBS로의 살균 여과 및 최종 ADC 희석을 포함한다. 최초 시점 이후, ADC 혼합물을 24시간 동안 4℃에서 보관하고 이어서 추후에 추가의 144시간(6일) 동안 실온(불빛 차단)에서 배양하였다. 항-Trop-2-화합물 1의 SEC 분석 및 모니터링을 ADC-CL2A-SN38과 유사하게 및 동일한 방식으로 수행하였다. 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 단백질 응집 및 순간적인 약물 방출과 관련하여 ADC-CL2A-SN38보다 유의미하게 좀 더 안정적임을 보여준다 (도 9). 상기 안정성 연구의 결과는 표 3에 요약되었다.
Figure pct00072
실시예 B4: ADC 항-Trop-2-화합물 1의 체내 안정성
14 시점을 가진 21일 후 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스를 사용하여 혈청에서 ADC 항-Trop-2-화합물 1 의 체내 안정성을 평가하였다. 요약하면, 항-Trop-2-화합물 1을 10mg/mL로 i.v. 투여하였다. 각각 5분, 30분, 1시간, 5시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 168시간, 240시간, 336시간, 408시간 및 504시간에 안구뒤 정맥총(retro-orbital venous plexus)을 통해 전체 혈액 샘플(~150μL)을 수집하였다. 각 시점에 3마리 마우스에서 실험을 실시하였다 (n = 3). 이어서 혈청을 수거하여, 40분 동안 4℃에서 상기 혈액 샘플을 방치한 후 10분 동안 8000 rpm으로 원심분리하여 -80℃에서 보관하였다.
항-Trop-2-화합물 1의 혈장 안정성을 미접합 항-Trop-2와 비교하였다. 상기 접합된 항-Trop-2-화합물 1의 양이 ADC 항-Trop-2-화합물 1의 총 항체의 수와 면밀히 일치함이 밝혀졌고, 이는 SN-38이 상기 ADC에서 혈장으로 유의미하게 방출되지 않음을 보여준다 (도 10). 따라서, 항-Trop-2-화합물 1은 혈장에서 안정적이다.
실시예 B5: 항체-약물 접합체(ADC) 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38의 약물동태학/약력학
본 연구의 목적은 사이노몰구스 마카크에 반복적인 정맥 주사 후 ADC 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38의 약물 동력학적 매개변수를 평가하는 것이었다.
실험 설계. 본 연구에서 사이노몰구스 마카크(Macaca fascicularis) 총 12마리를 사용하였다. 사이노몰구스 마카크(수컷 6마리, 암컷 6마리)를 3그룹으로 나누었다. 각 그룹은 암컷 2마리, 수컷 2마리롤 이루어졌다. 그룹 1은 ADC-CL2A-SN38로 처리하였고, 그룹 2와 3은 항-Trop-2-화합물 1로 처리하였다. ADC의 반복적인 정맥 주사를 1일차 및 4일차에 투여하였다. 60mg/kg(약물 농도: 6mg/mL)의 용량으로 ADC를 투여하였다. 하기와 같이 동물에서 혈액 샘플을 채취하였다: 그룹 1과 2 - 1일차(ADC 투여 전), 4일차(ADC 투여 전), 4일차에 ADC 투여 후 5분, 30분, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간 및 168시간; 그룹 3 - 1일차(ADC 투여 전), 4일차(ADC 투여 전), 4일차에 ADC 투여 후 5분, 30분, 2시간, 4시간, 8 시간, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 168시간, 240시간 및 336시간.
약 0.8mL의 혈액 샘플을 매 시점에 뒷다리 또는 앞다리에서 채취하였다. 각각의 혈액 샘플을 실온에서 분리 겔과 응고제를 함유한 시험관에 옮겨 담았고, 2시간 내에 원심 분리(1500 g, 실온 온도, 10분)를 수행하였다. 상기 원심분리된 혈청을 새로운 원심분리 시험관에 옮겨 담고, -70℃ 이하로 보관하였다.
검출 항체인 염소 항-인간 IgG Fc 교차흡착 2차 항체-HRP(LLOQ: 19.5 ng/mL)와 함께 인간 TROP2/TACSTD2 단백질(His Tag) 항원을 사용하여 전체 항체 농도를 계산하였다. ADC-CL2A-SN38의 접합된 항체의 농도를 항-SN38 항체와 염소-항-인간 IgG 원숭이 항체(LLOQ: 19.5 ng/mL)의 조합을 사용하여 측정하였다. 항-SN38 항체와 염소 항-인간 IgG 원숭이 항체(LLOQ: 19.5 ng/mL)의 조합을 사용하여 ADC 항-Trop-2-화합물 1의 접합된 항체의 농도를 결정하였다. LC-MS/MS (LLOQ: 0.200 ng/mL)를 사용하여 유리 또는 미접합 SN-38을 정략적으로 측정하였다.
왓슨 LIMS v.7.5 SP1(Thermo Science Inc.) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하였다. 분석 배치 표준 곡선을 적합화함으로써 획득된 방정식을 기반으로 왓슨 계산 모듈을 사용하여 샘플 농도를 계산하였다. WinNonLin v 5.2.1(Pharsight Inc.) 소프트웨어를 사용하여 약물 대사 매개변수(Noncompatmental Analysis)를 분석하였다.
결과. 전체 항체, 접합된 항체 및 유리 SN-38의 양을 표 4에 요약해두었다. 상기 데이터는 사이노몰구스 마카크에 ADC-CL2A-SN38의 투여가 유의미한 양의 유리 SN-38(즉, 미접합 약물)의 방출을 야기하는 반면, ADC 항-Trop-2-화합물 1에서 적은 양의 유리 SN-38만이 방출됨을 보여준다.
Figure pct00073
사이노몰구스 마카크에 ADC-CL2A-SN38 ADC와 항-Trop-2-화합물 1의 투여 후 전체 항체, 접합된 항체 및 유리 SN-38의 약물동력학 매개변수의 요약이 표 5에 제공되었다.
Figure pct00074
논의
사이노몰구스 마카크에 60mg/kg ADC-CL2A-SN38을 정맥내로 투여한 후, 전체 항체 및 접합된 항체의 피크 농도(C최대)가 동일한 용량으로 투여된 항-Trop-2-화합물 1의 피크 농도보다 약간 높았다. 추가로, 전체 항체 및 접합된 항체의 노출 수준(AUC)은 항-Trop-2-화합물 1의 경우보다 ADC-CL2A-SN38의 경우에 유의미하게 더 컸다.
유리 SN-38의 방출은 항-Trop-2-화합물 1보다 ADC-CL2A-SN38에서 유의미하게 더 높았다. 구체적으로, ADC-CL2A-SN38에서 유리 SN38의 방출은 항-Trop-2-화합물 1에서의 상응하는 피크 농도보다 대략 129배 더 큰 피크 농도(C최대)와, 항-Trop-2-화합물 1에서의 상응하는 AUC 매개변수보다 대략 247배 더 큰 AUC 값을 제공하였다. 더 나아가, ADC-CL2A-SN38 전체 항체의 반감기(t1/2)는 항-Trop-2-화합물 1의 반감기보다 약간 더 길지만, 유리 SN-38의 속성 방출 때문에, ADC-CL2A-SN38 접합 항체의 반감기는 항-Trop-2-화합물 1 접합 항체의 반감기보다 유의미하게 더 짧다. 항-Trop-2-화합물 1 전체 항체 및 접합된 항체의 반감기는 유사하여, 약 40시간이다. 더 나아가, ADC-CL2A-SN38에 대한 전체 항체 대 접합된 항체의 AUC(0-inf) 비율이 2.1인 반면, 항-Trop-2-화합물 1 에 대한 상응값은 1.2이다.
이와 함께, 상기 데이터는 항-Trop-2-화합물 1이 ADC-CL2A-SN38보다 더 큰 체내 안정성을 갖고 SN-38을 덜 방출함을 보여준다. SN-38의 해리가 SN-38-계 ADC로 처리된 대상체에서 높은 부작용 빈도와 관련이 있어서, 항-Trop-2-화합물 1은ADC-CL2A-SN38와 비교하여 개선된 안전성을 제공한다.
실시예 B6: 항체-약물 접합체(ADC) 항-Trop-2-화합물 1과ADC-CL2A-SN38의 독성 연구
본 연구의 목적은 사이노몰구스 마카크에 반복적인 정맥내 주입 후 ADC 항-Trop-2-화합물 1과 ADC-CL2A-SN38의 독성 프로파일을 평가하는 것이었다.
실험 설계.
사이노몰구스 마카크(Macaca fascicularis) 총 12마리를 본 연구에 사용하였다. 사이노몰구스 마카크를 동물의 체중에 따라 무작위로 3그룹으로 나누었다(그룹당 4마리, 수컷과 암컷).
1일차 및 4일차에 ADC의 반복적인 정맥내 주입을 시행하였다. ADC를 60mg/kg의 용량으로 투여하였다.
그룹 1의 동물들은 1일차 및 4일차에 ADC-CL2A-SN38로 처리하였다. 그룹 2 및 3의 동물들은 1일차 및 4일차에 항-Trop-2-화합물 1로 처리하였다. ADC를 복용 용량 10mL/kg와 복용 속도 대략 0.33mL/분/kg을 사용하여 상기 동물들에 정맥내로 투여하였다. 그룹 1과 그룹 2의 동물들은 최종 ADC 처리하고 1주일 후(12일차) 안락사시켰다. 그룹 3의 동물들은 최종 ADC 처리하고 4주일 후(30일차) 안락사시켰다. 상기 연구 도중, 임상적 관찰, 체중, 체온, 심전도, 혈구 계수, 응고 기능, 혈액 생화학, 전반적인 해부학적 구조, 조직병리학 및 독성 역학을 검토하였다.
결과.
사망/사망 직전. 본 연구 도중, ADC-CL2A-SN38로 처리한 수컷 1마리가 11일차에 죽은 것이 발견되었다. 죽은 동물의 일반적인 해부학적 구조는 작은 흉선을 보여주었고; 조직병리학적 검사는 상기 흉선에서 확산성 피질 및 수질 세포의 수가 감소되었음(일반적 해부학적 구조의 결과와 일치)과 비장 백색 펄프 다중초점 세포의 수가 약간 감소되었음을 보여주었다. 죽은 동물은 임상적으로 8일차 및 9일차에 적은 양의 묽은 황색변을 본 것이 관찰되었고, 9일차에 에너지 부족, 누워있으려는 경향, 즉각적인 활동의 저조, 창백한 뺨을 보여주었다. 항-Trop-2-화합물 1로 처리한 동물들 중에서는 한 마리도 죽지 않았고, 죽음 직전에 이르지도 않았다.
임상적 관찰. 본 연구 도중에, ADC-CL2A-SN38로 처리된 동물의 그룹은 7일차부터 묽은 황색변, 창백한 뺨과 잇몸, 잇몸 출혈과 같은 비정상적인 임상적 징후를 보이기 시작하였다. 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 동물의 그룹은 7일차부터 창백한 잇몸과 뺨, 잇몸 출혈 및 생식기 부종의 비정상적인 임상적 신호를 보이기 시작했다.
체중. 처리 전(3일 전) 대비, 그룹 1에서 ADC-CL2A-SN38로 처리된 수컷 한 마리가 체중의 약 9.2%가 빠졌고(7일차), 암컷 한 마리는 체중의 약 9.9%가 빠졌다(7일차). 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 동물들은 체중의 유의미하게 비정상적인 변화를 보이지 않았다.
체온 및 심전도. 본 연구 도중, ADC-CL2A-SN38 또는 항-Trop-2-화합물 1 중 하나로 처리된 동물들 중 어느 하나도 체온 및 심전도 매개변수 및 파형에 유의미하게 비정상적인 변화를 보이지 않았다.
혈구 계수. 처리 전(2일전) 대비, ADC-CL2A-SN38로 처리된 동물은 백혈구, 호중구, 림프구 및 단핵 세포의 감소를 보여주었다. 이들 세포는 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 수컷 및 암컷 동물에서 유의미하게 감소되지 않았다. 처리 전(2일전) 대비, ADC-CL2A-SN38로 처리된 동물들은 적혈구, 헤모글로빈, 및 적혈구 특이 체적의 감소를 보여주었다(5일차 및/또는 12일차). 이들 세포는 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 수컷 및 암컷 동물들에서 유의미하게 감소되지 않았다. 이들 세포 계수의 변화는 골수 억제와 관련이 있을 수 있다. 처리 전(2일전) 대비, ADC-CL2A-SN38로 처리된 암컷 2마리의 혈소판 계수는 증가하였다(12일차, 105.7% 및 44.6%).
응고 기능. 처리 전(2일전) 대비, ADC-CL2A-SN38로 처리된 동물에서 12일차에 피브리노겐의 양이 증가하였다. 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 동물에서도 피브리노겐의 양이 증가하였고, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 또한 증가하였다.
혈액 생화학. 처리 전(2일전) 대비, ADC-CL2A-SN38 또는 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 동물들은 2일차 및 5일차에 전체 빌리루빈(TBil)의 증가를 보여주었고, 12일차에 알부민의 감소를 보여주었다.
일반적인 및 조직면역학적 병리학 검사. ADC-CL2A-SN38로 처리된 동물 3마리의 처리 종료 안락사(12일차)는 상기 동물들이 작은 흉선을 가졌음을 보여주었는데, 이는 흉선에서 피질 세포 계수의 약간 내지 중간의 감소 및 미엘린 세포의 감소에 상응하는 것이다. 상기 흉선의 일반적인 병변은 병변의 높은 발병률 및 정도 때문에, ADC-CL2A-SN38과 관련이 있을 가능성이 크다. 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 암컷 2마리의 처리 종료 안락사(12일차) 및 항-Trop-2-화합물 1로 처리된 수컷 1마리의 처리 종료 안락사(30일차)는 흉선에서 피질 확산 세포의 약간의 감소를 나타내었다. 그와 같은 병변이 사이노몰구스 마카크의 배경 병변에 공통되게 관찰되고, 병변의 정도가 상대적으로 약하기에, 이는 항-Trop-2-화합물 1과 관련이 있을 수도 또는 없을 수도 있다.
논의
사이노몰구스 마카크에 60mg/kg의 용량으로 ADC-CL2A-SN38의 반복적인 정맥내 주입은 동물의 사망에 이를 수 있다. 주요 독성 효과는 (i) 체중 감량; (ii) 백혈구, 호중구, 림프구, 단핵 세포, 적혈구, 헤모글로빈, HCT, 레틱 및 알부민의 감소; 및 (iii) 혈소판, 피브리노겐 및 전체 빌리루빈의 증가이다. 독성의 주요 표적 기관은 흉선과 비장이다. 대조적으로, 항-Trop-2-화합물 1의 투여는 유의미하게 더 적은 독성 효과를 야기하였다. 따라서, 항-Trop-2-화합물 1은 독성과 관련하여 ADC-CL2A-SN38보다 개선점(즉, 독성이 덜함)을 제공한다.
앞서 언급된 본 발명이 이해의 명확성을 목적으로 묘사 및 예시에 의해 상세히 기술되었으나, 상기 설명과 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명확히 그 전체가 본원에 참조로 인용되었다.
Figure pct00075
SEQUENCE LISTING <110> Levena (Suzhou) Biopharma Co., Ltd. Shanghai Escugen Biotechnology Co. Ltd. <120> ANTIBODY-DRUG CONJUGATES COMPRISING AN ANTI-TROP-2 ANTIBODY <130> 01223-0067-00PCT <150> PCT/CN2020/088565 <151> 2020-05-03 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VL HVR1 <400> 1 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala Val Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VL HVR2 <400> 2 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VL HVR3 <400> 3 Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VH HVR1 <400> 4 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VH HVR2 <400> 5 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VH HVR3 <400> 6 Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VL <400> 7 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Trop-2 antibody VH <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Val 100 105 <210> 9 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary Human Trop-2 sequence (UniProt Accession No. P09758) <400> 9 Met Ala Arg Gly Pro Gly Leu Ala Pro Pro Pro Leu Arg Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Leu Ala Ala Val Thr Gly His Thr Ala Ala Gln Asp 20 25 30 Asn Cys Thr Cys Pro Thr Asn Lys Met Thr Val Cys Ser Pro Asp Gly 35 40 45 Pro Gly Gly Arg Cys Gln Cys Arg Ala Leu Gly Ser Gly Met Ala Val 50 55 60 Asp Cys Ser Thr Leu Thr Ser Lys Cys Leu Leu Leu Lys Ala Arg Met 65 70 75 80 Ser Ala Pro Lys Asn Ala Arg Thr Leu Val Arg Pro Ser Glu His Ala 85 90 95 Leu Val Asp Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Pro Glu Gly 100 105 110 Arg Phe Lys Ala Arg Gln Cys Asn Gln Thr Ser Val Cys Trp Cys Val 115 120 125 Asn Ser Val Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Gly Asp Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Cys Asp Glu Leu Val Arg Thr His His Ile Leu Ile Asp Leu Arg His 145 150 155 160 Arg Pro Thr Ala Gly Ala Phe Asn His Ser Asp Leu Asp Ala Glu Leu 165 170 175 Arg Arg Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Arg Leu His Pro Lys Phe Val Ala 180 185 190 Ala Val His Tyr Glu Gln Pro Thr Ile Gln Ile Glu Leu Arg Gln Asn 195 200 205 Thr Ser Gln Lys Ala Ala Gly Asp Val Asp Ile Gly Asp Ala Ala Tyr 210 215 220 Tyr Phe Glu Arg Asp Ile Lys Gly Glu Ser Leu Phe Gln Gly Arg Gly 225 230 235 240 Gly Leu Asp Leu Arg Val Arg Gly Glu Pro Leu Gln Val Glu Arg Thr 245 250 255 Leu Ile Tyr Tyr Leu Asp Glu Ile Pro Pro Lys Phe Ser Met Lys Arg 260 265 270 Leu Thr Ala Gly Leu Ile Ala Val Ile Val Val Val Val Val Ala Leu 275 280 285 Val Ala Gly Met Ala Val Leu Val Ile Thr Asn Arg Arg Lys Ser Gly 290 295 300 Lys Tyr Lys Lys Val Glu Ile Lys Glu Leu Gly Glu Leu Arg Lys Glu 305 310 315 320 Pro Ser Leu

Claims (44)

  1. 화학식 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate)(ADC).
    Figure pct00076

    여기서,
    Ab는 항-Trop-2 항체이고;
    q는 1 내지 20의 범위의 값이고;
    L1은 항-Trop-2 항체에 결합된 링커이고;
    L2는 -(CH2)p-이고, 여기서, p는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
    L3은 결합 또는 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-6 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, L1은 항-Trop-2 항체의 황에 결합된 링커인, ADC.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, -L1-L2-는
    Figure pct00077
    인, ADC.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이거나, 1 내지 10의 범위의 값이거나, 6 내지 8의 범위의 값인, ADC.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, p는 4, 5 또는 6, 바람직하게는 5인, ADC.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, L3은 결합인, ADC.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, L3은 폴리옥시에틸렌계 2가 링커인, ADC.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 C1-4 알킬 또는 C1-3 알킬인, ADC.
  9. 제8항에 있어서, R1은 메틸 또는 에틸인, ADC.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 C1-4 알킬 또는 C1-3 알킬인, ADC.
  11. 제10항에 있어서, R2는 메틸 또는 에틸인, ADC.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2는 동일한, ADC.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 화학식 (IIa), (IIb), (IIc), (IIIa), (IIIb) 또는 (IIIc) 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염인, ADC.
    Figure pct00078

    Figure pct00079

    Figure pct00080

    Figure pct00081

    Figure pct00082

    Figure pct00083
  14. 제13항에 있어서, 상기 ADC는 화학식 (IIa-1), (IIb-1), (IIc-1), (IIIa-1), (IIIb-1) 또는 (IIIc-1), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, ADC.
    Figure pct00084

    Figure pct00085

    Figure pct00086

    Figure pct00087

    Figure pct00088

    Figure pct00089
  15. 제1항에 있어서, 상기 ADC는 화학식 (IV) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, ADC.
    Figure pct00090
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 1의 서열을 포함하는 VL HVR1, 서열번호: 2의 서열을 포함하는 VL HVR2, 서열번호: 3의 서열을 포함하는 VL HVR3, 서열번호: 4의 서열을 포함하는 VH HVR1, 서열번호: 5의 서열을 포함하는 VH HVR2, 및 서열번호: 6의 서열을 포함하는 VH HVR3을 포함하는, ADC.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-Trop-2 항체는 서열번호: 7과의 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 갖는 VL, 서열번호: 8과의 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 서열을 갖는 VH, 서열번호: 7의 서열을 갖는 VL, 및/또는 서열번호: 8의 서열을 갖는 VH를 포함하는, ADC.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-Trop-2 항체는 카파 경쇄, 및/또는 IgG 항체를 포함하며, 임의로 상기 항-Trop-2 항체는 IgG1 항체인, ADC.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-Trop-2 항체는 인간 Trop-2와 결합하되, 임의로 상기 인간 Trop-2는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는, ADC.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료에 사용하기 위한, 임의로, Trop-2-발현 암의 치료에 사용하기 위한, ADC.
  21. 피험체에서 Trop-2-발현 암을 치료하는 방법으로, Trop-2-발현 암의 치료를 필요로 하는 피험체에게 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 ADC를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 약제의 제조를 위한, 임의로, Trop-2-발현 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 ADC의 용도.
  23. 상기 Trop-2-발현 암은 상피 세포-유래 암이며, 임의로, 상기 Trop-2-발현 암은 암종인, 제20항에 따른 ADC, 제21항에 따른 방법, 또는 제22항에 따른 용도.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암종은 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 신장 세포 암종, 제자리 유관 암종, 침습성 유관 암종, 또는 선암인, ADC, 방법, 또는 용도.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 Trop-2-발현 암은 고체 종양을 포함하는, ADC, 방법, 또는 용도.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Trop-2-발현 암은 전이성이고/이거나 재발된 암인, ADC, 방법, 또는 용도.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Trop-2-발현 암은 췌장암, 위암, 유방암, 흑색종, 신장암, 결장직장암, 자궁내막암, 전립선암, 요로상피암, 교모세포종, 폐암, 자궁경부암, 식도암 또는 난소암인, ADC, 방법, 또는 용도.
  28. 제27항에 있어서, 상기 Trop-2-발현 암은 췌장암, 위암 또는 유방암이며, 임의로 상기 암은 전이성인, ADC, 방법, 또는 용도.
  29. 제28항에 있어서, 상기 Trop-2-발현 암은 삼중 음성 유방암이며, 임의로 상기 암은 전이성인, ADC, 방법, 또는 용도.
  30. 제1항에 따른 ADC의 제조 방법으로서, 항-Trop-2 항체를 화학식 (P-I)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 반응시키는 단계를 포함하는, 방법.
    Figure pct00091

    여기서,
    B는 상기 항-Trop-2 항체와 결합을 형성할 수 있는 반응성 모이어티이고;
    L2는 -(CH2)p-이며, 여기서, p는 4, 5, 6, 7 또는 8이고;
    L3은 결합 또는 폴리옥시에틸렌계 2가 링커이고;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 C1-6 알킬이다.
  31. 제30항에 있어서, B는 상기 항-Trop-2 항체의 설프하이드릴과 결합을 형성할 수 있는 반응성 모이어티인, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, B는 N-말레이미도인, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 ADC인, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, p는 4, 5 또는 6, 바람직하게는 5인, 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 C1-4 알킬 또는 C1-3 알킬인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, R1은 메틸 또는 에틸인, 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 C1-4 알킬 또는 C1-3 알킬인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, R2는 메틸 또는 에틸인, 방법.
  39. 제30항 내지 제38에 있어서, R1 및 R2는 동일한, 방법.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, L3은 결합인, 방법.
  41. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, L3은 폴리옥시에틸렌계 2가 링커인, 방법.
  42. 제30항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자는 화학식 (P-IIa), (P-IIb), (P-IIc), (P-IIIa), (P-IIIb) 또는 (P-IIIc)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법:
    Figure pct00092

    Figure pct00093

    Figure pct00094

    Figure pct00095

    Figure pct00096

    Figure pct00097
  43. 제42항에 있어서, 상기 분자는 화학식 (P-IIa-1), (P-IIb-1), (P-IIc-1), (P-IIIa-1), (P-IIIb-1) 또는 (P-IIIc-1)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법:
    Figure pct00098

    Figure pct00099

    Figure pct00100

    Figure pct00101

    Figure pct00102

    Figure pct00103
  44. 제43항에 있어서, 상기 분자는 화학식 (P-IV)의 분자 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 방법:
    Figure pct00104
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