KR20110084196A - 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계 및 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다양한 글리코실화 패턴을 가진 당단백질을 생산하는 세포를 포함한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 방법 및 조성물들은 치료요법적 가치가 있는 항체 및 단백질의 생산에 이용될 수 있다.

Description

다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계 및 단백질{Cell lines and proteins with variant glycosylation pattern}

본 출원은 2008년 9월 26일자 출원된 US Serial No. 61/194,292 및 2008년 12월 8일자 출원된 US Serial No. 61/120,722, 그리고 2009년 4월 9일자 출원된 US Serial No. 61/168,186을 우선권으로 주장하며, 이 모두는 모든 목적을 위하여 전문 참고문헌에 통합된다.

탄수화물, 사카라이드, 또는 슈가 분자의 조성물에 변이(Variation)는 IgG 매개된 면역 반응과 세포 효과물질 기능을 연결시키는 세 가지 부류의 FcγRs (FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII)에 대한 IgG의 친화력에 영향을 주는 것으로 나타났다 (Wright and Morrison , Trends Biotechnol 15(1): 2632; Gessner et al ., Ann Hematol 76(6): 23148 (1998); Jefferis et al ., Immunol Rev 163: 5976 (1998). Ravetch and Bolland , Annu Rev Immunol 19: 27590 (2001)).

당단백질의 슈가 사슬은 단백질성 모이어티의 결합 형태에 근거하여 다음과 같이 두 가지 넓은 유형으로 일반적으로 분류된다: 즉, 아스파라긴에 결합된 슈가 사슬(N-글리코시드-링크된 슈가 사슬), 그리고 세린 또는 트레오닌과 같은 다른 아미노산에 결합된 슈가 사슬(O-글리코시드-링크된 슈가 사슬). 일반적으로 이들은 다음의 구조(I)와 같이 기본적인 공통의 코어를 가진다:

N-글리코시드-링크된 슈가 사슬은 다양한 슈가 분자와 함께 다양한 구조를 가진다. 아스파라긴에 결합하는 슈가 사슬 말단은 일반적으로 소위 환원 단부로 불리며, 반대 측은 비-환원 단부로 불린다. N-글리코시드-링크된 슈가 사슬들은 고(high) 만노즈 유형 (이때 만노즈 단독으로 코어 구조의 비-환원 단부에 결합함); 복합체 유형 (이때 코어 구조의 비-환원 단부 측면은 갈락토즈-N-아세틸글루코사민 (Gal-GlcNAc)의 최소한 한 개의 평행한 가지를 가지고 있고, Gal-GlcNAc의 비-환원 단부 측면은 N-아세틸글루코사민 또는 이와 유사한 것을 양분시키는 시알산 구조를 가지며); 하이브리드 유형 (이때 코어 구조의 비-환원 단부 측면은 고 만노즈 유형 및 복합체 유형 모두의 가지를 보유하며); 및 이와 유사한 유형을 포함할 수 있다. 슈가 사슬의 구조는 슈가 사슬을 합성하는 글리코실에 대한 유전자, 및/또는 슈가 사슬을 가수분해하는 해당(glycolytic) 효소에 대한 유전자와 같은 슈가 사슬 유전자에 의해 결정될 수 있다.

당단백질은 일반적으로 세포질 망상구조 (ER) 관강내 슈가 사슬로 변형된다. 예를 들면, N-글리코시드-링크된 슈가 사슬의 생합성 단계 동안, 상대적으로 큰 슈가 사슬은 폴리펩티드 사슬로 이동되어 ER 관강내에서 신장된다. 슈가 분자는 돌리콜 포스페이트 (PDol)와 같은 약 20개의 α이소프렌 유닛을 포함하는 긴 사슬 지질 캐리어의 포스페이트 기에 연속하여 추가될 수 있다. 예를 들면, N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)은 PDol으로 이동되어 GlcNAc-P-P-Dol를 형성하고, 그 다음 하나 이상의 GlcNAc은 이동되어 GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol를 형성한다. 그 다음, 5개 만노즈 (Man)가 이동되어 (Man)₅(GlcNAc)₂-P-P-Dol를 만들고, 그 다음 4개의 Man와 3개의 글루코즈 (Glc)가 이동된다. 그 결과, 슈가 사슬 전구물질인 코어 올리고사카라이드, (Glc)₃-(Man)₉-(GlcNAc)₂-P-P-Dol가 만들어진다. 14개 슈가를 포함하는 슈가 사슬 전구물질은 ER 관강안에서 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌 서열을 가지는 폴리펩티드로 이동될 수 있다. 코어 올리고사카라이드에 결합된 돌리콜 피로포스페이트 (PPDol)는 일반적으로 방출되어, 피로포스파타제로 가수분해되어 돌리콜 포스페이트 (PDol)가 되고, 그리고 재순환된다. 슈가 사슬의 정돈은 일반적으로 슈가 사슬이 폴리펩티드에 결합된 후에 시작된다. 예를 들면, 3개 Glc 와 1개 또는 2개 Man는 ER 상에서 α1,2글루코시다제 I, α1,3글루코시다제 II 및 α1,2만노시다제의 작용에 의해 제거된다.

ER 상에서 정돈 대상이었던 당단백질은 골지체(Golgi body)로 이동되어 추가 변형될 수 있다. 예를 들면, 골지체의 시스(cis) 부분에는 N-아세틸글루코사민 포스포전이효소(만노즈 포스페이트 추가를 돕는다), N-아세틸글루코사민 1포스포디에스테르 α-N-아세틸글루코사미미다제 및 α-만노시다제 I (Man 잔기를 5개로 감소시킴)이 존재한다. 골지체의 중간 부분에는 N-아세틸글루코사민 전이효소 I (GnTI) (복합체 유형 N-글리코시드-링크된 슈가 사슬의 제1 외측 GlcNAc 추가를 돕는다), α만노시다제 II (2개 Man 제거를 돕는다), N-아세틸글루코사민 전이효소 II (GnTII) (외부로부터 제 2 GlcNAc의 추가를 돕는다) 및 α1,6-퓨코실전이효소(환원 단부 N-아세틸글루코사민에 퓨코스 추가를 돕는다)가 존재한다. 골지체의 트란스(trans) 부분에는 갈락토즈 전이효소(갈락토즈 추가를 돕는다), 및 시알일전이효소(N-아세틸뉴라민산 또는 이와 유사한 것과 같은 시알산 추가에 관련됨)가 존재한다. 따라서, 다양한 N-글리코시드-링크된 슈가 사슬은 이들 다양한 효소 작용에 의해 형성될 수 있다.

사슬내 다양한 슈가 분자 함량으로 인하여 슈가 사슬 구조 변이, 또는 다양한 글리코실화 패턴은 항체와 같은 당단백질의 효과물질 기능에 중요한 역할을 한다. 예를 들면, IgG 유형 항체의 Fc 구역에서, 두 개의 N-글리코시드-링크된 슈가 사슬 결합 부위가 일반적으로 존재한다. 혈청 IgG에서, 슈가 사슬 결합 부위는 일반적으로 다중 가지를 가지는 복합체 유형 슈가 사슬에 결합하고, 이때 시알산의 추가 또는 N-아세틸글루코사민의 양분은 낮다. 갈락토즈의 복합체 유형 슈가 사슬의 비-환원 단부에 추가 및 환원 단부에서 N-아세틸글루코사민에 퓨코스의 추가를 만드는 것은 다양한 방식 및 형태가 있다(예를 들면, Leppanen et al ., Biochemistry, 36, 70267036 (1997) 참고).

퓨코실화는 세포의 골지 조직에서 새로 합성된 항체가 퓨코스 사카라이드의 추가에 의해 변형될 수 있는 프로세스의 실례가 된다. 이와 같은 단백질 변형은 세포를 형광단-콘쥬게이트된 LCA (Lens 쿨리마리스 아글루티닌-A:퓨코스로 변형된 단백질에 선호적으로 결합하는 화학물질)로 착색시켜 시각적으로 볼 수 있다, 최근, 항체의 퓨코실화는 항체가 인간 FcγR에 결합 및 항체-의존성 세포독성(ADCC)에 영향을 주는 것으로 관찰되었다. 항체가 낮은 수준의 퓨코스를 가질 때 항체-결합 친화력 및 항체-매개된 ADCC가 상당히 강화되었다(Shields et al ., J Biol Chem 277(30): 267334 (2002); Shinkawa et al ., J Biol Chem 278(5): 346673 (2003)).

단백질 퓨코실화는 자유 퓨코스의 취입으로 시작하여, 퓨코스 키나제에 의한 포스포릴화, 그리고 GDP-퓨코스 피로포스포릴라제에 의한 GDP-퓨코스로 전환되는 프로세스다. 퓨코실전이효소는 퓨코스 잔기를 분비 경로내 글리칸에 또는 단백질로 이동시키고, 후속적으로 변형된 당단백질은 분비를 위하여 세포 표면으로 운반된다. 항체를 생산하는 세포의 퓨코실화 상태는 생산된 항체내 퓨코스 함량과 관련되며, 그리고 퓨코실전이효소가 없으면 세포 및 항체 수준에서 퓨코실화가 되지 않았다(YamaneOhnuki et al ., Biotechnol Bioeng 87(5): 61422 (2004)).

ADCC는 치료 항체들이 면역 반응을 유도하고, 암 세포의 사멸을 중개하는 중요한 작용 기전이다. 치료 항체들에 의한 ADCC의 강화는 임상 반응을 개선시킬 수 있고, 그리고 치료 약량을 감소시킬 수 있어, 따라서 가능한 부작용을 감소시킬 수 있다(Adams and Weiner , Nat Biotechnol 23(9): 114757 (2005)). 생체내 모델 및 임상 실험에서 Herceptin과 같은 치료 항체들은 ADCC를 포함하는 세포독성 성질을 보유한다. 이와 같은 성질들은 Herceptin 유도된 유방 종양 퇴화 및 폐 전이로부터 보호에 주요 인자들이 된다(Carter et al ., Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 42859 (1992); Lewis et al ., Cancer Immunol Immunother 37(4): 25563 (1993); Cooley et al ., Exp Hematol 27(10): 153341 (1999); Clynes et al ., Nat Med 6(4): 4436 (2000); Repka et al ., Clin Cancer Res 9(7): 24406 (2003); Gennari et al ., Clin Cancer Res 10(17): 56505 (2004); Nahta and Esteva, Cancer Lett 232(2): 12338 (2006)). 또한, 낮은 퓨코실화 세포에 의해 만들어진 항체들은 ADCC 활성을 강화시킨다고 설명하였다(Shields et al ., J Biol Chem 277(30): 267334 (2002); Shinkawa et al ., J Biol Chem 278(5): 346673 (2003)).

인간 IgG1 하위부류 항체들의 ADCC 활성의 발현은 일반적으로 효과물질 세포 가령, 킬러 세포, 자연 킬러 세포, 활성화된 대식세포 또는 이와 유사한 것 (FcγR) 및 다양한 보체 성분들의 표면에 존재하는 항체 수용체에 항체의 Fc 부분의 결합을 요구한다. 항체 힌지 부위의 제2 도메인 및 C 부위 (이후 "Cγ2 도메인") 및 Cγ2 도메인에 링크된 슈가 사슬내 있는 몇 가지 아미노산 잔기들이 이와 같은 결합 반응에 중요하다고 제안되었다.

현재, 종양 세포에 대한 단클론 항체-매개된 ADCC를 강화시키기 위한 몇 가지 전략들이 제안되었는데, 가령, 1) 특이적 항암 항체들을 개발하고, 이때 항체의 한 팔은 면역 효과물질 세포를 좀더 효과적으로 모으기 위하여 IgG 수용체에 결합하며 (Segal et al ., J Immunol Methods 248(12): 16 (2001)); 2) 면역 효과물질 세포의 효과물질 기능을 강화시키기 위하여 재조합 인간 사이토킨을 이용하고(Carson et al ., Eur J Immunol 31(10): 301625 (2001); Repka et al ., Clin Cancer Res 9(7): 24406 (2003)); 3) IgG-사이토킨 융합 단백질을 이용하고 (Penichet and Morrison , J Immunol Method 248(12): 91101 (2001)); 4) IgG 수용체에 개선된 결합을 위하여 항체의 Fc 서열을 변형시키고(Shields et al ., J Biol Chem 276(9): 6591604 (2001)); 그리고 5) Asn297-링크된 탄수화물 수준을 최적화시킨다(Umana et al ., Nat Biotechnol 17(2): 17680 (1999); Davies et al ., Biotechnol Bioeng 74(4): 28894 (2001); Shinkawa et al ., J Biol Chem 278(5): 346673 (2003)).

한 가지 방법은 FcγRs 및 ADCC에 대한 결합 친화력을 증가시키기 위하여 항암 항체들의 퓨코스 함량을 변형시키는 것이다. IgG1는 Asn297에 결합된 두 개의 N-링크된 올리고사카라이드 사슬을 가지며, 코어 퓨코스 존부하에 트리만노실 코어 구조로 구성되며, N-아세틸글루코사민 및 말단 갈락토즈를 절단한다(Rademacher et al., Biochem Soc Symp 51: 13148 (1986)). 면역글로블린 G 효과물질 기능에서 Asn297-링크된 탄수화물의 성질 및 중요성은 오래전부터 인지되어 왔다. 퓨코실제거된 Rituxan, 림프종 치료를 위한 항-CD20 항체는 고친화력 및 100배 강화된 ADCC 활성으로 FcγRIIIa에 강력하게 결합한다는 것이 설명되었다(Shinkawa et al ., J Biol Chem 278(5): 346673 (2003); YamaneOhnuki et al ., Biotechnol Bioeng 87(5): 61422 (2004); Kanda et al ., Biotechnol Bioeng 94(4): 6808 (2006)). FcγRIIIa에 낮은 퓨코스 Herceptin 결합은 보통의 퓨코스 Herceptin 보다 약 50배 개선되었으며, 그 결과, Herceptin-매개된-ADCC는 실질적으로 개선된 것을 보여주었다(Shields et al ., J Biol Chem 277(30): 2673340 (2002)). 이것은 항암 항체들의 퓨코실제거는 FcγR에 이들의 결합 친화력을 증가시키고, 그리고 ADCC를 강화시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 퓨코스 함량의 변화는 이들의 치료 효과를 증강시키고, 퓨코실화된 항체들에 반응성이 없는 암 환자들까지 치료를 확대하기 위하여 항체들의 항암 면역 반응을 개선시키는 방법을 나타낸다.

그러나, 높은 치료 가능성을 가진 항체들을 변형시키기 위한 대안 방법이 여전히 요구된다.

발명의 요약

효과물질 기능이 증가된 치료 단백질을 만들 필요가 있다. 본 내용은 이와 같은 요구에 부합되는 방법 및 조성물을 제공하고, 뿐만 아니라 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계 및 당단백질의 생산, 또는 대응하는 야생형 유형 단백질과 비교하여 변형된 글리코실화 패턴을 가지는 세포계 또는 당단백질을 생산함으로써 관련된 잇점들, 또는, 변형안된 글리코실화 패턴을 가진 세포계에서 생산된 당단백질을 제공한다. 숙주 세포에 의해 발현된 당단백질의 슈가 사슬 함량에서 차이 및 다양한 글리코실화 패턴을 가진 이들 당단백질, 가령 항체의 생산에 이용될 수 있는 숙주 세포의 개발은 더 높은 효과물질 기능을 가질 수 있다.

한 구체예에서, 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하여, 다양한 글리코실화 패턴을 만들도록 변형된 숙주 세포를 생산하고 선별하는 방법 및 조성물을 제공한다. 다양한 글리코실화 패턴을 가진 숙주 세포를 선별하는 방법은 다수의 숙주 세포를 제공하고; 다수의 숙주 세포에 무작위 유전 정보를 도입시키고; 다수의 세포로부터 무작위 유전적 돌연변이를 당하지 않은 대응하는 부모계 세포와 비교하였을 때, 적어도 한 가지 유형의 슈가 분자 수준이 변형된 것을 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 최소한 한 가지 세포를 선택하는 것을 포함한다. 더욱이, 유전적 돌연변이는 화학적 돌연변이 유발요인(mutagen)에 의해 유도될 수 있다.

숙주 세포는 포유류 세포와 같은 진핵 세포가 될 수 있다. 변형된 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포가 될 수 있다. 숙주 세포는 변형된 CHO 세포, 가령, CHO-1E5, CHO-3F, 또는 CHO-2.6 세포가 될 수 있다. 숙주 세포는 골수종 세포가 될 수 있다. 변형된 숙주 세포는 NS0, SP2/0, HEK-293, PER.C6, 또는 YB2/0 세포가 될 수 있다. 변형된 숙주 세포는 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하였을 때, 숙주 세포의 표면에 존재하는 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 나타낸다. 수준의 변화는 적어도 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상이 될 수 있다. 다양한 글리코실화 패턴은 퓨코실화, 만노실화, N-아세틸글루코사미닐화, 또는 이의 조합의 수준 변화로 증명될 수 있다. 일부 구체예에서, 이와 같은 변화는 갈락토즈의 수준, 글루코즈의 수준, 또는 이둘의 수준의 변화가 될 수 있다. 이와 같은 변화는 갈락토즈의 수준, 글루코즈의 수준, 또는 이둘의 수준의 증가 또는 감소가 될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 변화는 글루코즈의 증가 및 갈락토즈의 감소가 될 수 있다.

일부 구체예에서, 이 변화는 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하였을 때, 변형된 숙주 세포의 퓨코실화 수준의 감소가 될 수 있다. 다양한 글리코실화 패턴은 또한 α-링크된 만노즈의 수준과 같은 만노실화 수준의 변화로 증명될 수 있다. 만노실화의 수준은 변형된 숙주 세포에서 증가될 수 있다. 다양한 글리코실화 패턴은 또한 N-아세틸글루코사미닐화의 수준의 변화, 가령, 변형된 숙주 세포에서 N-아세틸글루코사미닐화의 증가 또는 감소로 증명될 수 있다. N-아세틸글루코사미닐화는 α- 또는 β-링크된 N-아세틸글루코사민에 관련될 수 있다. 변형안된 부모계 숙주세포와 비교하였을 때, 다양한 글리코실화 패턴을 만들기 위하여 변형된 숙주 세포는 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하였을 때 이에 필적하는 1, 6-퓨코실전이효소 활성을 가질 수 있다. 또다른 측면에서, 변형된 숙주 세포는 적어도 약 30회, 40회, 50회, 60회, 80회, 100회, 120회, 150회, 200회, 1000회 또는 그 이상의 계대후 이의 다양한 글리코실화 패턴을 유지할 수 있다. 변형된 숙주 세포는 또한 무혈청배지, 현탁액, 및/또는 발효기에서 성장할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 실질적으로 균질한 패턴의 N-링크된 글리칸을 나타내는 항체들을 만드는 변형된 비-림프구성 숙주 세포에 의해 만들어진 항체 집단을 제공하며, 이들 집단의 멤버는 적어도 두 가지 별개 항원에 결합한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 및 글루코사민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 슈가 모이어티 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 가지는 N-링크된 글리칸을 생산하는 변형된 숙주 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 갈락토즈 수준의 감소를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 D-글루코사민의 수준 감소를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 만노즈 수준의 증가를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 글루코즈 수준의 증가를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 대응하는 변형안된 숙주 세포의 것보다 더 높은 ADCC 활성을 나타내는 항체들을 만든다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 대응하는 변형안된 숙주 세포에 의해 만들어지는 대응하는 항체와 비교하였을 때, FcγRIIIA 수용체에 결합 친화력이 증가된 항체들을 만든다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 NS0, SP2/0, HEK-293, PER.C6 및 YB2/0 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 골수종 세포다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 적어도 약 60회 계대후 다양한 글리코실화 패턴을 유지한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 무혈청 배지에서 성장한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 현탁액에서 성장한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 이형성 당단백질을 인코드하는 이형성 서열을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸을 나타내는 당단백질을 생산하는 분리된 숙주 세포를 제공한다. 일부 구체예에서, 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸은 질량분석에 의해 분석된 단일 피크로 증명된다. 일부 구체예에서, N-링크된 패턴은 구조식 I 또는 II를 가지며, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

또 다른 측면에서, 변형된 숙주 세포는 이종(heterologous) 서열을 포함할 수 있는데, 이때 이종 서열은 항체 또는 효소와 같은 이종 당단백질을 인코드할 수 있다. 여기에서 설명된 것과 같이, 변형된 당단백질을 생산하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 변형된 당단백질을 인코드하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열이 제공되며; 변형된 당단백질이 변형된 숙주 세포에서 발현되도록 하는 것을 포함한다. 따라서, 이종 서열에 의해 인코드되고, 그리고 가령, 변형안된 부모계 숙주 세포에서 생산되는 대응하는 야생형 당단백질과 비교하였을 때, 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 가지는 이종 당단백질과 같은 당단백질도 제공된다. 다양한 글리코실화 패턴은 N-링크된 올리고사카라이드의 수준의 변화로 증명될 수 있다. 이종 당단백질은 변형안된 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 야생형 당단백질과 비교하였을 때, 글루코즈, 갈락토즈, 퓨코스, 만노즈, 및/또는 N-아세틸글루코사민의 증가된 또는 감소된 수준을 나타낼 수 있다. N-아세틸글루코사민은 α 또는 β링크된 N-아세틸글루코사민이 될 수 있다.

한 측면에서, 당단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 항체는 암 항원에 결합할 수 있다. 예를 들면, 항원은 HER2, CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD19, CD30, CD33, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 및 인테그린 패밀리 멤버로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체는 또한 변형안된 숙주 세포에 의해 만들어진 대응하는 항체와 비교하였을 때, 증가된 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)를 나타낼 수 있다. 더욱이, 항체는 IgG 항체를 포함할 수 있다. 여기에서 설명된 것과 같이, 항체는 또한 변형안된 숙주 세포에 의해 만들어진 대응하는 항체와 비교하였을 때, 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있다. 슈가 분자는 항체의 Fc 부위를 통하여 부착될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 1개의 글루코즈 분자, 4개의 만노즈 분자, 그리고 두 개의 N-아세틸글리코자민 분자를 포함하는 N-링크된 글리칸을 제공한다. 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 하나 이상의 퓨코스 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 구조식 I을 가지며, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 구조식 II을 가지며, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

또다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 N-글리칸을 포함하는 분리된 당단백질을 제공한다. 일부 구체예에서, 당단백질은 항체다. 일부 구체예에서, 당단백질은 효소다. 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 항체의 Fc 부위에 부착된다. 일부 구체예에서, 항체는 암 항원에 결합한다. 일부 구체예에서, 암 항원은 HER2, 면역글로블린 입실론 Fc 수용체 II, Alk1,CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA4, 무친(Mucin) 1, 무친 16, 엔도글린(Endoglin), 메소테린(Mesothelin) 수용체, 노고(Nogo) 수용체, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 강글리오시드(Ganglioside) GD3, 및 알파 및 베타 인테그린으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 항체는 실질적으로 균일한 N-링크된 글리칸 집단을 생산하는 변형된 숙주 세포에 의해 만들어진다. 일부 구체예에서, 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL61 및 CRL9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, 증가된 ADCC(항체-의존성 세포성 세포독성) 활성을 가진다. 일부 구체예에서, 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL61 및 CRL9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 만들어진 대응하는 항체와 비교하였을 때, FcγRIIIA 수용체에 대한 증가된 결합 친화력을 가진다. 일부 구체예에서, 항체는 억제성(inhibitory) 항체다. 일부 구체예에서, 항체는 자극성(stimulatory) 항체다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 항체다.

일부 구체예에서, 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸을 나타내는 당단백질을 생산하는 숙주 세포는 비-림프성 세포다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 CHO 세포다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸을 나타내는 항체를 생산한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 변형된 당단백질을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 변형된 당단백질을 인코드하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고; 그리고 (b) 여기에서 설명된 숙주 세포에서 변형된 당단백질이 발현되도록 하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 당단백질은 숙주 세포에 의해 배출된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 무혈청 배지에 유지된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 현탁액 배양물에 유지된다. 일부 구체예에서, 변형된 당단백질은 항체다.

본 발명은 여기에서 설명된 것과 같이 숙주를 포함하는 배양 배지를 또한 제공한다. 일부 구체예에서, 배양물 배지는 무혈청이다. 본 발명은 배양물 배지안에서 다양한 글리코실화 패턴을 가지는 N-글리칸 또는 실질적으로 균일한 패턴의 N-글리칸을 나타내는 당단백질을 생산하는 다수의 숙주 세포를 포함하는 배양물 발효기를 설명한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 변형된 숙주 세포에 의해 만들어진 항체를 제공하는데, 이때 항체는 N-링크된 글리칸을 포함하며, 변형안된 숙주 세포에 의해 만들어지는 항체와 비교하였을 때, 항체는 Fc 감마 수용체 IIIa (FcgRIIIa)에 대한 증가된 결합 친화력, 및/또는 Fc 감마 수용체IIb (FcgRIIb)에 대한 감소된 결합 친화력을 가지고, 따라서 FcgRIIIa 및/또는 FcgRIIb를 발현시키는 효과물질 세포에 대해 ADCC(항체-의존성 세포 매개된 세포독성)을 강화시킨다. 또다른 측면에서, 본 발명은 변형된 숙주 세포에 의해 만들어진 항체를 제공하는데, 이때 항체는 N-링크된 글리칸을 포함하며, 대응하는 변형안된 숙주 세포에 의해 만들어지는 대응하는 항체와 비교하였을 때, 항체는 증가된 ADCC 활성을 나타내고, 이때 증가된 ADCC 활성은 높은 친화력 Fc 감마 수용체 FcgRIIIa 158V/V를 발현시키는 효과물질 세포, 그리고 낮은 친화력 Fc 감마 수용체, FcgRIIIa 158F/F 또는 FcgRIIIa 158F/V를 발현시키는 효과물질 세포에 대항한다.

본 발명의 항체들의 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 1개의 글루코즈 분자, 4개의 만노즈 분자, 그리고 두 개의 N-아세틸글리코자민 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 하나 이상의 퓨코스 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 구조식 I 또는 II를 가지며, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

(I)

일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 항체의 Fc 부위에 부착한다. 일부 구체예에서, 항체는 암 항원에 결합한다. 암 항원은 HER2, 면역글로블린 입실론 Fc 수용체II, Alk1, CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA4, 무친 1, 무친 16, 엔도글린, 메소테린 수용체, 노고 수용체, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 강글리오시드 GD3, 및 알파 및 베타 인테그린으로 구성된 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체는 억제성 항체 또는 자극성 항체가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG 항체다. 일부 구체예에서, 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL-61 및 CRL-9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때 낮은 친화력 FcR, FcgRIIIa 158F/F 또는 FcgRIIIa 158 F/V을 발현시키는 효과물질 세포에 대해 증가된 ADCC (항체의존성 세포매개된 세포독성) 활성을 가진다. 일부 구체예에서, 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL-61 및 CRL-9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, 높은 친화력 FcR, FcgRIIIa 158V/V을 발현시키는 효과물질 세포에 대해 증가된 ADCC(항체의존성 세포매개된 세포독성) 활성을 가진다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포다. 숙주 세포는 NS0, SP2/0, HEK-293, PER.C6 및 YB2/0 세포을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포는 또한 골수종 세포가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 효과물질 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)다. 일부 구체예에서, 효과물질 세포는 NK 세포, 단핵세포, 대식세포, 또는 다핵성 호중구 (PMN)다.

또다른 측면에서, 본 발명은 N-링크된 글리칸을 가지는 변형된 항체를 생산하는 능력으로 특징화된 변형된 숙주 세포를 제공하는데, 이때 항체는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산되는 대응항체와 비교하였을 때, Fc 감마 수용체IIIa (FcgRIIIa)에 대해 증가된 결합 친화력을 나타내거나 및/또는 Fc 감마 수용체IIb (FcgRIIb)에 대해 감소된 결합 친화력을 나타내어, FcgRIIIa 및/또는 FcgRIIb를 발현하는 효과물질 세포에 대항하여 ADCC (항체-의존성 세포매개된 세포독성) 활성이 강화된다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 N-링크된 글리칸을 가지는 변형된 항체를 생산하는 능력을 특징으로 하는 변형된 숙주 세포를 제공하는데, 이때 항체는 대응하는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산되는 대응 항체와 비교하였을 때, 증가된 ADCC 활성을 나타내고, 그리고 증가된 ADCC 활성은 고친화력 Fc 감마 수용체, FcgRIIIa 158V/V를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하는 것이며, 그리고 효과물질 저친화력 Fc 감마 수용체, FcgRIIIa 158F/F 또는 FcgRIIIa 158F/V를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하는 것이다.

본 발명의 변형된 숙주 세포의 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 및 글루코사민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 슈가 모이어티 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 나타낸다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 갈락토즈 수준의 감소를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 D-글루코사민 수준의 감소를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 만노즈 수준의 증가를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 다양한 글리코실화 패턴은 글루코즈 수준의 증가를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, N-링크된 글리칸은 구조식 I 또는 II를 가지며, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

일부 구체예에서, 숙주 세포는 대응하는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산된 대응하는 항체와 비교하였을 때, 고친화력 Fc 수용체, FcgRIIIa 158V/V를 발현하는 효과물질 세포에 대항하는 증가된 ADCC 활성을 나타내고, 그리고 저친화력 Fc 수용체, FcgRIIIa 158F/F 또는 FcgRIIIa 158F/V를 발현하는 효과물질 세포에 대항하는 증가된 ADCC 활성을 나타내는 항체를 생산한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 대응하는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산된 대응하는 항체와 비교하였을 때, Fc 감마 수용체IIIa (FcgRIIIa)에 대한 증가된 결합 친화력을 나타내고, 및/또는 Fc 감마 수용체IIb (FcgRIIb)에 대해 감소된 결합 친화력을 나타내어, FcgRIIIa 및/또는 FcgRIIb를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하여 ADCC 활성이 강화된 항체를 생산한다. 일부 구체예에서, 항체는 암 항원에 결합한다. 암 항원은 HER2, 면역글로블린 입실론 Fc 수용체 II, Alk1,CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA4, 무친 1, 무친 16, 엔도글린, 메소테린 수용체, 노고 수용체, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 강글리오시드 GD3, 및 알파 및 베타 인테그린을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포다. 숙주 세포는 NS0, SP2/0, HEK-293, PER.C6 및 YB2/0 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 숙주 세포는 또한 골수종 세포가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 적어도 약 60 회 계대 후 다양한 글리코실화 패턴을 유지한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 무혈청 배지에서 성장한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 현탁액에서 성장한다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 이종 당단백질을 인코드하는 이종 서열을 포함한다.

본 발명은 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 여기에서 설명된 목적 항체의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 암, 알레르기, 심혈관 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 신경 질환, 바이러스 감염 및/또는 세균 감염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 질환은 암 또는 알레르기가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 개체는 포유류, 예를 들면, 인간이다. 일부 구체예에서, 목적 항체 투여는 장관외 주사, 주입, 경구 투여 또는 흡입을 통하여 실시한다. 본 발명은 또한 변형된 항체를 생산하는 방법을 제공하는데 이 방법은 (a) 변형된 항체를 인코드하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고; 그리고 (b) 변형된 항체가 여기에서 설명된 숙주 세포에서 발현되도록 하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 항체는 숙주 세포에 의해 분비된다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 무혈청 배지내에서 유지된다 일부 구체예에서, 숙주 세포는 현탁액 배양물에서 유지된다. 본 발명은 또한 숙주 세포를 포함하는 배양물 배지와, 배양물 배지내에 숙주 세포 다수를 포함하는 배양물 발효기도 포함한다. 일부 구체예에서, 배양물 배지는 무혈청 배지다.

참고문헌의 통합

본 명세서에서 언급된 모든 공개 및 특허 출원은 각 개별적인 공개 또는 특허 출원이 참고문헌에 특이적으로 그리고 개별적으로 명시된 것과 같은 수준으로 참고문헌에 통합된다.

내용의 새로운 특징들은 첨부된 청구범위에서 상세하게 제시된다. 다음의 설명되는 구체예를 제공하는 상세한 설명과 다음의 도면 설명을 참고하면 본 내용의 특징 및 장점들을 더 잘 이해할 수 있을 것이고, 구체예에는 설명의 원리들이 이용되었다:
도 1 은 화학적 유도된 무작위 돌연변이 생성 이후 퓨코스를 적게 가진 CHO-K1 세포를 농축시키는 과정을 나타낸다. CHO-K1 세포를 화학물질로 처리하여 무작위 돌연변이를 유도한다. 퓨코실화침묵 돌연변이를 생성시키는 기회가 드물기 때문에, LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘을 이용하여 퓨코스를 많이 가진 세포를 고갈시키는 독특한 프로세스를 이용한다. 이들 두 가지 시약을 우선 혼합하여 배양물 배지에 바이오틴스트렙타아비딘 복합체를 만든다. 화학적유도된 돌연변이생성 이후, 복합체를 세포에 첨가하였다. 퓨코스를 많이 가진 세포의 표면에 LCA 결합으로 세포 막의 아주 근접 부분으로 사포린을 가져오게 되고, 세포 사멸을 초래한다.
도 2는 화학적 유도된 무작위 돌연변이 생성 이후 낮은 퓨코스 수준을 가진 CHO-K1 돌연변이체 세포를 선별하는 순서도이다.
도 3은 퓨코스를 많이 가진 CHO-K1 세포를 죽이기 위하여 LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘독소의 적정 농도를 확인시키는 그래프다. 웰당 10⁵개의 CHO-K1 세포를 96-웰 플레이트에 도말시켰다. LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린을 표시된 상이한 농도로 배지에서 혼합시키고, 세포에 첨가하였다. 10일 후 MTT 분석을 이용하여 세포 성장을 측정하였다. 독소 없는 배지에서 성장한 세포를 기준으로 이용하였다.
도 4는 LCA/독소 선별은 화학적-유도된 무작위 돌연변이 생성 이후 퓨코스를 적게 가진 세포 집단을 농축시킨다는 것을 보여준다. A) 무작위 돌연변이는 CHO-K1 세포에서 ICR-191에 의해 유도되었으며, 그리고 70일간 LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린으로 세포를 처리하였다. 세포의 퓨코실화 상태는 FITC-콘쥬게이트된 LCA 라벨링 및 주단위 FACs 분석에 의해 검사되었다. 부모계 CHO-K1 세포를 포지티브 기준으로 이용하였다. B) 에틸 메탄 술포네이트 (EMS)을 이용하여 CHO-K1 세포에서 무작위 돌연변이 생성을 유도하였다. 선별 및 퓨코실화 모니터링은 A)에서 설명한 것과 같다.
도 5는 LCA/독소저항성 세포내 낮은 퓨코스 함량은 유전적으로 안정적이라는 것을 설명하는 그래프다. 낮은 퓨코실화를 가진 클론들중 하나를 3개월 동안 LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린 없는 배지에서 성장시키고, 확장시켰다. 세포의 퓨코실화 상태는 FITC-콘쥬게이트된 LCA 라벨링 및 매주 FACs 분석에 의해 검사되었다.
도 6은 낮은 LCA-결합 돌연변이체 CHO-K1 세포의 N-글리칸 프로파일을 나타낸다. LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린 선별 후에 안정적인 세포 집단은 FITC-콘쥬게이트된 렉틴(LCA, WGA, ConA 및 GSII)으로 라벨되고, FACS에 의해 분석된다.
도 7은 현탁액에서 무혈청 배양물 배지에 적응된 돌연변이체 CHO-K1 클론중 하나의 N-글리칸 프로파일을 나타낸다. 돌연변이체 클론들은 제한 희석에 의해 단일 세포 클로닝에 의해 분리되었다. 클론들은 무혈청 현탁액에 적응되었으며, 돌연변이체 클론들은 FITC-콘쥬게이트된 렉틴(LCA, WGA, ConA 및 GSII)으로 라벨되고, FACS에 의해 분석된다. 클론들중 하나의 프로파일을 나타낸다.
도 8은 돌연변이체 CHO-K1 클론에서 Fut8의 발현이 변경되지 않음을 설명한다.
도 9는 현탁액에서 무혈청 배지에서 성장된 돌연변이체 클론에 의해 생산된 항체의 독특한 N-글리칸 프로파일을 나타낸다. 발현된 항체 ET101는 SDS-PAGE 겔에 의해 분리되고, A) Coomassie Blue로 착색시키거나 또는 B) 니트로셀룰로오즈 막으로 이동시키고, 바이오틴에 콘쥬게이트된 LCA, WGA, ConA 및 GSII으로 블랏팅시키고, HRP-콘쥬게이트된 스트렙타아비딘으로 항온처리하였다.
도 10은 무혈청 배지에서 현탁액 성장하도록 변경된 돌연변이체 클론에 의해 생산된 항체들에서 모노사카라이드 조성물의 독특한 프로파일을 설명한다. A) 부모계 CHO 세포, 돌연변이체 CHO-1E5 클론, 돌연변이체 CHO-3F 클론, 또는 돌연변이체 CHO-2.6 클론에 의해 생산된 항체 ET101에서 모노사카라이드의 정량화. 모든 CHO 클론은 배양액에 무혈청 배지 배양물에 적응되었다. B) 부모계 CHO 세포, 돌연변이체 CHO-1E5 클론, 돌연변이체 CHO-3F 클론, 또는 돌연변이체 CHO-2.6 클론에 의해 생산된 인간 IgG1(ET101 및 ET201)의 모노사카라이드 조성물. C) Fut8-/-녹아웃 CHO 세포(YamaneOhnuki et al ., Biotechnol . Biogeng . 87:614622 (2004))에 의해 생산된 인간 IgG1의 모노사카라이드 조성물 분석.
도 11은 혈청-함유 배양물 배지에서 성장된 돌연변이체 세포 집단에 의해 생산된 ErbB2-차단 인간 IgG1 (ET101)에 의해 나타난 강화된 ADCC 활성을 나타낸다. A) 10% FBS를 함유하는 조건화 배지 1㎖로부터 발현된 항체 ET101은 단백질 L 비드에 의해 침전되고, 변성 SDS-PAGE 겔을 이용하여 분리되고, 그리고 Coomassie 블루로 착색되었다. 빈 성장 배지는 네가티브 기준으로 이용하였다. B) SKBR3 세포를 이용한 ADCC 분석에서 돌연변이체 클론 (IRC 2.2) 또는 야생형 CHO (부모계)에서 발현된 ET101 항체.
도 12는 그래프상에 ET101로 표시된 부모계 세포계에 의해 생산된 ET101과 비교하였을 때, 무혈청 배지에 적응된 ET101-1E5로 표시된 돌연변이체 CHO-K1 세포 클론에 의해 생산된 ErbB2-차단 항체 인간 IgG1에 의한 다중 암 세포계(SKBR3, SKOV3, MDA-MB361, 및 MDA-MB-231)에 대항한 강화된 ADCC 활성을 나타낸다.
도 13은 야생형 CHO 계(CHO)에 의해 생산된 ET101과 비교하였을 때, 무혈청 배지에 적응된 다수 개별 돌연변이체 CHO-K1 세포 클론 (1E5, 2.6, 및 3F)에 의해 생산된 ErbB2-차단 항체 인간 IgG1 (ET101)에 의한 암 세포계 SKOV3 및 MDA-MB-231에 대항한 강화된 ADCC 활성을 나타낸다. PBS 또는 비-특이적 항체는 네가티브 기준으로 이용하였다.
도 14는 EGFR을 표적으로 하는 또 다른 차단 항체 인간 IgG1(ET201)에 의한 암 세포계 A549에 대항한 강화된 ADCC 활성을 나타낸다. 야생형 CHO 계(CHO)에 의해 생산된 ET201과 비교하였을 때, 무혈청 배지에 적응된 2가지 개별 돌연변이체 CHO-K1 세포 클론(1E5 및 3F)에 의해 생산된 ET201을 나타낸다. PBS 또는 비-특이적 항체는 네가티브 기준으로 이용하였다.
도 15a 및 b 는 CHO-1E5로 표시된 본 발명의 변형된 숙주 세포에 의해 합성된 N-링크된 올리고사카라이드의 조성물 구조를 나타내는 도식이다. 나타낸 구조는 모노사카라이드 프로파일, 글리칸의 MALDI-TOF MS 스펙트럼, 및 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체의 만노시다제 절단에 의해 결정된다.
도 16은 무혈청 현탁액에서 야생형 CHO 부모계 숙주 세포 (상부 패널) 및 CHO-1E5 세포 (중간 패널) 및 대응하는 모노사카라이드 기준 (하부 패널)에 의해 생산된 항체에서 모노사카라이드의 프로파일을 나타낸다.
도 17은 야생형 부모계 CHO 세포 (상부 패널) 및 CHO-1E5 세포 (하부 패널)에 의해 생산된 항체로부터 N-링크된 올리고사카라이드의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 18은 야생형 부모계 CHO 세포 (상부 패널) 및 CHO-1E5 세포 (하부 패널)에 의해 생산된 항체들로부터 방출된 N-링크된 글리칸의 용리 프로파일을 나타낸다. 결과에서 야생형 CHO 세포에 의해 생산된 항체에서 혼합된 집단과 비교하였을 때, CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체는 N-링크된 올리고사카라이드 단일 집단을 가진다는 것을 알 수 있다. N-글리칸은 37℃에서 72시간 동안 PNGase F 로 항체 200㎍을 절단하여 방출시켰다. 단백질을 -20℃에서 하룻밤동안 70% 에탄올로 침전시키고, 원심분리에 의해 분리하였다. 상청액을 진공에서 건조시키고, 탈이온수 200㎕에 재현탁시켰다. 시료를 C18, AG50WX8 및 AG4x4으로 채워진 마이크로컬럼 상에 로딩시켰다. 컬럼을 300㎕ 탈이온수로 세척시켰다. 통과 유체를 수거하였고, 올리고사카라이드는 PA200 컬럼 및 Dionex ICS3000를 이용하여 분석하였다.
도 19는 CHO-1E5에 의해 생산된 올리고사카라이드의 조성물 및 가상 구조를 보여준다. 19a. CHO-1E5에 의해 생산된 N-글리칸의 모노사카라이드 조성물은 도 16 및 17에서 설명된 PA1 컬럼/Dionex ICS3000 시스템과 MALDI-TOF MS으로 결정하였다. 19b. N-글리칸의 가상 구조는 모노사카라이드 분석 및 MALDI-TOF MS의 결과로부터 유추하였다.
도 20은 α1,2,3 만노시다제의 절단을 통하여 CHO-1E5에 의해 생산된 올리고사카라이드의 구조적 결정을 보여준다. CHO-1E5 및 부모계 숙주 세포에 의해 합성된 항체들 (ET101)은 37℃에서 24시간 동안 α1,2,3 만노시다제로 항온처리하였다. 항체 및 효소를 제거하기 위하여, 절단된 항체 용액을 우선 MicroCon YM10 (Millipore, Billerica, MA)을 통과시키고, 그 다음 MicroCon YM100 (Millipore, Billerica, MA)을 통과시켰다. 시료는 PA1 컬럼/Dionex ICS3000 시스템에 의해 분석되었다. A. 부모계 숙주 세포의 샘플로부터 N-글리칸의 α1,2,3 만노시다제 절단 부위. 밴드 C. 부모계 숙주 세포의 시료로부터 18 mM NaOH (B) 및 90 mM NaOH (C)에 의해 용리된 사카라이드 프로파일. D 와 E. CHO-1E5의 샘플로부터 18 mM NaOH (D) 및 90 mM NaOH (E)에 의해 용리된 사카라이드 프로파일. F 와 G. CHO-1E5에 의해 합성된 N-글리칸의 구조는 분석으로 추정한다.
도 21은 변성 조건하에 야생형 부모계 CHO 세포 및 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체 중쇄 (약 50 KD) 및 경쇄 (약 25 KD)에 대응하는 밴드와 비-변성 조건하에 야생형 부모계 CHO 세포 및 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체에 대응하는 밴드(약 150KD)를 보여주는 전기영동 겔의 재생이다. 결과는 글리코실화 패턴을 나타내는 올리고사카라이드는 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체의 단백질 구조 및 어셈블리를 변경시키지 않는다는 것을 보여준다.
도 22는 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 글리코실화 패턴을 나타내는 항체에 의한 강화된 ADCC 활성을 나타내는 세포 용해 분석 결과를 보여준다. 8a.무혈청 배지에 적응된 CHO-1E5 세포 클론에 의해 생산된 ErbB2-차단 항체 인간 IgG1 (ET101)에 의한 다중 암 세포계 (SKOV3 및 MDA-MB-231)에 대항하는 강화된 ADCC 활성. CHO-1E5 세포에서 발현되는 ET101 항체는 단백질 A 크로마토그라피에 의해 조건화 배지로부터 정제되었고; 그리고 UV280에 의해 정량화되었다. 부모계 ET101는 야생형 CHO 세포에서 발현되었고, 그리고 동일한 방법으로 정제되었다. ADCC 분석을 위하여, 96 웰 플레이트, 37℃에서 30분간 100 ㎕의 표적 세포 현탁액을 50㎕의 발현된 ErbB2-차단 항체 ET101로 사전-항온처리하였다. 그 다음 50㎕의 PBMCs을 효과물질/표적 세포 20:1의 비율로 첨가하였다. 16시간 항온처리한 후, 플레이트를 스핀 다운시키고, 50㎕의 세포없는 상층액을 새로운 플레이트로 옮겼다. CytoTox96 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 방출된 LDH를 측정하였다. 식 (E-S)/(M-S) (E: 실험적 방출, S: 자발적 방출, M: 최대 방출)으로 세포 용해를 계산하였다. 네가티브 기준으로 PBS 또는 비-특이적 항체가 이용되었다. 8B: 무혈청 배지에 적응된 CHO-1E5 세포 클론에 의해 생산된 EGFR-차단 항체 인간 IgG1 (ET201)에 의한 폐암 세포계(A549)에 대항한 강화된 ADCC 활성. CHO-1E5 세포에서 발현되는 ET201 항체는 단백질 A 크로마토그라피에 의해 조건화 배지로부터 정제되었고; 그리고 UV280에 의해 정량화되었다.
도 23은 항체/Fc 수용체 결합 친화력의 결과를 나타낸다. 결과는 CHO-1E5 세포에 의해 나타나는 N-글리칸은 FcγRIIIA 수용체에 대한 항체 결합을 개선시킨다는 것을 보여준다. 항체들을 우선 바이오티닐화시키고, 스트렙타아비딘-피복된 바이오센서(ForteBio, Menlo Park, CA)에 로딩하였다. 재조합 FcγRI 및 FcγRIIIb 단백질은 100-400 nM 의 농도에서 현탁되었다(R&D Systems, Minneapolis, MN). 결합 친화력 (KD, nM)은 ForteBio의 표준 역학 프로토콜에 따라 평가되었다.
도 24는 CHO-1E5 세포에 의해 생산되는 항체의 생체내 약동학 프로파일을 보여준다. 결과에서 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체의 역동학은 야생형 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 것과 실질적으로 동일하다는 것을 보여준다.
도 25는 α1,2,3 만노시다제 및 α1,2,3,6 만노시다제의 절단을 통하여 CHO-1E5에 의해 생산되는 올리고사카라이드의 구조 결정을 보여준다. 18 mM NaOH에 의해 용리되는 사카라이드(A)와 1E5 세포 또는 포지티브 기준(B)의 샘플로부터 N-글리칸의 α1,2,3 만노시다제 절단 부위. (C) 18 mM NaOH에 의해 용리되는 사카라이드(C)와 1E5 세포 또는 포지티브 기준(B)의 샘플로부터 N-글리칸의 α1,2,3,6 만노시다제 절단 부위.
도 26은 다양한 FcgR IIIa 수용체에 대한 항체 결합 친화력을 결정하기 위한 세포 용해 분석을 보여준다. 도 26a는 저결합 친화력 FcgR IIIa 158F/F를 발현시키는 인간 PBMCs를 효과물질 세포로 사용하였을 때, 독특한 글리코실화 패턴을 가진 항체는 강화된 ADCC 활성을 가진다는 것으로 보여준다. 도 26b는 고친화력 FcgR IIIa 158V/V를 발현시키는 인간 PBMCs에 대한 독특한 글리코실화를 가진 항체의 결합을 보여준다.
도 27은 인간 FcgR에 대한 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 항체들과 독특한 구조를 가진 항체들의 결합 친화력의 유세포계 측정을 보여준다. 도 27a는 독특한 구조의 N-글리칸을 가진 항체는 활성화 FcgRIIIa 수용체에 대해 결합 친화력을 개선시키는 것을 보여주고, 도 27b는 독특한 구조의 N-글리칸을 가진 항체는 억제성 수용체 FcgRIIb에 대해 결합 친화력을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 28은 CHO-K1-1E5에 의해 생산된 항체는 억제성 수용체 FcγRIIb에 대해 결합 친화력이 감소되었으며, 그리고 활성화 수용체 FcγRIIIa에 대해 결합 친화력이 증가되었음을 보여준다. 외생 Fcγ 수용체를 안정적으로 발현시키는 CHO-K1 세포는 20mM EDTA/PBS에 의해 분리되었으며, 단일 세포로 흩어졌다. 세포들을 CHO (CHO-ET101) 또는 CHO-K1-1E5 (CHO-1E5-ET101)에 의해 생산된 바이오티닐화된 항체로 얼음위에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 스트렙타아비딘FITC으로 항온처리하고, FACS 분석에 의해 분석하였다. 형광 강도의 상승 평균을 얻고, 플롯하였다.
도 29는 영장류와 같은 시험 동물에서 주어진 항체(CHO-1E5 클론에 의해 생산된 항체들)의 면역원성 또는 이의 부족을 평가하는 실험 과정을 나타낸다. A) 암컷 필리핀(cynomolgus) 원숭이에게 야생형 CHO 세포에 의해 생산된 항체 ET101, 또는 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 ET101를 체중당 8 mg/ml/kg양으로 제공하였다. 항체 주사전 그리고 항체 주사후 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 시점에 0.5㎖의 혈액을 채혈한다. 혈청 시료는 분리하여, 80℃에 냉동시켰다. B) ELISA를 이용하여 필리핀 원숭이에서 ET101-CHO-1E5 항체의 면역원성을 결정한다. ELISA 플레이트는 ET101-CHO 또는 ET101-CHO-1E5 항체들로 피복시킨다. 상이한 희석에서 분리된 원숭이 혈청 시료를 피복된 플레이트에 제공하여 피복된 표적 항체들에게 결합을 허용한다. 결합된 IgM은 항-IgM 2차 항체로 탐지된다. C) ELISA 결과에서 ET101-CHO 및 ET101-CHO-1E5 항체들 사이에 면역원성의 차이(가령, 원숭이 혈청에서 ET101-특이적 IgM 수준)는 없었다.

본 내용의 조성물 및 방법은 다양한 글리코실화 패턴을 가지도록 변형된 세포계를 제공한다. 이와 같은 세포계를 이용하여 증가된 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성과 같은 효과물질 기능이 강화된 항체와 같은 단백질을 생산할 수 있다. 단백질은 전형적으로 다양한 글리코실화 패턴을 가진다.

숙주 세포

본 발명의 숙주 세포는 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하였을 때 다양한 글리코실화 패턴을 만들기 위하여 변형된다. 숙주 세포는 개별 세포, 세포 배양물, 및/또는 세포계를 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 후손을 포함한다. 숙주 세포는 본 내용의 이종 서열로 형질감염될 수 있다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포가 될 수 있는데, 예를 들면, 세균 세포, 곰팡이 세포, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 글리코실화할 수 있는 이와 유사한 것이 될 수 있다.

세균 숙주 세포의 예로는 대장균(Escherichia), 세라티아(Serratia), 바실러스(Bacillus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 콜리네박테리움(Corynebacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 이와 유사한 것에 속하는 미생물을 포함한다. 예를 들면, 세균 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli) XL1Blue, XL2Blue, DH1, MC1000, KY3276, W1485, JM109, HB101, No.49, i W3110, NY49, G1698, 또는 TB1을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 기타 세균 숙주 세포는 세라티아 피카리아(Serratia ficaria), 세라티아 폰티코라(Serratia fonticola), 세라티아 리퀘파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀘페이션스(Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테리움 암모니아겐스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 이마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum) ATCC 14068, 브레비박테리움 사카로리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC 14066, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 콜리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032, 콜리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869, 콜리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870, 마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum) ATCC 15354, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) D0110 및 이와 유사한 것을 포함할 수 있지만 이에 국한되지 않는다.

효모 숙주 세포는 사카로미세스(Saccharomyces), 쉬소사카로미세스(Schizosaccharomyces ), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 트리코스포론(Trichosporon), 쉬완니오미세스(Schwanniomyces), 피치아(Pichia), 칸디다(Candida) 및 이와 유사한 속(genus)의 미생물, 가령, 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬소사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(richosporon pullulans), 쉬완니오미세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 칸디다 우틸리스(Candida utilis) 및 이와 유사한 것에 속하는 미생물을 포함할 수 있다.

진핵 세포의 또 다른 예로는 포유류 세포와 같은 동물 세포를 포함한다. 예를 들면, 숙주 세포 바람직하게는 Chinese 헴스터 난소 세포 (CHO) 또는 원숭이 세포, 가령 COS 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. CHO 세포는 CHO/dhfr 또는 CHO/DG44 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. Chinese 헴스터 난소 조직 유도된 CHO 세포는 Chinese 헴스터(Cricetulus griseus)의 난소 조직으로부터 확립된 세포계인 임의 세포를 포함한다. 예로는 Journal of Experimental Medicine , 108, 945 (1958); Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 60 , 1275 (1968); Genetics , 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Method in Cell Science , 18, 115 (1996); Radiation Research , 148, 260 (1997); Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 77, 4216 (1980); Proc . Natl . Acad . Sci ., 60, 1275 (1968); 세포, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics , Appendix I, II ( pp . 883900); 및 이와 유사한 것와 같은 문헌에서 설명된 CHO 세포를 포함한다. 또한, ATCC (The American Type Culture Collection)에 등록된 CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUXB11 (ATCC CCL-9096) 및 Pro-5 (ATCC CCL-1781) 및 상업적으로 이용가능한 CHOS (Life Technology , Cat # 11619) 또는 다양한 배지를 이용하여 이들 세포계를 개조하여 수득한 서브-세포계도 예가 될 수 있다.

대안적인 구체예에서, 부모 세포계는 B 세포계와 같은 림프계 세포계로부터 유도된다. 숙주 세포는 하이브리도마 생산에 이용되는 세포계로부터 얻어지는 것이 될 수 있다. 숙주 세포는 골수종 세포, MOPC-21, MPC-11, NS0, SP-2, Sp2/0, S194, 및 X63-Ag8653 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 뮤린 골수종계; Namalwa, Karpas 707H, RPMI 8226, 8226 AR/NIP4-1, KM-2R, 및 U-266을 포함하나 이에 한정되지 않는 인간 골수종 세포계; 또는 YB2/0, YB2/3.0.Ag.20, Y3-Agl.2.3, IR983F를 포함하나 이에 한정되지 않는 쥐 골수종 세포계와 같은 골수종 세포가 될 수 있다. 세포계, 가령, HeLa, HEK-293, NIH3T3, COS, CHO, NSO, PER.C6, K562, L1.2, JY, BHK, K562, 293F, 3T3, 및 Jurkat는 본 내용에서 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 숙주 세포는 CHO-1E5, CHO-3F, 또는 CHO-2.6 클론이 될 수 있다.

곤충 숙주 세포의 예로는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 난소 세포, 가령 Sf9 및 Sf21 (Baculovirus Expression Vectors , A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company , New York (1992)); 트리코플시아 니 (Trichoplusia ni) 난소 세포 가령, High 5 (Invitrogen에 의해 제작); 및 이와 유사한 것을 포함한다. 식물 숙주 세포의 예로는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 평지, 자주개자리, 쌀, 밀, 보리 및 이와 유사한 식물 세포를 포함한다.

본 발명의 변형된 숙주 세포는 배양물에서 성장하고, 그리고 발효기를 포함하여 배양물을 성장시키는데 이용될 수 있는 임의의 장치에서 성장할 수 있다. 숙주 세포들은 단층으로 또는 표면에 부착되어 성장할 수 있다. 대안으로, 숙주 세포는 현탁액에서 성장할 수 있다. 세포는 무혈청 배양물 배지에서 성장할 수 있다. 배지는 시판되는 배지가 될 수 있는데, 예를 들면, 8mM L글루타민과 같은 글루타민이 보충된 Opti-CHO (Invitrogen, Catalogue #12681)가 될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 변형된 숙주 세포는 배양물에서 다수의 계대를 위한 다양한 글리코실화 패턴을 유지할 수 있다. 예를 들면, 변형된 숙주 세포는 적어도 약 20회, 30회, 40회, 또는 50회 계대후에 다양한 글리코실화 패턴을 유지할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 적어도 약 60회 계대후에 다양한 글리코실화 패턴을 유지할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 적어도 약 100회, 150회, 200회, 500회, 또는 1000회 또는 그이상의 계대후 다양한 글리코실화 패턴을 유지할 수 있다.

일부 구체예에서, 숙주 세포는 비-림프성 세포다. 림프구는 척추동물 면역계내 백혈구 타입이다. 림프구는 전형적으로 T 세포, B 세포 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 비-림프성 세포는 림프구가 아닌 임의의 세포 유형을 포함한다. 본 발명의 숙주 세포는 인간, 마우스, 쥐, 과일 파리, 벌레, 효모 및 세균으로 구성된 군으로부터 선택된 종 기원을 가질 수 있다. 숙주 세포는 혈액, 근육, 신경, 뇌, 심장, 폐, 간, 췌장, 비장, 흉선, 식도, 위, 장, 신장, 고환, 난소, 모(hair), 피부, 뼈, 유방, 자궁, 방광, 척수, 또는 다양한 종류의 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는다 적절한 조직으로부터 유도될 수 있다. N-글리칸을 생산하는 숙주 세포는 배아 및 성인 단계를 포함하는 임의의 발달 단계 뿐만 아니라 외배엽, 중배엽 및 내배엽 기원과 같은 발달 기원으로부터 유도될 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주 세포는 CHO, NS0, SP2/0, HEK-293, PER.C6 또는 YB2/0 세포다.

변형된 세포계 생성

본 내용은 다양한 글리코실화 패턴을 생산하기 위하여 변형된 숙주 세포를 만들고 선택하는 방법을 제공한다. 변형된 글리코실화 패턴을 가진 숙주 세포를 선별하는 방법은 다수의 숙주 세포를 제공하고; 다수의 숙주 세포에 무작위 유전적 돌연변이를 도입시키고; 그리고 다수의 세포로부터 무작위 유전적 돌연변이를 겪지 않았던 대응하는 부모계 세포와 비교하여 적어도 한 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 적어도 한 가지 세포를 선택하는 것으로 구성된다. 숙주 세포는 CHO 세포 또는 YB2.0 세포와 같은 진핵 세포를 포함하는 여기에서 설명된 임의의 것을 포함할 수 있다.

유전적 돌연변이는 돌연변이 유발요인에 의해 유도될 수 있다. 돌연변이 유발요인은 유전적, 화학적 또는 방사능 물질을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 돌연변이 유발요인은 자외선, 감마 광선 또는 알파 입자들을 포함하나 이에 한정되지 않는 전리 방사선이 될 수 있다. 기타 돌연변이 유발요인은 복사 오류를 일으킬 수 있는 염기 유사체; 아질산과 같은 아미노 제거제; 에티디움 브롬화물과 같은 삽입물질; 브로모우라실과 같은 알킬화제; 트란스포존; 천연 및 합성 알칼로이드; 브롬 및 이의 유도체들; 아지드화나트륨; 소랄렌(예를 들면, 자외선 방사능과 복합됨)을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 돌연변이 유발요인은 ICR191, 1,2,7,8-디에폭시옥탄 (DEO) 또는 에틸 메탄 술포네이트 (EMS)와 같은 그러나 이에 한정되지 않은 화학적 돌연변이 유발요인이 될 수 있다. 상이한 돌연변이 유발요인들이 연속적으로 또는 동시에, 복합되어 숙주 세포로 도입될 수 있다.

방법은 도 1과 2에서 나타낸 것을 포함하거나 또는 실시예 2에 설명된 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포 집단을 다양한 글리코실화 패턴을 가진 변형된 숙주 세포로 변형시키기 위하여, 하나 이상의 돌연변이 유발요인, 가령, 화학적 돌연변이 유발요인을 세포에 적용시켜, 무작위 유전적 돌연변이를 일으킬 수 있다. 화학적으로 유도된 무작위 돌연변이 생성으로 슈가 생합성 및 가령, 퓨코실화, 만노실화, 및/또는 N-아세틸글루코사미닐화를 포함하나 이에 한정되지 않는 단백질 글리코실화 프로세스를 조절 또는 제어하는 유전자의 돌연변이를 유도할 수 있다. 화학적 돌연변이 유발요인은 퓨코실화가 높은 숙주 세포와 같이, 특정 글리코실화 패턴을 가진 숙주 세포를 선택적으로 죽일 수 있다. 따라서, 돌연변이 생성 후에 퓨코실화의 수준이 감소된 안정적인 클론을 높일 수 있고, 퓨코실화가 높은 세포를 특이적으로 표적하여 제거하는 LCS-독소로 이들 세포를 선별하여 분리시킬 수 있다(도 1 및 2, 실시예 2 참고). 다양한 글리코실화 패턴을 가지도록 유전적으로 변형된 숙주 세포는 무혈청 배지에서 유지되며, 현탁액에서 성장되고, 및/또는 발효기에서 성장되어 선별될 수 있다. 변형된 숙주 세포는 수확되거나 수거될 수 있는 당단백질을 생산할 수 있다. 당단백질은 분비될 수 있고, 다양한 글리코실화 패턴을 나타내며, 및/또는 여기에서 설명된 것과 같이 치료 용도를 가진다. 당단백질은 하기에서 추가 설명되는 것과 같이, 이종 서열에 의해 인코드되거나 및/또는 변형안된 부모계 숙주 세포에서 생산되는 대응 항체와 비교하였을 때, 증가된 ADCC 활성을 가지는 항체와 같은 항체가 될 수 있다,

부모계 숙주 세포의 글리코실화 패턴은 변형된 숙주 세포의 다양한 글리코실화 패턴과 비교될 수 있으며, 그리고 하나 이상의 유형의 슈가 분자의 수준 변화로 증명될 수 있다. 예를 들면, 다양한 글리코실화 패턴은 하기에서 설명되는 것과 같이, 퓨코실화, 만노실화, 및 N-아세틸글루코사미닐화로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 가지 유형의 글리코실화에 변화를 특징으로 할 수 있다. 더욱이, 다양한 글리코실화 패턴은 글루코즈 및/또는 갈락토즈의 수준 변화, 가령, 글루코즈의 증가 및 갈락토즈의 감소에 의해 증명될 수 있다. 추가 변이는 다음에서 설명된다.

글리코실화 패턴

본 발명의 숙주 세포는 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하였을 때, 숙주 세포 표면에 존재하는 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 가지도록 변형된다. 본 발명의 숙주 세포는 또한 단백질 또는 당단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 단백질은 항체들 또는 효소가 될 수 있으며, 그리고 치료제로 이용될 수 있다. 더욱이, 당단백질은 분비될 수 있다. 단백질은 이종 단백질, 가령, 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 변형된 숙주 세포로 이종 서열의 도입으로 생산된 단백질이 될 수 있다. 이종(heterologus)의미는 비교되는 엔티티의 나머지와 비교하였을 때 유전적으로 별개의 엔티티로부터 유도된다는 것을 의미하며, 이는 핵산 서열과 같은 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드에 적용할 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명의 단백질 또는 당단백질은 내생성 또는 이종이 될 수 있으며, 그리고 다양한 글리코실화 패턴을 나타내도록 변형된 숙주 세포에서 생산된다. 당단백질은 또한 다양한 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있는데, 이는 대응하는 야생형 당단백질 (가령, 변형안된 숙주 세포에서 생산된 당단백질)과 비교하였을 때, 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화를 특징으로 할 수 있다. 슈가 분자는 당단백질에 바로 부착되거나(예를 들면, 당단백질에 N- 또는 O-링크된), 또는 간접적으로 부착될 수 있다(예를 들면, 당단백질에 N- 또는 O-링크된 다른 슈가를 통하여 링크된). 사슬에 있는 다양한 슈가 분자의 함량에 따라 슈가 사슬 구조 변이, 또는 다양한 글리코실화 패턴은 당단백질의 효과물질 기능에 중요한 역할을 한다. 예를 들면, 당단백질의 다양한 글리코실화 패턴은 항체의 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성의 증가와 같이, 당단백질의 효과물질 기능을 증가시킬 수 있다,

숙주 세포의 글리코실화 패턴은 임의의 단백질성 모이어티의 N- 또는 O-글리코실화가 될 수 있는데, 이때, 하나 이상의 슈가 분자는 아스파라긴의 아미드 질소에 또는 하이드록시리신, 하이드록시프롤린, 세린, 또는 트레오닌의 각 하이드록시 산소에 첨가될 수 있다. 글리코실화 패턴은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드와 같은 적어도 두 개 이상의 슈가 분자 또는 사카라이드 수준의 변화를 특징으로 할 수 있다. 예를 들면, 슈가 분자는 트리오즈, 테트로오즈, 펜토즈, 헥소오즈, 헵토오즈, 옥토오즈, 노노오스, 또는 이의 유도체, 가령, 데옥시 슈가, 예를 들면 데옥시헥소오즈; N- 또는 O-치환된 유도체들, 가령, 시알산; 또는 아미노기를 가진 슈가가 될 수 있다. 슈가 분자는 갈락토즈 (Gal), 글루코즈 (Glc), 만노즈 (Man), N-아세틸뉴라민산 (NeuAc), 퓨코스 (Fuc), N-아세틸갈락토즈아민 (GalNAc), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc); 및 크실로즈 (Xyl)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 슈가 분자는 α- 또는 β- 링키지를 통하여 다른 슈가 분자에 링크될 수 있다.

본 발명의 다양한 글리코실화 패턴은 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화로 증명될 수 있으며, 그리고 숙주 세포 또는 당단백질의 상이한 글리코실화 패턴 변화로 증명될 수 있다. 예를 들면, 퓨코실화, 만노실화, N-아세틸글루코사미닐화 및/또는 이의 조합의 수준이 다양한 글리코실화 패턴의 증거로 이용될 수 있다. 예를 들면, 퓨코실화, 만노실화, 및/또는 N-아세틸글루코사미닐화의 수준은 변형안된 부모계 세포의 것과 비교하였을 때 변형된 숙주 세포에서 증가 또는 감소될 수 있다. 당단백질의 퓨코실화, 만노실화, 및/또는 N-아세틸글루코사미닐화 수준은 대응하는 야생형 당단백질 (가령, 변형안된 부모계 숙주 세포에서 생산된 것)과 비교하였을 때 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 예를 들면, 이종 당단백질은 상기 변형안된 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 야생형 당단백질과 비교하였을 때, 퓨코스, 만노즈, 및/또는 N-아세틸글루코사민의 감소된 수준을 나타낼 수 있다. 글리코실화는 α- 또는 β-링크된 만노즈 또는 α- 또는 β-링크된 N-아세틸글루코사민과 같은 α- 또는 β-링크된 슈가를 포함할 수 있다. 더욱이, 다양한 글리코실화 패턴을 가지는 숙주 세포는 변형안된 부모계 숙주 세포의 것과 비교하였을 때 1, 6-퓨코실전이효소 유전자 활성을 포함할 수 있고 및/또는 이를 유지할 수 있다.

본 발명의 다양한 글리코실화 패턴은 또한 변형안된 부모계 세포의 것과 비교하였을 때, 글루코즈, 갈락토즈 또는 이둘의 수준의 변화로 증명될 수 있다. 예를 들면, 이 변화는 갈락토즈 수준의 증가 또는 감소가 될 수 있다. 이 변화는 또한 글루코즈 수준의 감소 또는 증가가 될 수 있다. 일부 구체예에서, 이 변화는 글루코즈 수준의 증가, 갈락토즈 수준의 감소, 또는 글루코즈 수준의 증가와 갈락토즈 수준의 감소가 될 수 있다(도 10a, b에서 볼 수 있는 것과 같이). 다양한 글리코실화 패턴은 도 16 및 20에서 볼 수 있는 것과 같이, 글루코즈 및/또는 갈락토즈의 변화와 함께, 퓨코스, 글루쿠즈(glucuse), 만노즈, 및 N-아세틸글루코사민과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 다른 모노사카라이드 수준의 변화를 포함할 수 있다. 상이한 슈가 조합 및 부모계 세포와 비교하였을 때 이들 수준의 증가 또는 감소와 같은 이들 슈가의 수준을 다양하게 하는 것을 여기에서 고려한다.

다양한 글리코실화 패턴은 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자의 수준의 변화로 증명될 수 있는데, 이때 적어도 한 가지 유형의 슈가 분자의 수준의 변화는 적어도 약 2배가 된다. 대안으로, 수준의 변화는 적어도 두 가지 유형의 슈가에 대해 적어도 약 2배가 된다. 변화는 슈가 분자 수준의 증가 또는 감소가 될 수 있다. 수준의 변화는 적어도 약 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 50배, 75배, 100배, 500배, 1000배 또는 그 이상이 될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명은 N-링크된 글리칸을 포함하는 조성물을 제공하는데, 항체상에서 나타날 때, 항체의 항체의존성세포독성 (ADCC) 활성이 강화되는 결과를 초래한다. N-링크된 글리칸은 단백질의 아스파라긴 측쇄 사슬의 아미드 질소에 부착된다. 세 가지 주요 유형의 N-링크된 사카라이드가 있다: 고만노즈 올리고사카라이드, 복합체 올리고사카라이드 및 하이브리드 올리고사카라이드. 고(high)만노즈 N-링크된 글리칸은 전형적으로 만노즈 잔기를 많이 가진 두 개의 N-아세틸글루코사민을 포함한다. 복합체 올리고사카라이드는 전형적으로 대체로 다른 유형의 사카라이드 임의의 수를 포함한다. 단백질은 단백질의 상이한 부분에 있는 두 가지 유형의 올리고에 의해 글리코실화될 수 있다. N-링크된 글리칸은 글루코즈, 만노즈, 갈락토즈, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토즈아민, 퓨코스 및 시알산을 포함하는 다양한 상이한 모노사카라이드로 변형될 수 있다.

해당 N-링크된 글리칸 조성물 및 N-링크된 올리고사카라이드의 구조는 CHO-1E5로 지정된 변형된 예시적인 CHO 세포 클론에 의해 생산될 수 있다. 항체상에 단일 N-글리칸 구조는 CHO-1E5에 의해 만들어진다. CHO-1E5는 변경된 N-글리칸 생합성을 하고, 이 숙주 세포 클론에서 생산된 항체는 퓨코스 존부하에, 글루코즈, 만노즈, 및 N-아세틸글루코사민으로 구성된 글리코실화 프로파일을 나타낸다. N-글리칸의 구조적 형태는 Glu-GlcNAC₂-Man₄ (+/-Fuc)으로 설명되었다. 이 글리칸은 코어 N-링크된 올리고사카라이드의 기본 구조를 가진다: 퓨코스가 있거나 없이 3Man-2GluNAc, 그러나 두 개의 외측 아세틸글루코사민은 없다. 코어 올리고사카라이드의 측쇄 중 하나에 부착된 글루코즈 분자와 여분의 만노즈 분자가 있다(도 15). 일부 구체예에서, 글리코실화 패턴은 구조식 I의 조성물을 나타내는데, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫 번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

일부 구체예에서, 글리코실화 패턴은 구조식 II의 조성물을 나타내는데, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫 번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

상기에서, 그리고 도 15에서 나타낸 구조식 (I)과 (II)에서 퓨코스 분자는 해당 N-링크된 글리칸에 존재하거나 없을 수 있다는 것을 보여준다. 일부 구체예에서, 해당 N-링크된 글리칸은 한 개의 글루코즈 분자을 포함한다. 일부 구체예에서, 글루코즈 분자는 해당 N-링크된 글리칸의 말단에 있다(가령, 말단 글루코즈). 일부 구체예에서, 해당 N-링크된 글리칸은 하나 이상의 말단 글루코즈 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 해당 N-링크된 글리칸은 4개의 만노즈 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 해당 N-링크된 글리칸은 두 개의 N-아세틸글루코사민 분자를 포함한다.

일부 구체예에서, 글리코실화 패턴은 구조식 (I) 및 (II)의 혼합된 조성물을 나타낸다. 일부 구체예에서, CHO-1E5로 명명된 본 발명의 변형된 숙주 세포에 의해 합성된 N-글리칸은 야생형 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 N-글리칸과 비교하였을 때, 갈락토즈가 없고, 감소된 퓨코스 및 N-아세틸글루코사민의 수준을 보유하며, 그리고 말단 글루코즈를 포함한다 (도 16). 일부 구체예에서, CHO-1E5 클론에 의해 나타나는 N-글리칸은 MALDI-TOF MS 분석에서 단일 피크로 특징화되는데, 이는 올리고사카라이드 집단을 나타내는 것이다.

숙주 세포 또는 당단백질의 글리코실화 패턴은 특이적 슈가 분자 또는 특이적 슈가 분자와 연합된 또는 특이적 슈가 분자로 변형된 단백질성 모이어티를 특이적으로 또는 선호적으로 인지하고 또는 결합하는 물질을 이용하여 탐지할 수 있다. 이 물질은 퓨코스로 변형된 단백질에 특이적으로 결합하는 화학물질인 Lens 쿨리마리스 아글루티닌-A(LCA); N-아세틸글루코사민에 선호적 결합을 하는 맥아 아글루티닌 (WGA); α-링크된 만노즈를 인지하는 콘카나발린 A (Con A); 그리고 α- 또는 β-링크된 N-아세틸글루코사민 잔기에 결합하는 Griffonia (bandeiraea) Simplicifolia Lectin II (GSII)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

이 물질은 직간접적으로 탐지될 수 있다. 예를 들면, 이 물질들은 라벨에 콘쥬게이트될 수 있다. 형광 라벨과 같은 임의의 탐지가능한 라벨이 이용될 수 있다. 유세포분석기(flow cytometry)와 같은 당분야에 공지의 탐지 방법을 이용하여 라벨된 세포를 탐지하거나 및/또는 분리시킬 수 있다. 예를 들면, 탐지 및/또는 분리는 형광 활성화 세포 분류(FACS)가 될 수 있다. 라벨은 플루오레세인 또는 이의 유도체들, 가령, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green, Tokyo Green, SNAFL, 카르복시나프토플루오레세인 (CFSE), 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(CFDASE), DyLight 488, Alexa Fluor 488, 그린 형광 단백질 (GFP), 피코에리틴 (PE), 페리디닌 클로로필 단백질 (PerCP), PE-Alexa Fluor 700, PE-Cy5 (TRICOLOR), PE-Cy5.5, PE-Alexa Fluor 750, PE-Cy7, 알로피코시아닌 (APC), APC-Cy7, 및 이의유도체들을 포함할 수 있다. 언급된 라벨을 또한 이용하여 당단백질의 글리코실화 패턴을 분석할 수 있다. 대안으로, 이들 물질은 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 및 당분야에 공지된 다른 방법들에 의해 이러한 물질을 탐지하는 항체를 이용하여 직접 탐지될 수 있다.

글리코실화 패턴을 분석하는 다른 방법들에는 중성 슈가 및 아미노 기들을 가진 슈가와 같은 상이한 유형의 슈가의 조성 분석을 포함할 수 있다. 예를 들면, 갈락토즈, 만노즈, 퓨코스 또는 이와 유사한 것들과 같은 중성 슈가, 그리고 슈가 N-아세틸글루코사민 또는 이와 유사한 것과 같은 아미노기를 가진 슈가, 그리고 시알산 또는 이와 유사한 것과 같은 산성 슈가를 분석할 수 있다. 슈가 사슬의 산 가수분해에 의해 중성 슈가 또는 아미노 슈가의 방출됨에 의해 조성 비가 분석될 수 있다. 방법들은 슈가 조성물 분석기(BioLC)(Dionex가 제조)를 이용하는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. BioLC는 HPAECPAD (high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection) 방법(Rocklin et al ., J. Lig . Chromatogr . 6(9), 15771590 (1983))에 의한 슈가 조성물을 분석하는 장치다. 2-아미노피리딘 (PA)을 이용한 형광 라벨링 방법에 의해 조성 비율이 분석될 수 있다. 특이적으로, 조성 비율은 공지의 방법(Kondo et al ., Agric . Biol . Chem., 55(1), 283284 (1991))에 따라 산-가수분해된 시료를 2-아미노피리딘으로 형광 라벨링시키고, HPLC 분석을 실행하여 계산될 수 있다.

글리코실화 패턴은 또한 2차원 슈가 사슬 지도(mapping) 방법 (Tomiya et al ., Anal . Biochem ., 171, 7380 (1988); Biochemical Experimentation Method 23 Method for Studying Glycoprotein Sugar Chains ( Gakkai Shuppan Center ), edited by Reiko Takahashi (1989))에 의해 분석될 수 있다. 2차원 슈가 사슬 지도 방법은 예를 들면, X 축에 역상 크로마토그래피에 의한 슈가 사슬의 보유 시간 또는 용리 위치를 플롯팅하고, 그리고 Y 축에 정상 상(phase) 크로마토그래피에 의한 슈가 사슬의 보유 시간 또는 용리 위치를 플롯하고, 그리고 공지의 슈가 사슬의 것들과 결과를 비교함으로써 슈가 사슬 구조를 추측하는 방법이다.

슈가 사슬은 하이드라진분해(hydrazinolysis)에 의해 방출될 수 있고, 그리고 그 다음 슈가 사슬을 2-아미노피리딘으로 형광 라벨을 실행하였다(Hase et al ., J. Biochem ., 95, 1973203 (1984)). 겔 여과에 의해 과량의 PA 시약 및 이와 유사한 것으로부터 슈가 사슬을 분리시키고, 역상 크로마토그래피를 하였다. 그 다음, 분취된 슈사 사슬의 각 피크는 정상 상 크로마토그래피에 의해 분석된다. 이들 결과에 기초하여, 슈가 사슬 구조는 2차원 슈가 사슬 지도상에 점들을 플롯팅시키고, 이 점들을 표준 슈가 사슬(Takara Shuzo에서 제조된) 또는 기준(Tomiya et al ., Anal . Biochem ., 171, 7380 (1988))의 점들과 비교하여 예측할 수 있다.

또한, 글리코실화 패턴은 각 슈가 사슬을 MALDI-TOF-MS 또는 이와 유사한 것과 같은 질량 분석에 의해 분석될 수 있다.

이종( Heterologous ) 서열

다양한 글리코실화 패턴을 만들기 위하여 변형된 본 발명의 숙주 세포는 이종 서열을 포함할 수 있다. 이종 서열은 핵산 서열을 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열, 핵산 및 올리고뉴클레오티드와 호환 사용된다. 이는 임의의 길이의, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 폴리머 형태의 뉴클레오티드 또는 이의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원적 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 미지의 임의의 기능을 실행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예들이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 부위들, 링키지 분석으로 한정되는 좌(locus), 엑손, 인트론, 메신져 RNA (mRNA), 전이 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형이 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 변형은 폴리머 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분들에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 라벨링 성분과 콘쥬게이트되는 것과 같이, 폴리머화 이후에 추가 변형될 수 있다.

본 발명의 이종 서열은 단백질성 모이어티를 인코드할 수 있는데, 단백질성 모이어티는 임의의 길이의 아미노산 폴리머를 포함하는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산 서열을 지칭한다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산들을 포함할 수 있고, 그리고 비-아미노산들에 의해 중단될 수도 있다. 단백질성 모이어티는 예를 들면, 이황화물 결합 형성, 글리코실화, 지질화(lipidation), 아세틸화, 포스포릴화 또는 라벨링 성분과 콘쥬게이트시키는 것과 같은 임의의 다른 조작에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포함한다. 더욱이, 아미노산은 글리신, D 또는 L 광학 이성질체 모두, 아미노산 유사체 및 펩티드모방체(peptidomimetics)를 포함하나 이에 한정되지 않은 천연 및/또는 비-자연적 또는 합성 아미노산을 지칭한다. 아미노산을 명시하기 위하여 표준 단일 문자 코드 또는 세 개 문자 코드를 이용한다.

본 발명의 이종 서열에 의해 인코드되는 단백질은 전형적으로 당단백질이며, 효소 또는 항체와 같은 면역학적으로 기능을 하는 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다양한 글리코실화 패턴을 만드는 변형된 세포계는 항체 (인간화된 또는 키메라), 항체 단편, 사이토킨, 호르몬 또는 관심의 임의의 다른 단백질을 생산하는 이종 서열을 발현시킬 수 있다. 세포계에 의해 생산되는 단백질은 세포에 의해 분비되고, 수거될 수 있다. 대안으로, 세포는 수확될 수 있고, 세포로부터 단백질은 추출된다. 단백질, 또는 당단백질은 치료요법적으로 이용되어 원하는 결과 또는 유익한 결과를 초래할 수 있다.

이종 서열은 벡터를 포함할 수 있는데, 이 벡터는 핵산 분자, 바람직하게는 자가-복제가 가능하며, 숙주 세포로 삽입된 핵산 분자를 운반하거나 숙주 세포간에 삽입된 핵산 분자를 운반한다. 벡터는 세포안으로 DNA 또는 RNA 삽입을 위해 주로 기능을 하는 벡터, DNA 또는 RNA의 복제를 위해 주로 기능을 하는 복제 벡터, 그리고 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 해독 기능을 하는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 또한 상기 기능중 하나 이상을 제공하는 벡터들도 포함된다. 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드이며, 적절한 숙주 세포안으로 도입되면, 폴리펩티드로 전사 및 해독될 수 있다.

단백질을 인코드하는 이종 서열은 단일 또는 다중 벡터에 의해 발현될 수 있다. 핵산 서열은 단일 오페론안에서 임의의 순서로 배열되거나 또는 하나의 벡터 또는 다중 벡터안에 위치한 별도의 오페론에서 임의의 순서로 배열될 수 있다. 바람직하다면, 두 개 이상의 발현 벡터가 이용되는 경우, 각각은 단일 오페론에서 작용가능하도록 링크된 하나 이상의 이종 서열을 포함한다. “링크된”이란 화학적 콘쥬게이션 또는 재조합 수단을 포함하는 임의의 수단에 의해서건 상관없이, 두 개이상의 화학적 요소 또는 성분들이 서로 결합된 것을 말한다. “작용가능하게( Operably)링크된”이란 설명된 성분들이 원하는 방식으로 기능을 할 수 있도록 허용된 병치(juxtaposition)를 말한다. 예를 들면, 프로모터 서열이 코딩 서열의 전사를 촉진하는 경우, 코딩 서열에 프로모터 서열이 링크되거나 또는 작용가능하게 링크된다.

단일 또는 다중 벡터의 선택 및 단일 또는 다중 프로모터의 이용은 이종 서열의 크기 및 벡터의 용량에 따라 달라질 수 있지만, 선택된 숙주 세포에서 벡터가 발현되었을 때 벡터가 제공할 수 있는 주어진 당단백질의 전반적인 수율에 따라 대체로 달라질 것이다. 일부 경우, 두 개 오페론 발현 벡터 시스템은 더 높은 수율의 당단백질을 제공한다. 해당 벡터는 복제가능한 에피좀으로 유지될 수 있거나 또는 숙주 세포 게놈의 통합 부분으로 유지될 수 있다.

본 발명의 이종 서열은 단일 조절 요소의 제어하에 있을 수 있다. 일부 경우들에서, 이종 핵산 서열은 단일 프로모터에 의해 조절된다. 다른 경우에서, 이종 핵산 서열들은 단일 오페론내에 위치한다. 또 다른 경우들에서, 이종 핵산 서열들은 단일 리딩 프레임 내에 위치한다.

해당 핵산의 준비는 다양한 통상적인 재조합 기술 및 합성 과정에 의해 실행될 수 있다. 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술들은 당분야에 잘 공지되어 있으며, 그리고 Sambrook , J., Fritsch , E. F. and Maniatis , T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor , (1989) ( Maniatis ) and by T. J. Silhavy , M. L. Bennan , and L. W. Enquist, Experiments with Gene fusions , Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor , N.Y. (1984) and by Ausubel , F. M. et al ., Current Protocols in Molecular Biology , pub . by Greene Publishing Assoc . and WileyInterscience (1987)에서 설명하고 있다. 간략하게 설명하면, 해당 핵산은 게놈 DNA 단편, cDNAs, 및 RNAs으로 준비될 수 있으며, 이들 모두는 세포로부터 직접 추출하거나 또는 PCR 및 rt-PCR을 포함하나 이에 한정되지 않은 다양한 증폭 프로세스에 의해 재조합적으로 만들 수 있다.

핵산의 직접적인 화학적 합성은 커지는 뉴클레오티드 폴리머 사슬의 말단 5’하이드록실기에 3’차단된 및 5’차단된 뉴클레오티드 모노머들을 연속 추가하는 것을 포함하는데, 이때 각 추가는 첨가된 모노머의 3’위치에서 커지는 사슬의 말단 5’하이드록시 기의 친핵 공격에 의해 달성되며, 첨가되는 모노머는 일반적으로 인 유도체, 가령, 포스포트리에스테르, 포스포라미디트 또는 이와 유사한 것이다. 이와 같은 방법은 본 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 것이며, 관련 문헌에서 설명되고 있다(예를 들면, Matteuci et al ., Tet . Lett . 521:719 (1980); U.S. Pat. No. 4,500,707, Caruthers et al.; 그리고 U.S. Pat. No. 5,436,327 및 5,700,637, Southern et al.).

조절 요소는 예를 들면, 프로모터 및 오퍼레이터를 포함하는데, 당단백질을 인코드하는 하나이상의 이종 서열의 발현을 증가시키기 위하여 조작될 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리메라제 효소에 의해 핵산 서열의 전사 개시 및 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 오퍼레이터는 원하는 핵산 서열의 전사를 조절하는 기능을 하는 프로모터에 인접한 뉴클레오티드 서열이다. 오퍼레이터는 특이적 억제물질 단백질이 결합되는 단백질-결합 도메인을 포함한다. 적합한 억제물질 단백질이 없는 경우 전사는 프로모터를 통하여 개시된다. 적합한 억제물질 단백질이 존재하는 경우, 억제물질 단백질은 오퍼레이터에 결합하고, 이에 의해 프로모터로부터 전사가 억제된다.

본 발명의 일부 구체예에서, 발현 벡터에 사용된 프로모터는 유도성(inducible)이다. 다른 구체예에서, 발현 벡터에 이용된 프로모터는 구성적(constitutive)이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 핵산 서열은 유도성 프로모터에 작용가능하도록 링크되며, 그리고 하나 이상의 다른 핵산 서열은 구성 프로모터에 작용가능하도록 링크된다. 진핵 숙주 세포에 사용하기에 적합한 프로모터의 비-제한적 예로는 CMV 즉각 초기(immediate early) 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기(early) 또는 후기(late) SV40 프로모터, 레트로바이러스의 LTRs, 그리고 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

발현 벡터안에 유전자들은 전형적으로 임의의 인코드된 mRNA 유전자 산물의 해독(즉, 합성)을 지시하기 위하여 리보좀 결합 부위 또한 인코드할 수 있다. 발현 벡터에 이용될 수 있는 다른 조절 요소들은 전사 인헨서 요소들 및 전사 종료물질들을 포함한다. 예를 들면, Bitter et al ., Method in Enzymology , 153:516544 (1987) 참고.

발현 벡터는 특정 유형의 숙주 세포에 사용하는 것이 적합하며, 다른 숙주 세포에 사용하기에 적합하지 않을 수 있다. 그러나, 당업자는 특정 발현 벡터가 주어진 숙주 세포에 적합한 지를 통상적인 일반 실험을 통하여 바로 결정할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 숙주 유기체안으로 도입될 수 있고, 벡터안에 포함된 임의의 유전자의 발현 벡터 및 생존력에 대해 모니터된다.

발현 벡터는 하나 이상의 선택성 표식 유전자를 또한 포함할 수 있는데, 이 표식은 발현될 때, 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하거나 또는 확인하는데 유용한 하나 이상의 표현형 형질을 부여한다. 진핵 세포에서 적합한 선택성 표식들의 비-제한적 예로는 디하이드로 폴레이트 환원효소 및 네오마이신 저항성을 포함한다.

해당 벡터는 이미 확립된 다양한 기술에 의해 숙주 세포안으로 안정적으로 또는 일과적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 한 가지 방법은 염화칼슘 처리에 의해 발현 벡터는 칼슘 침전을 통하여 도입되는 것을 포함한다. 다른 염들, 예를 들면 칼슘 포스페이트 또한 유사한 과정에 이용될 수 있다. 또한, 전기천공(즉, 핵산에 대한 세포 침투성을 증가시키기 위하여 전류를 사용)이 이용될 수 있다. 다른 형질변형 방법은 마이크로인젝션, DEAE 덱스트란 매개된 형질변환, 그리고 아세테이트 리튬 존재하에 열 쇼크를 포함한다. 지질 복합체, 리포좀, 및 덴드리머(dendrimers)를 또한 이용하여 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다.

이종 서열을 숙주 세포안으로 도입시, 벡터가 도입된 숙주 세포를 확인하기 위하여 다양한 방법들을 실시할 수 있다. 한 가지 예시적인 선별 방법은 개별 세포를 준배양하여 개별 콜로니를 만들고, 원하는 단백질 산물의 발현을 테스트하는 것으로 포함한다. 또 다른 방법은 발현 벡터에 포함된 선택성 표식 유전자의 발현을 통하여 부여되는 표현형 형질에 근거하여 이종 서열을 포함하는 숙주 세포를 선별한다. 당업자는 본 발명 분야에서 이용가능한 이와 같은 방법 또는 다른 방법들을 이용하여 유전공학적으로 변형된 숙주 세포를 확인할 수 있다.

예를 들면, 숙주 세포 안으로 설명된 다양한 이종 서열의 도입은 PCR, 서든 블랏(Southern blot) 또는 노던 블랏(Northern blot) 하이브리드화와 같은 방법들에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 생성된 숙주 세포로부터 핵산이 준비될 수 있고, 원하는 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 관심대상의 특이적 서열은 증폭될 수 있다. 증폭된 산물은 아가로즈 겔 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동을 거치며, 이어서 에티디움 브롬화물, SYBR Green 용액 또는 이와 유사한 것으로 착색시키거나, 또는 UV 탐지를 이용하여 DNA를 탐지한다. 대안으로, 관심 서열에 특이적인 핵산 프로브는 하이브리드 반응에 이용될 수 있다. 특이적 유전자 서열의 발현은 역전사-결합된 PCR, 노던 블랏 하이브리드화를 통하여 대응하는 mRNA를 탐지하거나, 또는 인코드된 유전자 산물과 반응성이 있는 항체를 이용한 면역분석에 의해 확인될 수 있다. 예시적인 면역분석은 ELISA, 방사능면역분석 및 샌드위치 면역분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

더욱이, 숙주 세포안으로 본 발명의 다양한 이종 서열의 도입은 이종 서열이 인코드하는 효소의 효소적 활성에 의해 확인될 수 있다. 효소는 본 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다. 일반적으로, 효소적 활성은 조사되는 효소 반응의 산물 형성 또는 기질의 전환에 의해 확인될 수 있다. 반응은 생체내 또는 시험관에서 일어날 수 있다.

항체 생산

한 측면에서, 본 발명은 다양한 글리코실화 패턴을 만들기 위하여 변형된, 그리고 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다. 여기에서 사용된 것과 같이 항체는 재조합 항체들, 인간화된 항체들, 키메라 항체들, 단일 사슬 항체들, 융합 항체들, 단클론 항체들, 다클론 항체들 및 이와 유사한 것과 같은 모든 형태의 항체들을 포함한다. 항체들은 단편일 수 있다. 항체들은 또한 약물, 독소 또는 치료용 방사능동위원소와 콘쥬게이트될 수 있다. 이중특이적 항체 융합 단백질은 또한 하나 이상의 항원에 결합하는 하이브리드 항체들을 포함하는 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 항체는 네이키드 항체들 및 콘쥬게이트된 항체들 및 항체 단편들을 포함하는데, 이들은 단일 특이적 또는 다중 특이적이 될 수 있다.

항체들은 또한 대응하는 야생형 항체 (가령, 변형안된 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 항체)와 비교하였을 때, 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자의 수준의 변화를 특징으로 할 수 있는 다양한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 슈가 분자는 당단백질에 바로 부착될 수 있거나(예를 들면, 당단백질에 N- 또는 O-링크된), 또는 간접적으로 부착될 수 있다(예를 들면, 당단백질에 N- 또는 O-링크된 다른 슈가를 통하여 링크된). 사슬에 있는 다양한 슈가 분자의 함량으로 인하여 슈가 사슬 구조 변이, 또는 다양한 글리코실화 패턴은 당단백질의 효과물질 기능에 중요한 역할을 한다. 예를 들면, 상기에서 설명하는 것과 같이, 항체의 다양한 글리코실화 패턴는 항체의 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 증가시키는 것과 같이, 항체의 효과물질 기능을 증가시킬 수 있다. 다양한 글리코실화 패턴은 변형안된 부모계 숙주 세포에 의해 만들어진 대응하는 항체와 비교하였을 때, 항체의 Fc 부위를 통하여 부착된 적어도 두 가지 유형의 슈가분자의 수준의 변화로 증명될 수 있다.

일부 구체예에서, 항체들은 구조식 Glu-GlcNAC₂-Man₄ (+/-Fuc)을 가지는 N-글리칸을 나타낸다. 일부 구체예에서, 항체는 구조식 I의 글리코실화 패턴을 나타내는데, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫 번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

일부 구체예에서, 항체는 구조식 II의 글리코실화 패턴을 나타내는데, 이때 퓨코스 모이어티는 우측에서 첫 번째 4GlcNAc에 선택적으로 링크될 수 있다:

구조식 (I) 및 (II)는 두 가지 계획을 포함하는데, 이때 하나 이상의 퓨코스 분자가 해당 N-글리칸에 존재하거나 또는 없을 수 있다. 일부 구체예에서, 퓨코스는 N-글리칸에 존재한다. 다른 구체예에서, 퓨코스는 N-글리칸에 존재하지 않는다.

생산된 항체들은 고유 항체의 5가지 주요 부류중 하나 즉, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 될 수 있다. 생산된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2으로 부터 선택된 하위 부류중 하나의 멤버다.

본 발명의 항체들은 단클론 항체일 수 있고, 이것은 실질적으로 균일한 항체들 집단의 항체를 말하는 것으로, 가령, 집단을 구성하는 개별 항체들은 일반적으로 단클론 항체 생산 동안 발생할 수 있고 소량으로 존재하는 가능한 변이체를 제외하고, 동일하거나 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 이와 같은 단클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하는데, 이때 표적결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열을 선별하는 것으로 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선별 프로세스는 하이브리도마 클론 농축(pool), 파아지 클론 또는 재조합 DNA 클론과 같은 다수의 클론으로부터 독특한 클론의 선별이 될 수 있다.

선택된 표적 결합 서열은 추가 변형될 수 있는데, 예를 들면, 표적에 대한 친화력을 개선시키기 위하여, 표적 결합 서열을 인간화시키기 위하여, 세포 배양물에서 이의 생산을 개선시키기 위하여, 생체내에서 이의 면역원성을 감소시키기 위하여, 다중특이적 항체를 만들기 위하여 및 기타 목적을 위하여 변형될 수 있으며, 그리고 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 단클론 항체가 된다는 것을 인지해야 한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대한 상이한 항체들을 일반적으로 포함하는 다클론 항체 제조물과 대조적으로, 단클론 항체 조제물의 각 단클론 항체는 항원에 있는 단일 결정부위에 대응한다. 이들의 특이성에 추가하여, 단클론 항체 조제물은 다른 면역글로블린에 의해 일반적으로 오염되지 않은 장점이 있다. 변경자 "단클론"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내고, 그리고 임의의 특정 방법에 의해 항체 생산으로 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 이용되는 단클론 항체들은 예를 들면, 하이브리도마 방법 (Kohler et al ., Nature , 256:495 (1975); Harlow et al ., antibodies : A Laboratory Manual , ( Cold Spring Harbor Laboratory Press , 2 nd ed . 1988); Hammerling et al ., in: Monoclonal Antibodies and TCell hybridomas 563681, ( Elsevier , N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법들(U.S. Pat. No. 4,816,567 참고), 파아지 디스플레이 기술 (Clackson et al ., Nature , 352:624628 (1991); Marks et al ., J. Mol . Biol ., 222:581597 (1991); Sidhu et al ., J. Mol . Biol. 338(2):299310 (2004); Lee et al ., J. Mol . Biol .340(5):10731093 (2004); Fellouse , Proc . Nat. Acad . Sci . USA 101(34):1246712472 (2004); and Lee et al . J. Immunol . Method 284(12):119132 (2004) 참고)을 포함하는 다양한 기술, 및 인간 면역글로블린 좌의 일부분 또는 전부 또는 인간 면역글로블린 서열을 인코드하는 유전자를 가지는 동물에서 인간 또는 인간과 유사한 항체를 생산하는 기술(WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al ., Proc . Natl . Acad Sci . USA , 90:2551 (1993); Jakobovits et al ., Nature , 362:255258 (1993); Bruggemann et al ., Year in Immuno ., 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (GenPharm); U.S. Pat. No. 5,545,807; WO 1997/17852; U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al ., Bio/Technology, 10: 779783 (1992); Lonberg et al ., Nature , 368: 856859 (1994); Morrison , Nature, 368: 812813 (1994); Fishwild et al ., Nature Biotechnology , 14: 845851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology , 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar , Intern . Rev . Immunol., 13: 6593 (1995) 참고)에 의해 만들어질 수 있다.

여기에서 단클론 항체들은 키메라 항체들 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이들 항체들의 단편을 포함하는데, 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 부분의 일부는 특정 종으로부터 유도된 또는 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 대응하는 서열과 동일한 또는 상동성이며, 사슬의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유도된 또는 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 대응하는 서열과 동일한 또는 상동성인 항체가 된다(U.S. Pat. No. 4,816,567; 및 Morrison et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . USA , 81:68516855 (1984)). 여기서 관심 대상의 키메라 항체들은 “영장류화된(primatized)” 항체를 포함하는데, 이 항체는 인간이 아닌 형장류(구세계 원숭이, 유인원 등)에서 유도된 가변 도메인 항원 결합 서열과 인간의 불변 부위 서열을 포함한다.

본 발명의 숙주 세포는 또한 항체 생산을 위한 하이브리도마를 만드는데 이용될 수 있다. 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물(가령, 헴스터, 염소, 양, 개, 말, 돼지, 쥐, 토끼, 개, 고양이 또는 개르빌루스쥐)을 면역화시켜 면역화에 이용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도할 수 있다. 대안으로, 림프구는 시험관에서 면역화될 수 있다. 그 다음 림프구는 적합한 융합제, 가령, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 만든다 (Goding , Monoclonal Antibodies : Principles and Practice , pp . 59103 ( Academic Press , 1986)).

따라서, 준비된 하이브리도마 세포를 융합안된, 부모계 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 하나 이상의 물질을 바람직하게 포함하는 적합한 배양물 배지에 접종시키고, 성장시킨다. 예를 들면, 부모계 골수종 세포는 효소 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 부족하다면, 하이브리도마용 배양물 배지는 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시키는 물질인 하이포산틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이다.

한 구체예에서, 효과적으로 융합하고, 선택된 항체를 생산하는 세포에 의해 높은 수준의 항체를 안정적으로 생산하는 것을 뒷받침하고, 그리고 HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포가 이용된다. 일부 구체예에서, 골수종 세포계는 뮤린 골수종계(MOPC-21, MPC-11, SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는), 인간 골수종 세포계 (Karpas 707H, RPMI 8226, 8226 AR/NIP4-1, KM-2R, 또는 U-266을 포함하나 이에 한정되지 않는), 또는 쥐 골수종 세포계 (YB2/3.0.Ag.20, YB2/0, Y3-Agl.2.3, IR983F을 포함하나 이에 한정되지 않는)가 된다.

하이브리도마 세포가 성장하는 배양물 배지는 항원에 대응하는 단클론 항체들의 생산에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단클론 항체들의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관 결합 분석, 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA) 또는 효소링크된 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 단클론 항체의 결합 친화력은 예를 들면, Scatchard 분석에 의해 결정될 수 있다 (예를 들면, Munson et al ., Anal . Biochem . 107:220 (1980) 참고).

원하는 특이성, 친화력, 및/또는 활성을 가진 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론은 제한 희석 과정 및 표준 방법에 의한 성장으로 서브클론될 수 있다(Goding , Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , pp . 59103 (Academic Press , 1986)). 이와 같은 목적을 위한 적합한 배양물은 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로 생체내에서 성장될 수 있다.

서브클론에 의해 분비되는 단클론 항체들은 예를 들면, 단백질 A-Sepharose, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화력 크로마토그래피와 같은 통상적인 항체 정제 과정에 의해 배양물 배지, 복수, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리될 수 있다.

일부 구체예에서, 단클론 항체는 (1) Lowry 방법에 의해 측정되었을 때 항체 중량의 95% 이상의 순도로 정제되며, 그리고 가장 바람직하게는 99%의 순도로 정제될 수 있으며, (2) 스피닝 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)를 이용하여 적어도 15개 잔기의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 수득하는데 충분한 정도로 정제될 수 있으며, 또는 (3) Coomassie 블루 또는, 바람직하게는, 은 착색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 동질성을 가지는 수준으로 정제될 수 있다.

대안적인 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 만들어진 세포 집단은 재조합 DNA 방법에 의한 항체 생산에 이용된다(U.S. Pat. No. 4,816,567, 이의 전문이 참고문헌에 통합된다). 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 변형된 숙주 세포는 가령, HeLa, HEK-293, NIH3T3, COS, CHO, NSO, PER.C6, K562, L1.2, JY, BHK, K562, 293F, 3T3, 또는 Jurkat와 같은 부모 세포계로부터 만들어질 수 있다. 대안적인 구체예에서, 변형된 숙주 세포는 B 세포계와 같은 림프구로부터 유도된 부모 세포계로부터 유도된다.

한 구체예에서, 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 메신져 RNA(mRNA)는 성숙 B 세포 또는 하이브리도마 배양물과 같은 적합한 소스로부터 분리되고, RNA 분리 정제의 표준 기술 및 선택적으로 크기에 기초한 분리 기술을 이용하여 수득된다. 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 mRNA에 대응하는 cDNA가 만들어지고, cDNA 라이브러리 작제, 파아지 라이브러리 작제 및 특이적 관련 프라이머들을 이용한 스크리닝 또는 RT-PCR과 같은 본 기술 분야에 공지된 기술들을 이용하여 분리된다. 일부 구체예에서, cDNA 서열은 원하는 특이적 cDNA를 만들기 위하여 공지의 시험관 DNA 조작 기술을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 제작된 것일 수 있다. 그 다음 cDNA 서열은 유전자를 가진 리딩 프레임에 프로모터를 포함하고, 하위-변형된 숙주 세포와 필적하는 벡터안에 배치될 수 있다. 적합한 프로모터, 조절 서열, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종료 부위 그리고 선택적으로 편리한 표식 등을 포함하는 많은 플라스미드들이 본 기술분야에 공지되어 있고, U.S. Pat. No. 4,663,283 및 4,456,748에서 설명되고 있는 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 경쇄를 코딩하는 cDNA 및 중쇄를 코딩하는 cDNA를 별도의 발현 플라스미드안으로 삽입시킬 수 있다. 대안적인 구체예에서, 경쇄를 코딩하고, 중쇄를 코딩하는 cDNA가 각각 적합한 프로모터 및 전사 제어하에 있다면, 동일한 플라스미드에 함께 삽입시킬 수 있다.

상기에서 작제된 발현 벡터는 본 발명의 변형된 숙주 세포를 형질변환시키는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 경쇄 및 중쇄들은 동일한 또는 상이한 종의 별도의 변형된 숙주 세포 배양물안으로 형질도입될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 경쇄 및 중쇄에 대한 별도의 플라스미드는 단일 변형된 숙주 세포 배양물을 공동-형질변환시키는데 이용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 이들 두 가지 유전자를 포함하고, 경쇄 및 중쇄의 유전자를 발현시킬 수 있는 단일 발현 플라스미드는 단일 변형된 숙주 세포 배양물 안으로 형질도입될 수 있다.

중쇄 및 경쇄들이 동일한 숙주 안에서 공동 발현되면, 재구성된 항체를 회수하기 위하여 분리 과정이 기획된다. 예를 들면, 단백질 A-Sepharose, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화력 크로마토그라피와 같은 통상적인 항체 정제 과정에 의해 이루어질 수 있다.

일부 구체예에서, 재조합 방법에 의해 정제된 단클론 항체는 (1) Lowry 방법에 의해 측정되었을 때 항체 중량의 95% 이상의 순도로 정제되며, 그리고 가장 바람직하게는 99%의 순도로 정제될 수 있으며, (2) 스피닝 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)를 이용하여 적어도 15개 잔기의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 수득하는데 충분한 정도로 정제될 수 있으며, 또는 (3) Coomassie 블루 또는, 바람직하게는, 은 착색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 동질성을 가지는 수준으로 정제될 수 있다.

상기에서 제시된 재조합 방법에 의해 생산된 항체는 인간 키메라 항체, 또는 인간 상보적 결정 부위 (CDR) 접목된 항체와 같은 인간화 항체가 될 수 있다. 비인간 (가령, 마우스, 쥐, 헴스터, 염소, 양, 말, 소 또는 토끼)의 인간화 항체들은 비인간 면역글로블린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체들이다. 인간화된 항체들은 전형적으로 인간 면역글로블린 (수용자 항체)인데, 이때 수용자의 초가변 부위의 잔기들은 마우스, 쥐, 염소, 양, 말, 토끼 또는 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 가지는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(제공자 항체)의 초가변 부위의 잔기로 대체된다. 일부 경우들에서, 인간 면역글로블린의 프레임워크(FR) 잔기들은 대응하는 비인간 잔기들에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체들은 수용자 항체 또는 제공자 항체에서 볼 수 없는 잔기들을 포함할 수 있다. 항체 성능을 더 개선시키기 위하여 이와 같은 변형들이 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 포함하는데, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로블린의 것에 대응하며, 그리고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로블린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로블린 불변 부위 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로블린의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 더 상세한 것은 Jones et al ., Nature 321:522525 (1986); Riechmann et al , Nature 332:323329 (1988); and Presta , Curr . Op . Struct . Biol . 2:593596 (1992)을 참고한다.

용어 “가변”은 항체들 중에서 서열이 상당히 상이한 가변 도메인의 특정 부분을 말하며, 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다. 그러나, 가변성은 전형적으로 항체들의 가변 도메인에 균등하게 분포되지는 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 있는 소위 초가변 부위라고 불리는 세 가지 단편에 항상 집중된다. 가변 도메인의 더 많이 보존된 부분을 프레임워크 부위 (FRs)라고 부른다. 고유한 중쇄 및 경쇄의 각 가변 도메인은 4개의 FR 부분을 포함하는데, 대부분 β-쉬트 형상을 취하며, 3개의 CDR에 의해 연결되어, 루프 연결을 형성하고, 그리고 일부 경우에는 β-쉬트 구조의 일부분을 형성한다. 각 쇄의 초가변 부분은 FR 부분에 의해 근접하게 함께 지탱되며, 그리고 다른 쇄의 초가변 부분들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다. (Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5 th Ed . Public Health Service, National Institutes of Health , Bethesda , Md . (1991) 참고). 불변 도메인들은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포 독성(ADCC)에서 항체 참여와 같은 다양한 작용체 기능들을 발휘한다.

여기에서 사용된 초가변 부위("hypervariable region")는 항원에 항체가 결합하는 것을 주로 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭하는 것이다. 초가변 부분은 일반적으로 CDR의 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들면, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 그리고 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102(H3)를 포함하고(Kabat et al , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5 th Ed . Public Health Service , National Institutes of Health , Bethesda , Md . (1991)) 및/또는 "초가변루프"의 잔기들 (예를 들면, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 2632 (L1), 5052 (L2) 및 9196 (L3) 그리고 중쇄 가변 도메인에서 2632 (H1), 5355 (H2) 및 96101 (H3) : Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901917 (1987))을 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 여기에서 정의한 바와 같이, 초가변 부분을 제외한 가변 도메인 잔기들이다.

인간 키메라 항체는 항체 중쇄 가변 부위 (이후, "HV" 또는 "VH"라고 하며, 중쇄는 "H 사슬"임), 항체 경쇄 가변 부위 (이후 "LV" 또는 "VL"라고 하며, 경쇄는 "L 사슬"임), 둘다 인간이 아닌 동물의 것이며, 인간 항체 중쇄 불변 부위 (이후, "CH"라고 함) 그리고 인간 항체 경쇄 불변 부위 (이후, "CL"라고 함)을 포함하는 항체다. 인간이 아닌 동물로써, 동물로부터 하이브리도마를 만들 수 있는 한, 마우스, 쥐, 헴스터, 토끼 또는 이와 유사한 것과 같은 임의의 동물이 이용될 수 있다.

인간 키메라 항체는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 중쇄 가변 부위 (VH) 및 경쇄 가변 부위 (VL)를 인코드하는 cDNA를 수득하고, 이를 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL를 인코드하는 유전자를 가지는 숙주 세포용 발현 벡터 안에 삽입시켜 인간 키메라 항체 발현 벡터를 만들고, 그리고 그 다음 낮은 퓨코실화 세포 안으로 벡터를 도입시켜 항체를 발현시킴으로써 만들 수 있다.

인간 키메라 항체의 중쇄 불변 부위 (CH)에 관하여, 인간 면역글로블린 (이후, "hIg"라고 함) 부류에 속하는 한, 임의의 CH가 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, CH는 hIgG 부류 또는 hIgG1, hIgG2, hIgG3 및 hIgG4와 같은 hIgG 부류에 속하는 하위 부류중 하나에 속한다. 유사하게, 인간 키메라 항체의 경쇄 불변 부위(CL)에 관하여, hIg 부류에 속하는 한, 임의의 CL이 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 인간 키메라 항체의 경쇄 불변 부위(CL)는 카파 부류 또는 람다 부류에 속한다.

인간 CDR 접목된 항체는 가변 부위를 인코드하는 cDNA를 작제하고, 이때 인간이외의 동물에서 유도된 항체의 VH 및 VL의 CDR이 인간 항체의 VH 및 VL의 CDR에 접목되며, 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 인코드하는 유전자를 가지고 있는 숙주 세포용 발현 벡터안에 삽입시켜, 인간 CDR-접목된 항체 발현 벡터를 작제하고, 본 발명의 변형된 숙주 세포 안으로 발현 벡터를 도입시켜 인간 CDR-접목된 항체를 발현시킴으로써 만들 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 항체는 부모계 항체와 비교하였을 때 항원에 결합하는 능력을 기본적으로 유지한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 항원에 대한 더 높은 결합 친화력을 나타내는데, 예를 들면, 부모계 항체보다 적어도 1.1 배, 1.2배, 1.3배. 1.4배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 또는 5 배 더 높다. 다른 구체예들에서, 본 발명의 항체는 항원에 대한 더 낮은 결합 친화력을 나타내는데, 예를 들면, 항원에 대해 부모계 항체의 결합 친화력의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 정도가 된다. 본 발명의 항체의 결합 능력은 예를 들면, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 분석 또는 방사능면역침전 (RIA)과 같은 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

다양한 글리코실화 패턴을 가지고 및/또는 본 발명의 변형된 숙주 세포에 의해 만들어지는 항체는 암 항원과 같은 항원에 결합할 수 있다. 항원은 청구항 9항의 당단백질로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 이때, 암 항원은 HER2, 면역글로블린 입실론 Fc 수용체 II, Alk1,CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA4, 무친 1, 무친 16, 엔도글린, 메소테린 수용체, 노고 수용체, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 강글리오시드 GD3, 및 알파 및 베타 인테그린으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 인간화된 HER2 항체들은 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 변형된 숙주 세포에서 만들어진다. 인간화된 HER2 항체들은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 또는 U.S. Pat. No. 5,821,337(참고문헌에 통합된다)의 표 3에서 설명된 것과 같은 트라스투주마브(HERCEPTIN®); 인간화된 520C9 (WO93/21319); 및 페르투주마브와 같은 인간화된 2C4 항체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 변형된 숙주 세포에 의해 만들어지는 이와 같은 인간화된 항체들은 자체적으로 변형안된 부모계 세포에서 생상되는 항체들과 비교하였을 때 다양한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.

또다른 구체예에서, HER 억제제 가령, EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 항체를 인코드하는 벡터를 본 발명의 변형된 숙주 세포계 안으로 도입시킨다. HER 억제제 항체들은 트라스투주마브, 페르투주마브, 세투시마브, ABX-EGF, ABX0303, EMD7200, C11033, IMC-11F8, 및 IMC-11F5을 포함한다. 변형된 숙주 세포에서 생산된 HER 억제제는 변형안된 부모계 숙주 세포에서 생산된 HER 억제제와 비교하였을 때, 상기에서 설명된 것과 같이, 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화와 같은 다양한 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있다.

본 발명의 HER 항체들 또는 억제제는 HER 발현, 증폭 또는 활성화를 나타내는 암세포를 치료하는데 이용될 수 있다. HER 활성화는 임의의 하나 이상의 HER 수용체의 활성화 또는 포스포릴화를 말한다. 일반적으로, HER 활성화는 시그날 변환을 초래한다(가령, HER 수용체 또는 기질 폴리펩티드에서 HER 수용체 포스포릴화 티로신 잔기의 세포내 키나제 도메인에 의한). HER 활성화는 관심 대상의 HER 수용체를 포함하는 HER 이량체에 HER 리간드의 결합에 의해 매개될 수 있다. HER 이량체에 HER 리간드의 결합은 이량체에 있는 하나 이상의 HER 수용체의 키나제 도메인을 활성화시키고, 이에 의해 하나 이상의 HER 수용체에서 티로신 잔기의 포스포릴화되거나 및/또는 Akt 또는 MAPK 세포내 키나제와 같은 추가적인 기질 폴리펩티드에서 티로신 잔기들의 포스포릴화된다.

HER 억제제는 HER 이량체 형성을 억제하는 이량체화 억제제를 포함한다. HER 이량체화 억제제는 항체가 될 수 있는데, 예를 들면, 이종이량체 결합 부위에서 HER2에 결합하는 항체가 된다. 항체는 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 것과 같이, 여기에서 설명하고 있는 것들이 될 수 있다. 여기에서 고려되는 이량체화 억제제는 페르투주마브 또는 단클론 항체 2C4 (MAb 2C4)다. HER 이량체화 억제제의 다른 예로는 EGFR에 결합하고, 하나 이상의 다른 HER 수용체들과의 이량체화를 억제하는 항체들(예를 들면, 활성화된 또는 풀어진(untethered) EGFR에 결합하는 EGFR 단클론 항체 806, MAb 806; Johns et al ., J. Biol . Chem . 279(29):3037530384 (2004)); HER3에 결합하여, 하나 이상의 다른 HER 수용체들과의 이량체화를 억제하는 항체들; HER4에 결합하여, 하나 이상의 다른 HER 수용체들과의 이량체화를 억제하는 항체들; 펩티드 이량체화 억제제를 포함한다. U.S. Pat. No. 6,417,168 참고, 전문이 참고문헌에 통합된다. 페르투주마브와 같이 HER 이량체화를 억제하는 항체들은 암 세포 치료에 이용될 수 있는데, 페르투주마브는 HER2 수용체를 과다발현시키지 않고 또는 HER2 수용체를 증폭시키지 않는다.

변형된 숙주 세포는 또한 다양한 글리코실화 패턴을 가지고, 전장 항체가 아닌 재조합 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 본 기술 분야에 표준 기술을 이용하여 재조합 단백질을 인코드하는 벡터 (가령, 플라스미드, 또는 바이러스)를 변형된 숙주 세포 안으로 도입시키고, 그리고 재조합 단백질은 호르몬, 사이토킨 그리고 Fv, Fab, scFV 또는 디아바디(diabody) 단편과 같은 항체 단편들을 포함하는 관심대상의 임의의 단백질이 될 수 있다.

"Fv"는 완벽한 항원-인지 및 항원-결합 부위를 포함하는 항체의 최소 단편을 말한다. 이 부분은 한 개의 중쇄 및 한 개의 경쇄 가변 도메인이 서로 단단하게, 비-공유적으로 연합된 것으로 구성된다. 이와 같은 형태(configuration)에서, 각 가변 도메인의 세 개의 초가변 부분은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정시킨다. 6개의 초가변 부분은 집합적으로 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대한 특이성을 가지는 3개의 초가변 부분만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인지하고 항원에 결합하는 능력을 보유하지만, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화력을 가진다.

Fab는 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 부분에 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가됨으로써 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 최소한 한 개의 자유 티올 기를 가지는 Fab'를 말한다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 힌지 시스테인을 사이에 끼고 있는 Fab' 단편 쌍으로 만들어진다. 기타 항체 단편들의 화학적 커플링은 잘 알려져 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편들은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 구체예에서, Fv 폴리펩티드는 VH 와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하여, 항원 결합을 위한 원하는 구조를 scFv가 형성할 수 있도록 한다. scFv을 알아보기 위해서, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol . 113, Rosenburg and Moore eds ., SpringerVerlag , New York , pp . 269315 (1994)을 참고한다. HER2 항체 scFv 단편들은 WO93/16185; U.S. Pat. No. 5,571,894; 및 U.S. Pat. No. 5,587,458에 설명되어 있으며, 이들은 참고문헌에 통합되며, 그리고 이들은 본 발명의 변형된 숙주 세포에 의해 만들어질 수 있다.

용어 "디아바디(diabodies)"는 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편들은 동일한 펩티드 쇄(VH-VL)에서 가변 경쇄 도메인(VL)에 연결된 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄에서 두 개 도메인의 쌍을 허용하기엔 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 강요되어, 두 개의 항원-결합 부위가 만들어지게 된다. 디아바디는 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al , Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 90:6444-6448 (1993)에서 충분히 설명되고 있다.

일부 구체예들에서, 항체는 억제성 항체다. 억제성 항체는 항체가 결합하는 항원의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 예를 들면, 억제성 항체는 항원의 활성을 억제하거나 또는 항원의 발현을 억제함으로써 대응하는 항원의 신호 변환을 하향조절할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항체는 중화 항체다. 중화 항체는 가용성 항원의 일부 생물학적 활성을 감소시키거나 또는 폐기시키거나 또는 감염성 물질과 같은 살아있는 유기체의 일부 생물학적 활성을 감소시키거나 폐기시킨다. 중화 항체들은 천연 리간드 또는 항원의 수용체와 경쟁할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항체는 자극성 또는 활성화 항체다. 자극성 또는 활성화 항체는 항원의 결합시, 대응하는 항원의 신호 변환을 활성화시켜, 항원을 활성화시키거나 또는 항원의 활성을 상향조절하거나 또는 항체가 결합하는 항원의 발현을 상향조절하는 항진(agoinst) 항체가 될 수 있다.

본 발명의 N-글리칸을 포함할 수 있는 항체들은 아비씨시마드(ReoPro®), 아달리무마브(Humira®), 알렘투주마브(Campath®), 바시리시마브(Simulect®), 베바씨주마브(Avastin®), 세투시마브 (Erbitux®), 다클리주마브(Zenapax®), 다세투주마브, 에쿨리주마브(Soliris®), 에팔리주마브(Raptiva®), 에드레콜로마브 (Panorex®), 에프라투주마브, 이브리투모마브(Zevalin®), 티우세탄, 인플리시마브(Remicade®), 무로모나브CD3 (OKT3), 나탈리주마브(Tysabri®), 오말리주마브 (Xolair®), 팔리비주마브(Synagis®), 파니투무마브(Vectibix®), 라니비주마브(Lucentis®), 겜투주마브 오조가미신(Mylotarg®), 오레고보마브(OvaRex®), 리투시마브(Rituxan®), 토시투모마브(Bexxar®), 트라스투주마브(Herceptin®), MetMAb, 오크레리주마브, 페르투주마브, Raptiva®(에팔리주마브), hu M195Mab, MDX-210, BEC2, 항-A베타, 항-CD4, 항-IL13, 항-oxLDL, 트라스투주마브DM1, 아포마브, rhuMAb 베타7, rhuMAb IFNalpha, GA101, 항-OX40L, 이피리무마브, 발로르팀(Valortim), 우스테키누마브, 골리무마브, 오파투무마브, 잘루투무마브, 트레밀리무마브, 모타비주마브, 미투모마브, 에크로메시마브, ABXEGF, MDX010, XTL 002, H11 SCFV, 4B5, XTL001, MDX-070, TNX-901, IDEC-114, 그리고 보체 C5, CBL, CD147, gp120, VLA4, CD11a, CD18, VEGF, CD40L, 항-Id, ICAM1, CD2, EGFR, TGFβ2, TNFα, TNF 수용체, E셀렉틴, FactII, Her2/neu, F gp, CD11/18, CD14, CD80, ICAM3, CD4, CD23, β2-인테그린, α4β7, CD52, CD22, OX40L, IL-5 수용체, GMC-SF 수용체, GM-CSF, HLA-DR, oxLDL, CD64 (FcR), TCR αβ, CD3, Hep B, CD125, DR5, EpCAM, gpIIbIIIa, IgE, 베타 7 인테그린, CD20, IL1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-12/IL-23, IL-15, IFN-α, VEGFR-1, 혈소판-유도된 성장 인자 수용체α (PDGFRα), 혈관 부착 단백질 1 (VAP1), 결합 조직 성장 인자 (CTGF), Apo2/TRAIL, CD25, CD33, HLA, F gp, IgE, CTLA-4, IP-10, 항-C. difficile 독소 A 및 독소 B, B. anthracis PA, 호흡기 합체 바이러스 (RSV), 만노즈 수용체/hCGβ, 인테그린 수용체s, PD1, PDL-1, CD19, CD70, 및 VNR 인테그린을 포함하나 이에 한정되지 않는 항원에 특이적인 임의의 항체 단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 N-글리칸을 포함하는 항체들은 고유 항체들 또는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산되는 항체들의 반감기와 필적되는 양호한 반감기를 가진다. 항체 반감기는 전형적으로 항체가 형성된 후 평균 생존 시간 단위를 말하는데, 통상적으로 동물 몸으로부터 알고 있는 양의 면역글로블린을 50%를 감소하는데 소요되는 시간으로 표현된다. 반감기는 면역글로블린 부류에 따라, 그리고 종에 따라 다양하다. 일부 구체예들에서, CHO-1E5 세포에서 생산되는 해당 N-글리칸을 발현시키는 항체는 부모계 CHO 세포에 의해 생산되는 항체와 같이 생체내 필적하는 종말(Terminal) 반감기를 보유한다. 일부 구체예에서, 해당 항체들은 테스트 동물에서 적어도 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 또는 그 이상의 종말 반감기를 보유한다. 종말 반감기는 초기 주사후 그리고 한정된 시격의 과정을 두고 개체의 생물학적 유체(가령, 혈액 또는 혈청)에 남아있는 항체의 잔량을 정량화하여 평가할 수 있다. 최초 투여는 정맥, 피하 또는 본 기술 분야에 공지된 임의의 다른 경로 또는 여기에서 설명하고 있는 경로들을 통하여 실시될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 N-글리칸을 포함하는 해당 항체들은 변형안된 숙주 세포에 의해 생산되는 부모계 항체 또는 본 발명의 독특한 N-글리칸이 부족한 항체들과 비교하였을 때, 강화된 ADCC 활성을 보유하지만, 실질적으로 더 높은 면역원성을 유도하지는 않는다. 면역원성(Immunogenicity)은 전형적으로 면역 반응, 체액 및/또는 세포매개된 면역 반응을 제공하는 항원 또는 에피토프와 같은 특정 물질의 능력을 말한다. 단백질 및 폴리사카라이드는 면역원성일 수 있다. 한 구체예에서, 해당 N-글리칸을 포함하는 항체는 부모계 CHO 세포에 의해 생산되는 항체와 같은 필적하는 면역원성 또는 생체내에서 이보다 부족한 면역원성을 나타낸다. 면역원성 또는 이의 부족을 평가하는 방법들은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 통상적인 방법은 혈청 항체 역가와 같은 항체 반응을 유도하는 능력을 측정하는 것이다. 실시예 14 및 도 29에서 설명된 것과 같이, 생체내 면역원성은 본 발명의 해당 항체들에 대한 항체 역가로 측정된다. 한 실시예에서 특이적으로, 야생형 CHO 세포에 의해 생산되는 해당 ET101 항체 또는 CHO-1E5 세포에 의해 생산되는 ET101 항체는 인간이 아닌 영장류 두 개 군에 별도 주사한다. 주사된 해당 항체에 반응하여 혈청 IgM 생산은 ELISA에 의해 측정된다. 혈청 IgM 역가는 생체내 해당 항체들에 의해 유도된 면역원성 수준을 반영한다. 항체 역가는 혈청의 1:11:1,000,000 희석 범위에서 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, CHO 세포 또는 CHO-1E5 세포에 의해 생산되는 해당 항체들에 대한 IgM 역가는 혈청의 100,000 ng/ml을 넘지 않으며, 10,000 ng/ml을 넘지 않으며, 1,000 ng/ml을 넘지 않으며, 100 ng/ml을 넘지 않으며 또는 10 ng/ml 조차도 넘지않는 범위내에 있다. 일부 구체예에서, IgM 역가는 1:100 혈청 희석에서 405 nm에서 약 0.1 광학밀도(OD)이며, 이는 혈청의 약 500 ng 1000 ng/IgM/ml 범위에 상응한다. 도 29에 나타난 바와 같이, IgM 역가는 항체 주사후 7 일 이상, 14 일 이상, 20 일 이상, 24 일 이상, 30 일 이상, 35 일 이상 또는 더 긴 시간에 걸쳐 증가하지 않는다.

해당 항체들의 면역원성을 평가하기 위하여 IgM 또는 다른 항체 이소타입 역가를 측정하는데 적합한 분석은 직접적 결합 분석, 브릿지 분석, 캡쳐(샌드위치) 분석 및 방사능리간드, 효소, 형광, 화학적발광 또는 전기화학적 발광 탐지 시스템을 이용한 경쟁적 면역 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 표적 항체의 생체내 면역원성을 평가하는 한 가지 대안적 방법은 자석 비드계 면역침전 방법에 이어서 표적 항체, 가령, ET101-CHO-1E5 항체의 고순환 농도 존재하에 인간 및 필리핀 원숭이 혈청에서 항-약물 항체들(ADA)을 결정하기 위하여 정량적 액상 크로마토그라피질량분석 (LC/MS)이 된다. 이용가능한 ADA 결합 부위는 용리 및 절단전에 과량의 표적 항체를 첨가하여 포화시키고, IgG 항체와 이들의 결합된 항원의 자석 비드계 단백질 G 분리한다. 표적 항체들의 펩티드는 안정적인 동위원소 라벨된 표준을 이용하여 LC/MS에 의해 정량화시켜 총 ADA의 존재를 추정한다. 이와 같은 방법은 면역원성 반응 측정에 대해 확립된 방법론을 보완한다(Hendrik N. et al . Analytical chemistry, 2008,,6914).

표적 항체들에 의해 유도된 원하지 않는 면역원성은 체액 및 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. 원하는 경우, 체액 및 세포계 면역 반응 모두 측정할 수 있다. 대부분 경우, 성숙한 IgG 반응의 발달은 숨어있는 항원 특이적 헬퍼 T세포 관련을 의미한다. 본 발명의 해당 항체 투여시 세포-매개된 반응의 탐지/평가를 위한 분석의 예로는 T세포 자극/증식 분석, 사이토킨 (가령, IL2, IL4, IFN-감마) 생산/배출 방법, 수용체 포스포릴화 상태 측정, 또는 하나 이상의 T 세포 또는 B 세포 세포내 표식들의 조정을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들은 때때로 수지상 세포와 같은 다른 세포 유형의 조제물과 공동-배양된 T-세포 조제물의 사용을 포함한다. 이들 분석에 흔히 Elispot 및 유세포분석기 과정이 흔히 이용된다. 기억 B세포 ( 및 일부 경우 기억 T세포) 분석은 면역 반응의 성질에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있으며, 그리고 면역원성의 발달 예측에 기여할 수 있다. 펩티드 또는 전장 표적 단백질, 가령, ET101-CHO-1E5 항체 (분석 및 분석 목적에 따라 달라짐)를 이용한 연구 및 Elispot 방법론이 이용될 수 있다(“ GUIDELINE ON IMMUNOGENICITY ASSESSMENT OF BIOTECHNOLOGYDERIVED THERAPEUTIC PROTEINS ”, 2007 참고).

Fc 수용체( FcR ) 결합

한 측면에서, 본 발명은 변형된 숙주 세포에 의해 생산되는 항체를 제공하는데, 이때 항체는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, Fc 수용체, FcγIIIa에 증가된 결합 친화력을 가지고, 및/또는 또다른 Fc 수용체, FcγIIb에 대해 감소된 결합 친화력을 가지고, 따라서, Fc 수용체들을 발현시키는 효과물질 세포에 대한 항체의존성 세포매개된 세포독성을 강화시킨다. 또다른 측면에서, 본 발명은 변형된 항체를 생산하는 능력으로 특징화된 변형된 숙주 세포를 제공하는데, 이때 항체는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, FcγIIIa에 증가된 결합 친화력을 나타내고, 및/또는 또다른 FcγIIb에 대해 감소된 결합 친화력을 나타낸다.

항체들 및 항체-항원 복합체와 세포의 면역 시스템의 상호작용은 항체의존성 세포매개된 세포독성 (ADCC)을 포함하는 다양한 반응을 초래한다(Daeron , Annu . Rev . Immunol . 15:203234 (1997); Ward and Ghetie , Therapeutic Immunol . 2:7794 (1995); as well as Ravetch and Kinet , Annu . Rev . Immunol. 9:457492 (1991)).

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 부분에 결합하는 수용체를 설명하기 위하여 이용된다. 한 구체예에서, FcR은 인간의 고유 서열 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것으로, 그리고 대립형질 변이체 및 이들 수용체의 대체 접합형을 포함하는 FcγRI, FcγRII, 및 Fcγ RIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 세포질 도메인에서 주로 상이한, 유사 아미노산 서열을 보유한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 활성 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 저해 모티프 (ITIM)를 포함한다.(M. in Daeron , Annu . Rev . Immunol . 15:203-234 (1997)). FcRs는 Ravetch and Kinet , Annu . Rev . Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al , Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al , J. Lab . Clin . Med . 126:330-41 (1995)에서 살펴본다. 앞으로 확인될 수 있는 것들을 포함한, 기타 FcRs들도 여기에서 사용된 용어, "FcR"에 포함된다. 이 용어는 또한 신생 수용체, FcRn도 포함하는데, 이것은 모계 IgGs를 태아로 전달하는 임무를 맡고 있다(Guyer et al , J. Immunol . 117:587 (1976) and Kim et al , J. Immunol . 24:249 (1994)).

몇 가지 항체 효과물질 기능은 항체의 Fc 부위에 결합하는 Fc 수용체들(FcRs)에 의해 매개된다. FcRs는 면역글로블린 이소타입에 대한 이들의 특이성으로 정의된다; IgG 항체들에 대한 Fc 수용체들은 Fc γR로 불리며, IgE 항체들에 대한 Fc 수용체들은 Fc εR로 불리며, IgA 항체들에 대한 Fc 수용체들은 Fc αR 로 불린다. Fc γR의 세 가지 하위 부류가 확인되었다: Fc γRI (CD64), Fc γRII (CD32) 및 Fc γRIII (CD16). 각 Fc γR 하위부류는 두 개 또는 세 개 유전자에 의해 인코드되고, 그리고 또다른 RNA 접목은 다중 전사체를 유도하기 때문에 Fc γR 동소체에 광범위한 다양성이 존재한다. Fc γRI 하위부류 (Fc γRIA, Fc γRIB 및 Fc γRIC)를 인코드하는 세 개 유전자는 염색체 1의 긴 팔의 부위 1q21.1에서 몰려있고; Fc γRII 동소체 (Fc γRIIA, Fc γRIIB 및 Fc γRIIC)을 인코드하는 유효량 및 Fc γRIII (Fc γRIIIA 및 Fc γRIIIB)을 인코드하는 두 개 유전자는 모두 부위 1q22에 몰려있다. 이들 상이한 FcR 하위 유형들은 상이한 세포 유형에서 발현된다(Ravetch and Kinet , Annu . Rev . Immunol . 9:457492 (1991)). 예를 들면, 인간에서 Fc γRIIIB는 호중구에서만 유일하게 발견되지만, Fc γRIIIA는 대식세포, 단핵세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 및 T세포 하위 집단에서 발견된다. 특히, Fc γRIIIA는 ADCC에 연루된 세포 유형중에 하나인 NK 세포 상에 존재하는 유일한 FcR이다. Fc γ RIIIA는 대식세포 및 NK 세포 상에서 발현되는 활성 막통화 수용체다. 이것은 또한 호중구 옵소닌 수용체와 (Ravetch , J. and L. Lanier , 2000, Science 290:84). Fcγ RIA는 세 개의 세포외 Ig-유사 도메인을 가진 막통과 단백질이다. Fcγ RI는 단핵세포 및 대식세포 상에 구성적으로 발현되며, 그리고 호중구 및 호산구상에서 유도될 수 있다. 조혈 세포상에 FcR 발현 벡터는 Ravetch and Kinet , Annu . Rev . Immunol 9:45792 (1991)에서 다시 살펴본다(이 문헌은 참고문헌에 통합된다).

한 구체예에서, 본 발명은 변경된 FcR 결합 친화력을 가지는 항체를 제공한다. "변경된" FcR 결합 친화력을 가진 항체는 부모 항체와 비교하였을 때, 또는 고유 서열 Fc 부위를 포함하는 항체와 비교하였을 때, 강화된 또는 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 보유하는 항체다. FcR에 “증가된 결합”을 보여주는 본 발명의 항체는 부모 항체 보다 더 높은 친화력으로 적어도 하나의 FcR에 결합한다. FcR에 “감소된 결합”을 보여주는 본 발명의 항체는 부모 항체 보다 더 낮은 친화력으로 적어도 하나의 FcR에 결합한다. FcR에 대한 감소된 결합을 보여주는 이와 같은 변이체들은 FcR에 거의 결합하지 않거나 인지할 정도의 결합을 하지 않는데, 가령, 고유 서열 IgG Fc 부위와 비교하였을 때 FcR에 0-20% 결합한다.

독특한 N-링크된 글리칸을 가진 항체와 부모항체를 필적되는 양으로 사용하였을 때, 부모 항체 보다 더 높은 친화력으로 FcR에 결합하는 본 발명의 항체는 부모 항체보다 실질적으로 더 높은 결합 친화력으로 상기 확인된 FcR중 하나 이상에 결합하는 항체다. 예를 들면, 개선된 FcR 결합 친화력을 가지는 항체는 실시예에서 설명된 것과 같이, FcR 결합 친화력을 측정하였을 때, 부모 항체와 비교하여 FcR 결합 친화력이 약 1.1 배 내지 약 10,000 배, 예를 들면, 1.15 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 500 배, 1,000 배, 10, 000 배 또는 그 이상이 된다.

"낮은 친화력 수용체"는 관심 리간드에 대해 약한 결합 친화력을 가진 수용체, 예를 들면, 약 50 nM 또는 더 나쁜 친화력 결합 상수를 가진다. 예시적인 낮은 친화력 수용체 Fc γRIIIa 158 F/F 및 Fc γRIIIa 158 F/V을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일부 구체예에서, CHO-1E5 세포에 의해 생산되는 항체는 Fc γRIIIa, 활성화 Fc γR에 대해 증가된 결합을 나타내고, 그리고 Fc γRIIb, 억제성 Fc γR에 대해 감소된 결합을 나타낼 수 있다.

항체-의존성 세포성 세포독성 ( ADCC ) 활성

본 발명의 변형된 숙주 세포는 상기에서 설명된 것과 같이, 항체들 또는 기능을 하는 항체 단편들을 생산하는데 이용될 수 있다. 이들 세포에 의해 생산되는 항체들 또는 기능을 하는 항체 단편들은 변형안된 부모계 숙주 세포에서 생산된 대응하는 항체들 또는 기능을 하는 항체 단편과 비교하였을 때, 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자에서 수준의 변화와 같은 여기에서 설명된 다양한 글리코실화 패턴을 나타낼 수 있다. 더욱이, 다양한 글리코실화 패턴을 가지고 있는 이들 항체들 또는 단편들은 변형안된 부모계 숙주 세포에서 생산되는 대응하는 항체들 또는 항체 단편들과 비교하여 개선된 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 다른 항체 효과물질 기능을 가질 수 있다. 대안으로, 다양한 글리코실화 패턴을 가지는 항체 또는 항체 단편들은 상기 다양한 글리코실화 패턴이 부족한 대응하는 항체들과 비교하였을 때 증가된 ADCC를 나타낸다. 개선된 또는 증가된 ADCC 활성을 가진 항체 또는 항체 단편들은 또한 다양한 글리코실화 패턴을 보유할 수 있다.

예를 들면, 부모계 CHO 세포계는 다양한 글리코실화 패턴을 가진 변형된 CHO 세포계를 만들기 위하여 변형될 수 있다. 그 다음 변형된 CHO 세포계는 부모계 CHO 세포에 의해 생산되는 항체보다 더 높은 ADCC 활성을 보유하는 항체를 생산할 수 있다. 변형된 CHO 세포계에 의해 생산되는 항체는 또한 다양한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.

"항체-의존성 세포-중개된 세포독성(ADCC)"은 세포-중개된 반응으로, 여기서, Fc 수용체(FcRs) (가령, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)를 발현시키는 비-특이적 세포독성 세포는 표적 세포상의 결합된 항체를 인지하고, 결과적으로 표적 세포를 용해시킨다. ADCC를 중개하는 1차 세포는 NK 세포, 단핵세포 및 대식세포로 구성된다. NK 세포는 FcγRIII 만을 발현시키지만, 반면, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈세포 상에 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu . Rev . Immunol 9:457-92 (1991)에 요약되어 있다.

"효과물질 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현시키고, 효과물질 기능을 수행하는 백혈구다. 바람직하게는, 이 세포는 최소한 FcγRIII를 발현하고, 그리고 ADCC 효과물질 기능을 수행한다. ADCC를 중개하는 인간의 백혈구의 예로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 천연 킬러(NK) 세포, 단핵세포, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며; PBMCs 및 NK 세포가 바람직하다. 효과물질 세포는 이의 고유 소스 가령, 여기에서 설명된 것과 같이, 혈액 또는 PBMCs으로부터 분리될 수도 있거나 또는 본 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 시험관에서 증식될 수 있다.

한 구체예에서, 대상 항체들을 필적되는 양으로 사용하였을 때, 본 발명의 항체는 인간 효과물질 세포 존재하에, 부모 숙주 세포에서 생산된 대응 항체보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포매개된 세포독성 (ADCC)을 중재한다. 일반적으로, ADCC 활성은 여기에서 설명된 분석을 이용하여 확인되나, 동물 모델과 같은 ADCC 활성을 결정하기 위한 방법 또는 다른 분석들도 고려된다. 본 발명의 항체는 여기에서 설명된 시험관 분석에서, 부모 항체와 비교하여 ADCC 중재에 있어서 약 1.1 배 내지 약 10,000 배, 예를 들면, 1.15 배, 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 500 배, 1,000 배, 10, 000 배 또는 그 이상으로 효과적이다.

일부 구체예에서, 독특한 N-링크된 글리칸을 보유하는 본 발명의 항체는 부모계 항체와 비교하였을 때 상이한 유전자형의 Fc γRIIIa를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하여 증가된 ADCC를 나타낸다. 한 예에서, 독특한 N-링크된 글리칸을 가지는 항체는 Fc γRIIIa 158V/V(두 개 대립형질에서 아미노산 158은 발린인 경우)를 발현시키는 효과물질 세포에 대해 증가된 ADCC를 나타내는데, 이 항체는 IgG의 Fc 단편에 높은 친화력을 가진다. 또 다른 예에서, 독특한 N-링크된 글리칸을 보유한 항체는 부모계 항체와 비교하였을 때, Fc γRIII 158F/F 또는 Fc γRIII 158F/V (두 개 대립형질중 하나 또는 모두에서 아미노산 158은 페닐알라닌인 경우)을 발현시키는 효과물질 세포에 대항하여 증가된 ADCC를 나타내고, 이 항체는 IgG의 Fc 단편에 낮은 친화력을 가진다. Fc γRIIIa의 아미노산 158에서 발린(V) 또는 페닐알라닌(F)의 표현형에 대응하는 유전적 다형성은 Fc γR에 대한 IgG1의 친화력에 상당히 영향을 주는 것으로 알려져있다(Koene HR , et al . Blood 90:11091114, 1997). 또한, Fc γRIIIa V 대립유전자를 보유하는 면역 효과물질 세포는 F 대립유전자를 보유하는 세포보다 항-HER2/neu IgG1 변이체의 ADCC를 중재한다(Shields RL , et al . J Biol Chem 9:65916604, 2001). 항-HER2/neu 단클론 항체 트라스투주마브는 활성 (단편 C 수용체(Fc γRIIIa; Fc γRIIa)) 및 억제성 (Fc γRIIb) 항체 수용체 모두에 관여하는 것으로 보이며, Fc γR 다형성은 자연-킬러 세포/단핵세포의 항체의존성 세포매개된 세포독성 (ADCC)에 영향을 줄 수 있는 것으로 확인되었다. 트라스투주마브를 제공받은 유방암 환자의 임상 결과와 연관있는지에 대한 조사 연구가 있었다. Fc γRIIIa-158 V/V 유전자형은 객관적 반응률 (ORR)과 무진행 생존(PFS)과 유의적으로 관련된다는 것이 밝혀졌다. 또한 Fc γRIIa-131 H/H 유전자형에 대해 ORR 및 PFS에서 경향 의미가 있었다. 두 가지 우호적인 유전자형 (VV 및/또는 H/H)의 조합은 다른 조합들과 비교하였을 때 독립적으로 더 나은 ORR 및 OFS와 연관있었다. ADCC 분석은 상이한 유전자형을 품고있는 PBMC보다 더 높은 트라스투주마브 매개된 세포독성을 가진다는 것을 보여주었다. Fc γRIIIa 158 V/V의 환자에서 PFS 예상치 158 V/F, 158 F/F, 또는 F 캐리어 (V/F+F/F 복합됨)의 환자보다 유의적으로 더 길었다 (Antonino Musolino , et al . Journal of Clinical Oncology , Volume 26, No . 11, April 10 2008). 따라서, Fc γRIII 158V/V를 발현시키는 세포와 Fc γRIII 158F/F를 발현시키는 세포에 대항하여, 증가된 ADCC 활성을 보유하는 본 발명의 항체는 변형안된 항체와 비교하였을 때, 항체계 요법으로 치료되는 암을 포함한 다양한 질환을 가진 환자의 임상 결과를 강화시키는데 매우 유용할 것이다.

여기에서 이용된 것과 같이, ADCC 활성은 킬러세포, 천연 킬러 세포, 활성화된 대식세포 또는 이와 유사한 것과 같은 효과물질 세포의 표면상에 존재하는 Fc 수용체에 항체의 Fc 부위의 결합을 통하여, 예를 들면, 종양 세포와 같은 세포에 손상을 주는 활성 또한 포함한다. (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications , WileyLiss , Inc ., Chapter 2.1 (1995)). 예를 들면, ADCC 활성은 세포독성 활성이 될 수 있는데, 이때 생체내 종양 세포상의 세포 표면 항원에 결합된 항체는 Fc 수용체들 (FcRs)을 발현시키는 효과물질 세포(가령, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 단핵세포, 세포독성 T 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)를 활성화시켜, 표적 세포상에 결합된 항체 인지를 유도하여, 결국 표적 세포의 용해시킨다(Monoclonal Antibodies : Principles and Applications , WileyLiss , Inc ., Chapter 2.1 (1995)). 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, U.S. Pat. No. 5,500,362 또는 5,821,337에서 설명하는 것과 같은 시험관 ADCC 분석을 실행할 수 있다. 이와 같은 분석용으로 유용한 효과물질 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 Clynes et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:652656 (1998)에서 설명된 것과 같이 동물 모델과 같은 생체내에서 평가될 수 있다.

항체 효과물질 기능은 또한 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체-결합; 항체의존성 세포매개된 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체들(가령, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. "보체 의존성 세포독성"은 보체 존재하에 표적을 용해시킬 수 있는 분자의 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 동족(cognate) 항원과 복합된 분자(가령, 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 가령 Gazzano - Santoro et al , J. Immunol . Methods 202: 163 (1996)에서 설명된 것과 같은 CDC 분석을 실시할 수 있다.

본 발명의 항체는 부모계 항체와 비교하여 생물학적 활성의 임의의 변화를 평가하기 위하여 하나 이상의 분석을 받게될 수 있다.

FcR에 결합하는 본 발명의 항체의 능력이 평가될 수 있다. FcR이 고친화력 Fc 수용체, 가령 Fc γRIIIA158 V/V인 경우, 해당 항체를 적정하고, 표준 ELISA 포맷에서 본 발명의 항체에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 결합된 항체를 측정함으로써 결합을 측정할 수 있다.

본 발명의 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 효과물질: 표적 비율을 다양하게 하여 실시예 12에서 설명된 것과 같은 시험관 ADCC 분석을 실시할 수 있다. 이와 같은 분석용으로 유용한 효과물질 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 Clynes et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:652656 (1998)에서 설명된 것과 같이 동물 모델과 같은 생체내에서 평가될 수 있다.

제제, 투여 및 처치

증가된 ADCC 활성을 가지는 본 발명의 항체는 다양한 질환의 예방 및 치료에 유용할 것이다.

여기에서 사용된 "질환"은 본 발명의 변형된 숙주 세포에 의해 생산되는 항체를 이용한 치료에서 이익을 얻게 되는 임의의 상태를 말한다. 이와 같은 상태는 포유류가 문제의 질환에 걸리기 쉬운 병리학적 상태들을 포함한 만성 및 급성 질환 또는 장애를 포함한다. 질환의 예로는 암, 알레르기, 심혈관 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 신경 질환, 바이러스 감염 및/또는 세균 감염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 질환은 암이다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 암의 좀더 구체적인 예는 부신피질암, 항문암, 재생불량성 빈혈, 담관암, 방광암, 뼈암, 뼈 전이, 중추신경계 (CNS) 암, 말초신경계(PNS) 암, 유방 암, 캐틀만(Castleman) 질환, 경부암, 어린이 비-호지킨 림프종, 결장 및 직장암, 내막암, 식도 암, Ewing 패밀리 종양 (가령, Ewing 육종), 눈 암, 담도암, 위장 암양종 종양, 위장관 기질 종양, 임신성 융모성 질환, 모발 세포 백혈병, 호지킨 질환, 카포시(Kaposi) 육종, 신장 암, 후두 및 하인두 암, 급성 임파성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 어린이 백혈병, 만성 임파구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 간 암, 폐 암, 폐 암양종 종양, 비-호지킨 림프종, 남성 유방암, 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 골증식성 질환, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경아세포종, 구강 및 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선, 망막아세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종 (성인 연조직 암), 흑색종 피부 암, 비-흑색종 피부 암, 위암, 고환암, 흉선 암, 갑상선암, 자궁암 (가령, 자궁 육종), 질암, 외음부암, 그리고 Waldenstrom의 마크로글로블린혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암의 한 가지 예는 "HER2-발현 암"이 될 수 있으며, 이 암은 세포 표면에 있는 HER2 수용체 단백질을 가지고 있는 세포를 포함하여, 항-HER2 항체가 암에 결합할 수 있다. (Semba et al ., PNAS ( USA ) 82:64976501 (1985) and Yamamoto et al . Nature 319:230234 (1986) ( Genebank accession number X03363 )).

예를 들면, 악성 종양과 같은 암에서, 높은 ADCC 활성을 보유하는 항체는 이의 세포독성 효과를 통하여 암세포의 증식에 손상을 줌으로써 암을 치료할 수 있다. 다양한 종양 세포 상에 항체의 항종양 효과는 상기 설명된 방법들에 의해 분석될 수 있다. 예를 들면, CDC 활성 측정 방법, ADCC 활성 측정 방법 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 시험관 테스트와, 마우스 또는 이와 유사한 실험 동물에서 종양 시스템을 이용한 항-종양 실험과 같은 생체 테스트가 실행될 수 있다. CDC 활성 및 ADCC 활성 측정 그리고 항-종양 실험은 Shitara et al ., Cancer Immunology Immunotherapy, 36, 373380 (1993); Nakamura et al ., Cancer Research , 54, 15111516 (1994) 및 이와 유사한 것에서 설명된 방법에 따라 실행할 수 있다.

알레르기 반응이 면역 세포로부터 중개 분자의 방출에 의해 일반적으로 유도되는 알레르기 치료에서, 고 ADCC 활성을 가지는 항체를 이용하여 면역 세포를 제거함으로써 알레르기 반응이 억제될 수 있다. 심혈관 질환은 고 ADCC 활성을 가지는 항체를 이용하여 치료한 후 재협착(restricture)에서 동맥 세포의 증식을 억제시킴으로써 예방 및 치료될 수 있다. 바이러스 또는 세균 감염을 포함하는 다양한 질환은 고 ADCC 활성을 보유하는 항체를 이용하여 바이러스 또는 세포 감염된 세포의 증식을 억제함으로써 예방 및 치료될 수 있다.

일부 구체예에서, 글리코실화 패턴 Glu-GlcNAC_{2 -}Man₄ (+/-Fuc)을 나타내는 항체는 변형안된 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, 유방암 세포, 난소암 세포, 및 폐암 세포을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 암 세포에 대항한 증가된 ADCC 활성을 보유한다. 일부 구체예에서, 글리코실화 패턴 Glu-GlcNAC₂-Man₄ (+/-Fuc)을 나타내는 항체는 변형안된 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, Fc γRIIIA 수용체에 대해 증가된 결합 친화력을 보유한다. Glu-GlcNAC₂-Man₄ (+/-Fuc)을 나타내는 항체는 변형안된 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 항체와 유사한 생체내 약동학 특징을 가진다.

여기에서 설명된 N-링크된 글리코실화 패턴을 가지는 해당 항체는 야생형 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 대응하는 항체와 필적되는 약동학 프로파일을 나타낸다. 약동학 프로파일은 약물이 신체에 의해 어떻게 흡수되고, 분포되고, 대사되고, 그리고 신체로부터 제거되는지에 관한 매개변수들을 설명한다. 약동학은 시간을 두고 신체에서 약물의 흡수, 분포, 조직에서 국소화, 생체형질변환 및 방출 프로세스를 포함하는 약물의 작용을 연구하는 학문이다. 약동학 매개변수들은 약물 투여 경로, 약물의 분포 용적((Vd), 약물의 제거(Cl), 제거 상수(kel), 제거 반감기(t1/2), 혈청 농도, 생체이용성, 생체내 용해도, 0차 제거(zero order elimination), 약량 섭생, 간 약물 제거, 약물 분포, 단백질 결합 및 이온화를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 약물 약동학은 약물의 효과 개시, 지속 및 강도를 결정한다.

본 발명의 항체의 치료요법적 제제는 동결건조 제제 또는 수용액의 형태에서선택적으로 생리학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제와 원하는 순도를 가진 항체를 혼합함으로써 보관용으로 준비된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th edition , Osol , A. Ed . (1980)). 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 약량 및 농도에서 수용 개체에 비독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기 산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(가령, 옥타데실디메틸벤질 암모니움 클로라이드; 헥사메티오니움 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드, 벤제티오니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 글루코즈, 만노즈, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 솔비톨과 같은 슈가; 나트륨과 같은 염-형성 카운트-이온; 금속 복합체 (가령, Zn-단백질 복합체); 및/또는 Tween, Pluronics™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

여기에서 제제는 또한 치료될 특정 징후에 필수적인 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 반대효과를 가지지 않는 보체 활성을 가진 화합물을 포함할 수 있다. 이와 같은 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 복합적으로 적합하게 존재한다.

활성 성분들은 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 경계면(interfacial) 중합반응(가령, 하이드록시메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 마이크로캡슐)에 의해 준비된 마이크로캡슐에 포집되거나, 콜로이드성 약물 운반 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멸젼, 나노-입자 및 나노캡슐), 또는 마크로에멸젼에 포집될 수도 있다. 이와 같은 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences , 16 th edition , Oslo , A., Ed ., (1980)에서 설명되어 있다.

생체내 투여용으로 이용되는 제제는 멸균되어야만 한다. 멸균 필터 막을 통하여 여과시켜 용이하게 실시할 수 있다. 지연-방출 조제물이 준비될 수 있다. 지연-방출 조제물의 적합한 예는 본 발명의 항체를 포함하는 고형 소수성 폴리머의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이때 매트릭스는 필름 또는 미소캡슐과 같은 모양을 갖춘 물건 형태가 된다. 지연-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(U.S. Pat No. 3,773,919), L-글루타민산 및 γ-에틸L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 가령, Lupron Depot™ (락트산-글리콜산 코폴리머와 루프로리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 그리고 폴리-D-(-)-3-하이드록시부틸산을 포함한다. 에틸렌비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 폴리머는 100일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 포집된 항체들이 긴 시간 동안 체내 남아있을 때, 항체들은 37℃에서 수분에 노출되어 변성 또는 응집되어 생물학적 활성을 상실하거나 면역원성이 변화될 가능성이 있다. 이상적인 전략은 관련 기전에 따라 안정화를 고려해야 한다. 응집 기전이 티오-이황화물 상호 교환을 통하여 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 이용하여 수분 함량을 조절하고, 그리고 특이적 폴리머 매트릭스 조성물을 발달시켜 안정화를 이룰 수 있다.

본 발명의 1E5 세포에 의해 만들어진 항체는 항체 투여에 의해 이익을 얻을 수 있는 질병 또는 질환을 앓고 있는 또는 이와 같은 질병 또는 질환에 걸리기 쉬운 환자 등의 포유류를 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 상태는 많은 그리고 암(가령, 본 발명의 항체는 HER2 수용체, CD20 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합함); 천식과 같은 알레르기 질환(항-IgE 항체와 함께); 그리고 LFA1매개된 질환 (가령, 본 발명의 항체는 항-LFA1 또는 항-ICAM1 항체인 경우) 등을 포함한다.

항체가 HER2 수용체에 결합할 때, 질환은 바람직하게는 HER2-발현 암, 가령, HER2 수용체의 과다발현을 특징으로 하는 양성 또는 악성 종양이다. 이와 같은 암은 유방암, 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 신경아세포종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 머리 및 목암을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 설명된 기술에 따라, 개선된, 또는 감소된 ADCC 활성을 가지는 다양한 Fc 부위를 가진 폴리펩티드를 준비할 수 있다. 이와 같은 분자들은 상이한 질환 치료에 용도를 가질 것이다.

예를 들면, 개선된 ADCC 활성을 가진 항체는 조직 또는 외부 미생물의 파괴 또는 제거가 필요한 질환 또는 장애 치료에 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 암; 염증성 질환; 감염(가령, 세균, 바이러스, 곰팡이 또는 효모 감염); 그리고 조직 제거가 필요한 다른 상태(갑상선종과 같은) 및 기타 치료에 유용할 것이다.

ADCC 활성이 감소된 항체의 경우, 이들 항체는 반감기가 긴 Fc-부위 함유 폴리펩티드가 바람직하나, 본 발명의 항체는 바람직하게는 원하지 않는 효과물질 기능을 가지지 않는 질환 또는 장애 치료에 이용될 수 있다. 예를 들면, Fc 부위-함유 폴리펩티드는 항-조직 인자(TF) 항체; 항-IgE 항체; 및 항-인테그린 항체 (가령, 항-α4β7 항체)가 될 수 있다. 이와 같은 Fc 부위-함유 폴리펩티드의 바람직한 작용 기전은 리간드수용체 결합 쌍을 차단시키는 것이다. 더욱이, 감소된 ADCC 활성을 가진 Fc부위-함유 폴리펩티드는 항진 항체가 될 수 있다.

본 발명의 항체는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있는데, 장관외, 피하, 복막내, 폐내, 그리고 비강내, 그리고 국소 면역억제 치료가 바람직한 경우, 병소내 투여를 포함한다. 장관외 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 펄스 주입에 의해 적합하게 투여되는데, 특히 본 발명의 항체의 약량을 감소시키면서 투여된다. 바람직하게는 약량은 투여가 간단하게 또는 장시간에 이루어지는지의 여부에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥 또는 피하 주사에 의해 제공된다.

질병의 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 항체의 적절한 약량은 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방 목적으로 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 기존 치료, 환자의 병력 및 환자의 본 발명의 항체에 대한 반응, 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료과정에 걸쳐 적절하게 투여된다.

질병의 유형 및 중증도에 따라, 환자에게 투여하기 위한 초기 권장 약량은 하나 이상의 별도 투여 또는 연속 주입에 의해서건 간에, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (가령 0.1-20mg/kg)의 본 발명의 항체가 된다. 일반적인 일일 약량은 상기 언급된 인자들에 따라, 일반적으로 약 1 ㎍/kg 내지 약 l00mg/kg 또는 그 이상의 범위 내에 있을 것이다. 수일간 또는 더 긴 시간에 걸쳐 반복된 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 질병의 증상의 원하는 억제가 나타날 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 이와 같은 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터된다.

항체 조성물은 우수한 의학적 실행과 일관된 방식으로 조제, 투약 및 투여될 것이다. 이때 고려되는 인자들은 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유류, 개별 환자의 임상적인 상태, 질환의 원인, 물질의 운반 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 알려진 기타 인자들을 포함한다. 투여되는 항체의 "치료요법적 유효량"은 이와 같은 고려에 의해 조절될 것이며, 질환 또는 장애의 예방, 경감 또는 치료에 필요한 최소량이다. 항체는 문제의 질환을 예방 또는 치료하는데 현재 이용되는 하나 이상의 물질과 선택적으로 함께 조제될 수 있지만, 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 이와 같은 다른 물질들의 유효량은 제제내 존재하는 항체의 양, 질환 유형 또는 치료 유형 및 상기 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 일반적으로 이전에 사용된 것과 동일한 약량 및 투여 경로로 이용되거나 또는 지금까지 이용된 약량의 약 1% 내지 약 99%의 양으로 이용된다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체 및/또는 숙주 세포는 포유류에서 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다. 포유류는 인간, 인간이 아닌 영장류, 설치류, 대, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 토끼, 기나아 피그 또는 염소로 구성된 군으로부터 선택된다.

발효 및 생산 방법

한 측면에서, 본 발명은 변형된 당단백질을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 변형된 당단백질을 인코드하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고, 여기에서 설명된 숙주 세포에서 변형된 당단백질이 발현되도록 하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 여기에서 설명된 숙주 세포를 포함하는 배양물 배지를 포함한다. 다른 구체예들에서, 본 발명은 배양물 배지안에 다수의 숙주 세포를 포함하는 배양물 발효기를 더 포함한다.

발효는 산업용으로 호기성 성장 조건에서 단백질을 포함하는 생화학적 그리고 생물학적 분자의 분해 및 재조합(reassembly)을 위한 관련 분야에 잘 알려진 표준 프로세스이다. 여기에서 이용된 발효기 또는 생물 반응 장치는 당단백질, 예를 들면, 항체들과 같은 당단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는 생물학적 거대분자의 상업적 생산 및 대규모 또는 소규모 발효에 이용되는 본 발명의 숙주 세포와 같은 미생물의 성장을 위하여 최적의 조건을 유지하는 장치를 말한다.

재조합 단클론 항체들의 생산은 "레퍼토리 클로닝" 또는 "파아지 디스플레이/효모 디스플레이"로 지칭되는 기술과 연관된다. 재조합 항체 공학 기술은 마우스보다는 항체를 만들기 위하여 바이러스 또는 효소를 이용하는 것과 관련된다. 이와 같은 기술들은 약간 상이한 아미노산 서열을 가진 항체 라이브러리를 만들고, 이로부터 원하는 특이성을 가진 항체를 선택하기 위하여, 면역글로블린 유전자 단편들의 신속한 클로닝에 의존한다. 이와 같은 기술들을 이용하여 항원을 인지하는 항체들의 특이성을 강화시키고, 다양한 조건에서 이들의 안정성을 강화시키고, 치료 효과를 강화시키고, 진단시에 탐지성을 강화시킬 수 있다. 대규모로 이들 항체를 생산하는데 발효 챔버를 이용하였다. 일부 구체예에서, 본 발명의 독특한 N-글리칸을 발현시키는 항체는 배양물 발효기에서 생산될 수 있다.

실시예

실시예 1: 사멸 물질의 최적 농도의 선별

다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포 집단을 얻기 위하여, 세포에 화학물질을 제공하여 무작위 유전적 돌연변이을 일으키게 하고, 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포를 선택할 수 있다. 화학적유도된 무작위 돌연변이생성은 슈가 생합성 및 퓨코실화와 같은 단백질 글리코실화 프로세스를 통제 또는 조절하는 유전자의 돌연변이를 유도할 수 있다. 돌연변이후 낮은 퓨코실화 활성을 가진 안정적인 클론을 농축시키고, 세포 표면상에 있는 퓨코실화 단백질에 결합할 수 있는 LCA, 독소 (도 1 및 2)를 표적화시켜 분리시킬 수 있고, 따라서 고 퓨코실화 활성을 가진 세포가 제거될 수 있다.

LCA-바이오틴을 세포 표면에 결합하도록 첨가하였다. 그 다음 배지에 스트렙타아비딘사포린이 첨가되었다. 바이오틴스트렙타아비딘 상호작용으로 세포 막에 사포린을 근접하게 가져가며, 복합체는 세포안으로 내화될 수 있을 것이다. 세포 안에서, 사포린은 표적 물질로부터 떨어져 나와 리보좀을 비활성화시켜 사멸되게 한다.

효과적으로 고 퓨코실화 활성을 가진 세포를 사멸시키고, 비-특이적 사멸을 감소시키고, 따라서, 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포를 얻기 위한 LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린의 최적의 농도를 결정하기 위하여, 부모계 CHO-K1 세포의 사멸에서 LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린의 상이한 농도 조합의 효과가 실시되었다. 약 10 ㎍/ml 농도의 LCA-바이오틴과 약 2 ㎍/ml 농도의 스트렙타아비딘사포린은 부모계 CHO-K1 세포의 대부분을 사멸시키는 최적의 조합이었다(도 3).

실시예 2: 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계의 안정

두 가지 화학적 돌연변이 유발요인, ICR191 및 에틸 메탄 술포네이트 (EMS)을 이용하여 무작위 유전자 돌연변이를 유도하였다. CHO-K1 세포를 ICR191 또는 EMS으로 처리하였으며, 이는 전형적으로 각각 프레임 쉬프트(frame shift) 돌연변이 및 구아닌 알킬화를 일으킨다. 16시간 후에 화학물질을 씻어내었다. 세포는 5일간 회복되도록 두었다. 생존된 세포들은 4주간 10 ㎍/ml 농도의 LCA-바이오틴과 2 ㎍/ml 농도의 스트렙타아비딘사포린으로 선택되었다. 세포는 FITC-LCA으로 착색되었고, 이어서 FACS 분석이 실시되었다. 분류된 세포들은 고밀도에서 배양되어, 이들 집단을 확장시키고, 후속적인 LCA 라벨링 및 FACS 분류를 위한 세포들이 수득되었다.

선별과정은 ICR191 또는 EMS-유도된 돌연변이생성 후 낮은-퓨코실화 집단을 점진적으로 농축시켰다(도 4). 4주 선별 후, 세포들을 2개월 이상 동안 LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린없는 배지에서 성장시켰다. 수득된 집단들은 배지에서 LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린 없이 낮은 퓨코실화 상태를 유지하였다(도 4A). 생산 라인으로 안정적 세포 클론을 얻기 위하여, 제한된 희석을 이용하여 96-웰 플레이트에 세포를 접종시키고, LCA-바이오틴 및 스트렙타아비딘사포린없는 배지에서 단일 클론을 확장시켰다. 세포의 퓨코실화 상태는 3개월 이상 매주 FACs 분석을 통하여 모니터되었다. 이와 같은 수득된 클론은 장기간 동안 매우 안정적인 낮은 포코실화를 설명하였고, 이들 클론은 부모계 세포와 필적되는 세포 성장률을 가졌다. 클론들중 하나에서 낮은 퓨코실화 상태의 안정성은 도 5에 나타낸다. 이들 결과에서 우리의 무작위 돌연변이생성 및 선별 전략에 의해 특이적으로 낮은-퓨코실화 세포들이 농축된다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계의 글리코실화 프로파일

낮은 퓨코실화 세포 클론은 변형안된 또는 부모계 세포계와 비교하여 다양화된 글리코실화 패턴의 독특한 그리고 일관된 프로파일을 가진다. 이 프로파일은 부모계 세포 및 낮은 퓨코실화 클론을 FITC-콘쥬게이트된 맥아 아글루티닌 (WGA)(N-아세틸글루코사민에 선호적으로 결합함), 콘카나발린 A (Con A)(α-링크된 만노즈를 인지함), 및 Griffonia (bandeiraea) Simplicifolia Lectin II (GSII)(α- 또는 β-링크된 N-아세틸글루코사민 잔기들에 결함함)으로 착색시켜 확립되었다. FACS를 이용하여 라벨된 세포를 분석하였다. 낮은 퓨코실화 클론은 또한 WGA에 대해 낮은 결합 친화력을 가지는데, 이것은 이들 클론이 낮은 수준의 N-아세틸글루코사민을 가진다는 것을 말한다(도 6). 대조적으로, 이들 클론의 Con A 및 GSII에 대한 결합은 기준 보다 상당히 높았는데, 이는 이들 클론이 훨씬 많은 양의 α-링크된 만노즈 및 α- 또는 β-링크된 N-아세틸글루코사민 (도 6)을 보유한다는 것을 말한다. 이와 같은 독특한 글리코실화 패턴 프로파일의 안정성 또한 테스트되었다. 이들 클론은 8주 이상 LCA-바이오틴없는 배지에서 성장되었을 때 동일한 프로파일을 유지하였다(도 5). CHO-K1 돌연변이 클론은 현탁액으로 무혈청 배양물 배지에서 성장되고, 유사한 N-글리칸 프로파일을 보유하였다 (도 7).

실시예 4: 항체의 글리코실화 프로파일

다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계에서 발현된 항체들은 낮은 퓨코스 함량을 가진다. 이들 항체들은 또한 도 9b에서 나타낸 것과 같이 다양한 글리코실화 패턴을 가진다. 돌연변이체 CHO-K1 클론 1E5에서 인간화된 항-ErbB2 항체 ET101가 발현되는데, 이 항체는 다양한 글리코실화 패턴을 나타낸다. 1E5 돌연변이체 클론은 무혈청 현탁액에서 성장하였고, 그리고 변형안된 숙주 세포와 비교하였을 때, 유사한 수준의 1,6-퓨코실전이효소(Fut8) 유전자 전사체를 보유하였다(도 8). 전사체 수준은 세포로부터 전체 RNA를 분리시켜 측정되었다. 전사체는 cDNA로 역전사되었고, Fut8 전사체는 RT-PCR에 의해 증폭되었다. PCR 산물은 아가로즈 겔에서 전기영동에 의해 분리되었고, 악틴 수준은 로딩 기준으로 이용되었다.

돌연변이체 클론 1E5의 조건화 배지로부터 항체를 수득하였다. 항체의 발현은 SDS-PAGE 및 Coomassie 블루 착색에 의해 결정되었다(도 9A). SDS-PAGE에 얹은 시료 몇 방울은 니트로셀룰로오즈 막으로 이동시켰고, 그리고 차례로 각각 퓨코스 링크된(α1,6) N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민, α-링크된 만노즈, 및 α- 또는 β-링크된 아세틸글루코사민에 선호적으로 결합하는 바이오티닐화된 LCA, WGA, ConA, 및 GSII으로 블랏팅하였다. 동일한 항체는 도 9b에서 “CHO”로 표시된, 기준이 되는 부모계 CHO-K1 세포에서 발현되었다.

결과에서, 클론 1E5 에 의해 생산된 항체들은 기준과 비교하였을 때, LCA, WGA, GSII에 대해 상당히 감소된 결합 친화력과, ConA에 대해 증가된 결합 친화력을 가진 다양한 글리코실화 패턴을 보유하도록 변형되었다는 것을 알 수 있다(도 9b). 결과는 항체들의 퓨코스 함량이 급격히 감소되었다는 것을 나타낸다.

도 10a, b에서 볼 수 있는 것과 같이, 상이한 CHO 계에 의해 생산된 항체들 ET101 및 ET201l의 모노사카라이드 프로파일 또한 결정되었다. 항체 ET101 또는ET201는 부모계 CHO 세포, 돌연변이체 CHO-1E5 클론, 돌연변이체 CHO-3F 클론, 또는 돌연변이체 CHO-2.6 클론에서 생산되었다. 모든 CHO 클론은 현탁액에서 무혈청 배지에서 성장하도록 개조되었다. 4 M 트리플루오르아세트산으로, 100℃에서, 2시간 동안 가열하면, 항체 ET101 및 ET201 1mg으로부터 모노사카라이드가 방출되었다. 모노사카라이드들을 진공하에서 건조하였고, 물로 재구성하였다. DXISC3000 시스템 (DIONEX, Sunnyvale, CA)을 이용한 고성능 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 모노사카라이드를 분석하였다. CarboPacPA1 칼럼(DIONEX, Sunnyvale, CA)을 이용하여 35℃에서 분당 0.8㎖의 유속으로 모노사카라이드를 해리하였다. 샘플 주입후, 20분간 18 mM NaOH으로 모노사카라이드를 해리하였고, 10분간 200 mM NaOH으로 용리시켜 컬럼을 재생시켰다. 다음 주입 전, 컬럼에 18 mM NaOH을 30분간 유지시켰다. 부모계 CHO 및 돌연변이체 클론에의해 만들어진 ER101에서 모노사카라이드의 양은 도 10a에 나타낸다. 부모계 CHO 세포 및 돌연변이체 클론에 의해 만들어지는 인간 IgG1 (ET101 및 ET201)의 모노사카라이드 조성물은 도 10b에 나타내는데, 부모계 세포에 의해 만들어진 것과 비교하였을 때, 돌연변이체 클론에서 생산된 IgG1에서 갈락토즈 수준은 감소되었고, 글루코즈 수준은 증가된 것을 볼 수 있다.

도 10c에는 YamaneOhnuki et al ., Biotechnol . Biogeng . 87:614622 (2004)에서 설명된 Fut8-/-녹아웃 CHO 세포에 의해 생산된 인간 IgG1 세포의 모노사카라이드 조성물 분석을 나타내는데, 야생형 및 Fut8-/-녹아웃 CHO 세포 간에 갈락토즈 및 글루코즈 수준은 상대적으로 일정하다는 것을 보여준다.

실시예 5: 강화된 ADCC 활성을 가진 항체

세포계에서 합성된 Erb-차단 항체는 강화된 ADCC 활성을 가진다는 것을 설명하기 위하여, 돌연변이체 클론에서 다양한 글리코실화 패턴을 가진 인간화된 항-ErbB2 항체를 발현시켜, 부모계 세포에서 생산된 항체와 비교하였다. 강화된 ADCC 활성을 설명하기 위하여, A549, SKBR3, SKOV3, MDA-MB-361, 및 MDA-MB-231 세포의 항체-매개된 용해를 평가하여 세포 독성을 비교하였다. 표적 세포들을 클론 1E5, 2.6, 또는 3F으로부터 생산된 ErbB2-차단 항체들 (ET101 또는 ET201)과 항온처리시켜, 항체들이 이의 표적에 결합하도록 하였다. 그 다음 인간 PBMC을 표적 세포와 항온처리시켰다. 도 11b, 12, 13, 및 14에서 볼 수 있는 것과 같이, 기준 항체는 예상했던 것과 같이 세포 용해를 유도할 수 있고, 그리고 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포에 의해 생산된 항체는 세포 용해를 상당히 강화시켰으며, 이는 다양한 글리코실화 패턴화된 세포계-생산된 항체에 의해 ADCC 효과가 강화된다는 것을 나타낸다.

도 11a에서 볼 수 있는 것과 같이, 10% FBS를 포함하는 조건화 배지 1㎖로부터 발현된 항체 ET101을 단백질 L 비드로 침전시키고, 환원 SDS-PAGE 겔로 분리하고, Coomassie 블루로 착색하였다. 빈(blank) 성장 배지는 네가티브 기준으로 이용하였다. 돌연변이체 클론에서 발현된 ET101 항체는 단백질 L 크로마토그라피를 이용하여 10% FBS를 포함하는 조건화 배지로부터 정제하였고, 그리고 UV280에 의해 정량화하였다. 부모계 ET101는 야생형 CHO에서 발현되었고, 동일한 방법으로 정제하였다. ET201를 얻기 위하여 동일한 방법이 이용되었다.

도 11b, 12, 13, 및 14에서 나타낸 바와 같이, ADCC 분석을 위하여, 돌연변이체 클론에서 발현된 ET101 또는 ET201 항체를 단백질 A 크로마토그라피를 이용하여 조건화 배지로부터 정제하였고, 그리고 UV280에 의해 정량화하였다. 부모계 ET101 또는 ET201은 야생형 CHO에서 발현되었고, 동일한 방법으로 정제하였다. 96 웰 플레이트, 37℃에서 30분간 100 ㎕의 표적 세포 현탁액을 50㎕의 발현된 ErbB2-차단 항체 ET101로 사전-항온처리하였다. 그 다음 50㎕의 PBMCs을 효과물질/표적 세포 20:1의 비율로 첨가하였다. 16시간 항온처리한 후, 플레이트를 스핀 다운시키고, 50㎕의 세포없는 상층액을 새로운 플레이트로 옮겼다. CytoTox96 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 방출된 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 측정하였다. 식 (E-S)/(M-S) (E: 실험적 방출, S: 자발적 방출, M: 최대 방출)으로 세포 용해를 계산하였다. 네가티브 기준으로 PBS 또는 비-특이적 항체가 이용되었다.

실시예 6: 항체는 세포 증식을 억제한다.

실시간 증식 분석을 위하여 96 웰 플레이트에 또는 콜로니 형성 분석을 위하여 저밀도에서 24 웰 플레이트에 ErbB2-과다발현 유방암 세포계 SKBR3를 도말한다. 세포가 하룻밤동안 부착되도록 한 후, 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포 클론으로부터 생산된 다양한 항체들과 기준 항체를 다양한 농도로 배지에 첨가하여 세포 증식에 대한 이들의 억제 능력을 테스트한다. 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포 클론으로부터 생산된 ErbB2 차단 항체들은 기준 항체(부모계 세포에 의해 생산된 항체)와 필적하는 수준 또는 그 이상으로 세포 증식을 억제시킨다. 세포 증식 억제는 콜로니 형성 분석, 실시간 증식 분석 또는 본 기술분야에 공지된 다른 방법들과 같은 방법에 의해 확인된다.

실시예 7: N-글리칸 의 조성물 및 구조 결정

N-글리칸의 모노사카라이드 성분들을 결정하기 위하여, 무혈청 현탁액에서 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체와 부모계 숙주 세포에 의해 생산된 항체들을 트리플루오르아세트산 (TFA)으로 가수분해하였다. TFA의 최종 농도가 4M이 되도록 정제된 항체들 (100 ㎍)을 트리플루오르아세트산 (TFA)와 혼합시켰다. 혼합물을 2시간 동안 가열시키고, 용액은 진공에서 건조시켰다. 펠렛을 200㎕ 탈이온수에 용해시켰다. 100 ㎕의 재현탁된 샘플을 PA1 컬럼에 주입하여 Dionex ICS3000 시스템 (Dionex, Sunnyvale, CA)을 이용하여 모노사카라이드의 조성물을 분석하였다. 도 16에서 볼 수 있는 것과 같이, CHO-1E5에서 합성된 N-글리칸은 야생형 부모계 숙주 세포에서 생산된 N-글리칸과 비교하였을 때, 갈락토즈는 없고, 퓨코스와 N-아세틸글루코사민은 감소되었으며, 글루코즈 분자를 가지고 있다.

본 발명의 N-글리칸의 조성물을 추가 확인하기 위하여, CHO-1E5 및 이의 부모계 숙주 세포에서 생산된 항체들로부터 PNGase F (New England Biolabs, Ipswich, MA)를 이용하여 N-글리칸을 잘라내었다. 37℃에서, 72시간 동안 PNGase F로 항체 200㎍을 절단함으로써 N-글리칸이 방출되었다. -20℃에서 하룻밤동안 70% 에탄올로 단백질을 침전시켰고, 원심분리를 통하여 분리시켰다. 상청액을 진공에서 건조시켰고, 200㎕ 탈이온수로 재현탁시켰다. 시료는 C18, AG50WX8 및 AG4x4 (BioRad Laboratories , Hercules , CA)로 채워진 마이크로컬럼에 로딩하였고(Waters , Milford , MA), 그 다음 컬럼을 300㎕ 탈이온수로 씻어내었다. 통과유체(flowthrough)를 수거하고, 진공에서 건조시키고, MALDI-TOF MS 분광계를 이용하여 MALDI-TOF MS에 대해 N-글리칸을 분석하였다. m/z 값은 나트륨-연합된 올리고사카라이드 이온에 대응한다. 각 피크는 [M+Na]⁺에 대응한다. 부모계 세포에 의해 생산되는 항체의 N-글리칸에서 두 개 피크가 관찰되었는데, G1 (Gal₁-Fuc₁-GlcNAC₄-Man₃) 및 G0 (Fuc₁GlcNAC₄Man₃) N-글리칸의 질량에 상응한다 (도 17). 대조적으로, CHO-1E5 세포에서 합성된 항체의 N-글리칸은 1257.4 질량의 단일 피크를 가진다(도 17). 모노사카라이드의 조성물과 복합하여 (도 16), CHO-1E5에 의해 합성된 N-글리칸 분자 조성물은 Glu-GlcNAC₂-Man₄ (+/-Fuc)으로 결정되었다.

CHO-1E5에 의해 합성된 N-글리칸을 단일 집단은 올리고사카라이드 분석으로 추가 확인되었다. 항체로부터 N-글리칸이 방출되었고, MALDI-TOF MS 분석을 위하여 정제되었다. 간략하게 설명하면, 37℃에서, 72시간 동안 PNGase F로 항체 200㎍을 절단함으로써 N-글리칸이 방출되었다. -20℃에서 하룻밤동안 70% 에탄올로 단백질을 침전시켰고, 원심분리를 통하여 분리시켰다. 상청액을 진공에서 건조시켰고, 200㎕ 탈이온수로 재현탁시켰다. 시료는 C18, AG50WX8 및 AG4x4으로 채워진 마이크로컬럼에 로딩하였다. 그 다음 컬럼을 300㎕ 탈이온수로 씻어내었다. 통과유체를 수거하고, 올리고사카라이드를 PA200 컬럼에 주입하였고, Dionex ICS-3000 시스템으로 분석하였다. MALDI-TOF MS 분석에서 얻은 발견과 일관되게, CHO-1E5에 의해 생산된 항체의 올리고사카라이드는 단일 피크를 나타내고, 부모계 숙주 세포에 의해 생산되는 올리고사카라이드의 이질성 프로파일과는 상이하게, 실질적으로 균질한 집단을 나타낸다(도 18).

CHO-1E5에 의해 합성된 N-글리칸의 분자량과 모노사카라이드의 조성물에 근거하여, N-글리칸의 6가지 가능한 구조를 유추하였다(도 19a 및 b). CHO-1E5에 의해 합성된 N-글리칸 구조를 추가 확인하기 위하여, 상이한 만노시다제를 이용하여 항체에 있는 N-글리칸을 절단하였고, 방출된 사카라이드를 PA1 컬럼/ Dionex ICS3000 시스템으로 분석하였다. α1,2 만노시다제 (Prozyme, San Leandro, CA)를 이용하여 CHO-1E5 및 부모계 숙주 세포에 의해 합성된 N-글리칸을 절단하여, 만노즈 사이에 α1,2 결합이 있는지를 확인하였다. α1,2 만노즈 결합은 야생형 CHO 세포에 의해 만들어진 N-글리칸에는 존재하지 않는다고 확인된다. α1,2 만노시다제로 절단후 항체들로부터 사카라이드 방출은 없었는데, 이것은 CHO-1E5에 의해 합성된 N-글리칸에는 α1,2 만노즈 결합이 없다는 것을 말한다. 효소 활성은 포지티브 기준(올리고만노즈 9, Prozyme, San Leandro , CA)으로 확인되었다. 그 다음 또 다른, α1,2,3-만노시다제 (New England Biolabs , Ipswich , MA)를 이용하여 항체로부터 N-글리칸을 잘라내었고, 방출된 사카라이드 프로파일을 분석하였다. 야생형 CHO 세포에 의해 합성된 N-글리칸의 고전적 구조에 기초하여, α1,3 만노즈 결합에서 유일한 한 군데 절단 부위가 있고, 그리고 이 효소는 디사카라이드 또는 트리사카라이드를 방출할 수 있다는 것이 합당하였다(도 20A). CHO-1E5 및 부모계 숙주 세포에 의해 합성된 항체들(ET101)을 24시간 동안 37℃에서 α12,3 만노시다제로 항온처리하였다. 항체 및 효소를 제거하기 위하여, 절단된 항체 용액을 우선 MicroCon YM10 (Millipore, Billerica, MA)을 통과시키고, 그 다음 MicroCon YM100 (Millipore, Billerica, MA)을 통과시켰다. PA1 컬럼/Dionex ICS3000 시스템을 이용하여 시료를 분석하였다. 도 20b 및 C에서 볼 수 있는 것과 같이, 18 mM NaOH에 의해 모노사카라이드가 용리되지 않았고, 그리고 90 mM NaOH으로 용리시켰을 때 디사카라이드(슈크로즈)의 용리 시간에 대응하는 피크가 나타났다. CHO-1E5에의해 생산된 항체의 N-글리칸을 α12,3 만노시다제으로 절단하였을 때, 만노즈는 18 mM NaOH에 의해 용리되었고, 디사카라이드는 90 mM NaOH에 의해 용리되었다(도 6d 및 6e). α1,2 만노즈 결합의 부제와 α1, 2, 3 만노시다제에 의한 CHO-1E5-생산된 항체로부터 사카라이드 프로파일에 의해 α1, 2, 3 만노시다제에 의한 절단 프로파일과 일치되는 두 가지 구조가 제안된다(도 20f 및 20g).

실시예 8: N-글리칸 은 항체 어셈블리에 영향을 주지 않는다.

단백질 글리코실화의 변화는 단백질 폴딩 및 기능적 어셈블리에 영향을 줄 수 있기 때문에, 이 문제는 SDS-PAGE 전기영동에서 항체를 분리시켜 처리하였다. 부모계 숙주 세포 및 CHO-1E5에 의해 생산되는 정제된 항체들을 변성 및 비-변성 조건하에 SDS-PAGE 전기영동을 하였고, Coomassie Blue로 착색시켰다. 도 21에서 볼 수 있는 것과 같이, CHO-1E5에 의해 합성된 모노머(경쇄 및 중쇄 모두)와 전체 항체의 이동은 변성 및 비-변성 조건하에서 부모계 숙주 세포에 의해 생산된 항체들과 동일하였고, 이것은 CHO-1E5 세포에 의해 생산되는 N-글리칸이 생산된 항체의 기능적 어셈블리를 간섭하지 않는다는 것을 말한다.

실시예 9: 강화된 ADCC 활성과 Fc γ RIIIa 에 대해 높은 결합 친화력을 가진 항체

본 발명의 N-글리칸을 가진 항체의 변형이 ADCC 활성화같은 생물학적 기능을 개선시킬 수 있는 지를 결정하기 위하여, ErbB2 및 EGFR을 표적하는 두 가지 정제된 항체를 이용하여 이들의 각 시험관 ADCC 활성(차례로 ET101 및 ET201)을 테스트하였다. ET101 항체는 ErbB2-차단 IgG1이다. CHO-1E5 세포에 의해 생산된 ET101은 단백질 A 크로마토그라피에 의해 조건화 배지로부터 정제하였고; 그리고 UV280을 이용하여 정량화하였다. 변형안된 부모계 ET101는 야생형 CHO 세포에서 발현되었으며, 동일한 방법으로 정제하였다. ADCC 분석을 위하여, 96 웰 플레이트, 37℃에서 30분간 100 ㎕의 표적 세포 현탁액을 50㎕의 발현된 ErbB2-차단 항체 ET101로 사전-항온처리하였다. 그 다음 50㎕의 PBMCs을 효과물질/표적 세포 20:1의 비율로 첨가하였다. 16시간 항온처리한 후, 플레이트를 스핀 다운시키고, 50㎕의 세포없는 상층액을 새로운 플레이트로 옮겼다. CytoTox96 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 방출된 LDH를 측정하였다. 식 (E-S)/(M-S) (E: 실험적 방출, S: 자발적 방출, M: 최대 방출)으로 세포 용해를 계산하였다. 네가티브 기준으로 PBS 또는 비-특이적 항체가 이용되었다. 난소암 세포계 (SKOV3) 및 유방암 세포계 (MDA-MB-231)에 대항하여 무혈청 배지에서 CHO-1E5 세포 클론에 의해 생산된 N-글리칸을 나타내는 ET101의 ADCC 활성은 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 변형안된 ET101의 것과 비교하였을 때 상당히 강화되었다 (도 22A).

ET201은 항-EGFR 항체다. CHO-1E5 세포에서 발현된 ET201은 단백질 A 크로마토그라피에 의해 조건화 배지로부터 정제하였고; 그리고 UV280을 이용하여 정량화하였다. 도 8a에서 설명된 것과 동일한 방법을 이용하여 ADCC 분석을 실행하였다. 폐암 세포계 (A549)에 대항하여 무혈청 배지에서 CHO-1E5 세포 클론에 의해 생산된 N-글리칸을 나타내는 ET201의 ADCC 활성은 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 변형안된 ET101의 것과 비교하였을 때 강화되었다(도 22B).

본 발명의 N-글리칸이 어떻게 ADCC 활성을 개선시키는 지를 추가 확인하기 위하여, 재조합 FcγRIa 및 FcγRIIIa (R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 ForteBio System (ForteBio, Menlo Park, CA)을 이용하여 이들 두 가지 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화력을 측정하였다. 항체들을 우선 바이오티닐화시키고, 스트렙타아비딘피복된 바이오센서상에 로딩하였다(ForteBio, Menlo Park, CA). 재조합 FcγRI 및 FcγRIIIb 단백질을 100-400 nM (R&D Systems, Minneapolis, MN)의 농도에서 현탁시켰다. 결합 친화력 (KD, nM)은 ForteBio의 표준 역학 프로토콜에 따라 평가되었다. CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체는 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 항체와 비교하였을 때, FcγRIIIa에 대해 증가된 결합 친화력을 가지고 있었지만, FcγRIa에 대한 결합에서 유의적인 차이는 없었다(도 23). 이들 결과는 여기에서 설명되는 조성물 및 구조를 가진 N-글리칸에 의한 단백질 글리코실화는 항체에게 FcγRIIIa에 개선된 결합 친화력과 강화된 ADCC 활성을 부여한다는 것을 나타낸다.

실시예 10: N-글리칸 을 나타내는 항체의 약동학

CHO-1E5 세포에 의해 합성된 N-글리칸에 의한 글리코실화가 생체내에서 항체의 약동학에 영향을 줄 수 있는 지를 추가 결정하기 위하여, 부모계 숙주 세포 또는 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체들을 10 mg/kg의 농도에서 13주령의 암컷 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥을 통하여, 각 항체를 3마리 마우스에게 주사하였다. 5 분, 1시간, 6시간, 72시간 및 120 시간 시점에 50㎕ 혈액을 채취하였다. 주사후 1시간, 6시간, 72시간 및 120 시간 시점에 항체들의 혈청 농도를 모니터하였다. 혈청에 항체 농도는 OCTET (Fort, Menlo Park, CA)을 이용하여 측정하였다. 5 분 시점에서 항체 농도를 100%로 간주하였다. CHO-1E5-생산된 항체의 약동학은 부모계 숙주 세포에 의해 생산된 항체의 약동학에 필적하고 (도 24), 이는 생체내 항체의 약동학에 본 발명의 N-글리칸이 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 11: CHO-1E5에 의해 생산된 올리고사카라이드의 추가 구조 분석

1E5 세포에 의해 합성된 N-글리칸의 구조를 추가 확인하기 위하여, PNGase F에 의해 방출된 고품질 N-글리칸을 대규모로 정제시켰고, 정제된 N-글리칸 및 포지티브 기준(Oligimannose 9, Glyko, San Leandro, CA)을 α1,2,3 만노시다제 또는 α1,2,3,6 만노시다제로 절단하였으며, 절단 산물들은 PA1 컬럼 및 Dionex ICS3000 시스템 (Dionex, Sunnyvale, CA)을 이용하여 분석하였다.

1E5 (A 및 C)에 의해 합성된 항체들(ET101)과 포지티브 기준 N-글리칸 (B 및 D)(올리고만노즈 9, Glyko, San Leandro , CA)을 24시간 동안 37℃에서 α1,2,3 만노시다제 (A 및 B) 또는 α1,2,3,6 만노시다제 (C 및 D)로 항온처리하였다. 항체 및 효소를 제거하기 위하여, 절단된 항체 용액을 우선 C18, AG50WX8 및 AG4x4으로 채워진 마이크로컬럼을 통과시켰다. 그 다음 컬럼은 300㎕ 탈이온수로 세척하였다. 통과 유체를 수거하였고, 진공하에서 건조시키고, PA1 컬럼/Dionex ICS3000 시스템으로 분석하였다.

절단 산물을 18 mM NaOH으로 용리시켰을 때 두 개 피크가 관찰되었다. 1개 피크는 17분 시점에 있었고, 이는 만노즈 표준 용리 시간에 상응한다. 또 다른 피크는 24분 시점에 있었고, 이는 디사카라이드 표준과 유사하다(도 25A). α1,2,3 만노시다제에 의한 절단 패턴은 두 개 구조, 여기에서 설명된 구조 1과 2의 예측과 일치하며, 다른 가상 구조의 가능성은 배제되는데, 그 이유는 α1,2,3 만노시다제 절단에 의해 방출될 것으로 예측되는 만노즈는 없기 때문이다. α1,2,3 만노시다제에 의한 올리고만노즈 9 절단 산물은 예측과 일치하였다(도 25b). α1,2,3,6 만노시다제로 절단하였을 때, 만노즈, 디사카라이드, 및 트리사카라이드 표준에 대응하는 3개 피크가 18 mM NaOH에 의해 용리되었다(도 25c). α1,2,3,6 만노시다제에 의한 절단 패턴 또한 구조식 1 및 2의 예측과 일치하였다 (도 25c). 이들 데이터는 또한 구조식 1 과 2가 1E5 세포에 의해 합성되는 N-글리칸의 최종 두 가지 후보 구조라는 것을 확인시킨다. 이들 두 가지 구조를 구별하는데 이용할 수 있는 방법은 현재까지는 없다.

실시예 12: 저친화력 Fc γ RIIIa 158 F/F를 발현시키는 세포에 대항하는 강화된 ADCC

인간 FCγR IIIa는 아미노산 158에서 다형성을 가진다. 두 개 대립유전자에서 아미노산 158이 발린인 경우, FCγR IIIa는 IgG의 Fc 단편(FCγR IIIa 158V/V)에 고친화력를 가진다. 아미노산 158에서 페닐알라닌-캐리어인 경우, IgG의 Fc 단편에 대한 FCγR IIIa(FCγR IIIa 158F/F 또는 158F/V)의 결합 친화력은 낮다. ADCC 활성은 Fc 단편과의 FCγR IIIa 결합 친화력과 명확하게 관련된다. ADCC 분석에 이용된 PBMCs의 FCγR IIIa 다형성은 이미 보여진 것과 같이 유전자형화되었다.

ADCC 분석을 위하여, 96 웰 플레이트, 37℃에서 30분간 100 ㎕의 표적 세포 현탁액을 50㎕의 발현된 ErbB2-차단 항체 ET101로 사전-항온처리하였다. 그 다음 50㎕의 PBMCs을 효과물질/표적 세포 20:1의 비율로 첨가하였다. 16시간 항온처리한 후, 플레이트를 스핀 다운시키고, 50㎕의 세포없는 상층액을 새로운 플레이트로 옮겼다. CytoTox96 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI)을 이용하여 방출된 LDH를 측정하였다. 식 (E-S)/(M-S) (E: 실험적 방출, S: 자발적 방출, M: 최대 방출)으로 세포 용해를 계산하였다. 네가티브 기준으로 PBS 또는 비-특이적 항체가 이용되었다. ADCC 분석에 이용된 PMBCs로부터 게놈 DNA를 분리하였다. FcγR IIIa의 다형성의 유전자형 분석을 위한 PCR 분석은 본 기술 분야의 표준 프로토콜에 따른다. 난소암 세포계 (SKOV3) 및 유방암 세포계 (MDA-MB-231)에 대해 ADCC 활성을 측정되었다. CHO-1E5 세포에 의해 생산되는 독특한 N-글리칸을 발현시키는 항체는 고친화력 FCγR IIIa 158V/V 또는 저친화력 FCγR IIIa 158F/F를 발현시키는 상이한 유전적 배경의 PBMCs가 효과물질 세포로 이용되었을 때, 효과적으로 동등한 ADCC 활성을 강화시키는 것으로 발견되었다 (도 26a 및 26b). CHO-1E5 세포에 의해 생산된 ET101 세포는 균등하게 저친화력 FCγR IIIa 158F/F에 결합하였고, 강력한 ADCC 반응을 유도하였다.

실시예 13: 1 E5 세포에 의해 생산된 항체는 부모계 항체와 비교하였을 때, FcgRIIIa에 더 높은 결합 친화력을 나타내고, FC γR IIb 에 대해 더 낮은 결합 친화력을 나타낸다 .

ADCC는 세포 표면 항원을 표적으로 하는 특이적 항체가 세포에 우선 결합하고, 이 항체의 Fc 단편은 효과물질 세포의 세포 표면에서 발현되는 Fc 수용체에 Fc 결합을 통하여 천연 킬러 세포 및 단핵 세포와 같은 효과물질 세포를 표적 세포로 모집하는 프로세스다. 모집은 효과물질 세포에 의한 표적 세포를 사멸시키기 위하여 표적과 효과물질 세포를 근접하게 한다. Fc 수용체(FCγR)는 세 가지 유형 I, II 및 III으로 구성된다. FCγR Ia, FCγR IIa 및 FCγR IIIa는 활성화되었을 때 ADCC를 중재하고 강화시키는 활성화 수용체다. FCγR IIb는 활성화되었을 때 ADCC를 차단시키는 억제성 수용체다. FCγR Ia, FCγR IIa 또는 FCγR IIIa에 고친화력을 가지는 항체는 ADCC 활성을 강화시킨다. 그러나, FCγR IIb에 고친화력 항체는 반대로 ADCC 활성을 억제시킬 수 있다(도 27).

1E5 세포에 의해 생산되는 항체에 의한 강화된 ADCC 활성의 기전을 결정하기 위하여, FCγRs에 대한 항체의 결합 친화력을 평가하였다. 인간의 전장 FcgRIIIA 및 FcgRIIb를 발현 벡터내로 클론시키고, 그리고 CHO-K1 세포에서 안정적으로 발현시켰다. 20 mM EDTA/PBS에 의해 조직 배양 접시로부터 세포들이 방출되고, 그리고 단일 세포로 분배되었다. 30분간 얼음위에서 5% FBS와 PBS에서 10 ㎍/ml 농도의 바이오티닐화된 항체로 세포를 항온처리하였다. PBS로 세포를 3회 세척한 후, FITC-콘쥬게이트된 스트렙타아비딘으로 세포를 항온처리하고, FACS으로 분석하고, 평균 형광 강도(MFI)를 수득하였다. 억제성 FcgRIIb (A)과 활성화 FcgRIIIA (B) (10 ㎍/ml)과의 항체 결합 친화력 및 기계적인 도식(mechanistic schemes)을 나타내고 있다.

세포 표면상에서 FCγRIIb 및 FCγR IIIa 158 (V/V 유형고친화력)을 포함하는 인간 Fcγ 수용체를 안정적으로 발현시키는 CHO-K1 세포계가 확립되었다. FACS 방법을 이용하여, 부모계 CHO 세포 및 1E5 세포에 의해 생산된 항체들의 이들 Fcγ 수용체와의 결합 친화력은 평균 형광 강도(MFI)를 정량화함으로써 측정되었다. 1E5 세포에 의해 생산된 항체는 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 항체와 비교하였을 때, 억제성 수용체, FCγR IIb와 상당히 감소된 결합 친화력을 가진다(도 27a 및 도 28)는 것이 밝혀졌고, 이는 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체에 의해 억제성 수용체가 훨씬 적게 활성화된다는 것을 제시한다. 더욱이, 1E5 세포에 의해 생산되는 항체는 활성화 FCγR IIIa에 대해 상당히 증가된 결합 친화력을 보유하였다(도 27b 및 도 28). 1E5 세포에 의해 생산된 항체는 FCγRI 및 IgG에 대한 신생 Fc 수용체(FcRN)에 대해 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 항체와 필적되는 결합 친화력을 보유하였다(도 28). 이와 같은 결과로부터 1E5-생산된 항체에 의한 강화된 ADCC 활성은 활성화 FCγRIIIa의 증가된 활성 및 억제성 FCγR의 감소된 활성에 의해 매개된다는 기전을 제시한다.

실시예 14: CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체의 면역원성

변형안된 부모계 CHO 세포에 의해 생산된 항체의 ADCC 활성과 비교하였을 때 강화된 ADCC 활성을 나타내는 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 항체의 면역원성을 평가하기 위하여, 해당 항체들의 생체내 면역원성은 영장류에서 해당 항체들에 대항하는 항체 특이적 역가를 측정함으로써 평가된다. 특이적으로, 46 kg 체중, 3-5년령의 필리핀(cynomolgus) 암컷 원숭이에게 야생형 CHO 세포에 의해 생산된 항-Her2 항체 ET101, 또는 CHO-1E5 세포에 의해 생산된 ET101를 체중당 8 mg/ml/kg양으로 제공하였다. 각 군은 두 마리 원숭이를 포함한다. 항체 주사전 그리고 항체 주사후 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 시점에 0.5㎖의 혈액을 채혈한다. 혈청 시료를 분리하여, 80℃에 냉동시켰다(도 29a). ELISA를 이용하여 필리핀 원숭이에서 ET101-CHO-1E5 항체의 면역원성을 결정한다. 분석에서 투여된 ET101 항체들에 특이적인 원숭이 혈청에서 IgM 존재를 탐지한다. ELISA 플레이트는 ET101-CHO 또는 ET101-CHO-1E5 항체들로 피복시킨다. 상이한 희석에서 분리된 원숭이 혈청 시료를 피복된 플레이트에 제공하여 피복된 ET101-CHO 또는 ET101-CHO-1E5 항체들에게 결합을 허용한다. 결합된 IgM은 항-IgM 2차 항체로 탐지된다(도 29b). ELISA 결과에서 ET101-CHO 및 ET101-CHO-1E5 항체들 사이에 면역원성의 차이(가령, 원숭이 혈청에서 ET101-특이적 IgM 수준)는 없었다((도 29c). 이 실시예는 CHO-1E5 클론에 의해 생산된 항체는 야생형 CHO 세포에 의해 생산된 항체보다 더 높은 면역원성을 유도하지 않는다는 것을 설명한다.

본 내용은 상기 설명된 구체예에 제한되지 않으며, 첨부된 청구범위 범위내에서 변형이 가능하다. 당업자는 통상적인 실험으로 이용하여 여기에서 설명된 특정 구체예에 대한 많은 등가물을 인지할 수 있거나 또는 확인할 수 있을 것이다.

Claims (82)

1. 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 변형된 당단백질에 있어서, 이때 다양한 글리코실화 패턴은 대응하는 야생형 당단백질과 비교하였을 때 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자의 수준에서 변화를 특징으로 하는 당단백질.
2. 청구항 1 항에 있어서, 상기 다양한 글리코실화 패턴은 글루코즈, 갈락토즈, 또는 이들 모두의 수준의 변화로 증명되는, 당단백질.
3. 청구항 1 항에 있어서, 갈락토즈 수준의 변화는 감소된, 당단백질.
4. 청구항 1 항에 있어서, 글루코즈 수준의 변화는 증가된, 당단백질.
5. 청구항 1 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 글루코즈 수준은 증가, 갈락토즈 수준은 감소, 그리고 퓨코스 수준은 감소에 의해 증명되는, 당단백질.
6. 청구항 1 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 말단 글루코즈 모이어티에 의해 증명되는, 당단백질.
7. 청구항 1 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 구조식 (I) 또는 (II)를 가지는 N-링크된 글리칸을 포함하는, 당단백질:
   

   
8. 변형된 숙주 세포에 의해 생산된 항체에 있어서, 항체는 N-링크된 글리칸을 포함하며, 이때 항체는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산된 대응 항체와 비교하였을 때, Fc 감마 수용체IIIa (FcgRIIIa)에 대해 증가된 결합 친화력을 가지며, 및/또는 Fc 감마 수용체IIb (FcgRIIb)에 대해 감소된 결합 친화력을 가지며, 이에 의해 FcgRIIIa 및/또는 FcgRIIb를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하여 ADCC(항체의존성 세포매개된 세포독성) 활성이 강화된 것을 특징으로 하는 항체.
9. 변형된 숙주 세포에 의해 생산된 항체에 있어서, 항체는 N-링크된 글리칸을 포함하고, 이때 항체는 대응하는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산된 대응하는 항체와 비교하였을 때, 증가된 ADCC 활성을 나타내고, 그리고 증가된 ADCC 활성은 고친화력 Fc 감마 수용체, FcgRIIIa 158V/V를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하고, 그리고 저친화력 Fc 감마 수용체, FcgRIIIa 158F/F 또는 FcgRIIIa 158F/V를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하는 것을 특징으로 하는, 항체.
10. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, N-링크된 글리칸은 한 개의 글루코즈 분자, 네개의 만노즈 분자, 그리고 두 개의 N-아세틸글리코자민 분자를 포함하는, 항체.
11. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, N-링크된 글리칸은 하나 이상의 퓨코스 분자를 포함하는, 항체.
12. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, N-링크된 글리칸은 구조식 (I) 또는 (II)를 가지는, 항체:
    

    
13. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 N-링크된 글리칸은 항체의 Fc 부위에 부착되는, 항체
14. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 항체는 암 항원에 결합되는, 항체.
15. 청구항 14 항에 있어서, 암 항원은 HER2, 면역글로블린 입실론 Fc 수용체II, Alk1,CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA4, 무친 1, 무친 16, 엔도글린, 메소테린 수용체, 노고 수용체, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 강글리오시드 GD3, 및 알파 및 베타 인테그린으로 구성된 군으로부터 선택된, 항체.
16. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 항체는 억제성 항체가 되는, 항체.
17. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 항체는 IgG 항체가 되는, 항체.
18. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL-61 및 CRL-9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 생산된 대응하는 항체와 비교하였을 때, 저친화력 FcR, FcgRIIIa 158F/F 또는 FcgRIIIa 158 F/V을 발현시키는 효과물질 세포에 대항하여 강화된 ADCC (항체의존성 세포매개된 세포독성) 활성을 보유하는, 항체.
19. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL-61 및 CRL-9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 생산된 대응하는 항체와 비교하였을 때, 고친화력 FcR, FcgRIIIa 158V/V를 발현시키는 효과물질 세포에 대항하여 증가된 ADCC (항체의존성 세포매개된 세포독성) 활성을 보유하는, 항체.
20. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포가 되는, 항체.
21. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 숙주 세포는 NS0, SP2/0, HEK-293, PER.C6 및 YB2/0 세포로 구성된 군으로부터 선택된, 항체.
22. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 숙주 세포는 골수종 세포가 되는, 항체.
23. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 효과물질 세포는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)가 되는, 항체.
24. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 항체는 항-Her2 항체가 되는, 항체.
25. 청구항 8항 또는 9 항에 있어서, 이때 효과물질 세포는 NK 세포, 단핵세포, 대식세포, 또는 다핵성 호중구 (PMN)가 되는, 항체.
26. 한 개의 글루코즈 분자, 네 개의 만노즈 분자, 그리고 두 개의 N-아세틸글리코자민 분자를 포함하는 N-링크된 글리칸.
27. 청구항 26 항에 있어서, 이때 글루코즈는 N-링크된 글리칸의 말단에 위치하며, N-링크된 글리칸은 선택적으로 하나 이상의 퓨코스 분자를 포함하는, N-링크된 글리칸.
28. 청구항 26 항에 있어서, 구조식 (I)을 가지는, N-링크된 글리칸.
    

    
29. 청구항 26 항에 있어서, 구조식 (II)을 가지는, N-링크된 글리칸.
    

    
30. 청구항 26-29중 임의의 하나에 따른 N-글리칸을 포함하는 분리된 당단백질.
31. 청구항 30 항에 있어서, 당단백질은 항체가 되는, 당단백질.
32. 청구항 30 항에 있어서, 당단백질은 효소가 되는, 당단백질.
33. 청구항 31 항에 있어서, N-링크된 글리칸은 항체의 Fc 부위에 부착되는, 당단백질.
34. 청구항 31 항에 있어서, 이때 항체는 암 항원에 결합되는, 당단백질.
35. 청구항 34 항에 있어서, 이때 암 항원은 HER2, 면역글로블린 입실론 Fc 수용체II, Alk1, CD20, EGF 수용체, VEGF 수용체, FGF 수용체, NGF 수용체, PDGF 수용체, EpCam, CD3, CD4, CD11a, CD19, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD51, CD55, CD80, CD95, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CTLA4, 무친 1, 무친 16, 엔도글린, 메소테린 수용체, 노고 수용체, 엽산 수용체, CXCR4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 강글리오시드 GD3, 및 알파 및 베타 인테그린으로 구성된 군으로부터 선택된, 당단백질.
36. 청구항 31 항에 있어서, 이때 항체는 실질적으로 균일한 N-링크된 글리칸 집단을 생산하는 변형된 숙주 세포에 의해 생산되는, 당단백질.
37. 청구항 31 항에 있어서, 이때 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL-61 및 CRL-9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, 증가된 ADCC (항체-의존성 세포성 세포독성) 활성을 가지는, 당단백질.
38. 청구항 31 항에 있어서, 이때 항체는 변형안된 CHO 세포 클론, CHO-K1 (ATCC #CCL-61 및 CRL-9618) 또는 CHO-DG44 (Invitrogen #12609012)에 의해 생산되는 대응하는 항체와 비교하였을 때, FcγRIIIA 수용체에 대한 증가된 결합 친화력을 보유하는, 당단백질.
39. 청구항 31 항에 있어서, 이때 항체는 억제성 항체가 되는, 당단백질.
40. 청구항 31 항에 있어서, 이때 항체는 IgG 항체가 되는, 당단백질.
41. 변형된 당단백질을 생산하는 방법에 있어서:
    (a) 변형된 당단백질을 인코드하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하고; 그리고
    (b) 숙주 세포에서 변형된 당단백질이 발현되도록 하는 것을 포함하며, 이때 숙주 세포는 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 및 글루코사민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 슈가 모이어티의 수준에 변화가 있는 것을 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 가지는 N-링크된 글리칸을 생산하는, 방법.
42. 청구항 41 항에 있어서, 이때 숙주 세포는 무혈청 배지에 유지되는, 방법.
43. 청구항 41 항에 있어서, 이때 숙주 세포는 현탁액 배양물에 유지되는, 방법.
44. 청구항 41 항에 있어서, 이때 변형된 당단백질은 항체가 되는, 방법.
45. 청구항 41 항에 있어서, 이때 숙주 세포는 구조식 (I) 또는 (II)을 가지는 N-링크된 글리칸을 생산하는, 방법.
    

    
46. 다양한 글리코실화 패턴을 가지는 N-링크된 글리칸을 생산하는 변형된 숙주 세포에 있어서, 이때 다양한 글리코실화 패턴은 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하였을 때, 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 및 글루코사민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 슈가 모이어티의 수준의 변화를 특징으로 하는, 변형된 숙주 세포.
47. 청구항 46 항에 있어서, 이때 다양한 글리코실화 패턴은 변형안된 부모계 숙주 세포와 비교하였을 때, 숙주 세포의 표면상에 존재하는 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자의 수준의 변화를 특징으로 하는, 변형된 숙주 세포.
48. 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸을 나타내는 당단백질을 생산하는 분리된 숙주 세포.
49. 청구항 48 항에 있어서, 이때 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸은 질량분석에 의해 해리된 단일 피크로 증명되는, 분리된 숙주 세포.
50. N-링크된 글리칸을 가지는 변형된 항체를 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 변형된 숙주 세포에 있어서, 이때 항체는 변형안된 숙주 세포에 의해 생산된 대응하는 항체와 비교하였을 때, Fc 감마 수용체IIIa (FcgRIIIa)에 대해 증가된 결합 친화력을 나타내고, 및/또는 Fc 감마 수용체IIb (FcgRIIb)에 대해 감소된 결합 친화력을 나타냄으로써, FcgRIIIa 및/또는 FcgRIIb을 발현시키는 효과물질 세포에 대항하여 ADCC (항체의존성 세포매개된 세포독성) 활성을 강화시키는, 변형된 숙주 세포.
51. 청구항 50 항에 있어서, 강화된 ADCC 활성은 고친화력 Fc 감마 수용체, FcgRIIIa 158V/V를 발현시키는 효과물질 세포, 및 저친화력 Fc 감마 수용체, FcgRIIIa 158F/F 또는 FcgRIIIa 158F/V을 발현시키는 효과물질 세포에 대항하는, 변형된 숙주 세포.
52. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 이때 N-링크된 글리칸은 갈락토즈 수준의 감소를 특징으로 하는 다양한 패턴을 나타내는, 변형된 숙주 세포.
53. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 이때 다양한 글리코실화 패턴은 글루코즈 수준의 증가를 특징으로 하는, 변형된 숙주 세포.
54. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 대응하는 변형안된 숙주 세포보다 더 높은 ADCC 활성을 나타내는 항체들을 생산하는, 변형된 숙주 세포.
55. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 이때 다양한 글리코실화 패턴은 말단 글루코즈 모이어티의 존재를 특징으로 하는, 변형된 숙주 세포.
56. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 퓨코스 수준의 감소, 글루코즈 수준의 증가, 및 갈락토즈 수준의 감소를 특징으로 하는, 변형된 숙주 세포.
57. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 이때 N-링크된 패턴은 구조식 I 또는 II를 가지는, 변형된 숙주 세포:
    

    
58. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 이때, 숙주 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포가 되는, 변형된 숙주 세포.
59. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 이때, 세포는 골수종 세포가 되는, 변형된 숙주 세포.
60. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 있어서, 이때 세포는 적어도 약 60회 계대후 다양한 글리코실화 패턴을 유지하는, 변형된 숙주 세포.
61. 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 따른 숙주 세포를 포함하는, 배양물 배지.
62. 무혈청 배양물 배지에서 청구항 46-51 항중 임의의 한 항에 따른 다수의 숙주 세포를 포함하는 배양물 발효기.
63. 다양한 글리코실화 패턴을 가진 진핵 세포를 선택하는 방법에 있어서:
    (a) 다수의 진핵 세포를 제공하고;
    (b) 상기 진핵 세포에 무작위 유전적 돌연변이를 유도하고; 그리고
    (c) 상기 무작위 유전적 돌연변이를 겪지 않은 대응하는 부모계 세포와 비교하였을 때, 적어도 두 가지 유형의 슈가 분자 수준의 변화를 특징으로 하는 다양한 글리코실화 패턴을 나타내는 적어도 하나의 세포를 다수의 세포로부터 분리시키는 단계를 포함하는, 방법.
64. 청구항 63 항에 있어서, 상기 유전적 돌연변이는 화학적 돌연변이 유발요인에 의해 유도되는, 방법.
65. 청구항 63 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 글루코즈, 갈락토즈, 만노즈, 및 글루코사민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 슈가 모이어티 수준의 변화를 특징으로 하는, 방법.
66. 청구항 63 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 갈락토즈 수준의 감소를 특징으로 하는, 방법.
67. 청구항 63 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 D-글루코사민 수준의 감소를 특징으로 하는, 방법.
68. 청구항 63 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 만노즈 수준의 증가를 특징으로 하는, 방법.
69. 청구항 63 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 말단 글루코즈 분자의 존재를 특징으로 하는, 방법.
70. 청구항 63 항에 있어서, 선택된 진핵 세포는 상기 무작위 유전적 돌연변이를 겪지 않은 대응하는 세포보다 더 높은 ADCC 활성을 나타내는 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는, 방법.
71. 청구항 63 항에 있어서, 선택된 진핵 세포는 상기 무작위 유전적 돌연변이를 겪지 않은 대응하는 세포보다 FcγRIIIA 수용체에 대한 증가된 결합 친화력을 가지는 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는, 방법.
72. 청구항 63 항에 있어서, 이때 진핵 세포는 Chinese 헴스터 난소 (CHO) 세포가 되는, 방법.
73. 청구항 63 항에 있어서, 이때 진핵 세포는 NS0, SP2/0, HEK-293, PER.C6 및 YB2/0 세포로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
74. 청구항 63 항에 있어서, 이때 진핵 세포는 골수종 세포가 되는, 방법.
75. 청구항 63 항에 있어서, 이때 세포는 적어도 약 60회 계대후 다양한 글리코실화 패턴을 유지하는, 방법.
76. 청구항 63 항에 있어서, 선택된 세포는 무혈청 배지에서 성장하는, 방법.
77. 청구항 63 항에 있어서, 선택된 세포는 현탁액에서 성장하는, 방법.
78. 청구항 63 항에 있어서, 선택된 세포는 선택된 이종 당단백질을 인코드하는 이종 서열을 포함하는, 방법.
79. 청구항 63 항에 있어서, 선택된 세포는 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸을 발현시키는, 방법.
80. 청구항 79 항에 있어서, 실질적으로 균일한 패턴의 N-링크된 글리칸은 질량분석에 의해 해리되는 단일 피크에 의해 증명되는, 방법.
81. 청구항 63 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 구조식 I 또는 II를 가지는 N-링크된 글리칸을 특징으로 하는, 방법:
    

    

    
    

    
82. 청구항 63 항에 있어서, 다양한 글리코실화 패턴은 갈락토즈 수준의 감소, 글리코스 수준의 증가, 퓨코스 수준의 감소를 특징으로 하는, 방법.

Images