KR20230107615A - 항-axl 항체, 항체 단편 및 이들의 면역접합체로 axl 발현 암을 치료하는 방법 - Google Patents

항-axl 항체, 항체 단편 및 이들의 면역접합체로 axl 발현 암을 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

Axl 발현 암의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 Axl 단백질에 특이적으로 결합하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 폴리펩티드, 폴리펩티드를 함유하는 항체 또는 항체 단편, 및/또는 이의 면역접합체 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 수반한다. 면역접합체 화합물은 절단 가능한 링커(CAB-Axl-ADC)를 통해 하나 이상의 약물(들)에 접합된 조건부 활성 생물학적(CAB) 항-Axl 항체이다. 면역접합체는 mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 여기서 mAbBA3011은 항체 또는 항체 단편이고, MMAE는 모노메틸 아우리스타틴 E이고, (n)은 1 내지 4의 정수이다. 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 함유하는 항체 및 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 또한 제공된다.

Description

항-AXL 항체, 항체 단편 및 이들의 면역접합체로 AXL 발현 암을 치료하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 11월 12일에 출원된 미국 가출원 제63/113,040호의 이익을 주장하며, 그 전체 개시는 본 명세서에 참조로 구체적으로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 2020년 10월 14일에 생성되고 12,000바이트를 포함하는 "BIAT-1034_Sequence Listing"이라는 텍스트 파일로 제출된 서열 목록을 포함한다. 이 텍스트 파일에 포함된 자료는 본 명세서에 참조로 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 Axl 발현 암의 치료 방법에 관한 것이다. 방법은 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.8 mg/kg의 항-Axl 항체, 항체 단편 및/또는 이러한 항체 및 항체 단편의 면역접합체의 주당 용량을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
Axl 단백질(Ark, UFO, Tyro-7이라고도 함)은 Tyro-3 키나제 계열의 수용체 티로신 키나제이다. Tyro-3 수용체 키나제는 2개의 면역글로빈 유사 도메인과 세포외 영역 및 세포질 키나제 도메인에서 이중 피브로넥틴 유형 III 반복의 조합을 특징으로 한다. Tyro-3 수용체 키나제에 대한 리간드는 Gas6(성장 정지-특이적 6) 및 43% 아미노산 서열 동일성을 나타내고 유사한 도메인 구조를 공유하는 2개의 비타민 K 의존 단백질인 단백질 S이다. 각 단백질은 11g-카복시글루탐산 잔기를 함유하는 N-말단 Gla 도메인을 가지고 있으며, 그 뒤에 4개의 표피 성장 인자(EGF) 유사 모듈 및 2개의 탠덤 라미닌 G 도메인으로 구성된 C-말단 성 호르몬 결합 글로블린(SHBG) 유사 구조가 있다. SHBG 도메인은 Tyro-3 수용체 키나제 결합 및 활성화에 필요하고 충분한 반면, Gla 도메인은 음으로 하전된 막 인지질에 결합하고 세포자멸 세포의 Tyro-3 키나제 매개 식균작용에서 중요한 역할을 한다.
Axl 활성화는 PI-3-키나제/Akt를 통한 신호 전달(Franke 등, Oncogene, vol. 22, pp. 8983-8998, 2003) 및 다른 주요 경로 like Ras/Erk 및 β-카테닌/TCF (Goruppi 등, Mol. Cell. Biol., vol. 21, pp. 902-915, 2001)로 이어진다. Axl은 뇌, 심장, 골격근, 장기 캡슐 및 여러 다른 장기의 결합 조직을 포함한 다양한 정상 조직과 단핵구에서 약하게 발현되지만 림프구에서는 발현되지 않는다. Axl에 의해 유도된 Akt 인산화는 섬유아세포(Goruppi 등, Mol. Cell. Biol., vol. 17, pp. 4442-4453 1997), 내피 세포 (Hasanbasic 등, Am J Physiol Heart Circ Physiol, vol. 287, H1207-H1213, 2004), 혈관 평활근 세포 (Melaragno 등, J. Mol. Cell. Cardiol., vol. 37, pp. 881-887, 2004) 및 뉴런 (Allen 등, Mol. Endocrinol., vol. 13, pp.191-201, 1999)의 생존에서 기재되었다. 또한, Axl 녹아웃 동물이 혈소판 인테그린 IIb3의 감소된 활성화로 인해 손상된 혈소판 응집체 안정화 및 혈전 형성을 나타내기 때문에 Axl은 세포 부착 및 화학주성에서 역할을 한다.
Axl 또는 그 리간드 Gas6의 조절 장애는 다양한 인간 암의 병인과 관련이 있다. Axl 과발현은 다양한 암 유형, 예를 들어 유방 (Meric 등, Clin. Cancer Res., vol. 8, pp. 361-367, 2002; Berclaz 등, Ann. Oncol., vol. 12, pp. 819-824, 2001), 결장 (Chen 등, Int. J. Cancer, vol. 83, pp. 579-584, 1999; Craven 등, Int. J. Cancer,vol. 60, pp. 791-797, 1995), 전립선 (Jacob 등, Cancer Detect. Prey., vol. 23, pp. 325-332, 1999), lung (Wimmel 등, Eur J Cancer, vol. 37, pp. 2264-2274, 2001), 위 (Wu 등, Anticancer Res., vol. 22, pp. 1071-1078, 2002), 난소 (Sun 등, Oncology, vol. 66, pp. 450-457, 2004), 자궁내막 (Sun 등, Ann. Oncol., vol. 14, pp. 898-906, 2003), 신장 (Chung 등, DNA Cell Biol., vol. 22, pp. 533-540, 2003), 간세포 (Tsou 등, Genomics, vol. 50, pp. 331-340, 1998), 갑상선 (Ito 등, Thyroid, vol. 12, pp. 971-975, 2002; Ito 등, Thyroid, vol. 9, pp. 563-567, 1999), 및 추가로 만성 골수형성 백혈병 (Janssen 등, Oncogene, vol. 6, pp. 2113-2120, 1991; Braunger 등, Oncogene, vol. 14, pp. 2619-2631 1997; O'Bryan 등, Mol. Cell. Biol., vol. 11, pp. 5016-5031, 1991), 급성 골수성 백혈병 (Rochlitz 등, Leukemia, vol. 13, pp. 1352-1358, 1999), 골육종 (Nakano 등, J. Biol. Chem., vol. 270, pp. 5702-5705, 2003), 흑색종 (van Ginkel 등, Cancer Res., vol. 64, pp. 128-134, 2004), 및 두경부 편평 세포 암종 (Green 등, Br J. Cancer., vol. 94, pp. 1446-5, 2006)에서 입증되었다.
최근에, 포스포티로신 신호전달의 프로파일링에 의해, 활성화된 Axl이 NSCLC의 원발성 종양의 약 5%에서 검출되었다(Rikova 등, Cell, vol. 131, pp. 1190-1203, 2007). Axl 발현은 표적 화학요법 약물에 의해 유도되고 약물 유도 Axl 발현은 각각 급성 골수성 백혈병에서 화학 요법에 대한 내성 (Hong 등, Cancer Letters, vol. 268, pp. 314-324, 2008), 뿐만 아니라 위장 간질성 종양 (Mehadevan, 등, Oncogene, vol. 26, pp.3909-3919, 2007) 및 유방암 (Liu 등, Cancer Research, vol. 281, pp. 6871-6878, 2009)에서 이마티닙 및 라파티닙/헤르셉틴에 대한 내성을 부여한다.
또한 Axl은 비-침습성 세포에 비해 공격적인 유방암 세포주에서 상향조절되기 때문에 종양 전이와 관련이 있는 것으로 확인되었다. 시험관 내에서, Axl 활성은 이동 및 침습에 필요한 것으로 밝혀졌으며, 이 활성은 항체 처리에 의해 억제될 수 있다(WO 04/008147). 유사하게, Axl의 우성 음성 버전의 발현(Vajkoczy, P., 등, Proc. Natl. Acad. Science U.S.A., vol. 103, pp. 5799-5804, 2005) 또는 Axl의 siRNA 매개 하향 조절(Holland 등, Cancer Res., vol. 65, pp. 9294-9303, 2005)에 의한 생체 내 Axl 활성의 폐기는 뮤린의 이종이식 실험에서 피하 및 동소 세포 성장을 방지하였다.
따라서, 암 치료에 사용하기 위한 항-Axl 단클론성 항체가 기재되었다. 예를 들어 항-Axl 항체에 관한 간행물은 WO 2009/063965, WO 2009/062690, WO 2011/014457, US 2014/0227283 및 미국 특허 제8,853,369호를 포함한다. US 2014/0227283은 단클론성 항-Axl 항체 및 진단 및 치료 방법에서의 이의 용도를 개시한다. WO 2009/062690은 Axl 단백질의 세포외 도메인에 결합하고 Axl 활성을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 항체를 개시한다.
이러한 단클론성 항-Axl 항체는 치료하려는 종양 위치를 포함하여 유사한 친화도로 환자 신체의 모든 위치에서 Axl에 결합한다. 비종양 환경에서 Axl에 대한 이러한 항체의 결합은 이러한 환경에서 Axl의 정상적인 기능에 악영향을 미칠 것으로 예상되며 따라서 심각한 부작용을 유발할 수 있다. 본 발명은 비-종양 환경에서 Axl에 대한 결합 친화도와 비교하여 종양 미세환경에서 Axl에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 조건부 활성 항-Axl 항체 및 항체 단편을 제공한다. 본 발명의 항-Axl 항체 및 항체 단편은 당업계에 공지된 단클론성 항-Axl 항체와 비교하여 감소된 부작용과 유사하거나 더 큰 항암 효능을 가질 것으로 기대된다. 이것은 또한 더 높은 복용량의 항-Axl 항체 및 항체 단편의 투여 또는 더 빈번한 치료를 허용하여 더 효과적인 치료 옵션을 제공할 수 있다.
암은 계속해서 전 세계적으로 주요 건강 부담이다. 미국(US)에서는 심장 질환 다음으로 두 번째로 흔한 사망 원인으로, 사망 4건 중 거의 1건을 차지한다(American Cancer Society 2011). 고형 종양의 치료는 특별한 도전을 제기한다. 예를 들어, 폐암은 수십 년 동안 세계에서 가장 흔한 암이었으며 2008년까지 약 161만 건의 새로운 사례가 발생했으며 이는 모든 새로운 암의 12.7%를 나타낸다. 또한 암으로 인한 사망의 가장 흔한 원인으로 138만 명(전체의 18.2%)이 사망하였다(GLOBOCAN 2008). 비-소세포 폐암(NSCLC)은 전체 폐암의 약 80 내지 85%를 차지한다. 최근 면역 요법(프로그래밍된 사멸 리간드 1 항체) 및 표적 요법(예를 들어, 표피 성장 인자 수용체, 역형성 림프종 키나제 억제제 등)의 발전으로 NSCLC 환자의 제한된 부분만이 요법의 혜택을 받는다.
연조직 육종(STS)은 가장 최근의 세계보건기구(WHO) 분류(WHO 2013)에 따라 100개 이상의 조직학적 하위 유형을 갖는 중간엽 유래 암이다. STS의 관리는 치료가 본질적으로 완화적이고 치료 가능성이 급격히 감소하기 때문에 어려운 문제이다. 보고된 중앙 전체 생존 기간은 약 12 내지18개월이다(Cioffi 2012; Martin-Liberal 2014). 불행하게도, 암 치료의 진보에도 불구하고, 특히 기존 치료법에 반응하지 않거나 내성을 갖게 된 진행성 질환 환자의 경우, 보다 효과적이고 덜 독성인 치료법에 대한 미충족 의료 수요가 계속 존재한다.
한 양태에서, 본 발명은 Axl 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 폴리펩티드, 및 치료를 필요로 하는 인간에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 Axl 발현 종양의 치료 방법에서의 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 6개의 상보성 결정 영역 H1, H2, H3, L1, L2 및 L3을 포함하며, 여기에서:
H1 서열은 X1GX2X3MX4(서열번호: 1) (X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X1은 T 또는 A 또는 W이고,
X2는 H 또는 A이고,
X3은 T 또는 I이고, 그리고
X4는 N 또는 I이고;
H2 서열은 LIKX5SNGGTX6YNQKFKG(서열번호: 2) (X5 및 X6은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X5는 P 또는 N이고,
X6은 S 또는 I 또는 T이고; 그리고
H3 서열은 GX7X8X9X10X11X12X13X14DYX15X16(서열번호: 3) (X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, 및 X16은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X7은 H 또는 D 또는 E 또는 P 또는 R 또는 W이고,
X8은 Y 또는 N이고,
X9는 E 또는 A 또는 D 또는 F 또는 G 또는 H 또는 I 또는 L 또는 M 또는 N 또는 R 또는 V 또는 Y이고,
X10은 S 또는 D 또는 M 또는 N 또는 Q이고,
X11은 Y 또는 C 또는 E 또는 P이고,
X12는 F 또는 E 또는 N 또는 S 또는 T 또는 V이고,
X13은 A 또는 D 또는 G 또는 L 또는 Y이고,
X14는 M 또는 E 또는 F이고,
X15는 W 또는 A 또는 D 또는 H 또는 L 또는 N 또는 P 또는 R 또는 T이고, 그리고
X16은 G 또는 H이고,
L1 서열은 KASQDX17X18SX19VX20(서열번호: 4) (X17, X18, X19, 및 X20은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X17은 V 또는 D 또는 G 또는 N 또는 W이고,
X18은 S 또는 V이고,
X19는 A 또는 L 또는 M이고, 그리고
X20은 A 또는 D 또는 N 또는 Q이고;
L2 서열은 is X21X22X23TRX24T(서열번호: 5) (X21, X22, X23, 및 X24는 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X21은 W 또는 F이고,
X22는 A 또는 I 또는 N 또는 P 또는 Q이고,
X23은 S 또는 D이고,
X24는 H 또는 D이고; 그리고
L3 서열은 QEX25X26SX27X28X29X30(서열번호: 6)X25, X26, X27, X28, X29, and X30은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X25는 H 또는 C 또는 F 또는 I 또는 L 또는 Q 또는 S 또는 T 또는 V 또는 Y이고,
X26은 F 또는 C 또는 D 또는 E 또는 G 또는 N 또는 S이고,
X27은 T 또는 C 또는 P이고,
X28은 P 또는 A 또는 C 또는 D 또는 E 또는 H 또는 K 또는 S 또는 T 또는 V 또는 W이고,
X29는 L 또는 G 또는 R이고, 그리고
X30은 T 또는 I 또는 R이고,
본 발명의 폴리펩티드는 하기 6개의 CDR을 갖는 모 폴리펩티드를 배제한다:
H1 = TGHTMN,
H2 = LIKPSNGGTSYNQKFKG,
H3 = GHYESYFAMDYWG,
L1 = KASQDVSSAVA,
L2 = WASTRHT, 및
L3 = QEHFSTPLT.
또 다른 양태에서, 본 발명은 모 폴리펩티드에 비해 CDR H1, H2 및 H3에서 최대 1개의 치환 및 모 폴리펩티드에 비해 CDR L1, L2 및 Le에서 최대 1개의 치환을 갖는 상기 기재된 바와 같은 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 여기에는 모 폴리펩티드에 비해 CDR H1, H2 및 H3에 1개의 치환을 갖는 단리된 폴리펩티드, 모 폴리펩티드에 비해 CDR L1, L2 및 L3에 1개의 치환을 갖는 단리된 폴리펩티드, 및
모 폴리펩티드에 비해 CDR H1, H2 및 H3에서 1개의 치환 및 모 폴리펩티드에 비해 CDR L1, L2 및 L3에서 1개의의 치환을 갖는 단리된 폴리펩티드를 포함한다. CDR H1, H2 및 H3의 가능한 조합은 도 1a에 도시되어 있고, CDR L1, L2 및 L3의 가능한 조합은 도 1b에 도시되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Axl 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 폴리펩티드, 및 치료를 필요로 하는 인간에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 Axl 발현 종양의 치료 방법에서의 폴리펩티드의 용도를 제공하고, 단리된 폴리펩티드는 서열번호: 20으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 서열번호: 21으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 본 발명의 적어도 하나의 상기 단리된 폴리펩티드를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Axl 발현 종양의 치료를 위해 전술한 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 사용하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 화학요법제, 방사성 원자, 세포증식억제제 및 세포독성제로부터 선택되는 제제에 선택적으로 접합된, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 제공할 뿐만 아니라 이러한 면역접합체를 투여하는 것을 수반하는 Axl 발현 종양의 치료 방법을 제공한다.
한 양태에서, 면역접합체는 조건부 활성 생물제제(CAB) 항-Axl 항체가 절단 가능한 링커(CAB-Axl-ADC)를 통해 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다. CAB-Axl-ADC는 mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)일 수 있으며, 여기서 이종 분자는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이고, (n)은 1 내지 4(포함)의 정수이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 mAbBA301-절단 가능한 링커-MMAE(n)를 Axl 발현 종양의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 Axl 발현 종양의 치료 방법을 제공하고, 여기서 mAbBA301는 서열번호 14의 hcCDR1, 서열번호 15의 hcCDR2 및 서열번호 16의 hcCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 lcCDR1, 서열번호 18의 lcCDR2, 및 서열번호 19의 lcCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편이고; MMAE는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이고, 그리고 (n)은 1 내지 4(포함)의 정수이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Axl 발현 종양을 진단 또는 치료하기 위한 사용 설명서와 함께 본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 포함하는 진단 또는 치료용 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Axl 발현 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 mAbBA301-절단가능한 링커-MMAE(n) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 약제학적 조성물은 정맥내 주입에 의해 21일마다 1일차 및 8일차에 1.8 mg/인간 대상체 체중 kg의 용량으로 투여된다. mAbBA301은 서열번호 14의 hcCDR1, 서열번호 15의 hcCDR2 및 서열번호 16의 hcCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 lcCDR1, 서열번호 18의 lcCDR2, 및 서열번호 19의 lcCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편이고; 그리고 (n)은 1 내지 4(포함)의 정수이고, 바람직하게는, (n)은 4이다.
일 양태에서, mAbBA301의 중쇄 가변 영역은 서열번호 20을 포함하고 mAbBA301의 경쇄 가변 영역은 서열번호 21을 포함한다.
추가 양태에서, 절단 가능한 링커는 mc-vc-PAB이다.
추가 양태에서, Axl 발현 종양은 육종, 선암종 또는 비-소세포 폐암이고, 바람직하게는 Axl 발현 종양은 육종이다.
추가 양태에서, 방법은 프로그래밍된 사멸 수용체-1(PD-1) 차단 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, Axl 발현 종양은 적어도 70의 종양 막 P 점수를 갖는다.
추가 양태에서, 방법은 과립구 콜로니 자극 인자 또는 그의 유사체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 6.0의 pH를 가지며, 20 mM 히스티딘-HCl, 70 mg/mL 수크로스 및 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
도 1a 및 도 1b는 각각 본 발명의 항-Axl 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열 정렬을 보여준다.
도 2는 pH 6.0 및 pH 7.4에서 Axl의 세포외 도메인에 대한 본 발명의 다양한 조건부 활성 항체의 결합(OD450)을 보여준다. 이들 조건부 활성 항체는 pH 7.4보다 pH 6.0에서 더 활성이었다.
도 3은 Axl의 세포외 도메인에 대한 본 발명의 다양한 조건부 활성 항체의 선택도를 보여준다. 선택도는 pH 6.0에서 결합 파트너에 대한 결합 친화도 대 pH 7.4에서 동일한 결합 파트너에 대한 결합 친화도의 비율로 측정되었다.
도 4는 실시예 1에 기술된 바와 같이 본 발명의 조건부 활성 항체가 응집하지 않음을 나타내는 크기 배제 크로마토그래프를 보여준다.
도 5는 실시예 1에 기술된 바와 같이 ELISA 검정에 의해 측정 시, 열 충격 전 및 후의 본 발명의 조건부 활성 항체의 열안정성을 보여준다.
도 6a 및 도 6b는 실시예 1에서 SPR 검정에 의해 측정 시, 본 발명의 조건부 활성 항체의 선택도를 보여준다.
도 7은 KREBS 완충액에서 Axl에 대한 본 발명의 항-Axl 항체의 결합에 대한 pH 의존적 결합 프로파일을 보여준다.
도 8a 내지 도 8e는 본 발명의 항-Axl 항체가 pH 6.0 및 pH 7.4 및 상이한 항체 농도에서 세포 사멸에 사용된 A549 세포를 사용한 또 다른 세포 사멸 연구의 결과를 보여준다.
도 9a 내지 도 9d는 상이한 완충제 및 상이한 pH 수준에서 본 발명의 항-Axl 항체에 대한 인간 Axl 및 사이노몰구스 Axl에 대한 결합 친화도를 보여준다.
도 10a 내지 도 10h는 듀오마이신에 접합된 본 발명의 항-Axl 항체에 의한 상이한 pH 수준에서 상이한 세포주의 세포 사멸을 보여준다.
도 11은 젬시타빈에 접합된 본 발명의 항-Axl 항체에 의한 상이한 pH 수준에서 A549 세포의 세포 사멸을 보여준다.
도 12는 본 발명의 듀오마이신 접합된 항-Axl 항체로 이종이식된 마우스의 치료의 종양 부피에 대한 효과를 보여준다.
도 13a 및 도 13b는 접합체 주사 후 시간 경과에 따른 사이노몰구스 원숭이의 혈액에서 본 발명의 듀오마이신 접합된 항-Axl 항체의 검출된 존재를 보여준다.
도 14a는 접합체 주사 직전(사전(D-3))부터 시작하여 접합체 주사 3일 후(사후(D-3))까지 시간 경과에 따라 사이노몰구스 원숭이의 혈액에서 검출된 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST)의 존재를 보여준다.
도 14b는 접합체 주사 직전(사전(D-3))부터 시작하여 접합체 주사 3일 후(사후(D-3))까지 시간 경과에 따라 사이노몰구스 원숭이의 혈액에서 검출된 알라닌 아스파르테이트 트랜스아미나제(ALT)의 존재를 보여준다.
도 15는 접합체 주사 후 사이노몰구스 원숭이의 혈액에서 시간 경과에 따른 림프구 수를 보여준다.
도 16a 및 도16b는 각각 LCLC103H 및 DU145를 받은 마우스의 생체내 치료를 보여준다.
도 17a 내지 도 7d는 이종이식 마우스 모델에서 BA3011의 항종양 효능을 보여준다. BA3011의 항종양 효능은 면역 결핍 동물에서 Axl을 발현하는 인간 종양 세포주 유래 이종이식 종양을 사용하여 생체 내에서 입증되었다. NSCLC(LCLC103H; 도 17a), 전립선(DU145; 도 17b) 및 췌장 종양(MIAPaCa2; 도 17c)을 나타내는 종양 세포주를 이러한 생체내 마우스 모델 시스템에서 시험하였다.
도 18은 예시적인 용량 증량 흐름도이다.
도 19는 예시적인 투약 일정을 보여준다.
도 20은 1.8 mg/kg Q3W 또는 2Q3W BA3011-CAB-Axl-ADC-MMAE를 투여한 환자에서 표적 병변의 합의 변화를 보여준다. 종양 막 퍼센트 점수(TmPS)에서 AXL의 원형질막 평점은 ≥ 1+, ≥ 2+ 또는 ≥3+에서 강도의 백분율을 합산하여 계산된다. 따라서 점수의 범위는 0에서 100까지이다. 종양 세포질 점수와 종양 막 점수를 구분할 수 없는 환자는 배제된다.
도 21은 암 징후에 의한 평균 Axl 원형질막 H-점수를 보여준다.
도 22는 1.8 mg/kg Q3W(d1) 또는 2Q3W(d1,8)의 용량에서 Axl TmPS
Figure pct00001
70인 1상 육종 환자에서 표적 병변의 합(최상의 반응)의 백분율 변화를 보여준다.
도 23은 시험된 모든 용량에서 1상에서 평가가능한 육종 환자에서 Axl TmPS 카테고리에 의한 표적 병변의 합계(최상의 반응)의 백분율 변화를 보여준다.
도 24는 시험된 모든 용량에서 1상에서 평가가능한 육종 환자의 방문 및 Axl TmPS 카테고리에 의한 표적 병변의 합계의 변화 퍼센트를 보여준다.
본원에 제공된 예를 용이하게 이해하기 위해, 자주 나오는 특정 용어들을 이하에서 정의한다.
측정된 양에 관해 본원에서 사용된 "약"이라는 용어는, 측정을 담당하고 측정 대상과 사용된 측정 장비의 정밀도에 맞게 주의를 기울일 것을 훈련받은 숙련자가 예상할 정도의 측정량의 정상적인 변화를 말한다. 달리 지시된 바 없는 경우, "약"은 제공된 값의 +/-10%의 변화를 말한다.
본원에서 사용된 "친화성"이라는 용어는, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유적 상호 작용들의 강도의 총합을 나타낸다. 달리 지시된 바 없는 경우, 본원에서 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 멤버들 (예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호 작용을 반영한 고유한 결합 친화성을 말한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은, 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것들을 포함한 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 설명적이고 예시적인 특정 구현예들이 이하에 기재되어 있다.
용어 "친화도 성숙"은 항체와 관련하여 사용될 때, 항원에 대한 항체 또는 항체 단편의 친화도를 개선시키는 이러한 변경을 갖지 않는 모 항체 또는 항체 단편과 비교하여 하나 이상의 초가변 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경이 있는 항체 또는 항체 단편을 말한다.
본원에서 사용된 "아미노산"이라는 용어는, 바람직하게는 자유 기로서, 또는 대안적으로 펩티드 결합의 일부로서 축합된 후, 아미노 기 (-NH2) 및 카르복실 기 (-COOH)를 함유한 임의의 유기 화합물을 말한다. "20개의 자연적으로 인코딩된 폴리펩티드-형성 알파-아미노산"은 당업계에 이해된 용어이며: 알라닌 (ala 또는 A), 아르기닌 (arg 또는 R), 아스파라긴 (asn 또는 N), 아스파르트산 (asp 또는 D), 시스테인 (cys 또는 C), 글루탐산 (glu 또는 E), 글루타민 (gin 또는 Q), 글리신 (gly 또는 G), 히스티딘 (his 또는 H), 이소류신 (ile 또는 I), 류신 (leu 또는 L), 리신 (lys 또는 K), 메티오닌 (met 또는 M), 페닐알라닌 (phe 또는 F), 프롤린 (pro 또는 P), 세린 (ser 또는 S), 트레오닌 (thr 또는 T), 트립토판 (tip 또는 W), 티로신 (tyr 또는 Y), 및 발린 (val 또는 V)을 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "제제"는 예를 들어 제약, 치료적 또는 약리학적 화합물을 포함하는 요소, 화합물 또는 분자 독립체를 의미한다. 제제는 천연 또는 합성 또는 이들의 조합일 수 있다.
"항암제"는 단독으로 또는 치료 레지멘의 일부로서 또 다른 제제와 조합하여 암세포에 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 발휘하는 제제이다. 예를 들어, 항암제는 종양 성장을 억제하고, 종양 성장을 저지하고/하거나 이미 존재하는 종양의 퇴행을 유발할 수 있는 제제이다.
본원에서 사용되는 용어 "항-혈관신생제"는 혈관의 발달을 차단하거나 어느 정도 방해하는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 항-혈관신생제는 혈관형성 촉진에 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 한 구현예에서, 항-혈관신생제는 베바시주맙(AVASTIN®)과 같은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
"세포독성 효과"는 세포 증식의 억제를 의미한다. "세포독성제"는 세포에 대한 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 가져서 세포 집단 내의 세포 각각의 성장을 고갈시키거나 억제하는 제제를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자 (예를 들어 scFv)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들이 유래된 항체의 항원(예를 들어, 폴리펩티드 항원)에 선택적으로 결합하는 일부 능력을 보유하는 이들 항체 단편은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, supra] 참고).
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체 또는 항체 단편을 사용하여 면역친화성 크로마토그래피에 의해 분취 양의 항원을 단리할 수 있다. 이러한 항체 또는 항체 단편의 다양한 다른 용도는 질환(예를 들어, 신조직형성)을 진단하고/하거나 병기를 결정하고 질환, 예를 들어: 신조직형성, 자가면역 질환, AIDS, 심혈관 질환, 감염, 등과 같은 질환을 치료하기 위한 치료 적용을 위한 것이다. 키메라, 인간 유사, 인간화 또는 완전 인간 항체 또는 항체 단편은 특히 인간 환자에게 투여하는 데 유용하다.
Fab 절편은 항체 분자의 1가 항원-결합 절편으로 이루어지며, 전체 항체 분자를 파파인 효소로 소화시켜, 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어진 절편을 얻을 수 있다.
항체 분자의 Fab' 절편은 전체 항체 분자를 펩신(pepsin)으로 처리한 후 환원시켜, 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어진 분자를 얻음으로서 생성될 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 경우, 항체 분자당 2개의 Fab' 절편을 얻는다.
항체의 (Fab')2 절편은 전체 항체 분자에 펩신 효소를 처리한 후, 환원시키지 않음으로써 얻을 수 있다. (Fab')2 절편은 2개의 Fab' 절편의 이량체로서, 2개의 디설파이드 결합에 의해 함께 유지된다.
Fv 단편은 2개의 사슬로 발현되는 경쇄의 가변 영역와 중쇄의 가변 영역를 함유한 유전자 조작된 단편으로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "항-Axl 항체", 항-Axl 항체 단편 및 "Axl에 결합하는 항체 또는 항체 단편"은 항체 또는 항체 단편이 Axl을 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 Axl에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 한 구현예에서, 관련되지 않은 비-Axl 단백질에 대한 항-Axl 항체 또는 항체 단편의 결합 정도는, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정 시, Axl에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, Axl에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예를 들어 10-8M 이하, 또는 10-8M 내지 10-13M, 또는 10-9M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 상이한 종으로부터의 Axl 사이에 보존된 Axl의 에피토프에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈관신생 장애"는 비-신생물성 및 신생물성 상태 모두를 포함하는 혈관형성의 임의의 조절장애를 말한다. 신생물 상태에는 아래에 설명된 조건이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다(예를 "암" 참고). 비신생물성 장애는 바람직하지 않은 또는 비정상적인 비대, 관절염, 류마티스관절염 (RA), 건선, 건선성 플라크, 유육종증, 죽상동맥경화증, 죽상경화판, 당뇨병성 및 다른 증식성 망막병증 (미숙아 망막증 포함), 수정체뒤 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 각막 신생혈관형성, 각막 이식 신생혈관형성, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신생혈관형성, 각의 신생혈관형성 (조홍), 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착증, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 과다형성 (그레이브스병 포함), 각막 및 다른 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 일차 폐 고혈압, 악성 폐 삼출, 대뇌 부종 (예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄 헤드 손상/트라우마와 관련된 것), 활막 염증, RA에서의 판누스 형성, 화골성 근염, 비대성 뼈 형성, 골관절염 (OA), 불응성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액 질환의 3차 간격 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 유섬유종, 조기 분만, 만성 염증 예컨대 IBD (크론병 및 궤양성 대장염), 신장 동종이식편 거부반응, 염증성 장 질환, 신장 증후군, 바람직하지 않은 또는 비정상적인 조직 질량 성장 (비-암), 혈우병 조인트, 비대성 반흔, 모발 성장의 억제, 오슬러-웨버 증후군, 화농성 육아종 수정체뒤 섬유증식, 경피증, 트라코마, 혈관 접착, 윤활막염, 피부염, 전자간증, 복수, 심장주위 삼출 (예컨대 심막염과 관련된 것), 및 늑막 삼출액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "혈관신생"은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장에 기여하는 모든 Axl 관련 과정, 특히 혈관을 공급하는 새로운 종양에 한정되지 않는 것을 지칭한다. 이러한 과정에는 혈관 내피 세포의 증식, 생존, 이동 및 발아, 혈관 주위 세포의 유인 및 이동, 혈관 안정화를 위한 기저막 형성, 혈관 관류 또는 기질 또는 신생물 세포에 의한 혈관신생 인자의 분비와 같은 다중 세포 이벤트가 포함되고, 바람직하게는 Axl 인산화 및/또는 Axl 매개 신호 전달을 포함하는 Axl의 비-촉매 또는 촉매 활성에 의해 자극 또는 매개되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "Axl"은 달리 명시되지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함하는 모든 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 Axl을 말한다. 이 용어는 "전장(full-length)", 처리되지 않은 Axl뿐만 아니라 세포에서 처리된 결과로 생성된 모든 형태의 Axl을 포함한다. 이 용어는 또한 Axl의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 인간 Axl의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있고 GenBank와 같은 공개 데이터베이스에서 입수할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "Axl 활성화"는 Axl 수용체의 활성화 또는 인산화를 지칭한다. 일반적으로, Axl 활성화는 신호 전달(예를 들어, Axl 또는 기질 폴리펩티드에서 티로신 잔기를 인산화하는 Axl 수용체의 세포내 키나제 도메인에 의해 야기됨)을 초래한다. Axl 활성화는 관심 있는 Axl 수용체에 결합하는 Axl 리간드(Gas6)에 의해 매개될 수 있다. Axl에 대한 Gas6 결합은 Axl의 키나제 도메인을 활성화할 수 있으며, 그에 따라 Axl의 티로신 잔기의 인산화 및/또는 추가 기질 폴리펩티드(들)의 티로신 잔기의 인산화를 초래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Axl 매개 항-세포자멸"은 인간 세포, 바람직하게는 인간 암 세포를 프로그래밍된 세포 사멸(세포자멸)로부터 방지하는 모든 Axl 수반 과정을 지칭한다. 특히, 성장 인자 철수, 저산소증, 화학요법제 또는 방사선에 대한 노출 또는 Fas/Apo-1 수용체 매개 신호전달의 개시를 통한 세포자멸의 유도로부터 인간 세포, 바람직하게는 인간 암 세포를 방지하고, 바람직하게는 Axl 인산화 및/또는 Axl 매개 신호 전달을 포함하는 Axl의 비-촉매 또는 촉매 활성에 의해 자극되거나 매개되는 과정을 지칭한다.
본원에서 사용된 "결합"이라는 용어는, 항체의 가변 영역 또는 Fv와 항원 간의 상호 작용을 말하며, 상기 상호 작용은 항원 상의 특정 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 따라 달라진다. 예를 들어, 항체 가변 영역 또는 Fv는 일반적인 단백질보다는 오히려 특정 단백질 구조를 인식하여 이에 결합한다. 본원에서 사용된 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이라는 용어는, 항체 가변 영역 또는 Fv가 다른 단백질보다는 특정 항원과 더욱 빈번하고, 더욱 신속하게, 더욱 지속적으로 및/또는 더욱 큰 친화성으로 결합하거나, 이에 연결된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체 가변 부위 또는 Fv는 다른 항원에 결합할 때보다 더욱 큰 친화성, 결합성으로 더욱 신속히 및/또는 더욱 지속적으로 이의 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 예에서, 항체 가변 부위 또는 Fv는 관련된 단백질 또는 다른 세포 표면 단백질이나, 다중반응성 천연 항체에 의해 (즉, 인간에서 자연적으로 발견되는 다양한 항원들에 결합하는 것으로 알려진 자연 발생적인 항체에 의해) 공통적으로 인식되는 항원에서보다 훨씬 큰 친화성으로 세포 표면 단백질 (항원)에 결합한다. 그러나, "특이적인 결합"이 반드시 다른 항원의 배타적인 결합 또는 비-탐지성 결합을 필요로 하는 것은 아니며, "선택적 결합"이라는 용어를 의미한다. 일 예에서, 항원에 대한 항체 가변 영역 또는 Fv (또는 다른 결합 부위)의 "특이적인 결합"은, 항체 가변 영역 또는 Fv가 100 nM 이하, 예컨대 50 nM 이하, 예를 들어 20 nM 이하, 예컨대, 15 nM 이하, 또는 10 nM 이하, 또는 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 평형 상수 (KD)로 항원에 결합하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "암" 및 "암성"이라는 용어는, 전형적으로, 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유류의 생리적 조건을 말하거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 더욱 특수한 예는, 편평세포암, 소-세포 폐암, 비-소-세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포암, 복막의 암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 신경교종, 자궁 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁 내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간의 암종, 백혈병 및 다른 림프 증식 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
본원에서 사용된 "세포 증식 장애" 및 "증식 장애"라는 용어는, 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 말한다. 일 구현예에서, 상기 세포 증식 장애는 암이다.
본원에서 사용된 "화학치료제"라는 용어는, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 말한다. 본원에서 사용된 "화학치료제"라는 용어는, 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 말한다. 화학치료제의 예는, 알킬화제, 예컨대 티오테파(thiotepa) 및 사이클로포스파미드(cyclosphosphamide)(CYTOXAN®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판(busulfan), 임프로술판(improsulfan) 및 피포술판(piposulfan); 아지리딘(aziridine), 예컨대 벤조도파(benzodopa), 카보퀴온(carboquone), 메투레도파(meturedopa), 및 우레도파(uredopa); 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민(triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포라미드(triethylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸로멜라민을 포함한, 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌(acetogenin)(특히, 불라타신(bullatacin) 및 불라타시논(bullatacinone); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(tetrahydrocannabinol)(드로나비놀(dronabinol), MARINOL®); 베타-라파콘(lapachone); 라파콜(lapachol); 콜키신(colchicine); 베툴린산(betulinic acid); 캄포테신(camptothecin)(합성 유사체 토포테칸(topotecan)(HYCAMTIN®) 포함), CPT-11 (이리노테칸(irinotecan), CAMPTOSAR®), 아세틸캄토테신(acetylcamptothecin), 스코포렉틴(scopolectin), 및 9-아미노캄토테신(aminocamptothecin)); 브리오스타틴(bryostatin); 칼라이스타틴(callystatin); CC-1065 (이의 아도젤레신(adozelesin), 카르젤레신(carzelesin) 및 비젤레신(bizelesin) 합성 유사체 포함); 포도필로톡신(podophyllotoxin); 포도필린산(podophyllinic acid); 테니포시드(teniposide); 크립토파이신(cryptophycin)(특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴(dolastatin); 듀오카르마이신(duocarmycin)(합성 유도체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴(pancratistatin); 사르코딕티인(sarcodictyin); 스폰기스타틴(spongistatin); 질소 무스타드, 예컨대 클로람부실(chlorambucil), 클로마파진(chlomaphazine), 클로로포스파미드(chlorophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란(melphalan), 노벰비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실 무스타드(uracil mustard); 니트로소우레아(nitrosoureas), 예컨대 카무스틴(carmustine), 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴(nimustine), 및 라니무스틴(ranimnustine); 항생제, 예컨대 에네디인(enediyne) 항생제 (예를 들어, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마 ±및 칼리케아마이신 오메가 ±예를 들어, 문헌[Nicolaou 외, Angew. Chem. Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참고); CDP323, 경구용 알파-4 인테그린 저해제; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신(dynemicin); 에스테라미신(esperamicin); 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin) 발색단, 및 관련 발광 단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신(actinomycin), 오트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카미노마이신(caminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주사 (DOXIL®), 리소좀 독솜루비신(doxorumbicin) TLC D-99 (MYOCET®), 페길화 리소좀 독소루비신 (CAELYX®), 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycin), 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈로마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycin), 페플로마이신(peplomycin), 포르피로마이신(porfiromycin), 퓨로마이신(puromycin), 쿠엘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈(gemcitabine)(GEMZAR®), 데가푸르(tegafur)(UFTORAL®), 카페시타빈(capecitabine) (XELODA®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데놉테린(denopterin), 메토트렉세이트, 테롭테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate); 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈(fludarabine), 6-머캅토퓨린, 티아미프린(thiamiprine), 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르(carmofur), 사이타라빈(cytarabine), 디데옥시우리딘, 독시플루리딘(doxifluridine), 에노시타빈(enocitabine), 플록수리딘(floxuridine); 안드로겐, 예컨대 칼루스테론(calusterone), 드로모스탈론(dromostanolone) 프로피오네이트, 에피티오스타놀(epitiostanol), 메피티오스탄(mepitiostane), 테스토락톤(testolactone); 항-아드레날(adrenal), 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄(mitotane), 트리로스탄(trilostane); 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산(frolinic acid); 아세글라톤(aceglatone); 알도포스파미드(aldophosphamide) 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실(eniluracil); 암사크린(amsacrine); 베스트라부실(bestrabucil); 비산트렌(bisantrene); 에다트락세이트(edatraxate); 데포파민(defofamine); 데메콜신(demecolcine); 디아지퀴온(diaziquone); 엘포르미틴(elformithine); 엘립티늄(elliptinium) 아세테이트; 에포틸론(epothilone); 에토글루시드(etoglucid); 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난(lentinan); 로니다이닌(lonidainine); 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신(maytansine) 및 안사미토신(ansamitocin); 미토구아존(mitoguazone); 미톡산트론(mitoxantrone); 모피단몰(mopidanmol); 니트래린(nitraerine); 펜토스타틴(pentostatin); 페나메트(phenamet); 피라루비신(pirarubicin); 로속산트론(losoxantrone); 2-에틸하이드라지드; 프로카바진(procarbazine); PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, 오리곤주 유진 소재); 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지퀴온(triaziquone); 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라큐린(verracurin) A, 로리딘(roridin) A 및 안구이딘(anguidine)); 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine)(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 가시토신(gacytosine); 아라비노시드(arabinoside)("Ara-C"); 티오테파(thiotepa); 탁소이드(taxoid), 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (ABRAXANETM), 및 도세탁셀 (TAXOTERE®); 클로란부실(chloranbucil); 6-티오구아닌(thioguanine); 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 제제, 예컨대 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) (예를 들어, ELOXATIN®), 및 카보플라틴(carboplatin); 빈블라스틴(vinblastine)(VELBAN®), 빈크리스틴(vincristine)(ONCOVIN®), 빈데신(vindesine)(ELDISINE®, FILDESIN®), 및 비노렐빈(vinorelbine)(NAVELBINE® 포함하는, 튜블린이 중합하여 미세소관을 형성하는 것을 방지하는 빈카(vinca); 에토포시드(etoposide)(VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미톡산트론(mitoxantrone); 류코보린(leucovorin); 노반드론(novantrone); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신; 아미놉테린(aminopterin); 이반드로네이트(ibandronate); 토포이소머라제(topoisomerase) 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMF®); 레티노이드, 예컨대 벡사로텐(bexarotene)(TARGRETIN®)을 포함하는 레티노산; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트(clodronate)(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트(etidronate)(DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산(zoledronic acid)/졸레드로네이트(zoledronate)(ZOMETA®), 알렌드로네이트(alendronate)(FOSAMAX®), 파미드로네이트(pamidronate)(AREDIA®), 틸루드로네이트(tiludronate)(SKEL1D®), 또는 리세드로네이트(risedronate)(ACTONEL®); 트록사시타빈(troxacitabine)(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 세포 이상 증식에 관여하는 신호 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것들, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 THERATOPE® 백신 및 유전자 치료 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 저해제 (예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH (예를 들어, ABARELIX®); BAY439006 (소라페닙(sorafenib); Bayer); SU-11248 (수니티닙(sunitinib), SUTENT® Pfizer); 페리포신(perifosine), COX-2 저해제 (예를 들어, 셀레콕시브(celecoxib) 또는 에토리콕시브(etoricoxib)), 프로테오좀 저해제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉(bortezomib)(VELCADE®); CCI-779; 티피파밉(tipifarnib)(R11577); 오라페닙(orafenib), ABT510; Bcl-2 저해제, 예컨대 오블리머센(oblimersen) 소듐 (GENASENSE®); 픽산트론(pixantrone); EGFR 저해제 (이하의 정의를 참고한다); 티로신 키나제 저해제 (이하의 정의를 참고한다); 세린-트레오닌 키나제 저해제, 예컨대 라파마이신(rapamycin)(시롤리무스(sirolimus), RAPAMUNE®); 파프네실트랜스퍼라제(farnesyltransferase) 저해제, 예컨대 로나파닙(lonafarnib)(SCH 6636, SARASARTM); 및 상기의 것들 중 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기의 것들 중 둘 이상의 조합, 예컨대 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론(prednisolone)의 병용 치료제에 대한 약칭인 CHOP; 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴(oxaliplatin)(ELOXATINTM)에 의한 치료 요법의 약칭인 FOLFOX를 포함한다.
본원에 정의된 화학치료제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나, 감소시키거나, 차단하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제" 또는 "내인성 치료제"를 포함한다. 이들은 그 자체로: 타목시펜(tamoxifen)(NOLVADEX®), 4-하이드록시타목시펜, 토레미펜(toremifene)(FARESTON®), 이독시펜(idoxifene), 드롤록시펜(droloxifene), 라록시펜(raloxifene)(EVISTA®), 트리옥시펜(trioxifene), 케옥시펜(keoxifene), 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예컨대 SERM3를 포함한, 혼합된 작용제/길항제 특성이 있는 항-에스트로겐; 작용제 특성이 없는 순수한 항-에스트로겐, 예컨대 풀베스트란드(fulvestrant)(FASLODEX®), 및 EM800 (이러한 제제는 에스트로겐 수용체 (ER)의 이량체화를 차단하고, DNA 결합을 저해하고, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 억제할 수 있음); 스테로이드 아로마타제 저해제, 예컨대 포르메스탄(formestane) 및 엑세메스탄(exemestane)(AROMASIN®), 및 비스테로이드 아로마타제 저해제, 예컨대 아나스트라졸(anastrazole)(ARIMIDEX®), 레트로졸(letrozole)(FEMARA®) 및 아미노글루테티미드(aminoglutethimide)를 포함하는 아로마타제 저해제, 및 보로졸 (vorozole)(RIVISOR®), 메게스트롤 아세테이트 (MEGASE®), 파드로졸(fadrozole), 및 4(5)-이미다졸(imidazoles)를 포함하는 다른 아로마타제 저해제; 류프롤리드(leuprolide)(LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린(goserelin), 부세렐린(buserelin), 및 트립테렐린(tripterelin)을 포함하는 황체 호르몬-방출 호르몬 작용제; 메게스트롤(megestrol) 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트와 같은 프로게스틴(progestines), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol) 및 프레마린(premarin)과 같은 에스트로겐, 및 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 모든 트랜스레티온산(transretionic acid) 및 펜레티니드(fenretinide)와 같은 안드로겐/레티노이드를 포함하는 성 스테로이드; 오나프리스톤(onapristone); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide) 및 비칼루타미드(bicalutamide); 및 상기의 것들 중 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기한 둘 이상의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "키메라" 항체라는 용어는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종에서 유래하였으나, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종에서 유래한 항체를 말한다.
본원에서 사용되는 항체의 "부류"라는 용어는 그의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체는 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있고, 이러한 중 몇몇은 하위 부류(동형체), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나눠질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 한다.
본원에 사용된 "조건부 활성 항체" 및 "조건부 활성 항체 단편"이라는 용어는 비-종양 미세환경에서 동일한 조건의 상이한 값과 비교하여 종양 미세환경에서 조건의 값에서 더 활성인 항체 또는 항체 단편을 말한다. 비-종양 미세환경에서의 조건과 비교하여, 종양 미세환경에서의 조건은 더 낮은 pH, 더 높은 농도의 락테이트 및/또는 피루베이트, 저산소증, 더 낮은 글루코스 농도 및 약간 더 높은 온도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서 조건부 활성 항체 또는 항체 단편은 정상 체온에서 사실상 비활성일 수 있지만, 종양 미세환경에서 접할 수 있는 더 높은 온도에서는 활성일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조건부 활성 항체 또는 항체 단편은 종양 미세환경에 존재할 수 있는 덜 산소화된 환경에서보다 정상적인 산소화된 혈액에서 덜 활성일 수 있다. 항-Axl 항체 또는 항체 단편이 조건의 상이한 값에서 상이한 활성을 갖도록 촉발할 수 있는 본 발명의 조건으로서 사용하기 위해 또한 선택될 수 있는 당업자에게 공지된 종양 미세환경의 다른 조건이 있다.
예를 들어 Axl 활성에 적용되는 바와 같이 본원에서 사용되는 용어 "구성적"은 리간드 또는 다른 활성화 분자의 존재에 의존하지 않는 수용체 키나제의 연속적인 신호전달 활성을 지칭한다. 수용체 키나제의 특성에 따라, 모든 활성이 구성적일 수 있거나 수용체의 활성이 다른 분자(예를 들어, 리간드)의 결합에 의해 추가로 활성화될 수 있다. 수용체 키나제의 활성화를 유도하는 세포 이벤트는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 활성화는 고차 수용체 복합체로의 올리고머화, 예를 들어 이량체화, 삼량체화 등을 포함할 수 있다. 복합체는 단일 종의 단백질, 즉 동종체성 복합체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 복합체는 적어도 2개의 상이한 단백질 종, 즉 이종체성 복합체를 포함할 수 있다. 복합체 형성은 예를 들어 세포 표면에서 정상 또는 돌연변이 형태의 수용체의 과발현에 의해 야기될 수 있다. 복합체 형성은 또한 특정 돌연변이 또는 수용체의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다.
본원에 사용된 "세포 증식 억제제" 라는 용어는, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 성장을 지연시키는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 세포 증식 억제제는 S 기 세포의 백분율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 세포 증식 억제제의 추가 예는 G0/G1 휴지 상태 또는 M-기 휴지 상태를 유도하여, 세포 주기의 진행을 차단하는 제제를 포함한다. 인간화 항-Her2 항체 트라스투주맙 (HERCEPTIN®)은 G0/G1 휴지 상태를 유도하는 세포 증식 억제제의 예이다. 전형적인 M-기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산(taxanane) 및 토포이소머라제 II 저해제, 예컨대, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드, 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 휴지시키는 특정 제제, 예를 들어, DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 아라(ara)-C도 또한 S-기 휴지 상태로 유도한다. 추가 정보는 [Murakami 외]에 의한 문헌[Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, 챕터 1, 제목 "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs](W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)]의 예를 들어, p. 13에서 찾아볼 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목(yew tree)에서 유래한 항암 약물이다. 서양 주목(European yew)에서 유래한 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은, 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜블린(tubulin)이 미세 소관으로 조립되는 것을 촉진하고 탈중합을 방지하여, 미세 소관을 안정화시켜서, 세포에서 체세포 분열을 억제한다.
본원에 사용된 "세포 독성제"라는 용어는, 세포 기능을 저해 또는 방해하고/거나, 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 말한다. 세포 독성제는 방사능 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212　및 Lu의 방사능 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신(adriamicin), 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제(intercalating agent)); 성장 저해제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소, 또는 효소 활성 독소, 및 이의 단편 및/또는 변이체 포함; 및 이하에 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "디아바디"라는 용어는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 말하는데, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬의 경-쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중-쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다(VH-VL). 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에서 짝을 이루기에는 그 길이가 짧은 링커를 사용함으로서, 상기 도메인이 다른 사슬의 상보성 도메인들과 짝짓는 것을 강제하여, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다.
본원에 사용된 "탐지가능한 표지"라는 용어는, 직접적으로든 간접적으로든 물리적 또는 화학적 수단에 의한 탐지 또는 측정할 때, 시료 내 CTC의 존재를 나타내는 임의의 물질을 말한다. 유용한 탐지가능 표지의 대표적인 예는 이하의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 흡광도, 형광, 반사율, 광산란, 인광, 또는 발광 특성에 기초하여 직접 또는 간접적으로 탐지가능한 분자 또는 이온; 방사능 특성에 의해 탐지가능한 분자 또는 이온; 핵 자기 공명 또는 상자성 특성에 의해 탐지가능한 분자 또는 이온. 예를 들어, 흡광 또는 형광에 기초하여 간접적으로 탐지가능한 분자의 그룹에는, 적절한 기질을 예를 들어, 비-흡광성 분자에서 흡광성 분자로 변환시키거나, 또는 비-형광 분자에서 형광 분자로 변환시키는 다양한 효소들이 포함된다.
본원에 사용된 "진단"이라는 용어는, 질환 또는 장애에 대한 대상체의 민감성을 결정하고, 현재 대상체에 질환 또는 장애가 발병했는 지를 결정하고, 질환 또는 장애가 발병한 대상체의 예후(예를 들어, 암의 전-전이성 또는 전이성 암의 상태, 암의 기수, 또는 치료에 대한 암의 반응성의 확인)를 결정하고, 테라메트릭스(therametrics)(예를 들어, 치료 효과 또는 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 대상체의 상태를 모니터링 하는 것)는 하는 것을 말한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 진단 방법은 특히 초기 암을 탐지하는데 유용하다.
본원에 사용된 "진단제"라는 용어는, 직접 또는 간접적으로 탐지될 수 있고, 진단 목적으로 사용되는 분자를 말한다. 상기 진단제는 대상체 또는 시료에 투여될 수 있다. 상기 진단제는 그 자체로 제공되거나, 또는 비히클, 예컨대 조건부 활성 항체에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 "이펙터 기능"이라는 용어는, 항체의 Fc 영역에 기여할 수 있는 생물학적 활성을 말하는데, 항체 동형체에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 Clq 결합 및 보체 의존성 세포 독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC); 대식 작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된 제제, 예를 들어, 약제학적 제형의 "유효량"이라는 용어는, 투여 시 필요한 시간 동안 유효하여, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 양을 말한다.
본원에 사용된 "Fc 영역"라는 용어는, 불변 영역의 적어도 일부를 함유한 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 부위를 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 자연적인 서열 Fc 영역와 변이체 Fc 영역를 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역는 Cys226 또는 Pro230로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 신장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 본원에서 특정된 바 없는 경우, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호는, 문헌[Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]에 기재된 바와 같은 EU 번호 시스템에 따르며, 이는 또한 EU 지수라고도 부른다.
본원에서 사용되는 용어 "프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(중쇄에서 HVR 또는 H1-3 및 경쇄에서 L1-3) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4으로 이루어진다. 따라서, CDR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 이하의 순서: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4로 나타난다.
"전장 항체", "온전한 항체", 또는 "전체 항체"라는 용어는, 항원-결합 가변 영역 (VH 또는 VL), 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한 항체를 말한다. 상기 불변 도메인은 자연적인 서열의 불변 도메인 (예를 들어, 인간의 자연적인 서열의 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 전장 항체는 이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서 상이한 "부류들"에 배정될 수 있다. 전장 항체는 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있고, 이러한 중 몇몇은 "하위 부류"(동형체), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나눠질 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중-쇄 불변 도메인은, 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린들의 하위 단위 구조 및 3-차원 구조는 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 외인성 핵산이 도입되는 세포 및 이러한 세포의 자손을 포함한 세포를 말한다. 숙주 세포는 1차 형질전환 세포 및 계대수와 상관없이 이로부터 유래한 자손을 포함한 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 기능 또는 생물학적 활성이 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체, 또는 인간 항체의 범주를 이용한 비-인간 공급원에서 유래한 항체에 상응하는 아미노산 서열, 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비-인간 항원 결합 잔기를 포함한 인간화 항체는 배제한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 이루어진다. 일반적으로 서열의 하위군은 문헌[Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3]에서와 같이 하위군이다. 한 구현예에서, VL에 대해, 하위군은 문헌[Kabat 등, supra]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 구현예에서, VH에 대해, 하위군은 문헌[Kabat 등, supra]에서와 같은 하위군 III이다.
본원에 사용된 "인간화" 항체라는 용어는, 비-인간 HVR 유래의 아미노산 잔기와 인간 FR 유래의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)이 비-인간 항체에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 항체에 상응하는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는, 인간화를 거친 항체를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 초가변이고/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 말한다. 일반적으로 천연 4-사슬 항체는 6개의 HVR을 포함하고; VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식에 관여한다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., vol. 196, pp. 901-917 1987) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)는 L1의 24-34번, L2의 50-56번, L3의 89-97번, H1의 31-35B번, H2의 50-65번, H3의 95-102번 아미노산 잔기에서 발생한다(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1991). VH에서 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 약식 CDR 또는 a-CDR이라고 하는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR(a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 31-34번, L2의 50-55번, L3의 89-96번, H1의 31-35B, H2의 50-58번, 및 H3의 95-102번 아미노산 잔기에서 발생한다. (문헌[Almagro and Fransson,　Front. Biosci., vol. 13, pp.1619-1633, 2008]를 참고한다). 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 문헌[Kabat 등, supra]에 따라 본원에서 넘버링된다.
본원에 사용된 "면역접합체"라는 용어는, 세포 독성제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
본원에 사용된 "개체" 또는 "대상체"라는 용어는, 포유류를 말한다. 포유류는 가축 동물 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 개체 또는 대상체는 인간이다.
"부작용"(AE)(불리한 경험이라고도 함)은 약물 사용과 일시적으로 관련된 바람직하지 않고 의도하지 않은 징후(예를 들어, 비정상적인 실험실 소견), 증상 또는 질환을 의미하고, 인과 관계에 대한 판단을 의미하지 않는다. AE는 약물의 임의의 사용(예를 들어, 오프라벨 사용, 다른 약물과의 조합 사용) 및 과다용량을 포함하는 임의의 투여 경로, 제형 또는 용량으로 발생할 수 있다. AE는 다음 결과 중 하나를 초래하는 경우 "심각한" 것으로 간주된다:
● 사망(기저 질환으로 인한 사망 제외)
● 생명을 위협하는 경우
● 입원 환자 입원 또는 기존 입원 기간 연장 필요
● 정상적인 생활 기능을 수행하는 능력의 지속적이거나 상당한 무능력 또는 상당한 장애
● 선천적 기형/선천적 결함
● 중요한 의료 사건 - 사망을 초래하지 않거나, 생명을 위협하거나, 입원이 필요하지 않은 중요한 의료 사건은 적절한 의학적 판단에 따라 환자를 위험에 빠뜨릴 수 있으며 이 정의에 나열된 결과 중 하나를 예방하기 위해 의학적 또는 외과적 개입이 필요할 수 있을 때 심각한 것으로 간주될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "억제하다" 또는 "억제"는 측정 가능한 양만큼 감소시키거나 완전히 방지하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "세포 성장 또는 증식을 저해하는"이라는 용어는, 세포의 성장 또는 증식을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 감소시키는 것을 의미하며, 세포 사멸의 유발도 포함한다.
본원에 사용된 "단리된" 항체라는 용어는, 이의 자연적 환경의 요소로부터 분리된 것을 말한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정할 때, 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법을 검토하기 위해서는, 예를 들어 문헌[Flatman 등, J. Chromatogr. B, vol.　848, pp. 79-87, 2007]를 참고한다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된" 핵산은 자연 환경의 구성요소로부터 둔리된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산은 일반적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 존재한다.
본원에 사용된 "항-Axl 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"이라는 용어는, 항체의 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 말하는데, 여기에는 단일 벡터 또는 별개의 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들), 및 숙주 세포의 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)을 포함한다.
예를 들어 수용체 신호전달 활성에 적용되는 본원에서 사용되는 용어 "리간드-독립"은 리간드의 존재에 의존하지 않는 신호전달 활성을 의미한다. 리간드-독립 키나제 활성을 갖는 수용체는 키나제 활성의 추가적인 활성화를 생성하기 위해 리간드가 그 수용체에 결합하는 것을 반드시 배제하지는 않을 것이다.
본원에 사용된 "전이"라는 용어는 암 세포를 지원하여, 원발 종양로부터 확산되고, 림프관 및/또는 혈관으로 침투하여, 혈류를 통해 순환하며, 신체의 다른 정상 조직의 원위 포커스(distant focus)(전이)에서 자라는 모든 Axl 관여 과정을 말한다. 특히, 이는 전이의 기초가 되고 바람직하게는 Axl 인산화 및/또는 Axl 매개 신호 전달을 포함하는 Axl의 비-촉매 또는 촉매 활성에 의해. 자극되거나 매개되는 증식, 이동, 정착 독립, 세포자멸사의 회피, 또는 혈관신생 인자의 분비와 같은 종양 세포의 세포 이벤트를 의미한다.
본원에 사용된 "미세 환경"이라는 용어는, 조직의 다른 부위 또는 신체의 다른 부위와 항시적 또는 일시적으로 물리적 또는 화학적인 차이가 나는 조직, 기관 또는 신체의 어느 부분 또는 부위를 의미한다. 종양에서, 본원에서 사용된 "종양 미세 환경"이란 용어는, 종양이 존재하는 환경으로서, 종양 내의 비-세포 영역 및 종양성 조직 바로 밖에 있지만 암 세포 자체의 세포내 구획과는 관계없는 영역이다. 종양과 종양 미세 환경은 밀접하게 관련되며, 끊임없이 상호 작용한다. 종양은 이의 미세 환경을 변화시킬 수 있고, 미세 환경은 종양이 어떻게 성장하고 전파되는 지에 영향을 줄 수 있다. 전형적으로, 종양 미세환경은 5.8 내지 7.0 범위, 보다 일반적으로 6.2 내지 6.8 범위, 가장 일반적으로 6.4 내지 6.8 범위의 낮은 pH를 갖는다. 반면 정상적인 생리적 pH는 일반적으로 7.2 내지 7.8 범위이다. 종양 미세 환경은 또한 혈장에 비해 더 낮은 농도의 글루코스 및 다른 영양분을 갖지만, 더 높은 농도의 락트산을 갖는다고도 알려져 있다. 또한, 종양 미세 환경은 정상적인 생리적 온도보다 0.3 내지 1℃ 더 높은 온도를 가질 수 있다. 종양 미세 환경은 문헌[Gillies 외, "MRI of the Tumor Microenvironment," Journal of Magnetic Resonance Imaging, vol. 16, pp.430-450, 2002]에 논의되어 있다. "비-종양 미세 환경"이란 용어는, 종양이 아닌 부위의 미세 환경을 말한다.
본원에 사용된 "단클론성 항체"라는 용어는, 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 말하며, 즉, 예를 들어, 자연 발생적인 돌연변이를 함유하거나 단클론성 항체 제제를 생산하는 동안 발생하는 가능한 변이체 항체로서 일반적으로 소량으로 존재하는 변이체 항체를 제외하고는, 서로 동일하고/거나 동일 에피토프에 결합하는 집단을 포함한 개별 항체를 말한다. 전형적으로 상이한 결정기들 (에피토프)에 대한 상이한 항체들을 포함하는 다중클론 항체 제제와 반대로, 단클론성 항체 제제 내의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 따라서, "단일 클론"이라는 수식어는 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요하지 않은 것으로 해석된다. 예를 들어, 본 발명에 의해 사용된 단일 클론 항체는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있는데, 여기에는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이(phage-display) 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 함유한 형질전환 동물을 이용하는 방법, 본원에 기재되어 있는 단일 클론 항체를 제조하기 위한 이러한 방법의 다른 예시적인 제조 방법이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "네이키드 항체"라는 용어는, 이종 모이어티 (예를 들어, 세포 독성 모이어티) 또는 방사선 표지에 접합되지 않은 항체를 말한다. 상기 네이키드 항체도 약제학적 제형 내에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 의미한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 약 150,000달톤의 이종사량체 당단백질이며, 디설파이드 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된다. N-말단에서 C-말단까지, 각 중쇄에는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 하는 가변 영역(VH)이 있으며, 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)이 있다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄에는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 하는 가변 영역(VL)이 있으며, 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인이 있다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파(κ)와 람다(λ)라는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
본원에 사용된 "패키지 삽입물"이라는 용어는, 치료 제품의 상업용 패키지에 관례상 포함된 설명서를 지칭하는데 사용되는데, 여기에는 징후, 사용량, 투여량, 투여, 병용 치료제, 사용금지 사유에 대한 정보 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고가 포함된다.
폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는, 본원에서 사용될 때, 필요하다면 서열을 정렬하고 갭을 도입하여 최대 서열 동일성의 퍼센트를 얻고, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않은 후에 나타난, 참고 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성의 퍼센트를 결정하려는 목적으로 행하는 정렬은, 당업계의 숙련자의 상식 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업계의 숙련자들은 서열을 정렬하기 위한 적절한 변수를 결정할 수 있으며, 여기에는 비교되는 서열의 전장에서 최대 정렬을 얻는데 필요한 임의의 알고리즘이 포함된다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 값 %는 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 권한이 있으며, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 워싱턴 D.C. 20559 소재의 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office)에 제출되었고, 미국 저작권 등록 TXU510087로 등록받았다. 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 Genentech, Inc.의 ALIGN-2 프로그램은 공공연하게 사용가능하며, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함한 UNIX 운영 시스템에서 사용하기 위해서는 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며, 바뀌지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN-2를 이용하는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 A의 소정의 아미노산 서열 B에 대한 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 %을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A라는 어구로 나타낼 수도 있음)은 이하와 같이 계산되는데:　
100 * (X/Y)
상기 수식에서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A와 B의 프로그램 정렬에서 매치된다고 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것이라고 인식될 것이다. 특별히 달리 기술된 바 없는 경우, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 %은 바로 앞 단락에서 설명한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 얻었다.
본원에서 사용된 "약제학적 제형"라는 용어는, 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태의 제제를 말하는데, 이는 제형이 투여될 대상체에서 용납될 수 없을 정도의 독성 추가 성분은 함유하지 않는다.
본원에서 사용된 "약제학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는, 약제학적 제형 내의 활성 성분이 아닌 성분을 말하는데, 대상체에 대해 독성이 없다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "정제된" 및 "단리된"이라는 용어는, 표시된 분자는 동일한 유형의 다른 생물학적 거대 분자가 실질적으로 없는 상태에서 존재하는 본 발명에 의한 항체 또는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 본원에서 사용된 "정제된"이라는 용어는, 바람직하게는 동일한 유형의 생물학적 거대 분자의 적어도 75 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 85 중량%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95 중량%, 가장 바람직하게는 적어도 98 중량%가 존재한다는 것을 의미한다. 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 "단리된" 핵산 분자는, 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 다른 핵산 분자를 실질적으로 포함하지 않는 핵산 분자를 말하나; 상기 분자는 조성물의 기본 특성에 해로운 영향을 주지 않는 일부 추가 염기 또는 모이어티를 포함할 수는 있다.
본원에서 사용된 "재조합 항체"라는 용어는, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함한 재조합 숙주 세포에 의해 발현된 항체(예를 들어, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 말한다. 본원에서 사용된 "재조합 항체"라는 용어는, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함한 재조합 숙주 세포에 의해 발현된 항체(예를 들어, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 말한다. 재조합 항체를 생산하기 위한 "숙주 세포의 예는: (1) 포유류 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO), COS, 골수종 세포 (Y0 및 NS0 세포 포함), 햄스터 새끼 신장 (BHK), Hela 및 Vero 세포; (2) 곤충 세포, 예를 들어, sf9, sf21 및 Tn5; (3) 식물 세포, 예를 들어 담배(Nicotiana) 속에 속하는 식물(예를 들어, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)); (4) 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속(예를 들어, 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae)) 또는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속(예를 들어, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger))에 속하는 것들; 및 (5) 박테리아 세포, 예를 들어 대장균(Escherichia, coli) 세포 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 "치료 유효량"이라는 용어는, 임의의 의학적 치료에 적용가능한, 합리적인 수익/위험의 비로 상기 암을 치료하기에 충분한 항체 또는 항체 단편의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 항체 또는 항체 단편 및 조성물의 총 일일 사용량은 건전한 의료 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료 유효 용량의 수준은, 치료되는 장애 및 상기 장애의 심각성; 이용된 특정 항체 또는 항체 단편의 활성; 이용된 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 식사; 이용된 특정 항체 또는 항체 단편의 투여 시간, 투여 경로 및 분비 속도; 치료 지속 기간; 이용된 특정 항체와 조합하거나 동시에 사용되는 약물; 및 의료계에 잘 알려진 기타 요인을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 당업계의 숙련자는 원하는 치료 효과를 얻는데 필요한 용량보다 낮은 수준에서 화합물의 용량을 시작하여, 원하는 효과를 얻을 때까지 투여량을 점차 늘려나간다는 사실을 잘 알고 있다.
본원에서 사용된 "단일 사슬 Fv" ("scFv")라는 용어는, 공유 연결된 VH::VL　이종 이량체를 말하는데, 이는 통상 VH 및 VL 인코딩 유전자들이 펩티드-인코딩 링커에 의해 연결된 유전자 융합체로부터 발현된다. "dsFv"는 디설파이드 결합에 의해 안정화된 VH::VL 이종 이량체이다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv들의 연결에 의해 자발적으로 형성될 수 있거나, 또는 펩티드 링커, 예컨대 2가 sc(Fv)2에 의해 1가 scFv들을 결합시켜 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"이라는 용어는, 치료되는 개체의 자연적인 경과를 변화시키려는 시도에서 행하여지는 임상적 개재를 말하며, 예방 목적으로 또는 임상적 병리 증상의 경과 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하고, 증상을 경감시키고, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리 결과를 감소시키고, 전이를 방지하고, 질환의 전파 속도를 감소시키고, 질환 상태를 향상 또는 완화시키고, 징후에 차도를 보이거나 이를 개선시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 질환의 발달을 지연시키거나, 질환의 진행을 늦추는데 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 종양 증식의 발생 또는 재발을 예방하고, 종양 진행 또는 퇴행과 관련된 증상을 완화하고, 암과 관련된 임의의 직간접적인 병리학적 결과를 감소시키고, 종양 전이를 예방하고, 종양 퇴행을 강화하고, 종양 진행을 감소시키거나 억제하고, 관해 또는 개선된 예후를 유도하기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 "종양"이라는 용어는, 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장과 증식과, 모든 전-암성 및 암성 세포와 조직을 말한다. "암", "암성", "세포 증식 장애" "증식 장애" 및 "종양"이라는 용어는, 본원에서 언급될 때 상호 배타적이지 않다.
본원에서 사용된 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는, 항원에 대한 항체의 결합과 관련된 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각, VH　및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 부위 (FR)와 3개의 초가변 영역 (HVR)를 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt 외, Kuby Immunology, 6판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참고). 단일 VH 또는 VL 도메인으로도 충분히 항원 결합 특이성을 부여할 수 있다. 또한, 항원에 결합하는 항체에서 유래한 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 그 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 단리하여, 상보적인 VH 또는 VL 도메인의 라이브러리를 각각 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano 외, J. Immunol., vol. 150, pp. 880-887, 1993]; 문헌[Clarkson 외, Nature, vol. 352, pp. 624-628, 1991]를 참고한다.
본원에서 사용된 "벡터"라는 용어는, 이에 연결된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제하는 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작용가능하게 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 본원에서, 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 한다.
상세한 설명
예시를 위해, 본 발명의 원리는 다양한 예시적인 구현예를 참조하여 설명된다. 본 발명의 특정 구현예가 본 명세서에 구체적으로 설명되어 있지만, 당업자는 동일한 원리가 다른 시스템 및 방법에 동일하게 적용 가능하고 채용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 본 발명의 개시된 구현예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 도시된 임의의 특정 구현예의 세부 사항에 대한 적용에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용한 전문용어는 설명을 위해 사용된 것으로 한정적이지 않다. 또한, 특정 방법이 특정 순서로 본 명세서에 제시된 단계를 참조하여 설명되지만, 많은 경우에, 이들 단계는 당업자에 의해 이해될 수 있는 임의의 순서로 수행될 수 있고; 따라서 신규 방법은 본 명세서에 개시된 단계의 특정 배열에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함함에 유의해야 한다. 또한, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "갖는" 및 "~로부터 구성되는"이라는 용어는 또한 상호교환적으로 사용될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용된 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 퍼센트, 비, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수는, 용어 "약"이 존재하든지 존재하지 않든지 간에, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 개시내용에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 청구 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효숫자의 관점에서 그리고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 개시의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 구현예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 각각의 테스트 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오차를 포함한다.
본 명세서에 개시된 각각의 성분, 화합물, 치환체 또는 파라미터는 단독으로 또는 본원에 개시된 각각의 다른 모든 성분, 화합물, 치환체 또는 파라미터 중 하나 이상과 조합하여 사용하기 위해 개시된 것으로 해석되어야 함을 이해해야 한다.
또한, 본원에 개시된 각각의 성분, 화합물, 치환기 또는 파라미터에 대한 각각의 양/값 또는 양/값의 범위는 본원에 개시된 임의의 다른 성분(들), 화합물(들), 치환기(들) 또는 매개변수(들)에 대해 개시된 각각의 양/수치 또는 양/값의 범위의 조합과 함께 개시된 것으로 해석되어야 하며, 따라서 본원에 개시된 2개 이상의 성분(들), 화합물(들), 치환기(들) 또는 파라미터를 위한 양/값 또는 양/값의 범위의 임의의 조합은 본 설명의 목적을 위해 서로 조합되어 개시되는 것으로 이해된다.
본원에 개시된 각각의 범위의 각각의 하한은 동일한 성분, 화합물, 치환체 또는 파라미터에 대해 본원에 개시된 각각의 범위의 각각의 상한과 조합하여 개시된 것으로 해석되어야 한다는 것이 추가로 이해된다. 따라서 2개 범위의 개시는 각 범위의 하한과 각 범위의 상한을 합하여 4개의 범위를 개시하는 것으로 해석되어야 한다. 3개 범위의 개시는 각 범위의 하한과 각 범위의 상한을 합하여 5개의 범위를 개시하는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 상세한 설명 또는 실시예에 개시된 성분, 화합물, 치환기 또는 파라미터의 특정 양/값은 범위의 하한 또는 상한의 개시내용으로서 해석되어야 하며, 따라서 본원의 다른 곳에서 개시된 동일한 성분, 화합물의 치환기 또는 파라미터에 대한 범위 또는 특정 양/값의 임의의 다른 하한 또는 상한과 조합되어 그 성분, 화합물을 위한 치환기 또는 파라미터를 위한 범위를 형성할 수 있다.
항-Axl 항체 또는 항체 단편의 영역
한 양태에서, 본 발명은 Axl 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 폴리펩티드, 및 치료를 필요로 하는 인간에게 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 Axl 발현 종양의 치료 방법에서의 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 6개의 상보성 결정 영역 H1, H2, H3, L1, L2 및 L3을 포함하며, 여기에서:
H1 서열은 X1GX2X3MX4(서열번호: 1) (X1, X2, X3 및 X4는 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X1은 T 또는 A 또는 W이고,
X2는 H 또는 A이고,
X3은 T 또는 I이고, 그리고
X4는 N 또는 I이고;
H2 서열은 LIKX5SNGGTX6YNQKFKG(서열번호: 2) (X5 및 X6은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X5는 P 또는 N이고,
X6은 S 또는 I 또는 T이고; 그리고
H3 서열은 GX7X8X9X10X11X12X13X14DYX15X16(서열번호: 3) (X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, 및 X16은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X7은 H 또는 D 또는 E 또는 P 또는 R 또는 W이고,
X8은 Y 또는 N이고,
X9는 E 또는 A 또는 D 또는 F 또는 G 또는 H 또는 I 또는 L 또는 M 또는 N 또는 R 또는 V 또는 Y이고,
X10은 S 또는 D 또는 M 또는 N 또는 Q이고,
X11은 Y 또는 C 또는 E 또는 P이고,
X12는 F 또는 E 또는 N 또는 S 또는 T 또는 V이고,
X13은 A 또는 D 또는 G 또는 L 또는 Y이고,
X14는 M 또는 E 또는 F이고,
X15는 W 또는 A 또는 D 또는 H 또는 L 또는 N 또는 P 또는 R 또는 T이고, 그리고
X16은 G 또는 H이고,
L1 서열은 KASQDX17X18SX19VX20(서열번호: 4) (X17, X18, X19, 및 X20은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X17은 V 또는 D 또는 G 또는 N 또는 W이고,
X18은 S 또는 V이고,
X19는 A 또는 L 또는 M이고, 그리고
X20은 A 또는 D 또는 N 또는 Q이고;
L2 서열은 is X21X22X23TRX24T(서열번호: 5) (X21, X22, X23, 및 X24는 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X21은 W 또는 F이고,
X22는 A 또는 I 또는 N 또는 P 또는 Q이고,
X23은 S 또는 D이고,
X24는 H 또는 D이고; 그리고
L3 서열은 QEX25X26SX27X28X29X30(서열번호: 6)X25, X26, X27, X28, X29, and X30은 각각 독립적으로 아미노산을 나타냄)이고: 여기서
X25는 H 또는 C 또는 F 또는 I 또는 L 또는 Q 또는 S 또는 T 또는 V 또는 Y이고,
X26은 F 또는 C 또는 D 또는 E 또는 G 또는 N 또는 S이고,
X27은 T 또는 C 또는 P이고,
X28은 P 또는 A 또는 C 또는 D 또는 E 또는 H 또는 K 또는 S 또는 T 또는 V 또는 W이고,
X29는 L 또는 G 또는 R이고, 그리고
X30은 T 또는 I 또는 R이고,
본 발명의 폴리펩티드는 하기 6개의 CDR을 갖는 모 폴리펩티드를 배제한다:
H1 = TGHTMN,
H2 = LIKPSNGGTSYNQKFKG,
H3 = GHYESYFAMDYWG,
L1 = KASQDVSSAVA,
L2 = WASTRHT, 및
L3 = QEHFSTPLT.
또 다른 양태에서, 본 발명은 모 폴리펩티드에 비해 CDR H1, H2 및 H3에서 최대 1개의 치환 및 모 폴리펩티드에 비해 CDR L1, L2 및 Le에서 최대 1개의 치환을 갖는 상기 기재된 바와 같은 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 여기에는 모 폴리펩티드에 비해 CDR H1, H2 및 H3에 1개의 치환을 갖는 단리된 폴리펩티드, 모 폴리펩티드에 비해 CDR L1, L2 및 L3에 1개의 치환을 갖는 단리된 폴리펩티드, 및
모 폴리펩티드에 비해 CDR H1, H2 및 H3에서 1개의 치환 및 모 폴리펩티드에 비해 CDR L1, L2 및 L3에서 1개의의 치환을 갖는 단리된 폴리펩티드를 포함한다. CDR H1, H2 및 H3의 가능한 조합은 도 1a에 도시되어 있고, CDR L1, L2 및 L3의 가능한 조합은 도 1b에 도시되어 있다.
중쇄 가변 영역의 정렬은 도 1a에 나타나 있으며, 여기서 상보성 결정 영역 H1, H2 및 H3은 박스로 표시되어 있다.
경쇄 가변 영역의 정렬은 도 1b에 나타나 있으며, 여기서 상보성 결정 영역 L1, L2 및 L3은 박스로 표시되어 있다.
본 발명은 미국 특허 제8,709,755호에 개시된 방법을 사용하여 모 항체로부터 이들 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩타이드 및 단리된 경쇄 가변 영역 폴리펩타이드를 확인하였다. 모 항체(063-hum10F10)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 또한 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 및 단리된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드에서의 돌연변이를 나타내기 위해 도 1a 및 도 1b에서 정렬된다.
야생형 항체를 인코딩하는 DNA는 포괄적 위치상 진화 (CPE)를 사용하여 돌연변이 항체 라이브러리를 생성하도록 진화되었으며, 주형 항체의 각 위치는 한 번에 하나씩 무작위화된다. 라이브러리의 각 돌연변이 항체에는 단일 점 돌연변이가 하나만 있다. ELISA에 의해 pH 7.4보다 pH 6.0에서 Axl에 대한 선택적 결합 친화도를 동시에 스크리닝하여 라이브러리의 돌연변이 항체를 생성하였다. 2개의 돌연변이 항체 희석액이 사용되었다: 1:3 및 1:9 희석액. 1:3 또는 1:9 희석 하에서 pH 6.0 내지 pH 7.4에서 적어도 1.5 비율의 결합 친화도를 갖는 돌연변이 항체는 조건부 활성 항체로서 선택되며, 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 단일 점 돌연변이가 표시된다 (표 1 및 2).
Figure pct00002
Figure pct00003
또 다른 측면에서, 본 발명은 도 1a에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 및 도 1b에나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 확인하였다. 일부 중쇄 가변 영역은 서열번호: 11-13의 DNA 서열에 의해 인코딩된다. 일부 경쇄 가변 영역은 서열번호: 7-10의 DNA 서열에 의해 인코딩된다. 이러한 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 Axl에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역 중 하나를 포함하는 항체는 비-종양 미세환경에서의 pH보다 종양 미세환경에서 발견되는 pH에서 Axl에 더 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 또한 도 1a 도 1b에 제시되고 Axl에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호: 9-13의 DNA 서열에 의해 인코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 변이체를 포함한다. 이들 변이체를 유도하기 위해서는 중쇄 가변 영역(H1-H3)의 상보성 결정 영역(CDR)과 경쇄 가변 영역(L1-L3)의 CDR이 온전하게 유지되어야 한다고 판단하였다.
이들 변이체를 유도함에 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 공정에 의해 안내된다. 이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 변이체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형은 예를 들어 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실(들), 삽입(들) 및 치환(들)의 임의의 조합은 최종 작제물이 예를 들어 항원 결합과 같은 원하는 특성 중 적어도 하나를 보유한다면 최종 작제물에 도달하도록 만들어질 수 있다.
치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 또는 항체 단편 변이체가 제공된다. 관심있는 치환 돌연변이유발 부위는 CDR 및 프레임워크 부위 (FR)를 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 제목 하에 표 3에 나타나 있다. 더욱 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 제목 하에 표 3에 제공되어 있으며, 아미노산 측쇄 부류에 대해서는 이하에 추가로 설명되어 있다. 아미노산 치환은 관심있는 항체 또는 항체 단편, 및 원하는 활성, 예를 들어, 항원 결합의 유지/개선, 또는 면역원성의 감소를 위해 스크리닝된 생성물로 도입될 수 있다.
표 3: 아미노산 치환
Figure pct00004
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 나뉠 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 멤버를 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가면 영역 잔기를 치환하는 것과 관련된다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선별된 생성된 변이체(들)은 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)이 변할 것이고/거나(예를 들어, 개선되었을 것이고/거나), 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 예를 들어, 파지 디스플레이-기반의 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에 기재된 것들을 사용하여 편리하게 생성할 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지에 표시되고 특정 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
CDR에 변화 (예를 들어, 치환)가 일어나서, 예를 들어, 항체 친화성이 개선될 수 있다. 이러한 변화는 CDR "핫스폿", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 거치는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol., vol. 207, pp. 179-196, 2008] 참고), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 일어날 수 있는데, 이렇게 생성된 변이체 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 이차 라이브러리를 제작하고 이로부터 재선택하여 얻은 친화성 성숙에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Hoogenboom 외 in Methods in Molecular Biology, vol. 178, pp. 1-37, 2001])에 기재되어 있다. 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다중성(diversity)은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류 가능성이 있는(error-prone) PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정-돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선별된 가변 유전자에 도입된다. 이차 라이브러리는 이후 생성된다. 이후 상기 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다중성을 도입하는 다른 방법은 CDR-지정 접근법과 관련되는데, 여기에서는 몇몇 CDR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6 개의 잔기)가 무작위 배열된다. 특히, 항원 결합에 관련된 CDR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발(alanine scanning mutagenesis) 또는 모델링을 사용하여 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 자주 표적화된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변화로 인해 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 이상, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 결합 친화성을 감소시키지 않는 보존적 변화 (예를 들어, 본원에 제공된 보존적 치환)이, CDR에서 생성될 수도 있다. 이러한 변화는 CDR "핫스폿" 또는 SDR의 외부에 있을 수도 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL　서열의 특정 구현예에서, 각각의 CDR은 변화되지 않을 수도 있지만, 1개 이하, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 함유할 수도 있다.
돌연변이유발의 표적일 수 있는 항체의 잔기 또는 부위를 식별하는 유용한 방법은, 문헌[Cunningham and Wells, Science, vol. 244, pp. 1081-1085, 1989]에 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서는, 표적 잔기 (예를 들어, 전하성 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu) 또는 표적 잔기의 작용기를 식별하고, 이를 중성 또는 음전하성 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여, 항체 또는 항체 단편과 항원의 상호 작용이 영향을 받는 지를 결정한다. 또한, 치환은 초기의 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체 또는 항체 단편과 항원 사이의 접촉점을 식별한다. 접촉하는 이러한 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를 스크리닝하여, 이들이 원하는 특성을 함유하는 지를 결정할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 내지 100개 이상의 길이 범위의 잔기를 함유한 폴리펩티드에 대한 아미노-및/또는 카르복실-말단 융합체, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입체를 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체의 다른 삽입 변이체는, 항체의 N-또는 C-말단을 (예를 들어, ADEPT를 위한) 효소, 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 융합시킨 것을 포함한다.
본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 단순히 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 비-인간 동물 유래의 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 이식하여 인간화 항체가 생성될 때, 항원 결합 활성은 비-인간 동물 유래의 원래 항체에 비해 감소한다고 알려져 있다. CDR뿐만 아니라 FR에서의 비-인간 항체의 VH　및 VL의 몇몇 아미노산 잔기도, 항원 결합 활성과 직접 또는 간접적으로 관련되는 것으로 간주된다. 이런 이유로, 이 아미노산 잔기가 인간 항체의 VH 및 VL의 FR로부터 유래한 상이한 아미노산 잔기로 치환되면, 결합 활성이 감소할 것이다. 상기 문제를 해결하기 위하여, 인간 CDR가 이식된 항체에서, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열들 중에서, 항체에 대한 결합과 직접 관련되거나, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하거나, 항체의 3-차원 구조를 유지하며, 항원에 대한 결합과 직접 관련된 아미노산 잔기를 식별하기 위한 시도가 있었다. 감소된 항원 결합 활성은 식별된 아미노산을 비-인간 동물로부터 유래한 원래 항체의 아미노산 잔기로 대체함으로써 증가될 수 있다.
본 발명의 항체의 구조 내에서 그리고 이들을 인코딩하는 DNA 서열에서 변형 및 변화가 일어날 수 있지만, 여전히 바람직한 특징을 갖는 항체를 인코딩하는 기능성 분자를 얻는다.
아미노 서열에서 변화가 일어날 때, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 일반적으로 당업계에서는 단백질에 상호 생물학적 기능을 부여할 때 아미노산 수치 지수의 중요성을 이해하고 있다. 아미노산의 상대적인 수치 특성은 생성된 단백질의 이차 구조에 기여하여, 결국 상기 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등의 상호 작용을 정의한다고 인정된다. 각 아미노산에 대해 소수성 및 전하 특징에 기초하여 수치 지수를 할당하는데, 이들은: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스테인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5)이다.
본 발명의 추가 목적은 또한 본 발명의 항체의 기능-보존적 변이체를 포괄한다.
본원에 사용된 "기능-보존적 변이체"라는 용어는, 폴리펩티드의 전체 구성과 기능을 변화시키지 않고 단백질 또는 효소 내의 소정의 아미노산 잔기가 변화된 것을 말하는데, 여기에는 하나의 아미노산이 유사한 특성 (예를 들어, 극성, 수소 결합 가능성, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등)을 갖는 아미노산으로 대체된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단백질에서 보존된 것이라고 표시된 것들이 아닌 아미노산은 달라질 수 있어서, 유사한 기능의 임의의 2개의 단백질 간에 단백질 또는 아미노산 서열의 유사성 퍼센트는 달라질 수 있고, 예컨대 Cluster Methods에 의한 정렬 계획에 따라 결정할 때 70% 내지 99%일 수 있으며, 여기에서 유사성은 MEGALIGN 알고리즘을 기반으로 한다. "기능-보존적 변이체"는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 결정할 때 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 동일성을 갖고, 비교 대상인 자연적인 단백질 또는 모 단백질과 동일하거나 실질적으로 유사한 특성 또는 기능을 갖는 폴리펩티드도 포함한다.
2개의 아미노산 서열은 아미노산의 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 바람직하게는 90% 초과가 동일할 때 "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하며, 또는 약 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과는 더 짧은 서열의 전장에 걸쳐 유사(기능적으로 동일)하다. 바람직하게는, 유사하거나 상동적인 서열은 예를 들어, GCG (Genetics Computer Group, GCG 패키지를 위한 프로그램 매뉴얼, 버전 7, 위스콘신주 메디슨 소재) 파일업 프로그램, 또는 임의의 서열 비교 알고리즘, 예컨대 BLAST, FASTA 등을 사용하여 정렬하고, 식별한다.
예를 들어, 단백질 구조에서 특정 아미노산은 뚜렷한 활성 손실 없이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 단백질의 상호 작용 능력 및 특성은 그 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하기 때문에, 특정 아미노산의 치환이 단백질 서열은 물론 이의 DNA 인코딩 서열에도 일어날 수 있으나, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 얻을 수 있다. 따라서, 생물학적 활성의 뚜렷한 손실 없이도 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 서열, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 상응하는 DNA 서열에 다양한 변화가 이루어질 수 있다고 고려된다.
당업계에는 특정 아미노산이 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환되었지만, 여전히 생물학적 활성이 유사한 단백질을 생성할 수 있다, 즉 여전히 생물학적 기능이 동등한 단백질을 얻을 수 있다고 알려져 있다.
상기 개략된 바와 같이, 따라서 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들어, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 다양한 상기 특징들을 고려한 예시적인 치환이 당업계의 숙련자들에게 잘 알려져 있는데, 이하를 포함한다: 아르기닌과 리신; 글루타메이트와 아스파르테이트; 세린과 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.
당화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 당화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변형시켜, 항체에 대한 당화 부위를 부가 또는 결실시키는 것이 편리할 수 있다.
항체가 Fc 영역를 포함하는 경우, 여기에 부착된 탄수화물은 변할 수 있다. 포유류 세포가 생산한 천연 항체는 전형적으로 분지형의 2개로 분지된(biantennary) 올리고당을 포함하는데, 이는 일반적으로 N-연결기에 의해 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 부착된다. 예를 들어, 문헌[Wright 외, TIBTECH, vol. 15, pp. 26-32, 1997]를 참고한다.　 상기 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 살리실산, 뿐만 아니라 2개로 분지된 올리고당 구조의 "스템"의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서는, 본 발명의 항체에서 올리고당이 변형되면, 특정한 특성이 개선된 항체 변이체를 생성할 수 있다.
일 구현예에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체 내 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당 구조 (예를 들어, 복합체, 혼성체 및 고 만노스 구조)의 합에 대비된, 당 사슬 내 Asn297의 푸코스의 평균량을 계산하여 결정한다. Asn297는 Fc 영역의 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 번호)에 위치한 아스파라긴 잔기를 말하나; Asn297은 또한 항체 내 경미한 서열 변화 때문에 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ±3 개의 아미노산, 즉, 위치 294 내지 300에 위치할 수도 있다. 이러한 푸코스화 변이체는 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참고한다. "탈푸코스화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 간행물의 예는: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki 외, J. Mol. Biol., vol. 336, pp. 1239-1249, 2004]; 문헌[Yamane-Ohnuki 외, Biotech. Bioeng., vol. 87, pp. 614-622, 2004]를 포함한다. 　 　 탈푸코스화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는, 단백질 푸코스화가 결핍된 Lec 13 CHO 세포 (문헌[Ripka 외, Arch. Biochem. Biophys., vol. 249, pp. 533-545, 1986]; 미국 특허 출원 US 2003/0157108 A; 및 WO 2004/056312 A1, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki 외, Biotech. Bioeng., vol. 87, pp. 614-622, 2004]; 문헌[Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., vol. 94, pp. 680-688, 2006]; 및 WO2003/085107 참고)를 포함한다.　 　
올리고당이 이등분된 항체 변이체, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 2개로 분기된 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분되는 항체 변이체도 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 푸코스화가 감소되고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어, WO 2003/011878; 미국 특허 제6,602,684호; 및 US 2005/0123546에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에 적어도 하나의 갈락토스 잔기가 있는 항체 변이체도 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있다.
Fc 영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함한 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 이펙터 기능의 일부 갖지만 전부 다 갖지는 않아서, 항체의 생체 내 반감기가 중요하나 여전히 특정 이펙터 기능 (예컨대, ADCC)은 불필요하거나 해로운 응용에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포 독성 검정을 수행하여, CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여, 항체가 FcyR 결합이 없고 (이런 이유로 ADCC 활성이 없을 가능성이 높지만), FcRn 결합 능력은 보유하도록 보장할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcyRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcyRI, FcyRII 및 FcyRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., vol. 9, pp. 457-492, 1991]의 464쪽 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관 내 검정의 비-제한적인 예는, 미국 특허 제5,500,362호 (또한, 예를 들어 문헌[Hellstrom 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol. 83, pp. 7059-7063, 1986]도 참고한다) 및 문헌[Hellstrom, I 외, Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol. 82, pp. 1499-1502, 1985]; 미국 특허 제5,821,337호 (또한, 문헌[Bruggemann 외, J. Exp. Med., vol. 166, pp. 1351-1361, 1987]도 참고한다)에 기재되어 있다. 　 대안적으로, 비-방사능 검정 방법을 이용할 수도 있다 (예를 들어, 유세포 분석용 ACTITM 비-방사능 세포 독성 검정 (CellTechnology, Inc. 캘리포니아주 마운틴뷰 소재; 및 CytoTox 96® 비-방사능 세포 독성 검정 (Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)을 참고한다). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는, 모세혈 단핵구 (PBMC) 및 자연 살해자 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol. 95, pp. 652-656, 1998]에 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, Clq 결합 검정을 실시하여, 항체가 Clq에 결합할 수 없고 이러한 이유로 CDC 활성이 없다는 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에 나와 았는 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참고한다. 보체 활성화를 평가하기 위해서는, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro 외, J. Immunol. Methods, vol. 202, pp.163-171, 1996]; 문헌[Cragg, M. S. 외, Blood, vol. 101, pp. 1045-1052, 2003] 참고); 및 문헌[Cragg, M. S, and M. J. Glennie, Blood, vol. 103, pp. 2738-2743, 2004] 참고). FcRn 결합 및 생체 내 청소율/반감기 결정도 또한 당업계에 알려진 방법 (예를 들어, 문헌[Petkova, S. B. 외, Int'l. Immunol., vol. 18, pp. 1759-1769, 2006] 참고)을 사용하여 수행할 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체는, Fc 영역의 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상이 치환된 것들을 포함한다 (미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상이 치환된 Fc 돌연변이를 포함하는데, 여기에는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이가 포함된다 (미국 특허 제7,332,581호).
FcR에 대한 결합이 개선되거나 줄어든 특정 항체 변이체는, 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields 외, J. Biol. Chem., vol. 9, pp. 6591-6604, 2001] 참고).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 하나 이상의 아미노산이 치환된 Fc 영역, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 번회)에서의 치환을 포함하는데, 이는 ADCC를 개선시킨다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, WO 99/51642, 및 문헌[Idusogie 외, J. Immunol., vol. 164, pp. 4178-4184, 2000]에 기재된 바와 같이, Fc 영역에서 Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포 독성 (CDC)을 바꾸는 (즉, 개선시키거나 감소시키는) 변화가 일어난다. 　
반감기가 증가하고 모체 IgG를 태아로 전달하는 역할을 하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체(Guyer 등, J. Immunol., vol. 117, pp. 587-593, 1976 및 Kim 등, J. Immunol., vol. 24, p. 249, 1994), US2005/0014934에 기재되어 있다. 이러한 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역의 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상이 치환된 것, 예를 들어, Fc 영역의 잔기 434가 치환된 것 (미국 특허 제7,371,826호)을 포함한다. 또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는, 문헌[Duncan & Winter, Nature, vol. 322, pp. 738-740, 1988]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351도 참고한다.
시스테인 조작 항체 변이체
특정 구현예에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "thioMAb"을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하여, 반응성 티올 기를 사용하여 본원에서 추가로 설명한 바와 같이 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여, 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 이하의 잔기들 중 어느 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 번호); 중쇄의 모든 A118(EU 번호); 및 중쇄 Fc 영역의 5400 (EU 번호). 시스테인 조작된 항체는 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 항체 단편은 당업계에 알려져 있으며 용이하게 이용가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 유도체화에 적합한 모이어티는, 수용성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예는, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공-중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 수중 안정성이 있기 때문에 제조 시 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체 또는 항체 단편에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있는데, 하나 초과의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 중합체의 수 및/또는 종류는, 상기 유도체가 지정된 조건의 치료 등에 사용될 것인지와는 무관하게, 항체 또는 항체 단편의 특정한 특성 또는 기능을 개선시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려 사항에 기초하여 결정될 수 있다.
다른 구현예에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 또는 항체 단편과 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일 구현예에서, 상기 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌[Kam 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 102, pp. 11600-11605, 2005]). 조사는 임의의 파장에 의할 수 있으며, 정상적인 세포에는 해롭지 않으나 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티 근처의 세포가 사멸되는 온도로 가열시키는 파장을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 또는 단리된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 단리된 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는 각각 서열번호: 1-3을 갖는 H1, H2 및 H3 영역을 포함한다. 단리된 경쇄 가변 영역 폴리펩티드는 각각 서열번호: 4-6을 갖는 L1, L2 및 L3 영역을 포함한다.
본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 비-종양 미세환경 조건 하에서보다 종양 미세환경 조건 하에서 Axl에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 한 구현예에서, 종양 미세환경에서의 조건 및 비-종양 미세환경에서의 조건은 모두 pH이다. 따라서 본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 약 6.8의 pH 에서 Axl에 선택적으로 결합할 수 있지만 정상적인 생리학적 환경에서 접하게 되는 pH 7.2-7.8에서 Axl에 대한 더 낮은 결합 친화도를 가질 것이다. 실시예 3-4에 나타낸 바와 같이, 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 더 높은 결합 친화성을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 약 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예를 들어 10-8M 이하, 또는 10-8M 내지 10-13M, 또는 10-9M 내지 10-13 M)의 종양 미세환경에서의 조건 하에 CD46에 대한 해리 상수(Kd)를 갖는다. 한 구현예에서, 비-종양 미세환경에서 동일한 조건의 상이한 값에서의 Kd에 대한 종양 미세환경에서의 조건에서의 Axl에 대한 항체 또는 항체 단편의 Kd의 비는 적어도 약 1.5:1, 적어도 약 2:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 4:1, 적어도 약 5:1, 적어도 약 6:1, 적어도 약 7:1, 적어도 약 8:1, 적어도 약 9:1, 적어도 약 10:1, 적어도 약 20:1, 적어도 약 30:1, 적어도 약 50:1, 적어도 약 70:1, 또는 적어도 약 100:1이다.
일 구현예에서, Kd는 관심 항체 및 이의 항원의 Fab 버전에 대해, 이하의 검정을 사용하는 방사능 표지된 항원 결합 검정 (RIA)을 수행하여 측정한다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성은 비표지된 항원에 대한 일련의 적정을 수행하면서, Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형 상태로 만든 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트에 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌[Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참고). 검정의 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 다중-웰 플레이트 (Thermo Scientific)를 밤새 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/mL의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 코팅한 후, 2 시간 내지 5 시간 동안 실온(대략 23℃에서 PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민에 의해 차단시켰다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 관심 Fab의 연속 희석액과 혼합되어 (예를 들어, 문헌[Presta 외, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이후, 관심 Fab를 항온 처리하나; 더 오랜 기간(예를 들어, 약 65 시간) 동안 계속 항온 처리하여, 확실히 평형 상태에 도달되도록 한다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어, 1 시간 동안) 배양용 포획 플레이트로 옮긴다. 이후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 μL/웰의 신틸란트(scintillant)(MICROSCINT-20TM; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 TOPCOUNTTM 감마 계수기 (Packard)에서 10분 동안 계수하였다. 경쟁적 결합 검정에 사용하기 위해, 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 선택하였다.
다른 구현예에 의하면, Kd는 25℃에서 BIACORE® 2000 또는 BIACORE® 3000 (BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 측정하는데, 항원 CM5 칩은 약 10 반응 단위 (RU)로 고정시켰다. 간단히, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)을 제조사의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)에 의해 활성화한다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8에 의해 5 μg/mL (~0.2 pM)까지 희석한 후, 5 μl/분의 유속으로 주사하여, 대략 10 반응 단위 (RU)의 결합된 단백질을 얻는다. 항원을 주사한 후, 1 M 에탄올 아민을 주사하여 미반응 기를 차단한다. 속도론적 측정을 위해, 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST)를 포함한 PBS 중 Fab(0.78 nM 내지 500 nM)의 2-배의 연속 희석액을 25℃에서 대략 25 μl/분의 유속으로 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 단순 1-대-1 Langmuir 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여, 결합 및 해리 센서그램을 동시에 보정함으로써 계산하였다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비로서 계산된다. 예를 들어, 문헌[Chen 외, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]를 참고한다. 　 상기 표면 플라스몬 공명 검정에서 온-속도(on-rate)가 106 M-1 s-1를 초과하는 경우, 이후 분광측정기, 예컨대 정지-유동 장착(stop-flow equipped) 분광측정기 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광측정기 (ThermoSpectronic)에서 측정할 때 항원의 농도가 증가하는 경우, 25℃에서 PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도 (여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술을 사용하여, 온-속도를 측정할 수 있다.
본 발명의 항-Axl 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다. 항-Axl 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 F(ab')2 단편 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 이용된다 다른 구현예에서, 상기 항체는 전체-길이 항체, 예를 들어, 온전한 IgG 항체, 또는 본원에 정의된 다른 항체 부류 또는 동형체이다. 특정 항체 단편을 검토하기 위해서는, 문헌[Hudson 외, Nat. Med., vol. 9, pp. 129-134, 2003]를 참고한다.　 scFv 단편을 검토하기 위해서는, 예를 들어, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]를 참고하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호도 참고한다. 구조(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체 내 반감기가 증가한 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의는, 미국 특허 제5,869,046호를 참고한다.
본 발명의 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디의 예에 대해서는 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pp. 6444-6448, 1993]을 참고한다. 트리아바디 및 테트라바디의 예는 또한 문헌[Hudson 외, Nat. Med., vol. 9, pp. 129-134, 2003]에도 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항체의 중쇄 가변 영역 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함한 단일-도메인 항체 단편을 포함한다. 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., 메사추세츠주 월섬 소재; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516 B1호 참고).
항체 단편은 다양한 기술들에 의해 제조될 수 있는데, 여기에는 온전한 항체의 단백질 분해성 소화뿐만 아니라 본원에 기재된 재조합 숙주 세포(예를 들어, E. coli 또는 파지)에 의한 생산이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-Axl 항체는 키메라 항체일 수 있다. 특정 키메라 항체는 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, pp. 6851-6855, 1984])에 기재되어 있다. 일 예에서, 상기 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역)와 인간의 불변 영역를 포함한다. 추가 예에서, 상기 키메라 항체는 "부류가 전환된(class-switched)" 항체로서, 상기 항체의 부류 또는 하위 부류는 모 항체의 부류 또는 하위 부류에 비해 변화되었다. 키메라 항체는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 이러한 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되나, 비-인간 모 항체의 특이성과 친화성은 유지한다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR (또는 이의 일부)가 비-인간 항체로부터 유래하고, FR (또는 이의 일부)가 인간 항체 서열로부터 유래한 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부도 또한 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예를 들어, CDR 잔기가 유래한 항체) 유래의 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복하거나 개선시킨다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci., vol. 13, pp. 1619-1633, 2008]에서 검토되어 있으며, 추가로 예를 들어, 문헌[Riechmann 외, Nature, vol. 332, pp. 323-329, 1988]; 문헌[Queen 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol. 86, pp. 10029-10033, 1989]; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; 문헌[Kashmiri 외, Methods, vol. 36, pp. 25-34, 2005 (SDR (a-CDR) 이식(grafting)을 설명함]); 문헌[Padlan, Mol. Immunol., vol. 28, pp. 489-498, 1991 ("표면 치환(resurfacing)"에 대해 설명함]; 문헌[Dall'Acqua 외, Methods, vol. 36, pp. 43-60, 2005] (FR 셔플링(shuffling)에 대해 설명함); 및 문헌[Osbourn 외, Methods, vol. 36, pp. 61-68, 2005] 및 문헌[Klimka 외, Br. J. Cancer, vol. 83, pp. 252-260, 2000] (FR 셔플링에 대한 "권고된 선택" 접근법을 설명함)에도 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 부위는, 이하의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다: "최적 맞춤(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 부위 (예를 들어, 문헌[Sims 외, J. Immunol., vol. 151, p. 2296, 1993] 참고); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위 그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래한 프레임워크 부위 (예를 들어, 문헌[Carter 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, p. 4285, 1992]; 및 문헌[Presta 외, J. Immunol., vol. 151, p. 2623, 1993] 참고); 인간의 성숙한 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 부위 또는 인간 생식계 프레임워크 부위 (예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci., vol. 13, pp. 1619-1633, 2008] 참고); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래한 프레임워크 부위 (예를 들어, 문헌[Baca 외, J. Biol. Chem., vol. 272, pp. 10678-10684, 1997] 및 문헌[Rosok 외, J. Biol. Chem., vol. 271, pp. 22611-22618, 1996] 참고).　　 　
일부 구현예에서, 본 발명의 항-Axl 항체는 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론성 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 Axl에 대한 것이고 다른 하나는 다른 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이성 항체는 Axl의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적인 항체는 Axl를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는 데에도 사용할 수 있다. 이중특이적인 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 준비할 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은, 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합적 공동-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature, vol. 305, pp. 537-540, 1983], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker 외, EMBO J. vol. 10, pp. 3655-3659, 1991] 참고), 및 "놉-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참고)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다중-특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 전기적 조향 효과(electrostatic steering effect)의 조작(WO 2009/089004A1); 2개 이상 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호, 및 문헌[Brennan 외, Science, vol. 229, pp. 81-83, 1985] 참고); 류신 지퍼를 사용한 이중-특이적인 항체의 생성 (예를 들어, 문헌[Kostelny 외, J. Immunol., vol. 148, pp. 1547-1553, 1992] 참고); 이중 특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌[Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pp. 6444-6448, 1993] 참고); 단일-사슬 Fv (scFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌[Gruber 외, J. Immunol., vol. 152, pp. 5368-5374, 1994] 참고); 예를 들어, 문헌[Tutt 외, J. Immunol., vol. 147, pp. 60-69, 1991]에 기재된 삼중 특이적 항체의 제조에 의해 제작될 수도 있다.
"옥토푸스(octopus) 항체"를 포함한 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖도록 조작된 항체도, 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참고).　
항체 또는 항체 단편은 또한 Axl 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함할 수 있다(예를 들어, US 2008/0069820 참고).
본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 US 2016/0017040에 상세히 기재된 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다.
본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성은, 당업계에 알려진 다양한 검정에 의해 시험 및 측정될 수 있다. 이러한 검정들 중 일부는 미국 특허 제8,853,369호에 기재되어 있다.
면역접합체
다른 양태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 세포 독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사능 동위원소에 접합된, 본원의 항-Axl 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 면역접합체는 항체가 마이탄시노이드 (미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0425 235 Bl 참고); 오리스타틴, 예컨대 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 5,780,588호, 및 제7,498,298호 참고); 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 이의 유도체 (미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; 문헌[Hinman 외, Cancer Res., vol. 53, pp. 3336-3342, 1993]; 및 문헌[Lode 외, Cancer Res., vol. 58, pp. 2925-2928, 1998)]; 안트라사이클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌[Kratz 외, Current Med. Chem., vol. 13, pp. 477-523, 2006]; 문헌[Jeffrey 외, Bioorganic & Med. Chem. Letters, vol. 16, pp. 358-362, 2006]; 문헌[Torgov 외, Bioconj. Chem., vol. 16, pp. 717-721, 2005]; 문헌[Nagy 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, pp. 829-834, 2000]; 문헌[Dubowchik 외, Bioorg. & Med. Chem. Letters, vol. 12, vol. 1529-1532, 2002]; 문헌[King 외, J. Med. Chem., vol. 45, pp. 4336-4343, 2002]; 및 미국 특허 제6,630,579호 참고); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.다른 구현예에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 이들의 단편에 접합된 본원에 기재된 항체를 포함하는데, 상기 독소에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루시노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모덱신(modeccin) A 사슬, 알파-사르신(sarcin), 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 큐르신(curcin), 크로틴(crotin), 비누풀(sapaonaria officinalis) 저해제, 게놀린(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센스(tricothecenes)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 면역접합체는 방사능 원자에 접합되어 방사성 접합체를 형성하는, 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사능 동위원소는 방사성 접합체의 생산에 이용할 수 있다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사능 동위원소를 포함한다. 방사성 접합체는 탐지용으로 사용될 때, 신티그래픽 (scintigraphic) 연구용 방사능 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상 (자기 공명 영상, MRI라고도 알려짐)용 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 및 철을 포함할 수 있다.
항체와 세포 독성제의 접합체는, 다양한 이중 기능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 아미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중 기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, l,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역 독소는 문헌[Vitetta 외, Science, vol. 238, pp. 1098-, 1987]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지-이소티아시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 핵종 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026를 참고한다. 상기 링커는 세포 독성 약물을 세포에 용이하게 방출시키는 "분해가능한 링커(cleavable linker)"일 수 있다. 예를 들어, 산-취약성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광취약성 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커(문헌[Chari 외, Cancer Res., vol. 52, pp. 127-131, 1992]; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본 명세서의 면역접합체는 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A로부터) 상업적으로 입수가능한 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SLAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 가교제 시약으로 제조된 접합체를 명시적으로 고려하지만 이에 제한되지 않는다.
ADC의 예시적인 구현예는 종양 세포를 표적화하는 항체 (Ab), 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 리신 및/또는 시스테인을 통해 링커 모이어티 (L)에 부착된다.
예시적인 ADC는 Ab-(L-D)p과 같은 화학식 I을 갖는데, 상기 화학식에서 p는 1 내지 약 20이다. 일부 구현예에서, 항체에 접합시킬 수 있는 약물 모이어티의 수는 자유 시스테인 잔기의 수에 의해 제한된다. 일부 구현예에서, 자유 시스테인 잔기는 본원에 기재된 방법에 의해 항체 아미노산 서열에 도입된다. 화학식 I의 예시적인 ADC는 1, 2, 3, 또는 4 개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (Lyon 외, Methods in Enzym., vol. 502, pp. 123-138, 2012).
일부 구현예에서, 하나 이상의 자유 시스테인 잔기는 조작을 사용하지 않고도 이미 항체 내에 존재하는데, 이 경우, 기존의 자유 시스테인 잔기를 사용하여 항체를 약물에 접합시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 환원 조건에 노출된 후, 항체에 접합되어 하나 이상의 자유 시스테인 잔기를 생성한다.
본 발명은 절단 가능한 링커(CAB-Axl-ADC)를 통해 적어도 하나의 약물 모이어티에 접합된 조건부 활성 생물제제(CAB) 항-Axl 항체를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC) 및 Axl 발현 종양의 치료를 위한 그의 용도를 포괄한다. 이러한 ADC는 바람직하게는 약제학적 조성물 또는 키트에서 치료를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. 일부 구현예에서, 약물 모이어티는 적어도 하나의 세포독성제 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF)이다. CAB-Axl 항체는 약 4인 약물 대 항체 비율 (DAR)로 MMAE(돌라스타틴 10에 대한 합성 유사체, 항-튜불린제)와 커플링된 절단 가능한 펩티드 링커를 통해 항체의 중쇄 및 경쇄에 있는 시스테인에 화학적으로 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-Axl 항체를 포함하는 항체 약물 접합체는 vc-PAB 링커를 통해 MMAE에 공유 결합된다. 결합 후, CAB-Axl-ADC는 MMAE를 방출하기 위해 프로테아제에 의해 펩티드 링커가 절단되는 종양 세포로 내재화된다. Axl을 발현하는 종양 세포에 특이적으로 MMAE를 전달하면 추가 종양 세포 증식을 방지하고 종양 수축을 초래할 것으로 예상된다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체는 약제학적 조성물로서 대상체에게 전달된다.
일부 구현예에서, CAB-Axl-ADC는 Ab-절단 가능한 링커-MMAE(n)이고, 여기서 MMAE는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이고, (n)은 1 내지 4(포함)의 정수이다. 본 발명의 예시적인 CAB-Axl-ADC는 하기 화학 구조:
Figure pct00005
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 가지며, 여기서 Ab는 항-Axl 항체이고 S는 항체의 황 원자이다.
일부 구현예에서, CAB-Axl-ADC는 Ab 부분으로서의 mAb, 시스테인 접합된 말레이미드(MC), 및 발린 및 시트룰린(vc)을 함유하는 절단 가능한 펩티드 링커, 이어서 MMAE를 포함하는 여러 별개의 부분을 포함한다. 예를 들어, CAB-Axl-ADC는 mAb 절단 가능한 링커-MMAE(n)이다. 바람직하게는, mAbBA3011-MC-vc-PAB-MMAE 항체-약물 접합체는 파라-아미노벤질 알코올(PAB)(자기 희생 모이어티)(CAB-Axl-ADC)에 부착된 디펩티드 발린-시트룰린 (vc)을 포함하는 절단 가능한 링커를 통해 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)에 접합된 조건부 활성 생물학적(CAB) 항-Axl 인간화 단클론성 항체(mAb)(면역글로불린 IgG1)이다. 항체 부분(mAb)인 BA3011은 설프하이드릴 결합을 통해 MC-vc-PAB-MMAE에 부착되고 Axl 티로신 키나제 성장 인자 억제제에 특이적이며, 종양 미세 환경(TME) 내에서 발견되는 조건에서 Axl에 특이적으로 가역적으로 결합하지만 TME 외부의 Axl에 대한 결합이 감소되고; 따라서 정상 세포보다 종양에 대한 선택성 이점을 부여한다.
예를 들어 강력한 세포독성제 또는 독소를 mAb에 부착하는 항체 약물 접합체(ADC)는 독성을 증가시키지 않으면서 효능을 향상시킬 수 있는 잠재력을 제공하기 때문에 네이키드 항체를 사용한 치료보다 진보한 기술이다. CD33 양성 급성 골수성 백혈병 치료를 위한 젬투주맙 오조가미신(Mylotarg®)의 허가를 통해 임상적 유용성이 입증되었다. 두 개의 다른 ADC인 브렌툭시맙 베도틴(Adcetris®)과 아도-트라스투주맙 엠탄신(Kadcyla®)은 현재 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았다.
본 발명은 상이한 질환 및 조직과 관련된 표적 조직(종양과 같은)에 정의된 생리학적 조건 하에서 우선적으로 결합하는 CAB 항체(뿐만 아니라 다른 생물제제)를 제공한다. CAB에 의한 조건부 및 가역적 결합은 종양 외 독성 및 면역원성을 줄이고, 조직 매개 약물 침착을 방지하고, 약동학(PK)을 개선하도록 설계되었다. 예를 들어, 암에서, Warburg가 설명한 고유한 세포 대사는 낮은 pH 및 높은 락테이트와 같은 특징적인 미세 환경에 기여한다(Warburg 1924; Warburg 1956). 멕보타맙 베도틴(BA3011)은 진행성 고형 종양 환자를 위한 항암 요법으로 개발된 조건부 활성 생물학적 항-AXL 항체-약물 접합체(CAB-AXL-ADC)이다. BA3011은 고유한 TME를 활용하고 Axl을 발현하는 종양에 근접할 때 표적에 우선적으로 결합하고; 그러나 BA3011은 적절한 환경이 부족한 조건에서 Axl에 대한 결합을 감소시켰다. AXL은 육종을 비롯한 여러 종양 유형에서 고도로 발현되는 세포 표면 막관통 수용체 단백질 티로신 키나제이다. 증가된 AXL 발현은 화학 요법, 프로그래밍된 사망-1 (PD-1) 억제제, 분자 표적 요법, 및 방사선 요법에 대한 종양 저항성과 관련이 있다. BA3011과 같은 CAB의 활성화된 결합 특성은 가역적이어서, 병든 조직 미세 환경에서 정상 조직으로 전환될 때 영구적인 변화가 없다. BA3011은 CAB 특성을 달성하기 위해 비-항체 서열을 추가하지 않은 인간화 mAb이다.
BA3011은 관문 억제제 예컨대 항-프로그래밍된 사망-1 (PD-1) 및 항-프로그래밍된 사멸 리간드-1 (PD-L1) 치료 항체와 병용 투여할 수도 있다. 일반적으로 많은 ADC, 특히 MMAE를 세포독성 페이로드로 사용하는 ADC는 면역 종양(IO) 요법과 함께 테스트되었다(Gerber 2016). 종양 세포의 면역원성 세포 사멸(ICD)은 특정 부류의 세포독성 화합물에 의해 유도되며 종양에 대한 이펙터 T 세포 동원의 강력한 자극제를 나타낸다. 또한 여러 세포 독성 약물이 수지상 세포 활성화 및 성숙을 직접 자극하여, IO 화합물과 결합할 때 개선된 항종양 면역 반응을 나타낸다. 그 중 여러 세포독성제가 현재 ADC의 페이로드로 활용되고 있다. 따라서, ADC 및 IO 화합물과의 조합 레지멘은 CD8+ 이펙터 T-세포의 종양 코어 동원을 증가시킴으로써 면역 관문 억제제의 현재 한계를 극복할 수 있는 강력한 가능성을 가지고 있다. 임상 연구와 관련하여, ADC-IO 조합은 IO 화합물과 ADC 사이의 시너지 활성이 종양 특정 면역 기억의 형성을 증가시켜 궁극적으로 더 많은 암 환자에서 지속적인 반응으로 이어질 수 있기 때문에 종양학 약물 개발에 더 광범위한 영향을 미칠 수 있다 (Coats 2019). 관문 억제제와 BA3011 조합과 관련하여, PD-1 요법-저항성 흑색종 환자의 전사체 분석은 면역억제, 혈관신생, 대식세포 화학주성, 세포외 기질 리모델링 및 상피-중간엽 전이 (EMT)와 관련된 일련의 상향 조절된 유전자를 나타낸다. 상향 조절되는 유전자 중에는 BA3011 표적인 Axl이 있다(Hugo 2016; Bu 2016). PD-1 저항성 종양에서 Axl의 상향조절은 이 집단에서 저항성 및 재발에 대한 Axl의 역할을 강력하게 시사하며 BA3011을 PD-1 억제제, 예컨대 니볼루맙와 조합하기 위한 충분한 근거를 제공한다.
예시적인 링커
"링커"(L)는 화학식 I의 ADC와 같은 면역접합체를 형성하기 위해 약물 모이어티(D)와 같은 하나 이상의 모이어티를 항체(Ab)에 연결하는 데 사용될 수 있는 이중작용성 또는 다작용성 모이어티이다. 일부 구현예에서, ADC는 약물 및 항체에 공유적으로 부착하기 위한 반응성 작용기를 갖는 링커를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항체(Ab)의 시스테인 티올은 링커 또는 약물-링커 중간체의 반응성 작용기와 결합을 형성하여 ADC를 만들 수 있다.
한 양태에서, 링커는 공유 결합을 형성하기 위해 항체 상에 존재하는 유리 시스테인과 반응할 수 있는 기능을 갖는다. 그러한 반응성 작용기의 비제한적인 예는 말레이미드, 할로아세트아미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르 예컨대 석신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 염화물, 설포닐 클로라이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Klussman, 등,　Bioconjugate Chemistry, vol.　15, pp. 765-773, 2004]의 766쪽에서의 접합 방법을 참고한다.
일부 구현예에서, 링커는 항체에 존재하는 친전자성 기와 반응할 수 있는 작용기를 갖는다. 예시적인 이러한 친전자성 기는 알데하이드 및 케톤 카보닐 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 링커의 반응성 작용기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응할 수 있고 항체 단위에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 그러한 반응성 작용기의 비제한적인 예는 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라자이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카보닐 (a "PAB"), N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 및 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1 카복실레이트 ("MCC")를 포함한다. 다양한 링커 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 그 중 일부는 아래에 설명되어 있다.
링커는 약물 방출을 촉진하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 비제한적인 예시적인 절단 가능한 링커는 산 불안정한 링커 (예를 들어, 하이드라존 포함), 프로테아제 민감한 (예를 들어, 펩티다제 민감한) 링커, 광불안정적인 링커, 또는 디설파이드 함유 링커를 포함한다(Chari 등, Cancer Research, vol. 52, pp. 127-131, 1992; 미국 특허 제 5,208,020호).
특정 구현예에서, 링커는 ―Aa―Ww―Yy―로서 하기 화학식 II를 가지며, 여기서 A는 "확대기 단위"이고, a는 0 내지 1의 정수이고; W는 "아미노산 단위"이고, w는 0 내지 12의 정수이고; Y는 "스페이서 단위"이고 y는 0, 1 또는 2이다. 화학식 II의 링커를 포함하는 ADC는 하기 화학식 I(A)를 갖는다: Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p, 여기서 Ab, D 및 p는 화학식 I에 대해 상기 정의된 바와 같다. 이러한 링커의 예시적인 구현예는 미국 특허 제7,498,298호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 링커 성분은 항체를 또 다른 링커 성분 또는 약물 모이어티에 연결하는 "확대기 단위"(A)을 포함한다. 비제한적인 예시적인 확대기 단위가 아래에 제시되어 있다(물결선은 항체, 약물 또는 추가 링커 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타냄).
Figure pct00006
일부 구현예에서, 링커 성분은 "아미노산 단위"(W)를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 아미노산 단위는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 허용하여 리소좀 효소와 같은 세포내 프로테아제에 대한 노출 시 면역접합체로부터 약물의 방출을 촉진한다(Doronina 등, Nat. Biotechnol., vol.　21, pp. 778-784, 2003). 예시적인 아미노산 단위는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 및 펜타펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-라이신 (fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모라이신 (phe-homolys); 및 N-메틸-발린-시트룰린 (Me-val-cit)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 아미노산 단위는 자연 발생 아미노산 잔기 및/또는 소수의 아미노산 및/또는 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 예를 들어 특정 효소, 예를 들어, 종양-관련된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 절단을 위해 설계되고 최적화될 수 있다.
전형적으로, 펩티드형 링커는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 액상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, E. Schroder and K. Lubke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press).
일부 구현예에서, 링커 성분은 직접적으로 또는 확대기 단위 및/또는 아미노산 단위를 통해 항체를 약물 모이어티에 연결하는 "스페이서 단위"(Y)를 포함한다. 스페이서 단위는 "자기 희생" 또는 "비-자기 희생"일 수 있다. "비-자기 희생" 스페이서 단위는 스페이서 단위의 일부 또는 전부가 ADC의 절단 시 약물 모이어티에 결합된 상태로 남아 있는 것이다. 비-자기 희생 스페이서 단위의 예는 글리신 스페이서 단위 및 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 종양-세포 관련 프로테아제에 의한 글리신-글리신 스페이서 단위를 함유하는 ADC의 효소적 절단은 ADC의 나머지로부터 글리신-글리신-약물 모이어티의 방출을 초래한다. 일부 이러한 구현예에서, 글리신-글리신-약물 모이어티는 종양 세포에서 가수분해 단계를 거치고, 따라서 약물 모이어티로부터 글리신-글리신 스페이서 단위를 절단한다.
"자기 희생" 스페이서 단위는 약물 모이어티의 방출을 허용한다. 특정 구현예에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, p-아미노벤질 알코올은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되고, 벤질 알코올과 약물 사이에 카바메이트, 메틸카바메이트, 또는 카보네이트가 생성된다(Hamann 등 Expert Opin. Ther. Patents, vol.　15, pp. 1087-1103, 2005). 일부 구현예에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카보닐(PAB)을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 희생 링커를 포함하는 ADC는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00007
여기서 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4의 정수이고; X는 하나 이상의 추가 스페이서 단위이거나 부재일 수 있으며; p의 범위는 1에서 약 20이다. 일부 구현예에서, p는 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4의 범위이다. 비제한적인 예시적인 X 스페이서 단위는 다음을 포함한다:
Figure pct00008
및
Figure pct00009
여기서 R1 및 R2는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.
자기 희생 스페이서의 다른 예는 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체(미국 특허 제7,375,078호; Hay 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., vol.　9, p. 2237-, 1999)와 같은 PAB 기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 아미드 결합 가수분해 시 고리화를 겪는 스페이서를 사용할 수 있고, 그 스페이서의 예는 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (Rodrigues 등, Chemistry Biology, vol. 2, pp. 223-, 1995), 적절하게 치환된 바이사이클로[2.2.1] 및 바이사이클로[2.2.2] 고리 시스템 (Storm 등, J. Amer. Chem. Soc., vol. 94, p. 5815-, 1972) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry 등, J. Org. Chem., vol. 55, p. 5867, 1990)이다. 글리신 잔기의 α-탄소에 대한 약물의 연결은 ADC에서 유용할 수 있는 자기 희생 스페이서의 또 다른 예이다(Kingsbury 등, J. Med. Chem., vol. 27, p.1447, 1984).
일부 구현예에서, 링커 L은 분지형 다작용성 링커 모이어티를 통해 항체에 대한 하나 초과의 약물 모이어티의 공유 부착을 위한 수지상형 링커일 수 있다(Sun 등 Bioorganic　&　Medicinal Chemistry Letters, vol.　12, pp. 2213-2215, 2002; Sun 등, Bioorganic　&　Medicinal Chemistry,　vol.11, pp. 1761-1768, 2003).　 수지상 링커는 ADC의 효능과 관련된 약물 대 항체의 몰비, 즉 부하를 증가시킬 수 있다. 항체가 단 하나의 반응성 시스테인 티올 기를 보유하는 경우, 수지상 링커를 통해 다수의 다른 모이어티가 부착될 수 있다.
비제한적인 예시적인 링커는 화학식 I의 ADC와 관련하여 아래에 제시되어 있다:
Figure pct00010
Figure pct00011
여기서 R1 및 R2는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.
Figure pct00012
여기서 n은 0 내지 12다. 일부 구현예에서, n은 2 내지 10이다. 일부 구현예에서, n은 4 내지 8이다.
추가의 비제한적인 예시적인 ADC는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00013
각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다.
일부 구현예에서, 링커는 용해도 및/또는 반응성을 조절하는 기로 치환된다. 비제한적인 예로서, 설포네이트(-SO3 -) 또는 암모늄과 같은 하전된 치환기는 링커 시약의 수용성을 증가시킬 수 있으며 링커 시약과 항체 및/또는 약물 모이어티의 커플링 반응을 촉진하거나, ADC를 제조하는 데 사용되는 합성 경로에 따라 Ab-L(항체-링커 중간체)과 D와의 커플링 반응 또는 D-L(약물-링커 중간체)과 Ab와의 커플링 반응을 촉진한다. 일부 구현예에서, 링커의 일부는 항체에 커플링되고 링커의 일부는 약물에 커플링된 다음, Ab-(링커 부분)a는 약물-(링커 부분)b에 커플링되어 화학식 I의 ADC를 형성한다.
본 발명의 화합물은 비스-말레이미드 시약: 디티오비스말레이미도에탄 (DTME), 1,4-비스말레이미도부탄 (BMB), 1,4 비스말레이미딜-2,3-디하이드록시부탄 (BMDB), 비스말레이미도헥산 (BMH), 비스말레이미도에탄 (BMOE), BM(PEG)2 (아래에 표시됨), 및 BM(PEG)3 (아래에 표시됨); 이미도에스테르의 이중작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디석신이미딜 우베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)를 포함하여 다음의 링커 시약: 비스-말레이미도-트리옥시에틸렌 글리콜 (BMPEO), N-(β-말레이미도프로필옥시)-N-하이드록시 석신이미드 에스테르 (BMPS), N-(β-말레이미도카프로일옥시) 석신이미드 에스테르 (EMCS), N-[β-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 에스테르 (GMBS), 1,6-헥산-비스-비닐설폰 (HBVS), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르 (MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라자이드 (MPBH), 석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP), 석신이미딜 요오드아세테이트 (SIA), 석신이미딜 (4-요오드아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 석신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 석신이미딜 6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH), 이미노티올란 (IT), 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트 (SVSB)로 제조된 ADC를 명확하게 고려하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 비스-말레이미드 시약은 티올 함유 약물 모이어티, 링커 또는 링커-약물 중간체에 대한 항체 내의 시스테인의 티올 기의 부착을 허용한다. 티올 기와 반응성인 다른 작용기는 요오드아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디설파이드, 피리딜 디설파이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 유용한 링커 시약은 Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc.(Boulder, Colo.)와 같은 다양한 상업적 공급원으로부터 얻거나 당업계, 예를 들어 문헌[Toki 등, J. Org. Chem., vol.　67, pp. 1866-1872, 2002; Dubowchik, 등, Tetrahedron Letters,　vol. 38, pp. 5257-60, 1997; Walker, J. Org. Chem., vol. 60, pp. 5352-5355, 1995; Frisch 등, Bioconjugate Chem., vol.　7, pp. 180-186, 1995; 미국 특허 제6,214,345호; WO 02/088172; US2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828]에 기재된 절차에 따라 합성될 수 있다.
탄소-14-표지-이소티아시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 핵종 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 예를 들어 WO 94/11026 을 참고한다.
예시적인 약물 모이어티
1) 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 구현예에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 메이탄신의 유도체이며, 튜불린 중합을 억제하여 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테너스 세라타(Maytenus serrata)에서 처음으로 단리되었다(미국 특허 제3,896,111호). 이어서, 특정 미생물이 또한 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생산한다는 것이 밝혀졌다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이탄시노이드는 예를 들어 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티인데, 이는 (i) 발효 생성물의 발효 또는 화학적 변형 또는 유도체화에 의해 제조하기에 비교적 접근 가능하고, (ii) 비-디설파이드 링커를 통해 항체에 접합하기에 적합한 작용기로 유도체화되기 쉽고, (iii) 혈장에서 안정하고, 그리고 (iv) 다양한 종양 세포주에 효과적이기 때문이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기에 적합한 특정 메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있고 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리되거나 유전 공학 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Yu 등, PNAS, vol. 99, pp. 7968-7973, 2002] 참고). 메이탄시노이드는 또한 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조될 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형된 방향족 고리를 갖는 것, 예컨대 C-19-데클로로(미국 특허 제4,256,746호)(예를 들어, 안사미토신 P2의 수소화알루미늄리튬 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸)+/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(예를 들어, 스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 사용하는 탈메틸화 또는 LAH를 사용하는 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/- 데클로로(미국 특허 제4,294,757호) (예를 들어, 아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨), 및 방향족 고리의 다른 위치에서 변형을 갖는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 하기와 같은 변형을 갖는 포함한다: C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호)(예를 들어, 메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호); C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호)(예를 들어 노카르디아(Nocardia)로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호)(예를 들어, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); C-15-메톡시(미국 특허 4,313,946호 및 제4,315,929호)(예를 들어, 트레위아 누들플로라(Trewia nudlflora)로부터 단리됨); C-18-N-데메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호)(예를 들어, 스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시(미국 특허 제4,371,533호)(예를 들어, 메이탄시놀의 삼염화티타늄/LAH 환원에 의해 제조됨).
메이탄시노이드 화합물의 많은 위치가 연결 위치로 유용하다. 예를 들어, 에스테르 결합은 통상적인 커플링 기술을 사용하여 하이드록실 기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 결합은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 구조를 갖는 것을 포함한다:
Figure pct00014
여기서 물결선은 ADC의 링커에 대한 메이탄시노이드 약물 모이어티의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다. 각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다. 아미드 기를 황 원자에 부착시키는 알킬렌 사슬은 메탄일, 에타닐 또는 프로필일 수 있으며, 즉 m은 1, 2 또는 3이다(미국 특허 제633,410호; 미국 특허 제5,208,020호; Chari 등, Cancer Res., vol. 52, pp. 127-131, 1992; Liu 등, Proc. Nall. Acad. Sci. USA, vol. 93, pp. 8618-8623, 1996).
메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성체는 본 발명의 ADC, 즉 키랄 탄소에서의 R 및 S 배열의 임의의 조합에 대해 고려된다(미국 특허 제7,276,497호; 미국 특허 제6,913,748호; 미국 특허 제6,441,163호; 미국 특허 제633,410호(RE39151), 미국 특허 제5,208,020호, Widdison 등(2006) J. Med.Chem.49:4392-4408). 일부 구현예에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 다음의 입체화학을 갖는다:
Figure pct00015
메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적인 구현예는 하기의 구조를 갖는 DM1; DM3; 및 DM4을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
Figure pct00016
Figure pct00017
여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커(L)에 대한 약물의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다.
DM1이 BMPEO 링커를 통해 항체의 티올 기에 연결된 예시적인 항체-약물 접합체는 하기의 구조 및 약어를 갖는다:
Figure pct00018
여기서 Ab는 항체이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 1 내지 약 20이다. 일부 구현예에서, p는 1 내지 10, p는 1 내지 7, p는 1 내지 5, 또는 p는 1 내지 4이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 이를 제조하는 방법 및 이들의 치료적 용도는 예를 들어 문헌[미국 특허 제5,208,020호 및 제5,416,064호; US 2005/0276812 A1; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1]에 개시되어 있다. 또한 문헌[Liu 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.　93, pp. 8618-8623, 1996; and Chari 등,　Cancer Research, vol.　52, pp. 127-131, 1992]을 참고한다.
일부 구현예에서, 항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호를 참고한다. 일부 구현예에서, 항체 분자당 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자가 접합된 ADC는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 강화시키는 효능을 나타내었다. 어떤 경우에는 한 분자의 독소/항체라도 네이키드 항체를 사용하는 것보다 세포 독성을 강화할 것으로 예상된다.
항체-메이탄시노이드 접합체를 만들기 위한 예시적인 연결 기는 예를 들어 본원에 기술된 것들 및 문헌[미국 특허 제5,208,020호; EP 특허 0 425 235 B1; Chari 등, Cancer Research, vol. 52, pp. 127-131, 1992; US 2005/0276812 A1; 및 US 2005/016993 A1]에 기재된 것들을 포함한다.
(2) 아우리스타틴 및 돌라스타틴
약물 모이어티는 돌라스타틴, 아우리스타틴, 및 그의 유사체 및 유도체를 포함한다(미국 특허 제5,635,483호; 미국 특허 제5,780,588호; 미국 특허 제5,767,237호; 미국 특허 제6,124,431호). 아우리스타틴은 해양 연체동물 화합물인 돌라스타틴-10의 유도체이다. 어떤 특정 이론에 얽매이려는 의도는 아니지만, 돌라스타틴과 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열 (Woyke 등, Antimicrob. Agents and Chemother., vol.　45, pp. 3580-3584, 2001)을 방해하고 항암 (미국 특허 제5,663,149호) 및 항진균 활성 (Pettit 등, Antimicrob. Agents Chemother., vol. 42, pp. 2961-2965, 1998)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 돌라스타틴/아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다(WO 02/088172; Doronina 등, Nature Biotechnology, vol. 21, pp. 778-784, 2003; Francisco 등, Blood, vol.　102, pp. 1458-1465, 2003).
예시적인 아우리스타틴 구현예는 미국 특허 제7,498,298호 및 미국 특허 제7,659,241호에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다:여기서 DE 및 DF의 물결선은 항체 또는 항체-링커 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타내며 각 위치에서 독립적으로:
Figure pct00019
R2는 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되며;
또는 R4 및 R5 공동으로 카보사이클릭 고리를 형성하고 화학식 -(CRaRb)n-을 가지며, 여기서 Ra 및 Rb는 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카보사이클로부터 독립적으로 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되고;
R6는 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
각각의 R8은 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)으로부터 독립적으로 선택되며;
R9는 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 선택되며;
Z는 O, S, NH 또는 NR12이고, 여기서 R12는 C1-C8 알킬이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클,
Figure pct00020
(R13O)m
Figure pct00021
R14, 또는
Figure pct00022
(R13O)m
Figure pct00023
CH(R15)2로부터 선택되며;
m은 1 내지1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
각 경우의 e는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
각 경우의 e는 각각 독립적으로 H, C1-C8　알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18는 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카보사이클)로부터 선택되고; 그리고
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
한 구현예에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고 R5는 -H 또는 메틸이다. 예시적인 구현예에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이다.
또 다른 구현예에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 구현예에서, 각 경우의 R8은 -OCH3이다.
예시적인 구현예에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이고, R8은 각각 -OCH3이고, R9는 -H이다.
한 구현예에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
일 구현예에서, R10은 아릴이다.
예시적인 구현예에서, R10은 -페닐이다.
예시적인 구현예에서, Z가 -O-일 때, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
한 구현예에서, Z가 -NH일 때, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
또 다른 구현예에서, Z가 -NH일 때, R11은
Figure pct00024
CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
화학식 DE의 예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAE이고, 여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커(L)에 대한 공유 부착을 나타낸다:
Figure pct00025
화학식 DE의 예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAF이고, 여기서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커(L)에 대한 공유 부착을 나타낸다:
Figure pct00026
다른 예시적인 구현예는 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 카복시 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물(WO 2007/008848) 및 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 측쇄 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물(WO 2007/008603)을 포함한다.
MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 비제한적 예시적인 구현예는 Ab-MC-PAB-MMAF 및 Ab-PAB-MMAF를 추가로 포함한다. 단백분해로 절단할 수 없는 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체는 단백분해로 절단 가능한 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체에 필적하는 활성을 갖는 것으로 나타났다(Doronina 등, Bioconjugate Chem., vol. 17, pp.114-124, 2006). 이러한 일부 구현예에서, 약물 방출은 세포에서 항체 분해에 의해 영향을 받는 것으로 여겨진다.
전형적으로, 펩티드 기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 액상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, E. Schroder and K. L
Figure pct00027
bke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press). 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 일부 구현예에서 하기의 방법에 따라 제조될 수 있다: 미국 특허 제7,498,298호; 미국 특허 제5,635,483호; 미국 특허 제5,780,588호; Pettit 등, J. Am. Chem. Soc., vol. 111, pp. 5463-5465, 1998; Pettit 등, Anti-Cancer Drug Design, vol.　13, pp. 243-277, 1998; Pettit 등,　Synthesis,vol. 6,　pp. 719-725, 1996; Pettit 등, J. Chem. Soc. Perkin Trans. vol.　15, pp. 859-863, 1996; and Doronina ,　Nat. Biotechnol., vol.　21, pp. 778-784, 2003.
일부 구현예에서, 식 DE 예컨대 MMAE, 및 DE, 예컨대 MMAF의 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티, 및 약물-링커 중간체 및 이의 유도체, 예컨대 MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, 및 MC-vc-PAB-MMAE는 문헌[미국 특허 제7,498,298호; Doronina 등, Bioconjugate Chem., vol.　17, pp. 114-124, 2006; and Doronina 등, Nat. Biotech., vol.　21, pp. 778-784, 2003]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 그 다음 관심 항체에 접합될 수 있다.
(3) 칼리케아마이신
일부 구현예에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아마이신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아마이신 계열의 항생제 및 그 유사체는 피코몰 미만의 농도에서 이중 가닥 DNA 절단을 생성할 수 있다(Hinman 등, Cancer Research, vol.　53, pp. 3336-3342, 1993; Lode 등, Cancer Research, vol.　58, pp. 2925-2928, 1998). 칼리케아마이신은 세포내 작용 부위를 갖지만, 어떤 경우에는 원형질막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서, 항체 매개 내재화를 통한 이들 제제의 세포 흡수는 일부 구현예에서 이들의 세포독성 효과를 크게 강화시킬 수 있다. 칼리케아미신 약물 모이어티를 갖는 항체-약물 접합체를 제조하는 비제한적인 예시적인 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,712,374호; 미국 특허 제5,714,586호; 미국 특허 제5,739,116호; 및 미국 특허 제5,767,285호에 기재되어 있다.
(4) 피롤로벤조디아제핀
일부 구현예에서, ADC는 피롤로벤조디아제핀(PBD)을 포함한다. 일부 구현예에서, PDB 이량체는 특정 DNA 서열을 인식하고 결합한다. PBD인 천연 산물 안트라마이신은 1965년에 처음 보고되었다(Leimgruber 등, J. Am. Chem. Soc.,　vol. 87, pp. 5793-5795, 1965; Leimgruber 등, J. Am. Chem. Soc., vol. 87, pp. 5791-5793, 1965). 그 이후로, 삼환식 PBD 스캐폴드의 이량체를 포함하여 (미국 특허 제6,884,799호; 미국 특허 제7,049,311호; 미국 특허 제7,067,511호; 미국 특허 제7,265,105호; 미국 특허 제7,511,032호; 미국 특허 제7,528,126호; 미국 특허 제7,557,099호), 자연 발생 및 유사체의 다수의 PBD가 보고되었다(Thurston 등, Chem. Rev. vol. 1994, pp. 433-465 1994). 특정 이론에 얽매이지 않고, 이량체 구조는 B형 DNA의 작은 홈과 이소헬리시티(isohelicity)을 위한 적절한 3차원 형상을 부여하여 결합 부위에 꼭 맞도록 한다고 믿어진다(Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res.,　vol. 19, pp. 230-237, 1986). C2 아릴 치환기를 갖는 이량체 PBD 화합물은 세포독성제로서 유용한 것으로 밝혀졌다(Hartley et al Cancer Res., vol.　70, pp. 6849-6858, 2010; Antonow, J. Med. Chem.vol.　53, pp. 2927-2941, 2010; Howard 등, Bioorganic and Med. Chem. Letters, vol.　19, pp. 6463-6466, 2009).
PBD 이량체는 항체에 결합되어 있으며 생성된 ADC는 항암 특성을 갖는 것으로 나타났다. PBD 이량체 상의 비제한적인 예시적인 연결 부위는 5-원 피롤로 고리, PBD 단위 사이의 테더 및 N10-C11 이민 기를 포함한다(WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
ADC의 비제한적인 예시적인 PBD 이량체 성분은 화학식 A:
Figure pct00028
및 이의 염 및 용매화물이고, 여기서:
물결선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 선택적 존재를 나타내고;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 독립적으로 선택되고, 선택적으로 할로 또는 디할로로부터 추가로 선택되고, RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R6 및 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되며;
R11은 H 또는 R이거나, 여기서 Q는 O, SO3M(여기서 M은 금속 양이온임)이고;
R 및 R' 각각은 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-8 알킬, C1-12 알킬, C3-8 헤테로사이클릴, C3-20 헤테로사이클, 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 선택적으로 NRR' 기와 관련하여, R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R12, R16, R19　및 R17은 각각 R2, R6, R9 및 R7에 대해 정의된 것과 같고;
R"은 C3-12 알킬렌 기이며, 이 사슬은 하나 이상의 헤테로원자, 예를 들어 O, S, N(H), NMe 및/또는 방향족 고리, 예를 들어 벤젠 또는 피리딘에 의해 중단되고, 이 고리는 선택적으로 치환되고; 그리고
X 및 X'는 O, S 및 N(H)로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, R 및 R' 각각은 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로사이클, 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 선택적으로 NRR' 기와 관련하여, R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, R9 및 R19는 H이다. 일부 구현예에서, R6 및 R16은 H이다.
일부 구현예에서, R7은 R17이고 둘 다 R7A이고, 여기서 R7A는 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다. 일부 구현예에서, R7A는 Me이다. 일부 구현예에서, R7A는 Ch2Ph이고, 여기서 Ph는 페닐기이다. 일부 구현예에서, X는 O이다. 일부 구현예에서, R11은 H이다. 일부 구현예에서, 각 단량체 단위에서 C2와 C3 사이에 이중 결합이 있다.
일부 구현예에서, R2 및 R12는 독립적으로 H 및 R로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 독립적으로 R이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 독립적으로 선택적으로 치환된 C5-20 아릴 또는 C5-7 아릴 또는 C8-10 아릴이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 독립적으로 선택적으로 치환된 페닐, 티에닐, 나프틸, 피리딜, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 =O, =CH2, =CH-RD 및 =C(RD)2로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 각각 =CH2이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 각각 H이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 각각 =O이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 각각 =CF2이다. 일부 구현예에서, R2 및 R12는 독립적으로 =C(RD)2이다. 일부 구현예에서, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =CH-RD이다.
일부 구현예에서, R2 및/또는 R12가 =CH-RD인 경우, 각 기는 독립적으로 하기에 나타낸 구성 중 하나를 가질 수 있다:
Figure pct00029
일부 구현예에서, =CH-RD는 배열 (I)에 있다. 일부 구현예에서, R"는 C3 알킬렌기 또는 C5 알킬렌기이다.
PBD 이량체-val-cit-PAB-Ab 및 PBD 이량체-Phe-Lys-PAB-Ab의 링커는 프로테아제 절단이 가능한 반면, PBD 이량체-말레이미드-아세탈의 링커는 산에 불안정한다.
PBD 이량체 및 PBD 이량체를 포함하는 ADC는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598를 참고한다.
(5) 안트라사이클린
일부 구현예에서, ADC는 안트라사이클린을 포함할 수 있다. 안트라사이클린은 세포독성 활성을 나타내는 항생제 화합물이다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 연구에 따르면 안트라사이클린은 하기를 포함하는 다양한 메커니즘으로 세포를 죽이는 작용을 할 수 있다: 1) 약물 분자를 세포의 DNA에 삽입하여 DNA 의존적 핵산 합성을 억제함; 2) 세포 손상을 유발하기 위해 세포 거대분자와 반응하는 자유 라디칼의 약물에 의한 생산, 및/또는 3) 약물 분자와 세포막과의 상호작용(예를 들어, 문헌[C. Peterson 등, "Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" in　Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N. R. Bachur, "Free Radical Damage" id. at pp. 97-102] 참고). 안트라사이클린의 잠재적인 세포독성 때문에, 수많은 암 예컨대 백혈병, 유방 암종, 폐 암종, 난소 선암종 및 육종의 치료에 사용되었다(예: 문헌[ P. H-Wiernik, in　Anthracycline: Current Status And New Developments　p 11] 참고).
비제한적인 예시적인 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 다우노마이신, 네모루비신, 및 이의 유도체를 포함한다. 다우노루비신 및 독소루비신의 면역접합체 및 전구약물이 제조 및 연구되었다(Kratz 등, Current Med. Chem., vol.　13, pp. 477-523, 2006; Jeffrey 등, Bioorganic　&　Med. Chem. Letters, vol. 16, pp. 358-362. 1996; Torgov 등, Bioconj. Chem., vol.　16, pp. 717-721, 2005; Nagy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.　97, pp. 829-834, 2000; Dubowchik 등,　Bioorg. &　Med. Chem. Letters, vol.　12, pp. 1529-1532, 2002; King 등, J. Med. Chem., vol. 45, pp. 4336-4343, 2002; EP 0328147; 미국 특허 제6,630,579호). 항체-약물 접합체 BR96-독소루비신은 종양 관련 항원 Lewis-Y와 특이적으로 반응하며 1상 및 2상 연구에서 평가되었다(Saleh 등, J. Clin. Oncology, vol.　18, pp. 2282-2292, 2000; Ajani 등, Cancer Jour., vol.　6, pp. 78-81, 2000; Tolcher 등, J. Clin. Oncology, vol.　17, pp. 478-484, 1999).
PNU-159682는 네모루비신의 강력한 대사산물 (또는 유도체)이다(Quintieri 등, Clinical Cancer Research, vol. 11, pp. 1608-1617, 2005). 네모루비신은 독소루비신의 글리코시드 아미노 상에 2-메톡시모르폴리노 기를 갖는 독소루비신의 반합성 유사체이고 임상 평가를 받고 있다(Grandi 등 Cancer Treat. Rev. vol.17, pp. 133-138, 1990; Ripamonti 등 Brit. J. Cancer, vol. 65, pp. 703-707, 1992), including phase II/III trials for hepatocellular carcinoma (Sun 등, Proceedings of the American Society for Clinical Oncology, vol.　22, Abs1448, 2003; Quintieri, Proceedings of the American Association of Cancer Research,　vol. 44:1st Ed, Abs 4649, 2003; Pacciarini 등, Jour. Clin. Oncology, vol.　24, p. 14116, 2006).
PNU-159682를 포함하는 안트라사이클린은 본원에 기재된 링커를 포함하는 여러 연결 부위 및 다양한 링커를 통해 항체에 접합될 수 있다(US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124).
PNU-159682 말레이미드 아세탈-Ab의 링커는 산에 불안정한 반면, PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서-Ab, 및 PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서(R1R2)-Ab의 링커는 분해 가능한 프로테아제이다.
(6) 기타 약물 모이어티
약물 모이어티는 또한 젤다나마이신(Mandler 등, J. Nat. Cancer Inst., vol.　92, pp. 1573-1581, 2000; Mandler 등, Bioorganic　&　Med. Chem. Letters, vol.　10, pp. 1025-1028, 2000; Mandler 등, Bioconjugate Chem., vol.　13, pp. 786-791, 2002); 및 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루시노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모덱신(modeccin) A 사슬, 알파-사르신(sarcin), 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 큐르신(curcin), 크로틴(crotin), 비누풀(sapaonaria officinalis) 저해제, 게놀린(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센스(tricothecenes)가 포함되나, 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 및 그의 단편을 포함한다. 예를 들어 WO 93/21232 참조.
약물 모이어티는 또한 핵산분해 활성을 갖는 화합물(예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제)을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역접합체는 고방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합 항체 생산에 이용 가능한다. 예를 들면 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다. 일부 구현예에서, 면역접합체가 검출에 사용되는 경우, 이는 섬광계수법 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 Tc99 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 이미징을 위한 스핀 표지 (또한 자기 공명 영상, MRI로 알려져 있음), 예컨대 지르코늄-89, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다. 지르코늄-89는 다양한 금속 킬레이트화제와 복합될 수 있고, 예를 들어 PET 이미징을 위해 항체에 접합될 수 있다(WO 2011/056983).
방사성- 또는 다른 표지는 공지된 방식으로 면역접합체에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 예를 들어 하나 이상의 수소 대신에 하나 이상의 불소-19 원자를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 생합성되거나 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, Tc99, I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 항체의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 이트륨-90은 항체의 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, IODOGEN 방법(Fraker 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 80, pp. 49-57, 1978)은 요오드-123을 혼입하기 위해 사용될 수 있다. "Immunoscintigraphy의 Monoclonal Antibodies"(Chatal, CRC Press 1989)는 특정 다른 방법을 기재한다.
특정 구현예에서, 면역접합체는 프로드러그-활성화 효소에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 프로드러그-활성화 효소는 프로드러그 (예를 들어, 펩티딜 화학치료제, WO 81/01145 참고)를 활성 약물, 예컨대 항-암 약물로 변환시킨다. 이러한 면역접합체는 일부 구현예에서는, 항체 의존성 효소 매개 프로드러그 치료 ("ADEPT")에 유용하다. 항체에 접합될 수 있는 효소는, 포스페이트-함유 프로드러그를 자유 약물로 변환시키는데 유용한 알칼라인 포스파타제; 설페이트-함유 프로드러그를 자유 약물로 변환시키는데 유용한 아릴설파타제(arylsulfatase); 비-독성 5-플루오로시토신을 항-암 약물인 5-플루오로우라실로 변환시키는데 유용한 시토신 디아미나제; 펩티드-함유 프로드러그를 자유 약물로 변환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아(serratia) 프로테아제, 열분해(thermolysis), 서브틸리신(subtilisin), 카복시펩티다제 및 카텝신(cathepsin)(예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유한 프로드러그로 변환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 당화 프로드러그를 자유 약물로 변환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴로아미다제(neuraminidase); 베타-락탐에 의해 유도된 약물을 자유 약물로 변환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도된 약물을 각각 자유 약물로 변환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 및 페니실린 G 아미다제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 효소는 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 항체에 공유 결합할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Neuberger 외, Nature, vol. 312, pp. 604-608, 1984]를 참고한다.
약물 부하
약물 부하는 화학식 I의 분자에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수인 p로 표시된다. 약물 부하는 항체당 1 내지 20개의 약물 모이어티(D) 범위일 수 있다. 화학식 I의 ADC는 1 내지 20개의 다양한 약물 모이어티와 접합된 항체의 집합체를 포함한다. 접합 반응으로부터 ADC를 제조하는데 사용되는 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 종래의 수단 예컨대 질량 분광법, ELISA 검정, 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다. p의 관점에서 ADC의 정량적 분포도 결정될 수 있다. 일부 경우에, p가 다른 약물 부하를 갖는 ADC로부터의 특정 값인 균질 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 접합체에서, p는 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 특정 예시적인 구현예에서와 같이 부착부가 시스테인 티올인 경우, 항체는 단 하나 또는 여러 개의 시스테인 티올 기를 가질 수 있거나, 또는 링커가 부착될 수 있는 단 하나 또는 여러 개의 반응성이 충분한 티올 기를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 더 큰 약물 부하, 예를 들어 p＞5인 경우, 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성 또는 세포 투과성 손실을 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, ADC에 대한 평균 약물 부하은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5의 범위이다. 사실, 특정 ADC에서, 항체당 약물 모이어티의 최적 비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 나타났다 (미국 특허 제7,498,298호).
특정 구현예에서는, 접합 반응 동안 이론상 최대보다 적은 약물 모이어티가 항체에 접합된다. 항체는 예를 들어, 이하에서 논의된 약물-링커 중간물질 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 자유로운 반응성 시스테인 티올기를 많이 함유하지 않고; 정말로, 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디설파이드 브릿지로서 존재한다. 특정 구현예에서, 항체는 부분 또는 완전 환원 조건 하에서 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카보닐에틸포스핀 (TCEP)에 의해 환원되어, 반응성 시스테인 티올 기를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 변성 조건을 거쳐서, 반응성 친핵성 기, 예컨대 리신 또는 시스테인을 드러낸다.
ADC의 로딩(약물/항체 비)은 상이한 방식으로, 예를 들어: (i) 항체에 대해 약물-링커 중간물질 또는 링커 시약의 몰 과량을 제한하고, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한하고, (iii) 부분적으로는(partial or) 시스테인 티올 변형에 대한 환원 조건을 제한하여 조절될 수 있다.
하나 초과의 친핵성 기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하는 경우, 생성된 생성물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티 분포를 갖는 ADC의 혼합물이라는 것을 이해해야 한다. 항체당 평균 약물 수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개별 ADC는 질량 분광법에 의해 혼합물에서 식별될 수 있고 HPLC, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다 (예를 들어, 문헌[McDonagh 등, Prot. Engr. Design & Selection, vol. 19, pp. 299-307, 2006; Hamblett 등, Clin. Cancer Res., vol. 10, pp. 7063-7070, 2004] 참고). 특정 구현예에서, 단일 부하 값을 갖는 균질 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
면역접합체를 제조하는 특정 방법
화학식 I의 ADC인 면역접합체는 다음을 포함하는 유기 화학 반응, 조건 및 당업자에게 공지된 시약을 사용하는 여러 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성하기 위한 항체의 친핵성 기와 2가 링커 시약과의 반응에 이어 약물 모이어티 D와의 반응; 및 (2) 공유 결합을 통해 D-L을 형성하기 위한 약물 모이어티와 2가 링커 시약과의 친핵성 기의 반응에 이어 항체의 친핵성 기와의 반응. 후자의 경로를 통해 화학식 I의 ADC를 제조하는 예시적인 방법은 미국 특허 제7,498,298호에 기재되어 있다.
항체 상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 라이신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 당 하이드록실 또는 아미노 기를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 항체는 당화된다. 아민, 티올 및 하이드록실 기는 친핵성이며 (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; 및 (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기를 포함하여 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와의 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 특정 항체에는 환원성 사슬간 이황화물, 즉 시스테인 브릿지가 있다. 항체가 완전히 또는 부분적으로 환원되도록 환원제 예컨대 DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카보닐에틸포스핀 (TCEP)로 처리함으로써 항체는 링커 시약과의 접합을 위해 반응성으로 만들어질 수 있다. 따라서 각 시스테인 브릿지는 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체를 형성한다. 예를 들어, 라이신 잔기를 2-이미노티올란(트라우트 시약)과 반응시켜 아민을 티올로 전환시킴으로써 라이신 잔기의 변형을 통해 추가적인 친핵성 기를 항체에 도입할 수 있다. 반응성 티올 기는 또한 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입함으로써(예를 들어, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조함으로써) 항체에 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 또한 알데하이드 또는 케톤 카보닐 기와 같은 항체 상의 친전자성 기와 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 기 사이의 반응에 의해 생성될 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 친핵성 기는 하이드라자이드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라자이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 구현예에서, 항체는 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하도록 변형된다. 또 다른 구현예에서, 당화된 항체의 당은 예를 들어 퍼아이오데이트 산화 시약으로 산화되어 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민 기와 반응할 수 있는 알데하이드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프 염기 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 예를 들어 안정한 아민 결합을 형성하기 위한 붕소수화물 시약에 의해 환원될 수 있다. 한 구현예에서, 당화된 항체의 탄수화물 부분과 갈락토스 산화효소 또는 나트륨 메타-퍼아이오데이트와의 반응은 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 항체 내의 카보닐(알데하이드 및 케톤) 기를 생성할 수 있다(Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 구현예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 항체는 나트륨 메타-퍼아이오데이트과 반응하여 첫 번째 아미노산 대신 알데히드를 생성할 수 있다(Geoghegan & Stroh, Bioconjugate Chem., vol.　3, pp. 138-146, 1992; 미국 특허 제5,362,852호). 이러한 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
약물 모이어티 상의 예시적인 친핵성 기는 (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기를 포함하여 반응하여 링커 모이어티 및 링커 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성할 수 있는 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라자이드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라자이드 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
ADC를 제조하는 데 사용될 수 있는 비제한적인 예시적인 가교제 시약은 본원의 "예시적인 링커" 섹션에 기재되어 있다. 단백질성 모이어티 및 화학적 모이어티를 포함하는 2개의 모이어티를 연결하기 위해 이러한 가교제 시약을 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 분자는 접합체의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 인코딩하는 영역에 의해 분리되거나 서로 인접하거나 접합체의 세포독성 부분 및 항체를 인코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 항체는 종양 사전 표적화에 활용하기 위해 "수용체"(예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있고, 여기서 항체-수용체 접합체가 환자에게 투여된 후, 제거제(clearing agent)를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환계로부터 제거한 다음, 세포독성제 (예를 들어, 약물 또는 방사선뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에 제공된 임의의 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 생물학적 샘플에서 Axl의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "검출"이라는 용어는 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 유방, 췌장, 식도, 폐 및/또는 뇌 세포 또는 조직을 포함한다.
본 발명의 추가 양태는 Axl 수준이 신체의 적어도 하나의 위치에서 정상 생리학적 수준으로부터 증가 또는 감소하는 암 또는 다른 질환을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 본 발명의 항-Axl 항체에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 탐지가능한 분자 또는 물질, 예컨대 형광 분자, 방사능 분자, 또는 상기 기재된 바와 같은 당업계에 알려진 임의의 다른 표지에 의해 표지화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 방사능 분자에 의해 표지화될 수 있다. 예를 들어, 적합한 방사능 분자는 신티그래프 연구에서 사용되는 방사능 원자, 예컨대 123I, 124I, 111In, 186Re 및 188Re를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 또한 핵 자기 공명 (NMR) 영상용 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-I11, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철에 의해 표지화될 수 있다. 항체를 투여한 후, 환자 내의 방사선 표지 항체의 분포를 탐지한다. 임의의 적합한 공지된 방법을 사용할 수 있다. 일부 비-제한적인 예는 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 양성자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI), 형광, 화학발광 및 초음파 검사를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 Axl 과발현과 연관된 암 및 질환의 진단 및 병기결정에 유용할 수 있다. Axl 과발현과 연관된 암은 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 신경교 세포 종양 예컨대 교모세포종 및 신경섬유종증, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 흑색종, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선 암종, 신장암, 신장암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 간 암종, 육종, 혈액암 (백혈병), 성상세포종, 및 다양한 유형의 두경부암 또는 다른 Axl 발현 또는 과발현 과증식성 질환을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 Axl 발현이 증가하거나 감소하는 암 이외의 질환을 진단하는 데 유용할 수 있다. 이러한 진단에는 가용성 또는 세포성 Axl 형태가 모두 사용될 수 있다. 전형적으로, 그러한 진단 방법은 환자로부터 얻은 생물학적 샘플의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 "생물학적 시료"라는 용어는 진단 또는 모니터링 검정에서 사용할 수 있는, 대상체로부터 얻은 다양한 시료 유형들을 포괄한다. 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 시료, 고형 조직 시료, 예컨대 생검 시료, 또는 조직 배양액 또는 이로부터 유래한 세포 및 이의 자손을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 Axl 과발현과 연관된 암을 가진 것으로 의심되는 개체로부터 수집된 조직 샘플로부터 얻은 세포를 포함하며, 바람직한 구현예에서는 신경교종, 위, 폐, 췌장, 유방, 전립선, 신장, 간 및 자궁내막으로부터의 세포를 포함한다. 생물학적 시료는 임상 시료, 배양액 내의 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 및 조직 시료를 포괄한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 대상체로부터의 세포 상에서 Axl를 검출함으로써 대상체에서 Axl 과발현과 연관된 암을 진단하는 방법이다. 특히, 상기 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 본 발명에 의한 항체 또는 항체 단편에 적합한 조건 하에서, 대상체의 생물학적 시료를 상기 항체 또는 항체 단편과 접촉시켜, 생물학적 시료 내 세포와의 Axl을 발현하는 복합체를 형성시키는 단계; 및
(b) 상기 복합체를 탐지하고/거나 정량화하여, 상기 복합체의 탐지가 Axl 과발현과 관련된 암의 지표가 되도록 하는 단계.
암의 진행을 모니터링하기 위해, 본 발명에 의한 방법은 상이한 횟수만큼 반복하여 시료에 대한 항체 결합이 증가하는지 아니면 감소하는 지를 결정할 수 있고, 이로 인해 암이 진행하는지, 퇴보하는지, 아니면 안정화되었는 지를 결정할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Axl의 발현 또는 과발현 또는 Axl의 가용성 형태의 감소 또는 증가와 관련된 질환을 진단하는 방법이다. 그러한 질환의 예는 인간 면역 장애, 혈전성 질환(혈전증 및 죽상혈전증) 및 심혈관 질환을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 진단 또는 탐지 방법에 사용하기 위한 항-Axl 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 추가 양태에서, 생물학적 시료 내에서 Axl의 존재를 탐지하는 방법이 제공된다. 추가 양태에서는, 생물학적 시료 내의 Axl의 양을 정량화하는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 항-Axl 항체 또는 항체 단편이 Axl에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 생물학적 시료를 본원에 기재된 항-Axl 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계, 및 항-Axl 항체 또는 항체 단편과 Axl 사이에 복합체가 형성되는지 탐지하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 한 구현예에서, 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 사용하여 요법에 적합한 대상체를 선택한다. 일부 구현예에서, 요법은 대상체에게 항-Axl 항체 또는 항체 단편의 투여를 포함할 것이다.
특정 구현예에서, 표지된 항-Axl 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 상기 표지는 직접 탐지되는 표지 또는 모이어티(예컨대, 형광, 발색, 고전자 밀도(electron-dense), 화학발광, 및 방사능 표지), 뿐만 아니라 모이어티, 예컨대 간접적으로 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호 작용을 통해 탐지되는 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 표지는 방사능 동위원소 32P,　14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토금속 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론(umbelliferone), 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이의 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 서양고추냉이 퍼록시다제 (HRP), 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제(glucoamylase), 리소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소화효소, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제(uricase) 및 잔틴 옥시다제를 포함하나 이에 제한되지 않는데, 이들은 과산화수소를 이용하여 염료 전구체를 산화시키는데 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼록시다제, 또는 마이크로퍼록시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등에 결합되어 있다.
약제학적 제형
항-Axl 항체 또는 항체 단편은 세포 사멸 활성을 갖는다. 이 세포 사멸 활성은 여러 다른 유형의 세포주로 확장된다. 또한, 이러한 항체 또는 항체 단편은 일단 세포독성제에 접합되면 종양 크기를 감소시킬 수 있고 감소된 독성을 나타낼 수 있다. 본 출원의 실시예 3 및 6-9를 참조한다. 따라서, 항-Axl 항체, 이의 단편 또는 면역접합체는 Axl 발현과 관련된 증식성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 항체, 단편 또는 면역접합체는 단독으로 또는 임의의 적합한 제제 또는 다른 통상적인 치료와 조합하여 사용될 수 있다.
항-Axl 항체 또는 항체 단편은 Axl 및/또는 Gas6 발현, 과발현 또는 활성화와 관련된 과증식성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. Axl 발현 요건 외에 치료할 수 있는 암이나 조직의 종류에는 특별한 제한이 없다. 그 예는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 신경교 세포 종양 예컨대 교모세포종 및 신경섬유종증, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 흑색종, 결장직장암, 자궁내막암종, 타액선 암종, 신장암, 신장암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 간 암종, 육종, 혈액암 (백혈병), 성상세포종, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다. 보다 바람직한 암은 신경교종, 위암, 폐암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 신장암, 간암 및 자궁내막암이다.
항-Axl 항체 또는 항체 단편은 선천적 면역 반응의 잠재적 활성자이므로 패혈증과 같은 인간 면역 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 백신과 같은 면역화를 위한 보조제 및 예를 들어 박테리아, 바이러스 및 기생충에 대한 항감염제로서 사용될 수도 있다.
항-Axl 항체 또는 항체 단편은 정맥 및 동맥 혈전증 및 죽상혈전증과 같은 혈전성 질환을 보호, 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 또한 심혈관 질환에 대해 보호, 예방 또는 치료할 뿐만 아니라 라싸(Lassa) 및 에볼라 바이러스와 같은 바이러스의 진입을 예방 또는 억제하고 바이러스 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법의 각각의 구현예에서, 항-Axl 단클론성 항체, 항체 단편 또는 항-Axl 단클론성 면역접합체는 치료하고자 하는 질환 또는 장애의 관리와 관련된 통상적인 방법론과 일치하는 방식으로 전달될 수 있다. 본 개시 내용에 의하면, 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기에 충분한 시간과 조건 하에서, 유효량의 상기 항체, 항체 단편 또는 면역접합체를 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여한다. 따라서, 본 발명의 양태는 Axl의 발현과 관련된 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 치료 유효량의 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 면역접합체를 이것이 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
투여를 위해 항-Axl 단클론성 항체, 항체 단편 또는 면역접합체는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 항-Axl 단클론성 항체, 항체 단편 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 방법에서, 상기 치료성 분자는 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유한 용액 또는 조성물인 혼합물과 조합된다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 수여자(recipient) 환자에게 용인될 수 있는 물질이다. 멸균된 인산염-완충 식염수는 약제학적으로 허용가능한 담체의 한 예이다. 다른 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19판. 1995)]를 참고한다) 제형은 하나 이상의 부형제, 보존제, 용해제, 완충제, 알부민을 추가로 포함하여 바이러스 표면 등에서 단백질 손실을 방지할 수 있다.
약제학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 원래 치료될 질환, 질환의 심각성, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 달라진다. 이러한 고려사항은 적합한 약제학적 조성물을 제형화하기 위해 숙련자가 평가할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 주사가능한 제형에 대해 약제학적으로 사용가능한 비히클을 함유한다. 비히클은 특히 등장성의 멸균 식염수 용액 (인산나트륨 또는 인산이나트륨, 나트륨, 칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 이러한 염들의 혼합물)이거나, 또는 예를 들어, 멸균수 또는 생리 식염수를 첨가했을 때, 주사 용액으로 구성되는 건조된, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다.
일부 구현예에서, 등장화제는 종종 "안정화제"라고도 알려져 있는데, 액체의 등장성을 조절하거나 유지시키기 위해 조성물 중에 존재한다. 이들은 크기가 큰 전하성 생체 분자, 예컨대 단백질 및 항체와 함께 사용될 때 종종 "안정화제"라고 명명되며, 그 이유는 이들이 아미노산 측쇄의 전하성 기와 상호 작용할 수 있어서, 분자간 및 분자내 상호 작용의 가능성을 낮출 수 있기 때문이다. 등장화제는 약제학적 조성물의 0.1 중량% 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 내지 5 중량%의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 등장화제는 다가 당 알콜, 바람직하게는 3가 이상의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가적인 부형제는 이하의: (1) 팽화제(bulking agent), (2) 용해도 개선제, (3) 안정화제, 및 (4) 변성 또는 용기 벽면에의 접착을 방지하는 제제 중 하나 이상으로 작용할 수 있는 제제를 포함한다. 이러한 부형제는 다음을 포함할 수 있다: (상기 나열한) 다가 당 알콜; 아미노산, 예컨대 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알콜, 예컨대 수크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스(stachyose), 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 마이오이니시토스(myoinisitose), 마이오이니시톨(myoinisitol), 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨 (예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온(glutathione), 티옥트산(thioctic acid), 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트; 저분자량 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 단당류 (예를 들어, 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 이당류 (예를 들어, 락토스, 말토스, 수크로스); 삼당류, 예컨대 라피노스; 및 다당류, 예컨대 덱스트린 또는 덱스트란.
비-이온성 계면활성제 또는 세제 ("습윤제"라고도 알려짐)는 치료제를 용해시키는데 도움을 줄 뿐만 아니라 치료 단백질을 교반-유도 응집으로부터 보호하는데 사용될 수 있으며, 또한 활성 치료 단백질 또는 항체를 변성시키지 않고도 이를 전단 표면 응력에 노출될 수 있게 한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 농도 범위로 존재할 수 있다.
적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON® 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에티르 (TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소첨가 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀루오스, 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용할 수 있는 음이온성 세제는 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 술포숙시네이트 및 디옥틸 소듐 술포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토늄 클로라이드를 포함한다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 매개변수의 함수, 특히 사용되는 투여 방식, 관련 병리 또는 대안적으로 원하는 치료 지속기간의 함수로서 조정될 수 있다. 약제학적 조성물을 제조하기 위하여, 유효량의 상기 항체 또는 항체 단편을 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 배지에 용해시키거나, 분산시킬 수 있다.
주사 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산제; 참깨유, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함한 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산제의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균되어야 하고, 용이하게 주사될 수 있을 정도의 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
자유 염기 또는 약제학적으로 허용가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은, 적합하게는 계면활성제와 혼합된 물 중에 제조될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 내에, 및 오일 내에 분산시켜 제조할 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 보존제를 함유하여 미생물의 성장을 방지한다.
항체 또는 항체 단편은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 (단백질의 자유 아미노 기에 의해 형성된) 산 첨가염을 포함하는데, 이는 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된다. 자유 카르복실 기로부터 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화제2철, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로캐인(procaine) 등으로부터 유래할 수도 있다.
담체는 또한 용매, 또는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 적합한 이들의 혼합물, 및 식물유를 함유한 분산 배지일 수도 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 예방 작용은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티머로살(thimerosal) 등에 의해 일어날 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 조성물의 흡수성 지속은 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물을 사용할 때 일어날 수 있다.
멸균 주사 용액은 적절한 용매 중 필요량의 활성 화합물을 상기 나열된 다른 성분들 중 하나 이상과 혼입시킨 후, 필요하다면 여과 멸균하여 제조한다. 일반적으로, 분산제는 다양한 멸균 활성 성분을, 염기성 분산 배지 및 상기 나열된 것들 중 필요한 다른 성분을 함유한 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 얻는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
더욱 많거나 더욱 농축된 직접 주사용 용액을 제조하는 것도 또한 고려되는데, 이 경우 극히 신속하게 침투하여 고농도의 활성제를 작은 종양 부위에 전달하기 위해, 용매로서 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 사용하는 것도 구상된다.
제형화할 때, 용액은 투여 제형와 양립가능한 방식으로 치료 유효량으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 제형, 예컨대 상기 기재된 주사 용액의 유형으로 용이하게 투여되나, 약물 방출 캡슐 등도 또한 이용할 수 있다.
수용액에서 비경구성 투여를 위해서는, 예를 들어, 상기 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스에 의해 등장화된다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용할 수 있는 멸균 수성 배지는 본 개시내용에 비추어 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다. 예를 들어, 하나의 복용량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시켜서, 1000 ml의 피하주입액(hypodermoclysis fluid)에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15 판, 페이지 1035-1038 및 1570-1580] 참고). 치료되는 대상체의 상태에 따라 투여량이 필수적으로 일부 변동될 수 있다. 어떠한 경우에도, 투여를 담당하는 사람이 개별 대상체에게 적절한 용량을 결정할 것이다.
항체 또는 항체 단편은 용량당 약 0.0001 내지 10.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 5 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 1 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 약 10 밀리그램을 전달하도록 치료 혼합물 내에서 제형화될 수 있다. 다중 용량은 선택된 시간 간격으로 투여될 수도 있다.
비경구성 투여용으로 제형화된 화합물, 예컨대 정맥내 또는 근육내 주사 외에, 다른 약제학적으로 서용가능한 형태는 예를 들어 정제 또는 경구 투여용 다른 고체; 지속 방출형 캡슐; 및 현재 사용된 임의의 다른 형태를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 항체 단편을 숙주 세포에 도입하기 위한 리포좀 및/또는 나노 입자의 사용이 고려된다. 리포좀 및/또는 나노 입자의 형성과 사용은 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다.
나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내에 중합체를 과다 로딩하여 발생한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자(약 0.1 μm 크기)는 일반적으로 생체 내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 디자인된다. 이러한 요건을 만족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노 입자가 본 발명의 사용을 위해 고려되고, 이러한 입자가 쉽게 만들어질 수 있다.
리포좀은 수성 배지에 분산되어, 자발적으로 다중 라멜라 동심원 이중층 비히클 (다중 라멜라 비히클 (MLV)이라고도 명명됨)을 생성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV에 초음파를 처리하면, 코어 내에 수용액을 함유한 직경 200 내지 500 Å범위의 작은 단일 라멜라 비히클(SUV)이 형성된다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
본원에 기재된 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 함유한 약제학적 제형은, 원하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체 또는 항체 단편을 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 동결 건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 이용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탈올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 예시적인 약제학적으로 허용가능한 담체는 간질(interstitial) 약물 분산제, 예컨대 용해성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 용해성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)를 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 특정 예시적인 sHASEGP 및 이의 사용 방법은, 미국 특허 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결 건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 WO 2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 징후(indication)에 필요하다면 하나 초과의 활성 성분을 함유할 수도 있다. 바람직하게는, 서로 역 효과를 미치지 않는 보완적인 활성을 갖는 성분들은, 단일 제형으로 조합될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA4 항체, 본 발명의 항체 단편 또는 면역접합체 외에, EGFR 길항제 (예컨대, 에를로티닙(erlotinib)), 항-혈관 생성제 (예컨대, 항-VEGF 항체일 수 있는 VEGF 길항제) 또는 화학치료제 (예컨대, 탁소이드 또는 백금 제제)를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도한 목적에 효과적인 양으로 조합하여 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이트화(coacervation) 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐은 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 미세에멀전, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 거대 에멀전이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체 또는 항체 단편을 함유한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하는데, 상기 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태일 수 있다.
생체 내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-Axl 항체 또는 항체 단편 또는 면역접합체가 치료 방법에 사용될 수 있다. 한 양태에서, 약제로 사용하기 위한 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체가 제공된다. 추가 측면에서, 암 (예를 들어, 유방암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 뇌암, 췌장, 뇌, 신장, 난소, 위, 백혈병, 자궁 자궁내막, 결장, 전립선, 갑상선, 간의 암, 골육종, 및/또는 흑색종)의 치료에 사용되는 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체이 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 암을 앓는 개체에게 유효량의 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-넥틴-4 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 장애), 심혈관 장애 (예를 들어, 죽상동맥경화증, 고혈압, 혈전증), 감염성 질환 (예를 들어, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스) 또는 당뇨병이 있는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-넥틴-4 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를을 제공하고, 상기 방법은 개체에서 유효량의 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, 염증성 사이토카인 분비 억제(예를 들어, 종양 관련 대식세포로부터), 종양 맥관구조(예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 관련 맥관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제에 사용하기 위한 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 개체에서 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, 염증성 사이토카인 분비 억제(예를 들어, 종양 연관 대식세포로부터), 종양 맥관구조 (예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 연관 맥관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제 방법에 사용하기 위한 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 제공하고, 상기 방법은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, 염증성 사이토카인 분비 억제 (예를 들어, 종양 연관 대식세포로부터), 종양 맥관구조 (예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 연관 맥관구조) 발달 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제를 위해 개체에서 유효량의 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체 투여하는 것을 포함한다 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 준비에서의 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체의 용도를 제공한다. 약제는 암 (일부 구현예에서, 유방암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 뇌암, 췌장, 뇌, 신장, 난소, 위, 백혈병, 자궁 자궁내막, 결장, 전립선, 갑상선, 간의 암, 골육종, 및/또는 흑색종)의 치료를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 암을 앓는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 장애), 심혈관 장애 (예를 들어, 죽상동맥경화증, 고혈압, 혈전증), 감염성 질환 (예를 들어, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스) 또는 당뇨병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은 개체에서 유효량의 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 약제는 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, 염증성 사이토카인 분비 억제(예를 들어, 종양 연관 대식세포로부터), 종양 맥관구조 (예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 연관 맥관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제를 위한 것이다. 추가 구현예에서, 약제는 개체에서 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, 염증성 사이토카인 분비 억제(예를 들어, 종양 연관 대식세포로부터), 종양 맥관구조 (예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 연관 맥관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 촉진, 염증성 사이토카인 섹션 (예를 들어, 종양 연관 대식세포로부터) 유도, 종양 맥관구조 (예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 연관 맥관구조) 발달 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제를 위해 유효량의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 방법은 이러한 암을 갖는 개체에게 유효량의 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
Axl은 TYRO3, Axl 및 MER을 포함하여 밀접하게 관련된 수용체의 하위 계열에 속하는 140 kDa 세포 표면 막관통 수용체 단백질 티로신 키나아제이다 (TAM; Lai 1991; O'Bryan 1991). TAM 활성화 및 신호전달은 세포 생존, 증식, 이동 및 접착을 포함하는 다중 세포 반응과 관련되어 있다(Hafizi 2006). Axl은 원래 만성 골수성 백혈병 환자의 종양유전자로 확인되었으며, 과발현되면 변환 잠재력을 나타낸다(Janssen 1991; O'Bryan 1991). Axl 과발현은 다양한 인간 암에서 보고되었으며(Craven 1995; Ito 1999; Berclaz 2001; Sun 2004; Shieh 2005), 그리고 폐 (Shieh 2005), 전립선 (Sainaghi 2005), 유방 (Meric 2002), 및 위암 (Wu 2002) 뿐만 아니라 신장 세포 암종 (Chung 2003) 및 교모세포종 (Hutterer 2008)에서의 침습 및 전이와 관련된다.
최근 연구에서는 '티로신 키나제 스위치'를 통한 Axl 과발현이 위장관 간질 종양에서 이마티닙에 대한 내성을 유발한다는 것을 보여주었다(Mahadevan 2007). Axl 발현은 화학요법 약물에 의해 유도되고 Axl의 과발현은 급성 골수성 백혈병에서 약물 내성을 부여한다(Hong 2008). Axl은 또한 내피 세포 이동 및 관 형성을 조절하는 것으로 나타났다(Holland 2005). 이러한 결과는 Axl이 종양형성의 여러 양태를 조절하는 데 관여할 수 있음을 시사한다.
Axl을 발현하는 고형 종양 유형은 몇 가지 이유로 관심을 끌고 있다. 이러한 각 질환에 대한 새로운 치료 옵션에 대한 미충족 수요가 높다. 전임상 데이터는 Axl을 표적으로 삼는 것이 NSCLC 및 흑색종과 같은 다양한 종양 유형에서 항종양 활성을 초래할 수 있음을 시사한다. Axl-ADC의 제안된 메커니즘 및 기본 생물학과 함께 이러한 악성종양에서 항종양 활성이 예상된다. Axl은 예를 들어 평활근육종, 유잉 육종 및 지방육종의 공격적 하위 유형을 포함하여 수많은 인간 육종에서 고도로 발현되고 활성화된다(2015년 5월; Fleuren 2014; Dantas-Barbosa 2017). 평활근육종(LMS)은 성인 육종의 15%를 차지하며 전이 단계에서 치료하기 어려운 상태로 남아 있다. TYRO3 및 Axl을 포함한 TAM 수용체와 이들의 리간드는 LMS를 비롯한 여러 악성 종양에서 과발현되거나 활성화된다. LMS 환자, 특히 전이가 발생한 환자는 더 높은 수준의 TYRO3 및 GAS6를 발현한다. 크리조티닙 및 포레티닙은 TYRO3 및 Axl 비활성화를 통해 LMS에서 효과적인 항종양 활성을 나타냈으며, 이는 TYRO3 및 Axl 억제제를 사용한 임상 시험이 진행성 LMS에서 보장됨을 나타낸다. 이러한 데이터는 Axl이 Axl을 발현하는 육종에서 잠재적인 새로운 치료 표적임을 시사한다.
특히 PD-1 차단 형태의 면역 요법은 지난 10년 동안 혁신적인 종양 요법으로 부상하였다. 최근 SARC028 연구(Petitprez 2020)에서, 조사 중인 PD-1 억제제에 반응한 미분화 다형성 육종 환자의 대부분(75%)이 PD-1 억제제와의 병용 치료를 제안하는 PD-L1 양성 종양을 가지고 있었다. 면역 바이오마커의 발현은 육종 하위유형에 따라 다르며 면역 요법에 대한 반응과 연관될 수 있다(Petitprez 2020). 면역 세포는 지방육종을 탈분화시키고 다형성 육종을 미분화시켰다. 림프구 침윤 및 3차 림프양 구조가 있는 육종은 관문 억제제 니볼루맙에 반응하는 것으로 나타났다(Petitprez 2020). 이와 함께, PD-1 억제제를 병용하면 염증성 연조직 육종 환자에게 더 나은 결과를 제공할 수 있음을 시사한다. 소아 육종 환자의 경우 BA3011로 치료하면 발달, 골격 또는 생식선 결함이 발생할 것으로 예상되지 않는다. Axl 녹아웃 대립유전자에 대해 동형접합성인 마우스는 명백히 정상적인 표현형을 나타낸다(Lu 1999).
본 발명의 이러한 양태에서, Axl 발현 종양을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 항-Axl 항체 또는 항체 단편, 또는 본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, Axl 발현 종양을 치료하는 방법은 선택적으로 화학요법제, 방사성 원자, 세포증식억제제 및 세포독성제로부터 선택된 제제에 접합된, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 면역접합체는 조건부 활성 생물제제(CAB) 항-Axl 항체가 절단 가능한 링커(CAB-Axl-ADC)를 통해 하나 이상의 약물 모이어티에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다. 예를 들어, CAB-Axl-ADC는 mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)이고, 여기서 약물 모이어티는 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)이고, (n)은 1 내지 4(포함)의 정수이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 21일마다 1일차와 8일차 또는 14일마다 1일차와 8일차에 21일마다 1회 또는 2회 투여되는 약 0.3 mg/kg 내지 약 2.0 mg/kg의 용량에서 mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)(여기서 약물 모이어티는 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)이고, 1 내지 4(포함)의 정수임)와 같은 CAB-Axl-ADC를 사용한 치료 레지멘을 제공한다. 이러한 치료 레지멘은은 이러한 용량 및 이러한 간격으로 투여되는 본 발명의 항체-약물 접합체가 놀라울 정도로 높은 반응률 및 허용가능한 독성 또는 내약성 프로파일을 제공하기 때문에 놀라울 정도로 효과적이다. 따라서, 본 방법은 대상체에게 CAB-Axl-ADC 항체-약물 접합체를 투여하기 위한 투약 레지멘(dosing regimen)을 제공한다. 일부 구현예에서, 투약 레지멘은 다른 투약 레지멘과 비교하여 대상체의 치료 반응 확률을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 투약 레지멘은 다른 투약 레지멘과 비교하여 (독성을 제한하는 용량을 포함하는) 부작용을 겪을 대상체의 확률을 증가시키지 않는다. 본 발명은 또한 투약 레지멘에 따른 유지 요법을 제공한다.
특정 구현예에서, mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)는 21일마다 1회 또는 2회, 21일마다 1일차 및 8일차, 또는 14일마다 1일차 및 8일차에 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.8 mg/kg의 용량으로 투여된다. 바람직하게는, mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)는 21일마다 1회 또는 2회, 21일마다 1일차 및 8일차, 또는 14일마다 1일차 및 8일차에 약 0.8 mg/kg 내지 약 1.8 mg/kg의 용량으로 투여된다.
본 발명의 mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)과 같은 CAB-Axl-ADC는 상이한 질환 및 조직과 관련된 정의된 생리학적 조건 하에서 우선적으로 결합한다. 예를 들어, 암에서, Warburg가 설명한 고유한 세포 대사는 낮은 pH 및 높은 락테이트와 같은 특징적인 미세 환경에 기여한다(Warburg 1924; Warburg 1956). 본 발명의 mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)는 고유한 TME를 이용하고 Axl을 발현하는 종양에 근접할 때 그의 표적에 선택적으로 결합한다. mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)의 활성화된 결합 특성은 가역적이어서, 병든 조직 미세 환경에서 정상 조직으로 전환될 때 영구적인 변화가 없다. 특히, mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n)는 이러한 특성을 달성하기 위해 비-항체 서열을 추가하지 않고 인간화 mAb(BA3011)를 포함한다.
특정 양태에서, Axl 발현 종양을 치료하는 방법은 mAbBA301-절단 가능한 링커-MMAE(n)를 Axl 발현 종양의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 mAbBA301는 서열번호 14의 hcCDR1, 서열번호 15의 hcCDR2 및 서열번호 16의 hcCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 lcCDR1, 서열번호 18의 lcCDR2, 및 서열번호 19의 lcCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편이고; MMAE는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이고, 그리고 (n)은 1 내지 4(포함)의 정수이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 유용한 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약제학적 조성물에 존재한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편 또는 면역접합체는 Axl 발현 종양을 진단하거나 치료하기 위한 사용 설명서와 함께 키트에 포함된다.
또 다른 구현예에서, Axl 발현 종양을 치료하는 방법은 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 mAbBA301-절단가능한 링커-MMAE(n) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 약제학적 조성물은 정맥내 주입에 의해 21일마다 1일차 및 8일차에 1.8 mg/인간 대상체 체중 kg의 용량으로 투여된다. mAbBA301은 서열번호 14의 hcCDR1, 서열번호 15의 hcCDR2 및 서열번호 16의 hcCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 lcCDR1, 서열번호 18의 lcCDR2, 및 서열번호 19의 lcCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편이고; 그리고 (n)은 1 내지 4(포함)의 정수이고, 바람직하게는, (n)은 4이다.
특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 20을 포함하고 mAbBA301의 경쇄 가변 영역은 서열번호 21을 포함한다.
다른 구현예에서, 절단 가능한 링커는 mc-vc-PAB이다.
특정 구현예에서, Axl 발현 종양은 육종, 선암종 또는 비-소세포 폐암이다. 바람직하게는 Axl 발현 종양은 육종이다.
특정 구현예에서, 방법은 프로그래밍된 사멸 수용체-1(PD-1) 차단 항체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, Axl 발현 종양은 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 또는 적어도 95의 종양 막 P 점수를 갖는다. 바람직하게는, Axl 발현 종양은 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 또는 적어도 95의 종양 막 P 점수를 갖는다.
특정 구현예에서, 방법은 과립구 콜로니 자극 인자 또는 그의 유사체를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 6.0의 pH를 가지며, 20 mM 히스티딘-HCl, 70 mg/mL 수크로스 및 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 면역 장애 (예를 들어, 자가면역 장애), 심혈관 장애 (예를 들어, 죽상동맥경화증, 고혈압, 혈전증), 감염성 질환 (예를 들어, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스) 또는 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 이러한 구현예에서, 방법은 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 개체에서 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 억제, 염증성 사이토카인 분비 억제(예를 들어, 종양 연관 대식세포로부터), 종양 맥관구조 (예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 연관 맥관구조) 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 방법은 혈관신생 억제, 세포 증식 억제, 면역 기능 촉진, 염증성 사이토카인 섹션 (예를 들어, 종양 연관 대식세포로부터) 유도, 종양 맥관구조 (예를 들어, 종양내 맥관구조 또는 종양 연관 맥관구조) 발달 억제, 및/또는 종양 기질 기능 억제를 위해 유효량의 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, "개체"는 인간이다.
추가 양태에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 제공된 항-Axl 항체 또는 항체 단편 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 한 구현예에서, 약제학적 제형은 본 명세서에 제공된 항-Axl 항체 또는 항체 단편 중 임의의 것 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 제형은 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같이 본 명세서에 제공된 항-Axl 항체 또는 항체 단편 중 임의의 것 및 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함한다.
상기 기재된 각각의 모든 치료에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 치료 시 면역접합체로서 단독으로, 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 병용-투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 항-혈관 생성제이다. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 VEGF 길항제 (일부 구현예에서, 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맙(bevacizumab))이다. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 EGFR 길항제 (일부 구현예에서는, 에를로티닙)이다. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 화학치료제 및/또는 세포 증식 억제제이다. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 탁소이드 (예를 들어, 파클리탁셀) 및/또는 백금 제제 (예를 들어, 카보플레티넘)이다. 특정 구현예에서, 추가적인 치료제는 환자의 면역성 또는 면역계를 향상시키는 제제이다.
상기 기재된 이러한 병용 치료제는 병용 투여 (2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제형에 포함된 경우) 및 개별 투여를 포괄하며, 개별 투여의 경우 항체 또는 항체 단편의 투여는 추가적인 치료제 및/또는 어주번트의 투여 전에, 이와 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있다. 항체 또는 항체 단편는 또한 방사선 치료와 조합하여 사용될 수도 있다.
항체 또는 항체 단편은 양호한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고,복용되고, 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 고려 요인은 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유류, 개별 환자의 임상적인 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료진에게 알려진 다른 요인을 포함한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 궁금한 장애의 예방 또는 치료에 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화될 필요는 없지만, 선택적으로 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체 또는 항체 단편의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 동일한 투여량으로 본원에 기재된 투여 경로를 통해 사용되거나, 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 경험적으로/임상적으로 적절하다고 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체 또는 항체 단편의 적절한 투여량은 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 조합하여 사용될 때), 치료될 질환의 유형, 항체 또는 항체 단편의 유형, 상기 항체 또는 항체 단편이 예방 목적으로 투여되든 치료 목적으로 투여되든 질환의 심각성과 경과, 이전 치료제, 환자의 임상 이력 및 상기 항체 또는 항체 단편에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 다를 것이다. 상기 항체 또는 항체 단편은 환자에게 한번에 또는 일련의 치료 기간에 걸쳐 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1μg/kg 내지 40mg/kg의 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 1회 이상의 개별 투여 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 복용량일 수 있다. 하나의 일반적인 일일 복용량은 위에서 언급한 요인에 따라 약 1 μg/kg에서 100 mg/kg 이상 범위일 수 있다. 며칠 또는 그 이상의 반복 투여 시, 상태에 따라서 치료는 일반적으로 질환 증상이 원하는 만큼 억제될 때까지 지속될 것이다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3 주마다 투여될 수 있어서 (예를 들어, 환자는 약 2회 내지 약 20회 용량, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체 또는 항체 단편을 투여받는다). 처음에 고 부하 용량으로 투여된 후, 1회 이상의 저 용량으로 투여될 수도 있다. 그러나, 다른 투여량의 요법도 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 종래의 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링할 수 있다.
상기 임의의 제형 또는 치료 방법은 항-Axl 항체 대신 또는 항-Axl 항체 외에, 본 발명의 항체 단편 또는 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있다고 이해된다.
종양을 퇴치하기 위해 숙주의 면역 기능을 강화시키는 것은 점점 더 많은 관심을 받고 있는 대상체이다. 기존의 방법에는 (i) APC 강화, 예를 들어 (a) 외래 MHC 동종항원을 인코딩하는 DNA를 종양에 주입하거나 (b) 면역 항원 인식 가능성을 증가시키는 유전자(예를 들어, 면역 자극 사이토카인, GM-CSF, 종양의 동시자극 분자 B7.1, B7.2), (iii) 입양 세포 면역요법, 또는 활성화된 종양 특이적 T-세포로의 치료. 입양 세포성 면역 치료는 종양-침윤성 숙주 T-림프구를 분리하는 단계, 그 집단을 예컨대 IL-2 또는 종양 또는 둘 다에 의한 자극을 통해 시험관 내에서 확장시키는 단계를 포함한다. 추가로, 기능 부전인 단리된 T-세포도 또한 본 발명의 항-PD-Ll 항체의 시험관 내 적용을 통해 재활성화될 수 있다 이렇게-활성화된 T-세포는 이후 숙주에게 재투여될 수 있다. 이러한 방법 중 하나 이상은 항체, 본 발명의 항체 단편 또는 면역접합체의 투여와 조합하여 사용될 수 있다.
암에 대한 전통적인 치료는 이하를 포함한다: (i) 방사선 치료 (예를 들어, 방사선 치료, X-선 치료, 조사(irradiation)), 또는 암 세포를 사멸시키고 종양을 위축시키는 전리 방사선의 사용. 방사선 치료는 외부 빔 방사선 치료 (EBRT)를 통해 외부에서 투여되거나, 또는 근접 치료(brachytherapy)를 통해 내부에서 투여될 수 있다; (ii) 화학 치료, 또는 일반적으로 빠르게 분열하는 세포에 영향을 줄 수 있는 세포 독성 약물의 적용; (iii) 표적 치료, 또는 특히 암 세포의 조절되지 않는 단백질에 영향을 미치는 제제 (예를 들어, 티로신 키나제 저해제인 이마티닙(imatinib), 게피티닙(gefitinib); 단일 클론 항체, 광역학 치료(photodynamic therapy)); (iv) 면역치료, 또는 숙주의 면역 반응의 향상(예를 들어, 백신); (v) (예를 들어, 종양이 호르몬 민감성일 때) 호르몬 치료, 또는 호르몬의 차단, (vi) 혈관 생성 저해제, 또는 혈관 형성 및 성장의 차단, 및 (vii) 완화 치료, 또는 통증, 메스꺼움, 구토, 설사 및 출혈을 감소시키기 위한 케어의 품질을 개선시키는 것과 관련된 치료. 진통제, 예컨대 모르핀 및 옥시코돈(oxycodone), 항-구토제, 예컨대 온단세트론(ondansetron) 및 아프레피탄트(aprepitant)를 사용하면, 더욱 공격적인 치료 요법이 가능해진다.
암 치료에서, 암 면역의 치료를 위한 이전에 설명된 임의의 종래의 치료제는 항-Axl 항체 또는 항체 단편의 투여 이전, 이후, 또는 상기 투여와 동시에 수행될 수 있다. 추가로, 상기 항-Axl 항체 또는 항체 단편은 종래의 암 치료, 예컨대 종양-결합 항체 (예를 들어, 단일 클론 항체, 독소-접합된 단일 클론 항체)의 투여 및/또는 화학치료제의 투여 이전, 이후, 또는 상기 투여와 동시에 투여될 수 있다.
투약 레지멘
본 발명은 Axl 발현 종양의 치료를 위한 투약 레지멘을 제공한다. 투약 레지멘은 적어도 2주 (예를 들어, 14일 기간) 또는 3주 기간 (예를 들어, 21일 기간) 동안 약 0.3 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 0.4 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.5 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.9 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.0 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.1 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.2 mg/체중 kg 내지 약 1.3 mg/체중 kg, 0.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.4 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.5 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 또는 1.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-Axl 항체 또는 항체 단편 또는 본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체의 용량을 포함한다. 보다 바람직하게는 적어도 2주(예를 들어, 14일 기간) 또는 3주 기간(예를 들어, 21일 기간) 동안 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg. 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 투약 레지멘은 적어도 2주 (예를 들어, 14일 기간) 또는 3주 기간 (예를 들어, 21일 기간) 동안 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 면역접합체의 용량을 포함한다. 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 투약 레지멘은 적어도 2주 (예를 들어, 14일 기간) 또는 3주 기간 (예를 들어, 21일 기간) 동안 약 0.3 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 0.4 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.5 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.9 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.0 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.1 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.2 mg/체중 kg 내지 약 1.3 mg/체중 kg, 0.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.4 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.5 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 또는 1.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체-약물 접합체의 용량을 포함한다. 보다 바람직하게는 적어도 2주(예를 들어, 14일 기간) 또는 3주 기간(예를 들어, 21일 기간) 동안 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg. 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 투약 레지멘은 적어도 2주 (예를 들어, 14일 기간) 또는 3주 기간 (예를 들어, 21일 기간) 동안 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체-약물 접합체의 용량을 포함한다. 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 매주 용량은 적어도 1회의 2주(예를 들어, 14일) 치료 주기 동안 또는 적어도 1회의 3주(예를 들어, 21일) 치료 주기 동안 분할 전달 또는 단일 매주 용량으로서 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 14일 치료 주기의 1일차 및 8일차에 단일 매주 용량으로 투여될 것이다. 바람직하게는, 매주 용량은 분할 전달로서 또는 단일 매주 용량으로서 2회 이상의 14일 치료 주기 동안, 훨씬 더 바람직하게는 3회 이상, 4회 이상, 5회 또는 심지어 6회 이상의 치료 주기 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 매주 용량은 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 또는 6회 이하의 치료 주기 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 21일 치료 주기의 1일차 및 8일차에 단일 매주 용량으로 투여될 것이다. 바람직하게는, 매주 용량은 분할 전달로서 또는 단일 매주 용량으로서 2회 이상의 21일 치료 주기 동안, 훨씬 더 바람직하게는 3회 이상, 4회 이상, 5회 또는 심지어 6회 이상의 치료 주기 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 매주 용량은 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 또는 6회 이하의 치료 주기 동안 투여된다. 바람직하게는 치료 주기 사이에 휴지 기간이 있을 것이다.
예를 들어, 일부 바람직한 구현예에서, 투약 레지멘은 각 치료 주기 사이에 1주의 휴지 기간을 두고 최소 2회의 치료 주기 동안 약 0.3 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 0.4 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.5 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.9 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.0 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.1 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.2 mg/체중 kg 내지 약 1.3 mg/체중 kg, 0.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.4 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.5 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 1.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 또는 1.7 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의, 항체-약물 접합체의 총 매주 용량일 것이다. 일부 구현예에서, 치료 주기는 14일보다 길 것이다. 일부 구현예에서, 치료는 21일보다 길 것이다. 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여될 수 있다.
예를 들어, 일부 바람직한 구현예에서, 투약 레지멘은 각 치료 주기 사이에 1주의 휴지 기간을 두고 최소 2회의 치료 주기 동안 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의, 항체-약물 접합체의 총 매주 용량일 것이다. 일부 구현예에서, 치료 주기는 14일보다 길 것이다. 일부 구현예에서, 치료 주기는 14일보다 길 것이다. 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 0.8 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 0.9 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.0 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.1 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.2 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.3 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.4 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.5 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.6 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.7 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 단일 매주 용량(주 1회) 또는 분할 전달(예를 들어, 주당 2회 이상)로 투여되는 약 1.8 mg/체중 kg일 것이다. 일부 구현예에서, 항체 약물 접합체의 매주 용량은 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 1.8 mg//대상체의 체중 kg일 것이다.
2주(14일 기간) 치료 주기와 치료 주기 사이에 1주 휴지 기간은 3주(21일) 치료 주기라고도 할 수 있으며, 3 주 치료 주기에서 3주 중 2주에 항체-약물 접합체가 전달된다. 마찬가지로, 3주(21일 기간) 치료 주기와 치료 주기 사이에 1주 휴지 기간은 4주(28일) 치료 주기라고도 할 수 있으며, 4 주 치료 주기에서 4주 중 3주에 항체-약물 접합체가 전달된다. 따라서, 일부 구현예에서, 용량은 3주의 치료 주기에서 3주 중 2주에 분할 전달 또는 단일 매주 용량으로서 매주 투여되거나, 용량은 4주 치료 주기에서 4주 중 3주에 분할 전달 또는 단일 매주 용량으로 매주 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 21일 치료 주기의 1일차 및 8일차에 단일 매주 용량으로 투여되거나, 용량은 28일 치료 주기의 1일차 및 8일차에 단일 매주 용량으로 투여될 것이다. 바람직하게는, 매주 용량은 분할 전달로서 또는 단일 매주 용량으로서 2회 이상의 4주 치료 주기 동안, 훨씬 더 바람직하게는 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 또는 심지어 6회 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 연속 치료 주기)의 치료 주기 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 매주 용량은 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하, 또는 6회 이하의 치료 주기 동안 투여된다. 예를 들어, 일부 바람직한 구현예에서, 투약 레지멘은 적어도 2회의 3주 치료 주기 동안 3주 중 2주 동안 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의 항체-약물 접합체의 총 매주 용량 동안 분할 전달로서 또는 단일 매주 용량으로 매주 용량일 것이다. 예를 들어, 일부 바람직한 구현예에서, 투약 레지멘은 적어도 2회의 4주 치료 주기 동안 4주 중 3주 동안 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의 항체-약물 접합체의 총 매주 용량 동안 분할 전달로서 또는 단일 매주 용량으로 매주 용량일 것이다.
일부 바람직한 구현예에서, 일부 바람직한 구현예에서, 투약 레지멘은 1주, 2주, 3주, 4주 또는 5주 치료 주기 (예를 들어, 6주 기간 동안 4회 단일 매주 용량, 9주 기간 동안 6회 단일 매주 용량, 12주 기간 동안 8회 단일 매주 용량) 동안 3주 중 2주 동안 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의 항체-약물 접합체의 총 매주 용량 동안 분할 전달로서 또는 단일 매주 용량으로 매주 용량일 것이다.
일부 바람직한 구현예에서, 일부 바람직한 구현예에서, 투약 레지멘은 1주, 2주, 3주, 4주 또는 5주 치료 주기 (예를 들어, 8주 기간 동안 6회 단일 매주 용량, 12주 기간 동안 9회 단일 매주 용량, 16주 기간 동안 12회 단일 매주 용량) 동안 4주 중 3주 동안 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의 항체-약물 접합체의 총 매주 용량 동안 분할 전달로서 또는 단일 매주 용량으로 매주 용량일 것이다.
하나 이상의 치료 주기 후 또는 동안(예를 들어, 제2 치료 주기의 14일차 내지 21일차 동안 또는 제2 치료 주기의 21일차 내지 28일차 동안), 대상체를 평가하여(예를 들어, 임상 또는 진단 테스트를 통해) 대상체가 치료 일정을 유지해야 하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 28일 치료 주기(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회의 28일 치료 주기) 후 또는 동안에 대상체를 평가할 수 있다(예를 들어, 임상 및/또는 진단 평가). 평가에 따라, 대상체는 치료를 중단하거나 추가 치료 주기로 치료를 계속하거나 유지 요법을 시작할 것이다. 대상체가 치료를 계속하는 경우, 대상체는 하나 이상의 추가 치료 주기에 따라 추가로 평가될 수 있다. 각각의 연속적인 평가에 따라, 대상체는 치료를 중단하거나 추가 치료 주기로 치료를 계속하거나 유지 요법을 시작할 것이다.
본 발명은 대상체가 검출가능한 암이 없다는 것을 나타내는 평가 후, 예를 들어, CD30 발현 암에 대해 음성인 진단 테스트 후, 대상체가 매주 치료 주기(예를 들어, 2주 치료 주기 또는 3주 치료 주기)에 남아 있는 구현예를 포괄한다 (즉, 진단 테스트는 대상체에서 어떤 암도 감지할 수 없다). 예를 들어, 일부 구현예에서, 대상체는 이러한 평가 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상의 치료 주기 동안 매주 치료 주기를 유지할 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 2회 이상 3회 이하, 4회 이하, 5회 이하 또는 6회 이하의 치료 주기 동안 매주 치료 주기를 유지할 것이다. 암의 존재와 중증도를 결정하는 데 사용되는 진단 테스트의 한 예는 양전자 방출 단층 촬영(PET)이다.
일부 구현예에서, 대상체는 1회 이상, 바람직하게는 2회 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회) 치료 주기(예를 들어, 4주 치료 주기) 후에 유지 요법을 시작할 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 암이 거의 또는 전혀 검출되지 않는다는 것을 나타내는 평가 후에, 예를 들어 대상체가 완전한 반응을 가졌다는 것을 나타내는 평가 후에 유지 요법을 시작할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 유지 요법은 항체-약물 접합체를 사용하지만 동일하거나 상이한 복용량으로 감소된 투여 일정으로 요법을 의미한다. 유지 요법 동안, 항체-약물 결합체는 바람직하게는 적어도 매2주 치료 기간에 1회, 매3주 치료 기간에, 1회, 매2주 치료 기간의 1일차 및 8일차 또는 매3주 치료 기간의 1일차 및 8일차에 투여된다. 이들 유지 요법 주기 후에, 대상체가 유지 요법을 유지해야 하는지, 규칙적 치료를 계속해야 하는지 또는 치료를 중단해야 하는지를 결정하기 위해 대상체를 추가로 평가할 수 있다(예를 들어, 임상 또는 진단 테스트를 통해). 일부 구현예에서, 유지 요법은 2주 내지 4주마다, 또는 3주 내지 6주마다 1회일 것이다. 유지 요법 동안 투여되는 항체 약물 접합체의 복용량은 예를 들어 용량당 약 0.3 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 바람직하게는 약 0.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 바람직하게는 약 1.2 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 더 바람직하게는 약 1 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의 범위일 수 있고, 1.8 mg/kg은 예시적인 용량이다.
일부 구현예에서, 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 더 바람직하게는 복용량 of 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg의 항체 약물 접합체의 복용량으로 매주 치료 및 평가의 결론 후에, 대상체는 약 0.3 mg/체중 kg 내지 약 2 mg/체중 kg, 바람직하게는 약 0.6 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg, 바람직하게는 약 1.2 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg의 복용량으로 2 내지 4주마다 1회 또는 3 내지 6주마다 1회 항체-약물 접합체의 투여를 포함하는 유지 요법을 시작할 것고, 약 1.8 mg/kg이 바람직하다. 일부 구현예에서, 매주 치료 종료 후(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5회 치료 주기 동안), 대상체는 약 0.4 mg/체중 kg 내지 약 2 mg/체중 kg, 약 0.6 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 또는 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의 복용량으로 항체 약물 접합체의 2주마다 1회 투여 일정(예를 들어, 2주 유지 요법 주기의 1일차 치료)을 시작할 것이고, 약 1.8 mg/kg이 바람직하다. 일부 구현예에서, 매주 치료 종료 후(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5회 치료 주기 동안), 대상체는 약 0.4 mg/체중 kg 내지 약 2 mg/체중 kg, 약 0.6 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 또는 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의 복용량으로 항체 약물 접합체의 3주마다 1회 투여 일정(예를 들어, 3주 유지 요법 주기의 1일차 치료)을 시작할 것이고, 약 1.8 mg/kg이 바람직하다.
본 발명은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회의 21일 치료 주기 동안, 3주 중 2주 동안 약 0.8 mg/대상체의 체중 내지 kg 약 1.8 mg/kg of 대상체의 체중, 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의 총 주당 투여량에 대해 항체 약물 접합체의 분할 전달 또는 단일 매주 용량으로서 대상체에게 매주 용량을 투여하고, 2회 이상의 유지 요법 주기 동안 용량당 약 0.4 mg/체중 kg 내지 약 2 mg/체중 kg, 약 0.6 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 또는 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의 용량으로 항체 약물 접합체를 2주 내지 4주마다, 바람직하게는 2주마다 투여하는 구현예를 포괄한다. 일부 구현예에서, 매주 투여 주기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 치료 주기일 것이고 매2주 투여 일정은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 유지 요법 주기일 것이다. 일부 구현예에서, 매주 투여 주기는 2, 3, 4, 5 또는 6회 이하의 치료 주기일 것이다.
본 발명은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회의 28일 치료 주기 동안, 4주 중 3주 동안 약 0.8 mg/대상체의 체중 내지 kg 약 1.8 mg/kg of 대상체의 체중, 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.6 mg/체중 kg, 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.4 mg/체중 kg, 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.2 mg/체중 kg 또는 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.0 mg/체중 kg의 총 주당 투여량에 대해 항체 약물 접합체의 분할 전달 또는 단일 매주 용량으로서 대상체에게 매주 용량을 투여하고, 2회 이상의 유지 요법 주기 동안 용량당 약 0.4 mg/체중 kg 내지 약 2 mg/체중 kg, 약 0.6 mg/체중 kg 내지 약 2.0 mg/체중 kg, 또는 약 0.8 mg/체중 kg 내지 약 1.8 mg/체중 kg의 용량으로 항체 약물 접합체를 3주 내지 6주마다, 바람직하게는 3주마다 투여하는 구현예를 포괄한다. 일부 구현예에서, 매주 투여 주기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 치료 주기일 것이고 매3주 투여 일정은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 유지 요법 주기일 것이다. 일부 구현예에서, 매주 투여 주기는 2, 3, 4, 5 또는 6회 이하의 치료 주기일 것이다.
본 발명은 대상체가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 21일 치료 주기 동안 3주 중 2주(예를 들어, 21일 치료 주기의 1일차 및 8일차)에 약 0.8 mg/대상체의 체중 내지 kg 약 1.8 mg/kg의 총 매주 용량에서 항체 약물 접합체의 매주 용량으로, 분할 전달 또는 단일 주간 용량으로서 매주 용량으로 투여되고, 이후 2주에서 4주마다 용량을 투여하는 구현예를 포괄한다. 바람직하게는, 2회 이상의 유지 요법 주기 동안 약 1.8 mg/체중 kg의 용량으로 항체 약물 접합체의 매2주 용량 (예를 들어, 2주 이상의 2주 유지 요법 주기 동안 2주마다 약 1.8 mg/체중 kg의 용량). 바람직하게는, 2회 이상의 유지 요법 주기 동안 약 0.8 mg/체중 kg의 용량으로 항체 약물 접합체의 매2주 용량 (예를 들어, 2주 이상의 2주 유지 요법 주기 동안 2주마다 약 0.8 mg/체중 kg의 용량).
본 발명은 대상체가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 28일 치료 주기 동안 4주 중 3주(예를 들어, 28일 치료 주기의 1일차 및 8일차)에 약 0.8 mg/대상체의 체중 내지 kg 약 1.8 mg/kg의 총 매주 용량에서 항체 약물 접합체의 매주 용량으로, 분할 전달 또는 단일 주간 용량으로서 매주 용량으로 투여되고, 이후 3주에서 6주마다 용량을 투여하는 구현예를 포괄한다. 바람직하게는, 2회 이상의 유지 요법 주기 동안 약 1.8 mg/체중 kg의 용량으로 항체 약물 접합체의 매3주 용량 (예를 들어, 3회 이상의 2주 유지 요법 주기 동안 3주마다 약 1.8 mg/체중 kg의 용량). 바람직하게는, 2회 이상의 유지 요법 주기 동안 약 0.8 mg/체중 kg의 용량으로 항체 약물 접합체의 매3주 용량 (예를 들어, 3회 이상의 2주 유지 요법 주기 동안 3주마다 약 0.8 mg/체중 kg의 용량).
본 발명은 본 방법에 의해 치료될 대상체가 본 발명의 mAbBA301-절단 가능한 링커-MMAE(n) 항체-약물 접합체로 치료되지만 매주 투약 레지멘 이외의 일정으로 치료(예를 들어, 1회 이상의 2주 요법 주기 동안 2주마다, 또는 1회 이상의 3주 요법 주기 동안 3주마다 약 1.8 mg/체중 kg의 용량으로 항체 약물 접합체의 투여)되고, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 이하의 치료 주기 동안 본원에 기재된 바와 같은 매주 투약 레지멘으로 전환되는 구현예를 포괄한다. 매주 투약 레지멘 후, 환자는 선택적으로 본원에 기재된 유지 요법을 시작할 수 있다.
항체-약물 접합체는 바람직하게는 단일요법으로 투여된다. 용어 "단일요법"은 항체 약물 접합체가 치료 주기 동안 대상체에게 투여되는 유일한 항암제임을 의미한다. 그러나, 다른 치료제가 본원에 기재된 바와 같이 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 프로그래밍된 사멸 수용체-1(PD-1) 차단 항체 또는 과립구 콜로니 자극 인자 또는 이의 유사체. 추가로, 예를 들어 염증, 통증, 체중 감소 및 전반적인 권태감을 포함하는 기저 암 자체가 아니라 암과 관련된 증상을 치료하기 위해 암에 걸린 대상체에게 투여되는 항염증제 또는 기타 제제가 단일요법의 기간 동안 투여될 수 있다. 본 방법에 의해 치료되는 대상체는 바람직하게는 항체 약물 접합체의 투여 전에 항암제를 사용한 임의의 이전 치료를 완료할 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 항체 약물 접합체로의 치료 전 적어도 1주(바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)에 항암제로 임의의 사전 치료를 완료할 것이다. 대상체는 또한 바람직하게는 항체 약물 접합체를 사용한 첫 번째 치료 주기 완료 후 적어도 2주 (바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 동안 및 바람직하게는 항체 약물 접합체의 마지막 용량 완료 후 적어도 2주(바람직하게는 적어도 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 동안 임의의 추가 항암제로 치료받지 않을 것이다. 본 발명의 방법은 본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편 또는 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 Axl 발현 종양의 치료를 위한 대상체에게 투여한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-Axl 항체 또는 항체 단편을 포함하는 면역접합체를 대상체에게 투여하고 항-Axl 항체를 Axl 발현 종양 세포에 결합시킨 후, 항체-약물 접합체는 세포 내로 내재화되고, 약물이 방출된다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 Axl 발현 종양의 치료를 위해 대상체에게 mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n) 항체-약물 접합체를 투여하는 것을 포괄한다. 결합 후, mAbBA3011-절단 가능한 링커-MMAE(n) 항체-약물 접합체는 펩티드 링커가 프로테아제에 의해 절단되어 MMAE를 방출하는 종양 세포로 내재화된다. Axl을 발현하는 종양 세포에 특이적으로 MMAE를 전달하면 추가 종양 세포 증식을 방지하고 종양 수축을 초래할 것으로 예상된다.
본 발명의 방법으로 치료되는 대상체는 Axl 발현 암으로 진단되었거나 Axl 발현 암이 의심되는 대상체이다. 예를 들어, 조직 생검을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 진단할 수 있다.
제조 물품 및 키트
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상에 있거나 또는 상기 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 보틀, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기에는 조성물 그 자체, 또는 질환을 치료하고, 예방하고/거나 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 조합된 조성물이 담겨 있으며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 정맥 용액 주머니, 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있다). 조성물 내 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 항체 단편이다. 상기 라벨 또는 패키지 삽입물에는 상기 조성물이 선택한 질환의 치료에 사용된다고 표시되어 있다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 담긴 제1 용기로서, 여기에서 상기 조성물은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 제1 용기; 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기로서, 여기에서 상기 조성물은 세포 독성제 아니면 치료제를 추가로 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구현예에서, 제조 물품은 조성물을 사용하여 병태를 치료할 수 있다고 표시된 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약제학적으로-허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적인 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있는데, 여기에는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기가 포함된다.
상기 임의의 제조 물품은 항-Axl 항체 대신에 또는 그 외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
최종적으로, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나를 포함한 키트도 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 또는 항체 약물 접합체를 함유한 키트는, Axl 발현(증가 또는 감소)의 탐지, 또는 치료성 또는 진단성 검정에 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명의 키트는 고체 지지체, 예를 들어, 조직 배양액 플레이트 또는 비드 (예를 들어, 세파로스 비드)에 결합한 항체를 함유할 수 있다. 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 Axl을 시험관 내 탐지 및 정량화하는데 사용되는 항체를 함유한 키트도 제공될 수 있다. 탐지에 유용한 이러한 항체는 표지, 예컨대 형광 또는 방사능 표지와 함께 제공될 수 있다.
추가로 키트는 사용 설명서를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 설명서는 미국 식품 의약국이 요구한, 시험관 내 진단 키트에 대한 약물 투여 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 상기 시료 내 Axl의 존재 또는 부존재에 기초하여, 시료 내 뇌척수액의 존재 또는 부존재를 진단하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 키트는 하나 이상의 효소, 효소 저해제 또는 효소 활성자를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 하나 이상의 크로마토그래피 화합물을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 분광분석적 검정용 시료를 제조하는데 사용된 하나 이상의 화합물을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 키트는 지표의 강도, 컬러 스펙트럼, 또는 다른 물리적 특성에 따라서 Axl의 존재 또는 부존재를 해석하기 위한 비교용 참고 물질을 추가로 포함한다.
종양 중 Axl의 원형질 막 평점(종양 막 P 점수)
Axl은 종양 세포 및 대식세포의 하위 세트에서 반응성이다. 종양 세포에서, Axl은 주로 원형질 막에 국소화되지만, 또한 세포질에서 관찰될 수 있다. Axl을 발현하는 대식세포는 종종 종양 세포/둥지(nest) 중에, 그리고 종양에 인접한 기질(종양-연관 기질 또는 종양-기질) 내에 존재한다. Axl 대식세포 염색은, 모든 대식세포가 Axl로 표지되지 않지만, 원형질 막 또는 세포질에 국한된다.
CD68은 대식세포의 세포질에서 발현되며, 이와 같은 면역 세포 유형의 식별을 위한 표준 바이오마커이다. 대식세포는 조직 샘플 전체에 존재할 수 있지만, 종종 종양 세포 중에(종양 덩어리 내에) 그리고 종양/기질 계면(종양-연관 기질)에 존재할 경우, 가장 흥미롭다.
Axl은 종양 세포 및 대식세포 모두에서 발현되기 때문에, 본 발명은 평점 접근법을 사용하여 각 샘플의 일련의 절편들에서 Axl 및 CD68 염색을 비교한다. 이런 식으로, CD68 바이오마커가 Axl에 대해 염색된 종양에서 대식세포를 식별하기 위해 사용된다. 즉, CD68 일련 절편이 종양 세포 대 대식세포에서 Axl 반응성을 구별하기 위해 사용된다. 이와 같은 접근법을 사용하여, 종양 세포에서만 Axl 원형질 막 염색이 점수화된다. CD68 염색은 Axl에 대한 평가에서 '차감되어' 대식세포를 제외한 Axl 종양 평점(이하에서 '종양 막 P 점수')을 제공한다.
아래에 기재된 바와 같이, Axl 및 CD68의 평점을 위해 사용된 접근법은 포르말린-고정, 파라핀-포매된(FFPE) 종양 샘플에서, 비제한적으로 면역조직화학법(IHC)을 비롯한 방법에 의해 검출될 수 있다. 모든 샘플은 또한 평점에 일조하도록 형태학적 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색된다.
종양 중 Axl 원형질 막 발현은 반-정량적으로 점수화된다. 평점에 대한 주성분은 적절한 차등 강도에서 염색된 세포의 백분율이다.
백분율 점수는 샘플당 원형질 막 염색의 침투를 기술하기 위해 할당된다. 백분율은 증분으로서 추정 및 보고되는데, 비제한적으로 다음의 증분 중 하나를 포함한다: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%.
본 발명의 특정 구현예에서, Axl-발현 종양은 종양 막 P 점수가 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 또는 적어도 95%이다. 바람직하게는, Axl 발현 종양은 종양 막 P 점수가 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 또는 적어도 95%이다.
원형질 막 염색에 대한 차등 강도가 4점 척도(0, 1+, 2+, 3+)를 사용하여 반-정량적으로 기록된다. 이와 같은 규모에서, 0 = 없음, 음성, 또는 비-특이적 염색, 1+ = 낮은 또는 약한 염색, 2+ = 중간 또는 적당한 염색 및 3+ = 높은 또는 강한 염색.
종양 세포에서만의 Axl 반응성을 평가할 경우(대식세포를 제외한 Axl 종양 염색), Axl 및 CD68(대식세포 바이오마커) 모두에 대한 염색된 슬라이드가 직렬로 요구된다. CD68로의 염색은 종양의 영역에서 Axl로의 염색과 면밀하게 비교된다. Axl 및 CD68 모두로 염색되는 세포는 Axl-반응성 대식세포(종양 세포 아님)로 간주되고, Axl 점수에서 배제된다.
대식세포 중 Axl 염색은 혼합된 양성 세포 유형의 집단이 존재하는 경우, 종양 세포 중 원형질 막 염색을 점수 매기는 것을 어렵게 만든다. 암의 적응증에 걸쳐 대식세포를 제외한 종양 중 원형질 막 상의 Axl 발현의 전반적인 이해를 얻기 위해, 표준 백분율 점수 및 H-점수 접근법이 모두 사용되어 관찰된 반응성의 패턴을 포착한다.
백분율 점수 방법
백분율 점수는 ≥1+, ≥2+ 또는 ≥3+ 중 하나의 강도 백분율을 합산하여 계산한다. 따라서, 점수 범위는 0 내지 100이다.
백분율 점수 ≥1+ = (1+의 %) + (2+의 %) + (3+의 %)
백분율 점수 ≥2+ = (2+의 %) + (3+의 %)
백분율 점수 ≥3+ = (3+의 %)
H-점수 방법
H-점수는 4지점 반-정량적 척도(0, 1+, 2+, 3+)에서 발현(갈색 염색)의 강도를 가진 세포의 백분율에 그에 상응하는 차등 강도를 곱한 값들을 합산함으로써 계산한다. 따라서, 점수의 범위는 0 내지 300이다.
H-점수 = [ (<1의 %) x 0 ] + [ (1+의 %) x 1 ] + [ (2+의 %) x 2 ] + [ (3+의 %) x 3]
대식세포 염색의 평점
● 언급한 바와 같이, CD68은 대식세포에 대한 표준 바이오마커이고 Axl은 이와 같은 세포 유형에서 발현될 수 있다.
● CD68 및 Axl로 염색된 슬라이드를 사용하여 각각의 종양 조직에서 CD68-양성 및 Axl-양성 대식세포의 상대 존재비를 평가한다.
● 다음의 영역에서 CD68 및 Axl 양성에 대한 대식세포 추정을 실시한다: 종양 덩어리('종양'이라 칭함) 내 및 종양-관련 기질 또는 종양과 상호작용하는 기질('종양-기질'이라 칭함) 내. 종양-기질은 종양에 대한 실질 반응을 나타낸다. 이것은 종양 덩어리의 외부 가장자리, 즉 '얼굴' 외부에서 또는 그것에 인접한, 기질 반응이다.
● 종양에서, 평점은 CD68 또는 Axl-양성 대식세포로 구성되는 종양 덩어리 또는 종양 둥지(nest) 중 세포의 백분율(0~100%)을 나타낸다.
● 종양-기질에서, Axl 및 CD68에 대한 대식세포 존재비가 0~3의 반-정량적 척도를 사용하여 점수화된다. 이와 같은 척도에서, 0은 양성 대식세포가 없음을 나타내고, 1은 저밀도의 양성 대식세포를 나타내고, 2는 적당한 밀도의 양성 대식세포를 나타내고, 3은 고밀도의 양성 대식세포를 나타낸다.
종양 세포질 중 Axl의 평점
● 분산된 Axl 세포질 염색을 보이는 종양의 백분율(양성 세포 %)은 0~100%로 추정한다. 이와 같은 염색의 평균 강도는 0~3의 척도를 사용하여 추정한다. 이와 같은 척도에서, 0은 세포질 염색 없음을 나타내고, 1은 약한 세포질 염색을 나타내고, 2는 적당한 세포질 염색을 나타내고, 3은 강한 또는 강렬한 세포질 염색을 나타낸다.
● 세포질에서의 강한 Axl 염색은 잠재적 막 신호를 알아보는 것을 어렵게 만들 수 있다.
다음의 실시예는 비제한적으로, 본 개시의 연질 젤라틴 캡슐의 예시이다. 본 기술분야에서 정상적으로 직면하고, 당해기술의 기술자에게는 명백한 다양한 조건 및 매개변수의 다른 적합한 변형 및 적응은 본 개시의 범위에 속한다.
실시예
실시예 1: Axl에 대한 조건부 활성 항체
Axl은 조건부 활성 항체에 의해 접근 가능한 세포외 도메인을 가진 세포-표면 막관통 티로신 키나제이다. 이와 같은 세포 표면 단백질은 갑상선 암종 조직에서 높게 발현되고, 많은 다른 암 예컨대 육종, 골수증식성 장애, 전립선 암종 세포, 또는 유방암에서 과발현된다. AXL 발현의 증가는 화학요법, 프로그래밍된 사망-1(PD-1) 억제제, 분자 표적 요법, 및 방사선 요법에 대한 종양 저항과 관련되어져 왔다. Axl 단백질의 세포외 도메인에 대한 조건부 활성 항체가 본원에서 개발되었다.
Axl에 대한 야생형 항체를 주형 항체로 선택하였다(도 1a의 063-hum10F10-HC의 중쇄 가변 영역 및 도 1b의 063-hum10F10-HC의 경쇄 가변 영역을 가짐). 상기 야생형 항체를 인코딩하는 DNA를 진화시켜 주형 항체의 각 위치가 한 번에 무작위로 선택되는 방법인 포괄적인 위치상 진화(CPE)를 사용하여 돌연변이체 항체 라이브러리를 생성하였다. 상기 라이브러리 중 각 돌연변이체 항체는 단 하나의 단일 점 돌연변이를 갖는다. 상기 라이브러리 중 돌연변이체 항체는 pH 6.0에서의 Axl에 대한 선택적 결합 친화도를 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 pH 7.4 초과 상태에서 동시에 검사받음으로써 생성하였다.
동시에, 제조 공정에서 더 높은 분야의 목적을 위해 돌연변이체 항체의 발현 수준을 또한 최적화하였다. 검사에 대한 거짓 양성을 유발할 수도 있는 혈청 중 인간 항체가 존재했기 때문에, FLAG 태그를 사용하여 혈청에서 검사를 수행하였다. 검사 완충액은 카보네이트 완충액(ringer이 있는 Krebs 완충액 - PBS와는 다른 표준 완충액)이었다. 생성된 조건부 활성 항체는, 야생형 항체와 비교할 때, pH 6.0에서 Axl에 더 높은 친화성을 가지고, pH 7.4에서 Axl에 대해 더 낮은 친화성을 가짐이 밝혀졌다. pH 7.4보다 pH 6.0에서 더 높은 활성을 갖는 선택된 돌연변이체 항체(scFv)의 일부가 도 2에 제시된 한편, pH 6.0과 pH 7.4에서의 그들의 활성 비가 적어도 11배였다(도 3).
또한, 이들 조건부 활성 항체는 모두 아래 표 4 에 나타낸 바와 같이 높은 발현 수준을 갖는데, 첫 번째 열 '클론'은 항체를, 두 번째 열은 발현 수준 'mg/ml'을 보여준다.
요청된 발현 수준을 가진 이들 항체의 클론을 서비스 제공자에게 보냈다('주문된 양', 예상된 발현 수준). 그러나, 이들 항체의 실제 발현 수준('전달된 양')은 상당히 높고, 예상된 발현 수준을 초과하였다.
Figure pct00030
조건부 활성 항체는 예로서 BAP063.9-13-1 항체를 사용한 도 4에 입증된 바와 같이 완충액에서 응집을 보이지 않았다. BAP063.9-13-1 항체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 도 4에서, 단 하나의 피크를 검출하였는데, 이것은 항체의 응집이 거의 없음을 입증하였다.
또한 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 조건부 활성 항체를 검정함으로써 Axl에 대한 활성/불활성율(on and off rates)을 측정하였다. SPR 검정은 조건부 활성 항체에 대한 활성/불활성율을 측정하는 것으로 알려진 바 있다. SPR 검정을 바이카보네이트의 존재 하에 수행하였다. 조건부 활성 항체의 (동물 및 인간의) 생체 내 활성/불활성율은 조건부 활성 항체에 대한 매우 중요한 특징이다.
조건부 활성 항체가 음성 대조군(pH 6.0 및 pH 7.4 모두에서 유사한 결합 친화도를 갖는 BAP063 10F10)과 비교하여, pH 6.0에서 더 높은 결합 친화도를 가지고 pH 7.4에서 더 낮은 결합 친화도를 가지는 것이 관찰되었다(도 5). 또한, 실온에서 60℃까지 온도를 올리는 것은 ELISA 검정 결과를 유의미하게 변경시키지 않는다(도 5). ELISA 검정은 또한 이들 조건부 활성 항체가 pH 7.4와 비교하여 pH 6.0에서 상당히 선택적이었음을 보여주었다(도 6a~6b는 일 예로서 하나의 항체를 보여준다).
조건부 활성 생물학적 항체가 표 5에 요약되어 있다. 이들 중 두 항체는 scFv로 발현되었다(BAP063.9-13.3 및 BAP063.9-48.3). 상기 항체를 60℃에서 1시간 동안 배양하는 것은 항체들 대부분의 친화성을 변화시키지 않았다('열안정성').
조건부 활성 항체는 본 발명에 따라 CTC의 표면 상의 Axl 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다.
Figure pct00031
실시예 2: 항- Axl 항체의 pH-의존적 결합 친화도
본 발명의 항-Axl 항체의 일부를 상이한 pH 수준의 완충액에서 시험하였다. 완충액의 한 가지 유형은 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 존재하는 KREBS 완충액이었다. KREBS 완충액을 5 ~ 7.4의 범위의 pH를 갖도록 적정하였다. ELISA 검정(OD450)을 사용하여 항체의 Axl과의 결합 친화도를 측정하였고 결과를 도 7에 제시하였다. 상기 두 개의 대조군 항체(BAP063-3831 및 BAP063-3818)는 pH의 변화에 의해 유의미하게 영향을 받지 않는 결합 친화도를 가짐으로써 조건부 활성이 아니었다. 다른 한편으로는, 본 발명의 항-Axl 항체는 Axl와의 결합 친화도가 pH에 의존적이기 때문에, 조건부 활성이다(도 7).
실시예 3: 항- Axl 항체에 의한 세포 사멸
A549 세포를 사용하여 본 발명의 항-Axl 항체의 세포 사멸 활성을 시험하였다. 결과는 도 8a~8e에 나타냈다. 두 가지 pH 수준: 6.0 및 7.4에서 세포 사멸 활성을 측정하였는데, 이들은 각각 종양 미세환경에서의 pH 및 정상적인 생리학적 pH를 나타낸다. 다양한 항체 농도에서의 세포 사멸의 백분율을 도 8a~8e에 나타내었다.
상기 두 가지 시험은 일관된 세포 사멸 결과를 보여주었다. 음성 대조군(항-Axl 인간화된 WT)은 A549 세포에 대해 pH 6.0 및 pH 7.4에서 유사한 세포 사멸 활성을 나타내었다(도 8a). 대조적으로, 본 발명의 항-Axl 항체는 pH 7.4에서의 세포 사멸 활성과 비교하여, pH 6.0에서, 특히 상기 항체가 A549 세포를 포화시키지 않은 낮은 항체 농도에서, 상당히 더 높은 세포 사멸 활성을 나타내었다(도 8b-8e).
실시예 4: 항- Axl 항체에 의한 사이노 - Axl에 대한 결합 친화도
본 발명의 항-Axl 항체에 의한 사이노-Axl에 대한 결합 친화도를 측정하고, pH 6.0 및 7.4의 2개의 상이한 완충액에서 인간 Axl(hAxl)의 결합 친화도와 비교하였다. 결과는 도 9a~9d에 나타내었다. 사이노-Axl은 비-인간 영장류, 즉, 사이노몰구 스 마카크 원숭이에서 유래된 Axl 단백질이다.
대조군(BA-3831-WT)은 두 개의 완충액 중 pH 6.0 및 7.4 모두에서 인간 Axl (hAxl) 및 사이노몰구스 Axl (사이노-Axl)에 대해 유사한 결합 친화도를 나타내었다(도 9a). 본 발명의 항-Axl 항체는 상기 2개의 완충액 중 하나에서 hAxl 및 사이노-Axl에 대해 유사한 결합 친화도 프로파일을 나타내었고, 즉, pH 6.0에서 사이노-Axl에 대한 결합 친화도와 비교하여, pH 7.4에서 사이노-Axl에 대해 더 낮은 결합 친화도를 나타내었다(도 9b~9d). 상이한 완충액 중 pH 6.0 및 pH 7.0에서의 결합 친화도의 차이는 유의미하지 않았다.
실시예 5: 두오마이신에 접합된 항- Axl 항체의 세포독성
두오마이신은 단백질 합성을 중지시킴으로써 세포 성장을 억제하기 때문에 세포독성이 있다. 본 발명의 항-Axl 항체 주 하나인 BAP063.9 4007을 두오마이신에 접합시켜다. 본 시험에서 두 개의 대조군 BAP063 hum WT 및 B12(항-B12 항체)를 사용하였고, 또한 둘 모두 두오마이신에 접합시켰다.
pH 6.0 및 7.4에서 몇 개의 세포주를 3가지 두오마이신-접합 항체(BAP063.9 4007, BAP063 hum WT, 및 B12)로 처리하였다(도 10a~10h). 본 발명의 두오마이신-접합 항체 BAP063.9 4007은 pH 7.4에서 세포주 DU145(전립선암 세포), MDA-MD-231(유방암 세포), PL45(췌장암 세포) 및 A549(선암종 세포)에 대한 세포독성과 비교하여, pH 6.0에서 동일한 세포에 대해 상당히 더 높은 세포독성을 나타내었다.
실시예 6: 모델 독소에 접합된 항- Axl 항체
본 발명의 항-Axl 항체를 모델 독소(예를 들어, 젬시타빈)에 접합시켜 조건부 활성 항체-약물 접합체(CAB-Axl-ADC)를 생산하였다. CAB-Axl-ADC를 우선 시험하여 조건부 세포 사멸 활성이 약물 접합 공정에 의해 변경되지 않았음을 확인하였다. 이와 같은 시험은 CAB-Axl-ADC가 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 상당히 더 많은 세포를 사멸하였음을 보여주었다(도 11).
이어서, CAB-Axl-ADC를 MiaPaCa2 이종이식편 종양을 품은 마우스에 1 mg/kg의 용량으로 3주 동안 매주 2회씩 주입하였다. 본 연구에서 몇 개의 대조군을 사용하였는데, 이것은 미접합(naked) CAB(접합 없는 항-Axl 항체), 비히클, 독소 단독 (비접합된 겜시타블), 대조군 ADC, 친화성 일치 항-Axl ADC(AM ADC)을 포함한다. 본 연구는 CAB-Axl-ADC(CAB ADC) 및 AM ADC가, 대조군과 비교하여, 종양의 크기의 상당히 더 큰 감소를 제공함을 보여주었다(도 12). 비접합 항-Axl 항체는 종양의 크기를 감소시키지 않았다. 본 연구는 독소와 접합된 항-Axl 항체가 친화성 일치 항체만큼 종양 크기를 감소시키는 데 효과적임을 보여주었다.
실시예 7: 사이노몰구스 마카크 원숭이에서 항- Axl 항체 약물 접합체의 혈청 농도
본 발명의 항-Axl 항체 약물(두오마이신) 접합체(CAB-ADC)를 3개의 용량: 0.1, 1 및 10 mg/kg으로 수컷 및 암컷 사이노몰구스 마카크 원숭이에 주입하였다. 미접합 항-Axl 항체를 대조군으로 사용하였다. 친화성 일치 항체 약물 접합체(AM-ADC)를 또한 대조군으로 사용하였다. 항체의 혈청 농도를 1주의 기간에 걸쳐(168 시간, 도 13a~13b 참고) 측정하였다. CAB-ADC가 원숭이 혈청에서 AM-ADC 대조군보다 더 오래 지속되었다(도 13B). 수컷 및 암컷 원숭이 사이에 유의미한 차이가 존재하지 않았다(도 13a~13b).
실시예 8: 사이노몰구스 마카크 원숭이에서 항- Axl 항체 약물 접합체의 독성
본 발명의 CAB-ADC의 독성을 사이노몰구스 마카크 원숭이에서 시험하였다. 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(ALT)가 미 식품 의약국(FDA)에 의해 약물의 간독성의 지표로 사용되어 왔다. 혈청 AST 및 ALT 수준을 수컷 및 암컷 원숭이 모두에서 측정하였다(도 14a~14b). 비히클(PBS)은 혈청에서 AST 또는 ALT 수준 변경을 유발하지 않은 반면, 상기 일치 항체 약물 접합체(AM)는 10 mg/kg 용량 주입 후 3일차에 상당히 높은 AST 및 ALT 수준을 보여주었다. CAB-ADC는 AM 대조군과 비교하여 상당히 감소된 AST 및 ALT 수준을 보여주었다. 이것은본 발명의 항-Axl 항체 약물 접합체가 일치 항체 약물 접합체 AM 대비 간독성을 상당히 감소시킴을 표시하였다.
본 발명의 항-Axl 항체 약물 접합체는 또한 원숭이에서 염증을 덜 유발하는 것으로 밝혀졌다(도 15). CAB, AM 및 PBS의 주입 후 원숭이의 혈액에서 림프구의 계수를 수집하였다. 상당한 염증을 야기한 AM과 비교하여, 본 발명의 항-Axl 항체 약물 접합체(CAB-ADC)는 원숭이에게서 경미한 염증만을 야기하였다.
실시예 9: 마우스에서 생체 내 실험
마우스에 종양으로 발전할 2개 종양 세포주(LCLC103H 또는 DU145) 중 하나를 이식하였다. 항종양 약물 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)로 처리 후 종양 크기를 측정하였다. LCLC103H를 투여받은 마우스의 경우, 마우스를 단일 용량의 비히클(음성 대조군의 경우), CAB 항-Axl 항체 접합 MMAE ADC(CAB Axl-MMAE), 또는 비-CAB 항-Axl 항체 접합 MMAE ADCC(비-CAB Axl-MMAE), 도 16a로 처리하였다. ADC로 처리한 마우스에서 종양은 줄어든 반면, 비히클로 처리된 마우스의 종양은 계속 성장하였다.
또한, DU145를 투여받은 마우스는 2개의 상이한 농도(6 mg/kg 및 10 mg/kg)의 비히클(음성 대조군) 또는 CAB 항-Axl 항체 접합 MMAE ADC(CAB Axl-MMAE)로 처리하였다. 종양 부피를 시간 경과에 따라 측정하였다. 음성 대조군(비히클)에서 종양이 계속 자라는 반면, ADC로 처리된 마우스에서 상기 종양은 성장이 느려졌다(도 16b).
실시예 10: 종양 막 P 점수
절차
Axl(세포 표면 수용체 티로신 키나제)에 대한 면역조직화학(IHC) 염색은 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE) 조직에서 Axl의 검출을 위해 Lifespan Biosciences(Cat # LS-B6124)의 단클론성 마우스 IgG 클론 7E10을 사용하였다.
CD68에 대한 IHC 염색은 대식세포의 검출을 위한 Dako(Cat # M0814) 표준 마우스 단클론성 항체(클론 KP1)를 사용하였다(표 13). IHC 절차에 사용된 프로토콜은 TechMate 염색 플랫폼 상에서 하기와 같이 기술되어 있다.
● 1 단계: FFPE 조직 블록을 4~5 ㎛의 두께로 절단하고, 절편들을 양전하로 하전된, 모세관 갭 유리 슬라이드에 실장하였다. 사용 전에 슬라이드를 구웠다(60℃, 건조 열).
슬라이드 준비
a. 절편제작을 수행하였다. 4~5개 마이크론(4~5 ㎛) 절편을 Fisher Biotech 22-230-900 프로브-온 플러스 현미경 슬라이드에 실장하였다.
b. 적어도 1시간 동안 60℃(건조열)에서 슬라이드를 굽고, 2단계 개시 전 최소 15분 동안 실온에서 냉각되게 하였다.
● 2 단계: 유기 용매(자일렌, 100%, 4회 변경) 및 증류수로 하강하는 알코올 시리즈(100%, 70%, 30% 에탄올)를 사용하여 조직 절편을 탈랍함으로써, 상기 조직을 충분히 수화시키고 일차 항체 및 다른 검출 시약의 적절한 결합을 허용하였다.
탈랍 / 항원전 복구
a. 각각 5분 동안 실온(25℃) 절대 자일렌의 4회 변경[교반 없음]
b. 각각 2분 동안 실온(25℃) 무수 알코올의 2회 변경[교반 없음]
c. 각각 2분 동안 실온(25℃) 70% 알코올의 2회 변경[교반 없음]
d. 각각 2분 동안 실온(25℃) 30% 알코올의 2회 변경[교반 없음]
e. 세척을 위한 실온(25℃) 증류수의 2회 변경[분. 16회 담갔다 뺐다 함]
f. 실온(25℃) 증류수에 슬라이드 침지(항원 복구로 이전)
● 3 단계: 조직 절편을 탈랍한 후 항원 복구를 수행하였다. 본 단계는 열원으로 상업적 찜기(20분, 97℃ 초과)를 가진 쌍을 이룬 현미경 슬라이드 사이에 형성된 모세관 간격에 유입된 증기열 유도 에피토프 회수(SHIER) 용액을 사용하였다(상세한 설명은 Ladner 등, Cancer Res.; vol. 60, pp 3493-3503, 2000 참조).
증기열 항원 복구
a. 상업적 찜기를 98℃ 넘게 예열하였다.
b. (Black & Decker HS1000 모델 찜기 또는 그와 등등한 것) 20분 동안 98℃ 넘게, Axl의 경우 SHIER 2(Dako S1700, 시트레이트계, pH 6.0 ~ 6.2)를, CD68의 경우 SHIER 1(QualTek 제형, 시트레이트계, pH 5.6 ~ 6.1)을 사용하여 열 유도 항원/에피토프 복구. 최대 10개(10) 슬라이드를 정확히 10mL 항원/에피토프 복구 용액을 함유한 TechMate 시약 트레이에서 깨끗한 빈 슬라이드와 얼굴-쌍을 이루어 시약을조직 위 및 조직 너머로 모세관 인출하였다.
c. 5분 동안 복구-후 냉각을 하고, 슬라이드 쌍을 TechMate 슬라이드 홀더에 견고하게 삽입시키고 흡수제 심지 패드로 SHIER 1/SHIER 2를 배수하였다.
d. 0.02% v/v Tween-20 세제를 함유한 트리스-완충 식염수(TBST, SOP MFB003에 따라 QualTek에 의해 20X 보관 용액으로 제형화되고, 증류수/탈이온수[4℃로 저장됨]로 희석 후 1X 용액으로 사용됨)와 함께 모세관 작용(배수 인출)을 사용하여 수작업으로 2회 세척함.
● 4 단계: TechMate 기기 플랫폼 및 MIP 프로그램(효소 분해를 포함하지 않음) 또는 MIPE 프로그램(1:40 희석으로 프로테이나제 K로의 소화를 포함함)을 사용하여 표 6에 개략된 일반적인 절차에 따라, 샘플을 IHC에 의해 시험하였다. 상기 항원 또는 일차 항체에 대해 높은 수준의 특이성이 있는 IHC 동안 순차적인 항체의 검출을 활용하였다. 일차 항체의 위치는 궁극적으로 서양고추냉이 과산화효소(HRP)의 존재 하에 항원의 부위에서 별개의 불용성 반응 생성물을 침전시키는 비색 색원체(DAB)의 적용에 의해 시각화된다. 핵은 세포 및 조직 형태를 평가하기 위해 헤마톡실린(푸른 염색)을 사용하여 대조염색하였다.
Figure pct00032
면역조직화학
마우스 Polink2+ HRP 시약(Golden Bridge International [GBI]; Cat #: D37-110)는 TechMate 실행 QualTek MIPE 절차에 따라 실온에서(25℃) 하기 모든 절차가 자동화되어, 2~8℃에서 바로 사용할 수 있게 저장된다. 시약 변경(세척, 배양)이 흡수제 심지 패드(배수) 및 TechMate 시약 트레이(인출)를 사용하는 모세관 작용(배수-인출)에 의해 발생한다.
a. TBST로 3회 세척.
b. Axl 및 프로테이나제 K 소화를 위한 TBST(1:40 희석, Dako, Cat #: S3020), CD68의 경우 10분.
c. TBST로 3회 세척.
d. 염소 차단 시약(QML), 15분.
e. TBST로 1회 세척.
f. Axl (1:1500) 항체 클론 7E10(LifeSpan BioSciences Cat #: LS-B6124) 또는 CD68(1:7500) 항체 클론 KP1(Dako Cat #: M0814), 1시간 동안 1:10 작업 스톡(4℃에서 또한 RMB에서 유지됨)에서 유래된 QualTek 시약 제조 완충액에서 새롭게 희석됨(RMB: SOP MFB002에 따라 QualTek에 의해 제형화된 바와 같이, 0.01M 포스페이트, 0.151M NaCl, 1% w/v BSA, 0.1% v/v ProClin 300, 0.2% v/v Tween-20, 1% v/v 정상적 염소 혈청, pH 7.2).
g. TBST로 5회 세척.
h. 마우스 Polink2+ 이차(GBI 키트 일부 Cat #: D37-110), 25분.
i. TBST 세척 완충액으로 2회 세척.
j. 과산화효소 블록(3% USP H2O2, ~0.02% v/v Tween-20 첨가됨), 개재하는 시약 배수를 가지고 3X 2.5분 (총 7.5분).
k. TBST로 3회 세척.
l. 마우스 Polink2+ HRP 접합 중합체(GBI 키트의 일부 Cat #: D37-110), 25분
m. TBST로 5회 세척.
n. GBI (Cat #: C09-12) DAB 색원체(중합체 배양의 끝에 새롭게 만든 시약, 공급된 기질 완충액 1mL당 40㎕ DAB 색원체 농축액), 3X 5분(총 15분), 개재하는 시약 배수 및 TBST에서 1회 세척 포함.
o. TBST로 4회 세척
p. 헤마톡실린 대조염색(1:5), 1분
q. TBST로 6회 세척.
r. 실온(25℃) 증류수에 침지된 슬라이드(커버슬립 영역으로 이전).
● 5 단계: 슬라이드는 쌍을 이루지 않고, 증류수에서 세정하고, 알코올 시리즈(70%, 95%, 100% 에탄올) 및 유기 용매(자일렌, 100%, 4회 변경)에서 탈수시키고, 이어서 해석 및 저장을 위해 CytoSeal (또는 등가물)을 사용하여 영구적으로 커버슬립을 덮었다. 현미경 하에서 슬라이드를 검사하여 염색을 평가하였다.
SHIER 2(시트레이트계, pH 6.0~6.2) 용액을 FFPE 조직에서 Axl의 에피토프를 드러내기 위해 사용하였다. SHIER 1(시트레이트계, pH 5.6~6.1) 용액을 CD68의 에피토프를 드러내기 위해 사용하였다. 열 유도 에피토프 복구 후, 공정 단계를 QML 동료 소프트웨어 v3.96을 실행하는 TechMate 기기(Roche Diagnostics)로 자동화하였다. 이와 같은 자동화된 플랫폼은 모든 시약 변경의 경우, 최대 대조염색 및 개재하는 버퍼 세척을 비롯한 모세관 간격 공정을 사용한다. 모든 단계들은 실온(25℃)에서 수행하였다.
염소 혈청이 포함된 시약 제조 완충액[RMB; made by QualTek's Santa Barbara 실험실(QML-SB)에서 제조함]을 일차 항체 및 음성 대조군 항체의 유효 희석을 제조하는 데 사용하였다. FFPE 절편에서 항원-일차 항체 상호작용의 부위에서 Axl 및 CD68에 대한 표적 인식은 마우스 일차 항체의 검출을 위해 설계된 GBI Lab에서 나온 Polink-2 플러스 HRP 키트에서 유래된 시약을 사용하였다. Axl 및 CD68에 대한 항체 사양 및 최적화된 IHC 검정 조건에 대해서는 표 7을 참고한다.
탈수/ 커버슬립 덮기
a. 세정을 위해 실온(25℃) 95% 알코올의 2회 변경[분, 16회 담갔다 빼기].
b. 세정을 위해 실온(25℃) 무수 알코올의 6회 변경[분, 16회 담갔다 빼기].
c. 세정을 위해 실온(25℃) 절대 자일렌의 4회 변경[분, 16회 담갔다 빼기].
d. Thermo Scientific 8312 Cytoseal XYL 또는 등가물 비-수성 반영구적 실장 배지를 가진 커버슬립.
Figure pct00033
내부 공정 제어
대조군 조직에서 확립된 신호 강도를 갖는 종-일치 양성 대조군(표준 항체)을 각 실행에서 사용하여, 적절한 검출 시약 성능을 확인하였다. 본 프로젝트의 지속기간 전반에 걸쳐 사용된 양성 대조군은 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE) 대조군 편도 조직에서 실행된 LCA(마우스에서 유래됨)이거나, 또는 FFPE 결장암 대조군 조직에서 실행된 CK(사이토케라틴)(마우스에서 유래됨)였다.
일 범위의 Axl 발현 수준의 범위를 포함하는 조직 은행에서 유래된 폐암 다중 조직 블록(QMTB246, QMTB395)을 각각의 IHC 실행에서 Axl 및 CD68에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 상응하는 바이오마커 검정 조건에 대한 마우스 IgG1 아이소타입-일치 음성 대조군을 검출 시약 또는 조직에 내재하는 임의의 비특이적 염색을 결정하고 이들 공급원의 임의의 잠재적 배경 반응성을 정의하기 위해 사용하였다.
시험 조직
실험실 간의 검정 일치를 위한, 조직 은행으로부터의 총 13개의 상이한 포르말린-고정, 파라핀 포매(FFPE) 폐암(비-소세포 폐 암종 또는 NSCLC) 조직. CLIA 민감성 테스팅을 위해, 다음의 암 적응증에 대한 FFPE 조직 샘플에서 Axl 및 CD68 테스팅을 평가하였다: 흑색종(미처리 31개, 이전-처리된 16개), 난소암(미처리 52개), 췌장암(미처리 31개, 이전-처리된 2개), 폐암(미처리 43개, 이전에-처리 1개) 및 전립선암(미처리 51).
모든 미처리된 샘플은 조직 은행에서 유래되었다. 이전에-처리된 샘플 모두는 BioAtla에서 공급되었다. 각 샘플에 대한 상세한 정보는 결과 섹션의 민감성 평점 표에 포함된다. 흑색종, 난소암, 췌장암, 및 폐암 적응증에서 Axl 및 CD68 IHC 검정의 검증 시험을 위해 이들 암 샘플의 하위세트를 사용하였다.
Axl 및 CD68 특이성 시험을 위해, Pantomics, Inc의 FDA 다중-정상 인간 조직 마이크로어레이(TMA) 슬라이드(Cat # MNO961)를 수득하였다. TMA(P1478Q0035로 지정됨)는 35개의 상이한 장기 또는 부위에서 유래된 96개의 상이한 샘플을 함유하였다.
평점 반응식
앞서 종양(종양 막 P 점수) 섹션에서의 Axl의 원형질 막 평점에 기재된 바와 같이, 각 샘플의 일련의 절편에서 Axl 및 CD68 염색의 비교 평점을 수행하였다.
결과
Axl 및 CD68 IHC 검정 일치(A부)
실험실 간 일치 시험을 위해 비-소세포 폐 암종(NSCLC) 샘플의 총 13개의 상이한 FFPE 폐암 샘플을 사용하였다. NSCLC 샘플은 Axl 원형질 막 종양 세포 염색의 범위를 나타내었다.
일치 시험을 위한 조직은 시설에서 비-GLP Axl 및 CD68 IHC 검정을 사용하여 염색하였다. 이들은 또한 표 7 및 상기에 기재된 검정을 사용하는 상이한 작동자에 의해 제2 시설에서 일련의 절편(준비하는 사이에 물질의 손실이 최소인 슬라이드당 하나의 조직 절편)으로서 염색하였다. 모든 검정 시험은 TechMate 자동화 염색 플랫폼을 사용하여 수행하였다.
Axl에 대해, 본 명세서에 기재된 바와 같이 0~3+의 차등 강도에서 원형질 막 염색을 가진 종양 세포의 백분율을 기록함으로써, 평점을 수행하였다. 상이한 실험실에서 실행된 동일한 샘플들 사이의 비교를 H-점수 [(<1에서 %) x 0] + [(1+에서 %) x 1] + [(2+에서 %) x 2] + [ (3+에서 %) x 3]에 기초하여 수행하였다. CD68의 경우, CD68-양성 대식세포로 이루어진 종양 세포의 백분율(0~100%)(종양 중 %)을 기록함으로써 평점을 수행하였다.
상이한 실험실에서 염색된 샘플들 사이의 종양 중 백분율에 대한 Axl H-점수 및 CD68 점수를 비교할 때, 다음의 일치 파라미터를 설정하였다: 서로의 +/- 20% 내의 점수가 일치로 간주되고; 및 시험된 샘플의 85%가 승인된 검정 이전(assay transfer)에 대해 일치되어야 한다. 이러한 조건 하에서, 2개의 상이한 실험실에서 실행된 경우, NSCLC 조직의 집합의 전반에 걸쳐 허용 가능한 일치가 주목되었다.
각각의 시설에서 염색된 NSCLC 샘플을 비교하는 평점 데이터를 수득하였다(표 4). 각각의 시설의 샘플들 사이에 대한 종양 중 백분율에 대한 Axl H-점수 및 CD68 점수 사이의 변경 백분율(존재하는 경우)을 수득하였다. 두 개 실험실에서 총 13개 샘플을 수행하였다. 이들 13개 샘플 중에, Axl에 대해 모두 일치(20% 변경 내)하는 것으로 간주되었고, CD68의 경우 2개를 제외한 모두가 일치했다. 이것은 Axl의 경우 실험실 간의 100% 샘플 세트 일치 및 CD68의 경우 85%를 산출하였다.
CD68에 대한 임의의 비-일치 결과는 대식세포인 종양의 백분율에 대한 낮은 점수에 의해 설명이 가능하였다. 백분율 점수가 낮을 경우, 비교 슬라이드의 점수들의 차이는 시험의 속성에 의한 더 높은 변경 백분율로 해석된다. 예를 들어, 상기 2개의 시설의 샘플들 사이의 5% 내지 2%의 평점 차이가 작은 반면, 이것은 0~100 척도를 사용하여 큰 변경 백분율을 나타낸다. 이러한 샘플은 허용 가능한 것으로 간주하였다.
수득된 검정 이전 평점 데이터 및 일치에 대해 확립된 기준에 따라, Axl 및 CD68 검정을 성공적으로 이전된 것으로 간주하였다.
B부: Axl 및 CD68 암에 대한 민감성 선별
상이한 암 적응증의 인간 종양 조직의 일련을 절편들(준비 사이에 물질의 손실이 최소인 슬라이드당 조직의 하나의 절편)을 선별하기 위한, 표 6의 일반적인 IHC 절차 및 표 8의 시약과 함께 표 7의 Axl 및 CD68에 대한 최적화된 IHC 검정.
Figure pct00034
CLIA 민감성 스크리닝에 대해 각각에서 분석된 암 적응증 및 샘플 수는 아래와 같았다:
흑색종(미처리 31개, 이전에-처리된 16개), 난소암(미처리 52개), 췌장암( 미처리 31개, 이전에-처리된 2개), 폐암(미처리된 43개, 이전에-처리된 1개), 및 전립선암(미처리 51개). 민감성 시험에 대한 모든 조직은 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE) 인간 암 시편이었다. 미처리 샘플은 QualTek 조직 은행에서 유래되었고, 이전에-처리된 샘플은 OHSU를 통해 BioAtla에 의해 공급되었다(하기 표 9).
다음의 적응증에서 Axl 및 CD68 IHC 검정의 민감성을 평가하였다: 흑색종 (미처리 31개, 이전에-처리된 16개), 난소암(미처리 52개), 췌장암(미처리 31개, 이전에-처리된 2개), 폐암(미처리 43개, 이전에-처리된 1개), 전립선암(미처리 51개). 모든 조직은 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE) 인간 암 시편이었다. 미처리 샘플은 QualTek 조직 은행에서 유래하였고, 이전에-처리된 샘플은 아래 표 9에 기재된 바와 같았다.
Figure pct00035
사전 시험에서 Axl 반응성의 범위를 보여준 폐암 조직은 현재 종양 스크린 중에 적절한 반응성을 입증하기 위한 양성 대조군/품질 관리(QC)로서 작용하였다. 편도 조직은 CD68 대식세포 바이오마커에 대한 대조군으로서 작용하였다. 시험 중에 표준 종-일치 양성 대조군(마우스 CK) 및 아이소타입-일치 음성 대조군(마우스 IgG1)을 포함시켰고, 예상대로 반응하였다. 샘플은 또한 평점을 돕기 위해 형태학적 평가를 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다.
Axl은 종양 세포 및 대식세포의 하위 세트에서 반응성이다. 종양 세포에서, Axl 반응성은 원형질 막에 주로 국소화되지만, 세포질에도 존재할 수 있다. Axl을 발현하는 대식세포가 종양 세포들 사이에, 그리고 종양과 상호작용하는 기질(종양-관련 기질 또는 종양-기질) 내에 존재할 수 있다. 모든 대식세포가 Axl로 표지되지 않는다. CD68은 모든 대식세포(종양 내 및 종양-기질 중)에서 발현되고, 이와 같은 면역 세포 유형의 식별을 위한 표준 바이오마커이다.
종양 스크린에서 모든 조직을 평가하였다. 종양 중 Axl 원형질 막 염색을 백분율 점수[강도 ≥1+, ≥2+, 및 ≥3+의 백분율(0에서 100까지의 범위)의 총합] 및 H-점수[그의 상응하는 강도 점수(0, 1+, 2+, 3+)를 곱한 각각의 백분율 점수(0~100%)(0에서 300까지의 범위)의 총합]를 사용하여 평가하였다. Axl은 종양 세포 및 대식세포 모두에서 발현되기 때문에, 평점 접근법(상기 종양 중 Axl의 원형질 막 평점(종양 막 P 점수) 섹션에 기재된 바와 같음)은 일련의 절편에서 Axl 반응성과 CD68 염색을 비교하였다. CD68 바이오마커를 Axl 슬라이드에서 대식세포 염색를 식별하고 '차감'하여 대식세포를 제외한 Ax에 대한 '종양만의' 점수를 획득하기 위해 사용하였다.
본원에 기재된 평점 접근법은 또한 평균 강도에서 Axl 세포질 염색을 얻은 종양의 백분율에 대한 값을 기록하는 단계를 포함한다. 대식세포는 CD68 또는 Axl-양성 대식세포로 이루어진 종양의 백분율을 추정함으로써 종양 덩어리 내의 CD68 및 Axl 양성에 대해 평가하였다. 대식세포는 또한 Axl 및 CD68 염색의 상대 존재비에 대해 종양-기질 내에서 평가하였다.
상이한 암 적응증에서 유래된 대표적인 샘플에 걸쳐 반응성의 염색 강도 및 존재비(침투)의 범위를 이해하기 위해 Axl 종양 스크린을 수행하였다.
평가가능한 암 샘플 중 Axl 및 CD68에 대한 평점 결과는 흑색종, 이전에-처리된 흑색종, 난소암, 췌장암, 폐암, 및 전립선암에 대해 수득하였다.
각각의 암 적응증에서 시험된 다수의 샘플은 Axl 원형질 막 종양 염색에서 음성이었다(염색 강도 0에서 종양 세포 100%). 그러나, 흑색종, 난소암, 췌장암, 및 폐암 적응증에 대해, 낮은, 적당한, 및 높은 Axl 원형질 막 염색의 예 또한 선별된 샘플들 사이에서 관찰되었다.
상응하는 조직 영역에서 CD68 염색과 나란한 높은 또는 적당한 Axl 염색의 대표적인 이미지가 흑색종의 경우, 이전에-처리된 흑색종의 경우, 난소암, 췌장암 및 폐암의 경우에 관찰되었다.
전립선암 적응증의 경우, 51개 샘플을 평가하였고, 이들 중 단 1개 만이 제로(0)를 넘어 Axl 원형질 막 염색을 보여주었다. 전립선암에서 CD68 바이오마커와 나란히 Axl에 대한 음성 염색의 대표적인 이미지가 관찰되었다. 전립선암 적응증은 상당히 비반응성이었기 때문에, Axl 검증을 위한 후속 정밀도 및 재현성 시험에 포함되지 않았다.
마우스 IgG1 아이소타입-일치 음성 대조군을 민감성 스크린에서 시험된 각각의 조직 샘플에 포함시켰다. 이들 대조군에서의 염색은 비반응성이었다.
민감성 스크린에 대한 H-점수 및 백분율 점수 분석
Axl(CD68과 공조하여)에 대한 민감성 스크린은 임상 시험에서 사용하기 위해 Axl 양성에 대한 컷-오프(cut-off)을 판단하는 데 도움을 주기 위한 것이다. 종양(대식세포 제외)에서 Axl 원형질 막 발현의 비교 평가를 돕기 위해, 평점 데이터는 양성의 상이한 이론적 역치에 따라 분할하였다.
이와 같은 분석을 위해, 평가가능한 이전에-처리된 흑색종 샘플(n=16)을 분류하고 QualTek 조직 은행에서 수득한 미처리 흑색종 샘플(n=31)과는 별도로 분석하였다. 이전에-처리된 췌장암 샘플(n=2) 및 폐암 샘플(n=1)은 그들 자신의 그룹을 포함하기에는 샘플의 수가 너무 작기 때문에 민감성 요약에서 배제하였다. 이들은 미처리가 아니었기 때문에 이들 적응증에 대한 QualTek 조직들 사이에 포함되지 않았다.
표 10은 Axl 원형질 막 종양 염색에 대한 하기의 H-점수 컷-오프를 충족시킨 각각의 암 적응증 중 사례들의 개수 및 백분율을 제시한다: ≥1, ≥50, ≥100, ≥150, ≥200, ≥250. 표 10은 또한 각 적응증에서 시험된 샘플들에 걸쳐 평균 H-점수를 포함한다. Axl 반응성에 대한 이들 평균 H-점수는 또한 도 21에 나타낸 막대 그래프로 비교하였다.
Figure pct00036
H-점수 분석에 따르면, 모든 적응증은 종양 중 Axl 원형질 막 염색에 대해 매우 낮았다(평균 적응증 H-점수 <25). 그러나, 최고 전반적 반응성은 미처리 흑색종 및 다른 모든 미처리 적응증 대비 이전에-처리된 흑색종 사례(화학치료, IO 및 TKI 요법)에서 관찰되었다.
종양 중 Axl 원형질 막 발현 또한 백분율 점수로 평가하였다. 백분율 점수 분석에 대한 요약 표를 아래와 같이 제공하였다.
표 11은 다양한 비율의 종양에서 1+, 2+ 또는 3+ (≥1+)의 강도를 고려할 때 각각의 암 적응증 중 양성 사례의 개수 및 백분율을 제시한다.
Figure pct00037
표 12는 다양한 비율의 종양에서 2+ 또는 3+ (≥2+)의 강도를 고려할 경우, 각각의 암 적응증에서의 양성 사례의 개수 및 백분율을 제시한다.
Figure pct00038
표 13은 다양한 비율의 종양에서 3+ (> 3+)의 강도를 고려할 경우, 각각의 암 적응증에서 양성 사례의 개수 및 백분율을 제시한다.
Figure pct00039
양성에 대한 컷-오프로서 > 1%의 종양 세포 중 >1 + Axl 염색의 기준을 사용할 경우, 각 적응증에 대한 사례의 하기의 개수 및 백분율은 양성으로 고려될 것이다: 흑색종- 4/31(13%), 이전에-처리된 흑색종- 5/16(31%), 난소암- 10/52(19%), 췌장암- 6/31(19%), 폐암- 12/43(28%), 및 전립선암- 1/51(2%). 표 10~13을 사용하여 다른 양성 역치/컷-오프를 고려하였다.
Axl이 원형질 막 상의 종양 세포에서 주로 발현되지만, 이것은 또한 세포질에 국한된다. 많은 경우에, 종양 중 세포질 Axl 반응성은 부재하거나 약했다(0 또는 1+ 강도). 그러나 종양 세포질 중 강한 (2+ 또는 3+ 강도) Axl 발현을 보인 일부 샘플이 관찰되었다. 이러한 염색은 Axl 발현의 상당한 측정값일 수 있다.
0이 넘는 Axl 원형질 막 또는 세포질 발현을 보여주는 종양 스크린 샘플이 관찰되었다. 이들 샘플은 Axl 원형질 막 염색이 없는(0에서 100%) 샘플을 포함하지만, > 2+에서 >10%의 세포질 염색을 포함하였다. 이들 샘플은 Axl 원형질 막 반응성이 없지만 상당한 Axl 세포질 염색이 있는 사례를 나타낸다. 이러한 사례는 Axl 양성을 판단할 때 포함 기준으로 간주될 수 있다.
정상 조직 중 Axl 및 CD68의 특이성 시험( C부 )
표 6 및 표 7에 기재된 IHC 방법을 사용한 표적에 대한 Axl 및 CD68의 특이성. FDA-권장 다중-정상 인간 조직 마이크로어레이(TMA)로부터의 96개 상이한 조직을 사용하여 특이성 시험을 수행하였다. TMA(P1478Q0035)를 표 9에 충분히 기재된 바와 같이 Pantomics, Inc(Cat # MNO961, 다중-정상 인간 조직, FDA, 96개 샘플, 3 개체들에서 유래된 35 장기/부위, 1.5mm)에서 구입하였다. 모든 정상 조직 샘플의 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 조직학적으로 염색하고, Axl, CD68, 및 마우스 IgG1로 IHC-염색하였다.
모든 염색된 정상 조직을 상기의 종양 막 P 점수 섹션에 기재된 Axl 원형질 막에 대한 H-점수 방법을 사용하여 평가함으로써, (종양과 대조적으로) 정상 조직 구성요소를 평가하였다. 이와 같은 특이성 시험에 대한 평점 데이터는 또한 CD68 바이오마커를 사용한 각각의 정상 조직 전체의 대식세포의 추정된 존재비(0~3)를 포함하였다. 정상 조직에서 Axl 및 CD68에 대한 특이성 데이터를 수득하였다.
Axl은 정상적인 고환 샘플의 세르톨리 세포에서 반응성을 제외하고, 시험대상이 된 정상 인간 조직에서 비반응성 원형질 막 염색(0에서 100%)을 보여주었다. 이와 같이, 이러한 특이성 시험은 Axl 항체 및 IHC 시험이 고환의 종양 세포 및 하위집합 정상 세포에서의 표적에 특이적임을 시사하였다.
CD68 염색은 시험대상인 정상 조직 전반에 걸쳐 대식세포 존재비의 범위를 나타내었다. 정상 조직에서 Axl 및 CD68 발현이 관찰되었다. 마우스 IgG1 아이소타입-일치 음성 대조군은 시험대상인 모든 정상 조직에서 비반응성이었다.
Axl 및 CD68 정밀도 및 재현성 시험( D부 )
민감성 스크린의 결과가 흑색종, 난소암, 췌장암, 및 폐암 적응증에서 Axl 및 CD68 IHC 검정의 정밀도 및 재현성을 시험하기 위한 적절한 조직을 식별하는 데 도움이 되었다. 전립선암은 적응증이 종양 세포에서 Axl 원형질 막 반응성의 경우 거의 완전히 음성이기 때문에(50/51 샘플이 강도 0에서 100% 종양 염색을 보임) 금증에 포함되지 않았다.
흑색종, 난소암, 췌장암, 및 폐암의 검증을 위해, 종양 세포에서 Axl 원형질 막 염색의 범위를 보여주는 적응증당 4개 종양 샘플을 사용을 위해 선택하였다. Axl 발현에 기초하여 샘플을 선택하였고 CD68 바이오마커과 일련되게 수행함으로써 조합된 시험을 입증하였다. CD68과 함께 실행된 샘플은 Axl에 대해 선택된 것과 동일해야 했기 때문에, CD68 염색의 범위는 각각의 적응증 내에서 반드시 관찰되지는 않았으나, 전체 세트 전반에 걸쳐 반영되었다.
각각의 적응증에 대한 각각의 샘플은 표 7의 IHC 검정 및 단일 실시(정밀도)에 전술된 프로토콜에 따라 Axl 및 CD68 모두에 대해 삼중으로 실행하였다. 비-연속적으로 며칠에 걸쳐 수행된 2개의 별도의 실행에서, 동일한 샘플을 동일한 및 상이한 작동자에 의해 Axl 및 CD68와 함께 삼중으로 수행하였다(재현성). 일련의 절편으로서 모든 복제 슬라이드를 준비하였다(슬라이드 준비 사이에 물질의 손실이 최소인 슬라이드당 조직의 한 절편).
다시 말해서, 인트라-검정(intra-assay)(정밀도) 및 인터-검정(inter-assay)(재현성)을 Axl 및 CD68에 대한 4개의 선택된 종양 샘플 중 각각의 3개 복제 절편(실행당)을 가진 3-실행 시리즈를 사용하여 결정함으로써, 각 샘플에 대해 9개 복제 한 세트가 야기되었다. 상이한 TechMate 기구(작동자 1, 실행 1; 작동자 1, 실행 2; 작동자 2, 실행 3)를 사용하여 2명의 조작자가 검정을 시행하였다. 각 실행에 포함된 양성, 표준, 및 음성 대조군은 예상대로 반응하였다.
검증 도중 염색된 모든 복제는 검토 및 점수화하였다. 종양 중 Axl 원형질 막 염색을 백분율 점수 ≥1+를 사용하여 평가하였다. 정밀도 및 재현성 시험을 위해, ≥1+ 강도(≥10인 백분율 점수 ≥1+)에서 10% 또는 그 초과 종양 세포 염색을 가진 샘플은 양성(POS)이라 불린다. 염색이 0~9%의 종양 세포에서 ≥1+에서 존재하는 경우, 또는 <1+ 염색만이 관찰되는 경우, 샘플은 음성(NEG)이다. CD68은 상기의 종양 막 P 점수 섹션에 기술된 바와 같이 종양 중 대식세포의 추정된 백분율에 대해 평가하였다.
정밀도 및 재생산 가능 실험을 위한 복제는 각 샘플에 대한 민감성 스크리닝 중에 Axl 및 CD68로 염색된 절편과 비교되는 바와 같이, 병리학자에 의해 허용가능한 것으로 간주되었다. 복제에 대한 통계적 분석을 비롯한 전체 검증 평점 결과를 흑색종, 난소암, 췌장암, 및 또는 폐암에 대해 수득하였다.
종양 염색의 패턴, 백분율, 및 강도에 대해 모든 복제물에서 Axl 반응성의 유사한 세포 패턴을 관찰하였다. 또한 종양 중 CD68 염색의 동일한 백분율을 각 복제물에서 추정하였다. 이와 같은 일관성을 흑색종, 난소암, 췌장암 및 폐암의 경우 Axl 및 CD68에 대해 관찰하였다. 각각의 적응증에 대해 상응하는 마우스 IgG1 음성 대조군을 제공하였다.
통계적 분석 및 신뢰 구간 평가
염색 패턴의 일관성의 평가, 반-정량적 점수의 통계적 분석 및 동의/일치된 추정치의 백분율을 통해 IHC 검정 검증의 허용/거부를 결정하였다. 정밀도 및 재현성 시험의 허용은 백분율 동의에 의해 계산된 선택된 95% 신뢰 구간(CI)의 하한치가 85%를 충족시키거나 또는 초과하도록 요구한다. 일반적인 기준 또한 복제물 사이의 평균 표준 오차(SEM)가 5를 초과하지 않고, 변동 계수(CV)가 20%를 초과하지 않음을 언급하였다(백분율 점수 값이 ≥ 10인 샘플의 경우).
종양 중 Axl 백분율 점수 ≥1+ 및 CD68 백분율 점수에 대한 요약된 검증 평점 결과; 각 복제물 세트에 대한 평균 표준 편차(표준 편차), 평균의 표준 오차(SEM) 및 변동 계수(CV)가 표 14에 제시된다. ≥1의 강도에서 ≥10% 종양 세포 염색의 Axl에 대한 양성 컷-오프를 정밀도 및 재생산 가능 분석을 위한 이들 샘플의 평가에 적용하였다.
Figure pct00040
각각의 바이오마커에 대해 시험된 4개의 사례에서 유래된 9개 복제물의 각 세트에 대한 SEM는 1.8을 초과하지 않았고 CV는 20%를 초과하지 않았다(백분율 점수가 ≥1+ >5인 사례의 경우). 폐암 샘플 QMTB249-3에 대한 Axl 백분율 점수는 시험대상인 복제물들에서 1에서 5까지의 범위였다. 이와 같은 변이는 FFPE 조직 블록이 연속적으로 절편화되면서 반응성 세포의 클러스터에서 환원에 의해 유발되었다. 이것은 80%의 CV 값을 초래하였으나, SEM은 매우 낮은 0.6이고, 표준 편차는 겨우 1.7이었다.
백분율 점수가 낮은 경우, 복제물들 간의 차이는 시험의 속성 상 더 높은 CV 값으로 해석된다. 백분율 점수가 <10인 경우에, 상기 샘플은 허용 가능한 것으로 간주될 수 있다. 샘플 QMTB249-3을 허용 가능한 것으로 간주되었고, 다른 모든 샘플은 정의된 한계 내에 존재하였다.
Axl에 대한 신뢰 구간 평가를 표 15에 나타내었고, 이것은 95% 신뢰 구간(CI)에 대한 양성/음성 염색 동의 및 평균, 표준 편차, 평균(SEM)의 표준 오차 및 미리 정의된 Z-값을 포함한다. 이와 같은 평가를 위해, CI를 계산하기 위해 사용되는 기준점은 대다수의 Axl 복제물에 대한 염색 결과(양성 또는 음성)에 기반하였다. 예를 들어, 흑색종 샘플 Q2832에 대한 9/9 복제물은 Axl에 대해 양성이었다. Q2832 복제물이 음성인 경우, 이것은 다수에 대해 반하는 것이고 CI를 더 낮출 것이다. 그러나, 불일치 결과는 발견되지 않았다.
Figure pct00041
전체적으로, Axl 정밀도 및 재현성 연구에서 쌍 비교는 흑색종, 난소암, 및 폐암에서 36개 일치 및 0개 불일치 결과를 야기하였다. 췌장암에서, 35개 일치 및 0개 불일치 결과가 관찰되었다(하나의 염색된 샘플은 평가가능한 것이 아니었다) (표 15). 이와 같이, Axl에 대한 107/107 시험은 적절한 다수와 일치하였다. Axl IHC 검정에 대한 허용 기준은 95% CI로 충족되었다.
인간 흑색종, 난소암, 췌장암 및 폐암 적응증에서 검출을 위한 Axl 및 CD68 IHC 검정은 임상 시험에 사용하기 위해 성공적으로 검증된 것으로 간주되었다.
실시예 11: BA3011의 시험관 내 및 생체 내 활성
BA3011은 인간 Axl 및 사이노몰구스 원숭이 Axl 모두에 결합되지만, TME(pH 6.0~7.0)를 모방하는 조건에서 고친화도 및 특이성을 가지고 마우스 또는 랫트 Axl에는 결합되지 않고, 정상 조직 환경(pH 7.3~7.4)을 모방하는 조건에서 결합 감소를 갖는다(Stubbs 2000; Gillies 1994; van Sluis 1999; Estrella 2013; Anderson 2016). 시험관 내 기능적 검정에서, BA3011은 종양 조건에서 인간 암 세포주를 발현하는 Axl의 세포 독성을 유도하는 능력을 입증하였으나 정상적인 조건에서 세포독성을 감소시켰다.
BA3011의 항종양 효능은 또한 면역-결핍된 동물에서 Axl을 발현하는 인간 종양 세포주 유래 이종이식편 종양을 사용하여 생체 내에서 입증되었다. NSCLC(LCLC103H), 전립선(DU145) 및 췌장 종양(MIAPaCa2)을 나타내는 종양 세포주는 이와 같은 생체 내 마우스 모델 시스템에서 시험되었다. 종양이 약 150 mm3의 크기로 성립되면, 표시된 일정에 따라 표시된 용량 수준으로 동물을 BA3011로 처리하였다. 모든 시험 모델에 대해 입증된 대조군 대비 종양 성장 억제(TGI)를 도 17a~17d에 나타내었다. BA3011은 도 17d에 나타낸 바와 같이 시험대상인 7개 모델 중 4개에서 70%를 초과하는 TGI를 유도하였다. BA3011은 시험대상 용량 및 일정에서 체중 감량을 유도하지 않았고, 독성의 기타 임상 징후가 주목되지 않았다.
실시예 12: 생체 내 독성학 및 약동학
초기 용량-범위 발견 연구에서, 이어서 확정적인 우수 실험실 관리기준 반복 용량 독성학 연구 원숭이를 대상으로, BA3011의 비임상 정맥내(IV) 독성을 평가하였다. 사이노몰구스 원숭이를 독성학 종으로 선택하고 BA3011이 사이노몰구스 Axl 단백질에 교차-반응하는 반면, BA3011은 설치류 효소에 대한 결합이 결여되었다. BA3011로 관찰된 독성 중 중 다수는 MMAE에 접합된 다른 ADC와 유사하다.
1, 5, 또는 10 mg/kg/용량의 복용량으로 1일차 및 22일차에 IV 서방 볼러스 주사에 의한 총 2회 투약을 위해 사이노몰구스 원숭이에 BA3011의 투여는 10 mg/kg/용량의 경우 암컷의 조기 사망을 초래하였고, 5 및 10 mg/kg/용량의 경우 암컷과 수컷 모두 불리한 혈액학적 변경을 초래하였고, 10 mg/kg/용량의 경우 수컷에서, 5 mg/kg/용량의 경우 암컷에서 림프양 장기의 불리한 병리적 변경을 초래하였다. 체중, 심전도(ECG), 안과학, 또는 요검사에서는 본 연구에서 시험된 임의의 용량 수준에서 시험 항목-관련 변경이 관찰되지 않았다. 5 및 10 mg/kg/용량에서의 결과를 기초로, 수컷 및 암컷 모두의 경우, BA3011의 유해 효과 미관찰 수준(NOAEL)은 1 mg/kg/용량인 것으로 간주되었다. 1 mg/kg/용량에서, 22일차에 BA3011의 그룹 평균 최대 혈장 노출(C0)은 20.0 ㎍/mL였고, 농도 대 시간 곡선(AUC)0-inf 하의 면적은 376 ㎍ㆍh/mL였다. 최고 비중증 독성 용량(HNSTD)은 5 mg/kg/용량으로, 22일차에 C0은 111 ㎍/mL이고 AUC0 - inf는 2370 ㎍ㆍh/mL였다. 임상 시작 용량(0.3 mg)의 투사된 노출에 기초하여, 원숭이의 HNSTD은 0.3 mg에서 투사된 인간 AUCττ(253 ㎍ㆍh/mL)보다 9.4배 높고, 투사된 인간 최대 관찰 농도(Cmax), 7.87 ㎍/mL)보다 14배 높다.
실시예 13: 단계 I/II 연구
이는 진행된 고형 종양을 가진 12세 이상의 성인 및 청소년 환자에게서 BA3011 단독으로 그리고 니볼루맙과 병용하여 안전성, 내약성, PK, 면역원성 및 항종양 활성을 평가하도록 설계된 다중-중심, 개방 표지, 단계 1/2 연구이다.
단계 1은 순차적인 2부, 즉 용량 증량 및 용량 확대를 포함하고, 진행된 고형 종양을 가진 성인 환자에게서 BA3011의 안전성 및 내약성을 평가하고 BA3011에 대한 MTD 및/또는 RP2D를 식별하기 위해 설계된다.
단계 2는 진행된, 불응성 육종을 가진 성인 및 청소년 환자에게서 BA3011 단독으로 그리고 니볼루맙과 병용하여 효능 및 안전성을 평가하기 위한 개방 표지 연구이다. 상기 연구는 스크리닝 기간(제1 용량 이전 최대 28일), 치료 기간, 치료 종료(EOT) 방문(IP 중단 또는 IP의 마지막 용량 28일 이내) 및 추적 기간(후속 방문 1[IP의 마지막 용량으로부터 3개월] 및 후속 방문 2 및 그 후[후속 방문 1 후 3개월마다])로 구성된다.
단계 I:
일차:
● 진행된 고형 종양이 있는 환자에게서 BA3011에 대한 용량 제한 독성(DLT)을 비롯한 안전성 프로파일을 정의하고, 최대 허용 용량(MTD) 및/또는 권장된 단계 2 용량(RP2D) 및 다른 안전성 파라미터를 결정하기.
이차:
● BA3011의 약동학(PK)을 가늠하기.
● BA3011의 항종양 활성을 가늠하기.
● BA3011의 면역원성을 평가하기.
단계 II 연구
일차:
● BA3011 단독 및 니볼루맙 병용의 항종양 활성을 가늠하기.
● BA3011 단독 및 니볼루맙의 병용의 안전성을 가늠하기.
이차:
● BA3011 단독 및 니볼루맙의 병용의 임상 활성의 특징을 추가로 규명하기.
탐구적:
● BA3011 단독 및 니볼루맙의 병용의 PK를 가늠하기.
● BA3011 단독 및 니볼루맙의 병용의 면역원성을 평가하기.
● 종양 Axl 상태 및 BA3011에 대한 임상 반응 사이의 관계를 탐구하기.
● 환자 선별을 위한 잠재적 후보 종양 및 혈액-기반 바이오마커 또는 BA3011의 항종양 활성과의 상관관계를 평가하기.
일차 평가변수
단계 1:
● 안전성: DLT, MTD 및/또는 RP2D, 부작용(AE), 심각한 유해 사건(SAE) 및 실험실 파라미터 및 활력 징후에서 기준선으로부터의 변경.
단계 2:
● 효능: 전체 반응 속도(ORR).
● 안전성: AE, SAE 및 실험실 파라미터 및 활력 징후에서 기준선으로부터의 변경.
이차 평가변수
단계 1:
● BA3011의 PK: ADC의 혈장 농도, 총 항체 및 MMAE 및 Cmax 및 AUC를 비롯한 PK 파라미터.
● 효능(확대 코호트 단독): ORR, 질환 통제율(DCR), 반응까지의 시간(TTR), 반응의 지속기간(DOR), 최상의 객관적 반응(OR), 무진행 생존(PFS), 전체 생존(OS) 및 종양 크기에서 기준선으로부터의 변화 백분율.
● BA3011의 면역원성: 검출 가능한 항-약물 항체(ADA)를 발전시키는 환자의 명수 및 백분율.
단계 2:
● 효능:
- DOR
- PFS
- 최상의 OR
- DCR
- TTR
- 12주차에 무진행율(PFR)
- OS
- 종양 크기에서 기준선으로부터 변화 백분율
탐구적 평가변수
단계 2:
● BA3011의 PK: ADC의 혈장 농도, 총 항체 및 MMAE, 및 Cmax 및 AUC를 비롯한 PK 파라미터.
● BA3011의 면역원성: 검출 가능한 ADA가 있는 환자의 명수 및 백분율.
● 종양 Axl 상태 및 BA3011에 대한 임상 반응 사이의 관계.
● 환자 선별을 위한 잠재적 후보 종양 및 혈액-기반 바이오마커 또는 BA3011의 항종양 활성과의 상관관계.
포함 기준:
1. 단계 1: 환자는 반드시 조직학적으로 또는 세포적으로 확인된 국소적으로 진행된 절제 불가능한 또는 전이성 고형 종양이 있어야 하며, 이용가능한 표준 치료(SoC) 요법에 실패하였고, 그 환자를 위한 이용가능한 치유적 요법이 제공되지 않거나 또는 표준 요법에 적합하지 않거나 불내성이거나 또는 거부해야 한다.
단계 2: 환자는 반드시
- 조직학적으로 또는 세포적으로 확인된 국소적으로 진행된 절제 불가능한 또는 전이성 육종을 가져야 한다.
- 등록하기 전 6개월 이내에 고형 종양의 반응 평가 기준(RECIST) 버전 1.1 기준에 따른 문서화된 진행이 있어야 한다.
- 화학요법에 부적합하거나 또는 안트라사이클린 및, 영역 처방 정보와 관련하여 적용 가능한 경우, 파조파닙, 트라벡테딘, 에리불린 메실레이트, 또는 타제메토스타트를 비롯한, 전이성 질환용 전신 요법의 최대 3가지 사전 라인(조합 요법의 2개 라인 이하)을 함유하는 요법을 적어도 1회 받았어야 한다. 선행 치료에 대한 요건이 치료가 승인되지 않은 육종 하위유형에 적용되지 않는다.
2. 환자는 반드시 RECIST v1.1에 따른 측정가능한 질환을 가지고 있어야 한다. 이전에 방사선이 방출된 종양 병변은 표적 병변으로 간주되어서는 안 된다.
3. 단계 1: 환자는 반드시 연령이 18세 이상이어야 한다.
단계 2: 환자는 반드시 연령이 12세 이상이어야 한다.
4. 환자는 ECOG 수행 상태가 0 또는 1이어야 한다.
5. 환자는 기대 수명이 적어도 3개월이어야 한다.
6. 보관된 종양 조직 또는 생검에 적합한 조직은 Axl에 대한 후원자 및 다른 유전자 발현 시험에 이용 가능해야 한다. 모든 환자는 바이오마커 연구를 위해 전처리 종양 시편을 제공하는 것을 동의해야 한다. 기록 조직이 이용할 수 없는 경우, 환자는 스크리닝 중에 종양 생검을 받기로 동의해야 한다. 코어 바늘(최소한 3 개 코어 샘플이 요구됨) 또는 절제 생검 또는 절제된 조직 시편이 필요하다.
7. 단계 1 용량 확대 및 단계 2에서, 환자는 BioAtla Axl IHC 검정에 기초한 기록 조직 또는 생검에 기초한 BioAtla Axl IHC 검정에 의해 결정된 Axl-양성 질환을 가져야 한다; 충분한 수량의 세포가 수득되도록 하기 위해서 최소한 3개의 코어 샘플이 요구된다. 단계 1 용량 확대의 경우, Axl 발현 컷오프는 ≥10% 종양 세포 중 ≥1+이다. 단계 2의 경우, 70이상의 백분율 점수(1+, 2+, 및 3+ 강도로 이루어짐)가 양성으로 간주된다.
8. 환자는 반드시
- 제1 연구 용량 이전인 적어도 5 반감기 또는 2 주에 방사선요법, 화학요법으로의 임의의 선행 치료, 및/또는 다른 조사 항암제로의 치료, 또는 제1 연구 용량 이전 적어도 4주에 생물제제(예컨대, 단클론성 항체 [mAb])로의 치료를 완료했어야 한다(치료-관련 독성에서 회복되어야 함). 예외는 비스포스포네이트, 데노수맙 및 고나도트로핀-방출 호르몬 효능제 또는 길항제이다.
- 제1 연구 용량 이전 적어도 6주에 질소 머스타드 제제, 멜팔란, 또는 카무스틴(BCNU) 요법으로의 임의의 선행 치료를 완료했어야 한다.
- 제1 연구 용량 이전 적어도 8주에 임의의 사전 자가 조혈 줄기 세포 주입을 받았어야 한다.
9. 환자는 적절한 장기 기능을 가져야 한다. 다음은 필요한 기준선 실험실 값이다:
- 절대적인 호중구 수가 ≥ 1,500/μL 또는 1.5 x 109/L임.
- 혈소판이 ≥ 100,000/μL 또는 100 x 109/L임.
- 헤모글로빈이 ≥9.0 g/dL임.
- 빌리루빈이 ≤1.5 x 정상의 상한치(ULN)임.
- 혈청 크레아티닌이 ≤1.5 x ULN임.
- 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) ≤2.5 x ULN; 간에 전이가 있는 경우, ALT 및 AST ≤5 x ULN.
단계 2에만:
- INR < 1.7 또는 프로트롬빈 시간 대조군 넘어 < 4 초임.
- 알부민이 > 3.5 g/dL임.
10. 환자는 독성 치료 기관에서 주기적인 혈액 샘플링, 연구-관련된 평가 및 독성 관리를 위해 접근 가능해야 하며, 예상된 약물 투여 일정을 기꺼이 준수해야 한다.
11. 가임 가능성이 있는 여성은 BA3011의 제1 용량 이전에 음성 혈청 또는 소변 임신 시험 결과를 가지고 있어야 하고, 본 연구의 과정 중에 효과적인 피임 방법, 장벽/자궁내 방법 또는 호르몬 방법을 사용하기로 동의해야 한다.
- 비아동-잉태 잠재성을 가진 여성은 폐경후 1 년이 지났거나, 또는 양측 난관 결찰 또는 자궁절제술을 받은 이들이다.
- 가임/재생산적 잠재성을 가진 여성과 남성 모두 포함된 연구에서 BA3011의 마지막 주입 후 6개월 동안 본 연구에 포함된 효과적인 피임법을 사용할 것에 동의해야 한다.
12. 환자 또는 그의 법적으로 허용 가능한 대표 또는 법적 후견인(들)이 서면 고지에 의한 동의서를 제출해야만 했다. 환자 동의는 < 18 세 미만의 환자의 경우, 수득되어야 한다.
제외 기준:
1. 환자는 조사자의 판단 하에 임상적으로 유의미한 심장 질환을 가지고 있지 않아야 한다.
2. 환자는 반드시 치료가 필요한 알려진 울혈성 심부전(New York heart association II-IV) 또는 심각한 심장 부정맥이 없어야 하고; 안정한 상태에 있고 ≥ 3개월 동안의 약물처치를 받은 환자가 등록될 수 있다.
3. 적당한 (아동-Pugh B) 또는 중증(아동-Pugh C) 간 손상이 있는 환자. 단계 1 단독의 경우, 경미한(아동-Pugh A) 간 손상이 있는 환자의 경우, 초기 BA3011 용량은 1Q3W(1일차)에 1.2 mg/kg를 초과해서는 안 되고, 또는 (1일차 및 8일차) 2Q3W에 1.2 mg/kg을 초과해서는 안 된다.
4. 중증 신장 손상(30 mL/분 미만의 CrCL)이 있는 환자.
5. 환자는 알려진 비-제어된 중추신경계(CNS) 전이가 없어야 한다.
6. 단계 1 단독: 환자는 제1 BA3011 투여 2주 이전에 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 또는 과립구/대식세포 집락 자극 인자를 받지 않았어야 한다.
7. 환자는 본 연구 기간 동안 주어진 임의의 제제에 대한 알려진 또는 의심되는 알러지 또는 불내성 뿐만 아니라 mAb 요법에 대한 3등급 이상의 알러지성 반응의 이력이 있어서는 안 된다.
8. 환자는 제1 BA3011 투여 4주 전 내에 대수술을 받은 적이 없어야 한다.
9. 환자는 대뇌내 동정맥 기형, 대뇌 동맥류, 또는 뇌졸중의 임의의 이력이 없어야 한다.
10. 환자는 페이로드를 표적으로 삼는 선행 요법을 받지 않았어야 한다.
11. 환자는 치료가 요구되는 활성 및/또는 진행성인 알려진 추가의 악성종양이 있어서는 안 되고; 다른 악성종양일 명확하게 치료받았고 질환으로부터 자유롭게 된 환자가 적격일 것이다.
12. 환자는 2등급 이상 말초 신경병증이 있어서는 안 된다.
13. 환자는 전신 항생제/항바이러스제/항진균제를 요구하는 임상적으로 유의미한(조사자의 판단 하에) 활성 바이러스, 박테리아 또는 진균 감염이 있어서는 안 된다.
14. 환자는 알려진 HIV, 활성 간염 B 및또는 간염 C가 있어서는 안 된다.
15. 환자는 임신한 또는 모유 수유 중인 여성이 아니어야 한다.
16. 환자는 다른 항-신생물 또는 실험 제제와 함께하는 동반 요법을 사용하는 중이어서는 안 된다.
17. 단계 1 단독: 환자는 12 mg/일 프레드니손 등가물을 초과하는 코르티코스테로이드를 이용한 동반 요법을 받는 중이어서는 안 된다.
18. 환자는 적당한 또는 강한 CYP3A 유도제 또는 억제제, 예컨대 칸나비디올을 사용하는 중이어서는 안 된다.
19. 환자는 P-당단백질 (P-gp) 억제제를 사용하는 중이어서는 안 된다.
20. 환자는 조사자 또는 의료 모니터의 견해에 의하면, 계획된 치료를 받거나 또는 용인하는 그것의 능력을 손상시킬 임의의 심각한 기저 의학적 상태가 있어서는 안 된다. 그와 같은 경우에, 후원자-지정 의료 모니터가 환자 등록 이전에 각 사례를 검토해야 한다.
21. 환자는 임의의 임상적으로 유의미한 늑막, 심장주위, 및/또는 복막 삼출(예를 들어, 정상 장기 기능에 영향을 미치고 경피 배수 또는 이뇨제 대조군을 요구하는 삼출)이 있어서는 안 된다.
22. 환자는 간 뇌병증; 신체 검사에서 측정한 바와 같이 임의의 현재 임상적으로 유의미한 복수; 또는 활성 약물 또는 알코올 남용의 임의의 이력이 있어서는 안 된다.
23. 단계 2 단독: 니볼루맙과의 병용 요법에 적합한 환자가 되기 위해서, 환자는 간질 폐 질환, 비-감염성 폐렴, 또는 통제되지 않는 질환, 예컨대 폐 섬유증, 급성 폐 질환 등의 이력이 있어서는 안 된다.
24. 단계 2 단독: 니볼루맙과의 병용 요법에 적합한 환자가 되기 위해서, 환자는 등록 전 4주 이내에 생백신을 투여받은 적이 없어야 한다.
주석: 독감용 계절성 백신은 일반적으로 불활성화된 백신으로 허용된다. 비강내 백신은 생백신이고 허용되지 않는다.
25. 단계 2 단독: 니볼루맙과의 병용 요법에 적합한 환자가 되기 위해서, 활성, 알려진, 또는 의심되는 자가면역 질환이 있는 환자는 배제된다. 전신 치료가 필요하지 않은 유형 1 진성 당뇨병, 오직 호르몬 대체를 요구하는 갑상선기능저하증, 피부 장애(예컨대 백반증, 건선, 또는 탈모증), 또는 외부적 촉발제의 부재 하에 재발할 가능성이 없는 조건을 가진 환자가 등록이 허가될 수 있다.
26. 단계 2 단독: 니볼루맙과의 병용 요법에 적합한 환자가 되기 위해서, 환자는 등록 전 14일 이내에 코르티코스테로이드 (프레드니손 또는 등가물 매일 > 10 mg) 또는 다른 면역억제 약물로 전신 치료를 요구하는 임의의 질환이 있어서는 안 된다.
주석: 다음의 스테로이드 요법 중 임의의 것으로 현재 치료 중이거나 이전에 치료 받았던 환자는 배제된다:
- 부신 대체 스테로이드 (프레드니손 또는 등가물을 매일 ≤ 10 mg의 용량으로).
- 최소 전신 흡수를 보이는 국부, 안구, 관절내, 비강내, 또는 흡입된 코르티코스테로이드.
- 예방적으로 처방된 코르티코스테로이드(예를 들어, 대비염색 알러지) 또는 비-자가면역 상태의 치료를 위한(예를 들어, 접촉성 알러지항원에 의해 유발된 지연형 과민증 반응) 짧은 과정 (≤7일).
27. 단계 2 단독: 니볼루맙과의 병용 요법에 적합한 환자가 되기 위해서, 환자는 사전 동종이형 줄기 세포 이식 또는 장기 이식이 있어서는 안 된다.
단계 1 용량 증량 (BA3011 단독; 21일 주기)
단계 1 용량 증량 중에, 진행된 고형 종양이 있는 성인 환자를 순차적으로 등록하여 표 16에 나열된 계획된 용량 수준으로 IV 주입을 통해 BA3011를 투여받았다. BA3011은 각 코호트에 할당된 용량 수준에 따라 정맥내(IV) 주입을 통해 21일 주기의 1일차에만 또는 1일차 및 8일차에 3주마다 각각 1회(1Q3W) 또는 2회(2Q3W) 투여하였다. BA3011의 시작 용량은 0.3 mg/kg 1Q3W이었다. 각각의 코호트에서, BA3011의 제1 용량의 투여는 치료 받는 제1 및 제2 환자들 사이에 최소한 24시간의 시차를 두었다.
조사용 생성물, 복용량 및 투여 방식:
IV 주입으로 0.3 mg/kg 1Q3W(단계 1), RP2D (단계 2)에서 시작하는 BA3011, 용량 증량.
니볼루맙 (단계 2 단독): 18세 이상의 환자의 경우: 240 mg Q2W; 12~17세 환자의 경우: 3 mg/kg Q2W IV 주입.
치료의 지속기간:
환자는 질환 진행, 허용될 수 없는 독성, 또는 치료 중단에 대한 다른 이유가 있을 때까지 치료받을 것이다.
통계적 방법:
안전성 분석
MTD 평가는 DLT-평가가능 집단에 기초할 것이다. DLT-평가가능 집단은 적어도 BA3011의 1 전체 할당된 용량을 투여받고 DLT-평가 기간(투약 1일 후 21일차에 걸쳐 BA3011의 제1 용량으로부터 기간으로 정의됨)을 통해 안전성 후속 조치를 완료하거나 또는 DLT-평가 기간 동안 임의의 DLT를 경험하는, 단계 1 용량 증량에 등록된 모든 환자를 포함한다. 비-DLT-평가가능 환자는 대체될 것이다. 안전성 평가는 치료받은 집단에 기초할 것이다. 부작용(AE)은 조절 활성 의료 사전(MedDRA)에 의해 코딩되어, NCI CTCAE v4.03에 따라 등급화되고, 각각의 IP에 대한 유형, 발병률, 중증도 및 관계가 요약될 것이다. AE와 기준선 특징 사이에 관심대상의 임의의 연관성이 관찰되는 경우, 추가의 계층화된 결과가 제시될 수 있다. 모든 치료 후 발생한 AE는 MedDRA 기관계 분류 및 우선 용어에 의해 요약될 것이다. NCI CTCAE에 따른 독성 등급을 갖는 실험실 이상이 요약될 것이다.
효능 분석
단계 2에서 일차 효능 평가변수는 맹검 독립적 중심 검토(BICR)를 사용하는 RECIST v1.1에 따른 객관적 반응(OR)이다. 객관적 반응 속도(ORR)는 후속 항암 치료의 개시 이전에 발생하는 확인된 CR 또는 확인된 PR의 최상의 전반적인 반응을 갖는 대상체의 비율로 정의된다. ORR은 각각의 육종 하위유형에 대한 정확한 확률 방법 및 2개의 치료군(BA3011 단독 및 니볼루맙의 병용) 각각에서 전체를 사용하여 95% CI로 추정될 것이다. 다른 효능 평가변수는 반응의 지속기간(DOR), 무진행 생존(PFS), 최상의 전반적인 반응(OR), 질환 제어율(DCR), 반응까지 시간(TTR), 12주차에 무진행율(PFR), 전체 생존(OS) 및 직경의 표적 병변 합계에서 기준선으로부터의 변화 백분율이다. PFS 및 OS를 제외한 모든 효능 평가변수는 완전 분석 세트(FAS)에 주로 기초하여 요약될 것이다. PFS 및 OS는 처리된 바와 같은 집단에 기초하여 요약될 것이다. 시간 대 이벤트 데이터가 카플란-마이어 추정치를 사용하여 요약될 것이다. 반응 속도 및 그의 신뢰 구간은 정확한 확률 방법을 사용하여 추정될 것이다. 그래픽 분석은 변화에 대한 거미 및 폭포 플롯을 포함하고, 종양 크기의 기준선으로부터 최상의 변화를 포함할 것이다.
단계 1 용량 증량 중에, 진행된 고형 종양이 있는 대략 35명 내지 78명의 DLT-평가가능한 환자가, 코호트 확대 및 BA3011의 내약성에 따라 치료받을 것이다. 각각의 코호트는 단일-환자 코호트를 제외하고, 최소한 3명 및 최대한 6명의 환자를 필요로 할 것이다. 최소 6명 환자를 MTD에서 등록하였다.
표 16
BA3011 용량 증량을 위한 변형된-피보나치 방법
Figure pct00042
약어: 1Q3W, 3주마다 1회; 2Q3W, 3주마다 2회; int; 중간단계.
a 는 2.4 mg/kg 1Q3W 용량 수준에서 MTD를 나타낸다. 호중구감소증 예방과 무관하게 3 mg/kg 이상 투약된 추가 환자는 없을 것이다.
b 및 회색조 음영은 MTD의 확인에 기초하여 코호트 6-int 또는 7에서 어떤 환자도 투여되지 않았으며 투여되지 않을 것임을 표시한다.
용량 증량에 대한 규칙이 표 17 및 도 18에 제공된다(용량 증량 흐름도). 적어도 3+3 코호트에서 3명의 환자 또는 단일-환자 코호트에서 1명의 환자가 다음 코호트가 축적을 개시하기 전에 제1 주기(즉, DLT 평가 기간 중에) 21일의 안전성 평가를 완료했어야 한다. 단일-환자 코호트에서, 1명의 환자는 2 등급 이상의 독성이 관찰될 때에만 등록되고, 그 후 총 적어도 3명의 환자가 상기 용량 및 모든 후속 용량 수준에서 평가된다. 3+3 코호트에서, 21일 DLT-평가 기간 중에 첫 번째 3명의 환자에게서 DLT가 관찰되지 않을 경우, 다음 용량-수준 코호트까지 단계적 확대가 계속된다. DLT에 대한 기준이 하기에 제시되었다. 이들 환자로부터의 모든 이용가능한 안전성 데이터, 예컨대 제1 주기 이후에 발생한 독성이 다음 용량 수준으로 진전되기 전에 검토된다. 다음으로 명시된 용량 수준으로의 단계적 확대는 MTD가 식별될 때까지 계속된다.
단계 1 용량 증량 코호트에서의 등록은 표 17의 용량 증량 규칙에 기초하여, 도 18에서 나타낸 바와 같이 순차적으로 진행된다. MTD를 정의하기 위해, 환자는 제1 치료 주기 중에 BA3011의 실제 시작 용량에 따라 평가된다. 최대 투여된 용량(MAD) 및 MTD는 DLT의 발병률에 기초하여 결정된다. 페그필그라스팀의 공동-투여의 부재 또는 존재 하에 최대 허용 용량이 탐구된다. 코호트의 환자 6명 중 ≥ 2명이 DLT-평가 기간 중에 DLT를 경험하는 경우, MTD는 초과될 것이고, 상기 코호트에 추가 환자가 등록되지 않을 것이다. 앞의 코호트는 MTD에 대해 평가되고, 적어도 환자 6명은 사전 용량 수준에서 치료받을 것이다. 만약 환자 6명 중 ≤1명이 사전 용량 수준에서 DLT를 경험한다면, 이와 같은 용량 수준은 MTD로 간주된다. 최소한 환자 6명이 MTD에서 등록된다. 안전성 및 효능 데이터를 진화시킨다는 맥락에서, 투약 중인 코호트는 더 낮은 용량 수준, 예컨대 프로토콜에서 언급되지 않은 더 낮은 용량으로 중단 및/또는 계속될 것이다. MTD 및/또는 RP2D는 데이터의 전체에 기초하여 결정된다.
표 17
3-플러스-3 코호트에 대한 용량 증량 규칙
Figure pct00043
개별 환자는 질환 진행, 허용될 수 없는 독성, 또는 치료 중단의 다른 이유가 있을 때까지 BA3011로 투여는 계속된다. 더 높은 BA3011 용량 수준에서 용량-제한 호중구감소증의 관찰 후, 페그필그라스팀(또는 바이오시밀러)의 투여가 단계 1에서 환자에게 필요하고, BA3011의 매일 1회 주입 후 48 내지 72시간 사이에 발생해야 한다.
치료 배정
단계 1 용량 증량 중에, 환자는 표 17 및 도 19에 개략된 바와 같이 상승하는 BA3011 용량 수준의 코호트에 할당된다. BA3011은 각 코호트에 할당된 용량 수준에 따라, 각각 21일 주기의 1일차 단독, 또는 1일차 및 8일차에 IV 주입을 통해, 3주마다 1회(1Q3W) 또는 2회(2Q3W) 투여된다. 시작 BA3011 용량 수준은 0.3 mg/kg 1Q3W이다. 다음 명시된 용량 수준으로의 단계적 확대는 MTD가 식별될 때까지 계속된다. 안전성 및 효능 데이터를 진화시킨다는 맥락에서, 투여 중인 코호트는 더 낮은 용량 수준, 예컨대 프로토콜에 언급되지 않은 더 낮은 용량으로 중단되거나 또는 계속된다. 단계 1 용량 확대는 BA3011 용량을 결정하고 치료 일정 환자는 단계 2에서 투여받고(예를 들어, RP2D), 이것은 Axl-발현, 진행된 고형 종양이 있는 환자에게서 수행된다. RP2D는 데이터 전체에 기초하여 결정되고, MTD를 초과하지 않는다. 본 연구의 단계 1 일부의 데이터에 기초할 때, 단계 2에 대한 BA3011의 용량은 1.8 mg/kg Q2W이다. Q2W 투약 요법에 대한 근거는 모든 2주 투약 일정(28일 주기; 주기당 2회 투약)을 사용하여 BA3011 단독 및 니볼루맙의 병용의 평가에 기초한다. Q3W 투약 중인 코호트에서 BA3011에 대해 입수 가능한 데이터를 근거로, 1Q2W 투약은 몇 개의 이점을 제공한다. 1Q2W 투약 일정은 시간 경과에 따라 더 낮은 Cmax로 환자 안전성을 개선할 수 있다. 또한, 1일차 및 8일차에 투약하는 2Q3W와 비교하여, 개별 투여 사이의 지속기간의 증가가 투여 사이에 더 많은 회복 시간을 제공하고, 그 결과로써, 부작용, 특히 줄어든 호중구 수 및 상승된 간 효소와 연관된 것에 대한, 발병률을 감소시킬 수 있다. 1Q2W 투약 일정은 또한 주기 전반에 걸쳐 더 높은 수준의 BA3011을 유지함으로써(즉, 더 높은 Cmin) 더 나은 효능을 입증한다. 최종적으로, 1Q2W 일정은 니볼루맙에 대한 표준 Q2W (240 mg) 투약 일정과 정렬되기 때문에, 병용 요법 코호트에서 환자에게 필요한 방문의 수를 감소시킨다.
단계 2의 경우, 등록 기준을 충족시키는 환자는 BA3011 단독으로 또는 니볼루맙과 병용하여 투여되도록 할당된다. B 세포 침윤(CD20 IHC 검정에 따르면)을 보이는 종양이 있는 환자는 우선적으로 니볼루맙과 병용하여 BA3011이 투여되도록 할당된다.
페그필그라스팀에 대한 알러지가 있는 경우, 필그라스팀(또는 바이오시밀러)이 치환될 수 있다. 3주기에서 시작하여, 페그필그라스팀 또는 필그라스팀은 자가-투여된다.
용량-제한 독성:
DLT는 21일 DLT 평가 기간 중에 다음의 기준 중 하나를 충족시키는 것으로 또는 제1 및 제2 주기 사이에 1주 이상의 용량 지연을 요구하는 임의의 등급의 치료 관련 독성으로 정의된다:
● 비-혈액학적 독성
- 비-혈액학적 독성의 경우, DLT는 하기를 제외한, 적어도 치료와 관련이 있을 수 있는, 임의의 미국 국립 암 연구소 (NCI) 유해 사례 공통 용어 기준(CTCAE) v4.03 (2010년 6월 14일 공개) 3등급 이상의 독성으로 정의된다:
● 3등급 피로.
● 24시간 미만으로 지속되는 3등급 메스꺼움 및 구토.
● 무증상이고 14일 이내에 1등급 또는 기준선(상기 환자가 기존 독성의 연구에 들어선 경우)으로 해결되는 3등급 비-혈액학적 실험실 이상.
● 3 또는 4 등급, 적절한 임상 개입으로 6시간 이내에 해소되는, 예방적 스테로이드의 부재 하에 처음 발생하는 알러지성 또는 과민증 반응.
● 혈액학적 독성
- NCI CTCAE v4.03을 사용한, 혈액학적 독성에 대한 DLT가 아래와 같이 정의된다:
● 4 등급 - 7일 넘게 지속되는 호중구감소증.
● 3 또는 4 등급 - 열병 호중구감소증.
● 4 등급 - 임의의 시간에 혈소판 수(< 25,000/mm3).
또한, 상기에 포함되지 않은 임상적으로 중요한 또는 지속적 독성 또한 PSC에 의한 검토 후 DLT로 간주될 수 있다. BA3011의 골수억제 잠재성의 관점에서, 임의의 호중구 독성이 예방적 페그필그라스팀을 투여 받은 환자의 경우 적어도 1 등급 또는 2 등급으로 해소될 때까지, 환자에게 주입되지 않음이 특히 중요하다.
최대 허용 용량
단계 1 용량 증량 코호트에서의 등록은 표 17의 용량 증량 규칙에 기초하여 도 18에 나타낸 바와 같이 순차적으로 진행된다. MTD를 정의하기 위해, 환자는 제1 치료 주기 동안 BA3011의 실제 시작 용량에 따라 평가될 것이다. 최대 투여된 용량(MAD) 및 MTD는 DLT의 발병률에 기초하여 결정될 것이다. 페그필그라스팀의 공동-투여의 부재 또는 존재 하의 최대 허용 용량이 탐구될 것이다. 코호트 환자 6명 중 ≥2명이 DLT-평가 기간 중에 DLT를 경험하는 경우, MTD는 초과되고 상기 코호트에 추가적으로 환자가 등록되지 않을 것이다. 상기 코호트는 이어서 MTD에 대해 평가받을 것이고, 적어도 환자 6명은 사전 용량 수준으로 처리될 것이다. 만약 환자 6명 중 ≤1명이 앞의 용량 수준에서 DLT를 경험한다면, 이와 같은 용량 수준이 MTD로 간주될 것이다.
단계 1 용량 확대 (BA3011 단독; 21일 주기)
단계 1 용량 확대는 RP2D(섹션 3.1.2.1)를 결정하는 데 도움이 되고, Axl-발현, 진행된 고형 종양이 있고, 적절하게 그리고 MTD를 초과하지 않게 결정된 용량 및 요법으로 BA3011을 투여받도록 등록된 대략 30명의 성인 환자에게서 수행된다. 환자내 투약은 재량껏 변형될 수 있다. 특이적 종양 유형이 있는 환자는 인원수가 제한되어, Axl-발현 고형 종양의 충분한 표현을 확보한다. 개별 환자는 질환 진행, 허용될 수 없는 독성, 또는 치료 중단의 또 다른 이유가 있을 때까지 BA3011로의 투약을 지속할 것이다.
권장된 단계 2 용량
RP2D는 데이터 전체를 기초로 결정될 것이나, MTD를 초과하지 않을 것이다. 연구의 단계 1 일부로부터의 데이터를 기반으로, 단계 2에 대한 BA3011의 용량은 1.8 mg/kg Q2W이다. Q2W 투약 요법의 근거는 다음과 같다.
BA3011은 모든 2-주 투약 일정(28일 주기; 주기당 2회 투약)을 사용하여 단독으로 그리고 니볼루맙과 조합하여 평가될 것이다. Q3W 투약 중인 코호트에서 BA3011에 대해 입수 가능한 데이터를 기초로, 1Q2W 투약은 몇 개의 이점을 제공할 수 있다. 1Q2W 투약 일정은 시간 경과에 따라 더 낮은 Cmax로 환자 안전성을 개선할 것이다. 또한, 1일차 및 8일차에 투약하는 2Q3W과 비교하여, 개별 투여 사이의 지속기간의 증가는 투여들 사이에 좀 더 긴 회복 시간을 제공하고, 그 결과, 부작용, 특히 호중구 수 감소 및 간 효소 상승과 연관된 것들의 발병률을 감소시킬 수 있다. 1Q2W 투약 일정은 또한 주기 전반에 걸쳐 BA3011의 더 높은 수준(즉, 더 높은 Cmin)을 유지함으로써 더 나은 효능을 입증한다. 최종적으로, 1Q2W 일정은 니볼루맙에 대한 표준 Q2W (240 mg) 투약 일정과 정렬되기 때문에, 병용 요법 코호트에서 환자에게 필요한 방문의 수를 감소시킨다.
단계 2 (BA3011 단독 또는 니볼루맙과 병용; 28일 주기)
단계 2는 Axl-발현 종양 막 백분율 점수(TmPS)가 ≥70이고, 진행된, 불응성 육종이 있으며, 고형 종양(RECIST) 버전 1.1 기준의 반응 평가 기준에 의해 측정가능한 질환이 있고, 등록 이전 6개월 이내에 RECIST v1.1 기준에 따라 문서화된 진행이 있는 성인 및 청소년 환자에게서 BA3011 단독 및 니볼루맙의 병용의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 개방 표지 연구이다.
등록된 환자는 화학요법에 부적합하거나 또는, 영역 처방 정보에 따라 적용가능한 경우, 안트라사이클린 및 전이성 질환에 대한 전신 요법의 최대한 3개의 사전 라인(조합 레지멘 2개 라인 이하), 예컨대 파조파닙, 트라벡테딘, 에리불린 메실레이트, 또는 타제메토스타트를 함유한 적어도 하나의 요법을 받아본 적이 있어야 한다. 등록 기준에 부합하는 환자는 할당되어 단독으로 또는 니볼루맙과 병용하여 BA3011를 투여받는다(18세 이상의 환자의 모든 경우: 2주마다 240 mg[Q2W]; 12~17세의 환자의 경우: 3 mg/kg Q2W IV 주입). 세포 침윤(CD20 면역조직화학 [IHC] 검정에 따르면)을 보이는 종양이 있는 환자가 우선적으로 할당되어, 니볼루맙과 병용하여 BA3011과 투입된다. 본 연구의 단계 1 일부로부터의 데이터에 기초하여, 단계 2에 대한 BA3011의 용량은 1.8 mg/kg Q2W이다. 등록은 모노요법 방식으로 육종 하위유형에 대해 대략 환자 10명으로 시작하여 단계적이 될 것이다. 최대 7개 육종 하위유형 그룹이 등록될 수 있다:
연조직 육종:
● 평활근육종
● 활막 육종
● 지방육종
● GIST, 돌출성 피부섬유육종, 염증성 근섬유아세포 종양, 및 악성 중피종을 제외한 다른 연조직 육종
뼈 육종:
● 골육종
● 다른 뼈 육종, 예컨대 미분화 다형성 육종, 악성 섬유질 조직구종, 및 연골육종
본 연구의 조합 방식(BA3011과 니볼루맙)으로, 임의의 육종 하위유형 환자 20명이 등록될 것이다. 이들 환자 20명 중에서, 대략 환자 10명이 CD20 IHC 검정에 의해 결정된 바와 같이 B 세포 침윤(CD20 양성)을 보이는 종양을 가지고 있고, 나머지 10명은 CD20 발현이 없는 환자(CD20 음성)이다. 종양 평가는 12주까지 C1D1에서 대략 6주마다, 그리고 그 후에 8주마다 이루어질 것이다. 약동학적, 약력학적(PD), 면역원성, 및 바이오마커 평가가 표 19에 기재된 시점에 수행될 것이다. 환자 안전성 모니터링이 등록시 시작되고, 조사용 생성물(들)(IP)의 최종 용량의 투여 후에도 계속될 것이다.
BA3011 PK, PD, 및 면역원성 시험을 위한 샘플 수집 시점이 표 18(단계 1) 및 표 19(단계 2)에 제시된다.
Figure pct00044
Figure pct00045
하위유형 또는 치료 시 적어도 환자 10명이 IP의 개시 후 적어도 12 주 동안 따를 잠재성을 가진 후 각각의 하위유형 또는 치료에 대한 중간 분석을 수행한다(즉, CD20 양성인 종양이 있는 환자에게서 니볼루맙과 병용하는 BA3011 또는 CD20 음성인 종양이 있는 환자에게서 니볼루맙과 병용하는 BA3011).
역치에 부합되는 육종 하위유형에 대해 환자 대략 150명이 추가로 등록될 수 있다. 등록된 환자 모두에 대한 치료는 질환 진행, 허용될 수 없는 독성, 또는 치료 중단의 다른 이유가 있을 때까지 계속된다.
투약 전 호중구 수 감소가 있는 환자를 위해 예방적으로 또는 호중구감소증의 발생을 치료하기 위해, 조사자의 재량으로 페그필그라스팀 또는 필그라스팀(또는 바이오시밀러)가 사용될 수 있다. BA3011 투여 이전에 ANC 수준이 3000/μL 미만이거나 또는 3 x 109/L인 환자는 호중구감소증의 위험이 증가될 것이다. 이들 환자를 위해, 예방적 페그필그라스팀 또는 필그라스팀(또는 바이오시밀러)이 BA3011 투여 후 48 내지 72 시간 내에 투여될 수 있다.
무작위 선택 및 블라인딩
두 단계 모두 개방 표지 및 비무작위이다.
연구 약물 물질 및 관리
연구 약물
BA3011
BA3011은 항-인간 Axl 세포외 도메인 재조합체로, 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생성되고 절단 가능한 링커를 사용하여 MMAE에 접합되는 전장 2가 인간화된 mAb (IgG1)이다.
니볼루맙
OPDIVO®(니볼루맙)은 상업적으로 입수 가능한 프로그래밍된 사멸 수용체-1 (PD-1) 차단 항체이다. OPDIVO®(니볼루맙)의 용도와 관련된 더 많은 정보는 처방 정보를 참조할 수 있다.
BA3011 용량 계산
용량 계산은 최근접한 전체의 kg으로 반올림된 중량을 기초로 한다. 중량이 >100 kg인 환자의 경우, BA3011의 용량은 100 kg에 대해 계산되어야 한다. 필요한 용량 부피는 다음의 식을 사용하여 계산된다:
Figure pct00046
부피는 가장 가까운 10분의 1 mL로 반올림되는데, 예를 들어, 0.24 mL의 경우 0.2 mL로, 0.25 mL의 경우 0.3 mL로 반올림된다. 상기 용량을 제공하기 위해 필요한 바이알의 수는 총용량 부피를 바이알당 명목 충전 부피(5 mL)로 나누어 계산되고, 이것이 단위 바이알로 반올림된다.
Figure pct00047
각 주기에 대한 용량 조정은 1일차 용량에서 체중이 10% 넘게 변하는 경우에만 필요하다.
투여
BA3011
단계 1 용량 증량: BA3011의 총 투여 시간은 1 주기 1일차에 100 mL IV 백의 경우 67 mL/시간의 주입 속도로 대략 90(±15)분이어야 한다. 모든 후속 투여의 경우, 환자가 주입-관련 반응을 경험하지 않는다면, 총 투여 시간은 100 mL의 경우 100 mL/시간의 주입 속도로 대략 60(±15)분이어야 한다.
단계 1 용량 확대: BA3011의 총 투여 시간은, 환자가 주입-관련 반응을 경험하지 않는다면, 제1 주기 1일차에는 대략 60(±15)분이고, 모든 후속 투여의 경우, 대략 30(±15)분이어야 한다.
단계 2: 제1 주기 1일차 및 그 후에 모든 주입의 경우, BA3011의 총 투여 시간은 대략 30(±15)분이어야 한다.
Ba3011은 i.v. 푸쉬 또는 볼러스로서 투여되지 말아야 한다. BA3011은 비-PVC 식염수 백 및 주입 튜빙 세트만을 사용하는 전용 IV라인을 통해 투여되어야 한다. BA3011은 동일한 식염수 백에서 다른 약물과혼합하여 사용할 수 없다.
더 높은 BA3011 용량 수준에서 용량-제한 호중구감소증의 관찰 후, 페그필그라스팀 또는 필그라스팀(또는 바이오시밀러)의 투여는 BA3011의 매일 1 주입 후 48 내지 72시간 사이에 단계 1에서 환자에게 필요하다. BA3011의 골수억제 잠재성의 관점에서, 예방적 페그필그라스팀 또는 필그라스팀을 투여받은 환자의 경우 임의의 호중구 독성이 적어도 1 또는 2 등급으로 해소될 때까지 환자에게 주입되지 않는 것이 특히 중요하다.
니볼루맙
단계 2 단독: 병용 요법을 받도록 등록된 환자는 니볼루맙과 병용하여 BA3011을 투여받는다(즉, 18세 이상의 환자의 경우: 240 mg Q2W; 12~17세의 환자의 경우: 3 mg/kg Q2W IV 주입) (Davis 2020). 환자의 니볼루맙 용량은 연구 중 환자의 시간의 지속기간 동안 동일하게 유지되어야 한다.
BA3011 및 니볼루맙이 같은 날 투여되어야 할 경우, 각각의 주입을 위해 반드시 별도의 주입 백 및 필터를 사용해야 한다. 니볼루맙이 먼저 투여되어야 한다. 두 번재 주입은 항상 BA3011이고, 니볼루맙 주입 완료 후 적어도 30분이 지난 후에 투여되어야 한다. 니볼루맙은 30분 IV 주입으로 투여되어야 한다. 니볼루맙의 상세한 투여 지침이 OPDIVO®(니볼루맙) 처방 정보에 제공되었다.
환자 수
단계 1 용량 증량 중에, 진행된 고형 종양이 있는 대략 35 내지 78명의 DLT-평가가능 환자를 코호트 확대 및 BA3011의 내약성에 따라 처리하였다. 각 코호트는, 단일-환자 코호트를 제외하고, 환자가 최소 3명에서 최대 6명이 필요하다. 최소한 환자 6명이 MTD에 등록된다. 단계 1 용량 확대는 추가적으로 Axl-발현, 진행된 고형 종양이 있는 환자 약 30명에게 수행된다. 단계 2는 BA3011 모노요법 방식으로 최소한 대략 Axl-발현(TmPS≥70) 환자 70명(최대 7개 육종 하위유형 그룹 각각에 진행된, 불응성 육종이 있는 환자 10명)을 등록하고, 본 연구의 병용 방식(BA3011와 PD-1)으로 대략 Axl-발현(TmPS≥70) 환자 20명(CD20 양성 환자 10명 및 CD20 음성 환자 10명)을 등록한다. 중간 분석에서 관찰된 효능에 따라 대략 150명의 추가 환자가 등록될 수 있다.
치료 배정
단계 1 용량 증량 중에, 환자는 표 16 및 도 18에 개략된 바와 같이 BA3011 용량 수준이 상승하는 코호트로 할당된다. BA3011은 각 코호트에 할당된 용량 수준에 따라, 각각 21일 주기로 1일차 단독 또는 1일차 및 8일차에 3주마다 1회(1Q3W) 또는 2회(2Q3W) IV 주입을 통해 투여된다. 시작 BA3011 용량 수준은 0.3 mg/kg 1Q3W이다. MTD가 식별될 때까지, 다음 명시된 용량 수준으로의 단계적 확대가 지속될 것이다. 단계 1 용량 확대는 환자가 단계 2에서 받을(예를 들어, RP2D) BA3011 용량 및 치료 일정을 결정하는 데 도움이 되고자 설계되었고, PSC에 의해 적절하다고 결정된 BA3011 용량 및 요법에서 Axl-발현, 진행된 고형 종양이 있는 환자에게서 수행될 것이다. 지정된 의료 모니터 및 조사자와 논의한 후, 데이터 전체에 기초한 RP2D를 결정하고 MTD를 초과하지 않는 것은 후원자의 책임이다. 본 연구의 단계 1 일부로부터의 데이터에 기초하여, 단계 2에 대한 BA3011의 용량은 1.8 mg/kg Q2W이다. Q2W 투약 요법에 대한 근거는 섹션 1.6에 상세하게 나와 있다. 단계 2의 경우, 등록 기준에 부합되는 환자는 BA3011 단독으로 또는 니볼루맙과 병용하여 이들을 받도록 할당될 것이다. B 세포 침윤(per CD20 IHC 검정과 관련하여)을 보이는 종양이 있는 환자가 니볼루맙과 병용하여 BA3011을 투여받도록 우선적으로 할당된다.
페그필그라스팀 투여:
단계 1:
● 더 높은 BA3011 용량 수준에서 용량-제한 호중구감소증을 관찰한 후, 해당 포장 삽입물과 관련하여 승인된 용량으로 페그필그라스팀(또는 바이오시밀러)의 투여가 요구되며, 반드시 BA3011의 1일차 주입 후 48 내지 72 시간 사이에 이루어져야 한다.
● 2Q3W 일정으로 투약된 환자(즉, 1일차 및 8일차에 BA3011을 투여받은 환자)의 경우, 각 주기의 1일차 투약 후 24 시간이 지나서 필그라스팀의 투여가 허용되고, 이어서 9일차에 페그필그라스팀(또는 바이오시밀러)의 선택적 투여가 뒤따른다. 각 주기의 1일차 투약 후 48에서 72시간 사이에 필그라스팀의 개시가 권장되는데, 그 이유는 표준 화학요법과 비교하여 항체와 접합된 경우 MMAE의 방출 속도가 더 느리기 때문이다.
● 페그필그라스팀에 알러지가 있는 경우, 필그라스팀(또는 바이오시밀러)이 치환될 수 있다.
● 3주기에서 시작할 때, 페그필그라스팀 또는 필그라스팀은 자가-투여될 수 있다.
단계 2:
● 페그필그라스팀 또는 필그라스팀(또는 바이오시밀러)은 단계 2에서 필요하지 않지만, 조사자의 재량으로 투약 전 호중구 수가 적은 환자를 위해 예방 차원으로 또는 호중구감소증의 발생을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
● BA3011 투여 이전에 ANC 수준이 3000/μL 미만 또는 3 x 109/L인 환자는 호중구감소증의 위험이 증가될 수 있다. 이들 환자의 경우, BA3011 투여 후 48 내지 72시간 내에 예방적 페그필그라스팀 또는 필그라스팀(또는 바이오시밀러)이 권장된다.
실시예 14: 진행된 육종 환자의 멕보타맙 베도틴 (BA3011), CAB- AXL - ADC의 단계 1 연구의 중간 안전성 및 효능 결과
다음의 연구에서, 진행된 육종 또는 다른 고형 종양이 있는 환자에게서 BA3011의 안전성 프로파일, 권장된 단계 2 용량(RP2D), 및 항종양 활성의 예비 증거를 식별하였다.
방법
연구 BA3011-001은 BA3011의 진행 중인, 다중-중심, 개방 표지, 단계 1/2 최초의 인간 실험이었다.
단계 1(NCT03425279)에서, BA3011은 정맥내(IV) 주입을 통해 3주마다 1회 (Q3W) 또는 2회(2Q3W) 투여하였다.
단계 2(NCT03425279)는 12세 이상으로 AXL-발현 종양 막 백분율 점수(TmPS)가 ≥50이고, 진행된 불응성 육종을 가지며 측정가능한 질환 및 문서화된 진행을 가진 환자에게서 BA3011 단독 및 PD-1 억제제의 병용의 효능 및 안전성의 진행 중인 개방 표지 평가이다.
결과
환자 성향 및 기준선 인구통계
환자의 중앙(범위) 나이는 58.0세(24~80세)로, 57.7%는 여성이고 84.6%는 백인이며, 69.2%는 ECOG 점수가 0이고, 30.8%는 점수가 1이었다.
단계 1 육종 환자는 평균적으로 4회 이상의 선행 요법 라인을 받았다.
단계 1에서, 총 환자 60명이 0.3 내지 3.0 mg/kg Q3W, 및 1.2 내지 1.8 mg/kg 2Q3W의 용량 수준으로 BA3011을 투여받았고, 여기에는 육종이 있는 환자 26명이 포함되었다.
IHC 검정 검증 작업의 일부로서, 그리고 대략 50%의 TmPS가 ≥70인 단계 1 & 2 연구에서, AXL 종양 막 발현에 대해 육종 환자 227명을 실험하였다. AXL은 시험대상이었던 모든 육종 하위유형에 걸쳐 일관된 비율로 발현되는 것으로 보인다.
안전성
정상적인 AXL-발현 조직에 대한 임상적으로 유의미한 표적내 독성이 관찰되지 않았고, 낮은 비율의 변비가 있었다. 용량-제한 독성은 가역적 호중구감소증을 비롯하여, 시험대상이 된 최고 용량에서 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 접합체-관련 독성에 제한되었다.
단계 1 육종 환자에서, 사망에 이르는 치료 후 발생 부작용(TEAE)은 없었고, 및 단계 2(7.7%) 환자에게서 치료-관련 TEAE는 치료 중단으로 이어졌다(표 20).
환자 11명은 3등급 관련 TEAE를 보였고, 환자 한 명은 4등급 호중구감소증을나타냈고, 이것은 일반적으로 MMAE에 관련된 것으로, 예컨대 가역적 골수억제, 일시적 간 효소 상승 및 대사 교란이 포함된다(표 21).
제1 주기 치료 중에 보이는 일시적인 1~2 등급 간 효소 상승은 일반적으로 재처리 시 재발하지 않았다. 크레아티닌 수준은 일반적으로 처리의 처음부터 끝까지 변함없었다.
단계 1 육종 환자에게서, 치료 관련 SAE(2등급 간 뇌병증)가 환자 한 명에게서 발생하였다(표 20).
Figure pct00048
Figure pct00049
권장된 단계 2 용량( RP2D ) / 약동학
PK 모델링을 비롯한 단계 1 데이터의 통합된 평가에 기초하여, RP2D를 1.8 mg/kg Q2W로 결정하였다.
BA3011의 PK 프로파일은 대략 용량 비례하였고; 단계 1에서, 반감기는 대략 4일로 결정되었다.
효능
BA3011 항종양 활성은 육종 환자의 더 높은 수준의 AXL 종양 막 발현과 와 상관관계가 있었다.
기준선 TmPS이 ≥70이고 1.8 mg/kg (Q3w 또는 2Q3w)으로 투여되는치료 불응성 육종이 있는 환자 7명 중, 4명이 확인된 부분 반응을 보였다(도 20, 22 및 23).
Figure pct00050
본 연구에서 육종 환자의 요법에 대한 연장된 반응을 도 24에 입증하였다.
결론
본 연구의 예비 효능 및 안전성 결과에 기초하여, BA3011 모노요법의 혜택-위험 프로파일이 육종 환자에게 이로운 것으로 보였다.
임상적으로 유의미한 표적내 독성이 관찰되지 않았다. 단계 1 육종 환자에서, 항종양 활성의 증거가 관찰되었고, 더 높은 AXL 종양 막 발현이 반응과 상관관계가 있었다. AXL은 시험 대상인 모든 육종 하위유형에 걸쳐 일관된 비율로 발현되는 것으로 보였다.
그러나, 비록 본 발명의 많은 특징 및 장점이 본 발명의 구조 및 기능에 대한 상세 사항과 함께 상기 설명에 제시되기는 했지만, 본 개시 내용은 단지 예시이며, 특히 부품의 형태, 크기 및 배열에 관해서는 본 발명의 원칙 내에서 첨부된 청구 범위에서 표현되는 용어의 넓은 일반 의미로 완전히 나타낼 수 있을 정도로 세부적인 변화가 있을 수 있다고 이해될 것이다.
본원에 언급된 모든 문서는 전문이 참조로서 포함되거나, 또는 대안적으로 이들을 특히 신뢰하는 본 개시 내용을 이룬다. 본 출원인(들)은 개시된 어느 구현예도 대중에게 공개하려는 의도가 아니며, 개시된 어느 변형 또는 변화도 문자 그대로는 청구 범위의 범주 내에 속하지 않을 수 있는 정도에서, 이들은 균등론 하에서 본원의 일부로 간주된다.

Claims (22)

  1. Axl 발현 종양을 치료하는 방법으로서, mAbBA301-절단 가능한 링커-MMAEn 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하고,
    약제학적 조성물은 정맥내 주입에 의해 21일마다 1일차 및 8일차에 1.8 mg/인간 대상체 체중 kg의 용량으로 투여되고;
    mAbBA301은 서열번호 14의 hcCDR1, 서열번호 15의 hcCDR2 및 서열번호 16의 hcCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 lcCDR1, 서열번호 18의 lcCDR2, 및 서열번호 19의 lcCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편이고; 그리고
    n은 1 내지 4(포함)의 정수인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 20을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호 21을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커는 mc-vc-PAB인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Axl 발현 종양은 육종, 선암 또는 비-소세포 폐암인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, Axl 발현 종양은 육종인, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로그래밍된 사멸 수용체-1 (PD-1) 차단 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Axl 발현 종양은 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 또는 적어도 95의 종양 막 P 점수를 갖는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, Axl 발현 종양은 적어도 70의 종양 막 P 점수를 갖는, 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 또는 그의 유사체를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 6.0의 pH를 가지며, 20 mM 히스티딘-HCl, 70 mg/mL 수크로스 및 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n은 4인, 방법.
  12. Axl 발현 종양을 치료하는 방법으로서, mAbBA301-절단 가능한 링커-MMAEn 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하고,
    약제학적 조성물은 정맥내 주입에 의해 21일마다 1.8 mg/인간 대상체 체중 kg의 용량으로 투여되고;
    mAbBA301은 서열번호 14의 hcCDR1, 서열번호 15의 hcCDR2 및 서열번호 16의 hcCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 17의 lcCDR1, 서열번호 18의 lcCDR2, 및 서열번호 19의 lcCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편이고; 그리고
    n은 1 내지 4(포함)의 정수인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 20을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열번호 21을 포함하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 절단 가능한 링커는 mc-vc-PAB인, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Axl 발현 종양은 육종, 선암 또는 비-소세포 폐암인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, Axl 발현 종양은 육종인, 방법.
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 프로그래밍된 사멸 수용체-1 (PD-1) 차단 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Axl 발현 종양은 적어도 50, 적어도 55, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 적어도 75, 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 또는 적어도 95의 종양 막 P 점수를 갖는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, Axl 발현 종양은 적어도 70의 종양 막 P 점수를 갖는, 방법.
  20. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 과립구 콜로니 자극 인자 또는 그의 유사체를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 6.0의 pH를 가지며, 20 mM 히스티딘-HCl, 70 mg/mL 수크로스 및 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80을 포함하는, 방법.
  22. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, n은 4인 방법.
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