JP6701089B2 - 改変グリコシル化を有する組換え糖タンパク質の製造方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１４年３月１７日に出願された米国仮出願第６１／９５４，３７７の利益を主張し、参照によりその内容を全体で、本明細書に組み入れる。

グリコシル化は糖タンパク質の構造および機能には重要である。例えば、グリコシル化は、タンパク質折り畳み（および、ひいては安定性）および／または糖タンパク質の生物活性に影響を与えることが示唆されている。治療用組換え糖タンパク質、特にモノクローナル抗体の需要は、ここ２０年間において確実に増えてきている。従前の研究により、組換え糖タンパク質のグリカン構造における微細な違いが、糖タンパク質の生物学的活性および薬物動態に影響を及ぼし得ることが明らかにされている。例えば、ダルベポエチンアルファは、２つの追加的なＮ−結合グリコシル化部位を有する、組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の過剰にグリコシル化類似体である。追加的なＮ−グリコシル化は、内因性で組換え型のＥＰＯと比較して、炭水化物における分子質量の百分率を増加させ、およびダルベポエチンアルファの血清半減期を顕著に延長させる。加えて、その効力が主に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ（antibody-dependent cell cytotoxicity））に依拠する治療抗体については、Ｆｃ部分上のコアフコース残基（core fucose residue）を除去して、その抗体によって誘導されたＡＤＣＣ効果の強度を増加させる、化学的酵素的アプローチおよび遺伝学的アプローチの両方が開発されてきた。

しかしながら、グリコシル化をリモデリングするための現在可能な方法は、しばしば複数の酵素および／または複数のステップを必要とし、糖鎖工学的に操作された組換えタンパク質を製造するのに高コストをもたらす。

本開示は、脱フコシル化およびモノグリコシル化を含む改変グリコシル化を有する抗体などの糖タンパク質を産生することを可能とする、遺伝子操作された宿主動物細胞の開発に基づく。かかる宿主動物細胞は、フコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、またはその両方の、１以上を過剰発現するように操作されている。予想外にも、宿主動物細胞における、細胞のグリコシル化機構に対する変更は、糖タンパク質の合成および宿主細胞の成長に関する悪影響をもたらさなかった。

したがって、本開示は、フコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、またはその両方を過剰発現する遺伝子操作された宿主動物細胞であって、宿主動物細胞が、野生型の対応するものに対して改変グリコシル化を有する糖タンパク質を産生する、該遺伝子操作された宿主動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）を提供する。いくつかの例において、細菌フコシダーゼは、哺乳動物フコシダーゼまたは細菌フコシダーゼ、例えば、ヒトFUCA1、ヒトFUCA2、Cricetulus griseusフコシダーゼ、アルファ-L-1 Chryseobacterium meningosepticum α１，６−フコシダーゼまたは細菌フコシダーゼBF3242とすることができる。代わりに、または加えて、エンドグリコシダーゼは、Endo S酵素、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列を含む酵素であり得る。いくつかの例において、遺伝子操作された宿主動物細胞は、（ｉ）ヒトFUCA1、ヒトFUCA2、Cricetulus griseusフコシダーゼ、アルファ-L-1 Chryseobacterium meningosepticum α１，６−フコシダーゼまたは細菌フコシダーゼBF3242、および（ｉｉ）Endo S（配列番号１１など）を発現する。

本明細書に記載される遺伝子操作された宿主動物細胞は、糖タンパク質を、さらに発現し得、それは外因性（同じタイプの天然の動物細胞では発現しないもの）であり得る。その例は、これに限定されないが、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、サイトカイン、ホルモン、成長因子、または酵素を含む。

いくつかの例において、遺伝子操作された宿主動物細胞は、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ラット骨髄腫細胞、ベビーハムスター腎（BHK）細胞、ハイブリドーマ細胞、ナマルバ（Namalwa）細胞、胚性幹細胞または受精卵である。

本明細書に記載される遺伝子操作された宿主動物細胞のいずれかを用いる、改変グリコシル化パターン（例えば、脱フコシル化またはモノグリコシル化）を有する糖タンパク質の製造方法もまた、本明細書に記載される。該方法は、（ｉ）（ａ）糖タンパク質および（ｂ）フコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、またはその両方を発現する宿主動物細胞を提供すること；糖タンパク質およびフコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、またはその両方の産生を可能にする条件下で宿主動物細胞を培養すること、（ｉｉ）糖タンパク質を単離するために宿主動物細胞または培養上清を回収すること、および任意に、（ｉｉｉ）糖タンパク質を単離すること、を含み得る。該方法は、さらに、（ｉｖ）糖タンパク質のグリコシル化パターンを解析することを含み得る。

さらに、本開示は、本明細書に記載される遺伝子操作された宿主動物細胞のいずれかの作製方法を特徴とする。該方法は、（ｉ）フコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、またはそれら両方を、共同で（collectively）コードする、１以上の発現ベクターを、動物細胞へ導入すること、および任意に、（ｉｉ）糖タンパク質をコードする発現ベクターを、動物細胞へ導入すること、を含み得る。該方法は、さらに、フコシダーゼ、エンドグリコシダーゼおよび糖タンパク質を発現する形質転換細胞を選択することを含み得る。

本発明の１以上の態様の詳細を、以下の説明に記載する。本発明の他の特徴または有利は、以下の図面およびいくつかの実施態様の詳細な説明から、ならびに添付された請求の範囲から、明らかであろう。

図１は、種々のＮ−グリカンの構造を示す概略説明図である。Ａ：糖タンパク質の典型的なＮ−結合グリカン。Ｂ：脱フコシル化Ｎ−グリカン。Ｃ：モノ−Ｎ−アセチルグルコサミン還元糖を有する（モノグリコシル化）Ｎ−グリカン。

図２は、フコシダーゼを産生するための例示の発現ベクターの概略説明図である。Ａ：フコシダーゼ遺伝子を保有する例示のプラスミドのマップ。Ｂ：フコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼＳを発現するための例示の発現カセット。

図３は、フコシダーゼおよび／またはエンドグリコシダーゼを発現するように操作された宿主細胞における、一時的な抗体の発現による、均等な脱フコシル化単糖（ＧｌｃＮＡｃ）抗体h4B12の産生を示す図表を含む。Ａ：均等なアフコシル化単糖（ＧｌｃＮＡｃ）抗体の概略説明図。 Ｂ：LC/MS/MSにより決定された、ヒトFUCA1、ヒトFUCA2、C. griseusフコシダーゼ、アルファ-L-1、またはC. meningosepticum α１，６−フコシダーゼを発現するように操作された宿主細胞中で産生された抗体4B12のグリコシル化を示すグラフ。 Ｃ：ウェスタンブロットにより検出されたCHO細胞中に示された、フコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼの一時的な発現を示す図表。 Ｄ：フコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを発現するCHO細胞中で産生される抗体h4B12を示すグラフであり、示されるとおり、抗体は、LC/MS/MSにより決定される、均等なフコースフリーな単糖（ＧｌｃＮＡｃ）の糖型を有する。均等なＮ−グリカンは、そのＮ−グリカン（例えば、アフコシル化Ｎ−グリカン）の、抗体などの糖タンパク質中の総Ｎ−グリカンに対する比率を指す。

図４は、フコシダーゼおよび／またはエンドグリコシダーゼを発現するように操作された宿主細胞における、抗体の一時的な発現による、均等なアフコシル化単糖（ＧｌｃＮＡｃ）抗体リツキシマブの産生を示す図表を含む。Ａ：示される種々のフコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを発現するように操作された宿主細胞中で産生された抗体リツキシマブのグリコシル化を示すグラフ。 Ｂ：ウェスタンブロットにより検出される、CHO細胞中に示される、フコシダーゼ（左レーン）またはエンドグリコシダーゼ（右レーン）の一時的な発現を示す図表。

発明の詳細な説明
改変グリコシル化パターン（例えば、脱フコシル化Ｎ−グリカンまたは単糖グリカンなどの改変Ｎ−グリコシル化パターン）を有する糖タンパク質(例えば、抗体などの外因性糖タンパク質）を産生することができる、遺伝子操作された宿主動物細胞、例えば哺乳動物細胞などが、本明細書に開示されている。かかる宿主動物細胞は、フコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、またはその両方を過剰発現するように操作されたものであり得る。任意に、宿主動物細胞はまた、抗体などの外因性糖タンパク質を発現するように操作されていてもよい。

野生型の哺乳動物細胞において産生された糖タンパク質の典型的な複合Ｎ−グリカンの構造を、図１、パネルＡに示す。かかる複合Ｎ−グリカンは、グリコシル化部位に結合しているＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基、糖タンパク質のアスパラギン残基（Ａｓｎ）、およびアルファ１，６−結合でそのＡｓｎ残基に結合しているフコース残基を含有する。遺伝子操作された宿主動物細胞は、脱フコシル化Ｎ−グリカン（その例を図１、パネルＢに提供する）、およびＧｌｃＮＡｃ残基のみがＡｓｎグリコシル化部位に結合している単糖Ｎ−グリカン（図１、パネルＣ）などの改変Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質(例えば、内因性または外因性）を産生することを可能とする。改変グリコシル化を有する糖タンパク質は、遺伝子操作された宿主動物細胞に対する野生型の対応するものにおいて産生された糖タンパク質のグルカンと構造的に異なる、Ｎ−グリカンなどの少なくとも１のグリカンを保有する糖タンパク質を指す。脱フコシル化グリカンは、アルファ１，６−フコース残基を含まないか、またはいかなるフコース残基も含まない、あらゆるグリカンを指す。

Ａ． フコシダーゼ
フコシダーゼは、フコースを分解する酵素である。この酵素は、フコース残基を、それを含有するグリカンから開裂する。遺伝子操作された宿主動物細胞を作製するのに用いるためのフコシダーゼは、哺乳動物フコシダーゼまたは細菌フコシダーゼであり得る。いくつかの態様において、フコシダーゼは、野生型の酵素、例えば、野生型の細菌の酵素、またはヒトの酵素などの野生型の哺乳動物の酵素である。多数の例示的なフコシダーゼのアミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列を、以下に提供する（Ｃ末端におけるＨｉｓ−タグを含む）：

ヒトフコシダーゼ FUCA1：

アミノ酸配列（配列番号１）
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCQPPRRYTPDWPSLDSRPLPAWFDEAKFGVFIHWGVFSVPA
WGSEWFWWHWQGEGRPQYQRFMRDNYPPGFSYADFGPQFTARFFHPEEWADLFQAAGAKY
VVLTTKHHEGFTNWPSPVSWNWNSKDVGPHRDLVGELGTALRKRNIRYGLYHSLLEWFHP
LYLLDKKNGFKTQHFVSAKTMPELYDLVNSYKPDLIWSDGEWECPDTYWNSTNFLSWLYN
DSPVKDEVVVNDRWGQNCSCHHGGYYNCEDKFKPQSLPDHKWEMCTSIDKFSWGYRRDMA
LSDVTEESEIISELVQTVSLGGNYLLNIGPTKDGLIVPIFQERLLAVGKWLSINGEAIYA
SKPWRVQWEKNTTSVWYTSKGSAVYAIFLHWPENGVLNLESPITTSTTKITMLGIQGDLK
WSTDPDKGLFISLPQLPPSAVPAEFAWTIKLTGVKHHHHHH

ヌクレオチド配列（配列番号２；コドン最適化）
atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgc
cagccccctcggagatacacccctgactggccttccctggactccagacctctgcccgct
tggtttgacgaggccaagttcggcgtgttcatccactggggcgtgttctccgtgcctgcc
tggggctctgagtggttctggtggcattggcagggcgagggcagacctcagtaccagcgg
ttcatgcgggacaactacccccctggcttctcctacgccgacttcggccctcagttcacc
gcccggttcttccaccctgaggaatgggccgatctgttccaggccgctggcgccaaatac
gtggtgctgaccaccaagcaccacgagggcttcaccaactggccctcccccgtgtcctgg
aactggaactctaaggacgtgggcccccaccgggatctcgtgggagaactgggaaccgcc
ctgcggaagcggaacatcagatacggcctgtaccactccctgctggaatggttccacccc
ctgtacctgctggacaagaagaacggcttcaagacccagcacttcgtgtccgccaagacc
atgcccgagctgtacgacctcgtgaactcctacaagcccgacctgatttggagcgacggc
gagtgggagtgccccgacacctattggaactccaccaactttctgtcctggctgtacaac
gactcccctgtgaaggacgaggtggtcgtgaacgacagatggggccagaactgctcctgt
caccacggcggctactacaactgcgaggacaagttcaagccccagtccctgcccgaccac
aagtgggagatgtgcacctctatcgacaagttctcctggggctaccggcgggacatggcc
ctgtctgatgtgaccgaggaatccgagatcatctccgagctggtgcagaccgtgtccctg
ggcggcaactacctgctgaacatcggccctaccaaggacggcctgatcgtgcccatcttc
caggaacggctgctggccgtgggcaagtggctgtctatcaacggcgaggccatctacgcc
tccaagccttggcgagtgcagtgggagaagaacaccacctccgtgtggtacacctccaag
ggctctgccgtgtacgccatcttcctgcactggcccgagaacggcgtgctgaacctggaa
tcccccatcaccacctctaccaccaagatcaccatgctgggcatccagggcgacctgaag
tggtccaccgaccctgacaagggcctgttcatctccctgccccagctgcctccttccgct
gtgcctgctgagttcgcctggaccatcaagctgaccggcgtgaagcaccaccaccatcac
cattga

ヒトフコシダーゼ FUCA2：

アミノ酸配列（配列番号３）
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCHSATRFDPTWESLDARQLPAWFDQAKFGIFIHWGVFSVPS
FGSEWFWWYWQKEKIPKYVEFMKDNYPPSFKYEDFGPLFTAKFFNANQWADIFQASGAKY
IVLTSKHHEGFTLWGSEYSWNWNAIDEGPKRDIVKELEVAIRNRTDLRFGLYYSLFEWFH
PLFLEDESSSFHKRQFPVSKTLPELYELVNNYQPEVLWSDGDGGAPDQYWNSTGFLAWLY
NESPVRGTVVTNDRWGAGSICKHGGFYTCSDRYNPGHLLPHKWENCMTIDKLSWGYRREA
GISDYLTIEELVKQLVETVSCGGNLLMNIGPTLDGTISVVFEERLRQMGSWLKVNGEAIY
ETHTWRSQNDTVTPDVWYTSKPKEKLVYAIFLKWPTSGQLFLGHPKAILGATEVKLLGHG
QPLNWISLEQNGIMVELPQLTIHQMPCKWGWALALTNVIHHHHHH

ヌクレオチド配列（配列番号４；コドン最適化）
atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgc
cactccgccaccagattcgaccccacctgggagtctctggacgccagacagctgcccgct
tggtttgaccaggccaagttcggcatcttcatccactggggcgtgttctccgtgcccagc
ttcggctctgagtggttctggtggtactggcagaaagagaagatccccaaatacgtggag
ttcatgaaggacaactacccccccagctttaagtacgaggacttcggccccctgttcacc
gccaagttcttcaacgccaaccagtgggccgacatcttccaggcctctggcgccaagtac
atcgtgctgacctccaagcaccacgagggcttcaccctgtggggctccgagtactcctgg
aactggaacgccatcgacgagggccccaagcgggacatcgtgaaagaactggaagtggcc
atccggaaccggaccgacctgagattcggcctgtactactccctgttcgagtggttccac
cccctgtttctggaagatgagtcctccagcttccacaagcggcagttccccgtgtccaag
accctgcccgagctgtacgagctcgtgaacaactaccagcccgaggtgctgtggagtgac
ggggatggtggtgcccccgatcagtactggaactctaccggcttcctggcctggctgtac
aacgagtctcctgtgcggggcaccgtcgtgaccaacgatagatggggcgctggctccatc
tgcaagcacggcggcttctacacctgttccgaccggtacaaccccggccatctgctgcct
cacaagtgggagaactgcatgaccatcgacaagctgtcctggggctacagaagagaggcc
ggcatctccgactacctgacaatcgaggaactcgtgaagcagctggtggaaaccgtgtcc
tgcggcggcaacctgctgatgaacatcggccctaccctggacggcaccatctccgtggtg
ttcgaggaacggctgcggcagatgggctcctggctgaaagtgaacggcgaggccatctac
gagacacacacctggcggtcccagaacgacaccgtgacccctgacgtgtggtacaccagc
aagcccaaagaaaagctggtgtatgccatcttcctgaagtggcctacctccggccagctg
ttcctgggccaccctaaggctatcctgggcgccaccgaagtgaaactgctgggccatgga
cagcccctgaactggatctccctggaacagaacggcatcatggtggaactgccccagctg
accatccatcagatgccctgcaaatggggctgggccctggccctgaccaacgtgatccac
catcaccaccaccactga

Cricetulus griseus（チャイニーズハムスター）フコシダーゼ FUCA2

アミノ酸配列（配列番号５）
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCKSSRRYDPTWESLDRRPLPSWFDQAKFGIFIHWGVFSVPS
FGSEWFWWYWQKEKRPKFVDFMNNNYPPGFKYEDFGVLFTAKFFNASQWADILQASGAKY
LVLTSKHHEGFTLWGSEYSWNWNAVDEGPKRDIVKELKVAITKNTDLRFGLYYSLFEWFH
PLFLEDKLSSFQKRQFPISKMLPELYELVNKYQPDILWTDGDGGAPDRYWNSTGFLAWLY
NESPVRNTVVTNDRWGAGSICKHGGYYTCSDRYNPGHLLPHKWENCMTIDQFSWGYRREA
VISDYLTIEELVKQLVETVACGGNLLMNIGPTLDGIIPVIFEERLRQMGMWLKVNGEAIY
ETQPWRSQNDTATPDVWYTYKPEEKIVYAIFLKWPVSRELFLEQPIGSLGETEVALLGEG
KPLTWTSLKPNGIIVELPQLTLHQMPCKWGWTLALTNVTHHHHHH

ヌクレオチド配列（配列番号６；コドン最適化）
atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgc
aagtcctctcggagatacgaccccacctgggagtccctggacagaaggcctctgcccagt
tggttcgaccaggccaagttcggcatcttcatccactggggcgtgttctccgtgcccagc
ttcggctctgagtggttctggtggtactggcagaaagagaagcggcccaagttcgtggac
ttcatgaacaacaactacccccctggctttaagtacgaggacttcggcgtgctgttcacc
gccaagttcttcaacgcctcccagtgggccgacatcctgcaggcttccggcgctaagtac
ctggtgctgacctccaagcaccacgagggctttaccctgtggggctccgagtactcctgg
aactggaacgccgtggacgagggccctaagcgggacatcgtgaaagaactgaaggtggcc
atcaccaagaacaccgacctgagattcggcctgtactactccctgttcgagtggttccac
cccctgtttctggaagataagctgtccagcttccagaagcggcagttccccatctccaag
atgctgcccgagctgtacgagctcgtgaacaagtaccagcctgacatcctgtggaccgac
ggggatggtggcgcccctgacagatactggaactctaccggcttcctggcctggctgtac
aacgagtcccctgtgcggaacaccgtcgtgaccaacgacagatggggcgctggctccatc
tgcaagcacggcggctactacacctgttccgaccggtacaaccccggccatctgctgcct
cacaagtgggagaactgcatgacaatcgaccagttctcctggggctaccggcgcgaggcc
gtgatctctgactacctgaccatcgaggaactcgtgaagcagctggtggaaaccgtggcc
tgtggcggcaacctgctgatgaacatcggccctaccctggacggcatcatccccgtgatc
ttcgaggaacggctgcggcagatgggcatgtggctgaaagtgaacggcgaggccatctac
gagacacagccttggcggtcccagaacgacaccgccacacctgacgtgtggtacacctac
aagcccgaagagaagatcgtgtacgccatcttcctgaagtggcccgtgtccagagagctg
tttctggaacagcccatcggctccctgggcgagacagaagtggctctgctgggcgagggc
aagcctctgacctggacctccctgaagcccaatggcatcatcgtggaactgccccagctg
accctgcaccagatgccctgtaaatggggctggaccctggccctgaccaacgtgacccac
caccaccatcaccactga

Chryseobacterium meningosepticum α１，６−フコシダーゼ

アミノ酸配列（配列番号７）
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCHNVSEGYEKPADPLVVQNLEQWQDLKFGLFMHWGTYSQWG
IVESWSLCPEDESWTQRKPEHGKSYNEYVKNYENLQTTFNPVQFNPQKWADATKKAGMKY
VVFTTKHHDGFAMFDTKQSDYKITSSKTPFSKNPKADVAKEIFNTFRDNGFRIGAYFSKP
DWHSDDYWWSYFPPKDRNVNYDPQKYPARWENFKKFTFNQLNEITSNYGKIDILWLDGGW
VRPFHTIDPNIEWQRTIKVEQDIDMDKIGTMARKNQPGIIIVDRTVPGKWENYVTPEQAV
PEHALSIPWESCITMGDSFSYVPNDNYKSSQKIIETLIRIISRGGNYLMNIAPGPNGDYD
AVVYERLKEISGWMDKNQSAVFTTRALAPYHESDFYYTQSKDGKIVNVFHISEKSNYQAP
SELSFSIPENINPKTVKVLGISSQIKWKKKGNKIHVQLPEERTKLNYSTVIQITQHHHHH
H

ヌクレオチド配列（配列番号８；コドン最適化）
atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgc
cacaatgtgtccgagggctacgagaagcccgccgaccctctggtggtgcagaacctggaa
cagtggcaggacctgaagttcggcctgttcatgcactggggcacctactcccagtggggc
atcgtggaatcctggtccctgtgccctgaggacgagtcttggacccagcggaagcctgag
cacggcaagtcctacaacgagtacgtgaagaactacgagaacctgcagaccaccttcaac
cccgtgcagttcaacccccagaagtgggccgacgccaccaagaaagccggcatgaaatac
gtggtgttcaccaccaagcaccacgacggcttcgccatgttcgacaccaagcagtccgac
tacaagatcacctcctccaagacccccttcagcaagaaccccaaggccgacgtggccaaa
gagattttcaacaccttccgggacaacggcttccggatcggcgcctacttctccaagcct
gactggcactccgacgactactggtggtcctacttcccacccaaggaccggaacgtgaac
tacgaccctcagaaataccccgccagatgggagaacttcaagaagttcaccttcaatcag
ctgaacgagatcaccagcaactacggcaagatcgacatcctgtggctggacggcggatgg
gtgcgacccttccacaccatcgaccccaacatcgagtggcagcggaccatcaaggtggaa
caggacatcgacatggacaagatcggcaccatggcccggaagaaccagcccggcatcatc
atcgtggaccggaccgtgcctggcaagtgggagaattacgtgacccccgagcaggccgtg
cctgagcatgccctgtctatcccttgggagtcctgtatcacaatgggcgacagcttctcc
tacgtgcccaacgacaactacaagtcctcccagaagatcatcgagacactgatcaggatc
atctccagaggcggcaactacctgatgaatatcgcccctggccccaacggcgactacgac
gctgtggtgtacgagcggctgaaagaaatctccggctggatggataagaaccagtccgcc
gtgtttaccacccgggctctggccccttaccacgagtccgacttctactacacccagtcc
aaggacggaaagatcgtgaacgtgttccacatctccgagaagtccaactaccaggccccc
tccgagctgtccttcagcatccccgagaacatcaaccccaagaccgtgaaggtgctgggc
atctccagccagatcaagtggaagaagaagggcaacaagatccacgtgcagctgcccgag
gaacggaccaagctgaactactccaccgtgatccagatcacccagcaccaccaccatcac
cactga

細菌フコシダーゼ BF3242

アミノ酸配列（配列番号９）
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCQQKYQPTEANLKARSEFQDNKFGIFLHWGLYAMLATGEWT
MTNNNLNYKEYAKLAGGFYPSKFDADKWVAAIKASGAKYICFTTRHHEGFSMFDTKYSDY
NIVKATPFKRDVVKELADACAKHGIKLHFYYSHIDWYREDAPQGRTGRRTGRPNPKGDWK
SYYQFMNNQLTELLTNYGPIGAIWFDGWWDQDINPDFDWELPEQYALIHRLQPACLVGNN
HHQTPFAGEDIQIFERDLPGENTAGLSGQSVSHLPLETCETMNGMWGYKITDQNYKSTKT
LIHYLVKAAGKDANLLMNIGPQPDGELPEVAVQRLKEVGEWMSKYGETIYGTRGGLVAPH
DWGVTTQKGNKLYVHILNLQDKALFLPIVDKKVKKAVVFADKTPVRFTKNKEGIVLELAK
VPTDVDYVVELTIDHHHHHH

ヌクレオチド配列（配列番号１０；コドン最適化）
atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgc
cagcagaagtaccagcccaccgaggccaacctgaaggccagatccgagttccaggacaac
aagttcggcatcttcctgcactggggcctgtacgccatgctggctactggcgagtggacc
atgaccaacaacaacctgaactacaaagagtacgctaagctggctggcggcttctacccc
tccaagttcgacgccgacaaatgggtggccgccatcaaggcctctggcgccaagtacatc
tgcttcaccacccggcaccacgagggcttctccatgttcgacaccaagtactccgactac
aacatcgtgaaggccacccccttcaagcgggacgtcgtgaaagagctggccgacgcctgc
gctaagcacggcatcaagctgcacttctactactcccacatcgactggtacagagaggac
gccccccagggcagaaccggcagaagaacaggcagacccaaccccaagggcgactggaag
tcctactaccagtttatgaacaaccagctgaccgagctgctgaccaactacggccccatc
ggcgccatttggttcgacgggtggtgggaccaggacatcaaccccgacttcgactgggag
ctgcccgagcagtacgccctgatccacagactgcagcccgcctgtctcgtgggcaacaac
caccaccagaccccctttgccggcgaggacatccagattttcgagcgggatctgcccggc
gagaacaccgctggactgtctggccagtccgtgtcccatctgcccctggaaacctgcgag
acaatgaacggcatgtggggctacaagatcaccgaccagaactacaagtccaccaagaca
ctgatccactacctcgtgaaagccgctggcaaggacgccaacctgctgatgaacatcggc
ccccagcctgacggcgagctgcctgaagtggctgtgcagcggctgaaagaagtgggagag
tggatgtctaagtacggcgagactatctacggcaccagaggcggcctggtggcccctcat
gattggggcgtgaccacccagaagggcaacaagctgtacgtgcacatcctgaacctgcag
gacaaggccctgttcctgcccatcgtggacaagaaagtgaagaaagccgtggtgttcgcc
gacaagacccccgtgcggttcaccaagaacaaagagggcatcgtgctggaactggccaag
gtgcccaccgacgtggactacgtggtggaactgaccatcgaccaccatcatcaccaccac
tga

いくつかの態様において、フコシダーゼは、上記に提供された例示的なフコシダーゼ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９、ならびに本明細書に記載される他のフコシダーゼ）のいずれかと比較して、少なくとも８５％（例えば、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を共有する酵素（例えば、野生型の酵素）であり得る。

２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを、Karlinand Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変されたものを用いて決定される。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、score＝５０、wordlength＝３を以って実行して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されるGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）の初期設定のパラメーターを用いることができる。

遺伝子操作された宿主動物細胞を構築する際に用いることができる哺乳動物フコシダーゼは、これに限定されないが、GenBank Accession No. NP_114409.2、XP_003811598.1、AAH03060.1、EHH53333.1、XP_001127152.1、XP_010360962.1、XP_006084558.1、XP_004263802.1、XP_007171384.1、XP_006075254.1、XP_010982011.1、NP_001004218.1およびXP_010964137.1に開示されたものを含む。

遺伝子操作された宿主動物細胞を構築する際に用いることができる細菌フコシダーゼは、これに限定されないが、GenBank Accession No. WP_008769537.1、WP_032568292.1、EYA08300.1、WP_005780841.1、EXY26528.1、WP_044654435.1、WP_029425671.1、WP_022470316.1、CDA84816.1、WP_004307183.1およびWP_008025871.1に開示されたものを含む。

Ｂ． エンドグリコシダーゼ
エンドグリコシダーゼは、グリカン中の２つの糖モノマーの間のグリコシド結合を切断し、それによって糖タンパク質または糖脂質からオリゴ糖を放出する酵素である。本開示における使用のためのエンドグリコシダーゼ（例えば、野生型の酵素）は、エンドグリコシダーゼＤ、エンドグリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＨおよびエンドグリコシダーゼＳを含む。各亜属の例示的なエンドグリコシダーゼ酵素を、以下の表に提供する：

他の好適なエンドグリコシダーゼ酵素は、本明細書に記載される酵素のいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９８％または９９％）の配列同一性を共有するものを含む。上に挙げられるエンドグリコシダーゼのいずれかとの高い配列相同性（例えば、少なくとも８５％の配列同一性）を有する酵素は、同じ生物学的活性を有すると予測される。かかる酵素（例えば、野生型の酵素）は、GenBankなどの遺伝子データベースから、上に挙げられた酵素の１つをクエリとして用いて検索され得る。

いくつかの態様において、本明細書に記載されるエンドグリコシダーゼは、Endo S酵素である。Endo Sは、天然ＩｇＧ分子中におけるＦｃドメインのＡｓｎグリコシル化部位に結合している最初のＧｌｃＮＡｃ残基のＮ−グリカンを特異的に開裂し、モノグリコシル化ＩｇＧ分子（すなわちＡｓｎグリコシル化部位に結合した単一のＧｌｃＮＡｃを有するＩｇＧ分子）をもたらすエンドグリコシダーゼである。アミノ酸配列およびコードするヌクレオチド配列を、以下に提供する：

Endo S アミノ酸配列（配列番号１１）：
MRVPAQLLGLLLLWLPGARCAQHDSLIRVKAEDKVVQTSPSVSAIDDLHYLSENSKKEFK
EGLSKAGEVPEKLKDILSKAQQADKQAKVLAEMKVPEKIAMKPLKGPLYGGYFRTWHDKT
SDPAEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWTKDYSLFWQELATKHVPTLNKQGTRVIRTIPW
RFLAGGDHSGIAEDTQKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDIERDSIPKVNGK
ESNENIQRSIAVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYIDLLLVQVY
GIQGEKGDWDPVARKPEKTMEERWESYSKYIRPEQYMVGFSFYEENAGSGNLWYDINERK
DDHNPLNSEIAGTRAERYAKWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKVSDDEKRTNKAI
KDITDGIVKSDYKVSKALKKVMENDKSYELIDQKDFPDKALREAVIAQVGSRRGDLERFN
GTLRLDNPDIKSLEGLNKLKKLAKLELIGLSQITKLDSSVLPENIKPTKDTLVSVLETYK
NDDRKEEAKAIPQVALTISGLTGLKELNLAGFDRDSLAGIDAASLTSLEKVDLSKNKLDL
AAGTENRQIFDVMLSTVSNRVGSNEQTVTFDHQKPTGHYPNTYGTTSLRLPVGEGKIDLQ
SQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQEQLIAGRRFVDPGYAYKNFAVTYDAYKVRVTDSTL
GVTDEKKLSTSKEETYKVEFFSPTNGTKPVHEAKVVVGAEKTMMVNLAAGATVIKSDSHE
NAKKVFDGAIEYNPLSFSSKTSITFEFKEPGLVKYWRFFNDITRKDDYIKEAKLEAFVGH
LEDDSKVKDSLEKSTEWVTVSDYSGEAQEFSQPLDNISAKYWRVTVDTKGGRYSSPSLPE
LQILGYRLPLTHDYKDDDDK

Endo S ヌクレオチド配列（配列番号１２；コドン最適化）
atgagagtgcctgctcagctgctgggcctgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgc
gcccagcacgactccctgatcagagtgaaggccgaggacaaggtggtgcagacctcccct
tccgtgtccgccatcgacgacctgcactacctgtccgagaactccaagaaagagttcaaa
gagggcctgtccaaggccggcgaggtgcccgaaaagctgaaggacatcctgagcaaggct
cagcaggccgacaagcaggccaaggtgctggccgagatgaaggtgccagagaagatcgcc
atgaagcccctgaagggccctctgtacggcggctacttcagaacctggcacgacaagacc
tccgaccccgccgagaaggacaaagtgaactccatgggcgagctgcccaaagaggtggac
ctggccttcgtgttccacgactggaccaaggactactccctgttctggcaggaactggcc
accaagcacgtgcccaccctgaacaagcagggcaccagagtgatccggacaatcccctgg
cggtttctggctggcggcgaccactctggaatcgccgaggatacccagaagtaccccaac
acccccgagggcaacaaggccctggctaaggccatcgtggacgagtacgtgtacaagtac
aacctggacggcctggacgtggacatcgagcgggactccatccctaaagtgaacggcaaa
gagtccaacgagaacatccagcggtctatcgccgtgttcgaggaaatcggcaagctgatc
ggccccaagggcgccgacaagtcccggctgttcatcatggactccacctacatggccgat
aagaaccccctgatcgagagaggcgccccttacatcgatctgctgctggtgcaggtgtac
ggcatccagggcgagaagggcgattgggaccctgtggcccggaagcctgaaaagaccatg
gaagagagatgggagtcctactccaagtacatccggcccgagcagtatatggtgggattc
agcttctacgaggaaaacgccggctccggcaacctgtggtacgacatcaacgagcggaag
gacgaccacaaccctctgaactccgagatcgccggcacccgggctgagagatacgctaag
tggcagcccaagaccggcggagtgaagggcggcatcttctcctacgccatcgatagggat
ggcgtggcccaccagcctaagaaggtgtccgacgacgagaagcggaccaacaaggctatc
aaggacatcaccgacggcatcgtgaagtccgactacaaggtgtccaaagccctgaagaaa
gtgatggaaaacgacaagagctacgagctgatcgaccagaaggacttccccgataaggcc
ctgcgcgaggccgtgattgctcaagtgggctccagacggggcgacctggaaagattcaac
ggcaccctgcggctggacaaccccgacatcaagtccctggaaggcctgaacaaactgaag
aagctggccaagctggaactgatcggactgtcccagatcacaaagctggactcctccgtg
ctgcctgagaacatcaagcccaccaaggacaccctggtgtccgtgctggaaacctacaag
aacgacgaccggaaagaggaagccaaggccatccctcaggtggccctgaccatctctggc
ctgaccggcctgaaagagctgaatctggccggcttcgaccgggattccctggctggaatc
gatgccgcctctctgacctccctggaaaaagtggacctgtctaagaacaagctggatctg
gctgccggcaccgagaaccggcagatcttcgacgtgatgctgtccaccgtgtccaacaga
gtgggcagcaacgagcagaccgtgaccttcgaccaccagaagcccaccggccactaccct
aacacctacggcaccacctccctgagactgcctgtgggcgagggcaagatcgacctgcag
tcccagctgctgttcggcaccgtgaccaaccagggcacactgatcaactccgaggccgat
tacaaggcctaccaggaacagctgatcgctgggcggagattcgtggaccctggctacgct
tacaagaacttcgccgtgacctacgatgcctacaaagtgcgcgtgaccgactccaccctg
ggcgtgacagacgaaaagaagctgagcacctccaaagaagagacatacaaggtggaattc
ttctcccccaccaatggcaccaagcctgtgcatgaggctaaggtggtcgtgggcgccgag
aaaaccatgatggtcaacctggccgctggcgccaccgtgatcaagtctgactctcacgag
aatgccaaaaaggtgttcgacggcgccatcgagtacaatcctctgagcttctccagcaag
accagcatcaccttcgagtttaaagaacccggcctcgtgaaatactggcggttcttcaac
gatatcacccgcaaggacgactacatcaaagaggctaagctggaagccttcgtgggccat
ctggaagatgactccaaagtgaaggactctctggaaaagtccaccgagtgggtcaccgtg
tctgactactctggcgaggcccaggaattctcccagcccctggacaacatctccgccaag
tattggagagtgaccgtggacaccaagggcggacggtacagctctcctagcctgcccgag
ctgcagatcctgggctacagactgcctctgacccacgactataaggacgacgacgacaaa
tga

いくつかの態様において、本明細書に記載されるEndo S酵素は、配列番号１１と比較して、少なくとも８５％（例えば、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の配列同一性を共有する酵素（例えば、野生型の酵素）であり得る。その例は、これに限定されないが、GenBank Accession No. EQB24254.1、WP_037584019.1、WP_012679043.1およびADC53484.1に開示されたものを含む。

Ｃ． 遺伝子操作された宿主動物細胞
本明細書に記載される宿主動物細胞は、特定のグリカン改変活性を有する１以上の酵素（例えば、グリコシダーゼまたはグリコールトランスフェラーゼ）を過剰発現するように遺伝子操作されている。遺伝子操作された宿主動物細胞は、本明細書に記載されるフコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼの１以上をコードする外因性の（非天然の）遺伝物質、例えば外因性遺伝子などを保有する動物細胞である。酵素を過剰発現する宿主細胞は、該宿主細胞に対する野生型の対応するもの、すなわち、遺伝子操作された宿主細胞と同じ遺伝子改変を含有しない同じ種類の細胞における酵素のそれよりもより大きい（例えば、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１，０００倍、１０^４倍または１０^５倍高い）レベルで酵素を発現する遺伝子操作された宿主細胞を指す。いくつかの態様において、本明細書に記載される外因性酵素をコードする遺伝子は、好適な親動物細胞へと導入して、本明細書に記載される遺伝子操作された宿主動物細胞を作り出すことができる。外因性酵素は、操作された宿主動物細胞を作製するために用いられた親細胞中に存在しない酵素を指す。

野生型の対応するものと比較して、改変グリコシル化を有する糖タンパク質を産生することができる、本明細書に記載される遺伝子操作された宿主動物細胞は、常用の組換え手技によって作製することができる。いくつかの事例において、強力なプロモーターを外因性のフコシダーゼおよび／またはエンドグリコシダーゼ遺伝子の上流に挿入して、その発現を向上させることができる。他の事例において、フコシダーゼおよび／またはエンドグリコシダーゼの１以上をコードする外因性の遺伝物質を親宿主細胞に導入して、本明細書に記載される遺伝子操作された宿主動物細胞を作り出すことができる。

本明細書に記載されるフコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼをコードする遺伝子は、当技術分野において周知の方法を用いて、好適な発現ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）へと挿入することができる。Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press。例えば、該遺伝子およびベクターは、好適な条件下で、制限酵素と接触させて、互いに対を為すことができるそれぞれの分子上に相補的な端部を作りだして、リガーゼを以ってともに接合することができる。あるいは、合成核酸リンカーを、遺伝子の末端にライゲーションすることができる。これらの合成リンカーは、ベクター中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。いくつかの態様において、フコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼの遺伝子は、以下のエレメントの１以上を含む発現カセット中に含有される：酵素のＮ末端に位置するコザック配列およびシグナルペプチド配列、およびタンパク質タグ（例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ−タグ、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む）。タンパク質タグは、酵素のＮ末端またはＣ末端のいずれにも位置することができる。例えば、図２、パネルＢを参照。

加えて、発現ベクターは、例えば、以下のいくつかまたは全てを含有することができる：選択マーカー遺伝子、例えば哺乳動物細胞における安定なまたは一過的なトランスフェクション体の選択のためのネオマイシン遺伝子など、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；ＳＶ４０ポリオーマ複製開始点および適切なエピソーム複製のためのColE1；汎用性マルチクローニングサイト、ならびに、センスおよびアンチセンスＲＮＡのin vitro転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター。好適なベクター、および導入遺伝子を含有するベクターの製造方法は、当技術分野においてよく知られており、かつ利用可能である。Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press。

本明細書に記載される宿主動物細胞を構築する際に、２以上の酵素、例えば、２以上のフコシダーゼ、２以上のエンドグリコシダーゼ、またはフコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼの組み合わせが用いられる場合、該２以上の酵素をコードする遺伝子は、別々の発現ベクターに挿入されることができるか、または、複数のタンパク質を産生するために設計された共通の発現ベクターに挿入されることができる。

フコシダーゼ発現および／またはエンドグリコシダーゼを産生するためのベクターは、これに限定されないが、マウス骨髄腫細胞（例えば、NSO細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胎児由来腎細胞（例えば、HEK293）およびヒト網膜芽細胞腫（例えば、PER.C6）を含む、好適な親宿主細胞へ導入され得る。当業者の知識内にある好適な宿主細胞株の選択は、高い生産性への要求と所望の特性を有する産物の製造への要求とのバランスに依存する。

いくつかの事例において、発現ベクターは、当技術分野において知られた方法による相同的組換えまたは非相同的組換えによってそれらが細胞のゲノムへ組み込まれることができるように設計することができる。発現ベクターを親宿主細胞へとトランスファーさせる方法は、これに限定されないが、ウイルス仲介性遺伝子トランスファー、リポソーム仲介性トランスファー、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスに基づいたベクター、ならびにレトロウイルスに基づいたベクターの使用などの、ウイルス仲介性遺伝子トランスファー、を含む。遺伝子トランスファーの様式の例は、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ_４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクター、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルを含む。１つの例において、ウイルスベクターが用いられる。非ウイルスベクターの細胞への送達を向上させるために、核酸またはタンパク質が、抗体またはそれらの、細胞表面の抗体に結合する結合性フラグメントにコンジュゲートされていてもよい。標的抗原またはそのフラグメントをまた含むリポソームも、本明細書に記載される方法において用いることができる。

本明細書に記載される「ウイルスベクター」は、in vivo、ex vivoまたはin vitroのいずれかで宿主細胞中へ送達されるポリヌクレオチドを含む組換え産生されたウイルスまたはウイルス粒子を指す。ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど、を含む。遺伝子転移がレトロウイルスベクターによって仲介される側面において、ベクター構築体は、レトロウイルスゲノムまたはその一部および治療遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。

遺伝子操作された動物宿主細胞は、導入された遺伝子（単数、複数）の構成性発現または誘導性発現のいずれかのために作り出された発現カセットの使用を含むことができる。かかる発現カセットは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントを含むことができる。該エレメントは、遺伝子が宿主細胞において作動可能（operational）である（例えば、発現される）ように、対象となる表面タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に（operably）結合されることができる。

様々なプロモーターを、フコシダーゼおよび／またはエンドグリコシダーゼ（ならびに、本明細書に記載されるあらゆる外因性糖タンパク質）の発現のために、用いることができる。該タンパク質を発現させることに用いることができるプロモーターは、当技術分野においてよく知られており、これに限定しないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲ、などのウイルスＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）前初期プロモーター、E. coli lac UV5プロモーターおよび単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターを含む。

調節可能なプロモーター（regulatable promoters）もまた、用いることができる。かかる調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）を用いるもの［Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)、Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998)、Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)］を含む。他のシステムは、FK506二量体、エストラジオールを用いるVP16またはp65、RU486、ジフェノールムリスレロン（diphenol murislerone）またはラパマイシンを含む。誘導システムは、Invitrogen、ClontechおよびAriadから入手可能である。

いくつかの誘導プロモーターの有効性は、時間とともに増加することができる。かかる事例において、複数のリプレッサーを直列に挿入することによって、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によってTetRに結合されたTetR、によって、かかるシステムの有効性を向上させることができる。あるいは、所望の機能のためのスクリーニングの前に、少なくとも３日待つことがあり得る。幾何かのサイレンシングは起こり得るものの、好適な数の細胞、好ましくは少なくとも１×１０^４個、より好ましくは少なくとも１×１０^５個、なおより好ましくは少なくとも１×１０^６個、およびさらにより好ましくは少なくとも１×１０^７個、を用いることによって、最小化することができる。このシステムの有効性を向上させる公知の手段によって、所望のタンパク質の発現を向上させることができる。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element）（ＷＰＲＥ）を用いる。Loeb, V. E., et al., Human Gene Therapy 10:2295-2305 (1999)、Zufferey, R., et al., J. of Virol. 73:2886-2892 (1999)、Donello, J. E., et al., J. of Virol. 72:5085-5092 (1998)を参照。

本明細書に記載される方法を実施することに有用なポリアデニル化シグナルの例は、これに限定されないが、ヒトコラーゲンＩポリアデニル化シグナル、ヒトコラーゲンＩＩポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。

調節エレメントに作動可能に結合されたフコシダーゼ遺伝子および／またはエンドグリコシダーゼ遺伝子（ならびに、本明細書に記載される糖タンパク質遺伝子）を含む外因性遺伝物質は、機能的な細胞質分子、機能的なエピソーム分子として細胞内に存在したままであり得るか、または、それは細胞の染色体ＤＮＡに統合され得る。外因性遺伝物質は、それがプラスミドの形態で別々の遺伝物質のままで細胞へ導入され得る。あるいは、染色体へ統合されることができる線状ＤＮＡが、細胞へ導入され得る。細胞へＤＮＡを導入するとき、染色体へのＤＮＡ統合を促進する試剤が添加され得る。統合を促進するのに有用であるＤＮＡ配列もまた、該ＤＮＡ分子中に含まれ得る。あるいは、ＲＮＡが、細胞へ導入され得る。

選択可能なマーカーは、本明細書に記載される宿主動物細胞への所望の導入遺伝子の取り込みをモニターすることに用いることができる。これらのマーカー遺伝子は、あらゆるプロモーターまたは誘導プロモーターの制御下とすることができる。これらは、当技術分野において知られており、および、例えば栄養、抗生物質などの刺激に対する細胞の感受性を変化させる遺伝子を含む。遺伝子は、neo、puro、tk、多剤耐性（ＭＤＲ）などについてのものを含む。他の遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ルシフェラーゼおよびLacZなどについて容易にスクリーニングされることができるタンパク質を発現する。

Ｄ． 改変グリコシル化を有する糖タンパク質の製造
該遺伝子操作された宿主動物細胞は、改変グリコシル化パターンを有する糖タンパク質（例えば、内因性または外因性）の製造に用いることができる。いくつかの態様において、上記の操作された宿主動物細胞を産生することに用いるための親宿主細胞は、外因性糖タンパク質をコードする１または複数の遺伝子を、既に保有している。他の態様において、対象となる糖タンパク質をコードする１遺伝子または複数の遺伝子は、当技術分野において知られた方法または本明細書に記載される方法によって、１以上のフコシダーゼおよび／またはエンドグリコシダーゼを発現する、遺伝子操作された宿主動物細胞へ導入されることができる。

対象となる糖タンパク質と、１以上のフコシダーゼおよび／またはエンドグリコシダーゼとを両方とも産生することを可能とする遺伝子操作された宿主動物細胞は、これらのタンパク質の発現を可能にする好適な条件下で培養することができる。常用の手技によって、該細胞および／または培養培地は回収することができ、および、対象となった糖タンパク質を、細胞および／または培養培地から単離および精製することができる。このように作り出された、糖タンパク質のグリコシル化パターンは、常用の手技、例えばＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって決定して、グリコシル化の改変を確認することができる。

いくつかの例において、対象となる糖タンパク質は抗体である。例示的な抗体は、これに限定されないが、アブシキシマブ（糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ；循環器疾患）、アダリムマブ（ＴＮＦ−α、種々の自己免疫障害、例えば、関節リウマチ）、アレムツズマブ（ＣＤ５２；慢性リンパ球性白血病）、バシリキシマブ（ＩＬ−２Ｒα受容体（ＣＤ２５）；移植拒絶）、ベバシズマブ（血管内皮増殖因子Ａ；種々のがん、例えば、大腸癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、腎癌；滲出型加齢黄斑変性症）、カツマキソマブ、セツキシマブ（ＥＧＦ受容体、種々のがん、例えば、大腸癌、頭頸部癌）、セルトリズマブ（例えば、セルトリズマブペゴル）（ＴＮＦアルファ；クローン病、関節リウマチ）、ダクリズマブ（ＩＬ−２Ｒαレセプター（ＣＤ２５）；移植拒絶）、エクリズマブ（補体タンパク質Ｃ５；発作性夜間血色素尿症）、エファリズマブ（ＣＤ１１ａ；乾癬）、ゲムツズマブ（ＣＤ３３；急性骨髄性白血病（例えば、カリケアマイシンとともに））、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫（例えば、イットリウム９０またはインジウム１１１とともに））、インフリキシマブ（ＴＮＦアルファ；種々の自己免疫障害、例えば、関節リウマチ）、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｔ細胞ＣＤ３レセプター；移植拒絶）、ナタリズマブ（アルファ−４（α４）インテグリン；多発性硬化症、クローン病）、オマリズマブ（ＩｇＥ；アレルギー関連ぜんそく）、パリビズマブ（ＲＳＶ Ｆタンパク質のエピトープ；呼吸器合胞体ウイルス感染）、パニツムマブ（ＥＧＦレセプター；がん、例えば、大腸癌）、ラニビズマブ（血管内皮増殖因子Ａ；滲出型加齢黄斑変性症）、リツキシマブ（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫）、トシツモマブ（ＣＤ２０；非ホジキンリンパ腫）、トラスツズマブ（ＥｒｂＢ２；乳癌）を含む。

いくつかの例において、対象となる糖タンパク質は、サイトカインである。その例は、これに限定されないが、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βまたはＩＮＦ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、およびコロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）を含む。ＩＦＮは、例えば、インターフェロンアルファ２ａまたはインターフェロンアルファ２ｂであり得る。これらのサイトカインの特定のものについてのさらなる議論に関し、例えば、Mott HR and Campbell ID. “Four-helix bundle growth factors and their receptors: protein-protein interactions.” Curr Opin Struct Biol. 1995 Feb;5(1):114-21、Chaiken IM, Williams WV. “Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines: towards de novo mimetics design.” Trends Biotechnol. 1996 Oct;14(10):369-75、Klaus W, et al., “The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution”. J. Mol Biol., 274(4):661-75, 1997を参照。

対象となるタンパク質はまた、上述したサイトカインの１以上に類似した構造を有するサイトカインタンパク質であってもよい。例えば、サイトカインは、白血病阻害因子（ＬＩＦ）またはオンコスタチンＭなどのＩＬ−６クラスサイトカインであり得る。いくつかの態様において、サイトカインは、ＧＰ１３０シグナル伝達サブユニットを含む受容体に本来結合するものである。対象となる他の４ヘリックスバンドルタンパク質は、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）および胎盤性ラクトゲンを含む。いくつかの態様において、標的タンパク質は、赤血球造血刺激剤、例えば（ＥＰＯ）であり、これもまた４ヘリックスバンドルサイトカインである。いくつかの態様において、赤血球造血刺激剤は、ＥＰＯ変異体、例えば、５つのＮ−結合された炭水化物鎖（組換えＨｕＥＰＯよりも２つ多い）を含有するように操作された、新規の赤血球刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）とも呼ばれるダルベポエチンアルファである。いくつかの態様において、タンパク質は、５つの螺旋を含む。例えば、タンパク質は、インターフェロンベータ、例えばインターフェロンベータ−１ａまたはインターフェロンベータ−１ｂであり得、これは、（理解されるとおり）しばしば、４ヘリックスバンドルサイトカインとして分類される。いくつかの態様において、標的タンパク質は、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３またはＩＬ−１５である。特定のサイトカインについての議論に関し、例えば、Hunter, CA, Nature Reviews Immunology 5, 521-531, 2005を参照。また、Paul, WE (ed.), Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6th ed., 2008も参照。

加えて、対象となるタンパク質は、ヒトにおける疾患または障害の処置における使用のために米国食品医薬品局（または欧州医薬品審査庁などの同等の規制当局）によって認可されたタンパク質であり得る。かかるタンパク質は、そのペグ化されたバージョンが臨床試験において試験され、および／または市販化のために認可されたものであり得るか、または、そうではないものであり得る。いくつかの事例において、対象となるタンパク質は、これに限定しないが、アバタセプト、エタネルセプト、ＩＬ−２−Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ８０−Ｆｃ融合タンパク質およびＰＤＬ１−Ｆｃ融合タンパク質を含む、Ｆｃ融合タンパク質である。

さらに、対象となるタンパク質は、神経栄養因子、すなわち、神経系統細胞（この用語は、本明細書で用いられるとき、神経前駆細胞、ニューロンおよびグリア細胞、例えば、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ミクログリア、を含む）の生存、発生および／または機能を促進する因子であり得る。例えば、いくつかの態様において、標的タンパク質は、神経突起伸長を促進する因子である。いくつかの態様において、タンパク質は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ；４ヘリックスバンドルタンパク質）またはその類似体、例えばヒト毛様体神経栄養因子の、Ｃ末端の１５アミノ酸の欠失、および２つのアミノ酸置換を有する改変バージョンで、in vitroおよびin vivoアッセイにおいてＣＮＴＦよりも３〜５倍強力であり、および向上した安定性の特性を有するアキソキン、などである。

あるいは、対象となるタンパク質は、酵素、例えば、代謝または他の生理学的プロセスにおいて重要な酵素であり得る。当技術分野において知られているように、酵素または他のタンパク質の欠乏は、種々の疾患へとつながる可能性がある。かかる疾患は、炭水化物代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝、ポルフィリン代謝、プリンまたはピリミジン代謝などにおける欠陥、リソソーム貯蔵障害、血液凝固などと関連した疾患を含む。例として、ファブリー病、ゴーシェ病、ポンペ病、アデノシンデアミナーゼ欠乏、アスパラギナーゼ欠乏、ポルフィリン症、血友病、および遺伝性血管浮腫を含む。いくつかの態様において、タンパク質は、血栓化または凝固因子（例えば、VII、VIIa、VIIIまたはIX因子）である。他の態様において、タンパク質は、炭水化物代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝、ポルフィリン代謝、プリンまたはピリミジン代謝および／またはリソソーム貯蔵において役割を担う酵素であり、ここで該酵素の外因性投与は、少なくとも一部において疾患を軽減する。

さらに、対象となるタンパク質は、インスリン、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよび甲状腺刺激ホルモンなどのホルモンであり得る。対象となるタンパク質はまた、これに限定しないが、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌型運動因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ） 線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長分化因子−９（ＧＤＦ９）、回復因子、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ） 肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および胎盤成長因子（ＰＧＦ）を含む、成長因子であり得る。

さらなる労苦なく、上記の記載に基づき当業者は、本発明をその最大限にまで利用できると考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる例証として解釈されるべきであり、いかなる様式においても本開示の残りの部分を制限するものではない。本明細書中で引用される全ての刊行物は、本明細書で言及される目的または主題のために、参照により組み込まれる。

方法
ｉ． フコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを産生するための発現ベクターの構築。
フコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼのための発現ベクターを構築するために、フコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼ遺伝子を常用の手技により単離し、ハムスター細胞のコドンの使用に基づいて、コドン最適化を施した。合成遺伝子を、GeneArt Corp.により作製し、pcDNA3.1 B(-) Myc-Hisベクター（Invitrogen, US）の制限部位Bgl II/EcoR Iにクローンした（図２、パネルＡ）。アルファ−フコシダーゼの発現カセットは、５’から３’に向かって、コザック配列、Igkリーダー配列、フコシダーゼのコード配列、および、Ｈｉｓ−タグをコードする配列を含む。図２、パネルＢ。エンドグリコシダーゼの発現カセットは、５’から３’に向かって、コザック配列、Igkリーダー配列、エンドグリコシダーゼのコード配列、および、Flagタグをコードする配列を含む。図２、パネルＢ。

ｉｉ． 脱フコシル化抗体の作製
抗体産生細胞株を、完全培地、８ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗クランピング剤（anti-Clumping Agent）の１：１００希釈（Life Technologies, USA）を補充したCD FortiCHO（商標）培地中に０．３〜３．０×１０^６生存細胞／ｍＬで維持した。８％ＣＯ_２インキュベーター内で、細胞を、１３０〜１５０ｒｐｍに設定した振盪プラットフォーム上に維持した。

脱フコシル化抗体を産生するため、FreeStyleMAX試剤（Life Technologies, USA）により、製造者のプロトコルに従って、上で述べた抗体産生細胞を上記のアルファ−フコシダーゼをコードする発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、４ｇ／Ｌのグルコースを含む培地中で培養し、および、培地を１日おきに交換した。細胞生存率が７０％未満に低下したときに、細胞を採取した。清澄化した培養上清を回収し、Protein A Chromatographyによって精製した。

ｉｉｉ． 抗体のグリコシル化の解析
本明細書に記載される方法に従って作製した組換え抗体を、還元し、アルキル化し、消化した（終夜、トリプシンで、２５ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液の存在下（ｐＨ 〜８））。PNGase F溶液（３μＬ、Roche）を、２００μＬの消化した検体に添加して、および、混合物をさらに１６時間３７℃でインキュベートした。放出されたグリカンを、Sep-Pak（登録商標）C18カートリッジ（Waters）を用いてペプチドから分離した。Sep-Pak C18をアセトニトリルで、次いで水で洗浄した。PNGaseF消化した検体を、カートリッジ上に載せ、ペプチドがSep-Pak C18にバインドさせたまま、放出されたグリカンを１％エタノールで溶出させた。放出されたタンパク質オリゴ糖を、まず多孔質グラファイトカーボンカラム（PhyNexus）を用いて精製し、および次にパーメチル化した。全ての質量分析実験は、Orbitrap Fusion Tribrid質量分析計を用いて、ナノエレクトロスプレー源への直接的な注入により行った。

結果
１． 単糖（ＧｌｃＮＡｃ）の糖型を有する抗体h4B12、リツキシマブおよびオマリズマブの産生
単糖の糖変異体は、上述した二糖変異体からフコシダーゼ開裂反応によって作製することができた。多数の入手可能な酵素からの検索およびLC/MS/MSによるグリコール−ペプチド解析により、最適化された開裂反応条件では、α−１，６−フコシダーゼを用いて効率的な脱フコシル化を達成することができたということ、および、より高い開裂効率は、より低いＮＦ／Ｆ比と関連していることが示された。あるいは、単糖の糖変異体は、エンドグリコシダーゼ（Endo S）およびα−１，６−フコシダーゼを含む、連続して組み合わせられた２つの反応酵素で得ることができた。結果物のモノ−ＧｌｃＮＡｃ糖変異体を、図３、パネルＡに示した。

結果により、Endo-Sが、本明細書に記載される、操作されたCHO細胞において産生されたh4B12、リツキシマブおよびオマリズマブの重鎖の＞９０％のＮ−結合グリカンを除去したことが示された。５つの異なる種類のフコシダーゼ：FUCA1、FUCA2、Cricetulus griseusフコシダーゼ、アルファ-L-1、Chryseobacterium meningosepticum α１，６−フコシダーゼおよびBF3242の脱フコシル化能は、フコシダーゼの各々を発現するCHO細胞において産生されたh4B12抗体に対し、それぞれ５．８％、９．１％、１７．７％、１１．５％および６８％である。図３、パネルＢ。酵素の発現をウェスタンブロットで検出したところ、図３、パネルＣに示すとおりであった。

２−デオキシ−２−フルオロ Ｌ−フコースは、フッ素化フコース類似体である。それは、宿主細胞内で代謝されてフコシルトランスフェラーゼの基質ベースの阻害剤を生み出すことができる。フコシダーゼBF3242およびEndo-Sを一時的に発現する抗体産生CHO細胞を培養しているとき、CHO細胞において産生された抗体に結合したＮ−グリカンの９９．８９％が、モノグリコシル化されている（ＧｌｃＮＡｃ−Ｉｇ−Ｆｃ）。図３、パネルＤ。

リツキシマブを産生するCHO-35D6細胞に、BF3242およびEndo-Sを産生するための発現ベクターで安定なトランスフェクションを行った。細胞を、１００〜４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で培養した。このようにして産生された抗体は、１７〜１９％のＧｌｃＮＡｃ−Ｉｇ−Ｆｃを含有している。図４、パネルＡ。
酵素発現をウェスタンブロットで検出したところ、図４、パネルＢに示すとおりであった。

類似の結果が、フコシダーゼおよびEndo Sの両方を発現するように操作されたCHO細胞において産生されたオマリズマブにおいて観察された。
かかる効率性は、均等なグリカン形態を有する抗体の作製におけるトランスグリコシル化のための重要なステップを表す。

他の態様
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書において開示される各々の特徴は、同じ、均等な、または類似の目的の役割をする代替的な特徴により置き換えてもよい。ゆえに、他に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の均等物または類似の特徴の一例に過ぎない。

上記の説明から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、および、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明のさまざまな変更および改変をして、それをさまざまな用途および条件に適応させることができる。ゆえに、他の態様もまた、特許請求の範囲内にある。

Claims (18)

1. フコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼを発現する、遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞であって、操作された宿主哺乳動物細胞が、改変グリコシル化を有する糖タンパク質を産生し、エンドグリコシダーゼが、Endo S酵素、Endo F2酵素またはEndo F3酵素である、前記遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
2. フコシダーゼが、哺乳動物フコシダーゼまたは細菌フコシダーゼである、請求項１に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
3. エンドグリコシダーゼが、Endo S酵素である、請求項１または２に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
4. 外因性糖タンパク質をさらに発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
5. 糖タンパク質が、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、サイトカイン、ホルモン、成長因子または酵素である、請求項４に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
6. 糖タンパク質が、抗体である、請求項５に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
7. 哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞であり、エンドグリコシダーゼが、Endo S酵素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
8. （ｉ）ヒトFUCA1、ヒトFUCA2、Cricetulus griseusフコシダーゼ アルファ-L-1、Chryseobacterium meningosepticum α１，６−フコシダーゼまたは細菌フコシダーゼBF3242、および（ｉｉ）Endo Sを発現する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞。
9. 脱フコシル化糖タンパク質の製造方法であって、
   （ａ）外因性糖タンパク質、（ｂ）フコシダーゼおよび（ｃ）エンドグリコシダーゼを発現する、遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞を提供すること；
   糖タンパク質、フコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼの産生を可能にする条件下で宿主哺乳動物細胞を培養すること；および
   糖タンパク質を単離するために宿主哺乳動物細胞または培養上清を回収すること、を含み、
   エンドグリコシダーゼが、Endo S酵素、Endo F2酵素またはEndo F3酵素である、前記方法。
10. フコシダーゼが、哺乳動物フコシダーゼまたは細菌フコシダーゼである、請求項９に記載の方法。
11. エンドグリコシダーゼが、Endo S酵素である、請求項９または１０に記載の方法。
12. 糖タンパク質が、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、サイトカイン、ホルモン、成長因子または酵素である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 糖タンパク質が、抗体である、請求項１２に記載の方法。
14. 哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞であり、エンドグリコシダーゼが、Endo S酵素である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 糖タンパク質を単離することをさらに含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 糖タンパク質のグリコシル化パターンを解析することをさらに含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 請求項１に記載の遺伝子操作された宿主哺乳動物細胞の、作製方法であって、フコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼをコードする１以上の発現ベクターを、哺乳動物細胞へ導入することを含み、エンドグリコシダーゼが、Endo S酵素、Endo F2酵素またはEndo F3酵素である、前記方法。
18. 外因性糖タンパク質をコードする発現ベクターを哺乳動物細胞へ導入することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。