CN106715686B

CN106715686B - 生产具有改性糖基化重组糖蛋白的方法

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Publication number: CN106715686B
Application number: CN201580022914.0A
Authority: CN
Inventors: 陈念宜; 吴哲豪; 陈虹琦; 汤竣钧
Original assignee: Oneness Biotech Co ltd
Current assignee: ONENESS BIOTECH Co
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2035-03-17
Also published as: KR20160127830A; JP2020072667A; RU2016140528A3; SG11201607759RA; RU2016140528A; DK3119882T3; US20170145463A1; US10745729B2; EP3119882B1; US20150259720A1; EP3119882A4; IL247776B; CA2942618A1; CN106715686A; AU2015237951B2; ES2904993T3; PT3119882T; WO2015145268A8; AU2015237951A1; PL3119882T3

Abstract

基因工程宿主动物细胞能够生产具有改性糖基化模式，例如去岩藻糖基化和/或单糖基化的糖蛋白。这种宿主动物细胞可以被工程化以表达岩藻糖苷酶，糖苷内切酶或两者。

Description

生产具有改性糖基化重组糖蛋白的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年3月17日提交的美国临时申请号61/954,337的权益，其全部内容以引用方式并入本文中。

背景技术

糖基化(glycosylation)对糖蛋白的结构和功能至关重要。例如，认为糖基化可影响蛋白折叠(及由此的稳定性)和/或糖蛋白的生物活性。治疗性重组糖蛋白的需求，特别是单克隆抗体，在最近的二十年强劲增长。以前的研究显示，重组糖蛋白聚糖结构的微小差异可能影响糖蛋白的生物活性和药代动力学。例如，阿法达贝泊汀是具有两个额外的N-连接糖基化位点的重组人红细胞生成素(EPO)的高度糖基化的类似物。与内源或重组EPO相比，额外糖基化增加了糖类分子质量百分比，并且显著延长了阿法达贝泊汀的血清半衰期。此外，对于治疗性抗体，其功效主要依赖于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，去除Fc部分的核心岩藻糖残基的化学-酶促和遗传方法已被开发，以增加由所述抗体诱导的ADCC效应的效力。

但是，目前可用的用于糖基化重塑的方法通常需要多种酶和/或多个步骤，导致制造糖工程化的重组蛋白成本高。

发明内容

本发明是基于基因工程宿主动物细胞的开发，其能够生产糖蛋白，如具有包括去岩藻糖基化和单糖基化的改性糖基化的抗体。这样的宿主动物细胞被工程化以过量表达一种或多种岩藻糖苷酶、糖苷内切酶或二者。出乎意料的是，宿主动物细胞的细胞糖基化机制的改变没有导致与糖蛋白的合成和宿主细胞的生长相关的不利影响。

因此，本发明提供一种基因工程宿主动物细胞(例如，哺乳动物细胞)，其过量表达岩藻糖苷酶，糖苷内切酶或二者，其中与野生型对应物相比，所述宿主动物细胞生产具有改性糖基化的糖蛋白。在一些实例中，岩藻糖苷酶可以是哺乳动物岩藻糖苷酶或细菌岩藻糖苷酶，例如，人FUCA1，人FUCA2，灰仓鼠(Cricetulus griseus)岩藻糖苷酶，α-L-1脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum),α-1,6-岩藻糖苷酶或细菌岩藻糖苷酶BF3242。可替代地或另外地，糖苷内切酶可以是Endo S酶，例如，包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的酶。在一些实例中，基因工程化宿主动物细胞表达(i)人FUCA1，人FUCA2，灰仓鼠岩藻糖苷酶α-L-1,脑膜脓毒性金黄杆菌α-1,6-岩藻糖苷酶或细菌岩藻糖苷酶BF3242，和(ii)Endo S(如SEQ ID NO：11)。

本文中所描述的基因工程宿主动物细胞可以进一步表达糖蛋白，所述糖蛋白可以是外源性的(在相同类型的天然动物细胞中不表达)。实例包括：但不限于抗体、Fc融合蛋白、细胞因子、激素、生长因子或酶。

在一些实例中，基因工程宿主动物细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，大鼠骨髓瘤细胞，幼仓鼠肾(BHK)细胞，杂交瘤细胞，拿马瓦(Namalwa)细胞，胚胎干细胞或受精卵。

本文还描述了用于生产具有改性糖基化模式(例如，去岩藻糖基化或单糖基化)的糖蛋白的方法，所述方法使用任何本文所述的基因工程宿主动物细胞。所述方法可以包括(i)提供表达(a)糖蛋白和(b)岩藻糖苷酶、糖苷内切酶或二者的宿主动物细胞；在允许用于生产糖蛋白和岩藻糖苷酶、糖苷内切酶或二者的条件下，培养所述宿主动物细胞；(ⅱ)收集所述宿主动物细胞或培养上清液以便分离糖蛋白，和任选地(iii)分离所述糖蛋白。所述方法可以进一步包括(ⅳ)分析所述糖蛋白的糖基化模式。

此外，本发明特征在于一种用于制备本文描述的任一基因工程动物细胞的方法。所述方法可以包括：(i)将一种或多种表达载体引入动物细胞，所述表达载体共同地编码岩藻糖苷酶、糖苷内切酶或二者，以及任选地(ii)将编码糖蛋白的表达载体引入所述动物细胞。所述方法可以进一步包括分选表达岩藻糖苷酶、糖苷内切酶、和糖蛋白的转化细胞。

在下面的描述中提出本发明中一或多个具体实施方式的细节。从以下几个具体实施方式的详细说明和图示以及所附的权利要求书，本发明的其它特征或优点将是显而易见的。

附图说明

图1为各种不同的N-聚糖的结构示意图，A：糖蛋白的典型N连接聚糖，B：去岩藻糖基化的N-聚糖，C：具有单N-乙酰葡糖胺(Nacetylglucosamine)还原糖(单糖基化)的N-聚糖。

图2为用于生产岩藻糖苷酶的示例性表达载体的示意图，A:携带岩藻糖苷酶基因的示例性质粒的图谱，B：用于表达岩藻糖苷酶或糖苷内切酶S的示例性表达盒。

图3包括表示通过在工程化以表达岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶的宿主细胞内抗体的瞬时表达生产均匀去岩藻糖基化(afucosylated)单糖(GlcNAc)抗体h4B12的示意图，A：为生产均匀去岩藻糖基化单糖(GlcNAc)抗体的示意图，B：显示在工程化宿主细胞中产生抗体4B12糖基化的示意图，所述宿主细胞经工程化以表达人FUCA1，人FUCA2，灰仓鼠岩藻糖苷酶α-L-1，或脑膜脓毒性金黄杆菌(C.meningosepticum)α-1,6-岩藻糖苷酶，通过LC/MS/MS测定，C：为通过Western印迹检测到的CHO细胞内岩藻糖苷酶或糖苷内切酶的瞬时表达的示意图，D：表示在如上文所示的表达岩藻糖苷酶或糖苷内切酶的CHO细胞中生产抗体h4B12的图，通过LC/MS/MS测定，所述抗体具有均匀的无岩藻糖的单糖(GlcNAc)糖型。均匀N-聚糖是指糖蛋白例如抗体中N-聚糖(例如，去岩藻糖基化N-聚糖)相对于总N-聚糖的比率。

图4包括示出生产均匀去岩藻糖基化单糖(GlcNAc)抗体利妥昔单抗的示意图，通过在工程化以表达岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶的宿主细胞中瞬时表达所述抗体，A：表示在如上文所述的工程化以表达各种不同的岩藻糖苷酶或糖苷内切酶的宿主细胞中生产的抗体利妥昔单抗的糖基化，B：表示通过Western印迹测定，在如上文所述的CHO细胞中瞬时表达岩藻糖苷酶(左)或糖苷内切酶(右)。

具体实施方式

本文公开了基因工程宿主动物细胞例如哺乳动物细胞，其能够生产具有改性糖基化模式(例如改性N-糖基化模式如去岩藻糖基化N-聚糖或单糖聚糖)的糖蛋白(例如外源糖蛋白如抗体)。这种宿主动物细胞可以被工程化以过量表达岩藻糖苷酶，糖苷内切酶或二者。任选地，宿主动物细胞也可被改造以表达外源糖蛋白例如抗体。

图1中A表示野生型哺乳动物细胞中产生的糖蛋白的典型复杂N-聚糖的结构。这种复杂N-聚糖包含连接至糖基化位点的N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)残基，糖蛋白的天冬酰胺(Asn)残基，以及岩藻糖残基，其以α1,6键连接至所述Asn残基。所述基因工程宿主动物细胞能够产生糖蛋白(如内源或外源)，所述糖蛋白具有改性N-聚糖，如去岩藻糖化N-聚糖，其中一个实施例显示于图1中B，以及单糖N-聚糖，其中仅GlcNAc残基连接至Asn糖基化位点(图1中C)。具有改性糖基化的糖蛋白是指糖蛋白携带至少一种聚糖例如N-聚糖，其结构上与所述基因工程宿主动物细胞的野生型对应物产生的糖蛋白的聚糖不同。去岩藻糖化聚糖是指不含α1,6岩藻糖残基或任何岩藻糖残基的任何聚糖。

A.岩藻糖苷酶

岩藻糖苷酶是一种能够分解岩藻糖的酶。这种酶从包含岩藻糖残基的聚糖切割岩藻糖残基。用于制备基因工程宿主动物细胞的岩藻糖苷酶可以是哺乳动物岩藻糖苷酶或细菌岩藻糖苷酶。在一些实施方式中，所述岩藻糖苷酶是野生型酶，如野生型细菌酶或野生型哺乳动物酶例如人类酶。多种示例性岩藻糖苷酶的氨基酸序列及其编码核苷酸序列提供如下(包括C端的His标签)。

人类岩藻糖苷酶FUCA1:

氨基酸序列(SEQ ID NO:1)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCQPPRRYTPDWPSLDSRPLPAWFDEAKFGVFIHWGVFSVPAWGSEWFWWHWQGEGRPQYQRFMRDNYPPGFSYADFGPQFTARFFHPEEWADLFQAAGAKYVVLTTKHHEGFTNWPSPVSWNWNSKDVGPHRDLVGELGTALRKRNIRYGLYHSLLEWFHPLYLLDKKNGFKTQHFVSAKTMPELYDLVNSYKPDLIWSDGEWECPDTYWNSTNFLSWLYNDSPVKDEVVVNDRWGQNCSCHHGGYYNCEDKFKPQSLPDHKWEMCTSIDKFSWGYRRDMALSDVTEESEIISELVQTVSLGGNYLLNIGPTKDGLIVPIFQERLLAVGKWLSINGEAIYASKPWRVQWEKNTTSVWYTSKGSAVYAIFLHWPENGVLNLESPITTSTTKITMLGIQGDLKWSTDPDKGLFISLPQLPPSAVPAEFAWTIKLTGVKHHHHHH

核苷酸序列(SEQ ID NO:2；密码子经优化)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgccagccccctcggagatacacccctgactggccttccctggactccagacctctgcccgcttggtttgacgaggccaagttcggcgtgttcatccactggggcgtgttctccgtgcctgcctggggctctgagtggttctggtggcattggcagggcgagggcagacctcagtaccagcggttcatgcgggacaactacccccctggcttctcctacgccgacttcggccctcagttcaccgcccggttcttccaccctgaggaatgggccgatctgttccaggccgctggcgccaaatacgtggtgctgaccaccaagcaccacgagggcttcaccaactggccctcccccgtgtcctggaactggaactctaaggacgtgggcccccaccgggatctcgtgggagaactgggaaccgccctgcggaagcggaacatcagatacggcctgtaccactccctgctggaatggttccaccccctgtacctgctggacaagaagaacggcttcaagacccagcacttcgtgtccgccaagaccatgcccgagctgtacgacctcgtgaactcctacaagcccgacctgatttggagcgacggcgagtgggagtgccccgacacctattggaactccaccaactttctgtcctggctgtacaacgactcccctgtgaaggacgaggtggtcgtgaacgacagatggggccagaactgctcctgtcaccacggcggctactacaactgcgaggacaagttcaagccccagtccctgcccgaccacaagtgggagatgtgcacctctatcgacaagttctcctggggctaccggcgggacatggccctgtctgatgtgaccgaggaatccgagatcatctccgagctggtgcagaccgtgtccctgggcggcaactacctgctgaacatcggccctaccaaggacggcctgatcgtgcccatcttccaggaacggctgctggccgtgggcaagtggctgtctatcaacggcgaggccatctacgcctccaagccttggcgagtgcagtgggagaagaacaccacctccgtgtggtacacctccaagggctctgccgtgtacgccatcttcctgcactggcccgagaacggcgtgctgaacctggaatcccccatcaccacctctaccaccaagatcaccatgctgggcatccagggcgacctgaagtggtccaccgaccctgacaagggcctgttcatctccctgccccagctgcctccttccgctgtgcctgctgagttcgcctggaccatcaagctgaccggcgtgaagcaccaccaccatcaccattga

人类岩藻糖苷酶FUCA2:

氨基酸序列(SEQ ID NO:3)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCHSATRFDPTWESLDARQLPAWFDQAKFGIFIHWGVFSVPSFGSEWFWWYWQKEKIPKYVEFMKDNYPPSFKYEDFGPLFTAKFFNANQWADIFQASGAKYIVLTSKHHEGFTLWGSEYSWNWNAIDEGPKRDIVKELEVAIRNRTDLRFGLYYSLFEWFHPLFLEDESSSFHKRQFPVSKTLPELYELVNNYQPEVLWSDGDGGAPDQYWNSTGFLAWLYNESPVRGTVVTNDRWGAGSICKHGGFYTCSDRYNPGHLLPHKWENCMTIDKLSWGYRREAGISDYLTIEELVKQLVETVSCGGNLLMNIGPTLDGTISVVFEERLRQMGSWLKVNGEAIYETHTWRSQNDTVTPDVWYTSKPKEKLVYAIFLKWPTSGQLFLGHPKAILGATEVKLLGHGQPLNWISLEQNGIMVELPQLTIHQMPCKWGWALALTNVIHHHHHH

核苷酸序列(SEQ ID NO:4；密码子经优化)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgccactccgccaccagattcgaccccacctgggagtctctggacgccagacagctgcccgcttggtttgaccaggccaagttcggcatcttcatccactggggcgtgttctccgtgcccagcttcggctctgagtggttctggtggtactggcagaaagagaagatccccaaatacgtggagttcatgaaggacaactacccccccagctttaagtacgaggacttcggccccctgttcaccgccaagttcttcaacgccaaccagtgggccgacatcttccaggcctctggcgccaagtacatcgtgctgacctccaagcaccacgagggcttcaccctgtggggctccgagtactcctggaactggaacgccatcgacgagggccccaagcgggacatcgtgaaagaactggaagtggccatccggaaccggaccgacctgagattcggcctgtactactccctgttcgagtggttccaccccctgtttctggaagatgagtcctccagcttccacaagcggcagttccccgtgtccaagaccctgcccgagctgtacgagctcgtgaacaactaccagcccgaggtgctgtggagtgacggggatggtggtgcccccgatcagtactggaactctaccggcttcctggcctggctgtacaacgagtctcctgtgcggggcaccgtcgtgaccaacgatagatggggcgctggctccatctgcaagcacggcggcttctacacctgttccgaccggtacaaccccggccatctgctgcctcacaagtgggagaactgcatgaccatcgacaagctgtcctggggctacagaagagaggccggcatctccgactacctgacaatcgaggaactcgtgaagcagctggtggaaaccgtgtcctgcggcggcaacctgctgatgaacatcggccctaccctggacggcaccatctccgtggtgttcgaggaacggctgcggcagatgggctcctggctgaaagtgaacggcgaggccatctacgagacacacacctggcggtcccagaacgacaccgtgacccctgacgtgtggtacaccagcaagcccaaagaaaagctggtgtatgccatcttcctgaagtggcctacctccggccagctgttcctgggccaccctaaggctatcctgggcgccaccgaagtgaaactgctgggccatggacagcccctgaactggatctccctggaacagaacggcatcatggtggaactgccccagctgaccatccatcagatgccctgcaaatggggctgggccctggccctgaccaacgtgatccaccatcaccaccaccactga

灰仓鼠(中国仓鼠)岩藻糖苷酶FUCA2

氨基酸序列(SEQ ID NO:5)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCKSSRRYDPTWESLDRRPLPSWFDQAKFGIFIHWGVFSVPSFGSEWFWWYWQKEKRPKFVDFMNNNYPPGFKYEDFGVLFTAKFFNASQWADILQASGAKYLVLTSKHHEGFTLWGSEYSWNWNAVDEGPKRDIVKELKVAITKNTDLRFGLYYSLFEWFHPLFLEDKLSSFQKRQFPISKMLPELYELVNKYQPDILWTDGDGGAPDRYWNSTGFLAWLYNESPVRNTVVTNDRWGAGSICKHGGYYTCSDRYNPGHLLPHKWENCMTIDQFSWGYRREAVISDYLTIEELVKQLVETVACGGNLLMNIGPTLDGIIPVIFEERLRQMGMWLKVNGEAIYETQPWRSQNDTATPDVWYTYKPEEKIVYAIFLKWPVSRELFLEQPIGSLGETEVALLGEGKPLTWTSLKPNGIIVELPQLTLHQMPCKWGWTLALTNVTHHHHHH

核苷酸序列(SEQ ID NO:6；密码子经优化)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgcaagtcctctcggagatacgaccccacctgggagtccctggacagaaggcctctgcccagttggttcgaccaggccaagttcggcatcttcatccactggggcgtgttctccgtgcccagcttcggctctgagtggttctggtggtactggcagaaagagaagcggcccaagttcgtggacttcatgaacaacaactacccccctggctttaagtacgaggacttcggcgtgctgttcaccgccaagttcttcaacgcctcccagtgggccgacatcctgcaggcttccggcgctaagtacctggtgctgacctccaagcaccacgagggctttaccctgtggggctccgagtactcctggaactggaacgccgtggacgagggccctaagcgggacatcgtgaaagaactgaaggtggccatcaccaagaacaccgacctgagattcggcctgtactactccctgttcgagtggttccaccccctgtttctggaagataagctgtccagcttccagaagcggcagttccccatctccaagatgctgcccgagctgtacgagctcgtgaacaagtaccagcctgacatcctgtggaccgacggggatggtggcgcccctgacagatactggaactctaccggcttcctggcctggctgtacaacgagtcccctgtgcggaacaccgtcgtgaccaacgacagatggggcgctggctccatctgcaagcacggcggctactacacctgttccgaccggtacaaccccggccatctgctgcctcacaagtgggagaactgcatgacaatcgaccagttctcctggggctaccggcgcgaggccgtgatctctgactacctgaccatcgaggaactcgtgaagcagctggtggaaaccgtggcctgtggcggcaacctgctgatgaacatcggccctaccctggacggcatcatccccgtgatcttcgaggaacggctgcggcagatgggcatgtggctgaaagtgaacggcgaggccatctacgagacacagccttggcggtcccagaacgacaccgccacacctgacgtgtggtacacctacaagcccgaagagaagatcgtgtacgccatcttcctgaagtggcccgtgtccagagagctgtttctggaacagcccatcggctccctgggcgagacagaagtggctctgctgggcgagggcaagcctctgacctggacctccctgaagcccaatggcatcatcgtggaactgccccagctgaccctgcaccagatgccctgtaaatggggctggaccctggccctgaccaacgtgacccaccaccaccatcaccactga

脑膜脓毒素金黄杆菌α1,6-岩藻糖苷酶

氨基酸序列(SEQ ID NO:7)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCHNVSEGYEKPADPLVVQNLEQWQDLKFGLFMHWGTYSQWGIVESWSLCPEDESWTQRKPEHGKSYNEYVKNYENLQTTFNPVQFNPQKWADATKKAGMKYVVFTTKHHDGFAMFDTKQSDYKITSSKTPFSKNPKADVAKEIFNTFRDNGFRIGAYFSKPDWHSDDYWWSYFPPKDRNVNYDPQKYPARWENFKKFTFNQLNEITSNYGKIDILWLDGGWVRPFHTIDPNIEWQRTIKVEQDIDMDKIGTMARKNQPGIIIVDRTVPGKWENYVTPEQAVPEHALSIPWESCITMGDSFSYVPNDNYKSSQKIIETLIRIISRGGNYLMNIAPGPNGDYDAVVYERLKEISGWMDKNQSAVFTTRALAPYHESDFYYTQSKDGKIVNVFHISEKSNYQAPSELSFSIPENINPKTVKVLGISSQIKWKKKGNKIHVQLPEERTKLNYSTVIQITQHHHHHH

核苷酸序列(SEQ ID NO:8；密码子经优化)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgccacaatgtgtccgagggctacgagaagcccgccgaccctctggtggtgcagaacctggaacagtggcaggacctgaagttcggcctgttcatgcactggggcacctactcccagtggggcatcgtggaatcctggtccctgtgccctgaggacgagtcttggacccagcggaagcctgagcacggcaagtcctacaacgagtacgtgaagaactacgagaacctgcagaccaccttcaaccccgtgcagttcaacccccagaagtgggccgacgccaccaagaaagccggcatgaaatacgtggtgttcaccaccaagcaccacgacggcttcgccatgttcgacaccaagcagtccgactacaagatcacctcctccaagacccccttcagcaagaaccccaaggccgacgtggccaaagagattttcaacaccttccgggacaacggcttccggatcggcgcctacttctccaagcctgactggcactccgacgactactggtggtcctacttcccacccaaggaccggaacgtgaactacgaccctcagaaataccccgccagatgggagaacttcaagaagttcaccttcaatcagctgaacgagatcaccagcaactacggcaagatcgacatcctgtggctggacggcggatgggtgcgacccttccacaccatcgaccccaacatcgagtggcagcggaccatcaaggtggaacaggacatcgacatggacaagatcggcaccatggcccggaagaaccagcccggcatcatcatcgtggaccggaccgtgcctggcaagtgggagaattacgtgacccccgagcaggccgtgcctgagcatgccctgtctatcccttgggagtcctgtatcacaatgggcgacagcttctcctacgtgcccaacgacaactacaagtcctcccagaagatcatcgagacactgatcaggatcatctccagaggcggcaactacctgatgaatatcgcccctggccccaacggcgactacgacgctgtggtgtacgagcggctgaaagaaatctccggctggatggataagaaccagtccgccgtgtttaccacccgggctctggccccttaccacgagtccgacttctactacacccagtccaaggacggaaagatcgtgaacgtgttccacatctccgagaagtccaactaccaggccccctccgagctgtccttcagcatccccgagaacatcaaccccaagaccgtgaaggtgctgggcatctccagccagatcaagtggaagaagaagggcaacaagatccacgtgcagctgcccgaggaacggaccaagctgaactactccaccgtgatccagatcacccagcaccaccaccatcaccactga

细菌岩藻糖苷酶BF3242

氨基酸序列(SEQ ID NO:9)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCQQKYQPTEANLKARSEFQDNKFGIFLHWGLYAMLATGEWTMTNNNLNYKEYAKLAGGFYPSKFDADKWVAAIKASGAKYICFTTRHHEGFSMFDTKYSDYNIVKATPFKRDVVKELADACAKHGIKLHFYYSHIDWYREDAPQGRTGRRTGRPNPKGDWKSYYQFMNNQLTELLTNYGPIGAIWFDGWWDQDINPDFDWELPEQYALIHRLQPACLVGNNHHQTPFAGEDIQIFERDLPGENTAGLSGQSVSHLPLETCETMNGMWGYKITDQNYKSTKTLIHYLVKAAGKDANLLMNIGPQPDGELPEVAVQRLKEVGEWMSKYGETIYGTRGGLVAPHDWGVTTQKGNKLYVHILNLQDKALFLPIVDKKVKKAVVFADKTPVRFTKNKEGIVLELAKVPTDVDYVVELTIDHHHHHH

核苷酸序列(SEQ ID NO:10；密码子经优化)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgccagcagaagtaccagcccaccgaggccaacctgaaggccagatccgagttccaggacaacaagttcggcatcttcctgcactggggcctgtacgccatgctggctactggcgagtggaccatgaccaacaacaacctgaactacaaagagtacgctaagctggctggcggcttctacccctccaagttcgacgccgacaaatgggtggccgccatcaaggcctctggcgccaagtacatctgcttcaccacccggcaccacgagggcttctccatgttcgacaccaagtactccgactacaacatcgtgaaggccacccccttcaagcgggacgtcgtgaaagagctggccgacgcctgcgctaagcacggcatcaagctgcacttctactactcccacatcgactggtacagagaggacgccccccagggcagaaccggcagaagaacaggcagacccaaccccaagggcgactggaagtcctactaccagtttatgaacaaccagctgaccgagctgctgaccaactacggccccatcggcgccatttggttcgacgggtggtgggaccaggacatcaaccccgacttcgactgggagctgcccgagcagtacgccctgatccacagactgcagcccgcctgtctcgtgggcaacaaccaccaccagaccccctttgccggcgaggacatccagattttcgagcgggatctgcccggcgagaacaccgctggactgtctggccagtccgtgtcccatctgcccctggaaacctgcgagacaatgaacggcatgtggggctacaagatcaccgaccagaactacaagtccaccaagacactgatccactacctcgtgaaagccgctggcaaggacgccaacctgctgatgaacatcggcccccagcctgacggcgagctgcctgaagtggctgtgcagcggctgaaagaagtgggagagtggatgtctaagtacggcgagactatctacggcaccagaggcggcctggtggcccctcatgattggggcgtgaccacccagaagggcaacaagctgtacgtgcacatcctgaacctgcaggacaaggccctgttcctgcccatcgtggacaagaaagtgaagaaagccgtggtgttcgccgacaagacccccgtgcggttcaccaagaacaaagagggcatcgtgctggaactggccaaggtgcccaccgacgtggactacgtggtggaactgaccatcgaccaccatcatcaccaccactga

在一些实施方式中，岩藻糖苷酶可为相较于上述提供示例性的岩藻糖苷酶(例如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9，以及本文所述的其它岩藻糖苷酶)任一者，具有至少85％(例如90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％)序列相同性的酶(如野生型酶)。

两种氨基酸序列“百分比相同性”使用Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的算法确定，其如Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993描述修正。这种算法被并入Altschul等人.J.Mol.Biol.215:403-10,1990中的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。BLAST蛋白质搜索可以采用XBLAST程序进行，其中评分(score)为50、字长(wavelength)为3，以获取与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。若二序列间存在间隙(gap)，可使用Altschul等人,核酸研究(Nucleic Acids Res).25(17):3389-3402,1997所描述的Gapped BLAST。采用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如BLAST和Gapped BLAST)默认的参数。

可用于构建基因工程宿主动物细胞的哺乳动物岩藻糖苷酶包括但不限于：以GenBank登录号NP_114409.2,XP_003811598.1,AAH03060.1,EHH53333.1,XP_001127152.1,XP_010360962.1,XP_006084558.1,XP_004263802.1,XP_007171384.1,XP_006075254.1,XP_010982011.1,NP_001004218.1和XP_010964137.1所披露的那些。

可用于构建基因工程宿主动物细胞的细菌糖苷酶包括但不限于：以GenBank登录号WP_008769537.1,WP_032568292.1,EYA08300.1,WP_005780841.1,EXY26528.1,WP_044654435.1,WP_029425671.1,WP_022470316.1,CDA84816.1,WP_004307183.1和WP_008025871.1所披露的那些。

B.糖苷内切酶

糖苷内切酶是指能够破坏聚糖中2个单糖间糖苷键的酶，从而从糖蛋白或糖酯中释放寡糖。本发明披露中使用的糖苷内切酶(例如野生型酶)包括糖苷内切酶D、糖苷内切酶F、糖苷内切酶F1、糖苷内切酶F2、糖苷内切酶H、和糖苷内切酶S。各亚属示例性糖苷内切酶列于下表：

其它适用的糖苷内切酶包括与本文所述的酶具有至少85％(如90％,95％,98％,或99％)序列相同性的那些。与上述所列的糖苷内切酶任一者具有高度序列同源性(如至少85％序列相同性)的酶被预期具有相同的生物活性。此类酶(例如野生型)可以使用以上所列酶之一从基因数据库例如GenBank中查询获得。

在一些实施方式中，本文所述的糖苷内切酶为Endo S酶。Endo S是一种糖苷内切酶，其特异性切割连接至原始IgG分子Fc结构域Asn糖基化位点的第一个GlcNAc残基的N-聚糖，产生单糖基化的IgG分子，即具有单一GlcNAc连接至Asn糖基化位点的IgG分子。氨基酸序列以及编码核苷酸序列提供如下：

Endo S氨基酸序列(SEQ ID NO:11)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCAQHDSLIRVKAEDKVVQTSPSVSAIDDLHYLSENSKKEFKEGLSKAGEVPEKLKDILSKAQQADKQAKVLAEMKVPEKIAMKPLKGPLYGGYFRTWHDKTSDPAEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWTKDYSLFWQELATKHVPTLNKQGTRVIRTIPWRFLAGGDHSGIAEDTQKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDIERDSIPKVNGKESNENIQRSIAVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYIDLLLVQVYGIQGEKGDWDPVARKPEKTMEERWESYSKYIRPEQYMVGFSFYEENAGSGNLWYDINERKDDHNPLNSEIAGTRAERYAKWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKVSDDEKRTNKAIKDITDGIVKSDYKVSKALKKVMENDKSYELIDQKDFPDKALREAVIAQVGSRRGDLERFNGTLRLDNPDIKSLEGLNKLKKLAKLELIGLSQITKLDSSVLPENIKPTKDTLVSVLETYKNDDRKEEAKAIPQVALTISGLTGLKELNLAGFDRDSLAGIDAASLTSLEKVDLSKNKLDLAAGTENRQIFDVMLSTVSNRVGSNEQTVTFDHQKPTGHYPNTYGTTSLRLPVGEGKIDLQSQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQEQLIAGRRFVDPGYAYKNFAVTYDAYKVRVTDSTLGVTDEKKLSTSKEETYKVEFFSPTNGTKPVHEAKVVVGAEKTMMVNLAAGATVIKSDSHENAKKVFDGAIEYNPLSFSSKTSITFEFKEPGLVKYWRFFNDITRKDDYIKEAKLEAFVGHLEDDSKVKDSLEKSTEWVTVSDYSGEAQEFSQPLDNISAKYWRVTVDTKGGRYSSPSLPELQILGYRLPLTHDYKDDDDK

Endo S核苷酸序列(SEQ ID NO:12；密码子经优化)

atgagagtgcctgctcagctgctgggcctgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgcgcccagcacgactccctgatcagagtgaaggccgaggacaaggtggtgcagacctccccttccgtgtccgccatcgacgacctgcactacctgtccgagaactccaagaaagagttcaaagagggcctgtccaaggccggcgaggtgcccgaaaagctgaaggacatcctgagcaaggctcagcaggccgacaagcaggccaaggtgctggccgagatgaaggtgccagagaagatcgccatgaagcccctgaagggccctctgtacggcggctacttcagaacctggcacgacaagacctccgaccccgccgagaaggacaaagtgaactccatgggcgagctgcccaaagaggtggacctggccttcgtgttccacgactggaccaaggactactccctgttctggcaggaactggccaccaagcacgtgcccaccctgaacaagcagggcaccagagtgatccggacaatcccctggcggtttctggctggcggcgaccactctggaatcgccgaggatacccagaagtaccccaacacccccgagggcaacaaggccctggctaaggccatcgtggacgagtacgtgtacaagtacaacctggacggcctggacgtggacatcgagcgggactccatccctaaagtgaacggcaaagagtccaacgagaacatccagcggtctatcgccgtgttcgaggaaatcggcaagctgatcggccccaagggcgccgacaagtcccggctgttcatcatggactccacctacatggccgataagaaccccctgatcgagagaggcgccccttacatcgatctgctgctggtgcaggtgtacggcatccagggcgagaagggcgattgggaccctgtggcccggaagcctgaaaagaccatggaagagagatgggagtcctactccaagtacatccggcccgagcagtatatggtgggattcagcttctacgaggaaaacgccggctccggcaacctgtggtacgacatcaacgagcggaaggacgaccacaaccctctgaactccgagatcgccggcacccgggctgagagatacgctaagtggcagcccaagaccggcggagtgaagggcggcatcttctcctacgccatcgatagggatggcgtggcccaccagcctaagaaggtgtccgacgacgagaagcggaccaacaaggctatcaaggacatcaccgacggcatcgtgaagtccgactacaaggtgtccaaagccctgaagaaagtgatggaaaacgacaagagctacgagctgatcgaccagaaggacttccccgataaggccctgcgcgaggccgtgattgctcaagtgggctccagacggggcgacctggaaagattcaacggcaccctgcggctggacaaccccgacatcaagtccctggaaggcctgaacaaactgaagaagctggccaagctggaactgatcggactgtcccagatcacaaagctggactcctccgtgctgcctgagaacatcaagcccaccaaggacaccctggtgtccgtgctggaaacctacaagaacgacgaccggaaagaggaagccaaggccatccctcaggtggccctgaccatctctggcctgaccggcctgaaagagctgaatctggccggcttcgaccgggattccctggctggaatcgatgccgcctctctgacctccctggaaaaagtggacctgtctaagaacaagctggatctggctgccggcaccgagaaccggcagatcttcgacgtgatgctgtccaccgtgtccaacagagtgggcagcaacgagcagaccgtgaccttcgaccaccagaagcccaccggccactaccctaacacctacggcaccacctccctgagactgcctgtgggcgagggcaagatcgacctgcagtcccagctgctgttcggcaccgtgaccaaccagggcacactgatcaactccgaggccgattacaaggcctaccaggaacagctgatcgctgggcggagattcgtggaccctggctacgcttacaagaacttcgccgtgacctacgatgcctacaaagtgcgcgtgaccgactccaccctgggcgtgacagacgaaaagaagctgagcacctccaaagaagagacatacaaggtggaattcttctcccccaccaatggcaccaagcctgtgcatgaggctaaggtggtcgtgggcgccgagaaaaccatgatggtcaacctggccgctggcgccaccgtgatcaagtctgactctcacgagaatgccaaaaaggtgttcgacggcgccatcgagtacaatcctctgagcttctccagcaagaccagcatcaccttcgagtttaaagaacccggcctcgtgaaatactggcggttcttcaacgatatcacccgcaaggacgactacatcaaagaggctaagctggaagccttcgtgggccatctggaagatgactccaaagtgaaggactctctggaaaagtccaccgagtgggtcaccgtgtctgactactctggcgaggcccaggaattctcccagcccctggacaacatctccgccaagtattggagagtgaccgtggacaccaagggcggacggtacagctctcctagcctgcccgagctgcagatcctgggctacagactgcctctgacccacgactataaggacgacgacgacaaatga

一些实施方式中，本文所述Endo S酶可以是相较于SEQ ID NO:11具有至少85％(例如90％,93％,95％,96％,97％,98％,或99％)序列相同性的酶(例如野生型酶)。实例包括但不限于：GenBank登录号.EQB24254.1,WP_037584019.1,WP_012679043.1,和ADC53484.1所描述的那些。

C.基因工程宿主动物细胞

本文所述宿主动物细胞是基因工程化的，以过量表达一种或多种具有特异性聚糖-修饰活性的酶(例如糖苷酶或乙二醇转移酶)。基因工程宿主动物细胞是指携带外源(非原生)基因材料的动物细胞，这些外源基因编码本文所述的一种或多种岩藻糖苷酶和糖苷内切酶。过量表达酶的宿主细胞是指基因工程宿主细胞，所述基因工程宿主细胞表达酶的水平相较于该宿主细胞野生型对应物表达酶的水平高(例如20％,50％,80％,100％,2-倍,5-倍,10-倍,50-倍,100-倍,1,000-倍,10⁴-倍,或10⁵-倍)，该宿主细胞野生型对应物即为未含有与基因工程宿主细胞相同基因改性的相同类型的细胞。在一些实施方式中，编码本文所述外源酶的基因可被导入到适用的母体动物细胞，以生产本文所述基因工程宿主动物细胞。外源酶是指不存在于用以制造工程化宿主动物细胞的母体细胞内的酶。

本文所述基因工程宿主动物细胞，相较于野生型对应物，能够生产具有改性糖基化的糖蛋白，其可以通过常规重组技术制备。一些情况下，可将强的启动子插入内源岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶基因上游，以增强其表达。其它情况下，可将编码一种或多种岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶的基因材料导入母体宿主细胞，以生产本文所述的基因工程宿主动物细胞。

利用本领域熟知的方法，可将编码岩藻糖苷酶或糖苷内切酶的基因插入适用的表达载体(例如病毒载体或非病毒载体)。Sambrook等人.,分子克隆(Molecular Cloning),实验手册(A Laboratory Mannual),第三版.,冷泉港实验室出版社。举例而言，基因与载体在合适的条件下可互相接触，用限制性内切酶在各分子上创造互补端，可互补配对，且以连接酶相连接。或者，可将合成的核酸连接物连接至基因末端。这些合成的连接物含有相对应于载体上特定限制位点的核酸序列。在一些实施方式中，岩藻糖苷酶或糖苷内切酶的基因包含于表达盒内，其包含一种或多种下述元件：科扎克序列以及信号肽序列，其位于酶的N末端，以及蛋白质标签(例如FLAG,His标签，包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、和谷胱甘肽-S-转移酶(GST))。所述蛋白标签可以位于酶的N末端或者C末端。见例如图2中B。

此外，所述表达载体可包含，例如，下述部分或全部：选择性标记基因，例如新霉素基因，用于哺乳动物细胞筛选稳定或瞬时转染子；源于人类CMV立即早期基因的增强子/启动子序列，用于高水平转录；用于mRNA稳定性，源自SV40的转录终止和RNA加工信号(基因)；SV40多瘤复制起始(序列)和ColE1，用于适度游离型复制；通用多克隆位点；以及T7与SP6RNA启动子，用于体外转录正义与反义RNA。合适的载体以及用于生产含转基因载体的方法为本领域公知且可及。Sambrook等人.,分子克隆,实验手册,第三版.,冷泉港实验室出版社。

若需用二种或二种以上酶构建本文所述的宿主动物细胞，例如二种或多种岩藻糖苷酶，二种或多种糖苷内切酶，或岩藻糖苷酶与糖苷内切酶组合，则编码二种或多种酶的基因可插入各自表达载体或插入到经设计以表达多种蛋白的共用表达载体。

用于生产岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶表达载体可导入适用的母体宿主细胞，包括但不限于：鼠骨髓瘤细胞(如NSO细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人类胚胎肾细胞(如HEK293)、和人类视网膜母细胞瘤细胞(如PER.C6)。选择适用的宿主细胞系，其属于本领域技术人员公知范畴，将取决于高产率需求及生产具有所需性质产物的需求之间的平衡。

一些情况下，表达载体可经设计，以致它们能通过本领域公知方法，以同源或非同源重组并入细胞基因中。用于将表达载体转移至母宿主细胞的方法包括但不限于：病毒介导的基因转移、脂质体介导的转移、转化、转染和转导，例如，病毒介导的基因转移，如使用基于DNA病毒如腺病毒、腺相关病毒以及疱疹病毒的载体，以及基于反转录病毒的载体。基因转移模式的示例包括，如：裸DNA、CaPO₄沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞显微注射以及病毒载体、佐剂辅助型DNA、基因枪、导管。在一个示例当中，使用病毒载体。为了增加非病毒载体至细胞的输送，核酸或蛋白可偶联结合至抗体或它的结合片段，其结合细胞表面抗原。也包含靶标抗体或其片段的脂质体可用于本文所述的方法。

本文所述“病毒载体”是指以重组方式生产的病毒或病毒颗粒，其包含待输送至宿主细胞的多核苷酸，不论体内、离体或体外。病毒载体的示例包括：反转录病毒载体例如慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体及其类似物。对于反转录病毒载体介导的基因转移方面，载体构建物是指包含反转录病毒基因组或其部分的多核苷酸，以及治疗性基因。

基因工程宿主动物细胞可包含使用为所导入的一种或多用基因组成型表达或诱导型表达所创建的表达盒。此表达盒可包括调节元件，如启动子、起始密码子、终止密码子及多腺苷化信号。所述元件能够可操作连接至编码感兴趣的表面蛋白的基因，如此，该基因在宿主细胞中可操作(例如表达)。

许多启动子可用于表达岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶(以及本文所述的任何外源糖蛋白)。可用于表达蛋白的启动子为本领域公知，包括但不限于：巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒LTR如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴(simian)病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lac UV5启动子及单纯疱疹tk病毒启动子。

也可以使用调节性启动子。此类调节性启动子包括使用四环素抑制子(tetR)[Gossen,M.和Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992)；Yao,F.等人,人类基因治疗,9:1939-1950(1998)；Shockelt,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:6522-6526(1995)]的那些。其它系统包括FK506二聚体，使用雌二醇的VP16或p65，RU486，二酚米乐甾酮(diphenol murislerone)或雷帕霉素(rapamycin)。诱导性系统可向英杰(Invitrogen)、克隆泰克(Clontech)和阿瑞雅德(Ariad)购买。

一些诱导性启动子的效果可随时间增加。在这种情况下，通过串联方式插入多重抑制子，如通过内部核糖体插入位点(internal ribosome entry site；IRES)将TetR连接至TetR，可以增加此类系统的效果。或者，可以于筛选所需功能前，等待至少3天。虽然可能发生某些沉默现象，可以通过使用适当数目细胞而最小化该现象，所述细胞数目较佳为至少1x10⁴、更佳为至少1x10⁵、又更佳为至少1x10⁶、甚至更佳为至少1x10⁷。可以通过公知方法增强所需蛋白表达，以增进所述系统的功效。例如，使用土拔鼠肝炎病毒转录后调控元件(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element；WPRE)。参见Loeb,V.E.,等人,人类基因治疗(Human Gene Therapy)10:2295-2305(1999)；Zufferey,R.,等人,J.of Virol.73:2886-2892(1999)；Donello,J.E.,等人,J.of Virol.72:5085-5092(1998).

用于实施本文所述方法的聚腺苷酸化信号的示例包括但不限于：人类I型胶原蛋白聚腺苷酸化信号、人类II型胶原蛋白聚腺苷酸化信号及SV40聚腺苷酸化信号。

包括可操作地连接至调控元件的岩藻糖苷酶基因和/或糖苷内切酶基因(以及本文所述的糖蛋白基因)的外源基因材料，可维持存在于细胞以作为功能胞质分子、功能游离分子或其可整合入细胞的染色体DNA。外源基因材料可导入细胞，其以质粒形式维持为独立基因材料。或者，可整合入染色体的线型DNA，可被导入细胞。当导入DNA至细胞内时，可加入促进DNA整合入染色体的试剂。适用于促进整合的DNA序列也可包括于DNA分子中。或者，可将RNA导入细胞。

可使用选择性标记监控本文所述宿主动物细胞对所需转入基因的摄取。这些标记基因可以受控于任何启动子或诱导性启动子。这些是本领域公知的，且包括改变细胞对刺激，如营养物、抗生素等的敏感性的基因。基因包括那些neo、puro、tk、多重抗药性(multiple drug resistance；MDR)等基因。其它基因表达可易于进行筛选的蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、荧光素酶及LacZ。

D.生产具有改性糖基化的糖蛋白

基因工程宿主动物细胞可用于生产具有改性糖基化模式的糖蛋白(如内源性或外源性)。一些具体实施方式中，用于生产上述基因工程宿主动物细胞的母宿主细胞已携带编码外源性糖蛋白的一或多个基因。在其它实施方式中，编码感兴趣糖蛋白的一个或多个基因可被导入基因工程宿主动物细胞，所述宿主动物细胞可由本领域公知或本文所述方法表达一种或多种岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶。

能产生感兴趣糖蛋白和一种或多种岩藻糖苷酶和/或糖苷内切酶两者的基因工程宿主动物细胞可于容许蛋白质表达的适当条件下培养。可收集细胞和/或培养基，可使用常规技术自细胞和/或培养基分离和纯化感兴趣的糖蛋白。可以常规技术如LC/MS/MS测定所生产的糖蛋白的糖基化模式，以确认糖基化改性。

一些实施例中，感兴趣的糖蛋白为抗体。示例性抗体包括但不限于：阿昔单抗(糖蛋白IIb/IIIa；心血管疾病)，阿达木单抗(TNF-α；各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎)，阿仑单抗(CD52；慢性淋巴细胞白血病)，巴利昔单抗(IL-2Rα受体(CD25)；移植排斥)，贝伐单抗(血管内皮生长因子A；各种癌症，如结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、肾癌、湿性年龄相关性黄斑退化)，卡妥索单抗，西妥昔单抗(EGF受体，各种癌症，如结肠直肠癌、头颈癌)，赛妥珠单抗(如聚乙二醇结合赛妥珠单抗certolizumab pegol)(TNFα；克隆氏症，类风湿性关节炎)，达利珠单抗(IL-2Rα受体(CD25)；移植排斥)，依库珠单抗(补体蛋白C5；阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria))，依法利珠单抗(CD11a；牛皮癣)，吉妥珠单抗(CD33；急性骨髓性白血病(如伴随卡里奇霉素(calicheamicin)))，替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(CD20；非霍奇金淋巴瘤(如伴钇-90或铟-111))，英夫利昔单抗(TNF-α；各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎)，莫罗单抗-CD3(T细胞CD3受体；移植排斥)，那他珠单抗(α-4(α4)整合素；多发性硬化症，克隆氏症)，奥马珠单抗(IgE；过敏性哮喘)，帕利珠单抗(RSV F蛋白表位；呼吸道融合病毒感染)，帕尼单抗(EGF受体；癌症，如结肠直肠癌)，兰尼单抗(血管内皮生长因子A；湿性年龄相关性黄斑退化)，利妥昔单抗(CD20；非霍奇金淋巴瘤)，托西莫单抗(CD20，非霍奇金淋巴瘤)，曲妥珠单抗(ErbB2；乳腺癌)。

一些实施例中，感兴趣糖蛋白是细胞因子。示例包括但不限于：干扰素(如IFN-α、INF-β或INF-γ)、白介素(如IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-12)，及集落刺激因子(如G-CSF、GM-CSF、M-CSF)。IFN可为如干扰素α2a或干扰素α2b。参见如Mott HR和CampbellID.“四螺旋束生长因子及其受体:蛋白-蛋白相互作用(Four-helix bundle growthfactors and their receptors:protein-protein interactions).”Curr Opin StructBiol.1995 2月；5(1):114-21；Chaiken IM,Williams WV.“识别四螺旋束细胞因子结构-功能关系：重新模拟设计(Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines:towards de novo mimetics design).”TrendsBiotechnol.1996，10月；14(10):369-75；Klaus W等人,“由异核核磁共振光谱学测定溶解状态中人类干扰素α-2a的三维高分辨率结构(The three-dimensional high resolutionstructure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMRspectroscopy in solution)”.J.Mol Biol.,274(4):661-75,1997，对于某些此类细胞因子的进一步讨论。

感兴趣的蛋白质可为细胞因子蛋白，其具有与一种或多种前述细胞因子类似的结构。例如，所述细胞因子可为IL-6类细胞因子例如白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor；LIF)或抑瘤素M(oncostatin M)。一些实施方式中，所述细胞因子自然结合至包含GP130信号转导亚基的受体。其它感兴趣的四螺旋束蛋白包括生长激素(growth hormone；GH)、泌乳素(prolactin；PRL)及胎盘生乳素(placental lactogen)。一些具体实施方式中，靶标蛋白为红血球生成刺激剂，如(EPO)，其也为四螺旋束细胞因子。一些具体实施方式中，红血球生成刺激剂为EPO变体，如阿法达贝泊汀，也称作新型红血球生成刺激蛋白(novelerythropoiesis stimulating protein；NESP)，其被工程化以含有5条N-连接的糖链(比重组HuEPO多2条)。一些具体实施方式中，所述蛋白包含5个螺旋。例如，所述蛋白可为干扰素β，如干扰素β-1a或β-1b，其(如所理解)通常归类为四螺旋束细胞因子。一些具体实施方式中，靶标蛋白为IL-9,IL-10,IL-11,IL-13,或IL-15。参见如Hunter,CA,免疫学自然综述(Nature Reviews Immunology)5,521-531,2005,对特定细胞因子的探讨。还参见Paul,WE(编辑),基础免疫学(Fundamental Immunology),Lippincott Williams和Wilkins；第6版,2008。

此外，感兴趣的蛋白可以为用于治疗人体疾病或失调，经美国食品药品管理局(或对等法规机构如欧洲药物评审局)批准的蛋白。此类蛋白可为或可不为这样的蛋白，聚乙二醇化(PEGylated)形式已经经临床试验和/或上市许可。在某些情况下，所述感兴趣蛋白为Fc融合蛋白，包括但不限于：阿巴西普、依那西普、IL-2-Fc融合蛋白、CD80-Fc融合蛋白，及PDL1-1-Fc融合蛋白。

进一步地，感兴趣的蛋白可为神经营养因子，即促进神经谱系细胞(该词如本文所使用包括神经祖细胞、神经元、及神经胶质细胞，如星状胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞)存活、发育和/或功能的因子。例如，一些具体实施方式中，靶标蛋白为促进轴突生长的因子。一些具体实施方式中，所述蛋白为睫状神经营养因子(ciliary neurotrophicfactor；CNTF，一种四螺旋束蛋白)或其类似物如阿索开(Axokine)，其为人类睫状神经营养因子的修饰版本，其具有C端15个氨基酸截断以及2个氨基酸取代，其体外与体内试验的功效为CNTF的3至5倍，且具有改进的稳定性。

或者，感兴趣的蛋白可为酶，如代谢或其他生理过程中重要的酶。如本领域所知，酶或者其他蛋白质的缺乏可造成多种疾病。此类疾病包括与糖类代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、卟啉(porphyrin)代谢、嘌呤或嘧啶代谢、溶酶体储存失调、血液凝聚等缺陷相关的疾病。实例包括法布瑞症(Fabry disease)、高歇氏症(Gaucher disease)、庞贝氏症(Pompedisease)、腺苷脱胺酶缺失、天冬酰胺酶缺失、卟啉病(porphyria)、血友病以及遗传性血管水肿。一些具体实施方式中，蛋白为凝血或凝聚因子(如因子VII、VIIa、VIII或IX)。其他具体实施方式中，蛋白是一种酶，其在糖类代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、卟啉代谢、嘌呤或嘧啶代谢、和/或溶酶体储存中发挥作用，其中外源性注射所述酶可至少部分缓解疾病。

此外，感兴趣的蛋白可为激素，如胰岛素、生长激素、黄体生成素、卵泡刺激素、及促甲状腺激素。感兴趣的蛋白可为生长因子，包括但不限于：肾上腺髓质素(adrenomedullin；AM)、血管生成素(angiopoietin；Ang)、自分泌运动因子(autocrinemotility factor)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins；BMPS)、脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor；BDNF)、表皮生长因子(EGF)、红血球生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor；FGF)、胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor；GDNF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor；G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor；GM-CSF)、生长分化因子-9(growth differentiation factor-9；GDF9)、愈合因子、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(hepatoma-derived growth factor；HDGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor；KGF)、促移行因子(migration-stimulatingfactor；MSF)、肌肉生长抑制素(myostatin；GDF-8)、神经生长因子(NGF)与其他神经营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)及胎盘生长因子(PGF)。

据信无需进一步详尽说明，本领域普通技术人员可根据前面描述，最大程度利用本发明。因此，下列具体实施方式应理解为仅具有说明性，而非以任何方式局限本发明。通过引用并入本文引用的所有出版物用于本文引用的主题或目的。

实施例

方法

i.构建用于生产岩藻糖苷酶或糖苷内切酶的表达载体

为了构建岩藻糖苷酶或糖苷内切酶的表达载体，以常规技术分离岩藻糖苷酶或糖苷内切酶基因，并基于仓鼠细胞的密码子使用，进行密码子优化。合成基因由GeneArt Corp制备，并在限制酶位点Bgl II/EcoR I插入到pcDNA3.1B(-)Myc-His载体(英杰,US)(图2中A)。α岩藻糖苷酶的表达盒，从5’到3’，包含科扎克序列、Igk前导序列、岩藻糖苷酶编码序列及His-标签编码序列。图2中B。糖苷内切酶表达盒，从5’到3’，包含科扎克序列、Igk前导序列、糖苷内切酶编码序列、及His-标签编码序列。图2中B。

ii.制备去岩藻糖基化抗体

抗体产生细胞株以0.3～3.0×10⁶存活细胞/毫升的浓度维持于完全培养基，以8mM L-谷氨酰胺与抗结块剂1:100稀释补充的CD FortiCHO^TM培养基(生命科技(LifeTechnologies),美国)。将细胞维持在含8％CO₂培养箱中的振荡台，其设定为130-150rpm。

为了制备去岩藻糖基化抗体，利用FreeStyleMAX试剂(生命科技,美国)根据制造商的方案，以编码前述α-岩藻糖苷酶的表达载体转染前述抗体产生细胞。将转染细胞培养于含有4g/L葡萄糖的培养基，且每隔一天置换培养基。当细胞存活率降至70％时，收取细胞。收集澄清的培养上清液，并以蛋白A层析法纯化。

iii.分析抗体糖基化

根据本文所述方法制备的重组抗体是经过还原、烷基化、及于37℃25mM碳酸氢铵缓冲液(pH～8)存在下以胰酶隔夜分解。将PNG酶F溶液(3μL,罗氏(Roche))加至200μL经分解的样本，且将混合物于37℃下再孵育16小时。使用

C18柱(沃特斯(Waters))从肽中分离释放出的聚糖。以乙腈洗脱Sep-Pak C18，之后以水清洗。将PNG酶F分解样本填入该柱，并以1％乙醇冲洗释放的聚糖，同时肽仍结合于Sep-Pak C18。释放的蛋白质寡糖首先用多孔性石墨碳管柱(PhyNexus)纯化，之后经全甲基化(permethylated)。所有质谱实验以Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪进行，其经由直接输注至纳米电喷雾源(nano-electrospray source)内。

结果

1.生产具有单糖(GlcNAc)糖型的抗体h4B12、利妥昔单抗和奥马珠单抗

通过岩藻糖苷酶切割反应，可由前述二糖变体制备单糖的糖变体。由许多可得酶的检索及通过LC/MS/MS的乙二醇-肽分析显示，经过优化切割反应条件，使用α-1,6岩藻糖苷酶可达到有效去岩藻糖苷化，且较高的切割效率与较低的NF/N比例有关。或者，可依次结合两种反应酶以获得单糖的糖变体，所述两种酶包括糖苷内切酶(Endo S)和α-1,6-岩藻糖苷酶。所得的单-GlcNAc糖变体示于图3中A。

结果显示，Endo S移除大于90％本文所述的工程CHO细胞中产生的h4B12、利妥昔单抗和奥马珠单抗的重链的N-连接聚糖。关于表达各岩藻糖苷酶的CHO细胞中产生的h4B12抗体，五种不同类型的岩藻糖苷酶FUCA1、FUCA2、灰仓鼠岩藻糖苷酶α-L-1、脑膜脓毒性金黄杆菌α-1,6-岩藻糖苷酶以及BF3242的去岩藻糖基化能力分别为5.8％,9.1％,17.7％,11.5和68％。图3中B。酶表达以Western blot法检测，如图3中C所示。

2-去氧-2-氟L-岩藻糖是经氟化的岩藻糖类似物。其可以在宿主细胞内代谢，以产生基于底物的岩藻糖基转移酶抑制剂。当培养瞬时表达岩藻糖苷酶BF3242和Endo S的产生抗体的CHO细胞时，连接至CHO细胞产生的抗体的N-聚糖中，99.89％为单糖基化(GlcNAc-Ig-Fc)。图3中D。

CHO-35D6细胞，其产生利妥昔单抗，以表达载体稳定转染，以生产BF3242和EndoS。细胞于100～400g/ml G418存在下培养。因此，所产生的抗体含有17-19％的GlcNAc-Ig-Fc。图4中A。

酶表达以Western blot法检测，如图4中B所示。

在工程化以表达岩藻糖苷酶和Endo S两者的CHO细胞中所生产的奥马珠单抗中，观察到类似结果。

对于制备均一的聚糖型抗体中的转糖基化反应而言，这样的效率代表了至为重要的步骤。

其它实施方式

本说明书所揭示的所有特征可以任意组合结合。本说明书揭示的各特征可基于相同、等同或类似目的，以另一特征所替代。因此，除非另有明确指明，所揭示的各特征仅为一通用系列的等同或类似特征的实例。

由上述陈述，本领域普通技术人员可易于确定本发明的必要特征，且在不背离其精神及范畴之下，可进行本发明的各种变更及改进，以使其适应于各种不同的用途及条件。因此，其它实施方式也在权利要求范围内。

序列表

<110> 泉盛生物科技公司

<120> 生产具有可控多糖形式的重组蛋白的方法

<130> F0720.70001WO00

<150> US 61/954,337

<151> 2014-03-17

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Gln Pro Pro Arg Arg Tyr Thr Pro Asp Trp Pro Ser

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Leu Asp Ser Arg Pro Leu Pro Ala Trp Phe Asp Glu Ala Lys Phe Gly

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Trp Phe Trp Trp His Trp Gln Gly Glu Gly Arg Pro Gln Tyr Gln Arg

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<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 2

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<220>

<223> 合成多肽

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<210> 7

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cctgagcatg ccctgtctat cccttgggag tcctgtatca caatgggcga cagcttctcc 960

tacgtgccca acgacaacta caagtcctcc cagaagatca tcgagacact gatcaggatc 1020

atctccagag gcggcaacta cctgatgaat atcgcccctg gccccaacgg cgactacgac 1080

gctgtggtgt acgagcggct gaaagaaatc tccggctgga tggataagaa ccagtccgcc 1140

gtgtttacca cccgggctct ggccccttac cacgagtccg acttctacta cacccagtcc 1200

aaggacggaa agatcgtgaa cgtgttccac atctccgaga agtccaacta ccaggccccc 1260

tccgagctgt ccttcagcat ccccgagaac atcaacccca agaccgtgaa ggtgctgggc 1320

atctccagcc agatcaagtg gaagaagaag ggcaacaaga tccacgtgca gctgcccgag 1380

gaacggacca agctgaacta ctccaccgtg atccagatca cccagcacca ccaccatcac 1440

cactga 1446

<210> 9

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Gln Gln Lys Tyr Gln Pro Thr Glu Ala Asn Leu Lys

20 25 30

Ala Arg Ser Glu Phe Gln Asp Asn Lys Phe Gly Ile Phe Leu His Trp

35 40 45

Gly Leu Tyr Ala Met Leu Ala Thr Gly Glu Trp Thr Met Thr Asn Asn

50 55 60

Asn Leu Asn Tyr Lys Glu Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Gly Phe Tyr Pro

65 70 75 80

Ser Lys Phe Asp Ala Asp Lys Trp Val Ala Ala Ile Lys Ala Ser Gly

85 90 95

Ala Lys Tyr Ile Cys Phe Thr Thr Arg His His Glu Gly Phe Ser Met

100 105 110

Phe Asp Thr Lys Tyr Ser Asp Tyr Asn Ile Val Lys Ala Thr Pro Phe

115 120 125

Lys Arg Asp Val Val Lys Glu Leu Ala Asp Ala Cys Ala Lys His Gly

130 135 140

Ile Lys Leu His Phe Tyr Tyr Ser His Ile Asp Trp Tyr Arg Glu Asp

145 150 155 160

Ala Pro Gln Gly Arg Thr Gly Arg Arg Thr Gly Arg Pro Asn Pro Lys

165 170 175

Gly Asp Trp Lys Ser Tyr Tyr Gln Phe Met Asn Asn Gln Leu Thr Glu

180 185 190

Leu Leu Thr Asn Tyr Gly Pro Ile Gly Ala Ile Trp Phe Asp Gly Trp

195 200 205

Trp Asp Gln Asp Ile Asn Pro Asp Phe Asp Trp Glu Leu Pro Glu Gln

210 215 220

Tyr Ala Leu Ile His Arg Leu Gln Pro Ala Cys Leu Val Gly Asn Asn

225 230 235 240

His His Gln Thr Pro Phe Ala Gly Glu Asp Ile Gln Ile Phe Glu Arg

245 250 255

Asp Leu Pro Gly Glu Asn Thr Ala Gly Leu Ser Gly Gln Ser Val Ser

260 265 270

His Leu Pro Leu Glu Thr Cys Glu Thr Met Asn Gly Met Trp Gly Tyr

275 280 285

Lys Ile Thr Asp Gln Asn Tyr Lys Ser Thr Lys Thr Leu Ile His Tyr

290 295 300

Leu Val Lys Ala Ala Gly Lys Asp Ala Asn Leu Leu Met Asn Ile Gly

305 310 315 320

Pro Gln Pro Asp Gly Glu Leu Pro Glu Val Ala Val Gln Arg Leu Lys

325 330 335

Glu Val Gly Glu Trp Met Ser Lys Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Gly Thr

340 345 350

Arg Gly Gly Leu Val Ala Pro His Asp Trp Gly Val Thr Thr Gln Lys

355 360 365

Gly Asn Lys Leu Tyr Val His Ile Leu Asn Leu Gln Asp Lys Ala Leu

370 375 380

Phe Leu Pro Ile Val Asp Lys Lys Val Lys Lys Ala Val Val Phe Ala

385 390 395 400

Asp Lys Thr Pro Val Arg Phe Thr Lys Asn Lys Glu Gly Ile Val Leu

405 410 415

Glu Leu Ala Lys Val Pro Thr Asp Val Asp Tyr Val Val Glu Leu Thr

420 425 430

Ile Asp His His His His His His

435 440

<210> 10

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 10

atgagagtgc ctgctcagct gctgggactg ctgctgctgt ggctgcctgg tgctagatgc 60

cagcagaagt accagcccac cgaggccaac ctgaaggcca gatccgagtt ccaggacaac 120

aagttcggca tcttcctgca ctggggcctg tacgccatgc tggctactgg cgagtggacc 180

atgaccaaca acaacctgaa ctacaaagag tacgctaagc tggctggcgg cttctacccc 240

tccaagttcg acgccgacaa atgggtggcc gccatcaagg cctctggcgc caagtacatc 300

tgcttcacca cccggcacca cgagggcttc tccatgttcg acaccaagta ctccgactac 360

aacatcgtga aggccacccc cttcaagcgg gacgtcgtga aagagctggc cgacgcctgc 420

gctaagcacg gcatcaagct gcacttctac tactcccaca tcgactggta cagagaggac 480

gccccccagg gcagaaccgg cagaagaaca ggcagaccca accccaaggg cgactggaag 540

tcctactacc agtttatgaa caaccagctg accgagctgc tgaccaacta cggccccatc 600

ggcgccattt ggttcgacgg gtggtgggac caggacatca accccgactt cgactgggag 660

ctgcccgagc agtacgccct gatccacaga ctgcagcccg cctgtctcgt gggcaacaac 720

caccaccaga ccccctttgc cggcgaggac atccagattt tcgagcggga tctgcccggc 780

gagaacaccg ctggactgtc tggccagtcc gtgtcccatc tgcccctgga aacctgcgag 840

acaatgaacg gcatgtgggg ctacaagatc accgaccaga actacaagtc caccaagaca 900

ctgatccact acctcgtgaa agccgctggc aaggacgcca acctgctgat gaacatcggc 960

ccccagcctg acggcgagct gcctgaagtg gctgtgcagc ggctgaaaga agtgggagag 1020

tggatgtcta agtacggcga gactatctac ggcaccagag gcggcctggt ggcccctcat 1080

gattggggcg tgaccaccca gaagggcaac aagctgtacg tgcacatcct gaacctgcag 1140

gacaaggccc tgttcctgcc catcgtggac aagaaagtga agaaagccgt ggtgttcgcc 1200

gacaagaccc ccgtgcggtt caccaagaac aaagagggca tcgtgctgga actggccaag 1260

gtgcccaccg acgtggacta cgtggtggaa ctgaccatcg accaccatca tcaccaccac 1320

tga 1323

<210> 11

<211> 920

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 11

Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro

1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Ala Gln His Asp Ser Leu Ile Arg Val Lys Ala Glu

20 25 30

Asp Lys Val Val Gln Thr Ser Pro Ser Val Ser Ala Ile Asp Asp Leu

35 40 45

His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Lys Glu Gly Leu Ser

50 55 60

Lys Ala Gly Glu Val Pro Glu Lys Leu Lys Asp Ile Leu Ser Lys Ala

65 70 75 80

Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Lys Val Leu Ala Glu Met Lys Val Pro

85 90 95

Glu Lys Ile Ala Met Lys Pro Leu Lys Gly Pro Leu Tyr Gly Gly Tyr

100 105 110

Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro Ala Glu Lys Asp Lys

115 120 125

Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val Asp Leu Ala Phe Val

130 135 140

Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe Trp Gln Glu Leu Ala

145 150 155 160

Thr Lys His Val Pro Thr Leu Asn Lys Gln Gly Thr Arg Val Ile Arg

165 170 175

Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp His Ser Gly Ile Ala

180 185 190

Glu Asp Thr Gln Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu Gly Asn Lys Ala Leu

195 200 205

Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp Gly

210 215 220

Leu Asp Val Asp Ile Glu Arg Asp Ser Ile Pro Lys Val Asn Gly Lys

225 230 235 240

Glu Ser Asn Glu Asn Ile Gln Arg Ser Ile Ala Val Phe Glu Glu Ile

245 250 255

Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Ala Asp Lys Ser Arg Leu Phe Ile

260 265 270

Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro Leu Ile Glu Arg Gly

275 280 285

Ala Pro Tyr Ile Asp Leu Leu Leu Val Gln Val Tyr Gly Ile Gln Gly

290 295 300

Glu Lys Gly Asp Trp Asp Pro Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Thr Met

305 310 315 320

Glu Glu Arg Trp Glu Ser Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu Gln Tyr

325 330 335

Met Val Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gly Ser Gly Asn Leu

340 345 350

Trp Tyr Asp Ile Asn Glu Arg Lys Asp Asp His Asn Pro Leu Asn Ser

355 360 365

Glu Ile Ala Gly Thr Arg Ala Glu Arg Tyr Ala Lys Trp Gln Pro Lys

370 375 380

Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp

385 390 395 400

Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Val Ser Asp Asp Glu Lys Arg Thr

405 410 415

Asn Lys Ala Ile Lys Asp Ile Thr Asp Gly Ile Val Lys Ser Asp Tyr

420 425 430

Lys Val Ser Lys Ala Leu Lys Lys Val Met Glu Asn Asp Lys Ser Tyr

435 440 445

Glu Leu Ile Asp Gln Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg Glu Ala

450 455 460

Val Ile Ala Gln Val Gly Ser Arg Arg Gly Asp Leu Glu Arg Phe Asn

465 470 475 480

Gly Thr Leu Arg Leu Asp Asn Pro Asp Ile Lys Ser Leu Glu Gly Leu

485 490 495

Asn Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Leu Glu Leu Ile Gly Leu Ser Gln

500 505 510

Ile Thr Lys Leu Asp Ser Ser Val Leu Pro Glu Asn Ile Lys Pro Thr

515 520 525

Lys Asp Thr Leu Val Ser Val Leu Glu Thr Tyr Lys Asn Asp Asp Arg

530 535 540

Lys Glu Glu Ala Lys Ala Ile Pro Gln Val Ala Leu Thr Ile Ser Gly

545 550 555 560

Leu Thr Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu Ala Gly Phe Asp Arg Asp Ser

565 570 575

Leu Ala Gly Ile Asp Ala Ala Ser Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val Asp

580 585 590

Leu Ser Lys Asn Lys Leu Asp Leu Ala Ala Gly Thr Glu Asn Arg Gln

595 600 605

Ile Phe Asp Val Met Leu Ser Thr Val Ser Asn Arg Val Gly Ser Asn

610 615 620

Glu Gln Thr Val Thr Phe Asp His Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr Pro

625 630 635 640

Asn Thr Tyr Gly Thr Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Gly Glu Gly Lys

645 650 655

Ile Asp Leu Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln Gly

660 665 670

Thr Leu Ile Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Glu Gln Leu

675 680 685

Ile Ala Gly Arg Arg Phe Val Asp Pro Gly Tyr Ala Tyr Lys Asn Phe

690 695 700

Ala Val Thr Tyr Asp Ala Tyr Lys Val Arg Val Thr Asp Ser Thr Leu

705 710 715 720

Gly Val Thr Asp Glu Lys Lys Leu Ser Thr Ser Lys Glu Glu Thr Tyr

725 730 735

Lys Val Glu Phe Phe Ser Pro Thr Asn Gly Thr Lys Pro Val His Glu

740 745 750

Ala Lys Val Val Val Gly Ala Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu Ala

755 760 765

Ala Gly Ala Thr Val Ile Lys Ser Asp Ser His Glu Asn Ala Lys Lys

770 775 780

Val Phe Asp Gly Ala Ile Glu Tyr Asn Pro Leu Ser Phe Ser Ser Lys

785 790 795 800

Thr Ser Ile Thr Phe Glu Phe Lys Glu Pro Gly Leu Val Lys Tyr Trp

805 810 815

Arg Phe Phe Asn Asp Ile Thr Arg Lys Asp Asp Tyr Ile Lys Glu Ala

820 825 830

Lys Leu Glu Ala Phe Val Gly His Leu Glu Asp Asp Ser Lys Val Lys

835 840 845

Asp Ser Leu Glu Lys Ser Thr Glu Trp Val Thr Val Ser Asp Tyr Ser

850 855 860

Gly Glu Ala Gln Glu Phe Ser Gln Pro Leu Asp Asn Ile Ser Ala Lys

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Val Thr Val Asp Thr Lys Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Pro

885 890 895

Ser Leu Pro Glu Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Pro Leu Thr His

900 905 910

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

915 920

<210> 12

<211> 2763

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 12

atgagagtgc ctgctcagct gctgggcctg ctgctgctgt ggctgcctgg tgctagatgc 60

gcccagcacg actccctgat cagagtgaag gccgaggaca aggtggtgca gacctcccct 120

tccgtgtccg ccatcgacga cctgcactac ctgtccgaga actccaagaa agagttcaaa 180

gagggcctgt ccaaggccgg cgaggtgccc gaaaagctga aggacatcct gagcaaggct 240

cagcaggccg acaagcaggc caaggtgctg gccgagatga aggtgccaga gaagatcgcc 300

atgaagcccc tgaagggccc tctgtacggc ggctacttca gaacctggca cgacaagacc 360

tccgaccccg ccgagaagga caaagtgaac tccatgggcg agctgcccaa agaggtggac 420

ctggccttcg tgttccacga ctggaccaag gactactccc tgttctggca ggaactggcc 480

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cggtttctgg ctggcggcga ccactctgga atcgccgagg atacccagaa gtaccccaac 600

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gagtccaacg agaacatcca gcggtctatc gccgtgttcg aggaaatcgg caagctgatc 780

ggccccaagg gcgccgacaa gtcccggctg ttcatcatgg actccaccta catggccgat 840

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tggcagccca agaccggcgg agtgaagggc ggcatcttct cctacgccat cgatagggat 1200

ggcgtggccc accagcctaa gaaggtgtcc gacgacgaga agcggaccaa caaggctatc 1260

aaggacatca ccgacggcat cgtgaagtcc gactacaagg tgtccaaagc cctgaagaaa 1320

gtgatggaaa acgacaagag ctacgagctg atcgaccaga aggacttccc cgataaggcc 1380

ctgcgcgagg ccgtgattgc tcaagtgggc tccagacggg gcgacctgga aagattcaac 1440

ggcaccctgc ggctggacaa ccccgacatc aagtccctgg aaggcctgaa caaactgaag 1500

aagctggcca agctggaact gatcggactg tcccagatca caaagctgga ctcctccgtg 1560

ctgcctgaga acatcaagcc caccaaggac accctggtgt ccgtgctgga aacctacaag 1620

aacgacgacc ggaaagagga agccaaggcc atccctcagg tggccctgac catctctggc 1680

ctgaccggcc tgaaagagct gaatctggcc ggcttcgacc gggattccct ggctggaatc 1740

gatgccgcct ctctgacctc cctggaaaaa gtggacctgt ctaagaacaa gctggatctg 1800

gctgccggca ccgagaaccg gcagatcttc gacgtgatgc tgtccaccgt gtccaacaga 1860

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tcccagctgc tgttcggcac cgtgaccaac cagggcacac tgatcaactc cgaggccgat 2040

tacaaggcct accaggaaca gctgatcgct gggcggagat tcgtggaccc tggctacgct 2100

tacaagaact tcgccgtgac ctacgatgcc tacaaagtgc gcgtgaccga ctccaccctg 2160

ggcgtgacag acgaaaagaa gctgagcacc tccaaagaag agacatacaa ggtggaattc 2220

ttctccccca ccaatggcac caagcctgtg catgaggcta aggtggtcgt gggcgccgag 2280

aaaaccatga tggtcaacct ggccgctggc gccaccgtga tcaagtctga ctctcacgag 2340

aatgccaaaa aggtgttcga cggcgccatc gagtacaatc ctctgagctt ctccagcaag 2400

accagcatca ccttcgagtt taaagaaccc ggcctcgtga aatactggcg gttcttcaac 2460

gatatcaccc gcaaggacga ctacatcaaa gaggctaagc tggaagcctt cgtgggccat 2520

ctggaagatg actccaaagt gaaggactct ctggaaaagt ccaccgagtg ggtcaccgtg 2580

tctgactact ctggcgaggc ccaggaattc tcccagcccc tggacaacat ctccgccaag 2640

tattggagag tgaccgtgga caccaagggc ggacggtaca gctctcctag cctgcccgag 2700

ctgcagatcc tgggctacag actgcctctg acccacgact ataaggacga cgacgacaaa 2760

tga 2763

Claims

1.一种基因工程哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述基因工程哺乳动物宿主细胞生产具有改性糖基化的糖蛋白；

其中，所述基因工程宿主动物细胞表达：(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的细菌岩藻糖苷酶；和(ii)Endo S酶。

2.如权利要求1所述的基因工程哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述基因工程宿主动物细胞还表达糖蛋白。

3.如权利要求2所述的基因工程哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述糖蛋白是外源性的。

4.如权利要求2所述的基因工程哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述糖蛋白为抗体、Fc融合蛋白、细胞因子、激素、生长因子或酶。

5.如权利要求4所述的基因工程哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述糖蛋白为抗体。

6.如权利要求1所述的基因工程哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、大鼠骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、杂交瘤细胞或拿马瓦细胞。

7.一种生产具有糖基化修饰的糖蛋白的方法，包括：

提供基因工程哺乳动物宿主细胞，其表达(a)糖蛋白，以及(b)外源的岩藻糖苷酶和外源的糖苷内切酶；

培养所述哺乳动物宿主细胞，在容许生产所述糖蛋白以及所述岩藻糖苷酶、糖苷内切酶或二者的条件下进行；以及

收集所述哺乳动物宿主细胞或培养上清液以分离所述糖蛋白；

其中，所述(b)中包括：(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的细菌岩藻糖苷酶；和(ii)Endo S酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述糖蛋白是外源性的。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述糖蛋白为抗体、Fc融合蛋白、细胞因子、激素、生长因子或酶。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述糖蛋白为抗体。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、大鼠骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、杂交瘤细胞或拿马瓦细胞。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分离所述糖蛋白。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法还包括分析所述糖蛋白的糖基化模式。

14.一种制备权利要求1所述基因工程哺乳动物宿主细胞的方法，包括将同时编码所述岩藻糖苷酶和所述糖苷内切酶的一种或多种表达载体导入所述哺乳动物细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将编码糖蛋白的表达载体导入所述哺乳动物细胞。