KR100877676B1 - 항체 조성물을 생산하는 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 각종 질환에 유용한 항체 의존성 세포 억제 활성이 높은 항체, 항체의 단편, 항체의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질 등의 항체 조성물의 제조에 사용되는 세포, 당해 세포를 사용하는 항체 조성물의 제조방법, 항체 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다. 당해 항체 조성물중에서, Fc 영역에 결합된 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄에 대한 당쇄 환원 말단에 있는 N-아세틸글루코사민에 결합된 푸코스가 없는 당쇄의 비율이 20% 이상이다. 더욱이, 신규 GDP-만노스 4,6-데하이로게나제, GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제 4-리덕타제, GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 및 이들을 암호화하는 DNA가 제공된다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄, CHO 세포, N-아세틸글루코사민, 푸코스, GMD(GDP-만노스 4,6-데하이드라타제), Fx(GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4-리덕타제), GFPP(GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제)

Description

항체 조성물을 생산하는 세포{Cells producing antibody compositions}
본 발명은 각종 질환에 유용한 항체, 항체의 단편, 항체의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질 등의 항체 분자의 제조에 사용되는 세포, 당해 세포를 사용하는 항체 조성물의 제조방법, 항체 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
항체는 높은 결합 활성, 결합 특이성 및 혈중에서 안정성이 높아 사람의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료에 대한 응용이 시도되고 있다[문헌참조: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 2.1(1995)]. 또한, 유전자 재조합 기술을 이용하여 사람 이외의 동물 항체로부터 사람형 키메라 항체 또는 사람형 상보성 결정영역(이하, CDR이라고 표기한다) 이식 항체와 같은 사람화 항체를 작제하는 것이 시도되고 있다. 사람형 키메라 항체란 항체 가변영역(이하, V 영역이라고 표기한다)이 사람 이외의 동물 항체이며 불변영역(이하, C 영역이라고 표기한다)이 사람 항체인 항체이다. 사람형 CDR 이식 항체란 사람 항체의 CDR을 사람 이외의 동물 항체의 CDR과 치환한 항체이다.
포유류의 항체에는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE의 5종류의 클래스가 존재하는 것이 명백해지고 있지만 사람의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료에는 혈중 반감기가 길며 각종 효능인자(effector) 기능을 갖는 등의 기능 특성으로부터 사람 IgG 클래스의 항체가 주로 이용되고 있다[문헌참조: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapterl(1995)]. 사람 IgG 클래스의 항체는 다시 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 서브클래스로 분류되어 있다. IgG 클래스의 항체의 효능인자 기능인 항체 의존성 세포 억제 활성(이하, ADCC 활성이라고 표기한다)이나 보체(補體) 의존성 세포 억제 활성(이하, CDC 활성이라고 표기한다)에 관해서는 지금까지 다수의 연구가 시행되고 있으며 사람 IgG 클래스에서는 IgG1 서브클래스의 항체가 가장 높은 ADCC 활성, CDC 활성을 갖고 있는 것이 보고되어 있다[문헌참조: Chemical Immunology, 65, 88(1997)]. 이상의 관점에서 시판하는 리쓰키산, 하셉틴을 비롯하여 이의 효과 발현에 높은 효능인자 기능을 필요로 하는 항종양 사람화 항체의 대부분은 사람 IgG1 서브클래스의 항체이다.
사람 IgG1 서브클래스의 항체의 ADCC 활성 및 CDC 활성의 발현에는 항체 Fc 영역과 킬러 세포, 천연 킬러 세포, 활성화된 마크로파아지 등의 효능인자 세포 표면 위에 존재하는 항체 수용체(이하, FcγR이라고 표기한다) 및 각종 보체 성분과의 결합이 필요하며 이의 결합에 관해서는 항체의 힌지 영역 및 C 영역의 제2번째의 도메인(이하, Cγ2 도메인이라고 표기한다)내의 몇개의 아미노산 잔기의 중요성[문헌참조: Eur. J. Immunol., 23, 1098(1993), Immunology, 86, 319(1995), Chemical Immunolgy, 65, 88(1997)] 이외에 Cγ2 도메인에 결합되어 있는 당쇄의 중요성[문헌참조: Chemical Immnology, 65, 88(1997)]이 시사되어 있다.
당쇄에 관해서는 보이드(Boyd) 등은 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포) 또는 마우스 골수종 NSO 세포(NSO 세포)에서 생산한 사람형 CDR 이식 항체 CAMPATH-1H(사람 IgG1 서브클래스)를 각종 당분해 효소로 처리하며 당쇄의 ADCC 활성, CDC 활성에 대한 영향을 검토한 결과, 비환원 말단의 시알산의 제거는 양쪽 활성에 영향을 주지 않지만 다시 갈락토스 잔기를 제거하는 것으로 CDC 활성만이 영향을 받으며 약 50% 정도 활성이 저하되는 것과 당쇄의 완전한 제거는 양쪽 활성을 소실시킴을 보고했다[문헌참조: Molecular Immunol., 32, 1311(1995)]. 또한, 라이프리(Life1y) 등은 CHO 세포, NSO 세포 또는 래트 골수종 YO 세포로 생산한 사람형 CDR 이식 항체 CAMPATH-1H(사람 IgG1 서브클래스)의 당쇄의 분석 및 ADCC 활성을 측정한 결과, YO 세포 유래의 CAMPATH-1H가 가장 높은 ADCC 활성을 나타내며 이의 활성에는 바이섹팅에 위치하는 N-아세틸글루코사민(이하, GlcNAc라고 표기한다)이 중요함을 시사했다[문헌참조: Glycobiology, 5, 813(1995): WO 99/54342]. 이들 보고는 사람 IgG1 서브클래스의 항체의 효능인자 기능에 당쇄의 구조가 매우 중요한 역활을 하고 있으며 당쇄의 구조를 변경하는 것으로 보다 높은 효능인자 기능을 갖는 항체를 작제할 수 있음을 기재하고 있다. 그러나 실제로는 당쇄의 구조는 다양하면서 또한 복잡하며, 효능인자 기능에 실제로 중요한 구조가 확인되었다고 말하기 어렵다.
당 단백질의 당쇄는 단백질 부분과의 결합양식에 따라 아스파라긴과 결합되는 당쇄(N-글리코시드 결합 당쇄)와 세린, 트레오닌 등과 결합되는 당쇄(O-글리코 실 결합 당쇄)의 2종류로 대별된다. N-글리코시드 결합 당쇄는 다양한 구조를 갖고 있지만[생물화학실험법 23-당 단백질 당쇄 연구법(각가이슛판센터) 다카하시레이코편(1989년)] 어느 경우에도 하기 구조식 I를 기본으로 하는 공통의 코어 구조를 갖는 것이 공지되어 있다.
Figure 112003012058801-pct00001
구조식 I
아스파라긴과 결합되는 당쇄의 말단이 환원 말단, 반대측이 비환원 말단이라고 호칭되고 있다. N-글리코시드 결합 당쇄에는 코어 구조의 비환원 말단에 만노스만이 결합되는 하이만노스형, 코어 구조의 비환원 말단측에 갈락토스-N-아세틸글루코사민(이하, Gal-GlcNAc라고 표기한다)의 측쇄를 병행하여 1 내지 복수개를 소유하며 또한 Gal-GlcNAc의 비환원 말단측에 시알산, 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민 등의 구조를 갖는 콤플렉스형, 코어 구조의 비환원 말단측에 하이만노스형과 콤플렉스형의 양쪽 측쇄를 갖는 하이브리드형 등이 있는 것이 공지되어 있다.
항체 IgG 분자의 Fc 영역에는 2개소의 N-글리코시드형의 당쇄 결합부위가 존재하고 있으며 혈청중의 IgG에서는 통상적으로 이러한 부위에 시알산이나 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민의 부가 정도가 적은 복수개의 측쇄를 갖는 콤플렉스형 당쇄가 결합되어 있다. 이러한 콤플렉스형 당쇄의 비환원 말단에서 갈락토스의 부가 및 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 대한 푸코스의 부가에 관해서는 다양성이 있 는 것이 공지되어 있다[문헌참조: Biochemistry, 36, 130, 1997].
이러한 당쇄의 구조는 당쇄 유전자, 즉 당쇄를 합성하는 당 전이효소와 당쇄를 분해하는 당분해효소 유전자에 의해 규정되어 있다고 생각한다.
하기에 N-글리코시드 결합 당쇄의 생합성에 관해 기재한다.
당 단백질은 소포체(이하, ER이라고 표기한다) 내강(內腔)에서 당쇄의 개질을 받는다. N-글리코시드 결합 당쇄의 생합성 과정에서는 비교적 큰 당쇄가 ER 내강에서 신장되고 있는 폴리펩타이드쇄에 전이된다. 이때에 당쇄는 우선, 돌리콜 인산(이하, P-Dol이라고 표기한다)이라고 호칭되는 α-이소프렌 단위를 20개 정도 함유하는 장쇄의 지질 담체의 인산기에 순차적으로 부가된다. 즉, 돌리콜 인산에 N-아세틸-글루코사민이 전이되어 GlcNAc-P-P-Dol로 되며 계속해서 또 하나의 GlcNAc이 전이되어 GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol로 된다. 이어서 만노스(이하, Man이라고 표기한다)가 5개 전이되며 (Man) 5-(GlcNAc) 2-P-P-Dol, 또한 Man이 4개, 글루코스(이하, Glc라고 표기한다)가 3개 전이된다. 이와 같이 하여 코어 올리고당이라고 호칭되는 당쇄의 전구체 (Glc) 3-(Man)9-(GlcNAc) 2-P-P-Dol이 된다. 이러한 14개의 당을 포함하는 당쇄의 전구체는 한 덩어리인 채로 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 서열을 가진 폴리펩타이드로 ER 내강에서 전이된다. 이때에 코어 올리고당에 결합되어 있는 돌리콜 피로인산(P-P-Dol)은 유리되지만 피로포스파타제의 분해를 받아 다시 돌리콜 인산으로 되며 재이용된다. 당쇄의 트리밍은 당쇄가 폴리펩타이드에 결합되는 즉시 개시된다. 즉, 3개의 Glc와 1 내지 2개의 Man이 ER 위에서 제거되며 이러한 제거에는 α-1,2-글루코시다제I, α-1,3-글루코시다제II 및 α-1,2-만노시다제가 관여하는 것이 공지되어 있다.
ER 위에서 트리밍을 받은 당 단백질은 골지체로 수송되어 다양한 개질을 받는다. 골지체 시스부에는 만노스 인산을 부가하는 N-아세틸글루코사민포스포트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민1-포스포디에스테르α-N-아세틸글루코사미니다제 및 α-만노시다제I이 존재하며 Man 잔기를 5개까지로 감소시킨다. 골지체 미디어부에는 콤플렉스형의 N-글리코시드 결합 당쇄의 최초의 외측의 GlcNAc를 부가하는 N-아세틸글루코사민 전이효소I(GnTI), 2개의 Man을 제거하는 α-만노시다제II, 외측에서 2번째의 GlcNAc를 부가하는 N-아세틸글루코사민 전이효소II(GnTII), 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 존재한다. 골지체 트랜스부에는 갈락토스를 부가하는 갈락토스 전이효소, N-아세틸뉴라민산 등의 시알산을 부가하는 시알산 전이효소가 존재한다. 이러한 각종 효소의 작용을 받아 N-글리코시드 결합 당쇄가 만들어지는 것이 공지되어 있다.
일반적으로 의약으로의 응용이 고려되고 있는 사람화 항체의 대부분은 유전자 재조합 기술을 사용하여 작제되며 차이니즈 햄스터 난소조직 유래 CHO 세포를 숙주세포로서 사용하여 제조하고 있지만, 상기한 바와 같이 항체의 효능인자 기능에는 당쇄 구조가 매우 중요한 역할을 담당하고 있는 것과 숙주세포에 의해 발현된 당 단백질의 당쇄 구조에 차이가 관찰되는 점으로부터 보다 높은 효능인자 기능을 갖는 항체를 작제할 수 있는 숙주세포의 개발이 요망되고 있다.
생산되는 당 단백질의 당쇄 구조를 변형시키기 위해 1)당쇄의 개질에 관계되는 효소 억제제의 응용, 2)돌연변이체의 선택, 3)당쇄의 개질에 관계되는 효소 유전자의 도입 등의 방법이 시도되고 있다. 하기에 이들 구체적인 예를 기재한다.
당쇄의 개질에 관계되는 효소의 억제제로서는 N-글리코시드 결합 당쇄의 전구체인 코어 올리고당 형성의 최초의 단계인 GlcNAc-P-P-Dol의 형성을 선택적으로 억제하는 튜니카마이신, 글리코시다제I의 억제제인 카스타노스펠민이나 N-메틸-1-데옥시노지리마이신, 글루코시다제II의 억제제인 브로모콘즈리톨, 만노시다제I의 억제제인 1-데옥시노지리마이신 또는 1,4-디옥시-1,4-이미노-D-만니톨, 만노시다제II의 억제제인 스완소닌등이 공지되어 있다. 당 전이효소의 특이적인 억제제로서는 N-아세틸글루코사민 전이효소 V(GnTV) 등에 대한 기질의 데옥시 유도체가 공지되어 있다[참조: 글라이코바이올로지 시리즈 2-당쇄의 세포에서의 운명(고단샤사이언티픽) 나가이 가쓰타카·하코모리 센이치로·고하타 요우편(1993)]. 또한, 1-데옥시노지리마이신은 콤플렉스형 당쇄의 합성을 억제하며 하이만노스형이나 하이브리드형 당쇄의 비율을 증가시키는 것이 공지되어 있다. 실제로 이들 억제제를 배지에 첨가하는 것으로 IgG의 당쇄 구조가 변화되며 항원 결합성 등이 변화되는 것이 보고되어 있다[참조: Molecular. Immunol., 26, 1113(1989)].
당쇄의 개질에 관계되는 효소의 활성에 관한 돌연변이체는 주로 렉틴 내성주로서 선택되고 취득되어 있다. 예를 들면 WGA(티. 불가리스(T. vulgaris) 유래의 밀 씨앗 응집소), ConA(씨. 엔시포르미스(C. ensiformis) 유래의 콘카나발린 A), RIC(알. 코뮤니스(R. communis) 유래의 독소), L-PHA(피. 불가리스(P. vulgaris) 유래의 백혈 응집소), LCA(엘. 쿨리나리스(L. culinaris) 유래의 렌즈콩 응집소), PSA(피. 사티붐(P. sativum) 유래의 완두콩 렉틴) 등의 렉틴을 사용하며 다양한 당쇄 구조를 갖는 CHO 세포 변이주가 렉틴 내성주로서 취득되어 있다[문헌참조: Somatic Cell Mol. genet., 12, 51(1986)].
당쇄의 개질에 관계되는 효소의 유전자를 숙주세포에 도입하여 생산물의 당쇄 구조를 변형시킨 예로서는 래트의 β-갈락토시드-α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 CHO 세포에 도입하는 것으로 당쇄의 비환원 말단에 시알산이 많이 부가된 단백질을 제조할 수 있는 것이 보고되어 있다[참조: J. Biol. Chem., 26l, 13848, 1989].
또한, 사람의 β-갈락토시드-2-α-푸코실트랜스퍼라제를 마우스 L 세포에 도입하는 것으로 당쇄의 비환원 말단에 푸코스(이하, Fuc라고 표기한다)가 부가된 H 항원(Fucα1-2Galβ1-)의 발현이 확인되어 있다[참조: Science, 252, 1668, 1991]. 또한, 유마나(Umana) 등은 N-글리코시드 결합 당쇄의 바이섹팅에 위치하는 N-아세틸글루코사민의 부가가 항체의 ADCC 활성에 중요하다는 발견에 기초하며 β-1,4-N-아세틸글루코사민 전이효소III(GnTIII)를 발현시킨 CHO 세포를 작제하여 친주와의 비교를 실시하고 있다. 친주의 CHO 세포에서는 GnTIII의 발현이 관찰되지 않으며[참조: J. Biol. Chem., 26l, 13370, 1984] 작제된 GnTIII 발현 CHO 세포를 사용하여 발현시킨 항체는 친주로 발현시킨 항체와 비교하여 16배 높은 ADCC 활성을 갖고 있는 것을 확인하고 있다[참조: Glycobiology, 5, 813(1995): WO 99/54342]. 또한 이때에 유마나(Umana) 등은 β-1,4-N-아세틸글루코사민 전이효소 V(GnTV)의 유전자를 도입한 CHO 세포도 작제하고 있으며 GnTIII 또는 GnTV의 과잉 발현은 CHO 세포에 대하여 독성을 나타내는 것을 보고하고 있다.
발명의 개시
이와 같이 생산되는 당 단백질의 당쇄 구조를 변형시키기 위해 숙주세포의 당쇄의 개질에 관계되는 효소의 활성을 조절하려는 시도가 이루어지고 있지만 실제로는 당쇄의 구조는 다양하면서 복잡하며 또한 당쇄가 가지는 생리적인 역할의 해명도 충분하다고는 말하기 어려우므로 시행 착오를 반복하고 있는 것이 현재 상황이다. 특히, 항체의 효능인자 기능은 당쇄 구조에 의해 큰 영향을 받는 것이 명백해지고 있지만 진정으로 중요한 당쇄 구조는 특정된 바 없다. 따라서 항체의 효능인자 기능에 영향을 미치는 당쇄 구조의 동정과 이러한 당쇄 구조가 부가될 수 있는 숙주세포의 개발이 의약 개발에서 요구되고 있다.
본 발명은 항체 분자에 결합된 당쇄 구조를 제어할 수 있는, 항체 조성물을 생산하는 숙주세포, ADCC 활성이 높은 항체 조성물을 생산할 수 있는 세포, 당해 세포를 사용하는 항체 조성물의 제조방법, 당해 제조방법에서 제조된 항체 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 하기의 (1) 내지 (61)에 관한 것이다.
(1) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물이며 당해 조성물 중에 함유된 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 항체 분자를 암호화하는 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소조직 유래의 CHO 세포.
(2) 푸코스가 결합되지 않은 당쇄가 당해 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α 결합되지 않은 당쇄인 (1)에 기재된 CHO 세포.
(3) 항체 분자의 클래스가 IgG인 (1) 또는 (2)에 기재된 CHO 세포.
(4) 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하되거나 결실된 (1) 내지 (3)의 어느 한 항에 기재된 CHO 세포.
(5) 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 효소인 (4)에 기재된 CHO 세포.
(a) GMD(GDP-만노스 4,6-데하이드라타제);
(b) Fx(GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4-리덕타제);
(c) GFPP(GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제).
(6) GMD가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (5)에 기재된 CHO 세포.
(a)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(7) GMD가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (5)에 기재된 CHO 세포.
(a)서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 71의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질.
(c)서열 71의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질.
(8) Fx가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (5)에 기재된 CHO 세포.
(a)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(9) Fx가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (5)에 기재된 CHO 세포.
(a)서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 72의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질;
(c)서열 72의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질.
(10) GFPP가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (5)에 기재된 CHO 세포.
(a)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한, GFPP 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(11) GFPP가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (5)에 기재된 CHO 세포.
(a)서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 73의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질;
(c)서열 73의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질.
(12) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제인 (4)에 기재된 CHO 세포.
(13) α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (12)에 기재된 CH0 세포.
(a)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(14) α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (12)에 기재된 CHO 세포.
(a)서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 23의 아미노산 서열에서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질;
(c)서열 23의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(15) 효소의 활성이 하기의 (a), (b), (c), (d) 및 (e)로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법에 따라 저하되거나 결실된 (4) 내지 (14)의 어느 한 항목에 기재된 CHO 세포.
(a)효소 유전자를 표적한 유전자 파괴의 방법;
(b)효소 유전자의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 방법;
(c)효소에 관한 돌연변이를 도입하는 방법;
(d)효소 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 방법;
(e)N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포주를 선택하는 방법.
(16) 적어도 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 (4) 내지 (15)의 어느 한 항목에 기재된 CHO 세포.
(17) 친주인 CHO 세포가 생산하는 항체 조성물에서 항체 의존성 세포 억제 활성이 높은 항체 조성물을 생산하는 (4) 내지 (16)의 어느 한 항목에 기재된 CHO 세포.
(18) 항체 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민과 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 미만인 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 억제 활성이 높은 항체 조성물을 생산하는 (17)에 기재된 CHO 세포.
(19) 푸코스가 결합되지 않은 당쇄가 당해 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α 결합되지 않은 당쇄인 (18)에 기재된 CHO 세포.
(20) (1) 내지 (19)의 어느 한 항목에 기재된 CHO 세포를 배지에 배양하며 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는 항체 조성물을 제조하는 방법.
(21) (20)에 기재된 방법을 사용하여 제조되는 항체 조성물.
(22)CHO 세포가 생성하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물이며 당해 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물.
(23) 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 유전공학적인 방법에 따라 저하되거나 결실된 세포.
(24) 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 효소인 (23)에 기재된 세포.
(a)GMD(GDP-만노스 4,6-데하이드라타제);
(b)Fx(GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4-리덕타제);
(c)GFPP(GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제).
(25) GMD가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (24)에 기재된 세포.
(a)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(26) GMD가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (24)에 기재된 세포.
(a)서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 71의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질.
(c)서열 71의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질.
(27) Fx가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (24)에 기재된 세포.
(a)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 Fx를 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(28) Fx가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (24)에 기재된 세포.
(a)서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 72의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질;
(c)서열 72의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질.
(29) GFPP가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (24)에 기재된 세포.
(a)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(30) GFPP가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (24)에 기재된 세포.
(a)서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 73의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질;
(c)서열 73의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질.
(31) N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제인 (23)에 기재된 세포.
(32) α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 하기의 (a), (b), (c) 및 (d)로 이루어진 그룹에서 선택되는 DNA가 암호화하는 단백질인 (31)에 기재된 세포.
(a)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA;
(c)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA;
(d)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(33) α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 하기의 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 (31)에 기재된 세포.
(a)서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(c)서열 23의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질;
(d)서열 24의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질;
(e)서열 23의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질;
(f)서열 24의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(34)유전공학적 방법이 하기의 (a), (b), (c) 및 (d)로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법인 (23) 내지 (33)의 어느 한 항목에 기재된 세포.
(a)효소 유전자를 표적한 유전자 파괴의 방법;
(b)효소 유전자의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 방법;
(c)효소에 관한 돌연변이를 도입하는 방법;
(d)효소 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 방법.
(35) 적어도 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 (23) 내지 (34)의 어느 한 항목에 기재된 세포.
(36) (23) 내지 (35)의 어느 한 항에 기재된 세포가 하기의 (a) 내지 (i)로 이루어진 그룹에서 선택되는 세포.
(a)차이니즈 햄스터 난소조직 유래 CHO 세포;
(b)래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포;
(c)마우스 골수종 세포주 NSO 세포;
(d)마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포;
(e)시리안 햄스터 신장조직 유래 BHK 세포;
(f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포;
(g)사람 백혈병 세포주 나말바 세포;
(II)배성(胚性) 간세포;
(i)수정란 세포.
(37) (23) 내지 (36)의 어느 한 항목에 기재된 세포에 항체 분자를 암호화하는 유전자를 도입한 세포.
(38) 항체 분자의 클래스가 IgG인 (37)에 기재된 세포.
(39) (37) 또는 (38)항목에 기재된 세포를 배지에 배양하여 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 항체 조성물을 채취하는 공정을 함유하는 항체 조성물의 제조방법.
(40) 친주로부터 수득되는 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 억제 활성이 높은 항체 조성물을 생산하는 (39)에 기재된 방법.
(41) (39) 또는 (40)에 기재된 방법을 사용하여 제조되는 항체 조성물.
(42) 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하되도록 게놈이 변형된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
(43) 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 유전자 또는 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자가 녹아웃된 (42)에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
(44) 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 효소인 (42) 또는 (43)에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
(a)GMD(GDP-만노스 4,6-데하이드라타제);
(b)Fx(GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4-리덕타제);
(c)GFPP(GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제).
(45) GMD가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (44)에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
(a)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(46) Fx가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (44)에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
(a)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(47) GFPP가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA가 암호화하는 단백질인 (44)에 기재 된 세포.
(a)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(48) N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소가 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제인 (42) 또는 (43)에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
(49) α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 하기의 (a), (b), (c) 및 (d)로 이루어진 그룹에서 선택되는 DNA가 암호화하는 단백질인 (48)에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
(a)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA;
(b)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA;
(c)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA;
(d)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(50) 형질전환 비사람 동물이 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이, 및 토끼로 이루어진 그룹에서 선택되는 동물인 (42) 내지 (49)의 어느 한 항목에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 이의 자손.
(51) (42) 내지 (50)의 어느 한 항목에 기재된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손에게 항체 분자를 암호화하는 유전자를 도입하며 당해 동물 또는 식물을 사육하여 사육한 동물 또는 식물로부터 도입한 항체를 함유하는 조직 또는 체액을 취득하며 취득된 조직 또는 체액으로부터 목적하는 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는 항체 조성물을 제조하는 방법.
(52) 항체 분자의 클래스가 IgG인 (51)에 기재된 방법.
(53) 게놈이 개변되지 않은 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손으로부터 수득되는 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 억제 활성이 높은 항체 조성물을 생산하는 (51) 또는 (52)에 기재된 방법.
(54) (51) 내지 (53)의 어느 한 항목에 기재된 방법을 사용하여 제조되는 항체 조성물.
(55) (21), (22), (41) 또는 (54)의 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 유효성분으로서 함유하는 의약.
(56) 의약이 종양을 수반하는 질환, 알레르기를 수반하는 질환, 염증을 수반하는 질환, 자기면역 질환, 순환기 질환, 바이러스 감염을 수반하는 질환 또는 세균 감염을 수반하는 질환에 대한 진단약, 예방약 또는 치료약인 (55)에 기재된 의약.
(57) 하기의 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (II), (i) 및 (j)로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질.
(a)서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(b)서열 71의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질;
(c)서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(d)서열 72의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질;
(e)서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(f)서열 73의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질;
(g)서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(h)서열 23의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질;
(i)서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(j)서열 24의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질.
(58) (57)에 기재된 단백질을 암호화하는 DNA.
(59)하기의 (a), (b), (c), (d) 및 (e)로 이루어진 그룹에서 선택되는 DNA.
(a)서열 1의 염기서열을 함유하는 DNA;
(b)서열 2의 염기서열을 함유하는 DNA;
(c)서열 65의 염기서열을 함유하는 DNA;
(d)서열 48의 염기서열을 함유하는 DNA;
(e)서열 51의 염기서열을 함유하는 DNA.
(60) 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진 그룹에서 선택되는 게놈 DNA.
(a)서열 3의 염기서열을 함유하는 게놈 DNA;
(b)서열 67의 염기서열을 함유하는 게놈 DNA;
(c)서열 70의 염기서열을 함유하는 게놈 DNA.
(61) (58) 내지 (60)의 어느 한 항목에 기재된 DNA 전체 길이 또는 일부를 함유하는 상동성 재조합용의 표적 벡터.
본 발명의 항체 분자를 암호화하는 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소조직 유래 CHO 세포란, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물이며 당해 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 항체 분자를 암호화하는 유전자를 도입한 차이니즈 햄스터 난소조직 유래의 CHO 세포이면 어떠한 CHO 세포도 포함된다.
본 발명에서 항체 분자란 항체의 Fc 영역을 함유하는 분자이면 어떠한 분자도 포함된다. 구체적으로는 항체, 항체의 단편, Fc 영역을 함유하는 융합 단백질 등을 들 수 있다.
항체란 외래 항원 자극의 결과, 면역반응에 의해 생체내에 생성되는 단백질이며 항원과 특이적으로 결합되는 활성을 갖는 것을 말한다. 항체로서는 동물에게 항원을 면역하여 면역동물의 비장 세포에서 작제한 하이브리도마 세포가 분비하는 항체 이외에 유전자 재조합 기술에 의해 작제된 항체, 즉 항체 유전자를 삽입한 항체 발현 벡터를 숙주세포로 도입함으로써 취득된 항체 등을 들 수 있다. 구체적으로는 하이브리도마가 생산하는 항체, 사람화 항체, 사람 항체 등을 들 수 있다.
하이브리도마란 사람 이외의 포유동물에 항원을 면역하여 취득한 B 세포와 마우스 등에 유래하는 골수종 세포를 세포 융합시켜 수득되는 원하는 항원 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생성하는 세포를 의미한다.
사람화 항체로서는 사람형 키메라 항체, 사람형 CDR 이식 항체 등을 들 수 있다.
사람형 키메라 항체는 사람 이외의 동물 항체 중쇄 가변영역(이하, 가변영역은 V 영역으로서 HV 또는 VH라고 칭한다) 및 항체 경쇄 가변영역(이하, 경쇄는 L쇄로서 LV 또는 VL이라고 칭한다)과 사람 항체의 중쇄 불변영역(이하, CH라고 칭한다) 및 사람 항체의 경쇄 불변영역(이하, CL이라고 칭한다)에서 이루어진 항체를 의미한다. 사람 이외의 동물로서는 마우스, 래트, 햄스터, 래비트 등의 하이브리도마를 작제할 수 있으면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
사람형 키메라 항체는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에서 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 취득하여 사람 항체 CH 및 사람 항체 CL을 암호화하는 유전자를 갖는 숙주 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 사람형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하며 숙주세포로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
사람형 키메라 항체의 CH로서는 사람 면역글로불린(이하, hIg라고 표기한다)에 속하면 어떠한 것이라도 양호하지만 hIgG 클래스의 것이 적절하며 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgGl, hIgG2, hIgG3, hIgG4라는 서브클래스의 어떤 것도 사용할 수 있다. 또한, 사람형 키메라 항체의 CL로서는 hIg에 속하면 어떠한 것이라도 양호하며 κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
사람형 CDR 이식 항체는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 사람 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 의미한다.
사람형 CDR 이식 항체는 사람 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR 서열을 임의의 사람 항체의 VH 및 VL의 CDR 서열에 이식한 V 영역을 암호화하는 cDNA를 구축하며 사람 항체의 CH 및 사람 항체의 CL을 암호화하는 유전자를 갖는 숙주 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 사람형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하며 당해 발현 벡터를 숙주세포로 도입함으로써 사람형 CDR 이식 항체를 발현시켜 제조할 수 있다.
사람형 CDR 이식 항체의 CH로서는 hIg에 속하면 어떠한 것이라도 양호하지만 hIgG 클래스의 것이 적절하며 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgGl, hIgG2, hIgG3, hIgG4라는 서브클래스의 어떤 것도 사용할 수 있다. 또한, 사람형 CDR 이식 항체의 CL로서는 hIg에 속하면 어떠한 것이라도 양호하며 κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
사람 항체는 원래, 사람 체내에 천연으로 존재하는 항체를 의미하지만 최근 의 유전공학적, 세포공학적, 발생공학적인 기술의 진보에 따라 작제된 사람 항체 파아지 라이브러리 및 사람 항체 생성 형질전환 동물 또는 사람 항체 생성 형질전환 식물로부터 수득되는 항체 등도 포함된다.
사람 체내에 존재하는 항체는 예를 들면 사람 말초혈 임파구를 단리하며 EB 바이러스 등을 감염시켜 불멸화, 클로닝함으로써 당해 항체를 생성하는 임파구를 배양할 수 있으며 배양물 중에서 당해 항체를 정제할 수 있다.
사람 항체 파아지 라이브러리는 사람 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파아지 유전자에 삽입함으로써 Fab, 단일쇄 항체 등의 항체 단편을 파아지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 당해 라이브러리에서 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파아지를 회수할 수 있다. 당해 항체 단편은 또한 유전공학적 방법에 따라 2개가 완전한 H쇄 및 2개가 완전한 L쇄를 포함하는 사람 항체 분자로 변환할 수 있다.
사람 항체 생성 형질전환 비사람 동물은 사람 항체 유전자가 세포내에 통합된 동물을 의미한다. 구체적으로는 마우스 ES 세포에 사람 항체 유전자를 도입하며 당해 ES 세포를 다른 마우스의 초기 배아로 이식한 다음, 발생시킴으로써 사람 항체 생성 형질전환 동물을 작제할 수 있다. 또한, 동물의 수정란에 사람 항체 유전자를 도입하며 당해 수정란을 발생시켜 사람 항체 생성 형질전환 동물을 작제할 수 있다. 사람 항체 생성 형질전환 동물로부터 사람 항체의 작제방법은 통상적인 사람 이외의 포유동물에서 실시되고 있는 하이브리도마 작제방법에 따라 사람 항체 생성 하이브리도마를 수득하며 배양하는 것으로 배양물 중에 사람 항체를 생성 축적시킬 수 있다.
형질전환 비사람 동물은 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이, 또는 토끼 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 항체가 종양 관련 항원을 인식하는 항체, 알레르기 또는 염증에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 순환기 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 자기면역 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 또는 바이러스 또는 세균 감염에 관련되는 항원을 인식하는 항체인 것이 바람직하며 항체의 클래스가 IgG의 사람 항체가 바람직하다.
항체의 단편이란 항체의 Fc 영역을 함유하는 단편을 의미한다. 항체의 단편로서는 H쇄의 단량체, H쇄의 이량체 등을 들 수 있다.
Fc 영역을 함유하는 융합 단백질이란 항체의 Fc 영역을 함유하는 항체 또는 항체의 단편과 효소, 사이토카인 등의 단백질을 융합시킨 물질을 의미한다.
본 발명에서 항체 분자의 Fc 영역에 결합되는 당쇄로서는 N-글리코시드 결합 당쇄를 들 수 있으며 이러한 N-글리코시드 결합 당쇄로서는 코어 구조의 비환원 말단측에 갈락토스-N-아세틸글루코사민(이하, Gal-GlcNAc라고 표기한다)의 측쇄를 병행하여 1 내지 복수개를 갖고 다시 Gal-GlcNAc의 비환원 말단측에 시알산, 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민 등의 구조를 갖는 콤플렉스형(복합형)을 들 수 있다.
항체 분자의 Fc 영역에는 하기되는 N-글리코시드 결합 당쇄 하나가 결합되는 영역들을 갖고 있으므로 항체 1분자당 2개의 당쇄가 결합되어 있다. 항체에 결합되는 N-글리코시드 결합 당쇄로서는 상기 구조식(I)의 코어 구조를 갖는 어떠한 당쇄도 포함되므로 항체에 결합되는 2개의 N-글리코시드 결합 당쇄에는 다수의 당쇄의 조합이 존재하게 된다. 따라서 Fc 영역에 결합된 당쇄 구조의 관점에서 물질의 동일성을 판단할 수 있다.
본 발명에서 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물(이하, 본 발명의 항체 조성물이라고 칭한다)이란, 본 발명의 효과가 수득되는 범위이면 단일의 당쇄 구조를 갖는 항체로 구성될 수 있으며 복수의 상이한 당쇄 구조를 갖는 당쇄로 구성될 수 있다.
본 발명에서 항체 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이란 당해 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 모든 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 전체 수에 대해 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 수가 차지하는 비율을 말한다.
본 발명에서 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄란, 당해 푸코스가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 α 결합되지 않은 당쇄를 의미한다. 구체적으로는 당해 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α 결합되지 않은 당쇄를 들 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상, 특히 바람직하게는 40% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상인 항체 조성물은 높은 ADCC 활성을 갖는다. 항체 농도가 저하되면 이에 따라 ADCC 활성이 저하되지만 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상의 경우, 항체 농도가 낮아도 높은 ADCC 활성을 획득할 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물 중에 함유하는 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율은 항체 분자로부터 하이드라진 분해나 효소 소화 등의 공지된 방법[생물화학실험법 23-당 단백질 당쇄 연구법(각가이슛판센터) 다카하시 레이코편(1989)]을 사용하며 당쇄를 유리시키고 유리시킨 당쇄를 형광 표지 또는 동위원소 표지하여 표지한 당쇄를 크로마토그래피법으로 분리함으로써 결정할 수 있다. 또한, 유리시킨 당쇄를 HPAED-PAD법[참조: J. Liq. Chromat Ogr., 6, 1577(1983)]에 의해서 분석함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 차이니즈 햄스터 난소조직 유래의 CHO 세포란 차이니즈 햄스터(Chinese hamster; Cricetulus griseus)의 난소조직으로부터 수립된 세포주이면 어떠한 세포도 포함된다. 이의 구체적인 예로서는 문헌[참조: Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968), genetics, 55, 513(1968), Chromosoma, 4l, 129(1973), Methods in Cell Science, 18, 115(1996), Radiation Research, 148, 260(1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275(1968), Cell, 6, 121(1975),molecular Cell genetics, AppendixI, II(p883-900)]등에 기재되어 있는 CHO 세포를 들 수 있다. 또한, ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)에 등록되어 있는 CHO-K1주(ATCC CCL-61), DUXB11주(ATCC CRL-9096), Pro-5주(ATCC CRL-1781) 또는 시판되는 CH0-S주(Life technologies사 Cat #11619) 또는 이들 주를 다양한 배지에 순응시킨 아(亞)주 등도 구체적인 예로서 들 수 있다.
본 발명에서 세포내 당 뉴클레오타이드인 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소란 세포내에서 당쇄로의 푸코스의 공급원인 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소이면 어떤 효소도 포함된다. 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관계되는 효소란 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 영향을 주는 효소를 의미한다.
세포내의 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스는 드 노보(de novo) 합성경로 또는 살비지(Salvage) 합성경로에 따라 공급되고 있다. 따라서 이들 합성경로에 관여하는 효소는 전부 세포내 GDP-푸코스의 합성에 관계되는 효소에 포함된다.
세포내의 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 드 노보의 합성경로에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 GDP-만노스 4,6-데하이드라타제(GDP-만노스4,6-데하이드라타제; 이하, GMD라고 표기한다), GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4,6-리덕타제(GDP-케토-데옥시만노스3,5-에피메라제, 4,6-리덕타제(이하, Fx라고 표기한다) 등을 들 수 있다.
세포내의 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 살비지 합성경로에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제(GDP-베타-L-푸코스-피로 포스포릴라제; 이하, GFPP라고 표기한다), 푸코키나제 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 영향을 주는 효소로서는 상기한 세포내의 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성경로에 관여하는 효소의 활성에 영향을 주거나 당해 효소의 기질로 되는 물질의 구조에 영향을 주는 효소도 포함된다.
본 발명에서 GMD로서는,
(a)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(b)서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(c)서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(d)서열 71의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질 또는
(e)서열 71의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 GMD 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, GMD의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA로서는 서열 65의 염기서열을 갖는 DNA, 서열 65의 염기서열을 갖는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GMD 활성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에서 Fx로서는,
(a)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(b)서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(c)서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(d)서열 72의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질,
(e)서열 72의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 Fx 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, Fx의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA로서는 서열 48의 염기서열을 갖는 DNA, 서열 48의 염기서열을 갖는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 Fx 활성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에서 GFPP로서는,
(a)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(b)서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(c)서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(d)서열 73의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질,
(e)서열 73의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, GFPP의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA로서는 서열 51의 염기서열을 갖는 DNA, 서열 51의 염기서열을 갖는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또 한 Fx 활성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에서 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소란 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합되는 반응에 관여하는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합되는 반응에 관여하는 효소란 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합되는 반응에 영향을 주는 효소를 의미한다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 반응에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제나 α-L-푸코시다제 등을 들 수 있다.
또한, 상기한 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합되는 반응에 관여하는 효소의 활성에 영향을 주거나 당해 효소의 기질로 되는 물질의 구조에 영향을 주는 효소도 포함된다.
본 발명에서 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제로서는,
(a)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(b)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(c)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(d)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA가 암호화하는 단백질,
(e)서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(f)서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(g)서열 23의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질,
(h)서열 24의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질,
(i)서열 23의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질 또는
(j)서열 24의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA로서는 서열 1 또는 2의 염기서열을 갖는 DNA, 서열 1 또는 2의 염기서열을 갖는 DNA와 엄중 조건하에서 하이브리드화하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에서 엄중 조건하에 하이브리드화하는 DNA란 예를 들면 서열 l, 2, 48, 51 또는 65의 염기서열을 갖는 DNA 등의 DNA 또는 이의 일부의 단편을 프로브로서 콜로니·하이브리드화법, 플러그·하이브리드화법 또는 서던 블롯 하이브리드화법 등을 사용함으로써 수득되는 DNA를 의미하며 구체적으로는 콜로니 또는 플러그 유래의 DNA를 고정화한 필터를 사용하여 O.7 내지 1.OM의 염화나트륨 존재하에 65℃에서 하이브리드화를 실시한 다음, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산나트륨을 포함한다)을 사용하며 65℃ 조건하에 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 하이브리드화는 문헌[참조: molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989(이하, 몰레큘러·클로닝 제2판이라고 약칭한다), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997(이하, 커런트 프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지라고 약칭한다), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical approach, Second Edition, 0xford University 1995)] 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다. 하이브리드화할 수 있는 DNA로서 구체적으로는 서열 l, 2, 48, 51 또는 65의 염기서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에서 서열 23, 24, 7l, 72 또는 73의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또한 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성, GMD 활성, Fx 활성 또는 GFPP 활성을 갖는 단백질은 문헌[참조: 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982), gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488(1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이도입법을 사용하며 예를 들면 서열 l, 2, 65, 48 또는 51의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며 이의 수는 특별히 한정되지 않지만 상기한 부위 특이적 변이도입법 등의 주지의 기술에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이며 예를 들면 1 내지 수십개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 단백질이 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성, GMD 활성, Fx 활성 또는 GFPP 활성을 갖기 위해서는 각각 서열 23, 24, 7l, 72 또는 73의 아미노산 서열과 BLAST[J. Mol. Biol.,215, 403(1990)]나 FASTA[Methods in Enzymology, 183, 63(1990)] 등의 분석 소프트웨어를 사용하여 계산할 때에 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
본 발명의 CHO 세포로서는 상기한 효소 활성이 저하되거나 결실된 세포를 들 수 있다.
상기한 효소 활성이 저하되거나 결실된 세포로서는 즉, 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 친주에서 저하되거나 결실된 세포를 포함한다. 이러한 세포를 취득하는 방법으로서는 목적하는 효소 활성을 저하시키거나 결실시킬 수 있는 방법이면 어떤 방법이라도 사용할 수 있다. 상기한 효소 활성을 저하시키거나 결실시키는 방법으로서는
(a)효소 유전자를 표적한 유전자 파괴의 방법;
(b)효소 유전자의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 방법;
(c)효소에 관한 돌연변이를 도입하는 방법;
(d)효소 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 방법.
(e)N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
여기서 렉틴에 내성인 세포주는 어떤 일정한 농도의 렉틴을 함유하는 배지중에 배양하는 경우에 친주와 비교하여 통계적인 유의차를 수반하여 2배 이상, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 5배 이상 생존율에 차이가 생기는 성질을 획득하는 세포주를 선택하는 것에서 취득할 수 있다. 또한 렉틴을 함유하는 배지중에 배양하는 경우에 어떤 일정한 생존율, 예를 들면 80%의 생존율로 배양할 수 있는 렉틴의 농도가 친주와 비교하여 2배, 바람직하게는 5배, 보다 바람직하게는 10배, 더욱 바람직하게는 20배 이상의 농도로 되는 세포주를 선택하는 것에서 취득할 수 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴으로서는 당해 당쇄 구조를 인식할 수 있는 렉틴이면 어떤 렉틴이라도 사용할 수 있다. 이의 구체적인 예로서는 렌즈콩 렉틴 LCA(렌즈 쿨리나리스 유래의 렌즈콩 응집소), 완두콩 렉틴 PSA(피숨 사티붐 유래의 완두콩 렉틴), 누에 콩 렉틴 VFA(비시아파바(Viciafaba) 유래의 응집소), 진홍색 공기 대나무 렉틴 AAL(알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 유래의 렉틴) 등을 들 수 있다.
본 발명의 CHO 세포는 상기 목적하는 효소 활성을 저하시키거나 결실시키는 방법을 실시하기 전의 친주인 CHO 세포가 생산하는 항체 조성물보다 ADCC 활성이 높은 항체 조성물을 생산할 수 있다.
또한, 본 발명의 CHO 세포는 항체 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민과 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 미만인 항체 조성물보다 ADCC 활성이 높은 항체 조성물을 생산할 수 있다.
본 발명에서 친주로서는 예를 들면 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하되지 않은 세포를 들 수 있다. 구체적으로는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 저하시키거나 결실시키도록 하는 처리를 실시하지 않은 세포가 사용된다.
본 발명에서 ADCC 활성이란 생체내에서 종양세포 등의 세포 표면 항원 등에 결합된 항체가 항체 Fc 영역과 효능인자 세포 표면 위에 존재하는 Fc 수용체와의 결합을 통해 효능인자 세포를 활성화하며 종양세포 등을 장애하는 활성을 의미한다[참조: Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., Capter2.1(1995)]. 효능인자 세포로서는 킬러 세포, 천연 킬러 세포, 활성화된 마크로파아지 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한, 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 등의 쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 유전공학적인 방법에 따라 저하되는 세포(이하, 본 발명의 숙주세포라고 약칭한다)에 관한 것이다. 본 발명의 숙주세포는 ADCC 활성이 높은 항체 조성물을 생산하기 위한 숙주세포로서 유용하다.
본 발명의 숙주세포으로서는 항체 분자를 발현할 수 있는 숙주세포이면 어떠한 세포도 포함된다. 이의 예로서 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등을 들 수 있다. 이들 세포의 구체적인 예로서는 하기 3.에 기재된 것을 들 수 있다. 특히, 동물세포 중에서도 차이니즈 햄스터 난소조직 유래의 CHO 세포, 래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, 마우스 골수종 세포주 NSO 세포, 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포, 시리안 햄스터 신장조직 유래 BHK 세포, 항체를 생성하는 하이브리도마 세포, 사람 백혈병 세포주 나말바 세포, 배아성 간세포, 수정란 세포 등이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1.본 발명의 숙주세포의 작제
본 발명의 숙주세포는 하기에 기재된 방법에 따라 작제할 수 있다.
(1)효소의 유전자를 표적으로 하는 유전자 파괴의 방법
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 표적으로 하며 유전자 파괴 방법을 사용함으로써 작제할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 GMD, Fx, GFPP, 푸코키나제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제, α-L-푸코시다제 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 말하는 유전자란 DNA 또는 RNA를 함유한다.
유전자 파괴의 방법으로서는 표적으로 하는 효소 유전자를 파괴할 수 있는 방법이면 어떠한 방법도 포함된다. 이의 예로서는 안티센스법, 리보자임법, 상동 재조합법, RDO법, RNAi법, 레트로바이러스를 사용하는 방법, 트랜스포존을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 하기에 이들을 구체적으로 설명한다.
(a) 안티센스법 또는 리보자임법에 의한 본 발명의 숙주세포의 작제
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 표적으로하며[문헌참조: 세포공학, 12, 239, (1993), 바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOL0GY), 17, 1097, (1999), 휴먼·몰레큘러·제네틱스(Hum. Mol. genet.), 5, 1083, (1995), 세포공학, 13, 255, (1994), 프로시딩스·오브·더·내쇼날·아카데미·오브·사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886(1999)]등에 기재된 리보자임법을 사용하여 예를 들면 하기와 같이 작제할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 cDNA 또는 게놈 DNA를 조제한다.
조제한 게놈 DNA의 염기서열을 결정한다.
결정한 DNA의 서열에 근거하여 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루 코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 DNA 부분, 비해독 영역의 부분 또는 인트론 부분을 함유하는 적당한 길이의 안티센스 유전자 또는 리보자임의 작제물을 설계한다.
당해 안티센스 유전자 또는 리보자임을 세포내에서 발현시키기 위해 조제한 DNA의 단편 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 작제한다.
당해 재조합 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써 형질전환체를 수득한다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택함으로써 본 발명의 숙주세포를 수득할 수 있다. 또한, 세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조 또는 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택함으로써 본 발명의 숙주세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 숙주세포를 작제하기 위해 사용되는 숙주세포로서는 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등으로, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 갖는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 숙주세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서 상기 숙주세포에서 자립 복제가능 내지는 염색체 중으로 통합할 수 있으며 설계한 안티센스 유전자 또는 리보자임을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하는 것이 사용된다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주세포로의 유전자의 도입방법으로서는 하기의 3.에 기재된 각종 숙주세포에 적합한 재조합 벡터의 도입방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기 방법을 들 수 있다.
형질전환체를 선택하는 방법
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하된 세포를 선택하는 방법으로서는 문헌[신생화학실험 강좌 3-당질 I, 당 단백질(동경화학동인) 일본생화학회편(1988)], 문헌[세포공학, 별책, 실험 프로토콜 시리즈, 글라이코바이올로지실험프로토콜, 당 단백질·당 지질·프로테오글리칸(슈쥰샤제) 다니구치 나오유키·스즈키 아캐미·후루카와 기요시·스가와라 가즈유키 감수(1996)], 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 생화학적인 방법 또는 유전공학적인 방법 등을 들 수 있다. 생화학적인 방법으로서 는 예를 들면 효소특이적인 기질을 사용하여 효소 활성을 평가하는 방법을 들 수 있다. 유전공학적인 방법으로서는 예를 들면 효소 유전자의 mRNA 양을 측정하는 노던 해석이나 RT-PCR법 등을 들 수 있다.
세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기1의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기의 5 또는 6에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 cDNA를 조제하는 방법으로서는 예를 들면 하기에 기재된 방법을 들 수 있다.
DNA의 조제방법
사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA 또는 mRNA를 조제한다. 조제된 전체 RNA 또는 mRNA에서 cDNA 라이브러리를 작제한다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 근거하여 축퇴성 프라이머를 작제하며 작제한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되 는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자 단편을 취득한다.
취득한 유전자 단편을 프로브로서 사용하며 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 DNA를 취득할 수 있다.
사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포의 mRNA는 시판하는 것(예: Clontech사)를 사용할 수 있으며 하기와 같이 사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포로부터 조제할 수 있다. 사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로서는 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[문헌참조: Methods in Enzymology, 154, 3(1987)], 산성 티오시안산구아니딘·페놀·클로로포름(AGPC)법[참조: Analytical Biochemistry, 162, 156(1987); 실험의학, 9, 1937(1991)] 등을 들 수 있다.
또한, 전체 RNA로부터 poly(A)+RNA로서 mRNA를 조제하는 방법으로서는 올리고(dT) 고정화 셀룰로스 칼럼법(몰레큘러·클로닝 제2판) 등을 들 수 있다.
또한, 고속 트랙 mRNA 분리 키트(Fast Track mRNA Isolation Kit)(Invitrogen사), 퀵 프렙 mRNA 정제 키트(Quick Prep mRNA Purification Kit)(Pharmacia사) 등의 키트를 사용함으로써 mRNA를 조제할 수 있다.
조제한 사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 작제한다. cDNA 라이브러리 작제법으로서는 문헌[참조: 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989)] 등에 기재된 방법 또는 시판하는 키트, 예를 들면, cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템(Life Technologies사), ZAP-cDNA 합성 키트(STRATAGENE사)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 작제하기 위한 클로닝 벡터로서는 대장균 K12주 속에서 자립 복제할 수 있는 것이면 파아지 벡터, 플라스미드 벡터 등의 어느 하나를 사용할 수 있다. 구체적으로는 ZAP 익스프레스[STRATAGENE사, Strategies, 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)], 람다 ZAP II(STRAtagene사), λgt10, λgt11[DNA cloning, A Practical Approach, l, 49(1985)], λTriplEx(Clontech사), λ엑셀(ExCell)(Pharmacia사), pT7T318U(Pharmacia사), pcD2[몰레큘러·셀룰러·바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(gene), 33, 103(1985)] 등을 들 수 있다.
숙주 미생물로서는 미생물이면 어떤 것도 사용할 수 있지만 바람직하게는 대장균이 사용된다. 구체적으로는 에스케리치아 콜리 XL 1-블루 MRF'[Stratagene사, Strategies, 5, 81(1992)], 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) C600[제네틱스(genetics), 39, 440(1954)], 에스케리치아 콜리 Y1088[사이언스(Science), 222, 778(1983)], 에스케리치아 콜리 Y1090[Science, 222, 778(1983)], 에스케리치아 콜리 NM522[참조: 져널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. mol. Biol.), 166,l(1983)], 에스케리치아 콜리 K802[참조: 져널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 에스케리치아 콜리 Jml05[ 진(gene), 38, 275(1985)] 등이 사용된다.
이러한 cDNA 라이브러리를 그대로 이후의 해석에 사용할 수 있지만 불완전 길이 cDNA의 비율을 낮추고 되도록이면 완전 길이 cDNA를 효율적으로 취득하기 위해 간노(菅野) 등이 개발한 올리고캡법[진(gene), 138, 171(1994); 진(gene), 200, 149(1997); 단백질 핵산효소, 4l, 603(1996); 실험의학, 1l, 249 1(1993); cDNA 클로닝(요우치사) (1996); 유전자 라이브러리의 작제법(요우치사) (1994)]를 사용하여 조제한 cDNA 라이브러리를 하기의 해석에 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 기초하여 당해 아미노산 서열을 암호화하는 것이 예측되는 염기서열의 5' 말단 및 3' 말단의 염기서열에 특이적인 축퇴성 프라이머를 작제하며 작제한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법[피시알·프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)]을 사용하여 DNA의 증폭을 실시함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자 단편을 취득할 수 있다.
취득한 유전자 단편이 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 DNA인 것은 통상적으로 사용되는 염기서열 해석방법, 예를 들면 생거(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABIPRISM 377 DNA 서열분석기(PE Biosystems사제) 등의 염기서열 분석장치를 사용하여 분석함으로써 확인할 수 있다.
당해 유전자 단편을 DNA를 프로브로 하여 사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포에 함유되는 mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리에 대하여 콜로니 하이브리드화 또는 플러그 하이브리드화(몰레큘러·클로닝 제2판)을 실시함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 DNA를 취득할 수 있다.
또한, 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자 단편을 취득하기 위해 사용되는 프라이머를 사용하며 사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포에 함유되는 mRNA에서 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법을 사용하여 스크리닝을 실시함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 DNA를 취득할 수 있다.
취득한 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 DNA의 염기서열을 말단에서 통상적으로 사용되는 염기서열 해석방법, 예를 들면 생거(Sanger) 등의 디데옥시법[참조: 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABIPRISM 377 DNA 서열분석기 (PE Biosystems사제) 등의 염기서열 분석장치를 사용하여 분석함으로써 당해 DNA의 염기서열을 결정한다.
결정된 cDNA의 염기서열을 바탕으로 BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여 GenBank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기서열 데이터 베이스를 검색함으로써 데이터 베이스 중의 유전자 중에서 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 결정할 수 있다.
상기한 방법에서 수득되는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열로서는 예를 들면 서열 48, 51 또는 65에 기재된 염기서열을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열로서는 예를 들면 서열 1 또는 2에 기재된 염기서열을 들 수 있다.
결정된 DNA의 염기서열에 근거하여 포스포아미다이트법을 이용한 퍼킨·엘머사의 DNA 합성기 모델 392 등의 DNA 합성기로 화학합성함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 cDNA를 취득할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는 예를 들면 하기에 기재된 방법을 들 수 있다.
게놈 DNA의 조제방법
게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는 몰레큘러·클로닝 제2판이나 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다. 또한, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템(Genome Systems사)나 유니버셜 게놈 워커TM 키트(Universal Genome WalkerTM Kits)(CLONTECH사) 등을 사용함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 단리할 수 있다.
상기한 방법에서 수득되는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기서열로서 예를 들면 서열 67 또는 70에 기재된 염기서열을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기서열로서 예를 들면 서열 3에 기재된 염기서열을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 사용하지 않고 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP 푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 염기서열에 근거하여 설계된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 리보자임을 직접 숙주세포에 도입하는 것으로 본 발명의 숙주세포를 수득할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 리보자임은 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다. 구체적으로는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 cDNA 및 게놈 DNA의 염기서열 중에서 연속된 5 내지 15O염기, 바람직하게는 5 내지 60염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40염기에 상당하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 서열정보에 기초하며 당해 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열에 상당하는 올리고뉴클레오타이드(안티센스 올리고뉴클레오타이드) 또는 당해 올리고뉴클레오타이드의 서열을 함유하는 리보자임을 합성하는 것으로 조제할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드로서는 올리고 RNA 및 당해 올리고뉴클레오타이드의 유 도체(이하, 올리고뉴클레오타이드 유도체라고 한다) 등을 들 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 유도체로서는 올리고뉴클레오타이드 중의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 인산디에스테르 결합이 N3'-P5'포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스와 인산디에스테르 결합이 펩타이드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 우라실이 C-5 프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 유도체 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 중의 시토신이 C-5프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 시토신이 페녹사진 개질 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스가 2'-O-프로필리보스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체 등을 들 수 있다[세포공학, 16, 1463(1997)].
(b)상동 재조합법에 의한 본 발명의 숙주세포의 작제
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하며 염색체 위의 표적 유전자를 상동 재조합법을 사용하여 개변함으로써 작제할 수 있다.
염색체 위의 표적 유전자의 개변은 문헌[참조: Manipulating the 100use Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)(이하, 「매니퓰레이팅·더·마우스·엠브리오·어·래보러토리·매뉴얼」이라고 약칭한다), genetargeting, A Practical approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈8 유전자 표적화, ES 세포를 사용하는 변이 마우스의 작제, 요우치사(1995)(이하, 「ES 세포를 사용하는 변이 마우스의 작제」라고 약칭한다)] 등에 기재된 방법을 사용하며 예를 들면 하기와 같이 실시할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제한다.
게놈 DNA의 염기서열에도 근거하여 개변하는 표적 유전자(예: 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 구조 유전자 또는 프로모터 유전자)를 상동 재조합하기 위한 표적 벡터를 작제한다.
작제한 표적 벡터를 숙주세포에 도입하며 표적 유전자와 표적 벡터 간에 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써 본 발명의 숙주세포를 작제할 수 있다.
숙주세포로서는 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 표적으로 하는 세 포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 갖고 있는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 숙주세포를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 게놈 DNA의 조제방법 등을 들 수 있다.
상기한 방법에서 수득되는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기서열로서 예를 들면 서열 67 또는 70에 기재된 염기서열을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기서열로서 예를 들면 서열 3에 기재된 염기서열을 들 수 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 표적 벡터는 문헌[참조: Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈8 유전자 표적화, ES 세포를 사용하는 변이 마우스의 작제(요우치사)(1995)] 등에 기재된 방법에 따라서 작제할 수 있다. 표적 벡터는 대체형, 삽입형의 어느 하나를 사용할 수 있다.
각종 숙주세포로의 표적 벡터의 도입에는 하기의 3.에 기재된 각종 숙주세포에 적합한 재조합 벡터의 도입방법을 사용할 수 있다.
상동 재조합체를 효율적으로 선별하는 방법으로서 예를 들면, 문헌[참조: Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈8 유전자 표적화, ES 세포를 사용하는 변이 마우스의 작제(1995)] 등에 기재된 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 폴리A 선택 등의 방법을 사용할 수 있다. 선별한 세포주 중에서 목적하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리드화법(몰레큘러·클로닝 제2판)이나 PCR법[피시알·프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)] 등을 들 수 있다.
(c)RDO 방법에 따른 본 발명의 세포의 작제
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하여 RDO(RNA-DNA oligonucleotide)법을 사용하며 예를 들면 하기와 같이 작제할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 cDNA 또는 게놈 DNA를 조제한다.
조제한 cDNA 또는 게놈 DNA의 염기서열을 결정한다.
결정된 DNA의 서열에 근거하여 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루 코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 부분, 비해독 영역의 부분 또는 인트론 부분을 함유하는 적당한 길이의 RDO의 작제물을 설계하여 합성한다.
합성한 RDO를 숙주세포에 도입하며 표적로 하는 효소, 즉 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소에 변이가 생긴 형질전환체를 선택함으로써 본 발명의 숙주세포를 작제할 수 있다.
숙주세포로서는 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 갖고 있는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 숙주세포를 들 수 있다.
각종 숙주세포로의 RD0의 도입에는 하기의 3.에 기재된 각종 숙주세포에 적합한 재조합 벡터의 도입방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는 예를 들면 상기1의 (1)의 (a)에 기재된「DNA의 조제방법」 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리 코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는 예를 들면 상기1의 (1)의 (a)에 기재된 게놈 DNA의 조제방법 등을 들 수 있다.
DNA의 염기서열은 적당한 제한효소 등으로 절단한 다음, pBluescript SK(-)(Stratagene사제) 등의 플라스미드에 클로닝하며 통상적으로 사용되는 염기서열 해석방법, 예를 들면 생거(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 실시하며 염기서열 자동 분석장치, 예를 들면 A.L.F. DNA 서열분석기(Pharmacia사제) 등을 사용하여 해석하는 것으로 당해 DNA의 염기서열을 결정할 수 있다.
RDO는 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.
RDO를 숙주세포에 도입하며 표적으로 하는 효소, 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 유전자에 변이가 생긴 세포를 선택하는 방법으로서는 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 염색체 위의 유전자의 변이를 직접 검출하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기1의 (1)의 (a)에 기재된, 도입한 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법, 하기1의 (5)에 기재된 세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법 또는 5 또는 6에 기재된 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법도 사용할 수 있다.
RD0의 작제물은 문헌[참조: 사이언스(Science), 273, 1386, (1996); 네이처·메디신(Nature Medicine), 4, 285, (1998); 헤파톨로지(Hepatology), 25, 1462, (1997); 진·세라피(genetherapy), 5, 1960, (1999); 진·세라피(genetherapy), 5, 1960, (1999); 져널·오브·몰레큘러·메디신(J. mol. Med.), 75, 829, (1997); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774, (1999); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768, (1999); 뉴클레익·애시드·리서치(Nuc. Acids. Res.), 27, 1323, (1999); 인베스티게이션·오브·더마톨로지(Invest. Dematol.), 11l, 1172, (1998); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 16, 1343, (1998); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 43, (2000); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 555, (2000)] 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(d) RNAi 방법에 따른 본 발명의 숙주세포의 작제
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 표적 로 하여 RNAi(RNA 간섭)법을 사용하며 예를 들면 하기와 같이 작제할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 cDNA를 조제한다.
조제된 cDNA의 염기서열을 결정한다.
결정된 DNA의 서열에 근거하여 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 부분 또는 비해독 영역의 부분을 함유하는 적당한 길이의 RNAi 유전자의 작제물을 설계한다.
당해 RNAi 유전자를 세포내에서 발현시키기 위해 조제한 DNA의 단편 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 작제한다.
당해 재조합 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써 형질전환체를 수득한다.
도입한 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성 또는 생성 항체 분자 또는 세포 표면 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질전환체를 선택하는 것으로 본 발명의 숙주세포를 수득할 수 있다.
숙주세포로서는 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 갖고 있는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 숙주세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는 숙주세포에서 자립 복제가능 내지는 염색체 중으로 통합할 수 있으며 설계한 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하는 것이 사용된다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주세포로의 유전자의 도입에는 하기의 3.에 기재된 각종 숙주세포에 적합한 재조합 벡터의 도입방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 상기1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기 1의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기의 5 또는 6에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리 코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는 예를 들면 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 DNA의 조제방법 등을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 사용하지 않고 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 염기서열에 기초하여 설계된 RNAi 유전자를 직접 숙주세포에 도입하는 것으로 본 발명의 숙주세포를 수득할 수 있다.
RNAi 유전자는 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.
RNAi 유전자의 작제물은 문헌[참조: 네이처(Nature), 39l, 806, (1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502, (1998); 네이처(Nature), 395, 854, (1998); 프로시딩즈·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049, (1999); 셀(Cell), 95, 1017, (1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 145l, (1999); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959, (1998); 네이처·셀·바이올로지(Nature Cell Biol.), 2, 70, (2000)] 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(e)트랜스포존을 사용하는 방법에 따른 본 발명의 숙주세포의 작제
본 발명의 숙주세포는 네이처·제네틱(Nature genet.), 25, 35, (2000) 등에 기재된 트랜스포존의 시스템을 사용하며 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성 또는 생성 항체 분자 또는 세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 돌연변이체를 선택하는 것으로 본 발명의 숙주세포를 작제할 수 있다.
트랜스포존의 시스템이란 외래 유전자를 랜덤으로 염색체 위에 삽입시키는 것으로 돌연변이를 유발시키는 시스템이며 통상적으로 트랜스포존에 삽입된 외래 유전자를 돌연변이를 유발시키는 벡터로서 사용하며 이러한 유전자를 염색체 위에 랜덤으로 삽입시키기 위한 트랜스포제스의 발현 벡터를 동시에 세포 속에 도입한다.
트랜스포제스는 사용되는 트랜스포존의 서열에 적합한 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
외래 유전자로서는 숙주세포의 DNA에 변이를 유발하는 것이면 어떤 유전자도 사용할 수 있다.
숙주세포로서는 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소가 유전자를 갖는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 숙주세포를 들 수 있다. 각종 숙주세포 로의 유전자의 도입에는 하기의 3.에 기재된 각종 숙주세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 상기1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기 1의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기의 5 또는 6에 기재된 방법을 들 수 있다.
(2)효소 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 방법
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 표적으로 하여 당해 효소의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 방법을 사용함으로써 작제할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 GMD, Fx, GFPP, 푸코키나제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제, α-L-푸코시다제 등을 들 수 있다.
이들 효소는 기질특이성을 갖는 어떤 특정한 반응을 촉매하는 효소이며 이러한 기질특이성을 갖는 촉매작용을 갖는 효소의 활성 중심을 파괴하는 것으로 이들 효소의 도미넌트 네가티브체를 작제할 수 있다. 표적로 하는 효소 중에서 GMD를 예로 하여 이의 도미넌트 네가티브체에 제작에 관해서 구체적으로 하기에 기재한다.
대장균 유래의 GMD의 입체구조를 해석한 결과, 4개의 아미노산(133번째의 트레오닌, 135번째의 글루탐산, 157번째의 티로신, 161번째의 라이신)이 효소 활성에 중요한 기능을 담당하고 있는 것이 명백하게 되어 있다(참조: Structure, 8, 2, 20OO). 즉, 입체구조의 정보에 근거하여 이들 4개의 아미노산을 상이한 다른 아미노산으로 치환한 변이체를 작제한 결과, 어떤 변이체에서도 유의적으로 효소 활성이 저하되는 것으로 나타나고 있다. 한편, GMD의 보효소 NADP나 기질인 GDP-만노스와의 결합능에 관해서는 어떤 변이체에서도 거의 변화가 관찰되지 않는다. 따라서 GMD의 효소 활성을 담당하는 이들 4개의 아미노산을 치환함으로써 도미넌트 네가티브체를 작제할 수 있다. 대장균 유래의 GMD의 결과에 기초하며 아미노산 서열정보을 바탕으로 하는 상동성 비교나 입체구조 예측을 실시함으로써 예를 들면 CHO 세포 유래의 GMD(서열 65)에서는 155번째의 트레오닌, 157번째의 글루탐산, 179번째의 티로신, 183번째의 라이신을 다른 아미노산으로 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 작제할 수 있다. 이러한 아미노산 치환을 도입한 유전자의 작제는 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 부위 특이적 변이도입법을 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 숙주세포는 상기와 같이 작제한 표적효소의 도미넌트 네거티브체 유전자를 사용하며 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, 매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판 등에 기재된 유전자 도입방법에 따라서 예를 들면 하기와 같이 작제할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 도미넌트 네가티브체를 암호화하는 유전자(이하, 도미넌트 네가티브체 유전자라고 약칭한다)를 조제한다.
조제한 도미넌트 네가티브체 유전자의 전체 길이 DNA를 바탕으로 하여 필요에 따라 당해 단백질을 암호화하는 부분을 함유하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
당해 DNA 단편 또는 전체 길이 DNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 작제한다.
당해 재조합 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써 형질전환체를 수득한다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성 또는 생성 항체 분자 또는 세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질전환체를 선택하는 것으로 본 발명의 숙주세포를 작제할 수 있다.
숙주세포로서는 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 갖는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 숙주세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는 숙주세포에서 자립 복제가능 내지는 염색체 중으로 통합 할 수 있으며 목적하는 도미넌트 네가티브체를 암호화하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는 하기의 3.에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주세포로의 유전자의 도입에는 하기의 3.에 기재된 각종 숙주세포에 적합한 재조합 벡터의 도입방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하기 1의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질전환체를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 하 기의 5 또는 6에 기재된 방법을 들 수 있다.
(3)효소에 관한 돌연변이를 도입하는 방법
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자에 대해서 돌연변이를 도입하며 당해 효소에 돌연변이를 발생시킨 원하는 세포주를 선택하는 방법을 사용함으로써 작제할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는 GMD, Fx, GFPP, 푸코키나제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제, α-L-푸코시다제 등을 들 수 있다.
방법으로서는 1)돌연변이 유발처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 2)돌연변이 유발처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터 생산 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 3)돌연변이 유발처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터 당해 세 포의 세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
돌연변이 유발처리로서는 친주 세포의 DNA에 점 돌연변이, 결실 또는 프레임 전환 돌연변이를 유발하는 것이면 어떠한 처리도 사용할 수 있다.
구체적으로는 에틸니트로소우레아, 니트로소구아니딘, 벤조피렌, 아크리딘 색소에 의한 처리, 방사선의 조사 등을 들 수 있다. 또한, 각종 알킬화제나 발암물질도 돌연변이 유발물질로서 사용할 수 있다. 돌연변이 유발물질을 세포에 작용시키는 방법으로서는 예를 들면 조직배양의 기술 제3판(아사쿠라쇼텐) 일본조직배양학회편(1996), 네이처·제네틱스(Nature genet.), 24, 314, (2000) 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
자연발생적으로 생긴 돌연변이체로서는 특별한 돌연변이 유발처리를 실시하지 않고 통상적인 세포 배양의 조건에서 계대(繼 代) 배양을 계속함으로써 자연발생적으로 생기는 돌연변이체를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법으로서는 예를 들면 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는 예를 들면 하기 5 또는 6에 기재된 방법을 들 수 있다. 세포막 위의 당 단백질의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는 예를 들면 하기 1의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다.
(4)효소 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 방법
본 발명의 숙주세포는 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하며 안티센스 RNA/DNA 기술[문헌참조: 바이오사이언스와 인더스트리, 50, 322(1992), 화학, 46, 681(1991), Biotechnology, 9, 358(1992), Trends in Biotechnology, 10, 87(1992), Trends in Biotechnology, 10, 152(1992), 세포공학, 16, 1463(1997)], 삼중 나선 기술[문헌참조: Trends in Biotechnology, 10, 132(1992)] 등을 사용하며 표적으로 하는 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 것으로 작제할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 GMD, Fx, GFPP, 푸코키나제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제, α-L-푸코시다제 등을 들 수 있다.
(5)N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포주를 선택하는 방법
본 발명의 숙주세포는 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포주를 선택하는 방법을 사용함으로써 작제할 수 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포주를 선택하는 방법으로서는 예를 들면 문헌[참조: 소마틱·셀·앤드·몰레큘러·제네틱스(Somatic Cell Mol. genet.), 12, 5l, (1986) 등]에 기재된 렉틴을 사용하는 방법을 들 수 있다.
렉틴로서는 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴이면 어떤 렉틴이라도 사용할 수 있지만 이의 구체적인 예로서는 렌즈 콩 렉틴 LCA(렌즈 쿨리나리스 유래의 렌즈콩 응집소) 완두콩 렉틴 PSA(피숨 사티붐 유래의 완두콩 렉틴), 누에 콩 렉틴 VFA(비시아 파바(Vicia faba) 유래의 응집소), 진홍색 공기 대나무 렉틴 AAL(알레우리아 아우란티아 유래의 렉틴) 등을 들 수 있다.
구체적으로는 1μg/ml 내지 1mg/ml의 농도의 상기한 렉틴을 함유하는 배지에서 1일 내지 2주간, 바람직하게는 1일 내지 1주간 배양하며 생존하고 있는 세포를 계대 배양 또는 콜로니를 선택하여 별도의 배양기로 옮기며 다시 계속해서 렉틴을 함유하는 배지에서 배양을 계속함으로써 본 발명의 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포주를 선택할 수 있다.
상기 방법에서 수득되는 세포 주로서는 예를 들면 하기 실시예 14(2)에서 취득한 CH0/CCR4-LCA주 Nega-13(FERM BP-7756)을 들 수 있다.
2.본 발명의 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이들 자손의 작제
본 발명의 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이들 자손은 항체 분자의 당쇄의 개질에 관계되는 효소의 활성이 제어되도록 게놈 유전자가 개변된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이들 자손은 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소 유전자를 표적으로 하여 1.에 기재된 방법과 동일한 방법을 사용하여 작제할 수 있다.
형질전환 비사람 동물의 경우, 목적하는 비사람 동물, 예를 들면 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이, 토끼 등의 배아성 간세포에 1.에 기재된 방법과 동일한 방법을 사용함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 제어된 본 발명의 배아성 간세포를 작제할 수 있다.
구체적으로는 염색체 위의 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자를 공지된 상동성 재조합의 방법[문헌참조: Nature, 326, 6110, 295(1987), Cell, 5l, 3, 503(1987) 등]으로 불활성화시키거나 임의의 서열과 치환된 변이 클론을 작제한다. 작제된 당해 변이 클론을 사용하여 동물의 수정란의 배반포(胚盤胞)(blastcyst)로의 주입 키메라법 또는 집합 키메라법 등의 방법에 따라 배아성 간세포 클론과 정상세포을 포함하는 키메라 개체를 조제할 수 있다. 이러한 키메라 개체와 정상 개체가 교배함으로써 전신의 세포에서 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하되거나 결실된 형질전환 비사람 동물을 수득할 수 있다.
또한, 목적하는 비사람 동물, 예를 들면 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이, 토끼 등의 수정란 세포에 1.에 기재된 방법과 동일한 방법을 사용함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하되거나 결실된 본 발명의 수정란 세포를 작제할 수 있다.
작제된 수정란 세포를 매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판 등에 기재된 배아 이식방법을 사용하여 가짜임신 암컷의 난관 또는 자궁에 이식하여 출산시키는 것으로 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하된 형질전환 비사람 동물을 작제할 수 있다.
형질전환 식물의 경우, 목적하는 식물체 칼루스 또는 세포에 1.에 기재된 방법과 동일한 방법을 사용함으로써 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치 또는 3위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하되거나 결실된 본 발명의 칼루스를 작제할 수 있다.
작제된 칼루스를 공지된 방법[조직배양, 20(1994); 조직배양, 21(1995); 트렌드·인·바이오테크놀로지(Trends in Biotechnology), 15, 45(1997)]에 준해 옥신 및 사이토카인을 함유하는 배지에서 배양함으로써 재분화시키고 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치 또는 3위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 개질에 관여하는 효소의 활성이 저하된 형질전환 식물을 작제할 수 있다.
3.항체 조성물의 제조방법
항체 조성물은 문헌[참조: 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(이하, 항체라고 약칭한다), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1989(이하, 모노클로날 항체라고 약칭한다), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at 0xford University Press, 1996(이하, 항체 가공이라고 약칭한다)] 등에 기재된 방법을 사용하여 예를 들면 하기와 같이 숙주세포 중에 발현시켜 취득할 수 있다.
항체 분자의 전체 길이 cDNA를 조제하며 당해 항체 분자를 암호화하는 부분을 함유하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
당해 DNA 단편 또는 전체 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 작제한다.
당해 재조합 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입함으로써 항체 분자를 생산하는 형질전환체를 수득할 수 있다.
숙주세포로서는 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
항체 분자의 Fc 영역에 결합되는 N-글리코시드 결합 당쇄의 개질에 관계되는 효소를 유전공학적인 방법을 사용하여 도입한 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등의 세포를 숙주세포로서 사용할 수 있다.
발현 벡터로서는 숙주세포에서 자립 복제가능 내지는 염색체 중으로 통합할 수 있으며 목적하는 항체 분자를 암호화하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하는 것이 사용된다.
cDNA는 상기1의 (1)의 (a)에 기재된 DNA의 조제방법에 따라서 사람 또는 비사람 동물의 조직 또는 세포에서 목적하는 항체 분자에 특이적인 프로프라이머 등을 사용하여 조제할 수 있다.
효모를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서 예를 들면 YEP13(ATCC 37115), YEp24(ATCC 37051), YCp50(ATCC 37419)등을 들 수 있다.
프로모터로서는 효모 균주 속에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있으며 예를 들면 헥소스키나제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모 터, 사람 쇼크 단백질 프로모터, MF α1 프로모터, CUP 1프로모터 등을 들 수 있다.
숙주세포로서는 사카로마이세스속, 스키조사카로마이세스속, 클루이베로마이세스속, 토리코스포론속, 슈와니오마이세스속 등에 속하는 미생물, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈와니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로서는 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면 전기천공법[문헌참조: 메소드·엔자이몰로지(Methods. Enzzymol.), 194, 182(1990)], 스페로플라스트법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929(1978)], 아세트산리튬법[져널·오브·박테리올로지(J. Bacteriology), 153, 163(1983)], 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929(1978)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예를 들면 pcDNAI, pcDM8(프나코시사에서 시판), pAGEl07[일본 공개특허공보 제(평) 3-22979호; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133, (1990)], pAS3-3[일본 공개특허공보 제(평) 2-227075호], pCDM8[네이처(Nature), 329, 84O, (1987)], pcDNAI/Amp(Invitrogen사), pREP4(Invitrogen사), pAGEl03[져널·오브·바이오케미 스트리(J. Biochemistry), 10l, 1307(1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 동물세포 속에서 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면 사이토메갈로바이러스(CMV)의 IE(이메디에이트 어얼리(immediate early)) 유전자의 프로모터, SV4O의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 사람 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 사람 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용할 수 있다.
숙주세포로서는 사람의 세포인 나말바(Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈·햄스터의 세포인 CH0 세포, HBT 5637[일본 공개특허공보 제(소) 63-299), 래트 골수종 세포, 마우스 골수종 세포, 시리안 햄스터 신장 유래세포, 배아성 간세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로서는 동물세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], 인산칼슘법[일본 공개특허공보 제(평) 2-227075호], 리보펙션법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)], 인젝션법[매니퓰레이팅·더·마우스·엠브리오·어·래보로토리·매뉴얼], 파티클 건(유전자 총)을 사용하는 방법[일본 특허 제2606856호, 제2517813호], DEAE-덱스트란법[바이오 매뉴얼 시리즈4-유전자 도입과 발현·해석법(요우치사) 요코다 다카시·아라이 겐이치편(1994)], 바이러스 벡터법[매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판] 등을 들 수 있다.
곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 예를 들면, 문헌[참조: 커런트·프 로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York(1992), 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 6, 47(1988)] 등에 기재된 방법에 따라 단백질을 발현할 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큐로바이러스를 곤충세포에 공도입하여 곤충세포 배양 상등액 중에 재조합 바이러스를 수득한 다음, 다시 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 단백질을 발현시킬 수 있다.
당해 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로서는 예를 들면 pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두 in vitorogen사) 등을 들 수 있다.
바큐로바이러스로서는 예를 들면 밤도독나방과 곤충에게 감염시킨 바이러스인 오토그래퍼·캘리포니카·뉴클리어·폴리헤드로시스·바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충세포로서는 스포도프테라프루기페르다(Spodopterafrugiperda)의 난소세포인 Sf9, Sf21[커런트·프로트콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York(1992)], 트리코플러시아니(Trichoplusiani)의 난소세포인 High5(Invitrogen사) 등을 사용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한 곤충세포로의 재조합 유전자 도입 벡터와 바큐로바이러스의 공도입 방법으로서는 예를 들면 인산칼슘법[일본 공개특허공보 제(평) 2-227075호], 리보펙션법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브· 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
식물세포를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서 예를 들면 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 식물세포 속에서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것을 사용해도 양호하며 예를 들면 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터, 벼 액틴 1프로모터 등을 들 수 있다.
숙주세포로서는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 어플라나, 알파파, 벼, 소맥, 대맥 등의 식물세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로서는 식물세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며 예를 들면 아그로박테륨(Agrobacterium)[일본 공개특허공보 제(소) 59-140885호, 제(소) 60-70O80호, W0 94/00977], 전기천공법[일본 공개특허공보 제(소) 60-251887호], 파티클 건(유전자 총)을 사용하는 방법[일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제2517813고] 등을 들 수 있다.
유전자의 발현방법으로서는 직접 발현 이외에 몰레큘러·클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준해 분비생산, Fc 영역과 다른 단백질과의 융합 단백질 발현 등을 실시할 수 있다.
당쇄의 합성에 관여하는 유전자를 도입하는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포에 의해 발현시키는 경우에는 도입된 유전자에 따라 당 또는 당쇄가 부가된 항체 분자를 수득할 수 있다.
이상과 같이 하여 수득되는 형질전환체를 배지에 배양하며 배양물 중에 항체 분자를 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다. 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주세포의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라서 실시할 수 있다.
대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로서는 당해 생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하여, 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지의 어느 하나를 사용할 수 있다.
탄소원로서는 당해생물이 자화할 수 있는 것이면 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올등의 알콜류등을 사용할 수 있다.
질소원로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 기타 질소 함유 화합물 및 펩톤, 고기 엑스, 효모 엑스, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효 균체 및 이의 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기염류로서는 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 진탕배양 또는 심부(深部) 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에 실시한다. 배양온도는 15 내지 40℃가 양호하며 배양시간은 통상적으로 16시간 내지 7일 동안이다. 배양중의 pH는 3.0 내지 9.0으로 유지한다. pH의 조 제는 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
또한, 배양중 필요에 따라 암피시린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 유도인자를 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들면 lac 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가할 수 있다.
동물세포를 숙주로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지[더·져널·오브·더·어메리컨·메디컬·어소시에이션(The Journal of the American Medical association), 199, 519(1967)], Eag1e의 MEM 배지[사이언스(Science), 122, 501(1952)], 달베코 개변 MEM 배지[비루올로지(Virology), 8, 396(1959)], 199배지[프로시딩·오브·더·소사이어티·훠·더·바이올로지컬·메디슨(Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73,l(1950)], WhILten 배지[발생공학 실험 매뉴얼-형질전환·마우스의 작제 방법(고단샤) 가키모토야편(1987)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등를 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% C02 존재하 등의 조건하에 1 내지 7일 동안 실시한다.
또한, 배양중 필요에 따라 가나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
곤충세포를 숙주로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사), Sf-900 II SFM 배지(Life Technologies사), ExCell 400, ExCell 405(모두 JRH Biosciences사), Grace's Insect Medium[네이처(Nature), 195, 788(1962)] 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 pH 6 내지 7, 25 내지 30℃ 등의 조건하에 1 내지 5일 동안 실시한다.
또한, 배양중 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
식물세포를 숙주로 하여 수득된 형질전환체는 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 당해 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되는 무라시게·앤드·스크그(MS) 배지, 화이트(WhILe) 배지 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등의 식물 호르몬을 첨가한 배지 등를 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 pH 5 내지 9, 20 내지 40℃의 조건하에 3 내지 60일 동안 실시한다.
또한, 배양중 필요에 따라 가나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
상기와 같이 항체 분자를 암호화하는 DNA를 통합한 재조합체 벡터를 보유하 는 미생물, 동물세포 또는 식물세포 유래의 형질전환체를 통상적인 배양방법에 따라 배양하며 항체 조성물을 생성 축적시켜 당해 배양물에서 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다.
항체 유전자의 발현방법으로서는 직접 발현 이외에 몰레큘러·클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법에 준해 분비생산, 융합 단백질 발현 등을 할 수 있다.
항체 조성물의 생산방법으로서는 숙주세포 내에 생산시키는 방법, 숙주세포 외에 분비시키는 방법 또는 숙주세포 외막 위에 생산시키는 방법이 있으며 사용하는 숙주세포나 생산시키는 항체 분자의 구조를 변경함으로써 당해 방법을 선택할 수 있다.
항체 조성물이 숙주 세포내 또는 숙주세포 외막 위에 생산되는 경우, 보루송 등의 방법[참조: 져널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227(1989); 진·디벨롭먼트(genes Develop.), 4, 1288(1990)] 또는 일본 공개특허공보 제(평) 05-336963고, 제(평) 06-823021호 등에 기재된 방법을 준용함으로써 당해 항체 조성물을 숙주 세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 방법을 사용하여 발현 벡터에 항체 분자를 암호화하는 DNA 및 항체 분자의 발현에 적절한 시그널 펩타이드를 암호화하는 DNA를 삽입하며 당해 발현 벡터를 숙주세포로 도입한 후에 항체 분자로 발현시킴으로써 목적하는 항체 분자를 숙주 세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 공개특허공보 제(평) 2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준해 디하이드로엽산 환원효소 유전자 등을 사용하는 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수 있다.
또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써 유전자가 도입된 동물 개체(형질전환 비사람 동물) 또는 식물 개체(형질전환 식물)을 조성하며 이들 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조할 수 있다.
형질전환체가 동물 개체 또는 식물 개체의 경우에는 통상적인 방법에 따라서 사육 또는 재배하며 항체 조성물을 생성 축적시켜 당해 동물 개체 또는 식물 개체에서 당해 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다.
동물 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는 예를 들면 공지된 방법[문헌참조: 어메리컨·져널·오브·클리니컬·뉴트리션(American Journal of CBamical Nutrition), 63, 639S(1996); 어메리컨·져널·오브·클리니컬·뉴트리션(American Journal of CBamical Nutrition), 63, 627S(1996); 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 9, 830(1991)]에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물중에 목적하는 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우에는 예를 들면 항체 분자를 암호화하는 DNA를 도입한 형질전환 비사람 동물을 사육하며 항체 조성물을 당해 동물중에 생성·축적시켜 당해 동물중에서 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다. 당해 동물중의 생성·축적 장소로서는 예를 들면 당해 동물의 젓[일본 공개특허공보 제(소) 63-309192호], 알 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로서는 동물에 서 발현할 수 있는 것이면 어떤 것도 사용할 수 있지만 예를 들면 유선세포 특이적인 프로모터인 α 카제인 프로모터, β 카제인 프로모터, β 락토글로불린 프로모터, 산성 프로테인 프로모터 등이 적절하게 사용된다.
식물 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는 예를 들면 항체 분자를 암호화하는 DNA를 도입한 형질전환 식물을 공지된 방법[조직배양, 20(1994); 조직배양, 21(1995); 트렌드·인·바이오테크놀로지(Trends in Biotechnology), 15, 45(1997)]에 준하여 재배하며 항체 조성물을 당해 식물중에 생성·축적시켜 당해 식물중에서 당해 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.
항체 분자를 암호화하는 유전자를 도입한 형질전환체에 의해 제조된 항체 조성물은 예를 들면 항체 조성물이 세포내에 용해 상태로 발현하는 경우에는 배양 종료후, 세포를 원심분리에 의해 회수하며 수계 완충액에 현탁한 다음, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린 균질기, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 수득한다. 당해 무세포 추출액을 원심분리함으로써 수득되는 상등액에서 통상적인 효소의 단리정제법, 즉 용매추출법, 유안 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세팔로스, DIAION HPA-75[미쓰비시가가쿠(주)제] 등의 수지를 사용하는 음이온교환 크로마토그래피법, S-SepharoseFF(Pharmacia사) 등의 수지를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세팔로스, 페닐세팔로스 등의 수지를 사용하는 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용하는 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전 기영동 등의 전기영동법 등의 방법을 단독 또는 조합하여 사용하여 항체 조성물의 정제 표준품을 수득할 수 있다.
또한, 항체 조성물이 세포내에 불용체를 형성하여 발현하는 경우에는 동일하게 세포를 회수한 후, 파쇄하여 원심분리를 실시함으로써 침전 분획으로서 항체 조성물의 불용체를 회수한다. 회수한 항체 조성물의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 당해 가용화액을 희석 또는 투석함으로써 당해 항체 조성물을 정상적인 입체구조로 복귀시킨 다음, 상기와 동일한 단리정제법에 따라 당해 항체 조성물의 정제 표준품을 수득할 수 있다.
항체 조성물이 세포외로 분비되는 경우에는 배양 상등액에 당해 항체 조성물 또는 이의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 당해 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 방법에 따라 처리함으로써 가용성 분획을 취득하며 당해 가용성 분획으로부터 상기와 동일한 단리정제법을 사용함으로써 항체 조성물의 정제 표준품을 수득할 수 있다.
이와 같이 하여 취득되는 항체 조성물로서 예를 들면 항체, 항체의 단편, 항체의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질 등을 들 수 있다.
하기에 항체 조성물의 취득의 보다 구체적인 예로서 사람화 항체 조성물의 제조방법에 관해서 기재하지만 다른 항체 조성물을 당해 방법과 동일하게 하여 취득할 수 있다.
(1)사람화 항체 발현용 벡터의 구축
사람화 항체 발현용 벡터란 사람 항체의 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄) C 영역을 암호화하는 유전자가 통합된 동물세포용 발현 벡터이며 동물세포용 발현 벡터에 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역을 암호화하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
사람 항체의 C 영역으로서는 임의의 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역일 수 있으며 예를 들면 사람 항체의 H쇄의 IgG1 서브클래스의 C 영역(이하, hCγ1이라고 표기한다) 및 사람 항체의 L쇄의 κ클래스의 C 영역(이하, hCκ라고 표기한다) 등을 들 수 있다.
사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역을 암호화하는 유전자로서는 엑손과 인트론을 포함하는 염색체 DNA를 사용할 수 있으며 또한, cDNA를 사용할 수 있다.
동물세포용 발현 벡터로서는 사람 항체의 C 영역을 암호화하는 유전자를 통합 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면 pAGEl07[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], pAGEl03[져널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 10l, 1307(1987)], pHSG274[진(gene), 27, 223(1984)], pKCR[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78, 1527(1981)], pSG1βd2-4[사이토테크놀로지(Cytotechnolo5), 4, 173(199O)] 등을 들 수 있다. 동물세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터와 인핸서로서는 SV4O의 초기 프로모터와 인핸서[참조: 져널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 10l, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR[바이오케미컬·and·바이오피지컬·리서치·커뮤니케이션즈(Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960(1987)], 면역 글로불린 H쇄의 프로모터[셀(Cell), 4l, 479(1985)]와 인핸 서[셀(Cell), 33, 717(1983)] 등을 들 수 있다.
사람화 항체 발현용 벡터는 항체 H쇄 및 L쇄가 따로따로 벡터 위에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터 위에 존재하는 타입(이하, 탠덤형이라고 표기한다)의 어느 것이나 사용할 수 있지만 사람화 항체 발현 벡터의 구축이 용이성, 동물세포로의 도입이 용이성, 동물세포 내에서 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형되는 등의 점에서 탄뎀형의 사람화 항체 발현용 벡터의 편이 바람직하다[참조: 져널·오브·이뮤놀로지컬·메소드(J. Immunol. Methods), 167, 271(1994)].
구축한 사람화 항체 발현용 벡터는 사람형 키메라 항체 및 사람형 CDR 이식 항체의 동물세포에서의 발현에 사용할 수 있다.
(2)사람 이외의 동물 항체의 V 영역을 암호화하는 cDNA의 취득
사람 이외의 동물 항체, 예를 들면 마우스 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역을 암호화하는 cDNA는 하기와 같이 하여 취득할 수 있다.
목적하는 마우스 항체를 생성하는 하이브리도마 세포에서 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파아지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 작제한다. 당해 라이브러리에서 기존의 마우스 항체의 C 영역 부분또는 V 영역 부분을 프로브로서 사용하며 H쇄 V 영역을 암호화하는 cDNA를 갖는 재조합 파아지 또는 재조합 플라스미드 및 L쇄 V 영역을 암호화하는 cDNA를 갖는 재조합 파아지 또는 재조합 플라스미드를 단리한다. 재조합 파아지 또는 재조합 플라스미드 위의 목적하는 마우스 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 전체 염기서열을 결정하여 염기서열에서 H쇄 및 L쇄 V 영역의 전체 아미노산 서열을 추정한다.
사람 이외의 동물로서는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등의 하이브리도마 세포를 작제할 수 있으면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로서는 티오시안산구아니딘트리플루오로아세트산세슘법[메소드·인·엔자이몰로지(Methods in Enzymol.), 154, 3(1987)], 또한 전체 RNA로부터 mRNA를 조제하는 방법으로서는 올리고(dT) 고정화 셀룰로스 칼럼법[몰레큘러·클로닝: 어·래보로토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제하는 키트로서는 신속 트랙 mRNA 분리 키트(Invitrogen사제), QIIIck Prep mRNA 정제 키트(Pharmacia사제) 등을 들 수 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 작제법으로서는 통상적인 방법[몰레큘러·클로닝: 어·래보로토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지(Current Protocols inmolecular Biology), 보충액4], 또는 시판하는 키트, 예를 들면 SUPER ScriptTM cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝용 플라스미드 시스템(GIBCO BRL사제)나 ZAP-cDNA 합성 키트(Stratagene사제)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 작제할 때, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 통합한 벡터는 당해 cDNA를 통합한 벡터이면 어떠한 것이 라도 사용할 수 있다. 예를 들면 ZAP Express[스트래티지즈(Strategies), 5, 58(1992)], pB1uescript II SK(+)[뉴클레익·애시드·리서치(Nucleic Acids Research),], 17, 9494(1989)], λzap II(Stratagene사제), λgt10, λgt11[디엔에이·클로닝: 어·프랙티컬·어프로치(DNA Cloning: A Practical approach), l, 49(1985)], Lambda Blue Mid(Clontech사제), λExCell, pT7T3 18U(Pharmacia사제), pcD2[몰레큘러·앤드·셀률러·바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(Gene), 33, 103(1985)] 등이 사용된다.
파아지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로서는 당해 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면 XL1-B1ue MRF'[스트래티지즈(Strategies), 5, 81(1992)], C600[제네틱스(Genetics), 39, 440(1954)], Y1088, Y1090[사이언스(Science), 222, 778(1983)], NM522[져널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. mol. Biol.), 166,l(1983)], K802[져널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 Jml05[진(gene), 38, 275(1985)] 등이 사용된다.
cDNA 라이브러리로부터 사람 이외의 동물 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역을 암호화하는 cDNA 클론의 선택법으로서는 아이소토프 또는 형광 표지한 프로브를 사용하는 콜로니·하이브리드화법 또는 플러그·하이브리드화법[몰레큘러·클로닝: 어·래보로토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989]에 의해 선택할 수 있다. 또한, 프라이머을 조 제하며 mRNA로 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 Polymerase Chain Reaction[이하, PCR법이라고 표기한다; 몰레큘러·클로닝: 어·래보로토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지(Current Protocols inmolecular Biology), 보충액 1-34]에 의해 H쇄 및 L쇄 V 영역를 암호화하는 cDNA를 조제할 수 있다.
상기 방법에 따라 선택된 cDNA를 적당한 제한효소 등으로 절단한 다음, pBluescript SK(-)(Stratagene사제) 등의 플라스미드에 클로닝하여 통상적으로 사용되는 염기서열 해석방법, 예를 들면 생거(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 실시하고 염기서열 자동 분석장치, 예를 들면 A.L.F. DNA 서열분석기(Pharmacia사제) 등을 사용하는 해석하는 것으로 당해 cDNA의 염기서열을 결정할 수 있다.
결정한 염기서열로부터 H쇄 및 L쇄 V 영역의 전체 아미노산 서열을 추정하며 공지된 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 전체 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]와 비교함으로써 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 함유하는 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역이 완전한 아미노산 서열을 암호화하는지를 확인할 수 있다.
(3)사람 이외의 동물 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 해석
분비 시그널 서열을 함유하는 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역이 완전한 아미노산 서열에 관해서는 공지된 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 전체 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]와 비교함으로써 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있으며 또한 이들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, H쇄 및 L쇄 V 영역의 각 CDR의 아미노산 서열에 관해서도 공지된 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]와 비교함으로써 밝혀낼 수 있다.
(4)사람형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
상기 3(1)에 기재된 사람화 항체 발현용 벡터의 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역을 암호화하는 유전자의 상류에 사람 이외의 동물 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역을 암호화하는 cDNA를 클로닝하여 사람형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들면 사람 이외의 동물 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역를 암호화하는 cDNA를 사람 이외의 동물의 항나 H쇄 및 L쇄 V 영역의 3'말단 측의 염기서열과 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역의 5'말단 측의 염기서열을 포함하며 또한 적당한 제한효소의 인식서열을 양쪽 말단에 갖는 합성 DNA와 각각 연결하며 각각을 상기 3(1)에 기재된 사람화 항체 발현용 벡터의 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역을 암호화하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형으로 발현하도록 클로닝하여 사람형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(5)사람형 CDR 이식 항체의 V 영역를 암호화하는 cDNA의 구축
사람형 CDR 이식 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역을 암호화하는 cDNA는 하기와 같이 하여 구축할 수 있다. 우선, 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 CDR을 이식하는 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 프레임워크(이하, FR이라고 표기한다)의 아미노산 서열을 선택한다. 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 FR의 아미노산 서열로서는 사람 항체 유래의 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면 Protein Data Bank 등의 데이터 베이스에 등록된 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 FR의 아미노산 서열, 사람 항체의 H쇄 및 L쇄의 V 영역의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services; 1991] 등을 들 수 있지만 이중에서도 충분한 활성을 갖는 사람형 CDR 이식 항체를 작제하기 위해서는 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 FR의 아미노산 서열과 될 수 있는 한 높은 상동성(60% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
다음에 선택한 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 FR의 아미노산 서열에 목적하는 사람 이외의 동물 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 CDR의 아미노산 서열을 이식하여 사람형 CDR 이식 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기서열에서 보이는 코돈의 사용 빈도[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]를 고려하여 DNA 서열로 변환하여 사람형 CDR 이식 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 설계한다. 설계한 DNA 서열에 기초하며 10O염기 전후의 길이을 포함하는 수개의 합성 DNA를 합성하며 이들을 사용하여 PCR법을 실시한다. 이 경우, PCR에서의 반응효율 및 합성할 수 있는 DNA의 길이로부터 H쇄, L쇄 모두 6개의 합성 DNA를 설계하는 것이 바람직하다.
또한, 양쪽 말단에 위치하는 합성 DNA의 5'말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 도입하는 것으로 상기 3(1)에서 구축한 사람화 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR후, 증폭 산물을 pB1uescript SK(-)(Stratagene사제) 등의 플라스미드에 클로닝하여 상기 3(2)에 기재된 방법에 따라 염기서열을 결정하며 원하는 사람형 CDR 이식 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(6)사람형 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
상기 3(1)에 기재된 사람화 항체 발현용 벡터의 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역을 암호화하는 유전자의 상류에 상기 3(5)에서 구축한 사람형 CDR 이식 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역을 암호화하는 cDNA를 클로닝하여 사람형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들면 상기 3(5)에서 사람형 CDR 이식 항체의 H쇄 및 L쇄 V 영역을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중에서 양쪽 말단에 위치하는 합성 DNA의 5'말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 도입하는 것으로 본 항3의 (1)에 기재된 사람화 항체 발현용 벡터의 사람 항체의 H쇄 및 L쇄 C 영역을 암호화하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형으로 발현하도록 클로닝하여 사람형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(7)사람화 항체의 안정적 생산
상기 3(4) 및 (6)에 기재된 사람화 항체 발현 벡터를 적당한 동물세포에 도입함으로써 사람형 키메라 항체 및 사람형 CDR 이식 항체(이하, 아울러 사람화 항체라고 칭한다)를 안정적으로 생산하는 형질전환주를 수득할 수 있다.
동물세포로의 사람화 항체 발현 벡터의 도입법으로서는 전기천공법[일본 공개특허공보 제(평) 2-257891호; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)] 등을 들 수 있다.
사람화 항체 발현 벡터를 도입하는 동물세포로서는 사람화 항체를 생산시킬 수 있는 동물세포이면 어떠한 세포라도 사용할 수 있다.
구체적으로는 마우스 골수종 세포인 NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CH0/dhfr-세포, CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/0 세포, IR983F 세포, 시리안 햄스터 신장 유래인 BHK 세포, 사람골수종 세포인 나말바 세포 등을 들 수 있지만 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소 세포인 CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/0 세포, 5에 기재된 본 발명의 숙주세포 등을 들 수 있다.
사람화 항체 발현 벡터를 도입한 다음, 사람화 항체를 안정적으로 생산하는 형질전환주는 일본 공개특허공보 제(평) 2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라서 G418 sulfate(이하, G418이라고 표기한다; SIGMA사제) 등의 약제를 함유하는 동물세포 배양용 배지에 의해 선택할 수 있다. 동물세포 배양용 배지로서는 RPMI 1640 배지(닛스이세이야쿠사제), GIT 배지(니혼세이야쿠사제), EX-CELL 302 배지(JRH사제), IMDM 배지(GIBCO BRL사제), 하이브리도마-SFM 배지(GIBCO BRL사제), 또는 이들 배지에 소 태아 혈청(이하, FBS이라고 표기한다) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 수득된 형질전환주를 배지중에 배양하는 것으로 배양 상등액 중에 사람화 항체를 생산 축적시킬 수 있다. 배양 상등액 중의 사람화 항체의 생산량 및 항원 결합 활성은 효소 면역항체법[이하, ELISA법이라고 표기한다; 항체: 어·래보로토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998, 모노클로날 항체: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press LITMited, 1996] 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질전환주는 일본 공개특허공보 제(평) 2-257891호에 개시되어 있는 방법에 따라서 DHFR 유전자 증폭계 등을 이용하여 사람화 항체의 생산량을 상승시킬 수 있다.
사람화 항체는 형질전환주의 배양 상등액에서 프로테인A 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다[앤티보디즈: 어·래보로토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chaper 8, 1988, 모노클로날·앤티보티즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press LITMited, 1996]. 또한, 그외에 통상적으로 단백질의 정제에 사용되는 정제방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 겔 여과 이온교환 크로마토그래피 및 한외여과 등을 조합하여 실시하며 정제할 수 있다. 정제한 사람화 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동[이 하, SDS-PAGE라고 표기한다; 네이처(Nature), 227, 680(1970)]이나 웨스턴 블로팅법[앤티보디즈: 어·래보로토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988, 모노클로날·앤티보디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press LITMited, 1996] 등으로 측정할 수 있다.
이상, 동물세포를 숙주로 하는 항체 조성물의 제조방법을 기재했지만 상기한 바와 같이 효모, 곤충세포, 식물세포 또는 동물 개체 또는 식물 개체에서도 동물세포와 동일한 방법에 따라 항체 조성물을 제조할 수 있다.
이미 숙주세포가 항체 분자를 발현하는 능력을 갖는 경우에는 상기1.에 기재된 방법을 사용하여 항체 분자를 발현시키는 세포를 조제한 후에 당해 세포를 배양하며 당해 배양물로부터 목적하는 항체 조성물을 정제함으로써 본 발명의 항체 조성물을 제조할 수 있다.
4.항체 조성물의 활성평가
정제한 항체 조성물의 단백질량, 항원과의 결합 활성 또는 효능인자 기능을 측정하는 방법으로서는 모노클로날 앤티보디즈 또는 앤티보디 엔지니아링 등에 기재된 공지된 방법을 사용할 수 있다.
이의 구체적인 예로서는 항체 조성물이 사람화 항체의 경우, 항원과의 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성은 ELISA법 및 형광항체법[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immnunother.), 36, 373(1993)] 등에 의해 측정할 수 있다. 항원 양성 배양 세포주에 대한 세포 억제 활성은 CDC 활성, ADCC 활성 등을 측정함으로써 평가할 수 있다[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373(1993)].
또한, 항체 조성물의 사람에서의 안전성, 치료효과는 게 잡이 원숭이 등의 사람에게 비교적 가까운 동물종의 적당한 모델을 사용하여 평가할 수 있다.
5.각종 세포로 발현시킨 항체 분자의 당쇄의 분석
각종 세포로 발현시킨 항체 분자의 당쇄 구조는 통상적인 당 단백질의 당쇄 구조의 해석에 준하여 실시할 수 있다. 예를 들면 IgG 분자에 결합되어 있는 당쇄는 갈락토스, 만노스, 푸코스 등의 중성당, N-아세틸글루코사민 등의 아미노당, 시알산 등의 산성당으로 구성되어 있으며 당 조성분석 및 이차원 당쇄 맵법 등을 사용하는 당쇄 구조해석 등의 방법을 사용하여 실시할 수 있다.
(1)중성당·아미노당 조성분석
항체 분자의 당쇄의 조성분석은 트리플루오로아세트산 등으로 당쇄의 산 가수분해를 실시함으로써 중성당 또는 아미노당을 유리하여 이의 조성비를 분석할 수 있다.
구체적인 방법으로서 Dionex사제 당 조성 분석장치(BioLC)를 사용하는 방법을 들 수 있다. BioLC는 HPAEC-PAD(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)법[참조: 져널·오브·리퀴드·크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577(1983)]에 의해서 당 조성을 분석하는 장치이다.
또한, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지화법으로도 조성비를 분석할 수 있다. 구체적으로는 공지된 방법[어그리컬처럴·앤드·바이올로지컬·케미스트리(Agruc. Biol. Chem.), 55(1), 283-284(1991)]에 따라서 산 가수분해한 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 라벨화하며 HPLC 분석하여 조성비를 산출할 수 있다.
(2)당쇄 구조해석
항체 분자의 당쇄 구조해석은 2차원 당쇄 맵법[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 17l, 73(1988), 생물화학실험법23-당 단백질 당쇄연구법(각가이슛판센터) 다카하시레이코편(1989년)]에 의해 실시할 수 있다. 2차원 당쇄 맵법은 예를 들면 X축에는 역상 크로마토그래피 당쇄의 유지시간 또는 용출 위치, Y축에는 순상(順相) 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지시간 또는 용출 위치를 각각 플롯하며 공지 당쇄의 이들 결과와 비교함으로써 당쇄 구조를 추정하는 방법이다.
구체적으로는 항체를 하이드라진 분해하여 항체로부터 당쇄를 유리하며 2-아미노피리딘(이하, PA라고 약칭한다)에 의한 당쇄의 형광표지[져널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 95, 197(1984)]를 실시한 다음, 겔 여과에 의해 당쇄를 과잉의 PA화 시약 등과 분리하여 역상 크로마토그래피를 실시한다. 이어서 분취(분 取)한 당쇄의 각 피크에 관해서 순상 크로마토그래피를 실시한다. 이들 결과를 바탕으로 2차원 당쇄 맵 위에 플롯하고, 당쇄 표준물(Takara사제), 문헌[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 17l, 73(1988)]과의 스포트의 비교에서 당쇄 구조를 추정할 수 있다.
또한 각 당쇄의 MALDI-TOF-MS 등의 질량분석을 실시하여 2차원 당쇄 맵법에 따라 추정되는 구조를 확인할 수 있다.
6.항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 면역학적 정량방법
항체 조성물은 항체의 Fc 영역에 결합되는 당쇄 구조가 상이한 항체 분자로 구성되어 있다. 본 발명의 항체 조성물은 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상이며 높은 ADCC 활성을 나타내는 특징을 갖고 있다. 이러한 항체 조성물은 상기6.에 기재된 항체 분자의 당쇄 구조의 분석법을 사용함으로써 식별할 수 있다. 또한, 렉틴을 사용하는 면역학적 정량방법을 사용함으로써도 식별할 수 있다.
렉틴을 사용하는 면역학적 정량방법을 사용하는 항체 분자의 당쇄 구조의 식별은 문헌[모노클로날·앤티보티즈: 프린시플즈·앤드·어플리케이션즈(Monoclonal Antibodies: Principles and Application S), Wiley-Liss, Inc., (1995); 효소 면역측정법, 제3판, 의학서원(1987); 개정판, 효소항체법, 각쿠사이기가쿠(1985)] 등에 기재된 웨스턴 염색, RIA(방사선면역분석), VIA(비로면역분석), EIA(효소면역분석), FIA(형광면역분석), MIA(금속면역분석) 등의 면역학적 정량방법에 준해 예를 들면 하기와 같이 실시할 수 있다.
항체 조성물을 구성하는 항체 분자의 당쇄 구조를 인식하는 렉틴을 표지하여 표지한 렉틴과 시료인 항체 조성물을 반응시킨다. 다음에 표지한 렉틴과 항체 분자의 복합체의 양을 측정한다.
항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 데 사용하는 렉틴로서는 예를 들면 WGA(티. 불가리스 유래의 밀 씨앗 응집소), ConA(씨. 엔시포르미스 유래의 콘카나발린 A), RIC(알. 코뮤니스 유래의 독소), L-PHA(피. 불가리스 유래의 백혈 응집소), LCA(엘 쿨리나리스 유래의 렌즈콩 응집소, PSA(피. 사티붐 유래의 완두콩 렉틴), AAL(알레우리아 아우란티아 렉틴), ACL(아마란투스 카우다투스 렉틴),bpL(바우히니아 푸르푸레아(Bauhinia purpurea) 렉틴), DSL(다투라 스트라모늄(Datura stramonium) 렉틴), DBA(돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 응집소), EBL(딱총나무 렉틴), ECL(에리투리나 크리스타갈리(Erythrina cristagalli) 렉틴), EEL(유오니무스 유로파에우스(Euonymus europaeus) 렉틴), GNL(갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis) 렉틴), GSL(그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia simplicifolia) 렉틴), HPA(헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 응집소), HHL(히페아스트럼(Hippeastrum) 교배 렉틴), Jacalin, LTL(로투스 테트라고놀로버스 렉틴), LEL(리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 렉틴), MAL(마아키아아무렌시스(Maackiaamurensis) 렉틴), MPL(마클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴), NPL(나르시수스 슈도나르시수스(Narcissus pseudonarcissus) 렉틴), PNA(땅콩 응집소), E-PHA(파솔루스 불가리스 적혈 응집소), PTL(포스포카르푸스 테트라고놀로버스(Psophocarpus tetragonolobus) 렉틴), RCA(리시누스 코뮤누스(Ricinus communis) 응집소), STL(솔라눔 투버로섬(Solanum tuberosum) 렉틴), SJA(소포라 자포니카(Sophora Japonica) 응집소), SBA(콩 응집소), UEA(울렉스 유로파에우스(Ulex europaeus) 응집소), VVL(비시아 빌로사(Vicia villosa) 렉틴), WFA(비스테리아 플로리분다(Wisteria floribunda) 응집소)를 들 수 있다.
N-글루코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 렉틴을 사용하는 것이 바람직하며 이의 구체적인 예로서는 렌즈 콩 렉틴 LCA(렌즈 쿨리나리스 유래의 렌즈콩 응집소) 완두콩 렉틴 PSA(피숨 사티붐 유래의 완두콩 렉틴), 누에 콩 렉틴 VFA(비시아 파다(Vicia faba) 유래의 응집소), 진홍색 공기 대나무 렉틴 AAL(알레우리아 아우란티아 유래의 렉틴)을 들 수 있다.
7.본 발명의 항체 분자의 이용
본 발명의 항체 조성물은 높은 항체 의존성 세포 억제 활성을 갖는다. 높은 항체 의존성 세포 억제 활성을 갖는 항체는 암, 염증 질환, 자기면역 질환, 알레르기 등의 면역 질환, 순환기 질환, 또는 바이러스 또는 세균 감염을 비롯한 각종 질환의 예방 및 치료에서 유용하다.
암, 즉 악성 종양은 암 세포가 증식된다. 통상적인 항암제는 암 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. 그러나 높은 항체 의존성 세포 억제 활성을 갖는 항체는 살세포 효과에 의해 암 세포를 장애함으로써 암을 치료할 수 있기 때문에 통상적인 항암제보다도 치료약으로서 효과적이다. 특히 암의 치료약에서 현 상황에서는 항체 의약 단독의 항종양 효과는 불충분하며 화학요법과의 병용요법이 실시되고 있지만[사이언스(Science), 280, 1197, 1998] 본 발명의 항체 조성물 단독에서 보다 강한 항종양 효과가 확인되면 화학요법에 대한 의존도가 낮아지며 부작용이 감소한다.
염증 질환, 자기면역 질환, 알레르기 등의 면역 질환에서 이들 질환에서의 생체내 반응은 면역세포에 의한 메디에이터 분자의 방출에 의해 야기되므로 높은 항체 의존성 세포 억제 활성을 갖는 항체를 사용하여 면역세포를 제거함으로써 알레르기 반응을 억제할 수 있다.
순환기 질환로서는 동맥 경화 등을 들 수 있다. 동맥 경화는 현재 벌룬 카테테르에 의한 치료를 실시하지만 치료후의 재협착에서 동맥세포의 증식을 높은 항체 의존성 세포 억제 활성을 갖는 항체를 사용하여 억제하는 것으로 순환기 질환을 예방 및 치료할 수 있다.
바이러스 또는 세균에 감염된 세포를 높은 항체 의존성 세포 억제 활성을 갖는 항체를 사용하여 바이러스 또는 세균에 감염된 세포의 증식을 억제함으로써 바이러스 또는 세균 감염을 비롯한 각종 질환을 예방 및 치료할 수 있다.
종양 관련 항원을 인식하는 항체, 알레르기 또는 염증에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 순환기 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 또는 바이러스 또는 세균 감염에 관련되는 항원을 인식하는 항체의 구체적인 예를 하기에 기재한다.
종양 관련 항원을 인식하는 항체로서는 항 GD2 항체(Ohta et al., Anticancer Res., 13, 331-336, 1993), 항 GD3 항체(Ohta et al., Cancer Immunol. Immunother., 36, 260-266, 1993), 항 GM2 항체(Nakamura et al., Cancer Res., 54, 1511-1516, 1994), 항 HER2 항체(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992), 항 CD52 항체(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992), 항 MAGE 항체(Jungbluth et al., British J. Cancer, 83, 493-497, 2000), 항 HMl.24 항체(Ono et al.,molecular Immunol., 36, 387-395, 1999), 항부갑상선 호르몬 관련 단백질(PTHrP) 항체(Ogata et al., Cancer, 88, 2909-291l, 2000), 항염기성 섬유 아세포 증식인자 항체, 항 FGF8 항체(Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989), 항염기성 섬유 아세포 증식인자 수용체 항체, 항 FGF8 수용체 항체(Kuo et al., J. Biol. Chem., 265, 16455-16463, 1990), 항 인슐린성 증식인자 항체(Yao et al., J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995), 항 인슐린성 증식인자 수용체 항체(Yao et al., J. Neurosci. Res., 40, 647-659; 1995), 항 PMSA 항체(Murphy et al., J. Uro1ogy, 160, 2396-240l, 1998), 항혈관 내피 세포 증식인자 항체(Presta et al., Cancer Res., 57, 4593-4599, 1997), 항혈관 내피 세포 증식인자 수용체 항체(Kanno et al., 0ncogene, 19, 2138-2146, 2000) 등을 들 수 있다.
알레르기 또는 염증에 관련되는 항원을 인식하는 항체로서는 항인터류킨6 항체(Abrams et al., Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), 항인터류킨6 수용체 항체(Sato et al.,molecular Immunol., 3l, 371-38l, 1994), 항인터류킨5 항체(Abrams et al., Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), 항인터류킨5 수용체 항체, 항인터류킨4 항체(Bird et al., Cytokin E, 3, 562-567, 1991), 항인터류킨4 수용체 항체(Jung et al., J. Immunol. Meth., 217, 41-50, 1998), 항종양 괴사인자 항체(Tempest et al., 하이브리도마, 13, 183-190, 1994), 항종양 괴사인자 수용체 항체(Amrani et al.,molecular Pharmacol., 58, 237-245, 2000), 항 CCR4 항체(Campbell et al., Nature, 400, 776-780, 1999), 항 케모카인 항체(Peri et al., J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994) 또는 항 케모카인 수용체 항체(Wu et al., J. Exp. Med., 186, 1373-138l, 1997)이며 순환기 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체가 항 GpIIb/IIIa 항체(Co et al., J. Immunol., 152, 2968-2976, 1994), 항혈소판 유래 증식인자 항체(Ferns et al., Science, 253, 1129-1132, 1991), 항혈소판 유래 증식인자 수용체 항체(Shulman et al., J. Biol. Chem., 272, 17400-17404, 1997), 항혈액 응고인자 항체(Peter et al., Circulation, 10l, 1158-1164, 2000) 등을 들 수 있다.
바이러스 또는 세균 감염에 관련되는 항원을 인식하는 항체로서는 항 gp120 항체(Tugarinov et al., Structure, 8, 385-395, 2000), 항 CD4 항체(Schulze-Koops et al., J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998), 항 CCR4 항체, 항 베로 독소 항체(Karmali et al., J. CBam. Microbiol., 37, 396-399, 1999) 등을 들 수 있다.
상기 항체는 ATCC(The American Type Culture Collection), 이화학연구소 세포개발은행, 공업기술원 생명공업기술연구소(현: 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터) 등이 공적인 기관 또는 다이니혼세이야쿠가부시키가이샤, R＆D SYSTEMS사, PharMingen사, 코스모바이오사, 프나코시가부시키가이샤 등의 민간 시약 판매회사로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물을 함유하는 의약은 치료약으로서 단독으로 투여할 수 있지만 통상적으로는 약제학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하며 제제학의 기술분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 따라 제조한 의약 제 제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여경로는 치료할 때에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하며 경구투여 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구투여를 들 수 있으며 항체 제제의 경우, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여형태로서는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구투여에 적당한 제제로서는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 가루약, 과립제 등을 들 수 있다.
유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 기름류, p-하이드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 향미료, 페퍼민트 등의 향미료류 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.
캡슐제, 정제, 가루약, 과립제 등은 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형(賦形)제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 활석 등의 활택(滑澤)제, 폴리비닐알콜, 하이드록시프로필셀룰로스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.
비경구투여에 적당한 제제로서는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는 소금 용액, 포도당 용액 또는 양자의 혼합물을 포함하는 담체 등을 사용하여 조제된다. 또는 항체 조성물을 통상적인 방법에 따라서 동결 건조하며 여기에 염화나트륨을 가함으로써 분말 주사제를 조제할 수 있다.
좌제는 카카오 유지, 수소화 지방 또는 카복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다.
또한, 분무제는 당해 항체 조성물, 그 자체 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고 또한 당해 항체 조성물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 조제된다.
담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등이 예시된다. 당해 항체 조성물 및 사용하는 담체의 성질에 따라 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제로 할 수 있다. 또한, 이들 비경구제에서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는 목적하는 치료효과, 투여방법, 치료기간, 연령, 체중 등에 따라 상이하지만 유효성분의 양으로서 통상적으로 성인 1일당 10μg/kg 내지 20mg/kg이다.
또한, 항체 조성물의 각종 종양세포에 대한 항종양 효과를 검토하는 방법은 시험관내 실험로서는 CDC 활성 측정법, ADCC 활성 측정법 등을 들 수 있으며 인비보 실험로서는 마우스 등의 실험동물에서 종양계를 사용하는 항종양 실험 등을 들 수 있다.
CDC 활성, ADCC 활성, 항종양 실험은 문헌[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunology Immunotherapy), 36, 373(1993); 캔서·리서치(Cancer Research), 54, 1511(1994)] 등에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다.
하기의 실시예에 따라 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만 실시예는 본 발명의 단순한 예시를 기재하는 것에 불과하며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
도 1은 정제한 5종류의 항 GD3 키메라 항체의 SDS-PAGE(4 내지 15% 그레디언트 겔을 사용)의 전기영동 패턴을 도시하는 도면이다. 도 1A가 비환원 조건, 도 1B가 환원조건에서 전기영동을 실시한 도면이다. 레인1이 고분자량 마커, 2가 YB2/0-GD3 키메라 항체, 3이 CH0/DG44-GD3 키메라 항체, 4가 SP2/0-GD3 키메라 항체, 5가 NS0-GD3 키메라 항체(302), 6이 NS0-GD3 키메라 항체(GIT), 7이 저분자량 마커의 영동 패턴을 각각 도시한다.
도 2는 정제한 5종류의 항 GD3 키메라 항체의 GD3와의 결합 활성을 항체 농도를 변화시켜 측정한 도면이다. 종축은 GD3과의 결합 활성, 횡축은 항체 농도를 도시한다. ○가 YB2/0-GD3 키메라 항체, ●이 CH0/DG44-GD3 키메라 항체, □가 SP2/0-GD3 키메라 항체, ■가 NS0-GD3 키메라 항체(302), △가 NS0-GD3 키메라 항체(GIT)의 활성을 도시한다.
도 3은 정제한 5종류의 항 GD3 키메라 항체의 사람 멜라노머 세포주 G-361에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ○가 YB2/0-GD3 키메라 항체, ●이 CH0/DG44-GD3 키메라 항체, □가 SP2/0-GD3 키메라 항체, ■가 NS0-GD3 키메라 항체(302), △가 NS0-GD3 키메라 항체(GIT)의 활성을 각각 도시한다.
도 4는 정제한 3종류의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 SDS-PAGE(4 내지 15% 그레디언트 겔을 사용)의 전기영동 패턴을 도시하는 도면이다. 도 4A가 비환원 조건, 도 4B가 환원조건에서 전기영동을 실시한 도면이다. 레인1이 고분자량 마커, 2가 YB2/0-hIL-5R CDR 항체, 3이 CH0/d-hIL-5R CDR 항체, 4가 NS0-hIL-5R CDR 항체, 5가 저분자량 마커의 영동 패턴을 각각 도시한다.
도 5는 정제한 3종류의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 hIL-5Rα와의 결합 활성을 항체 농도를 변화시켜 측정한 결과를 도시하는 도면이다. 종축은 hIL-5Rα와의 결합 활성, 횡축은 항체 농도를 도시한다. ○이 YB2/0-hIL-5R CDR 항체, ●이 CH0/d-hIL-5R CDR 항체, □가 NSO-hIL-5R CDR 항체의 활성을 각각 도시한다.
도 6은 정제한 3종류의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 hIL-5R 발현 마우스 T 세포주 CTLL-2(h5R)에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ○이 YB2/0-hIL-5R CDR 항체, ●가 CHO/d-hIL-5R CDR 항체, □가 NSO-hIL-5R CDR 항체의 활성을 각각 도시한다.
도 7은 정제한 3종류의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 게 잡이 원숭이의 hIL-5 유발 호산구 증가 모델에 대한 억제작용을 도시하는 도면이다. 종축에 말초 혈중 호산구수, 횡축에 일수(항체 및 hIL-5의 투여 개시일을 0일로 한다)를 각각 도시한다. 10l, 102가 항체 비투여군, 30l, 302, 303이 YB2/0-hIL-5R CDR 항체 투여군, 40l, 402, 403이 CH0/d-hIL-5R CDR 항체 투여군, 50l, 502, 503이 NS0-hIL-5R CDR 항체 투여군의 결과를 도시한다.
도 8은 YB2/0이 생산한 정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체(도 8A) 및 NS0가 생산한 정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체(도 8B)의 PA화 당쇄의 역상 HPLC 용리의 용리도(좌도)와 이의 PA화 당쇄를 α-L-푸코시다제 처리한 후에 역상 HPLC에서 분석하여 수득한다(용리도(우도))를 도시한 것이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 도시한다.
도 9는 CHO/d 세포가 생산한 정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체로부터 PA화 당쇄를 조제하며 역상 HPLC에서 분석하여 수득한 용리도를 도시한 것이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 도시한다.
도 10에서 도 10A는 비흡착 분획, 흡착 분획의 일부의 GD3와의 결합 활성, 항체 농도를 변화시켜 측정한 도면이다. 종축은 GD3과의 결합 활성, 횡축은 항체 농도를 각각 도시한다. ●가 비흡착 분획, ○이 흡착 분획의 일부를 각각 도시한다. 도 10B는 비흡착 분획, 흡착 분획의 일부의 사람 멜라노머 세포주 G-361에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ●가 비흡착 분획, ○이 흡착 분획의 일부를 각각 도시한다.
도 11은 비흡착 분획, 흡착 분획의 일부에서 조제한 PA화 당쇄를 역상 HPLC에서 분석하여 수득한다(용리도를 도시하는 도면이다. 도 11A에 비흡착 분획의 용리도, 도 11B에 흡착 분획의 일부의 용리도를 각각 도시한다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 각각 도시한다.
도 12는 6종류의 항 GD3 키메라 항체(도 12A 내지 도 12F)에서 조제한 PA화 당쇄를 역상 HPLC에서 분석하여 수득한다(용리도를 도시하는 도면이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 각각 도시한다.
도 13은 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 6종류의 항 GD3 키메라 항체의 GD3에 대한 결합 활성을 항체 농도를 변화시켜 측정한 도면이다. 종축은 GD3과의 결합 활성, 횡축은 항체 농도를 각각 도시한다. ●가 항 GD3 키메라 항체에 (50%), □가 항 GD3 키메라 항체(45%), ■가 항 GD3 키메라 항체(29%),△가 항 GD3 키메라 항체(24%), ▲가 항 GD3 키메라 항체(13%), ×가 항 GD3 키메라 항체(7%)의 활성을 각각 도시한다.
도 14는 공여체A의 효능인자 세포를 사용한 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 6종류의 항 GD3 키메라 항체의 사람 멜라노머 세포주 G-361에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ●가 항 GD3 키메라 항체(50%), □가 항 GD3 키메라 항체(45%), ■가 항 GD3 키메라 항체(29%), △가 항 GD3 키메라 항체(24%), ▲가 항 GD3 키메라 항체(13%), ×가 항 GD3 키메라 항체(7%)의 활성을 각각 도시한다.
도 15는 공여체B의 효능인자 세포를 사용한 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 6종류의 항 GD3 키메라 항체의 사람 멜라노머 세포주 G-361에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ●가 항 GD3 키메라 항체(50%), □가 항 GD3 키메라 항체(45%), ■가 항 GD3 키메라 항체(29%), △가 항 GD3 키메라 항체(24%), ▲가 항 GD3 키메라 항체(13%), ×가 항 GD3 키메라 항체(7%)의 활성을 각각 도시한다.
도 16은 6종류의 항 CCR4 키메라 항체로부터 조제한 PA화 당쇄를 역상 HPLC에서 분석하여 수득한 용리도를 도시한 것이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 각각 도시한다.
도 17은 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 6종류의 항 CCR4 키메라 항체의 CCR4에 대한 결합 활성을 항체 농도를 변화시켜 측정한 도면이다. 종축은 CCR4와의 결합 활성, 횡축은 항체 농도를 각각 도시한다. ■가 항 CCR4 키메라 항체(46%), □가 항 CCR4 키메라 항체(39%), ▲가 항 CCR4 키메라 항체(27%), △가 항 CCR4 키메라 항체(18%), ●가 항 CCR4 키메라 항체(9%), ○이 항 CCR4 키메라 항체(8%)의 활성을 각각 도시한다.
도 18은 공여체A의 효능인자 세포를 사용한 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 항 CCR4 키메라 항체의 CCR4/EL-4 세포에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ■가 항 CCR4 키메라 항체(46%), □가 항 CCR4 키메라 항체(39%), ▲가 항 CCR4 키메라 항체(27%), △가 항 CCR4 키메라 항체(18%), ●가 항 CCR4 키메라 항체(9%), ○이 항 CCR4 키메라 항체(8%)의 활성을 각각 도시한다. 또한, 도 18A는 공여체A, 18도는 공여체B의 효능인자 세포를 사용한 결과를 도시한다.
도 19는 공여체B의 효능인자 세포를 사용한 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 항 CCR4 키메라 항체의 CCR4/EL-4 세포에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ■가 항 CCR4 키메라 항체(46%), □가 항 CCR4 키메라 항체(39%), ▲가 항 CCR4 키메 라 항체(27%), △가 항 CCR4 키메라 항체(18%), ●가 항 CCR4 키메라 항체(9%), ○이 항 CCR4 키메라 항체(8%)의 활성을 각각 도시한다.
도 20은 플라스미드 CHFT8-pCR2.l 및 YBFT8-pCR2.l의 구축을 도시하는 도면이다.
도 21은 플라스미드 CHAc-pBS 및 YBAc-pBS의 구축을 도시하는 도면이다.
도 22는 플라스미드 CHFT8d-pCR2.l 및 YBFT8d-pCR2.l의 구축을 도시하는 도면이다.
도 23은 플라스미드 CHAcd-pBS 및 YBAcd-pBS의 구축을 도시하는 도면이다.
도 24는 경합적 RT-PCR법을 사용하는 각 숙주세포주에서의 FUT8 전사 산물량의 정량 결과를 도시하는 도면이다. 래트 FUT8 서열을 표준물, 내부 대조군에 사용하는 경우에 각 숙주세포주에서의 FUT8 전사 산물의 양을 도시한다. ■가 CHO 세포주, □가 YB2/0 세포주를 숙주세포로서 사용한 결과를 도시한다.
도 25는 플라스미드 mfFUT8-pCR2.1의 구축을 도시하는 도면이다.
도 26은 플라스미드 pBSmfFUT8의 구축을 도시하는 도면이다.
도 27은 플라스미드 pAGEmfFUT8의 구축을 도시하는 도면이다.
도 28은 경합적 RT-PCR법을 사용하는 FUT8 유전자 과잉 발현주의 당해 유전자 발현량 해석결과를 도시하는 도면이다. 종축에 β-액틴 전사성에 대한 FUT8 전사량의 상대치를 도시한다.
도 29는 FUT8 유전자 과잉 발현주에서 정제한 항 GD3 키메라 항체의 사람 멜라노머 세포주 G-361에 대한 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 도시한다.
도 30은 mfFUT8-6, pAGE249 도입주에 의해서 생성된 항체로부터 조제한 PA화 당쇄를 각각 역상 HPLC에서 분석하여 수득한 용리도를 도시한 것이다. 30A도에 mfFUT8-6주에 의해서 생성된 항체로부터 조제한 PA화 당쇄, 30B도에 pAGE249 도입주에 의해서 생성된 항체로부터 조제한 PA화 당쇄의 용리도를 도시한다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 도시한다.
도 31은 하세프틴에서 조제한 PA화 당쇄, 역상 HPLC에서 분석하여 수득한 용리도를 도시한 것이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 도시한다.
도 32는 플라스미드 CHfFUT8-pCR2.1의 구축을 도시하는 도면이다.
도 33은 플라스미드 ploxPPuro의 구축을 도시하는 도면이다.
도 34는 플라스미드 pK0FUT8gE2-1의 구축을 도시하는 도면이다.
도 35는 플라스미드 pK0FUT8gE2-2의 구축을 도시하는 도면이다.
도 36는 플라스미드 pscFUT8gE2-3의 구축을 도시하는 도면이다.
도 37은 플라스미드 pK0FUT8gE2-3의 구축을 도시하는 도면이다.
도 38은 플라스미드 pK0FUT8gE2-4의 구축을 도시하는 도면이다.
도 39는 플라스미드 pKOFUT8gE2-5의 구축을 도시하는 도면이다.
도 40은 플라스미드 pKOFUT8Puro의 구축을 도시하는 도면이다.
도 41은 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 파괴 CHO 세포주인 1st. △FUT8 2-46-1주 및 1st. △FUT8 2-46주의 게놈 서던 해석결과를 도시하는 도면이다.
도 42는 FUT8 대립 유전자 파괴주에서 정제한 항 CCR4 키메라 항체의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. ▲, ■은 각각, 항 CCR4 키메라 항체 생성 CHO 세포 5-03주 유래의 정제 항체 및 1st. △FUT8 2-46-1주 유래의 정제 항체의 활성을 각각 도시한다.
도 43은 렉틴 내성주가 생산한 항 CCR4 사람형 키메라 항체의 ADCC 활성을 평가한 결과를 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. □는 5-03주, ■는 CH0/CCR4-LCA주, ◆는 CH0/CCR4-AAL주, ▲은 CH0/CCR4-PHA주가 생산한 항체의 활성을 도시한다.
도 44는 렉틴 내성주가 생산한 항 CCR4 사람형 키메라 항체의 ADCC 활성을 평가한 결과를 도시한 것이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다. □는 YB2/0주(KM2760 #58-35-16), △는 5-03주, ●는 CH0/CCR4-LCA주가 생산한 항체의 활성을 각각 도시한다.
도 45는 정제한 항 CCR4 사람형 키메라 항체로부터 조제한 PA 화당쇄를 역상 HPLC에서 분석하여 수득한다(용리도를 도시하는 도면이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 각각 도시한다. 도 45A는 5-03주가 생산하는 항체, 도 45B는 CH0/CCR4-LCA주가 생산하는 항체, 도 45C는 CH0/CCR4-AAL주가 생산하는 항체 및 45D도는 CH0/CCR4-PHA주가 생산한 항체의 분석결과를 도시한다.
도 46은 CH0 세포 유래 GMD의 발현 벡터 구축(전체 6공정)의 제1의 공정을 도시하는 도면이다.
도 47은 CHO 세포 유래 GMD의 발현 벡터 구축(전체 6공정)의 제2의 공정을 도시하는 도면이다.
도 48은 CHO 세포 유래 GMD의 발현 벡터 구축(전체 6공정)의 제3의 공정을 도시하는 도면이다.
도 49는 CHO 세포 유래 GMD의 발현 벡터 구축(전체 6공정)의 제4의 공정을 도시하는 도면이다.
도 50은 CHO 세포 유래 GMD의 발현 벡터 구축(전체 6공정)의 제5의 공정을 도시하는 도면이다.
도 51은 CHO 세포 유래 GMD의 발현 벡터 구축(전체 6공정)의 제6의 공정을 도시하는 도면이다.
도 52는 GMD를 발현시킨 CH0/CCR4-LCA주의 LCA 렉틴에 대한 내성도를 도시하는 도면이다. LCA 렉틴를 첨가하지 않고 배양한 세포군의 생존율을 100%로 하여 2회 측정을 한 도면이다. 도면중의 249는 발현 벡터 pAGEZ49를 도입한 CH0/CCR4-LCA주의 LCA 렉틴에 대한 생존율을 도시한다. GMD는 GMD 발현 벡터 pAGE249GMD를 도입한 CHO/CCR4-LCA주의 LCA 렉틴에 대한 내성도를 도시한다.
도 53은 GMD를 발현시킨 CHO/CCR4-LCA주의 세포군이 생산한 항 CCR4 키메라 항체의 ADCC 활성을 도시하는 도면이다. 종축에 세포 억제 활성, 횡축에 항체 농도를 각각 도시한다.
도 54는 CHO 세포 유래의 GMD cDNA 클론 22-8의 5' 말단에 클론 34-2의 5' 말단을 도입한 플라스미드 CHO-GMD의 작제공정을 도시하는 도면이다.
도 55는 GMD 유전자를 발현시킨 CHO/CCR4-LCA주에서 정제한 항 CCR4 키메라 항체로부터 조제한 PA화 당쇄를 역상 HPLC에서 분석하여 수득한다(용리도를 도시하 는 도면이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 도시한다.
실시예 1. 항암 글리오시드 GD3 사람형 키메라 항체의 작제
1.항암 글리오시드 GD3 사람형 키메라 항체의 탄뎀형 발현 벡터 pChiLHGM4의 구축
항암 글리오시드 GD3 사람형 키메라 항체(이하, 항 GD3 키메라 항체로 표기한다)의 L쇄의 발현 벡터 pChi641LGM4[져널·오브·이뮤놀로지컬·메소드(J. Immunol. Methods), 167, 271(1994)]를 제한효소 MluI(다카라슈조사제)와 SalI(다카라슈조사제)로 절단하여 수득되는 L쇄 cDNA를 함유하는 약 4.03kb의 단편과 동물세포용 발현 벡터 pAGEl07[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]을 제한효소 MluI(다카라슈조사제)와 SalI(다카라슈조사제)로 절단하여 수득되는 G418 내성 유전자 및 스프라이싱 시그널을 함유하는 약 3.40kb의 단편을 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 연결하고 대장균 HB 101주[몰레큘러·클로닝: 어·래보러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989]를 형질전환하여 플라스미드 pChi641LGM40을 구축한다.
다음에 상기에서 구축한 플라스미드 pChi641LGM40을 제한효소 ClaI(다카라슈조사제)로 절단한 다음, DNA 평활 절단 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 평활 말단화하며 다시 MluI(다카라슈조사제)로 절단하여 수득되는 L쇄 cDNA를 함유하는 약 5.68kb의 단편과 항 GD3 키메라 항체의 H쇄의 발현 벡터 pChi641HGM4[져널·오브·이뮤놀로지컬·메소드(J. Immunol. Methods), 167, 271(1994)]를 제한효소 XhoI(다카라슈조사제)로 절단한 다음, DNA 평활 절단 키트(다카라슈조사제}를 사용하여 평활 말단화하며 다시 MluI(다카라슈조사제)로 절단하여 수득되는 H쇄 cDNA를 함유하는 약 8.40kb의 단편을 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 연결하고 대장균 HB 101주[몰레큘러·클로닝: 어·래보러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989]를 형질전환하여 항 GD3 키메라 항체의 탄뎀형 발현 벡터 pChi641LHGM4를 구축한다.
2.항 GD3 키메라 항체의 안정 생산세포의 작제
실시예 1의 1항에서 구축한 항 GD3 키메라 항체의 탠덤형 발현 벡터 pChi641LHGM4를 각종 세포주에 도입하여 우량주를 선택하는 것으로 항 GD3 키메라 항체의 안정 생산세포를 아래와 같이 작제한다.
(1)래트 골수종 YB2/0 세포를 사용한 생산세포의 작제
항 GD3 키메라 항체 발현 벡터 pChi641LHGM4의 5μg을 4×106 세포의 래트 골수종 YB2/0 세포[ATCC CRL-1662, J.V. Kilmarin et al., J. Cell. Bio1. 93, 576-582(l982)] 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]에 의해 도입한 다음, 40ml의 RPMI 1640-FBS(10)[FBS(GIBC0 BRL사제)를 10% 함유하는 RPMI 1640 배지]에 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(스미토모 베크라이트사제)에 200μl/웰씩 분주(분 注)한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, G418을 0.5mg/ml로 되도록 첨가하여 1 내지 2주 동안 배양한다. G418 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니가 출현하며 증식이 확인되는 웰에서 배양 상등액을 회수하며 상등액 중의 항 GD3 키메라 항체의 항원 결합 활성을 실시예 1의 3항의 ELISA법에 따라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 GD3 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시킬 목적으로 G418을 0.5mg/ml, DHFR의 억제제인 메소트렉세이트(이하, MTX라고 표기한다; SIGMA사제)를 50nM 함유하는 RPMI 1640-FBS(10) 배지에 1 내지 2×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 24웰 플레이트(Greiner사제)에 2ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃로 1 내지 2주 동안 배양하여 50nM MTX 내성을 나타내는 형질전환주를 유도한다. 형질전환주의 증식이 확인되는 웰의 배양 상등액 중의 항 GD3 키메라 항체의 항원 결합 활성을 실시예 1의 3항의 ELISA법에 따라 측정한다. 배양 상등액 중에 항 GD3 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 상기와 동일한 방법에 따라 MTX 농도를 100nM, 200nM으로 순차적으로 상승시키고 최종적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 200nM의 농도로 함유하는 RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 증식할 수 있으며 또한, 항 GD3 키메라 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 중에서 우량주를 선택하며 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화(클론화)를 실시한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 선택하여 사용한다.
이와 같이 수득되는 항 GD3 키메라 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론 7- 9-51은 평성11년 4월5일부로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고) (현·독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터(이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 쥬오 제6))에 FERM BP-6691로서 기탁되어 있다.
(2)CH0/DG44-세포를 사용하는 생산세포의 작제
항 GD3 키메라 항체 발현 벡터 pChi641LHGM4의 4μg을 1.6×106 세포의 CHO/DG44 세포[G. Urlaub and L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220(1980)]에 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]에 의해 도입한 다음, 10ml의 IMDM-FBS(10)[FBS를 10%, HT 보충액(GIBCO BRL사제)를 1배 농도로 함유하는 IMDM 배지]에 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(이와키가라스사제)에 200μl/웰씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, G418을 0.5mg/ml로 되도록 첨가하여 1 내지 2주 동안 배양한다. G418 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니가 출현하며 증식이 확인되는 웰에서 배양 상등액을 회수하며 상등액 중의 항 GD3 키메라 항체의 항원 결합 활성을 실시예 1의 3항의 ELISA법에 따라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 GD3 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 대해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시킬 목적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 10nM 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지[투석 소 태아 혈청(이하, dFBS라고 표기한다; GIBCO BRL사제)를 10% 함유하는 IMDM 배지]에 1 내지 2×105 세포/ml로 되도록 현탁하고 24웰 플레이트(이와키가라스사제)에 0.5ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 1 내지 2주 동안 배양하여 10nM MTX 내성을 나타내는 형질전환주를 유도한다. 증식이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 상기와 동일한 방법에 따라 MTX 농도를 100nM으로 상승시키고, 최종적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 100nM의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에서 증식할 수 있으며 또한, 항 GD3 키메라 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 중에서 우량주를 선택하며 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화(클론화)를 실시한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 선택하여 사용한다.
(3)마우스 골수종 NSO 세포를 사용하는 생산세포의 작제
항 GD3 키메라 항체 발현 벡터 pChi641LHGM4의 5μg을 4×106 세포의 마우스 골수종 NSO 세포에 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133, 1990]에 의해 도입한 다음, 40ml의 EX-CELL302-FBS(10)[FBS를 10%, L-글루타민(이하, L-Gln이라고 표기한다; GIBCO BRL사제)를 2mM 함유하는 EX-CELL302 배지]에 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(스미토모베크라이트사제)에 200μl/웰씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, G418을 0.5mg/ml로 되도록 첨가하여 1 내지 2주 동안 배양한다. G418 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니가 출현하며 증식이 확인되는 웰에서 배양 상등액을 회수하며 상등액 중의 항 GD3 키 메라 항체의 항원 결합 활성을 실시예 1의 3항의 ELISA법에 따라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 GD3 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시킬 목적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 50nM 함유하는 EX-CELL302-dFBS(10) 배지(dFBS를 10%, L-Gln을 2mM 함유하는 EX-CELL302 배지)에 1 내지 2×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 24웰 플레이트(Greiner사제)에 2ml씩 분주한다. 5% CO2 인큐베이터 속에서 37℃로 1 내지 2주 동안 배양하여 50nM MTX 내성을 나타내는 형질전환주를 유도한다. 형질전환주의 증식이 확인되는 웰의 배양 상등액 중의 항 GD3 키메라 항체의 항원 결합 활성을 실시예 1의 3항의 ELISA법에 따라 측정한다. 배양 상등액 중에 항 GD3 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 상기와 동일한 방법에 따라 MTX 농도를 100nM, 200nM으로 순차적으로 상승시켜 최종적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 200nM의 농도로 함유하는 EX-CELL302-dFBS(10) 배지에서 증식할 수 있으며 또한, 항 GD3 키메라 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 중에서 우량주를 선택하며 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화(클론화)를 실시한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 선택하여 사용한다.
3.항체의 GD3에 대한 결합 활성의 측정(ELISA법)
항체의 GD3에 대한 결합 활성은 하기와 같이 하여 측정한다.
4nmol의 GD3을 10μg의 디팔미토일포스파티딜콜린(SIGMA사제)와 5μg의 콜레스테롤(SIGMA사제)를 함유하는 2ml의 에탄올 용액에 용해한다. 당해 용액의 20μl(40pmol/웰로 된다)를 96웰의 ELISA용의 플레이트(Greiner사제)의 각 웰에 각각 분주하며 바람으로 건조한 후, 1% 소 혈청 알부민(이하, BSA이라고 표기한다; SIGMA사제)를 함유하는 PBS(이하, 1% BSA-PBS라고 표기한다)를 100μl/웰로 가하며 실온에서 1시간 동안 반응시켜 잔존하는 활성기를 블록한다. 1% BSA-PBS를 버리고 형질전환주의 배양 상등액 또는 정제한 사람형 키메라 항체의 각종 희석 용액을 50μl/웰로 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 각 웰을 0.05% Tween20(와코쥰야쿠사제)를 함유하는 PBS(이하, Tween-PBS라고 표기한다)에서 세정한 다음, 1% BSA-PBS에서 3000배로 희석한 퍼옥시다제 표지 염소 항 사람 IgG(H＆L) 항체 용액(American Qualex사제)를 2차 항체 용액으로서 50μl/웰로 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, Tween-PBS에서 세정한 다음, ABTS 기질액[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)암모늄의 0.55g을 1L의 0.1M 시트르산 완충액(pH 4.2)에 용해하여 사용 직전에 과산화수소를 1μl/ml로 첨가한 용액(이하, 동일)]을 50μl/웰로 가하여 발색시켜 415nm의 흡광도(이하, OD415라고 표기한다)를 측정한다.
4.항 GD3 키메라 항체의 정제
(1) YB2/O 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 1의 2항(1)에서 수득되는 항 GD3 키메라 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론을 BSA를 0.2%, MTX를 200nM, 트리요오도티로닌(이하, T3이라고 표기한다; SIGMA사제)를 100nM의 농도로 함유하는 하이브리도마-SFM 배지에 3×105 세포/ml로 되도록 현탁하고 2.0L 스피너 보틀(이와키가라스사제)를 사용하여 50rpm의 속도로 교반 배양한다. 37℃의 항온실 내에서 10일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 Prosep-A(Bioprocessing사제) 칼럼을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 항 GD3 키메라 항체를 정제한다. 정제한 항 GD3 키메라 항체는 YB2/0-GD3 키메라 항체라고 명명한다.
(2)CH0/DG44 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 1의 2항(2)에서 수득되는 항 GD3 키메라 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론을 L-Gln을 3mM, 지방산 농축액(이하, CDLC라고 표기한다; GIBCO BRL사제)를 0.5%, 플루로닉 F68(이하, PF68이라고 표기한다; GIBCO BRL사제)를 0.3%의 농도로 함유하는 EX-CELL302 배지에 1×106 세포/ml로 되도록 현탁하며 175mm2 플라스크(Greiner사제)에 50ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 4일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 Prosep-A(Bioprocessing사제) 칼럼을 사용하며 첨부된 설명서에 따라서 항 GD3 키메라 항체를 정제한다. 정제한 항 GD3 키메라 항체는 CHO/DG44-GD3 키메라 항체라고 명명한다.
(3)NSO 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 1의 2항(3)에서 수득되는 항 GD3 키메라 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론을 L-Gln을 2mM, G418을 0.5mg/ml, MTX를 200nM, FBS를 1%의 농도로 함유 하는 EX-CELL3O2 배지에 1×106 세포/ml로 되도록 현탁하며 175mm2 플라스크(Greiner사제)에 200ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃로 4일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 Prosep-A(Bioprocessing사제) 칼럼을 사용하며 첨부된 설명서에 따라서 항 GD3 키메라 항체를 정제한다. 정제한 항 GD3 키메라 항체는 NSO-GD3 키메라 항체(302)라고 명명한다.
또한, 당해 형질전환 세포 클론을 G418을 O.5mg/ml, MTX를 20OnM의 농도로 함유하는 GIT 배지에 3×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 175mm2 플라스크(Greiner사제)에 200ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 10일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 Prosep-A(Bioprocessing사제) 칼럼을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 항 GD3 키메라 항체를 정제한다. 정제한 항 GD3 키메라 항체는 NS0-GD3 키메라 항체(GIT)라고 명명한다.
(4)SP2/0 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
일본 공개특허공보 제(평) 5-304989호(EP533199)에 기재된 항 GD3 키메라 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론(KM-871(FERM BP-3512))를 G418을 0.5mg/ml, MTX를 200nM의 농도로 함유하는 GIT 배지에 3×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 175mm2 플라스크(Greiner사제)에 200ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 8일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 Prosep- A(Bioprocessing사제) 칼럼을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 항 GD3 키메라 항체를 정제한다. 정제한 항 GD3 키메라 항체는 SP2/0-GD3 키메라 항체라고 명명한다.
5.정제한 항 GD3 키메라 항체의 해석
실시예 1의 4항에서 수득된 각종 동물세포로 생산, 정제한 5종류의 항 GD3 키메라 항체의 각 4μg을 공지된 방법[네이처(Nature), 227, 680, 1970]에 따라서 SDS-PAGE하여 분자량 및 정제도를 해석한다. 그 결과를 도 1에 도시한다. 도 1에 도시한 바와 같이 정제한 각 항 GD3 키메라 항체는 어떤 것도 비환원 조건하에서는 분자량이 약 150킬로달톤(이하,Kd라고 표기한다)의 단일한 밴드가 환원 조건하에서는 약 50Kd와 약 25Kd의 2개의 밴드가 확인된다. 이들의 분자량은 항체의 H쇄 및 L쇄의 cDNA의 염기서열로부터 추정되는 분자량(H쇄: 약 49Kd, L쇄: 약 23Kd, 분자 전체: 약 144Kd)과 거의 일치하며 또한, IgG형의 항체는 비환원 조건하에서는 분자량은 약 150Kd이며 환원 조건하에서는 분자내의 디설파이드 결합(이하, S-S 결합이라고 표기한다)이 절단되며 약 50Kd의 분자량을 가지는 H쇄와 약 25Kd의 분자량을 가지는 L쇄로 분해된다는 보고[앤티보디즈: 어·래보로토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988, 모노클로날·앤티보디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press LITMited, 1996]와 일치하며 각 항 GD3 키메라 항체가 옳은 구조의 항체 분자로서 발현되며 또한 정제되는 것이 확인된다.
실시예 2.항 GD3 키메라 항체의 활성평가
1.항 GD3 키메라 항체의 GD3에 대한 결합 활성(ELISA법)
실시예 1의 4항에서 수득된 5종류의 정제 항 GD3 키메라 항체의 GD3(유키지루시뉴교사제)에 대한 결합 활성을 실시예 1의 3항의 ELISA법에 따라 측정한다. 도 2는 첨가하는 항 GD3 키메라 항체의 농도를 변화시켜 결합 활성을 검토한 결과이다. 도 2에 도시한 바와 같이 5종류의 항 GD3 키메라 항체는 거의 동등한 GD3에 대한 결합 활성을 나타낸다. 이 결과는 항체의 항원 결합 활성은 항체를 생산하는 동물세포와 이의 배양방법에 관계없이 일정함을 나타내고 있다. 또한, NS0-GD3 키메라 항체(302)와 NSO-GD3 키메라 항체(GIT)의 비교로부터 항원 결합 활성은 배양에 사용되는 배지에도 의존하지 않으며 일정한 것으로 시사된다.
2.항 GD3 키메라 항체의 시험관내 세포 억제 활성(ADCC 활성)
실시예 1의 4항에서 수득된 5종류의 정제 항 GD3 키메라 항체의 시험관내 세포 억제 활성을 평가하기 위해 하기 방법에 따라서 ADCC 활성을 측정한다.
(1)표적 세포 용액의 조제
RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 배양한 사람 멜라노머 배양 세포주 G-361(ATCC CRL1424)의 1×106 세포를 조제하고 방사성 물질인 Na2 51cr04를 3.7MBq 당량 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 세포를 방사선 표지한다. 반응시킨 다음, RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 현탁 및 원심분리 조작에 의해 3회 세정하여 배지에 재현탁하며 4℃에서 30분 동안 얼음중에 방치하여 방사성 물질을 자연 해리시킨다. 원심분리후, RPMI 1640-FBS(10) 배지를 5ml 가하여 2×105 세포/ml로 조제하며 표적 세 포 용액으로 한다.
(2)효능인자 세포 용액의 조제
건강한 사람 정맥피 50ml를 채취하고, 헤파린나트륨(다케다야쿠힝사제) 0.5ml를 가하고 조심스럽게 혼합한다. 이것을 림포프렙(Lymphoprep)(Nycomed Pharma AS사제)을 사용하여 사용 설명서에 따라서 원심분리하여 단핵구층을 분리한다. RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 3회 원심분리하여 세정한 다음, 배지를 사용하여 2×106 세포/ml의 농도로 재현탁하며 효능인자 세포 용액으로 한다.
(3)ADCC 활성의 측정
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사제)의 각 웰에 상기(1)에서 조제한 표적 세포 용액의 50μl(1×104 세포/웰)를 분주한다. 이어서 (2)에서 조제한 효능인자 세포 용액을 100μl(2×105 세포/웰, 효능인자 세포와 표적 세포의 비는 20:1로 된다) 첨가한다. 또한, 각종 항 GD3 키메라 항체를 각 최종 농도 0.0025 내지 2.5μg/ml로 되도록 가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 플레이트를 원심분리하며 상등액의 51Cr 양을 γ-카운터로써 측정한다. 자연 해리 51Cr 양은 효능인자 세포 용액, 항체 용액 대신에 배지만을 사용하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. 전체 해리 51Cr 양은 항체 용액 대신에 배지만을 효능인자 세포 용액 대신에 1규정 염산을 첨가하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. ADCC 활성은 하기 수학식 II에 의해 구한다.
Figure 112003012058801-pct00002
그 결과를 도 3에 도시한다. 도 3에 도시한 바와 같이 5종류의 항 GD3 키메라 항체중에서 YB2/0-GD3 키메라 항체가 가장 높은 ADCC 활성을 나타내며 이어서 SP2/0-GD3 키메라 항체, NS0-GD3 키메라 항체, CHO-GD3 키메라 항체의 순서로 높은 ADCC 활성을 나타낸다. 배양에 사용하는 배지의 상이한 NS0-GD3 키메라 항체(302)와 NS0-GD3 키메라 항체(GIT)에서는 이들의 ADCC 활성에 차이는 확인되지 않는다. 이상의 결과는 항체의 ADCC 활성은 생산에 사용되는 동물세포에 의해서 크게 다른 것을 기재하고 있다. 이의 메커니즘로서는 항원 결합 활성이 동등하므로 항체의 Fc 영역의 구조의 차이에 기인하는 것으로 추정된다.
실시예 3.항 사람 인터류킨 5 수용체 α쇄 사람형 CDR 이식 항체의 작제
1.항 사람 인터류킨5 수용체 α쇄 사람형 CDR 이식 항체의 안정 생산세포의 작제
(1)래트 골수종 YB2/0 세포를 사용하는 생산세포의 작제
WO 97/l0354에 기재된 항 사람 인터류킨 5 수용체 α쇄 사람형 CDR 이식 항체(이하, 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체라고 표기한다)의 발현 벡터 pKANTEX1259HV3LV0를 각종 세포주에 도입하며 우량주를 선택하는 것으로 항 hIL-5R α CDR 이식 항체의 안정 생산세포를 하기와 같이 하여 작제한다.
항 hIL-5Rα CDR 이식 항체 발현 벡터 pKANTEX1259HV3LV0의 5μg을 4×106 세포의 래트 골수종 YB2/0 세포에 전기천공법[사이토테크놀로지 (Cytotechnology), 3, 133, 1990]에 의해 도입한 다음, 40ml의 RPMI 1640-FBS(10)에 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(스미토모베크라이트사제)에 200μl/웰씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, G418을 0.5mg/ml로 되도록 첨가하여 1 내지 2주 동안 배양한다. G418 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니가 출현하며 증식이 확인되는 웰에서 배양 상등액을 회수하며 상등액 중의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 항원 결합 활성을 실시예 3의 2항의 ELISA법에 따라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시킬 목적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 50nM 함유하는 RPMI 1640-FBS(10) 배지에 1 내지 2×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 24웰 플레이트(Greiner사제)에 2ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃로 1 내지 2주 동안 배양하여 50nM MTX 내성을 나타내는 형질전환주를 유도한다. 형질전환주의 증식이 확인되는 웰의 배양 상등액 중의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 항원 결합 활성을 실시예 3의 2항의 ELISA법에 따라 측정한다. 배양 상등액 중에 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 상기와 동일한 방법에 따라 MTX 농도를 100nM, 200nM으로 순 차적으로 상승시키고 최종적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 200nM의 농도로 함유하는 RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 증식할 수 있으며 또한, 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 중에서 우량주를 선택하며 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화(클론화)를 실시한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 선택하여 사용한다. 이와 같이 하여 수득되는 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론 No.3는 평성11년 4월5일부로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반 3고) (현·독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터(이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 쥬오 제6))에 FERM BP-6690으로서 기탁되어 있다.
(2)CH0/dhfr-세포를 사용하는 생산세포의 작제
WO 97/l0354에 기재된 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체 발현 벡터 pKANTEX1259HV3LV0의 4μg을 1.6×106 세포의 CHO/dhfr-세포에 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]에 의해 도입한 다음, 10ml의 IMDM-FBS(10)에 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(이와키가라스사제)에 200μl/웰씩 분주한다. 5% CO2 인큐베이터 안에서 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, G418을 0.5mg/ml로 되도록 첨가하여 1 내지 2주 동안 배양한다. G418 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니가 출현하며 증식이 확인되는 웰에서 배양 상등액을 회수하며 상등액 중의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 항원 결합 활성을 실시예 3의 2항의 ELISA법에 따 라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시킬 목적으로 G418을 O.5mg/ml, MTX를 10nM 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에 1 내지 2x105 세포/ml로 되도록 현탁하고 24웰 플레이트(이와키가라스사제)에 0.5ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 1 내지 2주 동안 배양하여 10nM MTX 내성을 나타내는 형질전환주를 유도한다. 증식이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 상기와 동일한 방법에 따라 MTX 농도를 100nM, 500nM으로 상승시키고 최종적으로 G418을 0.5mg/ml, MTX를 500nM의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에서 증식할 수 있으며 또한, 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 중에서 우량주를 선택하며 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화(클론화)를 실시한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜즈페라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 선택하여 사용한다.
(3)마우스 골수종 NSO 세포를 사용하는 생산세포의 작제
야란톤(Yarranton) 등의 방법[바이오/테크놀로지(BIO/TEChnolOGY), 10, 169(1992)]에 따라서 WO 97/l0354에 기재된 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체 발현 벡터 pKANTEX1259HV3LV0 위의 항체 H쇄 및 L쇄 cDNA를 사용하여 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체 발현 벡터를 작제하며 NSO 세포를 형질전환하여 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주 중에서 우량주를 선택하며 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화(클론화)를 실시한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 사용한다.
2.항체의 hIL-5Rα에 대한 결합 활성의 측정(ELISA법)
항체의 hIL-5Rα에 대한 결합 활성은 하기와 같이 하여 측정한다.
WO 97/l0354에 기재된 항 hIL-5Rα 마우스 항체 KM1257을 PBS에서 10μg/ml의 농도로 희석한 용액의 50μl를 96웰의 ELISA용의 플레이트(Greiner사제)의 각 웰에 각각 분주하며 4℃에서 20시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 1% BSA-PBS를 100μl/웰로 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 잔존하는 활성기를 블록한다. 1% BSA-PBS를 버리고 WO 97/l0354에 기재된 가용성 hIL-5Rα를 1% BSA-PBS에서 0.5μg/ml의 농도로 희석한 용액을 50μl/웰로 가하여 4℃에서 20시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 각 웰을 Tween-PBS에서 세정한 다음, 형질전환주의 배양 상등액 또는 정제한 사람형 CDR 이식 항체의 각종 희석용액을 50μl/웰로 가하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 각 웰을 Tween-PBS에서 세정한 다음, 1% BSA-PBS에서 3000배로 희석한 퍼옥시다제 표지 염소 항 사람 IgG(H&L) 항체 용액(American Qualex사제)를 2차 항체 용액으로서 50μl/웰로 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, Tween-PBS에서 세정한 다음, ABTS 기질액을 50μl/웰로 가하여 발색시켜 OD415를 측정한다.
3.항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 정제
(1)YB2/0 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 3의 1항(1)에서 수득되는 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론을 G418을 0.5mg/ml, MTX를 200nM의 농도로 함유하는 GIT 배지에 3×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 175mm2 플라스코(Greiner사제)에 200ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 8일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과법을 사용하여 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 정제한다. 정제한 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체는 YB2/0-hIL-5R CDR 항체라고 명명한다.
(2)CHO/dhfr 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 3의 1항(2)에서 수득되는 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론을 L-Gln을 3mM, CDLC를 0.5%, PF68을 0.3%의 농도로 함유하는 EX-CELL302 배지에 3×105 세포/ml로 되도록 현탁하고 4.0L 스피너 보틀(이와키가라스사제)를 사용하여 100rpm의 속도로 교반 배양한다. 37℃의 항온실 내에서 10일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과법을 사용하여 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 정제한다. 정제한 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체는 CH0/d-hIL-5R CDR 항체라고 명명한다.
(3)NSO 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 3의 1항(3)에서 수득되는 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 생산하는 형질전환 세포 클론을 야란톤(Yarranton) 등의 방법[바이오/테크놀로지(B10/TEChnolOGY), 10, 169(1992)]에 따라서 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 이온교환 크로마토그래피 및 겔 여과법을 사용하여 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 정제한다. 정제한 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체는 NS0-hIL-5R CDR 항체라고 명명한다.
4.정제한 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 해석
실시예 3의 3항에서 수득된 각종 동물세포로 생산, 정제한 3종류의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 각 4μg을 공지된 방법[네이처(Nature), 227, 680(1970)]에 따라서 SDS-PAGE하여 분자량 및 정제도를 해석한다. 그 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에 도시한 바와 같이 정제한 각 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체는 어떤 것도 비환원 조건하에서는 분자량이 약 150Kd의 단일한 밴드가 환원 조건하에서는 약 50Kd와 약 25Kd의 2개의 밴드가 확인된다. 이들의 분자량은 항체의 H쇄 및 L쇄의 cDNA의 염기서열로부터 추정되는 분자량(H쇄: 약 49Kd, L쇄: 약 23Kd, 분자 전체: 약 144Kd)과 거의 일치하며 또한, IgG 형의 항체는 비환원 조건하에서는 분자량은 약 150Kd이며 환원 조건하에서는 분자내의 S-S 결합이 절단되며 약 50Kd의 분자량을 갖는 H쇄와 약 25Kd의 분자량을 가지는 L쇄에 분해된다는 보고[앤티보디즈: 어·래보로토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988, 모노클로날·앤티보디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press LITMited, 1996]와 일치하며 각 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체가 옳은 구조의 항체 분자로서 발현되며 또한, 정제되는 것이 확인된다.
실시예 4.항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 활성평가
1.항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 hIL-5Rα에 대한 결합 활성(ELISA법)
실시예 3의 3항에서 수득된 3종류의 정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 hIL-5Rα에 대한 결합 활성을 실시예 3의 2항의 ELISA법에 따라 측정한다. 도 5는 첨가하는 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 농도를 변화시켜 결합 활성을 검토한 결과이다. 도 5에 도시한 바와 같이 3종류의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체는 거의 동등한 hIL-5Rα에 대한 결합 활성을 나타낸다. 이 결과는 실시예 2의 1항의 결과와 동일하게 항체의 항원 결합 활성은 항체를 생산하는 동물세포나 이의 배양방법에 관계없이 일정한 것을 기재하고 있다.
2.항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 시험관내 세포 억제 활성(ADCC 활성)
실시예 3의 3항에서 수득된 3종류의 정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 시험관내 세포 억제 활성을 평가하기 위해 하기 방법에 따라서 ADCC 활성을 측정한다.
(1)표적 세포 용액의 조제
WO 97/l0354에 기재된 hIL-5Rα쇄 및 β쇄을 발현하고 있는 마우스 T 세포주 CTLL-2(h5R)를 RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 배양하며 1×106 세포/0.5ml로 되도록 조제하고 방사성 물질인 Na2 51CrO4를 3.7MBq 당량 가하여 37℃에서 1.5시간 동안 반응시켜 세포를 방사선 표지한다. 반응시킨 다음, RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 현탁 및 원심분리 조작에 의해 3회 세정하여 배지에 재현탁하며 4℃에서 30분 동안 얼음중에 방치하여 방사성 물질을 자연 해리시킨다. 원심분리후, RPMI 1640-FBS(10) 배지를 5ml 가하여 2×105 세포/ml로 조제하며 표적 세포 용액으로 한다.
(2)효능인자 세포 용액의 조제
건강한 사람 정맥피 50ml를 채취하고 헤파린나트륨(다케다야쿠힝사제) 0.5ml를 가하고 조심스럽게 혼합한다. 이것을 폴리모르프프펩(Polymorphprep)(Nycomed Pharma AS사제)를 사용하여 사용 설명서에 따라서 원심분리하여 단핵구층을 분리한다. RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 3회 원심분리하여 세정한 다음, 배지를 사용하여 9×106 세포/ml의 농도로 재현탁하며 효능인자 세포 용액으로 한다.
(3)ADCC 활성의 측정
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사제)의 각 웰에 상기(1)에서 조제한 표적 세포 용액의 50μl(1×104 세포/웰)를 분주한다. 이어서(2)에서 조제한 효능인자 세포 용액을 10Oμl(9×105 세포/웰, 효능인자 세포와 표적 세포의 비는 90:1로 된다) 첨가한다. 또한, 각종 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 각 최종 농도 0.001 내지 0.1μg/ml로 되도록 가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 플레이트를 원심분리하며 상등액의 51Cr 양을 γ-카운터로 측정한다. 자연 해리 51Cr 양은 효능인자 세포 용액, 항체 용액 대신에 배지만을 사용하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. 전체 해리 51Cr 양은 항체 용액 대신에 배지만을 효능인자 세포 용액 대신에 1규정 염산을 첨가하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. ADCC 활성은 상기 일반식(II)에 의해 구한다.
그 결과를 도 6에 도시한다. 도 6에 도시한 바와 같이 3종류의 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체중에서 YB2/0-hIL-5R CDR 항체가 가장 높은 ADCC 활성을 나타내며 이어서 CH0/d-hIL-5R CDR 항체, NS0-hIL-5RCDR 항체의 순서로 높은 ADCC 활성을 나타낸다. 이상의 결과는 실시예 2의 2항의 결과와 동일하게 항체의 ADCC 활성은 생산에 사용되는 동물세포에 의해서 크게 다른 것을 기재하고 있다. 또한, 2종류의 사람화 항체의 어떤 경우에도 YB2/0 세포로 생산한 항체가 가장 높은 ADCC 활성을 나타내므로 YB2/0 세포를 사용함으로써 ADCC 활성이 높은 항체를 제조할 수 있는 것이 명백해졌다.
3.항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 생체내에서의 활성평가
실시예 3의 3항에서 수득된 3종류의 정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 생체내에서의 활성을 평가하기 위해 하기 방법에 따라서 게 잡이 원숭이의 hIL-5 유발 호산구 증가 모델에 대한 억제작용을 검토한다.
게 잡이 원숭이에게 초일부터 hIL-5(조제방법은 WO 97/l0354에 기재)를 1μg/kg으로 1일 1회, 합계 14회 등 부분 피하에서 투여한다. 각종 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 0일의 hIL-5의 투여 1시간 전에 0.3mg/kg으로 정맥내에 단회 투여한다. 항체 비투여군을 대조군으로서 사용한다. 항체 투여군은 각 군 3두(頭)(No.30l, No.302, No.303, No.40l, No.402, No.403, No.50l, No.502, No.503), 항체 비투여군은 2두(No.10l, No.102)의 게 잡이 원숭이를 사용한다. 투여 개시의 7일 전부터 투여후 42일째까지 경시적으로 약 1ml의 혈액을 복재(伏在)정맥 또는 대퇴정맥에서 채취하여 1μl의 말초 혈중의 호산구수를 측정한다. 그 결과를 도 7에 도시한다. 도 7에 도시한 바와 같이 YB2/0-hIL-5R CDR 항체를 투여한 그룹에서는 혈중 호산구의 증가가 완전하게 억제된다. 한편, CHO/d-hIL-5R CDR 항체의 투여군에서는 1두로 완전한 억제작용이 확인되지만 2두로서는 이의 억제작용은 불충분하다. NS0-hIL-5R CDR 항체의 투여군에서는 완전한 억제작용은 확인되지 않으며 이의 효과는 불충분하다.
이상의 결과는 항체의 생체내 활성은 생산에 사용하는 동물세포에 따라 크게 다른 것을 기재하고 있다. 또한, 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체에서는 이의 생체내 활성의 높이는 실시예 4의 2항에 기재된 ADCC 활성의 높이와 양의 상관이 확인되므로 이의 활성 발현에는 ADCC 활성의 높이가 매우 중요한 것이 시사된다.
이상의 결과로부터 ADCC 활성이 높은 항체는 사람의 각종 질환의 임상에서도 유용할 것으로 기대된다.
실시예 5. ADCC 활성을 증가시키는 당쇄의 해석
1.2-아미노피리딘 표지 당쇄(PA화 당쇄)의 조제
본 발명의 사람화 항체를 염산에 의한 산 가수분해로써 시알산을 제거한다. 염산을 완전하게 제거한 다음, 하이드라진 분해에 의해 당쇄를 단백질로부터 절단한다[참조: 메소드·오브·엔자이몰로지(Method of Enzymology), 10, 263, 1982]. 하이드라진을 제거한 다음, 아세트산암모늄 수용액과 무수 아세트산을 가하여 N-아 세틸화를 실시한다. 동결 건조후, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지를 실시한다[참조: 져널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 36, 197(1984)]. 형광 표지된 당쇄(PA화 당쇄)를 슈퍼덱스 펩타이드(Surperdex Peptide) HR 10/30 칼럼(Pharmacia사제)를 사용하여 불순물과 분리한다. 당쇄 분획을 원심농축기로써 건고(乾 固)시켜 정제 PA화 당쇄로 한다.
2.정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 PA화 당쇄의 역상 HPLC 분석
실시예 5의 1항 방법에서 실시예 3에서 작제된 각종 항 hIL-5R CDR 항체에 관해서 PA화 당쇄를 실시한 다음, CLC-ODS 칼럼(Shimadzu사제)에 의한 역상 HPLC 분석을 실시한다. 과잉량의α-L-푸코시다제(소 신장 유래, SIGMA사제)를 PA화 당쇄에 첨가하여 소화를 실시하고(37℃, 15시간) 역상 HPLC에서 분석한다(도 8). 아스파라긴 결합 당쇄는 30분에서 80분의 범위로 용출하는 것을 TaKaRa사제 PA화 당쇄 표준물을 사용하여 확인한다. α-L-푸코시다제 소화에 따라 역상 HPLC의 용출 위치가 이동하는 당쇄(48분에서 78분으로 용출하는 당쇄)의 전체에 차지하는 비율을 계산한다. 결과를 표 1에 도시한다.
항체의 생산 세포 α-1,6-푸코스 결합 당쇄(%)
YB2/0 47
NSO 73

YB2/0 세포로 생산한 항 hIL-5R CDR 이식 항체는 약 47%, NSO 세포로 생산시킨 항 hIL-5R CDR 이식 항체는 약 73%가 N 글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아 세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄(이하, 「α-1,6-푸코스를 가지는 당쇄」라고 표기한다)이다. 따라서 YB2/0 세포로 생산한 항체는 NSO 세포로 생산한 항체와 비교하여 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄(이하, 단순히 「α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄」라고 표기한다)의 비율이 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄가 많다.
3.정제 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 단당 조성분석
트리플루오로아세트산에 의한 산 가수분해에 의해 YB2/0 세포, NSO 세포 및 CH0/d 세포로 생산한 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체의 당쇄를 단당으로 분해하며 BioLC(Dionex사제)를 사용하여 단당 조성분석을 실시한다.
N-글리코시드 결합 당쇄 중에서 콤플렉스형에서는 1개의 당쇄에서 만노스 수는 3이므로 만노스를 3으로서 계산하는 경우의 각 단당의 상대비를 표 2에 도시한다.
항체의 생산 세포 Fuc GlcNAc Gal Man ADCC 활성(%)*
YB2/0 0.60 4.98 0.30 3.00 42.27
NSO 1.06 3.94 0.66 3.00 16.22
CHO/dhfr- 0.85 3.59 0.49 3.00 25.73
CHO/dhfr- 0.91 3.80 0.27 3.00 25.73
* 항체 농도 O.Olμg/ml

푸코스의 상대비는 YB2/0< CH0/d< NS0이며 본 결과에서도 YB2/0 세포로 생산한 항체의 당쇄는 푸코스 함량이 가장 낮다.
4.CH0/dhfr-세포생산 항체의 당쇄 해석
CH0/dhfr-세포로 생산한 정제 항 hIl-5Rα CDR 이식 항체로부터 PA화 당쇄를 조제하며 CLC-ODS 칼럼(시마쓰사제)을 사용하여 역상 HPLC 분석을 실시한다(도 9). 도 9에서 용출 시간 35 내지 45분 동안이 푸코스를 갖지 않는 당쇄, 45 내지 60분 동안이 푸코스를 가지는 당쇄이다. 100/dhfr-세포로 생산한 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체는 마우스 골수종 NSO 세포로 생산시킨 항체와 동일하게 래트 골수종 YB2/0 세포로 생산시킨 항체에서 푸코스를 갖지 않는 당쇄의 함량이 적다.
실시예 6. 고 ADCC 활성항체의 분리
푸코스를 가지는 당쇄에 결합되는 렉틴 칼럼을 사용하여 래트 골수종 YB2/0 세포로 생산시킨 항 hIl-5Rα CDR 이식 항체의 분리를 실시한다. HPLC는 시마쓰사제 LC-6A를 사용하며 유속은 1ml/분, 칼럼 온도는 실온에서 실시한다. 50mM 트리스-황산 완충액(pH 7.3)에서 평형화하여 정제된 항 hIL-5Rα CDR 이식 항체를 주입한 다음, 0.2M α-메틸만노시드(나카라이테스크사제)의 직선 농도 구배(60분 동안)로써 용출한다. 항 hIl-5Rα CDR 이식 항체를 비흡착 분획과 흡착 분획으로 분리한다. 비흡착 분획, 흡착 분획의 일부를 취하고 hIL-5Rα에 대한 결합 활성을 측정하면 동일한 결합 활성을 나타낸다(도 10A). ADCC 활성을 측정하면 비흡착 분획의 편이 흡착 분획의 일부보다 높은(100 내지 1000배)ADCC 활성을 나타낸다(도 10B). 또한, 비흡착 분획, 흡착 분획의 일부에서 PA화 당쇄를 조제하며 CLC-ODS 칼럼(시마쓰사제)을 사용하여 역상 HPLC 분석을 실시한다(도 11). 비흡착 분획은 주로 푸코스가 없는 당쇄를 갖는 항체이며 흡착 분획의 일부는 주로 푸코스가 있는 당쇄를 갖는 항체이다.
실시예 7. α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 항 GD3 키메라 항체의 활성평가
1.α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 항 GD3 키메라 항체의 조제
실시예 1의 2항(1)에 기재된 방법에 따라서 항 GD3 키메라 항체를 생산하는 YB2/0 세포 유래의 형질전환 클론을 수득한다. 각각의 YB2/0 세포 유래의 형질전환 클론에서 항체를 조제하며 각각을 로트l, 로트2, 로트3으로 한다. 항 GD3 키메라 항체 로트l, 로트2, 로트3의 당쇄 분석을 실시예 11의 (6)방법에 따라서 실시한 결과, α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 각각 50%, 45%, 29%이다. 이하, 이들 시료를 항 GD3 키메라 항체(50%), 항 GD3 키메라 항체(45%), 항 GD3 키메라 항체(29%)라고 표기한다.
또한, 실시예 1의 2항(2)에서 조제한 CH0/DG44 세포 유래의 항 GD3 키메라 항체의 당쇄 분석을 실시예 11의 (6)방법에 따라서 실시한 결과, α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 7%이다. 이하, 본 시료를 항 GD3 키메라 항체(7%)라고 표기한다.
또한, 항 GD3 키메라 항체(45%)와 항 GD3 키메라 항체(7%)를 사용하여 항 GD3 키메라 항체(45%):항 GD3 키메라 항체(7%)= 5:3 및 1:7의 비율로 혼합한다. 이들의 시료를 실시예 10의 (6)방법에 따라서 당쇄 분석을 실시한 결과, α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 24% 및 13%(분석치)의 시료를 조제한다. 이들을 이하, 항 GD3 키메라 항체(24%), 항 GD3 키메라 항체(13%)라고 표기한다.
도 12에는 각 시료의 당쇄 분석의 결과를 도시한다. α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 2회의 당쇄 분석의 결과를 평균한 값을 사용한다.
2.GD3에 대한 결합 활성의 평가(ELISA법)
실시예 7의 1항에서 조제한 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 6종류의 항 GD3 키메라 항체의 GD3(유키지루시뉴교사제)에 대한 결합 활성은 실시예 1의 3항의 ELISA법에 따라 측정한다. 그 결과, 도 13에 도시한 바와 같이 6종류의 항 GD3 키메라 항체는 어떤 것도 동등한 GD3에 대한 결합 활성을 나타내며 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 항체의 항원 결합 활성에 영향을 주지 않은 것이 명백해졌다.
3.사람 흑색종 세포주에 대한 ADCC 활성의 평가
항 GD3 키메라 항체의 사람 멜라노머 세포주 G-361(ATCC CRL1424)에 대한 ADCC 활성은 하기와 같이 하여 측정한다.
(1)표적 세포 용액의 조제
사람 흑색종 세포주 G-361의 1×106 세포를 조제하고 방사성 물질인 Na2 51CrO 4를 3.7MBq 당량 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 세포를 방사선 표지한다. 반응시킨 다음, 배지를 사용하는 현탁 및 원심분리 조작에 의해 3회 세정하여 배지에 재현탁하며 4℃에서 30분 동안 얼음중에 방치하여 방사성 물질을 자연 해리시킨다. 원심분리후, 배지를 5ml 가하여 2×105 세포/mL로 조제하며 표적 세포 용액으로 한다.
(2)사람 효능인자 세포 용액의 조제
건강한 사람 말초혈 50ml를 채취하고 헤파린나트륨(시미즈세이야쿠사제)를 0.5mL를 가하여 조심스럽게 혼합한다. 이것을 림포프렙(AXIS SHIELD사제)를 사용하여 사용 설명서에 따라서 원심분리(800g, 20분 동안)하여 단핵구층을 분리한다. 배지에서 3회 원심분리(1200rPHA, 5분 동안)하여 세정한 다음, 배지를 사용하여 2×106 세포/mL의 농도로 재현탁하며 사람 효능인자 세포 용액으로 한다.
(3)ADCC 활성의 측정
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사제)의 각 웰에 상기(1)에서 조제한 표적 세포 용액의 50μl(1×104 세포/웰)를 분주한다. 이어서 상기(2)에서 조제한 사람 효능인자 세포 용액을 100μl(2×105 세포/웰, 사람 효능인자 세포와 표적 세포의 비는 20:1로 된다) 첨가한다. 또한, 항 GD3 키메라 항체를 각 최종 농도 0.0005 내지 5μg/ml로 되도록 가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 플레이트를 원심분리하며 상등액 중의 51Cr 양을 카운터로써 측정한다. 자연 해리 51Cr 양은 사람 효능인자 세포 용액, 항체 용액 대신에 배지만을 사용하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액 중의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. 전체 해리 51Cr 양은 항체 용액 대신에 배지만을 사람 효능인자 세포 용액 대신에 1mol/L의 염산 용액을 첨가하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액 중의 51Cr 양을 측정함 으로써 구한다. 세포 억제 활성(%)은 수학식 II에 의해 구한다.
도 14 및 도 15에는 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 6종류의 항 GD3 키메라 항체의 각종 농도(0.0005 내지 5μg/ml)에서의 ADCC 활성을 2명의 건강한 사람 공여체(A, B)의 효능인자 세포를 사용하여 측정한 결과를 도시한다. 도 14 및 도 15에 도시한 바와 같이 항 GD3 키메라 항체의 ADCC 활성은 어떤 항체 농도에서도 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율에 비례하여 상승하는 경향을 나타낸다. 항체 농도가 낮으면 ADCC 활성은 저하된다. 항체 농도가 0.05μg/ml에서는 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄가 24%, 29%, 45% 및 50%의 ADCC 활성은 거의 동일한 높은 활성을 나타내지만 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄가 20% 미만의 항체인 13% 및 7%에서는 ADCC 활성은 낮다. 본 결과는 효능인자 세포의 공여체가 상이해도 동일하다.
실시예 8. α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 항 CCR4 키메라 항체의 활성평가
1.항 CCR4 키메라 항체의 안정 생산세포의 작제
WO 01/64754에 기재된 항 CCR4 키메라 항체의 탄뎀형 발현 벡터 pKANTEX2160을 사용하여 항 CCR4 키메라 항체의 안정 생산세포를 하기와 같이 하여 작제한다.
(1)래트 골수종 YB2/0 세포를 사용하는 생산세포의 작제
10μg의 항 CCR4 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2160을 4×106 세포의 래트 골수종 YB2/0 세포(ATCC CRL 1662)에 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]에 의해 도입한 다음, 40ml의 하이브리도마-SFM-FBS(5)[FBS(PAA 래보러토리즈사제)를 5% 함유하는 하이브리도마-SFM 배지(인비트로젠사제)]에 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(스미토모베크라이트사제)에 200μl/웰씩 분주한다. 5% CO2 인큐베이터 안에서 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, G418을 1mg/ml로 되도록 첨가하여 1 내지 2주 동안 배양한다. G418 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니가 출현하며 증식이 확인되는 웰에서 배양 상등액을 회수하며 상등액 중의 항 CCR4 키메라 항체의 항원 결합 활성을 실시예 8의 2항에 기재된 ELISA법에 따라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 CCR4 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시킬 목적으로 G418을 1mg/mL, DHFR의 억제제인 MTX(SIGMA사제)를 50nM 함유하는 하이브리도마-SFM-FBS(5) 배지에 1 내지 2×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 24웰 플레이트(Greiner사제)에 1ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 1 내지 2주 동안 배양하며 50nM MTX 내성을 나타내는 형질전환주를 유도한다. 형질전환주의 증식이 확인되는 웰의 배양 상등액 중의 항 CCR4 키메라 항체의 항원 결합 활성을 실시예 8의 2항에 기재된 ELISA법에 따라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 CCR4 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주 에 관해서는 상기와 동일한 방법에 따라 MTX 농도를 상승시켜 최종적으로 MTX를 200nM의 농도로 함유하는 하이브리도마-SFM-FBS(5) 배지에서 증식할 수 있으며 또 한, 항 CCR4 키메라 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주에 관해서 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화(클론화)를 실시하여 수득된 클론화주를 KM2760 #58-35-16이라고 명명한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 선택하여 사용한다.
(2)CH0/DG44 세포를 사용하는 생산세포의 작제
항 CCR4 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2160의 4μg을 1.6×106 세포의 CHO/DG44 세포에 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnolgy), 3, 133(1990)]에 의해 도입한 다음, 10ml의 IMDM-dFBS(10)-HT(1)[dFBS(인비트로젠사제)를 10%, HT 보충액(인비트로젠사제)를 1배 농도로 함유하는 IMDM 배지(인비트로젠사제)]에 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(이와키가라스사제)에 100μl/웰씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 안에서 37℃, 24시간 동안 배양한 다음, IMDM-dFBS(10)(투석 FBS를 10%로 함유하는 IMDM 배지)에 배지 교환하여 1 내지 2주 동안 배양한다. HT 비의존적인 증식을 나타내는 형질전환주의 콜로니가 출현하기 때문에 증식이 확인되는 웰에서 배양 상등액을 회수하며 상등액 중의 항 CCR4 키메라 항체의 발현량을 실시예 8의 2항에 기재된 ELISA법에 따라 측정한다.
배양 상등액 중에 항 CCR4 키메라 항체의 생산이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시킬 목적으로 MTX를 50nM 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에 1 내지 2×105 세포/ml로 되도록 현탁하고 24웰 플레이트(이와키가라스사제)에 0.5ml씩 분주한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 1 내지 2주 동안 배양하며 50nM MTX 내성을 나타내는 형질전환주를 유도한다. 증식이 확인되는 웰의 형질전환주에 관해서는 상기와 동일한 방법에 따라 MTX 농도를 200nM으로 상승시켜 최종적으로 MTX를 200nM의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에서 증식할 수 있으며 또한, 항 CCR4 키메라 항체를 고생산하는 형질전환주를 수득한다. 수득된 형질전환주는 5-03주라고 명명한다. 또한, 실시예 9의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하며 당해 전사물의 양이 비교적 낮은주를 우량주로서 선택하여 사용한다.
2.항체 CCR4 부분 펩타이드에 대한 결합 활성(ELISA법)
항 CCR4 키메라 항체가 반응할 수 있는 사람 CCR4 세포외 영역 펩타이드로서 화합물 1(서열 25)를 선택한다. ELISA법에 의한 활성측정에 사용하기 위해 하기 방법에서 BSA(소 혈청 알부민) (나카라이테스크사제)와의 접합체를 작제하며 항원으로서 사용한다. 즉, 10mg의 BSA를 함유하는 PBS 용액 900mL에 100ml의 25mg/ml SMCC[4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥산-1-카복실릭애시드N-하이드록시석신이미드에스테르](시그마사제)-DMSO 용액을 vortex하면서 적가하며 30분 동안 천천히 교반한다. 25mL PBS에서 평형화한 NAP-10 칼럼 등의 겔 여과 칼럼에 반응액 1mL를 어플라이하고 1.5ml의 PBS에서 용출시킨 용출액을 BSA-SMCC 용액으로 한다(A280 측정으로부터 BSA 농도를 산출). 다음에 0.5mg의 화합물1에 250ml, PBS를 가한 다음, 250ml DMF를 가하여 완전하게 용해시킨 다음, 상기한 BSA-SMCC 용액(BSA 환산 1.25mg)을 vortex 하에 첨가하여 3시간동안 천천히 교반한다. 반응액을 PBS에 대하여 4℃, 밤새 투석하고 최종 농도 0.05%로 되도록 아지화나트륨을 첨가하여 0.22mm 필터로 여과한 후, BSA-화합물1 용액으로 한다.
96웰의 EIA용 플레이트(글라이너사)에 상기와 같이 조제한 접합체를 O.05μg/mL, 50μl/웰로 분주하며 4℃에서 밤새 방치하여 흡착시킨다. PBS에서 세정한 다음, 1% BSA-PBS를 100μl/웰로 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 잔존하는 활성기를 블록한다. 각 웰을 0.05% Tween20을 함유하는 PBS(이하, Tveen-PBS라고 표기한다)에서 세정한 다음, 형질전환주의 배양 상등액을 50μl/웰로 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 각 웰을 Tween-PBS에서 세정한 다음, 1% BSA-PBS에서 6000배로 희석한 퍼옥시다제 표지 염소 항 사람 IgG(γ) 항체 용액(American Qualex사제)를 2차 항체 용액으로 하여 각각 50μl/웰로 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, Tween-PBS에서 세정한 다음, ABTS 기질액을 50μl/웰로 가하여 발색시켜 20분 후에 5% SDS 용액을 50μl/웰 가하여 반응을 정지한다. 다음에 OD 415를 측정한다. 실시예 8의 1항에서 수득되는 항 CCR4 키메라 항체는 CCR4에 대한 결합 활성을 나타낸다.
3.항 CCR4 키메라 항체의 정제
(1)YB2/0 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 8의 1항(1)에서 수득되는 항 CCR4 키메라 항체를 발현하는 형질전환 세포 클론 KM2760 #58-35-16을 200nM MTX, Daigo's GF21(와코쥰야쿠제)를 5%의 농 도로 함유하는 하이브리도마-SFM(인비트로젠사제) 배지에 2×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 스피너 보틀(이와키가라스사제)를 사용하여 37℃의 항온실 내에서 유가식으로 교반 배양한다. 8-10일 동안 배양하여 회수한 배양 상등액에서 Prosep-A(밀리포어사제) 컬럼 및 겔 여과법을 사용하며 항 CCR4 키메라 항체를 정제한다. 정제된 항 CCR4 키메라 항체를 KM2760-1이라고 명명한다.
(2)CHO/DG44 세포 유래의 생산세포의 배양 및 항체의 정제
실시예 8의 1항(2)에서 수득되는 항 CCR4 키메라 항체를 생산하는 형질전환 세포주 5-03주를 IMDM-dFBS(10) 배지중에서 182cm2 플라스크(Greiner사제)로써 5% CO2 인큐베이터 속에서 37℃로 배양한다. 수일후, 세포 밀도가 합류점에 달한 시점에서 배양 상등액을 제거하여 25ml의 PBS 버퍼로써 세포를 세정한 다음, EXCELL301 배지(JRH사제)를 35ml 주입한다. 5% C02 인큐베이터 속에서 37℃로 7일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 Prosep-A(밀리포어사제) 칼럼을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 항 CCR4 키메라 항체를 정제한다. 정제한 항 CCR4 키메라 항체는 KM3060이라고 명명한다.
KM2760-1 및 KM3060의 CCR4에 대한 결합 활성을 ELISA에 의해 측정한 결과, 동등한 결합 활성을 나타낸다.
4.정제한 항 CCR4 키메라 항체의 해석
본 실시예 1항에서 수득된 각종 동물세포로 생산, 정제한 2종류의 항 CCR4 키메라 항체의 각 4μg을 공지된 방법[네이처(Nature), 227, 680, 1970]에 따라 SDS-PAGE하여 분자량 및 정밀도를 해석한다. 정제한 각 항 GD3 키메라 항체는 어떤 것도 비환원 조건하에서는 분자량이 약 150Kd의 단일한 밴드, 환원 조건하에서는 약 50Kd와 약 25Kd의 2개의 밴드가 확인된다. 이들의 분자량은 항체의 H쇄 및 L쇄의 cDNA의 염기서열로부터 추정되는 분자량(H쇄: 약 49Kd, L쇄: 약 23Kd, 분자 전체: 약 144Kd)와 거의 일치하며 또한, IgG형의 항체는 비환원 조건하에서는 분자량은 약 150Kd이며 환원 조건하에서는 분자내의 S-S 결합이 절단되며 약 50Kd의 분자량을 가지는 H쇄와 약 25Kd의 분자량을 가지는 L쇄로 분해된다는 보고[앤티보디즈: 어·래보로토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter14, 1988, 모노클로날·앤티보디즈: 프린시플즈·앤드·플랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Acadenlic Press LITMited, 1996]와 일치하며 항 CCR4 키메라 항체가 옳은 구조의 항체 분자로서 발현되며 또한 정제된 것이 확인된다.
5.α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 항 CCR4 키메라 항체의 조제
실시예 8의 3항(1)에서 조제한 YB2/0 세포 유래의 항 CCR4 키메라 항체 KM2760-1과 실시예 8의 3항(2)에서 조제한 CHO/DG44 세포 유래의 항 CCR4 키메라 항체 KM3060의 당쇄 분석을 실시예 10의 (6)방법에 따라서 실시한다. α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 KM2760은 87%, KM3060은 8%이다. 이하, 이들의 시료를 항 CCR4 키메라 항체(87%), 항 CCR4 키메라 항체(8%)라고 표기한다.
또한, 항 CCR4 키메라 항체(87%)와 항 CCR4 키메라 항체(8%)를 사용하여 항 CCR4 키메라 항체(87%):항 CCR4 키메라 항체(8%)= 1:39, 16:67, 22:57, 32:47, 42:37의 비율로 혼합한다. 이들 시료를 실시예 10의 (6)방법에 따라 당쇄 분석을 실시한다. α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 9%, 18%, 27%, 39%, 46%이다. 이하, 이들 시료를 항 CCR4 키메라 항체(9%), 항 CCR4 키메라 항체(18%), 항 CCR4 키메라 항체(27%), 항 CCR4 키메라 항체(39%), 항 CCR4 키메라 항체(46%)라고 표기한다.
도 16에는 각 시료의 당쇄 분석의 결과를 도시한다. α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 2회의 결과를 평균한 값을 사용한다.
6.CCR4 부분 펩타이드에 대한 결합 활성의 평가(ELISA법)
실시예 8의 5항에서 조제한 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 6종류의 항 CCR4 키메라 항체의 CCR4 부분 펩타이드에 대한 결합 활성은 실시예 8의 2에 기재된 방법에 따라서 측정한다.
그 결과, 도 17에 도시한 바와 같이 6종류의 항 CCR4 키메라 항체는 어떤 것도 동등한 CCR4에 대한 결합 활성을 나타내며 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율은 항체의 항원 결합 활성에 영향을 주지 않는 것이 명백해졌다.
7.사람 CCR4 고발현 세포주에 대한 ADCC 활성의 평가
항 CCR4 키메라 항체의 사람 CCR4 고발현세포인 CCR4/EL-4 세포(W001/64754)에 대한 ADCC 활성은 하기와 같이 하여 측정한다.
(1)표적 세포 용액의 조제
WO 01/64754에 기재된 사람 CCR4를 발현하고 있는 CCR4/EL-4 세포의 1.5×106 세포를 조제하고 방사성 물질인 Na2 51CrO4를 5.55MBq 당량 가하여 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜 세포를 방사선 표지한다. 반응시킨 다음, 배지를 사용하는 현탁 및 원심분리 조작에 의해 3회 세정하여 배지에 재현탁하며 4℃에서 30분 동안 얼음중에 방치하여 방사성 물질을 자연 해리시킨다. 원심분리후, 배지를 7.5ml 가하여 2×105 세포/mL로 조제하며 표적 세포 용액으로 한다.
(2)사람 효능인자 세포 용액의 조제
건강한 사람 말초혈 60ml를 채취하고 헤파린나트륨(시미즈세이야쿠사제)를 0.6ml를 가하여 조심스럽게 혼합한다. 이것을 림포프렙(AXIS SHIELD사제)를 사용하여 사용 설명서에 따라서 원심분리(800g, 20분 동안)하여 단핵구층을 분리한다. 배지에서 3회 원심분리(1400rPHA, 5분 동안)하여 세정한 다음, 배지를 사용하여 5×106 세포/ml의 농도로 재현탁하며 사람 효능인자 세포 용액으로 한다.
(3)ADCC 활성의 측정
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사제)의 각 웰에 상기(1)에서 조제한 표적 세포 용액의 50μl(1×104 세포/웰)를 분주한다. 이어서 상기(2)에서 조제한 사람 효능인자 세포 용액을 10Oμl(5×105 세포/웰, 사람 효능인자 세포와 표적 세포의 비는 50:1로 된다) 첨가한다. 또한, 항 CCR4 키메라 항체를 각 최종 농도 0.0001 내지 10μg/mL로 되도록 가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응시킨 다음, 플레이트를 원심분리하며 상등액 중의 51Cr 양을 γ-카운터로 측정한다. 자연 해리 51Cr 양은 사람 효능인자 세포 용액, 항체 용액 대신에 배지만을 사용하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액 중의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. 전체 해리 51Cr 양은 항체 용액과 사람 효능인자 세포 용액 대신에 1mol/L의 염산 용액을 첨가하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액 중의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. ADCC 활성(%)은 수학식 II에 의해 구한다.
도 18 및 도 19에는 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 상이한 항 CCR4 키메라 항체의 각종 농도(0.001 내지 10μg/mL)에서 ADCC 활성을 2명의 건강한 사람 공여체(A, B)의 효능인자 세포를 사용하여 측정한 결과를 각각 도시한다. 도 18 및 도 19에 도시한 바와 같이 항 CCR4 키메라 항체의 ADCC 활성은 어떤 항체 농도에서도 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율에 비례하여 상승하는 경향을 나타낸다. 항체 농도가 낮으면 ADCC 활성은 저하된다. 항체 농도가 O.01μg/ml에서는 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄가 27%, 39% 및 46%의 ADCC 활성은 거의 동일한 높은 활성을 나타내지만 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄가 20% 미만의 항체에서는 ADCC 활성은 낮다. 본 결과는 효능인자 세포의 공여체가 상이해도 동일하다.
실시예 9. 숙주세포주에서의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제유전자 전사물의 정량
(1)각종 세포주 유래 일본쇄 cDNA의 조제
디하이드로엽산 환원효소 유전자(dhfr)를 결손한 차이니즈 햄스터 난소 유래 CHO/DG44 세포 및 래트 골수종 YB2/0 세포에서 하기의 순서로 일본쇄 cDNA를 조제한다.
CHO/DG44 세포를 10% 소 태아 혈청(Life Technologies사제) 및 1배 농도의 HT 보충액(Life Technologies사제)을 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)에 현탁하며 2×105개/ml의 밀도로 접착 세포 배양용 T75 플라스크(Greiner사제)에 15ml 파종한다. 또한, YB2/0 세포를 10% 소 태아 혈청(Life Technologies사제), 4mmol/l L-GLN(Life Technologies사제)를 첨가한 RPMI 1640 배지(Life Technologies사제)에 현탁하며 2×105개/ml의 밀도로 부유세포 배양용 T75 플라스크(Greiner사제)에 15ml 파종한다. 이들을 37℃의 5% CO2 인큐베이터 속에서 배양하며 배양 1일째, 2일째, 3일째, 4일째 및 5일째에 각 숙주세포 1x107개를 회수한 다음, RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 첨부된 설명서에 따라서 전체 RNA를 추출한다.
전체 RNA를 45μl의 멸균수에 용해하며 RQ1 RNase-부재 DNAse(Promega사제) 1μl, 부속의 10xDNase 완충액 5μl, RNasin 리보뉴클레아제 억제제(Promega사제) 0.5μl를 각각 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 시료중에 혼입된 게놈 DNA를 분해한다. 반응시킨 다음, RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 전체 RNA를 재정제하며 50μl의 멸균수에 용해한다.
수득된 각각의 전체 RNA 3μg에 대해 SUPERSCRIPTTM 일본쇄 cDNA 합성용 예 비 증폭 시스템(Life Technologies사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 올리고(dT)를 프라이머로 하는 20μl의 시스템에서 역전사 반응을 실시함으로써 일본쇄 cDNA를 합성한다. 각 숙주세포 유래 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(이하, FUT8이라고 한다), β-액틴의 클로닝에는 당해 반응액의 1배 농도액을 경합적 PCR에 의한 각 유전자 전사량의 정량에는 당해 반응액의 50배 희석 수용액을 사용하며 각각 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다.
(2)차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 각 cDNA 부분 단편의 취득
차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 각 cDNA 부분 단편의 취득은 하기의 순서로 실시한다(도 20).
우선, 사람 FUT8의 cDNA[져널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 12l, 626, (1997)] 및 돼지 FUT8의 cDNA[져널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 27l, 27810, (1996)]에 공통의 염기서열에 대하여 특이적인 프라이머(서열 4 및 서열 5에 기재한다)를 설계한다.
다음에 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 본 항(1)에서 조제한 배양 2일째의 CHO 세포 유래 cDNA 및 YB2/0 세포 유래 cDNA를 각각 1μl를 함유하는 25μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 4 및 서열 5)]를 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다. PCR은 94℃에서 1분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 30사이클 후, 다시 72℃에서 10분 동안 가열하는 조건에서 실시한다.
PCR후, 반응액을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 특이적 증폭 단편 979bp를 유전자 클린 스핀 키트(Bio 101사제)를 사용하여 정제하며 멸균수 10μl로 용출한다(이하, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편의 정제에는 본 방법을 사용한다). 상기 증폭 단편 4μl를 TOPO TA 클로닝 키트(Ivitrogen사제)의 설명서에 따라서 플라스미드 pCR2.1에 삽입하며 당해 반응액을 사용하여 대장균 XL1-Blue주를 코엔 등의 방법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 69, 2110(1972)](이하, 대장균의 형질전환에는 본 방법을 사용한다)에 의해 형질전환한다. 수득된 가나마이신 내성 콜로니중, cDNA가 통합된 6 클론으로부터 공지된 방법[뉴클레익·애시드·리서치(Nucleic Acids Research), 7, 1513(1979)](이하, 플라스미드의 단리방법에는 본 방법을 사용한다)에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다.
각 플라스미드에 삽입된 cDNA의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열 분석 FS 준비 반응 키트(Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit)(Parkin Elmer사제)를 사용하여 결정하며 방법은 첨부 매뉴얼에 따른다. 본 법에 따라 서열 결정한 모든 삽입 cDNA가 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8(서열 6 및 7에 기재한다)의 오픈 리딩 프레임(0RF) 부분서열을 암호화하는 것을 확인한다. 이 중 PCR에 따르는 염기의 판독 오류를 당해 서열내에 전혀 포함하지 않는 플라스미드 DNA를 선택한다. 이하, 각 플라스미드를 CHFUT8-pCR2.1 및 YBFUT8-pCR2.1이라고 칭한다.
(3) 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴 cDNA의 취득
차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴의 취득은 하기의 순서로 실시한다(도 21).
우선, 차이니즈 햄스터 β-액틴 게놈서열(GenBank, U20114) 및 래트 β-액틴 게놈서열[뉴클레익·애시드·리서치(Nucleic Acids Research), 1l, 1759(1983)]에서 해독 개시 코돈을 함유하는 공통 서열에 특이적인 정배향 프라이머(서열 8에 기재한다) 및 해독 종지코돈을 함유하는 각 서열 특이적인 역배향 프라이머(서열 9 및 서열 10에 기재한다)를 설계한다.
다음에 DNA 폴리머라제 KOD(도요보세키사제)를 사용하여 본 항(1)에서 조제한 배양 2일째의 CHO 세포 유래 cDNA 및 YB2/0 세포 유래 cDNA 1μl를 함유하는 25μl의 반응액[KOD 완충액 #1{도요보세키사제), 0.2mmol/l dNTPs, 1mmol/l MgCl2, 0.4μmol/l의 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 8 및 9 또는 서열 8 및 10), 5% DMSO]을 조제하며 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 4분 동안 가열한 다음, 98℃에서 15초 동안, 65℃에서 2초 동안, 74℃에서 30초 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 25사이클 실시한다.
PCR후, 반응액을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 특이적 증폭 단편 1128bp를 정제한다. 이러한 DNA 단편에 대해 MEGLABEL(다카라슈조사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 DNA 5' 말단의 인산화를 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수하며 멸균수 10μl에 용해한다.
한편, 플라스미드 pBluescriptII KS(+) 3μg(Strategene사제)를 NE 완충액 2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 16단위의 제한효소 EcoRV(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에 pH 8.0의 1mol/l Tris-HCl 완충액 35μl 및 대장균 C15주 유래 알칼린 포스파타제(다카라슈조사제) 3.5μl를 첨가하여 65℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈 인산화를 실시한다. 이러한 반응액에 대하여 페놀/클로로포름 추출처리 후, 에탄올 침전법을 실시하여 회수한 DNA 단편을 멸균수 10Oμl에 용해한다.
상기에서 수득한 차이니즈 햄스터 cDNA 유래 증폭 단편 및 래트 cDNA 유래 증폭 단편(1192bp) 4μl, 플라스미드 pBluescriptII KS(+) 유래의 EcoRV-EcoRV 단편(약 3.0kb) 1μl, Ligation High(도요보세키사제) 5μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 XL1-Blue주를 형질전환하며 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리한다.
각 플라스미드에 삽입된 cDNA의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Parkin Elmer사제)를 사용하여 결정하며 방법은 첨부된 매뉴얼에 따른다. 본 법에 따라 서열 결정한 모든 삽입 cDNA가 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴 각 cDNA의 ORF 전체 길이 서열을 암호화하는 것을 확인한다. 이 중 PCR에 따르는 염기의 판독 오류를 당해 서열내에 전혀 포함하지 않는 플라스미드 DNA를 선택한다. 이하, 각 플라스미드를 CHAc-pBS 및 YBAc-pBS라고 칭한다.
(4) FUT8 표준물 및 내부 대조군의 조제
각 세포내의 FUT8 유전자 유래 mRNA 전사량을 측정하기 위해 검량선에 사용하는 표준물로서 본 항(2)에서 수득한 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 각 cDNA 부분 단편을 pCR2.1에 통합한 플라스미드인 CHFT8-pCR2.1 및 YBFT8-pCR2.1을 제한효소 EcoRI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다. FUT8 정량의 내부 대조군으로서는 CHFT8-pCR2.1 및 YBFT8-pCR2.1 중에서 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 내부 염기서열의 ScaI-HindIII 간 203bp를 결실시킴으로써 수득된 CHFT8d-pCR2.1 및 YBFT8d-pCR2.1을 제한효소 EcoRI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다. 하기에 이의 상세한 것을 설명한다.
차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 표준물의 조제는 다음 수순으로 실시한다. 플라스미드 CHFT8-pCR2.1 2μg을 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 40μl에 용해하며 24단위의 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 한편, 플라스미드 YBFT8-pCR2.1 2μg을 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 40μl에 용해하며 24단위의 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액의 일부를 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 제한효소 분해반응에 의해 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8각 cDNA 부분 단편을 함유하는 EcoRI-EcoRI 단편(약 1kb)이 플라스미드 CHFT8-pCR2.1 및 YBFT8-pCR2.1에서 분리된 것을 확인한다. 각 반응액에서 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용하여 0.02fg/μl, 0.2fg/μl, 1fg/μl, 2fg/μl, 10fg/μl, 20fg/μl, 100fg/μl의 희석액을 조제하며 이들을 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 표준물로 한다.
차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 내부 대조군의 조제는 다음과 같이 실시한다(도 22). DNA 폴리머라제 KOD(도요보세키사제)를 사용하여 CHFT8-pCR2.1 및 YBFT8-pCR2.1 5ng을 함유하는 25μl의 반응액[KOD 완충액 ＃1(도요보세키사제), 0.2mmol/l dNTPs, 1mmol/l MgCl2, 0.4μmol/l 유전자 특이적 프라이머(서열 11 및 12), 5% DMS0]을 조제하며 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 4분 동안 가열한 다음, 98℃에서 15초 동안, 65℃에서 2초 동안, 74℃에서 30초 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 25사이클 실시한다. PCR후, 반응액을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 특이적 증폭 단편 약 4.7kb를 정제한다. 당해 DNA 단편에 대해 MEGALABEL(다카라슈조사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 DNA 5'말단의 인산화를 실시한 다음, 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수하며 멸균수 50μl에 용해한다. 상기에서 수득한 DNA 단편(약 4.7kb) 5μl 및 Ligation High(도요보세키사제) 5μl를 혼합하여 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 자기 환상화 반응을 실시한다.
당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α균주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 각 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Parkin Elmer사제)를 사용하여 서열 결정을 실시하며 상기 플라스미드에 삽입된 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 내부 염기서열 ScaI-HindIII 간 203bp가 결실된 것을 확인한다. 수득된 각 플라스미드를 CHFT8d-pCR2.1 및 YBFT8d-pCR2.1이라고 칭한다.
다음에 플라스미드 CHFT8d-pCR2.1 2μg을 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 40μl에 용해하며 24단위의 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 한편, 플라스미드 YBFT8d-pCR2.1 2μg을 NE 완충액 2(New England Biolabs사제) 40μl에 용해하며 24단위의 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액의 일부를 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 제한효소 분해반응에 의해 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8 부분 단편의 내부 염기서열 203bp가 결실된 단편을 함유하는 EcoRI-EcoRI 단편(약 800bp)이 플라스미드 CHFT8d-pCR2.1 및 YBFT8d-pCR2.1에서 분리된 것을 확인한다.
각 반응액에서 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용하여 2fg/μl의 희석액을 조제하며 이들을 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 내부 대조군으로 한다.
(5)β-액틴 표준물 및 내부 대조군의 조제
각 숙주세포 내의 β-액틴 유전자 유래 mRNA 전사량을 측정하기 위해 검량선에 사용하는 표준물로서 본 항(3)에서 수득한 차이니즈 햄스터 액틴 및 래트 β-액틴 각 cDNA의 ORF 전체 길이를 pBluescriptII KS(+)에 통합한 플라스미드인 CHAc-pBS 및 YBAc-pBS를 전자는 제한효소 HindIII 및 PstI에서 후자는 제한효소 HindIII 및 KpnI에서 각각 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다. β-액틴 정량의 내부 대조군으로서는 CHAc-pBS 및 YBAc-pBS 중에서 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액 틴의 내부 염기서열의 DraIII 간 180bp를 결실시킴으로써 수득된 CHAcd-pBS 및 YBAcd-pBS를 전자는 제한효소 HindIII 및 PstI에서 후자는 제한효소 HindIII 및 KpnI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다. 하기에 이의 상세한 것을 설명한다.
차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴의 표준물의 조제는 다음 수순으로 실시한다. 플라스미드 CHAc-pBS 2μg을 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 40μl에 용해하며 25단위의 제한효소 HindIII(다카라슈조사제) 및 20단위의 PstI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 한편, 플라스미드 YBAc-pBS 2μg을 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 40μl에 용해하며 25단위의 제한효소 HindIII(다카라슈조사제) 및 24단위의 KpnI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액의 일부를 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 제한효소 분해반응에 의해 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴 각 cDNA ORF 전체 길이를 함유하는 HindIII-PstI 단편 및 HindIII-KpnI 단편(약 1.2kb)이 플라스미드 CHAc-pBS 및 YBAc-pBS에서 분리된 것을 확인한다. 각 반응액에서 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용하여 2pg/μl, 1pg/μl, 200fg/μl, 100fg/μl, 20fg/μl의 희석액을 조제하며 이들을 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴의 표준물로 한다.
차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴의 내부 대조군의 조제는 다음 수순으로 실시한다(도 23). CHAc-pBS 2μg을 100ng/μl BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액3(New England Biolabs사제) 100μl에 용해하며 10단위의 제한효소 DraIII(New England Biolabs)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수하며 DNA 평활 절단 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 DNA 말단의 평활화를 실시한 다음, 반응액을 2등분한다. 우선 한쪽의 반응액에는 pH 8.0의 1mol/l Tris-HCl 완충액 35μl 및 대장균 C15주 유래 알칼린 포스파타제(다카라슈조사제) 3.5μl를 첨가하여 65℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈 인산화를 실시한다. 탈 인산화 처리, 페놀/클로로포름 추출처리 및 에탄올 침전법을 실시하며 회수한 DNA 단편을 멸균수 10μl에 용해한다. 잔류된 다른쪽의 반응액은 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 차이니즈 햄스터 β-액틴 ORF 부분 단편을 함유하는 약 1.1Kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 탈 인산화 DraIII-DraIII 단편 0.5μl, 약 1.1kb의 DraIII-DraIII 단편 4.5μl, Ligation High(도요보세키사제) 5μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 각 플라스미드 DNA에 대하여 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Parkin Elmer사제)를 사용하여 서열 결정을 실시하며 상기 플라스미드에 삽입된 차이니즈 햄스터 β-액틴 DraIII-DraIII 간 180bp가 결실된 것을 확인한다. 본 플라스미드를 CHAcd-pBS라고 칭한다.
또한, 래트β-액틴 DraIII-DraIII 간 180bp가 결실된 플라스미드를 CHAcd-pBS와 동일한 공정을 경유하여 작제한다. 본 플라스미드를 YBAcd-pBS라고 칭한다.
다음에 플라스미드 CHAcd-pBS 2μg을 NE 완충액2(New EI1dand Biolabs사제) 40μl에 용해하며 25단위의 제한효소 HindIII(다카라슈조사제) 및 20단위의 PstI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 한편, 플라스미드 YBAcd-pBS 2μg을 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 40μl에 용해하며 25단위의 제한효소 HindIII(다카라슈조사제) 및 24단위의 KpnI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 3시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액의 일부를 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 제한효소 분해반응에 의해 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴 각 cDNA ORF 전체 길이의 내부 염기서열 180bp가 결실된 단편을 함유하는 HindIII-PstI 단편 및 HindIII-KpnI 단편(약 1.0kb)이 플라스미드 CHAcd-pBS 및 YBAcd-pBS에서 분리된 것을 확인한다. 각 반응액에서 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용하여 200fg/μl의 희석액을 조제하며 이들을 차이니즈 햄스터 액틴 및 래트 β-액틴의 내부 대조군으로 한다.
(6)경합적 PCR에 의한 전사량의 정량
본 항(4)에서 작제한 FUT8 내부 대조군 DNA 및 본 항(1)에서 수득한 숙주세포주 유래 cDNA를 주형으로 하여 경합적 PCR을 실시하며 각 주형에 유래하는 증폭 산물량의 상대치에서 숙주세포주 내의 FUT8의 전사 산물의 정량치를 산출한다. 한편, β-액틴 유전자는 각 세포에서 항상적으로 전사되어 있으며 이의 전사량은 세포간에 동일한 정도라고 생각되고 있으므로 각 숙주세포주 유래 cDNA 합성반응의 효율적인 목표로서 β-액틴 유전자의 전사량을 정량한다. 즉, 본 항(5)에서 작제한 β-액틴 내부 대조군 DNA 및 본 항(1)에서 수득한 숙주세포주 유래 cDNA를 주형 으로 하여 PCR을 실시하며 각 주형에 유래하는 증폭 산물량의 상대치에서 숙주세포주 내의 β-액틴의 전사 산물의 정량치를 산출한다. 하기에 이의 상세한 것을 설명한다.
FUT8의 전사 산물의 정량은 다음 수순으로 실시한다. 우선, 본 항(2)에서 수득한 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8 ORF 부분서열의 내부서열에 대해 공통 서열 특이적인 프라이머 세트(서열 13 및 14에 기재한다)를 설계한다.
다음에 본 항(1)에서 수득한 각 숙주세포주 유래의 cDNA 용액의 50배 희석액 5μl 및 내부 대조군용 플라스미드 5μl(10fg)를 함유하는 총 체적 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 13 및 14), 5% DMSO]으로 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 3분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 60℃에서 1분 동안, 72에서 1분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 32사이클 실시한다.
또한, 각 숙주세포주 유래 cDNA를 대신하여 본 항(4)에서 수득한 FUT8 표준물 플라스미드 5μl(0.1fg, 1fg, 5fg, 10fg, 50fg, 100fg, 500fg, 1pg)를 첨가한 시스템에서 PCR을 실시하며 FUT8 전사량의 검량선 작제에 사용한다.
β-액틴의 전사 산물의 정량은 다음 수순으로 실시한다. 우선, 본 항(3)에서 수득한 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴 ORF 전체 길이의 내부서열에 대해 각 유전자 특이적인 프라이머 세트(전자를 서열 15 및 서열 16, 후자를 서열 17 및 서열 18에 기재한다)를 설계한다.
다음에 본 항(1)에서 수득된 각 숙주세포주 유래의 cDNA 용액의 50배 희석액 5μl 및 내부 대조군용 플라스미드 5μl(1pg)를 함유하는 총 체적 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 15 및 서열 16 또는 서열 17 및 서열 18), 5% DMSO]에서 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 3분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 65℃에서 1분 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로 하는 17사이클의 조건에서 실시한다.
또한, 각 숙주세포주 유래 cDNA를 대신하여 본 항(5)에서 수득한 β-액틴 표준물 플라스미드 5μl(10pg, 5pg, 1pg, 500fg, 100fg)를 첨가한 시스템에서 PCR을 각각 실시하여 β-액틴 전사량의 검량선 작제에 사용한다.
표적 유전자 *프라이머 세트 PCR 증폭 산물의 크기(bp)
표적 콤페티터
FUT8 F: 5'-GTCCATGGTGATCCTGCAGTGTGG-3' R: 5'-CACCAATGATATCTCCAGGTTCC-3' 638 431
β-액틴 (차이니즈 햄스터) F: 5'-GATATCGCTGCGCTCGTTGTCGAC-3' R: 5'-CAGGAAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3' 789 609
β-액틴 (래트) F: 5'-GATATCGCTGCGCTCGTCGTCGAC-3' R: 5'-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAGC-3' 789 609
*F: 정배향 프라이머, R: 역배향 프라이머

표 3에 기재된 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 각 유전자 전사 산물 및 각 표준물로부터 표 3의 표적란에 기재된 사이즈의 DNA 단편을 각 내부 대조군으로부터 표 3의 콤페티터란에 기재된 사이즈의 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
PCR 후의 용액 중에서 7μl를 1.75% 아가로스 겔 전기영동에 제공한 다음, 겔을 1배 농도의 SYBR 녹색 I 핵산 겔 염색(Molecular Probes사제)에 30분 동안 침지하여 염색한다. 증폭된 각 DNA 단편의 발광 강도를 플루오로 이메저(F1uor Imager SI;molecular Dynamics사제)에서 산출함으로써 증폭된 DNA 단편의 양을 측정한다.
상기한 방법에 따라 표준물 플라스미드를 주형으로 하는 PCR에 의해서 생긴 증폭 산물량을 측정하여 이의 측정치와 표준물 플라스미드량을 플롯하여 검량선을 작성한다. 이러한 검량선을 사용하여 각 발현주 유래 전체 cDNA를 주형으로 하는 경우에 증폭 산물의 양에서 각 주중의 목적 유전자 cDNA 양을 산출하여 이것을 각 주에서의 mRNA 전사량으로 한다.
래트 FUT8 서열을 표준물 내부 대조군에 사용하는 경우에 각 숙주세포주에서 FUT8 전사 산물의 양을 도 24에 도시한다. 배양기간을 통하여 CHO 세포주는 YB2/0 세포주의 10배 이상의 전사량을 나타낸다. 이 경향은 차이니즈 햄스터 FUT8 서열을 표준물 내부 대조군에 사용하는 경우에도 확인된다.
또한, 표 4에 β-액틴 전사 산물의 양과의 상대치로서 FUT8 전사량을 나타낸다. 배양기간을 통하여 YB2/0 세포주의 FUT8 전사량이 β-액틴의 0.1% 전후인 데 대해 CHO 세포주는 0.5% 내지 2%이다.
이상의 결과에서 YB2/0 세포주의 FUT8 전사 산물량은 CHO 세포주의 그것보다도 유의적으로 적은 것으로 나타난다.
배양 일수
세포주 1일째 2일째 3일째 4일째 5일째
CHO 1.95 0.90 0.57 0.52 0.54
YB2/0 0.12 0.11 0.14 0.08 0.07

실시예 10. 항암 글리오시드 GD3 키메라 항체 생산 세포주에서의 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 전사물의 정량
(1)각종 생산 세포주 유래 일본쇄 cDNA의 조제
항암 글리오시드 GD3 키메라 항체 생산세포 DCHI01-20주 및 61-33주에서 하기의 순서로 일본쇄 cDNA를 조제한다. DCHI01-20주는 실시예 1 제2항(2)에 기재된 CHO/DG44 세포 유래의 형질전환 클론이다. 또한 61-33주는 YB2/0 유래의 형질전환 세포 7-9-51주(독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터 FERM BP-6691)에 대하여 무혈청 순화를 실시한 다음, 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화를 실시하여 수득한 클론이다.
DCHI01-20주를 3mmol/l L-GLN(Life Technologies사제), 0.3% PLURONIC F-68(Life Technologies사제) 및 0.5% 지방산 농축액(Life Technologies사제)를 첨가한 EXCELL302 배지(JRH BIOSCIENCES사제)에 현탁하며 2×105개/ml의 밀도로 부유세포 배양용 T75 플라스크(Greiner사제)에 15ml 파종한다. 또한, 61-33주를 0.2% 소 혈청 알부민 프랙션V(Life Technologie사제)(이하, BSA라고 약칭한다)를 첨가한 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사제)에 현탁하며 2×105개/ml의 밀도로 부유 세포 배양용 T75 플라스크(Greiner사제)에 15ml 파종한다. 이들을 37℃의 5% C02 인큐베이터 속에서 배양하며 배양 1일째, 2일째, 3일째, 4일째 및 5일째에 각 숙주세포 1×107개를 회수하며 RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 첨부된 설명서에 따라서 전체 RNA를 추출한다.
전체 RNA를 45μl의 멸균수에 용해하며 RQ1 RNase 부재 DNase(Promega사제) 1μl, 부속의 10×DNase 완충액 5μl, RNasin 리보뉴클레아제 억제제(Promega사제) 0.5μl를 각각 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 시료중에 혼입된 게놈 DNA를 분해한다. 반응시킨 다음, RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 전체 RNA를 재정제하며 50μl의 멸균수에 용해한다.
수득된 전체 RNA 3μg에 대해 SUPERSCRIPTM 일본쇄 cDNA 합성용 예비 증폭 시스템(Life Technologies사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 올리고(dT)를 프라이머로 하는 20μl의 시스템에서 역전사 반응을 실시함으로써 일본쇄 cDNA를 합성한다. 당해 반응액을 물로 50배 희석하며 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다.
(2)경합적 PCR에 의한 각 유전자 전사량의 정량
본 항(1)에서 수득한 항체 생산 세포주 유래 cDNA에 대해 실시예 9(6)에 준하여 경합적 PCR에 의한 각 유전자 전사량의 정량을 실시한다.
각 생산 세포주 내의 FUT8 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은 하기의 순서로 실시한다. FUT8 전사량을 정량할 때에 검량선에 사용하는 표준물로서 실시예 9(2)에서 수득한 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 cDNA 부분 단편을 pCR2.1에 통합한 플라스미드인 CHFT8-pCR2.1 및 YBFT8-pCR2.1을 제한효소 EcoRI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
FUT8 정량의 내부 대조군으로서는 실시예 9(4)에서 조제한 CHFT8d-pCR2.1 및 YBFT8d-pCR2.1 중에서 차이니즈 햄스터 FUT8 및 래트 FUT8의 내부 염기서열의 ScaI-HindIII 간 203bp를 결실시킴으로써 수득된 CHFT8d-pCR2.1 및 YBFT8d-pCR2.1을 제한효소 EcoRI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
본 항(1)에서 수득한 각 생산 세포주 유래의 cDNA 용액의 50배 희석액 5μl 및 내부 대조군용 플라스미드 5μl(10fg)를 함유하는 총 체적 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l FUT8 유전자 특이적 프라이머(서열 13 및 14), 5% DMS0]으로 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 3분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 60℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 32사이클 실시한다.
또한, 각 생산 세포주 유래 cDNA를 대신하여 FUT8 표준물 플라스미드 5μl(0.1fg, 1fg, 5fg, 10fg, 50fg, 100fg, 500fg, 1pg)를 첨가한 시스템에서 PCR을 실시하며 FUT8 전사량의 검량선 작제에 사용한다. 또한, 표준물 플라스미드의 희석에는 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용한다.
한편, β-액틴 유전자는 각 세포에서 항상적으로 전사되어 있으며 이의 전사량은 세포간에서 동일한 정도라고 생각되고 있으므로 각 생산 세포주 유래 cDNA 합성반응의 효율적인 목표로서 β-액틴 유전자의 전사량을 하기의 순서로 정량한다.
β-액틴 유전자 전사량을 정량할 때에 검량선에 사용되는 표준물로서 실시예 9(3)에서 조제한 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴의 cDNA의 ORF 전체 길이를 pBluescriptII KS(+)에 통합한 플라스미드인 CHAc-pBS 및 YBAc-pBS를 제한효소 HindIII 및 KpnI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
β-액틴 정량의 내부 대조군으로서는 실시예 9(5)에서 조제한 CHAc-pBS 및 YBAc-pBS 중 차이니즈 햄스터 β-액틴 및 래트 β-액틴의 내부 염기서열의 DraIII-DraIII 간 180bp를 결실시킴으로써 수득된 CHAcd-pBS 및 YBAcd-pBS를 제한효소 HindIII 및 KpnI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
상기에서 수득한 각 생산 세포주 유래의 cDNA 용액의 50배 희석액 5μl 및 내부 대조군용 플라스미드 5μl(lpg)를 함유하는 총 체적 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l β-액틴 특이적 프라이머(서열 17 및 18), 5% DMSO]으로 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 3분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 65℃에서 1분 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로 하는 17사이클의 조건에서 실시한다. 또한, 각 생산 세포주 유래 cDNA를 대신하여 β-액틴 표준물 플라스미드 10pg, 5pg, 1pg, 500fg, 100fg를 첨가한 시스템에서 PCR을 각각 실시하며 β-액틴 전사량의 검량선 작제에 사용한다. 또한, 표준물 플라스미드의 희석에는 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용한다.
표 3에 기재된 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 각 유전자 전사 산물 및 각 표준물로부터 표 3의 표적란에 기재된 사이즈의 DNA 단편을 각 내부 대조군 으로부터 표 3의 콤페티터란에 기재된 사이즈의 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
PCR 후의 용액 중에서 7μl를 1.75% 아가로스 겔 전기영동에 제공한 다음, 겔을 1배 농도의 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular Probes사제)에 30분 동안 침지하여 염색한다. 증폭된 각 DNA 단편의 발광 강도를 플루오로이메저(Fluor Imager SI;molecular Dynamics사제)에서 산출함으로써 증폭된 DNA 단편의 양을 측정한다.
상기한 방법에 따라 표준물 플라스미드를 주형으로 하는 PCR에 의해서 생긴 증폭 산물량을 측정하며 이의 측정치와 표준물 플라스미드량을 플롯하여 검량선을 작성한다. 이러한 검량선을 사용하여 각 생산 세포주 유래 전체 cDNA를 주형으로 하는 경우의 증폭 산물의 양에서 각 주중의 목적 유전자 cDNA 양을 산출하며 이것을 각 주에서의 mRNA 전사량으로 한다.
표 5에 β-액틴 전사 산물의 양과의 상대치로서 FUT8 전사량을 나타낸다. 배양기간을 통하여 YB2/0 세포 유래 항체 생산주 61-33의 FUT8 전사량이 β-액틴의 0.3% 이하인 데 대해 CHO 세포 유래 항체 생산주 DC1mol-20은 0.7 내지 1.5%이다. 이 결과에서 YB2/0 세포 유래 항체 생산주의 FUT8 전사 산물량은 CHO 세포 유래 항체 생산주의 그것보다 유의적으로 적은 것으로 나타난다.
배양일수
세포주 1일째 2일째 3일째 4일째 5일째
DCHI01-20 0.75 0.73 0.99 1.31 1.36
61-33 0.16 0.19 0.24 0.30 <0.10

실시예 11. 마우스 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 과잉 발현주의 작제
(1)마우스α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 발현 플라스미드의 구축
10% 소 태아 혈청(Life Technologie사제)를 함유하는 IMDM 배지(Life Technologie사제)에서 계대 배양한 마우스 골수종 NSO 세포(이화학연구소 셀은행, RCB0213) 1×107개에 대해 RNAeasy(QIAGEN사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 전체 RNA를 추출한다. 전체 RNA를 45μl의 멸균수에 용해하고 RQ1 RNase 부재 DNase(Promega사제) 1μl, 부속의 10×DNase 완충액 5μl, RNasin 리보뉴클레아제 억제제(Promega사제) 0.5μl를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 시료중에 혼입된 게놈 DNA를 분해한다. 반응시킨 다음, RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 전체 RNA를 재정제하며 50μl의 멸균수에 용해한다. 수득된 전체 RNA 중 3μg에 대해 SUPERSCRIPTTM 일본쇄 cDNA 합성용 예비 증폭 시스템(Life Technologies사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 올리고(dT)를 프라이머로 하는 20μl의 시스템에서 역전사 반응을 실시함으로써 일본쇄 cDNA를 합성한다.
마우스 FUT8 cDNA의 취득은 하기의 순서로 실시한다(도 25).
우선, 마우스 FUT8의 cDNA 서열(GenBank, AB025198)에서 해독 개시 코돈을 함유하는 서열에 특이적인 정배향 프라이머(서열 19에 기재한다) 및 해독 종지코돈을 함유하는 서열 특이적인 역배향 프라이머(서열 20에 기재한다)를 설계한다.
다음에 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 상기한 NSO 세포 유래 cDNA 1μl를 함유하는 25μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 4% DMS0, 0.5μmol/l 특이적 프라이머(서열 19 및 서열 20)]을 조제하며 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 1분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 30사이클 후, 다시 72℃에서 10분 동안 가열하는 조건에서 실시한다.
PCR후, 반응액을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 특이적 증폭 단편 1728bp를 정제한다. 이러한 DNA 단편 4μl를 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen사제)의 설명서에 따라서 플라스미드 pCR2.1로 삽입하며 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환한다. 수득된 가나마이신 내성 콜로니 중에서 cDNA가 통합된 6 클론으로부터 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다.
각 플라스미드에 삽입된 cDNA의 염기서열은 DNA 서열분석기377(parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Parkin Elmer사제)를 사용하여 결정하며 방법은 첨부 매뉴얼에 따른다. 본 법에 따라 서열 결정한 모든 삽입 cDNA가 마우스 FUT8의 ORF 전체 길이 서열을 암호화하는 것을 확인한다. 이 중 PCR에 따르는 염기의 판독 오류를 당해 서열내에 전혀 포함하지 않는 플라스미드 DNA를 선택한다(이의 DNA 서열을 서열 2에 기재한다. 또한, 이러한 아미노산 서열을 서열 24에 기재한다). 또한, 본 서열에는 상기한 GenBank 위에 등록된 마우스 FUT8 서열과는 아미노산 치환을 수반하는 3염기의 불일치가 있다. 이하, 본 플라스미드를 mfFUT8-pCR2.1이라고 칭한다.
계속해서 마우스 FUT8 ORF 전체 길이 서열을 함유하는 플라스미드 pBSmfFUT8의 구축을 하기와 같이 실시한다(도 26). 우선, 플라스미드 pB1uescriptII KS(+) 1μg을(Strategene사제)를 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에 pH 8.0의 1mol/l Tris-HCl 완충액 35μl 및 대장균 C15주 유래 알칼린 포스파타제(다카라슈조사제) 3.5μl를 첨가하여 65℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈 인산화를 실시한다. 이러한 반응액에 대하여 페놀/클로로포름 추출처리의 후, 에탄올 침전법을 실시하며 회수한 DNA 단편을 멸균수 10μl에 용해한다.
한편, 플라스미드 mfFUT8-pCR2.1 1μg을(Strategene사제)를 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 마우스 FUT8 cDNA ORF 전체 길이를 함유하는 약 1.7Kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pBluescriptII KS(+) 유래의 EcoRI-EcoRI 단편(2.9kb) 1μl, 플라스미드 mfFUT8-pCR2.1 유래의 EcoRI-EcoRI 단편(1.7kb) 4μl, Ligation High(도요보세키사제) 5μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pBSmfFUT8라고 칭한다.
상기 pBSmfFUT8 및 pAGE249를 사용하여 마우스 FUT8 발현 벡터 pAGEmfFUT8의 구축을 하기의 순서로 실시한다(도 27). pAGE249는 pAGE248[져널·오브·바이오테 크놀로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 269, 14730(1994)]의 유도체이며 pAGE248에서 디하이드로엽산 환원효소 유전자(dhfr) 발현 유닛을 함유하는 SphI-SphI 단편(2.7Kb)을 제거한 벡터이다.
pAGE249 1μg을 범용 완충액 H(다카라슈조사제) 50μl에 용해하며 20단위의 제한효소 SalI(New England Biolabs사제)를 가하고 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 BamHI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액에 pH 8.0의 1mol/l Tris-HCl 완충액 35μl 및 대장균 C15주 유래 알칼린 포스파타제(다카라슈조사제) 3.5μl를 첨가하여 65℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈 인산화를 실시한다. 이러한 반응액에 대하여 페놀/클로로포름 추출처리 후, 에탄올 침전법을 실시하며 회수한 DNA 단편을 멸균수 10μl에 용해한다.
한편, pBSmfFUT8 1μg을 범용 완충액 H(다카라슈조사제) 50μl에 용해하며 20단위의 제한효소 SalI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, NE 완충액2(New Englald Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 BamHI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 마우스 FUT8 cDNA ORF 전체 길이를 함유하는 약 1.7kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pAGE249 유래의 BamHI-SalI 단편(6.5kb) 1μl, 플라스미드 pBSmfFUT8 유래의 BamHI-SalI 단편(1.7Kb) 4μl, Ligation High(도요보세키사제) 5μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pAGEmfFUT8이라고 칭한다.
(2)마우스α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 과잉 발현주의 작제
본 항(1)에서 구축한 마우스 FUT8 발현 벡터 pAGEmfFUT8을 61-33주로 도입하며 FUT8 유전자의 안정적 발현주를 취득한다. 상기 61-33주는 항암 글리오시드 GD3 키메라 항체를 고생산하는 YB2/0 세포 유래의 형질전환 세포 7-9-51주(독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터 FERM BP-6691)에 대하여 무혈청 순화를 실시한 다음, 2회의 한계희석법에 의한 단일 세포화를 실시하여 수득한 클론이다.
플라스미드 pAGEmfFUT8의 61-33주로의 유전자 도입은 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]에 준하여 하기의 순서로 실시한다. 우선, 플라스미드 pAGEmfFUT8 30μg을 NE 완충액4(New Enghnd Biolabs사제) 600μl에 용해하며 100단위의 제한효소 FspI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시함으로써 선형화한다. 당해 반응액에 대하여 에탄올 침전법을 실시하며 회수한 선형화 플라스미드를 1μg/μl 수용액으로 한다. 다음에 61-33주를 K-PBS 완충액(137mmol/l KCl, 2.7mmol/l NaCl, 8.1mmol/l Na2HP04, 1.5mmol/l K2HP04, 4.0mmol/l MgCl2)에 현탁하여 2×107개/ml로 하여 세포 현탁액 200μl(4×106개)를 선형화 플라스미드 10μl(10μg)와 혼화한다. 세포-DNA 혼화액을 유전자 펄서 규벳(전극간 거리 2mm)(BI0-RAD사제)로 옮긴 다음, 세포 융합장치 유전자 펄서(B10-RAD사제)를 사용하여 펄스 전압 0.2KV, 전기용량 250μF의 조건에서 유전자 도입을 실시한다. 이러한 세포 현탁액을 5% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제) 및 0.2% BSA(Life Technologie사제)를 첨가한 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사제) 10ml에 혼화하여 부유세포용 96웰 플레이트(Greiner사제)에 100μl씩 분주한다. 5% CO2, 37℃의 조건하에 24시간 동안 배양한 다음, 배양 상등액 50μl를 제거하고 0.5mg/ml 하이그로마이신 B(와코쥰야쿠고교사제), 5% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제) 및 0.2% BSA(Life Technologie사제)를 첨가한 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사제)를 100μl씩 분주한다. 이러한 배지 교환작업을 3 내지 4일마다 반복하면서 3주간의 배양을 실시하며 하이그로마이신 내성을 나타내는 14주를 취득한다.
한편, pAGEmfFUT8의 모골격 벡터인 플라스미드 pAGE249를 61-33주로 도입함으로써 네가티브 대조군주를 작제한다. 상기한 순서로 제한효소 FspI에 의해 선형화한 플라스미드 pAGE249 10μg을 전기천공법을 사용하여 61-33주 4x106cells로 유전자 도입한다. 당해 세포를 5% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제) 및 0.2% BSA(Life Technologie사제)를 첨가한 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사제) 15ml에 혼화한 다음, 부유세포용 T75 플라스크(Greiner사제)에 옮겨 넣고 5% C02, 37℃의 조건하에 24시간 동안 배양한다. 배양한 다음, 800rPHA에서 4분 동안의 원심분리를 실시하며 상등액의 반량(7.5ml)을 제거한 다음, 0.5mg/ml 하이그로마이신 B(와코쥰야쿠고교사제), 5% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제) 및 0.2% BSA(Life Technologie사제)를 첨가한 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사제) 7.5ml를 첨가하여 현탁하며 부유세포용 T75 플라스크(Greiner사제)에 옮겨 넣는다. 이러한 배지 교환작업을 3 내지 4일마다 반복하면서 3주간의 배양을 실시하며 하이그로마이신 내성주를 취득한다.
(3)마우스α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 과잉 발현주에서의 당해 유전자 발현량의 해석
본 항(2)에서 작제한 61-33주 유래 마우스 FUT8 과잉 발현주 14주에서 임의로 선택한 6주 및 네가티브 대조군주에 대해 경합적 RT-PCR을 사용하여 FUT8 발현량을 비교한다.
상기 과잉 발현주를 0.5mg/ml 하이그로마이신 B(와코쥰야쿠고교사제), 5% 소 태아 투석 혈청(Life Tecbnologie사제) 및 0.2% BSA(Life Technologie사제)를 첨가한 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사제)에 현탁하며 3×105개/ml의 밀도로 부유세포 배양용 T75 플라스크(Greiner사제)에 15ml 파종한다. 37℃, 5% C02의 조 건하에 24시간 동안 배양한 다음, 생세포 1×107개를 회수하며 RNAeasy(QIAGEN사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 전체 RNA를 추출한다. 전체 RNA를 45μl의 멸균수에 용해하고 RQ1Rnase 부재 DNase(Promega사제) 0.5U/μl, 부속의 10×DNase 완충액 5μl, RNasin 리보뉴클레아제 억제제(Promega사제) 0.5μl를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 시료중에 혼입된 게놈 DNA를 분해한다. 반응시킨 다음, RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 전체 RNA를 재정제하며 50μl의 멸균수에 용해한다.
수득된 전체 RNA 2.5μg에 대해 SUPERSCRIPTTM 일본쇄 cDNA 합성용 예비 증폭 시스템(Life Technologies사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 올리고(dT)를 프라이머로 하는 20μl의 시스템에서 역전사 반응을 실시함으로써 일본쇄 cDNA를 합성한다. 당해 반응액을 물로 50배 희석하며 실시예 9(6)에 준하여 경합적 PCR에 의한 각 유전자 전사량의 정량에 제공한다.
각 발현주 내의 FUT8 유전자 유래의 mRNA 전사량의 정량은 하기의 순서로 실시한다. FUT8 전사량을 정량할 때에 검량선에 사용하는 표준물로서 실시예 9(2)에서 조제한 래트 FUT8의 cDNA 부분 단편을 pCR2.1에 통합한 플라스미드인 YBFT8-pCR2.1을 제한효소 EcoRI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
FUT8 정량의 내부 대조군으로서는 실시예 9(4)에서 조제한 YBFT8-pCR2.1 중에서 래트 FUT8의 내부 염기서열의 ScaI-HindIII 간 203bp를 결실시킴으로써 수득된 YBFT8d-pCR2.1을 제한효소 EcoRI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
상기에서 수득한 각 발현주 유래의 cDNA 용액의 50배 희석액 5μl 및 내부 대조군용 플라스미드 5μl(10fg)를 함유하는 총 체적 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/ㅣ 래트 FUT8 유전자 특이적 프라이머(서열 13 및 14), 5% DMS0]으로 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 pCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 3분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 60℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 32사이클 실시한다.
또한, 각 발현주 유래 cDNA를 대신하여 FUT8 표준물 플라스미드 5μl(0.1fg, 1fg, 5fg, 10fg, 50fg, 100fg, 500fg, 1pg)를 첨가한 시스템에서 PCR을 실시하며 FUT8 전사량의 검량선 작제에 사용한다. 또한, 표준물 플라스미드의 희석에는 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용한다.
한편, β-액틴 유전자는 각 세포에서 항상적으로 전사되어 있으며 이의 전사량은 세포간에 동일한 정도라고 생각되고 있으므로 각 발현주 유래 cDNA 합성반응의 효율적인 목표로서 β-액틴 유전자의 전사량을 하기의 순서로 정량한다.
β-액틴 유전자 전사량을 정량할 때에 검량선에 사용하는 표준물로서 실시예 9(3)에서 조제한 래트 β-액틴의 cDNA의 ORF 전체 길이를 pBluescriptII KS(+)에 통합한 플라스미드인 YBAc-pBS를 제한효소 HindIII 및 KpnI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
β-액틴 정량의 내부 대조군으로서는 실시예 9(5)에서 조제한 YBAc-pBS 중에서 래트 β-액틴의 내부 염기서열의 DraIII-DraIII 간 180bp를 결실시킴으로써 수득된 YBAcd-pBS를 제한효소 HindIII 및 KpnI로 절단하고 직쇄화한 DNA를 사용한다.
상기에서 수득한 각 발현주 유래의 cDNA 용액의 50배 희석액 5μl 및 내부 대조군용 플라스미드 5μl(1pg)를 함유하는 총 체적 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l 래트 β-액틴 특이적 프라이머(서열 17 및 18), 5% DMS0]에서 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 3분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 65℃에서 1분 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로 하는 17사이클의 조건에서 실시한다.
또한, 각 발현주 유래 cDNA를 대신하여 β-액틴 표준물 플라스미드 10pg, 5pg, 1pg, 500fg, 100fg를 첨가한 시스템에서 PCR을 각각 실시하며 β-액틴 전사량의 검량선 작제에 사용한다. 또한, 표준물 플라스미드의 희석에는 1μg/ml 빵 효모 유래 t-RNA(SIGMA사제)를 사용한다.
표 3에 기재된 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 각 유전자 전사 산물 및 각 표준물로부터 표 3의 표적란에 기재된 사이즈의 DNA 단편을 각 내부 대조군으로부터 표 3의 콤피티터란에 기재된 사이즈의 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
PCR 후의 용액 중에서 7μl를 1.75% 아가로스 겔 전기영동에 제공한 다음, 겔을 1배 농도의 SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular Probes사제)에 30분 동안 침지하여 염색한다. 증폭된 각 DNA 단편의 발광 강도를 플루오로이메저(Fluor Imager SI; Molecular Dynamics사제)에서 산출함으로써 증폭된 DNA 단편의 양을 측정한다.
상기한 방법에 따라 표준물 플라스미드를 주형으로 하는 PCR에 의해서 생긴 증폭 산물량을 측정하며 이의 측정치와 표준물 플라스미드량을 플롯팅하여 검량선을 작성한다. 이러한 검량선을 사용하여 각 발현주 유래 전체 cDNA를 주형으로 하는 경우의 증폭 산물의 양에서 각 주중의 목적 유전자 cDNA량을 산출하며 이것을 각 주에서의 mRNA 전사량으로 한다.
도 28에 β-액틴 전사 산물의 양과의 상대치로서 FUT8 전사량을 도시한다. mfFUT8-l, mfFUT8-2, mfFUT8-4의 3주 및. pAGE249 도입주는 FUT8 전사량이 β-액틴 전사량의 0.3 내지 10%이며 FUT8 전사량이 비교적 낮은 주이다. 한편, mfFUT8-3, mfFUT8-6, mfFUT8-7의 3주는 FUT8 전사량이 β-액틴 전사량의 20 내지 40%이며 FUT8 발현량이 비교적 높은 주이다.
(4)마우스α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 과잉 발현주가 생성하는 항체의 정제
본 항(2)에서 수득한 FUT8 유전자 과잉 발현주 6주 및 네가티브 콘트롤주 1주를 200nmol/l MTX, 0.5mg/ml 하이그로마이신 B(와코쥰야쿠고교사제) 및 0.2% BSA(Life Technologie사제)를 첨가한 하이브리도마-SFM 배지(Life Technologie사제)에 현탁하며 2×105개/ml의 밀도로 부유세포 배양용 T225 플라스크(IWAKI사제) 3개에 합계 100ml 각각 파종한다. 이들을 37℃의 5% C02 인큐베이터 안에서 7 내지 9일 동안 배양한 다음, 생세포수를 카운트하여 바이어빌리티가 동일한 정도(각각 30% 이하)인 것을 확인한 다음, 각 세포 현탁액을 회수한다. 당해 세포 현탁액에 대하여 3000rPHA, 4℃의 조건에서 10분 동안의 원심분리를 실시하여 상등액을 회수하며 10OOOrPHA, 4℃의 조건에서 1시간의 원심분리를 실시한 다음, O.22μm 웰 직경 150ml 용적 PES 필터 유니트(NALGENE사제)를 사용하여 여과한다.
0.8cm 직경의 칼럼에 Prosep-A 하이 캐퍼시티(bioPROCESSing사제)를 두께 2cm로 충전하고, 0.1mol/l 시트르산 완충액(pH 3.0) 10ml 및 1mol/l 글리신/NaOH-0.15mol/l NaCl 완충액(pH 8.6) 10ml로 순차적으로 세정함으로써 담체의 평형화를 실시한다. 다음에 상기 배양 상등액 각 10Oml를 칼럼의 통에 통과시키고 1mol/l 글리신/NaOH-0.15mol/l NaCl 완충액(pH 8.6) 50ml로 세정한다. 세정한 다음, 0.1mol/l 시트르산 완충액(pH 3.0) 2.5ml를 사용하여 Prosep-A에 흡착한 항체의 용출을 실시하며 용출액을 500μl씩 분획하는 동시에 각 분획을 각각 2mol/l Tris-HCl(pH 8.5) 100μl와 혼합하여 중화한다. BCA법[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 150, 76(1985)]를 사용하여 항체를 고농도로 함유하는 2분획(계 1.2ml)를 선택하여 합일하고 10mol/l 시트르산 완충액(pH 6.0)을 사용하여 4℃에서 하루 동안 투석을 실시한다. 투석후, 항체 용액을 회수하고 0.22μm 웰 직경 Millex GV(MILLIPORE사제)를 사용하여 멸균 여과한다.
(5)마우스α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 과잉 발현주가 생성하는 항체의 시험관내 세포 억제 활성(ADCC 활성)
본 항(4)에서 정제한 항 GD3 항체의 시험관내 세포 억제 활성을 평가하기 위해 GD3 양성 세포인 사람 멜라노머 배양 세포주 G-361[이화학연구소 셀은행, RCB0991]을 사용하여 ADCC 활성을 측정한다.
10% 소 태아 혈청(Life Technologie사제)를 함유하는RPMI 1640 배지(Life Technologie사제) (이하, RPMI 1640-FBS(10)라고 약칭한다)에서 계대 배양한 G-361 세포 1x106개를 RPMI 1640-FBS(10) 500μl에 현탁하고 Na2 51CrO4 3.7MBg를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 배양함으로써 세포의 방사선 표지를 실시한다. 1200rPHA에서 5분의 원심분리를 실시한 다음, 상등액을 제거하여 표지 세포를 RPMI 1640-FBS(10) 5ml에 현탁한다. 이러한 세정조작을 3회 반복한 다음, 세포 현탁액을 빙상에서 30분 동안 정치하고 방사성 물질을 자연 해리시킨다. 다시 상기한 세정조작을 2회 반복한 다음, RPMI 1640-FBS(10) 5ml에 현탁함으로써 2×105개/ml의 표적 세포 현탁액을 조제한다.
한편, 건강한 사람의 정맥혈 30ml를 채취하고, 헤파린나트륨(시미즈세이야쿠사제) 0.5ml를 가하여 조심스럽게 혼화한 다음, 생리적 식염수(오쓰카세이야쿠사제) 30ml와 혼합한다. 혼합후, 각 10ml를 각각 림포프렙(NYCOMED PHARMA AS사제) 4ml 위에 조심스럽게 중층하여 실온하 2000rPHA에서 30분 동안의 원심분리를 실시한다. 분리된 단핵구 분획을 각 원심관에서 수집하여 합일하며 RPMI 1640-FBS(10) 30ml에 현탁한다. 실온하 1200rPHA에서 15분의 원심분리를 실시한 다음, 상등액을 제거하며 당해 세포를 RPMI 1640-FBS(10) 20ml에 현탁한다. 이러한 세정조작을 2회 반복한 다음, RPMI 1640-FBS(10)를 사용하여 2x106개/ml의 효능인자 세포 현탁액을 조제한다.
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사제)의 각 웰에 표적 세포 현탁액을 50μl씩(1×104개/웰) 분주한다. 계속해서 각 웰에 효능인자 세포 현탁액을 100μl씩(2×105개/웰) 분주함으로써 효능인자 세포와 표적 세포의 비를 20:1로 한다. 다음에 10M 시트르산 완충액(pH 6.0)을 사용하며 본 항(4)에서 수득한 각종 항 GD3 항체에서 0.01μg/ml, O.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml의 희석계열을 조제하며 당해 희석용액을 각 웰에 50μl 첨가함으로써 종료 농도 0.0025μg/ml, 0.025μg/ml, 0.25μg/ml, 2.5μg/ml로 한다. 5% C02, 37℃의 조건하에 4시간 동안 반응시킨 다음, 플레이트에 대하여 1200rPHA에서 5분의 원심분리를 실시한다. 각 웰의 상등액 50μl를 12mm 직경 RIA 튜브(IWAKI사제)로 분취하며 MINAX-γ 오토감마 카운터 5550(PACKRD사제)를 사용하여 해리 51Cr 양의 측정을 실시한다.
또한, 효능인자 세포 현탁액 및 항체 용액을 대신하여 RPMI 1640-FBS(10) 150μl를 첨가한 시스템에서 상기한 반응을 실시함으로써 자연 해리 51Cr 양의 값을 구한다. 또한 효능인자 세포 현탁액 및 항체 용액을 대신하여 1규정 염산 100μl 및 RPMI 164O-FBS(10) 50μl를 첨가한 시스템에서 상기한 반응을 실시함으로써 전체 해리 51Cr 양의 값을 구한다. 이들의 값을 사용하여 실시예 2의 2항(3)에 기재된 일반식(II)에 의해 ADCC 활성을 구한다.
도 29에 각종 항 GD3 항체의 G-361 세포에 대한 ADCC 활성을 나타낸다. 도 28에서 FUT8 발현량이 낮은 mfFUT8-l, mfFUT8-2, mfFUT8-4의 3주는 네가티브 콘트롤인 pAGE249주 도입주와 동등한 높은 ADCC 활성을 나타낸다. 한편, 도 28에서 FUT8 발현량이 높은 mfFUT8-3, mfFUT8-6, mfFUT8-7의 3주는 CHO 세포에서 취득한 항 GD3 항체와 동등한 낮은 ADCC 활성을 나타낸다. 이상의 결과에서 숙주세포의 FUT8 발현량을 조절함으로써 생성 항체의 ADCC 활성을 조절할 수 있는 것으로 나타난다.
(6)마우스α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 과잉 발현주가 생성하는 항체의 당쇄 해석
본 항(4)에서 정제한 항 GD3 항체의 당쇄 해석을 실시한다. mfFUT8-6, pAGE249주 도입주가 생성하는 항체의 하이드라진 분해를 실시하며 당쇄를 단백질로 절단한 [메소드·오브·엔자이몰로지(Method of Enzymology), 83, 263, 1982]. 감압 증류 제거함으로써 하이드라진을 제거한 다음, 아세트산암모늄 수용액과 무수 아세트산을 가하여 N-아세틸화를 실시한다. 동결 건조후, 2-아미노피리딘에 의한 형광표지를 실시한다[져널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 95, 197, 1984]. 형광 표지된 당쇄군(PA화 당쇄군)을 슈퍼덱스 펩타이드 HR 10/30 칼럼(Pharmacia사제)를 사용하여 과잉의 시약과 분리한다. 당쇄 분획을 원심농축기로써 건고(乾 固)시켜 정제 PA화 당쇄군으로 한다. 다음에 CLC-ODS 칼럼(Shimadzu사제)를 사용하여 정제 PA화 당쇄군의 역상 HPLC 분석을 실시한다(도 30). 피크 면적으로부터 계산하면 mfFUT8-6의 α-1,6-푸코스가 없는 당쇄 함량은 10%, α-1,6-푸코스 결합 당쇄 함량은 90%이다. pAGE249의 α-1,6-푸코스가 없는 당쇄 함량은 20%, α-1,6-푸코스 결합 당쇄 함량은 80%이다. 이상의 결과로부터 FUT8 유전자를 과잉 발현시킴으로써 생성 항체의 α-1,6-푸코스 결합 당쇄 함량이 증가되는 것을 알았다.
도 30는 mfFUT8-6, pAGE249 도입주에 의해서 생성된 항체로부터 조제한 PA화 당쇄를 각각 역상 HPLC에서 분석하여 수득한 용리도를 도시한 것이다. 제30A도에 mfFUT8-6, 제30B도에 pAGE249의 용리도를 각각 도시한다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 각각 도시한다. 완충액 A로서 인산나트륨 완충액(pH 3.8), 완충액 B로서 인산나트륨 완충액(pH 3.8)+0.5% 1-부탄올을 사용하며 하기의 농도구배로 분석한다.
시간(분) 0 80 90 90.1 120
완충액 B(%) 0 60 60 0 0
도 30와 도 31에 도시된 (i) 내지 (ix)의 피크는 하기의 구조를 나타낸다.
(i)
Figure 112003012058801-pct00003
(ii)
Figure 112003012058801-pct00004
(iii)
Figure 112003012058801-pct00005
(iv)
Figure 112003012058801-pct00006
(v)
Figure 112003012058801-pct00007
(vi)
Figure 112003012058801-pct00008
(vii)
Figure 112003012058801-pct00009
(viii)
Figure 112003012058801-pct00010
(ix)
Figure 112003012058801-pct00011

GlcNAc는 N-아세틸글루코사민, Gal는 갈락토스, Man은 만노스, Fuc는 푸코스, PA는 피리딜아미노기를 나타낸다. 도 30와 도 31에서 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄군의 비율은 (i) 내지 (ix)중에서 (i) 내지 (iv)의 피크가 차지하는 면적, α-1,6-푸코스가 결합된 당쇄군의 비율은 (i) 내지 (ix)중에서 (v) 내지 (ix)의 피크가 차지하는 면적으로부터 산출한다.
실시예 12. CHO 세포 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자의 취득
(1)CHO 세포α-1,6-푸코실트랜스프라제(FUT8) cDNA 서열의 취득
실시예 9(1)에서 배양 2일째의 CH0/DG44 세포에서 조제한 일본쇄 cDNA에서 하기의 순서로 차이니즈 햄스터 FUT8 cDNA를 취득한다(도 32).
우선, 마우스 FUT8의 cDNA 서열(GenBank, AB025198)에서 5'측 비해독 영역에 특이적인 정배향 프라이머(서열 21에 기재한다) 및 3'측 비해독 영역에 특이적인 역배향 프라이머(서열 22에 기재한다)를 설계한다.
다음에 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 상기한 CHO/DG44 세포 유래 cDNA 1μl를 함유하는 25μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 4% DMSO, 0.5μmol/l 특이적 프라이머(서열 21 및 서열 22)]를 조제하며 PCR을 실시한다. PCR은 94℃에서 1분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 30사이클 후, 다시 72℃에서 10분 동안 가열하는 조건에서 실시한다.
PCR후, 반응액을 0.8% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 특이적 증폭 단편 약 2kb를 정제한다. 이러한 DNA 단편 4μl를 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen사제)의 설명서에 따라서 플라스미드 pCR2.1로 삽입하며 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환한다. 수득된 가나마이신 내성 콜로니 중에서 cDNA가 통합된 8 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리한다.
각 플라스미드에 삽입된 cDNA의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Parkin Elmer사제)를 사용하여 결정하며 방법은 첨부 매뉴얼에 따른다. 본 법에 따라 모든 삽입 cDNA가 CHO 세포 FUT8의 ORF 전체 길이를 함유하는 서열을 암호화하는 것을 확인한다. 이 중 PCR에 따르는 염기의 판독 오류를 당해 서열내에 전혀 포함하지 않는 플라스미드 DNA를 선택한다. 이하, 본 플라스미드를 CHfFUT8-pCR2.1이라고 칭한다. 결정한 CHO 세포 FUT8 cDNA의 염기서열을 서열 1에 기재한다. 또한, 당해 아미노산 서열을 서열 23에 기재한다.
(2)CHO 세포α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 게놈 서열의 취득
본 항(1)에서 취득한 CHO 세포 FUT8 ORF 전체 길이 cDNA 단편을 프로브로서 사용하며 CHO-K1세포 유래 λ-파아지 게놈 라이브러리(STRATEGENE사제)에서 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989) 등에 기재된 공지된 게놈 스크리닝 방법에 따라서 CHO 세포 FUT8 게놈 클론을 취득한다. 다음에 취득한 게놈 클론을 각종 제한효소를 사용하여 소화한 다음, CHO 세포 FUT8 cDNA의 개시 코돈을 함유하는 AfaI-Sau3AI 단편(약 280bp)을 프로브로서 서던 하이브리드화를 실시하며 양성을 나타내는 제한효소 단 편 중에서 XbaI-XbaI 단편(약 2.5kb) 및 SacI-SacI 단편(약 6.5kb)을 선택하여 pBluescriptII KS(+)(Strategene사제)로 각각 삽입한다.
취득한 각 게놈 단편의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Parkin Elmer사제)를 사용하여 결정하며 방법은 첨부 매뉴얼에 따른다. 본 법에 따라 XbaI-XbaI 단편은 CHO 세포 FUT8의 엑손2을 함유하는 상류 인트론 약 2.5kb의 서열을 SacI-SacI 단편은 CHO 세포 FUT8의 엑손2을 함유하는 하류 인트론 약 6.5kb의 서열을 각각 암호화하는 것을 확인한다. 이하, XbaI-XbaI 단편을 함유하는 플라스미드를 pFUT8fgE2-2, SacI-SacI 단편을 함유하는 플라스미드를 pFUT8fgE2-4라고 칭한다. 결정된 CHO 세포 FUT8의 엑손2을 함유하는 게놈 영역의 염기서열(약 9.0kb)을 서열 3에 기재한다.
실시예 13. α-1,6-푸코스 전이효소 유전자를 파괴한 CHO 세포의 작제와 당해 세포를 사용하는 항체의 생산
CHO 세포 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 엑손2을 함유하는 게놈 영역을 결실한 CHO 세포를 작제하며 당해 세포가 생산하는 항체의 ADCC 활성을 평가한다.
1.차이니즈 햄스터 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 엑손2 표적화 벡터 플라스미드 pKOFUT8Puro의 구축
(1)플라스미드 ploxPPuro의 구축
하기의 순서로 플라스미드 ploxPPuro를 구축한다(도 33).
플라스미드 pKOSelectPuro(Lexicon사제) 1.0μg을 NE 완충액4(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 AscI(New England Biolabs사제)를 가하고 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 퓨로마이신 내성 유전자 발현 유닛을 함유하는 약 1.5kb의 DNA 단편을 정제한다.
한편, 일본 공개특허공보 제(평)11-314512호에 기재된 플라스미드 ploxP 1.0μg을 NE 완충액4(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 AscI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 2.0Kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pK0SelectPuro 유래의 AscI-AscI 단편(약 1.5kb) 4.5μl, 플라스미드 ploxP 유래의 AscI-AscI 단편(약 2.0kb) 0.5μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하여 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, ploxPPuro라고 칭한다.
(2)플라스미드 pK0FUT8gE2-1의 구축
실시예 12(2)에서 수득한 차이니즈 햄스터 FUT8의 엑손2을 함유하는 게놈 영역을 갖는 플라스미드 pFUT8fgE2-2를 사용하며 하기의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-1을 구축한다(도 34).
플라스미드 pFUT8fgE2-2 2.0μg을 100μg/ml BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액 1(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 제한효소 SacI(NelvEngland Biolabs사제) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, 100μg/ml BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 EcoRV(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 1.5kb의 DNA 단편을 정제한다.
한편, 플라스미드 LITMUS28(New England Biolabs사제) 1.0μg을 100μg/ml BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액 1(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 제한효소 SacI(New England Biolabs사제) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, 100μg/ml BSA(New EDgland Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 EcoRV(New England Biolabs사제)를 가하고 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 2.8kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pFUT8fgE2-2 유래의 EcoRV-SacI 단편(약 1.5kb) 4.5μl, 플라스미드 LlTMUS28 유래의 EcoRV-SacI 단편(약 2.8kb) 0.5μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-1이라고 칭한다.
(3)플라스미드 pK0FUT8gE2-2의 구축
본 항(2)에서 수득한 플라스미드 pKOFUT8gE2-1을 사용하며 하기의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-2를 구축한다(도 35).
플라스미드 pK0FUT8gE2-1 2.0μg을 100μg/ml BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 제한효소 EcoRV(New England Biolabs사제) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, 10Oμg/ml BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액 1(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 20단위의 제한효소 KpnI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 1.5kb의 DNA 단편을 정제한다.
한편, 플라스미드 ploxPPuro 1.0μg을 NE 완충액4(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 제한효소 HpaI(New England Biolabs사제) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, 10Oμg/ml BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액 1(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 20단위의 제한효소 KpnI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 3.5kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pK0FUT8gE2-1유래의 EcoRV-KpnI 단편(약 1.5kb) 4.0μl, 플라스미드 ploxPPuro 유래의 HpaI-KpnI 단편(약 3.5kb) 1.0μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-2라고 칭한다.
(4)플라스미드 pscFUT8gE2-3의 구축
실시예 12(2)에서 수득한 차이니즈 햄스터 FUT8의 엑손2을 함유하는 게놈 영역을 갖는 플라스미드 pFUT8fgE2-4를 사용하며 하기의 순서로 플라스미드 pscFUT8gE2-3을 구축한다(도 36).
플라스미드 pFUT8fgE2-4 2.0μg을 NE 완충액 1(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 HpaI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, Blunting High(도요보사제)을 사용하며 첨부된 설명서에 따라서 DNA 말단의 평활화를 실시한다. 페놀/클로로포름 추출처리 및 에탄올 침전을 실시하여 DNA 단편을 회수한 다음, NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 HindIII(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 3.5kb의 DNA 단편을 정제한다.
한편, 플라스미드 LITMUS39(New England Biolabs사제) 1.0μg을 NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 EcoRV(New England Biolabs사제) 및 20단위의 제한효소 HindII1(New England Biolabs사제)를 가하고 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 2.8kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pFUT8fgE2-4 유래의 HpaII-HindIII 단편(약 3.5kb) 4.0μl, 플라스미드 LITMUS39 유래의 EcoRV-HindIII 단편(약 2.8kb) 1.0μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pscFUT8gE2-3이라고 칭한다.
(5)플라스미드 pKOFUT8gE2-3의 구축
실시예 12(2)에서 수득한 차이니즈 햄스터 FUT8의 엑손2을 함유하는 게놈 영역을 갖는 플라스미드 pFUT8fgE2-4를 사용하며 하기의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-3을 구축한다(도 37).
플라스미드 pFUT8fgE2-4 2.0μg을 NE 완충액 for EcoRI(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 EcoRI(New England Biolabs사제) 및 20 단위의 제한효소 HindIII(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 1.8kb의 DNA 단편을 정제한다.
한편, 플라스미드 pBluescriptII KS(+)(Strategene사제) 1.0μg을 NE 완충액 for EcoRI(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 EcoRI(New England Biolabs사제) 및 20단위의 제한효소 HindIII(New England Biolabs사제)를 가하고 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 O.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 3.0kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pFUT8fgE2-4 유래의 HindIII-EcoRI 단편(약 1.8kb) 4.0μl, 플라스미드 pBluescriptII KS(+) 유래의 HindIII-EcoRI 단편(약 3.0kb) 1.0μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pK0FUT8gE2-3이라고 칭한다.
(6)플라스미드 pK0FUT8gE2-4의 구축
본 항(4) 및 (5)에서 수득한 플라스미드 pscFUT8gE2-3 및 pK0FUT8gE2-3을 사용하며 하기의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-4를 구축한다(도 38).
플라스미드 pscFUT8gE2-3 1.0μg을 100μg/ml BSA(New Endand Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액 for SalI(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 제한 효소 SalI(New England Biolabs사제) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, NE 완충액2(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 20단위의 제한효소 HindIII(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 3.6kb의 DNA 단편을 정제한다.
한편, 플라스미드 pK0FUT8gE2-3 1.0μg을 100μg/ml BSA(New England Biolabs사제)를 함유하는 NE 완충액 for SalI(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 제한효소 SalI(New England Biolabs사제) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, NE 완충액2(New England Biolabs사제) 35μl에 용해하며 20단위의 제한효소 HindIII(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, pH 8.0의 1mol/l Tris-HCl 완충액 35μl 및 대장균 C15주 유래 알칼린 포스파타제(다카라슈조사제) 3.5μl를 첨가하여 65℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈 인산화를 실시한다. 탈 인산화 처리후, 페놀/클로로포름 추출처리 및 에탄올 침전을 실시하며 회수한 DNA 단편을 멸균수 10μl에 용해한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pscFUT8gE2-3 유래의 SalI-HindIII 단편(약 3.1kb) 4.0μl, 플라스미드 pK0FUT8gE2-3 유래의 SalI-HindIII 단편(약 4.8kb) 1.0μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴 으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-4라고 칭한다.
(7)플라스미드 pKOFUT8gE2-5의 구축
본 항(3) 및 (6)에서 수득한 플라스미드 pK0FUT8gE2-2 및 pKOFUT8gE2-4를 사용하며 하기의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-5를 구축한다(도 39).
플라스미드 pK0FUT8gE2-2 1.0μg을 NE 완충액4(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 제한효소 SmaI(New England Biolabs사제) 20단위를 가하여 25℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, NE 완충액2(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 20단위의 제한효소 BamHI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, pH 8.0의 1mol/l Tris-HCl 완충액 30μl 및 대장균 C15주 유래 알칼린 포스파타제(다카라슈조사제) 3.0μl를 첨가하여 65℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈 인산화를 실시한다. 탈 인산화 처리후, 페놀/클로로포름 추출처리 및 에탄올 침전을 실시하며 회수한 DNA 단편을 멸균수 10μl에 용해한다.
한편, 플라스미드 pK0FUT8gE2-4 1.0μg을 NE 완충액4(New England Biolabs사제) 30μl에 용해하며 제한효소 SmaI(New England Biolabs사제) 20단위를 가하고 25℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, NE 완충액2(New England Biolabs사제) 30μl에 용 해하며 20단위의 제한효소 BamHI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 5.2kb의 DNA 단편을 정제한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pKOFUT8gE2-2 유래의 SmaI-BamHI 단편(약 5.0kb) 0.5μl, 플라스미드 pKOFUT8gE2-4 유래의 SmaI-BamHI 단편(약 5.4kb) 4.5μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하며 16℃에서 15시간 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pK0FUT8gE2-5라고 칭한다.
(8)플라스미드 pKOFUT8Puro의 구축
본 항(7)에서 수득한 플라스미드 pK0FUT8gE2-5를 사용하며 하기의 순서로 플라스미드 pKOFUT8Puro를 구축한다(도 40).
플라스미드 pKOSelectDT(Lexicon사제) 1.Oμg을 NE 완충액4(New England Biolabs사제) 50μl에 용해하며 제한효소 RsrII(New England Biolabs사제) 16단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, 당해 액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 디프테리아톡신 발현 유닛을 함유하는 약 1.2kb의 DNA 단편을 정제한다.
한편, 플라스미드 pK0FUT8gE2-5 1.0μg을 NE 완충액4(New England Biolabs사제) 50μl에 용해하며 제한효소 RsrII(New England Biolabs사제) 16단위를 가하여 37℃에서 2시간 동안 분해반응을 실시한다. 소화 반응시킨 다음, pH 8.0의 1mol/l Tris-HCl 완충액 30μl 및 대장균 C15주 유래 알칼린 포스파타제(다카라슈조사제) 3.0μl를 첨가하고 65℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈 인산화를 실시한다. 탈 인산화 처리후, 페놀/클로로포름 추출처리 및 에탄올 침전을 실시하며 회수한 DNA 단편을 멸균수 10μl에 용해한다.
상기에서 수득한 플라스미드 pK0Select DT 유래의 RsrII-RsrII 단편(약 1.2kb) 1.0μl, 플라스미드 pK0FUT8gE2-5 유래의 RsrII-RsrII 단편(약 10.4kb) 1.0μl, 멸균수 3.0μl, Ligation High(도요보사제) 5.0μl를 혼합하며 16℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 결합반응을 실시한다. 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 수득되는 암피시린 내성 클론에서 공지된 방법에 따라서 각각 플라스미드 DNA를 단리한다. 본 플라스미드를 이하, pK0FUT8Puro라고 칭한다.
2.α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 엑손2을 함유하는 게놈 영역를 1카피 파괴한 CHO 세포의 작제
(1)표적 벡터의 도입
본 실시예 제1항에서 구축한 차이니즈 햄스터 FUT8 게놈 영역 표적 벡터 pK0FUT8Puro를 실시예 8의 1(2)에서 작제한 5-03주로 도입한다.
플라스미드 pKOFUT8Puro의 5-03주로의 유전자 도입은 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]에 준해 하기의 순서로 실시한다. 우선, 플라스미드 pKOFUT8Puro 150μg을 NE 완충액 for SalI(New England Biolabs사제) 1.8ml에 용해하며 600단위의 제한효소 SalI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 5시간 동안 분해반응을 실시함으로써 선형화한다. 당해 반응액에 대하여 페놀/클로로포름 추출처리 및 에탄올 침전을 실시하며 회수한 선형화 플라스미드를 1μg/μl 수용액으로 한다. 한편, 5-03주를 K-PBS 완충액(137mmol/l KC1, 2.7mmol/l NaCl, 8.1mmo1/l Na2HPO4, 1.5mmol/l KH2HPO4, 4.0mmol/l MgCl2)에 현탁하여 8×107개/ml로 한다. 세포 현탁액 200μl(1.6x106개)를 선형화 플라스미드 4μl(4μg)와 혼화한 다음, 세포-DNA 혼화액의 전량을 Gene Pulser Cuvette(전극간 거리 2mm)(BI0-RAD사제)로 옮기며 세포 융합장치 Gene Pulser(BI0-RAD사제)를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250μF의 조건에서 유전자 도입을 실시한다. 동일하게 하여 큐베트 30개분에 대하여 유전자 도입한 다음, 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청(Life Technologies사제) 및 1배 농도의 HT supp1ement(Life Technologies사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)에 현탁하며 접착 세포 배양용 10cm 디쉬(Falcon사제) 30장에 파종한다. 5% C02, 37℃의 조건하에 24시간 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 제거하며 15μg/ml 푸로마이신(SIGMA사제) 및 10% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)를 10ml씩 분주한다. 이러한 배지 교환작업을 3 내지 4일마다 반복하면서 10일 동안의 배양을 실시하며 퓨로마이신 내성주를 취득한다.
(2)표적 벡터 도입주의 취득
본 항(1)에서 수득한 퓨로마이신 내성주에서 임의의 900개의 콜로니를 하기의 순서로 채취한다.
우선, 퓨로마이신 내성주가 출현한 10cm 디쉬에서 배양 상등액을 제거하며 인산 완충액 7ml를 주입한 다음, 실체 현미경 밑으로 옮긴다. 다음에 피페트 맨(GlLSON사제)를 사용하여 콜로니를 긁어 취하여 흡입하고 둥근 바닥 96웰 플레이트(Falcon사제)에서 채취한다. 트립신 처리를 실시한 다음, 접착 세포용 평평한 바닥 96웰 플레이트(이와키가라스사제)에서 각 클론을 파종하며 15μg/ml 푸로마이신(SIGMA사제) 및 10% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)를 사용하여 1주 동안 배양한다.
배양한 다음, 플레이트의 각 클론에 대하여 트립신 처리를 실시하며 2배량의 동결 배지(20% DMS0, 40% 소 태아 혈청, 40% IMDM)와 혼화한다. 이 중 반량을 접착 세포용 평평한 바닥 96웰 플레이트(이와키가라스사제)에서 파종하여 레플리카 플레이트로 하는 한편, 나머지의 반량을 마스터 플레이트로서 동결 보존에 제공한다. 레플리카 플레이트는 15μg/ml 푸로마이신(SIGMA사제) 및 10% 소 태아 투석 혈청(Life Teckmologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)를 사용하여 1주 동안 배양한다.
(3)게놈 PCR에 의한 상동 재조합의 진단
본 항(2)에서 수득한 900클론에 대해 하기의 순서로 게놈 PCR에 의한 상동 재조합의 진단을 한다.
우선, 본 항(2)에서 작제한 레플리카 플레이트에서 공지된 방법[어낼리티컬·바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 201, 331(1992)]에 따라서 각 클론의 게놈 DNA를 조제하고 각각 TE-RNase 완충액(pH 8.0) (10mmol/l Tris-HCl, 1mmo1/l EDTA, 200μg/ml RNaseA) 30μl에 밤새 용해한다. 또한, 실시예 12.에서 수득한 FUT8 게놈 영역중 표적 벡터 상동영역을 초과하는 부분의 서열에 결합되는 프라이머(서열 26에 기재한다) 및 벡터 내의 loxP 서열에 결합되는 프라이머(서열 27에 기재한다)를 설계한다.
DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 상기에서 조제한 게놈 DNA 용액을 각각 10μl 함유하는 25μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 26 및 서열 27)]을 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다. PCR은 94℃에서 3분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 60℃에서 1분 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로 하는 38사이클의 조건에서 실시한다.
PCR후, 반응액을 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 CHO 세포 게놈 영역과 표적 벡터 상동영역의 경계부를 함유하는 약 1.7kb의 특이적 증폭이 확인되는 것을 양성 클론으로 한다. 본 법에 따라 양성을 나타내는 1클론을 밝혀냈다.
(4)게놈 서던 블롯에 의한 상동 재조합의 진단
본 항(3)에서 양성이 확인된 1클론에 대해 하기의 순서로 게놈 서던 블롯에 의한 상동 재조합의 진단을 한다.
본 항(2)에서 동결 보존한 마스터 플레이트 중에서 본 항(3)에서 밝혀낸 양성 클론을 함유하는 96웰 플레이트를 선택하며 5% C02, 37℃의 조건하에 10분 동안 정치한다. 정치후, 양성 클론에 해당하는 웰로부터 세포를 접착 세포용 평평한 바닥 24웰 플레이트(Greiner사제)에서 파종한다. 15μg/ml 푸로마이신(SIGMA사제) 및 10% 소 태아 투석 혈청(Life Teckmologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)를 사용하여 1주 동안 배양한 다음, 접착 세포용 평평한 바닥 6웰 플레이트(Greiner사제)에서 파종한다. 당해 플레이트에서 공지된 방법[뉴클레익·애시드·리서치(Nucleic Acids Research), 3, 2303(1976)]에 따라서 각 클론의 게놈 DNA를 조제하고 각각 TE-RNase 완충액(pH 8.0) (10mmol/l Tris-HCl, 1mmol/l EDTA, 200μg/ml RNaseA) 150μl에 밤새 용해한다.
상기에서 조제한 게놈 DNA 12μg을 NE 완충액3(New England Biolabs사제) 120μl에 용해하며 25단위의 제한효소 PstI(New England Biolabs사제)를 가하여 37℃에서 밤새 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, TE 완충액(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl, 1mmol/l EDTA) 20μl에 용해하고 0.8%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공한다. 영동후, 공지된 방법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683(1979)]에 따라서 나일론 막에 게놈 DNA를 전사한다. 전사 종료후, 나일론 막에 대하여 80℃에서 2시간의 열처리를 실시한다.
한편, 서던 블롯에 사용하는 프로브를 하기와 같이 조제한다. 우선, 실시예 12에서 수득한 FUT8 게놈 영역중 표적 벡터 상동영역을 초과하는 부분의 서열에 결합되는 프라이머(서열 28 및 서열 29)를 설계한다. 다음에 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 실시예 12(2)에서 수득한 플라스미드 pFUT8fgE2-2 4.0ng를 함유하는 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, 0.5μmol/l 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 28 및 서열 29)]를 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다. PCR은 94℃에서 1분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 74℃에서 1분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로 하는 25사이클의 조건에서 실시한다. PCR후, 반응액을 1.75%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 230bp의 프로브 DNA 단편을 정제한다. 수득된 프로브 DNA 용액 5μl에 대해 [α-32P]dCTP 1.75MBq 및 Megaprhne DNA LabelBamg system, dCTP(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 사용하여 방사선 표지한다.
하이브리드화는 하기와 같이 실시한다. 우선, 상기한 나일론 막을 로울러 보틀에 밀봉하고 하이브리드화액[5×SSPE, 50×Denhaldt's액, 0.5%(w/v) SDS, 100μg/ml 연어 정자 DNA] 15ml를 가하여 65℃에서 3시간의 예비 하이브리드화를 실시한다. 다음에 32P 표지한 프로브 DNA를 열변성하여 보틀에 투입하며 65℃에서 밤새 가온한다.
하이브리드화 후, 나일론 막을 2×SSC-0.1%(w/v) SDS 50ml에 침지하여 65℃에서 15분 동안 가온한다. 상기한 세정조작을 2회 반복한 다음, 막을 0.2×SSC-0.1%(w/v) SDS 50ml에 침지하며 65℃에서 15분 동안 가온한다. 세정한 다음, 나일론 막을 X선 필름에서 80℃로 이틀밤 폭로하여 현상한다.
상기한 제한효소 PstI 처리에 의해 야생형 FUT8 대립 유전자로부터 약 4.4kb의 DNA 단편이 생긴다. 한편, 상기 제한효소 처리에 의해 표적 벡터와의 상동 재조합이 일어난 대립 유전자로부터 약 6.0kb의 DNA 단편이 생긴다.
본 법에 따라 본 항(3)에서의 양성 클론의 게놈 DNA에서 약 4.4kb 및 약 6.0kb의 특이적 단편을 밝혀냈다. 양쪽 단편의 양비가 1:1이므로 본 클론은 FUT8 대립 유전자를 1카피 파괴한 클론인 것이 확인된다. 본 클론을 이하, 1st. △FUT8 2-46주라고 칭한다.
3.α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자를 1카피 파괴한 CHO 세포로부터의 약제 내성 유전자의 제거
(1)Cre 리콤비나제 발현 벡터의 도입
본 실시예 제2항에서 작제한 1st. △FUT8 2-46주로(에), Cre 리콤피나제 발현 벡터pBS185(Life Technologies사제)를 도입한다.
플라스미드 pBS185의 1st. △FUT8 2-46주로의 유전자 도입은 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology); 3, 133(1990)]에 준하여 하기의 순서로 실시한다. 우선, 1st. △FUT8 2-46주를 K-PBS 완충액[137mmol/l KCl, 2.7mmol/l NaCl, 8.1mmol/l Na2HPO4, 1.5mmol/l KH2PO4, 4.0mmol/l MgCl2 ]에 현탁하여 8×107개/ml로 한다. 세포 현탁액 200μl(1.6×106개)를 플라스미드 pBS185 4μg과 혼화한 다음, 세포-DNA 혼화액의 전량을 Gene Pulser Cuvette(전극간 거리 2mm)(BI0-RAD사제)로 옮기며 세포 융합장치 Gene Pulser(BIO-RAD사제)를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기용량 250μF의 조건에서 유전자 도입을 실시한다. 도입한 후, 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청(Life Technologies사제) 및 1배 농도의 HT 보충액(Life Technologies사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제) 10ml에 현탁한 다음, 상기 배지를 사용하여 2만배 희석한다. 접착 세포 배양용 10cm 디쉬(Falcon사제) 7장에 파 종한 다음, 5% C02, 37℃의 조건하에 24시간 동안 배양한다. 배양한 다음, 상등액을 제거하며 10% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)를 10ml씩 분주한다. 이러한 배지 교환작업을 3 내지 4일마다 반복하면서 10일 동안의 배양을 한다.
(2)Cre 리콤비나제 발현 벡터 도입주의 취득
본 항(1)에서 수득한 주에서 임의의 40O개의 콜로니를 하기의 순서로 채취한다.
우선, 10cm 디쉬에서 배양 상등액을 제거하며 인산 완충액 7ml를 주입한 다음, 실체 현미경 하에 옮긴다. 다음에 피페트 맨(GILSON사제)를 사용하여 콜로니를 긁어 취하여 흡입하고 둥근 바닥 96웰 플레이트(Falcon사제)에서 채취한다. 트립신 처리를 실시한 다음, 접착 세포용 평평한 바닥 96웰 플레이트(이와키가라스사제)에서 각 클론을 파종하며 10% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Tecbnologies사제)를 사용하여 1주 동안 배양한다.
배양한 다음, 플레이트의 각 클론에 대하여 트립신 처리를 실시하며 2배량의 동결 배지(20% DMSO, 40% 소 태아 혈청, 40% IMDM)와 혼화한다. 이 중 반량을 접착 세포용 평평한 바닥 96웰 플레이트(이와키가라스사제)에 파종하여 레플리카 플레이트를 작제하는 한편, 나머지의 반량을 마스터 플레이트로서 동결 보존에 제공한다.
다음에 레플리카 플레이트를 15μg/ml 푸로마이신(SIGMA사제) 및 10% 소 태 아 투석 혈청(Life Technologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)를 사용하여 6일 동안 배양한다. Cre 리콤비나제의 발현에 의해 loxP 서열에 끼워진 퓨로마이신 내성 유전자가 제거된 양성 클론은 퓨로마이신 존재하에 사멸한다. 본 선택법에 따라 91개의 양성 클론을 찾아낸다.
(3)게놈 서던 블롯에 의한 약제 내성 유전자 제거의 진단
본 항(2)에서 밝혀낸 양성 클론 중 임의의 6 클론에 대해 하기의 순서로 게놈 서던 블롯에 의한 약제 내성 유전자 제거의 진단을 한다.
본 항(2)에서 동결 보존한 마스터 플레이트 중에서 상기 6 클론을 함유하는 96웰 플레이트를 선택하며 5% C02, 37℃의 조건하에 10분 동안 정치한다. 정치후, 상기 클론에 해당하는 웰로부터 세포를 접착 세포용 평평한 바닥 24웰 플레이트(Greiner사제)로 파종한다. 10% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)를 사용하여 1주 동안 배양한 다음, 접착 세포용 평평한 바닥 6웰 플레이트(Greiner사제)에 파종한다. 당해 플레이트에서 공지된 방법[뉴클레익·애시드·리서치(Nucleic Acids Research), 3, 2303(1976)]에 따라서 각 클론의 게놈 DNA를 조제하고 각각 TE-RNase 완충액(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl, 1mmol/l EDTA, 200μg/ml RNase A) 150μl에 밤새 용해한다.
상기에서 조제한 게놈 DNA 12μg을 NE 완충액 for BamHI(New England Biolabs사제) 120μl에 용해하며 20단위의 제한효소 BamHI(New England Biolabs사 제)를 가하여 37℃에서 밤새 분해반응을 실시한다. 당해 반응액에서 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 다음, TE 완충액(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl, 1mmol/l EDTA) 20μl에 용해하고 O.4%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공한다. 영동후, 공지된 방법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683(1979)]에 따라서 나일론 막에 게놈 DNA를 전사한다. 전사 종료후, 나일론 막에 대하여 80℃에서 2시간의 열처리를 실시한다.
한편, 서던 블롯에 사용하는 프로브를 하기와 같이 조제한다. 우선, 실시예 12에서 수득한 FUT8 게놈 영역 중에서 표적 벡터 상동영역을 초과하는 부분의 서열에 결합되는 프라이머(서열 30 및 서열 31)를 설계한다. 다음에 DNA 폴리머라제 ExTaq(다카라슈조사제)를 사용하여 실시예 12(2)에서 수득한 플라스미드 pFUT8fgE2-2 4.0ng를 함유하는 20μl의 반응액[ExTaq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mmol/l dNTPs, O.5μmol/l 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 30 및 서열 31)]을 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다. PCR은 94℃에서 1분 동안 가열한 다음, 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안, 74℃에서 1분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로 하는 25사이클의 조건에서 실시한다. PCR후, 반응액을 1.75%(w/v) 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 약 230bp의 프로브 DNA 단편을 정제한다. 수득된 프로브 DNA 용액 5μl에 대해 [α-32P]dCTP 1.75MBq 및 메가프라임 DNA 표지 시스템, dCTP(Amersham Pharmacia Biotech사제)를 사용하여 방사선 표지 한다.
하이브리드화는 하기와 같이 실시한다. 우선, 상기한 나일론 막을 로울러 보틀에 밀봉하고 하이브리드화액(5×SSPE, 50×Denhaldt's 액, 0.5%(w/v) SDS, 100μg/ml 연어 정자 DNA) 15ml를 가하여 65℃에서 3시간의 예비 하이브리드화를 실시한다. 다음에 32P 표지한 프로브 DNA를 열변성하여 보틀에 투입하며 65℃에서 밤새 가온한다.
하이브리드화 후, 나일론 막을 2×SSC-0.1%(w/v) SDS 50ml에 침지하며 65℃에서 15분 동안 가온한다. 상기한 세정조작을 2회 반복한 다음, 막을 0.2×SSC-0.1%(w/v) SDS 50ml에 침지하며 65℃에서 15분 동안 가온한다. 세정한 다음, 나일론 막을 X선 필름에 80℃에서 2일 동안 노출하여 현상한다.
상기한 제한효소 BamHI 처리에 의해 야생형 FUT8 대립 유전자로부터 약 19.0kb의 DNA 단편이 생긴다. 또한, 제한효소 처리에 의해 표적 벡터와의 상동 재조합이 일어난 대립 유전자로부터 약 12.5kb의 DNA 단편이 생긴다. 또한, 상동 재조합이 일어난 대립 유전자로부터 퓨로마이신 내성 유전자(약 1.5kb)가 제거된 경우에는 동처리에 의해 약 11.0kb의 DNA 단편이 생긴다.
본 법에 따라 상기 6 클론중 5 클론의 게놈 DNA에서 약 19.0kb 및 약 11.0kb의 특이적 단편을 밝혀냈다. 양쪽 단편의 양비가 1:1이므로 FUT8 게놈영역을 1카피 파괴한 주에서 퓨로마이신 내성 유전자가 제거된 것으로 나타난다. 본 클론을 이하, 1st. △FUT8 2-46-1주라고 칭한다. 또한, 상기한 1st. △FUT8 2-46-1주, 1st. △FUT8 2-46주 및 5-03주의 게놈 서던의 결과를 도 41에 도시한다. 또 1st. △FUT8 2-46-1주는 2-46-1의 주명으로 평성13년 9월26일부로 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터(이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 쥬오 제6)에 FERM BP-7755로서 기탁되어 있다.
4.α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 파괴주가 생성하는 항체의 정제
본 실시예 제3항에서 수득한 FUT8 대립 유전자를 1카피 파괴한 주 1st. △FUT8 2-46-1주를 3×105개/ml의 밀도로 15μg/ml 푸로마이신(SIGMA사제) 및 10% 소 태아 투석 혈청(Life Technologie사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)에서 현탁한 다음, 접착 세포 배양용 T182 플라스크(Greiner사제) 2개에 계 60ml 각각 파종한다. 3일 동안의 배양한 다음, 상등액을 제거하며 EXCELL301 배지(JRH Biosciences사제) 계 60ml로 교환한다.
이들을 37℃의 5% C02 인큐베이터 속에서 7일 동안 배양한 다음, 생세포수를 카운트하여 생존성이 동일한 정도(각각 30% 이하)인 것을 확인한 다음, 각 세포 현탁액을 회수한다. 당해 세포 현탁액에 대하여 3000rpm, 4℃의 조건에서 10분 동안의 원심분리를 실시하여 상등액을 회수하며 10000rpm, 4℃의 조건에서 1시간의 원심분리를 실시한 다음, 0.22μm 웰 직경 150ml 용적 PES Filter Unit(NALGENE사제)를 사용하여 여과한다.
0.8cm 직경의 칼럼에 Prosep-A HighCapacity(bioPR0CESSING사제)를 두께 2cm로 충전하고, 0.1mol/l 시트르산 완충액(pH 3.0) 10ml 및 1mol/l 글리신/Na0H- 0.15mol/l NaCl 완충액(pH 8.6) 10ml로 순차적으로 세정함으로써 담체의 평형화를 실시한다. 다음에 배양 상등액 각 10Oml를 칼럼에 통과시키고 1mol/l 글리신/NaOH-0.15mol/l NaCl 완충액(pH 8.6) 50ml로 세정한다. 세정한 다음, 0.1mol/l 시트르산 완충액(pH 3.0) 2.5ml를 사용하여 Prosep-A에 흡착한 항체의 용출을 실시하며 용출액을 500μl씩 분획하는 동시에 각 분획을 각각 2mol/l Tris-HCl(pH 8.5) 100μl와 혼합하여 중화한다. BCA법[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 150, 76(1985)]을 사용하여 항체를 고농도로 함유하는 2분획(계 1.2ml)를 선택하여 합일하며 10mol/l 시트르산-0.15mol/l NaCl 완충액(pH 6.0)을 사용하여 4℃에서 하루 동안 투석을 실시한다. 투석후, 항체 용액을 회수하고 O.22μm 웰 직경 Mil1ex GV(MILLIPORE사제)를 사용하여 멸균 여과한다.
5.α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자 파괴주가 생성하는 항체의 시험관내 세포 억제 활성(ADCC 활성)
본 실시예 제4항에서 정제한 항 CCR4 항체의 시험관내 세포 억제 활성을 평가하기 위해 실시예 8에 기재된 CCR4 양성 세포주 CCR4/EL-4를 사용하는 ADCC 활성을 실시한다.
10% 소 태아 혈청(Life Technologie사제)를 함유하는 RPMI 1640 배지(Life Technologie사제)(이하, RPMI 1640-FBS(10)라고 약칭한다)에서 계대 배양한 CCR4/EL-4주 1x106개를 RPMI 1640-FBS(10) 500μl에 현탁하고 Na2 51CrO 4 3.7MBq를 첨 가하고 37℃에서 90분 동안 배양함으로써 세포의 방사선 표지를 실시한다. 1200rpm에서 5분의 원심분리를 실시한 다음, 상등액을 제거하며 표지 세포를 RPMI 1640-FBS(10) 5ml에 현탁한다. 이러한 세정조작을 3회 반복한 다음, 세포 현탁액을 빙상에서 30분 동안 정치하여 방사성 물질을 자연 해리시킨다. 다시 상기한 세정조작을 2회 반복한 다음, RPMI 1640-FBS(10) 5ml에 현탁함으로써 2.O×105개/ml의 표적 세포 현탁액을 조제한다.
한편, 건강한 사람의 정맥혈 30ml를 채취하고, 헤파린나트륨(시미즈세이야쿠사제) 0.5ml를 가하여 조심스럽게 혼화한 다음, 생리적 식염수(오쓰카세이야쿠사제) 30ml와 혼합한다. 혼합후, 각 10ml를 각각 림포프렙(NYCOMED PHARMA AS사제) 4ml 위에 조심스럽게 중층하며 실온하 2000rpm에서 30분 동안의 원심분리를 실시한다. 분리된 단핵구 분획을 각 원심관에서 수집하여 합일하며 RPMI 1640-FBS(10) 30ml에 현탁한다. 실온하 1200rpm에서 15분의 원심분리를 실시한 다음, 상등액을 제거하며 당해 세포를 RPMI 1640-FBS(10) 20ml에 현탁한다. 이러한 세정조작을 2회 반복한 다음, RPMI 1640-FBS(10)를 사용하여 2.5×105개/ml의 효능인자 세포 현탁액을 조제한다.
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사제)의 각 웰에 표적 세포 현탁액을 50μl씩(1×104개/웰) 분주한다. 계속해서 각 웰에 효능인자 세포 현탁액을 100μl씩(2.5×105개/웰) 분주함으로써 효능인자 세포와 표적 세포의 비를 25:1로 한다. 다음에 RPMI 1640-FBS(10)를 사용하여 본 실시예 제5항에서 수득한 각 항 CCR4 항체에서 0.01μg/ml, O.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml의 희석계열을 조제하고 당해 희석 용액을 각 웰에 50μl 첨가함으로써 종료 농도 0.0025μg/ml, 0.025μg/ml, 0.25μg/ml, 2.5μg/ml로 한다. 5% C02, 37℃의 조건하에 4시간 동안 반응시킨 다음, 플레이트에 대해 1200rpm에서 5분의 원심분리를 실시한다. 각 웰의 상등액 75μl를 12mm 직경 RIA 튜브(IWAKI사제)에 분취하며 MINAX-α오토 감마 카운터5550(PACKRD사제)를 사용하여 해리 51Cr 양의 측정을 실시한다.
또한, 효능인자 세포 현탁액 및 항체 용액을 대신하여 RPMI 1640-FBS(10) 150μl를 첨가한 시스템에서 상기한 반응을 실시함으로써 자연 해리 51Cr 양의 값을 구한다. 또한 효능인자 세포 현탁액 및 항체 용액을 대신하여 1규정 염산 100μl 및 RPMI 1640-FBS(10) 50μl를 첨가한 시스템에서 상기한 반응을 실시함으로써 전체 해리 51Cr 양의 값을 구한다. 이들의 값을 사용하여 수학식 II에 의해 ADCC 활성을 구한다.
도 42에 각종 항 CCR4 항체의 ADCC 활성을 나타낸다. FUT8 대립 유전자를 1카피 파괴한 1st. △FUT8 2-46-1주에서 수득한 항체는 당해 유전자 파괴전의 CHO 세포 5-03주가 생성하는 항체와 비교하여 유의적으로 높은 ADCC 활성을 나타낸다. 또한, 이들 항체에서의 항원 결합 활성에는 변화는 관찰되지 않는다. 이상의 결과에서 숙주세포의 FUT8 대립 유전자를 파괴함으로써 생성 항체의 ADCC 활성을 향상 할 수 있는 것이 확인된다.
실시예 14. 렉틴 내성 CHO/DG44 세포의 작제와 당해 세포를 사용하는 항체의 생산
(1)렉틴 내성 CHO/DG44주의 취득
CHO/DG44 세포를 IMDM-FBS(10) 배지[소 태아 혈청(FBS)을 10%, HT 보충액(GlBCO BRL사제)를 1배 농도 함유하는 IMDM 배지]로써 접착 배양용 플라스크 75cm2(글라이나사제) 속에서 배양하며 합류점 직전까지 증식시킨다. 5ml의 달베코 PBS(인비트로젠사제)로써 세포를 세정한 다음, 달베코 PBS에서 희석한 0.05% 트립신(인비트로젠사제)를 1.5ml첨가하여 37℃에서 5분 동안 방치하고 세포를 배양기 바닥면으로부터 박리시킨다. 박리시킨 세포를 통상적인 세포 배양에서 실시되는 원심조작에 의해 회수하며 1x105 세포/ml의 밀도로 되도록 IMDM-FBS(10) 배지를 첨가하고 현탁한 다음, 미첨가 또는 0.1g/ml의 알킬화제인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin(이하, MNNG라고 표기, Sigma사제)를 첨가한다. CO2 인큐베이터(TABAI제) 속에서 37℃에서 3일 동안 방치한 다음, 배양 상등액을 제거하며 다시 상기한 조작과 동일한 조작으로 세포를 세정, 박리, 회수하며 IMDM-FBS(10) 배지에 현탁한 다음, 접착 배양용 96웰 플레이트(이와키가라스사제)에 1000세포/웰의 밀도로 파종한다. 각 웰에는 배지중 종료 농도로 1mg/ml의 렌즈 콩 응집소(렌즈 쿨리나리스 응집소; 이하, LCA이라고 표기, Vector사제) 또는 1mg/ml의 진홍색 공기 대나무 응집소(알레우리아 아우란티아 렉틴; 이하, AAL이라고 표기, Vector사제) 또는 1mg/ml의 까치콩 응집소(파세올루스 불가리스 백혈 응집소; 이하, L-PHA라고 표기, Vector사제)를 첨가한다. C02 인큐베이터 속에서 37℃로 2주 동안 배양한 다음, 출현한 콜로니를 렉틴 내성 CHO/DG44주로서 취득한다. 취득한 각각의 렉틴 내성 CHO/DG44주에 관해서는 LCA 내성주를 CHO-LCA주, AAL 내성주를 CHO-AL주, L-PHA 내성주를 CH0-PHA주라고 명명한다. 취득한 이들 주의 각종 렉틴에 대한 내성을 조사한 바, CHO-LCA주는 AAL에 대하여도 내성이며 CHO-AAL주는 LCA에 대하여도 내성인 것을 알았다. 또한, CHO-LCA주 및 CHO-AAL주는 LCA나 AAL이 인식하는 당쇄 구조와 동일한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴, 즉 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민 잔기의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합으로 부가된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 대하여도 내성을 나타낸다. 구체적으로는 종료 농도 1mg/ml의 완두콩 응집소(Pisum sativum Agglutinin; 이하, PSA라고 표기, Vector사제)가 첨가된 배지에서도 CHO-LCA주 및 CHO-AAL주는 내성을 나타내며 생존하는 것을 알았다. 또한, 알킬화제 MNNG 무첨가의 경우라도 상기한 처리를 실시하는 세포수를 증가시키는 것으로 렉틴 내성주를 취득할 수 있다. 이후, 이들 주를 해석에 사용한다.
(2)항 CCR4 사람형 키메라 항체 생산세포의 작제
상기(1)에서 수득한 3종류의 렉틴 내성주에 실시예 8에 기재한 방법에서 항 CCR4 사람형 키메라 항체 발현 플라스미드 pKANTEX2160을 도입하며 약제 MTX에 의한 유전자 증폭을 실시하며 항 CCR4 사람형 키메라 항체 생산주를 작제한다. 항체 발현량의 측정은 실시예 8의 2에 기재한 ELISA법을 사용하여 실시하며 CHO-LCA주, CH0-AAL주, CH0-PHA주, 각각으로부터 항체를 발현하는 형질전환주를 취득한다. 취득한 각각의 형질전환주에 관해서는 CH0-LCA주 유래의 형질전환주를 CH0/CCR4-LCA주, CH0-AAL주 유래의 형질전환주를 CH0/CCR4-AAL주, CHO-PHA주 유래의 형질전환주를 CHO/CCR4-PHA주라고 명명한다. 또 CH0/CCR4-LCA주는 Nega-13의 주명으로 평성13년 9월26일부로 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물기탁센터(이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 쥬오 제6)에 FERM BP-7756로서 기탁되어 있다.
(3)렉틴 내성 CHO 세포에 의한 고 ADCC 활성 항체의 생산
상기(2)에서 수득된 3종류의 형질전환주를 사용하며 실시예 8의 3에 기재한 방법으로 정제 항체를 취득한다. 각 항 CCR4 사람형 키메라 항체 정제 표준품의 항원 결합 활성은 실시예 8의 2에 기재한 ELISA법을 사용하여 평가한다. 어떤 형질전환주가 생산하는 항체도 실시예 8에서 작제한 통상적인 CH0/DG44 세포를 숙주로 하는 재조합 세포주(5-03주)가 생산하는 항체와 동등한 항원 결합 활성을 나타낸다. 이들 정제 항체를 사용하며 실시예 8의 7에 기재한 방법에 따라 각 항 CCR4 사람형 키메라 항체 정제 표준품의 ADCC 활성을 평가한다. 그 결과를 도 43에 기재한다. 5-03주가 생산한 항체와 비교하여 CH0/CCR4-LCA주 및 CH0/CCR4-AAL주가 생산한 항체로서는 약 100배 정도의 ADCC 활성의 상승이 관찰된다. 한편, CHO/CCR4-PHA주가 생산한 항체로서는 유의적인 ADCC 활성의 상승은 관찰되지 않는다. 또한, CH0/CCR4-LCA주와 YB2/0주가 생산한 항체의 ADCC 활성을 실시예 8의 7에 기재한 방법에 따라 비교한 바, CHO/CCR4-LCA주가 생산한 항체는 실시예 8의 1 에서 작제한 YB2/0 세포주가 생산한 항체 KM2760-1과 동일하게 5-03주가 생산한 항체와 비교하여 높은 ADCC 활성을 나타내는 것이 명백해진다(도 44).
(4)렉틴 내성 CHO 세포가 생산하는 항체의 당쇄 해석
상기(3)에서 정제한 항 CCR4 사람형 키메라 항체의 당쇄 해석을 실시한다. 정제한 각각의 항체를 울트라프리 0.5-10K(밀리포어사제)를 사용하여 10mM KH2PO4로 용액을 치환한다. 치환 배율은 80배 이상으로 되도록 한다. 치환한 항체는 UV-1600(시마쓰사제)을 사용하여 농도를 측정한다. 항체의 아미노산 서열로부터 수학식 III[아드반스즈·인·프로테인케미스트리(Advances in Protein Chemistry), 12, 303, 1962]를 사용하여 몰 흡광상수를 산출하고, 280nm의 흡광도 1.0을 1.38mg/ml로서 농도를 결정한다.
E1mol/l=A×n1 + B×n2 + C×n3
상기식에서,
E1mol/ml= E1mol/l/MW이며,
E1mol/l는 280nm에서의 흡광계수(mg-1 ml cm-1),
E1mol/ml-280 nm 에서의 몰 흡광계수(『cm-1)
A:트립토판의 280nm에서의 몰 흡광계수 = 5550(M-1 cm-1)
B:티로신의 280nm 에서의 몰 흡광계수 = 1340(M-1 cm-1)
C:시스틴의 280 nm 에서의 몰 흡광계수 = 200(M-1 cm-1)
n1:항체 1분자당 트립토판의 수
n 2:항체 1분자당 티로신의 수
n 3:항체 1분자당 시스틴의 수
MW: 항체의 분자량(g/mo1)
100μg의 항체를 하이드라크럽 S-204용 시험관에 투입하고 원심농축기로써 건고한다. 샘플을 건고시킨 시험관을 호넨사제 하이드라크럽으로써 하이드라진 분해를 실시한다. 하이드라진은 호넨사제 하이드라진 분해시약을 사용하며 110℃, 1시간 동안 반응시킨다[메소드·오브·엔자이몰로지(Method of Enzymology), 83, 263, 1982]. 반응한 후, 하이드라진을 감압 증류 제거시켜 반응 용기를 30분 동안 방치하여 실온으로 복귀시킨다. Test tube에 호넨사제 아세틸화 시약의 아세틸화 시약을 250μl, 무수 아세트산을 25μl 가하여 잘 교반시켜 실온에서 30분 동안 반응시킨다. 다시 아세틸화 시약을 250μl, 무수 아세트산을 25μl 가하여 잘 교반시켜 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 시료를 -80℃의 냉동기로 동결시키고 약 17시간 동안 동결 건조시킨다. 동결 건조한 시료로부터 TaKaRa사제 셀룰로스 카트리지 글리칸 프레퍼레이션 키트를 사용하여 당쇄를 회수한다. 시료 당쇄용액을 원심농축기로써 건고한 다음, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지를 실시한다[참조: 져널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 95, 197, 1984]. 2-아미노피리딘 용액 은 2-아미노피리딘 1g에 대하여 HCl 760μl를 가하여 (1×PA 용액) 당해 용액을 역침투 정제수로 10배로 희석한 것을 사용한다(10배 희석 PA 용액). 시아노수소화붕소나트륨 용액은 시아노수소화붕소나트륨 10mg에 대하여 1×PA 용액 20μl, 역침투 정제수 430μl를 가하여 조제한다. 시료에 10배 희석 PA 용액을 67μl 투입하여 100℃, 15분 동안 반응시켜 방냉후에 시아노수소화붕소나트륨 용액을 2μl 투입하여 90℃, 12시간 동안 반응시켜 시료 당쇄를 형광 표지한다. 형광 표지한 당쇄군(PA화 당쇄군)을 슈퍼덱스 펩타이드 HR 10/30 칼럼(Pharmacia사제)를 사용하여 과잉의 시약과 분리한다. 용리액은 10mM 탄산수소암모늄, 유속은 0.5ml/분, 칼럼 온도는 실온, 형광검출기는 여기파장 320nm, 형광파장 400nm에서 실시한다. 시료 첨가후 20분으로부터 30분의 용출액을 회수하며 원심농축기로써 건고시켜 정제 PA화 당쇄군으로 한다. 다음에 CLC-ODS 칼럼(Shimadzu사제, (ψ6.0nm×150nm)를 사용하여 정제 PA화 당쇄군의 역상 HPLC 분석을 실시한다. 칼럼 온도는 55℃, 유속은 1ml/ml, 형광검출기는 여기파장 320nm, 형광파장 400nm에서 실시한다. 10mM 인산나트륨 완충액(pH 3.8)에서 칼럼을 평형화하고 0.5% 1-부탄올의 직선 농도 구배에서 80분 동안 용출한다. 각 PA화 당쇄의 동정은 분취한 각 PA화 당쇄의 피크의 매트릭스 지원 레이저 이온화 비행시간형 질량분석(MALDl-TOF-MS 분석)에서 포스트 소스 분해(Post Source Decay) 분석, TaKaRa사제 PA화 당쇄 표준물과의 용출 위치의 비교 및 각종 효소를 사용하여 각 PA화 당쇄를 소화한 다음, 역상 HPLC 분석에 의해 실시한다(도 45). 당쇄 함량은 역상 HPLC 분석에서 각 PA화 당쇄의 피크 면적에서 산출한다. 환원 말단이 N-아세틸글루코사민이 아닌 PA화 당쇄는 불순 물 유래이거나 PA화 당쇄 조제중의 부반응물이므로 피크 면적의 산출로부터 제외한다.
완충액 A로서 인산나트륨 완충액(pH 3.8), 완충액 B로서 인산나트륨 완충액(pH 3.8)+0.5% 1-부탄올을 사용하며 실시예 11의 (6)과 동일하게 분석한다.
도 45에서 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄군의 비율은 (i) 내지 (viii)중 (i) 내지 (iv)의 피크가 차지하는 면적, α-1,6-푸코스가 결합된 당쇄군의 비율은 (i) 내지 (viii)중 (v) 내지 (viii)의 피크가 차지하는 면적으로부터 산출한다.
렉틴 내성주가 생산하는 항 CCR4 사람형 키메라 항체 정제 표준품의 당쇄 구조를 분석한 결과를 표 6에 기재한다. 여기서, 렉틴 내성주가 생산한 항 CCR4 사람형 키메라 항체의 당쇄를 분석한 결과를 도시한 것이다. 실시예 d(4)에 기재한 방법으로 분석하여 피크의 면적으로부터 계산한 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율(%)을 표에 도시한다.
항세의 생산 세포 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 복합체 당쇄형(%)
5-03주 9
CHO/CCR4-LCA 주 48
CHO/CCR4-AAL 주 27
CHO/CCR4-PHA 주 8

5-03주가 생산한 항체와 비교하여 CH0/CCR4-LCA주가 생산한 항체에서는 분석 피크의 면적으로부터 계산하면 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 9%부터 48%까지 상승하고 있다. CH0/CCR4-AAL주가 생산한 항체에서는 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 9%부터 27%까지 상승하고 있다. 한편, PHA 내성주에서는 5-03주와 비교하여 당쇄 패턴 및 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율에 거의 변화는 확인되지 않는다.
실시예 15. 렉틴 내성 CHO 세포주의 해석
1.항 CCR4 사람형 키메라 항체 생산 세포주 CH0/CCR4-LCA에서의 GMD 효소의 발현량 해석
실시예 14에서 취득한 항 CCR4 사람형 키메라 항체 생산 세포주 CH0/CCR4-LCA에서의 푸코스 생합성 효소로서 공지되어 있는 GMD(GDP-만노스 4,6-데하이드라타제), GFPP(GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4-리덕타제), FX(GDP-베타-L-푸코스피로포스포릴라제) 및 푸코스 전이효소인 FUT8(α-1,6-푸코실트랜스퍼라제)의 각 유전자의 발현량을 RT-PCR법을 사용하여 해석한다.
(1)각종 세포주로부터의 RNA 조제
CHO/DG44 세포, 실시예 8의 1(2)에서 취득한 항 CCR4 사람형 키메라 항체 생산 세포주 5-03, 실시예 14(2)에서 취득한 항 CCR4 사람형 키메라 항체 생산 세포주 CH0/CCR4-LCA를 각각 37℃의 5% C02 인큐베이터 안에서 계대후 4일 동안 배양한다. 배양한 다음, RNeasy 보호 소형 키트(키아겐사제)를 사용하여 각 1x107 세포에서 첨부된 사용 설명서에 따라서 RNA를 조제한다. 계속해서 SUPER SCRIPT RT-PCR용 일본쇄 합성 시스템(GIBCO BRL사제)를 사용하여 첨부된 사용 설명서에 따라서 각 RNA 5μg에서 20μl의 반응액 중에서 일본쇄 cDNA를 합성한다.
(2)RT-PCR법을 사용하는 GMD 유전자의 발현량 해석
GMD cDNA를 PCR법에 따라서 증폭하기 위해 실시예 17의 1에 기재된 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열에서 서열 32에 기재된 염기서열을 갖는 24mer의 합성 DNA 프라이머와 서열 33에 기재된 염기서열을 갖는 26mer의 합성 DNA 프라이머를 작제한다.
계속해서 본 항(1)에서 작제한 각 세포주 유래의 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유하는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM의 dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 32와 33의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써말 사이클러480(파킨 엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 30사이클 실시한다. 당해 PCR 반응액 10μl를 아가로스 전기영동한 다음, 사이버그린(BMA사제)를 사용하여 DNA 단편을 염색하며 예상되는 약 350bp의 DNA 단편량을 Fluor Imager SI(몰레큘러다이내믹스사제)를 사용하여 측정한다.
(3)RT-PCR법을 사용하는 GFPP 유전자의 발현량 해석
GFPP cDNA를 PCR법에 따라서 증폭하기 위해 실시예 16의 2에서 취득한 CHO 세포 유래 GFPP의 cDNA 서열에 기초하여 서열 34의 염기서열을 갖는 27mer의 합성 DNA 프라이머와 서열 35에 기재된 염기서열을 갖는 23mer의 합성 DNA 프라이머를 작제한다.
계속해서 본 항(1)에서 작제한 각 세포주 유래의 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유되는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM의 dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 34와 35의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 24사이클한다. 당해 PCR 반응액 10μl를 아가로스 전기영동한 다음, 사이버그린(BMA사제)를 사용하여 DNA 단편을 염색하며 예상되는 약 600bp의 DNA 단편량을 Fluor Imager SI(몰레큘러다이내믹스사제)를 사용하여 측정한다.
(4)RT-PCR법을 사용하는 FX 유전자의 발현량 해석
FX cDNA를 PCR법에 따라서 증폭하기 위해 실시예 16의 1에서 취득한 CHO 세포 유래 FX의 cDNA 서열에 기초하여 서열 36에 기재된 염기서열을 갖는 28mer의 합성 DNA 프라이머와 서열 37에 기재된 염기서열을 갖는 28mer의 합성 DNA 프라이머를 작제한다.
계속해서 본 항(1)에서 작제한 각 세포주 유래의 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유되는 20μl의 반응액[1xEX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM의 dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), O.5μM의 서열 36과 37의 합성 DNA 프라이머]을 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 22사이클 실시한다. 당해 PCR 반응액 10μl를 아가로스 전기영동한 다음, 사이버그린(BMA사제)를 사용하여 DNA 단편을 염색하며 예상되는 약 300bp의 DNA 단편량을 Fluor Imager SI(몰레큘러다이내믹스사제)를 사용하여 측정한다.
(5)RT-PCR법을 사용하는 FUT8 유전자의 발현량 해석
FUT8 cDNA를 PCR법에 따라서 증폭하기 위해 본 항(1)에서 작제한 각 세포주 유래의 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유되는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), O.2mM의 dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 13과 14의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 20사이클한다. 당해 PCR 반응액 10μl를 아가로스 전기영동한 다음, 사이버그린(BMA사제)를 사용하여 DNA 단편을 염색하며 예상되는 약 600bp의 DNA 단편량을 Fluor Imager SI(몰레큘러다이내믹스사제)를 사용하여 측정한다.
(6)RT-PCR법을 사용하는 β-액틴 유전자의 발현량 해석
β-액틴 cDNA를 PCR법에 따라서 증폭하기 위해 본 항(1)에서 작제한 각 세포주 유래의 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유되는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM의 dNTP's, 0.5단위의 FX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 15와 16의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 14사이클 실시한다. 당해 PCR 반응액 10μl를 아가로스 전기영동한 다음, 사이버그린(BMA사제)를 사용하여 DNA 단편을 염색하며 예상되는 약 800bp의 DNA 단편량을 Fluor Imager SI(몰레큘러다이내믹스사제)를 사용하여 측정한다.
(7)각 세포주에서의 GMD, GFPP, FX, FUT8 유전자의 발현량
본 항(2) 내지 (6)에서 측정한 각 세포주에서의 GMD, GFPP, FX, FUT cDNA 유래 PCR 증폭 단편량의 값을 각 세포주에서 β-액틴의 cDNA 유래 PCR 증폭 단편량의 값으로 나누며 CH0/DG44 세포에서의 PCR 증폭 단편량을 1로 하는 경우에 5-03주 및 CH0/CCR4-LCA주에서의 각 유전자의 PCR 증폭 단편량을 구한다. 결과를 표 7에 기재한다.
GMD GEPP FX FUT8
CHO/DG44주 1 1 1 1
5-03 주 1.107 0.793 1.093 0.901
5-03주 유래 LCA 내성 세포 CHO/CCR4-LCA 0.160 0.886 0.920 0.875

표 7에서 기재된 바와 같이 CH0/CCR4-LCA주의 GMD 유전자의 발현량이 다른 세포주와 비교하여l/10 정도로 저하되고 있다. 또한, 본 실험은 독립하여 2회 실시하며 이의 평균치를 사용한다.
2.GMD 유전자를 강제 발현시킨 항 CCR4 사람형 키메라 항체 생산 세포주 CH0/CCR4-LCA를 사용하는 해석
(1)CHO 세포 유래 GMD 유전자 발현 벡터 pAGE249GMD의 구축
실시예 17의 1에서 취득한 CHO 세포 유래 GMD의 cDNA 서열에 기초하여 서열 38에 기재된 염기서열을 갖는 28mer의 프라이머 및 서열 39에 기재된 염기서열을 갖는 29mer의 프라이머를 작제한다. 계속해서 본 실시예 1 항(1)에서 작제한 CHO 세포 유래 GMD 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유되는 20μl의 반응액[1× EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM dNTP's, O.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 38와 39의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분 동안, 58℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 동안의 사이클을 8사이클 반복한 다음, 다시 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 22사이클 반복한다. 반응 종료후, 당해 PCR 반응액을 아가로스 전기영동으로 분획한 다음, 약 600bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BI0 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수한다. 회수한 DNA 단편은 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터(Novagen사제)에 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사제)를 형질전환하며 플라스미드 mt-C를 수득한다(도 46 참조).
다음에 실시예 17의 1에서 취득한 CHO 세포 유래 GMD의 cDNA 서열에 기초하여 서열 40의 염기서열을 갖는 45mer의 프라이머 및 서열 41에 기재된 염기서열을 갖는 31mer의 프라이머를 작제한다. 계속해서 본 실시예 1 항(1)에서 작제한 CHO 세포 유래 GMD 일본쇄 cDNA O.5μl를 주형으로 하여 함유되는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 40과 41의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분 동안, 57℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 동안의 사이클을 8사이클 반복한 다음, 다시 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 22사이클 반복한다. 반응 종료후, 당해 PCR 반응액을 아가로스 전기영동으로써 분획한 다음, 약 150p의 DNA 단편을 GENE CleanII 키트(BIO 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 회수한 DNA 단편은 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터(Novagen사제)에 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사제)를 형질전환하여 플라스미드 ATG를 수득한다(도 47 참조).
다음에 실시예 17의 1에서 작제한 3μg의 플라스미드 CHO-GMD를 제한효소 SacI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시하여 DNA를 회수하며 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 아가로스 전기영동으로써 분획한 다음, 약 900bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO 101사제)을 사용하며 첨부된 매뉴얼에 따라서 회수한다. 각각 회수한 DNA 단편을 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 플라스미드 WT-N(-)를 수득한다(도 48 참조).
다음에 2μg의 플라스미드 WT-N(-)를 제한효소 BamHI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 페놀/클로로퍼름 추출 및 에탄올 침전을 실시하여 DNA를 회수하고 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 아가로스 전기영동으로써 분획하며 약 1kbp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 3μg의 플라스미드 pB1uescript SK(-)(Stratagene사제)를 제한효소 BamHI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시하여 DNA를 회수하고 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 아가로스 전기영동으로써 분획하며 약 3kbp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 회수한 DNA 단편을 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 플라스미드 WT-N(-) in pBS를 수득한다(도 49 참조).
다음에 2μg의 플라스미드 WT-N(-) in pBS를 제한효소 HindIII(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시하여 DNA를 회수하며 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 아가로스 전기영동으로써 분획하며 약 4kbp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 2μg의 플라스미드 ATG를 제한효소 HindIII(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시하여 DNA를 회수하며 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 아가로스 전기영동으로써 분획하며 약 150bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 각각 회수한 DNA 단편을 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 플라스미드 WT in pBS를 수득한다(도 50 참조).
다음에 2μg의 플라스미드 pAGE249를 제한효소 HindIII과 BamHI(함께 다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 아가로스 전기영동으로써 분획하고 약 6.5kbp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 2μg의 플라스미드 WT in pBS를 제한효소 HindIII과 BamHI(함께 다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응한 후, 아가로스 전기영동으로써 분획하고, 약 1.2kbp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO 101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 각각 회수한 DNA 단편을 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주를 형질전환하여 플라스미드 pAGE249GMD를 수득한다(도 51 참조).
(2)CHO/CCR4-LCA에서 GMD 유전자의 안정 발현
제한효소 FspI(New ENGLAND BIOLABS사제)로 절단함으로써 직쇄형으로 하는 CHO 세포 유래 GMD 유전자 발현 벡터 pAGE249GMD를 5μg, 1.6×106 세포의 CH0/CCR4-LCA주에 전기천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)]에 의해 도입한 다음, MTX(SIGMA사제)를 200nM의 농도로 함유하는 3Oml의 IMDM-dFBS(10) 배지를 10% 함유하는 IMDM 배지(GIBC0 BRL사제)]에 현탁하고 182cm2 플라스크(Greiner사제)로써 37℃의 5% C02 인큐베이터 안에서 24시간 동안 배양한다. 배양한 다음, 하이그로마이신을 0.5mg/ml, MTX(SIGMA사제)를 200nN의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에 배지 교환하여 다시 19일 동안 배양하며 하이그로마이신 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니군을 취득한다.
또한 동일하게 pAGE249벡터를 상기와 동일한 방법으로 CH0/CCR4-LCA주로 도입하며 하이그로마이신 내성을 나타내는 형질전환주의 콜로니군을 취득한다.
(3)GMD 유전자를 발현시킨 CH0/CCR4-LCA주의 배양 및 항체의 정제
본 항(2)에서 취득한 GMD를 발현하고 있는 형질전환 세포군을 MTX(SIGMA사제)를 200nM, 하이그로마이신을 0.5mg/ml의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지를 사용하여 182cm2 플라스크(Greiner사제)로써 37℃의 5% CO2 인큐베이터 안에서 배양한다. 수일후, 세포 밀도가 합류점에 달한 시점에서 배양 상등액을 제거하며 25ml의 PBS 버퍼(GlBCO BRL사제)로써 세포를 세정한 다음, EXCELL301 배지(JRH사제)를 35ml 주입한다. 37℃의 5% C02 인큐베이터 안에서 7일 동안 배양한 다음, 배양 상등액을 회수한다. 배양 상등액에서 Prosep-A(밀리포어사제) 칼럼을 사용하며 첨부된 설명서에 따라서 항 CCR4 키메라 항체를 정제한다.
또한 동일하게 pAGE249 벡터를 도입한 형질전환 세포군을 상기와 동일한 방법으로 배양한 다음, 배양 상등액에서 항 CCR4 키메라 항체를 회수, 정제한다.
(4)형질전환 세포군에서의 렉틴 내성도의 측정
본 항(2)에서 취득한 GMD 유전자를 발현하고 있는 형질전환 세포군을 MTX(SIGMA사제)를 200nM, 하이그로마이신을 0.5mg/ml의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에 6×104 세포/ml로 되도록 현탁하며 96웰 배양용 플레이트(이와키가라스사제)에 50μl/웰씩 분주한다. 계속해서 이러한 웰에 MTX(SIGMA사제)를 200nM, 하이그로마이신을 0.5mg/ml의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에 0mg/ml, 0.4mg/ml, 1.6mg/ml, 4mg/ml의 농도로 LCA(LENS CULINARIS AGGLUTlNlN: Vector Laboratories사제)를 현탁한 배지를 50μl씩 가하여 37℃의 5% CO2 인큐베이 터 속에서 96시간 동안 배양한다. 배양후, WST-I(베링거사제)를 1 Oμl/웰이 되도록 가하고 37℃의 5% CO2 인큐베이터 안에서 30분 동안 방치하여 발색시킨 후, 마이크로플레이트 리더(BIO-RAD사제)로써 450nm과 595nm의 흡광도(이하, OD450, 0D595라고 표기한다)를 측정한다. 또한 동일하게 pAGE249 벡터를 도입한 형질전환 세포군도 상기와 동일한 방법으로 측정한다. 이상의 실험은 독립하여 2회 실시한다.
상기에서 측정한 0D450으로부터 0D595를 뺀 값을 각 세포군의 생존수로 하며 LCA를 가하지 않은 웰의 세포 생존수를 100%로 하는 경우에 각 웰의 세포 생존수를 %로 표기하여 도 52에 도시한다. 도 52에 도시한 바와 같이 GMD를 발현시킨 CHO/CCR4-LCA주에서는 LCA 내성도의 저하가 관찰되며 0.2mg/ml의 LCA 존재하(밑)에서의 세포생존율은 40%정도, 0.8 mg/ml의 LCA 존재하(밑)에서의 세포생존율은 20% 정도이다. -쪽, pAGE249 vector_를 도입한 CHO/CCR4-LCA 주로서는, 0.2 mg/ml의 LCA 존재하(밑)에서의 세포생존율은 100%, 0.8 mg/ml의 LCA 존재하에 세포 생존율은 80% 정도이다. 이상의 결과에서 CH0/CCR4-LCA주는 GMD 유전자의 발현량이 저하되고 있으며 그 결과, LCA에 대한 내성을 획득하는 것이 시사된다.
(5)GMD를 발현시킨 CH0/CCR4-LCA주에서 취득한 항 CCR4 키메라 항체의 시험관내 세포 억제 활성 (ADCC 활성)
본 항(3)에서 수득된 정제 항 CCR4 키메라 항체의 시험관내 세포 억제 활성을 평가하기 위해 하기에 기재된 방법에 따라서 ADCC 활성을 측정한다.
i)표적 세포 용액의 조제
RPMI 1640-FBS(10) 배지에 500μg/ml의 농도로 G418 황산염(나카라이테스크제)를 첨가한 배지로 배양한 CCR4-EL4주(실시예 8의 7 참조)의 1×106세포를 조제하고 방사성 물질인 Na2 51CrO4를 3.7MBq 당량 가하여 37℃에서 90분간 반응시켜 세포를 방사선 표지한다. 반응후, RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 현탁 및 원심분리 조작에 의해 3회 세정하여 배지에 재현탁하고 4℃에서 3O분간 얼음중에 방치하여 방사성 물질을 자연 해리시킨다. 원심 분리후, RPMI 1640-FBS(10)배지를 5ml 가하고 2.5×105세포/ml에 조제하여 표적 세포용액으로 한다.
ii)효능인자 세포용액의 조제
건강한 사람 정맥혈 50ml를 채취하고 헤파린나트륨(다케다약품사제) 0.5ml를 가하고 조심스럽게 혼합한다. 이것을 림포프렙(Nycomed Pharma AS사제)를 사용하여 사용 설명서에 따라서 원심분리하여 단핵구층을 분리한다. RPMI 1640-FBS(10) 배지에서 3회 원심분리하여 세정한 후, 배지를 사용하여 2×106세포/ml의 농도로 재현탁하며 효능인자 세포용액으로 한다.
iii)ADCC 활성의 측정
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사제)의 각 웰에 상기1)에서 조제한 표적 세포용액의 50μl(1×104세포/웰)를 분주한다. 이어서 2)에서 조제한 효능인자 세포용액을 100μl(2×105세포/웰, 효능인자 세포와 표적 세포의 비는 25:1로 된다) 첨 가한다. 또한, 각종 항 CCR4 키메라 항체(본 항(3)에서 정제한 항 CCR4 키메라 항체, 및 KM 2760-1, KM 3060)를 최종 농도 0.0025 내지 2.5μg/ml로 되도록 가하고 37℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응후, 플레이트를 원심분리하여 상등액의 51Cr 양을 카운터로써 측정한다. 자연 해리 51Cr 양은 효능인자 세포용액, 항체 용액의 대신에 배지만을 사용하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. 전체 해리 51Cr 양은 항체 용액 대신에 배지만을 효능인자 세포 용액 대신에 1규정 염산을 첨가하여 상기와 동일한 조작을 실시하며 상등액의 51Cr 양을 측정함으로써 구한다. ADCC 활성은 상기 일반식(II)에 의해 구한다.
ADCC 활성측정의 결과를 도 53에 도시한다. 도 53에 도시한 바와 같이 GMD를 발현시킨 CH0/CCR4-LCA주에서 취득한 정제 항 CCR4 키메라 항체의 ADCC 활성은 실시예 8에서 취득한 KM3060과 동일항 정도로까지 저하되어 있다. 한편, pAGE249 벡터를 도입한 CH0/CCR4-LCA주에서 취득한 정제 항 CCR4 키메라 항체의 ADCC 활성은 CH0/CCR4-LCA주에서 취득한 정제 항 CCR4 키메라 항체와 동일한 정도의 ADCC 활성을 갖고 있다. 이상의 결과에서 CHO/CCR4-LCA주는 GMD 유전자의 발현량이 저하되고 있으며 그 결과, ADCC 활성이 높은 항체를 생산할 수 있는 것이 시사된다.
(6)GMD를 발현시킨 CH0/CCR4-LCA주 유래의 항 CCR4 키메라 항체의 당쇄 해석
본 항(3)에서 수득된 정제 항 CCR4 키메라 항체의 당쇄 해석을 실시예 14(4)의 방법에 따라서 실시하며 이의 해석결과를 도 55에 도시한다. 실시예 14에서 작 제한 CH0/CCR4-LCA에서 취득한 정제 항 CCR4 키메라 항체와 비교하여 GMD 유전자를 발현시킨 CHO/CCR4-LCA주에서 취득한 정제 항 CCR4 키메라 항체에서는 분석 피크의 면적으로부터 계산하면 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 9%로 저하되고 있다. 이상으로부터 CHO/CCR4-LCA주에 GMD 유전자를 발현시킴으로써 당해 세포가 생산하는 항체의 α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄의 비율이 5-03주가 생산하는 항체와 동일한 정도까지 저하되는 것으로 나타난다.
실시예 16. CHO 세포 유래의 당쇄 합성에 관계되는 각종 효소 유전자의 취득
1.CHO 세포의 FX cDNA 서열의 결정
(1)CHO/DG44 세포 유래 전체 RNA의 추출
CH0/DG44 세포를 10% 소 태아 혈청(Life Technologies사제) 및 1배 농도의 HT 보충액(Life Technologies사제)를 첨가한 IMDM 배지(Life Technologies사제)에 현탁하며 2×105개/ml의 밀도로 접착 세포 배양용 T75 플라스크(Greiner사제)에 15ml 파종한다. 37℃의 5% CO2 인큐베이터 속에서 배양하며 배양 2일째에 1×107개를 회수한 다음, RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 첨부된 설명서에 따라서 전체 RNA를 추출한다.
(2)CHO/DG44 세포 유래 전체 일본쇄 cDNA의 조제
상기(1)에서 조제한 전체 RNA를 45μl의 멸균수에 용해하고 RQ1 RNase 부재 DNase(Promega사제) 1μl, 부속의 10×DNase 완충액 5μ1, RNasin 리보뉴클레아제 억제제(Promega사제) 0.5μl를 각각 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킴으로써 시료중에 혼입된 게놈 DNA를 분해한다. 반응후, RNAeasy(QIAGEN사제)에 의해 전체 RNA를 재정제하며 50μl의 멸균수에 용해한다.
수득된 각각의 전체 RNA 3μl에 대해 SUPERSCRIPTM 일본쇄 cDNA 합성용 예비 증폭 시스템(Life Technologies사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 올리고(dT)를 프라이머로 하는 20μl의 시스템에서 역전사 반응을 실시함으로써 일본쇄 cDNA를 합성한다. GFPP 및 FX의 클로닝에는 당해 반응액의 50배 희석 수용액을 사용한다. 사용할 때까지 -80℃에서 보관한다.
(3)차이니즈 햄스터 FX의 cDNA 부분 단편의 취득
하기의 순서에 따라 차이니즈 햄스터 FX의 cDNA 부분 단편을 취득한다.
우선 공적 데이터 베이스에 등록되어 있는 사람 FX의 cDNA(Genebank 등록번호 U58766) 및 마우스의 cDNA(Genebank 등록번호 M30127)에 공통된 염기서열에 대하여 특이적인 프라이머(서열 42 및 서열 43에 기재한다)를 설계한다.
다음에 DNA 폴리머라제EX Taq(다카라슈조사제)를 사용하여 본 항(2)에서 조제한 CHO/DG44 유래 일본쇄 cDNA를 1μl를 함유하는 25μl의 반응액[EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM dNTPs, 0.5μmol/l 상기 유전자 특이적 프라이머(서열 42 및 서열 43)]을 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다. PCR은 94℃에서 5분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분, 58℃에서 2분 동안, 72℃에서 3분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 30사이클 후, 다시 72℃에서 10분 동안 가열하는 조건에서 실시한다.
PCR후, 반응액을 2% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 특이적 증폭 단편 301bp를 QiaexII 겔 추출 키트(키아겐사제)를 사용하여 정제하며 멸균수 20μl로 용출한다(이하, 아가로스 겔로부터의 DNA 단편의 정제에는 본 방법을 사용한다). 상기 증폭 단편 4μl를 TOPO TA 클로닝 키트(invitrogen사제)의 설명서에 따라서 플라스미드 pCR2.1에 삽입하며 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α를 코엔 등의 방법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 69, 2110(1972)](이하, 대장균의 형질전환에는 본 방법을 사용한다)에 의해 형질전환한다.
수득된 복수의 가나마이신 내성 콜로니로부터 공지된 방법[뉴클레익·애시드·리서치(Nucleic Acids Researbh), 7, 1513(1979)](이하, 플라스미드의 단리방법에는 본 방법을 사용한다)에 따라서 플라스미드 DNA를 단리하며 FX cDNA 부분 단편이 통합된 2클론을 수득한다. 각각 pCRFX 클론8, pCRFX 클론12라고 칭한다.
FX 클론8, FX 클론12에 삽입된 cDNA의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Perkin Elmer사제)를 사용하여 결정한다. 방법은 첨부된 매뉴얼에 따른다. 본 법에 따라 서열 결정한 삽입 cDNA가 차이니즈 햄스터의 FX의 오픈 리딩 프레임(ORF) 부분서열을 암호화하는 것을 확인한다.
(4)RACE용 일본쇄 cDNA의 합성
본 항(1)에서 추출한 CHO/DG44 전체 RNA에서 5' 및 3' RACE용 일본쇄 cDNA의 작제를 SMARTM RACE cDNA 증폭 키트(CLONTECH사제)를 사용하여 실시한다. 방법은 첨부된 설명서에 따른다. 단, PowerScriptTM 역상 트랜스크립타제(CLONTECH사제)를 역전사 효소로서 사용한다. 조제후의 일본쇄 cDNA는 각각, 키트 첨부된 Tricin-EDTA 완충액로 10배로 희석한 것을 PCR의 주형으로 하여 사용한다.
(5)RACE법에 의한 차이니즈 햄스터 FX 전체 길이 cDNA의 결정
상기(3)항에서 결정한 차이니즈 햄스터 FX의 부분서열을 바탕으로 차이니즈 햄스터 FX에 특이적인 5' RACE용 프라이머 FXGSP1-1(서열 44) 및 FXGSP1-2(서열 45), 차이니즈 햄스터 FX 특이적인 3' RACE용 프라이머 FXGSP2-1(서열 46) 및 FXGSP2-2(서열 47)를 설계한다.
다음에 어드반테이지(Advantage)2 PCR 키트(CLONTECH사제)를 사용하여 본 항(4)에서 조제한 CH0/DG44 유래 RACE용 일본쇄 cDNA를 1μl를 함유하는 50μl의 반응액[Advantage2 PCR 완충액(CLONTECH사제), 0.2mM dNTPs, O.2μmol/l 차이니즈 햄스터 FX 특이적 RACE용 프라이머, 1배 농도의 공통 프라이머(CLONTECH사제)]를 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다.
PCR은 94℃에서 5초 동안, 68℃에서 10초 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 20사이클 반복하는 조건에서 실시한다.
반응 종료후, 반응액에서 1μl를 취하고 트리신-EDTA 완충액에서 50배로 희석한 수용액 1μl를 템플레이트로서 사용하며 다시 반응액을 조제하여 동일 조건에서 PCR을 실시한다. 1회째 및 2회째의 PCR에서 사용하는 템플레이트, 프라이머의 조합 및 증폭되는 DNA 단편 길이를 표 8에 기재한다.
챠이니스 햄스터 FXcDNA RACE PCR에 사용한다. 프라이머의 조합과 PCR 산물의 길이
5'RACE FX 특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭산물의 크기
1회째 FXGSP1-1 UPM(유니버셜 프라이머 믹스) 300bp
2회째 FXGSP1-2 NUP(네스티드 유니버셜 프라이머)
3' RACE FX 특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭산물의 크기
1회째 FXGSP2-1 UPM(유니버셜 프라이머 믹스) 1100bp
2회째 FXGSP2-2 NUP(네스티드 유니버셜 프라이머)

PCR후, 반응액을 1% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 목적하는 특이적 증폭 단편을 QiaexII 겔 추출 키트(키아겐사제)를 사용하여 정제하며 멸균수 20μl로 용출한다. 상기 증폭 단편 4μl를 TOPO TA 클로닝 키트(invitrogen사제)의 설명서에 따라서 플라스미드 pCR2.1로 삽입하며 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5αFMF 형질전환한다.
수득된 복수의 가나마이신 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 단리하며 차이니즈 햄스터 FX의 5'영역을 함유하는 cDNA5 클론을 수득한다. 각각을 FX 5' 클론25, FX 5' 클론26, FX 5' 클론27, FX 5' 클론28, FX 5' 클론31, FX 5' 클론32라고 칭한다.
동일하게 차이니즈 햄스터 FX의 3'영역을 함유하는 cDNA5 클론을 수득한다. 각각 FX 3'를 FX 3' 클론1, FX 3' 클론3, FX 3' 클론6, FX 3' 클론8, FX 3' 클론9라고 칭한다.
상기에서 5' 및 3' RACE에 의해 취득한 각 클론의 cDNA 부분의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제)를 사용하여 결정한다. 방법은 첨부된 매뉴얼에 따른다. 본 법에서 결정한 각 cDNA의 염기서열을 비교하여 PCR에 수반되는 염기의 판독 오류를 제거하며 차이니즈 햄스터 FXcDNA 전체 길이의 염기서열을 결정한다. 결정한 서열(서열 48)에 기재한다.
2.CHO 세포의 GFPP cDNA 서열의 결정
(1)차이니즈 햄스터 GFPP의 cDNA 부분 단편의 취득
하기의 순서에 따라 차이니즈 햄스터 GFPP의 cDNA 부분 단편을 취득한다.
우선 공적 데이터 베이스에 등록되어 있는 사람 GFPP의 cDNA(Genebank 등록번호 AF017445), 당해 서열과 상동성이 높은 마우스 EST 서열(Genebank 등록번호 AI467195, AA422658, BE304325, AI466474) 및 Rat EST 서열(Genebank 등록번호 BF546372, AI058400, AW144783)의 염기서열을 비교하여 3종간에 보존성이 높은 영역에 래트 GFPP에 특이적인 프라이머 GFPP FW9 및 GFPP RV9(서열 49 및 서열 50)를 설계한다.
다음에 DNA 폴리머라제EX Taq(다카라슈조사제)를 사용하여 본 항1(2)에서 조제한 CHO/DG44 유래 일본쇄 cDNA를 1μl를 함유하는 25μl의 반응액[EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM dNTPs, 0.5μmol/l GFPP 특이적 프라이머 GFPP FW9 및 GFPP RV9(서열 49 및 서열 50)]을 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다. PCR은 94℃에서 5분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분, 58℃에서 2분 동안, 72℃에서 3분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 30사이클 후, 다시 72℃에서 10 분 동안 가열하는 조건에서 실시한다.
PCR후, 반응액을 2% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 특이적 증폭 단편 1.4kbp를 QiaexII 겔 추출 키트(키아겐사제)를 사용하여 정제하며 멸균수 20μl로 용출한다. 상기 증폭 단편 4μl를 TOPO TA 클로닝 키트(invitrogen사제)의 설명서에 따라서 플라스미드 pCR2.1로 삽입하며 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α를 형질전환한다.
수득된 복수의 가나마이신 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 단리하며 GFPP cDNA 부분 단편이 통합된 3클론을 수득한다. 각각 GFPP 클론8, CFPP 클론11, GFPP 클론12라고 칭한다.
GFPP 클론8, GFPP 클론11, GFPP 클론12에 삽입된 cDNA의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제) 및 대형 염료 종결인자 사이클 서열분석 FS 준비 반응 키트(Perkin Elmer사제)를 사용하여 결정한다. 방법은 첨부된 매뉴얼에 따른다. 본 법에 따라 서열 결정한 삽입 cDNA가 차이니즈 햄스터의 GFPP의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 부분서열을 암호화하는 것을 확인한다.
(2)RACE법에 의한 차이니즈 햄스터 GFPP 전체 길이 cDNA의 결정
본 항2(1)에서 결정한 차이니즈 햄스터 FX의 부분서열을 바탕으로 차이니즈 햄스터 FX에 특이적인 5' RACE용 프라이머 GFPP GSP1-1(서열 52) 및 GFPP GSP1-2(서열 53), 차이니즈 햄스터 GFPP 특이적인 3' RACE용 프라이머 GFPP GSP2-1(서열 54) 및 GFPP GSP2-2(서열 55)를 설계한다.
다음에 어드밴테이지2 PCR 키트(CLONTECH사제)를 사용하여 본 항(4)에서 조 제한 CH0/DG44 유래 RACE용 일본쇄 cDNA 1μl를 함유하는 50μl의 반응액[어드밴테이지2 PCR 완충액(CLONTECH사제), 0.2mM dNTPs, 0.2μmol/l 차이니즈 햄스터 GFPP 특이적 RACE용 프라이머, 1배 농도의 공통 프라이머(CLONTECH사제)]를 조제하며 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 실시한다.
PCR은 94℃에서 5초 동안, 68℃에서 10초 동안, 72℃에서 2분 동안으로 이루어진 반응을 1사이클로서 20사이클 반복하는 조건에서 실시한다.
반응 종료후, 반응액에서 1μl를 취하고 트리신-EDTA 완충액로 50배로 희석한 수용액 1μl를 템플레이트로서 다시 반응액을 조제하며 동일 조건에서 PCR을 실시한다. 1회 및 2회째의 PCR에서 사용하는 템플레이트, 프라이머의 조합 및 증폭되는 DNA 단편장을 표 9에 기재한다.
차이니즈 햄스터GFPP cDNA RACE PCR에 사용하는 프라이머의 조합과 PCR 산물의 길이
5'RACE FX 특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭산물의 크기
1회째 GFPPGSP1-1 UPM(유니버셜 프라이머 믹스) 1100bp
2회째 GFPPGSP1-2 NUP(네스티드 유니버셜 프라이머)
3' RACE FX 특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭산물의 크기
1회째 GFPPGSP2-1 UPM(유니버셜 프라이머 믹스) 1400bp
2회째 GFPPGSP2-2 NUP(네스티드 유니버셜 프라이머)

PCR후, 반응액을 1% 아가로스 겔 전기영동에 제공하며 목적하는 특이적 증폭 단편을 QiaexII 겔 추출 키트(키아겐사제)를 사용하여 정제하며 멸균수 20μl로 용출한다. 상기 증폭 단편 4μl를 TOPO TA 클로닝 키트(invitrogen사제)의 설명서에 따라서 플라스미드 pCR2.1에 삽입하며 당해 반응액을 사용하여 대장균 DH5α를 형질전환한다.
수득된 복수의 가나마이신 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 단리하며 차이니즈 햄스터 GFPP의 5'영역을 함유하는 cDNA 4클론을 수득한다. 각각을 GFPP 5' 클론1, GFPP 5' 클론2, GFPP 5' 클론3, GFPP 5' 클론4라고 칭한다.
동일하게 차이니즈 햄스터 GFPP의 3'영역을 함유하는 cDNA 5클론을 수득한다. 각각을 GFPP 3' 클론10, GFPP 3' 클론16, GFPP 3' 클론20이라고 칭한다.
상기에서 5' 및 3' RACE에 의해 취득한 각 클론의 cDNA 부분의 염기서열은 DNA 서열분석기377(Parkin Elmer사제)를 사용하여 결정한다. 방법은 첨부된 매뉴얼에 따른다. 염기서열 결정후, 각 cDNA의 염기서열을 비교하여 PCR에 수반되는 염기의 판독 오류를 제거하며 차이니즈 햄스터 GFPP cDNA 전체 길이의 염기서열을 결정한다. 결정한 서열(서열 51)에 기재한다.
실시예 17. CHO 세포 유래 GMD 유전자의 취득
1.CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열의 결정
(1)CHO 세포 유래 GMD 유전자의 cDNA 취득(5' 및 3' 말단 서열을 제거한 부분 cDNA의 취득)
GenBank에 등록되어 있는 사람 GMD cDNA 서열(GenBank Accession No. AF042377)을 쿠에리로서 설치류 유래 GMD cDNA를 공적 데이터 베이스(BLAST)를 사용하여 검색한 결과, 3종류의 마우스 EST 서열이 수득된다(GenBank Accesssion No.BE986856, BF158988, BE284785). 이들 EST 서열을 연결시킴으로써 추정되는 마 우스 GMD cDNA 서열을 결정한다.
이러한 마우스 GMD cDNA 서열에서 서열 56의 염기서열을 갖는 28mer의 프라이머, 서열 57의 염기서열을 갖는 27mer의 프라이머, 서열 58의 염기서열을 갖는 25mer의 프라이머, 서열 59의 염기서열을 갖는 24mer의 프라이머, 서열 60의 염기서열을 갖는 25mer의 프라이머를 작제한다.
계속해서 CHO 세포 유래 GMD cDNA를 증폭하기 위해서 하기 방법으로 PCR을 실시한다. 실시예 15의 1항(1)에서 작제한 CHO 세포 유래 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유되는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), O.2mM의 dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 합성 DNA 프라이머 2종류]를 조제한다. 또한, 합성 DNA 프라이머에는 서열 56과 서열 57, 서열 58과 서열 57, 서열 56과 서열 59, 서열 56과 서열 60의 조합을 사용한다. 당해 반응액을 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 30사이클 실시한다.
이러한 PCR 반응액을 아가로스 전기영동으로써 분획한 결과, 서열 56과 서열 57의 합성 DNA 프라이머를 사용하는 PCR 산물에서는 약 1.2kbp, 서열 57과 서열 59의 합성 DNA 프라이머를 사용하는 PCR 산물에서는 약 1.1kbp, 서열 56과 서열 59의 합성 DNA 프라이머를 사용하는 PCR 산물에서는 약 350bp, 서열 56과 서열 60의 합성 DNA 프라이머를 사용하는 PCR 산물에서는 약 1kbp의 DNA 단편이 증폭된다. 이들 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 회수한 DNA 단편은 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터(Novagen사제)에 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5주(도요보세키사제)를 형질전환하여 플라스미드 22-8(서열 56과 서열 57의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 1.2kbp의 DNA 단편을 갖는다), 23-3(서열 58과 서열 57의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 1.1kbp의 DNA 단편을 갖는다), 31-5(서열 56과 서열 59의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 350bp의 DNA 단편을 갖는다), 34-2(서열 56과 서열 60의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 1kbp의 DNA 단편을 갖는다)를 수득한다. 이들 플라스미드에 함유되는 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열을 DNA 서열분석기 ABI PRISM377(파킨엘머사제)를 사용하여 통상적인 방법에 따라서 결정한다(5'말단 측의 개시 메티오닌보다 하류 28염기의 서열 및 3'말단 측의 종료 코돈보다 상류 27염기의 서열은 합성 올리고 DNA 서열 유래이므로 마우스 GMD cDNA 서열이다).
또한, 플라스미드 22-8과 34-2에 함유되는 CHO 세포 유래 GMD cDNA 를 조합한 플라스미드를 작제하기 위해 하기의 공정을 실시한다. 1μg의 플라스미드 22-8을 제한효소 EcoRI(다카라슈조사제)로 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 아가로스 전기영동으로써 분획하며 약 4kbp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BI0101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 2μg의 플라스미드 34-2를 제한효소 EcoRI로 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 아가로스 전기영동으로써 분획하며 약 150bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 각각 회수한 DNA 단편을 소 장 알칼린 포스파타제(다 카라슈조사제)로 말단을 탈 인산화한 다음, DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사제)를 형질전환하여 플라스미드 CHO-GMD를 수득한다(도 54 참조).
(2)CHO 세포 유래 GMD cDNA의 5'말단 서열의 결정
CHO 세포 유래 사람 및 마우스 GMD cDNA의 5'말단측 비암호화(non-coding) 영역의 염기서열에서 서열 61의 염기서열을 갖는 24mer의 프라이머 및 CHO 유래 GMD cDNA 서열에서 서열 62의 염기서열을 갖는 32mer의 프라이머를 작제하며 cDNA를 증폭하기 위해 하기 방법으로 PCR을 실시한다. 실시예 15의 1항(1)에서 수득된 CHO 세포 유래의 일본쇄 cDNA 0.5μl를 주형으로 하여 함유하는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM의 dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 61과 서열 62의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 55℃에서 1분 동안, 72℃에서 2분 동안의 사이클을 20사이클한 다음, 다시 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 18사이클 실시한다. 당해 PCR 반응액을 아가로스 전기영동으로써 분획한 다음, 약 300bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BI0101사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 회수한다. 회수한 DNA 단편은 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터(Novagen사제)에 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사제)를 형질전환하여 플라스미드 5' GMD를 수득한다. DNA 서열분석기377(파킨엘머사제)를 사용하여 당해 플라스미드에 함유되는 CHO 유래 GMD cDNA의 개시 메티오닌보다 하류 28염기의 서열을 결정한다.
(3)CHO 세포 유래 GMD cDNA의 3'말단 서열의 결정
CHO 세포 유래 GMD의 3'말단 cDNA 서열을 얻기 위해 하기 방법으로 RACE법을 실시한다. 실시예 15의 1항(1)에서 취득한 CHO 세포 유래 RNA에서 3' RACE용 일본쇄 cDNA의 작제를 SMARTTM RACE cDNA 증폭 키트(CLONTECH사제)를 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 한다. 단, 역전사 효소에는 PowerScriptTM 역전사 트랜스크립타제(CLONTECH사제)를 사용한다. 조제후의 일본쇄 cDNA는 키트 첨부된 Tricin-EDTA 완충액에서 10배로 희석한 것을 PCR의 주형으로 하여 사용한다.
계속해서 상기 3' RACE용 일본쇄 cDNA 1μl를 주형으로 하여 함유하는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mm dNTP로 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 63의 24mer의 합성 DNA 프라이머[본 항(1)에서 결정한 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열에서 작제], 1배 농도의 Universal Primer MTX(SMARTTM RACE cDNA 증폭 키트에 부속; CLONTECH사제)]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 30사이클 실시한다.
반응 종료후, 당해 PCR 반응액에서 1μl를 취하고 트리신-EDTA 완충액(CLONTECH사제)에서 20배 희석한 수용액 1μl를 주형으로 하여 함유하는 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), O.2mM dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 64의 25mer의 합성 DNA 프라이머[본 항(1)에서 결정한 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열에서 작제], 0.5μM의 네스티드 유니버셜 프라이머(Nested Universal Primer)(SMARTTM RACE cDNA 증폭 키트에 부속; CLONTECH사제)]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 30사이클 실시한다.
반응 종료후, 당해 PCR 반응액을 아가로스 전기영동으로써 분획한 다음, 약 700bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(B101O1사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 회수한 DNA는 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터(Novagen사제)에 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사제)를 형질전환하여 플라스미드 3' GMD를 수득한다. DNA 서열분석기377(파킨엘머사제)를 사용하여 당해 플라스미드에 함유되는 CHO 유래 GMD cDNA의 종지 코돈보다 상류 27염기의 서열 및 3'측의 non-coding 영역 415bp의 염기서열을 결정한다.
이상, 본 항(1), (2), (3)에서 결정한 CHO 유래 GMD 유전자의 전체 길이 cDNA 서열을 서열 65, 여기에 대응하는 아미노산 서열을 서열 71에 기재한다.
2.CH0/DG44 세포의 GMD 유전자를 포함하는 게놈 서열의 결정
실시예 17의 1항에서 결정한 마우스 GMD cDNA 서열에서 서열 66의 염기서열을 갖는 25mer의 프라이머를 작제한다. 계속해서 하기 방법으로 CHO 세포 유래 게놈 DNA를 취득한다. CHO/DG44 세포 유래 KC861주를 IMDM-dFBS(10)-HT(1) 배지[HT 보충액(인비트로젠사제)를 1배 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지]에 3×105 세포/ml로 되도록 현탁하며 접착 세포용 평평한 바닥 6웰 플레이트(Greiner사제)에 2ml/웰씩 분주한다. 37℃의 5% C02 인큐베이터 속에서 합류점으로 될 때까지 배양한 후, 당해 플레이트에서 공지된 방법[뉴클레익·애시드·리서치(Nucleic Acids Research), 3, 2303(1976)]에 따라서 게놈 DNA를 조제하고 TE-RNase 완충액(pH 8.0)(10mmol/l Tris-HCl, 1mmol/l EDTA, 200μg/ml RNase A) 150μl에 밤새 용해한다.
상기에서 취득한 CHO/DG44 세포 유래 게놈 DNA를 10Ong, 2Oμl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 59와 서열 66의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 30사이클 실시한다. 반응 종료후, 당해 반응액을 아가로스 전기영동으로써 분획한 다음, 약 100bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수한다. 회수한 DNA 단편은 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터(Novagen사제)에 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사제)를 형질전환하여 플라스미드 ex3을 수득한다. DNA 서열분석기377(파킨엘머사제)를 사용하여 당해 플라스미드에 함유되는 CHO 세포 유래 게놈 DNA의 염기서열을 결정하며 서열 67에 기재한다.
다음에 실시예 17의 1항에서 결정한 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열에서 서열 68의 염기서열을 갖는 25mer의 프라이머 및 서열 69의 염기서열을 갖는 25mer의 프라이머를 작제한다. 계속해서 CH0/DG44 유래 게놈 DNA를 100ng, 20μl의 반응액[1×EX Taq 완충액(다카라슈조사제), 0.2mM dNTP's, 0.5단위의 EX Taq 폴리머라제(다카라슈조사제), 0.5μM의 서열 68과 서열 69의 합성 DNA 프라이머]를 조제하며 DNA 써멀 사이클러480(파킨엘머사제)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 가열한 다음, 94℃에서 1분 동안, 68℃에서 2분 동안의 사이클을 30사이클 실시한다.
반응 종료후, 당해 반응액을 아가로스 전기영동으로써 분획한 다음, 약 200bp의 DNA 단편을 유전자 클린 II 키트(BIO101사제)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라서 회수한다. 회수한 DNA 단편은 DNA 연결 키트(다카라슈조사제)를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터(Novagen사제)에 연결하며 수득된 재조합 플라스미드 DNA를 사용하여 대장균 DH5α주(도요보세키사제)를 형질전환하여 플라스미드 ex4를 수득한다. DNA 서열분석기377(파킨엘머사제)를 사용하여 당해 플라스미드에 함유되는 CHO 세포 유래 게놈 DNA의 염기서열을 결정하며 서열 70에 기재한다.
실시예 18. 시판 항체의 당쇄 해석
CHO 세포를 숙주세포로 하여 생성시킨 시판 항 HER2/neu 항체 하세프틴(Herceptin; GENENTECH사, Roche사제)의 당쇄 해석을 실시예 10의 (6)방법에 따라 실시한다(도 31). 피크 면적으로부터 계산하면 하세프틴의 α-1,6푸코스가 없는 당쇄 함량은 16%, α-1,6-푸코스 결합 당쇄 함량은 84%이다. 다른 시판 항체에 관해서도 동일한 분석을 실시한 결과, Rituxan(GENENTECH사, Roche사, IDEC 사제), Zenapax(Roche사, PDL사제)에서는 하세프틴보다 α-1,6-푸코스가 없는 당쇄 함량이 적다.
도 31는 하세프틴에서 조제한 PA화 당쇄를 역상 HPLC에서 분석하여 얻은 용리도를 도시한 것이다. 종축에 상대 형광강도, 횡축에 용출 시간을 도시한다. 역상 HPLC의 분석조건, 당쇄 구조, α-1,6-푸코스를 갖지 않는 당쇄군의 비율의 산출은 실시예 11의 (6)과 동일한 방법으로 실시한다.
본 발명에 따라 항체 조성물을 생산할 수 있는 세포, 당해 세포를 사용하는 항체 조성물의 제조방법, 항체 조성물 및 이의 용도를 제공할 수 있다.
서열 프리텍스트
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<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> CELLS PRODUCING ANTIBODY COMPOSITIONS <130> 5-1998-095796-6 <140> PCT/JP2001/08804 <141> 2001-10-05 <150> JP 2000-308526 <151> 2000-10-06 <160> 73 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2008 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt 60 tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc 120 tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180 catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240 gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300 cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360 gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420 ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480 ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540 catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat gacagatcta 600 tactacctca gtcaaacaga 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gacctctgga agaacagtca gtgctcttaa ccgctgagcc atctctccag cccctgaagt 8640 gtttctttta aagaggatag cagtgcatca tttttccctt tgaccaatga ctcctacctt 8700 actgaattgt tttagccatt tatatgtaat gctgttacca ggtttacatt ttcttttatc 8760 ttgctaaatt tcttccctgt ttgtctcatc tcttattttt gtctgttgga ttatataggc 8820 ttttattttt ctgtttttac agtaagttat atcaaattaa aattatttta tggaatgggt 8880 gtgttgacta catgtatgtc tgtgcaccat gtgctgacct ggtcttggcc agaagaaggt 8940 gtcatattct ctgaaactgg tattgtggat gttacgaact gccatagggt gctaggaatc 9000 aaaccccagc tcctctggaa aagcagccac tgctctgagc cactgagtcc tctcttcaag 9060 caggtgatgc caacttttaa tggttaccag tggataagag tgcttgtatc tctagcaccc 9120 atgaaaattt atgcattgct atatgggctt gtcacttcag cattgtgtga cagagacagg 9180 aggatcccaa gagctc 9196 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 actcatcttg gaatctcaga attgg 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 cttgaccgtt tctatcttct ctcg 24 <210> 6 <211> 979 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 6 actcatcttg gaatctcaga attggcgcta tgctactgga ggatgggaga ctgtgtttag 60 acctgtaagt gagacatgca cagacaggtc tggcctctcc actggacact ggtcaggtga 120 agtgaaggac aaaaatgttc aagtggtcga gctccccatt gtagacagcc tccatcctcg 180 tcctccttac ttacccttgg ctgtaccaga agaccttgca gatcgactcc tgagagtcca 240 tggtgatcct gcagtgtggt gggtatccca gtttgtcaaa tacttgatcc gtccacaacc 300 ttggctggaa agggaaatag aagaaaccac caagaagctt ggcttcaaac atccagttat 360 tggagtccat gtcagacgca ctgacaaagt gggaacagaa gcagccttcc atcccattga 420 ggaatacatg gtacacgttg aagaacattt tcagcttctc gaacgcagaa tgaaagtgga 480 taaaaaaaga gtgtatctgg ccactgatga cccttctttg ttaaaggagg caaagacaaa 540 gtactccaat tatgaattta ttagtgataa ctctatttct tggtcagctg gactacacaa 600 ccgatacaca gaaaattcac ttcggggcgt gatcctggat atacactttc tctcccaggc 660 tgacttcctt gtgtgtactt tttcatccca ggtctgtagg gttgcttatg aaatcatgca 720 aacactgcat cctgatgcct ctgcaaactt ccattcttta gatgacatct 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gactacacaa 600 tcggtacaca gaaaattcac ttcggggcgt gatcctggat atacactttc tctctcaggc 660 tgacttccta gtgtgtactt tttcatccca ggtctgtcgg gttgcttatg aaatcatgca 720 aaccctgcat cctgatgcct ctgcaaactt ccactcttta gatgacatct actattttgg 780 aggccaaaat gcccacaacc agattgccgt ttatcctcac aaacctcgaa ctgatgagga 840 aattccaatg gaacctggag atatcattgg tgtggctgga aaccattggg atggttattc 900 taaaggtgtc aacagaaaac ttggaaaaac aggcttatat ccctcctaca aagtccgaga 960 gaagatagaa acggtcaag 979 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 aagtataagc ttacatggat gacgatatcg ctgcgctcgt 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 9 atttaactgc aggaagcatt tgcggtggac gatggagggg 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 10 atttaaggta ccgaagcatt tgcggtgcac gatggagggg 40 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 11 ctccaattat gaatttatta gtg 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 12 ggatgtttga agccaagctt cttgg 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 13 gtccatggtg atcctgcagt gtgg 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 14 caccaatgat atctccaggt tcc 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 15 gatatcgctg cgctcgttgt cgac 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 16 caggaaggaa ggctggaaaa gagc 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 17 gatatcgctg cgctcgtcgt cgac 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 18 caggaaggaa ggctggaaga gagc 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 19 atgcgggcat ggactggttc ctgg 24 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 20 ctatttttca gcttcaggat atgtggg 27 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 21 gtctgaagca ttatgtgttg aagc 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 22 gtgagtacat tcattgtact gtg 23 <210> 23 <211> 575 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 23 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu 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Synthetic DNA <400> 28 ggtaggcctc actaactg 18 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 29 catagaaaca agtaacaaca gccag 25 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 30 gagacttcag cccacttcaa ttattggc 28 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 31 gaggccactt gtgtagcgcc aagtg 25 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 32 aggaaggtgg cgctcatcac gggc 24 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 33 taaggccaca agtcttaatt gcatcc 26 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 34 caggggtgtt cccttgagga ggtggaa 27 <210> 35 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Sequence: Synthetic DNA <400> 47 ggaatgggtg tttgtctcctc caaagatgc 28 <210> 48 <211> 1316 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 48 gccccgcccc ctccacctgg accgagagta gctggagaat tgtgcaccgg aagtagctct 60 tggactggtg gaaccctgcg caggtgcagc aacaatgggt gagccccagg gatccaggag 120 gatcctagtg acagggggct ctggactggt gggcagagct atccagaagg tggtcgcaga 180 tggcgctggc ttacccggag aggaatgggt gtttgtctcc tccaaagatg cagatctgac 240 ggatgcagca caaacccaag ccctgttcca gaaggtacag cccacccatg tcatccatct 300 tgctgcaatg gtaggaggcc ttttccggaa tatcaaatac aacttggatt tctggaggaa 360 gaatgtgcac atcaatgaca acgtcctgca ctcagctttc gaggtgggca ctcgcaaggt 420 ggtctcctgc ctgtccacct gtatcttccc tgacaagacc acctatccta ttgatgaaac 480 aatgatccac aatggtccac cccacagcag caattttggg tactcgtatg ccaagaggat 540 gattgacgtg cagaacaggg cctacttcca gcagcatggc tgcaccttca ctgctgtcat 600 ccctaccaat gtctttggac ctcatgacaa cttcaacatt gaagatggcc atgtgctgcc 660 tggcctcatc cataaggtgc atctggccaa gagtaatggt tcagccttga ctgtttgggg 720 tacagggaaa ccacggaggc 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<211> 1965 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 51 acggggggct cccggaagcg gggaccatgg cgtctctgcg cgaagcgagc ctgcggaagc 60 tgcggcgctt ttccgagatg agaggcaaac ctgtggcaac tgggaaattc tgggatgtag 120 ttgtaataac agcagctgac gaaaagcagg agcttgctta caagcaacag ttgtcggaga 180 agctgaagag aaaggaattg ccccttggag ttaactacca tgttttcact gatcctcctg 240 gaaccaaaat tggaaatgga ggatcaacac tttgttctct tcagtgcctg gaaagcctct 300 atggagacaa gtggaattcc ttcacagtcc tgttaattca ctctggtggc tacagtcaac 360 gacttcccaa tgcaagcgct ttaggaaaaa tcttcacggc tttaccactt ggtgagccca 420 tttatcagat gttggactta aaactagcca tgtacatgga tttcccctca cgcatgaagc 480 ctggagtttt ggtcacctgt gcagatgata ttgaactata cagcattggg gactctgagt 540 ccattgcatt tgagcagcct ggctttactg ccctagccca tccatctagt ctggctgtag 600 gcaccacaca tggagtattt gtattggact ctgccggttc tttgcaacat ggtgacctag 660 agtacaggca atgccaccgt ttcctccata agcccagcat tgaaaacatg caccacttta 720 atgccgtgca tagactagga agctttggtc aacaggactt gagtgggggt gacaccacct 780 gtcatccatt gcactctgag tatgtctaca 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attcgccatt cagcctgagc aacttcaagc 1680 tgctgtccat ccaggaaatg cttctctgca aagatgtagg agacatgctt gcttacaggg 1740 agcaactctt tctagaaatc agttcaaaga gaaaacagtc tgattcggag aaatcttaaa 1800 tacaatggat tttgcctgga aacaggattg caaatgcagg catattctat agatctctgg 1860 gttcttcttt ctttctcccc tctctccttt cctttccctt tgatgtaatg acaaaggtaa 1920 aaatggccac ttctgatgga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1965 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 52 caggggtgtt cccttgagga ggtggaa 27 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 53 cactgagcca ggggccacac agcatcc 27 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 54 cccctcacgc atgaagcctg gag 23 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 55 tgccaccgtt tcctccataa 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 62 ggcaggtgct gtcggtgagg tcaccatagt gc 32 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 63 ggggccatgc caaggactat gtcg 24 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 64 atgtggctga tgttacaaaa tgatg 25 <210> 65 <211> 1504 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> CDS <222> (1)..(1119) <400> 65 atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tct ggg gac 48 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc atc acc 96 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac 144 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca ggt cga 192 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg 240 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta aaa atc 288 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 100 atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc cag agc 336 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 105 110 115 cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat gtt gat 384 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 120 125 130 gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt ggc ctt 432 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 135 140 145 ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg tat gga 480 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 150 155 160 aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat cca agg 528 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 180 tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta gtg aac 576 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 185 190 195 ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc ttc aat 624 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 200 205 210 cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc 672 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 215 220 225 cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 230 235 240 gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc 768 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 260 gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc 816 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 265 270 275 ata gct act ggg gaa gtt 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ccctcgactg 1219 cctgtgtcgt ccccacagct aagagctggg ccacaggttt gtgggcacca ggacggggac 1279 actccagagc taaggccact tcgcttttgt caaaggctcc tctcaatgat tttgggaaat 1339 caagaagttt aaaatcacat actcatttta cttgaaatta tgtcactaga caacttaaat 1399 ttttgagtct tgagattgtt tttctctttt cttattaaat gatctttcta tgacccagca 1459 aaaaaaaaaa aaaaaaggga tataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1504 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 66 atgaagttgc actatggtga cctca 25 <210> 67 <211> 59 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 67 ccgacagcac ctgcctagta aaaatcatca atgaagtcaa acctacagag atctacaat 59 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 68 gacttagcag agtacactgc agatg 25 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 69 accttggata gaaaggggtg gtctc 25 <210> 70 <211> 125 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 70 ttgatggagt tggcaccttg cggcttctgg atgcaattaa gacttgtggc cttataaatt 60 ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg aactgtatgg aaaagtgcaa gaaatacccc 120 agaaa 125 <210> 71 <211> 376 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 71 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 100 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 105 110 115 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 120 125 130 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 135 140 145 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 180 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 185 190 195 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 200 205 210 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 215 220 225 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 230 235 240 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 260 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 265 270 275 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 280 285 290 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 295 300 305 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 340 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 345 350 355 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 360 365 370 Asn Pro Asn Ala 375 <210> 72 <211> 321 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 72 Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr 50 55 60 His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile 65 70 75 80 Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn 85 90 95 Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys 100 105 110 Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu 115 120 125 Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser 130 135 140 Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln 145 150 155 160 His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro 165 170 175 His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile 180 185 190 His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp 195 200 205 Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala 210 215 220 Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile 225 230 235 240 Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala 245 250 255 Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp 260 265 270 Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys 275 280 285 Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala 290 295 300 Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg 305 310 315 320 Lys <210> 73 <211> 590 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 73 Met Ala Ser Leu Arg Glu Ala Ser Leu Arg Lys Leu Arg Arg Phe Ser 1 5 10 15 Glu Met Arg Gly Lys Pro Val Ala Thr Gly Lys Phe Trp Asp Val Val 20 25 30 Val Ile Thr Ala Ala Asp Glu Lys Gln Glu Leu Ala Tyr Lys Gln Gln 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Leu Lys Arg Lys Glu Leu Pro Leu Gly Val Asn Tyr 50 55 60 His Val Phe Thr Asp Pro Pro Gly Thr Lys Ile Gly Asn Gly Gly Ser 65 70 75 80 Thr Leu Cys Ser Leu Gln Cys Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Asp Lys Trp 85 90 95 Asn Ser Phe Thr Val Leu Leu Ile His Ser Gly Gly Tyr Ser Gln Arg 100 105 110 Leu Pro Asn Ala Ser Ala Leu Gly Lys Ile Phe Thr Ala Leu Pro Leu 115 120 125 Gly Glu Pro Ile Tyr Gln Met Leu Asp Leu Lys Leu Ala Met Tyr Met 130 135 140 Asp Phe Pro Ser Arg Met Lys Pro Gly Val Leu Val Thr Cys Ala Asp 145 150 155 160 Asp Ile Glu Leu Tyr Ser Ile Gly Asp Ser Glu Ser Ile Ala Phe Glu 165 170 175 Gln Pro Gly Phe Thr Ala Leu Ala His Pro Ser Ser Leu Ala Val Gly 180 185 190 Thr Thr His Gly Val Phe Val Leu Asp Ser Ala Gly Ser Leu Gln His 195 200 205 Gly Asp Leu Glu Tyr Arg Gln Cys His Arg Phe Leu His Lys Pro Ser 210 215 220 Ile Glu Asn Met His His Phe Asn Ala Val His Arg Leu Gly Ser Phe 225 230 235 240 Gly Gln Gln Asp Leu Ser Gly Gly Asp Thr Thr Cys His Pro Leu His 245 250 255 Ser Glu Tyr Val Tyr Thr Asp Ser Leu Phe Tyr Met Asp His Lys Ser 260 265 270 Ala Lys Lys Leu Leu Asp Phe Tyr Glu Ser Val Gly Pro Leu Asn Cys 275 280 285 Glu Ile Asp Ala Tyr Gly Asp Phe Leu Gln Ala Leu Gly Pro Gly Ala 290 295 300 Thr Ala Glu Tyr Thr Lys Asn Thr Ser His Val Thr Lys Glu Glu Ser 305 310 315 320 His Leu Leu Asp Met Arg Gln Lys Ile Phe His Leu Leu Lys Gly Thr 325 330 335 Pro Leu Asn Val Val Val Leu Asn Asn Ser Arg Phe Tyr His Ile Gly 340 345 350 Thr Thr Glu Glu Tyr Leu Leu His Phe Thr Ser Asn Gly Ser Leu Gln 355 360 365 Ala Glu Leu Gly Leu Gln Ser Ile Ala Phe Ser Val Phe Pro Asn Val 370 375 380 Pro Glu Asp Ser His Glu Lys Pro Cys Val Ile His Ser Ile Leu Asn 385 390 395 400 Ser Gly Cys Cys Val Ala Pro Gly Ser Val Val Glu Tyr Ser Arg Leu 405 410 415 Gly Pro Glu Val Ser Ile Ser Glu Asn Cys Ile Ile Ser Gly Ser Val 420 425 430 Ile Glu Lys Ala Val Leu Pro Pro Cys Ser Phe Val Cys Ser Leu Ser 435 440 445 Val Glu Ile Asn Gly His Leu Glu Tyr Ser Thr Met Val Phe Gly Met 450 455 460 Glu Asp Asn Leu Lys Asn Ser Val Lys Thr Ile Ser Asp Ile Lys Met 465 470 475 480 Leu Gln Phe Phe Gly Val Cys Phe Leu Thr Cys Leu Asp Ile Trp Asn 485 490 495 Leu Lys Ala Met Glu Glu Leu Phe Ser Gly Ser Lys Thr Gln Leu Ser 500 505 510 Leu Trp Thr Ala Arg Ile Phe Pro Val Cys Ser Ser Leu Ser Glu Ser 515 520 525 Val Ala Ala Ser Leu Gly Met Leu Asn Ala Ile Arg Asn His Ser Pro 530 535 540 Phe Ser Leu Ser Asn Phe Lys Leu Leu Ser Ile Gln Glu Met Leu Leu 545 550 555 560 Cys Lys Asp Val Gly Asp Met Leu Ala Tyr Arg Glu Gln Leu Phe Leu 565 570 575 Glu Ile Ser Ser Lys Arg Lys Gln Ser Asp Ser Glu Lys Ser 580 585 590

Claims (67)

  1. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물로서, 당해 조성물 중에 함유된 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하도록, GMD(GDP-만노스 4,6-데하이드라타제), Fx(GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4-리덕타제), GFPP(GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제) 및 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹에서 선택되는 효소의 활성을 저하시키거나 결실시킨, 항체 분자를 암호화하는 유전자가 도입된 차이니즈 햄스터 난소조직 유래의 CHO 세포.
  2. 제1항에 있어서, 푸코스가 결합되지 않은 당쇄가 당해 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α 결합되지 않은 당쇄인 CHO 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자의 클래스가 IgG인 CHO 세포.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, GMD가 서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 CHO 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, GMD가 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 CHO 세포.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, Fx가 서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 CHO 세포.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, Fx가 서열 72의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 CHO 세포.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, GFPP가 서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 CHO 세포.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, GFPP가 서열 73의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 CHO 세포.
  12. 삭제
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 CH0 세포.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가 서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 CHO 세포.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 효소의 활성이, (a)효소 유전자를 표적한 유전자 파괴의 방법, (b)효소 유전자의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 방법, (c)효소에 관한 돌연변이를 도입하는 방법, (d)효소 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 방법 및 (e)N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포주를 선택하는 방법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법에 따라 저하되거나 결실된 CHO 세포.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 CHO 세포.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 친주인 CHO 세포가 생산하는 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 억제 활성이 더 높은 항체 조성물을 생산하는 CHO 세포.
  18. 제17항에 있어서, 항체 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민과 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 미만인 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 억제 활성이 높은 항체 조성물을 생산하는 CHO 세포.
  19. 제18항에 있어서, 푸코스가 결합되지 않은 당쇄가 당해 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α 결합되지 않은 당쇄인 CHO 세포.
  20. 제1항 또는 제2항에 따른 CHO 세포를 배지에 배양하여 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는 항체 조성물의 제조방법.
  21. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민을 통해 결합된 Fc 영역을 포함하는 항체 분자의 100%가 N-아세틸글루코사민에 결합된 푸코스를 갖는 당쇄를 함유하지 않는, 상기 항체 분자를 포함하는 항체 조성물.
  22. CHO 세포가 생성하는, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물이며, 당해 조성물 중에 함유되는 Fc 영역에 결합되는 전체 N-글리코시드 결합 당쇄 중에서 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물.
  23. α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 활성이, (a)α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자를 표적한 유전자 파괴의 방법, (b)α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자의 도미넌트 네가티브체를 도입하는 방법, (c)α-1,6-푸코실트랜스퍼라제에 관한 돌연변이를 도입하는 방법 및 (d)α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 방법으로 이루어진 그룹에서 선택되는 유전공학적인 방법에 따라 저하되거나 결실된 세포.
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  32. 제23항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가, (a)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA 및 (b)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA로 이루어진 그룹에서 선택되는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 세포.
  33. 제23항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가, (a)서열 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 (b)서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 단백질로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질인 세포.
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  35. 제23항, 제32항 또는 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α 결합된 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포.
  36. 제23항, 제32항 또는 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, (a)차이니즈 햄스터 난소조직 유래 CHO 세포, (b)래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, (c)마우스 골수종 세포주 NSO 세포, (d)마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포, (e)시리안 햄스터 신장조직 유래 BHK 세포, (f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포, (g)사람 백혈병 세포주 나말바 세포, (h)배아성 줄기세포 및 (i)수정란 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세포.
  37. 제23항, 제32항 또는 제33항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 분자를 암호화하는 유전자가 도입된 세포.
  38. 제37항에 있어서, 항체 분자의 클래스가 IgG인 세포.
  39. 제37항에 따른 세포를 배지에 배양하여 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시켜 당해 배양물로부터 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는 항체 조성물의 제조방법.
  40. 제39항에 있어서, 친주로부터 수득되는 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 억제 활성이 더 높은 항체 조성물을 생산하는 방법.
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  42. α-1,6-푸코실트랜스퍼라제의 활성이 저하되도록 게놈이 변형된 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
  43. 세포내 당 뉴클레오타이드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합되는 당쇄 변형에 관여하는 효소 활성이 저하되도록 변형된 게놈을 포함하고, GMD(GDP-만노스 4,6-데하이드라타제), Fx(GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제, 4-리덕타제), GFPP(GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제) 및 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제로 이루어진 그룹에서 선택되는 효소를 암호화하는 유전자가 녹아웃된, 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
  44. 삭제
  45. 제43항에 있어서, GMD가 서열 65의 염기서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
  46. 제43항에 있어서, Fx가 서열 48의 염기서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
  47. 제43항에 있어서, GFPP가 서열 51의 염기서열을 포함하는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
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  49. 제42항 또는 제43항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제가, (a)서열 1의 염기서열을 포함하는 DNA 및 (b)서열 2의 염기서열을 포함하는 DNA로 이루어진 그룹에서 선택되는 DNA에 의해 암호화된 단백질인 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손.
  50. 제42항 또는 제43항에 있어서, 형질전환 비사람 동물이 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이, 및 토끼로 이루어진 그룹에서 선택되는 동물인 형질전환 비사람 동물 또는 이의 자손.
  51. 제42항 또는 제43항에 따른 형질전환 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손에게 항체 분자를 암호화하는 유전자를 도입하며 당해 동물 또는 식물을 사육하여 사육한 동물 또는 식물로부터 도입한 항체를 함유하는 조직 또는 체액을 취득하며 취득된 조직 또는 체액으로부터 목적하는 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는 항체 조성물의 제조방법.
  52. 제51항에 있어서, 항체 분자의 클래스가 IgG인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 게놈이 변형되지 않은 비사람 동물 또는 식물, 또는 이의 자손으로부터 수득되는 항체 조성물보다 항체 의존성 세포 억제 활성이 높은 항체 조성물을 생산하는 방법.
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