CN116635053A - 以抗axl抗体、抗体片段和其免疫结合物治疗表达axl的癌症的方法 - Google Patents

以抗axl抗体、抗体片段和其免疫结合物治疗表达axl的癌症的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116635053A
CN116635053A CN202180076413.6A CN202180076413A CN116635053A CN 116635053 A CN116635053 A CN 116635053A CN 202180076413 A CN202180076413 A CN 202180076413A CN 116635053 A CN116635053 A CN 116635053A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
axl
antibodies
seq
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180076413.6A
Other languages
English (en)
Inventor
埃里克·西沃斯
菲利普·马丁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioatla Inc
Original Assignee
Bioatla Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioatla Inc filed Critical Bioatla Inc
Publication of CN116635053A publication Critical patent/CN116635053A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供治疗表达Axl的癌症的方法。所述方法涉及向有需要的个体投与具有特异性结合于Axl蛋白的重链可变区及/或轻链可变区的多肽、含有所述多肽的抗体或抗体片段及/或其免疫结合物化合物。所述免疫结合物化合物为经由可裂解连接子(CAB‑Axl‑ADC)与一或多种药物结合的条件性活性生物CAB抗Axl抗体。所述免疫结合物是mAbBA3011‑可裂解连接子‑MMAE(n)或其药学上可接受的盐，其中所述mAbBA3011是抗体或抗体片段，所述MMAE是单甲基奥瑞他汀E，且所述(n)是1与4之间的整数。也提供包含所述多肽或含有所述多肽的抗体及抗体片段的医药组合物及试剂盒。

Description

以抗AXL抗体、抗体片段和其免疫结合物治疗表达AXL的癌症 的方法
相关申请案的交叉引用
本申请案主张2020年11月12日申请的美国临时申请案第63/113,040号的利益，其全部内容以引用的方式特别并入本文中。
序列表的引用
本申请案包括在2020年10月14日创建且含有12,000位组、名为“BIAT-1034_Sequence Listing”、以正文文件形式提交的序列表。此正文文件中所含的材料以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明是关于治疗表达Axl的癌症的方法。所述方法包含向有需要的个体施用每周剂量为约0.3mg/kg至约1.8mg/kg的抗Axl抗体、抗体片段和/或此类抗体和抗体片段的免疫结合物。
背景技术
Axl蛋白(也称为Ark、UFO、Tyro-7)为激酶Tyro-3家族中的受体酪氨酸激酶。Tyro-3受体激酶的特征在于胞外区域和细胞质激酶域中两个免疫球蛋白样域和双纤维结合蛋白III型重复序列的组合。Tyro-3受体激酶的配位体为Gas6(生长停滞特异性6)和蛋白质S，为两种展示43％氨基酸序列一致性且共享类似域结构的维生素-K依赖性蛋白质。各蛋白具有含有11g-羧基谷氨酸残基的N端GIa域，继的以四个表皮生长因子(EGF)样模块，和由两个串联层黏连蛋白G域组成的C-末端性激素结合球蛋白(SHBG)样结构。SHBG域对于Tyro-3受体激酶结合和活化均为必需且足够的，而GIa域结合带负电的膜磷脂，且在凋亡细胞的Tyro-3激酶介导的吞噬作用中起重要作用。
Axl活化经由PI-3-激酶/Akt(Franke等人,Oncogene,第22卷,第8983-8998页,2003)和其它主要路径，如Ras/Erk和β-连环蛋白/TCF(Goruppi等人,Mol.Cell.Biol.,第21卷,第902-915页,2001)引起信号传导。Axl在包括脑部、心脏、骨胳肌肉、器官囊和若干其它器官的结缔组织的一系列正常组织中和单核细胞中而非在淋巴细胞中微弱地表达。在成纤维细胞(Goruppi等人,Mol.Cell.Biol.,第17卷,第4442-4453页,1997)、内皮细胞(Hasanbasic等人,Am J Physiol Heart Circ Physiol,第287卷,H1207-H1213,2004)、血管平滑肌细胞(Melaragno等人,J.Mol.Cell.Cardiol.,第37卷,第881-887页,2004)和神经元(Allen等人,Mol.Endocrinol.,第13卷,第191-201页,1999)的存活中，已描述由Axl诱导的Akt磷酸化。此外，Axl在细胞黏附和趋化性中起作用，因为Axl基因剔除动物由于血小板集成素IIb3的活化降低而展示血小板聚集稳定和血栓形成受损。
Axl或其配位体Gas6的失调涉及多种人类癌症的发病机制。Axl过度表达已在各种癌症类型中得到证实，例如乳癌(Meric等人,Clin.Cancer Res.,第8卷,第361-367页,2002；Berclaz等人,Ann.Oncol.,第12卷,第819-824页,2001)、结肠癌(Chen等人,Int.J.Cancer,第83卷,第579-584页,1999；Craven等人,Int.J.Cancer,第60卷,第791-797页,1995)、前列腺癌(Jacob等人,Cancer Detect.Prey.,第23卷,第325-332页,1999)、肺癌(Wimmel等人,Eur J Cancer,第37卷,第2264-2274页,2001)、胃癌(Wu等人,AnticancerRes.,第22卷,第1071-1078页,2002)、卵巢癌(Sun等人,Oncology,第66卷,第450-457页,2004)、子宫内膜癌(Sun等人,Ann.Oncol.,第14卷,第898-906页,2003)、肾癌(Chung等人,DNA Cell Biol.,第22卷,第533-540页,2003)、肝细胞癌(Tsou等人,Genomics,第50卷,第331-340页,1998)、甲状腺癌(Ito等人,Thyroid,第12卷,第971-975页,2002；Ito等人,Thyroid,第9卷,第563-567页,1999)，且进一步在慢性骨髓性白血病(Janssen等人,Oncogene,第6卷,第2113-2120页,1991；Braunger等人,Oncogene,第14卷,第2619-2631页,1997；O'Bryan等人,Mol.Cell.Biol.,第11卷,第5016-5031页,1991)、急性骨髓白血病(Rochlitz等人,Leukemia,第13卷,第1352-1358页,1999)、骨肉瘤(Nakano等人,J.Biol.Chem.,第270卷,第5702-5705页,2003)、黑色素瘤(van Ginkel等人,Cancer Res.,第64卷,第128-134页,2004)和头颈部鳞状细胞癌(Green等人,Br J.Cancer.,第94卷,第1446-5页,2006)中得到证实。
最近，通过分析磷酸酪氨酸信号传导，在大约5％的NSCLC原发性肿瘤中检测到活化Axl(Rikova等人,Cell,第131卷,第1190-1203页,2007)。Axl表达由靶向化学疗法药物诱导，且药物诱导的Axl表达使急性骨髓白血病对化学疗法产生抗性(Hong等人,CancerLetters,第268卷,第314-324页,2008)，以及分别使胃肠道基质肿瘤(Mehadevan等人,Oncogene,第26卷,第3909-3919页,2007)和乳癌(Liu等人,Cancer Research,第281卷,第6871-6878页,2009)对伊马替尼(imatinib)和拉帕替尼(Lapatinib)/赫赛汀(Herceptin)产生抗性。
此外，已识别出Axl与肿瘤转移相关，因为与非侵袭性细胞相比，Axl在侵袭性乳癌细胞系中上调。在活体外，发现Axl活性为迁移和侵入所必需，且此活性可通过抗体治疗抑制(WO 04/008147)。类似地，经由表达Axl的显性阴性形式(Vajkoczy,P.,等人,Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.,第103卷,第5799-5804页,2005)或通过siRNA介导的Axl下调(Holland等人,Cancer Res.,第65卷,第9294-9303页,2005)活体内消除Axl活性，可防止鼠类异种移植实验中的皮下和原位细胞生长。
因此，已描述用于治疗癌症的抗Axl单克隆抗体。例如，关于抗Axl抗体的公开案包括WO 2009/063965、WO 2009/062690、WO 2011/014457、US 2014/0227283和美国专利第8,853,369号。US 2014/0227283公开单克隆抗Axl抗体和其在诊断和治疗方法中的用途。WO2009/062690公开结合于Axl蛋白的胞外域且可至少部分抑制Axl活性的抗体。
此些单克隆抗Axl抗体将以类似亲和力结合于患者身体的任何位置的Axl，包括其打算治疗的肿瘤位置。预期此类抗体与非肿瘤环境中的Axl结合对此些环境中的Axl的正常功能具有不良影响，且因此可引起显着副作用。本发明提供条件性活性抗Axl抗体和抗体片段，相比于其在非肿瘤环境中与Axl的结合亲和力，其在肿瘤微环境中与Axl具有较高结合亲和力。预期本发明的抗Axl抗体和抗体片段与所属领域中已知的单克隆抗Axl抗体相比具有相当或更高的抗癌功效，且具有减少的副作用。此也可允许施用更高剂量的抗Axl抗体和抗体片段或更频繁治疗，因此提供更有效的治疗选项。
癌症持续为一种严重的全球健康负担。在美国(US)，其为仅次于心脏病的第二大常见死因，几乎每4人中就有1人死亡(美国癌症协会2011)。实体肿瘤的治疗引起特定挑战。例如，几十年来，肺癌已为世界上最常见的癌症，且到2008年，估计有161万新病例，占所有新癌症的12.7％。其也为最常见的癌症死亡原因，有138万人死亡(占总数的18.2％)(GLOBOCAN 2008)。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的约80％至85％。随着免疫疗法(程序性死亡配位体1抗体)和靶向疗法(例如表皮生长因子受体、退行性淋巴瘤激酶抑制剂等)的近来进展，仍仅有有限的一部分NSCLC患者自疗法中受益。
软组织肉瘤(STS)为间质衍生的癌症，根据最新世界卫生组织(WHO)分类(WHO2013)，其具有超过100种组织学亚型。对STS的管理也为具有挑战性的问题，因为治疗为基本上姑息性的且治愈可能性大幅度减少。所报道的中值总存活期为约12至18个月(Cioffi2012；Martin-Liberal 2014)。不幸的是，尽管癌症的治疗有进展，但对更有效且较低毒性的疗法仍存在未满足的医学需要，尤其对于对现有疗法不起反应或对现有疗法产生抗性的患有晚期疾病的那些患者而言。
发明内容
在一方面中，本发明提供一种特异性结合于Axl蛋白质的经分离多肽，以及所述多肽在治疗表达Axl的肿瘤的方法中的用途，其涉及向需要此类治疗的人类施用多肽。
本发明的多肽包括六个互补决定区H1、H2、H3、L1、L2和L3，其中：
H1序列为X1GX2X3MX4(SEQ ID NO:1)(X1、X2、X3和X4各自独立地表示氨基酸)：其中
X1为T或A或W，
X2为H或A，
X3为T或I，且
X4为N或I；
H2序列为LIKX5SNGGTX6YNQKFKG(SEQ ID NO:2)(X5和X6各自独立地表示氨基酸)：其中
X5为P或N，且
X6为S或I或T；和
H3序列为GX7X8X9X10X11X12X13X14DYX15X16(SEQ ID NO:3)(X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15和X16各自独立地表示氨基酸)：其中
X7为H或D或E或P或R或W，
X8为Y或N，
X9为E或A或D或F或G或H或I或L或M或N或R或V或Y，
X10为S或D或M或N或Q，
X11为Y或C或E或P，
X12为F或E或N或S或T或V，
X13为A或D或G或L或Y，
X14为M或E或F，
X15为W或A或D或H或L或N或P或R或T，且
X16为G或H，
L1序列为KASQDX17X18SX19VX20(SEQ ID NO:4)(X17、X18、X19和X20各自独立地表示氨基酸)：其中
X17为V或D或G或N或W，
X18为S或V，
X19为A或L或M，且
X20为A或D或N或Q；
L2序列为X21X22X23TRX24T(SEQ ID NO:5)(X21、X22、X23和X24各自独立地表示氨基酸)：其中
X21为W或F，
X22为A或I或N或P或Q，
X23为S或D，且
X24为H或D；和
L3序列为QEX25X26SX27X28X29X30(SEQ ID NO:6)(X25、X26、X27、X28、X29和X30各自独立地表示氨基酸)：其中
X25为H或C或F或I或L或Q或S或T或V或Y，
X26为F或C或D或E或G或N或S，
X27为T或C或P，
X28为P或A或C或D或E或H或K或S或T或V或W，
X29为L或G或R，且
X30为T或I或R，和
本发明的多肽不包括具有以下六个CDR的亲本多肽：
H1＝TGHTMN，
H2＝LIKPSNGGTSYNQKFKG，
H3＝GHYESYFAMDYWG，
L1＝KASQDVSSAVA，
L2＝WASTRHT，和
L3＝QEHFSTPLT。
在另一方面中，本发明提供如上文所描述的经分离多肽，其相对于亲本多肽在CDRH1、H2和H3中具有至多一个取代，且相对于亲本多肽在CDR L1、L2和L3中具有至多一个取代。此包括相对于亲本多肽在CDR H1、H2和H3中具有一个取代的经分离多肽，相对于亲本多肽在CDR L1、L2和L3中具有一个取代的经分离多肽，和相对于亲本多肽在CDR H1、H2和H3中具有一个取代且相对于亲本多肽在CDR L1、L2和L3中具有一个取代的经分离多肽。CDR H1、H2和H3的可能组合展示于图1A中，以及CDR L1、L2和L3的可能组合展示于图1B中。
在另一方面中，本发现提供特异性结合于Axl蛋白质的经分离多肽，和多肽在治疗表达Axl的肿瘤的方法中的用途，其涉及向需要此类治疗的人类施用多肽，其中经分离多肽包含选自SEQ ID NO:20的重链可变区和选自SEQ ID NO:21的轻链可变区。
在又一方面中，本发明提供抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物，其包括至少一种本发明的所述经分离多肽。
在另一方面中，本发明提供一种使用上述抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物治疗表达Axl的肿瘤的方法。
在又一方面中，本发明提供一种免疫结合物，其包括任选地与选自化学治疗剂、放射性原子、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂的试剂结合的本发明的抗体或抗体片段，以及提供治疗表达Axl的肿瘤的方法，所述方法涉及施用此类免疫结合物。
在一个方面中，免疫结合物为抗体-药物结合物(ADC)，其中条件性活性生物(CAB)抗Axl抗体经由可裂解连接子(CAB-Axl-ADC)与一或多种异源分子结合。CAB-Axl-ADC可为mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)，其中异源分子为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，且(n)为1与4之间的整数，包括端点。
在又一方面中，本发明提供治疗表达Axl的肿瘤的方法，其包括向需要此类治疗的人类个体施用mAbBA301-可裂解连接子-MMAE(n)，其中mAbBA301是抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有包括SEQ ID NO.14的hcCDR1、SEQ ID NO.15的hcCDR2和SEQ ID NO.16的hcCDR3的重链可变区；和包括SEQ ID NO.17的lcCDR1、SEQ ID NO.18的lcCDR2和SEQ IDNO.19的lcCDR3的轻链可变区；MMAE是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，且(n)为1至4之间的整数，包括端点。
在又一方面中，本发明提供一种医药组合物，其包括本发明的多肽、抗体或抗体片段或免疫结合物以及药学上可接受的载剂。
在又一方面中，本发明提供一种用于诊断或治疗的试剂盒，其包括本发明的多肽、抗体或抗体片段或免疫结合物，其具有诊断或治疗表达Axl的肿瘤的使用说明书。
在另一方面中，本发明提供一种治疗表达Axl的肿瘤的方法，其包括向需要此类治疗的人类个体施用含有mAbBA301-可裂解连接子-MMAE(n)和药学上可接受的载剂的医药组合物，其中所述医药组合物每21天在第1天和第8天通过静脉内输注以1.8mg/kg人类个体体重的剂量施用。mAbBA301是抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有包括SEQ ID NO.14的hcCDR1、SEQ ID NO.15的hcCDR2和SEQ ID NO.16的hcCDR3的重链可变区；和包括SEQ IDNO.17的lcCDR1、SEQ ID NO.18的lcCDR2和SEQ ID NO.19的lcCDR3的轻链可变区；且(n)为1至4之间的整数，包括端点，优选地(n)等于4。
在一个方面中，mAbBA301的重链可变区包括SEQ ID NO.20，和mAbBA301的轻链可变区包括SEQ ID NO.21。
在另一方面中，可裂解连接子为mc-vc-PAB。
在另一方面中，表达Axl的肿瘤为肉瘤、腺癌或非小肺细胞癌，优选地，表达Axl的肿瘤为肉瘤。
在另一方面中，方法进一步包括施用程序性死亡受体-1(PD-1)阻断抗体。
在另一方面中，表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少70。
在另一方面中，方法进一步包括施用颗粒球群落刺激因子或其类似物。
在另一方面中，药学上可接受的载剂具有6.0的pH且包含20mM组氨酸-HCL、70mg/mL蔗糖和0.5mg/mL聚山梨醇酯80。
附图说明
图1A-1B分别展示本发明的抗Axl抗体的重链可变区和轻链可变区的序列比对。
图2展示在pH 6.0和pH 7.4下，本发明的多种条件性活性抗体对Axl的胞外域的结合(OD450)。这些条件性活性抗体在pH 6.0下比在pH 7.4下更具活性。
图3展示本发明的多种条件性活性抗体对Axl的胞外域的选择性。选择性经测量为在pH 6.0下对结合搭配物的结合亲和力与在pH 7.4下对相同结合搭配物的结合亲和力的比率。
图4通过尺寸排阻色谱展示，其指示如实例1中所描述本发明的条件性活性抗体不聚集。
图5展示如通过ELISA分析所测量，如实例1中所描述，本发明条件性活性抗体在热休克之前和之后的热稳定性。
图6A-6B展示如通过实例1中的SPR分析所测量的本发明的条件性活性抗体的选择性。
图7展示本发明的抗Axl抗体在KREBS缓冲剂中与Axl的结合的pH依赖性结合概况。
图8A-8E展示使用A549细胞的另一细胞杀伤研究的结果，其中采用本发明的抗Axl抗体在pH 6.0和pH 7.4下且在不同抗体浓度下进行细胞杀伤。
图9A-9D展示本发明的抗Axl抗体在不同缓冲剂中和不同pH水平下对人类Axl和食蟹猕猴Axl的结合亲和力。
图10A-10H展示结合至金霉素(duomycin)的本发明的抗Axl抗体在不同pH水平下对不同细胞系的细胞杀伤。
图11展示结合至吉西他滨(gemcitabine)的本发明的抗Axl抗体在不同pH水平下对A549细胞的细胞杀伤。
图12展示用本发明的金霉素结合的抗Axl抗体治疗异种移植小鼠的肿瘤体积的作用。
图13A-13B展示在注射结合物之后，食蟹猕猴的血液中本发明的金霉素结合的抗Axl抗体随时间推移的检测到的存在时间。
图14A展示在即将注射之前(pre(D-3))开始直至注射结合物后3天(post(D-3))，食蟹猕猴的血液中天冬氨酸转胺酶(AST)随时间推移的检测到的存在时间。
图14B展示在即将注射之前(pre(D-3))开始直至注射结合物后3天(post(D-3))，食蟹猕猴的血液中丙氨酸天冬氨酸转胺酶(ALT)随时间推移的检测到的存在时间。
图15展示在注射结合物之后食蟹猕猴的血液中随时间推移的淋巴细胞计数。
图16A-16B展示分别接受LCLC103H和DU145的小鼠的活体内治疗。
图17A-D展示BA3011在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤功效。使用免疫缺乏动物中表达Axl的人类肿瘤细胞系衍生的异种移植肿瘤活体内证实BA3011的抗肿瘤功效。表示NSCLC(LCLC103H；图17A)、前列腺(DU145；图17B)和胰脏肿瘤(MIAPaCa2；图17C)的肿瘤细胞系在活体内小鼠模型系统中进行测试。
图18为示范性剂量升级流程图。
图19展示示范性给药时程。
图20展示施用1.8mg/kg Q3W或2Q3W BA3011-CAB-Axl-ADC-MMAE的患者的目标病变总和的变化。肿瘤膜百分比评分(TmPS)中AXL的质膜评分通过对≥1+、≥2+或≥3+的强度百分比求和来计算。因此，评分在0至100范围内。肿瘤膜评分与肿瘤细胞质评分不能区分的患者被排除。
图21展示按癌症迹象划分的平均Axl质膜H-评分值。
图22展示1期中Axl TmPS≥70，剂量为1.8mg/kg Q3W(d1)或2Q3W(d1,8)的肉瘤患者中目标病变总和(最优选反应)的百分比变化。
图23展示在所有测试剂量下1期中可评估的肉瘤患者按Axl TmPS类别得到的目标病变总和(最优选反应)的百分比变化。
图24展示在所有测试剂量下1期中可评估的肉瘤患者按问诊和Axl TmPS类别得到的目标病变总和的百分比变化。
定义
为有助于理解本文提供的实例，某些频繁出现的术语在本文中加以定义。
结合所测量的量，如本文所用的术语“约”是指熟习所属领域者所预期使测量和操作与测量的目的和所用测量设备的精确度在所关心的量上相匹配的测量的量的正常变化。除非另外指明，否则“约”是指所提供值的+/-10％的变化。
如本文所用，术语“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体与抗原)成员之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常量(Kd)表示。可通过所属领域中已知的常用方法(包括本文所描述的那些方法)来测量亲和力。用于测量结合亲和力的特定说明性和示范性实施例描述于下文中。
当提及抗体使用时，术语“亲和力成熟”是指与不具有此类改变的亲本抗体或抗体片段相比，在一或多个高变区(HVR)中具有一或多个改变的抗体或抗体片段，此类改变引起抗体或抗体片段对抗原的亲和力提高。
如本文所使用，术语“氨基酸”是指含有氨基(--NH2)和羧基(--COOH)的任何有机化合物；其优选呈游离基团形式或者在缩合之后作为肽键的一部分。“二十种天然编码的多肽形成α-氨基酸”在所属领域中理解且是指：丙氨酸(ala或A)、精氨酸(arg或R)、天冬酰胺(asn或N)、天冬氨酸(asp或D)、半胱氨酸(cys或C)、谷氨酸(glu或E)、谷氨酰胺(gin或Q)、甘氨酸(gly或G)、组氨酸(his或H)、异亮氨酸(ile或I)、亮氨酸(leu或L)、赖氨酸(lys或K)、甲硫氨酸(met或M)、苯丙氨酸(phe或F)、脯氨酸(pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(thr或T)、色氨酸(tip或W)、酪氨酸(tyr或Y)和缬氨酸(val或V)。
如本文中所使用，术语“试剂”意谓元素、化合物或分子实体，包括例如医药化合物、治疗化合物或药理学化合物。试剂可为天然或合成的或其组合。
“抗癌剂”是单独或与另一试剂组合作为治疗方案的一部分对癌细胞施加细胞毒性或细胞生长抑制作用的试剂。例如，抗癌剂为可抑制肿瘤生长、遏制肿瘤生长和/或引起已存在的肿瘤消退的试剂。
如本文所用，术语“抗血管生成剂”是指阻断或在一定程度上干扰血管的出现的化合物。抗血管生成剂可例如为与参与促进血管生成的生长因子或生长因子受体结合的小分子或抗体。在一个实施例中，抗血管生成剂为与血管内皮生长因子(VEGF)(例如贝伐单抗(bevacizumab))结合的抗体或抗体片段。
“细胞毒性作用”意谓抑制细胞增殖。“细胞毒性剂”意谓在细胞上具有细胞毒性或细胞生长抑制作用的试剂，由此分别耗竭或抑制细胞群体内的细胞生长。如本文所用，术语“抗体片段”是指除完整抗体外的分子，其包含完整抗体的一部分，且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双功能抗体；直链抗体；单链抗体分子(例如，scFv)。此些抗体片段可使用所属领域中熟知的方法制得(参见例如Harlow和Lane,同上)，所述抗体片段保留一定的与其所源于的抗体的抗原(例如多肽抗原)选择性结合的能力。
如本文所用，术语“抗体”是指完整免疫球蛋白分子。抗体或抗体片段可用于通过免疫亲和色谱法分离制备量的抗原。此类抗体或抗体片段的各种其它用途是诊断和/或分级疾病(例如赘瘤形成)且用于治疗疾病的治疗性应用，所述疾病是例如：赘瘤形成、自体免疫性疾病、AIDS、心血管疾病、感染和其类似疾病。嵌合、人类样、人类化或全人类抗体或抗体片段尤其适用于向人类患者施用。
Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成，且可通过用番木瓜蛋白酶消化全抗体分子得到由完整轻链和一部分重链组成的片段而产生。
抗体分子的Fab'片段可通过用胃蛋白酶处理全抗体分子，随后还原，产生由完整轻链和一部分重链组成的分子而获得。每个以此方式处理的抗体分子获得两个Fab'片段。
抗体的(Fab')2片段可在无后续还原下通过用胃蛋白酶处理全抗体分子获得。(Fab')2片段是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab'片段的二聚体。
Fv片段定义为含有轻链可变区和重链可变区且表达为两条链的经基因工程改造的片段。
如本文所用，术语“抗Axl抗体”、抗Axl抗体片段和“结合于Axl的抗体或抗体片段”是指能够以足够亲和力结合Axl，使得抗体或抗体片段可用作靶向Axl的诊断剂和/或治疗剂的抗体或抗体片段。在一个实施例中，如例如通过放射免疫分析(RIA)所测量，抗Axl抗体或抗体片段与不相关非Axl蛋白质的结合程度小于抗体或抗体片段与Axl的结合程度的约10％。在某些实施例中，结合于Axl的抗体或抗体片段的解离常量(Kd)≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或更低，或10-8M至10-13M，或10-9M至10-13M)。在某些实施例中，抗Axl抗体或抗体片段结合至Axl的抗原决定基，所述抗原决定基在来自不同物种的Axl当中为保守性的。
如本文中所使用，术语“血管生成病症”是指血管生成的任何失调，包括非赘生性和赘生性病状。赘生性病状包括(但不限于)下文所描述的病状(参见例如，“癌症”)。非赘生性病症包括(但不限于)不合需要的或异常肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、牛皮癣性斑、类肉瘤病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑、糖尿病性和其它增生性视网膜病变，包括早产儿视网膜病变、晶状体后组织纤维增生、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥反应、视网膜/脉络膜新生血管、眼角新血管生成(虹膜红变)、眼部新生血管性疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷氏病(Grave's disease))、角膜和其它组织移植、慢性发炎、肺部发炎、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺高血压、恶性肺积液、脑水肿(例如与急性中风/闭锁性头部损伤/创伤相关)、滑膜发炎、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、骨关节炎(OA)、难治性腹水、多囊性卵巢疾病、子宫内膜异位、第3间隔体液疾病(胰脏炎、腔室综合征、烧伤、肠病)、子宫肌瘤、早产、慢性发炎，例如IBD(克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植排斥反应、发炎性肠道疾病、肾病综合征、不合需要的或异常组织大量生长(非癌症)、嗜血性关节、肥厚性疤痕、抑制头发生长、奥斯勒-韦伯综合征(Osler-Weber syndrome)、化脓性肉芽肿瘤晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管黏附、滑膜炎、皮炎、子痫前症、腹水、心包积液(例如与心包炎相关心包积液)和肋膜积液。
如本文所用，术语“血管生成”是指所有涉及Axl的过程，其有助于自预先存在的血管生长新血管，特定言的(但不限于)新肿瘤供应血管。此些过程包括多种细胞事件，例如血管内皮细胞的增殖、存活、迁移和出芽、外被细胞的吸引和迁移以及用于基质或赘生性细胞的血管生成因子的血管稳定、血管灌注或分泌的基底膜形成，且应由Axl的非催化或催化活性刺激或介导，优选包括Axl磷酸化和/或Axl介导的信号转导刺激或介导。
除非另有指示，否则如本文所用，术语“Axl”是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然Axl。所述术语涵盖未处理的“全长”Axl以及在细胞中处理而产生的任何Axl形式。所述术语也涵盖Axl的天然存在的变异体，例如剪接变异体或对偶基因变异体。人类Axl的氨基酸序列为所属领域中熟知的且购自公共数据库，例如GenBank。
如本文所用，术语“Axl活化”是指Axl受体的活化或磷酸化。一般来说，Axl活化引起信号转导(例如由Axl受体的胞内激酶域使Axl或受质多肽中的酪氨酸残基磷酸化引起的信号转导)。Axl活化可由结合于所关注的Axl受体的Axl配位体(Gas6)介导。与Axl结合的Gas6可活化Axl的激酶域，且从而引起Axl中的酪氨酸残基磷酸化和/或额外受质多肽中的酪氨酸残基磷酸化。
如本文所用，术语“Axl介导的抗细胞凋亡”是指预防人类细胞，优选(但不限于)人类癌细胞发生程序性细胞死亡(细胞凋亡)的所有涉及Axl的过程。特定言的，其是指预防人类细胞，优选(但不限于)人类癌细胞经由生长因子戒断、低氧、暴露于化学治疗剂或放射或引发Fas/Apo-1受体介导的信号传导而诱导细胞凋亡的过程，且通过Axl的非催化或催化活性刺激或介导，优选包括Axl磷酸化和/或Axl介导的信号转导刺激或介导。
如本文所用，术语“结合”是指抗体的可变区或Fv与抗原的相互作用，其中所述相互作用视抗原上特定结构(例如抗原决定子或抗原决定基)的存在而定。举例来说，抗体可变区或Fv识别且结合于特定蛋白质结构而非一般蛋白质。如本文所用，术语“特异性结合(specifically binding/binding specifically)”意谓抗体可变区或Fv与特定抗原以比与其它蛋白质更频繁、更快速、更大的持续时间和/或更大的亲和力结合或缔合。举例来说，抗体可变区或Fv与其抗原以比其结合于其它抗原更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大的持续时间特异性结合。对于另一实例，抗体可变区或Fv与细胞表面蛋白质(抗原)以比其结合于相关蛋白质或其它细胞表面蛋白质或通常通过多反应性天然抗体(即通过已知结合人类中天然发现的多种抗原的天然产生的抗体)识别的抗原大体上更大的亲和力结合。然而，“特异性结合”不一定需要排他性结合或不可检测地结合另一抗原，此为术语“选择性结合”的含义。在一个实例中，抗体可变区或Fv(或其它结合区)“特异性结合”结合于抗原意谓抗体可变区或Fv与抗原以l00 nM或更小，例如50nM或更小，例如20nM或更小，15nM或更小，或10nΜ或更小，或5nM或更小，2nM或更小，或1nM或更小的平衡常量(KD)结合。
如本文所用，术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常特征为不受调控的细胞生长/增生的生理病状。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏(Hodgkin's)淋巴瘤和非霍奇金氏(non-Hodgkin's)淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、神经胶母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(livercancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增生病症，和各种类型的头颈癌。
如本文所使用，术语“细胞增殖性病症”和“增生性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施例中，细胞增殖性病症为癌症。
如本文所使用，术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷基化剂，例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；伸乙亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷酰胺、三伸乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，/>)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicines)；桦木酸(betulinicacid)；喜树碱(包括合成性类似物拓朴替康(topotecan)/>CPT-11(伊立替康(irinotecan)，/>)、乙酰基喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻环肽(特别是克瑞托欣(cryptophycin)1和克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盘克斯塔叮(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲基二(氯乙基)胺、甲基二(氯乙基)胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如Nicolaou等人，Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；CDP323(一种口服α-4集成素抑制剂)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycini)、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、小红莓(包括N-口吗啉基-小红莓、氰基-N-吗啉基-小红莓、2-吡咯啉基-小红莓、小红莓HCl脂质粒注入/>脂质小红莓TLC D-99/>聚乙二醇化脂质小红莓/>和去氧小红莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)/>喃氟啶(tegafur)/>卡培他滨(capecitabine)/>埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如迪诺特宁(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；罗尼达宁(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比达摩(mopidanmol)；硝拉维林(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK(R)多糖复合物(JHSNatural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其T-2毒素、黏液霉素A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine))/>达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；噻替派(thiotepa)；紫杉醇，例如太平洋紫杉醇/>太平洋紫杉醇的白蛋白工程改造的纳米粒子调配物(ABRAXANETM)和多西他赛/>苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂试剂，例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如/>)和卡铂(carboplatin)；长春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)/>长春新碱(vincristine)/>长春地辛(vindesine)/>和长春瑞宾(vinorelbine)/>依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；诺凡特龙(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)/>类视黄素，例如视黄酸，包括贝瑟罗汀(bexarotene)双膦酸盐，例如氯屈膦酸盐(clodronate)(例如，/>或/>)、依替膦酸盐(etidronate)/>NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)/>阿仑膦酸盐(alendronate)/>帕米膦酸盐(pamidronate)/>替鲁膦酸盐(tiludronate)/>或利塞膦酸盐(risedronate)/>曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特定言的抑制基因在涉及异常细胞增殖的信号传导路径中的表达的那些，所述基因例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如疫苗和基因疗法疫苗，例如/>疫苗、/>疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，/>)；rmRH(例如，/>)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，/>Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制剂(例如，塞内昔布(celecoxib)或依他昔布(etoricoxib))、蛋白酶体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米(bortezomib)/>CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥利默森钠(oblimersen sodium)/>匹蒽醌(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见以下定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见以下定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，/>)；法呢基转移酶抑制剂，例如洛那法尼(lonafarnib)SCH 6636，SARASARTM)；和以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上中的两者或更多者的组合，例如CHOP，即环磷酰胺、小红莓、长春新碱和普赖苏秾(prednisolone)的组合疗法的缩写；和FOLFOX，即使用奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的治疗方案的缩写。
如本文所定义的化学治疗剂包括用来调节、减轻、阻断或抑制可促进癌症生长的激素作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。其本身可为激素，包括(但不限于)：具有混合促效剂/拮抗剂型态的抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)/>艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷诺昔酚(raloxifene)/>曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)和选择性雌激素受体调节剂(SERM)(例如SERM3)；不具有促效剂特性的纯抗雌激素，例如氟维司群(fulvestrant)/>和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER转换和/或抑制ER含量)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂，例如福美司坦(formestane)和依西美坦(exemestane)/>和非类固醇芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑(anastrazole)/>来曲唑(letrozole)/>和胺鲁米特，和其它芳香酶抑制剂，包括伏罗唑(vorozole)/>乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)/>法屈唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；黄体激素释放激素促效剂，包括亮丙立德(leuprolide)(/>和/>)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲特瑞林(tripterelin)；性类固醇，包括助孕素(例如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)和乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate))、雌激素(例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin))和雄激素/类视黄素(例如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸和非瑞替尼(fenretinide))；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两者或更多者的组合。
如本文所用，术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而所述重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。
如本文所用，术语抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。存在五个主要抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且此些类别中的若干个类别可进一步分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“条件性活性抗体”和“条件性活性抗体片段”是指在肿瘤微环境中的条件值相比于非肿瘤微环境中的相同条件的不同值下更具活性的抗体或抗体片段。与非肿瘤微环境中的条件相比，肿瘤微环境中的条件可包括较低pH、较高浓度的乳酸盐和/或丙酮酸盐、低氧、较低浓度的葡萄糖和略较高温度。例如，在一个实施例中，条件性活性抗体或抗体片段可在正常体温下几乎无活性，但在肿瘤微环境中可能遇到的较高温度下具有活性。在又一实施例中，条件性活性抗体或抗体片段在正常含氧血液中的活性可能低于在肿瘤微环境中可能存在的低氧环境中的活性。熟习所属领域者已知的肿瘤微环境中存在其它条件，其也可经选择以适用作本发明中的条件，其可触发抗Axl抗体或抗体片段在所述条件的不同值下具有不同活性。
如本文所用，例如适用于Axl活性，术语“构成性”是指不依赖于配位体或其它活化分子的存在的受体激酶的连续信号传导活性。视受体激酶的性质而定，所有活性均可为组成性的或受体的活性可通过其它分子(例如配位体)的结合进一步活化。致使受体激酶活化的细胞事件已为一般技术者所熟知。举例来说，活化可包括寡聚，例如二聚、三聚等，以达成高阶受体复合物。复合物可包含单一蛋白质物种，即同聚体复合物(homomeric complex)。另外，复合物可包含至少两个不同蛋白质物种，即异聚体复合物(heteromeric complex)。复合物形成可由例如正常或突变形式的受体于细胞表面上过度表达所致。复合物形成也可由受体中的一或多个特异性突变所致。
如本文所用，术语“细胞生长抑制剂”是指在活体外或活体内阻滞细胞生长的化合物或组合物。因此，细胞生长抑制剂可为显着降低S期细胞百分比的药剂。细胞生长抑制剂的其它实例包括通过诱导G0/G1停滞或M期停滞阻断细胞周期进程的药剂。人类化抗Her2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)为诱导G0/G1停滞的细胞生长抑制剂的实例。经典M期阻断剂包括长春花(vincas)(长春新碱和长春花碱(vinblastine))、紫杉烷(taxane)和II型拓扑异构酶抑制剂，例如小红莓、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷和博莱霉素。停滞G1的某些药剂也会使S期停滞，例如DNA烷基化剂，例如他莫西芬、普赖松(prednisone)、达卡巴嗪、甲氮芥、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可见于Mendelsohn和Israel编,The Molecular Basis of Cancer,第1章,标题为“Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs”,Murakami等人(W.B.Saunders,Philadelphia,1995),例如第13页。紫杉烷(太平洋紫杉醇和多西他赛)皆为来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫杉的多西他赛(/>Rhone-Poulenc Rorer)是太平洋紫杉醇(/>Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。太平洋紫杉醇和多烯紫杉醇促进微管自微管蛋白二聚物组装且通过防止解聚合稳定微管，其致使抑制细胞中的有丝分裂。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或妨碍细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括(但不限于)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨喋呤、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、小红莓、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺霉素或其它插入剂)；生长抑制剂；酶和其片段，例如核分解酶；抗生素；毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变异体；以及以下所公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
如本文所用，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含连接至同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个域之间不能配对的连接子，迫使域与另一条链的互补域配对，且产生两个抗原结合位点。
如本文所用，术语“可检测标记”是指通过物理或化学方式进行直接或间接检测或测量指示样品中存在CTC的任何物质。适用的可检测标记的代表性实例包括(但不限于)以下：可基于吸光度、萤光、反射率、光散射、磷光或发光特性直接或间接检测的分子或离子；可通过其放射特性检测的分子或离子；可通过其核磁共振或顺磁特性检测的分子或离子。可基于吸光度或萤光间接检测的分子组中包括例如各种酶，所述酶致使适当受质例如由非光吸收转化为光吸收分子或由非萤光转化为萤光分子。
如本文中所使用，术语“诊断”是指确定个体对疾病或病症的易感性、确定个体目前是否患有疾病或病症、患有疾病或病症的个体的预后(例如鉴别转移前或转移性癌状态、癌症的分级或癌症对疗法的反应)和治疗计量(therametrics)(例如监测个体的状况以提供关于治疗效果或功效的信息)。在一些实施例中，本发明的诊断方法尤其适用于检测早期癌症。
如本文所用，术语“诊断剂”是指可直接或间接检测且用于诊断目的的分子。诊断剂可向个体或样品施用。可提供诊断剂本身或可与例如条件性活性抗体的媒剂结合。
如本文所用，术语“效应功能”是指可归因于抗体的Fc区的所述生物活性，其因抗体同型而异。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
如本文所用，术语药剂(例如医药调配物)的“有效量”是指在所需剂量和时段下有效获得所需治疗性或防治性结果的量。
如本文所用，术语“Fc区”用以定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。所述术语包括原生序列Fc区和变异体Fc区。在一个实施例中，人类IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中所描述。
如本文所用，术语“构架”或“FR”残基是指除高变区(HVR或重链中的H1-3和轻链中的L1-3)残基外的所述可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，在VH(或VL)中HVR和FR序列一般出现以下序列：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”是指包含抗原结合可变区(VH或VL)以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定域可以为天然序列恒定域(例如人类天然序列恒定域)或其氨基酸序列变异体。视其重链的恒定域的氨基酸序列而定，全长抗体可归属于不同“类别”。存在五类全长抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且此些类别中的若干个类别可进一步分成“子类”(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的次单元结构和三维配置为熟知的。
如本文所用，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞之后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初代转化细胞和来源于其之后代(不考虑继代次数)。后代的核酸含量与母细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括针对原始转化细胞筛选或选择具有相同功能或生物活性的突变型子代。
如本文所用，术语“人类抗体”是具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人类或人类细胞所产生的抗体或源自使用人类抗体谱系或其它人类抗体编码序列的非人类来源的抗体的氨基酸序列。人类抗体的此定义特定排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所用，术语“人类共同构架”是表示人类免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的构架。一般来说，人类免疫球蛋白VL或VH序列是选自可变域序列的子组。一般来说，序列子组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的子组。在一个实施例中，对于VL，子组为如Kabat等人(见上文)中的子组κI。在一个实施例中，对于VH，子组为如Kabat等人(见上文)中的子组III。
如本文所用，术语“人类化”抗体是指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人类化抗体将包含至少一个且通常两个可变域的大体上全部，其中全部或大体上全部HVR(例如CDR)均对应于非人类抗体的HVR，且全部或大体上全部FR皆对应于人类抗体的FR。人类化抗体任选地可包含来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人类抗体)的“人类化形式”是指已经历人类化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变域中在序列上具有高变性和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的各区域。一般来说，原生四链抗体包含六个HVR；三个位于VH中(H1、H2、H3)，且三个位于VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或与抗原识别相关。示范性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,第196卷,第901-917页,1987)。示范性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65和H3的氨基酸残基95-102处(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.1991)。除VH中的CDR1的外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR也包含“特异性决定残基”或“SDR”，其为接触抗原的残基。SDR包含于简称为-CDR或a-CDR的CDR区域内。示范性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现于L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102处(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.,第13卷,第1619-1633页,2008)。除非另外指示，否则在本文中，根据Kabat等人,同前文献对可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)进行编号。
如本文所用，术语“免疫结合物”是结合于一或多个异源分子的抗体，所述(等)分子包括(但不限于)细胞毒性剂。
如本文所用，术语“个人(individual)”或“个体(subject)”是指哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)家养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物，例如猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，所述个体(individual/subject)为人类。
“不良事件”(AE)(也称为不良经历)意味着与药物使用暂时相关的任何不利且非预期的迹象(例如异常实验室研究结果)、症状或疾病，且并不暗示对因果关系的任何判断。AE可由药物的任何使用(例如，标签外使用、与另一药物组合使用)和由任何施用途径、调配物或包括过度剂量的剂量产生。如果AE导致以下结果中的任一者，那么将其视为“严重”：
·死亡(排除由潜在疾病所致的死亡)
·危及生命
·需要住院或延长现有住院
·持续性或显着无能力或执行正常生活功能的能力的重大破坏
·先天性异常/出生缺陷
·重大医疗事件-当基于适当医学判断，可危及患者且可需要医疗或手术干预以预防此定义中所列的结果的一时，可能不导致死亡、危及生命且需要住院的重大医疗事件可视为严重。
如本文所使用，术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition of)”意谓降低可测量的量或完全防止。
如本文所使用，术语“抑制细胞生长或增殖”意谓使细胞的生长或增殖减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，且包括诱导细胞死亡。
如本文所用，术语“分离的”抗体是一种自其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或逆相HPLC)所测定，抗体纯化至大于95％或99％的纯度。用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B,第848卷，第79-87页,2007。
如本文所用，术语“分离的”核酸是指已自其天然环境的组分分离的核酸分子。分离核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
如本文所用，术语“编码抗Axl抗体的经分离核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一或多种核酸分子，包括单一载体或各别载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中一或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所用，如例如应用于受体信号传导活性的术语“非配位体依赖型”是指信号传导活性与配位体的存在无关。具有非配位体依赖型激酶活性的受体不一定妨碍配位体与所述受体结合以使得激酶活性额外活化。
如本文所用，术语“癌转移”是指所有涉及Axl的过程，其支持癌细胞自原发性肿瘤扩散，穿透至淋巴管和/或血管中，经由血流循环和在体内其它地方的正常组织中的远程灶中生长(癌转移)。详言的，其是指肿瘤细胞的细胞事件，例如增殖、迁移、固着非依赖性、逃避细胞凋亡或分泌血管生成因子，所述细胞事件是癌转移的基础且通过Axl的非催化或催化活性(优选包括Axl磷酸化和/或Axl介导的信号转导)刺激或介导。
如本文所用，术语“微环境”意谓组织或身体的任何部分或区域，其与组织的其它区域或身体的其它区域具有持久或暂时物理或化学差异。如本文所用，对于肿瘤，术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的环境，其是肿瘤内的非细胞区域和刚好处于肿瘤组织外的区域，但并不涉及癌细胞本身的细胞内隔室。肿瘤和肿瘤微环境密切相关且不断相互作用。肿瘤可改变其微环境，且微环境可影响肿瘤生长和扩散方式。通常，肿瘤微环境具有5.8至7.0范围内，更通常6.2至6.8范围内，6.4至6.8范围内的低pH值。另一方面，正常生理pH值通常在7.2至7.8的范围内。也已知肿瘤微环境具有与血浆相比较低浓度的葡萄糖和其它养分，但具有较高浓度的乳酸。此外，肿瘤微环境可具有高于正常生理温度0.3℃至1℃的温度。肿瘤微环境已论述于Gillies等人,“MRI of the Tumor Microenvironment”,Journal ofMagnetic Resonance Imaging,第16卷,第430-450页,2002中。术语“非肿瘤微环境”是指除肿瘤外的部位的微环境。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指自大体上均质抗体的群体获得的抗体，即除可能变异体抗体(例如含有天然产生的突变或在制造单克隆抗体制剂期间出现的变异体抗体，此类变异体通常以较小量存在)以外，包含所述群体的个别抗体相同和/或结合相同抗原决定基。相比于典型地包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体是针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征为自大体上均质的抗体群体获得，且不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体。举例来说，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制得，包括(但不限于)融合瘤方法、重组DNA方法、噬菌体呈现方法和利用含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座的转殖基因动物的方法、本文所描述的制造单克隆抗体的此类方法和其它示范性方法。
如本文所用，术语“裸抗体”是指不结合于异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于医药调配物中。
如本文所用，术语“原生抗体”是指具有不同结构的天然产生的免疫球蛋白分子。举例来说，天然IgG抗体为约150,000道尔顿(dalton)的杂四聚体糖蛋白，其由二硫化物键结的两条相同轻链和两条相同重链构成。自N端至C端，各重链具有可变区(VH)，也称为可变重链域或重链可变域，随后为三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N端至C端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链域或轻链可变域，继而为恒定轻链(CL)域。抗体轻链可基于其恒定域的氨基酸序列而归为两种类型的一，称为κ和λ。
如本文所使用，术语“药品说明书”用以指通常包括于治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗性产品有关的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所用，相对于参考多肽序列的术语“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列且必要时引入间隙以达成最大序列一致性百分比之后，且在不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分的情况下，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以所属领域中的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。熟习所属领域者可确定适用于比对序列的参数，包括在所比较序列的全长内达成最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，氨基酸序列一致性％值是使用序列比较计算机程式ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程式由Genentech,Inc.设计，且原始程式码已随用户文件一起提交于美国版权局(U.S.CopyrightOffice,Washington D.C.,20559),其以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程式可公开购自Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.或可自原始程式码编译。ALIGN-2程式经编译可用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程式设定且不变化。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，既定氨基酸序列A相对于、与或针对既定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(或者其可表述为，既定氨基酸序列A具有或包含相对于、与或针对既定氨基酸序列B的一定氨基酸序列一致性％)如下计算：
100*(X/Y)
其中X是在用序列比对程式ALIGN-2比对A与B时由所述程式评为一致匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应了解，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的氨基酸序列一致性％与B相对于A的氨基酸序列一致性％不相等。除非另外特定陈述，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％值如刚刚前段中所描述使用ALIGN-2计算机程式获得。
如本文所用，术语“医药调配物”是指所呈形式允许其中所含活性成分的生物活性有效发挥，且不含对调配物将施用的个体具有不可接受毒性的其它组分的制剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指医药调配物中除活性成分外的对个体无毒的成分。药学上可接受的载剂包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所用，术语“纯化”和“分离”是指根据本发明的抗体或核苷酸序列，所指分子在大体上不存在其它同型生物大分子下存在。如本文所使用，术语“纯化”优选地意谓存在至少75重量％、更优选地至少85重量％、又更优选地至少95重量％、且最优选地至少98重量％的相同类型的生物大分子。编码特定多肽的“经分离”的核酸分子是指大体上不含其它不编码多肽的核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包括并不有害地影响组合物的基本特征的一些额外碱基或部分。
如本文中所使用，术语“重组抗体”是指由包含编码抗体的核酸的重组宿主细胞表达的抗体(例如嵌合、人类化或人类抗体或其抗原结合片段)。制造重组抗体的“宿主细胞”的实例包括：(1)哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包括Y0和NS0细胞)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞和Vero细胞；(2)昆虫细胞，例如sf9、sf21和Tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属的植物(例如烟草(Nicotiana tabacum))；(4)酵母细胞，例如属于酵母属(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或曲霉菌属(例如黑曲霉(Aspergillus niger))的酵母细胞；(5)细菌细胞，例如大肠杆菌细胞(Escherichia.colicell)或枯草杆菌细胞(Bacillus subtilis cell)等。
术语本发明的抗体或抗体片段的“治疗有效量”意谓足以按适用于任何医学治疗的合理的效益/风险比率治疗疾病或小病的抗体或抗体片段的量。然而，应理解，本发明的抗体或抗体片段和组合物的每日总用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。对于任何特定患者的特定治疗有效剂量将视多种因素而定，所述因素包括所治疗的病症和所述病症的严重程度；所采用的特异性抗体或抗体片段的活性；所采用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所采用的特异性抗体或抗体片段的施用时间、施用途径和分泌速率；治疗持续时间；与所采用的特异性抗体组合或同时使用的药物；和医学技术中熟知的类似因素。举例来说，在所属领域的技能范围内，以低于达成期望的治疗效果所需的水平开始给药化合物，且逐渐增加剂量直至达成期望效果。
如本文所用，术语“单链Fv”(“scFv”)是共价连接的VH::VL杂二聚体，其通常由基因融合体表达，所述基因融合体包括由肽编码连接子连接的VH和VL编码基因。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异二聚体。二价和多价抗体片段可通过单价scFvs的结合自发形成，或可通过肽连接子(例如二价sc(Fv)2)偶合单价scFvs来产生。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指试图改变所治疗的个体的天然病程的临床干预，且可为实现预防或在临床病理学病程期间进行。所需治疗作用包括(但不限于)预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病状和缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体或抗体片段是用以迟缓疾病的发展或减慢疾病的进展。在特定实施例中，本发明的抗体或抗体片段用于预防肿瘤增殖的出现或复发、缓解与肿瘤进展或消退相关的症状、削弱与癌症相关的任何直接或间接病理学结果、预防肿瘤转移、增强肿瘤消退、减少或抑制肿瘤进展和诱导缓解或改善预后。
如本文所用，术语“肿瘤”是指所有瘤性细胞生长和增生(无论恶性或良性)，和所有癌前和癌细胞以及组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”不为互相排斥的，如本文中所提及。
如本文所用，术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)可变域一般具有类似结构，其中各域均包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人.Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页,(2007).)单一VH或VL域可足以赋予抗原结合专一性。此外，可使用VH或VL域自结合抗原的抗体分离结合特定抗原的抗体或抗体片段以分别筛选互补VL或VL域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.,第150卷,第880-887页,1993；Clarkson等人,Nature,第352卷,第624-628页,1991。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播至其所连接的另一个核酸的核酸分子。所述术语包括呈自我复制核酸结构的载体以及并入其已引入的宿主细胞的基因体中的载体。某些载体能够导引可操作地连接其的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
具体实施方式
本申请案要求保护于2020年11月12日申请的美国临时申请案第63/113,040号的的优先权，其全部公开内容具体地以引用的方式并入本文中。
出于说明的目的，通过参考各种示范性实施例来描述本发明的原理。尽管在本文中具体描述本发明的某些实施例，但所属领域的一般技术人员将易于认识到相同原理同样适用于且可用于其它系统和方法中。在详细解释本发明所公开的实施例之前，应了解，本发明不将其应用限制于所显示的任何特定实施例的细节。此外，本文所使用的术语是出于描述而非限制的目的。此外，尽管参考以一定次序呈现于本文中的步骤来描述某些方法，但在许多情况下，可按可为熟习所属领域者理解的任何次序进行此些步骤；因此，新颖方法不限于本文中所公开的特定步骤排列。
须注意，除非上下文另外明确指示，否则如本文和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括多个(种)指示物。此外，术语“一(a或an)”、“一或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换使用。术语“包含”、“包括”、“具有”和“构建自”也可互换使用。
除非另外规定，否则说明书和权利要求书所使用的表示成分的数量、例如分子量、百分比、比率、反应条件等等的特性的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰，无论所述术语“约”是否存在。因此，除非有相反指示，否则说明书和权利要求书中所阐述的数值参数为近似值，其可视本发明设法获得的所需特性而变化。至少，且不试图将均等论的应用限于权利要求书的范围，各数值参数至少应根据所报道的有效数字的个数且通过应用普通舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但尽可能精确地报告特定实例中所阐述的数值。然而，任何数值均固有地含有因其对应测试测量值中发现的标准差所必然引起的某些错误。
应理解，本文所公开的各组分、化合物、取代基或参数均应解释为单独或与本文所公开的每一其它组分、化合物、取代基或参数中的一或多者组合使用而进行公开。
也应理解，本文所公开的各组分、化合物、取代基或参数的各量/值或量/值的范围应解释为也与针对本文公开的任何其它组分、化合物、取代基或参数所公开的各量/值或量/值的范围组合进行公开，且因此，任何两种或更多种本文所公开的组分、化合物、取代基或参数的量/值或量/值的范围的组合也出于本说明书的目的彼此组合进行公开。
应进一步理解，本文公开的各范围的各下限解释为与本文针对相同组分、化合物、取代基或参数所公开的各范围的各上限的组合进行公开。因此，两个范围的公开内容解释为通过组合各范围的各下限与各范围的各上限所衍生的四个范围的公开内容。因此，三个范围的公开内容解释为通过组合各范围的各下限与各范围的各上限所衍生的九个范围的公开内容等。此外，本说明书或实例中所公开的组分、化合物、取代基或参数的特定量/值应解释为范围的下限或上限的公开内容，且因此可与范围的任何其它下限或上限或本申请案中别处所公开的相同组分、化合物、取代基或参数的特定量/值组合，以形成所述组分、化合物、取代基或参数的范围。
抗Axl抗体或抗体片段的区域
在一方面中，本发明提供一种特异性结合于Axl蛋白质的经分离多肽，以及所述多肽在治疗表达Axl的肿瘤的方法中的用途，其涉及向需要此类治疗的人类施用多肽。
本发明的多肽包括六个互补决定区H1、H2、H3、L1、L2和L3，其中：
H1序列为X1GX2X3MX4(SEQ ID NO:1)(X1、X2、X3和X4各自独立地表示氨基酸)：其中
X1为T或A或W，
X2为H或A，
X3为T或I，且
X4为N或I；
H2序列为LIKX5SNGGTX6YNQKFKG(SEQ ID NO:2)(X5和X6各自独立地表示氨基酸)：其中
X5为P或N，且
X6为S或I或T；和
H3序列为GX7X8X9X10X11X12X13X14DYX15X16(SEQ ID NO:3)(X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15和X16各自独立地表示氨基酸)：其中
X7为H或D或E或P或R或W，
X8为Y或N，
X9为E或A或D或F或G或H或I或L或M或N或R或V或Y，
X10为S或D或M或N或Q，
X11为Y或C或E或P，
X12为F或E或N或S或T或V，
X13为A或D或G或L或Y，
X14为M或E或F，
X15为W或A或D或H或L或N或P或R或T，且
X16为G或H，
L1序列为KASQDX17X18SX19VX20(SEQ ID NO:4)(X17、X18、X19和X20各自独立地表示氨基酸)：其中
X17为V或D或G或N或W，
X18为S或V，
X19为A或L或M，且
X20为A或D或N或Q；
L2序列为X21X22X23TRX24T(SEQ ID NO:5)(X21、X22、X23和X24各自独立地表示氨基酸)：其中
X21为W或F，
X22为A或I或N或P或Q，
X23为S或D，且
X24为H或D；和
L3序列为QEX25X26SX27X28X29X30(SEQ ID NO:6)(X25、X26、X27、X28、X29和X30各自独立地表示氨基酸)：其中
X25为H或C或F或I或L或Q或S或T或V或Y，
X26为F或C或D或E或G或N或S，
X27为T或C或P，
X28为P或A或C或D或E或H或K或S或T或V或W，
X29为L或G或R，且
X30为T或I或R，和
本发明的多肽不包括具有以下六个CDR的亲本多肽：
H1＝TGHTMN，
H2＝LIKPSNGGTSYNQKFKG，
H3＝GHYESYFAMDYWG，
L1＝KASQDVSSAVA，
L2＝WASTRHT，和
L3＝QEHFSTPLT。
在另一方面中，本发明提供如上文所描述的经分离多肽，其相对于亲本多肽在CDRH1、H2和H3中具有至多一个取代，且相对于亲本多肽在CDR L1、L2和L3中具有至多一个取代。此包括相对于亲本多肽在CDR H1、H2和H3中具有一个取代的经分离多肽，相对于亲本多肽在CDR L1、L2和L3中具有一个取代的经分离多肽，和相对于亲本多肽在CDR H1、H2和H3中具有一个取代且相对于亲本多肽在CDR L1、L2和L3中具有一个取代的经分离多肽。CDR H1、H2和H3的可能组合展示于图1A中，以及CDR L1、L2和L3的可能组合展示于图1B中。
重链可变区的比对展示于图1A中，其中互补决定区H1、H2和H3加框。
轻链可变区的比对展示于图1B中，其中互补决定区L1、L2和L3加框。
本发明使用美国专利第8,709,755号中所公开的方法鉴别此些来自亲本抗体的经分离的重链可变区多肽和经分离的轻链可变区多肽。亲本抗体(063-hum10F10)的重链可变区和轻链可变区也在图1A-1B中比对，以展示经分离的重链可变区多肽和经分离的轻链可变区多肽中的突变。
编码野生型抗体的DNA使用综合位置演进(CPE)进化而产生突变体抗体文库，模板抗体中的各位置一次随机分组一个。文库中的各突变体抗体仅具有一个单点突变。所述文库中的突变体抗体是通过ELISA在pH 6.0和pH 7.4下同时筛选对Axl的选择性结合亲和力而产生。使用两种突变体抗体稀释：1:3和1:9稀释。在1:3或1:9稀释下，将在pH 6.0下与在pH 7.4下具有至少1.5结合亲和力比的突变体抗体选择为条件性活性抗体，其中在重链和轻链可变区中的每一者中指示单一点突变(表1和2)。
表1：条件性活性抗Axl抗体重链可变区
表2：条件性活性抗Axl抗体轻链可变区
/>
在另一方面中，本发明识别图1A中表示的重链可变区和图1B中呈现的轻链可变区。一些重链可变区由具有SEQ ID NO:11-13的DNA序列编码。一些轻链可变区由具有SEQID NO:7-10的DNA序列编码。此些重链和轻链可变区可特异性结合于Axl。已发现包含此些重链和轻链可变区中的一者的抗体与Axl在肿瘤微环境中的pH下比在非肿瘤微环境中的pH下具有更高的结合亲和力。
本发明也包括图1A-1B中呈现的重链和轻链可变区的变异体，且由可特异性结合于Axl的具有SEQ ID NO:9-13的DNA序列编码。为得到此些变异体，确定重链可变区(H1-H3)的互补决定区(CDR)和轻链可变区(L1-L3)的CDR应保持完整。
在得到此些变异体时，通过如本文所描述的方法引导。此些重链和轻链可变区的变异体可通过将适当修饰引入至编码重链和轻链可变区的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如缺失抗体或抗体片段的氨基酸序列内的残基，和/或插入至所述残基中和/或取代所述残基。可产生缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构筑体，前提是所述最终构筑体具有所需特征中的至少一者，例如抗原结合。
取代、插入和缺失变异体
在某些实施例中，提供具有一或多个氨基酸取代的抗体或抗体片段变异体。用于取代型突变诱发的相关位点包括CDR和构架区(FR)。保守取代展示于表3中的“保守取代”标题下。更多实质性变化以标题“示范性取代”提供于表3中，且参考氨基酸侧链类别在下文进一步描述。氨基酸取代可引入至相关抗体或抗体片段中且针对所需活性，例如保留/改进的抗原结合或降低的免疫原性来筛检产物。
表3：氨基酸取代
/>
氨基酸可根据共有侧链特性来进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将引起此些类别中的一者的成员换成另一个类别。
一种类型的取代型变异体涉及取代亲本抗体(例如人类化或人类抗体)的一或多个高变区残基。一般来说，经选择以用于进一步研究的一或多个所得变异体相对于亲本抗体而言将在某些生物特性方面具有修饰(例如改善)(例如亲和力提高、免疫原性降低)和/或将大体上保持亲本抗体的某些生物特性。一种示范性取代型变异体为亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体呈现的亲和力成熟技术(例如本文所描述的那些技术)便利地产生。简言的，使一或多个CDR残基突变，且在噬菌体上呈现变异体抗体且针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
改变(例如取代)可于CDR中进行以例如改善抗体亲和力。此类改变可在CDR“热点(hotspot)”中，即，由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.第207卷,第179-196页,2008)和/或SDR(a-CDR)中进行，并测试所得变异体VH或VL的结合亲和力。通过构筑二级文库和自文库再选择达成的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology，第178卷，第1-37页，2001)中。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的突变诱发)中的任一者将多样性引入至所选用于成熟的可变基因中。随后产生二级文库。随后筛选所述文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变异体。引入多样性的另一方法涉及CDR导引途径，其中将若干CDR残基(例如一次4-6个残基)随机分组。涉及抗原结合的CDR残基可特定鉴别，例如使用丙氨酸扫描突变诱发或模型化来鉴别。常常尤其以CDR-H3和CDR-L3为目标。
在某些实施例中，一或多个HVR内可存在取代、插入或缺失，只要此类改变不大体上降低抗体或抗体片段结合抗原的能力即可。举例来说，不大体上降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文所提供的保守性取代)可以在CDR中进行。此类改变可在CDR“热点”或SDR外。在上文所提供的变异体VH和VL序列的某些实施例中，各CDR未改变或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells,Science,第244卷,第1081-1085页,1989中所描述，适用于鉴别可针对突变诱发进行靶向的抗体残基或区的方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”。在此方法中，鉴别出一个残基或一组目标残基(例如带电荷残基，例如arg、asp、his、lys和glu)且将其置换为中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)以确定抗体或抗体片段与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体或抗体片段与抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可作为取代候选物的标靶或排除在取代候选物的外。可筛选变异体以确定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或超过一百个残基的多肽范围内的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体的其它插入变异体包括抗体N末端或C末端与延长抗体血清半衰期的酶(例如针对ADEPT)或多肽的融合物。
考虑本文所描述的抗体的一或多个氨基酸序列修饰。举例来说，可能需要改进抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。已知在通过简单地仅接枝来源于非人类动物的抗体的VH和VL中的CDR于人类抗体的VH和VL的FR中产生人源化抗体时，抗原结合活性相比来源于非人类动物的原始抗体降低。认为非人类抗体的VH和VL的若干氨基酸残基不仅在CDR中而且在FR中与抗原结合活性直接或间接相关。因此，用源自人类抗体的VH和VL的FR的不同氨基酸残基取代此些氨基酸残基将降低结合活性。为解决所述问题，在移植人类CDR的抗体中，试图鉴别人类抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中的与结合于抗体直接相关，或与CDR的氨基酸残基相互作用，或维持抗体的三维结构和与结合于抗原直接相关的氨基酸残基。降低的抗原结合活性可通过用源自非人类动物的原始抗体的氨基酸残基替换鉴别的氨基酸而增加。
修饰和变化可于本发明抗体的结构中和于编码其的DNA序列中进行，且仍可获得具有所需特征的编码抗体的功能分子。
在氨基序列中进行所述变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在对蛋白赋予相互作用生物功能上的重要性为所属领域中一般所理解。公认氨基酸的相对亲水性促成所得蛋白质的二级结构，所述二级结构又界定蛋白质与其它分子(例如酶、受质、受体、DNA、抗体、抗原和其类似物)的相互作用。各氨基酸已基于其疏水性和电荷特征指定亲水指数，此些亲水指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本发明的另一目的也涵盖本发明抗体的功能保守性变异体。
“功能保守性变异体”是其中在不改变多肽的总体构形和功能下，变化蛋白质或酶中的给定氨基酸残基的所述变异体，包括(但不限于)用具有类似特性(例如极性、氢键结潜能、酸性、碱性、疏水性、芳香族性和其类似物)的一者置换氨基酸。除指示为保守氨基酸外的氨基酸的蛋白质可不同，以使得如根据比对方案通过例如丛集法(Cluster Method)所测定，具有类似功能的两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似性百分比可变化且可为例如70％至99％，其中相似性是基于MEGALIGN算法。“功能保守性变异体”也包括如通过BLAST或FASTA算法所测定，具有至少60％、优选地至少75％、更优选地至少85％、又优选地至少90％且甚至更优选地至少95％氨基酸一致性且具有与其相比较的天然或亲本蛋白质相同或大体上类似的特性或功能的多肽。
两个氨基酸序列在相对于较短序列的全长，氨基酸的大于80％、优选大于85％、优选大于90％一致，或大于约90％、优选大于95％类似(功能相同)时是“大体上同源的”或“大体上类似的”。优选地，类似或同源序列通过使用例如GCG(遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，Program Manual for the GCG Package,第7版,Madison,Wis.)堆积程式或例如BLAST、FASTA等序列比较算法中的任一种进行比对来鉴别。
举例来说，某些氨基酸可经蛋白质结构中的其它氨基酸取代而不会显着损失活性。因为蛋白质的相互作用能力和性质界定蛋白质生物功能活性，所以某些氨基酸取代可在蛋白质序列中进行，且当然在其DNA编码序列中进行，同时却获得具有类似特性的蛋白质。因此，预期可在本发明的抗体或抗体片段的序列或编码所述抗体或抗体片段的相应DNA序列中进行各种变化而不会显着损失其生物活性。
所属领域中已知某些氨基酸可经具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸取代，而仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物学功能上等效的蛋白质。
如上文所概述，氨基酸取代因此一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小和其类似形式。考虑多种前述特征的示范性取代为熟习所属领域者所熟知，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
糖基化变异体
在某些实施例中，对本文所提供的抗体进行改变以增加或降低所述抗体经糖基化的程度。向抗体中添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以便产生或去除一或多个糖基化位点来便利地实现。
在抗体包含Fc区的情况下，可改变连接于其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的原生抗体通常包含分支链双触角寡糖，其通常通过N键连接至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright等人.TIBTECH,第15卷,第26-32页,1997。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至双触寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以便产生具有某些改进特性的抗体变异体。
在一个实施例中，提供具有缺乏连接(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变异体。举例来说，此类抗体中的岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％，或20％至40％。岩藻糖的量是通过计算糖链内Asn297处的岩藻糖的平均量来确定，此平均量是相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的连接至Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和而言，如例如WO 2008/077546中所描述。Asn297是指位于Fc区中的约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变异体可具有改进的ADCC功能。参见例如美国专利公开案第US 2003/0157108号(Presta,L.)；第US 2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。关于“去岩藻糖基化”或“缺乏岩藻糖”的抗体变异体的公开案的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人.J.Mol.Biol.,第336卷,第1239-1249页,2004；Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.,第87卷,第614-622页,2004。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.第249卷，第533至545页，1986；美国专利申请案第US 2003/0157108A号；和WO 2004/056312A1，尤其实例11)，和基因剔除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因剔除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.第87卷，第614至622页，2004；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,第94卷，第680至688页，2006；和WO2003/085107)。
抗体变异体进一步具备平分寡糖，例如其中连接于抗体的Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc平分。此类抗体变异体可具有减少的岩藻糖基化和/或经改进的ADCC功能。此类抗体变异体的实例描述于例如WO 2003/011878；美国专利第6,602,684号；和US 2005/0123546中。也提供寡糖中的至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变异体。此类抗体变异体可具有经改进的CDC功能。所述抗体变异体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO1999/22764中。
Fc区变异体
在某些实施例中，可将一或多个氨基酸修饰引入本文所提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变异体。Fc区变异体可包含人类Fc区序列(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施例中，本发明涵盖具有一些而非所有效应功能的抗体变异体，由此使得所述抗体成为对于其中活体内抗体半衰期至关重要，而某些效应功能(例如ADCC)为不必要或有害的应用合乎需要的候选物。可进行活体外和/或活体内细胞毒性分析以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核球表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.第9卷,第457-492页,1991的第464页的表5中。评估所关注分子的ADCC活性的活体外分析的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(也参见例如Hellstrom等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,第83卷,第7059至7063页,1986)和Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,第82卷,第1499至1502页,1985；美国专利第5,821,337号(也参见Bruggemann等人,J.Exp.Med.,第166卷,第1351至1361页,1987)中。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞测量术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.；和CytoTox非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,Wis.)。适用于此类分析的效应细胞包括周边血液单核球(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者或另外，可在活体内，例如在动物模型(例如Clynes等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,第95卷，第652-656页，1998中所公开的动物模型)中评估所关注分子的ADCC活性，也可进行C1q结合分析以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods,第202卷，第163至171页，1996；Cragg,M.S.等人,Blood,第101卷，第1045至1052页，2003；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood,第103卷，第2738至2743页，2004)。也可使用所属领域中已知的方法(参见例如Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.,第18卷，第1759-1769页，2006)进行FcRn结合和活体内清除率/半衰期测定。
效应功能减小的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一或多者发生取代的那些抗体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包括具有氨基酸位置265、269、270、297和327中的两者或更多处的取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
描述具有提高或降低的与FcR的结合的某些抗体变异体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312和Shields等人,J.Biol.Chem.,第9卷，第6591-6604页，2001)。
在某些实施例中，抗体变异体包含Fc区，其具有改进ADCC的一或多个氨基酸取代，例如Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)的取代。
在一些实施例中，在Fc区中进行使C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减弱)的改变，例如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.,第164卷，第4178至4184页，2000中所描述。
半衰期增加且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等人,J.Immunol.,第117卷，第587-593页，1976；和Kim等人,J.Immunol.,第24页，第249页，1994)的结合改善的抗体描述于US2005/0014934中。那些抗体包含其中具有一或多个取代的Fc区，所述取代改进Fc区与FcRn的结合。此类Fc变异体包括在以下Fc区残基中的一或多者处具有取代的所述变异体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利编号7,371,826)。关于Fc区变异体的其它实例，也参见Duncan和Winter,Nature,第322卷，第738-740页，1988；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；和WO 94/29351。
半胱氨酸工程改造的抗体变异体
在某些实施例中，可能需要产生半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫基MAb(thioMAb)”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，经取代的残基存在于抗体的可近接位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基进而定位于抗体的可近接位点且可用于使抗体与其它部分(例如药物部分或连接子-药物部分)结合以产生如本文中进一步描述的免疫结合物。在某些实施例中，以下残基中的任一或多者可经半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(Eu编号)；和重链Fc区的5400(Eu编号)。半胱氨酸工程改造的抗体可如例如美国专利第7,521,541号中所描述产生。
抗体衍生物
在某些实施例中，本文中所提供的抗体或抗体片段可经进一步修饰以含有所属领域中已知且可易于获得的额外非蛋白质部分。适用于抗体或抗体片段衍生作用的部分包括(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛因其于水中的稳定性而可在制造中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支链或未分支链。连接于抗体或抗体片段的聚合物数目可为变化的，和如果连接超过一个聚合物，那么其可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生作用的聚合物的数目和/或类型可基于包括(但不限于)待改进的抗体或抗体片段的特定特性或功能、衍生物是否将用于限定条件下的疗法等考虑因素来确定。
在另一实施例中，提供抗体或抗体片段与可通过暴露于放射选择性地加热的非蛋白质部分的结合物。在一个实施例中，非蛋白质部分为碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第102卷，第11600-11605页，2005)。放射可具有任何波长，且包括(但不限于)不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热至杀死抗体-非蛋白质部分近侧的细胞的温度的波长。
在另一方面中，本发明提供一种抗Axl抗体或抗体片段，其包括经分离的重链可变区多肽或经分离的轻链可变区多肽。经分离的重链可变区多肽包含分别具有SEQ ID NO:1-3的H1、H2和H3区。经分离的轻链可变区多肽包含分别具有SEQ ID NO:4-6的L1、L2和L3区。
相比于在非肿瘤微环境中的条件下，本发明的抗Axl抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件下对Axl具有较高结合亲和力。在一个实施例中，肿瘤微环境中的条件和非肿瘤微环境中的条件均为pH值。本发明的抗Axl抗体或抗体片段因此可在约5至6.8的pH下选择性结合于Axl，但在正常生理环境中遇到pH为7.2至7.8时将对Axl具有较低结合亲和力。如实例3至4所示，抗Axl抗体或抗体片段在pH 6.0下、在pH 7.4下具有较高结合亲和力。
在某些实施例中，在肿瘤微环境中，本发明的抗Axl抗体或抗体片段与Axl的解离常量(Kd)约≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或更低，或10-8M至10-13M，或10-9M至10-13M)。在一个实施例中，抗体或抗体片段与Axl在肿瘤微环境中的条件值的Kd与在非肿瘤微环境中的同一条件的不同值的Kd的比率至少约为1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
在一个实施例中，Kd通过放射性标记的抗原结合分析(RIA)测量，所述分析利用相关抗体的Fab型式和其抗原使用以下分析进行。Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过以下来测量：在未标记抗原的滴定系列存在下使Fab与最低浓度的(125I)标记抗原相平衡，随后用经抗Fab抗体涂布的培养盘捕捉结合抗原(参见例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为确立分析条件，将多孔盘(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉抗Fab抗体(Cappel Labs)涂布过夜，且随后在室温(约23℃)下用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭两小时至五小时。在无吸附剂培养盘(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与所关注的Fab的连续稀释液混合(例如与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中对抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。接着将相关Fab培育过夜；然而，培育可持续较长时间段(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，在室温下将混合物转移至捕捉培养盘中以用于培育(例如持续一小时)。随后去除溶液且用含0.1％聚山梨醇酯20/>的PBS洗涤培养盘八次。当盘干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对盘计数十分钟。选择提供小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合分析。
根据另一实施例，Kd使用表面等离子体子共振分析在25℃下使用具有约10个反应单位(RU)的固定抗原CM5芯片的-2000或/>-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)来测量。简言的，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羧甲基化聚葡萄糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)活化。用10mM乙酸钠(pH 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后在5μl/分钟的流动速率下注射以获得大约10个反应单位(RU)的偶合蛋白质。在注入抗原后，注入1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃下以大约25μl/min的流动速率注射Fab于含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一朗格缪尔结合模型(one-to-one Langmuirbinding model)(/>评估软件3.2版)通过同时拟合缔合和解离感测图谱来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常量(Kd)按比率koff/kon来计算。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体子共振分析法得到的结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用萤光淬灭技术测定，所述技术是测量PBS(pH7.2)中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25℃、在浓度递增的抗原存在下的萤光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如用光谱仪(例如具有搅拌式比色管的止流装备型光谱光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM光谱光度计(ThermoSpectronic))所测量。
本发明的抗Axl抗体可为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。在一个实施例中，采用抗Axl抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体或F(ab')2片段和由抗体片段形成的多特异性抗体。在另一实施例中，抗体为全长抗体，例如完整IgG抗体或如本文中所定义的其它抗体类别或同型。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.第9卷,第129-134页,2003。a关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269至315页,(1994)；也参见WO93/16185；和美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。关于包含救助受体结合抗原决定基残基且具有增加的活体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的论述，参见美国专利第5,869,046号。
本发明的双功能抗体可为二价的或双特异性的。关于双功能抗体的实例，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.,9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第90卷，第6444-6448页，1993。三功能抗体和四功能抗体的实例也描述于Hudson等人,Nat.Med.,第9卷,第129-134页,2003中。
在一些实施例中，本发明包含单域抗体片段，其包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分。在某些实施例中，单域抗体为人类单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利第6,248,516B1号)。
抗体片段可通过各种技术制得，包括(但不限于)蛋白分解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所描述。
在一些实施例中，本发明的抗Axl抗体可为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第81卷,第6851-6855页,1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物(例如猴)的可变区)和人类恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中相对于亲本抗体的类别或子类，所述抗体的类别或子类已有所变化。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中，本发明的嵌合抗体是人类化抗体。通常，对非人类抗体进行人类化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。一般来说，人类化抗体包含一或多个可变域，其中CDR(或其部分)源自非人类抗体，且FR(或其部分)源自人类抗体序列。人类化抗体可任选地也包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的对应残基取代，例如用以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人类化抗体和其制造方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.,第13卷，第1619至1633页，2008中，且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature,第332卷，第323至329页，1988；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,第86卷，第10029至10033页，1989；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；Kashmiri等人,Methods,第36卷，第25至34页，2005(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.,第28卷，第489至498页，1991(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods,第36卷，第43至60页，2005(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods,第36卷，第61至68页，2005和Klimka等人,Br.J.Cancer,第83卷，第252至260页，2000(描述FR改组的“导引选择”途径)中。
可用于人类化的人类构架区包括(但不限于)：使用“最优选拟合”法选择的构架区(参见例如Sims等人,J.Immunol.第151卷，第2296页，1993)；来源于具有轻链或重链可变区的特定子组的人类抗体的共有序列的构架区(参见例如Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第89卷，第4285页，1992；和Presta等人,J.Immunol.,第151卷，第2623页，1993)；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.,第13卷，第1619-1633页，2008)；和来源于筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.,第272卷，第10678-10684页，1997和Rosok等人,J.Biol.Chem.,第271页，第22611-22618页，1996)。
在一些实施例中，本发明的抗Axl抗体为多特异性，例如双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性中的一者是针对Axl且另一者是针对另一抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合于Axl的两个不同抗原决定基上。双特异性抗体也可用于使细胞毒性剂定位于表达Axl的细胞上。双特异性抗体可以全长抗体或抗体片段形式制备。
用于制造多特异性抗体的技术包括(但不限于)具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature,第305卷，第537-540页，1983),WO 93/08829，和Traunecker等人，EMBO J.第10卷，第3655-3659页，1991)和“杵-臼结构(knob-in-hole)”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体也可通过以下制备：工程改造静电导向效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号和Brennan等人,Science,第229卷，第81-83页，1985)；使用亮氨酸拉链制造双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,第148卷，第1547-1553页，1992)；使用“双功能抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第90卷，第6444-6448页，1993)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,第152卷，第5368-5374页，1994)；以及如例如Tutt等人,J.Immunol.,第147卷，第60-69页，1991中所描述制备三特异性抗体。
本文也包括具有三个或更多个功能抗原结合位点的经工程改造的抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
抗体或抗体片段也可包括“双作用Fab”或“DAF”，其包含结合于Axl的抗原结合位点以及另一不同抗原(参见例如US 2008/0069820)。
本发明的抗Axl抗体或抗体片段可使用重组方法和组合物产生，其详细描述于US2016/0017040中。
本发明的抗Axl抗体或抗体片段的物理/化学特性和/或生物活性可通过所属领域中已知的各种分析来测试和测量。一些此些分析描述于美国专利第8,853,369号中。
免疫结合物
在另一方面中，本发明也提供免疫结合物，其包含与一或多种细胞毒性剂结合的抗Axl抗体或抗体片段，所述细胞毒性剂是例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一个实施例中，免疫结合物为抗体-药物结合物(ADC)，其中抗体结合于一或多种药物，包括(但不限于)类美登素(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥瑞他汀(auristatin)，例如单甲基阿瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利第5,635,483号和第5,780,588号，以及第7,498,298号)；海兔毒素；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号和第5,877,296号)；Hinman等人，Cancer Res.,第53卷，第3336-3342页，1993；和Lode等人，Cancer Res.,第58卷，第2925-2928页，1998)；蒽环霉素，例如柔红霉素或小红莓(参见Kratz等人，CurrentMed.Chem.,第13卷，第477-523页，2006；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters,第16卷，第358-362页，2006；Torgov等人，Bioconj.Chem.,第16卷，第717-721页，2005；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第97卷，第829-834页，2000；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters,第12卷，第1529-1532页，2002；King等人，J.Med.Chem.,第45卷，第4336-4343页，2002；和美国专利第6,630,579号)；甲氨喋呤；长春地辛；紫杉烷，例如多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；霉菌毒素(trichothecene)；和CC1065。在另一实施例中，免疫结合物包含结合于酶促活性毒素或其片段的如本文所描述的抗体或抗体片段，所述酶促活性毒素或其片段包括(但不限于)白喉A链(diphtheria A chain)、白喉毒素(diphtheria toxin)的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链(ricin A chain)、相思子毒素A链(abrin A chain)、莫迪素A链(modeccin Achain)、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族毒素。
在另一实施例中，免疫结合物包含与放射性原子结合以形成放射性结合物的如本文所描述的抗体。多种放射性同位素可用于制造放射性结合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性结合物用于检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如tc99m或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(也称磁共振成像，MRI)的自旋标记，又例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可使用多种双官能蛋白质偶合剂制得抗体与细胞毒性剂的结合物，所述双官能蛋白质偶合剂是例如N-丁二酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚氨基-4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science,第238卷,第1098页,1987中所描述来制备。碳14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于使放射性核苷酸与抗体结合的示范性螯合剂。参见WO94/11026。连接子可为在细胞中促进细胞毒性药物释放的“可裂解连接子”。举例来说，可使用酸不稳定性连接子、肽酶敏感性连接子、光不稳定性连接子、二甲基连接子或含二硫键的连接子(Chari等人,Cancer Res.,第52卷,第127至131页,1992；美国专利第5,208,020号)。
本文的免疫结合物明确涵盖(但不限于)用交联试剂制备的结合物，所述交联试剂包括(但不限于)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SLAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC和磺酸基-SMPB，和SVSB(丁二酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，所述交联试剂可购得(例如购自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,Ill.,U.S.A)。
ADC的示范性实施例包含抗体(Ab)，其靶向肿瘤细胞、药物部分(D)和使Ab与D连接的连接子部分(L)。在一些实施例中，抗体经由一或多个氨基酸残基，例如赖氨酸和/或半胱氨酸附接于连接子部分(L)。
示范性ADC具有式I：Ab-(L-D)p，其中p是1至约20。在一些实施例中，可结合至抗体的药物部分的数目受游离半胱氨酸残基的数目限制。在一些实施例中，游离半胱氨酸残基通过本文所描述的方法引入抗体氨基酸序列中。示范性式I的ADC包括(但不限于)具有1、2、3或4个经工程改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon等人，Methods in Enzym.,第502卷，第123至138页，2012)。在一些实施例中，一或多个游离半胱氨酸残基不使用工程改造已存在于抗体中，在此情况下现有游离半胱氨酸残基可用于将抗体结合于药物。在一些实施例中，抗体在抗体结合前暴露于还原条件以产生一或多个游离半胱氨酸残基。
本发明涵盖包含条件性活性生物(CAB)抗Axl抗体的抗体-药物结合物(ADC)，其经由可裂解连接子(CAB-Axl-ADC)与至少一个药物部分结合，和其用于治疗表达Axl的肿瘤的用途。此类ADC是优选以医药组合物或试剂盒形式递送至需要治疗的个体。在一些实施例中，药物部分为至少一种细胞毒性剂，例如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)。CAB-Axl抗体可经由与MMAE(与海兔毒素10的合成类似物，抗微管蛋白剂)偶合的可裂解肽连接子且以接近4的药物与抗体比率(DAR)来与抗体的重链和轻链中的半胱氨酸化学结合。在一些实施例中，包含抗Axl抗体的抗体药物结合物经由vc-PAB连接子共价连接于MMAE。结合之后，CAB-Axl-ADC内化至肿瘤细胞中，其中肽连接子通过蛋白酶裂解而释放MMAE。预期MMAE特定递送至表达Axl的肿瘤细胞以预防进一步肿瘤细胞增殖，且使肿瘤缩小。
在一些实施例中，抗体药物结合物以医药组合物形式递送至个体。
在一些实施例中，CAB-Axl-ADC为Ab-可裂解连接子-MMAE(n)，其中MMAE为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，且(n)为1与4之间(包括端点)的整数。本发明的示范性CAB-Axl-ADC具有以下化学结构：
或其药学上可接受的盐，其中Ab为抗Axl抗体且S为所述抗体的硫原子。
在一些实施例中，CAB-Axl-ADC包含若干不同部分，包括mAb(作为Ab部分)、与半胱氨酸结合的顺丁烯二酰亚胺(MC)和含有缬氨酸和瓜氨酸(vc)且后接MMAE的可裂解肽连接子。举例来说，CAB-Axl-ADC是mAb-可裂解连接子-MMAE(n)。优选地，mAbBA3011-MC-vc-PAB-MMAE抗体-药物结合物为条件性活性生物(CAB)抗Axl人类化单克隆抗体(mAb)(免疫球蛋白IgG1)，其经由包含二肽缬氨酸-瓜氨酸(vc)的可裂解连接子结合至单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，而所述二肽缬氨酸-瓜氨酸又连接至对氨基苯甲基醇(PAB)(自分解型部分)(CAB-Axl-ADC)。抗体部分(mAb)BA3011经由硫氢基键连接于MC-vc-PAB-MMAE，且对Axl酪氨酸激酶生长因子抑制剂具有特异性，且在肿瘤微环境(TME)内发现的条件下特异性且可逆地结合于Axl，但在TME外部与Axl的结合有所降低；因此相对于正常细胞赋予肿瘤选择性优势。
抗体药物结合物(ADC)(其例如将强效细胞毒性剂或毒素连接至mAb)代表了较裸抗体治疗的进步，因为其提供在不增加毒性的情况下增强功效的潜力。已通过许可应用吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)以治疗CD33阳性急性骨髓白血病来证实临床效用。目前由美国食品与药物管理局(FDA)审批通过以下两种其它ADC：本妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin)/>和曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine)/>
本发明提供CAB抗体(以及其它生物制剂)，其优选在所定义的生理条件下结合至与不同疾病和组织相关的靶组织(例如肿瘤)。CAB的条件性和可逆结合经设计以降低肿瘤外毒性和免疫原性，避免组织介导的药物沉积，且改进药物动力学(PK)。举例来说，在癌症中，通过沃伯格(Warburg)描述的独特细胞代谢促成特殊微环境，例如低pH和高乳酸盐(沃伯格1924；沃伯格1956)。美波他单抗维多汀(Mecbotamab vedotin)(BA3011)为经研发用于晚期实体肿瘤患者的抗癌疗法的条件性活性生物抗AXL抗体结合物(CAB-AXL-ADC)。BA3011利用独特TME，且当非常接近表达Axl的肿瘤时优先与其靶结合；然而，在缺乏适当环境的条件下BA3011与Axl的结合有所降低。AXL为在若干肿瘤类型(包括肉瘤)中高度表达的细胞表面跨膜受体蛋白酪氨酸激酶。AXL表达的增加与对化学疗法、程序性死亡-1(PD-1)抑制剂、分子靶向疗法以及放射疗法的肿瘤抗性相关。如同BA3011的CAB的活化结合特性为可逆的，使得当其自病变转移至正常再至病变组织微环境时不会发生永久变化。BA3011是在不添加非抗体序列的情况下实现CAB特性的人类化mAb。
BA3011也可与检查点抑制剂组合施用，例如抗程序性死亡-1(PD-1)和抗程序性死亡配位体-1(PD-L1)治疗性抗体。一般来说，许多ADC(尤其使用MMAE作为细胞毒性有效负载的ADC)已与免疫肿瘤学(IO)疗法(戈贝尔(Gerber)2016)组合测试。肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡(ICD)由某些类别的细胞毒性化合物诱导且代表肿瘤的效应T细胞募集的有效刺激因子。另外，当与IO化合物组合时，数种细胞毒性药物直接刺激树突状细胞活化和成熟，从而改善抗肿瘤免疫反应。其中，目前将数种细胞毒性剂用作ADC的有效负载。因此，ADC和IO化合物的组合方案通过增加CD8+效应T细胞向肿瘤核心的募集来有望克服当前免疫检查点抑制剂的局限性。在临床研究方面，ADC-IO组合可对肿瘤学药物研发具有较广泛影响，因为IO化合物与ADC之间的协同活性可增加肿瘤特异性免疫记忆的形成，最终引起较大部分癌症患者的持久反应(科特斯(Coats)2019)。关于BA3011与检查点抑制剂组合，对PD-1疗法具有抗性的黑色素瘤患者的转录组分析揭露，一组上调基因涉及免疫抑止、血管生成、巨噬细胞趋化性、细胞外基质重塑和上皮-间质转化(EMT)。上调的基因尤其为BA3011标靶Axl(雨果(Hugo)2016；布(Bu)2016)。PD-1抗性肿瘤中Axl的上调强烈表明其在此群体中的抗性和复发中的作用，且为BA3011与PD-1抑制剂(例如纳武单抗(nivolumab))组合提供充分的理由。
示范性连接子
“连接子”(L)是可用以将一或多个例如药物部分(D)的部分连接于抗体(Ab)以形成例如式I的ADC的免疫结合物的双功能或多功能部分。在一些实施例中，ADC可使用具有用于共价连接于药物和抗体的反应性官能团的共价连接于药物和抗体的的连接子制备。举例来说，在一些实施例中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可与连接子或药物-连接物中间物的反应性官能团形成键以制备ADC。
在一个方面中，连接子具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应形成共价键的官能团。非限制性示范性此类反应性官能团包括顺丁烯二酰亚胺、卤乙酰胺、α-卤乙酰基、活化酯(例如丁二酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酸酐、酸氯化物、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。参见例如Klussman等人,Bioconjugate Chemistry第15卷,第765-773页,2004的第766页中的结合方法。
在一些实施例中，连接子具有能够使抗体上存在的亲电子基团反应的官能团。示范性此类亲电子基包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施例中，连接子的反应性官能团的杂原子可与抗体上的亲电子基反应且形成与抗体单元的共价键。非限制性示范性此类反应性官能团包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯和芳基酰肼。
连接子可包含一或多种连接子组分。示范性连接子组分包括6-顺丁烯二酰亚氨基己酰基(“MC”)、顺丁烯二酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苯甲氧基羰基(“PAB”)、N-丁二酰亚氨基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)和4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(“MCC”)。各种连接子组分为所属领域中已知，其中一些在下文中描述。
连接子可为“可裂解连接子”，有助于药物的释放。非限制性示范性可裂解连接子包括：酸不稳定连接子(例如，包含腙)、对蛋白酶敏感(例如，对肽酶敏感)的连接子、对光不稳的连接子或含二硫化物连接子(Chari等人，Cancer Research,第52卷,第127-131页,1992；美国专利第5,208,020号)。
在某些实施例中，连接子具有以下式II：-Aa-Ww-Yy-，其中A是“延伸子单元”，且a是0至1的整数；W是“氨基酸单元”，且w是0至12的整数；Y是“间隔子单元”，且y是0、1或2。包含式II的连接子的ADC具有式I(A)：Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p，其中Ab、D和p如上文针对式I所定义。此类连接子的示范性实施例描述于美国专利第7,498,298号中。
在一些实施例中，连接子组分包含将抗体连接于另一连接子组分或药物部分的“延伸子单元”(A)。非限制性示例性延伸子单元展示如下(其中波浪线指示共价连接于抗体、药物或额外连接子组分的位点)：
在一些实施例中，连接子组分包含“氨基酸单元”(W)。在一些此类实施例中，氨基酸单元允许连接子通过蛋白酶裂解，借此有助于药物在免疫结合物暴露于例如溶酶体酶的细胞内蛋白酶时自所述免疫结合物的释放(Doronina等人,Nat.Biotechnol.,第21卷,第778-784页,2003)。示范性氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示范性二肽包括(但不限于)缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)；和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示范性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含产生天然和/或微量氨基酸和/或非天然产生的氨基酸类似物的氨基酸残基，例如瓜氨酸。氨基酸单元可经设计和优化以用于通过例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤维蛋白溶酶蛋白酶的特定酶进行酶促裂解。
通常，肽型连接子可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可例如根据液相合成方法制备(例如，E.Schroder和K.Lübke(1965)“ThePeptides”,第1卷,第76-136页,Academic Press)。
在一些实施例中，连接子组分包含使抗体直接或经由延伸子单元和/或氨基酸单元连接于药物部分的“间隔子单元”(Y)。间隔子单元可为“自分解型”或“非自分解型”。“非自分解型”间隔子单元为在ADC裂解时部分或所有间隔子单元仍然结合于药物部分之间隔子单元。非自分解型间隔子单元的实例包括(但不限于)甘氨酸间隔子单元和甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。在一些实施例中，含有甘氨酸-甘氨酸间隔子单元的ADC通过肿瘤细胞相关蛋白酶进行酶裂解，使得甘氨酸-甘氨酸-药物部分自ADC的其余部分释放。在一些此类实施例中，甘氨酸-甘氨酸-药物部分在肿瘤细胞中进行水解步骤，因此自药物部分裂解甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。
“自分解型”间隔子单元允许释放药物部分。在某些实施例中，连接子之间隔子单元包含对氨基苯甲基单元。在一些此类实施例中，对氨基苯甲醇经由酰胺键连接至氨基酸单元，且在苯甲醇与药物之间得到氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人,Expert Opin.Ther.Patents,第15卷,第1087-1103页,2005)。在一些实施例中，间隔子单元包含对氨基苯甲氧基羰基(PAB)。在一些实施例中，包含自分解型连接子的ADC具有以下结构：
其中Q是-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；m是0至4范围内的整数；X可为一或多个额外间隔子单元或可不存在；且p在1至约20的范围内。在一些实施例中，p在1至10、1至7、1至5或1至4范围内。非限制性示范性X间隔子单元包括：
其中R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基。在一些实施例中，R1和R2各自为-CH3。
自分解型间隔子的其它实例包括(但不限于)电子学上类似于PAB基的芳香族化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利第7,375,078号；Hay等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,第9卷,第2237页,1999)和邻氨基苯甲基乙醛或对氨基苯甲基乙醛。在一些实施例中，可使用在酰胺键水解时进行环化之间隔子，例如经取代和未经取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人,Chemistry Biology,第2卷,第223页,1995)、经适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环系统(Storm等人,J.Amer.Chem.Soc.,第94卷,第5815页,1972)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人,J.Org.Chem.,第55卷,第5867页,1990)。药物连接至甘氨酸残基的α-碳是可适用于ADC的自分解型间隔子的另一实例(Kingsbury等人,J.Med.Chem.,第27卷,第1447页,1984)。
在一些实施例中，连接子L可为树突型连接子，用于经由分支链、多官能连接子部分将多于一个药物部分共价连接至抗体(Sun等人,Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters,第12卷,第2213-2215页,2002；Sun等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry,第11卷,第1761-1768页,2003)。树突状连接子可增加药物与抗体的摩尔比，即负载，其与ADC性能有关。因此，在抗体仅仅载有一个反应性半胱氨酸硫醇基情况下，可经由树突状连接子附接多个药物部分。
下文展示在式I的ADC的情况下非限制性示例性连接子：
其中R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基。在一些实施例中，R1和R2各自为-CH3。
其中n是0至12。在一些实施例中，n是2至10。在一些实施例中，n是4至8。
其它非限制性示范性ADC包括结构：
Y为：
各R独立地为H或C1-C6烷基；且n是1至12。
在一些实施例中，连接子经调节溶解性和/或反应性的基团取代。作为一非限制性实例，例如磺酸根(-SO3-)或铵的带电取代基可增加连接子试剂的水溶性且促进连接子试剂与抗体和/或药物部分的偶合反应，或促进Ab-L(抗体-连接子中间物)与D或D-L(药物-连接子中间物)与Ab的偶合反应，视用于制备ADC的合成途径而定。在一些实施例中，使连接子的一部分偶合至抗体且使连接子的一部分偶合至药物，且接着使Ab-(连接子部分)a偶合至药物-(连接子部分)b以形成式I的ADC。
本发明的化合物明确涵盖(但不限于)用以下连接子试剂制备的ADC：双-顺丁烯二酰亚氨基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-顺丁烯二酰亚氨基丙基氧基)-N-羟基丁二酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-顺丁烯二酰亚氨基己酰基氧基)丁二酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ-顺丁烯二酰亚氨基丁酰基氧基]丁二酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双-乙烯基砜(HBVS)、丁二酰亚氨基4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、间顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-顺丁烯二酰亚氨基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、丁二酰亚氨基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)、丁二酰亚氨基碘乙酸酯(SIA)、丁二酰亚氨基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-丁二酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-丁二酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、丁二酰亚氨基4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、丁二酰亚氨基4-(p-顺丁烯二酰亚氨基苯基)丁酸酯(SMPB)、丁二酰亚氨基6-[(β-顺丁烯二酰亚氨基丙酰氨基)己酸酯](SMPH)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC和磺酸基-SMPB以及丁二酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，且包括双-顺丁烯二酰亚胺试剂：二硫基双顺丁烯二酰亚氨基乙烷(DTME)、1,4-双顺丁烯二酰亚氨基丁烷(BMB)、1,4-双顺丁烯二酰亚氨基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双顺丁烯二酰亚氨基己烷(BMH)、双顺丁烯二酰亚氨基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(下文展示)和BM(PEG)3(下文展示)；酰亚胺酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些实施例中，双顺丁烯二酰亚胺试剂允许抗体中半胱氨酸的硫醇基连接于含硫醇的药物部分、连接子或连接子-药物中间物。与硫醇基反应的其它官能团包括(但不限于)碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫键、吡啶基二硫键、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
某些适用的连接子试剂可获自各种商业来源，例如Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Ill.),Molecular Biosciences Inc.(Boulder,Colo.)，或根据所属领域中描述的程序合成；例如在Toki等人,J.Org.Chem.,第67卷,第1866-1872页,2002；Dubowchik等人,Tetrahedron Letters,第38卷,第5257-60页,1997；alker,J.Org.Chem.,第60卷,第5352-5355页,1995；Frisch等人,Bioconjugate Chem.,第7卷,第180-186页,1995；美国专利第6,214,345号；WO 02/088172；US2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；和WO 04/032828中。
碳14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于使放射性核苷酸与抗体结合的示范性螯合剂。参见例如WO94/11026。
示范性药物部分
1)美登素和类美登素
在一些实施例中，免疫结合物包含结合于一或多个类美登素分子的抗体。类美登素为美登素的衍生物，且为通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。美登素首次自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离而得(美国专利案第3,896,111号)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，例如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利第4,151,042号)。合成类美登素公开于以下：例如美国专利第4,137,230号；第4,248,870号；第4,256,746号；第4,260,608号；第4,265,814号；第4,294,757号；第4,307,016号；第4,308,268号；第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,362,663号；和第4,371,533号。
类美登素药物部分为抗体-药物结合物中具有吸引力的药物部分，因为其：(i)通过发酵或发酵产物的化学改质或衍生，相对易于制备；(ii)易由适合于经由非二硫化物连接子结合于抗体的官能团衍生；(iii)在血浆中稳定；和(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适合于用作类美登素药物部分的某些类美登素为所属领域中已知，且可自天然来源根据已知方法分离，或使用基因工程改造技术产生(参见例如Yu等人,PNAS,第99卷,第7968-7973页,2002)。类美登素也可根据已知方法以合成方式制备。
示范性类美登素药物部分包括(但不限于)具有经改质的芳环的类美登素药物部分，例如：C-19-去氯(美国专利第4,256,746号)(例如通过氢化锂铝还原安莎霉素P2制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利第4,361,650号和第4,307,016号)(例如通过使用链霉菌或放线菌去甲基化或使用LAH去氯来制备)；和C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利第4,294,757号)(例如通过使用酰基氯酰化来制备)和在芳环其它位置具有改质的类美登素。
示范性类美登素药物部分也包括具有改质的类美登素药物部分，例如：C-9-SH(美国专利第4,424,219号)(例如通过使美登醇与H2S或P2S5反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美国专利第4,331,598号)；C-14-羟基甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利第4,450,254号)(例如由诺卡菌属(Nocardia)制备)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利第4,364,866号)(例如通过经链霉菌使美登醇转化来制备)；C-15-甲氧基(美国专利第4,313,946号和第4,315,929号)(例如自滑桃树(Trewia nudlflora)分离)；C-18-N-去甲基(美国专利第4,362,663号和第4,322,348号)(例如通过经链霉菌使美登醇去甲基化来制备)；和4,5-去氧(美国专利第4,371,533号)(例如通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。
类美登素化合物上的许多位置适用作连接位置。举例来说，酯键可通过使用常规偶合技术与羟基反应形成。在一些实施例中，反应可在具有羟基的C-3位置、经羟基甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置发生。在一些实施例中，键在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成。
类美登素药物部分包括具有以下结构的类美登素药物部分：
其中波浪线指示类美登素药物部分的硫原子共价连接至于ADC的连接子。各R可独立地为H或C1-C6烷基。使酰氨基连接至硫原子的亚烷基链可为甲烷基、乙烷基或丙基，即m为1、2或3(美国专利第633,410号、美国专利第5,208,020号，Chari等人,第52卷,第127-131页,1992；Liu等人,Proc.Nall.Acad.Sci.USA,第93卷,第8618-8623页,1996)。
本发明的ADC涵盖类美登素药物部分的所有立体异构体，即对掌性碳的R和S配置的任何组合(美国专利第7,276,497号；美国专利第6,913,748号；美国专利第6,441,163号；美国专利第633,410(RE39151)号；美国专利第5,208,020号；Widdison等人(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408)。在一些实施例中，类美登素药物部分具有以下立体化学：
类美登素药物部分的示例性实施例包括(但不限于)DM1；DM3；以及DM4，具有以下结构：
其中波浪线指示药物的硫原子共价连接于抗体-药物结合物的连接子(L)。
其中DM1经由BMPEO连接子连接于抗体的硫醇基的示例性抗体-药物结合物具有以下结构和缩写：
其中Ab是抗体；n是0、1或2；且p是1至约20。在一些实施例中，p为1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4。
含有类美登素的免疫结合物、其制备方法和其医疗用途公开于例如美国专利第5,208,020号和第5,416,064号；US 2005/0276812 A1；和欧洲专利EP 0 425 235 B1中。也参见Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第93卷,第8618-8623页,1996；和Chari等人,CancerResearch,第52卷,第127-131页,1992。
在一些实施例中，抗体-类美登素结合物可通过化学连接抗体于类美登素分子来制备，不显着降低抗体或类美登素分子的生物活性。参见例如，美国专利第5,208,020号。在一些实施例中，每个抗体分子平均结合3-4个类美登素分子的ADC已展示增强目标细胞的细胞毒性的功效，不负面影响抗体的功能或溶解性。在一些情况下，即使一个分子毒素/抗体也预期与使用裸抗体相比，增强细胞毒性。
制备抗体-类美登素结合物的示范性连接基团包括例如本文所描述的那些连接基团和公开于以下中的那些连接基团：美国专利第5,208,020号；欧洲专利0 425 235B1；Chari等人,Cancer Research,第52卷,第127-131页,1992；US 2005/0276812 A1；和US2005/016993A1。
(2)奥瑞他汀和海兔毒素
药物部分包括海兔毒素、奥瑞他汀和其类似物和衍生物(美国专利第5,635,483号；美国专利第5,780,588号；美国专利第5,767,237号；美国专利第6,124,431)。奥瑞他汀为海洋软件动物化合物海兔毒素-10的衍生物。虽然不欲受任何特定理论束缚，但海兔毒素和奥瑞他汀已展示干扰微管动力学、GTP水解和核和细胞分裂(Woyke等人,Antimicrob.Agents and Chemother.,第45卷,第3580-3584页,2001)且具有抗癌(美国专利第5,663,149号)和抗真菌活性(Pettit等人,Antimicrob.Agents Chemother.,第42卷,第2961-2965页,1998)。海兔毒素/奥瑞他汀药物部分可经由肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端连接至抗体(WO 02/088172；Doronina等人,Nature Biotechnology,第21卷,第778-784页,2003；Francisco等人,Blood,第102卷,第1458-1465页,2003)。
示范性奥瑞他汀实施例包括N末端连接的单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF，公开于美国专利第7,498,29和美国专利第7,659,241：
其中DE和DF的波浪线指示共价连接于抗体或抗体-连接子组分的位点，且独立地在各位置：
R2是选自H和C1-C8烷基；
R3是选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4是选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5是选自H和甲基；
或R4和R5共同形成碳环且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb独立地选自H、C1-C8烷基和C3-C8碳环且n是选自2、3、4、5和6；
R6是选自H和C1-C8烷基；
R7是选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环和C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
各R8是独立地选自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环和O-(C1-C8烷基)；
R9是选自H和C1-C8烷基；
R10是选自芳基或C3-C8杂环；
Z是O、S、NH或NR12，其中R12是C1-C8烷基；
R11是选自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
m是1-1000范围内的整数；
R13是C2-C8烷基；
R14是H或C1-C8烷基；
e在每次出现时独立地为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
e在每次出现时独立地为H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；
R18是选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；和
n是0至6范围内的整数。
在一个实施例中，R3、R4和R7独立地为异丙基或二级丁基且R5为-H或甲基。在一示范性实施例中，R3和R4各自为异丙基，R5为-H，且R7为二级丁基。
在又一实施例中，R2和R6各自为甲基，且R9为-H。
在另一实施例中，R8在每次出现时为-OCH3。
在一示范性实施例中，R3和R4各自为异丙基，R2和R6各自为甲基，R5为-H，R7为二级丁基，R8在每次出现时为-OCH3，且R9为-H。
在一个实施例中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施例中，R10为芳基。
在一示范性实施例中，R10为-苯基。
在一示范性实施例中，当Z为-O-时，R11为-H、甲基或三级丁基。
在一个实施例中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，且R16为-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一实施例中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
式DE的示范性奥瑞他汀实施例是MMAE，其中波浪线指示与抗体-药物结合物的连接子(L)的共价连接：
式DE的示范性奥瑞他汀实施例是MMAF，其中波浪线指示与抗体-药物结合物的连接子(L)的共价连接：
其它示范性实施例包括在五肽奥瑞他汀药物部分的C端具有苯丙氨酸羧基修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)和在五肽奥瑞他汀药物部分的C端具有苯丙氨酸侧链修饰的单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008603)。
包含MMAF和各种连接子组分的式I的ADC的非限制性示例性实施例进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF和Ab-PAB-MMAF包含通过非蛋白分解可裂解的连接子附接于抗体的MMAF的免疫结合物已展示具有与包含通过蛋白分解可裂解连接子附接于抗体的MMAF的免疫结合物相当的活性(Doronina等人,Bioconjugate Chem.,第17卷,第114-124页,2006)。在一些此类实施例中，认为药物释放由抗体在细胞中降解实现。
典型地，基于肽的药物部分可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。例如根据液相合成方法可制备此类肽键(参见例如E.和K.Lübke,“The Peptides”,第1卷,第76-136页,1965,Academic Press)。在一些实施例中，奥瑞他汀/海兔毒素药物部分可根据以下的方法制备：美国专利第7,498,298号；美国专利第5,635,483号；美国专利第5,780,588号；Pettit等人,J.Am.Chem.Soc.,第111卷,第5463-5465页,1998；Pettit等人,Anti-Cancer Drug Design,第13卷,第243-277页,1998；Pettit等人,Synthesis,第6卷,第719-725页,1996；Pettit等人,J.Chem.Soc.Perkin Trans.第15卷,第859-863页,1996；和Doronina,Nat.Biotechnol.,第21卷,第778-784页,2003。
在一些实施例中，式DE(例如MMAE)和DE(例如MMAF)的奥瑞他汀/海兔毒素药物部分和药物-连接子中间物和其衍生物(例如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF和MC-vc-PAB-MMAE)可使用以下中所描述的方法制备：美国专利第7,498,298号；Doronina等人,Bioconjugate Chem.,第17卷,第114-124页,2006；和Doronina等人,Nat.Biotech.,第21卷,第778-784页,2003，且接着结合于相关抗体。
(3)卡奇霉素
在一些实施例中，免疫结合物包含结合于一或多个卡奇霉素分子的抗体。抗生素的卡奇霉素家族和其类似物能够在低于皮摩尔浓度下产生双股DNA断裂(Hinman等人,Cancer Research,第53卷,第3336-3342页,1993；Lode等人,Cancer Research,第58卷,第2925-2928页,1998)。卡奇霉素具有胞内作用位点，但在某些情况中，不容易交叉质膜。因此，在一些实施例中，此些药剂经由抗体介导的内化的细胞吸收可大大增强其细胞毒性作用。制备具有卡奇霉素药物部分的抗体-药物结合物的非限制性示范性方法描述于例如美国专利第5,712,374号；美国专利第5,714,586号；美国专利第5,739,116号；和美国专利第5,767,285号。
(4)吡咯并苯并二氮呯
在一些实施例中，ADC包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些实施例中，PDB二聚体识别且结合于特定DNA序列。天然产物安曲霉素(一种PBD)于1965年首次报道(Leimgruber等人,J.Am.Chem.Soc.,第87卷,第5793-5795页,1965；Leimgruber等人,J.Am.Chem.Soc.,第87卷,第5791-5793页,1965)。此后，已报道许多PBD，天然存在的PBD与PBD类似物(Thurston等人,Chem.Rev.第1994卷,第433-465页1994)，包括三环PBD骨架的二聚体(美国专利第6,884,799号；美国专利第7,049,311号；美国专利第7,067,511号；美国专利第7,265,105号；美国专利第7,511,032号；美国专利第7,528,126号；美国专利第7,557,099号)。不欲受任何特定理论束缚，认为二聚体结构用B形式的DNA的小沟赋予适当等螺旋性三维形状，使得在结合位点紧密贴合(Kohn,In Antibiotics III.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,第19卷,第230-237页,1986)。载有C2芳基取代基的二聚PBD化合物已展示适用作细胞毒性剂(Hartley等人,Cancer Res.,第70卷,第6849-6858页,2010；Antonow,J.Med.Chem.第53卷,第2927-2941页,2010；Howard等人,Bioorganic and Med.Chem.Letters,第19卷,第6463-646页6,2009).
PBD二聚体已结合于抗体且所得ADC展示具有抗癌特性。PBD二聚体上非限制性示例性键联位点包括五员吡咯环(PBD单元与N10-C11亚氨基之间的系栓)(WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598)。
ADC的非限制性示例性PBD二聚体组分具有式A：
和其盐与溶剂合物，其中：
波浪线指示共价连接于连接子的位点；
虚线指示C1与C2或C2与C3之间任选地存在双键；
R2是独立地选自H、OH、═O、═CH2、CN、R、OR、═CH-RD、═C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，且任选地进一步选自卤基或二卤基，其中RD是独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤基；
R6和R9是独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；
R7是独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤基；
Q是独立地选自O、S和NH；
R11为H或R，或其中Q为O、SO3M，其中M为金属阳离子；
R和R'各自独立地选自任选地经取代的C1-8烷基、C1-12烷基、C3-8杂环基、C3-20杂环和C5-20芳基，且任选地与基团NRR'有关，R和R'连同其所连接的氮原子一起形成任选地经取代的4员、5员、6员或7员杂环；
R12、R16、R19和R17如分别关于R2、R6、R9和R7所定义；
R"是C3-12亚烷基，所述链可杂有一或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环(例如苯或吡啶)，所述环任选地经取代；和
X和X'是独立地选自O、S和N(H)。
在一些实施例中，R和R'各自独立地选自任选地经取代的C1-12烷基、C3-20杂环和C5-20芳基，且任选地与基团NRR'有关，R和R'连同其所连接的氮原子一起形成任选地经取代的4员、5员、6员或7员杂环。在一些实施例中，R9和R19是H。在一些实施例中，R6和R16是H。
在一些实施例中，R7是R17均为OR7A，其中R7A是任选地经取代的C1-4烷基。在一些实施例中，R7A是Me。在一些实施例中，R7A是Ch2Ph，其中Ph是苯基。在一些实施例中，X是O。在一些实施例中，R11是H。在一些实施例中，各单体单元中C2与C3之间存在一双键。
在一些实施例中，R2和R12是独立地选自H和R。在一些实施例中，R2和R12独立地为R。在一些实施例中，R2和R12独立地为任选地经取代的C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些实施例中，R2和R12独立地为任选地经取代的苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。在一些实施例中，R2和R12是独立地选自═O、═CH2、═CH-RD和═C(RD)2。在一些实施例中，R2和R12各为═CH2。在一些实施例中，R2和R12各为H。在一些实施例中，R2和R12各为═O。在一些实施例中，R2和R12各为═CF2。在一些实施例中，R2和/或R12独立地为═C(RD)2。在一些实施例中，R2和/或R12独立地为═CH-RD。
在一些实施例中，当R2和/或R12是═CH-RD时，各基团可独立地具有下文所示的任一配置：
/>
在一些实施例中，═CH-RD呈配置(I)。在一些实施例中，R"是C3亚烷基或C5亚烷基。
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab和PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab的连接子为蛋白酶可裂解的，而PBD二聚体-顺丁烯二酰亚胺-缩醛的连接子为酸不稳定的。
PBD二聚体和包含PBD二聚体的ADC可根据所属领域中已知的方法制备。参见例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598。
(5)蒽环霉素(Anthracyclines)
在一些实施例中，ADC可包含蒽环霉素。蒽环霉素为显示细胞毒活性的抗生素化合物。虽然不欲受任何特定理论束缚，但研究已指示蒽环霉素可通过许多不同机制用以杀死细胞，包括：1)药物分子插入细胞DNA，由此抑制DNA依赖性核酸合成；2)通过药物产生自由基，接着自由基与细胞大分子反应，对细胞造成损害，和/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如C.Peterson等人,“Transport And Storage Of Anthracycline InExperimental Systems And Human Leukemia”in Anthracycline Antibiotics InCancer Therapy；N.R.Bachur,“Free Radical Damage”id.at第97-102页)。因为具有细胞毒性潜能，所以蒽环霉素已用于治疗许多癌症，例如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌和肉瘤(参见例如P.H-Wiernik,in Anthracycline:Current Status And New Developments第11页)。
非限制性示范性蒽环霉素包括小红莓、表柔比星、伊达比星、柔红霉素、奈莫柔比星和其衍生物。已制备和研究道诺霉素和小红莓的免疫结合物和前药(Kratz等人,CurrentMed.Chem.,第13卷,第477-523页,2006；Jeffrey等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters,第16卷,第358-362页.1996；Torgov等人,Bioconj.Chem.,第16卷,第717-721页,2005；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第97卷,第829-834页,2000；Dubowchik等人,Bioorg.&Med.Chem.Letters,第12卷,第1529-1532页,2002；King等人,J.Med.Chem.,第45卷,第4336-4343页,2002；EP 0328147；美国专利第6,630,579号)。抗体-药物结合物BR96-小红莓与肿瘤相关抗原路易斯-Y(Lewis-Y)特异性反应且已在I和II阶段研究中评估(Saleh等人,J.Clin.Oncology,第18卷,第2282-2292页,2000；Ajani等人,Cancer Jour.,第6卷,第78-81页,2000；Tolcher等人,J.Clin.Oncology,第17卷,第478-484页,1999)。
PNU-159682是奈莫柔比星的有效代谢物(或衍生物)(Quintieri等人,ClinicalCancer Research,第11卷,第1608-1617页,2005)。奈莫柔比星是在小红莓的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基的小红莓半合成类似物，且已处于临床评定下(Grandi等人,CancerTreat.Rev.第17卷,第133-138页,1990；Ripamonti等人,Brit.J.Cancer,第65卷,第703-707页,1992)，包括针对肝细胞癌的阶段II/III试验(Sun等人,Proceedings of theAmerican Society for Clinical Oncology,第22卷,Abs1448,2003；Quintieri,Proceedings of the American Association of Cancer Research,第44卷:第1版,Abs4649,2003；Pacciarini等人,Jour.Clin.Oncology,第24卷,第14116页,2006)。
包括PNU-159682的蒽环霉素可经由若干键位点和多个连接子结合于抗体(US2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)，包括本文所描述的连接子。
PNU-159682顺丁烯二酰亚胺缩醛-Ab的连接子是酸不稳定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab,PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子-Ab和PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子(R1R2)-Ab的连接子是蛋白酶可裂解的。
(6)其它药物部分
药物部分也包括格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等人,J.Nat.CancerInst.,第92卷,第1573-1581页,2000；Mandler等人,Bioorganic&Med.Chem.Letters,第10卷,第1025-1028,2000；Mandler等人,Bioconjugate Chem.,第13卷,第786-791,2002)；和酶活性毒素和其片段，包括(但不限于)白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌)、篦麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、康乃馨蛋白、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树素、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)和霉菌毒素(tricothecene)。参见例如WO 93/21232.
药物部分也包括具有核分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶)。
在某些实施例中，免疫结合物可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性结合抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在一些实施例中，当免疫结合物用于检测时，其可包含用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如Tc99或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂错合且与抗体结合，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。
放射性标记或其它标记可以已知方式并入免疫结合物中。举例来说，肽可使用包含例如一或多个氟-19原子代替一或多个氢的适合氨基酸前体生物合成或化学合成。在一些实施例中，例如Tc99、I123、Re186、Re188和In111的标记可经由抗体中的半胱氨酸残基附接。在一些实施例中，钇-90可经由抗体的赖氨酸残基附接。在一些实施例中，IODOGEN方法(Fraker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,第80卷，第49-57页，1978)可用于并入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)描述某些其它方法。
在某些实施例中，免疫结合物可包含结合于前药活化酶的抗体。在一些此类实施例中，前药活化酶使前药(例如肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化为活性药物，例如抗癌药物。在一些实施例中，此类免疫结合物适用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)。可结合至抗体的酶包括(但不限于)碱性磷酸酶，其可用于将含磷酸酯基的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，其可用于将含硫酸酯基的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱胺酶，其可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含肽前药转化为游离药物；D-丙胺酰基羧肽酶，其可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，其可用于将经β-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其可用于将胺氮分别经苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生化的药物转化为游离药物。在一些实施例中，酶可通过所属领域中熟知的重组DNA技术共价结合于抗体。参见例如Neuberger等人,Nature,第312卷,第604-608页,1984。
药物负载
药物负载由p表示，是式I分子中每个抗体的药物部分的平均数目。药物负载可在每个抗体1至20个药物部分(D)的范围内。式I的ADC包括与1至20个的范围的药物部分结合的抗体的集合。在由结合反应制备ADC时，每个抗体的药物部分的平均数目可通过例如质谱分析、ELISA分析和HPLC的常规方式表征。也可测定就p而言的ADC的定量分布。在一些情况下，可通过例如逆相HPLC或电泳的方式来实现其中p是来自具有其它药物负载的ADC的一定值的均质ADC的分离、纯化和表征。
对于一些抗体-药物结合物，p可受抗体上的连接位点的数目限制。举例来说，在连接是半胱氨酸硫醇的情况下，如在以上某些示范性实施例中，抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅具有一个或若干个可连接连接子的足够反应性硫醇基。在某些实施例中，较高药物负载(例如p>5)可造成某些抗体-药物结合物的聚集、不可溶性、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施例中，ADC的平均药物负载在1至约8；约2至约6；或约3至约5范围内。实际上，某些ADC已展示药物部分/抗体的最优选比率可低于8，且可为约2至约5(美国专利第7,498,298号)。
在某些实施例中，在结合反应期间使少于理论最大值的药物部分结合于抗体。抗体可含有例如不与药物-连接子中间物或连接子试剂反应的赖氨酸残基，如下文所论述。一般来说，抗体不含许多可连接至药物部分的游离和反应性半胱氨酸硫醇基；实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇基残基以二硫桥键形式存在。在某些实施例中，抗体可用例如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂在部分或完全还原条件下还原，产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施例中，抗体经历变性条件，以显出反应性亲核基团，例如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载(药物/抗体比率)可以不同方式控制，且例如通过如下来控制：(i)限制药物-连接子中间物或连接子试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制结合反应时间或温度；和(iii)针对半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。
应了解，如果超过一个亲核性基团与药物-连接子中间物或连接子试剂反应，那么所得产物是ADC与连接于抗体的一或多个药物部分的分布的混合物。平均药物数目/抗体可通过对抗体具有特异性且对药物具有特异性的双重ELISA抗体分析由混合物计算。个别ADC可在混合物中通过质谱分析鉴别且通过HPLC，例如疏水相互作用色谱分离(参见例如McDonagh等人,Prot.Engr.Design&Selection,第19卷,第299-307页,2006；Hamblett等人,Clin.Cancer Res.,第10卷,第7063-7070页,2004)。在某些实施例中，具有单一负载值的均质ADC可通过电泳或色谱自结合混合物分离。
制备免疫结合物的某些方法
作为式I的ADC免疫结合物可通过若干途径，采用熟习所属领域者已知的有机化学反应、条件和试剂制备，包括以下：(1)抗体的亲核性基团与二价连接子试剂反应，经由共价键形成Ab-L，接着与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核性基团与二价连接子试剂反应，经由共价键形成D-L，接着与抗体的亲核性基团反应。经由后一途径制备式I的ADC的示范性方法描述于美国专利第7,498,298号中。
抗体上的亲核性基团包括(但不限于)：(i)N端氨基；(ii)侧链氨基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体发生糖基化。胺、硫醇和羟基为亲核性的且能够与连接子部分和连接子试剂上的亲电性基团反应形成共价键，所述亲电性基团包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤基甲酸酯和酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，例如卤乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和顺丁烯二酰亚氨基。某些抗体具有可还原链间二硫键，即半胱氨酸桥键。通过用例如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)的还原剂处理，使得抗体完全或部分还原，可使抗体具有反应性，以与连接子试剂结合。理论上各半胱氨酸桥键将因此形成两个反应性硫醇亲核体。可经由例如使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(妥特氏试剂(Traut'sreagent))反应，修饰赖氨酸残基，使胺转化为硫醇，而将额外亲核性基团引入至抗体中。也可通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变异体抗体)，而将反应性硫醇基引入至抗体中。
本发明的抗体-药物结合物也可通过抗体上的亲电性基团(例如醛或酮羰基)与连接子试剂或药物上的亲核性基团之间发生反应来产生。连接子试剂上的适用亲核性基团包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯和芳基酰肼。在一个实施例中，抗体经修饰以引入能够与连接子试剂或药物上的亲核性取代基反应的亲电性部分。在另一实施例中，糖基化抗体的糖可例如用过碘酸盐氧化试剂氧化，以形成醛基或酮基，其可与连接子试剂或药物部分的氨基反应。所得亚胺希夫碱(Schiff base)基团可形成稳定键联，或可经还原，例如通过硼氢化物试剂还原，以形成稳定的胺键联。在一个实施例中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏过碘酸钠反应可在抗体中产生羰基(醛和酮)，其可与药物(Hermanson,Bioconjugate Techniques)上的适当基团反应。在另一实施例中，含有N端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可与偏过碘酸钠反应，产生醛而非第一氨基酸(Geoghegan&Stroh,Bioconjugate Chem.,第3卷,第138-146页,1992；美国专利第5,362,852号)。此类醛可与药物部分或连接子亲核试剂反应。
药物部分上的示范性亲核性基团包括(但不限于)：能够与连接子部分和连接子试剂上的亲电子基反应形成共价键的胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，所述亲电子基包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、卤基甲酸酯和酸卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，例如卤乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和顺丁烯二酰亚氨基。
可用于制备ADC的非限制性示范性交联试剂在本文中描述于标题为“示范性连接子”的章节下。使用此类交联试剂连接两个部分，包括蛋白质部分和化学部分的方法为所属领域中已知。在一些实施例中，包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白可例如通过重组技术或肽合成来制备。重组DNA分子可包含编码结合物的抗体和细胞毒性部分的区域，所述区域彼此相邻或由编码不破坏结合物的所需特性的连接子肽的区域分离。
在又一实施例中，抗体可结合于“受体”(例如抗生蛋白链菌素)，以用于肿瘤预先靶向中，其中抗体-受体结合物施用患者，接着使用清除剂将未结合的结合物自循环中去除且接着施用结合于细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)的“配位体”(例如抗生素蛋白)。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施例中，本文所提供的抗Axl抗体或抗体片段中的任一者可用于检测生物样品中的Axl的存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施例中，生物样品包含细胞或组织，例如乳房、胰腺、食道、肺和/或大脑细胞或组织。
本发明的另一方面是关于本发明的抗Axl抗体，其用于诊断和/或监测癌症或另一种疾病，其中Axl水平在身体中的至少一个位置自正常生理水平增加或降低。
在一优选实施例中，本发明的抗体或抗体片段可用例如萤光分子、放射性分子或上述在所属领域中已知的任何其它标记的可检测分子或物质标记。举例来说，本发明的抗体可用放射性分子标记。举例来说，适合放射性分子包括(但不限于)用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如123I、124I、111In、186Re和188Re。本发明的抗体或抗体片段也可用用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记来标记，例如碘-123、碘-131、铟-Ill、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。在施用抗体后，检测患者内放射性标记抗体的分布。可使用任何适合的已知方法。一些非限制性实例包括，计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)、萤光、化学发光和超声波扫描。
本发明的抗体或抗体片段可适用于诊断和分级与Axl过度表达相关的癌症和疾病。与Axl过度表达相关的癌症可包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰脏癌、胶细胞肿瘤(例如神经胶母细胞瘤和神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、黑素瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤和各种类型的头颈癌或其它Axl表达或过度表达型过度增殖性疾病。
本发明的抗体或抗体片段可适用于诊断Axl表达增加或降低的除癌症外的疾病。可溶性或细胞Axl形式均可以用于此类诊断。通常，此类诊断性方法涉及使用获自患者的生物样品。如本文所用，术语“生物样品”涵盖可用于诊断或监测分析的获自个体的多种样品类型。生物样品包括(但不限于)血液和生物学来源的其它液体样品、实体组织样品(例如活组织检验样本)或组织培养基或来源于其的细胞和其子代。举例来说，生物样品包括获自由怀疑患有与Axl过度表达相关的癌症的个体收集的组织样品的细胞，且在优选实施例中，获自神经胶质瘤、胃、肺、胰脏、乳房、前列腺、肾、肝脏和子宫内膜。生物样品涵盖临床样品、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物流体和组织样品。
在一特定实施例中，本发明为一种诊断个体中与Axl过度表达相关的癌症的方法，其是通过使用本发明抗体检测来自个体的细胞上的Axl来进行。详言的，所述方法可包括以下步骤：
(a)使个体的生物样品与根据本发明的抗体或抗体片段在适用于抗体或抗体片段的条件下接触，以与生物样品中表达Axl的细胞形成复合物；和
(b)检测和/或定量所述复合物，由此所述复合物的检测指示与Axl过度表达相关的癌症。
为监测癌症的进展，可在不同时间重复根据本发明的方法以确定结合于样品的抗体是否增加或减少，由此可确定癌症是否发展、消退或稳定。
在一特定实施例中，本发明为诊断与Axl的表达或过度表达或可溶形式的Axl的减少或增加的相关的疾病的方法。此类疾病的实例可包括人类免疫病症，血栓性疾病(血栓形成和动脉粥样硬化血栓形成(atherothrombosis))和心血管病
在一个实施例中，提供一种用于诊断或检测方法的抗Axl抗体或抗体片段。在另一方面中，提供一种检测Axl在生物样品中的存在的方法。在另一方面中，提供一种定量生物样品中Axl的量的方法。在某些实施例中，所述方法包含使生物样品与如本文所描述的抗Axl抗体或抗体片段在容许抗Axl抗体或抗体片段与Axl结合的条件下接触，和检测抗Axl抗体或抗体片段与Axl之间是否形成复合物。此类方法可在活体外或活体内进行。在一个实施例中，使用抗Axl抗体或抗体片段以选择符合治疗的个体。在一些实施例中，疗法将包括向个体施用抗Axl抗体或抗体片段。
在某些实施例中，提供经标记的抗Axl抗体或抗体片段。标记包括(但不限于)直接检测的标记或部分(例如萤光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如经由酶反应或分子相互作用间接检测的部分(例如酶或配位体)。示范性标记包括(但不限于)放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；萤光团，例如稀土螯合剂或萤光素和其衍生物；如果丹明(rhodamine)和其衍生物；丹酰基；伞酮；萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利第4,737,456号)；萤光素；2,3-二氢呔嗪二酮；辣根过氧化酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶，例如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶相结合；生物素/抗生物素蛋白；自旋标记；噬菌体标记；稳定自由基；和类似物。
医药调配物
抗Axl抗体或抗体片段具有细胞杀伤活性。此细胞杀灭活性延伸至多种不同类型的细胞系。此外，此些抗体或抗体片段，一旦结合于细胞毒性剂，即可降低肿瘤大小且可展现毒性降低。参见本申请案的实例3和6至9实例。因此，抗Axl抗体、其片段或免疫结合物可适用于治疗与Axl表达相关的增殖性疾病。抗体、片段或免疫结合物可单独或与任何适合的药剂或其它常规治疗组合使用。
抗Axl抗体或抗体片段可用于治疗与Axl和或Gas6表达、过度表达或活化相关的疾病。除对Axl表达的要求外对可治疗的癌症或组织的类型无特定限制。实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰脏癌、胶细胞肿瘤(例如神经胶母细胞瘤和神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、黑素瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤和各种类型的头颈癌。更优选癌症是神经胶质瘤、胃癌、肺癌、胰脏癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、肝癌和子宫内膜癌。
抗Axl抗体或抗体片段是先天性免疫反应的潜在活化剂，且因此可用于治疗人类免疫病症，例如败血症。本发明的抗Axl抗体或抗体片段也可用作免疫佐剂，例如用于疫苗和作为针对例如细菌、病毒和寄生虫的抗感染剂。
抗Axl抗体或抗体片段可用于保护免受、预防或治疗血栓性疾病，例如静脉和动脉血栓形成和动脉粥样硬化血栓形成。抗Axl抗体或抗体片段也可用以保护免受、预防或治疗心血管病以及预防或抑制例如拉沙热病(Lassa)和埃博拉(Ebola)病毒的病毒的侵入和治疗病毒感染。
在本文所描述的治疗方法的各个实施例中，抗Axl单克隆抗体、抗体片段或抗Axl单克隆免疫结合物可以与控制寻求治疗的疾病或病症相关的常规方法一致的方式递送。根据本发明，在足以预防或治疗疾病或病症的一段时间和条件下向需要此类治疗的个体施用有效量的抗体、抗体片段或免疫结合物。因此，本发明的一方面是关于一种治疗与Axl的表达相关的疾病的方法，其包含向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段或免疫结合物。
为了施用，可将抗Axl单克隆抗体、抗体片段或免疫结合物调配为医药组合物。包括抗Axl单克隆抗体、抗体片段或抗体-药物结合物的医药组合物可根据已知用于制备医药组合物的方法调配。在此类方法中，通常将治疗性分子与含有药学上可接受的载剂的混合物、溶液或组合物组合。
药学上可接受的载剂是接受者患者可耐受的物质。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载剂的一个实例。其它合适的药学上可接受的载剂为熟习所属领域者所熟知。(参见例如Gennaro(编),Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCompany,19版.1995))调配物可进一步包括一或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止小瓶表面上的蛋白损失的白蛋白等。
医药组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然视待治疗的病状、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等而定。熟习所属领域者可考虑此些考虑因素以调配适合的医药组合物。本发明的医药组合物可经调配用于局部、经口、非经肠、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内施用和其类似施用方式。
优选地，医药组合物含有用于能够注射的调配物的药学上可接受的媒剂。此些媒剂尤其可为等张的无菌盐水溶液(磷酸单钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁和其类似物或此类盐的混合物)，或干燥，尤其冷冻干燥的组合物，其在添加例如灭菌水或生理盐水时，使得可复原成可注射溶液。
在一些实施例中，存在张力剂，有时称为“稳定剂”以调节或维持组合物中液体的张力。当与大型带电生物分子(例如蛋白质和抗体)一起使用时，其通常称为“稳定剂”，因为其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，借此减小分子间和分子内相互作用的可能性。张力剂可以医药组合物的0.1重量％至25重量％，优选1重量％至5重量％的任何量存在。优选张力剂包括多羟基糖醇，优选包括三元醇或高级糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。
额外赋形剂包括可充当以下中的一或多种的试剂：(1)增积剂，(2)溶解增强剂，(3)稳定剂，和(4)防止变性或黏着于容器壁的试剂。此类赋形剂可包括：多羟基糖醇(上问所列举)；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如脲、麸胱甘肽、硫辛酸、巯乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，例如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；双糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，例如棉子糖；和多糖，例如糊精或葡聚糖。
可采用非离子型表面活性剂或清洁剂(也称为“润湿剂”)以有助于溶解治疗剂以及保护治疗蛋白以抵抗搅动诱导的聚集，由此也可使得调配物暴露于剪切表面应力而不会致使活性治疗蛋白或抗体变性。非离子表面活性剂可按约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的浓度范围存在。
适合的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、聚氧化物(polyoxamer)(184、188等)、多元醇、/>聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(/>-20、/>-80等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧基甲基纤维素。可使用的阴离子性洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基丁二酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子性洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
用于施用的剂量可随各种参数而调适，且特定言的随所用施用模式、相关病理学或者所需治疗持续时间而调适。为制备医药组合物，可将有效量的抗体或抗体片段溶解或分散于药学上可接受的载剂或水性介质中。
适用于可注射使用的医药形式包括无菌水溶液或分散液；调配物，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；和用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，形式必须为无菌的，且必须在易于注射性存在的程度上为流体。形式在制造和存储条件下必须稳定，且必须保护其免遭例如细菌和真菌的微生物的污染作用。
呈游离碱或药理学上可接受的盐形式的活性化合物的溶液可于水中适当地与表面活性剂混合来制备。也可在甘油、液态聚乙二醇和其混合物中和在油中制备分散液。在一般存储和使用条件下，此些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
抗体或抗体片段可调配成呈中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)且其由无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸和类似者)形成。用游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；和有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)和其类似碱。
载剂也可是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇和其类似物)、其适合的混合物和植物油的溶剂或分散介质。举例来说，可通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持就分散液而言所需粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞和其类似物来实现。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液如下制备：将所要量的活性化合物视需要与上文列举的其它成分中的一或多者一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌。一般来说，通过将各种灭菌活性成分并入含有碱性分散介质和来自上文列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，由其先前无菌过滤溶液产生活性成分加任何额外所需成分的粉末。
也涵盖制备更多或高浓度的用于直接注射的溶液，其中设想使用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂产生极快渗透，递送高浓度的活性剂至小肿瘤区域中。
在配制时，溶液将以与剂量配制物相容的方式且以例如治疗有效的量施用。调配物易于以各种剂型，例如上文所描述的可注射溶液的类型施用，但也可采用药物释放胶囊和其类似者。
对于以水溶液形式非经肠施用，例如，所描述溶液必要时应经适当缓冲且首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂具有等张性。此些特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在此方面，根据本发明，可采用的无菌水性介质将为熟习所属领域者已知的。举例来说，可将一个剂量溶解于1ml等张NaCl溶液中且添加至1000ml皮下灌注流体或在所提出的输注位点注射，(参见例如“Remington'sPharmaceutical Sciences”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。视所治疗个体的病状而定，将必然产生一些剂量变化。在任何事件中，负责施用的人员将确定个别个体的适当剂量。
抗体或抗体片段可调配于治疗性混合物内以每剂量递送约0.0001至10.0毫克，或约0.001至5毫克，或约0.001至1毫克，或约0.001至0.1毫克，或约0.1至1.0或甚至约10毫克。也可以所选时间间隔施用多个剂量。
除经调配用于非经肠施用(例如静脉内或肌肉内注射)的化合物以外，其它药学上可接受的形式包括例如锭剂或用于经口施用的其它固体；延时释放胶囊；和目前所用的任何其它形式。
在某些实施例中，涵盖使用脂质粒和/或纳米粒子将抗体或抗体片段引入至宿主细胞中。脂质粒和/或纳米粒子的形式和用途为熟习所属领域者已知。
纳米胶囊可一般以稳定和可复制方式裹住化合物。为避免由细胞内聚合物过载引起的副作用，此类超细粒子(大小为约0.1μm)一般使用能够在活体内降解的聚合物设计。涵盖满足此些要求的生物可降解氰基丙烯酸聚烷基酯纳米粒子以用于本发明，且此类颗粒可易于制得。
脂质粒由磷脂形成，磷脂分散于水性介质中且自发形成多层同心双层小泡(也称为多层小泡(MLV))。MLV一般具有25nm至4μm的直径。MLV的音波处理使得形成直径在200至范围内且在核心含有水溶液的小单层小泡(SUV)。脂质粒的物理特征视pH值、离子强度和二价阳离子的存在而定。
含有如本文所描述的抗Axl抗体或抗体片段的医药调配物通过将具有所需纯度的此类抗体或抗体片段与一或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))，呈冻干调配物或水溶液形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下一般对接受者无毒性，且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相对离子，例如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。
本文中的示范性药学上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International公司)。某些示范性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公开案第2005/0260186号和第2006/0104968号中。在一个方面中，sHASEGP与一或多种其它葡萄糖胺聚糖酶，例如软骨素酶组合。/>
示范性冻干抗体调配物描述于美国专利第6,267,958号中。抗体调配物水溶液包括美国专利第6,171,586号和WO2006/044908中所描述的那些抗体调配物水溶液，后者调配物包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
视所治疗的特定适应症所的需要，在本文中,调配物也可含有一种以上活性成分。优选地，可将不会彼此不利影响的具有互补活性的成分组合成单一调配物。举例来说，除本发明的抗Axl抗体、抗体片段或免疫结合物以外，可能还需要提供EGFR拮抗剂(例如埃罗替尼(erlotinib))、抗血管生成剂(例如VEGF拮抗剂，其可为抗VEGF抗体)或化学治疗剂(例如紫杉醇或铂制剂)。此类活性成分宜以有效达成预期目的的量组合存在。
可将活性成分包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应制备的微胶囊中。举例来说，可采用分别于胶态药物递送系统(例如脂质粒、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或巨乳液中的羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。所述技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有抗体或抗体片段的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形制品形式，例如薄膜或微胶囊。
用于活体内施用的调配物通常为无菌的。无菌性可容易地通过例如经由无菌过滤膜过滤来实现。
治疗方法和组合物
本文所提供的抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物中的任一者可用于治疗方法中。在一个方面中，提供用作药剂的抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物。在其它方面中，提供一种抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物，其用于治疗癌症(例如乳癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、脑癌、胰脏癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤和/或黑色素瘤)。在某些实施例中，提供一种抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物，其用于治疗方法中。在某些实施例中，本发明提供一种抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物，其用于治疗患有癌症的个体的方法中，所述方法包含向个体施用有效量的抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物。在某些实施例中，本发明提供一种抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物，其用于治疗患有免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如伊波拉病毒、马堡病毒(Marburg virus))或糖尿病的个体的方法中，所述方法包含向所述个体施用有效量的抗Axl抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包含向个体施用有效量的至少一种例如如下文所描述的其它治疗剂。在其它实施例中，本发明提供一种抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物，其用于抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)和/或抑制肿瘤基质功能。
在某些实施例中，本发明提供一种抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物，其用于个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)和/或抑制肿瘤基质功能的方法中，包含向个体施用有效的抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物以抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)和/或抑制肿瘤基质功能。根据以上实施例中的任一者的“个体”优选为人类。
在另一方面中，本发明提供抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物的用途，其用于制造或制备药剂。在一个实施例中，所述药剂用于治疗癌症(在一些实施例中，乳癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、脑癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病癌、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤和/或黑素瘤)。在另一实施例中，药剂用于治疗癌症的方法，所述方法包含向患有癌症的个体施用有效量的药剂。在另一实施例中，所述药剂用于治疗免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如伊波拉病毒、马堡病毒)或糖尿病的方法中，所述方法包含向个体施用有效量的抗Axl抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包含向个体施用有效量的至少一种例如如下文所描述的其它治疗剂。在另一实施例中，所述药剂用于抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关血管)和/或抑制肿瘤基质功能。在另一实施例中，所述药剂用于个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)和/或抑制肿瘤基质功能的方法中，所述方法包含向个体施用有效量的药剂以抑制血管生成、抑制细胞增殖、促进免疫功能、诱导发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)和/或抑制肿瘤基质功能。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面中，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施例中，所述方法包含向患有此类癌症的个体施用有效量的抗Axl抗体或抗体片段或免疫结合物。在一个此类实施例中，所述方法进一步包含向个体施用有效量的至少一种如下文所描述的额外治疗剂。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
Axl为属于包括TYRO3、Axl和MER的紧密相关受体的亚家族的140kDa细胞表面跨膜受体蛋白质酪氨酸激酶(TAM；Lai 1991；O'Bryan 1991)。TAM活化和信号传导已牵涉多种细胞反应，包括细胞存活、增殖、迁移和黏附(Hafizi 2006)。Axl最初鉴别为来自慢性骨髓性白血病的患者的致癌基因，且当过度表达时，其展现转化潜力(Janssen 1991；O'Bryan1991)。Axl过度表达已报道于各种人类癌症(Craven 1995；Ito 1999；Berclaz 2001；Sun2004；Shieh 2005)中，且与肺癌(Shieh 2005)、前列腺癌(Sainaghi 2005)、乳癌(Meric2002)和胃癌(Wu 2002)以及肾细胞癌(Chung 2003)和神经胶母细胞瘤(Hutterer 2008)中的侵袭和癌转移相关。
近期研究显示Axl经由“酪氨酸激酶开关”过度表达引起胃肠道基质瘤对伊马替尼的抗性(Mahadevan 2007)。Axl表达由化学疗法药物诱导，且Axl的过度表达赋予急性骨髓白血病的抗药性(Hong 2008)。也已显示Axl调节内皮细胞迁移和管形成(Holland 2005)。此些发现表明Axl可涉及调节肿瘤发生的多个方面。
出于若干原因，表达Axl的实体肿瘤类型备受关注。对于此些疾病中的每一者中的新颖治疗选项，存在高度未满足的需求。临床前数据表明靶向Axl可引起各种肿瘤类型(例如NSCLC和黑色素瘤)中的抗肿瘤活性。结合Axl-ADC的拟议机制和基础生物学，预期在此些恶性肿瘤中会有抗肿瘤活性。Axl在许多人类肉瘤，包括侵袭性亚型的平滑肌肉瘤、尤文氏肉瘤和脂肪肉瘤中高度表达和活化(例如2015五月；Fleuren2014；Dantas-Barbosa 2017)。平滑肌肉瘤(LMS)为成人肉瘤的15％且在转移期中仍然难以治疗。TAM受体(包括TYRO3和Axl)和其配位体在多种恶性肿瘤(包括LMS)中过度表达或活化。LMS患者，尤其罹患癌转移的那些患者，表达较高水平的TYRO3和GAS6。克卓替尼(Crizotinib)和弗雷替尼(foretinib)由TYRO3和Axl失活在LMS中显示出有效抗肿瘤活性，表明在晚期LMS中使用TYRO3和Axl抑制剂的临床试验是必要的。此些数据表明，Axl为表达Axl的肉瘤中的潜在新颖治疗目标。
免疫疗法，尤其呈PD-1阻断形式，在过去十年期间已成为一种革命性的肿瘤疗法。在近期SARC028研究(Petitprez 2020)中，对研究性PD-1抑制剂有反应的大部分(75％)患有未分化多形性肉瘤的患者患有PD-L1阳性肿瘤，表明与PD-1抑制剂组合治疗。免疫生物标志物的表达因肉瘤亚型而不同，且可能与对免疫疗法的反应相关(Petitprez 2020)。免疫细胞去分化脂肪肉瘤和未分化多形性肉瘤。已展示，具有淋巴细胞浸润和第三淋巴结构的肉瘤对检查点抑制剂纳武单抗作出反应(Petitprez 2020)。总的，此表明组合使用PD-1抑制剂可在患有发炎软组织肉瘤的患者中提供优选结果。对于儿科肉瘤患者，用BA3011治疗预计不会导致发育、骨骼或性腺缺陷。Axl基因剔除对偶基因的同型接合小鼠展现明显的正常表型(Lu 1999)。
在本发明的此方面中，提供治疗表达Axl的肿瘤的方法。在一些实施例中，方法包含施用抗Axl抗体或抗体片段，或包括本发明的抗Axl抗体或抗体片段的免疫结合物。
在一个实施例中，治疗表达Axl的肿瘤的方法包含施用免疫结合物，其包括任选地与选自化学治疗剂、放射性原子、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂的试剂结合的本发明的抗体或抗体片段。免疫结合物为抗体-药物结合物(ADC)，其中条件性活性生物(CAB)抗Axl抗体经由可裂解连接子(CAB-Axl-ADC)与一或多个药物部分结合。例如，CAB-Axl-ADC为mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)，其中药物部分为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，且(n)为1与4之间(包括端点)的整数。
在一些实施例中，本发明提供一种具有CAB-Axl-ADC(例如mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n))的治疗方案，其中药物部分为单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，且(n)为1与4之间(包含端点)的整数，以约0.3mg/kg至约2.0mg/kg的剂量每21天施用一次或两次、每21天的第1天和第8天进行施用、或每14天的第1天和第8天进行施用。此类治疗方案为出人意料地有效的，因为本发明的抗体-药物结合物以此类剂量且以此类时间间隔施用，提供令人惊讶的高反应率和可接受的毒性或耐受性概况。因此，本发明方法提供用于向个体施用CAB-Axl-ADC抗体-药物结合物的给药方案。在一些实施例中，相比于其它给药方案，所述给药方案增加个体对所述疗法的反应概率。在一些实施例中，相较于其它给药方案，所述给药方案不增加个体罹患不良事件(包括剂量限制毒性)的概率。本发明也提供给药方案之后的维持治疗。
在某些实施例中，mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)是以约0.3mg/kg至约1.8mg/kg的剂量每21天施用一次或两次、每21天的第1天和第8天进行施用、或每14天的第1天和第8天进行施用。优选地，mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)是以约0.8mg/kg至约1.8mg/kg的剂量每21天施用一次或两次、每21天的第1天和第8天进行施用、或每14天的第1天和第8天进行施用。
CAB-Axl-ADC，例如本发明的mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)优先在与不同疾病和组织相关的定义生理条件下结合。举例来说，在癌症中，通过沃伯格(沃伯格1924；沃伯格1956)描述的独特细胞代谢促成特殊微环境，例如低pH和高乳酸盐。本发明的mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)利用独特TME且在非常接近表达Axl的肿瘤时选择性地与其目标结合。mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)的活化结合特性为可逆的，使得当其自病变转移至正常再至病变组织微环境时不会发生永久变化。特定言的，mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)包括人类化mAb(BA3011)而无需添加非抗体序列以实现此些特性。
在一具体方面中，治疗表达Axl的肿瘤的方法包含向需要此类治疗的人类个体施用mAbBA301-可裂解连接子-MMAE(n)，其中mAbBA301是抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有包括SEQ ID NO.14的hcCDR1、SEQ ID NO.15的hcCDR2和SEQ ID NO.16的hcCDR3的重链可变区；和包括SEQ ID NO.17的lcCDR1、SEQ ID NO.18的lcCDR2和SEQ ID NO.19的lcCDR3的轻链可变区；MMAE是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)，且n为1至4之间的整数，包括端点。
在另一实施例中，适用于本发明的方法中的多肽、抗体或抗体片段或免疫结合物与药学上可接受的载剂一起处于医药组合物中。
在另一实施例中，适用于本发明方法的多肽、抗体或抗体片段或免疫结合物包括于具有诊断或治疗表达Axl的肿瘤的使用说明书的试剂盒中。
在又一实施例中，治疗表达Axl的肿瘤的方法包含向需要此类治疗的人类个体施用包括mAbBA301-可裂解连接子-MMAE(n)和药学上可接受的载剂的医药组合物，其中所述医药组合物在每21天的第1天和第8天通过静脉内输注以1.8mg/kg人类个体体重的剂量施用。mAbBA301是抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段具有包括SEQ ID NO.14的hcCDR1、SEQID NO.15的hcCDR2和SEQ ID NO.16的hcCDR3的重链可变区；和包括SEQ ID NO.17的lcCDR1、SEQ ID NO.18的lcCDR2和SEQ ID NO.19的lcCDR3的轻链可变区；且(n)为1至4之间的整数，包括端点，优选地(n)等于4。
在某些实施例中，mAbBA301的重链可变区包括SEQ ID NO.20，和轻链可变区包括SEQ ID NO.21。
在另一实施例中，可裂解连接子为mc-vc-PAB。
在某些实施例中，表达Axl的肿瘤为肉瘤、腺癌或非小肺细胞癌。优选地，表达Axl的肿瘤为肉瘤。
在某些实施例中，方法进一步包括施用程序性死亡受体-1(PD-1)阻断抗体。
在又一实施例中，表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90或至少95。优选地，表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少70、至少75、至少80、至少85、至少90或至少95。
在某些实施例中，方法进一步包括施用颗粒球群落刺激因子或其类似物。
在又一实施例中，药学上可接受的载剂具有6.0的pH且包含20mM组氨酸-HCL、70mg/mL蔗糖和0.5mg/mL聚山梨醇酯80。
在另一方面中，本发明提供一种治疗免疫病症(例如自体免疫病症)、心血管病症(例如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、传染病(例如伊波拉病毒、马堡病毒)或糖尿病的方法。在一个此类实施例中，所述方法进一步包含向个体施用有效量的至少一种如下文所描述的额外治疗剂。根据任一以上实施例的“个体”可为人类。
在另一方面中，本发明提供一种在个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)和/或抑制肿瘤基质功能的方法。在一个实施例中，所述方法包含向个体施用有效量的抗Axl抗体或抗体片段以抑制血管生成、抑制细胞增殖、促进免疫功能、诱导发炎性细胞介素分泌(例如来自肿瘤相关的巨噬细胞)、抑制肿瘤血管发展(例如瘤内血管或肿瘤相关的血管)和/或抑制肿瘤基质功能。在一个实施例中，“个体”为人类。
在另一方面中，本发明提供包含本文所提供的抗Axl抗体或抗体片段中的任一者的医药调配物，例如用于上述治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，医药调配物包含本文所提供的抗Axl抗体或抗体片段中的任一者和药学上可接受的载剂。在另一实施例中，医药调配物包含本文所提供的抗Axl抗体或抗体片段中的任一者和至少一种额外治疗剂，例如如下文所描述。
在各和每一上文所描述的治疗中，本发明的抗体或抗体片段可单独、以免疫结合物形式或与其它药剂组合用于治疗中。举例来说，本发明的抗体可与至少一种额外治疗剂共施用。在某些实施例中，其它治疗剂是抗血管生成剂。在某些实施例中，其它治疗剂是VEGF拮抗剂(在一些实施例中，是抗-VEGF抗体，例如贝伐单抗(bevacizumab))。在某些实施例中，其它治疗剂是EGFR拮抗剂(在一些实施例中，是埃罗替尼)。在某些实施例中，其它治疗剂是化学治疗剂和/或细胞生长抑制剂。在某些实施例中，其它治疗剂是紫杉醇(例如太平洋紫杉醇)和/或铂药剂(例如卡铂)。在某些实施例中，其它治疗剂是增强患者的免疫性或免疫系统的药剂。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括于相同或各别调配物中)和各别施用，在此情况下，抗体或抗体片段的施用可在其它治疗剂和/或佐剂施用之前、同时和/或之后进行。抗体或抗体片段也可与放射疗法组合使用。
抗体或抗体片段可以符合良好医学实务的方式调配、给药和施用。在此情形下，考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用时程和医学从业者已知的其它因素。抗体或抗体片段无需但任选地与一或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起调配。此类其它药剂的有效量视存在于调配物中的抗体或抗体片段的量、病症或治疗的类型和如上文所描述的其它因素而定。其一般是以相同剂量且以如本文所描述的施用途径使用，或以约1至99％的本文所描述的剂量，或以凭经验/在临床上确定适当的任何剂量和任何途径使用。
为预防或治疗疾病，抗体或抗体片段(当单独或与一或多种其它额外治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体或抗体片段的类型、疾病的严重程度和病程、抗体或抗体片段是出于预防性抑或治疗性目的施用、先前疗法、患者的临床病史和对抗体或抗体片段的反应、以及主治医师的判断。一次性或历经一系列治疗向患者适当地施用抗体或抗体片段。视疾病的类型和严重程度而定，约1μg/kg至40mg/kg的抗体或抗体片段可为例如通过一或多次分别施用或通过连续输注向患者施用的初始候选剂量。一种典型日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或以上的范围内，视上文所提及的因素而定。经历数日或更长时间重复施用时，视病状而定，治疗一般持续至疾病症状发生所需抑制为止。此类剂量可间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如以使得患者接受约二至约二十次剂量，或例如约六次剂量的抗体或抗体片段)。最初可施用较高起始剂量，随后可施用一或多种较低剂量。然而，其它给药方案可为适用的。此疗法的进程容易通过常规技术和分析来监视。
应理解，代替抗Axl抗体或除抗Axl抗体以外，可使用本发明的抗体片段或免疫结合物进行上述调配或治疗方法中的任一者。
增强宿主的免疫功能以对抗肿瘤是日益关注的主题。常规方法包括(i)APC增强，例如(a)注射至编码外来MHC同种异体抗原的DNA的肿瘤中，或(b)用增加肿瘤的免疫抗原识别概率的基因转染活组织检验肿瘤细胞(例如免疫刺激细胞介素、GM-CSF、共刺激分子B7.1、B7.2)，(iii)授受性细胞免疫治疗，或用活化肿瘤特异性T细胞处理。授受性细胞免疫治疗包括分离肿瘤浸润性宿主T-淋巴细胞，例如经由通过IL-2或肿瘤或两者刺激来活体外扩增群体。另外，功能异常的经分离的T细胞也可通过活体外施用抗PD-L1抗体来活化。接着可将共同活化的T细胞重新施用宿主。此些方法中的一或多者可与施用本发明的抗体、抗体片段或免疫结合物组合使用。
传统癌症疗法包括以下：(i)放射疗法(例如放射线疗法、X射线疗法、照射)或使用电离辐射来杀死癌细胞和收缩肿瘤，放射疗法可经由外射柱放射疗法(EBRT)外部施用或经由近接疗法内部施用；(ii)化学疗法或细胞毒性药物的应用，其一般影响快速分裂细胞；(iii)靶向疗法或具体影响癌细胞的蛋白质失调的药剂(例如酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)；单克隆抗体、光动力疗法)；(iv)免疫疗法或增强宿主的免疫反应(例如疫苗)；(v)激素疗法或激素阻断(例如，当肿瘤对激素敏感时)；(vi)血管生成抑制剂或阻断血管形成和生长；和(vii)姑息治疗，或针对改善护理质量以减少疼痛、恶心、呕吐、腹泻和出血的治疗。例如吗啡碱(吗啡碱)和氧可酮(oxycodone)的止痛药、例如昂丹司琼(ondansetron)和阿匹坦(aprepitant)的镇吐药可允许更具侵袭性的治疗方案。
在治疗癌症中，可在施用抗Axl抗体或抗体片段之前、之后或同时进行用于治疗癌症免疫的先前所描述常规治疗中的任一者。另外，抗Axl抗体或抗体片段可在常规癌症治疗之前、之后或同时施用，例如施用肿瘤结合抗体(例如单克隆抗体、毒素结合的单克隆抗体)和/或施用化学治疗剂。
给药方案
本发明提供治疗表达Axl的肿瘤的给药方案。给药方案包含一定剂量的抗Axl抗体或抗体片段或包括如本文所描述的本发明的抗Axl抗体或抗体片段的免疫结合物，其剂量为约0.3mg/kg体重至约2.0mg/kg体重、0.4mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.5mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.9mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.0mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.1mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.2mg/kg体重至约1.3mg/kg体重、0.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.4mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.5mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重或1.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，持续至少两周(例如14天时段)或三周(例如21天时段)。更优选为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，持续至少两周(例如14天时段)或三周(例如21天时段)。每周剂量可以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)进行施用。
在某些实施例中，给药方案包含一定剂量的如本文所描述的多肽、抗体或抗体片段或本发明的免疫结合物，其剂量为0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重，持续至少两周(例如14天时段)或三周(例如21天时段)。每周剂量可以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)进行施用。
在某些实施例中，给药方案包含一定剂量的如本文所描述的抗体-药物结合物，其剂量为约0.3mg/kg体重至约2.0mg/kg体重、0.4mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.5mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.9mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.0mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.1mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.2mg/kg体重至约1.3mg/kg体重、0.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.4mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.5mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重或1.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，持续至少两周(例如14天时段)或三周(例如21天时段)。更优选为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，持续至少两周(例如14天时段)或三周(例如21天时段)。每周剂量可以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)进行施用。
在一些实施例中，给药方案包含一定剂量的如本文所描述的抗体-药物结合物，其剂量为0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重，持续至少两周(例如14天时段)或三周(例如21天时段)。每周剂量可以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)进行施用。
在某些实施例中，每周剂量以分开递送或以单周剂量形式施用，持续至少一个两周(例如14天)治疗周期或至少一个三周(例如21天)治疗周期。在一些实施例中，剂量将在14天治疗周期的第1天和第8天以单周剂量形式施用。优选地，每周剂量以分开递送或以单周剂量的形式施用持续两个或更多个14天治疗周期，甚至更优选地持续三个或更多个、四个或更多个、五个或甚至六个或更多个治疗周期。在一些具体实例中，每周剂量施用持续不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个治疗周期。在一些实施例中，剂量将在21天治疗周期的第1天和第8天以单周剂量形式施用。优选地，每周剂量以分开递送或以单周剂量的形式施用持续两个或更多个21天治疗周期，甚至更优选地持续三个或更多个、四个或更多个、五个或甚至六个或更多个治疗周期。在一些具体实例中，每周剂量施用持续不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个治疗周期。优选地，治疗周期之间将存在休息时段。
例如，在一些优选实施例中，给药方案将为每周总剂量的抗体-药物结合物，其剂量为约0.3mg/kg体重至约2.0mg/kg体重、0.4mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.5mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.9mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.0mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.1mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.2mg/kg体重至约1.3mg/kg体重、0.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.4mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.5mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、1.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重或1.7mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，持续至少两个治疗周期，治疗周期中的每一者之间存在一周的休息时段。在一些实施例中，治疗周期将大于14天。在一些实施例中，治疗将大于21天。每周剂量可以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)进行施用。
例如，在一些优选实施例中，给药方案将为每周总剂量的抗体-药物结合物，其剂量为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重，持续至少两个治疗周期，治疗周期中的每一者之间存在一周的休息时段(例如，在八周时间段内进行六次单周剂量)。在一些实施例中，治疗周期将大于14天。在一些实施例中，治疗周期将大于21天。每周剂量可以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)进行施用。
在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约0.8mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约0.9mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.0mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.1mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.2mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.3mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.4mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.5mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.6mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.7mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为以单周剂量(一周一次)或通过分开递送(例如每周两次或更多次)施用约1.8mg/kg体重。在一些实施例中，每周剂量的抗体药物结合物将为个体体重的0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8mg/kg。
在治疗周期之间具有一周休息时段的两周(14天时间段)治疗周期也可称为3周(21天)治疗周期，其中在3周治疗周期中抗体-药物结合物在3周中2周递送。同样地，在治疗周期之间具有一周休息时段的三周(21天时间段)治疗周期也可称为4周(28天)治疗周期，其中在4周治疗周期中抗体-药物结合物在4周中3周递送。因此，在一些实施例中，剂量是在3周治疗周期中以每周、以分开递送形式或以单周剂量形式在3周中2周施用，或剂量是在4周治疗周期中以每周、以分开递送形式或以单周剂量形式在4周中3周施用。在一些实施例中，剂量将在21天治疗周期的第1天和第8天以单周剂量形式施用，或剂量将在28天治疗周期的第1天和第8天以单周剂量形式施用。优选地，以分开递送或以单周剂量形式的每周剂量施用两个或更多个四周治疗周期，甚至更优选地持续三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至六个或更多个四周治疗周期(例如，2、3、4、5或6个连续治疗周期)。在一些具体实例中，每周剂量施用持续不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个治疗周期。例如，在一些优选实施例中，给药方案将为以分开递送形式或以单周剂量形式的每周剂量，每周总剂量为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重的抗体药物结合物，进行3周中的2周，持续至少两个三周治疗周期。例如，在一些优选实施例中，给药方案将为以分开递送形式或以单周剂量形式的每周剂量，每周总剂量为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重的抗体药物结合物，进行4周中的3周，持续至少两个四周治疗周期。
在一些优选实施例中，给药方案将为以分开递送形式或以单周剂量形式的每周剂量，每周总剂量为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重的抗体药物结合物，进行3周中的2周，持续至少一个、两个、三个、四个、五个四周治疗周期(例如，在六周时间段内进行四次单周剂量，在九周时间段内进行六次单周剂量，在十二周时间段内进行八次单周剂量)。
在一些优选实施例中，给药方案将为以分开递送形式或以单周剂量形式的每周剂量，每周总剂量为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重的抗体药物结合物，进行4周中的3周，持续至少一个、两个、三个、四个、五个四周治疗周期(例如，在八周时间段内进行六次单周剂量，在十二周时间段内进行九次单周剂量，在十六周时间段内进行十二次单周剂量)。
在一或多个治疗周期之后或期间(例如，在第二治疗周期的第14天至第21天期间或在第二治疗周期的第21天至第28天期间)，可评估(例如，经由临床或诊断测试)个体以确定个体是否应保持治疗时程。举例来说，在一或多个28天治疗周期(例如1、2、3、4、5或6个28天治疗周期)之后或期间，可评估(例如临床和/或诊断评估)个体。视评估而定，个体将中断治疗、继续用额外治疗周期治疗或开始维持疗法。如果个体继续治疗，那么可在一或多个额外治疗周期之后进一步评估个体。视连续评估而定，个体将中断治疗、继续用额外治疗周期治疗或开始维持疗法。
本发明涵盖各实施例，其中在指示个体患有不可检测的癌症的评估之后，例如在对表达CD30的癌症呈阴性的诊断测试(即诊断测试不能检测个体中的任何癌症)之后，个体仍维持每周治疗周期(例如两周治疗周期或三周治疗周期)。举例来说，在一些实施例中，个体将在此类评估之后维持至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个治疗周期的每周治疗周期。在一些实施例中，个体将维持至少两个但不超过3个、不超过4个、不超过5个或不超过6个治疗周期的每周治疗周期。用于确定癌症的存在和严重程度的诊断测试的一个实例为正电子发射断层摄影(PET)。
在一些实施例中，个体将在一或多个、优选两个或更多个(例如，在1、2、3、4、5或6个之后)治疗周期(例如，四周治疗周期)之后开始维持疗法。在一些实施例中，例如在指示个体已经历完全反应的评估之后，个体将在指示个体患有极少或无可检测的癌症的评估之后开始维持疗法。如本文所使用，维持疗法是指使用抗体-药物结合物，但以减少的施用时程以相同或不同剂量进行的疗法。在维持疗法期间，抗体-药物结合物优选每两周治疗期至少一次、每三周治疗期一次、每两周治疗期的第1天和第8天或每三周治疗期的第1天和第8天施用。在此些维持疗法周期之后，可进一步评估(例如经由临床或诊断测试)个体以测定个体是否应保持维持疗法、继续常规治疗或中断治疗。在一些实施例中，维持疗法将为每两周至四周一次，或每三周至六周一次。在维持疗法期间施用的抗体药物结合物的剂量可在例如每剂量约0.3mg/kg体重至约2.0mg/kg体重，优选约0.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，优选约1.2mg/kg体重至约2.0mg/kg体重，更优选约1mg/kg体重至约1.8mg/kg体重范围内，其中1.8mg/kg为示范性剂量。
在一些实施例中，在结束每周治疗，其中抗体药物结合物的剂量为约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，更优选剂量为约0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重且评估之后，个体将开始维持疗法，其包含以约0.3mg/kg体重至约2mg/kg体重、优选约0.6mg/kg体重至约1.8mg/kg体重、优选约1.2mg/kg体重至约2.0mg/kg体重、更优选约1mg/kg体重至约1.8mg/kg体重的剂量每两周至四周一次或每三至六周一次施用抗体-药物结合物，其中约1.8mg/kg为优选剂量。在一些实施例中，在每周治疗(例如，持续一个、两个、三个、四个或五个治疗周期)结束之后，个体将开始每两周一次施用时程(例如，两周维持疗法周期的第1天进行治疗)，其中抗体药物结合物的剂量为约0.4mg/kg体重至约2mg/kg体重、约0.6mg/kg体重至约2.0mg/kg体重或约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，其中约1.8mg/kg为优选剂量。在一些实施例中，在每周治疗(例如，持续一个、两个、三个、四个或五个治疗周期)结束之后，个体将开始每三周一次施用时程(例如，三周维持疗法周期的第1天进行治疗)，其中抗体药物结合物的剂量为约0.4mg/kg体重至约2mg/kg体重、约0.6mg/kg体重至约2.0mg/kg体重或约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，其中约1.8mg/kg为优选剂量。
本发明包涵各实施例，其中个体将以分开递送形式或以单周剂量形式施用每周剂量，抗体药物结合物的每周总剂量为约0.8mg/kg个体体重至约1.8mg/kg个体体重、约0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、约0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、约0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或约0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重，进行3周中的2周，持续至少一个、两个、三个、四个、五个或六个21天治疗周期，随后进行每两周至四周剂量，优选每两周剂量施用，其中抗体药结合物的剂量为每剂量约0.4mg/kg体重至约2mg/kg体重、约0.6mg/kg体重至约2.0mg/kg体重或约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，持续2个或更多个维持疗法周期。在一些实施例中，每周施用周期将持续2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个治疗周期，且每两周施用时程将持续2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个维持疗法周期。在一些实施例中，每周施用周期将持续不超过2、3、4、5或6个治疗周期。
本发明包涵各实施例，其中个体将以分开递送形式或以单周剂量形式施用每周剂量，抗体药物结合物的每周总剂量为约0.8mg/kg个体体重至约1.8mg/kg个体体重、约0.8mg/kg体重至约1.6mg/kg体重、约0.8mg/kg体重至约1.4mg/kg体重、约0.8mg/kg体重至约1.2mg/kg体重或约0.8mg/kg体重至约1.0mg/kg体重，进行4周中的3周，持续至少一个、两个、三个、四个、五个或六个28天治疗周期，随后每三周至六周给药一次，优选每三周给药一次进行施用，其中抗体药结合物的剂量为每剂量约0.4mg/kg体重至约2mg/kg体重、约0.6mg/kg体重至约2.0mg/kg体重或约0.8mg/kg体重至约1.8mg/kg体重，持续2个或更多个维持疗法周期。在一些实施例中，每周施用周期将持续2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个治疗周期，且每三周施用时程将持续2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个维持疗法周期。在一些实施例中，每周施用周期将持续不超过2、3、4、5或6个治疗周期。
本发明涵盖各实施例，其中个体将3周中的2周(例如在21天治疗周期的第1天和第8天)以分开递送形式或以单周剂量形式施用每周剂量，以个体体重的约0.8mg/kg至约1.8mg/kg剂量施用抗体药物结合物的每周总剂量，持续一个、两个、三个、四个、五个或六个21天治疗周期，随后进行每两周至四周剂量施用。优选地，每两周剂量的抗体药物结合物以约1.8mg/kg/体重的剂量持续2个或更多个维持疗法周期(例如，每两周约1.8mg/kg/体重的剂量持续两个或更多个两周维持疗法周期)。优选地，每两周剂量的抗体药物结合物以约0.8mg/kg/体重的剂量持续2个或更多个维持疗法周期(例如，每两周约0.8mg/kg/体重的剂量持续两个或更多个两周维持疗法周期)。
本发明涵盖各实施例，其中个体将4周中的3周(例如在28天治疗周期的第1天和第8天)以分开递送形式或以单周剂量形式施用每周剂量，以个体体重的约0.8mg/kg至约1.8mg/kg剂量施用抗体药物结合物的每周总剂量，持续一个、两个、三个、四个、五个或六个28天治疗周期，随后进行每三周至六周剂量施用。优选地，每三周剂量的抗体药物结合物以约1.8mg/kg/体重的剂量持续2个或更多个维持疗法周期(例如，每三周约1.8mg/kg/体重的剂量持续两个或更多个三周维持疗法周期)。优选地，每三周剂量的抗体药物结合物以约0.8mg/kg/体重的剂量持续2个或更多个维持疗法周期(例如，每三周约0.8mg/kg/体重的剂量持续两个或更多个三周维持疗法周期)。
本发明涵盖各实施例，其中待通过本发明方法治疗的个体用本发明的mAbBA301-可裂解连接子-MMAE(n)抗体-药物结合物治疗，但以除每周给药方案以外的时程进行治疗(例如，以约1.8mg/kg体重的剂量每两周进行抗体药物结合物的施用，持续一或多个两周疗法周期，或每三周进行一或多个三周疗法周期)，且切换为如本文所描述的每周给药方案，持续不超过1、2、3、4、5或6个治疗周期。在每周给药方案之后，患者可任选地开始如本文所描述的维持疗法。
抗体-药物结合物优选以单一疗法形式进行施用。术语“单一疗法”意谓抗体药物结合物为在治疗周期期间向个体施用的唯一抗癌剂。然而，可如本文所描述向个体施用其它治疗剂。举例来说，程序性死亡受体-1(PD-1)阻断抗体或颗粒球群落刺激因子或其类似物。另外，向患有癌症的个体施用以治疗与癌症相关的症状但本身并非为潜在癌症(包括例如发炎、疼痛、体重减轻和一般不适)的消炎剂或其它试剂也可在单一疗法时段期间施用。通过本发明方法治疗的个体优选在施用抗体药物结合物之前将完成用抗癌剂进行的任何先前治疗。在一些实施例中，在用抗体药结合物治疗之前，个体将已完成用抗癌剂进行的任何先前治疗至少1周(优选2、3、4、5、6、7或8周)。优选地，个体在用抗体药物结合物完成第一治疗周期后至少2周(优选至少3、4、5、6、7或8周)且优选在完成最后一次剂量的抗体药物结合物后至少2周(优选至少3、4、5、6、7或8周)也不用任何额外抗癌剂进行治疗。本发明的方法涵盖向个体施用抗Axl抗体或抗体片段或包含本发明的抗Axl抗体或抗体片段的免疫结合物以治疗表达Axl的肿瘤。
在一些实施例中，在向个体施用包含本发明的抗Axl抗体或抗体片段的免疫结合物且使抗Axl抗体与表达Axl的肿瘤细胞结合之后，抗体-药物结合物内化至细胞中，且释放药物。举例来说，本发明的方法涵盖向个体施用mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)抗体-药物结合物以治疗表达Axl的肿瘤。在结合之后，mAbBA3011-可裂解连接子-MMAE(n)抗体-药物结合物内化至肿瘤细胞中，其中肽连接子通过蛋白酶裂解以释放MMAE。预期MMAE特定递送至表达Axl的肿瘤细胞以预防进一步肿瘤细胞增殖，且使肿瘤缩小。
待用本发明方法治疗的个体为已诊断患有表达Axl的癌症或疑似患有表达Axl的癌症的个体。诊断可以通过所属领域中已知的方法，包括例如组织活组织检验。
制品和试剂盒
在本发明的另一方面中，提供含有适用于治疗、预防和/或诊断上述病症的制品。制品包含容器和容器上或容器随附的标记或药品说明书。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳单独或与有效治疗、预防和/或诊断病状的另一组合物组合的组合物，且可具有无菌接取口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或抗体片段。标记或药品说明书指示组合物用于治疗所选病状。此外，制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含抗体或抗体片段；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一细胞毒性或其它治疗剂。本发明的此实施例中的制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定病状的药品说明书。或者或另外，制品可进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。其可进一步包括就商业和用户观点而言所期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
应理解，代替抗Axl抗体或除抗Axl抗体的外，以上制品中的任一者可包括本发明的免疫结合物。
最后，本发明也提供包含至少一种本发明的抗体或抗体片段的试剂盒。含有本发明的多肽、抗体或抗体片段或抗体药物结合物的试剂盒可用于检测Axl表达(增加或减少)或用于治疗或诊断分析。本发明的试剂盒可含有偶合至固体支撑物(例如组织培养物盘或珠粒(例如琼脂糖珠粒))的抗体。可提供含有抗体的试剂盒用于例如在ELISA或西方墨点法中活体外检测和定量Axl。此类适用于检测的抗体可具有标记，例如萤光或放射性标记。
所述试剂盒进一步含有关于其用途的说明书。在一些实施例中，说明书包含美国食品与药物管理局对于活体外诊断试剂盒所要求的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含根据样品存在或不存在Axl而诊断所述样品中存在或不存在脑脊髓液的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒包含一或多种抗体或抗体片段。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包含一或多种酶、酶抑制剂或酶活化剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含一或多种色谱化合物。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包含一或多种用以制备光谱分析用样品的化合物。在其它实施例中，所述试剂盒进一步包含比较参考材料以根据指示剂的强度、颜色光谱或其它物理属性来解释Axl存在或不存在。
肿瘤中Axl的质膜评分(肿瘤膜P评分)
Axl在肿瘤细胞和巨噬细胞中的子组中具有反应性。在肿瘤细胞中，Axl主要位于质膜中，但也可在细胞质中观测到。表达Axl的巨噬细胞通常存在于肿瘤细胞/巢中和邻近于肿瘤的基质(肿瘤相关基质或肿瘤基质)内。Axl巨噬细胞染色局限于质膜或细胞质，不过并非所有巨噬细胞都经Axl标记。
CD68表达于巨噬细胞的细胞质中，且为用于鉴别此免疫细胞类型的标准生物标志物。巨噬细胞可存在于整个组织样品中，但当存在于肿瘤细胞中(肿瘤块内)和肿瘤/基质界面(肿瘤相关基质)时通常最受关注。
因Axl表达于肿瘤细胞与巨噬细胞中，所以本发明使用评分方法比较各样品的连续切片中的Axl和CD68染色。以此方式，使用CD68生物标志物来鉴别针对Axl染色的肿瘤中的巨噬细胞。即，CD68连续切片用于区分肿瘤细胞与巨噬细胞中的Axl反应性。使用此方法，仅在肿瘤细胞中对Axl质膜染色进行评分。自针对Axl的评估中“减去”CD68染色以提供不包括巨噬细胞的Axl肿瘤评分(下文中的“肿瘤膜P评分”)。
用于对Axl和CD68评分的方法可通过如下文所描述的方法检测，包括(但不限于)福马林固定、石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品中的免疫组织化学(IHC)。所有样品也用苏木精和伊红(H&E)染色而进行形态学评估以协助评分。
半定量地对肿瘤中的Axl质膜表达进行评分。评分的主要组成部分为在适当差异强度下染色的细胞百分比。
百分比评分用于描述每个样品的质膜染色的外显率。估计百分比且报道为增量，包括(但不限于)以下增量之一：0、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％。
在本发明的某些实施例中，表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90或至少95％。优选地，表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少70、至少75、至少80、至少85、至少90或至少95％。
使用四点标度半定量地(0，1+，2+，3+)记录质膜染色的差异强度。在此标度上，0＝无效、阴性或非特异性染色，1+＝低或弱染色，2+＝中或中度染色，且3+＝高或强染色。
当仅评估肿瘤细胞中的Axl反应性(不包括巨噬细胞的Axl肿瘤染色)时，串联需要Axl与CD68的染色玻片(巨噬细胞生物标志物)。用CD68的染色与用Axl的染色在肿瘤区域内密切对比。用Axl和CD68进行染色的细胞视为Axl反应性巨噬细胞(并非肿瘤细胞)，且排除在Axl评分的外。
巨噬细胞中的Axl染色使得难以在存在混合的阳性细胞类型群体时对肿瘤细胞中的质膜染色进行评分。为全面了解肿瘤质膜上的Axl表达(不包括癌症适应症的巨噬细胞)，使用标准百分比评分和H-评分方法来捕获观测到的反应性模式。
百分比评分方法
百分比评分是通过将≥1+、≥2+或≥3+处的强度百分比求和来计算。因此，评分在0至100范围内。
百分比评分≥1+＝(1+处的百分比)+(2+处的百分比)+(3+处的百分比)
百分比评分≥2+＝(2+处的百分比)+(3+处的百分比)
百分比评分≥3+＝(3+处的百分比)
H-评分方法
通过将具有表达强度(棕色染色)的细胞的百分比乘以其在四点半定量标度(0，1+，2+，3+)上的对应差异强度进行求和来计算H-评分。因此，评分在0至300范围内。
H-评分＝[(<1处的百分比)x 0]+[(1+处的百分比)x 1]+[(2+处的百分比)x2]+[(3+处的百分比)x 3]
巨噬细胞染色的评分
·如所陈述，CD68为巨噬细胞的标准生物标志物且Axl可表达于此细胞类型中。
·用CD68和Axl染色的玻片用于评估各肿瘤组织中CD68阳性和Axl阳性巨噬细胞的相对丰度。
·在以下区域中获得CD68和Axl阳性的巨噬细胞估计值：肿瘤块(称为“肿瘤”)内和肿瘤相关基质或与肿瘤相互作用的基质(称为“肿瘤基质”)内。肿瘤基质表示对肿瘤的实质反应。其为肿瘤块的外边缘或“表面”的外部或相邻处的基质反应。
·在肿瘤中，评分表示肿瘤块或肿瘤巢中由CD68或Axl阳性巨噬细胞构成的细胞百分比(0-100％)。
·在肿瘤基质中，使用0-3的半定量标度对Axl和CD68的巨噬细胞丰度进行评分。在此标度上，0表示无阳性巨噬细胞，1指示低密度阳性巨噬细胞，2指示中度密度阳性巨噬细胞，且3指示高密度阳性巨噬细胞。
肿瘤细胞质中Axl的评分
·显示弥漫性Axl细胞质染色的肿瘤百分比(阳性细胞％)自0-100％估计。此类染色的平均强度使用0-3的标度估计。在此标度上，0表示无细胞质染色，1表示弱细胞质染色，2表示中度细胞质染色，且3表示强或剧烈细胞质染色。
·细胞质中的强Axl染色可使得难以辨别潜在膜信号。
以下实例说明但不限制本发明的软明胶胶囊。所属领域中通常遇到且对熟习所属领域者显而易见的各种条件和参数的其它适合的修改和调整均在本发明的范围内。
实例
实例1：针对Axl的条件性活性抗体
Axl为细胞表面跨膜酪氨酸激酶，其胞外域可由条件性活性抗体进入。此细胞表面蛋白质高度表达于甲状腺癌组织中且过度表达于许多其它癌症中，例如肉瘤、骨髓增生病症、前列腺癌细胞或乳癌。AXL表达的增加与对化学疗法、程序性死亡-1(PD-1)抑制剂、分子靶向疗法以及放射疗法的肿瘤抗性相关。本文中产生针对Axl蛋白的胞外域的条件性活性抗体。
选择针对Axl的野生型抗体作为模板抗体(在图1A中具有063-hum10F10-HC的重链可变区和图1B中具有063-hum10F10-HC的轻链可变区)。编码野生型抗体的DNA使用综合位置演进(CPE)进化而产生突变体抗体文库，通过此方法模板抗体中的各位置一次随机分组一个。文库中的各突变体抗体仅具有一个单点突变。所述文库中的突变体抗体是通过ELISA测定在pH 6.0和pH 7.4下同时筛选对Axl的选择性结合亲和力而产生。
同时，也使突变体抗体的表达量优化以达到在制造过程中得到较高区域的目的。在血清中使用FLAG标签进行筛检，这是因为血清中存在可导致筛检假阳性的人类抗体。筛选缓冲剂为碳酸盐缓冲剂(克雷布斯(krebs)缓冲剂与林格氏标准缓冲剂，但与PBS不同)。与野生型抗体相比，发现所产生的条件性活性抗体与Axl在pH 6.0下具有较高亲和力，但在pH 7.4下对Axl具有较低亲和力。图2中表示，一些所选突变体抗体(scFv)在pH 6.0下相较于pH 7.4具有较高活性，而其在pH 6.0至pH 7.4之间的活性比率为至少11倍(图3)。
另外，此些条件活性抗体均具有高表达量，如下表4中所示，其中行“克隆”展示抗体且表达量“mg/ml”显示于第二纵行中。
以所需表达量(“预订量”，预期表达量)将此些抗体克隆传送至服务提供商。然而，此些抗体的实际表达量(“递送量”)极高且超出预期表达量。
表4.具有高表达量的条件性活性抗体
使用BAP063.9-13-1抗体作为实例，条件性活性抗体不展示缓冲液中的聚集，如图4中所展现。BAP063.9-13-1抗体通过尺寸排阻色谱分析。在图4中，仅检测到一个峰，表明抗体极少或不聚集。
也使用表面等离子体子共振(SPR)分析条件性活性抗体以测量其对Axl的缔合和解离速率。SPR分析已知测量条件活性抗体的缔合和解离速率。在碳酸氢盐存在下进行SPR分析。条件活性抗体的活体内缔合和解离速率(在动物和人类中)为条件活性抗体极其重要的特征。
观测到，相较于阴性对照(BAP063 10F10，其在pH 6.0和pH 7.4下具有类似结合亲和力)，条件活性抗体在pH 6.0下具有较高结合亲和力且在pH 7.4下具有较低结合亲和力(图5)。另外，将温度自室温提高至60℃不会明显地改变ELISA分析结果(图5)。ELISA分析也展示此些条件性活性抗体在pH 6.0下相较于pH 7.4具有高度选择性(图6A-6B展示一种抗体作为实例)。
条件性活性生物学抗体概述于表5中。两种抗体表达为scFv(BAP063.9-13.3和BAP063.9-48.3)。在60℃下培育抗体一小时不会改变大部分抗体的亲和力(“热稳定性”)。
根据本发明可使用条件性活性抗体来检测CTC的表面上的Axl蛋白质。
表5-条件性活性抗Axl抗体的概述
实例2：抗Axl抗体的pH依赖性结合亲和力
在不同pH水平的缓冲液中测试一些本发明的抗Axl抗体。一种缓冲液为存在有1％牛血清白蛋白(BSA)的KREBS缓冲液。滴定KREBS缓冲液以具有在5至7.4范围内的pH值。使用ELISA分析(OD450)测量抗体与Axl的结合亲和力且结果呈现于图7中。两种对照抗体(BAP063-3831和BAP063-3818)并非条件性地具有活性，因为其具有不受pH变化显着影响的结合亲和力。另一方面，本发明的抗Axl抗体为条件性活性的，因为其与Axl的结合亲和力视pH而定(图7)。
实例3：抗Axl抗体的细胞杀伤
使用A549细胞测试本发明的抗Axl抗体的细胞杀伤活性。结果展示于图8A至图8E中。在以下两个pH水平下测量细胞杀伤活性：6.0和7.4，其分别表示肿瘤微环境中的pH和正常生理pH。各种抗体浓度下的细胞杀伤百分比展示于图8A至图8E中。
两次测试得到一致的细胞杀伤结果。阴性对照(抗Axl人类化WT)展示A549细胞在pH 6.0和pH 7.4下类似的细胞杀伤活性(图8A).相比的下，本发明的抗Axl抗体在pH 6.0时的细胞杀伤活性明显高于pH 7.4时的细胞杀伤活性，尤其在抗体浓度较低时，此时抗体并不使A549细胞饱和(图8B-8E)。
实例4：抗Axl抗体与cyno-Axl的结合亲和力
测量通过本发明的抗Axl抗体与cyno-Axl的结合亲和力，且与两种不同缓冲液中的人类Axl(hAxl)在pH 6.0和7.4下的结合亲和力相比。结果展示于图9A至图9D中。cyno-Axl是来自非人类灵长类动物即食蟹猕猴的Axl蛋白质。
对照(BA-3831-WT)在两种缓冲液中在pH 6.0和7.4下展示与人类Axl(hAxl)和食蟹猕猴Axl(cyno-Axl)两者的类似的结合亲和力(图9A)。本发明的抗Axl抗体在两种缓冲液中的一者对hAxl和cyno-Axl显示出类似的结合亲和力，即在pH 7.4时对cyno-Axl的结合亲和力比在pH 6.0时对cyno-Axl的结合亲和力低(图9B-9D)。在其它缓冲液中在pH 6.0和pH7.0时的结合亲和力差异不显着。
实例5：与金霉素结合的抗Axl抗体的细胞毒性
金霉素由于其通过阻止蛋白质合成而抑制细胞生长而为细胞毒性的。本发明的抗Axl抗体中的一者BAP063.9 4007，其与金霉素结合。在此测试中使用两种对照，BAP063 humWT和B12(抗B12抗体)，两者也结合金霉素。
在pH 6.0和7.4下用三种金霉素结合的抗体(BAP063.9 4007、BAP063 hum WT和B12)处理若干细胞系(图10A-10H)。与在pH 7.4下的相同细胞的细胞毒性相比，本发明的金霉素结合的抗体BAP063.9 4007在pH 6.0下对细胞系DU145(前列腺癌细胞)、MDA-MD-231(乳癌细胞)、PL45(胰脏癌细胞)和A549(腺癌细胞)显示出显着更高的细胞毒性。
实例6：与模型毒素结合的抗Axl抗体
使本发明的抗Axl抗体结合于模型毒素(例如吉西他滨)以产生条件性活性抗体-药物结合物(CAB-Axl-ADC)。首先测试CAB-Axl-ADC以证实条件细胞杀伤活性未通过药物结合过程改变。此测试显示CAB-Axl-ADC在pH 6.0下比在pH 7.4下显着杀死更多的细胞(图11)。
随后将CAB-Axl-ADC每周两次以1mg/kg的剂量注射至携带MiaPaCa2异种移植肿瘤的小鼠中，持续3周。此研究中使用若干对照物，包括裸CAB(无结合的抗Axl抗体)、媒剂、单独毒素(未结合的吉西他滨)、对照ADC、亲和力匹配抗Axl ADC(AM ADC)。所述研究展示与对照相比，CAB-Axl-ADC(CAB ADC)和AM ADC使肿瘤大小明显大大减小(图12)。未结合的抗Axl抗体未减小肿瘤大小。此研究显示与毒素结合的抗Axl抗体在减小肿瘤大小方面与亲和力匹配抗体同样有效。
实例7：食蟹猕猴中抗Axl抗体药物结合物的血清浓度
将本发明的抗Axl抗体(CAB-ADC)的药物(金霉素)结合物以三种剂量注射至雄性和雌性食蟹猕猴中：0.1、1和10mg/kg。裸抗Axl抗体用作对照。亲和力匹配抗体药物结合物(AM-ADC)也用作对照。在一周时间段(168小时，参见图13A-13B)内测量抗体的血清浓度。CAB-ADC在猴血清中的持续时间比AM-ADC对照组更长(图13B)。雄性与雌性猴之间不存在显着差异(图13A-13B)。
实例8：食蟹猕猴中抗Axl抗体药物结合物的毒性
本发明的CAB-ADC在食蟹猕猴中测试的毒性。天冬氨酸转胺酶(AST)和丙氨酸转胺酶(ALT)已被食品与药物管理局(FDA)用作药物的肝脏毒性的指标。在雄性和雌性猴中测量血清AST和ALT水平(图14A-14B)。媒剂(PBS)未引起血清中的AST或ALT水平改变，而匹配抗体药物结合物(AM)在10mg/kg剂量后3天显示出极高AST和ALT水平。与AM对照相比，CAB-ADC显示AST和ALT水平显着减少。此表明，相对于匹配抗体药物结合物AM，本发明的抗Axl抗体药物结合物的肝脏毒性显着降低。
也发现本发明的抗Axl抗体药物结合物在猴中引起较少发炎(图15)。在注射CAB、AM和PBS之后，收集猴血液中淋巴细胞的计数。与引起显着发炎的AM相比，本发明的抗Axl抗体药物结合物(CAB-ADC)仅在猴中引起轻度发炎。
实例9：小鼠中的活体内实验
将小鼠植入2个肿瘤细胞系(LCLC103H或DU145)中的一者，所述细胞系将发展成肿瘤。测量在用抗肿瘤药物单甲基奥瑞他汀E(MMAE)处理之后的肿瘤大小。对于接受LCLC103H的小鼠，小鼠用单一剂量的媒剂(作为阴性对照)、CAB抗Axl抗体结合MMAE ADC(CAB Axl-MMAE)，或非CAB抗Axl抗体结合MMAE ADCC(非CAB Axl-MMAE)处理，图16A.ADC处理的小鼠中的肿瘤收缩，同时用媒剂处理的小鼠中的肿瘤持续生长。
此外，接受DU145的小鼠用媒剂(阴性对照)或CAB抗Axl抗体结合MMAE ADC(CABAxl-MMAE)以两种不同浓度(6mg/kg和10mg/kg)处理。随时间推移测量肿瘤体积。肿瘤在阴性对照组(媒剂)中持续生长，而肿瘤生长在用ADC处理的小鼠中减缓(图16B)。
实例10：肿瘤膜P评分
程序
Axl(细胞表面受体酪氨酸激酶)的免疫组织化学(IHC)染色使用来自LifespanBiosciences的单克隆小鼠IgG克隆7E10(目录号LS-B6124)，用于检测福马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织中的Axl。
CD68的IHC染色使用来自Dako(目录号M0814)的标准小鼠单克隆抗体(克隆KP1)，用于检测巨噬细胞(表13)。IHC程序使用方案描述于下文TechMate染色平台上。
·步骤1：以4-5μM厚度切割FFPE组织块且将切片安置于带正电荷的毛细管间隙玻璃玻片上。玻片在使用之前进行烘烤(60℃，干热)。
玻片制备
a.进行显微切片。将四至五微米(4-5μm)切片安装于Fisher Biotech 22-230-900Probe-On Plus显微镜玻片上。
b.在60℃下将玻片烘烤至少1小时(干热)且使其在室温下冷却最少15分钟，随后开始步骤2。
·步骤2：使用有机溶剂(二甲苯，100％，四次变化)和酒精系列(100％、70％、30％乙醇)降至蒸馏水对组织进行脱蜡，以充分水合且允许初级抗体和其它检测试剂适当结合。
脱蜡/抗原前修复
a.四次(4)更换室温(25℃)的绝对二甲苯，每次5分钟[不搅动]
b.两次(2)更换室温(25℃)的绝对酒精，每次2分钟[不搅动]
c.两次(2)更换室温(25℃)的70％酒精，每次2分钟[不搅动]
d.两次(2)更换室温(25℃)的30％酒精，每次2分钟[不搅动]
e.两次(2)更换室温(25℃)的蒸馏水进行冲洗[min.至少浸泡16次]
f.将玻片浸入室温(25℃)的蒸馏水中(转移至抗原恢复)
·步骤3：组织切片在脱蜡之后进行抗原修复。此步骤使用蒸汽热诱导的抗原决定基恢复(SHIER)溶液，用市售蒸锅(97℃以上持续20分钟)作为热源，抽取至形成于配对显微镜玻片之间的毛细管间隙中(关于描述请参见Ladner等人,Cancer Res.；第60卷,第3493-3503页,2000)。
蒸汽热抗原修复
a.预加热98℃以上的市售蒸锅
b.对Axl使用SHIER 2(Dako S1700，柠檬酸盐基，pH 6.0-6.2)，对CD68使用SHIER1(QualTek调配物，柠檬酸盐基，pH 5.6-6.1)，在98℃以上持续20分钟(Black&DeckerHS1000型蒸锅或同等产品)进行热诱导抗原/抗原决定基恢复。在TechMate试剂盘中，将多达十(10)张玻片与干净的空白玻片进行表面配对，其中盘中恰好有10mL抗原/抗原决定基恢复溶液，以便毛细血管将试剂抽取至组织上方。
c.恢复后冷却5分钟，将玻片对牢牢插入至TechMate玻片架，用吸水芯垫排空SHIER 1/SHIER 2。
d.用含有0.02％v/v Tween-20清洁剂的Tris缓冲盐水(TBST，由QualTek根据SOPMFB003调配的20X储备溶液，在用蒸馏/去离子水稀释后作为1X溶液进行使用[存储于4℃])使用毛细管作用(排空-抽吸)手动洗涤两(2)次。
·步骤4：根据表6中概述的通用程序，使用TechMate仪器平台和MIP程式(其不包括酶消化)或MIPE程式(其包括用蛋白酶K以1:40稀释度消化)，通过IHC测试样品。在IHC期间采用抗体的依序检测，其中对抗原或初级抗体具有高水平特异性。通过施用比色色素原(DAB)，在辣根过氧化物酶(HRP)存在的情况下，在抗原位点处沉淀出离散的不溶性反应产物，最终使初级抗体的位置可视化。使用苏木精(蓝色染色)对细胞核进行对比染色以评估细胞和组织形态。
表6
免疫组织化学
小鼠Polink2+HRP试剂(Golden Bridge International[GBI]；目录号:D37-110)在2-8℃下存储备用，以下所有程序在室温(25℃)下自动在TechMate上运行QualTek MIPE程序。试剂更换(洗涤、培育)通过毛细作用(排空-抽吸)进行，使用吸水芯垫(排空)和TechMate试剂盘(抽吸)。
a.用TBST洗涤三(3)次。
b.TBST用于Axl和蛋白酶K消化(1:40稀释度，Dako，目录号:S3020)，对于CD68持续10分钟。
c.用TBST洗涤三(3)次。
d.山羊阻断试剂(QML)，15分钟。
e.用TBST洗涤一(1)次。
f.Axl(1:1500)抗体克隆7E10(LifeSpan BioSciences目录号:LS-B6124)或CD68(1:7500)抗体克隆KP1(Dako目录号:M0814)，在QualTek试剂制造缓冲液(RMB：0.01M磷酸酯，0.151M NaCl，1％w/v BSA，0.1％v/v ProClin 300，0.2％v/v Tween-20，1％v/v正常山羊血清，pH 7.2，根据SOP MFB002通过QualTek调配)中自1:10工作储备液(保持4℃，也在RMB中)新鲜稀释一小时。
g.用TBST洗涤五(5)次。
h.小鼠Polink2+二级(GBI试剂盒的一部分，目录号:D37-110)，25分钟。
i.用TBST洗涤缓冲液洗涤两(2)次。
j.过氧化酶阻断(3％ USP H2O2，添加约0.02％v/v Tween-20)，3×2.5分钟(总计7.5分钟)，其中中间有试剂排空。
k.用TBST洗涤三(3)次。
l.小鼠Polink2+HRP结合聚合物(GBI试剂盒的一部分，目录号:D37-110)，25分钟。
m.用TBST洗涤五(5)次。
n.GBI(目录号:C09-12)DAB色素原(在聚合物培育结束后新鲜制成的试剂，每1mL底物缓冲液中使用40μl DAB色素原浓缩液)，3×5分钟(总计15分钟)，其中中间有试剂排空且用TBST洗涤一(1)次。
o.用TBST洗涤四(4)次
p.苏木精对比染色(1:5)，1分钟
q.用TBST洗涤六(6)次。
r.将玻片浸入室温(25℃)的蒸馏水中(转移至盖玻片区域)。
·步骤5：玻片未配对，在蒸馏水中冲洗，在酒精系列(70％，95％，100％乙醇)和有机溶剂(二甲苯，100％，四次更换)中脱水，随后使用CytoSeal(或等效物)永久封片，以便解释和存储。在显微镜下检查载片以评估染色。
SHIER 2(柠檬酸盐基，pH 6.0-6.2)溶液用于去除FFPE组织中Axl的抗原决定基。SHIER 1(柠檬酸盐基，pH 5.6-6.1)溶液用于去除CD68的抗原决定基。在热诱导的抗原决定基恢复之后，用运行QML工作软件v3.96的TechMate仪器(Roche Diagnostics)使工艺步骤自动化。此自动化平台将毛细管间隙过程用于所有试剂更换，直至(且包括)对比染色，且中间介入缓冲剂洗涤。所有步骤均在室温(25℃)下进行。
试剂制造缓冲液[RMB；由QualTek的圣巴巴拉实验室(QML-SB)制造]与山羊血清一起用来制备初级抗体和阴性对照抗体的工作稀释液。在FFPE切片的抗原-初级抗体相互作用的位点对Axl和CD68进行目标识别，使用GBI实验室的Polink-2 Plus HRP试剂盒的试剂，所述试剂盒为检测小鼠初级抗体而设计。关于Axl和CD68的抗体规格和优化的IHC分析条件请参考表7。
脱水/封片
a.两次(2)更换室温(25℃)的95％酒精进行冲洗[min.至少浸泡16次]。
b.六次(6)更换室温(25℃)的绝对酒精进行冲洗[min.至少浸泡16次]。
c.四次(4)更换室温(25℃)的绝对二甲苯进行冲洗[min.至少浸泡16次]。
d.用Thermo Scientific 8312Cytoseal XYL或等效非水性半永久性固定培养基封片。
表7
内部过程对照
在每一次运行中，使用在对照组织中具有确立信号强度的物种匹配阳性对照(标准抗体)，以确认检测试剂的正确性能。此项目中使用的阳性对照为在福马林固定、石蜡包埋(FFPE)的对照扁桃体组织上运行的LCA(源自小鼠)或在FFPE大肠癌对照组织上运行的CK(细胞角蛋白)(源自小鼠)。
来自包括一系列Axl表达量的组织库的肺癌多组织块(QMTB246，QMTB395)用作每个IHC运行中的Axl和CD68的阳性对照。针对相应生物标志物分析条件使用小鼠IgG1同型匹配阴性对照，以测定检测试剂或组织中固有的任何非特异性染色，且定义来自此些来源的任何潜在背景反应性。
检测组织
为保证实验室之间分析的一致性，自组织库中总计收集13种不同的福马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肺癌(非小细胞肺癌或NSCLC)组织。对于CLIA敏感性测试，Axl和CD68测试在FFPE组织样品中对以下癌症适应症进行评估：黑色素瘤(31个未经处理，16个先前经处理)、卵巢癌(52个未经处理)、胰脏癌(31个未经处理，2个先前经处理)、肺癌(43个未经处理，1个先前经处理)和前列腺癌(51个未经处理)。
所有未经处理的样品均来自组织库。所有先前经处理的样品均通过BioAtla供应。各样品的详细信息包括于结果部分中的灵敏度评分表中。此些癌症样品的子集用于黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌适应症中的Axl和CD68 IHC分析的验证测试。
对于Axl和CD68特异性测试，获得来自Pantomics公司(目录号MNO961)的FDA多正常人类组织微阵列(TMA)玻片。TMA(称为P1478Q0035)含有来源于35个不同器官或部位的96个不同样品。
评分方案
如以上肿瘤(肿瘤膜P得分)部分中的Axl的质膜评分中所描述进行各样品的连续切片中的Axl和CD68染色的比较评分。
结果
Axl和CD68 IHC分析一致性(A部分)
非小细胞肺癌(NSCLC)样品的总共13种不同FFPE肺癌样品用于实验室之间的一致性测试。NSCLC样品表示Axl浆膜肿瘤细胞染色的范围。
用于一致性测试的组织是在机构中使用非GLP Axl和CD68 IHC分析进行染色。在第二机构中，也通过不同操作员使用表7和上文所描述的分析对其进行连续切片染色(每个玻片上有一个组织切片，其中制剂之间的材料损失最小)。使用TechMate自动化染色平台进行所有分析测试。
对于Axl，通过记录具有质膜染色的肿瘤细胞的百分比来进行评分，其中差异强度为如本文所描述的0至3。在不同实验室进行的相同样品之间的比较是基于H-评分[(<1处的百分比)x 0]+[(1+处的百分比)x 1]+[(2+处的百分比)x 2]+[(3+处的百分比)x 3]进行的。对于CD68，通过记录包含CD68阳性巨噬细胞(肿瘤中的百分比)的肿瘤细胞百分比(0-100％)进行评分。
当比较不同实验室染色的样品之间的肿瘤百分比的Axl H-评分和CD68评分时，设定以下一致性参数：彼此在+/-20％范围内的评分被认为是一致的；和85％的测试样本必须是一致的才能用于批准分析转移。在此些条件下，当在两个不同实验室运行时，注意到整个NSCLC组织集合中可接受的一致性。
获得比较在各机构中染色的NSCLC样品的评分数据(表4)。获得各机构样品之间肿瘤百分比的Axl H-评分和CD68评分之间的百分比变化(如果存在)。在两个实验室运行总计13个样品。在此些13个样品中，所有Axl样品被认为是一致的(变化在20％以内)，且除2个以外，所有CD68样品是一致的。此产生Axl实验室之间的样品集一致性为100％，和CD68实验室之间的样品集一致性为85％。
CD68的任何不一致结果均可由作为巨噬细胞的肿瘤百分比的低评分解释。当百分比评分较低时，对比玻片上的评分差异会根据测试的性质转化为较高的百分比变化值。举例来说，虽然两个机构的样品之间5％至2％的评分差异较小，但用0-100的评分标准，其代表一个较大的百分比变化。此类样品视为可接受的。
根据所获得的分析转移评分数据和确定的一致性准则，认为Axl和CD68分析成功转移。
B部分：Axl和CD68癌症的敏感性筛选
表7中的Axl和CD68的优化IHC分析以及表6中的一般IHC程序和表8中的试剂筛选来自不同癌症适应症的人类肿瘤组织的连续切片(每个玻片上有一个组织切片，其中制剂之间的物质损失最小)。
表8
针对CLIA敏感性筛选的癌症适应症和各中分析的样品数目如下：
黑色素瘤(31个未经处理，16个先前经处理)、卵巢癌(52个未经处理)、胰脏癌(31个未经处理，2个先前经处理)、肺癌(43个未经处理，1个先前经处理)和前列腺癌(51个未经处理)。所有用于敏感性测试的组织都为福马林固定、石蜡包埋(FFPE)的人类癌症标本。未接受处理的样品来自QualTek组织库，且先前经处理的样品由BioAtla经由OHSU提供(如下表9)。
Axl和CD68 IHC分析的敏感性在以下适应症中进行评估：黑色素瘤(31个未经处理，16个先前经处理)、卵巢癌(52未经处理)、胰脏癌(31未经处理，2个先前经处理)、肺癌(43未经处理，1个先前经处理)和前列腺癌(51未经处理)。所有组织均为福马林固定、石蜡包埋(FFPE)的人类癌症人类癌症。未接受治疗的样品来自QualTek组织库，且先前经处理的样品如下表9所描述。
表9
在先前测试中显示一系列Axl反应性的肺癌组织充当阳性对照/质量对照(QC)以在当前肿瘤筛选期间展现适当反应性。扁桃体组织充当CD68巨噬细胞生物标志物的对照。在测试期间包括标准物质匹配阳性对照(小鼠CK)和同型匹配阴性对照(小鼠IgG1)且按预期反应。样品也用苏木精和伊红(H&E)染色进行形态学评估，以协助评分。
Axl在肿瘤细胞和巨噬细胞中的个子组中具有反应性。在肿瘤细胞中，Axl反应性主要位于质膜，但也可在细胞质中存在。表达Axl的巨噬细胞可存在于肿瘤细胞中和与肿瘤相互作用的基质(肿瘤相关基质或肿瘤基质)内。并非所有巨噬细胞经Axl标记。CD68在巨噬细胞(肿瘤内和肿瘤基质中)中表达，且为用于鉴别此免疫细胞类型的标准生物标志物。
评价肿瘤筛选中的所有组织。肿瘤中的Axl质膜染色使用百分比评分[强度≥1+、≥2+和≥3+的百分比的和，数值范围为0至100]和H-评分[各百分比评分(0-100％)的和乘以其相应的强度评分(0，1+，2+，3+)，数值范围为0至300]进行评估。因为Axl在肿瘤细胞和巨噬细胞中均有表达，所以评分方法(如上述肿瘤中Axl的浆膜评分(肿瘤膜P评分)部分所描述)将Axl反应性与连续切片中的CD68染色进行比较。CD68生物标志物用于鉴别和“减去”Axl幻灯片中的巨噬细胞染色，得到不包括巨噬细胞的Axl的“纯GPCR肿瘤”评分。
本文所描述的评分方法也包括记录平均强度下具有Axl细胞质染色的肿瘤百分比的值。通过评估由CD68或Axl阳性巨噬细胞构成的肿瘤百分比来评估肿瘤块内呈CD68和Axl阳性的巨噬细胞。也评估巨噬细胞在肿瘤基质内Ax和CD68染色的相对丰度。
进行Axl肿瘤筛选以理解来自不同癌症适应症的代表性样品集中的染色强度和反应性丰度(外显率)的范围。
针对黑色素瘤、先前处理的黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌、肺癌和前列腺癌获得可评估癌症样品中的Axl和CD68的评分结果。
各癌症适应症中测试的许多样品对Axl质膜肿瘤染色呈阴性(100％肿瘤细胞在0染色强度下)。然而，对于黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌适应症，也在筛检的样品中观测到低、中度和高Axl质膜染色的实例。
在黑色素瘤、先前处理的黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌的相应组织区域中观测到高度或中度Axl染色和CD68染色的代表性图片。
对于前列腺癌适应症，评估51个样品且此些样品中仅1个展示Axl质膜染色高于零。观测到前列腺癌中Axl阴性染色的代表性图片以及CD68生物标志物。因为前列腺癌适应症为高度非反应性的，所以其不包括于Axl验证之后续精确度和可再现性测试中。
小鼠IgG1同型匹配阴性对照包括在灵敏度筛选中测试的各组织样品上。用此些对照染色为无反应性的。
灵敏度筛选的H-评分和百分比评分分析
Axl的灵敏度筛选(结合CD68)打算帮助确定Axl阳性的截止值，以用于临床测试。为了辅助肿瘤(不包括巨噬细胞)中Axl质膜表达的比较评估，根据阳性的不同理论阈值划分评分数据。
对于此分析，将可评估的先前经处理的黑色素瘤样品(n＝16)分组且与来自QualTek组织库的未接受处理的黑色素瘤样品(n＝31)分开分析。先前经处理的胰脏癌样品(n＝2)和肺癌(n＝1)样品被排除在灵敏度概述的外，因为样品过少以无法包含自身的组。其不包括于此些适应症的QualTek组织中，这是由于其未接受处理。
表10呈现各癌症适应症中满足Axl质膜肿瘤染色的以下H-评分截止值的病例数目和百分比：≥1、≥50、≥100、≥150、≥200、≥250。表10也包括在各适应症中测试的样品中的平均H-评分。此些Axl反应性的平均H-评分也在图21所示的条形图中进行比较。
表10通过H-评分阈值进行Axl质膜反应性分组
根据H-评分分析，肿瘤中的Axl质膜染色的所有适应症极低(平均适应症H-评分<25)。然而，在先前经处理的黑色素瘤案例(包括化疗、IO和TKI疗法)对比未接受处理的黑色素瘤和所有其它未经处理的适应症中观测到最高整体反应性。
也评估肿瘤中Axl质膜表达的百分比评分。百分比评分分析的概述表提供如下：
表11呈现当在各种肿瘤比例中考虑1+、2+或3+(≥1+)的强度时，各癌症适应症中阳性病例的数目和百分比。
表11通过阈值≥1+染色进行Axl反应性分组
表12呈现当在各种肿瘤比例中考虑2+或3+(≥2+)的强度时，各癌症适应症中阳性病例的数目和百分比。
表12通过阈值≥2+染色进行Axl反应性分组
表13呈现当在各种肿瘤比例中考虑3+(≥3+)的强度时，各癌症适应症中阳性病例的数目和百分比。
表13
通过阈值≥3+染色进行Axl反应性分组
如果使用≥1％的肿瘤细胞中出现≥1+Axl染色的准则作为阳性的截止值，那么各适应症中被认为阳性的病例数量和百分比如下：黑色素瘤-4/31(13％)、先前经处理的黑色素瘤-5/16(31％)、卵巢癌-10/52(19％)、胰腺癌-6/31(19％)、肺癌-12/43(28％)和前列腺癌-1/51(2％)。使用表10-13考虑其它阳性阈值/截止值。
尽管Axl主要在肿瘤细胞的质膜上表达，但也可定位至细胞质上。在许多情况下，肿瘤中的细胞质Axl反应性不存在或较弱(0或1+强度)。然而，观测到肿瘤细胞质中具有强(2+或3+强度)Axl表达的一些样品。此类染色可为Axl表达的显着度量。
观测到显示Axl质膜或高于0的细胞质表达的肿瘤筛选样品。此些样品包括不含Axl质膜染色的样品(0处为100％)，但在≥2+时有≥10％的细胞质染色。此些样品呈现无Axl质膜反应性但具有显着Axl细胞质染色的案例。当确定Axl阳性时，可考虑此些情况以用于纳入准则。
正常组织中Axl和CD68的特异性测试(C部分)
使用表6和表7中所描述的IHC方法测试Axl和CD68对其目标的特异性。特异性测试使用FDA建议的多正常人类组织微阵列(TMA)的96个不同组织进行。TMA(P1478Q0035)购自Pantomics公司(目录号MNO961，多正常人类组织，FDA，96个样品，来自3名个体的35个器官/部位，1.5mm)，且在表9中全面描述。所有正常组织样品的切片用苏木精和伊红(H&E)进行组织学染色，且用Axl、CD68和小鼠IgG1进行IHC染色。
使用以上肿瘤膜P评分部分中所描述的Axl质膜染色的H-评分方法评估所有染色正常组织以评估正常组织组分(相较于肿瘤)。此特异性测试的评分数据也包括使用CD68生物标志物在整个各正常组织中巨噬细胞的所估计的丰度(0-3)。获得正常组织中的Axl和CD68的特异性数据。
Axl在所有测试的正常人类组织中展示无反应性质膜染色(在0处为100％)；除了正常睪丸样品中在塞特利氏细胞(Sertoli cell)中的反应性以外。因此，此特异性测试表明Axl抗体和IHC测试对肿瘤细胞和睪丸子组中的目标具有特异性。
CD68染色表示在整个测试的正常组织中巨噬细胞的丰度范围。观测到正常组织中的Axl和CD68表达。小鼠IgG1同型匹配阴性对照在所有测试正常组织中均无反应。
Axl与CD68精确度和再现性测试(D部分)
灵敏度筛选的结果有助于鉴别用于测试黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌适应症中的Axl和CD68 IHC分析的精确度和再现性的适当组织。验证不包括前列腺癌，因为所述适应症在肿瘤细胞中的Axl质膜反应性几乎完全阴性(50/51个样品显示0强度下100％肿瘤染色)。
对于黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌中的验证，每个适应症选择4个显示肿瘤细胞中Axl质膜染色范围的肿瘤样品进行使用。基于Axl表达选择样品，且与CD68生物标志物串联操作以验证组合测试。因为用CD68运行的样品必须与针对Axl所选择的那些样品相同，所以在各适应症内未必观测到CD68染色的范围，但在整个组中都能反映出来。
各适应症的各样品根据表7中的IHC分析和上文在单次操作(精确度)中所描述的方案针对Axl与CD68均一式三份地运作。在两个独立操作中，在非连续日进行，由相同和不同操作员对相同的样品进行一式三份地Axl和CD68检测(再现性)。所有复制玻片制备为连续切片(每个玻片上有一个组织切片，在玻片制备之间材料损失最少)。
换言的，分析内(精确度)和分析间(再现性)使用具有Axl和CD68的4个所选肿瘤样品中的每一者的3个复制切片(每个运行)的3个运行系列测定，产生各样品的9个复本组。两个操作员使用不同TechMate工具(操作员1，运行1；操作员1，运行2；操作员2，运行3)进行分析。各运行中包括的阳性、标准和阴性对照均有预期反应。
对验证过程中染色的所有复本进行审查且评分。肿瘤中的Axl质膜染色是用百分比评分≥1+来评估。对于精确度和再现性测试，在≥1+强度下具有10％或更多肿瘤细胞染色的样品(百分比评分≥1+即≥10)被称为阳性(POS)。如果0-9％的肿瘤细胞染色强度≥1+或只观测到<1+染色，那么样品为阴性(NEG)。评估CD68的肿瘤中巨噬细胞的估计百分比，如上文在肿瘤膜评分部分中所描述。
与各样品的灵敏度筛选期间用Axl和CD68染色的切片相比，病理学家认为精确度和再现性测试的复本为可接受的。对于黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌或肺癌，获得完整验证评分结果，包括统计分析和复制结果。
在肿瘤染色的图案、百分比和强度中的所有复本中观测到Axl反应性的类似细胞图案。也在各复本中估计肿瘤中相同百分比的CD68染色。在黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌中观测到Axl和CD68的此类一致性。针对适应症中的每一者提供相应小鼠IgG1阴性对照。
统计分析和信赖区间评估
经由评估染色模式的一致性、半定量评分的统计分析和一致/一致估算百分比来确定IHC分析验证的接受/排斥反应。精确度和再现性测试的接受要求通过百分比一致性计算的选定的95％信赖区间(CI)的下限符合或超过85％。一般准则也规定，复本当中的平均值的标准误差(SEM)不超过5，且变异是数(CV)不超过20％(对于具有百分比评分值≥10的样品)。
表14呈现了肿瘤中Axl百分比评分≥1+和CD68百分比评分的验证评分结果；包括各复本组的平均值、标准差(Std Dev)、平均值的标准误差(SEM)和变异是数(CV)。Axl的阳性截止值为≥10％的肿瘤细胞染色强度≥1+，用于评估此些样本的精确度和可再现性地分析。
表14癌症适应症中的Axl和CD68的验证统计概述
/>
各生物标志物测试的4个案例的9个复本各组的SEM不超过1.8且CV不超过20％(对于百分比评分≥1+>5的案例)。肺癌样品QMTB249-3的Axl百分比评分在所测试的复本中的1至5范围内。此变异是由随着连续切片FFPE组织块时而使反应性细胞集群减少引起。其产生80％的CV值但具有0.6的极低SEM和仅1.7的标准差。
当百分比评分低时，复本之间的差异通过测试性质转化为较高CV值。在百分比评分<10的情况下，样品可视为可接受的。样品QMTB249-3被认为是可接受的且所有其它样品均在规定的限值内。
Axl的信赖区间评估展示于表15中，且包括阳性/阴性染色一致性和平均值、标准差、平均值的标准误差(SEM)和95％信赖区间(CI)的预定的Z-值。对于此评估，用于计算CI的参考点是基于Axl复本的大部分染色结果(阳性或阴性)。举例来说，黑色素瘤样品Q2832的9/9复本对Axl呈阳性。如果Q2832复本已为阴性，那么其将针对大部分且将降低CI。然而，未发现不一致结果。
表15癌症适应症中针对Axl的信赖区间验证分析
在黑色素瘤、卵巢癌和肺癌中，Axl精确度和再现性研究的成对比较总计产生了36个一致的结果和0个不一致的结果。在胰脏癌中，观测到35个一致的结果和0个不一致的结果(一个染色样品无法评估)(表15)。因此，Axl的107/107个测试与适当大部分一致。在95％CI下符合Axl IHC分析的接受准则。
用于检测人类黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌和肺癌适应症的Axl和CD68 IHC分析被认为成功验证用于临床测试。
实例11：BA3011的活体外和活体内活性
BA3011在模拟TME(pH 6.0-7.0)的条件下与人类Axl和食蟹猕猴Axl结合，但不与小鼠或大鼠Axl结合，具有高亲和力和特异性，但在模拟正常组织环境(pH7.3-7.4)的条件下，结合力下降(Stubbs 2000；Gillies 1994；van Sluis 1999；Estrella 2013；Anderson2016)。在活体外功能分析中，BA3011显示在肿瘤条件下诱导表达Axl的人类癌细胞系的细胞毒性，但在正常条件下具有降低的细胞毒性的能力。
也使用免疫缺乏动物中表达Axl的人类肿瘤细胞系衍生的异种移植肿瘤活体内证实BA3011的抗肿瘤功效。在此活体内小鼠模型系统中测试代表NSCLC(LCLC103H)、前列腺(DU145)和胰脏肿瘤(MIAPaCa2)的肿瘤细胞系。一旦肿瘤以约150mm3的大小建立，那么用BA3011按指定时程以指定剂量水平对动物进行处理。所有测试模型所展现的肿瘤生长抑制(TGI)相对于对照组展示于图17A-17D中。如图17D所示，BA3011在测试的7个模型中的4个中诱导大于70％的TGI。BA3011在所测试的剂量和时程下不诱发体重损失，且未注意到其它临床毒性迹象。
实例12：活体内毒理学和药物动力学
BA3011的非临床静脉(IV)毒性在猴子身上进行初步剂量范围研究，随后进行明确的良好实验室操作规范重复剂量毒理学研究。由于BA3011与食蟹猕猴Axl蛋白有交叉反应，而BA3011与啮齿动物酶缺乏结合，因此选择食蟹猕猴作为毒理学物种。在BA3011下观测到的许多毒性与结合于MMAE的其它ADC类似。
在第1天和第22天通过静脉内缓慢推注注射以1、5或10mg/kg/剂的剂量向食蟹猕猴施用BA3011持续共2次剂量，导致雌性在10mg/kg/剂时早期死亡，两性在5和10mg/kg/剂时出现不良血液学变化，且雄性在10mg/kg/剂和雌性在5mg/kg/剂时出现淋巴器官的不良病理学变化。在此研究中所测试的剂量水平中的任一者下，未观测到与测试品相关的体重、心电图(ECG)、眼科或尿分析的变化。基于5和10mg/kg/剂的结果，认为BA3011对雄性和雌性的无观测不良效应水平(NOAEL)均为1mg/kg/剂。在1mg/kg/剂下，BA3011在第22天的群组平均最大血浆暴露量(C0)为20.0μg/mL，且浓度对时间曲线下面积(AUC)0-inf为376μg·h/mL。最高非严重毒性剂量(HNSTD)为5mg/kg/剂，其中在第22天C0为111μg/mL且AUC0-inf为2370μg·h/mL。基于临床起始剂量(0.3mg)的预计暴露，猴的HNSTD比在0.3mg时预测的人类AUCττ(253μg·h/mL)高9.4倍，且比预测的人类最大观察浓度(Cmax)(7.87μg/mL)高14倍。
实例13：I/II期研究
这是一种多中心、开放标记、1/2期研究，其经设计以评估BA3011单独和与纳武单抗组合在患有晚期实体肿瘤的12岁和更年长的成年和青少年患者中的安全性、耐受性、PK、免疫原性和抗肿瘤活性。
1期将包含2个连续的部分—剂量递增和剂量扩增，且其经设计以评估BA3011在患有晚期实体肿瘤的成年患者中的安全性和耐受性，且识别BA3011的MTD和/或RP2D。
2期是一项开放标记研究，旨在评估BA3011单独使用和与纳武单抗组合使用在患有晚期难治性肉瘤的成人和青少年患者的疗效和安全性。所述研究由筛选期(在第一次给药之前至多28天)、治疗期、治疗结束(EOT)问诊(在IP中断时或在IP最后一次给药后28天内)和随访期(随访问诊1[最后一次IP给药后3个月]和随访问诊2和其后[随访问诊1后每3个月])组成。
I期：
主要：
·为了定义安全概况，包括剂量限制性毒性(DLT)，且确定患有晚期实体肿瘤的患者中BA3011的最大耐受剂量(MTD)和/或建议2期剂量(RP2D)和其它安全性参数。
次要：
·以评估BA3011的药物动力学(PK)。
·以评定BA3011的抗肿瘤活性。
·以评估BA3011的免疫原性。
II期研究
主要：
·以评估单独BA3011和与纳武单抗的组合的抗肿瘤活性。
·以评估BA3011单独和与纳武单抗组合的安全性。
次要：
·以进一步表征BA3011单独和与纳武单抗组合的临床活性。
探索性：
·以评估BA3011单独和与纳武单抗组合的PK。
·以评估BA3011单独和与纳武单抗组合的免疫原性。
·以探究肿瘤Axl状态与BA3011临床反应之间的关系。
·以评估用于患者选择或与BA3011抗肿瘤活性相关的潜在候选肿瘤和基于血液的生物标志物。
主要指标
1期：
·安全性：DLT、MTD和/或RP2D、不良事件(AE)、严重不良事件(SAE)和实验室参数和生命迹象相对于基线的变化。
2期：
·功效：整体反应率(ORR)。
·安全性：AE、SAE和实验室参数和生命迹象相对于基线的变化。
次要指标
1期：
·BA3011的PK：ADC、总抗体和MMAE的血浆浓度和PK参数，包括Cmax和AUC。
·功效(仅扩增组)：ORR、疾病控制率(DCR)、反应时间(TTR)、反应持续时间(DOR)、最优选客观反应(OR)、无进展存活期(PFS)、总存活率(OS)和肿瘤大小相对于基线的百分比变化。
·BA3011的免疫原性：出现可检测抗药物抗体(ADA)的患者的数目和百分比。
2期：
·功效：
-DOR
-PFS
-最优选OR
-DCR
-TTR
-12周的无进展速率(PFR)
-OS
-肿瘤大小相对于基线的百分比变化
探索性指标
2期：
·BA3011的PK：ADC、总抗体和MMAE的血浆浓度和PK参数，包括Cmax和AUC。
·BA3011的免疫原性：出现可检测ADA的患者的数目和百分比。
·肿瘤Axl状态与BA3011临床反应之间的关系。
·用于患者选择或与BA3011抗肿瘤活性相关的潜在候选肿瘤和基于血液的生物标志物。
纳入准则：
1.1期：患者必须患有组织学或细胞学上证实的局部晚期不可切除性或转移性实体肿瘤，且无法用标准照护(SoC)疗法，且其无法用治愈性疗法或不符合条件、对标准疗法不耐受或拒绝标准疗法。
2期：患者必须：
-患有组织学或细胞学上证实的局部晚期不可切除性或转移性肉瘤。
-具有在入选之前6个月内根据实体肿瘤反应评估准则(RECIST)1.1版准则的进展记录。
-不符合化疗条件或已接受过至少1种含蒽环霉素的治疗方案和最多3个先前系列的转移性疾病的系统疗法(不超过2个系列的组合方案)，如果适用于各区域处方信息，那么包括帕佐泮尼(pazopanib)、曲贝替定(trabectedin)、甲磺酸艾日布林(eribulinmesylate)或他泽司他(tazemetostat)。对先前治疗的要求不适用于未批准治疗的肉瘤亚型。
2.根据RECIST v1.1患者必须患有可测量的疾病。先前经放射的肿瘤病变不应视为目标病变。
3.1期：患者年龄必须为≥18岁。
2期：患者年龄必须为≥12岁。
4.患者必须具有0或1的ECOG性能状态。
5.患者必须具有至少3个月的预期寿命。
6.存档的肿瘤组织或可进行活组织检验的组织必须提供给试验委托者用于Axl和其它基因表达测试。所有患者必须同意提供用于生物标志物研究的预处理肿瘤样本。如果存档组织不可用，那么患者必须同意在筛选期间进行肿瘤活组织检验。需要核心针(最少需要3个核心样品)或切除活体组织切片或切除的组织样本。
7.在1期剂量扩增和2期，患者必须患有Axl阳性疾病，其通过BioAtla Axl IHC分析基于存档组织或活组织检验确定；至少需要3个核心样品以确保获得足够数量的细胞。对于1期剂量扩增，Axl表达截止值为≥1+，在≥10％的肿瘤细胞中。对于2期，大于或等于70的百分比评分(由1+、2+和3+强度组成)被视为阳性。
8.患者必须具有以下条件：
-在首次研究剂量之前，已完成(且自治疗相关毒性反应中恢复)任何先前的放疗、化疗和/或其它研究性抗癌药物治疗至少5个半衰期或2周，或在首次研究剂量之前至少4周已完成生物制剂治疗(例如单克隆抗体[mAb])。双膦酸盐、地诺单抗(denosumab)和促性腺激素释放激素促效剂或拮抗剂除外。
-在第一研究剂量之前至少6周已完成用氮芥试剂、美法仑或卡莫司汀(BCNU)疗法的任何先前治疗。
-在第一研究剂量之前至少8周接受任何先前自体造血干细胞输注。
9.患者必须具有足够器官功能。以下为所需基线实验室值：
-绝对嗜中性球计数≥1,500/μL或1.5×109/L。
-血小板≥100,000/μL或100x 109/L。
-血红蛋白≥9.0g/dL。
-胆红素≤1.5×正常值上限(ULN)。
-血清肌酐≤1.5×ULN。
-丙氨酸氨基转移酶(ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(AST)≤2.5×ULN；如果肝脏中有癌转移，ALT和AST≤5×ULN。
仅2期：
-INR<1.7或凝血酶原时间比对照<4秒。
-白蛋白>3.5g/dL。
10.患者必须能在治疗机构进行定期血液采样、研究相关评估和毒性管理，且愿意遵守预期的药物施用时程。
11.有生育能力的女性在服用BA3011第一剂量之前，血清或尿液妊娠测试结果必须为阴性，且必须同意在研究过程中使用有效的避孕方法(势垒/子宫内方法或激素方法)。
-非育龄女性是指绝经后超过1年的女性，或已进行两侧输卵管结扎或子宫切除术的女性。
-具有生育/生殖能力的女性和男性必须同意在包括在研究期间和最后一次输注BA3011后的6个月内采取有效的避孕措施。
12.患者或其法律上可接受的代表性或法定监护人必须提供书面知情同意书。对于年龄<18岁的患者，必须获得患者的同意。
淘汰准则：
1.在研究者判断下，患者必须不患有临床上显着的心脏病。
2.患者必须尚未患有已知的充血性心脏衰竭(纽约心脏协会II-IV级)或需要治疗的严重心律不整；病情稳定和用药≥3个月的患者可入选。
3.患有中度(Child-Pugh B)或重度(Child-Pugh C)肝脏损伤的患者。仅对于1期，患有轻度(Child-Pugh A)肝脏损伤的患者，初始BA3011剂量可不大于1.2mg/kg1Q3W(第1天)或1.2mg/kg 2Q3W(第1天和第8天)。
4.患有严重肾损伤的患者(CrCL小于30mL/min)。
5.患者必须无已知非控制性中枢神经系统(CNS)癌转移。
6.仅1期：患者在第一次施用BA3011前2周未接受颗粒球群落刺激因子(G-CSF)或颗粒球/巨噬细胞群落刺激因子支持。
7.患者不能有对mAb疗法的≥3级过敏性反应病史，以及对此研究期间给予的任何药剂的已知或疑似过敏或不耐受。
8.患者在第一次施用BA3011之前4周内必须尚未经受重大手术。
9.患者不能有任何脑内动静脉畸形、脑动脉瘤或中风病史。
10.患者之前必须未接受过结合或非结合奥瑞他汀衍生物/vinca结合位点靶向有效负载的疗法。
11.患者必须无已知需要治疗的活跃和/或进行性的其它恶性肿瘤；患有其它恶性肿瘤已明确治疗且已无疾病的患者将有资格。
12.患者必须无2级或更高级周边神经病变。
13.患者必须不具有临床上显着(根据研究者判断中)需要全身性抗生素/抗病毒剂/抗真菌剂的活性病毒、细菌或真菌感染。
14.患者必须无已知HIV、活性B型肝炎和/或C型肝炎。
15.患者不得为怀孕或母乳哺育的女性。
16.患者不得同时使用其它抗赘生剂或实验药剂疗法。
17.仅1期：患者必须不得同时使用大于或等于12mg/天的普赖松等量的皮质类固醇疗法。
18.患者不得使用中等或较强CYP3A诱导剂或抑制剂，包括大麻二酚。
19.患者不得使用P-糖蛋白(P-gp)抑制剂。
20.患者必须不具有任何严重的基础医学病状，其在调查员或医学监测员的观点中将损害其接受或耐受计划治疗的能力。在此类情况下，试验委托者指定医学监测员必须在患者参与之前审查各情况。
21.患者不得有任何临床上显着的胸腔、心包和/或腹膜积液(例如，影响正常器官功能和/或需要经皮引流或利尿控制的的积液)。
22.患者不得有任何肝性脑病史；任何目前临床上显着的腹水，如通过体检所测量；或活性药物或酒精滥用。
23.仅2期：为符合与纳武单抗组合组的条件，患者不得有间质性肺病、非感染性肺炎或不受控制的疾病，包括肺纤维化、急性肺部疾病等病史。
24.仅2期：为符合与纳武单抗的组合组的条件，患者在入选之前≤4周必须尚未施用活痘苗。
注意：流感的季节性疫苗一般为灭活疫苗且允许使用。
鼻内疫苗为活疫苗且不允许使用。
25.仅2期：为符合与纳武单抗的组合组的条件，排除患有活性、已知或疑似自体免疫疾病的患者。患有1型糖尿病、仅需要激素替代的甲状腺功能低下、不需要全身治疗的皮肤病症(例如白斑病、牛皮癣或秃头症)或在无外部触发存在下预期不会复发的病状的患者可允许入选。
26.仅2期：为符合与纳武单抗的组合组的条件，患者在入选之前≤14天必须不患有需要使用皮质类固醇(>10mg每天普赖松或等效物)或其它免疫抑制药剂进行全身性治疗的任何病况。
注意：不排除当前或先前接受过以下任何一种类固醇方案的患者：
-肾上腺替代类固醇(剂量为每天≤10mg普赖松或等效物)。
-局部、眼部、关节内、鼻内或吸入性皮质类固醇，具有最小全身性吸收。
-开处短疗程(≤7天)的皮质类固醇，用于防治(例如，造影剂过敏)或治疗非自体免疫病状(例如，接触过敏原引起的延迟型超敏反应)。
27.仅2期：为符合与纳武单抗的组合组的条件，患者必须尚未进行先前同种异体干细胞移植或器官移植。
1期剂量递增(BA3011单独；21天周期)
在1期剂量递增期间，患有晚期实体肿瘤的成年患者按顺序入选，以表16所列的计划剂量水平经由静脉内输注接受BA3011的21天周期。BA3011每3周施用一次(1Q3W)或两次(2Q3W)，分别在每个21天周期的仅第1天或第1和第8天，根据分配给各群组的剂量水平经由静脉内(IV)输注施用。BA3011的起始剂量为0.3mg/kg1Q3W。在各群组中，在所治疗的第一与第二患者之间施用第一剂量的BA3011的时间最少交错24小时。
研究产品、剂量和投药模式：
BA3011，以0.3mg/kg 1Q3W(1期)、RP2D(2期)、IV输注开始剂量递增。
纳武单抗(仅2期)：对于18岁和以上患者：240mg Q2W；对于12至17岁患者：3mg/kgQ2W IV输注。
治疗持续时间：
治疗患者直至疾病进展、不可接受的毒性或其它原因而中断治疗。
统计方法：
安全性分析
MTD评估将基于DLT可评估群体。DLT可评估群体包括入选1期剂量递增中的所有患者，所述患者接受至少1次完整分配剂量的BA3011且在整个DLT评估时间段完成安全性随访(定义为自剂量1后BA3011至21天的第一剂量的时间段)或在DLT评估时间段期间经历任何DLT。将替换非DLT可评估患者。安全性评估将以接受治疗群体为基础。不良事件(AE)将通过监管活动医学词典(MedDRA)进行编码，且根据NCI CTCAE v4.03进行分级，且同时将概述每个IP的类型、发病率、严重程度和关系。如果观测到AE与基线特征之间的所关注的任何相关性，那么可呈现额外分层结果。所有治疗-出现的AE将通过MedDRA系统器官类别和优选术语概述。根据NCI CTCAE，将对实验室的异常情况进行概述，且给出毒性等级。
功效分析
2期中的主要功效指标为根据RECIST v1.1使用盲法非依赖性中心审查(BICR)的客观反应(OR)。客观反应率(ORR)定义为在开始后续抗癌治疗之前出现的具有确认CR或确认PR的最优选总体反应的个体的比例。ORR将采用精确概率方法对每个肉瘤亚型和2个治疗组中的每一者(BA3011单独治疗和与纳武单抗组合治疗)的整体进行估计，且给出95％ CI。其它功效指标为反应持续时间(DOR)、无进展存活期(PFS)、最优选总体反应(OR)、疾病控制率(DCR)、反应时间(TTR)、在12周时无进展速率(PFR)、总体存活率(OS)和目标病变直径的和相对于基线的百分比变化。将主要基于全分析集(FAS)概述除PFS和OS外的所有功效指标。将基于接受治疗的群体概述PFS和OS。将使用卡本-麦尔(Kaplan-Meier)估计来概述时间与事件(time-to-event)数据。将使用准确的概率方法估计反应率和其信赖区间。图形分析将包括蜘蛛图和瀑布图，分别显示肿瘤大小相对于基线的变化和最优选变化。
在1期剂量递增期间，治疗约35至78名患有晚期实体肿瘤的DLT可评估患者，其视BA3011的群体扩增和耐受性而定。每个群组将最少需要3名且最多6名患者，但除单一患者群组以外。最少6名患者以MTD入选。
表16
BA3011剂量递增的改进斐波那契方法(Fibonacci Method)
缩写：1Q3W，每3周一次；2Q3W，每3周两次；int；中间物。
a指示在2.4 mg/kg 1Q3W剂量水平下的MTD。无论是否有嗜中性球减少症防治措施，都不会有其它患者的给药达到和/或超过3 mg/kg。
b和灰度阴影指示在确认MTD的基础上，在群组6-Int或群组7中无患者已给药或将进行给药。
剂量递增的规则提供于表17和图18中(剂量递增流程图)。在3+3群组中至少有3名患者或单一患者群组中的1名患者必须在第1周期(即DLT评估时间段期间)完成21天的安全性评估，随后才开始下一个群组的招募。在单一患者群组中，仅入选1名患者直至观测到2级或更大毒性，其后在彼剂量下且在所有后续剂量水平下评估总共至少3名患者。在3+3群组中，如果在21天的DLT评估时间段期间，前3名患者未观测到DLT，那么持续递增到下一个剂量水平群组。DLT的准则呈现如下。在前进至下一个剂量水平之前审查此些患者的所有可获得的安全性数据，包括第1周期之后发的毒性。持续递增至下一个指定剂量水平直至MTD经识别。
根据表17中的剂量递增规则，1期剂量递增群组的入选程序如图18所示，将依次进行。为定义MTD，在第一治疗周期期间根据BA3011的实际起始剂量评估患者。最大施用剂量(MAD)和MTD是基于DLT的发生率来确定。研究不含派非格司亭(pegfilgrastim)和与派非格司亭共同施用的最大耐受剂量。如果群组中的6名患者中≥2名在DLT评估时间段期间经历DLT，那么将超过MTD且将无其它患者入选所述组中。前述群组接着关于MTD进行评估且至少6名患者将在前述剂量水平下进行治疗。如果在先前剂量水平下6名患者中≤1个经历DLT，那么此剂量水平为MTD。最少6名患者以MTD入选。在演进安全性和功效数据的情形下，给药组可以较低剂量水平中断和/或继续，包括方案中未陈述的较低剂量。MTD和/或RP2D是基于全部数据而确定。
表173加3群组的剂量递增规则
个别患者继续用BA3011给药直至疾病进展、不可接受的毒性或其它原因而中断治疗。在观测到较高BA3011剂量下的剂量限制性嗜中性球减少症之后，1期患者需要施用派非格司亭(或生物类似药)且必须在每次BA3011的第1天输注后48至72小时内进行。
治疗分配
在1期剂量递增期间，患者分配给递增BA3011剂量水平的群组，如表17和图19中所概述。根据分配给各群组的剂量水平，BA3011经由静脉内输注每3周施用一次(1Q3W)或两次(2Q3W)，分别在每个21天周期的仅第1天或第1和第8天。起始BA3011剂量水平为0.3mg/kg1Q3W。持续递增至下一个指定剂量水平直至MTD经识别。在演进安全性和功效数据的情形下，给药组可以较低剂量水平中断和/或继续，包括方案中未陈述的较低剂量。1期剂量扩增确定患者在2期接受的BA3011剂量和治疗时程(例如，RP2D)，且在表达Axl的晚期实体瘤患者中进行。RP2D是基于全部数据而测定且不超过MTD。基于研究的1期的部分数据，2期的BA3011剂量为1.8mg/kg Q2W。Q2W给药方案的基本原理是基于使用每2周给药时程评估单独使用BA3011和与纳武单抗的组合使用(28天周期；每周期2次给药)。基于Q3W给药群组中可用的BA3011数据，1Q2W给药提供若干优点。1Q2W给药时程可随时间改善具有较低Cmax的患者安全性。此外，与第1天和第8天的2Q3W给药相比，个别剂量之间的持续时间增加提供更多的剂量之间的恢复时间，且因此可减少不良事件的发生率，尤其对于与嗜中性球计数减少和肝酶升高相关的不良事件而言。1Q2W给药时程也可通过在整个周期内维持较高水平的BA3011而展现优选功效(即较高Cmin)。最后，由于1Q2W时程与纳武单抗的标准Q2W(240mg)给药时程比对，因此1Q2W时程减少组合疗法组中患者所需的问诊次数。
对于2期，满足入选准则的患者经分配以单独接受BA3011或与纳武单抗组合。患有展示B细胞浸润(根据CD20 IHC分析)的肿瘤的患者优先分配为接受BA3011与纳武单抗的组合。
在对派非格司亭过敏的情况下，非格司亭(filgrastim)(或生物类似药)可为取代的。以第3周期开始，派非格司亭或非格司亭可自行施用。
剂量限制性毒性：
在21天DLT评估时间段或在第一与第二周期之间需要1周的剂量延迟的任何等级的治疗相关毒性期间，DLT定义为符合以下准则中的1者：
·非血液学毒性
-对于非血液学毒性，DLT将被定义为任何美国国家癌症研究所(NCI)不良事件通用术语准则(CTCAE)v4.03(公开于2010年6月14日)3级或更高级别毒性，至少可能与治疗有关，但以下情况除外：
○3级疲乏。
○3级恶心和呕吐持续少于24小时。
○3级非血液实验室异常，其无症状，且在14天内缓解至1级或基线级(如果患者在进入研究时已有毒性)。
○在无防治性类固醇的情况下，首次出现3级或4级过敏或超敏反应，且在适当的临床干预下于6小时内缓解
·血液学毒性
-使用NCI CTCAE v4.03，对于血液毒性的DLT将定义为：
○4级嗜中性球减少症持续超过7天。
○3级或4级发热性嗜中性球减少症。
○在任何时间的4级血小板计数(<25,000/mm3)。
另外，在通过PSC审查之后，未包括于上文中的临床上重要或持久性毒性也可视为DLT。鉴于BA3011有可能造成骨髓抑制，特定言的在任何嗜中性球毒性缓解至至少1级之前，或对于接受过防治性派非格司亭的患者来说缓解至2级之前，患者不进行灌注为至关重要的。最大耐受剂量
根据表17中的剂量递增规则，1期剂量递增群组的入选程序如图18所示，依次进行。为定义MTD，将在第一治疗周期期间根据BA3011的实际起始剂量评估患者。最大施用剂量(MAD)和MTD将基于DLT的发生率来确定。将研究不含派非格司亭和与派非格司亭共同施用的最大耐受剂量。如果群组中的6名患者中≥2名在DLT评估时间段期间经历DLT，那么将超过MTD且将无其它患者入选所述组中。前述群组将接着关于MTD进行评估且至少6名患者将在前述剂量水平下进行治疗。如果在先前剂量水平下6名患者中≤1个经历DLT，那么此剂量水平将视为MTD。
1期剂量扩增(BA3011单独；21天周期)
1期剂量扩增有助于确定RP2D(章节3.1.2.1)，且在大约30名患有表达Axl的晚期实体瘤的成年患者中进行，所述患者以确定为适当且不超过MTD的剂量和方案而接受BA3011。患者体内给药可以酌情修改。可限制具有特定肿瘤类型的患者数目以确保表达Axl的实体肿瘤的充分表示。个别患者将继续用BA3011给药直至疾病进展、不可接受的毒性或其它原因而中断治疗。
建议的2期剂量
RP2D将基于全部数据而测定且不超过MTD。基于研究的1期的部分数据，2期的BA3011剂量为1.8mg/kg Q2W。Q2W给药方案的基本原理如下。
BA3011将使用每2周一次给药时程(28天周期；每个周期2次给药)单独和与纳武单抗组合进行评估。基于Q3W给药群组中可用的BA3011数据，1Q2W给药可提供若干优点。1Q2W给药时程可随时间改善具有较低Cmax的患者安全性。此外，与第1天和第8天的2Q3W给药相比，个别剂量之间的持续时间增加提供更多的剂量之间的恢复时间，且因此可减少不良事件的发生率，尤其对于与嗜中性球计数减少和肝酶升高相关的不良事件而言。1Q2W给药时程也可通过在整个周期内维持较高水平的BA3011而展现优选功效(即较高Cmin)。最后，由于1Q2W时程与纳武单抗的标准Q2W(240mg)给药时程比对，因此1Q2W时程减少组合疗法组中患者所需的问诊次数。
2期(BA3011单独或与纳武单抗组合；28天周期)
2期是一项开放标记研究，旨在评估BA3011单独使用和与纳武单抗组合使用在患有表达Axl的肿瘤膜百分比评分(TmPS)≥70的晚期难治性肉瘤的成人和青少年患者的疗效和安全性，所述患者具有通过实体肿瘤反应评估准则(RECIST)1.1版准则的测量疾病且具有在入选之前6个月内根据RECIST v1.1准则的进展记录。
入选患者必须不符合化疗条件或已接受过至少1种含蒽环霉素的治疗方案和最多3个先前系列的转移性疾病的系统疗法(不超过2个系列的组合方案)，如果适用于各区域处方信息，那么包括帕佐泮尼、曲贝替定、甲磺酸艾日布林或他泽司他。符合入组准则的患者将被分配接受BA3011单独治疗或与纳武单抗组合治疗(对于18岁和以上的患者：每2周240mg[Q2W]；对于12-17岁的患者。3mg/kg Q2W静脉内输注)。患有展示B细胞浸润(根据CD20免疫组织化学[IHC]分析)的肿瘤的患者将优先分配为接受BA3011与纳武单抗的组合。基于研究的1期的部分数据，2期的BA3011剂量为1.8mg/kg Q2W。入选将分阶段进行，开始时每个肉瘤亚型在单药疗法组约有10名患者。至多7种肉瘤亚型组可入选：
软组织肉瘤：
·平滑肌肉瘤
·滑膜肉瘤
·脂肪肉瘤
·除GIST、隆凸性皮肤纤维肉瘤、发炎性肌成纤维细胞瘤和恶性间皮瘤以外，所有其它软组织肉瘤
骨肉瘤：
·骨肉瘤
·尤文氏肉瘤
·其它肉瘤，包括未分化多形性肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤和软骨肉瘤
在研究的组合组(BA3011与纳武单抗)中，将入选20名任何肉瘤亚型患者。在此些20名患者中，大约10名患者将患有展示B细胞浸润(CD20阳性)的肿瘤，如通过CD20 IHC分析所测定，和10名无CD20表达(CD20阴性)患者。自C1D1直至12周的大约每6周进行肿瘤评估，和其后每8周进行评估。将在表19中所描述的时间点进行药物动力学、药效动力学(PD)、免疫原性和生物标志物评估。患者安全性监测将在入选时开始且将在施用最终剂量的研究性产物(IP)后继续。
BA3011 PK、PD和免疫原性测试的样品收集时间点呈现于表18(1期)和表19(2期)中。
表181期的BA3011药物动力学、药效动力学和免疫原性评定时间点
/>
缩写：ADA，抗药物抗体；C，周期；D，天；EOT，治疗结束；PD，药效动力学；PK，药物动力学。用于ADA评定的血清收集在给药前<24小时进行。
表19
2期的BA3011药物动力学、药效动力学和免疫原性评定时间点
/>
缩写：ADA，抗药物抗体；C，周期；D，天；EOT，治疗结束；PD，药效动力学；PK，药物动力学。用于ADA评定的血清收集在给药前<24小时进行。
在开始IP后至少有10名患者可能被随访至少12周，然后在各亚型或治疗(即BA3011与纳武单抗组合在患有CD20阳性肿瘤的患者中或BA3011与纳武单抗组合在患有CD20隐形肿瘤的患者中)中进行中期分析。
对于达到临界值的肉瘤亚型，可入选大致150名额外患者。所有入选患者的治疗持续直至疾病进展、不可接受的毒性或其它原因而中断治疗。
派非格司亭或非格司亭(或生物类似药)可依研究者酌情处理用于防治性地治疗给药前嗜中性球计数较低的患者或治疗嗜中性球减少症的发生。在BA3011施用之前具有低于3000/μL或3×109/L的ANC水平的患者可具有增加的嗜中性球减少症风险。对于此些患者，防治性派非格司亭或非格司亭(或生物类似药)可在BA3011施用之后48至72小时施用。
随机化和盲法
两期均为开放标记和非随机化。
研究药物材料和管理
研究药物
BA3011
BA3011为在中国仓鼠卵巢细胞中生产的抗人类Axl胞外域重组全长二价人类化mAb(IgG1)，且使用可裂解连接子与MMAE结合。
纳武单抗
(纳武单抗)为可商购的程序性死亡受体-1(PD-1)阻断抗体。关于/>(纳武单抗)的使用的更多信息参考处方信息。
BA3011剂量计算
剂量计算以重量为基础，舍入至最接近的整数千克。对于重量>100kg的患者，应按100kg计算BA3011的剂量。所需剂量体积将使用下式计算：
体积应舍入至最接近的十分的一毫升，例如，0.24mL舍入至0.2ML，且0.25mL舍入至0.3mL。供应剂量所需的小瓶数目通过用每个小瓶标称填充体积(5mL)除以总剂量体积来计算，舍入至单位小瓶。
仅当体重与第1天的剂量相比有大于10％的变化时，才需要调整各周期的剂量。
施用
BA3011
1期剂量递增：在第1周期第1天BA3011以100mL静脉袋的总施用时间应为大约90(±15)分钟，且输注速率为67mL/hr。对于所有后续施用，100mL的总施用时间应为大约60(±15)分钟，且输注速率为100mL/hr，前提是患者不经历输注相关反应。
1期剂量扩增：在第1周期第1天BA3011的总施用时间应为大约60(±15)分钟且对于所有后续施用可为大约30(±15)分钟，前提是患者不经历输注相关反应。
2期：对于所有输注，第1周期第1天和此后BA3011的总施用时间应为大约30(±15)分钟。
Ba3011不得以静脉内推送或推注形式施用。BA3011应经由专用静脉内管线仅使用非PVC盐水袋和输注管组进行施用。BA3011无法在同一盐水袋中与其它药剂混合。
在观测到较高BA3011剂量下的剂量限制性嗜中性球减少症之后，在每次BA3011的第1天输注后48至72小时内需要向1期患者施用派非格司亭或非格司亭(或生物类似药)。鉴于BA3011有可能造成骨髓抑制，特定言的在任何嗜中性球毒性缓解至至少1级之前，或对于接受过防治性派非格司亭或非格司亭的患者来说缓解至2级之前，患者不进行灌注为至关重要的。
纳武单抗
仅2期：入选接受组合疗法的患者将接受BA3011与纳武单抗的组合(即对于18岁和以上患者：240mg Q2W；对于12-17岁的患者：3mg/kg Q2W静脉内输注)(Davis2020)。患者的纳武单抗剂量应在患者的研究时间期间内保持相同。
当BA3011和纳武单抗将在同一天施用时，单独的输液袋和过滤器必须用于各输注。纳武单抗将首先施用。第二次输注将始终为BA3011，且应在完成纳武单抗输注之后至少30分钟施用。纳武单抗将以30分钟静脉内输注形式施用。纳武单抗投药的详细说明书提供于(纳武单抗)处方信息中。
患者数目
在1期剂量递增期间，治疗约35至78名患有晚期实体肿瘤的DLT可评估患者，其视BA3011的群体扩增和耐受性而定。每个群组最少需要3名且最多6名患者，但除单一患者群组以外。最少6名患者以MTD入选。1期剂量扩增在大约30名额外患有表达Axl的晚期实体瘤的患者中进行。2期在BA3011单药疗法组中至少入选大约70名表达Axl的(TmPS≥70)患者(在至多7个肉瘤亚型组中的每一者中具有10名患有晚期难治性肉瘤的患者)，和在研究的组合疗法(BA3011与PD-1)组中入选大约20名Axl的(TmPS≥70)患者(10名CD20阳性和10名CD20阴性患者)。视在中期分析中所观测到的功效而定，可能入选大约150名额外患者。
治疗分配
在1期剂量递增期间，患者将分配给递增BA3011剂量水平的群组，如表16和图18中所概述。根据分配给各群组的剂量水平，BA3011经由静脉内输注每3周施用一次(1Q3W)或两次(2Q3W)，分别在每个21天周期的仅第1天或第1和第8天。起始BA3011剂量水平将为0.3mg/kg 1Q3W。将持续递增至下一个指定剂量水平直至MTD经识别。1期剂量扩增经设计以有助于确定患者将在2期(例如，RP2D)接受的BA3011剂量和治疗时程，且将在患有表达Axl的晚期实体瘤的患者中进行，所述患者以确定为适于PSC的BA3011剂量和方案而进行。在与指定医学监测者和研究者讨论之后，试验委托者有责任基于全部数据来确定RP2D，且不超过MTD。基于研究的1期的部分数据，2期的BA3011剂量为1.8mg/kg Q2W。Q2W给药方案的基本原理详述于章节1.6中。对于2期，满足入选准则的患者将经分配以单独接受BA3011或与纳武单抗组合。患有展示B细胞浸润(根据CD20 IHC分析)的肿瘤的患者将优先分配为接受BA3011与纳武单抗的组合。
派非格司亭施用：
1期：
·在观测到较高BA3011剂量下的剂量限制性嗜中性球减少症之后，在审批通过的剂量/适用药品说明书下需要施用派非格司亭(或生物类似药)且必须在每次BA3011的第1天输注后48至72小时内进行。
·对于按2Q3W时程给药的患者(即在第1天和第8天接受BA3011治疗的患者)，允许在各周期的第1天剂量之后不早于24小时施用非格司亭，随后在第9天任选地施用派非格司亭(或生物类似药)。由于与标准化疗相比，当MMAE与抗体结合时的释放速率较慢，因此建议在各周期的第1天剂量之后48小时与72小时之间开始使用非格司亭。
·在对派非格司亭过敏的情况下，非格司亭(filgrastim)(或生物类似药)可为取代的。
·以第3周期开始，派非格司亭或非格司亭可自行施用。
2期：
·派非格司亭或非格司亭(或生物类似药)在2期期间不为所需的，但可依研究者酌情处理用于防治性地治疗给药前嗜中性球计数较低的患者或治疗嗜中性球减少症的发生。
·在BA3011施用之前具有低于3000/μL或3×109/L的ANC水平的患者可具有增加的嗜中性球减少症风险。对于此些患者，建议防治性派非格司亭或非格司亭(或生物类似药)在BA3011施用之后48至72小时进行施用。
实例14：Mecbotamab维多汀(BA3011)(CAB-AXL-ADC)在晚期肉瘤患者中的1期研究的中期安全性和功效结果
在以下研究中，确定了BA3011在患有晚期肉瘤或其它实体肿瘤的患者中的安全性、建议2期剂量(RP2D)和抗肿瘤活性的初步证据。
方法
研究BA3011-001为一项正在进行的、多中心、开放标记、1/2期的BA3011首次人体试验。
在1期(NCT03425279)中，BA3011每3周经由静脉内(IV)输注施用一次(Q3W)或两次(2Q3W)。
2期(NCT03425279)为一项正在进行的开放标记评估，其评估BA3011单独使用和与PD-1抑制剂组合使用对12岁或以上且表达AXL的肿瘤膜百分比评分(TmPS)≥50的晚期难治性肉瘤患者的功效和安全性，所述患者具有可测量疾病和进展记录。
结果
患者安置和基线人口统计数据
患者的中值(范围)年龄为58.0(24-80)岁，57.7％为女性，84.6％为白人，其中69.2％的患者ECOG评分为0且30.8％的患者评分为1。
1期肉瘤患者先前平均接受过4种或更多种疗法系列。
在第1阶段，总计60名患者接受BA3011，剂量水平为0.3至3.0mg/kg Q3W，和1.2至1.8mg/kg 2Q3W，其中包括26名肉瘤患者。
作为IHC分析验证工作的一部分，227名肉瘤患者接受了AXL肿瘤膜表达的测试，且在1期和2期研究中大约50％患者的TmPS≥70。在所有所测试肉瘤亚型中AXL似乎以一致比率表达。
安全性
未观测到对正常表达AXL的组织有临床意义的靶向毒性，便秘率较低。剂量限制性毒性受限于所测试的最高剂量下的单甲基奥瑞他汀E(MMAE)结合物相关的毒性，包括可逆嗜中性球减少症。
在1期肉瘤患者中，不存在导致死亡的治疗引发不良事件(TEAE)，且2名(7.7％)患者的治疗相关TEAE导致治疗中止(表20)。
十一名患者出现3级相关TEAE，且1名患者出现4级嗜中性球减少症，其一般与MMAE相关，包括可逆骨髓抑制、短暂性肝酶升高和代谢紊乱(表21)。
在第1周期治疗期间可见的短暂1至2级肝脏酶升高通常在再次治疗时不会再出现。肌酐水平在整个治疗中一般不变。
在1期肉瘤患者中，在1名患者中发生与治疗相关的SAE(2级肝性脑病)(表20)。
表20-1期肉瘤患者中的不良事件的概述
CTCAE＝不良事件的常见术语准则
Q3W＝每3周
2Q3W＝每3周两次
TEAE＝治疗出现的不良事件
a相关严重TEAE：肝性脑病，CTCAE 2级
b周边神经病变，CTCAE 2级；疲乏，CTCAE 3级
表21-1期肉瘤患者中最频繁治疗不良事件(≥20％，所有TEAE所有级别)和任何相关级别3/4TEAE
/>
建议2期剂量(RP2D)/药物动力学
基于包括PK建模的1期数据的集成式评估，测定RP2D为1.8mg/kg Q2W。
BA3011的PK曲线大约与剂量成比例；在1期中，半衰期经测定为大约4天。
功效
BA3011抗肿瘤活性与肉瘤患者中更高的AXL肿瘤膜表达量相关。
在7名基线TmPS≥70且剂量为1.8mg/kg(Q3w或2Q3w)的治疗难治性肉瘤患者中，4名患者证实有部分反应(图20、22和23)。
表22-如图20中所示的个体
此研究中对肉瘤患者中的疗法的延长反应在图24中得到证实。
结论
基于此研究的初步疗效和安全性结果，BA3011单药疗法的益处-风险概况似乎在患有肉瘤的患者中是有利的。
未观测到临床上有意义的靶毒性。在1期肉瘤患者中，观测到抗肿瘤活性证据，其中较高AXL肿瘤膜表达与反应相关。在所有所测试肉瘤亚型中，AXL似乎以一致比率表达。
然而，应了解，尽管已于先前描述中连同本发明的结构和功能的细节一起阐述本发明的许多特征和优势，但本发明仅为示范性的，且可详细地作出改变，尤其关于本发明的原理内的部分的形状、大小和布置，其最大程度地通过术语的广泛一般含义所指示，在所述术语中表达所附权利要求书。
本文中提及的所有文献均以全文引用的方式并入本文中，或者提供其特定依赖的本发明。本申请人并不打算将任何所公开的实施例均贡献于公众，且达到任何所公开的修饰或变化字面上均不属于权利要求书的范围内，但其在等同原则下视为其一部分的程度。
序列表
<110> 生物蛋白有限公司(BioAtla, Inc.)
<120> 以抗AXL抗体、抗体片段和其免疫结合物治疗表达AXL的癌症的方法
<130> KHP232110761.3
<150> US63/113,040
<151> 2020-11-12
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H1序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为T或A或W
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为H或A
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为T或I
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为N或I
<400> 1
Xaa Gly Xaa Xaa Met Xaa
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H2序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为P或N
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为S或I或T
<400> 2
Leu Ile Lys Xaa Ser Asn Gly Gly Thr Xaa Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H3序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为H或D或E或P或R或W
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为Y或N
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为E或A或D或F或G或H或I或L或M或N或R或V或Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为S或D或M或N或Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为Y或C或E或P
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为F或E或N或S或T或V
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为A或D或G或L或Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为M或E或F
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa为W或A或D或H或L或N或P或R或T
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa为G或H
<400> 3
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L1序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为V或D或G或N或W
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为S或V
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为A或L或M
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为A或D或N或Q
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Asp Xaa Xaa Ser Xaa Val Xaa
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L2序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa为W或F
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为A或I或N或P或Q
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为H或D
<400> 5
Trp Xaa Xaa Thr Arg Xaa Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> L3序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa为H或C或F或I或L或Q或S或T或V或Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为F或C或D或E或G或N或S
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为T或C或P
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为P或A或C或D或E或H或K或S或T或V或W
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为L或G或R
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为T或I或R
<400> 6
Gln Glu Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 7
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区序列
<400> 7
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtggtt tctgctgtag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctattgg caggataccc ggcacactgg agtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgtcaggaa cattttagca ctccgctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acc 323
<210> 8
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区序列
<400> 8
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgagt tctgctgtag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctattgg caggataccc ggcacactgg agtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgtcaggaa cattttagcc ctccgctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acc 323
<210> 9
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区序列
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtggtt tctgctgtag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctattgg caggataccc ggcacactgg agtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgtcaggaa cattttagcc ctccgctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acc 323
<210> 10
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区序列
<400> 10
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtggtt tctgctgtag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctattgg caggataccc ggcacactgg agtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgtcaggaa cattttagcc ctccgctcag gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acc 323
<210> 11
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区序列
<400> 11
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg tttctggtta ctcattcact ggcgctacca tgaactggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggtctt attaaacctt ccaatggtgg tactagttac 180
aaccagaagt tcaagggcag agtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc acatggtcac 300
tacgagagtt acgaggctat ggactactgg ggccagggaa cgctggtcac cgtcagctca 360
<210> 12
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区序列
<400> 12
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg tttctggtta ctcattctgg ggcgctacca tgaactggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggtctt attaaacctt ccaatggtgg tactagttac 180
aaccagaagt tcaagggcag agtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc acatggtcac 300
tacgagagtt acgaggctat ggactactgg ggccagggaa cgctggtcac cgtcagctca 360
<210> 13
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区序列
<400> 13
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg tttctggtta ctcattcact ggccacacca tgaactggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggtctt attaaacctt ccaatggtgg tactagttac 180
aaccagaagt tcaagggcag agtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc acatggtcac 300
tacgagagtt acgaggctat ggactactgg ggccagggaa cgctggtcac cgtcagctca 360
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hcCDR1
<400> 14
Trp Gly Ala Thr Met Asn
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hcCDR2
<400> 15
Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hcCDR3
<400> 16
Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lcCDR1
<400> 17
Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala Val Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lcCDR2
<400> 18
Trp Gln Asp Thr Arg His Thr
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> lcCDR3
<400> 19
Gln Glu His Phe Ser Pro Pro Leu Thr
1 5
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变区
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Trp Gly Ala
20 25 30
Thr Met Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala His Gly His Tyr Glu Ser Tyr Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Val Ser Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Gln Asp Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu His Phe Ser Pro Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (22)

1.一种用于治疗表达Axl的肿瘤的方法，其包括向有此治疗需求的人类个体投与包括mAbBA301-可裂解连接子-MMAEn和药学上可接受的载剂的医药组合物，
其中所述医药组合物透过静脉内输注以1.8mg/kg人类个体体重的剂量在每21天的第1和8天投与，
其中mAbBA301是具有以下各项的抗体或抗体片段：包含SEQ ID NO.14的hcCDR1、SEQID NO.15的hcCDR2及SEQ ID NO.16的hcCDR3的重链可变区；及包含SEQ ID NO.17的lcCDR1、SEQ ID NO.18的lcCDR2及SEQ ID NO.19的lcCDR3的轻链可变区；且
其中n为1与4之间的整数，包括端点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO.20且所述轻链可变区包含SEQ ID NO.21。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述可裂解连接子为mc-vc-PAB。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤为肉瘤、腺癌或非小肺细胞癌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤为肉瘤。
6.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其进一步包含投与程序性死亡受体-1(PD-1)阻断抗体。
7.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、或至少95。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少70。
9.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其进一步包含投与颗粒球群落刺激因子或其类似物。
10.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述药学上可接受的载剂具有6.0的pH且包含20mM组氨酸-HCL、70mg/mL蔗糖及0.5mg/mL聚山梨醇酯80。
11.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中n等于4。
12.一种用于治疗表达Axl的肿瘤的方法，其包括向有此治疗需求的人类个体投与包括mAbBA301-可裂解连接子-MMAEn和药学上可接受的载剂的医药组合物，
其中所述医药组合物透过静脉内输注以1.8mg/kg人类个体体重的剂量每21天投与，
其中mAbBA301是具有以下各项的抗体或抗体片段：包含SEQ ID NO.14的hcCDR1、SEQID NO.15的hcCDR2及SEQ ID NO.16的hcCDR3的重链可变区；及包含SEQ ID NO.17的lcCDR1、SEQ ID NO.18的lcCDR2及SEQ ID NO.19的lcCDR3的轻链可变区；且
其中n为1与4之间的整数，包括端点。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO.20且所述轻链可变区包含SEQ ID NO.21。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述可裂解连接子为mc-vc-PAB。
15.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤为肉瘤、腺癌或非小肺细胞癌。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤为肉瘤。
17.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其进一步包含投与程序性死亡受体-1(PD-1)阻断抗体。
18.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、或至少95。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述表达Axl的肿瘤的肿瘤膜P评分为至少70。
20.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其进一步包含投与颗粒球群落刺激因子或其类似物。
21.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其中所述药学上可接受的载剂具有6.0的pH且包含20mM组氨酸-HCL、70mg/mL蔗糖及0.5mg/mL聚山梨醇酯80。
22.根据权利要求12至14中任一权利要求所述的方法，其中n等于4。
CN202180076413.6A 2020-11-12 2021-11-10 以抗axl抗体、抗体片段和其免疫结合物治疗表达axl的癌症的方法 Pending CN116635053A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063113040P 2020-11-12 2020-11-12
US63/113,040 2020-11-12
PCT/US2021/058747 WO2022103811A1 (en) 2020-11-12 2021-11-10 Methods of treating axl-expressing cancers with anti-axl antibodies, antibody fragments and their immunoconjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116635053A true CN116635053A (zh) 2023-08-22

Family

ID=81601645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180076413.6A Pending CN116635053A (zh) 2020-11-12 2021-11-10 以抗axl抗体、抗体片段和其免疫结合物治疗表达axl的癌症的方法

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP4243877A1 (zh)
JP (1) JP2023550043A (zh)
KR (1) KR20230107615A (zh)
CN (1) CN116635053A (zh)
AU (1) AU2021377224A1 (zh)
CA (1) CA3197822A1 (zh)
IL (1) IL302589A (zh)
MX (1) MX2023005571A (zh)
TW (1) TW202227484A (zh)
WO (1) WO2022103811A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2766065C (en) * 2009-06-30 2020-07-21 Research Development Foundation Immunoglobulin fc polypeptides
TW201204388A (en) * 2010-06-18 2012-02-01 Genentech Inc Anti-Axl antibodies and methods of use
EP3186284B1 (en) * 2014-08-28 2022-04-06 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
US11111505B2 (en) * 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
KR20230162730A (ko) * 2016-04-15 2023-11-28 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 Axl항체 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
IL302589A (en) 2023-07-01
EP4243877A1 (en) 2023-09-20
AU2021377224A1 (en) 2023-06-22
KR20230107615A (ko) 2023-07-17
WO2022103811A1 (en) 2022-05-19
CA3197822A1 (en) 2022-05-19
TW202227484A (zh) 2022-07-16
JP2023550043A (ja) 2023-11-30
MX2023005571A (es) 2023-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7456658B2 (ja) 抗Ａｘｌ抗体、抗体断片およびそれらの免疫コンジュゲートならびにそれらの使用
JP7432253B2 (ja) 抗Ｒｏｒ２抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用
KR20210100668A (ko) 항-CD79b 면역접합체, 알킬화제 및 항-CD20 항체를 포함하는 미만성 큰 B-세포 림프종의 조합 요법
CN116635053A (zh) 以抗axl抗体、抗体片段和其免疫结合物治疗表达axl的癌症的方法
TWI844893B (zh) 抗-axl抗體、抗體片段及其免疫結合物及其用途
JP2024088638A (ja) 抗Ａｘｌ抗体、抗体断片およびそれらの免疫コンジュゲートならびにそれらの使用
TW202342537A (zh) 使用條件性活性抗ror2抗體-藥物結合物之癌症治療

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40090289

Country of ref document: HK