JP7161783B2 - 抗Ａｘｌ抗体、抗体断片およびそれらの免疫コンジュゲートならびにそれらの使用 - Google Patents

抗Ａｘｌ抗体、抗体断片およびそれらの免疫コンジュゲートならびにそれらの使用 Download PDF

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Description

本開示は、抗Ａｘｌ抗体、抗体断片ならびにそのような抗体および抗体断片の免疫コンジュゲートならびに診断および治療方法における抗体、抗体断片および免疫コンジュゲートの使用に関する。
Ａｘｌタンパク質（Ａｒｋ、ＵＦＯ、Ｔｙｒｏ－７としても公知）は、キナーゼのＴｙｒｏ－３ファミリーにおける受容体チロシンキナーゼである。Ｔｙｒｏ－３受容体キナーゼは、細胞外領域中の２つの免疫グロビン様ドメインおよび二重フィブロネクチンＩＩＩ型リピートと細胞質キナーゼドメインとの組合せを特徴とする。Ｔｙｒｏ－３受容体キナーゼについてのリガンドはＧａｓ６（成長停止特異的（ｇｒｏｗｔｈ－ａｒｒｅｓｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）６）およびプロテインＳであり、これらは４３％のアミノ酸配列同一性を示し、類似のドメイン構造を共有する２つのビタミンＫ依存的タンパク質である。それぞれのタンパク質は、１１個のｇ－カルボキシグルタミン酸残基を含有するＮ末端Ｇｌａドメインとそれに続く４つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様モジュール、および２つのタンデムラミニンＧドメインからなるＣ末端性ホルモン結合グロビン（ＳＨＢＧ）様構造を有する。ＳＨＢＧドメインは、Ｔｙｒｏ－３受容体キナーゼ結合および活性化に必須であり、十分である一方、ＧＩａドメインは負荷電膜リン脂質に結合し、アポトーシス細胞のＴｙｒｏ－３キナーゼ媒介食作用において重要な役割を担う。
Ａｘｌ活性化は、ＰＩ－３－キナーゼ／Ａｋｔ（Ｆｒａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．８９８３－８９９８，２００３）および他の主要な経路、例えば、Ｒａｓ／Ｅｒｋおよびβ－カテニン／ＴＣＦ（Ｇｏｒｕｐｐｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．９０２－９１５，２００１）を介するシグナリングをもたらす。Ａｘｌは、一連の正常組織、例として、脳、心臓、骨格筋、器官の嚢およびいくつかの他の器官の結合組織中で弱く発現され、単球中で発現されるがリンパ球中では発現されない。Ａｘｌにより誘導されるＡｋｔリン酸化は、線維芽細胞（Ｇｏｒｕｐｐｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．４４４２－４４５３ １９９７）、内皮細胞（Ｈａｓａｎｂａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ，ｖｏｌ．２８７，Ｈ１２０７－Ｈ１２１３，２００４）、血管平滑筋細胞（Ｍｅｌａｒａｇｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．８８１－８８７，２００４）および神経細胞（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１９１－２０１，１９９９）の生存において記載されている。さらに、Ａｘｌは、細胞接着および走化性における役割を担う。それというのも、Ａｘｌノックアウト動物が血小板インテグリンＩＩｂ３の低減した活性化の結果として損傷した血小板凝集物安定化および血栓形成を呈するためである。
ＡｘｌまたはそのリガンドＧａｓ６の機能不全は、種々のヒト癌の病因に関与する。種々の癌タイプ、例えば、乳癌（Ｍｅｒｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．３６１－３６７，２００２；Ｂｅｒｃｌａｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．８１９－８２４，２００１）、結腸癌（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．５７９－５８４，１９９９；Ｃｒａｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６０，ｐｐ．７９１－７９７，１９９５）、前立腺癌（Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ．Ｐｒｅｙ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．３２５－３３２，１９９９）、肺癌（Ｗｉｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．２２６４－２２７４，２００１）、胃癌（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１０７１－１０７８，２００２）、卵巣癌（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６６，ｐｐ．４５０－４５７，２００４）、子宮内膜癌（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．８９８－９０６，２００３）、腎臓癌（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．５３３－５４０，２００３）、肝細胞癌（Ｔｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．３３１－３４０，１９９８）、甲状腺癌（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｙｒｏｉｄ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．９７１－９７５，２００２；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｙｒｏｉｄ，ｖｏｌ．９，ｐｐ．５６３－５６７，１９９９）、およびさらには慢性骨髄性白血病（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．２１１３－２１２０，１９９１；Ｂｒａｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．２６１９－２６３１ １９９７；Ｏ’Ｂｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．５０１６－５０３１，１９９１）、急性骨髄性白血病（Ｒｏｃｈｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１３５２－１３５８，１９９９）、骨肉腫（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．５７０２－５７０５，２００３）、黒色腫（ｖａｎ Ｇｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６４，ｐｐ．１２８－１３４，２００４）、および頭頸部扁平上皮癌（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，ｖｏｌ．９４，ｐｐ．１４４６－５，２００６）において、Ａｘｌ過剰発現が実証されている。
近年、ホスホチロシンシグナリングのプロファイリングにより、活性化ＡｘｌがＮＳＣＬＣの原発腫瘍の約５％において検出された（Ｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３１，ｐｐ．１１９０－１２０３，２００７）。Ａｘｌ発現は標的化学療法薬により誘導され、薬物により誘導されたＡｘｌ発現は急性骨髄性白血病における化学療法に対する耐性（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．３１４－３２４，２００８）、ならびに消化管間質腫瘍（Ｍｅｈａｄｅｖａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２６，ｐｐ．３９０９－３９１９，２００７）および乳癌（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２８１，ｐｐ．６８７１－６８７８，２００９）におけるイマチニブおよびラパチニブ／ハーセプチンに対する耐性をそれぞれ付与する。
さらに、Ａｘｌは、腫瘍転移に関連することが同定されている。それというも、Ａｘｌは、非侵襲性細胞と比較して侵襲性乳癌細胞系において上方調節されるためである。インビトロで、Ａｘｌ活性は遊走および侵入に要求されることが見出され、この活性は抗体処理により阻害することができた（国際公開第０４／００８１４７号パンフレット）。同様に、Ａｘｌのドミナントネガティブ型の発現を介する（Ｖａｊｋｏｃｚｙ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．５７９９－５８０４，２００５）またはＡｘｌのｓｉＲＮＡ媒介下方調節による（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６５，ｐｐ．９２９４－９３０３，２００５）インビボでのＡｘｌ活性の停止は、ネズミゼノグラフト実験において皮下および同所細胞成長を妨害した。
したがって、抗Ａｘｌモノクローナル抗体は癌の治療における使用について記載されている。例えば、抗Ａｘｌ抗体に関する刊行物としては、国際公開第２００９／０６３９６５号パンフレット、国際公開第２００９／０６２６９０号パンフレット、国際公開第２０１１／０１４４５７号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０２２７２８３号明細書、および米国特許第８，８５３，３６９号明細書が挙げられる。米国特許出願公開第２０１４／０２２７２８３号明細書は、モノクローナル抗Ａｘｌ抗体ならびに診断および治療方法におけるその使用を開示している。国際公開第２００９／０６２６９０号パンフレットは、Ａｘｌタンパク質の細胞外ドメインに結合し、少なくとも部分的にＡｘｌ活性を阻害し得る抗体を開示している。
これらのモノクローナル抗Ａｘｌ抗体は、患者の身体の任意の位置、例として治療が意図される腫瘍の位置において類似の親和性でＡｘｌに結合する。非腫瘍環境中でのＡｘｌへのこのような抗体の結合は、それらの環境中でＡｘｌの正常機能に対する悪影響を有し、したがって顕著な副作用を引き起こし得ると予測される。本発明は、非腫瘍環境中でのＡｘｌへの結合親和性と比較して腫瘍微小環境中でＡｘｌへの高い結合親和性を有する条件的に活性な抗Ａｘｌ抗体および抗体断片を提供する。本発明の抗Ａｘｌ抗体および抗体断片は、当分野において公知のモノクローナル抗Ａｘｌ抗体と比較して同等または大きな抗癌効力を、低減した副作用で有すると予測される。これは、抗Ａｘｌ抗体および抗体断片のより高い投与量の投与またはより高頻度の治療も許容し、したがってより有効な治療選択を提供し得る。
一態様において、本発明は、Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する単離重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、３つの相補性決定領域Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を含み、
Ｈ１配列は、Ｘ1ＧＸ2Ｘ3ＭＸ4（配列番号１）であり；
Ｈ２配列は、ＬＩＫＸ5ＳＮＧＧＴＸ6ＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）であり；
Ｈ３配列は、ＧＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14ＤＹＸ15Ｘ16（配列番号３）であり、
Ｘ1は、ＴまたはＡまたはＷであり、
Ｘ2は、ＨまたはＡであり、
Ｘ3は、ＴまたはＩであり、
Ｘ4は、ＮまたはＩであり、
Ｘ5は、ＰまたはＮであり、
Ｘ6は、ＳまたはＩまたはＴであり、
Ｘ7は、ＨまたはＤまたはＥまたはＰまたはＲまたはＷであり、
Ｘ8は、ＹまたはＮであり、
Ｘ9は、ＥまたはＡまたはＤまたはＦまたはＧまたはＨまたはＩまたはＬまたはＭまたはＮまたはＲまたはＶまたはＹであり、
Ｘ10は、ＳまたはＤまたはＭまたはＮまたはＱであり、
Ｘ11は、ＹまたはＣまたはＥまたはＰであり、
Ｘ12は、ＦまたはＥまたはＮまたはＳまたはＴまたはＶであり、
Ｘ13は、ＡまたはＤまたはＧまたはＬまたはＹであり、
Ｘ14は、ＭまたはＥまたはＦであり、
Ｘ15は、ＷまたはＡまたはＤまたはＨまたはＬまたはＮまたはＰまたはＲまたはＴであり、
Ｘ16は、ＧまたはＨである。
別の態様において、単離重鎖可変領域ポリペプチドは、３つの相補性決定領域Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を含み、
Ｌ１配列は、ＫＡＳＱＤＸ17Ｘ18ＳＸ19ＶＸ20（配列番号４）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ21Ｘ22Ｘ23ＴＲＸ24Ｔ（配列番号５）であり；
Ｌ３配列は、ＱＥＸ25Ｘ26ＳＸ27Ｘ28Ｘ29Ｘ30（配列番号６）であり、
Ｘ17は、ＶまたはＤまたはＧまたはＮまたはＷであり、
Ｘ18は、ＳまたはＶであり、
Ｘ19は、ＡまたはＬまたはＭであり、
Ｘ20は、ＡまたはＤまたはＮまたはＱであり、
Ｘ21は、ＷまたはＦであり、
Ｘ22は、ＡまたはＩまたはＮまたはＰまたはＱであり、
Ｘ23は、ＳまたはＤであり、
Ｘ24は、ＨまたはＤであり、
Ｘ25は、ＨまたはＣまたはＦまたはＩまたはＬまたはＱまたはＳまたはＴまたはＶまたはＹであり、
Ｘ26は、ＦまたはＣまたはＤまたはＥまたはＧまたはＮまたはＳであり、
Ｘ27は、ＴまたはＣまたはＰであり、
Ｘ28は、ＰまたはＡまたはＣまたはＤまたはＥまたはＨまたはＫまたはＳまたはＴまたはＶまたはＷであり、
Ｘ29は、ＬまたはＧまたはＲであり、
Ｘ30は、ＴまたはＩまたはＲである、
単離軽鎖可変領域と組み合わせられている。
さらに別の態様において、本発明は、本発明の単離重鎖可変領域ポリペプチドを含む抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、場合により、化学療法剤、放射性原子、細胞増殖抑制剤および細胞毒性剤から選択される薬剤にコンジュゲートしている本発明の抗体または抗体断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、抗体もしくは抗体断片、または免疫コンジュゲートを薬学的に許容可能な担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、抗体もしくは抗体断片、または免疫コンジュゲートを含む診断または治療のためのキットを提供する。
本発明の抗Ａｘｌ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列アラインメントをそれぞれ示す。 本発明の抗Ａｘｌ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列アラインメントをそれぞれ示す。 本発明の抗Ａｘｌ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列アラインメントをそれぞれ示す。 ｐＨ６．０およびｐＨ７．４におけるＡｘｌ細胞外ドメインへの本発明の種々の条件的に活性な抗体の結合（ＯＤ４５０）を示す。これらの条件的に活性な抗体は、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０において活性であった。 Ａｘｌ細胞外ドメインに対する本発明の種々の条件的に活性な抗体の選択性を示す。選択性は、ｐＨ６．０における結合パートナーに対する結合親和性と、ｐＨ７．４における同一の結合パートナーに対する結合親和性の比として計測した。 実施例１に記載のとおり、本発明の条件的に活性な抗体が凝集しないことを示すサイズ排除クロマトグラフを示す。 実施例１に記載のとおり、ＥＬＩＳＡアッセイにより計測された熱ショック前後の本発明の条件的に活性な抗体の熱安定性を示す。 実施例１におけるＳＰＲアッセイにより計測された本発明の条件的に活性な抗体の選択性を示す。 ＫＲＥＢＳ緩衝液中でのＡｘｌへの本発明の抗Ａｘｌ抗体の結合についてのｐＨ依存的結合プロファイルを示す。 Ａ５４９細胞を使用し、本発明の抗Ａｘｌ抗体をｐＨ６．０およびｐＨ７．４において異なる抗体濃度において細胞殺傷に用いた別の細胞殺傷試験の結果を示す。 Ａ５４９細胞を使用し、本発明の抗Ａｘｌ抗体をｐＨ６．０およびｐＨ７．４において異なる抗体濃度において細胞殺傷に用いた別の細胞殺傷試験の結果を示す。 Ａ５４９細胞を使用し、本発明の抗Ａｘｌ抗体をｐＨ６．０およびｐＨ７．４において異なる抗体濃度において細胞殺傷に用いた別の細胞殺傷試験の結果を示す。 異なる緩衝液中および異なるｐＨレベルにおける本発明の抗Ａｘｌ抗体についてのヒトＡｘｌおよびカニクイザルＡｘｌに対する結合親和性を示す。 異なる緩衝液中および異なるｐＨレベルにおける本発明の抗Ａｘｌ抗体についてのヒトＡｘｌおよびカニクイザルＡｘｌに対する結合親和性を示す。 デュオマイシン（ｄｕｏｍｙｃｉｎ）にコンジュゲートさせた本発明の抗Ａｘｌ抗体による異なるｐＨレベルにおける異なる細胞系の細胞殺傷を示す。 デュオマイシン（ｄｕｏｍｙｃｉｎ）にコンジュゲートさせた本発明の抗Ａｘｌ抗体による異なるｐＨレベルにおける異なる細胞系の細胞殺傷を示す。 デュオマイシン（ｄｕｏｍｙｃｉｎ）にコンジュゲートさせた本発明の抗Ａｘｌ抗体による異なるｐＨレベルにおける異なる細胞系の細胞殺傷を示す。 デュオマイシン（ｄｕｏｍｙｃｉｎ）にコンジュゲートさせた本発明の抗Ａｘｌ抗体による異なるｐＨレベルにおける異なる細胞系の細胞殺傷を示す。 ゲムシタビンにコンジュゲートさせた本発明の抗Ａｘｌ抗体による異なるｐＨレベルにおけるＡ５４９細胞の細胞殺傷を示す。 本発明のデュオマイシンコンジュゲート抗Ａｘｌ抗体によるゼノグラフトマウスの処理の腫瘍体積に対する効果を示す。 本発明のデュオマイシンコンジュゲート抗Ａｘｌ抗体の存在の、そのコンジュゲートの注射後の経時的なカニクイザルの血液中での検出を示す。 図１４Ａ：コンジュゲートの注射直前（前（Ｄ－３））に開始し、注射３日後（後（Ｄ－３））までの経時的なカニクイザルの血液中でのアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の存在の検出を示す。図１４Ｂ：コンジュゲートの注射直前（前（Ｄ－３））に開始し、注射３日後（後（Ｄ－３））までの経時的なカニクイザルの血液中でのアラニンアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の存在の検出を示す。 コンジュゲートの注射後のカニクイザルの血液中での経時的なリンパ球数を示す。 ＬＣＬＣ１０３ＨおよびＤＵ１４５をそれぞれ受けたマウスのインビボ処理を示す。
定義
本明細書において提供される実施例の理解を容易にするため、ある高頻度に使用される用語を本明細書において定義する。
計測される量との関連で、本明細書において使用される用語「約」は、計測を行い、計測の目的および使用される計測装置の精度に見合うあるレベルのケアを実行する当業者により予測されるその計測される量の通常の変動を指す。特に示されない限り、「約」は、提供される値の＋／－１０％の変動を指す。
本明細書において使用される用語「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総計の強度を指す。特に示されない限り、本明細書において使用される「結合親和性」は、結合ペア（例えば、抗体および抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹについての親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、当分野において公知の一般的方法、例として、本明細書に記載のものにより計測することができる。結合親和性を計測するための具体的な説明および例示的な実施形態を以下に記載する。
用語「親和性成熟」は、抗体を参照して使用される場合、変更を保有しない親抗体または抗体断片と比較して１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）中の１つ以上の変更を有する抗体または抗体断片を指し、そのような変更は、抗原についての抗体または抗体断片の親和性の改善をもたらす。
本明細書において使用される用語「アミノ酸」は、アミノ基（－－ＮＨ2）およびカルボキシル基（－－ＣＯＯＨ）を好ましくは遊離基として、あるいは縮合後にペプチド結合の一部として含有する任意の有機化合物を指す。「２０個の天然にコードされるポリペプチド形成アルファ－アミノ酸」は当分野において理解され、アラニン（ａｌａまたはＡ）、アルギニン（ａｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ａｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐまたはＤ）、システイン（ｃｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕまたはＥ）、グルタミン（ｇｉｎまたはＱ）、グリシン（ｇｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ｉｌｅまたはＩ）、ロイシン（ｌｅｕまたはＬ）、リジン（ｌｙｓまたはＫ）、メチオニン（ｍｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）、プロリン（ｐｒｏまたはＰ）、セリン（ｓｅｒまたはＳ）、スレオニン（ｔｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ｔｉｐまたはＷ）、チロシン（ｔｙｒまたはＹ）、およびバリン（ｖａｌまたはＶ）を指す。
本明細書において使用される用語「抗血管新生剤」は、血管の発生をある程度遮断し、または妨げる化合物を指す。抗血管新生剤は、例えば、血管新生の促進に関与する成長因子または成長因子受容体に結合する小分子または抗体であり得る。一実施形態において、抗血管新生剤は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体または抗体断片、例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））である。
本明細書において使用される用語「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）が挙げられる。由来する抗体の抗原（例えば、ポリペプチド抗原）に選択的に結合するいくらかの能力を保持するこれらの抗体断片は、当分野において周知の方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、前掲参照）を使用して作製することができる。
本明細書において使用される用語「抗体」は、インタクト免疫グロブリン分子を指す。抗体または抗体断片は、分取量の抗原を免疫親和性クロマトグラフィーにより単離するために使用することができる。このような抗体または抗体断片の種々の他の使用は、疾患（例えば、新生物形成）を診断および／または病期分類するため、ならびに疾患、例えば、新生物形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管疾患、感染症などを治療するための治療用途のためのものである。キメラヒト様ヒト化または完全ヒト抗体または抗体断片は、ヒト患者への投与に特に有用である。
Ｆａｂ断片は、抗体分子の一価抗原結合断片からなり、酵素パパインによる完全抗体分子の消化により、インタクト軽鎖および重鎖の一部からなる断片を生じさせて産生することができる。
抗体分子のＦａｂ’断片は、完全抗体分子をペプシンにより処理し、次いで還元してインタクト軽鎖および重鎖の一部からなる分子を生じさせることにより得ることができる。２つのＦａｂ’断片は、この様式で処理される抗体分子ごとに得られる。
抗体の（Ｆａｂ’）２断片は、完全抗体分子を酵素ペプシンにより後続の還元なしで処理することにより得ることができる。（Ｆａｂ’）２断片は、２つのジスルフィド結合により一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である。
Ｆｖ断片は、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片として定義される。
本明細書において使用される用語「抗Ａｘｌ抗体」、抗Ａｘｌ抗体断片および「Ａｘｌに結合する抗体または抗体断片」は、抗体または抗体断片がＡｘｌの標的化における診断および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でＡｘｌに結合し得る抗体または抗体断片を指す。一実施形態において、非関連非Ａｘｌタンパク質への抗Ａｘｌ抗体または抗体断片の結合の程度は、例えば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）により計測してＡｘｌへの抗体または抗体断片の結合の約１０％未満である。ある実施形態において、Ａｘｌに結合する抗体または抗体断片は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０-8Ｍ以下、または１０-8Ｍ～１０-13Ｍ、または１０-9Ｍ～１０-13Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態において、抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、異なる種からのＡｘｌ間で保存されるＡｘｌのエピトープに結合する。
本明細書において使用される用語「血管新生障害」は、血管新生の任意の機能不全、例として、非新生物形成および新生物形成病態の両方を指す。新生物形成病態としては、限定されるものではないが、下記のもの（例えば、「癌」参照）が挙げられる。非新生物形成障害としては、限定されるものではないが、不所望または異常な肥大、関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症プラーク、糖尿病性および他の増殖性網膜症、例として、未熟児網膜症、水晶体後部線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植拒絶反応、網膜／脈絡膜血管新生、隅角の血管新生（ルベオーシス）、眼部血管新生疾患、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺肥大（例として、グレーブス病）、角膜および他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺滲出、脳浮腫（例えば、急性脳卒中／閉鎖性頭部損傷／外傷に伴うもの）、滑膜炎、ＲＡにおけるパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞性卵巣、子宮内膜症、サードスペースの体液疾患（膵炎、コンパートメント症候群、火傷、腸疾患）、子宮筋腫、早産、慢性炎症、例えば、ＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎同種移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、不所望または異常な組織塊成長（非癌性）、血友病性関節、肥厚性瘢痕、発毛阻害、オスラーウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、水晶体後部線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管癒着、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心外膜液（例えば、心膜炎などに伴うもの）、および胸膜滲出が挙げられる。
本明細書において使用される用語「血管新生」は、既存の血管からの新たな血管、特に、限定されるものではないが、新たな腫瘍供給血管の成長に寄与する全てのＡｘｌ関与プロセスを指す。これらのプロセスとしては、複数の細胞イベント、例えば、血管内皮細胞の増殖、生存、遊走および出芽、周囲細胞の誘引および遊走ならびに血管安定化のための基底膜形成、血管灌流、または間質もしくは新生物細胞による血管新生因子の分泌が挙げられ、それらのプロセスは、Ａｘｌの非触媒または触媒活性、好ましくは、例として、Ａｘｌリン酸化および／またはＡｘｌ媒介シグナル伝達により刺激または媒介される。
本明細書において使用される用語「Ａｘｌ」は、特に示されない限り、任意の脊椎動物資源、例として、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）からの任意の天然Ａｘｌを指す。この用語は、「全長」のプロセシングを受けていないＡｘｌおよび細胞中でのプロセシングから生じるＡｘｌの任意の形態を包含する。この用語は、Ａｘｌの天然存在バリアント、例えば、スプライスバリアントまたはアレルバリアントも包含する。ヒトＡｘｌのアミノ酸配列は当分野において周知であり、公開データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから利用可能である。
本明細書において使用される用語「Ａｘｌ活性化」は、Ａｘｌ受容体の活性化、またはリン酸化を指す。一般に、Ａｘｌ活性化は、シグナル伝達（例えば、Ａｘｌまたは基質ポリペプチド中のＡｘｌ受容体リン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインにより引き起こされるもの）をもたらす。Ａｘｌ活性化は、目的のＡｘｌ受容体へのＡｘｌリガンド（Ｇａｓ６）結合により媒介され得る。ＡｘｌへのＧａｓ６結合は、Ａｘｌのキナーゼドメインを活性化させ、それによりＡｘｌ中のチロシン残基のリン酸化および／または追加の基質ポリペプチド中のチロシン残基のリン酸化をもたらし得る。
本明細書において使用される用語「Ａｘｌ媒介抗アポトーシス」は、ヒト細胞、好ましくは、限定されるものではないが、ヒト癌細胞を、プログラム細胞死（アポトーシス）から妨害する全てのＡｘｌ関与プロセスを指す。特にそれは、ヒト細胞、好ましくは、限定されるものではないが、ヒト癌細胞を、成長因子離脱、低酸素、化学療法剤もしくは放射線への曝露、またはＦａｓ／Ａｐｏ－１受容体媒介シグナリングの開始を介するアポトーシスの誘導から妨害し、Ａｘｌの非触媒または触媒活性、好ましくは、例として、Ａｘｌリン酸化および／またはＡｘｌ媒介シグナル伝達により刺激または媒介されるプロセスを指す。
本明細書において使用される用語「結合」は、抗体の可変領域またはＦｖと、抗原との相互作用を指し、その相互作用は抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体可変領域またはＦｖは、タンパク質全般ではなく特異的タンパク質構造を認識し、それに結合する。本明細書において使用される「特異的に結合すること（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的に結合すること（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、抗体可変領域またはＦｖが、特定の抗原に、他のタンパク質よりも高頻度で急速に長い持続時間および／または大きな親和性で結合し、または会合することを意味する。例えば、抗体可変領域またはＦｖは、その抗原に、他の抗原に結合するよりも大きな親和性、アビディティで、急速に、および／または長い持続時間、特異的に結合する。別の例では、抗体可変領域またはＦｖは、細胞表面タンパク質（抗原）に、それが関連タンパク質もしくは他の細胞表面タンパク質に、または多反応性天然抗体により（すなわち、ヒトにおいて天然に見出される種々の抗原に結合することが公知の天然存在抗体により）一般に認識される抗原に結合するよりもかなり大きな親和性で結合する。しかしながら、「特異的に結合する」は、必ずしも排他的結合または別の抗原の非検出結合を要求せず、これは、用語「選択的結合」を意味する。一例において、抗原に結合する抗体可変領域またはＦｖ（または他の結合領域）の「特異的結合」は、抗体可変領域またはＦｖが、１００ｎＭ以下、例えば、５０ｎＭ以下、例えば、２０ｎＭ以下、例えば、１５ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。
本明細書において使用される用語「癌」および「癌性」は、典型的には、無秩序な細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的病態を指し、または説明する。癌の例としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。このような癌のより特定の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞腫、白血病および他のリンパ球増殖性疾患、ならびに種々のタイプの頭頸部癌が挙げられる。
本明細書において使用される用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、ある程度の異常細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。
本明細書において使用される用語「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化合物を指す。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、例として、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（例として、合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９－アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体のＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマＩＩおよびカリケアマイシンオメガＩＩ（例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）参照）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ－４インテグリン阻害剤；ジネマイシン、例として、ジネマイシンＡ；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（例として、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣ１リポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ－９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ｐｅｇ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフル（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補給剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミンエンジニアリングナノ粒子配合物（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、およびカルボプラチン；チューブリン重合の微小管形成を妨害するビンカ、例として、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦ（登録商標））；レチノイド、例えば、レチノイン酸、例として、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））；；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナリング経路における遺伝子、例えば、ＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）などの発現を阻害するもの；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ－１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ－７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ－２阻害剤、例えば、オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義参照）；セリン－トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ロナファルニブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の省略形であるＣＨＯＰ；および５－ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いる治療レジメンの省略形であるＦＯＬＦＯＸなどが挙げられる。
本明細書において定義される化学療法剤としては、癌の成長を促進し得るホルモンの効果を調節し、低減させ、遮断し、または阻害するように作用する「抗ホルモン剤」または「内分泌治療薬」が挙げられる。これらは、ホルモンそれ自体であり得、例として、限定されるものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン剤、例として、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４－ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えば、ＳＥＲＭ３；アゴニスト特性を有さない純抗エストロゲン剤、例えば、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（このような薬剤は、エストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲターンオーバーを増加させ、および／またはＥＲレベルを抑制し得る）；アロマターゼ阻害剤、例として、ステロイドアロマターゼ阻害剤、例えば、ホルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、および非ステロイドアロマターゼ阻害剤、例えば、アナストラゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミド、および他のアロマターゼ阻害剤、例として、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、および４（５）－イミダゾール；黄体形成ホルモン放出モルモンアゴニスト、例として、ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリン；性ステロイド、例として、プロゲスチン、例えば、酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリン、およびアンドロゲン／レチノイド、例えば、フルオキシメステロン、全てのトランスレチノイン酸およびフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン剤；エストロゲン受容体下方調節剤（ＥＲＤ）；抗エストロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組合せが挙げられる。
本明細書において使用される用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の資源または種に由来する一方、重鎖および／または軽鎖の残部が異なる資源または種に由来する抗体を指す。
本明細書において使用される用語、抗体の「クラス」は、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。５つの主要な抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、およびＩｇＡ2にさらに分類することができる。異なる免疫グロブリンのクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
本明細書において使用される用語「条件的に活性な抗体」および「条件的に活性な抗体断片」は、腫瘍微小環境中の条件の値において、非腫瘍微小環境中の同一条件の異なる値と比較して活性である抗体または抗体断片を指す。非腫瘍微小環境中の条件と比較する場合、腫瘍微小環境中の条件としては、より低いｐＨ、より高い濃度の乳酸塩および／またはピルビン酸塩、低酸素、より低い濃度のグルコース、ならびにわずかに高い温度を挙げることができる。例えば、一実施形態において、条件的に活性な抗体または抗体断片は、正常な体温において実質的に不活性であり得るが、腫瘍微小環境中に見出すことができるより高温において活性であり得る。さらに別の実施形態において、条件的に活性な抗体または抗体断片は、腫瘍微小環境中で存在し得る低含酸素環境よりも正常な含酸素血液中で低活性であり得る。当業者に公知の腫瘍微小環境中の他の条件が存在し、それらは抗Ａｘｌ抗体または抗体断片がその条件の異なる値において異なる活性を有することを誘発し得る本発明における条件としての使用に選択することもできる。
本明細書において使用される用語「構成的」は、例えば、Ａｘｌ活性に適用される場合、リガンドの存在にも他の活性化分子の存在にも依存的でない受容体キナーゼの連続的なシグナリング活性を指す。受容体キナーゼの性質に応じて、活性の全ては構成的であり得、または受容体の活性は、他の分子（例えば、リガンド）の結合によりさらに活性化され得る。受容体キナーゼの活性化をもたらす細胞イベントは、当業者の間で周知である。例えば、活性化としては、より高次の受容体複合体へのオリゴマー化、例えば、二量体化、三量体化などを挙げることができる。複合体は、単一種のタンパク質、すなわち、ホモ複合体を含み得る。あるいは、複合体は、少なくとも２つの異なるタンパク質種、すなわち、ヘテロ複合体を含み得る。複合体形成は、例えば、細胞の表面上の受容体の正常または突然変異形態の過剰発現により引き起こされ得る。複合体形成は、受容体中の１つ以上の特異的突然変異によっても引き起こされ得る。
本明細書において使用される用語「細胞増殖抑制剤」は、インビトロまたはインビボのいずれかにおける細胞の成長を停止させる化合物または組成物を指す。したがって、細胞増殖抑制剤は、Ｓ期における細胞の割合を顕著に低減させるものであり得る。細胞増殖抑制剤のさらなる例としては、Ｇ０／Ｇ１停止またはＭ期停止を誘導することにより細胞周期進行を遮断する薬剤が挙げられる。ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、Ｇ０／Ｇ１停止を誘導する細胞増殖抑制剤の一例である。古典的Ｍ期遮断剤としては、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンが挙げられる。Ｇ１を停止させるある薬剤、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、およびａｒａ－ＣはＳ期停止にも波及する。さらなる情報は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ １、表題“Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ”、Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、例えば、１３頁に見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、両方ともイチイ由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進し、脱重合を妨害することにより微小管を安定させ、細胞の有糸分裂の阻害をもたらす。
本明細書において使用される用語「細胞毒性剤」は、細胞機能を阻害もしくは妨害し、および／または細胞死もしくは破壊を引き起こす、物質を指す。細胞毒性剤としては、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212、およびＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレート剤）；成長阻害剤；酵素およびその断片、例えば、核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素（それらの断片および／またはバリアントを含む）；ならびに以下に開示される種々の抗腫瘍または抗癌剤が挙げられる。
本明細書において使用される用語「ダイアボディ」は、断片が同一ポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶL）に連結している重鎖可変ドメイン（ＶH）（ＶH－ＶL）を含む２つの抗原結合部位を有する小分子抗体断片を指す。同一鎖上の２つのドメイン間の対合を許容し得ないほど短鎖のリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、それが２つの抗原結合部位を作出する。
本明細書において使用される用語「検出可能に標識する」は、物理的または化学的手段による直接または間接的のいずれかの検出または計測が試料中のＣＴＣの存在を示す任意の物質を指す。有用な検出可能標識の代表的な例としては、限定されるものではないが、以下のもの：光吸収、蛍光、反射、光散乱、燐光、または発光特性に基づき直接または間接的に検出可能な分子またはイオン；放射性により検出可能な分子またはイオン；核磁気共鳴または常磁性により検出可能な分子またはイオンが挙げられる。光吸収または蛍光に基づき間接的に検出可能な分子の群には、例えば、非光吸収から光吸収分子への、または非蛍光から蛍光分子への適切な基質の変換を引き起こす種々の酵素が含まれる。
本明細書において使用される用語「診断」は、疾患または障害に対する対象の感受性の測定、対象が疾患または障害を現在罹患しているか否かに関する決定、疾患または障害を罹患している対象の予後診断（例えば、前転移または転移癌性状態、癌の病期、または治療法に対する癌の応答性の同定）、および治療方針（例えば、治療法の効果または効力に関する情報を提供するための対象病態のモニタリング）を指す。一部の実施形態において、本発明の診断方法は、早期癌の検出において特に有用である。
本明細書において使用される用語「診断剤」は、直接または間接的に検出することができ、診断目的のために使用される分子を指す。診断剤は、対象または試料に投与することができる。診断剤は、それ自体で提供することができ、またはビヒクル、例えば、条件的に活性な抗体にコンジュゲートさせることができる。
本明細書において使用される用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因し、抗体アイソタイプにより変動する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
本明細書において使用される用語、薬剤、例えば、医薬配合物の「有効量」は、投与量において、および必要な期間にわたり、所望の治療または予防結果を達成するために有効な量を指す。
本明細書において使用される用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へと伸長する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書において特に規定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１に記載のとおりＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付け系に従う。
本明細書において使用される用語「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲまたは重鎖中のＨ１～３および軽鎖中のＬ１～３）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般に、ＶH（またはＶL）中の以下の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４に出現する。
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」、または「完全抗体」は、抗原結合可変領域（ＶHまたはＶL）ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体を指す。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、全長抗体は、異なる「クラス」に割り当てることができる。全長抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、それらのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分類することができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニットおよび三次元立体配置は周知である。
本明細書において使用される用語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、および「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」および「形質転換細胞」が挙げられ、それらとしては一次形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫が挙げられる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてよく、突然変異を含有し得る。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫が、本明細書に含まれる。
本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体、またはヒト抗体のレパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト資源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
本明細書において使用される用語「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶLまたはＶHフレームワーク配列の選択において、最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶLまたはＶH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１－３におけるようなサブグループである。一実施形態において、ＶLについてのサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前掲におけるようなサブグループカッパＩである。一実施形態において、ＶHについてのサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前掲におけるようなサブグループＩＩＩである。
本明細書において使用される用語「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのドメイン中ではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書において使用される用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列が超可変的であり、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、天然四鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶH中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶL中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループからの、および／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は配列変動性が最も高く、および／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）において生じる（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９６，ｐｐ．９０１－９１７ １９８７）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２の５０～５６、Ｌ３の８９～９７、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～６５、およびＨ３の９５～１０２において生じる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９９１）。ＶH中のＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」、または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮型ＣＤＲ、またはａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。例示的なａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、およびａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１～３４、Ｌ２の５０～５５、Ｌ３の８９～９６、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～５８、およびＨ３の９５～１０２において生じる（Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８参照）。特に示されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書においてＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前掲に従って番号付けされる。
本明細書において使用される用語「免疫コンジュゲート」は、（１つ以上の）異種分子、例として、限定されるものではないが、細胞毒性剤にコンジュゲートしている抗体である。
本明細書において使用される用語「個体」または「対象」は、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、限定されるものではないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
本明細書において使用される用語「細胞成長または増殖を阻害する」は、細胞成長または増殖を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％だけ減少させることを意味し、細胞死の誘導も含む。
本明細書において使用される用語「単離」抗体は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。一部の実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により測定して９５％または９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，ｖｏｌ．８４８，ｐｐ．７９－８７，２００７参照。
本明細書において使用される用語「単離」核酸は、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、通常核酸分子を含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
本明細書において使用される用語「抗Ａｘｌ抗体をコードする単離核酸」は、抗体重鎖および軽鎖（またはそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別個のベクター中のそのような核酸分子、および宿主細胞中の１つ以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書において使用される用語「リガンド非依存的」は、例えば、受容体シグナリング活性に適用される場合、リガンドの存在に依存的でないシグナリング活性を指す。リガンド非依存的キナーゼ活性を有する受容体は、必ずしも、キナーゼ活性の追加の活性化を産生するためのその受容体へのリガンドの結合を除外しない。
本明細書において使用される用語「転移」は、癌細胞が原発腫瘍から分散し、リンパおよび／または血管中に浸透し、血流を介して循環し、体内の他箇所の正常組織中の遠位病巣中で成長する（転移）ことを支持する全てのＡｘｌ関与プロセスを指す。特に、これは、転移の基盤をなし、Ａｘｌの非触媒または触媒活性、好ましくは、例として、Ａｘｌリン酸化および／またはＡｘｌ媒介シグナル伝達により刺激または媒介される腫瘍細胞の細胞イベント、例えば、増殖、遊走、足場非依存性、アポトーシスの回避、または血管新生因子の分泌を指す。
本明細書において使用される用語「微小環境」は、組織の他の領域または身体の領域と恒常的または一時的な物理的または化学的差異を有する組織または身体の任意の一部または領域を意味する。腫瘍について、本明細書において使用される用語「腫瘍微小環境」は、腫瘍内の非細胞区域および腫瘍組織のすぐ外側の区域であるが、癌細胞自体の細胞内コンパートメントに関連しない、腫瘍が存在する環境を指す。腫瘍および腫瘍微小環境は密接に関連しており、常に相互作用する。腫瘍はその微小環境を変化させ得、微小環境は、いかに腫瘍が成長し、拡散するかに影響を及ぼし得る。典型的には、腫瘍微小環境は、５．８～７．０の範囲、より一般には、６．２～６．８の範囲、最も一般には、６．４～６．８の範囲の低ｐＨを有する。他方で、正常な生理学的ｐＨは、典型的には７．２～７．８の範囲である。腫瘍微小環境は、血漿と比較して低濃度のグルコースおよび他の栄養素を有するが、高濃度の乳酸を有することも公知である。さらに、腫瘍微小環境は、正常の生理学的温度よりも０．３～１℃高い温度を有し得る。腫瘍微小環境は、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，“ＭＲＩ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．４３０－４５０，２００２に考察されている。用語「非腫瘍微小環境」は、腫瘍以外の部位における微小環境を指す。
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団をなす個々の抗体が同一であり、および／または同一のエピトープに結合するが、例えば、天然存在の突然変異を含有し、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のあるバリアント抗体を除き、このようなバリアントは一般に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求するものとして解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用することができるモノクローナル抗体は、種々の技術、例として、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法により作製することができ、モノクローナル抗体を作製するこのような方法および他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
本明細書において使用される用語「裸抗体」は、異種部分（例えば、細胞毒性部分）にも放射性標識にもコンジュゲートしていない抗体を指す。裸抗体は、医薬配合物中に存在し得る。
本明細書において使用される用語「天然抗体」は、変動する構造を有する天然存在の免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２本の同一軽鎖および２本の同一重鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけ、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶH）と、それに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけ、それぞれの軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶL）と、それに続く定常軽鎖（ＣL）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの一方に割り当てることができる。
本明細書において使用される用語「添付文書」は、治療用製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すために使用され、適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌および／またはそのような治療用製品の使用に関する注意事項についての情報を含有する。
本明細書において使用される用語、参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインし、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要であればギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性決定の目的のためのアラインメントは、当分野の技能の範囲内である種々の手法で、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列をアラインするための適切なパラメータ、例として、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のため、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により著作され、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に利用者向け文書とともに申請されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７のもと登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に利用可能であり、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、例として、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄ上での使用のためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ－２を用いる状況において、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有し、または含む所与のアミノ酸配列Ａと代替表現することもできる）は、以下のとおり算出される：
１００*（Ｘ／Ｙ）
（式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によりＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識される。特に具体的に記述されない限り、本明細書において使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載のとおりに得られる。
本明細書において使用される用語「医薬配合物」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性の有効性を許容するような形態であり、配合物が投与される対象に許容不可能な毒性を示す追加の構成成分を含有しない製剤を指す。
本明細書において使用される用語「薬学的に許容可能な担体」は、対象に非毒性である、活性成分以外の医薬配合物中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体としては、限定されるものではないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられる。
本明細書において使用される用語「精製」および「単離」は、示される分子が同一タイプの他の生物巨大分子の実質的不存在下で存在する本発明による抗体、またはヌクレオチド配列を指す。本明細書において使用される用語「精製」は、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも８５重量％、いっそうより好ましくは、少なくとも９５重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％の同一タイプの生物巨大分子が存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離」核酸分子は、ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に有さず、核酸分子を指し；しかしながら、分子は、組成物の基本的特徴に悪影響を及ぼさない一部の追加の塩基または部分を含み得る。
本明細書において使用される用語「組換え抗体」は、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞により発現される抗体（例えば、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体またはそれらの抗原結合性断片）を指す。組換え抗体を産生するための「宿主細胞」の例としては：（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（例として、Ｙ０およびＮＳ０細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨｅｌａおよびＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えばｓｆ９、ｓｆ２１およびＴｎ５；（３）植物細胞、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物（例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））に属するもの；（５）細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）細胞または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などが挙げられる。
用語「治療有効量」の本発明の抗体または抗体断片は、任意の医学的治療に適用可能な妥当な利益／リスク比において疾患または疾病を治療するために十分な量の抗体または抗体断片を意味する。しかしながら、本発明の抗体または抗体断片および組成物の総１日使用量は、正当な医学的判断の範囲内で担当医により決定されることが理解される。任意の特定の患者についての具体的な治療有効用量レベルは、種々の因子、例として、治療される障害および障害の重症度；用いられる具体的な抗体または抗体断片の活性；用いられる具体的な組成物、患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事；用いられる具体的な抗体または抗体断片の投与の時間、投与経路、および排泄速度；治療の持続時間；用いられる具体的な抗体との組合せまたはそれと同時で使用される薬物；ならびに医学分野において周知の同様の因子に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために要求されるよりも低いレベルにおいて化合物の用量を開始すること、および所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは当分野の技能の範囲内で周知である。
本明細書において使用される用語「単鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」）は、通常、ペプチドコードリンカーにより結合しているＶHおよびＶLコード遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される共有結合しているＶH：：ＶLヘテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されるＶH：：ＶLヘテロ二量体である。二価および多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合により自然に形成し得、またはペプチドリンカーにより一価ｓｃＦｖをカップリングさせることにより生成することができる（例えば、二価ｓｃ（Ｆｖ）２）。
本明細書において使用される用語「治療」、「治療する」または「治療すること」などは、治療される個体の自然経過を変更する試行の臨床的介入を指し、予防のため、または臨床的病変の経過において実施することができる。治療の望ましい効果としては、限定されるものではないが、疾患の発症または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な任意の病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、疾患状態の改善または軽減、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、疾患の発生を遅延させ、または疾患の進行を減速させるために使用される。
本明細書において使用される用語「腫瘍」は、悪性であるか良性であるかに関わらない、全ての新生物性の細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」および「腫瘍」は、本明細書において相互に排他的に言及されるわけではない。
本明細書において使用される用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶHおよびＶL）は一般に、それぞれのドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む類似の構造を有する（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）参照）。単一のＶHまたはＶLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体または抗体断片は、その抗原に結合する抗体からのＶHまたはＶLドメインを使用して単離してそれぞれ相補的なＶLまたはＶHドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５０，ｐｐ．８８０－８８７，１９９３；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５２，ｐｐ．６２４－６２８，１９９１参照。
本明細書において使用される用語「ベクター」は、結合している別の核酸を伝播し得る核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および導入された宿主細胞のゲノム中に取り込まれるベクターを含む。あるベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
例示を目的として、種々の例示的実施形態を参照して本発明の原理を説明する。本発明のある実施形態が本明細書において具体的に説明されるが、当業者は、同一原理が他の系および方法において同様に適用可能であり、用いることができることを容易に認識する。本発明の開示される実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、示される任意の特定の実施形態の詳細にその適用が限定されないことを理解すべきである。さらに、本明細書において使用される用語は説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではない。さらに、ある方法は本明細書においてある順序で提示されるステップを参照して記載されるが、多くの場合、当業者が理解し得るとおり、これらのステップは任意の順序で実施することができ；したがって、新規方法は、本明細書に開示の特定のステップの順に限定されるものではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明示しない限り、複数形の参照物を含むことに留意しなければならない。さらに、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を有する」および「～から構築される」も、互換的に使用することができる。
特に示されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される、成分の量、特性、例えば分子量、パーセント、比、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において、用語「約」により、その用語「約」の有無にかかわらず修飾されるものとして理解すべきである。したがって、逆の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載の数値パラメータは近似値であり、その近似値は、本開示により得ることができる求められる所望の特性に応じて変動し得る。少なくとも、および特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する企図としてではなく、それぞれの数値パラメータは、報告された有効数字に照らし、通常の四捨五入法を適用することにより少なくとも解釈すべきである。本開示の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは近似値であるが、具体例において記載されている数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じる、ある誤差を本質的に含有する。
本明細書に開示のそれぞれの構成成分、化合物、置換基、またはパラメータは、単独で、または本明細書に開示のそれぞれのおよび他のあらゆる構成成分、化合物、置換基、もしくはパラメータの１つ以上との組合せでの使用について開示されているとして解釈すべきであることを理解すべきである。
本明細書に開示のそれぞれの構成成分、化合物、置換基、またはパラメータについてのそれぞれの量／値または量／値の範囲は、本明細書に開示の他のあらゆる構成成分、化合物、置換基、またはパラメータについて開示されているそれぞれの量／値、または量／値の範囲との組合せでも開示されているとして解釈すべきであること、および、したがって本明細書に開示の２つ以上の構成成分、化合物、置換基、またはパラメータの量／値、または量／値の範囲の任意の組合せも、本詳細な説明の目的のために互いとの組合せでも開示されていることも理解すべきである。
本明細書に開示のそれぞれの範囲のそれぞれの下限値は、同一の構成成分、化合物、置換基、またはパラメータについて本明細書に開示のそれぞれの範囲のそれぞれの上限値との組合せで開示されているものとして解釈すべきであることがさらに理解される。したがって、２つの範囲の開示は、それぞれの範囲のそれぞれの下限値を、それぞれの範囲のそれぞれの上限値と組み合わせることにより導かれる４つの範囲の開示として解釈すべきである。３つの範囲の開示は、それぞれの範囲のそれぞれの下限値を、それぞれの範囲のそれぞれの上限値と組み合わせることにより導かれる９つの範囲の開示などとして解釈すべきである。さらに、本明細書または実施例に開示の構成成分、化合物、置換基、またはパラメータの具体的な量／値は、範囲の下限値または上限値のいずれかの開示として解釈するべきであり、したがって、本出願の他箇所に開示の同一の構成成分、化合物、置換基、またはパラメータについての範囲の他の任意の下限値もしくは上限値または具体的な量／値と組み合わせてその構成成分、化合物、置換基、またはパラメータの範囲を形成し得る。
Ａ．抗Ａｘｌ抗体または抗体断片の領域
一態様において、本発明は、ヒトＡｘｌタンパク質に特異的に結合する単離重鎖可変領域ポリペプチドを提供する。重鎖可変領域ポリペプチドは、３つの相補性決定領域Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３配列を含み、
Ｈ１配列は、Ｘ1ＧＸ2Ｘ3ＭＸ4（配列番号１）であり；
Ｈ２配列は、ＬＩＫＸ5ＳＮＧＧＴＸ6ＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）であり；
Ｈ３配列は、ＧＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12Ｘ13Ｘ14ＤＹＸ15Ｘ16（配列番号３）であり、
Ｘ1は、ＴまたはＡまたはＷであり、
Ｘ2は、ＨまたはＡであり、
Ｘ3は、ＴまたはＩであり、
Ｘ4は、ＮまたはＩであり、
Ｘ5は、ＰまたはＮであり、
Ｘ6は、ＳまたはＩまたはＴであり、
Ｘ7は、ＨまたはＤまたはＥまたはＰまたはＲまたはＷであり、
Ｘ8は、ＹまたはＮであり、
Ｘ9は、ＥまたはＡまたはＤまたはＦまたはＧまたはＨまたはＩまたはＬまたはＭまたはＮまたはＲまたはＶまたはＹであり、
Ｘ10は、ＳまたはＤまたはＭまたはＮまたはＱであり、
Ｘ11は、ＹまたはＣまたはＥまたはＰであり、
Ｘ12は、ＦまたはＥまたはＮまたはＳまたはＴまたはＶであり、
Ｘ13は、ＡまたはＤまたはＧまたはＬまたはＹであり、
Ｘ14は、ＭまたはＥまたはＦであり、
Ｘ15は、ＷまたはＡまたはＤまたはＨまたはＬまたはＮまたはＰまたはＲまたはＴであり、
Ｘ16は、ＧまたはＨである。
重鎖可変領域のアラインメントを図１Ａに示し、相補性決定領域Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３に枠を付す。
別の態様において、本発明は、ヒトＡｘｌタンパク質に特異的に結合する単離軽鎖可変領域ポリペプチドを提供する。軽鎖可変領域ポリペプチドは、３つの相補性決定領域Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３配列を含み、
Ｌ１配列は、ＫＡＳＱＤＸ17Ｘ18ＳＸ19ＶＸ20（配列番号４）であり；
Ｌ２配列は、Ｘ21Ｘ22Ｘ23ＴＲＸ24Ｔ（配列番号５）であり；
Ｌ３配列は、ＱＥＸ25Ｘ26ＳＸ27Ｘ28Ｘ29Ｘ30（配列番号６）であり、
Ｘ17は、ＶまたはＤまたはＧまたはＮまたはＷであり、
Ｘ18は、ＳまたはＶであり、
Ｘ19は、ＡまたはＬまたはＭであり、
Ｘ20は、ＡまたはＤまたはＮまたはＱであり、
Ｘ21は、ＷまたはＦであり、
Ｘ22は、ＡまたはＩまたはＮまたはＰまたはＱであり、
Ｘ23は、ＳまたはＤであり、
Ｘ24は、ＨまたはＤであり、
Ｘ25は、ＨまたはＣまたはＦまたはＩまたはＬまたはＱまたはＳまたはＴまたはＶまたはＹであり、
Ｘ26は、ＦまたはＣまたはＤまたはＥまたはＧまたはＮまたはＳであり、
Ｘ27は、ＴまたはＣまたはＰであり、
Ｘ28は、ＰまたはＡまたはＣまたはＤまたはＥまたはＨまたはＫまたはＳまたはＴまたはＶまたはＷであり、
Ｘ29は、ＬまたはＧまたはＲであり、
Ｘ30は、ＴまたはＩまたはＲである。
軽鎖可変領域のアラインメントを図１Ｂに示し、相補性決定領域Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３に枠を付す。
本発明は、これらの単離重鎖可変領域ポリペプチドおよび単離軽鎖可変領域ポリペプチドを、親抗体から、米国特許第８，７０９，７５５号明細書に開示の方法を使用して同定した。親抗体（０６３－ｈｕｍ１０Ｆ１０）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域も図１Ａ～１Ｂにアラインして単離重鎖可変領域ポリペプチドおよび単離軽鎖可変領域ポリペプチド中の突然変異を示す。
テンプレート抗体中のそれぞれの位置を１つずつランダム化する包括的位置進化（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＣＰＥ）を使用して野生型抗体をコードするＤＮＡを進化させて突然変異抗体ライブラリーを生成した。ライブラリー中のそれぞれの突然変異抗体は、１つの単一点突然変異のみを有する。ライブラリー中の突然変異抗体は、ＥＬＩＳＡによりｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０におけるＡｘｌに対する選択的結合親和性についての同時にスクリーニングすることにより生成した。２つの突然変異抗体希釈物：１：３および１：９希釈物を使用した。１：３または１：９希釈物のいずれかのもとでｐＨ６．０とｐＨ７．４とにおける結合親和性の少なくとも１．５の比を有する突然変異抗体を、重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれにおいて示される単一点突然変異を有する条件的に活性な抗体として選択する（表１および２）。
Figure 0007161783000001
Figure 0007161783000002
別の態様において、本発明は、図１Ａに表される重鎖可変領域および図１Ｂに提示される軽鎖可変領域を同定した。一部の重鎖可変領域は、配列番号１１～１３を有するＤＮＡ配列によりコードされる。図１Ａの重鎖可変領域は、配列番号１４～６７に記載のアミノ酸配列を有する。一部の軽鎖可変領域は、配列番号７～１０を有するＤＮＡ配列によりコードされる。図１Ｂの軽鎖可変領域は、配列番号６８～１１６に記載のアミノ酸配列を有する。これらの重鎖および軽鎖可変領域は、Ａｘｌに特異的に結合し得る。これらの重鎖および軽鎖可変領域の１つを含む抗体は、非腫瘍微小環境中のｐＨよりも腫瘍微小環境中に見出されるｐＨにおいてＡｘｌに対して高い結合親和性を有することが見出された。
本発明は、Ａｘｌに特異的に結合し得る、図１Ａ～１Ｂに提示され、配列番号９～１３を有するＤＮＡ配列によりコードされる重鎖および軽鎖可変領域のバリアントも含む。これらのバリアントを誘導するため、重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｈ１～Ｈ３）および軽鎖可変領域のＣＤＲ（Ｌ１～Ｌ３）がインタクトのままであるべきことが決定された。
これらのバリアントの誘導において、本明細書に記載の方法がガイドとなる。これらの重鎖および軽鎖可変領域のバリアントは、重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成により調製することができる。このような改変としては、例えば、抗体または抗体断片のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれらの残基への挿入、および／またはそれらの残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換の任意の組合せを作製して最終構築物に到達し得るが、ただし、最終構築物は、所望の特性の少なくとも１つ、例えば、抗原結合を保有するものとする。
置換、挿入、および欠失バリアント
ある実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体または抗体断片バリアントが提供される。置換突然変異誘発のための目的部位としては、ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換を「保存的置換」という見出しで表３に示す。より実質的な変化を、「例示的な置換」という見出しで表３に提供し、アミノ酸側鎖のクラスに関してさらに以下に記載する。アミノ酸置換を目的の抗体または抗体断片に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、または免疫原性の減少についてスクリーニングすることができる。
Figure 0007161783000003
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを別のクラスのものに交換することを伴う。
１つのタイプの置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる試験のために選択されて得られるバリアントは、親抗体に対してある生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の減少）を有し、および／または親抗体のある生物学的特性を実質的に保持する。例示的な置換バリアントは親和性成熟抗体であり、例えば、ファージディスプレイベースの親和性成熟技術、例えば、本明細書に記載のものを使用して簡便に生成することができる。簡潔に述べると、１つ以上のＣＤＲ残基を突然変異させ、バリアント抗体をファージ上でディスプレイさせ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
変更（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するためにＣＤＲ中で作製することができる。このような変更は、ＣＤＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２０７，ｐｐ．１７９－１９６，２００８参照）、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）中で作製することができ、得られるバリアントＶＨまたはＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーの構築および二次ライブラリーからの再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７８，ｐｐ．１－３７，２００１）に記載されている。親和性成熟の一部の実施形態において、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発）のいずれかにより、成熟について選択された可変遺伝子中に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法はＣＤＲ指向アプローチを含み、そのアプローチでは、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、１回に４～６残基）をランダム化する。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して抗原結合に関与するＣＤＲ残基を具体的に同定することができる。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３を標的化することが多い。
ある実施形態において、置換、挿入、または欠失は、このような変更が抗原に結合する抗体または抗体断片の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じてよい。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）をＣＤＲ中で作製することができる。このような変更は、ＣＤＲの「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であってよい。上記提供されるバリアントＶHおよびＶL配列のある実施形態において、それぞれのＣＤＲは不変であり、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
突然変異誘発のために標的化することができる抗体の残基または領域を同定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２４４，ｐｐ．１０８１－１０８５，１９８９により記載されるとおり「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法において、標的残基の残基または群（例えば、荷電残基、例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕ）を同定し、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により置き換えて抗体または抗体断片と抗原との相互作用が影響されるか否かを決定する。さらなる置換を、最初の置換に対して機能的感受性を実証するアミノ酸位置において導入することができる。あるいは、またはさらに、抗体または抗体断片と抗原との間の接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。このような接触残基および隣接残基を置換の候補として標的化し、または排除することができる。バリアントをスクリーニングしてそれらが所望の特性を含有するか否かを決定することができる。
アミノ酸配列挿入としては、１残基～１００以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲であるアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、抗体のＮまたはＣ末端と酵素との融合（例えば、ＡＤＥＰＴのための）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの融合が挙げられる。
本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。非ヒト動物に由来する抗体のＶＨおよびＶＬ中のＣＤＲのみをヒト抗体のＶHおよびＶLのＦＲ中に簡易にグラフト化することによりヒト化抗体を産生する場合、抗体結合活性は、非ヒト動物に由来する元の抗体のものと比較して低減することが公知である。非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのいくつかのアミノ酸残基は、ＣＤＲ中だけでなく、ＦＲ中のものも抗体結合活性に直接または間接的に関連することが考慮される。したがって、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基によるこれらのアミノ酸残基の置換は、結合活性を低減させる。この問題を解消するため、ヒトＣＤＲがグラフト化される抗体において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列のうち、抗体への結合に直接関連し、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用し、または抗体の三次元構造を維持し、抗原への結合に直接関連するアミノ酸残基を同定することを試行しなければならない。低減した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を非ヒト動物に由来する元の抗体のアミノ酸残基により置き換えることにより増加させることができる。
改変および変化は、本発明の抗体の構造中で、およびそれらをコードするＤＮＡ配列中で作製することができ、所望の特徴を有する抗体をコードする機能的分子を依然として得る。
アミノ酸配列中の変化の作製において、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することができる。タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能の付与におけるハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、一般に当分野において理解されている。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特徴が得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそれがタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定めることが受け入れられる。それぞれのアミノ酸には、それらの疎水性および電荷の特徴に基づきハイドロパシー指数が割り当てられており、それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）である。
本発明のさらなる目的は、本発明の抗体の機能保存的バリアントも包含する。
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な立体構造および機能を変更せずに変化したもの、例として、限定されるものではないが、類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸によるアミノ酸の置き換えである。保存されることが示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質中で異なり得、その結果、類似機能の任意の２つのタンパク質間のパーセントタンパク質またはアミノ酸配列類似性が変動し得、例えば、アラインメントスキームに従って、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法により決定して７０～９９％であり得る。「機能保存的バリアント」は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定して少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらに好ましくは、少なくとも９０％、いっそうより好ましくは、少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、比較される天然または親タンパク質と同一または実質的に類似の特性または機能を有するポリペプチドも含む。
２つのアミノ酸配列は、より短い配列の全長と比べて８０％超、好ましくは、８５％超、好ましくは、９０％超のアミノ酸が同一であり、または約９０％超、好ましくは、９５％超が類似（機能的に同一）である場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）パイルアッププログラム、または配列比較アルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのいずれかを使用するアラインメントにより同定される。
例えば、あるアミノ酸は、活性の認識可能な損失なしでタンパク質構造中で他のアミノ酸により置換することができる。タンパク質の相互作用キャパシティおよび性質がタンパク質の生物学的機能活性を定めるため、あるアミノ酸置換をタンパク質配列中で、および無論、そのＤＮＡコード配列中で作製することができる一方、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得る。したがって、本発明の抗体もしくは抗体断片の配列、または前記抗体もしくは抗体断片をコードする対応するＤＮＡ配列中で種々の変化を、それらの生物学的活性の認識可能な損失なしで作製することができることが企図される。
あるアミノ酸は、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸により置換することができ、類似の生物学的活性を有するタンパク質を依然としてもたらす、すなわち、生物学的機能等価タンパク質を依然として得ることが当分野において公知である。
上記概略のとおり、したがって、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の上記の特徴を考慮する例示的な置換は当業者に周知であり、それとしては、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
グリコシル化バリアント
ある実施形態において、本明細書において提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより簡便に達成することができる。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着している炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、一般にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合により付着している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２６－３２，１９９７参照。オリゴ糖としては、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」におけるＧｌｃＮＡｃに付着しているフコースを挙げることができる。一部の実施形態において、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変は、ある改善された特性を有する抗体バリアントを作出するために作製することができる。
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）付着しているフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、このような抗体中のフコース量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコース量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号パンフレットに記載のとおりＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により計測してＡｓｎ２９７に付着している全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の合計と比較してＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の２９７位あたり（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指し；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体中の軽微な配列変動に起因して２９７位の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位～３００位の間にも位置し得る。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号明細書（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）参照。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関連する刊行物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；国際公開第２０００／６１７３９号パンフレット；国際公開第２００１／２９２４６号パンフレット；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号明細書；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号明細書；国際公開第２００３／０８５１１９号パンフレット；国際公開第２００３／０８４５７０号パンフレット；国際公開第２００５／０３５５８６号パンフレット；国際公開第２００５／０３５７７８号パンフレット；国際公開第２００５／０５３７４２号パンフレット；国際公開第２００２／０３１１４０号パンフレット；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３３６，ｐｐ．１２３９－１２４９，２００４；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．６１４－６２２，２００４が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生し得る細胞系の例としては、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，ｖｏｌ．２４９，ｐｐ．５３３－５４５，１９８６；米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ号明細書；および国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号パンフレット、特に実施例１１）、ならびにノックアウト細胞系、例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．６１４－６２２，２００４；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．９４，ｐｐ．６８０－６８８，２００６；および国際公開第２００３／０８５１０７号パンフレット参照）が挙げられる。
例えば、抗体のＦｃ領域に付着している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている二分オリゴ糖を有する抗体バリアントがさらに提供される。このような抗体バリアントは、低減したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントの例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号パンフレット；米国特許第６，６０２，６８４号明細書；および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号明細書に記載されている。Ｆｃ領域に付着しているオリゴ糖中の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善したＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号パンフレット；国際公開第１９９８／５８９６４号パンフレット；および国際公開第１９９９／２２７６４号パンフレットに記載されている。
Ｆｃ領域バリアント
ある実施形態において、１つ以上のアミノ酸改変を本明細書において提供される抗体のＦｃ領域中に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。
ある実施形態において、本発明は、全てではないが、一部のエフェクター機能を保有する抗体バリアントを企図し、これらは、インビボにおける抗体の半減期が重要である一方で、あるエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）が不要または有害である用途に関して望ましい候補となる。インビトロおよび／またはインビボの細胞毒性アッセイを実施してＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能を保持することを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．４５７－４９２，１９９１の４６４頁の表５にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号明細書（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．７０５９－７０６３，１９８６も参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８２，ｐｐ．１４９９－１５０２，１９８５；米国特許第５，８２１，３３７号明細書（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．１３５１－１３６１，１９８７も参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６５２－６５６，１９９８に開示のものにおいてインビボで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合し得ず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレットおよび国際公開第２００５／１００４０２号パンフレットにおけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡ参照。補体活性化を評価するため、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．２０２，ｐｐ．１６３－１７１，１９９６；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．１０４５－１０５２，２００３；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．２７３８－２７４３，２００４参照）。ＦｃＲｎ結合およびインビボクリアランス／半減期の決定も、当分野において公知の方法を使用して実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１７５９－１７６９，２００６参照）。
減少したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１つ以上の置換を有するもの（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）が挙げられる。このようなＦｃ突然変異体としては、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７および３２７位の２つ以上における置換を有するＦｃ突然変異体、例として、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）が挙げられる。
ＦｃＲに対する改善または縮小した結合を有するある抗体バリアントが記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、国際公開第２００４／０５６３１２号パンフレット、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．６５９１－６６０４，２００１参照）。
ある実施形態において、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。
一部の実施形態において、変更された（すなわち、改善され、または縮小した）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす変更、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号パンフレット、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１６４，ｐｐ．４１７８－４１８４，２０００に記載のものが、Ｆｃ領域中で作製される。
増加した半減期を有し、胎児への母体ＩｇＧの移動を担う（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１１７，ｐｐ．５８７－５９３，１９７６およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２４，ｐ．２４９，１９９４）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号明細書に記載されている。それらの抗体は、その中にＦｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４の１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号明細書）を有するものが挙げられる。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３２２，ｐｐ．７３８－７４０，１９８８；米国特許第５，６４８，２６０号明細書；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；および国際公開第９４／２９３５１号パンフレットも参照。
システインエンジニアリング抗体バリアント
ある実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基により置換されているシステインエンジニアリング抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作出することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換残基は抗体のアクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインにより置換することにより、反応性チオール基は、それにより抗体のアクセス可能な部位に位置され、それを使用して抗体を他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー－薬物部分とコンジュゲートさせて本明細書においてさらに記載されるとおり免疫コンジュゲートを作出することができる。ある実施形態において、以下の残基のいずれか１つ以上をシステインにより置換することができる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域の５４００（ＥＵ番号付け）。システインエンジニアリング抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号明細書に記載のとおり生成することができる。
抗体誘導体
ある実施形態において、本明細書において提供される抗体または抗体断片は、当分野において公知の容易に利用可能な追加の非タンパク質部分を含有するようにさらに改変することができる。抗体または抗体断片の誘導体化に好適な部分としては、限定されるものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐でも非分岐でもよい。抗体または抗体断片に付着しているポリマーの数は変動し得、２つ以上のポリマーが付着している場合、それらは同一または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、検討事項、例として、限定されるものではないが、改善すべき抗体または抗体断片の特定の特性または機能、その誘導体が規定の条件下で治療法において使用されるか否かなどに基づき決定することができる。
別の実施形態において、放射線への曝露により選択的に加熱することができる抗体または抗体断片および非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１１６００－１１６０５，２００５）。放射線は任意の波長のものであり得、それとしては、限定されるものではないが、通常の細胞を害することはないが、抗体－非タンパク質部分の近位の細胞が殺滅される温度まで非タンパク質部分を加熱する波長が挙げられる。
別の態様において、本発明は、単離重鎖可変領域ポリペプチドまたは単離軽鎖可変領域ポリペプチドを含む抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を提供する。単離重鎖可変領域ポリペプチドは、それぞれ、配列番号１～３を有するＨ１、Ｈ２、およびＨ３領域を含む。単離軽鎖可変領域ポリペプチドは、それぞれ、配列番号４～６を有するＬ１、Ｌ２、およびＬ３領域を含む。
本発明の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、腫瘍微小環境中の条件下で、非腫瘍微小環境中の条件下よりも高いＡｘｌに対する結合親和性を有する。一実施形態において、腫瘍微小環境中の条件および非腫瘍微小環境中の条件は、両方のｐＨである。したがって、本発明の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、約５．～約６．８のｐＨにおいてＡｘｌに選択的に結合し得るが、正常な生理学的環境中に見出される７．２～７．８のｐＨにおいてはより低いＡｘｌに対する結合親和性を有する。実施例３～４に示されるとおり、抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、ｐＨ６．０においてｐＨ７．４よりも高い結合親和性を有する。
ある実施形態において、本発明の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、約≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０-8Ｍ以下、または１０-8Ｍ～１０-13Ｍ、または１０-9Ｍ～１０-13Ｍ）の腫瘍微小環境中の条件下のＡｘｌについての解離定数（Ｋｄ）を有する。一実施形態において、腫瘍微小環境中の条件の値におけるＡｘｌについての抗体または抗体断片のＫｄと、非腫瘍微小環境中の同一条件の異なる値におけるＫｄとの比は、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約７０：１、または少なくとも約１００：１である。
一実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイを使用する目的抗体のＦａｂ型およびその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって計測される。抗原についてのＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下で最小濃度の（125Ｉ）標識抗原によりＦａｂを平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートにより結合した抗原を捕捉することにより計測される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）参照）。アッセイ条件を確立するため、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中で５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）により一晩コーティングし、続いてＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンにより室温（約２３℃）において２～５時間ブロッキングする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［125Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの段階希釈物（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体のＦａｂ－１２の評価と一致する）と混合する。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートし；しかしながら、インキュベーションは、平衡への到達を確保するためにより長い時間（例えば、約６５時間）継続し得る。その後、混合物を、室温におけるインキュベーション（例えば、１時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））により８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与えるそれぞれのＦａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃において固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、約１０応答単位（ＲＵ）において計測する。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を供給業者の説明書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）により５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈してから、約１０の応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成するように５μｌ／分の流速において注入する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応基をブロッキングする。カイネティクス計測のため、Ｆａｂの２倍段階希釈物（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を２５℃において、約２５μｌ／分の流速において０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に注入する。会合速度（ｋon）および解離速度（ｋoff）を、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合および解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋoff／ｋon比として算出する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０6Ｍ-1ｓ-1を超過する場合、オン速度は、分光計、例えば、ストップフロー方式の分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）において計測する場合、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増加または減少を増加濃度の抗原の存在下で２５℃において計測する蛍光消光技術を使用することにより測定することができる。
本発明の抗Ａｘｌ抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であり得る。一実施形態において、抗Ａｘｌ抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディまたはＦ（ａｂ’）2断片および抗体断片から形成される多重特異的抗体を用いる。別の実施形態において、抗体は、本明細書において定義される全長抗体、例えば、インタクトＩｇＧ抗体または他の抗体クラスまたはアイソタイプである。ある抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２９－１３４，２００３参照。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）参照；国際公開第９３／１６１８５号パンフレット；および米国特許第５，５７１，８９４号明細書および同第５，５８７，４５８号明細書も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号明細書参照。
本発明のダイアボディは、二価または二重特異的であり得る。例えば、ダイアボディの例については、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号パンフレット；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６４４４－６４４８，１９９３参照。トリアボディおよびテトラボディの例も、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２９－１３４，２００３に記載されている。
一部の実施形態において、本発明は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一ドメイン抗体断片を含む。ある実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号明細書参照）。
抗体断片は、種々の技術、例として、限定されるものではないが、本明細書に記載のとおりインタクト抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生により作製することができる。
一部の実施形態において、本発明の抗Ａｘｌ抗体は、キメラ抗体であり得る。あるキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐｐ．６８５１－６８５５，１９８４）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、抗体のクラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスに対して変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、それらの抗原結合断片を含む。
ある実施形態において、本発明のキメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、このような非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合によりヒト定常領域の少なくとも一部も含み得る。一部の実施形態において、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復させ、または改善するために非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基により置換される。
ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８に概説されており、さらに例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３３２，ｐｐ．３２３－３２９，１９８８；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８６，ｐｐ．１００２９－１００３３，１９８９；米国特許第５，８２１，３３７号明細書、同第７，５２７，７９１号明細書、同第６，９８２，３２１号明細書、および同第７，０８７，４０９号明細書、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２５－３４，２００５（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化について記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２８，ｐｐ．４８９－４９８，１９９１（「リサーフェイシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．４３－６０，２００５（「ＦＲシャフリング」について記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．６１－６８，２００５およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．２５２－２６０，２０００（ＦＲシャフリングに対する「誘導選択」アプローチについて記載）に記載されている。
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、限定されるものではないが、「ベストフィット」法（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５１，ｐ．２２９６，１９９３参照）を使用して選択されるフレームワーク領域；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループにおけるヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐ．４２８５，１９９２；およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５１，ｐ．２６２３，１９９３参照）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８参照）；ならびにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．１０６７８－１０６８４，１９９７およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２２６１１－２２６１８，１９９６参照）が挙げられる。
一部の実施形態において、本発明の抗Ａｘｌ抗体は、多重特異的抗体、例えば、二重特異的抗体である。多重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる部位についての結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施形態において、結合特異性のあるものはＡｘｌについてのものであり、他方は別の抗原についてのものである。ある実施形態において、二重特異的抗体は、Ａｘｌの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異的抗体は、Ａｘｌを発現する細胞に対して細胞毒性剤を局在化させるために使用することもできる。二重特異的抗体は、全長抗体または抗体断片として調製することができる。
多重特異的抗体を作製する技術としては、限定されるものではないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐｐ．５３７－５４０，１９８３）、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３６５５－３６５９，１９９１参照）、ならびに「ノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書参照）が挙げられる。多重特異的抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果をエンジニアリングすること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号パンフレット）；２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２９，ｐｐ．８１－８３，１９８５参照）；二重特異的抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４８，ｐｐ．１５４７－１５５３，１９９２参照）；二重特異的抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６４４４－６４４８，１９９３参照）；ならびに単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５２，ｐｐ．５３６８－５３７４，１９９４参照）；ならびに例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．６０－６９，１９９１に記載のとおり三重特異的抗体を調製することにより作製することもできる。
３つ以上の機能的抗原結合部位を有するエンジニアリング抗体、例として「オクトパス抗体」も本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号明細書参照）。
抗体または抗体断片としては、Ａｘｌおよび別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」も挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号明細書参照）。
本発明の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、米国特許出願公開第２０１６／００１７０４０号明細書に詳述されている組換え法および組成物を使用して産生することができる。
本発明の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片の物理的／化学的特性および／または生物学的活性は、当分野において公知の種々のアッセイにより試験および計測することができる。これらのアッセイの一部は、米国特許第８，８５３，３６９号明細書に記載されている。
Ｂ．免疫コンジュゲート
別の態様において、本発明はまた、１つ以上の細胞毒性剤、例えば、化学療法剤または化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体にコンジュゲートしている本明細書の抗Ａｘｌ抗体を含む免疫コンジュゲートを提供する。
一実施形態において、免疫コンジュゲートは、抗体が１つ以上の薬物にコンジュゲートしている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり、その薬物としては、限定されるものではないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号明細書、同第５，４１６，０６４号明細書および欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書参照）；アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号明細書および同第５，７８０，５８８号明細書、および同第７，４９８，２９８号明細書参照）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号明細書、同第５，７１４，５８６号明細書、同第５，７３９，１１６号明細書、同第５，７６７，２８５号明細書、同第５，７７０，７０１号明細書、同第５，７７０，７１０号明細書、同第５，７７３，００１号明細書、および同第５，８７７，２９６号明細書参照；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５３，ｐｐ．３３３６－３３４２，１９９３；およびＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．２９２５－２９２８，１９９８）；アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４７７－５２３，２００６；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３５８－３６２，２００６；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．７１７－７２１，２００５；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９７，ｐｐ．８２９－８３４，２０００；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１２，ｖｏｌ．１５２９－１５３２，２００２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．４３３６－４３４３，２００２；ならびに米国特許第６，６３０，５７９号明細書参照）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えば、デセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセル；トリコテセン；およびＣＣ１０６５が挙げられる。
別の実施形態において、免疫コンジュゲートは、酵素活性毒素またはその断片、例として、限定されるものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュアヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、またはクルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンにコンジュゲートしている本明細書に記載の抗体を含む。
別の実施形態において、免疫コンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートしている本明細書に記載の抗体を含む。放射性コンジュゲートの産生には種々の放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートを検出に使用する場合、それは、シンチグラフィー試験のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても公知）用のスピン標識、例えば、ヨウ素－１２３、さらにヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンを含み得る。
抗体および細胞毒性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジプイミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３８，ｐｐ．１０９８－，１９８７に記載のとおり調製することができる。炭素－１４により標識された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号パンフレット参照。リンカーは、細胞中で細胞毒性薬の放出を容易にする「開裂可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）を使用することができる。
本明細書における免疫コンジュゲートは、限定されるものではないが、架橋試薬、例として、限定されるものではないが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に企図する。
ＡＤＣの例示的な実施形態は、腫瘍細胞を標的化する抗体（Ａｂ）、薬物部分（Ｄ）、およびＡｂをＤに付着させるリンカー部分（Ｌ）を含む。一部の実施形態において、抗体は、１つ以上のアミノ酸残基、例えば、リジンおよび／またはシステインを介してリンカー部分（Ｌ）に付着している。
例示的なＡＤＣは、式Ｉ：Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）pＩ（式中、ｐは、１～約２０である）を有する。一部の実施形態において、抗体にコンジュゲートされ得る薬物部分の数は、遊離システイン残基の数により限定される。一部の実施形態において、遊離システイン残基は、本明細書に記載の方法により抗体アミノ酸配列中に導入される。式Ｉの例示的なＡＤＣとしては、限定されるものではないが、１、２、３、または４つのエンジニアリングされたシステインアミノ酸を有する抗体が挙げられる（Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．５０２，ｐｐ．１２３－１３８，２０１２）。一部の実施形態において、１つ以上の遊離システイン残基が、エンジニアリングを使用することなく抗体中で既に存在し、その場合、既存の遊離システイン残基を使用して抗体を薬物にコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態において、抗体は、１つ以上の遊離システイン残基を生成するために抗体のコンジュゲーション前に還元条件に曝露される。
ａ）例示的なリンカー
「リンカー」（Ｌ）は、１つ以上の部分、例えば、薬物部分（Ｄ）を抗体（Ａｂ）に結合して免疫コンジュゲート、例えば、式ＩのＡＤＣを形成するために使用することができる二官能性または多官能性部分である。一部の実施形態において、ＡＤＣは、薬物におよび抗体に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して調製することができる。例えば、一部の実施形態において、抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカーの反応性官能基または薬物－リンカー中間体との結合を形成してＡＤＣを作製し得る。
一態様において、リンカーは、抗体上に存在する遊離システインと反応して共有結合を形成し得る官能基を有する。このような反応性官能基の非限定的な例としては、マレイミド、ハロアセトアミド、α－ハロアセチル、活性化エステル、例えば、スクシンイミドエステル、４－ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．７６５－７７３，２００４の７６６頁におけるコンジュゲーション法参照。
一部の実施形態において、リンカーは、抗体上に存在する求電子基と反応し得る官能基を有する。例示的なそのような求電子基としては、限定されるものではないが、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が挙げられる。一部の実施形態において、リンカーの反応性官能基のヘテロ原子が、抗体上の求電子基と反応し、抗体単位への共有結合を形成し得る。非限定的な例示的なこのような反応性官能基としては、限定されるものではないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられる。
リンカーは、１つ以上のリンカー構成成分を含み得る。例示的なリンカー構成成分としては、６－マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン－シトルリン（「ｖａｌ－ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン－フェニルアラニン（「ａｌａ－ｐｈｅ」）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、および４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１カルボキシレート（「ＭＣＣ」）が挙げられる。種々のリンカー構成成分が当分野において公知であり、それらの一部が以下に記載される。
リンカーは、薬物の放出を容易にする「開裂可能なリンカー」であり得る。開裂可能なリンカーの非限定的な例としては、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンを含む）、プロテアーゼ感受性（例えば、ペプチダーゼ感受性）リンカー、光不安定性リンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）が挙げられる。
ある実施形態において、リンカーは、以下の式ＩＩ：－Ａａ－Ｗｗ－Ｙｙ－（式中、Ａは、「ストレッチャー単位」であり、ａは、０～１の整数であり；Ｗは、「アミノ酸単位」であり、ｗは、０～１２の整数であり；Ｙは「スペーサー単位」であり、ｙは、０、１、または２である）を有する。式ＩＩのリンカーを含むＡＤＣは、式Ｉ（Ａ）：Ａｂ－（Ａa－Ｗw－Ｙy－Ｄ）p（式中、Ａｂ、Ｄ、およびｐは、式Ｉについて上記定義のとおりである）を有する。このようなリンカーの例示的な実施形態は、米国特許第７，４９８，２９８号に記載されている。
一部の実施形態において、リンカー構成成分は、抗体を別のリンカー構成成分にまたは薬物部分に結合させる「ストレッチャー単位」（Ａ）を含む。非限定的な例示的なストレッチャー単位が以下に示される（式中、波線は、抗体、薬物、または追加のリンカー構成成分への共有結合の部位を示す）。
Figure 0007161783000004
一部の実施形態において、リンカー構成成分は、「アミノ酸単位」（Ｗ）を含む。一部のそのような実施形態において、アミノ酸単位は、プロテアーゼによるリンカーの開裂を可能にし、それにより細胞内プロテアーゼ、例えば、リソソーム酵素への曝露時に免疫コンジュゲートからの薬物の放出を容易にする（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３）。例示的なアミノ酸単位としては、限定されるものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、限定されるものではないが、バリン－シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ－ｃｉｔ）、アラニン－フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ－ｐｈｅ）、フェニルアラニン－リジン（ｆｋまたはｐｈｅ－ｌｙｓ）；フェニルアラニン－ホモリジン（ｐｈｅ－ｈｏｍｏｌｙｓ）；およびＮ－メチル－バリン－シトルリン（Ｍｅ－ｖａｌ－ｃｉｔ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、限定されるものではないが、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）およびグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸単位は、天然に生じるアミノ酸残基および／または微量アミノ酸および／または非天然存在アミノ酸類似体、例えば、シトルリンを含み得る。アミノ酸単位は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、およびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的開裂のために設計および最適化することができる。
典型的には、ペプチドタイプリンカーは、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片間のペプチド結合を形成することにより調製することができる。このようなペプチド結合は、例えば、脂質相合成法（例えば、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｅｂｋｅ（１９６５）“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ７６－１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に従って調製することができる。
一部の実施形態において、リンカー構成成分は、抗体を薬物部分に直接、またはストレッチャー単位および／もしくはアミノ酸単位を介して結合する「スペーサー」単位（Ｙ）を含む。スペーサー単位は、「自己犠牲型（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）」または「非自己犠牲型」であり得る。「非自己犠牲型」スペーサー単位は、ＡＤＣの開裂時にスペーサー単位の一部または全部が薬物部分に結合しているままのものである。非自己犠牲型スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、グリシンスペーサー単位およびグリシン－グリシンスペーサー単位が挙げられる。一部の実施形態において、腫瘍細胞関連プロテアーゼによるグリシン－グリシンスペーサー単位を含有するＡＤＣの酵素的開裂が、ＡＤＣの残部からのグリシン－グリシン－薬物部分の放出をもたらす。一部のそのような実施形態において、グリシン－グリシン－薬物部分は、腫瘍細胞中で加水分解ステップに供され、したがってグリシン－グリシンスペーサー単位を薬物部分から開裂する。
「自己犠牲型」スペーサー単位は、薬物部分の放出を可能にする。ある実施形態において、リンカーのスペーサー単位は、ｐ－アミノベンジル単位を含む。一部のそのような実施形態において、ｐ－アミノベンジルアルコールは、アミド結合を介してアミノ酸単位に付着しており、カルバメート、メチルカルバメート、またはカルボネートが、ベンジルアルコールと薬物との間に作製される（Ｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１０８７－１１０３，２００５）。一部の実施形態において、スペーサー単位は、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）を含む。一部の実施形態において、自己犠牲型リンカーを含むＡＤＣは、構造：
Figure 0007161783000005
 （式中、Ｑは、－Ｃ1～Ｃ8アルキル、－Ｏ－（Ｃ1～Ｃ8アルキル）、－ハロゲン、－ニトロ、または－シアノであり、ｍは、０～４範囲の整数であり；Ｘは、１つ以上の追加のスペーサー単位であり得、または不存在であり得；ｐは、１～約２０の範囲である）を有する。一部の実施形態において、ｐは、１～１０、１～７、１～５、または１～４の範囲である。非限定的な例示的なＸスペーサー単位としては、
Figure 0007161783000006
 （式中、Ｒ1およびＲ2は、ＨおよびＣ1～Ｃ6アルキルから独立して選択される）が挙げられる。一部の実施形態において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ－ＣＨ3である。
自己犠牲型スペーサーの他の例としては、限定されるものではないが、ＰＡＢ基と電子的に類似する芳香族化合物、例えば、２－アミノイミダゾール－５－メタノール誘導体（米国特許第７，３７５，０７８号明細書；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．９，ｐ．２２３７－，１９９９）およびオルト－またはパラ－アミノベンジルアセタールが挙げられる。一部の実施形態において、アミド結合加水分解時に環化を受けるスペーサー、例えば、置換および非置換４－アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．２２３－，１９９５）、適切に置換されているビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．９４，ｐ．５８１５－，１９７２）ならびに２－アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５５，ｐ．５８６７，１９９０）を使用することができる。グリシン残基のα－炭素への薬物の結合は、ＡＤＣにおいて有用であり得る自己犠牲型スペーサーの別の例である（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７，ｐ．１４４７，１９８４）。
一部の実施形態において、リンカーＬは、分岐する多官能性リンカー部分を介して２つ以上の薬物部分が抗体に共有結合するための樹状型リンカーであり得る（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．２２１３－２２１５，２００２；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１７６１－１７６８，２００３）。樹状リンカーは、ＡＤＣの効力に関連する薬物と抗体とのモル比、すなわち、負荷を増加させ得る。したがって、抗体が１つのみの反応性システインチオール基を担持する場合、複数の薬物部分が、樹状リンカーを介して付着され得る。
非限定的な例示的リンカーは、式ＩのＡＤＣの関連において以下に示される：
Figure 0007161783000007
 （式中、Ｒ1およびＲ2は、ＨおよびＣ1～Ｃ6アルキルから独立して選択される）。一部の実施形態において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ－ＣＨ3である。
Figure 0007161783000008
 （式中、ｎは、０～１２である）。一部の実施形態において、ｎは、２～１０である。一部の実施形態において、ｎは、４～８である。
さらなる非限定的な例示的なＡＤＣとしては、構造：
Figure 0007161783000009
 それぞれのＲは、独立してＨまたはＣ1～Ｃ6アルキルであり；ｎは、１～１２である）が挙げられる。
一部の実施形態において、リンカーは、溶解度および／または反応性をモジュレートする基により置換されている。非限定的な例として、荷電置換基、例えば、スルホネート（－ＳＯ3 -）またはアンモニウムは、リンカー試薬の水溶性を増加させ、リンカー試薬と抗体および／もしくは薬物部分とのカップリング反応を容易にし得、またはＡＤＣを調製するために用いられる合成経路に応じて、Ａｂ－Ｌ（抗体－リンカー中間体）とＤとのカップリング反応、もしくはＤ－Ｌ（薬物－リンカー中間体）とＡｂとのカップリング反応を容易にし得る。一部の実施形態において、リンカーの一部を抗体にカップリングし、リンカーの一部を薬物にカップリングし、次いでＡｂ－（リンカー部分）aを薬物－（リンカー部分）bにカップリングして式ＩのＡＤＣを形成する。
本発明の化合物は、限定されるものではないが、以下のリンカー試薬を用いて調製されるＡＤＣを明示的に企図する：ビス－マレイミド－トリオキシエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、Ｎ－（β－マレイミドプロピルオキシ）－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、Ｎ－（ε－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、Ｎ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、１，６－ヘキサン－ビス－ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、スクシンイミジル３－（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル６－［（ベータ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート］（ＳＭＰＨ）、イミノチオラン（ＩＴ）、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにスクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、ならびに例として、ビス－マレイミド試薬：ジチオビスマレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４－ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル－２，３－ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、ＢＭ（ＰＥＧ）2（以下に示される）、およびＢＭ（ＰＥＧ）3（以下に示される）；イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジプイミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）。一部の実施形態において、ビス－マレイミド試薬は、チオール含有薬物部分、リンカー、またはリンカー－薬物中間体への抗体中のシステインのチオール基の付着を可能にする。チオール基と反応性である他の官能基としては、限定されるものではないが、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
ある有用なリンカー試薬は、種々の商業的供給源、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）から入手し、または当分野において、例えば、Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６７，ｐｐ．１８６６－１８７２，２００２；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．３８，ｐｐ．５２５７－６０，１９９７；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．６０，ｐｐ．５３５２－５３５５，１９９５；Ｆｒｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１８０－１８６，１９９５；米国特許第６，２１４，３４５号明細書；国際公開第０２／０８８１７２号パンフレット；米国特許出願公開第２００３１３０１８９号明細書；米国特許出願公開第２００３０９６７４３号明細書；国際公開第０３／０２６５７７号パンフレット；国際公開第０３／０４３５８３号パンフレット；および国際公開第０４／０３２８２８号パンフレットに記載される手順に従って合成することができる
炭素－１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。例えば、国際公開第９４／１１０２６号パンフレット参照。
ｂ）例示的な薬物部分
１）メイタンシンおよびメイタンシノイド
一部の実施態様において、免疫コンジュゲートは、１つ以上のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている抗体を含む。メイタンシノイドはメイタンシンの誘導体であり、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカ低木のメイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３８９６１１１号明細書）。続いて、ある微生物もメイタンシノイド、例えば、メイタンシノールおよびＣ－３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号明細書）。合成メイタンシノールおよびその誘導体および類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号明細書；同第４，２４８，８７０号明細書；同第４，２５６，７４６号明細書；同第４，２６０，６０８号明細書；同第４，２６５，８１４号明細書；同第４，２９４，７５７号明細書；同第４，３０７，０１６号明細書；同第４，３０８，２６８号明細書；同第４，３０８，２６９号明細書；同第４，３０９，４２８号明細書；同第４，３１３，９４６号明細書；同第４，３１５，９２９号明細書；同第４，３１７，８２１号明細書；同第４，３２２，３４８号明細書；同第４，３３１，５９８号明細書；同第４，３６１，６５０号明細書；同第４，３６４，８６６号明細書；同第４，４２４，２１９号明細書；同第４，４５０，２５４号明細書；同第４，３６２，６６３号明細書；および同第４，３７１，５３３号明細書に開示されている。
メイタンシノイド薬物部分は、（ｉ）発酵もしくは化学修飾、または発酵産物の誘導体化により調製することが比較的利用しやすく、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィドリンカーを介するコンジュゲーションに好適な官能基による誘導体化に従い、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、（ｉｖ）種々の腫瘍細胞系に対して有効であるため、抗体－薬物コンジュゲートの有力な薬物部分である。
メイタンシノイド薬物部分としての使用に好適なあるメイタンシノイドは当分野において公知であり、公知の方法に従って天然の供給源から単離することができ、または遺伝子操作技術を使用して産生することができる（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９９，ｐｐ．７９６８－７９７３，２００２参照）。また、メイタンシノイドは、公知の方法に従って合成により調製することもできる。
例示的なメイタンシノイド薬物部分としては、限定されるものではないが、修飾芳香環を有するもの、例えば、Ｃ－１９－デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号明細書）（例えば、アンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元により調製される）；Ｃ－２０－ヒドロキシ（またはＣ－２０－デメチル）＋／－Ｃ－１９－デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号明細書および同第４，３０７，０１６号明細書）（例えば、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用する脱メチル化またはＬＡＨを使用する脱塩素により調製される）；およびＣ－２０－デメトキシ、Ｃ－２０－アシロキシ（－ＯＣＯＲ）、＋／－デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号明細書）（例えば、アシル塩化物を使用するアシル化により調製される）、ならびに芳香環の他の位置における修飾を有するものが含まれる。
例示的なメイタンシノイド薬物部分としては、修飾を有するもの、例えば、Ｃ－９－ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号明細書）（例えば、メイタンシノールとＨ2ＳまたはＰ2Ｓ5との反応により調製される）；Ｃ－１４－アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ2ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号明細書）；Ｃ－１４－ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ2ＯＨまたはＣＨ2ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号明細書）（例えば、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）；Ｃ－１５－ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号明細書）（例えば、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの変換により調製される）；Ｃ－１５－メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号明細書および同第４，３１５，９２９号明細書）（例えば、トレウィア・ヌドルフローラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）から単離される）；Ｃ－１８－Ｎ－デメチル（例えば、米国特許第４，３６２，６６３号明細書および同第４，３２２，３４８号明細書）（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの脱メチル化により調製される）；および４，５－デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号明細書）（例えば、メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）も挙げられる。
メイタンシノイド化合物上の多くの位置が結合位置として有用である。例えば、慣用のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応によりエステル結合を形成することができる。一部の実施形態において、反応は、ヒドロキシル基を有するＣ－３位、ヒドロキシメチルにより修飾されているＣ－１４位、ヒドロキシル基により修飾されているＣ－１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ－２０位において生じ得る。一部の実施形態において、結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類似体のＣ－３位において形成される。
メイタンシノイド薬物部分としては、以下の構造：
Figure 0007161783000010
 （式中、波線は、ＡＤＣのリンカーへのメイタンシノイド薬物部分の硫黄原子の共有結合を示す）を有するものが挙げられる。それぞれのＲは、独立してＨまたはＣ1－Ｃ6アルキルであり得る。アミド基を硫黄原子に付着しているアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであり得、すなわち、ｍは、１、２または３である（米国特許第６３３，４１０号明細書；米国特許第５，２０８，０２０号明細書；Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９３，ｐｐ．８６１８－８６２３，１９９６）。
メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体、すなわちキラル炭素におけるＲおよびＳ立体配置の任意の組合せが、本発明のＡＤＣについて企図される（米国特許第７，２７６，４９７号明細書；米国特許第６，９１３，７４８号明細書；米国特許第６，４４１，１６３号明細書；米国特許第６３３，４１０号明細書（ＲＥ３９１５１）；米国特許第５，２０８，０２０号明細書；Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：４３９２－４４０８）。一部の実施態様において、メイタンシノイド薬物部分は、以下の立体化学を有する：
Figure 0007161783000011
メイタンシノイド薬物部分の例示的な実施態様としては、限定されるものではないが、構造：
Figure 0007161783000012
（式中、波線は、抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への薬物の硫黄原子の共有結合を示す）を有するＤＭ１；ＤＭ３およびＤＭ４が挙げられる。
ＤＭ１が抗体のチオール基にＢＭＰＥＯリンカーを介して結合している例示的な抗体－薬物コンジュゲートは、構造および略記号：
Figure 0007161783000013
 （式中、Ａｂは、抗体であり；ｎは、０、１、または２であり；ｐは、１～約２０である）を有する。一部の実施形態において、ｐは、１～１０であり、ｐは、１～７であり、ｐは、１～５であり、またはｐは、１～４である。
メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、その作製方法およびその治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書および同第５，４１６，０６４号明細書；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２Ａ１号明細書；および欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書に開示されている。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９３，ｐｐ．８６１８－８６２３，１９９６；およびＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２も参照。
一部の実施形態において、抗体－メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体の生物学的活性もメイタンシノイド分子の生物学的活性も実質的に縮小させずに、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製することができる。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書参照。一部の実施形態において、抗体分子当たりコンジュゲートしている平均３～４つのメイタンシノイド分子を有するＡＤＣは、抗体の機能にも溶解度にも悪影響を及ぼさずに標的細胞の細胞毒性の向上において効力を示している。一部の例において、毒素／抗体の１つの分子であっても、裸抗体の使用と比べて細胞毒性を向上させることが予測される。
抗体－メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための例示的な結合基としては、例えば、本明細書に記載のものならびに米国特許第５，２０８，０２０号明細書；欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書；Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１、１９９２；米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２Ａ１号明細書；および米国特許出願公開第２００５／０１６９９３Ａ１号明細書に開示のものが挙げられる。
（２）アウリスタチンおよびドラスタチン
薬物部分としては、ドラスタチン、アウリスタチン、ならびにそれらの類似体および誘導体が挙げられる（米国特許第５，６３５，４８３号明細書；米国特許第５，７８０，５８８号明細書；米国特許第５，７６７，２３７号明細書；米国特許第６，１２４，４３１号明細書）。アウリスタチンは、海産軟体動物化合物ドラスタチン－１０の誘導体である。任意の特定の理論により拘束されるものではないが、ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管ダイナミクス、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞分裂（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．３５８０－３５８４，２００１）を妨げ、抗癌性（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．２９６１－２９６５，１９９８）を有することが示されている。ドラスタチン／アウリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に付着させることができる（国際公開第０２／０８８１７２号パンフレット；Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１４５８－１４６５，２００３）。
例示的なアウリスタチンの実施態様としては、米国特許第７，４９８，２９８号明細書および米国特許第７，６５９，２４１号明細書に開示のＮ末端結合モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤEおよびＤFが挙げられる：
Figure 0007161783000014
 （式中、ＤEおよびＤFの波線は、抗体または抗体－リンカー構成成分への共有結合部位を示し、独立してそれぞれの位置において、
Ｒ2は、ＨおよびＣ1～Ｃ8アルキルから選択され；
Ｒ3は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環、アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8炭素環）、Ｃ3～Ｃ8複素環およびＣ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8複素環）から選択され；
Ｒ4は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環、アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8炭素環）、Ｃ3～Ｃ8複素環およびＣ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8複素環）から選択され；
Ｒ5は、Ｈおよびメチルから選択され；
またはＲ4およびＲ5は共同で炭素環式環を形成し、式－（ＣＲaＲb）n－（式中、ＲaおよびＲbは、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキルおよびＣ3～Ｃ8炭素環式化合物から独立して選択され、ｎは、２、３、４、５および６から選択される）を有し；
Ｒ6は、ＨおよびＣ1～Ｃ8アルキルから選択され；
Ｒ7は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環、アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－アリール、Ｃ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8炭素環）、Ｃ3～Ｃ8複素環およびＣ1～Ｃ8アルキル－（Ｃ3～Ｃ8複素環）から選択され；
それぞれのＲ8は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、Ｃ3～Ｃ8炭素環およびＯ－（Ｃ1～Ｃ8アルキル）から独立して選択され；
Ｒ9は、ＨおよびＣ1～Ｃ8アルキルから選択され；
Ｒ10は、アリールまたはＣ3～Ｃ8複素環から選択され；
Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ12であり、Ｒ12は、Ｃ1～Ｃ8アルキルであり；
Ｒ11は、Ｈ、Ｃ1～Ｃ20アルキル、アリール、Ｃ3～Ｃ8複素環、－（Ｒ13Ｏ）m－Ｒ14、または（Ｒ13Ｏ）m－ＣＨ（Ｒ15）2から選択され；
ｍは、１～１０００の範囲の整数であり；
Ｒ13は、Ｃ2～Ｃ8アルキルであり；
Ｒ14は、ＨまたはＣ1～Ｃ8アルキルであり；
ｅのそれぞれの存在は、独立してＨ、ＣＯＯＨ、－（ＣＨ2）n－Ｎ（Ｒ16）2、－（ＣＨ2）n－ＳＯ3Ｈ、または（ＣＨ2）n－ＳＯ3－Ｃ1～Ｃ8アルキルであり；
ｅのそれぞれの存在は、独立してＨ、Ｃ1～Ｃ8アルキル、または（ＣＨ2）n－ＣＯＯＨであり；
Ｒ18は、－Ｃ（Ｒ8）2－Ｃ（Ｒ8）2－アリール、－Ｃ（Ｒ8）2－Ｃ（Ｒ8）2（Ｃ3～Ｃ8複素環）、およびＣ（Ｒ8）2－Ｃ（Ｒ8）2（Ｃ3～Ｃ8炭素環）から選択され；
ｎは０～６の範囲の整数である）。
一実施態様において、Ｒ3、Ｒ4およびＲ7は、独立してイソプロピルまたはｓｅｃ－ブチルであり、Ｒ5は、－Ｈまたはメチルである。例示的な実施態様において、Ｒ3およびＲ4は、それぞれイソプロピルであり、Ｒ5は、－Ｈであり、Ｒ7は、ｓｅｃ－ブチルである。
さらに他の実施態様において、Ｒ2およびＲ6は、それぞれメチルであり、Ｒ9は－Ｈである。
さらに他の実施態様において、Ｒ8のそれぞれの存在は、－ＯＣＨ3である。
例示的な実施態様において、Ｒ3およびＲ4は、それぞれイソプロピルであり、Ｒ2およびＲ6は、それぞれメチルであり、Ｒ5は、－Ｈであり、Ｒ7は、ｓｅｃ－ブチルであり、Ｒ8のそれぞれの存在は、－ＯＣＨ3であり、Ｒ9は、－Ｈである。
一実施態様において、Ｚは、－Ｏ－またはＮＨ－である。
一実施態様において、Ｒ10は、アリールである。
例示的な実施態様において、Ｒ10は、－フェニルである。
例示的な実施態様において、Ｚが－Ｏ－である場合、Ｒ11は、－Ｈ、メチルまたはｔ－ブチルである。
一実施態様において、Ｚが－ＮＨである場合、Ｒ11は、－ＣＨ（Ｒ15）2であり、Ｒ15は、－（ＣＨ2）n－Ｎ（Ｒ16）2であり、Ｒ16は、－Ｃ1～Ｃ8アルキルまたは（ＣＨ2）n－ＣＯＯＨである。
別の実施態様において、Ｚが－ＮＨである場合、Ｒ11は、－ＣＨ（Ｒ15）2であり、Ｒ15は、－（ＣＨ2）n－ＳＯ3Ｈである。
式ＤEの例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥであり、式中、波線は、抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す：
Figure 0007161783000015
式ＤEの例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥであり、式中、波線は、抗体－薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す：
Figure 0007161783000016
他の例示的な実施態様としては、ペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端におけるフェニルアラニンカルボキシ修飾を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８８４８号パンフレット）およびペンタペプチドアウリスタチン薬物部分のＣ末端におけるフェニルアラニン側鎖修飾を有するモノメチルバリン化合物（国際公開第２００７／００８６０３号パンフレット）が挙げられる。
ＭＭＡＦおよび種々のリンカー構成成分を含む式ＩのＡＤＣの非限定的な例示的な実施態様としては、Ａｂ－ＭＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦおよびＡｂ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦも挙げられる。タンパク質分解により開裂可能でないリンカーにより抗体に付着しているＭＭＡＦを含む免疫コンジュゲートは、タンパク質分解により開裂可能なリンカーにより抗体に付着しているＭＭＡＦを含む免疫コンジュゲートと同等の活性を保有することが示されている（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１１４－１２４，２００６参照）。一部のこのような実施形態において、薬物放出は細胞中の抗体分解に影響されると考えられる。
典型的には、ペプチドベースの薬物部分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片間でペプチド結合を形成することにより調製することができる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成法に従って調製することができる（例えば、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｅｂｋｅ，“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ ７６－１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、一部の実施形態において、米国特許第７，４９８，２９８号明細書；米国特許第５，６３５，４８３号明細書；米国特許第５，７８０，５８８号明細書；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１１１，ｐｐ．５４６３－５４６５，１９９８；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．２４３－２７７，１９９８；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．７１９－７２５，１９９６；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．ｖｏｌ．１５，ｐｐ．８５９－８６３，１９９６；およびＤｏｒｏｎｉｎａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３の方法に従って調製することができる。
一部の実施形態において、式ＤEのアウリスタチン／ドラスタチン薬物部分、例えば、ＭＭＡＥ、およびＤE、例えば、ＭＭＡＦ、ならびにそれらの薬物－リンカー中間体および誘導体、例えば、ＭＣ－ＭＭＡＦ、ＭＣ－ＭＭＡＥ、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ、およびＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥは、米国特許第７，４９８，２９８号明細書；Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１１４－１２４，２００６；およびＤｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．２１，ｐｐ．７７８－７８４，２００３に記載の方法を使用して調製し、次いで目的の抗体にコンジュゲートさせることができる。
（３）カリケアマイシン
一部の実施態様において、免疫コンジュゲートは、１つ以上のカリケアマイシン分子にコンジュゲートしている抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリー、およびそれらの類似体は、サブピコモル濃度において二本鎖ＤＮＡ分解を産生し得る（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５３，ｐｐ．３３３６－３３４２，１９９３；Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．２９２５－２９２８，１９９８）。カリケアマイシンは、細胞内作用部位を有するが、ある例において、細胞膜を容易に通過しない。したがって、抗体媒介内在化を介するこれらの薬剤の細胞取り込みは、一部の実施形態において、それらの細胞毒性効果を大きく向上させ得る。カリケアマイシン薬物部分を有する抗体－薬物コンジュゲートを調製する非限定的な例示的方法は、例えば、米国特許第５，７１２，３７４号明細書；米国特許第５，７１４，５８６号明細書；米国特許第５，７３９，１１６号明細書；および米国特許第５，７６７，２８５号明細書に記載されている。
（４）ピロロベンゾジアゼピン
一部の実施形態において、ＡＤＣは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。一部の実施形態において、ＰＤＢ二量体は特異的ＤＮＡ配列を認識し、それに結合する。天然産物アントラマイシンであるＰＢＤは、１９６５年に最初に報告された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．５７９３－５７９５，１９６５；Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．５７９１－５７９３，１９６５）。それ以降、天然存在および類似体の両方の多数のＰＢＤが報告されており（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．ｖｏｌ．１９９４，ｐｐ．４３３－４６５ １９９４）、それらとしては、三環式ＰＢＤ足場の二量体（米国特許第６，８８４，７９９号明細書；米国特許第７，０４９，３１１号明細書；米国特許第７，０６７，５１１号明細書；米国特許第７，２６５，１０５号明細書；米国特許第７，５１１，０３２号明細書；米国特許第７，５２８，１２６号明細書；米国特許第７，５５７，０９９号明細書）が挙げられる。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、二量体構造が、Ｂ型ＤＮＡの副溝との等螺旋性（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）に適切な三次元形状を付与し、結合部位における滑合をもたらすと考えられる（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３－１１（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ－ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２３０－２３７，１９８６）。Ｃ２アリール置換基を担持する二量体ＰＢＤ化合物は、細胞毒性剤として有用であることが示されている（Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７０，ｐｐ．６８４９－６８５８，２０１０；Ａｎｔｏｎｏｗ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．５３，ｐｐ．２９２７－２９４１，２０１０；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ．６４６３－６４６６，２００９）。
ＰＢＤ二量体は抗体にコンジュゲートされており、得られるＡＤＣは、抗癌特性を有することが示されている。非限定的な例示的なＰＢＤ二量体上の結合部位としては、５員ピロロ環、ＰＢＤ単位の間のテザー、およびＮ１０－Ｃ１１イミン基が挙げられる（国際公開第２００９／０１６５１６号パンフレット；米国特許出願公開第２００９／３０４７１０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０４７２５７号明細書；米国特許出願公開第２００９／０３６４３１号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書；国際公開第２０１１／１３０５９８号パンフレット）。
非限定的な例示的ＡＤＣのＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ：
Figure 0007161783000017
 のもの、ならびにその塩および溶媒和物（式中、
波線は、リンカーへの共有結合部位を示し；
点線は、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間の二重結合の任意選択の存在を示し；
Ｒ2は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ2、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ－ＲD、＝Ｃ（ＲD）2、Ｏ－ＳＯ2－Ｒ、ＣＯ2ＲおよびＣＯＲから独立して選択され、場合により、ハロまたはジハロからさらに選択され、ＲDは、Ｒ、ＣＯ2Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ2Ｈ、およびハロから独立して選択され；
Ｒ6およびＲ9は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ2、Ｍｅ3Ｓｎおよびハロから独立して選択され；
Ｒ7は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ2、Ｍｅ3Ｓｎおよびハロから独立して選択され；
Ｑは、Ｏ、Ｓ、およびＮＨから独立して選択され、
Ｒ11は、ＨもしくはＲのいずれかであり、またはＱがＯである場合、ＳＯ3Ｍであり、Ｍは、金属陽イオンであり；
ＲおよびＲ’は、場合により置換されているＣ1～8アルキル、Ｃ1～12アルキル、Ｃ3～8ヘテロシクリル、Ｃ3～20複素環、およびＣ5～20アリール基からそれぞれ独立して選択され、場合により、基ＮＲＲ’との関連で、ＲおよびＲ’は、それらが付着している窒素原子と一緒になって、場合により置換されている４、５、６、または７員複素環式環を形成し；
Ｒ12、Ｒ16、Ｒ19、およびＲ17は、それぞれＲ2、Ｒ6、Ｒ9、およびＲ7について定義されるとおりであり、
Ｒ’’は、Ｃ3～12アルキレン基であり、その鎖は、１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、および／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジンにより中断されていてよく、それらの環は、場合により置換されており；
ＸおよびＸ’は、Ｏ、Ｓ、およびＮ（Ｈ）から独立して選択される）である。
一部の実施形態において、ＲおよびＲ’は、場合により置換されているＣ1～12アルキル、Ｃ3～20複素環、およびＣ5～20アリール基からそれぞれ独立して選択され、場合により、基ＮＲＲ’との関連で、ＲおよびＲ’は、それらが付着している窒素原子と一緒になって、場合により置換されている４、５、６、または７員複素環式環を形成する。一部の実施形態において、Ｒ9およびＲ19は、Ｈである。一部の実施形態において、Ｒ6およびＲ16は、Ｈである。
一部の実施形態において、Ｒ7およびＲ17は両方とも、ＯＲ7Aであり、Ｒ7Aは、場合により置換されているＣ1～4アルキルである。一部の実施形態において、Ｒ7Aは、Ｍｅである。一部の実施形態において、Ｒ7Aは、Ｃｈ2Ｐｈであり、Ｐｈは、フェニル基である。一部の実施形態において、Ｘは、Ｏである。一部の実施形態において、Ｒ11は、Ｈである。一部の実施形態において、それぞれの単量体単位中のＣ２とＣ３との間に二重結合が存在する。
一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、ＨおよびＲから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、独立してＲである。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、独立して、場合により置換されているＣ5～20アリールまたはＣ5～7アリールまたはＣ8～10アリールである。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、独立して、場合により置換されているフェニル、チエニル、ナフチル、ピリジル、キノリニル、またはイソキノリニルである。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、＝Ｏ、＝ＣＨ2、＝ＣＨ－ＲD、および＝Ｃ（ＲD）2から独立して選択される。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、それぞれ＝ＣＨ2である。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、それぞれＨである。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、それぞれ＝Ｏである。一部の実施形態において、Ｒ2およびＲ12は、それぞれ＝ＣＦ2である。一部の実施形態において、Ｒ2および／またはＲ12は、独立して＝Ｃ（ＲD）2である。一部の実施形態において、Ｒ2および／またはＲ12は、独立して＝ＣＨ－ＲDである。
一部の実施形態において、Ｒ2および／またはＲ12が＝ＣＨ－ＲDである場合、それぞれの基は、独立して、以下に示される立体配置のいずれかを有し得る：
Figure 0007161783000018
一部の実施形態において、＝ＣＨ－ＲDは、立体配置（Ｉ）である。一部の実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ3アルキレン基またはＣ5アルキレン基である。
ＰＢＤ二量体－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＡｂおよびＰＢＤ二量体－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＰＡＢ－Ａｂのリンカーは、プロテアーゼ開裂可能である一方、ＰＢＤ二量体－マレイミド－アセタールのリンカーは、酸不安定性である。
ＰＢＤ二量体およびＰＢＤ二量体を含むＡＤＣは、当分野において公知の方法に従って調製することができる。例えば、国際公開第２００９／０１６５１６号パンフレット；米国特許出願公開第２００９／３０４７１０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０４７２５７号明細書；米国特許出願公開第２００９／０３６４３１号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書；国際公開第２０１１／１３０５９８号パンフレット参照。
（５）アントラサイクリン
一部の実施形態において、ＡＤＣは、アントラサイクリンを含み得る。アントラサイクリンは、細胞毒性活性を示す抗生物質化合物である。いかなる特定の理論によっても拘束されるものではないが、研究は、アントラサイクリンが多数の異なる機序、例として、１）細胞のＤＮＡ中への薬物分子のインターカレーションと、それによるＤＮＡ依存的核酸合成の阻害；２）次に細胞巨大分子と反応して細胞への損傷を引き起こすフリーラジカルの薬物による産生、および／または３）薬物分子と細胞膜との相互作用により細胞を殺傷するように機能し得ることを示している（例えば、Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｏｆ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ”ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｎ．Ｒ．Ｂａｃｈｕｒ，“Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｄａｍａｇｅ”ｉｄ．ａｔ ｐｐ．９７－１０２参照）。アントラサイクリンは、その細胞毒性潜在性のため、多数の癌、例として、白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌、および肉腫の治療において使用されている（例えば、Ｐ．Ｈ－Ｗｉｅｒｎｉｋ，ｉｎ Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ Ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｐ１１参照）。
非限定的な例示的なアントラサイクリンとしては、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ネモルビシン、およびそれらの誘導体が挙げられる。ダウノルビシンおよびドキソルビシンの免疫コンジュゲートおよびプロドラッグが調製され、研究されている（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４７７－５２３，２００６；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３５８－３６２．１９９６；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．７１７－７２１，２００５；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９７，ｐｐ．８２９－８３４，２０００；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１５２９－１５３２，２００２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．４３３６－４３４３，２００２；欧州特許第０３２８１４７号明細書；米国特許第６，６３０，５７９号明細書）。抗体－薬物コンジュゲートＢＲ９６－ドキソルビシンは、腫瘍関連抗原ルイス－Ｙと特異的に反応し、第Ｉ相および第ＩＩ相試験において評価されている（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．２２８２－２２９２，２０００；Ａｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒ．，ｖｏｌ．６，ｐｐ．７８－８１，２０００；Ｔｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．４７８－４８４，１９９９）。
ＰＮＵ－１５９６８２は、ネモルビシンの強力な代謝産物（または誘導体）である（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１６０８－１６１７，２００５）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノ上の２－メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成類似体であり、臨床評価中であり（Ｇｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１３３－１３８，１９９０；Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６５，ｐｐ．７０３－７０７，１９９２）、例としては、第ＩＩ相／第ＩＩＩ相治験が挙げられる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２，Ａｂｓ１４４８，２００３；Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４４：１ｓｔ Ｅｄ，Ａｂｓ ４６４９，２００３；Ｐａｃｃｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４，ｐ．１４１１６，２００６）。
アントラサイクリン、例として、ＰＮＵ－１５９６８２は、いくつかの結合部位、および種々のリンカー（米国特許出願公開第２０１１／００７６２８７号明細書；国際公開第２００９／０９９７４１号パンフレット；米国特許出願公開第２０１０／００３４８３７号明細書；国際公開第２０１０／００９１２４号パンフレット）、例として、本明細書に記載のリンカーを介して抗体にコンジュゲートさせることができる。
ＰＮＵ－１５９６８２マレイミドアセタール－Ａｂのリンカーは酸不安定性である一方、ＰＮＵ－１５９６８２－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－Ａｂ、ＰＮＵ－１５９６８２－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－スペーサー－Ａｂ、およびＰＮＵ－１５９６８２－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢ－スペーサー（Ｒ1Ｒ2）－Ａｂのリンカーは、プロテアーゼ開裂可能である。
（６）他の薬物部分
薬物部分としては、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，ｖｏｌ．９２，ｐｐ．１５７３－１５８１，２０００；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１０２５－１０２８，２０００；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．７８６－７９１，２００２）；ならびに酵素活性毒素およびその断片、例として、限定されるものではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンも挙げられる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレット参照。
薬物部分としては、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）も挙げられる。
ある実施形態において、免疫コンジュゲートは、高放射性の原子を含み得る。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲート抗体の産生に利用可能である。例としては、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。一部の実施形態において、免疫コンジュゲートを検出に使用する場合、それは、シンチグラフィー試験のための放射性原子、例えば、Ｔｃ99もしくはＩ123、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）としても公知）用のスピン標識、例えば、ジルコニウム－８９、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含み得る。例えば、ＰＥＴイメージングのためにジルコニウム－８９を種々の金属キレート剤に錯化させ、抗体にコンジュゲートさせることができる（国際公開第２０１１／０５６９８３号パンフレット）。
放射標識または他の標識は、公知の手法で免疫コンジュゲートに取り込むことができる。例えば、ペプチドは、例えば、１つ以上のフッ素－１９原子を１つ以上の水素の代わりに含む好適なアミノ酸前駆体を使用して生合成または化学合成することができる。一部の実施形態において、標識、例えば、Ｔｃ99、Ｉ123、Ｒｅ186、Ｒｅ188、およびＩｎ111を、抗体中のシステイン残基を介して付着させることができる。一部の実施形態において、イットリウム－９０は、抗体のリジン残基を介して付着させることができる。一部の実施形態において、ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．８０，ｐｐ．４９－５７，１９７８）を使用してヨウ素－１２３を取り込むことができる。“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は、ある他の方法を記載している。
ある実施形態において、免疫コンジュゲートは、プロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートしている抗体を含み得る。一部のこのような実施形態において、プロドラッグ活性化酵素は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号パンフレット参照）を活性薬物、例えば、抗癌薬に変換する。このような免疫コンジュゲートは、一部の実施形態において、抗体依存的酵素媒介性プロドラッグ療法（「ＡＤＥＰＴ」）において有用である。抗体にコンジュゲートさせることができる酵素としては、限定されるものではないが、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアリールスルファターゼ；非毒性５－フルオロシトシンを抗癌薬５－フルオロウラシルに変換するために有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、テルモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）；Ｄ－アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するために有用なＤ－アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用な炭水化物開裂酵素、例えば、β－ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；β－ラクタムにより誘導体化されている薬物を遊離薬物に変換するために有用なβ－ラクタマーゼ；ならびにアミン窒素においてフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基によりそれぞれ誘導体化されている薬物を遊離薬物に変換するために有用なペニシリンアミダーゼ、例えば、ペニシリンＶアミダーゼおよびペニシリンＧアミダーゼが挙げられる。一部の実施形態において、酵素は、当分野において周知の組換えＤＮＡ技術により抗体に共有結合させることができる。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３１２，ｐｐ．６０４－６０８，１９８４参照。
ｃ）薬物負荷
薬物負荷は、式Ｉの分子における抗体当たりの薬物部分の平均数ｐにより表される。薬物負荷は、抗体当たり１～２０個の薬物部分（Ｄ）の範囲であり得る。式ＩのＡＤＣは、１～２０個の範囲の薬物部分とコンジュゲートしている抗体の集団を含む。コンジュゲーション反応からのＡＤＣ調製において使用される抗体当たりの薬物部分の平均数は、慣用の手段、例えば、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣにより特徴付けすることができる。また、ｐの単位でのＡＤＣの定量分布を測定することもできる。一部の例において、ｐがある値である同種ＡＤＣを、他の薬物負荷を有するＡＤＣから分離し、精製し、特徴付けることは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動のような手段により達成することができる。
一部の抗体－薬物コンジュゲートについて、ｐは、抗体上の付着部位の数により限定され得る。例えば、上記のある例示的な実施形態のように付着がシステインチオールである場合、抗体は、１つのみもしくは数個のシステインチオール基を有し得、または１つのみもしくは数個の反応性が十分なチオール基を有し得、それらによりリンカーを付着させることができる。ある実施形態において、薬物負荷がより高くなると、例えば、ｐ＞５になると、ある抗体－薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の損失を引き起こし得る。ある実施形態において、ＡＤＣについての平均薬物負荷は、１～約８；約２～約６；または約３～約５の範囲である。実際、あるＡＤＣについて、抗体当たりの薬物部分の最適な比は、８未満であり得、約２～約５であり得ることが示されている（米国特許第７，４９８，２９８号明細書）。
ある実施形態において、理論上の最大数よりも少ない薬物部分を、コンジュゲーション反応の間に抗体にコンジュゲートさせる。抗体は、以下に考察されるとおり、例えば、薬物－リンカー中間体ともリンカー試薬とも反応しないリジン残基を含有し得る。一般に、抗体は、薬物部分に結合され得る多くの遊離および反応性システインチオール基を含有せず；実際、抗体中のほとんどのシステインチオール残基は、ジスルフィド架橋として存在する。ある実施形態において、抗体は、還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）により部分または完全還元条件下で還元して反応性システインチオール基を生成することができる。ある実施形態において、抗体を変性条件に供して反応性求核基、例えば、リジンまたはシステインを明らかにする。
ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比）は、様々な手法で、例えば、（ｉ）抗体に対してモル過剰の薬物－リンカー中間体またはリンカー試薬の限定、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度の限定、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分または限定的還元条件により制御することができる。
２つ以上の求核基が薬物－リンカー中間体またはリンカー試薬と反応する場合、得られる生成物は、抗体に付着している１つ以上の薬物部分の分布を有するＡＤＣの混合物であることが理解される。抗体当たりの薬物の平均数は、抗体に特異的であり、薬物に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイにより混合物から算出することができる。個々のＡＤＣは、質量分析法により混合物中で同定し、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離することができる（例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２９９－３０７，２００６；Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．７０６３－７０７０，２００４参照）。ある実施形態において、単一の負荷値を有する同種ＡＤＣを、電気泳動またはクロマトグラフィーによりコンジュゲーション混合物から単離することができる。
ｄ）免疫コンジュゲートを調製するある方法
式ＩのＡＤＣである免疫コンジュゲートは、当業者に公知の有機化学反応、条件、および試薬を用いるいくつかの経路、例として、（１）抗体の求核基を二価リンカー試薬と反応させて共有結合を介してＡｂ－Ｌを形成し、次いで薬物部分Ｄと反応させることと；ならびに（２）薬物部分の求核基を二価リンカー試薬と反応させて共有結合を介してＤ－Ｌを形成し、次いで抗体の求核基と反応させることにより調製することができる。後者の経路を介して式ＩのＡＤＣを調製する例示的な方法は、米国特許第７，４９８，２９８号明細書に記載されている。
抗体上の求核基としては、限定されるものではないが、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖ヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられる。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基、例として、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；ならびに（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基と反応して共有結合を形成し得る。ある抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、抗体が完全にまたは部分的に還元されるように、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）による処理によりリンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性とすることができる。したがって、それぞれのシステイン架橋は、理論上、２つの反応性チオール求核剤を形成する。追加の求核基は、リジン残基の修飾を介して、例えば、リジン残基を２－イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）と反応させてアミンをチオールに変換させることにより抗体中に導入することができる。反応性チオール基も、１、２、３、４つ以上のシステイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の非天然システインアミノ酸残基を含むバリアント抗体を調製することにより）抗体中に導入することができる。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、抗体上の求電子基、例えば、アルデヒドまたはケトンカルボニル基と、リンカー試薬または薬物上の求核基との間の反応によっても産生することができる。リンカー試薬上の有用な求核基としては、限定されるものではないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられる。一実施形態において、抗体は、リンカー試薬または薬物上の求核置換基と反応し得る求電子部分を導入するように修飾される。別の実施形態において、グリコシル化抗体の糖を、例えば、過ヨウ素酸塩酸化試薬により酸化してリンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応し得るアルデヒド基またはケトン基を形成することができる。得られるイミンシッフ塩基群は、安定した結合を形成し得、または例えば、ホウ化水素試薬により還元して安定したアミン結合を形成することができる。一実施形態において、グリコシル化抗体の炭水化物部分と、ガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応は、薬物上の適切な基と反応し得る抗体中のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を生じさせ得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態において、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有する抗体はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドを産生し得る（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ＆ Ｓｔｒｏｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３，ｐｐ．１３８－１４６，１９９２；米国特許第５，３６２，８５２号明細書）。このようなアルデヒドは、薬物部分またはリンカー求核剤と反応させることができる。
薬物部分上の例示的な求核基としては、限定されるものではないが、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基、例として、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基と反応して共有結合を形成し得るアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基が挙げられる。
ＡＤＣを調製するために使用することができる非限定的な例示的な架橋試薬は、本明細書において「例示的なリンカー」と題されるセクションに記載される。このような架橋試薬を使用して２つの部分、例として、タンパク質性部分および化学部分を結合させる方法は、当分野において公知である。一部の実施形態において、抗体および細胞毒性剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成により作製することができる。組換えＤＮＡ分子は、互いに隣接しており、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって隔離されている、コンジュゲートの抗体および細胞毒性部分をコードする領域を含み得る。
さらに別の実施形態において、抗体は、腫瘍のプレターゲティングにおいて利用するために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲートさせることができ、その腫瘍のプレターゲティングにおいては、抗体－受容体コンジュゲートを患者に投与し、次いでクリアリング剤を使用して血液循環から非結合コンジュゲートを除去し、次いで細胞毒性剤（例えば、薬物または放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートしている「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
Ｃ．診断および検出のための方法および組成物
ある実施形態において、本明細書において提供される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片のいずれも、生物学的試料中のＡｘｌの存在の検出に使用することができる。本明細書において使用される用語「検出すること」は、定量または定性的検出を包含する。ある実施形態において、生物学的試料は、細胞または組織、例えば、乳房、膵臓、食道、肺および／または脳細胞または組織を含む。
本発明のさらなる態様は、Ａｘｌレベルが体内の少なくとも１つの場所において正常な生理学的レベルから増加または減少する癌または別の疾患を診断および／またはモニタリングするための本発明の抗Ａｘｌ抗体に関する。
好ましい実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、検出可能な分子または物質、例えば、上記の蛍光分子、放射性分子または当分野において公知の任意の他の標識により標識することができる。例えば、本発明の抗体は、放射性分子により標識することができる。例えば、好適な放射性分子としては、限定されるものではないが、シンチグラフィー試験に使用される放射性原子、例えば、123Ｉ、124Ｉ、111Ｉｎ、186Ｒｅ、および188Ｒｅが挙げられる。本発明の抗体または抗体断片は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング用のスピン標識、例えば、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄により標識することもできる。抗体の投与後、患者内の放射性標識抗体の分布を検出する。任意の好適な公知の方法を使用することができる。一部の非限定的な例としては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光および超音波診断が挙げられる。
本発明の抗体または抗体断片は、Ａｘｌ過剰発現に関連する癌および疾患の診断および病期分類に有用であり得る。Ａｘｌ過剰発現に関連する癌としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、例えば、膠芽細胞腫および神経線維腫症、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞腫、肉腫、血液癌（白血病）、星状細胞腫、および種々のタイプの頭頸部癌または他のＡｘｌ発現または過剰発現の過剰増殖性疾患を挙げることができる。
本発明の抗体または抗体断片は、Ａｘｌ発現が増加または減少する癌以外の疾患の診断に有用であり得る。（可溶性または細胞Ａｘｌ形態の両方をそのような診断に使用することができる。典型的には、このような診断法は、患者から得られる生物学的試料の使用を含む。本明細書において使用される用語「生物学的試料」は、診断またはモニタリングアッセイにおいて使用することができる対象から得られる種々の試料タイプを包含する。生物学的試料としては、限定されるものではないが、生物起源の血液ならびに他の液体試料、固体組織試料、例えば、生検標本または組織培養物またはそれに由来する細胞、およびその子孫が挙げられる。例えば、生物学的試料としては、Ａｘｌ過剰発現に関連する癌、および好ましい実施形態において、神経膠腫、胃癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌および子宮内膜癌を有すると疑われる個体から回収される組織試料から得られる細胞が挙げられる。生物学的試料は、臨床試料、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的体液、および組織試料を包含する。
特定の実施形態において、本発明は、本発明の抗体を使用して対象からの細胞上のＡｘｌを検出することにより対象におけるＡｘｌ過剰発現に関連する癌を診断する方法である。特に、前記方法は、
（ａ）対象の生物学的試料を、本発明による抗体または抗体断片と、抗体または抗体断片がＡｘｌを発現する生物学的試料の細胞との複合体を形成するのに好適な条件下で接触させるステップ；ならびに
（ｂ）前記複合体を検出および／または定量するステップ（前記複合体の検出は、Ａｘｌ過剰発現に関連する癌を示す）
を含み得る。
癌の進行をモニタリングするため、方法による方法を異なる時点において繰り返して試料への抗体結合が増加または減少するか否かを決定することができ、それから、癌が進行、退縮または安定しているか否かを決定することができる。
特定の実施形態において、本発明は、Ａｘｌの発現もしくは過剰発現またはＡｘｌの可溶性形態の減少もしくは増加に関連する疾患を診断する方法である。このような疾患の例としては、ヒト免疫障害、血栓疾患（血栓症およびアテローム血栓症）、および心血管疾患を挙げることができる。
一実施形態において、診断または検出の方法において使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片が提供される。さらなる態様において、生物学的試料中のＡｘｌの存在を検出する方法が提供される。さらなる態様において、生物学的試料中のＡｘｌの量を定量する方法が提供される。ある実施形態において、本方法は、生物学的試料を、本明細書に記載の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片と、Ａｘｌへの抗Ａｘｌ抗体または抗体断片の結合を許容する条件下で接触させること、および抗Ａｘｌ抗体または抗体断片とＡｘｌとの間で複合体が形成されるか否かを検出することを含む。このような方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。一実施形態において、抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、治療法に適格の対象を選択するために使用される。一部の実施形態において、治療法は、対象への抗Ａｘｌ抗体または抗体断片の投与を含む。
ある実施形態において、標識抗Ａｘｌ抗体または抗体断片が提供される。標識としては、限定されるものではないが、直接検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色団、高電子密度、化学発光、および放射性標識）、および間接的に、例えば、酵素反応または分子相互作用を介して検出される酵素またはリガンドのような部分が挙げられる。例示的な標識としては、限定されるものではないが、放射性同位体32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、および131Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号明細書）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼとカップリングしている複素環オキシダーゼ、例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどが挙げられる。
Ｄ．医薬配合物
抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、細胞殺傷活性を有する。この細胞殺傷活性は、複数の異なる細胞系のタイプに及ぶ。さらに、これらの抗原または抗体断片は、細胞毒性剤にコンジュゲートされると腫瘍サイズを低減させ得、低減した毒性を示し得る。本出願の実施例３および６～９参照。したがって、抗Ａｘｌ抗体、その断片または免疫コンジュゲートは、Ａｘｌ発現に関連する増殖性疾患の治療に有用であり得る。抗体、断片または免疫コンジュゲートは、単独で、または任意の好適な薬剤または他の慣用の治療との組合せで使用することができる。
抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、ＡｘｌおよびまたはＧａｓ６発現、過剰発現または活性化に関連する過剰増殖性疾患を治療するために使用することができる。Ａｘｌ発現についての要求以外の、治療することができる癌のタイプまたは組織に対する特定の限定は存在しない。例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、例えば、膠芽細胞腫および神経線維腫症、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞腫、肉腫、血液癌（白血病）、星状細胞腫、および種々のタイプの頭頸部癌が挙げられる。より好ましい癌は、膠芽細胞腫、胃癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌および子宮内膜癌である。
抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は自然免疫応答の強力な活性化因子であり、したがって、ヒト免疫障害、例えば、敗血症の治療において使用することができる。本発明の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、免疫化、例えば、ワクチンのためのアジュバントとして、ならびに例えば、細菌、ウイルスおよび寄生虫に対する抗感染剤として使用することもできる。
抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、血栓疾患、例えば、静脈および動脈血栓症ならびにアテローム血栓症から保護し、それを予防し、または治療するために使用することができる。抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、心血管疾患から保護し、それを予防し、または治療するため、ならびにウイルス、例えば、ラッサおよびエボラウイルスの侵入を予防し、または阻害するため、ならびにウイルス感染を治療するために使用することもできる。
本明細書に記載の治療方法の実施形態のそれぞれにおいて、抗Ａｘｌモノクローナル抗体、抗体断片または抗Ａｘｌモノクローナル免疫コンジュゲートは、治療が求められる疾患または障害の管理に関連する慣用の方法と一致する様式で送達することができる。本明細書の開示によれば、有効量の抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートを、そのような治療が必要とされる対象に、疾患または障害を予防または治療するために十分な期間および条件下で投与する。したがって、本発明の一態様は、Ａｘｌの発現に関連する疾患の治療が必要とされる対象に治療有効量の本発明の抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートを投与することを含む、Ａｘｌの発現に関連する疾患を治療する方法に関する。
投与のため、抗Ａｘｌモノクローナル抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートを、医薬組成物として配合することができる。抗Ａｘｌモノクローナル抗体、抗体断片または抗体－薬物コンジュゲートを含む医薬組成物は、医薬組成物を調製する公知の方法に従って配合することができる。このような方法において、治療分子は、典型的には、薬学的に許容可能な担体を含有する混合物、溶液または組成物と組み合わせる。
薬学的に許容可能な担体は、レシピエント患者により寛容され得る材料である。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容可能な担体の一例である。他の好適な薬学的に許容可能な担体は、当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）参照）。配合物は、１つ以上の賦形剤、保存剤、安定剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を防止するためのアルブミンなどをさらに含み得る。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量およびレジメンは、通常、治療すべき病態、疾病の重症度、患者の年齢、体重および性別などに依存する。これらの検討事項は、当業者が考慮して好適な医薬組成物を配合することができる。本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与用などに配合することができる。
好ましくは、医薬組成物は、注射され得る配合物のために薬学的に許容可能なビヒクルを含有する。これらは、特定の等張無菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムなどまたはそのような塩の混合物）、または例えば、無菌水もしくは生理食塩水の添加時に注射液の構成を可能とする乾燥、特に凍結乾燥組成物中で存在し得る。
一部の実施形態において、「安定剤」として公知であることもある等張化剤は、組成物中の液体の等張性を調整または維持するために存在する。大型荷電生体分子、例えば、タンパク質および抗体とともに使用される場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより分子間および分子内相互作用の潜在性を減少させ得るため「安定剤」と称されることが多い。等張化剤は、医薬組成物の０．１重量％～２５重量％、好ましくは１～５％の任意の量で存在し得る。好ましい等張化剤としては、多価糖アルコール、好ましくは三価またはより高級の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが挙げられる。
追加の賦形剤としては、以下の１つ以上として機能し得る薬剤が挙げられる：（１）増量剤、（２）溶解度向上剤、（３）安定剤および（４）および変性または容器壁への接着を防止する薬剤。このような賦形剤としては、多価糖アルコール（上記列挙）；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど；有機糖または糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えばイノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖（例えば、ラフィノース）；ならびに多糖（例えば、デキストリンまたはデキストラン）を挙げることができる。
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても公知）は、治療剤を溶解させるのに役立ち、および撹拌誘導性凝集から治療タンパク質を保護するために用いることができ、さらにそれにより、活性治療タンパク質または抗体の変性を引き起こさずに剪断表面応力への配合物の曝露を可能とする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在し得る。
好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用することができる陰イオン性洗浄剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。陽イオン性洗浄剤としては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
投与に使用される用量は、種々のパラメータに応じて、特に、使用される投与方式、関連病変、または代替的に所望の治療期間に応じて適合させることができる。医薬組成物を調製するため、有効量の抗体または抗体断片を、薬学的に許容可能な担体または水性媒体中で溶解または分散させることができる。
注射使用に好適な剤形としては、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む配合物；および無菌注射液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用から保存しなければならない。
遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤と好適に混合された水中で調製することができる。分散液も、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用の条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
抗体または抗体断片は、中性または塩形態の組成物に配合することができる。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、それは無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩も、無機塩基、例えば、水酸化カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄、および例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導することができる。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射組成物の吸収延長は、その組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによりもたらすことができる。
無菌注射液は、要求量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他の成分の１つ以上とともに取り込み、次いで滅菌濾過することにより調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基礎分散媒体および上記に列挙されるものから要求される他の成分を含有する無菌ビヒクル中に取り込むことにより調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
直接注射のためのより濃縮され、または高度に濃縮された溶液の調製も企図され、溶媒としてのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用は極めて急速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍区域に送達することが想定される。
配合時、液剤は投与配合物と適合性の様式で、治療有効であるような量で投与される。配合物は、種々の投与剤形で、例えば、上記のタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
水溶液中での非経口投与のため、例えば、液剤は、必要であれば好適に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な生理食塩水またはグルコースにより等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、用いることができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中で溶解させることができ、１０００ｍｌの皮下点滴療法用液体に添加し、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０参照）。投与量のいくらかの変動が、治療される対象の病態に応じて必然的に生じる。投与責任者は、いずれのイベントにおいても、個々の対象に適切な用量を決定する。
抗体または抗体断片は、治療混合物内に１用量あたり０．０００１～１０．０ミリグラム、または約０．００１～５ミリグラム、または約０．００１～１ミリグラム、または約０．００１～０．１ミリグラム、または約０．１～１．０またはさらには約１０ミリグラムを送達するように配合することができる。複数回用量を選択される時間間隔において投与することもできる。
非経口投与、例えば、静脈内または筋肉内注射用に配合された化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態としては、例えば、錠剤または経口投与用の他の固形剤；徐放性カプセル剤；および現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
ある実施態様において、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が、宿主細胞中への抗体または抗体断片の導入のために企図される。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成および使用は、当業者に公知である。
ナノカプセル剤は、一般に、安定した再現性のある手法で化合物を捕捉し得る。細胞内へのポリマーの過剰負荷に起因する副作用を回避するため、このような超微細粒子（サイズは約０．１μｍ）が、インビボで分解し得るポリマーを使用して一般に設計される。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が本発明における使用のために企図され、このような粒子は容易に作製することができる。
リポソームは、水性媒体中で分散するリン脂質から形成され、多重膜同心円状二層小胞（多層膜ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を自発的に形成する。ＭＬＶは、一般に２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中で水溶液を含有する２００～５００Åの範囲の直径を有する小さな一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。
本明細書に記載の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を含有する医薬配合物は、所望の純度の程度を有するそのような抗体または抗体断片を１つ以上の任意選択の薬学的に許容可能な担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥配合物または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容可能な担体は、一般に、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、それとしては、限定されるものではないが、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；酸化防止剤、例として、アスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免役グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖、二糖、および他の炭水化物、例として、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
本明細書における例示的な薬学的に許容可能な担体としては、介在性薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法、例として、ｒＨｕＰＨ２０は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書および同第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体配合物は、米国特許第６，２６７，９５８号明細書に記載されている。水性抗体配合物としては、米国特許第６，１７１，５８６号明細書および国際公開第２００６／０４４９０８号パンフレットに記載のものが挙げられ、後者の配合物はヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。
本明細書における配合物は、治療される特定の適応症に対する必要に応じて、２つ以上の活性成分も含有し得る。好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する成分を単一配合物中で組み合わせることができる。例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、エルロチニブ）、抗アンドロゲン剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体であり得るＶＥＧＦアンタゴニスト）または化学療法剤（例えば、タキソイドまたは白金剤）を、本発明の抗Ａｘｌ抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートに加えて提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図される目的のために有効である量の組合せで好適に存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により調製されるマイクロカプセル中にカプセル封入することができる。例えば、それぞれ、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルを用いることができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の好適な例としては、抗体または抗体断片を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリクスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態であり得る。
インビボ投与に使用すべき配合物は、一般に無菌性である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜に通す濾過により容易に達成することができる。
Ｅ．治療方法および組成物
本明細書において提供される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片のいずれも、治療方法において使用することができる。一態様において、医薬品として使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片が提供される。さらなる態様において、癌（例えば、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、甲状腺、肝臓の癌、骨肉腫、および／または黒色腫）の治療において使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片が提供される。ある実施形態において、治療の方法において使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片が提供される。ある実施形態において、本発明は、個体に有効量の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法において使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を提供する。ある実施形態において、本発明は、個体に有効量の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を投与することを含む、免疫障害（例えば、自己免疫障害）、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）または糖尿病を有する個体を治療する方法において使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を提供する。１つのそのような実施形態において、本方法は、個体に有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、下記のものを投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、本発明は、血管新生の阻害、細胞増殖の阻害、免疫機能の阻害、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）の阻害、腫瘍血管系（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）の阻害、および／または腫瘍間質機能の阻害において使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を提供する。
ある実施形態において、本発明は、個体に有効の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を投与して血管新生を阻害し、細胞増殖を阻害し、免疫機能を阻害し、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）を阻害し、腫瘍血管系発生（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）を阻害し、および／または腫瘍間質機能を阻害することを含む、個体において血管新生を阻害し、細胞増殖を阻害し、免疫機能を阻害し、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）を阻害し、腫瘍血管系（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）を阻害し、および／または腫瘍間質機能を阻害する方法において使用される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を提供する。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくは、ヒトである。
さらなる態様において、本発明は、医薬品の製造または調製における抗Ａｘｌ抗体または抗体断片の使用を提供する。一実施形態において、医薬品は、癌（一部の実施形態において、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、甲状腺、肝臓の癌、骨肉腫、および／または黒色腫）の治療用である。さらなる実施形態において、医薬品は、癌を有する個体に有効量の医薬品を投与することを含む、癌を治療する方法において使用される。さらなる実施形態において、医薬品は、個体に有効量の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を投与することを含む、免疫障害（例えば、自己免疫障害）、心血管障害（例えば、アテローム動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）または糖尿病を治療する方法において使用される。１つのそのような実施形態において、本方法は、個体に有効量の少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、下記のものを投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、医薬品は、血管新生の阻害、細胞増殖の阻害、免疫機能の阻害、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）の阻害、腫瘍血管系（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）の阻害、および／または腫瘍間質機能の阻害用である。さらなる実施形態において、医薬品は、個体に有効量の医薬品を投与して血管新生を阻害し、細胞増殖を阻害し、免疫機能を促進し、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）を誘導し、腫瘍血管系発生（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）を阻害し、および／または腫瘍間質機能を阻害することを含む、個体において血管新生を阻害し、細胞増殖を阻害し、免疫機能を阻害し、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）を阻害し、腫瘍血管系（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）を阻害し、および／または腫瘍間質機能を阻害する方法において使用される。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる態様において、本発明は、癌を治療する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、そのような癌を有する個体に有効量の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を投与することを含む。１つのそのような実施形態において、本方法は、個体に有効量の下記の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる態様において、本発明は、免疫障害（例えば、自己免疫障害）、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例えば、エボラウイルス、マールブルグウイルス）または糖尿病を治療する方法を提供する。１つのそのような実施形態において、本方法は、個体に有効量の少なくとも１つの下記の追加の治療剤を投与することをさらに含む。上記実施形態のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる態様において、本発明は、個体において血管新生を阻害し、細胞増殖を阻害し、免疫機能を阻害し、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）を阻害し、腫瘍血管系（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）を阻害し、および／または腫瘍間質機能を阻害する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、個体に有効量の抗Ａｘｌ抗体または抗体断片を投与して血管新生を阻害し、細胞増殖を阻害し、免疫機能を促進し、炎症性サイトカイン分泌（例えば、腫瘍関連マクロファージからのもの）を誘導し、腫瘍血管系発生（例えば、腫瘍内血管系または腫瘍関連血管系）を阻害し、および／または腫瘍間質機能を阻害することを含む。一実施形態において、「個体」は、ヒトである。
さらなる態様において、本発明は、例えば、上記治療方法のいずれかにおいて使用される、本明細書において提供される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片のいずれかを含む医薬配合物を提供する。一実施形態において、医薬配合物は、本明細書において提供される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片のいずれかおよび薬学的に許容可能な担体を含む。別の実施形態において、医薬配合物は、本明細書において提供される抗Ａｘｌ抗体または抗体断片のいずれかおよび少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、下記のものを含む。
それぞれのおよび全ての上記治療において、本発明の抗体または抗体断片は、単独で、免疫コンジュゲートとして、または他の薬剤との組合せで治療法において使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与することができる。ある実施形態において、追加の治療剤は、抗血管新生剤である。ある実施形態において、追加の治療剤は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（一部の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ）である。ある実施形態において、追加の治療剤は、ＥＧＦＲアンタゴニスト（一部の実施形態において、エルロチニブ）である。ある実施形態において、追加の治療剤は、化学療法剤および／または細胞増殖抑制剤である。ある実施形態において、追加の治療剤は、タキソイド（例えば、パクリタキセル）および／または白金剤（例えば、カルボ白金（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ））である。ある実施形態において、追加の治療剤は、患者の免疫または免疫系を向上させる薬剤である。
上記のこのような併用療法は、併用投与（同一または別個の配合物中に２つ以上の治療剤が含まれる）、および別個の投与を包含し、別個の投与の場合、抗体または抗体断片の投与は、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与前、投与と同時に、および／または投与後に行うことができる。抗体または抗体断片は、放射線療法との組合せで使用することもできる。
抗体または抗体断片は、良好な医療行為と一致する様式で、配合し、投薬し、投与することができる。これに関連する検討事項の因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、および医師に公知の他の因子が挙げられる。抗体または抗体断片は、必ずしもそうである必要はないが、場合により、当該の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに配合される。このような他の薬剤の有効量は、配合物中の抗体または抗体断片の量、障害または治療のタイプ、および上記で考察される他の因子に依存する。これらは一般に、本明細書に記載のものと同一の投与量および投与経路で、もしくは本明細書に記載の投与量の約１～９９％で使用され、または実験的／臨床的に適切と判断される任意の投与量で、および任意の経路により使用される。
疾患の予防または治療について、抗体または抗体断片の適切な投与量（単独で、または１つ以上の他の追加の治療剤との組合せで使用される場合）は、治療すべき疾患のタイプ、抗体または抗体断片のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体または抗体断片が予防または治療目的で投与されるか否か、前治療、患者の病歴および抗体または抗体断片に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体または抗体断片は好適に、１回で、または一連の治療にわたり患者に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるものであるか、連続注入によるものであるかにかかわらず、約１μｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇの抗体または抗体断片が、患者への投与のための初回候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上記因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日間以上にわたる反復投与については、病態に応じて、治療は一般に疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。このような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、または例えば、約６回の用量の抗体または抗体断片を受容するように）投与することができる。より高い初回負荷用量、次いで１回以上のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投与量レジメンが有用であり得る。この治療法の進行は、慣用の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。
上記配合物または治療方法のいずれも、抗Ａｘｌ抗体の代わりに、またはそれに加えて本発明の抗体断片または免疫コンジュゲートを使用して実施することができることが理解される。
腫瘍を撲滅するための宿主の免疫機能の向上は、関心が増加している主題である。慣用の方法としては、（ｉ）ＡＰＣ増強、例えば、（ａ）外来ＭＨＣアロ抗原をコードするＤＮＡの腫瘍中への注射、または（ｂ）腫瘍の免疫抗原認識の確率を増加させる遺伝子（例えば、免疫刺激サイトカイン、ＧＭ－ＣＳＦ、共刺激分子Ｂ７．１、Ｂ７．２）による生検採取腫瘍細胞の形質移入、（ｉｉｉ）養子細胞免疫療法、または活性化腫瘍特異的Ｔ細胞による治療が挙げられる。養子細胞免疫療法は、腫瘍浸潤宿主Ｔリンパ球を単離し、例えば、ＩＬ－２または腫瘍またはその両方による刺激を介してインビトロでその集団を拡大することを含む。さらに、機能不全の単離Ｔ細胞を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のインビトロ適用により活性化することもできる。次いで、こうして活性化されたＴ細胞を宿主に再投与することができる。これらの方法の１つ以上を、本発明の抗体、抗体断片または免疫コンジュゲートの投与との組合せで使用することができる。
癌のための慣習的な治療法としては、以下のもの：（ｉ）放射線療法（例えば、ラジオセラピー、Ｘ線療法、放射線照射）または癌細胞を殺傷し、腫瘍を縮小させるためのイオン化放射線の使用が挙げられる。放射線療法は、外部ビームラジオセラピー（ＥＢＲＴ）を介して外部から、または小線源療法を介して内部から施与することができ；（ｉｉ）一般に急速に分裂する細胞に影響を及ぼす化学療法、または細胞毒性薬の適用；（ｉｉｉ）癌細胞の調節不全タンパク質に特異的に影響を及ぼす標的療法、または薬剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ、ゲフィニチブ；モノクローナル抗体、光線力学的療法）；（ｉｖ）免疫療法、または宿主免疫応答の向上（例えば、ワクチン）；（ｖ）ホルモン療法、またはホルモンの遮断（例えば、腫瘍がホルモン感受性である場合）、（ｖｉ）血管新生阻害剤、または血管形成および成長の遮断、ならびに（ｖｉｉ）苦痛緩和ケア、または疼痛、悪心、嘔吐、下痢および出血を低減させるためのケアの質の改善に指向される治療が挙げられる。鎮痛剤、例えば、モルヒネおよびオキシコドン、制吐剤、例えば、オンダンセトロンおよびアプレピタントは、より侵襲的な治療レジメンを可能とし得る。
癌の治療において、癌免疫の治療のための既に記載されている慣用の治療のいずれも、抗Ａｘｌ抗体または抗体断片の投与前、投与後または投与と同時に実施することができる。さらに、抗Ａｘｌ抗体または抗体断片は、慣用の癌治療、例えば、腫瘍結合抗体（例えば、モノクローナル抗体、毒素コンジュゲートモノクローナル抗体）および／または化学療法剤の投与前、投与後または投与と同時に投与することができる。
Ｆ．製品およびキット
本発明の別の態様において、上記障害の治療、予防および／または診断に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器および容器上または容器に伴うラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成することができる。容器は、組成物それ自体、または病態の治療、予防、および／もしくは診断に有効な別の組成物との組合せである組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体または抗体断片である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選択される病態の治療に使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）抗体または抗体断片を含む組成物を中に含有する第１の容器；および（ｂ）さらなる細胞毒性剤または他の治療剤を含む組成物を中に含有する第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、組成物を特定の病態を治療するために使用することができることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、製品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液を含む第２（または第３）の容器をさらに含み得る。これは、商業的および使用者の見地から望ましい他の材料、例として、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針および注射器をさらに含み得る。
上記製品のいずれも、抗Ａｘｌ抗体に代えて、またはそれに加えて本発明の免疫コンジュゲートを含み得ることが理解される。
最後に、本発明はまた、少なくとも１つの本発明の抗体または抗体断片を含むキットを提供する。本発明のポリペプチド、抗体もしくは抗体断片、または抗体薬物コンジュゲートを含有するキットは、Ａｘｌ発現（増加または減少）の検出において、または治療もしくは診断アッセイにおいて使用される。本発明のキットは、固体担体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ）にカップリングしている抗体を含有し得る。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおける、インビトロでのＡｘｌの検出および定量のための抗体を含有するキットを提供することができる。検出に有用なこのような抗体は、標識、例えば、蛍光または放射標識とともに提供することができる。
キットは、その使用に関する説明書をさらに含有する。一部の実施形態において、説明書は、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによりインビトロ診断キットに要求される説明書を含む。一部の実施形態において、キットは、試料中の脳脊髄液の存在または不存在を、前記試料中のＡｘｌの存在または不存在に基づき診断するための説明書をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の抗体または抗体断片を含む。他の実施形態において、キットは、１つ以上の酵素、酵素阻害剤または酵素活性化剤をさらに含む。さらに他の実施形態において、キットは、１つ以上のクロマトグラフィー化合物をさらに含む。さらに他の実施形態において、キットは、分光光度アッセイ用の試料を調製するために使用される１つ以上の化合物をさらに含む。さらなる実施形態において、キットは、指示薬の強度、色スペクトル、または他の物理的属性に従ってＡｘｌの存在または不存在を解釈するための比較参照材料をさらに含む。
以下の実施例は、限定されるものではないが、本開示の軟ゼラチンカプセル剤の説明のためのものである。当分野において通常見出され、当業者に明らかである種々の条件およびパラメータの他の好適な改変および適合が本開示の範囲内である。
実施例１：Ａｘｌに対する条件的に活性な抗体
Ａｘｌは、条件的に活性な抗体によりアクセス可能な細胞外ドメインを有する膜貫通チロシンキナーゼである。この細胞表面タンパク質は、甲状腺癌組織中で高度に発現され、多くの他の癌、例えば、骨髄増殖性障害、前立腺癌細胞、または乳癌において過剰発現される。Ａｘｌタンパク質の細胞外ドメインに対する条件的に活性な抗体が本明細書において発見された。
Ａｘｌに対する野生型抗体（図１Ａの０６３－ｈｕｍ１０Ｆ１０－ＨＣの重鎖可変領域および図１Ｂの０６３－ｈｕｍ１０Ｆ１０－ＨＣの軽鎖可変領域を有する）を、テンプレート抗体として選択した。テンプレート抗体中のそれぞれの位置を１つずつランダム化する方法である包括的位置進化（ＣＰＥ）を使用して野生型抗体をコードするＤＮＡを進化させて突然変異抗体ライブラリーを生成した。ライブラリー中のそれぞれの突然変異抗体は、１つのみの単一点突然変異を有する。ＥＬＩＳＡにより測定してｐＨ７．４と比べてｐＨ６．０においてＡｘｌに対する選択結合親和性についての同時スクリーニングにより、ライブラリー中の突然変異抗体を生成した。
同時に、突然変異抗体の発現レベルも、製造プロセスにおけるより高いフィールドの目的のために最適化した。ＦＬＡＧタグを使用してスクリーニングを血清中で行った。それというのも、スクリーニングについて偽陽性を引き起こし得る血清中のヒト抗体が存在したためである。スクリーニング緩衝液は、炭酸塩緩衝液（リンガーを有するＫｒｅｂｓ緩衝液－ＰＢＳと異なるが標準的な緩衝液）であった。生成された条件的に活性な抗体は、両方とも野生型抗体と比較してｐＨ６．０においてＡｘｌに対する高い親和性を有するが、ｐＨＧ７．４においてＡｘｌに対する低い親和性を有することが見出された。選択された突然変異抗体（ｓｃＦｖ）の一部を図２に表し、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０において活性が高かった一方、ｐＨ６．０とｐＨ７．４との活性比は少なくとも１１倍であった（図３）。
さらに、これらの条件的に活性な活性は全て、以下の表４に示されるとおり高い発現レベルを有し、列「クローン」は抗体を示し、発現レベル「ｍｇ／ｍｌ」を第２の列に示す。
これらの抗体のクローンをサービス提供業者に要求される発現レベル（「オーダー量」、予測発現レベル）で送付した。しかしながら、これらの抗体の実際の発現レベル（「送達量」）は極めて高く、予測発現レベルを超過した。
Figure 0007161783000019
条件的に活性な抗体は、テンプレートとしてのＢＡＰ０６３．９－１３－１抗体を使用して図４において実証されるとおり緩衝液中で凝集を示さなかった。ＢＡＰ０６３．９－１３－１抗体をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。図４において、１つのみのピークが検出され、抗体がほとんど凝集せず、または全く凝集しないことを実証した。
条件的に活性な抗体を、表面プラズモン表面（ＳＰＲ）も使用してアッセイしてＡｘｌに対するオンおよびオフ速度を計測した。ＳＰＲアッセイは、条件的に活性な抗体についてのオンおよびオフ速度を計測することが公知であった。ＳＰＲアッセイは、重炭酸塩の存在下で実施した。条件的に活性な抗体のインビボのオンおよびオフ速度（動物およびヒトにおけるもの）は、条件的に活性な抗体に極めて重要な特徴である。
条件的に活性な抗体は、陰性対照（ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方において類似の結合親和性を有するＢＡＰ０６３ １０Ｆ１０）と比較してｐＨ６．０において高い結合親和性およびｐＨ７．４において低い結合親和性を有することが観察された（図５）。さらに、室温から６０℃への温度上昇は、ＥＬＩＳＡアッセイ結果を有意に変更しなかった（図５）。ＥＬＩＳＡアッセイは、それらの条件的に活性な抗体がｐＨ７．４と比較してｐＨ６．０において高度に選択的であることも示した（図６Ａ～６Ｂは、一例として１つの抗体を示す）。
条件的に活性な生物抗体を表５にまとめる。これらの抗体の２つを、ｓｃＦｖとして発現させた（ＢＡＰ０６３．９－１３．３およびＢＡＰ０６３．９－４８．３）。１時間の６０℃において抗体のインキュベーションは、抗体のほとんどの親和性を変化させなかった（「熱安定性」）。
条件的に活性な抗体は、本発明によりＣＴＣの表面上のＡｘｌタンパク質を検出するために使用することができる。
Figure 0007161783000020
実施例２：抗Ａｘｌ抗体のｐＨ依存的結合親和性
本発明の抗Ａｘｌ抗体の一部を、異なるｐＨレベルにおいて緩衝液中で試験した。緩衝液の１つのタイプは、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が存在するＫＲＥＢＳ緩衝液であった。ＫＲＥＢＳ緩衝液は、５～７．４の範囲のｐＨを有するように滴定した。ＥＬＩＳＡアッセイ（ＯＤ450）を使用してＡｘｌについての抗体の結合親和性を計測し、結果を図７に提示する。２つの対照抗体（ＢＡＰ０６３－３８３１およびＢＡＰ０６３－３８１８）は、ｐＨの変化により有意に影響されなかった結合親和性を有するため、条件的に活性でなかった。他方、本発明の抗Ａｘｌ抗体は、Ａｘｌについてのその結合親和性がｐＨに依存的であったため、条件的に活性であった（図７）。
実施例３：抗Ａｘｌ抗体による細胞殺傷
Ａ５４９細胞を使用して本発明の抗Ａｘｌ抗体の細胞殺傷活性を試験した。結果を図８Ａ～８Ｅに示す。細胞殺傷活性を２つのｐＨレベル：６．０および７．４において計測し、腫瘍微小環境中のｐＨおよび正常の生理学的ｐＨをそれぞれ表した。種々の抗体濃度における細胞殺傷の割合を図８Ａ～８Ｅに示す。
２つの試験は、一貫した細胞殺傷結果を与えた。陰性対照（抗Ａｘｌヒト化ＷＴ）は、Ａ５４９細胞についてｐＨ６．０およびｐＨ７．４において類似の細胞殺傷活性を示した（図８Ａ）。対照的に、本発明の抗Ａｘｌ抗体は、特に、抗体がＡ５４９細胞を飽和しない低い抗体濃度においてｐＨ７．４における細胞殺傷活性と比較してｐＨ６．０において有意に高い細胞殺傷活性を示した（図８Ｂ～８Ｅ）。
実施例４：抗Ａｘｌ抗体によるｃｙｎｏ－Ａｘｌに対する結合親和性
本発明の抗Ａｘｌ抗体によるｃｙｎｏ－Ａｘｌに対する結合親和性を計測し、６．０および７．４のｐＨにおいて２つの異なる緩衝液中でヒトＡｘｌ（ｈＡｘｌ）の結合親和性と比較した。結果を図９Ａ～９Ｄに示す。ｃｙｎｏ－Ａｘｌは、非ヒト霊長類、すなわち、サル類カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）からのＡｘｌタンパク質である。
対照（ＢＡ－３８３１－ＷＴ）は、２つの緩衝液中でｐＨ６．０および７．４の両方においてヒトＡｘｌ（ｈＡｘｌ）およびカニクイザルＡｘｌ（ｃｙｎｏ－Ａｘｌ）の両方に対して類似の結合親和性を示した（図９Ａ）。本発明の抗Ａｘｌ抗体は、２つの緩衝液の一方でｈＡｘｌおよびｃｙｎｏ－Ａｘｌについての類似の結合親和性プロファイルを示し、すなわち、ｐＨ６．０におけるｃｙｎｏ－Ａｘｌに対する結合親和性と比較してｐＨ７．４におけるｃｙｎｏ－Ａｘｌに対する結合親和性が低かった（図９Ｂ～９Ｄ）。他方の緩衝液中のｐＨ６．０およびｐＨ７．０における結合親和性の差異は、有意でなかった。
実施例５：デュオマイシンにコンジュゲートしている抗Ａｘｌ抗体の細胞毒性
デュオマイシンは、タンパク質合成を停止させることにより細胞成長を阻害するため、細胞毒性である。本発明の抗Ａｘｌ抗体の１つ、ＢＡＰ０６３．９ ４００７をデュオマイシンにコンジュゲートさせた。２つの対照ＢＡＰ０６３ｈｕｍＷＴおよびＢ１２（抗Ｂ１２抗体）をこの試験に使用し、それらも両方ともデュオマイシンにコンジュゲートさせた。
いくつかの細胞系を、ｐＨ６．０および７．４において３つのデュオマイシンコンジュゲート抗体（ＢＡＰ０６３．９ ４００７、ＢＡＰ０６３ｈｕｍＷＴ、およびＢ１２）により処理した（図１０Ａ～１０Ｈ）。本発明のデュオマイシンコンジュゲート抗体ＢＡＰ０６３．９ ４００７は、細胞系ＤＵ１４５（前立腺癌細胞）、ＭＤＡ－ＭＤ－２３１（乳癌細胞）、ＰＬ４５（膵臓癌細胞）、およびＡ５４９（腺癌細胞）に対して、ｐＨ６．０においてｐＨ７．４における同一細胞に対する細胞毒性と比較して有意に高い細胞毒性を示した。
実施例６：モデル毒素にコンジュゲートしている抗Ａｘｌ抗体
本発明の抗Ａｘｌ抗体をモデル毒素（例えば、ゲムシタビン）にコンジュゲートさせて条件的に活性な抗体－薬物コンジュゲート（ＣＡＢ－Ａｘｌ－ＡＤＣ）を産生した。最初にＣＡＢ－Ａｘｌ－ＡＤＣを試験して条件的細胞殺傷活性が薬物コンジュゲーションプロセスにより変更されないことを確認した。この試験は、ＣＡＢ－Ａｘｌ－ＡＤＣがｐＨ７．４よりもｐＨ６．０において有意に多くの細胞を殺傷することを示した（図１１）。
次いで、ＣＡＢ－Ａｘｌ－ＡＤＣを、ＭｉａＰａＣａ２ゼノグラフト腫瘍を担持するマウスに、１ｍｇ／ｋｇの用量において３週間、週２回注射した。裸ＣＡＢ（コンジュゲーションなしの抗Ａｘｌ抗体）、ビヒクル、毒素単独（非コンジュゲートゲムシタビン）、対照ＡＤＣ、親和性一致抗Ａｘｌ ＡＤＣ（ＡＭ ＡＤＣ）を含めたいくつかの対照をこの試験において使用した。試験は、ＣＡＢ－Ａｘｌ－ＡＤＣ（ＣＡＢ ＡＤＣ）およびＡＭ ＡＤＣが対照と比較して有意に大きな腫瘍のサイズ低減を提供することを示した（図１２）。非コンジュゲート抗Ａｘｌ抗体は、腫瘍のサイズを低減させなかった。この試験は、毒素にコンジュゲートしている抗Ａｘｌ抗体が、腫瘍サイズ低減において親和性一致抗体と同程度に有効であることを示した。
実施例７：サル類カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）における抗Ａｘｌ抗体薬物コンジュゲートの血清濃度
本発明の抗Ａｘｌ抗体の薬物（デュオマイシン）コンジュゲート（ＣＡＢ－ＡＤＣ）を、サル類の雄および雌カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）中に３つの用量：０．１、１、および１０ｍｇ／ｋｇにおいて注射した。裸抗Ａｘｌ抗体を対照として使用した。親和性一致抗体薬物コンジュゲート（ＡＭ－ＡＤＣ）も対照として使用した。抗体の血清濃度を１週間の期間にわたり計測した（１６８時間、図１３Ａ～１３Ｂ参照）。ＣＡＢ－ＡＤＣは、サル血清中でＡＭ－ＡＤＣ対照よりも長く持続した（図１３Ｂ）。雄および雌サル間の有意差は存在しなかった（図１３Ａ～１３Ｂ）。
実施例８：サル類カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）における抗Ａｘｌ抗体薬物コンジュゲートの毒性
本発明のＣＡＢ－ＡＤＣの毒性をサル類カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）において試験した。アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）は、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）による薬物の肝臓毒性の指標として使用されている。血清ＡＳＴおよびＡＬＴレベルを雄および雌サルの両方で計測した（図１４Ａ～１４Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇ投与の３日後において、ビヒクル（ＰＢＳ）は血清中のＡＳＴレベルの変更もＡＬＴレベルの変更も引き起こさなかった一方、一致抗体薬物コンジュゲート（ＡＭ）は極めて高いＡＳＴおよびＡＬＴレベルを示した。ＣＡＢ－ＡＤＣは、ＡＭ対照と比較して有意に低減したＡＳＴおよびＡＬＴレベルを示した。これは、本発明の抗Ａｘｌ抗体薬物コンジュゲートが一致抗体薬物コンジュゲートＡＭに対して有意に低減した肝臓毒性を有することを示した。
本発明の抗Ａｘｌ抗体薬物コンジュゲートは、サルにおいてより小さな炎症を引き起こすことも見出された（図１５）。ＣＡＢ、ＡＭおよびＰＢＳの注射後のサルの血液中のリンパ球数をまとめた。顕著な炎症を引き起こしたＡＭと比較して、本発明の抗Ａｘｌ抗体薬物コンジュゲート（ＣＡＢ－ＡＤＣ）は、サルにおいて軽度の炎症のみを引き起こした。
実施例９：マウスにおけるインビボ実験
マウスに、腫瘍に発達する２つの腫瘍細胞系（ＬＣＬＣ１０３ＨまたはＤＵ１４５）の一方を移植した。抗腫瘍薬モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）による処理後の腫瘍サイズを計測した。ＬＣＬＣ１０３Ｈを受容したマウスについて、マウスを単回用量のビヒクル（陰性対照として）、ＣＡＢ抗Ａｘｌ抗体コンジュゲートＭＭＡＥ ＡＤＣ（ＣＡＢ Ａｘｌ－ＭＭＡＥ）、または非ＣＡＢ抗Ａｘｌ抗体コンジュゲートＭＭＡＥ ＡＤＣＣ（非ＣＡＢ Ａｘｌ－ＭＭＡＥ）により処理した、図１６Ａ。ＡＤＣにより処理したマウス中の腫瘍は縮小した一方、ビヒクルにより処理したマウス中の腫瘍は成長し続けた。
さらに、ＤＵ１４５を受容したマウスを、ビヒクル（陰性対照）またはＣＡＢ抗Ａｘｌ抗体コンジュゲートＭＭＡＥ ＡＤＣ（ＣＡＢ Ａｘｌ－ＭＭＡＥ）により２つの異なる濃度（６ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）において処理した。腫瘍体積を経時的に計測した。腫瘍は、陰性対照群（ビヒクル）において成長し続けた一方、ＡＤＣにより処理したマウスにおいては腫瘍成長は減速した（図１６Ｂ）。
しかしながら、本発明の多数の特徴および利点を、本発明の構造および機能の詳細と一緒に上記の詳細な説明において記載してきたが、本開示は、説明のためのものにすぎず、変更を詳細に、特に本発明の原理内でパーツの形状、サイズおよび配置の事項において、添付の特許請求の範囲が表現される用語の広義の一般的意味により示される完全な程度に作製することができることを理解すべきである。
本明細書に挙げられる全ての文献は、参照により全体として、あるいはそれらが特に依存する開示を提供するために本明細書に組み込まれる。本出願人らは、任意の開示実施形態を公的に提供する意図はなく、任意の開示の改変または変更が特許請求の範囲の範囲内に文字通り収まり得ない程度で、それらは、均等論のもと、その一部とみなされる。

Claims (20)

  1. Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する抗体または抗体断片であって、前記抗体または抗体断片は、配列番号１４～６７から選択される１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号６８～１１６から選択される１つのアミノ配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、配列番号１４～１１６の配列に対するアミノ酸変異のすべてがフレームワーク領域においてのみ生じるものであり、抗体または抗体断片が、腫瘍微小環境中のｐＨにおいて、非腫瘍微小環境中で生じる異なるｐＨと比較してＡｘｌタンパク質に対する高い結合親和性を有する抗体または抗体断片（但し、前記軽鎖可変領域が、配列番号７～１０から選択されるＤＮＡ配列によりコードされ、且つ前記重鎖可変領域が、配列番号１１～１３から選択されるＤＮＡ配列によりコードされる抗体または抗体断片を除く）。
  2. 重鎖可変領域が、配列番号１４～６７から選択された１つの前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
  3. 軽鎖可変領域が、配列番号６８～１１６から選択された１つの前記アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
  4. 重鎖可変領域が、配列番号１４～６７から選択された１つの前記アミノ酸配列と比べて１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  5. 軽鎖可変領域が、配列番号６８～１１６から選択された１つのアミノ酸配列と比べて１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  6. 重鎖可変領域が、配列番号１４～６７から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  7. 軽鎖可変領域が、配列番号６８～１１６から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  8. 前記抗体または抗体断片が、配列番号９によってコードされる軽鎖可変領域および配列番号１２によってコードされる重鎖可変領域を有する抗体または抗体断片と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
  9. 前記腫瘍微小環境中のｐＨが５．８～７．０の範囲にあり、非腫瘍微小環境中のｐＨが７．２～７．６の範囲にある、請求項１に記載の抗体または抗体断片。
  10. 少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約７０：１、または少なくとも約１００：１の、腫瘍微小環境中の条件の値における前記Ａｘｌタンパク質に対する結合親和性と、非腫瘍微小環境中の同一条件の異なる値における前記Ａｘｌタンパク質に対する結合親和性との比を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片。
  11. キメラ抗体、多重特異性抗体、またはヒト化抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を含む免疫コンジュゲート。
  13. 化学療法剤、放射性原子、細胞増殖抑制剤および細胞毒性剤から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項１２に記載の免疫コンジュゲート。
  14. 少なくとも２つの前記薬剤を含む、請求項１３に記載の免疫コンジュゲート。
  15. 抗体または抗体断片および少なくとも１つの薬剤がリンカー分子に共有結合している、請求項１３または１４に記載の免疫コンジュゲート。
  16. 前記少なくとも１つの薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、およびアントラサイクリンから選択される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
  17. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片、または請求項１２～１６のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート；および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
  18. 等張化剤をさらに含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 癌を有する患者に投与して、癌を治療するために使用される、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
  20. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片、または請求項１２～１６のいずれか１項に記載の免疫コンジュゲート、または請求項１７～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物、および抗体または抗体断片、免疫コンジュゲートおよび／または医薬組成物を診断または治療用に使用するための説明書を含む、診断または治療用キット。
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