CN102216452A - 具有变异糖基化方式的细胞系和蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含产生具有变异糖基化方式的糖蛋白的细胞的组合物和方法。所述方法和组合物可以用来制备具有治疗价值的抗体和蛋白质。

Description

具有变异糖基化方式的细胞系和蛋白质

交叉引用

本申请要求享有2008年9月26日提交的美国专利申请No.61/194,292、2008年12月8日提交的美国专利申请No.61/120,722、以及2009年4月9日提交的美国专利申请No.61/168,186的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文。

技术领域

已经表明碳水化合物、糖类、或者糖分子组成中的变化会影响IgG对三类FcγR(FcγRI、FcγRII和FcγRIII)的亲和性，其中FcγR将IgG-介导的免疫反应与效应子功能联系起来(Wright和Morrison，Trends Biotechnol 15(1)：26-32；Gessner等，Ann Hematol 76(6)：231-48(1998)；Jefferis等，Immunol Rev 163：59-76(1998).Ravetch和Bolland，Annu Rev Immunol 19：275-90(2001))。

根据与蛋白质部分的结合形式的不同，通常将糖蛋白的糖链分为下列两大类：即，与天冬酰胺结合的糖链(N-糖苷连接的糖链)；以及与其它氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)结合的糖链(O-糖苷连接的糖链)。通常，它们具有下述结构式(I)所示的基本共同核结构：

N-糖苷连接的糖链具有多种结构并具有不同糖分子。与天冬酰胺结合的糖链末端通常称为还原末端，而相对的一侧称为非还原末端。N-糖苷连接的糖链可以包括：高甘露糖型，其中只有甘露糖与核心结构的非还原末端结合；复合型，其中核心结构的非还原末端侧具有至少一个半乳糖-N-乙酰基葡萄糖胺(Gal-GlcNAc)的平行分支，并且Gal-GlcNAc的非还原末端侧具有唾液酸结构，将N-乙酰基葡萄糖胺等一分为二；杂化型，其中核心结构的非还原末端侧具有高甘露糖型和复合型这二者的分支；等。可以通过糖链基因(如合成糖链的糖基转移酶的基因和/或水解糖链的糖分解酶的基因)来确定糖链的结构。

通常在内质网(ER)腔中通过糖链来修饰糖蛋白。例如，在N-糖苷连接的糖链的生物合成步骤过程中，相对较大的糖链转移至多肽链(其在ER腔中延长)中。糖分子可以连续地被加入到包含约20个α-异戊二烯单元的长链脂质载体的磷酸酯基(如长醇磷酸酯(P-Dol))上。例如，N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)被转移至P-Dol以形成GlcNAc-P-P-Dol，然后又有一个GlcNAc被转移来从而形成GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol。接下来，五个甘露糖(Man)被转移来从而形成(Man)₅-(GlcNAc)₂-P-P-Dol，然后四个甘露糖和三个葡萄糖(Glc)被转移来。结果，形成糖链前体(Glc)₃-(Man)₉-(GlcNAc)₂-P-P-Dol，其为核心寡糖。然后在ER腔中，包含14个糖的糖链前体可以被转移至具有天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸序列的多肽。与核心寡糖结合的长醇焦磷酸酯(P-P-Dol)通常通过焦磷酸酶的水解作用而被释放并成为长醇磷酸酯(P-Dol)，并被回收。通常在糖链结合到多肽上之后开始糖链的修剪。例如，在α-1，2-葡萄糖苷酶I、α-1，3-葡萄糖苷酶II和α-1，2-甘露糖苷酶的作用下，在ER中消除3个Glc和1或2个Man。

在ER中经过修剪的糖蛋白可以被转移至高尔基体并被进一步修饰。例如，存在于高尔基体的顺(cis)面的是N-乙酰基葡萄糖胺磷酸转移酶(其有助于甘露糖磷酸酯的添加)、N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸二酯α-N-乙酰基葡萄糖胺酶和α-甘露糖苷酶I(其将Man残基减少至5个)。存在于高尔基体中间部分的是N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I(GnTI)(其有助于复合型N-糖苷连接的糖链第一外侧GlcNAc的添加)、α-甘露糖苷酶II(其有助于除去2个Man)、N-乙酰基葡萄糖胺转移酶II(GnTII)(其有助于从外侧添加第二GlcNAc)以及α-1，6-岩藻糖基转移酶(其有助于将岩藻糖添加至N-乙酰基葡萄糖胺的还原末端)。存在于高尔基体反(trans)面的是半乳糖转移酶(其有助于半乳糖的添加)以及唾液酸转移酶(其与N-乙酰基神经氨酸之类的唾液酸的添加有关)。因此，可以通过这些不同酶的活性来形成不同的N-糖苷连接的糖链。

糖链结构变异、或该链中不同糖分子含量引起的变异糖基化方式在糖蛋白(如抗体)的效应子功能中发挥重要作用。例如，在IgG型抗体的Fc区，通常存在两个N-糖苷连接的糖链结合位点。在血清IgG中，糖链结合位点一般结合具有多个分支的复合型糖链，并且在血清IgG中唾液酸或等分N-乙酰基葡萄糖胺的添加较低。有多种方式和形式使得半乳糖添加至复合型糖链的非还原末端并且使岩藻糖添加至还原末端中的N-乙酰基葡萄糖胺(例如参见Leppanen等人，Biochemistry，36，7026-7036(1997))。

岩藻糖基化为这样的过程的例子，在该过程中，新合成的抗体在细胞的高尔基体中可以通过添加岩藻糖而被修饰。通过用结合有萤光团的LCA(扁豆凝集素A，其为一种偏向性地与经岩藻糖修饰的蛋白质结合的化学品)将细胞染色可以看到这种蛋白质修饰。最近，发现抗体的岩藻糖基化会影响抗体对人FcγR的结合以及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。当抗体的岩藻糖水平低时，抗体结合的亲和性以及抗体介导的ADCC大大提高(Shields等人，J Biol Chem 277(30)：26733-4(2002)；Shinkawa等人，J Biol Chem 278(5)：3466-73(2003))。

蛋白质岩藻糖基化为这样的过程：首先摄取自由的岩藻糖，接下来被岩藻糖激酶磷酸化并被GDP-岩藻糖焦磷酸化酶转化为GDP-岩藻糖。在分泌途径中岩藻糖基转移酶将岩藻糖残基转移至多糖或蛋白质，接着，修饰后的糖蛋白被转运至分泌细胞表面。产生抗体的细胞的岩藻糖基化状态与所产生的抗体中的岩藻糖含量相关，并且在细胞和抗体水平上，没有岩藻糖基转移酶就不会发生岩藻糖基化(Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol Bioeng 87(5)：614-22(2004))。

ADCC为重要的作用机理，通过该作用机理，治疗性抗体诱导免疫反应并介导癌细胞的杀死。治疗性抗体提高了ADCC，从而可以改善临床反应并降低治疗剂量，从而减少可能的副作用(Adams和Weiner，Nat Biotechnol 23(9)：1147-57(2005))。体内模型和临床试验已经表明治疗性抗体(如赫赛汀)具有细胞毒性，包括ADCC。在赫赛汀诱导的胸部肿瘤退化和防止肺转移方面这些性质是主要因素(Carter等人，Proc Natl Acad Sci USA 89(10)：4285-9(1992)；Lewis等人，Cancer Immunol Immunother 37(4)：255-63(1993)；Cooley等人，Exp Hematol 27(10)：1533-41(1999)；Clynes等人，Nat Med 6(4)：443-6(2000)；Repka等人，Clin Cancer Res 9(7)：2440-6(2003)；Gennari等人，Clin Cancer Res 10(17)：5650-5(2004)；Nahta和Esteva，Cancer Lett 232(2)：123-38(2006))。另外，已经表明，由岩藻糖基化低的细胞产生的抗体能够提高ADCC活性(Shields等人，J Biol Chem 277(30)：26733-4(2002)；Shinkawa等人，J Biol Chem 278(5)：3466-73(2003))。

人IgG1亚型抗体的ADCC活性表达通常需要将抗体的Fc区结合至存在于效应细胞(如杀伤细胞、天然杀伤细胞、活化巨噬细胞等(FcγR)以及各种补体成分)的表面上的抗体受体。已经表明，对于这种结合反应而言，抗体铰链区的第二域和C区(下文称为″Cγ2域″)以及与Cγ2域连接的糖链中的多个氨基酸残基是重要的。

现在，为了提高针对肿瘤细胞的单克隆抗体介导的ADCC，已提出了多种策略，如：1)开发特定的抗癌抗体，其中抗体的一个臂与IgG受体结合以更有效地吸引免疫效应细胞(Segal等人，J Immunol Methods 248(1-2)：1-6(2001))；2)使用重组人细胞因子以增加免疫效应细胞的效应子功能(Carson等人，Eur J Immunol 31(10)：3016-25(2001)；Repka等人，Clin Cancer Res 9(7)：2440-6(2003))；3)使用IgG-细胞因子融合蛋白(Penichet和Morrison，J Immunol Methods 248(1-2)：91-101(2001))；4)改变抗体的Fc序列以提高与IgG受体的结合(Shields等人，J Biol Chem 276(9)：6591-604(2001))；以及5)优化Asn297-连接的碳水化合物的水平(Umana等人，Nat Biotechnol 17(2)：176-80(1999)；Davies等人，Biotechnol Bioeng 74(4)：288-94(2001)；Shinkawa等人，J Biol Chem 278(5)：3466-73(2003))。

一个方案是修饰抗癌抗体的岩藻糖含量以提高FcγR和ADCC的结合亲和性。IgG1具有两个与Asn297结合的N-连接的低聚糖链，该低聚糖链由三甘露糖基核心结构(存在或不存在核心岩藻糖)、等分N-乙酰基葡萄糖胺和末端半乳糖构成(Rademacher等人，Biochem Soc Symp 51：131-48(1986))。早已经认识到Asn297-连接的碳水化合物在免疫球蛋白G效应子功能中的性质和重要性。已经证明，去岩藻糖化的利妥昔单抗(其为淋巴癌治疗用抗CD20抗体)以高亲和性与FcγRIIIa强结合，并且ADCC活性提高100倍(Shinkawa等人，J Biol Chem 278(5)：3466-73(2003)；Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol Bioeng 87(5)：614-22(2004)；Kanda等人，Biotechnol Bioeng 94(4)：680-8(2006))。其它文献已经表明，与正常岩藻糖赫赛汀相比，使低岩藻糖赫赛汀与FcγRIIIa结合可以提高约50倍，结果，赫赛汀介导的ADCC被实质性提高(Shields等人，J Biol Chem 277(30)：26733-40(2002))。这表明，抗癌抗体的去岩藻糖基化使它们与FcγR的结合亲和性增加并提高了ADCC。另外还表明，岩藻糖含量的改变表示了用于提高抗体的抗癌免疫反应的方式，以提高它们的治疗有效性，并且使该治疗可以扩展至对岩藻糖基化抗体无响应的癌症患者。

然而，人们依然需求一种用于改变具有高治疗可能性的抗体的其它方法。

发明概述

存在这样的需求：制备出效应子功能得以提高的治疗用蛋白质。通过制备具有变异糖基化方式或者与对应的野生型蛋白质相比得以修饰的糖基化方式的细胞系和糖蛋白、或者制备在具有未被修饰的糖基化方式的细胞系中产生的蛋白质，本发明公开提供了可满足上述需求以及相关优点的方法和组成。宿主细胞表达的糖蛋白的糖链含量的差异以及诸如抗体等宿主细胞(其可用来生产具有变异糖基化方式的糖蛋白)的生长，可以具有较高的效应子功能。

在一个实施方案中，提供一种用于生产和选择宿主细胞的方法和组成，其中所述宿主细胞被修饰以产生与未被修饰的母本宿主细胞相比的变异糖基化方式。具有变异糖基化方式的宿主细胞的选择方法可以包括下列步骤：提供多个宿主细胞；将随机基因突变引入所述多个宿主细胞中；以及从所述多个细胞中选出至少一个表现出变异糖基化方式的细胞，该变异糖基化方式的特征在于，与对应的未进行所述随机基因突变的母细胞相比，至少一种糖分子的水平发生改变。另外，可以通过化学诱变剂来诱导所述基因突变。

所述宿主细胞可以为真核细胞，如哺乳动物细胞。所述经修饰的宿主细胞可以为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。所述宿主细胞可以是经修饰的CHO细胞，如CHO-1E5、CHO-3F或CHO-2.6细胞。所述宿主细胞也可以是骨髓瘤细胞。所述经修饰的宿主细胞可以是NS0、SP2/0、HEK293、PER.C6或YB2/0细胞。经修饰的所述宿主细胞表现出变异糖基化方式，其特征在于，与未修饰的母本宿主细胞相比，存在于宿主细胞表面的至少两种糖分子的水平发生改变。所述水平的改变可以是至少约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍或更多倍。可以通过岩藻糖基化、甘露糖基化、N-乙酰基葡萄糖氨基化、或它们的组合的水平变化来证明所述变异糖基化方式。在一些实施方案中，该变化可以是半乳糖、葡萄糖或这二者的水平的变化。该变化可以是半乳糖、葡萄糖或这二者的水平的增加或降低。例如，所述变化可以是葡萄糖水平增加并且半乳糖水平降低。

在一些实施方案中，所述水平的变化可以是与未修饰的母本宿主细胞相比，经修饰的宿主细胞的岩藻糖基化水平降低。也可以通过甘露糖基化水平(如α-连接的甘露糖的水平)的变化来证明所述变异糖基化方式。在经修饰的宿主细胞中，甘露糖基化水平可以增加。也可以通过N-乙酰基葡萄糖氨基化水平的变化(如在经修饰的宿主细胞中，N-乙酰基葡萄糖氨基化降低或增加)来证明所述变异糖基化方式。所述N-乙酰基葡萄糖氨基化可以涉及α-或β-连接的N-乙酰基葡萄糖胺。与未修饰的母本宿主相比，所述宿主细胞被修饰以产生变异糖基化方式，该宿主细胞可以具有与未修饰的母本宿主细胞相当的1，6-岩藻糖基转移酶活性。在其它的方面中，所述经修饰的宿主细胞可以在约30、40、50、60、80、100、120、150、200、1000或更高代之后仍保持其变异糖基化方式。所述经修饰的宿主细胞可以在无血清培养基、混悬液和/或发酵罐中生长。

在其它方面中，本发明提供一种由经修饰的非淋巴宿主细胞产生的抗体群，其中所述非淋巴宿主细胞产生表现出基本上同种方式的N-连接多糖的抗体，其中所述抗体群的成员结合至少两个不同的抗原。

在其它方面中，本发明提供经修饰的宿主细胞，其产生具有变异糖基化方式的N-连接的多糖，所述变异糖基化方式的特征在于，一个或多个糖部分的水平发生改变，其中所述糖部分选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺所组成的组中的基团。在一些实施方案中，所述变异糖基化方式的特征在于，半乳糖的水平降低。在一些实施方案中，所述变异糖基化方式的特征在于，D-葡萄糖胺的水平降低。在一些实施方案中，所述变异糖基化方式的特征在于，甘露糖水平的增加。在一些实施方案中，所述变异糖基化方式的特征在于，葡萄糖水平的增加。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞产生抗体，该抗体的ADCC活性高于对应的未修饰的宿主细胞的ADCC活性。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞产生抗体，与由对应的未修饰的宿主细胞产生的对应的抗体相比，该抗体与FcγRIIIA受体的结合亲和性增加。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞选自由NS0、SP2/0、HEK293、PER.C6和YB2/0细胞构成的组。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞为骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞在至少约60代后仍保持所述变异糖基化方式。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞在无血清培养基中生长。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞在混悬液中生长。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞包括编码异源糖蛋白的异源序列。

在其它方面，本发明提供一种分离的宿主细胞，该宿主细胞产生表现出基本上同种方式的N-连接多糖的糖蛋白。在一些实施方案中，所述基本上同种方式的N-连接多糖通过质谱解析中的单峰来确认。在一些实施方案中，所述N-连接方式具有式I或II所示的结构，其中，岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一4GlcNAc连接。

在其它方面中，所述经修饰的宿主细胞可以包含异源序列，其中所述异源序列可以编码异源糖蛋白(如抗体或酶)。如本文所公开的，提供一种经修饰的糖蛋白的制备方法，包括：提供编码所述经修饰的糖蛋白的异源多核苷酸序列；以及使所述经修饰的糖蛋白在经修饰的宿主细胞中表达。因此，本发明还提供一种糖蛋白(如被异源序列编码的异源糖蛋白)，其表现出变异糖基化方式，该变异糖基化方式的特征在于，与对应的野生型糖蛋白(如未修饰的母本宿主细胞所产生的糖蛋白)相比，至少两种糖分子的水平发生改变。所述变异糖基化方式可以通过N-连接的寡糖的水平变化来证实。与对应的由未修饰的母本宿主细胞产生的野生型糖蛋白相比，所述异源糖蛋白可以表现出葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖的水平和/或N-乙酰基葡萄糖胺含量水平的降低或增加。所述N-乙酰基葡萄糖胺可以是α-或β-连接的N-乙酰基葡萄糖胺。

在一个方面，所述糖蛋白为抗体或抗体片段。所述抗体可以结合癌抗原。例如，所述抗原可以选自由HER2、CD20、EGF受体、VEGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD19、CD30、CD33、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、以及整联蛋白家族成员所组成的组。与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，所述抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)增加。另外，所述抗体可以包括IgG抗体。如本文所公开，所述抗体可以表现出变异糖基化方式，该变异糖基化方式的特征在于，与对应的野生型抗体(如未修饰的母本宿主细胞所产生的抗体)相比，至少两种糖分子的水平发生改变。所述糖分子可以通过所述抗体的Fc区而相连。

在其它方面中，本发明提供一种N-连接的多糖，包含一个葡萄糖分子、四个甘露糖分子和两个N-乙酰基葡萄糖胺分子。在一些实施方案中，所述N-连接的多糖包含一个或多个岩藻糖分子。在一些实施方案中，所述N-连接的多糖具有式(I)所示结构，其中，岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一4GlcNAc连接。

(I)

在一些实施方案中，所述N-连接的多糖具有式(II)所示的结构，其中岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一4GlcNAc连接。

在其它方面中，本发明提供一种分离的糖蛋白，其含有本发明公开的N-多糖。在一些实施方案中，所述糖蛋白为抗体。在一些实施方案中，所述糖蛋白为酶。在一些实施方案中，所述N-连接的多糖与抗体的Fc区相连。在一些实施方案中，所述抗体结合癌抗原。在一些实施方案中，所述癌抗原选自由HER2、免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1、CD20、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、NGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3、以及α和β整联蛋白组成的组。在一些实施方案中，所述抗体由经修饰的宿主细胞(其产生基本上同种群的N-连接多糖)产生。在一些实施方案中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性增加。在一些实施方案中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体对FcγRIIIA受体的结合亲和性增加。在一些实施方案中，所述抗体为抑制性抗体。在一些实施方案中，所述抗体为刺激性抗体。在一些实施方案中，所述抗体为IgG抗体。

在一些实施方案中，所述宿主细胞为非淋巴细胞，其中该宿主细胞产生表现出基本上同种方式的N-连接多糖的糖蛋白。在一些实施方案中，所述宿主细胞为CHO细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞产生抗体，该抗体表现出基本上同种方式的N-连接多糖。

在其它方面中，本发明提供一种制备经修饰的糖蛋白的方法，包括：(a)提供编码所述经修饰的糖蛋白的异源多核苷酸序列；以及(b)使所述经修饰的糖蛋白在本文公开的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，所述经修饰的糖蛋白由宿主细胞分泌。在一些实施方案中，所述宿主细胞保持在无血清培养基中。在一些实施方案中，所述宿主细胞保持在混悬液培养基中。在一些实施方案中，所述经修饰的糖蛋白为抗体。

本发明还提供一种培养基，其包含本文所公开的宿主细胞。在一些实施方案中，所述培养基不含血清。本发明还公开一种培养发酵罐，其包含多个宿主细胞，该宿主细胞在培养基中产生具有变异糖基化方式的N-多糖或者表现出基本上同种方式的N-多糖的糖蛋白。

在其它方面中，本发明提供一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体，该抗体包含N-连接多糖，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，所述抗体与Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)的结合亲和性增加，以及/或者与Fcγ受体IIb(FcγRIIb)的结合亲和性降低，从而增强了针对表达FcγRIIIa和/或FcγRIIb的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。在其它方面中，本发明提供一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体，该抗体包含N-连接多糖，其中，与对应的由对应的未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，所述抗体的ADCC活性增加，并且所述增加的ADCC活性是针对表达高亲和性的Fcγ受体、FcγRIIIa158V/V的效应细胞以及表达低亲和性的Fcγ受体、FcγRIIIa 158F/F或FcγRIIIa 158F/V的效应细胞的。

在本发明抗体的一些实施方案中，所述N-连接多糖包含一个葡萄糖分子、四个甘露糖分子和两个N-乙酰基葡萄糖胺分子。在一些实施方案中，所述N-连接多糖包含一个或多个岩藻糖分子。在一些实施方案中，所述N-连接多糖具有式(I)或(II)所示结构，其中，岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一4GlcNAc连接。

在一些实施方案中，所述N-连接多糖与抗体的Fc区相连。在一些实施方案中，所述抗体结合癌抗原。所述癌抗原可以包括，但不限于，HER2、免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1、CD20、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、NGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3、以及α和β整联蛋白。本发明的抗体可以抑制性抗体或刺激性抗体。在一些实施方案中，所述抗体为IgG抗体。在一些实施方案中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体对表达低亲和性的FcR、FcγRIIIa 158F/F或FcγRIIIa 158F/V的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。在一些实施方案中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体对表达高亲和性的FcR、FcγRIIIa 158V/V的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。在一些实施方案中，所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。所述宿主细胞可以包括但不限于，NS0、SP2/0、HEK293、PER.C6和YB2/0细胞。所述宿主细胞也可以为骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞为人外周血液单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，所述效应细胞为NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或多形核中性粒细胞(PMN)。

在其它方面中，本发明提供一种经修饰的宿主细胞，其特征在于，能够产生具有N-连接多糖的经修饰抗体，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，所述抗体与Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)的结合亲和性增加，以及/或者与Fcγ受体IIb(FcγRIIb)的结合亲和性降低，从而提高了对表达FcγRIIIa和/或FcγRIIb的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。在其它方面中，本发明提供一种经修饰的宿主细胞，其特征在于，能够产生具有N-连接多糖的经修饰抗体，其中，与对应的由对应的未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，所述抗体的ADCC活性增加，并且，所述增加的ADCC活性是针对表达高亲和性Fcγ受体、FcγRIIIa 158V/V的效应细胞、以及针对表达低亲和性Fcγ受体、FcγRIIIa 158F/F或FcγRIIIa158F/V的效应细胞。

在本发明的经修饰的宿主细胞的一些实施方案中，N-连接多糖表现出变异糖基化方式，该变异糖基化方式的特征在于，选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺组成的组中的一个或多个糖部分的水平发生变化。在一些实施方案中，所述变异糖基化方式的特征在于半乳糖水平降低。在一些实施方案中，变异糖基化方式的特征在于D-葡萄糖胺水平的降低。在一些实施方案中，变异糖基化方式的特征在于甘露糖水平的增加。在一些实施方案中，变异糖基化方式的特征在于葡萄糖水平的增加。在一些实施方案中，N-连接多糖具有式I或II所示的结构，其中，岩藻糖部分可任选地从右侧与第一4GlcNAc连接。

在一些实施方案中，宿主细胞产生抗体，与对应的由对应的未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，该抗体对表达高亲和性Fc受体、FcγRIIIa158V/V的效应细胞的ADCC活性增加，并且对表达低亲和性Fc受体、FcγRIIIa 158F/F或FcγRIIIa 158F/V的细胞的ADCC活性增加。在一些实施方案中，宿主细胞产生抗体，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，该抗体对Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)的结合亲和性增加，以及/或者对Fcγ受体IIb(FcγRIIb)的结合亲和性降低，从而提高了针对表达FcγRIIIa和/或FcγRIIb的效应细胞的ADCC活性。在一些实施方案中，所述抗体结合癌抗原。所述癌抗原可以包括但不限于HER2、免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1、CD20、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、NGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3、以及α和β整联蛋白、在一些实施方案中，所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。所述宿主细胞可以包括但不限于NS0、SP2/0、HEK293、PER.C6和YB2/0细胞。所述宿主细胞可以为骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞在至少约60代后仍保持变异糖基化方式。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞在无血清培养基中生长。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞在悬浮液中生长。在一些实施方案中，所述经修饰的宿主细胞包含编码异源糖蛋白的异源序列。

本发明还提供一种预防或治疗疾病的方法，该方法包括给需要的对象施用有效量的本文所公开所述抗体。在一些实施方案中，所述疾病选自由癌症、过敏症、心血管疾病、炎症性疾病、代谢性疾病、神经性疾病、病毒感染和/或细菌感染所组成的组。例如，所述疾病可以为癌症或过敏症。在一些实施方案中，所述对象为哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，通过非肠道注射、输液、口服或吸入的方式来给所述对象施用。本发明还提供一种制备经修饰的抗体的方法，包括：(a)提供编码所述经修饰的抗体的异源多核苷酸序列；以及(b)使所述经修饰的抗体在本文所公开的所述宿主细胞中表达。在一些实施方案中，所述经修饰的抗体由所述宿主细胞分泌。在一些实施方案中，所述宿主细胞保持在无血清培养基中。在一些实施方案中，所述宿主细胞保持在悬浮液培养物中。本发明还涉及包含所述宿主细胞的培养基、以及在培养基包含多个所述宿主细胞的培养发酵罐。在一些实施方案中，所述培养基无血清。

通过引用的方式并入

本说明书中提及的所有出版物和专利申请以引用的方式并入本文，如同各个出版物或专利申请分别具体地被指出以引用的方式并入。

附图说明

随附的权利要求书具体地示出了本发明的新颖特征。通过参考下面具体的描述(其示出了示例性的实施方案，这些实施方案利用了本申请的原则)，可以更好地理解本申请的特征和优点。其中附图为：

图1为化学品诱导的随机变异后富集岩藻糖低的CHO-K1细胞的策略的示意图。用化学品处理CHO-K1细胞以诱导随机突变。由于产生岩藻糖基化沉默突变的机会很少，所以利用了通过使用LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素来减少岩藻糖高的细胞的唯一过程。首先将这两种试剂在培养基中混合以形成生物素-链霉亲和素复合物。化学诱导变异后，将所述复合物添加到细胞中。结合到岩藻糖高的细胞表面上的LCA将肥皂草素带入到接近细胞膜，从而杀死细胞。

图2为选择化学诱导的随机变异之后低岩藻糖CHO-K1突变细胞的流程图。

图3为示出确定LCA-生物素和链霉亲和素-毒素杀死高岩藻糖CHO-K1细胞的最佳浓度的图。将每孔10⁵个CHO-K1细胞放入到96孔板中。以所示的不同浓度将LCA-生物素以及链霉亲和素-肥皂草素在介质中混合并添加到细胞中。10天后通过MTT检测法测定细胞生长情况。将在没有毒素的介质中的细胞生长情况作为对照。

图4示出了化学诱导的随机变异后LCA/毒素选择性逐渐富集低岩藻糖细胞群。A)CHO-K1细胞中由ICR-191诱导的随机突变，所述细胞用LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素处理70天。每周通过FITC共轭LCA标记物和FACs分析来检查所述细胞岩藻糖基化状态。母本CHO-K1细胞用作阳性对照。B)在CHO-K1细胞中使用甲磺酸乙酯(EMS)来诱导随机变异。选择和岩藻糖基化监测如A)所述。

图5示出了这样的图，该图描述了抗LCA/毒素细胞中岩藻糖含量低在基因学上是稳定的。岩藻糖基化低的克隆中的一个在不含LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素的介质中生长并延伸三个月。每周通过FITC共轭LCA标记物和FACS分析来检查细胞的岩藻糖基化状态。

图6描述了低LCA-结合的突变CHO-K1细胞的N-多糖情况。用FITC共轭外源凝集素(LCA、WGA、ConA和GS-II)来标记LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素选择后的稳定的细胞群并用FACS进行分析。

图7描述了适合于悬浮液中的无血清培养基的一个突变CHO-K1克隆的N-多糖情况。通过有限稀释法由单个细胞克隆来分离所述突变克隆。所述克隆适合于无血清悬浮液，并且用FITC共轭外源凝集素(LCA、WGA、ConA和GS-II)来标记所述突变克隆并用FACS进行分析。示出了一个所述克隆的情况。

图8说明了在突变CHO-K1克隆中Fut8的表达未改变。

图9描述了由在悬浮液中的无血清培养基中生长的突变克隆所产生的抗体的唯一N-多糖情况。通过SDS-PAGE凝胶来分离所表达的抗体ET101，A)用考马斯亮蓝染色，或者B)转移至硝酸纤维素膜并用LCA、WGA、ConA和与生物素共轭的GS-II印迹，然后用HRP共轭的链霉亲和素孵育。

图10描述了在由突变克隆(其适合在悬浮液的无血清培养基中生长)产生的抗体中糖类组成的唯一情况。A)由母本CHO细胞、突变CHO-1E5克隆、突变CHO-3F克隆、或突变CHO-2.6克隆产生的抗体ET101中的单糖的定量。所有的CHO克隆均适合于在悬浮液培养的无血清培养基。B)由母本CHO细胞、突变CHO-1E5克隆、突变CHO-3F克隆、或突变CHO-2.6克隆产生的人IgG1(ET101和ET201)的单糖组成。C)根据Yamane-Ohnuk等人，Biotechnol.Biogeng.87：614-622(2004)，由Fut8-/-敲除CHO细胞产生的人IgG1的单糖组成分析。

图11描述了由生长在含血清培养基中的突变细胞群产生的ErbB2封闭人IgG1(ET101)所显示的提高的ADCC活性。A)从1毫升含有10％FBS的条件培养基得到的表达抗体ET101被蛋白质L珠沉淀，用还原SDS-PAGE凝胶分离并用考马斯亮蓝染色。空白生长培养基用作阴性对照。B)在突变克隆(IRC2.2)中表达的ET101抗体或者在用SKBR3细胞的ADCC检测中的野生型CHO(母本)。

图12描述了与母本细胞系产生的ET101(图中表示为ET101)相比，适合于无血清培养基的、由突变CHO-K1细胞克隆产生的ErbB2-封闭抗体人IgG1(ET101)(图中表示为ET101-1E5)对多个癌细胞系(SKBR3、SKOV3、MDA-MB-361和MDA-MB-231)具有提高的ADCC活性。

图13描述了与由野生型CHO株(CHO)产生的ET101相比，由适合于无血清培养基的多个单个突变CHO-K1细胞克隆(1E5、2.6和3F)产生的ErbB2-封闭抗体人IgG1(ET101)对癌细胞系SKOV3和MDA-MB-231具有提高的ADCC活性。PBS或非特异性抗体用作阴性对照。

图14描述了靶向EGFR的其它封闭抗体人IgG1(ET201)对癌细胞系A549具有提高的ADCC活性。图中描述了与由野生型CHO株(CHO)产生的ET201相比，由适合于无血清培养基的2个单个的突变CHO-K1细胞克隆(1E5和3F)产生的ET201。PBS或非特异性抗体用作阴性对照。

图15a和b表示由本发明经修饰的宿主细胞(表示为CHO-1E5)合成的N-连接寡糖的组成和结构的示意图。通过单糖组成的分析、多糖的MALDI-TOF MS谱、以及由CHO-1E5细胞产生的抗体的甘露糖苷酶消化来确定此处示出的结构。

图16示出了在无血清悬浮液中，由野生型CHO母本宿主细胞(上侧)和CHO-1E5细胞(中间)产生的抗体中的单糖情况、以及对应的单糖标准品(下侧)。

图17示出了由野生型母本CHO细胞(上侧)和CHO-1E5细胞(下侧)所产生的抗体的N-连接寡糖的MALDI-TOF MS谱。

图18示出了从由野生型母本CHO细胞(上侧)和CHO-1E5细胞(下侧)产生的抗体释放的N-连接多糖的洗脱情况。该结果表明，由CHO-1E5细胞产生的抗体具有单组的N-连接寡糖，而由野生型CHO细胞产生的抗体中具有混合群的N-连接寡糖。通过在37℃下用PNGase F消化200μg抗体72小时，释放N-多糖。在-20℃下用70％乙醇将所述蛋白质沉淀过夜，并离心除去。真空干燥所述上清液并再次悬浮在200μl去离子水中。将样品负载到填充有C18、AG50WX8和AG4x4的微柱上。然后将该柱用300μl去离子水洗涤。收集洗脱物，用PA200柱和Dionex ICS-3000来分析所述寡糖。

图19示出了由CHO-1E5产生的寡糖的组成和推定结构。19A：通过PA1柱/Dionex ICS-3000系统和图16和17所示的MALDI-TOF MS来确定由CHO-1E5产生的N-多糖的单糖组成。19B：由单糖分析结果和MALDI-TOF MS来推断N-多糖的推定结构。

图20示出了通过α1，2，3甘露糖苷酶的消化由CHO-1E5产生的寡糖的结构确认。在37℃下将由CHO-1E5和母本宿主细胞合成的抗体(ET101)与α1，2，3甘露糖苷酶孵育24小时。为了除去所述抗体和所述酶，首先将消化后的抗体溶液穿过MicroCon YM10(Millipore，Billerica，MA)，然后穿过MicroCon YM100(Millipore，Billerica，MA)。用PA1柱/Dionex ICS-3000系统来分析所述样品。A：从母本宿主细胞样品获得的N-多糖的α1，2，3甘露糖苷酶消化位点。条带C：从母本宿主细胞样品上由18mM NaOH(B)和90mM NaOH(C)洗脱下来的糖类情况。D和E：从CHO-1E5样品上由18mM NaOH(D)和90mM NaOH(E)洗脱下来的糖类情况。F和G：通过分析推断的由CHO-1E5合成的N-多糖的结构。

图21为显示条带的电泳凝胶的复制品，其中所述条带对应于在还原条件下由野生型母本CHO细胞和CHO-1E5细胞产生的抗体重链(约50KD)和轻链(约25KD)，以及所述条带对应于在非还原条件下由野生型母本CHO细胞和CHO-1E5细胞产生的抗体(约150KD)。该结果表明，显示出糖基化方式的寡糖不改变蛋白质结构以及由CHO-1E5细胞产生的抗体的组装体。

图22示出了细胞裂解检测的结果，表明由CHO-1E5细胞产生的表现出糖基化方式的抗体的ADCC活性提高。8A：由适合于无血清培养基的CHO-1E5细胞克隆产生的ErbB2-封闭抗体人IgG1(ET101)对多个癌细胞系(SKOV3和MDA-MB-231)具有提高的ADCC活性。通过蛋白质A色谱法从条件培养基中纯化出在CHO-1E5细胞中表达的ET101抗体；并通过UV280定量。母本ET101在野生型CHO细胞中表达并采用同样方式纯化。为了进行ADCC检测，将100μl靶向细胞悬浮液在96孔板中于37℃下用50μl经表达的ErbB2-封闭抗体ET101预孵育半小时。然后按照效应分子/靶向细胞的比例为20∶1，加入50μl PBMC。孵育16小时后，将板旋转减慢，并将50μl没有细胞的上清液转移至新的板中。通过CytoTox96非放射性细胞毒性检测(Promega，Madison，WI)来测定所释放的LDH。通过式子(E-S)/(M-S)(E：试验性释放量，S：自发性释放量，M：最大释放量)来计算细胞裂解。PBS或非特异性抗体用作阴性对照。8B：由适合于无血清培养基的CHO-1E5细胞克隆产生的EGFR-封闭抗体人IgG1(ET201)对人肺癌细胞系(A549)具有提高的ADCC活性。通过蛋白质A色谱法从条件培养基纯化在CHO-1E5细胞中表达的ET201抗体，并通过UV280定量。

图23示出了抗体/Fc受体结合亲和性的结果。该结果表明，由CHO-1E5细胞显示的N-多糖改善了抗体与FcγRIIIA受体的结合性。首先将所述抗体生物素化，并负载到覆盖有链霉亲和素的生物传感器(ForteBio，Menlo Park，CA)上。将重组FcγRI和FcγRIIIb蛋白质以100-400nM的浓度混悬(R&D系统，Minneapolis，MN)。根据ForteBio标准动力学规程来评价结合亲和性(KD，nM)。

图24示出了由CHO-1E5细胞产生的抗体的体内药物代谢动力学情况。该结果表明，由CHO-1E5细胞产生的抗体的药物代谢动力学基本上与野生型母本CHO细胞产生的抗体一致。

图25示出了通过α1，2，3甘露糖苷酶和α1，2，3，6甘露糖苷酶的消化由CHO-1E5产生的寡糖的结构确定。(A)从1E5细胞样品或阳性对照(B)由18mM NaOH洗脱的糖类以及N-多糖的α1，2，3甘露糖苷酶消化位点。(C)从1E5细胞样品或阳性对照(D)由18mM NaOH洗脱的糖类以及N-多糖的α1，2，3，6甘露糖苷酶消化位点。

图26示出了细胞裂解检测，用于检测与不同FcγR IIIa受体的抗体结合亲和性。图26a示出了当表达低结合亲和性FcγR IIIa 158F/F的人PBMCs用作效应细胞时，具有唯一糖基化的抗体具有提高的ADCC活性。图26b示出了具有唯一的糖基化的抗体与表达高亲和性FcγR IIIa 158V/V的人PBMC的结合性。

图27示出了由母本CHO细胞产生的抗体和具有N-多糖唯一结构的抗体对人FcγR的结合亲和性的流式细胞术测量。图27A示出了具有N-多糖唯一结构的抗体提高了对活性FcγRIIIa受体的结合亲和性，图27B示出了具有N-多糖唯一结构的抗体降低了对抑制性受体FcγRIIb的结合亲和性。

图28示出了由CHO-K1-1E5产生的抗体对抑制性受体FcγRIIb具有降低的结合亲和性而对活性受体FcγRIIIa具有增加的结合亲和性。稳定地表达外源性Fcγ受体的CHO-K1细胞被20mM EDTA/PBS分解并分散成单个细胞。在冰上，将该细胞与由CHO(CHO-ET101)或CHO-K1-1E5(CHO-1E5-ET101)产生的生物素化抗体孵育1小时。用PBS洗后，将细胞与链霉亲和素-FITC孵育并通过FACS分析进行分析。获得荧光强度的几何学方式并绘图。

图29示出了试验过程，通过该试验过程，在试验动物(如灵长目动物)中评价给定抗体(例如，由CHO-1E5克隆产生的抗体)的免疫原性或其缺失。A)雌性猕猴以8mg/ml/kg的剂量接受由野生型CHO细胞产生的抗体ET101、或由CHO-1E5细胞产生的ET101抗体。注射前收集0.5ml血液共7天并且注射后在第3、5、7、14、21、28、35天收集血液。分离血清样品并冷冻在-80℃。B)采用ELISA检测来检测猕猴中ET101-CHO-1E5抗体的免疫原性。所述检测发现在猴子血清中存在特定的针对所施用的ET-101抗体的IgM。用ET101-CHO或ET101-CHO-1E5抗体覆盖ELISA板。将稀释倍数不同的分离后的猴子血清样品施加到板上以与所覆盖的目标抗体结合。通过抗IgM二级抗体来检测所结合的IgM。C)期望的ELISA结果表明，ET101-CHO和ET101-CHO-1E5在免疫原性(猴子血清中ET101特定的IgM水平)上不存在显著的差异。

发明详述

本申请的组成和方法提供一种细胞系，该细胞系被修饰以具有变异糖基化方式。这种细胞系可以用来产生蛋白质，如效应子功能得以提高(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性得以增加)的抗体。该蛋白质通常也具有变异糖基化方式。

宿主细胞

与未修饰的母本宿主细胞相比，本申请的宿主细胞被修饰以产生变异糖基化方式。宿主细胞包括单个细胞、细胞培养物和/或细胞系。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代。宿主细胞可转染有本申请的异源序列。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，如能够糖基化的细菌细胞、真菌细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。

细菌宿主细胞的例子包括属于Escherichia、Serratia、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Microbacterium、Pseudomonas等种的微生物。例如，细菌宿主细胞可以包括但不限于Escherichia coli XL1-Blue、XL2-Blue、DH1、MC1000、KY3276、W1485、JM109、HB101，No.49、iW3110、NY49、G1698或TB1。其它细菌宿主细胞可以包括但不限于Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066、Brevibacterium flavum ATCC 14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、Corynebacterium glutamicum ATCC 13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354、Pseudomonas putida、Pseudomonas sp.D-0110等。

酵母宿主细胞可以包括属于Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Trichosporon、Schwanniomyces、Pichia、Candida等属的微生物，如Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Candida utilis等。

真核细胞的其它例子包括动物细胞，如哺乳动物细胞。例如，宿主细胞优选包括但不限于中华仓鼠卵巢细胞(CHO)或猴子细胞如COS细胞、CHO细胞可以包括但不限于CHO/dhfr-或CHO/DG44细胞。来自于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞包括任意的细胞，该细胞为由中国仓鼠(Cricetulus griseus)的卵巢组织建立的细胞系。其例子包括文献中所述的CHO细胞，如Journal of Experimental Medicine，108，945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，1275(1968)；Genetics，55，513(1968)；Chromosoma，41，129(1973)；Methods in Cell Science，18，115(1996)；Radiation Research，148，260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.，60，1275(1968)；Cell，6，121(1975)；Molecular Cell Genetics，Appendix I，II(pp.883-900)；等。另外，还可以列举在ATCC(The American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心)中注册的CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUXB11(ATCC CCL-9096)和Pro-5(ATCC CCL-1781)以及市售可得的CHO-S(Life Technologies，Cat#11619)或者通过使用不同培养基使细胞系适应而获得的亚细胞系。

在其它的实施方案中，母本细胞系来自于淋巴谱系细胞系，如B细胞系。该宿主细胞可以为来自在产生杂种瘤时所用的细胞系。它们可以为(例如)来自鼠科动物骨髓瘤株的骨髓瘤细胞，例如但不限于MOPC-21、MPC-11、NS0、SP-2、Sp2/0、S194和X63-Ag8-653细胞；来自人骨髓瘤细胞系的骨髓瘤细胞，例如但不限于Namalwa、Karpas 707H、RPMI 8226、8226AR/NIP4-1、KM-2R和U-266；或来自大鼠骨髓瘤细胞系骨髓瘤细胞，例如但不限于YB2/0、YB2/3.0.Ag.20、Y3-Ag1.2.3、IR983F。本申请中也可使用这样的细胞系，如HeLa、HEK-293、NIH3T3、COS、CHO、NSO、PER.C6、K562、L1.2、JY、BHK、K562、293F、3T3、以及Jurkat。例如，在一些实施方案中，宿主细胞为CHO-1E5、CHO-3F或CHO-2.6克隆。

昆虫宿主细胞的例子包括秋粘虫(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞，如Sf9和Sf21(Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992))；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢细胞，如High 5(Invitrogen生产)；等。植物宿主细胞的例子包括烟草、马铃薯、西红柿、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麦、大麦等的植物细胞。

本申请的经修饰的宿主细胞可以在培养物、以及可以用来使培养物生长的装置(包括发酵罐)中生长。它们可以生长成为单层或附着在表面上。或者，宿主细胞可以在悬浮液中生长。该细胞可以在不含血清的培养基中生长。所述培养基可以是市售的培养基，例如但不限于补充有谷氨酰胺(如8mM L-谷氨酰胺)的Opti-CHO(Invitrogen，编号#12681)。经修饰的宿主细胞在培养基中可以很多代地保持其变异糖基化方式。例如，经修饰的宿主细胞在至少约20、30、40或50代后仍保持其变异糖基化方式。在一些实施方案中，经修饰的宿主细胞在至少约60代后仍保持其变异糖基化方式。在另一个其它实施方案中，经修饰的宿主细胞在至少约100、150、200、500或1000以上的代之后仍保持其变异糖基化方式。

在一些实施方案中，宿主细胞为非淋巴细胞。淋巴细胞为脊椎动物免疫系统中的一种白血细胞。淋巴细胞通常包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞。非淋巴细胞包括任意类型的不是淋巴细胞的细胞。本发明的宿主细胞可以具有选自人、小鼠、大鼠、果蝇、蠕虫、酵母和细菌的物种起源。宿主细胞可以来自合适的组织，包括但不限于血液、肌肉、神经、脑、心脏、肺、肝、胰脏、脾、胸腺、食道、胃、肠、肾脏、睾丸、卵巢、头发、皮肤、骨头、胸、子宫、膀胱、脊髓、或各种体液。产生N-多糖的宿主细胞可以来自任意的发育阶段(包括胚胎和成熟阶段)，以及起源如内胚层、中胚层和外胚层起源。在一些实施方案中，宿主细胞为CHO、NS0、SP2/0、HEK293、PER.C6或YB2/0细胞。

产生经修饰的细胞系

本申请提供一种产生和选择宿主细胞的方法，其中所述宿主细胞被修饰以产生变异糖基化方式。选择具有经修饰的糖基化方式的宿主细胞的方法可以包括：提供多个宿主细胞；将随机基因突变引入到所述多个宿主细胞中；以及从所述多个细胞中选择至少一个表现出变异糖基化方式的细胞，其中变异糖基化方式的特征在于，与对应的未进行随机基因突变的母本细胞相比，至少一种糖分子的水平发生改变。宿主细胞可以为本文中描述的那些细胞中的任意一种，包括真核细胞如CHO细胞或YB2.0细胞。

可以通过诱变剂来诱导基因突变。诱变剂可以为但不限于，遗传试剂、化学试剂或辐射性试剂。例如，诱变剂可以是电离辐射，例如但不限于紫外光、γ射线或α粒子。其它的诱变剂可以包括但不限于：碱基类似物，其可以引起复制错误；脱氨基试剂，如亚硝酸；嵌入剂，如转位子化乙锭；烷基化试剂，如转位子尿嘧啶；转位子；天然及合成的生物碱；溴及其衍生物；叠氮化钠；补骨脂素(例如，与紫外线辐射并用)。诱变剂可以为化学诱变剂，例如但不限于ICR191、1，2，7，8-二环氧基-辛烷(DEO)或甲磺酸乙酯(EMS)。当被引入到宿主细胞中时，不同的诱变剂可以依次或同时合用。

所述方法可以包括图1和2中所示的方法，或者如实施例2所描述的方法。例如，为了修饰宿主细胞群以获得具有变异糖基化方式的经修饰的宿主细胞，可以向细胞施加一种或多种诱变剂(如化学诱变剂)以引起随机基因突变。化学-诱导的随机变异可以导致控制或调节糖生物合成和蛋白质糖基化过程(例如但不限于岩藻糖基化、甘露糖基化和/或N-乙酰基葡萄糖氨基化)的基因突变。化学诱变剂也可以选择性地杀死具有特定糖基化方式的宿主细胞(如具有高岩藻糖基化的宿主细胞)。因此，可以通过选择具有LCA-毒素的细胞(其特定靶向并消除具有高岩藻糖基化的细胞(参见图1和2，实施例2))，来富集和分离变异后岩藻糖基化水平降低的稳定克隆。可以选择已被基因修饰为具有变异糖基化方式的宿主细胞，以便保持在无血清培养基中、在悬浮液中生长以及/或者在发酵罐中生长。经修饰的宿主细胞还可以产生能够被收获或收集的糖蛋白。如本文中进一步所描述的那样，糖蛋白可以被分泌，表现出变异糖基化方式，以及/或者具有治疗用途。如本文中进一步所描述的那样，糖蛋白可以被异源序列和/或抗体编码，所述抗体例如为与对应的由未修饰的母本宿主细胞产生的抗体相比、ADCC活性增加的抗体。

母本宿主细胞的糖基化方式可以与经修饰的宿主细胞的变异糖基化方式相当，并且可以通过一种或多种糖分子的水平变化来证明。例如，如本文中进一步所描述的那样，变异糖基化方式的特征在于，选自岩藻糖基化、甘露糖基化和N-乙酰基葡萄糖氨基化中的至少两种糖基化发生改变。另外，变异糖基化方式可以通过葡萄糖和/或半乳糖的水平变化(如葡萄糖增加且半乳糖降低)来证明。其它的变化如下所述。

糖基化方式

本申请的宿主细胞被修饰以产生变异糖基化方式，其特征在于，例如，与未修饰的母本宿主细胞相比，宿主细胞表面上的至少两种糖分子的水平发生变化。本申请的宿主细胞也可以用来产生蛋白质或糖蛋白。蛋白质可以是抗体或酶，并且可以用于治疗。另外，糖蛋白可以被分泌。蛋白质可以是异源蛋白质，例如通过将异源序列引入到表现出变异糖基化方式的经修饰的宿主细胞中而产生的蛋白质。“异源”是指来自于基因型方面不同的实体，该实体的其余部分相当，并且能够被用于多核苷酸(如核苷酸序列)或多肽(其是指多核苷酸或多肽或蛋白质)。

本申请的蛋白质或糖蛋白可以是内源的或异源的，并且在已被修饰表现出变异糖基化方式的宿主细胞中产生。糖蛋白也可以表现出变异糖基化方式，其特征在于，与对应的野生型糖蛋白(如，在未修饰的宿主细胞中产生的糖蛋白)相比，至少两种糖分子的水平发生改变。糖分子可以直接与糖蛋白连接(例如，N-或O-连接的糖蛋白)，或者间接地与糖蛋白连接(例如，通过其它的作为N-或O-连接的糖蛋白的糖连接)。在这些链中不同糖分子含量导致的糖链结构变化或变异糖基化方式在糖蛋白的效应子功能中发挥重要的作用。例如，糖蛋白的变异糖基化方式可以增加糖蛋白的效应子功能，例如增加抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。

宿主细胞的糖基化方式可以是任何蛋白质部分发生N-或O-糖基化，其中，可以分别在天冬酰胺的酰胺氮处、或者羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸的羟基氧处添加一个或多个糖分子。糖基化方式的特征在于，至少两个或多个糖分子或糖类(如单糖、二糖、多糖或寡糖)的水平发生改变。例如，糖分子可以是三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、九糖、或它们的衍生物，如脱氧糖(如脱氧六糖)；N-或O-取代的衍生物，如唾液酸；或者具有氨基的糖。糖分子可以包括但不限于半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、N-乙酰基神经氨酸(NeuAc)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)；以及木糖(Xyl)。糖分子可以通过α或β连接而与其它糖分子连接。

本申请的变异糖基化方式可以通过至少两种糖分子的水平变化来证明，并且可以通过宿主细胞或糖蛋白不同类型的糖基化的变化来证明。例如，岩藻糖基化、甘露糖基化、N-乙酰基葡萄糖氨基化和/或它们的组合的水平可以用来证明变异糖基化方式。例如，与未修饰的母本细胞相比，经修饰的宿主细胞中，岩藻糖基化、甘露糖基化和/或N-乙酰基葡萄糖氨基化的水平可以降低或增加。与对应的野生型糖蛋白(即，在未修饰的母本宿主细胞中产生的糖蛋白)相比，糖蛋白的岩藻糖基化、甘露糖基化和/或N-乙酰基葡萄糖氨基化水平可以降低或增加。例如，与对应的由所述未修饰的宿主细胞产生的野生型糖蛋白相比，异源糖蛋白的岩藻糖、甘露糖和/或N-乙酰基葡萄糖胺含量水平可以降低。糖基化可以涉及α-或β-连接的糖，如α-或β-连接的甘露糖或α-或β-连接的N-乙酰基葡萄糖胺。另外，与未修饰的母本宿主细胞相比，具有变异糖基化方式的宿主细胞还可以包含1，6-岩藻糖基转移酶基因活性和/或保持该活性。

本申请的变异糖基化方式可以通过与未修饰的母本细胞相比，葡萄糖、半乳糖或这二者的水平发生变化来证明。例如，半乳糖水平可以增加或降低。葡萄糖水平也可以增加或降低。在一些实施方案中，如图10A和B所示，该变化可以是：葡萄糖水平增加、半乳糖水平降低，或者葡萄糖水平增加且半乳糖水平降低。如图16和20所示，变异糖基化方式可以包括葡萄糖和/或半乳糖变化，同时其它单糖(例如但不限于岩藻糖、葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基葡萄糖胺)水平发生变化。本文关注的是：与母本细胞相比，糖的不同组合以及这些糖的变化水平(例如，水平的增加或降低)。

变异糖基化方式可以通过至少两种糖分子的水平变化来证明，其中，至少一种糖分子的水平变化为至少约2倍。或者，至少两种糖的水平变化为至少约2倍。所述变化可以是糖分子水平的增加或降低。水平变化可以是至少约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、75、100、500、1000备或更高。

在一些实施方案中，本发明提供一种包含N-连接多糖的组合物，当在抗体显示时，使得该抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性提高。N-连接多糖与蛋白质的天冬酰胺侧链的酰胺氮相连。有3种主要类型的N-连接糖类：高-甘露糖寡糖，复合寡糖和杂化寡糖。高-甘露糖N-连接多糖通常包含两个具有多个甘露糖残基的N-乙酰基葡萄糖胺。复合寡糖通常包含差不多任意数量的其它类型的糖类。蛋白质可以在蛋白质的不同位置处被两种类型的寡糖糖基化。N-连接多糖可被各种不同的单糖(包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰基葡萄糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、岩藻糖和唾液酸)修饰。

可以通过示例性的经修饰的CHO细胞克隆(以CHO-1E5表示)来制备N-连接寡糖的所述N-连接多糖组成和结构。通过CHO-1E5来制备抗体上的单一N-多糖结构。CHO-1E5具有改变的N-多糖生物合成，并且由该宿主细胞克隆产生的抗体表现出由葡萄糖、甘露糖和N-乙酰基葡萄糖胺构成的糖基化方式，该糖基化方式可以有岩藻糖也可以没有岩藻糖。N-多糖的结构式已被确认为Glu-GlcNAC2-Man4(+/-Fuc)。该多糖具有核心N-连接寡糖：3Man-2 GluNAc的基本结构，可以有岩藻糖也可以没有岩藻糖，但缺少两个外侧乙酰基葡萄糖胺。葡萄糖分子和额外的甘露糖分子与核心寡糖的一个侧链相连(图15)。在一些实施方案中，糖基化方式表示结构式(I)的组成，其中，岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一个4GlcNAc连接：

在一些实施方案中，糖基化方式表示结构式(II)的组成，其中，岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一个4GlcNAc连接。

上面所描绘的以及图15中的结构式(I)和(II)表明，在所述N-连接多糖中，可以存在岩藻糖分子或不存在岩藻糖分子。在一些实施方案中，所述N-连接多糖包含一个葡萄糖分子。在一些实施方案中，葡萄糖分子位于所述N-连接多糖的末端(即，末端葡萄糖)。在一些实施方案中，所述N-连接多糖包含一个或多个末端葡萄糖分子。在一些实施方案中，所述N-连接多糖包含四个甘露糖分子。在一些实施方案中，所述N-连接多糖包含两个N-乙酰基葡萄糖胺分子。

在一些实施方案中，糖基化方式表示结构式(I)和(II)的混合组成。在一些实施方案中，与由野生型母本宿主细胞产生的N-多糖相比，由本发明的经修饰的宿主细胞(表示为CHO-1E5)合成的N-多糖缺少半乳糖，岩藻糖和N-乙酰基葡萄糖胺水平降低，并且含有末端葡萄糖(图16)。在一些实施方案中，由CHO-1E5克隆表现的N-多糖的特征在于，MALDI-TOF MS分析为单峰，这表明为基本上同种群寡糖。

可以使用试剂来检查宿主细胞或糖蛋白的糖基化方式，其中所述试剂特异性或偏好性地识别或结合特定的糖分子或蛋白质部分(其与特定的糖分子相关或被特定的糖分子修饰)。所述试剂可以包括但不限于：扁豆凝集素-A(LCA)，其为特异性地与被岩藻糖修饰的蛋白质结合的化学品；麦胚凝集素(WGA)，其偏好性地与N-乙酰基葡萄糖胺结合；伴刀豆球蛋白A(Con A)，其识别α-连接的甘露糖；以及加纳籽外源凝集素II(GS-II)，其与α-或β-连接的N-乙酰基葡萄糖胺残基结合。

所述试剂可以直接或间接检测。例如，可以将所述试剂与示踪剂结合。可以使用任何的可检测的示踪剂，如荧光示踪剂。检测方法在本领域中是已知的，如可以使用流式细胞术来检测和/或分离被标记的细胞。例如，可以通过荧光激活细胞分类术(FACS)来检测和/或分离。示踪剂可以包括荧光素或其衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿、东京绿、SNAFL、羧基萘并荧光素(CFSE)、羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)、DyLight 488、Alexa Fluor 488、绿荧光蛋白质(GFP)、藻红蛋白(PE)、甲藻素-叶绿素蛋白质(PerCP)、PE-Alexa Fluor 700、PE-Cy5(TRI-COLOR)、PE-Cy5.5、PE-Alexa Fluor 750、PE-Cy7、别藻蓝蛋白(APC)、APC-Cy7、以及它们的衍生物。还可使用上述示踪剂来分析糖蛋白的糖基化方式。或者，例如，可以通过使用抗体检测试剂来直接检测所述试剂，如通过本领域已知的Western印迹法和其它方法。

其它的分析糖基化方式的方法可以包括不同类型的糖(如中性糖和具有氨基的糖)的组成分析。例如，可以分析中性如半乳糖、甘露糖、岩藻糖等；具有氨基的糖如N-乙酰基葡萄糖胺等；以及酸性糖如唾液酸等。可以通过糖链酸水解来释放中性糖或氨基糖以分析组成比。方法可以包括但不限于利用由Dionex生产的糖组成分析仪(BioLC)的方法。BioLC为采用HPAEC-PAD(高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法)方法来分析糖组成的仪器(Rocklin等人，J.Lig.Chromatogr.6(9)，1577-1590(1983))。也可以利用2-氨基吡啶(PA)通过荧光标记法来分析组成比。具体来说，根据已知方法(Kondo等人，Agric.Biol.Chem.，55(1)，283-284(1991))用2-氨基吡啶将酸水解后的样品荧光标记并进行HPLC分析，从而可以计算组成比。

也可以通过二维糖链绘图法(Tomiya等人，Anal.Biochem.，171，73-80(1988)；Biochemical Experimentation Method 23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chains(Gakkai Shuppan Center)，Reiko Takahashi编，(1989))来分析糖基化方式。二维糖链绘图法为这样的方法，其中，例如，将由反相色谱法获得的糖链保留时间或洗脱位置作为X轴，将由正相色谱法获得的糖链保留时间或洗脱位置作为Y轴，进行绘图，并将结果与已知糖链相比，由此推断糖链结构。

通过肼解作用可以释放糖链，然后用2-氨基吡啶将糖链荧光标记(Hase等人，J.Biochem.，95，1973203(1984))。通过凝胶过滤将糖链从过多的PA试剂等中分离出来，并进行反相色谱法。接着，通过正相色谱法来分析分级后的糖链的各峰。基于这些结果，通过将各点描绘在二维糖链图中并将它们与标准糖链(由Takara Shuzo生产)或对照品相比，可以推断糖链结构(Tomiya等人，Anal.Biochem.，171，73-80(1988))。

另外，可以通过各糖链的质谱(如MALDI-TOF-MS等)来分析糖基化方式。

异源序列

本申请的经修饰以产生变异糖基化方式的宿主细胞可以包含异源序列。异源序列可以包含核酸序列。如本文所用的那样，核酸序列可与多核苷酸、核苷酸、核苷酸序列、核酸和寡核苷酸互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，或者为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者它们的类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构，并且可以进行已知或未知的任何功能。下面是多核苷酸的非限定性例子：基因或基因片段的编码区或非编码区，由连接分析限定的位点、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的孤立DNA、任何序列的孤立RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果需要的话，可以在组装聚合物之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分隔开。聚合之后多核苷酸可以进一步被修饰，例如与标记物结合。

本申请的异源序列可以编码蛋白质部分，所述蛋白质部分是指蛋白质、多肽、肽、氨基酸序列，包括任意长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以直链或直链的，可以包括经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸隔开。所述蛋白质部分包括已被修饰的氨基酸聚合物，例如，形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰基化、磷酸化、或者任意的其它改变(如与标记物结合)。另外，氨基酸是指天然和/或非天然或合成氨基酸中的任意一者，包括但不限于甘氨酸和D或L光学异构体、以及氨基酸类似物和拟肽类。采用标准的单个字母或三字母来表示氨基酸。

本申请的由异源序列编码的蛋白质通常为糖蛋白，可以包括但不限于酶或免疫功能分子(如抗体)。产生变异糖基化方式的经修饰细胞系可以表达异源序列，该异源序列产生抗体(人化的或嵌合体)、抗体片段、细胞因子、荷尔蒙或感兴趣的任意其它蛋白质。细胞系产生的蛋白质可以由细胞分泌并获得。或者，可以收获细胞并从细胞提取蛋白质。这些蛋白质或糖蛋白可以用于治疗，以产生有益的或所需的结果。

异源序列可以包括载体，其为核酸分子，优选自我复制，其将插入的核酸分子转运至宿主细胞和/或转运在宿主细胞间。载体可以包括那些主要起到将DNA或RNA插入到细胞中的作用的载体、主要起到复制DNA或RNA作用的复制载体、以及起到转录和/或翻译DNA或RNA作用的表达载体。还包括提供上述功能中的一种以上功能的载体。表达载体为多核苷酸，当被引入到合适的宿主细胞中时，其能够被转录并翻译成多肽。

编码蛋白质的异源序列可以由多个或多个载体表达。在单个操纵子中、或者在置于一个或多个载体中的分离操纵子中，核酸序列可以以任意顺序排列。根据需要，可以采用两个或多个表达载体，每个表达载体都含有一个或多个异源序列(其可操作地连接在单个操纵子中)。连接是指两个以上化学成分或组分连接在一起，不管任何方式，都包括化学结合或重组方式。可操作地连接是指毗邻，其中，所述的组分可以以所需的方式发挥作用。例如，如果启动子序列促进编码序列的转录，则启动子序列连接至或者可操作地连接至编码序列。

虽然单个或多个载体的选择以及单个或多个启动子的使用可以取决于异源序列的大小以及载体的能力，但是，很大程度上取决于给定的糖蛋白的总体产量(当在选择的宿主细胞中表达时载体能够提供的产量)。在某些情况下，双操纵子表达系统可提供较高产量的糖蛋白。所述载体可以以游离的方式保持可复制，或者作为宿主细胞基因组的组成部分。

本申请的异源序列可以在单个调控成分的控制之下。在一些情况下，异源核酸序列受单个启动子的调控。在其它情况下，异源核酸序列被置于单个操纵子中。在其它的情况下，异源核酸序列置于单个读取框中。

可以通过各种常规重组技术和合成方法来制备所述核酸。标准的重组DNA和分子克隆技术在本领域中是已知的，并且在文献Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)和文献T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)以及文献Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in分子Biology，pub.by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)中有所描述。简而言之，所述核酸可以由基因性DNA片段、cDNA和RNA制得，所述基因性DNA片段、cDNA和RNA可以从细胞直接提取得到，或者通过各种扩增法(包括但不限于PCR和rt-PCR)重组制得。

核酸的直接化学合成通常涉及向生长的核苷酸聚合物链的5’-羟基末端依次添加3’-封闭的和5’-封闭的核苷酸单体，其中，每次添加都受到所添加单体(通常为磷衍生物，如磷酸三酯、亚磷酰胺等)的3’-位置处的生长链的5’-羟基末端的亲核性攻击的影响。这种方法学对于本领域技术人员是已知的，并且在有关的教科书和文献(例如，Matteuci等人，Tet.Lett.521：719(1980)；Caruthers等人的美国专利No.4,500,707；以及Southern等人的美国专利No.5,436,327和5,700,637)中有所描述。

调控成分包括(例如)启动子和操作子，它们也能够被工程化以增加编码糖蛋白的一个或多个异源序列的表达。启动子为这样的核苷酸序列，其通过RNA聚合酶来启动并控制核酸序列的转录。操作子为与启动子相邻的核苷酸序列，其作用是控制所需核酸序列的转录。操作子含有蛋白质结合域(其中特定的抑制蛋白质可以结合)。当不存在合适的抑制蛋白质时，通过启动子启动转录。当存在合适的抑制蛋白质时，该抑制蛋白质与操作子合从而抑制启动子转录。

在本申请的一些实施方案中，表达载体中所用的启动子为可诱导的。在其它实施方案中，表达载体中所用的启动子为组成的。在一些实施方案中，一个或多个核酸序列与可诱导的启动子可操作地连接，并且一个或多个其它核酸序列与组成的启动子可操作地连接。用于真核宿主细胞的合适的启动子的非限定性例子包括但不限于CMV介导的早期启动子、HSV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子、早期或晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR、以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。

表达载体中的基因通常也会编码核糖体结合位点以直接翻译(即，合成)任何的编码后的mRNA基因产物。可用于表达载体中的其它调控成分包括转录增强子成分和转录终止子。例如，参见Bitter等人，Methods in Enzymology，153：516-544(1987)。

表达载体可以适用于某一类型的宿主细胞而不适用于其它细胞。但是，本领域技术人员通过常规的试验能够容易地确定某一表达载体是否适用于给定的宿主细胞。例如，表达载体可被引入到宿主有机体中，然后，监测载体中所含的任何基因的存活性和表达。

表达载体还可以含有一个或多个选择性标记基因，表达时，使得一个或多个表型特征可用于选择或识别宿主细胞(其携带表达载体)。用于真核细胞的合适的选择性标记物的非限定性例子包括二氢叶酸还原酶和抗新霉素剂。

通过各种已建立的所述载体技术，可将所述载体稳定地或暂时地引入到宿主细胞中。例如，一个方法涉及氯化钙处理，其中，通过钙沉淀引入表达载体。根据相似的过程，也可以使用其它盐，例如磷酸钙。另外，可以采用电穿孔(即，施加电流以增加细胞渗透至核酸的性能)。其它转变方法包括微注射、DEAE葡聚糖介导的转变、以及在醋酸锂存在下的热休克。还可以采用脂质复合物、脂质体和树枝状聚合物以转染宿主细胞。

将异源序列引入到宿主细胞中后，可以采用各种方法来识别其中引入有所述载体的宿主细胞。一个示例性选择方法涉及将各个细胞次培养以形成各个克隆，然后检测所需蛋白质产物的表达。其它方法包括基于表型特征(其是通过表达载体中所含的选择性标记基因的表达而赋予的)来选择含有异源序列的宿主细胞。本领域技术人员通过采用这些方法或者本领域可获得的其它方法可以识别基因上经修饰的宿主细胞。

例如，可以通过这样的方法如PCR、DNA印迹或RNA印迹杂化来确认本申请中不同异源序列引入到宿主细胞中。例如，可以由获得的宿主细胞制得核酸，通过使用了感兴趣序列的特定引物的PCR来扩增感兴趣的特定序列。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，然后用溴化乙锭、SYBR Green溶液等进行染色，或者用UV检测器来检测DNA。或者，在杂化反应中可以采用特定用于感兴趣序列的核酸探针。可以通过反转录偶合PCR、RNA印迹杂化来检测对应的mRNA、或者通过使用与编码后的基因产物反应的抗体进行免疫检测，由此确定特定基因序列的表达。示例性的免疫检测包括但不限于ELISA、放射免疫检测和夹心免疫检测。

另外，可以通过编码异源序列的酶的酶活性来确认本申请的不同异源序列引入到宿主细胞中。可以通过本领域已知的各种方法来检测酶。一般来说，可以通过产物的形成、或者在研究条件下的酶反应的底物的转化来确认酶活性。所述反应可以在体内或体外进行。

抗体的制备

在一个方面中，本申请提供产生抗体的宿主细胞，其被修饰以产生变异糖基化方式。本文所用的抗体包括所有形式的抗体，如重组抗体、人源化抗体、嵌合体抗体、单链抗体、融合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体等。该抗体可为片段。该抗体还可以与药物、毒素或治疗用放射性同位素结合。本申请的宿主细胞也可产生双特异抗体融合蛋白质，包括与一个以上抗原结合的杂化抗体。因此，抗体包括裸抗体和结合抗体以及抗体片段，它们可以是单特异性或多特异性。

抗体还可以具有变异糖基化方式，其特征在于，与对应的野生型抗体(即，未修饰的母本宿主细胞中产生的抗体)相比，至少两种糖分子的水平发生变化。糖分子可以直接与糖蛋白连接(例如，N-或O-连接的糖蛋白)，或者间接与糖蛋白连接(例如，通过其它糖(其为N-或O-连接的糖蛋白)进行连接)。由该链中不同糖分子的含量导致的糖链结构变化或变异糖基化方式在糖蛋白的效应子功能中发挥重要作用。例如，如上所述，抗体的变异糖基化方式能够提高抗体的效应子功能，如提高抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。与对应的在未修饰的母本宿主细胞中所产生的抗体相比，至少两种糖分子(它们通过抗体的Fc区而连接)的水平发生改变，可以证明变异糖基化方式。

在一些实施方案中，抗体的N-多糖具有结构式Glu-GlcNAC2-Man4(+/-Fuc)。在一些实施方案中，抗体具有结构式(I)所示的糖基化方式，其中岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一4GlcNAc连接：

在一些实施方案中，抗体具有结构式(II)所示的糖基化方式，其中岩藻糖部分可以任选地从右侧与第一4GlcNAc连接：

结构式(I)和(II)包括两种形式，其中，在所述N-多糖中存在或不存在一个或多个岩藻糖分子。在一些实施方案中，在N-多糖中存在岩藻糖。在其它实施方案中，在N-多糖中不存在岩藻糖。

所产生的抗体可以为五个主要类型的全抗体(如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中的一种。所产生的抗体为选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2中的一个亚型。

本申请的抗体可以为单克隆，是指来自一群基本上同种抗体的抗体，即，包含该群的单个抗体是一样的和/或结合相同的表位，不包括在单克隆抗体制备过程中产生的可能变异，这种变异的存在量一般很低。这种单克隆抗体通常包括这样的抗体，该抗体包含与靶标结合的多肽序列，其中，与靶标结合的多肽序列可以通过这样的过程而获得，该过程包括从多个多肽序列中选择单个的与靶标结合的多肽序列。例如，该选择过程可以为：从多个克隆(如杂种瘤克隆池、噬菌体克隆或重组DNA克隆)中选择单一克隆。

应该理解的是，所选择的与靶标结合的序列可以进一步被改变以(例如)提高靶标亲和性，使得与靶标结合的序列人化，提高其在细胞培养物中的生产，降低体内免疫原性，产生多特异性抗体等，并且包含改变后的与靶标结合的序列的抗体为本申请的单克隆抗体。与多克隆抗体制剂(其通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体)不同，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制剂由于它们通常不会被其它免疫球蛋白污染因而是有益的。术语″单克隆″是指抗体具有这样的性质：其得自基本上同种抗体群，并且不会被解释为需要通过任何特定方法来制备抗体。例如，本申请中所用的单克隆抗体可以通过各种技术获得，包括(例如)杂种瘤方法(如，Kohler等人，Nature，256：495(1975)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling等人，：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681，(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA法(例如参见美国专利No.4,816,567)，噬菌体显示技术(例如参见Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))，以及在动物(其具有一部分或全部的编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白位点或基因)中产生人或类人抗体的技术(例如参见WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；GenPharm的美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,591,669；美国专利No.5,545,807；WO 1997/17852；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature，368：856-859(1994)；Morrison，Nature，368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology，14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14：826(1996)；以及Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995))。

本文的单克隆抗体包括嵌合体抗体，其中一部分重链和/或轻链与来自特定种的抗体或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的对应序列一致或同源，而其余部分的链与来自其它种的抗体或属于其它抗体类型或亚型的抗体中的对应序列、以及这种抗体的片段一致或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合体抗体包括″灵长动物源″抗体，其包括来自非人类的灵长目动物(如旧大陆猴、猩猩等)的可变域抗原结合的序列以及人恒定区序列。

本申请的宿主细胞还可用于制备产生抗体的杂种瘤。小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠、山羊、绵羊、狗、马、猪、大鼠、兔、狗、猫、或沙鼠等)可被免疫以诱发淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将与免疫用蛋白质特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可以在体外被免疫。然后使用合适的融合试剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂种瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。

这样制得的杂种瘤细胞被播种并在合适的培养基(优选含有一种或多种抑制未融合的母本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质)中生长。例如，如果母本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂种瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、以及胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺乏细胞的生长。

在一个实施方案中，使用骨髓瘤细胞以通过所选择的产生抗体的细胞来有效地融合、支持稳定的高水平产生抗体，并且骨髓瘤细胞对诸如HAT培养基之类的培养基敏感。在一些实施方案中，骨髓瘤细胞系为鼠科动物骨髓瘤株(包括但不限于MOPC-21、MPC-11、SP-2或X63-Ag8-653细胞)、人骨髓瘤细胞系(包括但不限于Karpas 707H、RPMI 8226、8226AR/NIP4-1、KM-2R或U-266)、或大鼠骨髓瘤细胞系(包括但不限于YB2/3.0.Ag.20、YB2/0、Y3-Ag1.2.3、IR983F)。

对其中有杂种瘤细胞生长的培养基检测是否产生针对抗原的单克隆抗体。可通过免疫沉淀反应或体外结合检测(如放射免疫检测(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA))来确定杂种瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和性(例如)可以通过Scatchard分析来确定(例如参见Munson等人，Anal.Biochem.107：220(1980))。

待杂种瘤细胞确认能够产生所需特异性、亲和性和/或活性的抗体之后，通过限定稀释过程可以将克隆进行亚克隆并通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于该目的的合适的培养基包括(例如)D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂种瘤细胞可以在动物体内生长为腹水肿瘤。

然后，通过常规的抗体纯化过程(例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、或亲和色谱法)，可以从培养基、腹水液或血清中分离亚克隆所分泌的单克隆抗体。

在一些实施方案中，单克隆抗体可被(1)纯化至大于抗体的95重量％(通过Lowry法测定)，最优选大于99重量％；(2)纯化至足以获得至少15个N-末端残基或内部氨基酸序列的程度(通过使用自旋转杯式测序仪)；或者(3)通过使用考马斯亮蓝或优选银染色在还原或非还原条件下采用SDS-PAGE而纯化至同质。

在其它的实施方案中，由本申请的方法产生的细胞群通过重组DNA法而用于制备抗体(美国专利No.4,816,567，其全文以引用的方式并入本文)。表现出变异糖基化方式的经修饰的宿主细胞可由母本细胞系如HeLa、HEK-293、NIH3T3、COS、CHO、NSO、PER.C6、K562、L1.2、JY、BHK、K562、293F、3T3或Jurkat产生。在其它的实施方案中，经修饰的宿主细胞来自这样的母本细胞系，该细胞系来自淋巴谱系细胞系(如B细胞系)。

在一个实施方案中，用于编码重链或轻链的信使RNA(mRNA)由合适的来源(如成熟B细胞或杂种瘤培养物)分离得到，通过采用标准的RNA分离纯化技术以及可任选的基于大小的分离法而获得。然后，通过采用本领域已知的技术(如cDNA文库构建、噬菌体文库构建和筛选或采用特定相关引物的RT-PCR)来制备和分离与用于编码重链或轻链的信使RNA相对应的cDNA。在一些实施方案中，cDNA序列可以为这样的序列：在体外通过使用已知的DNA操纵技术来全部或部分地制备该序列，以产生特定的所需cDNA。然后，cDNA序列可被定位在载体中，其中所述载体在读取框中含有具有基因的启动子并且与低水平的经修饰的宿主细胞相容。许多含有合适的启动子、控制序列、核糖体结合位点和转录终止位点以及可任选的常规标记物的质粒在本领域中是已知的，它们包括但不限于美国专利No.4,663,283和4,456,748中所描述的载体。在一个实施方案中，用于编码轻链的cDNA和用于编码重链的cDNA可以分别被插入到单独的表达质粒中。在其它的实施方案中，用于编码轻链的cDNA和用于编码重链的cDNA可以可以一同被插入到相同的质粒中，只要每个cDNA均处于合适的启动子和翻译控制下即可。

然后可使用上述所构建的表达载体以改变本申请的经修饰的宿主细胞。在一个实施方案中，轻链和重链可被改变成单独的经修饰的宿主细胞培养物，可以是相同的种类也可以是不同的种类。在其它的实施方案中，可以使用用于轻链和重链的单独的质粒来共同改变单个的经修饰的宿主细胞培养物。在其它的实施方案中，含有轻链和重链这两种基因并且能够表达这两种基因的单个的表达质粒可被改变成单个的经修饰的宿主细胞培养物。

当重链和轻链在相同的宿主中共同表达时，设计分离过程以回收再生抗体。这可以通过常规的抗体纯化过程(例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)来完成。

在一些实施方案中，通过重组方法纯化的单克隆抗体可被(1)纯化至大于抗体的95重量％(通过Lowry法测定)，最优选大于99重量％；(2)纯化至足以获得至少15个N-末端残基或内部氨基酸序列的程度(通过使用自旋转杯式测序仪)；或者(3)通过使用考马斯亮蓝或优选银染色在还原或非还原条件下采用SDS-PAGE而纯化至同质。

通过如上所述的重组方法产生的抗体可以为人源化抗体，如人嵌合体抗体或人互补决定区(CDR)移植抗体。非人类(如小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、马、牛或兔)抗体的人化形式为嵌合体抗体，其含有来自非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体通常为人免疫球蛋白(受者抗体)，其中，来自受者的高变区的残基被来自具有所需特异性、亲和性和性能的非人类(供体抗体)如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、马、兔或非人类灵长目动物的高变区的残基所取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的骨架区(FR)残基被对应的非人类残基所取代。另外，人源化抗体可以包含这样的残基，该残基在受者抗体或供体抗体中未发现。进行这些修饰以进一步精制抗体性质。总体来说，人源化抗体基本上都包含至少一个、通常两个可变区，其中，全部的或基本上全部的对应于非人类免疫球蛋白的高变区环以及全部的或基本上全部的FR都是人免疫球蛋白序列的高变区环和FR。人源化抗体还可任选地包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为一部分人免疫球蛋白。更详细情况参见文献Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

术语“可变”是指抗体中序列大范围不同的某部分可变区，并且该可变区用于特定抗原用的各个特定抗体的结合性和特异性。但是，在抗体的整个可变区中，可变性通常并不是均匀地分布。通常集中在轻链和重链可变区的三个所谓的高变区部分中。可变区的保存程度更高的部分称为骨架区(FR)。天然的重链和轻链的可变区均包含四个FR，很大程度上采用β-折叠构型，由三个高变区连接，这形成环连接，在某些情况下，形成部分β-折叠结构。每个链中的高变区通过FR而彼此相邻地保持在一起，并且通过与来自其它链的高变区一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定区不直接涉及抗体对抗原的结合性，但是表现出不同的效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

本文中使用术语“高变区”时是指抗体的氨基酸残基(其与抗原结合性有关)。高变区一般包含来自CDR的氨基酸残基(如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变区中的残基31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))和/或来自″高变区环″的残基(如，轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。″骨架区″或″FR″残基为除了此处所定义的高变区残基之外的其它可变区残基。

人嵌合体抗体为这样的抗体，其包括：人之外的其它动物的抗体重链可变区(下文称为″HV″或″VH″，重链称为″H链″)和抗体轻链可变区(下文称为″LV″或″VL″，轻链称为″L链″)；人抗体重链恒定区(下文也称为″CH″)和人抗体轻链恒定区(下文也称为″CL″)。作为人之外的其它动物，可以使用任何的动物如小鼠、大鼠、仓鼠、兔等，只要能够从其中制得杂种瘤即可。

通过从产生单克隆抗体的杂种瘤获得cDNA的编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并将它们插入到用于具有基因(其编码人抗体CH和人抗体CL)的宿主细胞的表达载体中从而构建人嵌合体抗体表达载体，然后将该载体引入到岩藻糖基化低的细胞中以表达所述抗体，从而可以产生人嵌合体抗体。

关于人嵌合体抗体的重链恒定区(CH)，可以使用任何的CH，只要其处于人免疫球蛋白(下文称为″hIg″)类即可。在一些实施方案中，CH属于hIgG类、或者属于hIgG类的一个亚型，如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。与此类似，关于人嵌合体抗体的轻链恒定区(CL)，可以使用任何的CL，只要其属于hIg类即可。在一些实施方案中，人嵌合体抗体的轻链恒定区(CL)属于κ类或λ类。

通过构建cDNA的编码可变区(其中，CDR的来自人之外的其它动物的抗体的VH和VL被移植到CDR的人抗体的VH和VL中)，并将它们插入到用于具有基因(其编码人抗体CH和人抗体CL)的宿主细胞的表达载体中从而构建人CDR移植的抗体表达载体，然后将该表达载体引入到本申请的经修饰的宿主细胞中以表达人CDR移植的抗体，从而可制备人CDR移植抗体。

优选的是，与母本抗体相比，本发明的抗体基本上保持与抗原结合的能力。在一些实施方案中，本发明的抗体表现出较高的与抗原的结合亲和性，与母本抗体相比，例如至少高1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4或5倍。在其它的实施方案中，本发明的抗体表现出较低的与抗原的结合亲和性，与母本抗体对抗原的结合亲和性相比，例如，不低于5％、10％、20％、30％、40％或50％。可通过使用(例如)荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的技术来确定本发明抗体的结合能力。

具有变异糖基化方式的抗体和/或由本申请的经修饰的宿主细胞产生的抗体可以结合抗原如癌抗原。所述抗原可以选自权利要求9的糖蛋白，其中，癌抗原选自由HER2、免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1、CD20、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、NGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3、以及α和β整联蛋白组成的组。

在一些实施方案中，在表现出变异糖基化方式的经修饰的宿主细胞中产生人源化HER2抗体。人源化HER2抗体包括但不限于huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或者美国专利No.5,821,337(以引用的方式并入本文)的表3中所述的曲妥单抗(赫赛汀)；人源化520C9(WO93/21319)；以及人源化2C4抗体如帕妥珠单抗。与未修饰的母本细胞中产生的抗体相比，由本申请的经修饰的宿主细胞产生的这些人源化抗体本身具有变异糖基化方式。

在其它的实施方案中，编码HER抑制剂(如EGFR、HER2、HER3或HER4抗体)的载体被引入到本申请的经修饰的宿主细胞系中。HER抑制剂抗体包括曲妥单抗、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、ABX-EGF、ABX0303、EMD7200、C11033、IMC-11F8和IMC-11F5。在经修饰的宿主细胞中产生的HER抑制剂可以表现出变异糖基化方式，例如，与在未修饰的母本宿主细胞中产生的HER抑制剂相比，至少2个上述糖分子的水平发生变化。

可以使用本申请的HER抗体或抑制剂来处理癌细胞，该癌细胞显示出HER表达、扩增或激活。HER激活是指任意的一个以上HER受体的激活或磷酸化。一般来说，HER激活导致信号转换(如，由使HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基磷酸化的HER受体的细胞内激酶域引起的信号转换)。可以通过与HER二聚体(其包含感兴趣的HER受体)结合的HER配体来介导HER激活。与HER二聚体结合的HER配体可以激活二聚体中的一个以上HER受体的激酶域，从而使得一个以上HER受体中的酪氨酸残基发生磷酸化和/或使得其它的底物多肽(如Akt或MAPK细胞内激酶)中的酪氨酸残基发生磷酸化。

HER抑制剂包括二聚体化抑制剂，其为抑制HER二聚体形成的试剂。HER二聚体化抑制剂可以为抗体，例如在其异源二聚体结合位点处与HER2结合的抗体。抗体可以为本文所描述的那些抗体，如表现出变异糖基化方式的那些抗体。本文所关注的二聚体化抑制剂为帕妥珠单抗或单克隆抗体2C4(MAb 2C4)。HER二聚体化抑制剂的其它例子包括：与EGFR结合并且抑制其与一个或多个其它HER受体二聚体化的抗体(例如，与已激活或解链的EGFR结合的EGFR单克隆抗体806、MAb 806；参见Johns等人，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))；与HER3结合并且抑制其与一个或多个其它HER受体二聚体化的抗体；与HER4结合并且抑制其与一个或多个其它HER受体二聚体化的抗体；肽二聚体化抑制剂。参见美国专利No.6,417,168，其全部内容以引用的方式并入本文。抑制HER二聚体化的抗体如帕妥珠单抗可以用来处理癌细胞，其不会使HER2受体过表达或扩增。

经修饰的宿主细胞还可以用来产生全长抗体之外的其它重组蛋白质(其具有变异糖基化方式)。使用本领域标准技术编码重组蛋白质的载体(如质粒、或病毒)可被引入到经修饰的宿主细胞中，并且重组蛋白质可以为任何的感兴趣蛋白质，包括荷尔蒙、细胞因子和抗体片段(如Fv、Fab、scFV或双链抗体片段)。

Fv片段为最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合位点。该区域以牢固的非共价结合构成由一个重链可变区和一个轻链可变区形成的二聚体。在该构造中，每个可变区的三个高变区相互反应以限定VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。总体来说，六个高变区使得抗体具有抗原结合特异性。尽管与整个结合位点相比亲和性较低，但是，单个可变区(或者Fv的一半，其仅包含特定用于抗原的三个高变区)也能够识别和结合抗原。

Fab片段也包含轻链的恒定区以及重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段不同，其在重链CH1区(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)的羧基末端添加了几个残基。本文中Fab′-SH表示这样的Fab′，其中恒定区的半胱氨酸残基具有至少一个游离的硫醇基团。起初F(ab′)2抗体片段产生为一对Fab′片段，它们之间具有铰合半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。

单链Fv(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些区域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽在VH和VL域之间还包含多肽连接物，其能够使scFv形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。HER2抗体scFv片段在WO93/16185、美国专利No.5,571,894和美国专利No.5,587,458中有所描述，它们的全文以引用的方式并入本文，并且HER2抗体scFv片段可以由本申请的经修饰的宿主细胞产生。

术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，该片段包含与相同的多肽链中的VL域连接的VH域(VH-VL)。通过使用太短从而难以在相同的链上在两个域之间配对的连接物，这些区域被迫与其它链的互补域配对并且形成两个抗原结合位点。在EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：6444-6448(1993)中更详细地描述了双链抗体，它们的全文以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，抗体为抑制性抗体。抑制性抗体可以抑制抗体所结合的抗原的一种或多种生物活性。例如，抑制性抗体可以通过抑制抗原活性或抗原的抑制表达而下调对应的抗原的信号转换。在一些实施方案中，抗体为中和抗体。中和抗体降低或消除可溶性抗原或活的微生物的某些生物活性，如传染剂。中和抗体可与天然配体或抗原的受体竞争。在一些实施方案中，抗体为刺激性或活性抗体。刺激性或活性抗体可以为激动剂抗体，在结合抗原后其可以激活对应的抗原的信号转换，从而激活或下调抗原的活性，或者上调抗体所结合的抗原的表达。

可以包含本发明N-多糖的抗体可以包括但不限于阿昔单抗(ReoPro

)、阿达木单抗(Humira

)、阿仑珠单抗(Campath

)、巴利昔单抗(Simulect

)、贝伐单抗(Avastin)、西妥昔单抗(Erbitux

)、达利珠单抗(Zenapax

)、dacetuzumab、依库珠单抗(Soliris

)、依法珠单抗(Raptiva

)、依决洛单抗(Panorex

)、依帕珠单抗、伊莫单抗(Zevalin

)、英利昔单抗(Remicade

)、muromonab-CD3(OKT3)、那他珠单抗(Tysabri

)、omalizumab(Xolair

)、奥马珠单抗(Synagis

)、潘尼单抗(Vectibix

)、雷珠单抗(Lucentis

)、吉妥单抗(Mylotarg

)、奥马珠单抗(OvaRex

)、利妥昔单抗(Rituxan

)、托西莫单抗(Bexxar

)、曲妥单抗(赫赛汀

)、MetMAb、ocrelizumab、帕妥珠单抗、Raptiva

(依法珠单抗)、hu M195Mab、MDX-210、BEC2、抗-Aβ、抗-CD4、抗-IL-13、抗-oxLDL、曲妥单抗-DM1、apomab、rhuMAbβ7、rhuMAb IFNα、GA101、抗-OX40L、ipilimumab、Valortim、ustekinumab、戈利木单抗、ofatumumab、zalutumumab、tremelimumab、莫维珠单抗、米妥莫单抗、依美昔单抗、ABX-EGF、MDX010、XTL 002、H11 SCFV、4B5、XTL001、MDX-070、TNX-901、IDEC-114，以及任意的特定用于抗原的抗体片段，包括但不限于补体C5、CBL、CD147、gp120、VLA4、CD11a、CD18、VEGF、CD40L、抗-Id、ICAM1、CD2、EGFR、TGF-β2、TNF-α、TNF受体、E-选择蛋白、FactII、Her2/neu、F gp、CD11/18、CD14、CD80、ICAM3、CD4、CD23、β2-整联蛋白、α4β7、CD52、CD22、OX40L、IL-5受体、GM-CSF受体、GM-CSF、HLA-DR、oxLDL、CD64(FcR)、TCRαβ、CD3、Hep B、CD125、DR5、EpCAM、gpIIbIIIa、IgE、β7整联蛋白、CD20、IL1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-12/IL-23、IL-15、IFN-α、VEGFR-1、来自血小板的生长因子受体α(PDGFRα)、血管粘附蛋白1(VAP1)、结缔组织生长因子(CTGF)、Apo2/TRAIL、CD25、CD33、HLA、F gp、IgE、CTLA-4、IP-10、抗-C.艰难梭菌毒素A和毒素B、B.炭疽杆菌PA、呼吸道合胞病毒(RSV)、甘露糖受体/hCGβ、整联蛋白受体、PD1、PDL-1、CD19、CD70、以及VNR整联蛋白。

包含本发明N-多糖的抗体具有与天然抗体或由未修饰的宿主细胞产生的抗体相当的良好的半衰期。抗体半衰期通常是指抗体分子形成之后的平均存活时间值，通常用将已知量的免疫球蛋白从动物体中消除50％所需要的时间来表示。半衰期随免疫球蛋白的类型不同而不同，并且也随种类的不同而不同。在一些实施方案中，表达由CHO-1E5细胞所产生的所述N-多糖的抗体在体内具有与由母本CHO细胞产生的抗体相当的终末半衰期。在某些实施方案中，试验动物中所述抗体的终末半衰期为至少4、8、12、24、48、72小时甚至更长。将抗体施用并经过一段预定的时间之后，对残留在对象的生物体液(如血液或血清)中的抗体的量进行定量，从而可以确定终末半衰期。可以通过静脉内、皮下或者本领域中或本文所公开的已知的任何其它合适的途径来进行最初施用。

在一些实施方案中，与由未修饰的宿主细胞产生的母本抗体或者缺少本发明特有N-多糖的抗体相比，包含本发明N-多糖的所述抗体的ADCC活性提高，但是基本上不会诱发较高的免疫原性。免疫原性通常是指特定物质(如抗原或表位)引起免疫反应、体液和/或细胞介导的免疫反应的能力。蛋白质和多糖类可以是免疫原性的。在一个实施方案中，包含所述N-多糖的抗体在体内表现出与由母本CHO细胞产生的抗体相当的免疫原性或不具有免疫原性。评价免疫原性或不具有免疫原性的方法在本领域中是已知的。例如，常规的方法是测量其诱导抗体反应的能力，如血清抗体滴定量。如实施例14和图29所示，通过对本发明所述抗体的抗体滴定量来测量体内免疫原性。具体来说，在一个实施例中，将由野生型CHO细胞产生的所述ET101抗体或由CHO-1E5细胞产生的ET101分别注入到两组非人类灵长目动物中。通过ELISA来测定对所注入的所述抗体反应的血清IgM产量。血清IgM滴定量反映了体内由所述抗体诱导的免疫原性的水平。可以在血清稀释1∶1-1∶1,000,000的范围内测量抗体滴定量。在一些实施方案中，对由CHO细胞或CHO-1E5细胞产生的所述抗体的IgM滴定量在不超过100,000ng/ml血清、不超过10,000ng/ml、不超过1,000ng/ml、不超过100ng/ml或者不超过10ng/ml的范围内。在一些实施方案中，在1∶100血清稀释下，405nm下的IgM滴定量为约0.1光密度(OD)，这相当于约500ng-1000ng/IgM/ml血清。如图29所示，抗体注射后，在经过多于7天、14天、20天、24天、30天、35天或更长时间后IgM滴定量不增加。

适于测量IgM的检测法或者用于评价所述抗体的免疫原性的其它抗体同型滴定法包括但不限于直接结合检测法、桥连检测(bridging assay)、捕获(夹入)检测以及使用放射性配体、酶、荧光、化学发光或电化学发光检测系统的竞争性免疫检测。用于体内评价靶标抗体的免疫原性的一个其它方法为磁珠式免疫沉淀反应法，然后通过定量的液相色谱法-质谱(LC/MS)，以确定在存在高循环浓度的靶标抗体(即，ET101-CHO-1E5抗体)的条件下人和猕猴血清中的抗药抗体(ADA)。通过添加过量的靶标抗体、然后通过IgG抗体的磁珠式蛋白质G分离以及洗脱和消化前它们的结合抗原，使可得的ADA结合位点饱和。然后利用稳定的同位素标记标准品(其可推知总ADA的存在)由LC/MS来对靶标抗体的肽类进行定量。该方法补充了已建立的用于评价免疫原性反应的方法学(Hendrik N.等人，Analytical chemistry，2008，vol.80，18期，6907-6914页)。

由靶标抗体诱导的不需要的免疫原性可以包括体液和细胞免疫反应。如果需要，本领域技术人员可以测量体液免疫反应和细胞免疫反应。多数情况下，成熟IgG反应的进展暗示着基本的抗原特异性帮助者T-细胞的存在。施用本发明的所述抗体后，用于检测/评价细胞介导的反应的检测法的例子包括但不限于T-细胞刺激/增生检测、细胞因子(如IL2、IL4、IFN-γ)产生/释放法、受体磷酸化状态的测量、或者一个或多个T细胞或B细胞细胞内标记物的调节。这些都涉及使用T-细胞制剂，有时与其它细胞类型(如树突状细胞)制剂共培养。通常使用酶联免疫斑点检测和流式细胞术法进行这些检测。记忆性B-细胞(有时候以及记忆性T-细胞)检测可以提供关于免疫反应性质的有用信息，并且可以有助于预测免疫原性的进展。可以采用利用了肽或全长靶标蛋白质(如ET101-CHO-1E5抗体(取决于检测和检测目的))的研究以及酶联免疫斑点检测方法学(参见“GUIDELINE ON IMMUNOGENICITY ASSESSMENT OF BIOTECHNOLOGY-DERIVED THERAPEUTIC PROTEINS”，2007)。

Fc受体(FcR)结合

在一个方面，本发明提供一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，该抗体对Fc受体、FcγIIIa的结合亲和性增加，并且/或者对其它Fc受体、FcγIIb的结合亲和性降低，从而提高了针对表达这种Fc受体的效应细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在其它方面中，本发明提供一种经修饰的宿主细胞，其特征在于，能够产生经修饰的抗体，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，该抗体对FcγIIIa的结合亲和性增加，并且/或者对FcγIIb的结合亲和性降低。

抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统的细胞之间的相互作用影响了各种反应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(综述参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)；Ward和Ghetie，Therapeutic Immunol.2：77-94(1995)；以及Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991))。

术语″Fc受体″或″FcR″用来描述与抗体的Fc区结合的受体。示例性的FcR为天然的序列人FcR。另外，优选的FcR为结合IgG抗体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚型的受体的FcR，包括这些受体的等位基因变异和选择性地拼接型。FcγRII受体包括FcγRIIA(″活性受体″)和FcγRIIB(″抑制性受体″)，其具有相似的氨基酸序列(其主要在其细胞质区域不同)。活性受体FcγRIIA在其细胞质区域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞质区域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)(综述参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，ImmunoMethods 4：25-34(1994)；以及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其它的FcR(包括近来被确认的那些)包含在术语″FcR″中。该术语还包括新生儿的受体FcRn，其负责将母亲的IgG转运至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。

许多抗体效应子功能由Fc受体(FcR)介导，该受体结合抗体的区。通过FcR对免疫球蛋白同型的特异性来定义FcR；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR、IgE抗体的Fc受体被称为FcεR、IgA抗体的Fc受体被称为FcαR等。FcγR的三种亚型已被确认：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。因为每个FcγR亚型被两个或三个基因编码，并且可选择的RNA调味(spicing)导致多个转录，在FcγR异形体中存在广泛的多样性。编码FcγRI亚型(FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC)的三个基因集中在染色体1的长臂的1q21.1区；编码FcγRII异形体(FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC)的基因以及编码FcγRIII(FcγRIIIA和FcγRIIIB)的两个基因都集中在1q22区。这些不同的FcR亚型都表达在不同的细胞类型上(综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991))。例如，在人体内，只在嗜中性粒细胞中发现FcγRIIIB，而在巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞和T-细胞亚群中发现FcγRIIIA。显然，FcγRIIIA为NK细胞(ADCC涉及的细胞类型中的一种)上的唯一FcR。FcγRIIIA为在巨噬细胞和NK细胞上表达的活性跨膜受体。其也是嗜中性粒细胞调理素受体(Ravetch，J.和L.Lanier，2000，Science 290：84)。FcγRIA为具有三个细胞外Ig样区域的跨膜蛋白质。组成上，FcγRI在单核细胞和巨噬细胞上表达，并且能够在嗜中性粒细胞和嗜酸粒细胞上被诱导。关于造血细胞上的FcR表达的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)，其全部内容以引用的方式并入本文。

在一个实施方案中，本发明提供一种具有改变的FcR结合亲和性的抗体。具有″改变的″FcR结合亲和性的抗体为这样的抗体，与母本抗体或包含天然序列Fc区的抗体相比，该抗体的FcR结合活性和/或ADCC活性提高或者降低。与母本抗体相比，与FcR的结合性提高的本发明抗体以更好的亲和性结合至少一个FcR。与母本抗体相比，与FcR的结合性降低的本发明抗体以更低的亲和性结合至少一个FcR。这种与FcR的结合性降低的变体可以对FcR具有较低的结合性或者没有可看出的结合性，例如，与天然序列IgGFc区相比，结合性为0-20％。

本发明的以比母本抗体高的亲和性结合FcR的抗体为这样的抗体，当以相当的量施加具有唯一N-连接多糖的该抗体以及母本抗体时，该抗体以基本上比母本抗体高的结合亲和性结合一个或多个上述已识别的FcR。例如，如本文实施例所述，在测定FcR结合亲和性时，与母本抗体相比，FcR结合亲和性得以提高的所述抗体的FcR结合亲和性可以为约1.1倍至约10,000倍，例如为1.15倍、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1,000、10,000倍或更高。

表达方式″低亲和性受体″是指这样的受体，其对感兴趣的配体的结合亲和性弱，例如，结合常数为约50nM或更低的亲和性。示例性的低亲和性受体包括但不限于FcγRIIIa 158F/F好FcγRIIIa 158F/V。

在一些实施方案中，由CHO1E5细胞产生的抗体对FcγRIIIa(活性FcγR)的结合性增加，并且还可以对FcγRIIb(抑制性FcγR)的结合性降低。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性

如上所述，本申请的经修饰的宿主细胞可以用来产生抗体或功能性抗体片段。由这些细胞产生的抗体或功能性抗体片段还可以表现出如本文所述的变异糖基化，例如，与对应的在未修饰的母本宿主细胞中产生的抗体或功能性抗体片段相比，至少2个糖分子的水平发生变化。另外，与对应的在未修饰的母本宿主细胞中产生的抗体或抗体片段相比，这些具有变异糖基化方式的抗体或片段的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或其它抗体效应子功能可以提高。或者，与对应的缺少所述变异糖基化方式的抗体相比，具有变异糖基化方式的抗体或抗体片段的ADCC增加。ADCC活性得以提高或增加的抗体或抗体片段还可以具有变异糖基化方式。

例如，母本CHO细胞系可被修饰以产生具有变异糖基化方式的经修饰CHO细胞系。然后该经修饰CHO细胞系可以产生ADCC活性比由母本CHO细胞产生的抗体的ADCC活性高的抗体。由经修饰CHO细胞系产生的抗体也可以具有变异糖基化方式。

″抗体依赖性细胞介导的细胞毒性″(ADCC)是指细胞介导的反应，其中，表达FcR的效应细胞(如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并且接下来使靶细胞裂解。用于介导ADCC的原代细胞包括NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。NK细胞通常主要表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。关于造血细胞上的FcR表达的综述参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)。

″效应细胞″为表达一个或多个FcR并且发挥效应子功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血液单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从天然来源(如本文所述的血液或PBMC)分离得到，或者可以采用本领域已知方法在体外繁殖得到。

在一个实施方案中，当对象抗体以相当的量施加时，与对应的由母本宿主细胞产生的抗体相比，本发明的抗体在人效应细胞的存在下更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。一般来说，可以通过采用本文所述的检测法来确定ADCC活性，但是，也可以考虑其它的检测法或者(例如)在动物模型中确定ADCC活性的方法。例如，在本文所述的体外检测中，与母本抗体相比，本发明抗体为约1.1倍至约10,000倍，例如为1.15、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1,000、10,000倍或更高，更有效地介导ADCC。

在一些实施方案中，与母本抗体相比，具有唯一N-连接多糖的本发明抗体对表达不同基因型的FcγRIIIa的效应细胞的ADCC增加。在一个例子中，与母本抗体相比，具有唯一N-连接多糖的所述抗体对表达FcγRIIIa158V/V(当氨基酸158在两个等位基因处为缬氨酸时)的效应细胞的ADCC增加，所述FcγRIIIa 158V/V对IgG的Fc片段具有高亲和性。在其它例子中，与母本抗体相比，具有唯一N-连接多糖的所述抗体对表达FcγRIII158F/F或FcγRIII 158F/V(当氨基酸158在两个等位基因或一个等位基因处为苯丙氨酸时)的效应细胞的ADCC增加，所述FcγRIII 158F/F或FcγRIII158F/V对IgG的Fc片段具有低亲和性。已知的是，与FcγRIIIa上氨基酸158处的缬氨酸(V)或苯丙氨酸(F)显型对应的基因多形性极大地影响IgG1对FcγR的亲和性(Koene HR等人，Blood 90：1109-1114，1997)。另外，与具有F等位基因的细胞相比，具有FcγRIIIaV等位基因的免疫效应细胞更好地介导抗-HER-2/neu IgG1变体的ADCC(Shields RL等人，J Biol Chem 9：6591-6604，2001)。已知抗-HER-2/neu单克隆抗体曲妥单抗参与活性抗体受体(片段C受体(FcγRIIIa；FcγRIIa)和抑制性(FcγRIIb)抗体受体，并且已证实FcγR多形性可以影响天然杀伤细胞/单核细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。已经对FcγR多形性是否与已施用了曲妥单抗的胸部癌患者的临床结果有关进行了研究。发现FcγRIIIa-158V/V基因型与客观有效率(ORR)和无进展生存期(PFS)显著相关。另外，FcγRIIa-131H/H基因型在ORR和PFS中有显著性趋势。与其它组合相比，两种有利的基因型(VV和/或H/H)的组合独立地与较好的ORR和PFS相关。ADCC分析表明，与具有不同基因型相比，V/V和/或H/H PBMC具有显著较高的曲妥单抗介导细胞毒性。施用FcγRIIIa 158V/V的患者的PFS评价结果显著长于施用158V/F、158F/F或F载体(V/F+F/F组合)的患者(Antonino Musolino等人，Journal of Clinical Oncology，26卷，No.11，2008年4月10日)。因此，与未修饰的抗体相比，对表达FcγRIII 158V/V的细胞和表达FcγRIII 158F/F的细胞的ADCC活性得以增加的本发明抗体，在提高患有各种疾病(包括用抗体类疗法进行治疗的癌症)的患者的临床结果方面非常有用。

本文所用的ADCC活性还包括这样的活性：通过使抗体的Fc区结合至存在于效应细胞(如杀伤细胞、天然杀伤细胞、激活的巨噬细胞等)表面上的Fc受体以激活效应细胞从而损伤细胞(例如肿瘤细胞)(Monoclinal Antibodies：Principles and Applications，Wiley-Liss，Inc.，Chapter 2.1(1995))。例如，ADCC活性可以为细胞毒活性，其中已结合至活体中的肿瘤细胞的细胞表面抗原上的抗体激活表达Fc受体(FcR)的效应细胞(如，外周血液单核细胞(PBMC)、单核细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)，导致靶细胞上所结合的抗体的识别并且接下来使靶细胞裂解(Monoclinal Antibodies：Principles and Applications，Wiley-Liss，Inc.，Chapter 2.1(1995))。为了评价感兴趣分子的ADCC活性，可以进行如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所述的体外ADCC检测。用于这种检测的有用的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地，或者另外，如Clynes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所述的那样，可以在体内(如在动物模型中)评价感兴趣分子的ADCC活性。

抗体效应子功能还包括但不限于C1q结合性、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、噬菌作用、细胞表面受体(如B细胞受体BCR)的下调，等。补体依赖性细胞毒性(CDC)是指分子在补体的存在下使靶标溶解的能力。通过将补体系统(C1q)的第一组分结合至与同族抗原偶合的分子(如抗体)从而启动补体激活途径。为了评价补体激活，可以进行如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202：163(1996)中所述的CDC检测。

本发明的抗体可以进行一种或多种检测以评价与母本抗体相比的生物活性变化。

可以评价本发明抗体结合FcR的能力。当FcR为高亲和性Fc受体(如FcγRIIIA-158V/V)时，可以通过滴定所述抗体并且在标准的ELISA流程中使用与本发明抗体特异性结合的抗体来测量所结合的抗体，从而测量结合性。

为了评价本发明抗体的ADCC活性，如实施例12所述，可以使用各种比例的效应分子：靶标来进行体外ADCC检测。用于这种检测的有用的″效应细胞″包括外周血液单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选择地，或者另外，如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所述，可以在体内(如在动物模型中)评价本发明抗体的ADCC活性。

制剂、施用和治疗

本发明的ADCC活性得以增加的抗体可以用于预防和治疗各种疾病。

本文所说的″疾病″是指任何的通过使用本发明的由经修饰的宿主细胞产生的抗体而有益于治疗的症状。其包括慢性和急性疾病或病症，包括那些倾向于使哺乳动物患病的病理学症状。疾病的例子包括但不限于：癌症、过敏症、心血管疾病、炎症疾病、代谢性疾病、神经性疾病、病毒感染和/或细菌感染。在一个实施方案中，所述疾病为癌症。癌症的例子包括但不限于：癌、淋巴癌、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这种癌症的更具体例子包括但不限于：肾上腺皮质瘤、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肿瘤、中枢神经系统(CNS)癌、末梢神经系统(PNS)癌、胸癌、Castleman病、宫颈癌、儿童非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因肉瘤家族肿瘤(如尤因肉瘤)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、毛细胞白血病、霍奇金病淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉及下咽骨癌、急性淋巴白血病、急性骨髓白血病、儿童白血病、慢性淋巴白血病、慢性骨髓白血病、肝癌、肺癌、肺类癌、非霍奇金淋巴癌、男性胸癌、胸膜间皮瘤、多发骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、骨髓增殖性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔及口咽部癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾腺癌、肉瘤(成人软组织癌)、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌(如子宫肉瘤)、阴道癌、外阴癌以及Waldenstrom巨球蛋白血症。癌症的一个例子可以为″HER2-表达癌″，其包含具有存在于细胞表面上的HER2受体蛋白的细胞(Semba等人，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)以及Yamamoto等人，Nature 319：230-234(1986)(Genebank编号X03363))，使得抗-HER2抗体能够与癌结合。

例如，癌症(如恶性肿瘤)中，ADCC活性高的抗体通过其细胞毒作用破坏癌细胞的增生从而可以治疗癌症。可以通过上述方法来分析抗体对不同肿瘤细胞的抗肿瘤作用。例如，可以进行体外试验，例如但不限于CDC活性测量法、ADCC活性测量法等；以及体内试验，如在试验动物(如小鼠)中利用肿瘤系统的抗肿瘤实验。可以按照文献Shitara等人，Cancer Immunology Immunotherapy，36，373-380(1993)；Nakamura等人，Cancer Research，54，1511-1516(1994)等中所描述的方法进行CDC活性和ADCC活性测量以及抗肿瘤实验。

为了治疗过敏症，当通常由于介质分子从免疫细胞释放而诱导过敏反应时，可以通过使用ADCC活性高的抗体除去该免疫细胞从而抑制过敏反应。通过使用ADCC活性高的抗体，在治疗之后抑制再狭窄(re-stricture)中的动脉细胞的增生，从而可以预防和治疗心血管疾病。通过使用ADCC活性高的抗体，抑制病毒或细菌感染的细胞的增生，从而可以预防和治疗各种疾病包括病毒或细菌感染。

在一些实施方案中，与对应的由未修饰的母本宿主细胞产生的抗体相比，表现出糖基化方式Glu-GlcNAC2-Man4(+/-Fuc)的抗体对各种癌细胞(包括但不限于胸部癌细胞、卵巢癌细胞和肺癌细胞)的ADCC活性增加。在一些实施方案中，与对应的由未修饰的母本宿主细胞产生的抗体相比，表现出糖基化方式Glu-GlcNAC2-Man4(+/-Fuc)的抗体对FcγRIIIA受体的结合亲和性增加。表现出Glu-GlcNAC2-Man4(+/-Fuc)的抗体具有与对应的由未修饰的母本宿主细胞产生的抗体相似的体内药物代谢动力学特征。

本文所公开的具有N-连接的糖基化方式的所述抗体表现出与由野生型母本宿主细胞产生的抗体相当的药物代谢动力学谱图。该药物代谢动力学谱图描述了药物如何在体内被吸收、分布、代谢和消除的参数。药物代谢动力学研究的是药物在体内随时间的行为，包括吸收、分布、组织中的定位、生物转化和排泄的过程。药物代谢动力学参数包括但不限于药物施用途径、一级动力学包括分布体积(Vd)、药物清除率(Cl)、消除常数(kel)、消除半衰期(t1/2)、血清浓度、生物利用度、体内溶解性、零级消除率、给药方案、肝脏药物清除率、药物分布、蛋白质结合性、以及离子化度。药物代谢动力学确定药物作用的发生、持续以及强度。

通过将具有所需程度的纯度的抗体与可选的生理学上可接受的载体、赋型剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合，以冻干制剂或水性溶液的形式，制得用于贮存的本发明抗体的治疗制剂。可接受的载体、赋型剂或稳定剂在所应用的剂量和浓度下对受者无毒，包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐以及其它的有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄基醇；烷基对羟苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-丙醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖类以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如Tween、Pluronics^TM或聚乙二醇(PEG)。

根据治疗所需的特定说明，本文的制剂中还可以包含一种以上活性化合物，优选具有补充的活性、并且不会彼此不利地影响的那些化合物。该分子以合适的组合用量存在，并且能够有效地用于所要达到的目的。

例如，通过凝聚技术或者通过界面聚合作用(例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶体药物传递系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或者在大乳液中，将该活性成分包裹在所制得的微胶囊中。这种技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中有所公开。

要用于体内施用的制剂必须是无菌的。通过无菌过滤膜进行过滤可容易地完成。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有本发明抗体的固体疏水性聚合物的半透明基质，其中该基质为成型品的形式，如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-醋酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron Depot^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物能够持续100天释放分子，但是，某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当所包裹的抗体长时间保留在体内时，当暴露在37℃的水气中时，它们可能变性或者凝集，导致生物活性损失以及免疫原性可能发生变化。根据所涉及的机理，可以想到用于稳定的合理策略。例如，如果凝集机理发现为由硫醇-二硫物的互换导致形成分子内S-S键的话，可以通过修饰巯基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂以及开发特定的聚合物基质组成来实现稳定化。

注意的是，本发明的由1E5细胞产生的抗体可以用来治疗哺乳动物(如患有或偏向于患有通过施用该抗体而有利的病症或疾病的患者)。能够被本发明抗体治疗的症状很多，包括：癌症(如，本发明抗体结合HER2受体、CD20或血管内皮细胞生长因子(VEGF))；过敏症，如哮喘(用抗IgE抗体)；以及LFA-1介导的疾病(如，本发明抗体为抗-LFA-1或抗-ICAM-1抗体)，等。

当所述抗体结合HER2受体时，所述疾病优选为表达HER2的癌，如，良性或恶性肿瘤，其特征在于HER2受体的过表达。这种癌包括但不限于胸癌、鳞片细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肝细胞癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌以及各种头和颈部癌。根据本文的教导，本领域人员可以制得具有变异Fc区的多肽，其ADCC活性提高或降低。该分子可以用于治疗各种疾病。

例如，可以使用ADCC活性提高的抗体来治疗这样的疾病或病症，其中需要破坏或消除组织或外源微生物。例如，本发明的抗体可以用来治疗癌、炎症疾病、感染(如，细菌、病毒、真菌或酵母感染)、以及其它症状(如甲状腺肿，其中需要除去组织)，等。

当抗体的ADCC活性降低时，该抗体可以用来治疗这样的疾病或病症，其中需要半衰期长的含有Fc区的多肽，但是，本发明抗体优选不具有不需要的效应子功能。例如，含有Fc区的多肽可以为抗-组织因子(TF)抗体、抗-IgE抗体、以及抗-整联蛋白抗体(如抗-α4-β7抗体)。该含有Fc区的多肽的所需作用机制可以被配体-受体结合对所阻断。另外，ADCC活性降低的含有Fc-区的多肽可以为激动剂抗体。

本发明的抗体可通过任何合适的方式来施用，包括非肠道方式、皮下、腹膜内、肺内和鼻内方式，并且，如果需要的话，为了进行局部免疫抑制治疗，可以采用病灶内施用方式。非肠道灌注方式包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用方式。另外，本发明抗体可通过脉冲式灌注(特别是，本发明抗体的剂量梯度变化)来合适地施用。根据施用时间短或长，优选通过注射来给药，最优选通过静脉内或皮下注射来给药。

为了预防或治疗疾病，本发明抗体的合适剂量取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和疗程、施用本发明抗体的目的是预防还是治疗性、以前的疗法、患者的临床史以及对本发明抗体的反应、以及医生的判断。本发明抗体可以一次性或者在一系列的治疗中施加给患者。

根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(如，0.1-20mg/kg)的本发明抗体作为施加给患者的最初参考剂量，该剂量可一次或多次单独施用或者连续灌注。取决于上述因素，每天剂量通常为约1μg/kg至100mg/kg或更多。为了多天或更长时间反复施用，根据病症，可以持续治疗直至发生所需的疾病症状抑制。但是，其它剂量安排也是有用的。可通过常规的技术和检测法来容易地监控该疗法的进展。

按照良好医疗实践的方式来将所述抗体组合物制剂、定剂量以及施用。在这方面要考虑的因素包括治疗的特定疾病、治疗的特定哺乳动物、各个患者的临床症状、病因、制剂的传递位置、施用方法、施用的时间安排、以及医疗工作者已知的其它因素。通过上述考虑来控制待施用的抗体的″治疗有效量″，并且该″治疗有效量″为预防、改善、或治疗疾病或病症所需的最小量。该抗体不必、但是可选地与现有的用于预防或治疗问题疾病的一种或多种药剂一起做成制剂。这种其它药剂的有效量取决于制剂中的抗体存在量、疾病或治疗类型、以及上述其它因素。按照迄今为止所采用的剂量和施用途径相同的方式来使用，或者按照迄今为止所采用的剂量的1至99％的方式来使用。

在一些实施方案中，本发明的抗体和/或宿主细胞可用于预防或治疗哺乳动物的疾病。该哺乳动物选自人、非人类灵长目动物、啮齿目动物、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、兔、豚鼠或山羊。

发酵以及制备方法

在一个方面，本发明提供一种制备经修饰的糖蛋白的方法，包括：提供编码所述经修饰的糖蛋白的异源多核苷酸序列以及使所述经修饰的糖蛋白在本文所述的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，本发明包括培养基，其包含本文所述的宿主细胞。在其它实施方案中，本发明还包括培养发酵罐，其在培养基中具有多个本发明宿主细胞。

发酵为本领域已知的标准过程，其用于通常在需氧生长条件中，将生化药剂和包含蛋白质的生物分子破坏并重组装。本文所用的发酵罐或生物反应器是指这样的仪器，其能够保持微生物(如本发明的宿主细胞)生长的最佳条件，在大规模或小规模发酵中以及在商业化生产生物大分子(例如但不限于糖蛋白，如抗体)中使用。

重组单克隆抗体的制备涉及称为″受体库克隆(repertoire cloning)″或″噬菌体展示/酵母展示″的技术。重组抗体工程化涉及使用病毒或酵母(而不是小鼠)以产生抗体。这些技术依赖于免疫球蛋白基因片段的快速克隆以产生氨基酸序列稍微不同的抗体文库，可以从中选择具有所需特性的抗体。这些技术可用来提高特异性(抗体通过该特异性来识别抗原)、它们在不同环境条件中的稳定性、它们的治疗有效性、以及它们在诊断应用中的检测性。已使用发酵室来大规模地产生这些抗体。在一些实施方案中，可在培养发酵罐中产生本发明的表达唯一N-多糖的抗体。

实施例

实施例1：杀伤剂最佳浓度的选择

为了获得具有变异糖基化方式的细胞群，将化学剂施加至细胞以引起随机基因性突变，其会选择具有变异糖基化方式的细胞。化学诱导的随机变异会导致控制或调节糖生物合成和蛋白质糖基化过程(如岩藻糖基化)的基因发生突变。通过用LCA(其与细胞表面上的岩藻糖基化蛋白质结合)靶向细胞，可以富集并分离变异后岩藻糖基化活性低的稳定克隆(见图1和2)，使得岩藻糖基化活性高的细胞被消除。

添加LCA-生物素以结合至细胞表面。然后将链霉亲和素-肥皂草素添加至培养基。生物素-链霉亲和素相互作用使得肥皂草素位于细胞膜附近，从而可以将复合物内在化至细胞中。肥皂草素一旦进入细胞中，其能够离开靶向药剂并消除核糖体的活性，导致其死亡。

为了确定LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素的最佳浓度，为了有效杀死岩藻糖基化活性高的细胞，减少非特异性杀伤，从而产生变异糖基化方式的细胞，研究了LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素浓度的不同组合对杀死母本CHO-K1细胞的效果。浓度为约10μg/ml的LCA-生物素和浓度为约2μg/ml的链霉亲和素-肥皂草素为杀死大多数母本CHO-K1细胞的最佳组合(图3)。

实施例2：具有变异糖基化方式的细胞系的稳定性

使用两种化学诱变剂ICR191和甲磺酸乙酯(EMS)以引入随机基因性突变。用ICR191或EMS(它们通常分别引起移码突变和鸟嘌呤烷基化)处理CHO-K1细胞。16小时后洗涤该化学品。将细胞恢复5天。存活下来的细胞用浓度为10μg/ml的LCA-生物素和浓度为2μg/ml的链霉亲和素-肥皂草素筛选4周。用FITC-LCA将细胞进行常规染色，然后进行FACS分析。分选后的细胞以高密度培养从而扩大它们的个数并且获得用于后续的LCA标记和FACS分类的细胞。

该选择逐渐地富集了ICR191或EMS-诱导变异后的低岩藻糖基化的群组(图4)。经过4周的选择后，将细胞在不含LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素的培养基中再生长2个月以上的时间。在培养基中不存在LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素的情况下，所获得的群组保持它们的低岩藻糖基化状态(图4A)。为了获得稳定的细胞克隆作为生产菌株，使用有限稀释法将细胞播种在96孔板中并在不含LCA-生物素和链霉亲和素-肥皂草素培养基中扩大单个克隆。3个月中每星期通过FAC分析来监控细胞岩藻糖基化状态。发现所获得的这些克隆长时间保持非常稳定的低岩藻糖基化水平，并且这些克隆的细胞生长率与母本细胞相当。图5示出了一个克隆中低岩藻糖基化状态的稳定性。这些结果表明，我们的随机变异和选择策略特异性地富集低岩藻糖基化细胞。

实施例3：具有变异糖基化方式的细胞系的糖基化谱图

低岩藻糖基化细胞克隆具有唯一的且一致的糖基化方式，与未修饰的细胞系或母本细胞系相比，该糖基化方式发生了改变。通过用FITC共轭的麦胚凝集素(WGA)以及加纳籽外源凝集素II(GS-II)将母本细胞和低岩藻糖基化克隆染色来建立该谱图，其中FITC共轭的麦胚凝集素(WGA)偏好性地与N-乙酰基葡萄糖胺、伴刀豆球蛋白A(Con A)结合并识别α-连接的甘露糖，并且加纳籽外源凝集素II(GS-II)与α-或β-连接的N-乙酰基葡萄糖胺残基结合。通过FACS来分析标记的细胞。低岩藻糖基化克隆还具有低的与WGA的结合亲和性，表明这些克隆具有低水平的N-乙酰基葡萄糖胺(图6)。相反，与对照相比，这些克隆与ConA和GS-II的结合性显著较高，表明这些克隆具有较高含量的α-连接甘露糖和α-或β-连接N-乙酰基葡萄糖胺(图6)。也测定了该糖基化方式唯一谱图的稳定性。当这些克隆在不含LCA-生物素的培养基中生长8周以上时仍保持相同的谱图(图5)。CHO-K1突变克隆在悬浮液中的不含血清培养基中生长，并且具有相似的N-多糖谱图(图7)。

实施例4：抗体的糖基化谱图

在具有变异糖基化方式的细胞系中表达的抗体具有低的岩藻糖含量。它们也具有图9B所示的变异糖基化方式。人源化抗-ErbB2抗体ET101在表现出变异糖基化方式的突变CHO-K1克隆1E5中表达。1E5突变克隆在不含血清的悬浮液中生长，并且具有与未修饰的宿主细胞相似的1，6-岩藻糖基转移酶(Fut8)基因转录水平(图8)。通过从细胞中分离总RNA以确定转录水平。将转录物反转录为cDNA并通过RT-PCR将Fut8转录物扩增。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并将肌动蛋白用作内参照。

从突变克隆1E5的条件培养基获得抗体。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来确定抗体的表达(图9A)。将SDS-PAGE上的试样量的样品转移至硝酸纤维素膜上并用生物素化LCA、WGA、ConA和GS-II(其分别偏好性地与(α-1，6)连接至N-乙酰基葡萄糖胺的岩藻糖、N-乙酰基葡萄糖胺、α-连接甘露糖、以及α-或β-连接乙酰基葡萄糖胺结合)进行印迹。如图9B中的“CHO”所示，在作为对照物的母本CHO-K1细胞中表达相同的抗体。

该结果表明，由克隆1E5产生的抗体被修饰为具有这样的变异糖基化方式，与对照物相比，该变异糖基化方式与LCA、WGA、GSII的结合亲和性显著降低并且与ConA的结合亲和性增加(图9B)。结果表明，抗体的岩藻糖含量显著降低。

如图10A、B所示，也可以确定由不同CHO株产生的抗体ET101和ET201的单糖组成。在母本CHO细胞、突变CHO-1E5克隆、突变CHO-3F克隆或突变CHO-2.6克隆中产生抗体ET101或ET201。所有的CHO克隆都适合在悬浮液的无血清培养基中生长。通过在100℃下加热2小时，从1mg抗体ET101和ET201中释放单糖。然后将单糖真空干燥并加水复原。使用DX-ISC-3000系统(DIONEX，Sunnyvale，CA)，通过高效离子交换色谱法来分析单糖。使用CarboPac-PA-1柱(DIONEX，Sunnyvale，CA)，在35℃下以0.8ml/min的流速来解析单糖。注入样品后，用18mM NaOH将单糖解离20分钟，并且通过用200mM NaOH洗脱10分钟来再生柱子。下次注射之前将柱子保持在18mM NaOH中30分钟。由母本CHO和突变克隆产生的ET101中单糖的定量如图10A所示。由母本CHO细胞和突变克隆产生的人IgG1(ET101和ET201)的单糖组成如图10B所示，可以看出，与在母本细胞中产生的那些相比，突变克隆中所产生的IgG1中半乳糖水平降低并且葡萄糖水平增加。

由如文献Yamane-Ohnuk等人，Biotechnol.Biogeng.87：614-622(2004)中所述的Fut8-/-敲除CHO细胞产生的人IgG1的单糖组成分析示于图10C中，可以看出，野生型和Fut8-/-敲除CHO细胞之间，半乳糖和葡萄糖水平相对一致。

实施例5：ADCC活性提高的抗体

在具有变异糖基化方式的突变克隆中表达人源化抗-ErbB2抗体，并且与母本细胞中产生的抗体进行比较，以确定由ADCC活性提高的细胞系所合成的ErbB2-阻断抗体。为了确定提高的ADCC活性，对A549、SKBR3、SKOV3、MDA-MB-361和MDA-MB-231细胞的抗体介导的裂解进行评价以比较细胞毒性的有效性。用由克隆1E5、2.6或3F产生的ErbB2-阻断抗体(ET101或ET201)将靶标细胞预孵育，使得抗体与靶标结合。然后用靶标细胞孵育人PBMC。如图11B、12、13和14所示，如所期望的那样，对照抗体可以诱导细胞的裂解，并且具有变异糖基化方式的细胞所产生的抗体显著提高了细胞裂解，表明具有变异糖基化方式的细胞所产生的抗体可以提高ADCC效率。

从1毫升含有10％FBS的条件培养基所表达的抗体ET101被蛋白质L微珠沉淀，被还原性SDS-PAGE凝胶分离，并被考马斯亮蓝染色(如图11A所示)。空白生长培养基用作阴性对照。突变克隆中所表达的ET101抗体通过蛋白质L色谱法而从含有10％FBS的条件培养基中被纯化，并通过UV280来定量。母本ET101在野生型CHO中表达并采用相同的方式纯化。采用相似的方法以获得ET201。

如图11B、12、13和14所示的ADCC检测，通过蛋白质A色谱法从条件培养基中纯化在突变克隆中所表达的ET101或ET201抗体，并通过UV280来定量。母本ET101或ET201在野生型CHO中表达并采用相同的方式纯化。将100μl靶标细胞悬浮液在96孔板中于37℃下用50μl所表达的ErbB2-阻断抗体ET101预孵育半小时。然后在效应分子/靶标细胞的比值为20∶1的条件下添加50μl PBMC。孵育16小时后，将板旋转减慢并且将50μl不含细胞的上清液转移至新板中。通过CytoTox96非放射性细胞毒性检测(Promega，Madison，WI)来测量所释放的乳酸脱氢酶(LDH)。由式子(E-S)/(M-S)(E：试验释放量，S：自发释放量，M：最大释放量)来计算细胞裂解。将PBS或非特异性抗体用作阴性对照。

实施例6：抗体抑制细胞的增生

将ErbB2-过表达胸部癌细胞系SKBR3放入96孔板中以进行实时增生检测或者以低密度放入24孔板中以进行菌落形成检测。使细胞附着过夜后，将不同浓度的抗体、对照物或者由具有变异糖基化方式的细胞克隆产生的各种抗体添加到培养基中以检测它们对细胞增生的抑制。由具有变异糖基化方式的细胞克隆产生的ErbB2阻断抗体以与对照抗体(由母本细胞产生的抗体)相当的或更大的程度抑制细胞的增生。通过诸如菌落形成检测、实时增生检测、或其它本领域已知的方法来确定细胞增生的抑制情况。

实施例7：N-多糖的组成和结构的确定

为了确定N-多糖的单糖组分，将由CHO-1E5细胞产生的抗体以及在无血清悬浮液中由母本宿主细胞产生的抗体用三氟醋酸(TFA)水解。将纯化后的抗体(100μg)与三氟醋酸(TFA)混合使TFA的最终浓度为4M。将混合物煮沸2小时，并将溶液真空干燥。将颗粒溶解在200μl去离子水中。将100μl再混悬后的样品注入PA1柱中，以通过Dionex ICS-3000系统(Dionex，Sunnyvale，CA)来分析单糖组成。如图16所示，与由野生型母本宿主细胞产生的N-多糖相比，由CHO-1E5合成的N-多糖缺少半乳糖，岩藻糖和N-乙酰基葡萄糖胺减少，并且具有葡萄糖分子。

为了进一步确立本发明N-多糖的组成，通过PNGase F(New England Biolabs，Ipswich，MA)将N-多糖从CHO-1E5和其母本宿主细胞所产生的抗体切断。通过用PNGase F在37℃下将200μg抗体消化72小时，从而释放N-多糖。在-20℃下用70％乙醇将蛋白质沉淀过夜并离心除去。真空干燥上清液并再混悬在200μl去离子水中。将样品负载到填充有C18的微柱(Waters，Milford，MA)、填充有AG50WX8的微柱和填充有AG4x4的微柱(Biorad Laboratories，Hercules，CA)上。然后用300μl去离子水洗涤柱子。收集洗脱物，真空干燥，然后采用MALDI-TOF MS质谱仪对N-多糖进行MALDI-TOF MS分析。m/z值对应于连接有钠的寡糖离子。每个峰对应于[M+Na]+。在由母本细胞产生的抗体的N-多糖中观察到两个峰，分别对应于N-多糖的G1(Gal₁-Fuc₁-GlcNAC₄-Man₃)和G0(Fuc₁-GlcNAC₄-Man₃)的质量(图17)。与此相对的是，在由CHO-1E5细胞合成的抗体的N-多糖中有质量为1257.4的单峰(图17)。通过与单糖的组成一起分析(图16)，由CHO-1E5合成的N-多糖的分子组成确定为Glu-GlcNAC₂-Man₄(+/-Fuc)。

通过寡糖分析来进一步确定由CHO-1E5合成的单个N-多糖。从抗体释放N-多糖并纯化以进行MALDI-TOF MS分析。简而言之，通过在37C下用PNGase F将200μg抗体消化72小时以释放N-多糖。在-20℃下用70％乙醇将蛋白质沉淀过夜并离心除去。真空干燥上清液并再混悬在200μl去离子水中。将样品负载到填充有C18的微柱、填充有AG50WX8的微柱和填充有AG4x4的微柱上。然后用300μl去离子水洗涤柱子。收集洗脱物，并将寡糖注入到PA200柱中并通过Dionex ICS-3000系统进行分析。与由MALDI-TOF MS分析结果一致，来自CHO-1E5所产生的抗体的寡糖以单峰存在，并且基本上同种群，该群与由母本宿主细胞产生的寡糖的异源谱图不同(图18)。

基于CHO-1E5所合成的N-多糖的单糖组成和分子量，推断了N-多糖的6个可能结构(图19A和B)。为了进一步确定CHO-1E5所合成的N-多糖的结构，使用不同的甘露糖苷酶来消化抗体上的N-多糖，并通过PA1柱/Dionex ICS-3000系统来分析所释放的糖类。使用α1，2甘露糖苷酶(Prozyme，San Leandro，CA)来切断CHO-1E5和母本宿主细胞合成的N-多糖以确定甘露糖间是否存在α1，2键。已知的是，野生型CHO细胞所产生的N-多糖中不存在α1，2甘露糖键。用α1，2甘露糖苷酶消化后从抗体不释放糖类，表明CHO-1E5所合成的N-多糖中不存在α1，2甘露糖键。使用阳性对照(低聚甘露糖9，Prozyme，San Leandro，CA)来确认酶活性。然后用其它酶α1，2，3甘露糖苷酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)将N-多糖从抗体切开，并分析所释放的糖类的谱图。根据野生型CHO细胞合成的N-多糖的典型结构，仅有一个α1，3甘露糖键切割位点并且该酶能够释放二糖或三糖(图20A)是合乎逻辑的。将CHO-1E5和母本宿主细胞合成的抗体(ET101)在37℃下与α1-2，3甘露糖苷酶孵育24小时。为了除去该抗体和酶，首先将消化后的抗体溶液通过MicroCon YM10(Millipore，Billerica，MA)、然后通过MicroCon YM100(Millipore，Billerica，MA)。通过PA1柱/Dionex ICS-3000系统来分析样品。如图20B和C所示，用18mM NaOH洗脱时没有单糖出现，当用90mM NaOH洗脱时，出现了与二糖(蔗糖)的洗脱时间对应的峰。当CHO-1E5产生的抗体上的N-多糖被α1-2，3甘露糖苷酶消化时，18mM NaOH洗脱下甘露糖，并且90mM NaOH洗脱下二糖类(图6D和E)。缺少α1，2甘露糖键、以及通过α1，2，3甘露糖苷酶而从CHO-1E5产生的抗体上所释放的糖类组成表明，这两个结构与α1，2，3甘露糖苷酶的消化情况吻合(图20F和G)。

实施例8：N-多糖不影响抗体组装体

由于蛋白质糖基化的改变可能影响蛋白质折叠和功能性组装体，通过在SDS-PAGE电泳上分离抗体来对组织编址。将经纯化的由母本宿主细胞和CHO-1E5产生的抗体在还原性和非还原性条件下进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染色。如图21所示，在还原性和非还原性条件下，单体(轻链和重链)以及CHO-1E5合成的整个抗体的迁移与母本宿主细胞产生的抗体相同，这表明CHO-1E5细胞产生的N-多糖不妨碍所产生的抗体的功能性组装体。

实施例9：ADCC活性提高并且与FcγRIIIa的结合亲和性较高的抗体

为了确定具有本发明N-多糖的抗体的修饰是否能够提高其生物功能(如ADCC活性)，使用靶向ErbB2和EGFR的两个经纯化抗体以测定它们在体外的ADCC活性(分别为ET101和ET201)。ET101抗体为ErbB2-封闭IgG1。通过蛋白质A色谱法从条件培养基纯化CHO-1E5细胞所产生的ET101，并通过UV280进行定量。母本未修饰的ET101在野生型CHO细胞中表达，并以同样方式纯化。为了进行ADCC检测，在96孔板中于37℃下用50μl经表达的ErbB2-阻断抗体ET101将100μl靶向细胞悬浮液预孵育半小时。然后按照效应分子/靶向细胞的比值为20∶1添加50μl PBMC。孵育16小时后，将板旋转减慢并且将50μl不含细胞的上清液转移至新板中。通过CytoTox96非放射性细胞毒性检测(Promega，Madison，WI)来测量所释放的LDH。由式子(E-S)/(M-S)(E：试验释放量，S：自发释放量，M：最大释放量)来计算细胞裂解。将PBS或非特异性抗体用作阴性对照。与母本CHO细胞产生的未修饰的ET101相比，具有在无血清培养基中CHO-1E5细胞克隆所产生的N-多糖的ET101对卵巢癌细胞系(SKOV3)和胸部癌细胞系(MDA-MB-231)的ADCC活性显著提高(图22A)。

ET201为抗-EGFR抗体。通过蛋白质A色谱法从条件培养基纯化在CHO-1E5细胞中所表达的ET201，并通过UV280定量。采用图8A中所述的相同方法进行ADCC检测。与母本CHO细胞产生的未修饰的ET101相比，具有在无血清培养基中CHO-1E5细胞克隆所产生的N-多糖的ET201对肺癌细胞系(A549)的ADCC活性显著提高(图22B)。

为了进一步研究本发明的N-多糖如何提高ADCC活性，使用重组FcγRIa和FcγRIIIa(R&D systems，Minneapolis，MN)以及ForteBio System(ForteBio，Menlo Park，CA)来测量抗体与这两个Fc受体的结合亲和性。首先将抗体生物素化并负载到覆盖有链霉亲和素的生物传感器(ForteBio，Menlo Park，CA)上。将重组FcγRI和FcγRIIIb蛋白质以100-400nM的浓度悬浮(R&D Systems，Minneapolis，MN)。根据ForteBio′s标准动力学规程来评价结合亲和性(KD，nM)。与母本CHO细胞产生的抗体相比，尽管对FcγRIa的结合性没有显著差异，但是，CHO-1E5细胞产生的抗体对FcγRIIIa的结合亲和性增加(图23)。这些结果表明，具有上述组成和结构的N-多糖引起的蛋白质糖基化使得抗体对FcγRIIIa的结合亲和性提高并且ADCC活性提高。

实施例10：具有N-多糖的抗体的药物代谢动力学

为了进一步确认CHO-1E5细胞合成的N-多糖引起的糖基化在体内是否可能影响抗体的药物代谢动力学，将母本宿主细胞或CHO-1E5细胞产生的抗体以10mg/kg剂量通过尾静脉注入到13周龄的雌性Balb/c小鼠中，每种抗体3只小鼠。在第5分钟、1小时、6小时、72小时和120小时时收集50μl血液。注射后在第1、6、72和120小时时监测抗体的血清浓度。通过OCTET(FortéBio，Menlo Park，CA)来测量血清中的抗体浓度。将第5分钟时的抗体浓度作为100％。CHO-1E5产生的抗体的药物代谢动力学与母本宿主细胞产生的抗体的药物代谢动力学相当(图24)，这表明本发明的N-多糖在体内不影响抗体的药物代谢动力学。

实施例11：CHO-1E5产生的寡糖的进一步结构分析

为了进一步验证1E5细胞合成的N-多糖的结构，大量纯化通过PNGaseF释放的高质量N-多糖，并用α1，2，3甘露糖苷酶或α1，2，3，6甘露糖苷酶来消化经纯化的N-多糖和阳性对照(低聚甘露糖9，Glyko，San Leandro，CA)，并通过PA1柱和Dionex ICS-3000系统(Dionex，Sunnyvale，CA)来分析消化产物。

将1E5(A和C)合成的抗体(ET101)以及阳性对照N-多糖(Band D)(低聚甘露糖9，Glyko，San Leandro，CA)在37℃下与α1，2，3甘露糖苷酶(A和B)或α1，2，3，6甘露糖苷酶(C和D)孵育24小时。为了除去抗体和酶，首先将消化后的抗体溶液通过填充有C18的微柱、填充有AG50WX8的微柱和填充有AG4x4的微柱。然后用300μl去离子水洗涤柱子。收集洗脱物，真空干燥，并通过PA1柱/Dionex ICS-3000系统进行分析。

当消化产物用18mM NaOH洗脱时，观察到2个峰。一个峰在17分钟，其对应于甘露糖标准品的洗脱时间。另一个峰在24分钟，其与二糖标准品相似(图25A)。α1，2，3甘露糖苷酶的消化方式与预测的两个结构(即，本文公开的式1和2)一致，因为预计到不会由于α1，2，3甘露糖苷酶消化而释放甘露糖，因此排除其它的所推定结构的可能性。α1，2，3甘露糖苷酶引起的低聚甘露糖9消化产物与预计的一致(图25B)。当被α1，2，3，6甘露糖苷酶消化时，18mM NaOH洗脱时有三个峰，对应于甘露糖标准品、二糖标准品和三糖标准品(图25C)。α1，2，3，6甘露糖苷酶引起的消化方式也与结构式1和2的预测一致(图25C)。这些数据进一步证实结构式1和2为1E5细胞合成的N-多糖的两个最终候选结构。到目前为止，尚无其它方法来区分这两个结构。

实施例12：对表达低亲和性FcγRIIIa 158 F/F的细胞的ADCC增强

人FCγRIIIa在氨基酸158处具有多形性。当在两个等位基因处氨基酸158为缬氨酸时，FCγR IIIa对IgG的Fc片段(称为FCγR IIIa 158V/V)具有高亲和性。当在氨基酸158处为苯丙氨酸载体时，FCγR IIIa对IgG的Fc片段(FCγR IIIa 158F/F或158F/V)的结合亲和性低。ADCC活性与FCγR IIIa对Fc片段的结合亲和性密切相关。如前所述，对ADCC检测中所用的PBMC的FCγR IIIa多形性的基因型进行调查。

为了进行ADCC检测，将100μl靶向细胞悬浮液在96孔板中于37℃下用50μl经表达的ErbB2-阻断抗体ET101预孵育半小时。然后按照效应分子/靶向细胞的比例为20∶1，加入50μl PBMC。孵育16小时后，将板旋转减慢，并将50μl不含细胞的上清液转移至新板中。通过CytoTox96非放射性细胞毒性检测(Promega，Madison，WI)来测定所释放的LDH。通过式子(E-S)/(M-S)(E：试验释放量，S：自发释放量，M：最大释放量)来计算细胞裂解。PBS或非特异性抗体用作阴性对照。从用于这些ADCC检测的PMBC中分离基因组DNA。根据本领域标准规程来进行对FcγR IIIa多形性基因型的PCR检测。测量针对卵巢癌细胞系(SKOV3)和胸部癌细胞系(MDA-MB-231)的ADCC活性。发现：当表达高亲和性FCγR IIIa 158V/V或低亲和性FCγR IIIa 158F/F的不同基因背景的PBMC用作效应细胞时，表达CHO-1E5细胞产生的唯一N-多糖的抗体同样有效地提高了ADCC活性(图26A和B)。CHO-1E5细胞产生的ET101抗体同样很好地与低亲和性FCγR IIIa 158F/F结合并诱发强的ADCC反应。

实施例13：与母本抗体相比，1E5细胞产生的抗体对FcγRIIIa具有较高 的结合亲 和性并且对FCγRIIb具有较低的结合亲和性

ADCC为这样的过程：靶向细胞表面抗原的特定抗体首先结合至细胞，然后通过将Fc结合至在效应细胞的细胞表面上表达的Fc受体，该抗体的Fc片段将效应细胞(如天然杀伤细胞和单核细胞)补充至靶向细胞。该补充使得靶标和效应细胞接近以通过效应细胞杀死靶向细胞。Fc受体(FCγR)由三种类型I、II和III构成。FCγR Ia、FCγR IIa和FCγR IIIa为活性受体，当其被激活时能够介导并提高ADCC。FCγR IIb为抑制性受体，当其被激活时能够阻断ADCC。因此，对FCγR Ia、FCγR IIa或FCγR IIIa具有高亲和性的抗体的ADCC活性提高。但是，对FCγR IIb具有高亲和性的抗体可以抑制ADCC活性，反之亦然(图27)。

为了确定1E5细胞产生的抗体引起ADCC活性提高的机理，对该抗体对FCγR的结合亲和性进行评价。人全长FcγRIIIA和FcγRIIb被克隆至表达载体中，并在CHO-K1细胞中稳定地被表达。通过20mM EDTA将细胞从细胞培养皿释放在PBS中，并分散成单个细胞。在冰上在具有5％FBS的PBS中以10μg/ml的浓度将该细胞与生物素化抗体孵育30分钟。用PBS洗涤三次后，将细胞与FITC共轭的链霉亲和素孵育，用FACS分析，并获得平均荧光强度(MFI)。与抑制性FcγRIIb(A)和活性FcγRIIIA(B)的抗体结合亲和性(10μg/ml)以及机理图示于图27中。

建立在细胞表面上稳定地过表达人Fcγ受体(包括FCγRIIb和FCγRIIIa158(V/V型高亲和性))的CHO-K1细胞系。通过利用FACS法，通过对平均荧光强度(MFI)进行定量，以测量母本CHO细胞和1E5细胞产生的抗体对这些Fcγ受体的结合亲和性。发现：与母本CHO细胞产生的抗体相比，1E5细胞产生的抗体对抑制性受体FCγR IIb的结合亲和性显著降低(图27A和28)，这表明抑制性受体更不容易被CHO-1E5细胞产生的抗体激活。另外，1E5细胞产生的抗体与活性FCγR IIIa的结合亲和性显著增加(图27B和28)。1E5细胞产生的抗体对FCγRI和新生儿的IgG的Fc受体(FcRN)的结合亲和性与母本CHO细胞产生的抗体相当(图28)。这些结果表明了这样的机理：1E5产生的抗体引起的ADCC活性提高是由活性FCγRIIIa的激活提高以及抑制性FCγR的激活降低而导致的。

实施例14：CHO-1E5细胞产生的抗体的免疫原性

为了评价CHO-1E5细胞产生的抗体(其中，与未修饰的母本CHO细胞产生的抗体相比，ADCC活性提高)的免疫原性，通过在灵长目动物中测量特别针对该抗体的抗体滴定量，评价该抗体的体内免疫原性。具体来说，以8mg/ml/kg体重的剂量，使3-5岁、体重4-6公斤(kg)的雌性猕猴接受野生型CHO细胞产生的抗-Her2抗体ET101、或者CHO-1E5细胞产生的ET101。每组2只猴子。抗体注射之前收集0.5ml血液，共收集7天，并且抗体注射后在第3、5、7、14、21、28和35天收集0.5ml血液。分离血清样品并冷冻在-80℃(图29A)。利用ELISA来确定猕猴中ET101-CHO-1E5抗体的免疫原性。在猴子血清中检测IgM(其特定针对所施加的ET-101抗体)的存在。用ET101-CHO或ET101-CHO-1E5抗体覆盖ELISA板。将不同稀释倍数的经分离的猴子血清样品施加到所覆盖的板上以结合至所覆盖的ET-101-CHO或ET-101-CHO-1E5抗体上。用抗IgM二抗检测所结合的IgM(图29B)。ELISA结果表明，ET101-CHO与ET101-CHO-1E5抗体之间，免疫原性(即，猴子血清中特定针对ET101的IgM水平)无显著差异(图29C)。该实施例证明：与由野生型CHO细胞产生的抗体相比，由CHO-1E5克隆产生的抗体不会诱发较高的免疫原性。

本申请不局限于上述实施方案，而是可以在随附的权利要求书的范围内进行改变。本领域技术人员会认识到、或者只是利用常规试验就能够确定本申请的具体实施方案的许多等同形式。

Claims (82)

1.一种糖蛋白，该糖蛋白被修饰为表现出变异糖基化方式，其中所述变异糖基化方式的特征在于，与对应的野生型糖蛋白相比，至少两种糖分子的水平发生变化。

2.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述变异糖基化方式通过葡萄糖、半乳糖、或这二者的水平变化来证实。

3.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述半乳糖的水平变化为降低。

4.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述葡萄糖的水平变化为增加。

5.根据权利要求1所述的糖蛋白，其中所述变异糖基化方式通过葡萄糖水平的增加、半乳糖水平的降低以及岩藻糖水平的降低来证实。

6.根据权利要求1所述的糖蛋白，所述变异糖基化方式通过末端葡萄糖部分来证实。

7.根据权利要求1所述的糖蛋白，所述变异糖基化方式包括具有式(I)或(II)所示结构的N-连接多糖：

8.一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体，该抗体包含N-连接多糖，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，所述抗体对Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)的结合亲和性增加，并且/或者对Fcγ受体IIb(FcγRIIb)的结合亲和性降低，从而提高了对表达FcγRIIIa和/或FcγRIIb的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。

9.一种由经修饰的宿主细胞产生的抗体，该抗体包含N-连接多糖，其中，与由对应的未修饰的宿主细胞产生的对应的抗体相比，所述抗体的ADCC活性增加，并且其中，所述增加的ADCC活性针对表达高亲和性Fcγ受体FcγRIIIa 158V/V的效应细胞、以及表达低亲和性Fcγ受体FcγRIIIa158F/F或FcγRIIIa 158F/V的效应细胞。

10.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖包含一个葡萄糖分子、四个甘露糖分子和两个N-乙酰基葡萄糖胺分子。

11.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖包含一个或多个岩藻糖分子。

12.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖具有式(I)或(II)所示的结构：

13.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述N-连接多糖与所述抗体的Fc区相连。

14.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体结合癌抗原。

15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述癌抗原选自由HER2、免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1、CD20、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、NGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3、以及α和β整联蛋白所组成的组。

16.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体为抑制性抗体。

17.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体为IgG抗体。

18.根据权利要求8或9所述的抗体，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体对表达低亲和性FcR的FcγRIIIa158F/F或FcγRIIIa 158F/V的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。

19.根据权利要求8或9所述的抗体，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体对表达高亲和性FcR的FcγRIIIa158V/V的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。

20.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。

21.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述宿主细胞选自由NS0、SP2/0、HEK293、PER.C6和YB2/0细胞组成的组。

22.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述宿主细胞为骨髓瘤细胞。

23.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述效应细胞为人外周血液单核细胞(PBMC)。

24.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述抗体为抗-Her2抗体。

25.根据权利要求8或9所述的抗体，其中所述效应细胞为NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、或多形核中性粒细胞(PMN)。

26.一种N-连接多糖，包含一个葡萄糖分子、四个甘露糖分子和两个N-乙酰基葡萄糖胺分子。

27.根据权利要求26所述的N-连接多糖，其中所述葡萄糖位于所述N-连接多糖的末端，并且该N-连接多糖可任选地包含一个或多个岩藻糖分子。

28.根据权利要求26所述的N-连接多糖，具有式(I)所示的结构：

29.根据权利要求26所述的N-连接多糖，具有式(II)所示的结构：

30.一种经分离的糖蛋白，其包含权利要求26至29中任意一项所述的N-多糖。

31.根据权利要求30所述的糖蛋白，其中该糖蛋白为抗体。

32.根据权利要求30所述的糖蛋白，其中该糖蛋白为酶。

33.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述N-连接多糖与所述抗体的Fc区相连。

34.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体结合癌抗原。

35.根据权利要求34所述的糖蛋白，其中所述癌抗原选自由HER2、免疫球蛋白εFc受体II、Alk-1、CD20、EGF受体、VEGF受体、FGF受体、NGF受体、PDGF受体、EpCam、CD3、CD4、CD11a、CD19、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD51、CD55、CD80、CD95、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CTLA-4、黏蛋白1、黏蛋白16、内皮糖蛋白、间皮蛋白受体、Nogo受体、叶酸受体、CXCR4、胰岛素样生长因子受体、神经节苷脂GD3、以及α和β整联蛋白所组成的组。

36.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体由经修饰的宿主细胞产生，所述宿主细胞产生基本上同种群的N-连接多糖。

37.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性增加。

38.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中，与对应的由未修饰的CHO细胞克隆、CHO-K1(ATCC#CCL-61和CRL-9618)或CHO-DG44(Invitrogen#12609-012)产生的抗体相比，所述抗体对FcγRIIIA受体的结合亲和性增加。

39.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体为抑制性抗体。

40.根据权利要求31所述的糖蛋白，其中所述抗体为IgG抗体。

41.一种制备经修饰的糖蛋白的方法，包括：

(a)提供编码所述经修饰的糖蛋白的异源多核苷酸序列；以及

(b)使所述经修饰的糖蛋白在宿主细胞中表达，其中所述宿主细胞产生具有变异糖基化方式的N-连接多糖，所述变异糖基化方式的特征在于，选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺所组成的组中的一种或多种糖部分的水平发生变化。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主细胞保持在无血清培养基中。

43.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主细胞保持在悬浮液培养物中。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述经修饰的糖蛋白为抗体。

45.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主细胞产生具有式(I)或(II)所示结构的N-连接多糖：

46.一种经修饰的宿主细胞，其产生具有变异糖基化方式的N-连接多糖，所述变异糖基化方式的特征在于，与未修饰的母本宿主细胞相比，选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺所组成的组中的一种或多种糖部分的水平发生变化。

47.根据权利要求46所述的经修饰的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，与所述未修饰的母本宿主细胞相比，所述宿主细胞表面上存在的至少两种糖分子的水平发生变化。

48.一种经分离的宿主细胞，其产生糖蛋白，该糖蛋白表现出基本上同种方式的N-连接多糖。

49.根据权利要求48所述的宿主细胞，其中所述基本上同种方式的N-连接多糖由通过质谱解析的单峰来证实。

50.一种经修饰的宿主细胞，其特征在于能够产生具有N-连接多糖的经修饰的抗体，其中，与对应的由未修饰的宿主细胞产生的抗体相比，该抗体对Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)的结合亲和性增加，并且/或者对Fcγ受体IIb(FcγRIIb)的结合亲和性降低，从而提高对表达FcγRIIIa和/或FcγRIIb的效应细胞的ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。

51.根据权利要求50所述的宿主细胞，其中提高的ADCC活性针对表达高亲和性Fcγ受体FcγRIIIa 158V/V的效应细胞、以及表达低亲和性Fcγ受体的FcγRIIIa 158F/F或FcγRIIIa 158F/V的效应细胞。

52.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述N-连接多糖表现出变异方式，该变异方式的特征在于，半乳糖水平降低。

53.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，葡萄糖水平增加。

54.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其产生这样的抗体，该抗体表现出的ADCC活性高于对应的未修饰的宿主细胞的ADCC活性。

55.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，存在末端葡萄糖部分。

56.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述变异糖基化方式的特征在于，岩藻糖水平降低，葡萄糖水平增加并且半乳糖水平降低。

57.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述N-连接方式具有式I或II所示的结构：

(II)。

58.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。

59.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述细胞为骨髓瘤细胞。

60.根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞，其中所述细胞在至少约60代后仍保持所述变异糖基化方式。

61.一种培养基，其包含根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞。

62.一种培养发酵罐，其包含在无血清培养基中的多种根据权利要求46至51中任意一项所述的宿主细胞。

63.一种选择具有变异糖基化方式的真核细胞的方法，包括：：

(a)提供多个真核细胞；

(b)将随机基因突变引入到所述多个真核细胞中；以及，

(c)从所述多个细胞中选择至少一个表现出变异糖基化方式的细胞，所述变异糖基化方式的特征在于，与对应的未进行所述随机基因突变的母本细胞相比，至少一种糖分子的水平发生变化。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述基因突变由化学诱变剂诱导。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，选自由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺中的一种或多种糖部分的水平发生变化。

66.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，半乳糖水平降低。

67.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，D-葡萄糖胺水平降低。

68.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，甘露糖水平增加。

69.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，存在末端葡萄糖分子。

70.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述真核细胞产生这样的抗体，该抗体表现出的ADCC活性高于对应的未进行所述随机基因突变的细胞的ADCC活性。

71.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述真核细胞产生这样的抗体，与对应的由未进行所述随机基因突变的细胞产生的抗体相比，该抗体对FcγRIIIA受体的结合亲和性增加。

72.根据权利要求63所述的方法，其中所述真核细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。

73.根据权利要求63所述的方法，其中所述真核细胞选自由NS0、SP2/0、HEK293、PER.C6和YB2/0细胞组成的组。

74.根据权利要求63所述的方法，其中所述真核细胞为骨髓瘤细胞。

75.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞在至少约60代之后仍保持所述变异糖基化方式。

76.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞在无血清培养基中生长。

77.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞在悬浮液中生长。

78.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞包含编码异源糖蛋白的异源序列。

79.根据权利要求63所述的方法，其中所选择的所述细胞表达基本上同种方式的N-连接多糖。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述基本上同种方式的N-连接多糖由通过质谱解析的单峰来证实。

81.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，所述N-连接方式具有式I或II所示的结构：

82.根据权利要求63所述的方法，其中所述变异糖基化方式的特征在于，半乳糖水平降低，葡萄糖水平增加，并且岩藻糖水平降低。

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