KR20160127830A

KR20160127830A - 변형된 글리코실화를 갖는 재조합 당단백질을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20160127830A
Application number: KR1020167028632A
Authority: KR
Inventors: 니엔-이 첸; 체-하올즈 우; 헝-치 첸; 윈스턴 타운
Original assignee: 파운테인 바이오파마 인크.
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2015-03-17
Publication date: 2016-11-04
Also published as: EP3119882A4; JP2020072667A; EP3119882B1; IL247776A0; DK3119882T3; HUE057904T2; SG11201607759RA; KR102333923B1; PT3119882T; ES2904993T3; JP6701089B2; RU2704830C2; CN106715686B; CA2942618A1; US9540673B2; PL3119882T3; TW201623620A; US10745729B2; WO2015145268A8; EP3119882A2

Abstract

변형된 글리코실화 패턴, 예를 들어, 탈푸코실화 및/또는 단일글리코실화를 갖는 당단백질을 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포. 이러한 숙주 동물 세포를 푸코시다제, 엔도글리코시다제 또는 둘 다를 발현하도록 조작할 수 있다.

Description

변형된 글리코실화를 갖는 재조합 당단백질을 생산하는 방법 {Methods for Producing Recombinant Glycoproteins with Modified Glycosylation}

<관련 출원의 상호참조>

본 출원은 그 내용이 전체로서 본원에 참조로 포함된, 2014년 3월 17일에 출원된, 미국 가출원 제61/954,337호의 이익을 청구한다.

글리코실화는 당단백질의 기능 및 구조에 중요하다. 예를 들어, 글리코실화는 당단백질의 생물활성 및/또는 단백질 접힘 (및 따라서 안정성)에 영향을 미치는 것으로 제안된다. 치료 재조합 당단백질, 특히 단일클론 항체의 필요는 최근 이십 년간 꾸준히 증가했다. 이전의 연구는 재조합 당단백질의 글리칸 구조의 사소한 차이가 당단백질의 약동학 및 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있음을 밝혔다. 예를 들어, 다베포에틴(Darbepoetin) 알파는 두 개의 추가적인 N-연결(N-linked) 글리코실화 부위를 갖는 재조합 인간 에리트로포이에틴(EPO)의 과-글리코실화된(hyper-glycosylated) 유사체이다. 추가적인 N-글리코실화는 내인성 및 재조합 EPO와 비교하여, 다베포에틴 알파의 혈청 반감기를 현저하게 연장시키며 탄수화물의 분자량의 백분율을 증가시킨다. 이에 더해, 그의 효능이 항체-의존 세포 세포독성(ADCC)에 주로 의존하는 치료 항체에 대해서, Fc 부분의 핵심 푸코스 잔기를 제거하기 위한 화학-효소적 및 유전적 접근법 모두가 상기 항체에 의해서 유발된 ADCC 효과의 효력을 증가시키도록 개발되었다.

그러나, 현재 이용가능한 글리코실화 리모델링 방법은 종종 다수의 효소 및/또는 다수의 단계를 요구하며, 당-조작된(glyco-engineered) 재조합 단백질 제조에 대한 고비용을 일으킨다.

본 개시내용은 당단백질, 예컨대 탈푸코실화 및 단일글리코실화를 포함하는 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포의 개발에 기반한다. 이러한 숙주 동물 세포는 하나 이상의 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 과도하게 발현하도록 조작된다. 예상치 못하게, 숙주 동물 세포의 세포성 글리코실화 기구의 변화는 당단백질 합성 및 숙주 세포 성장과 관련한 부작용을 초래하지 않았다.

따라서, 본 개시내용은 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 과도하게 발현하며, 숙주 동물 세포가 야생형 대응물과 비교하여 변형된 글리코실화를 갖는 당단백질을 생산하는, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포(예를 들어, 포유류 세포)를 제공한다. 일부 예에서, 푸코시다제는 포유류 푸코시다제 또는 박테리아 푸코시다제, 예를 들어, 인간 FUCA1, 인간 FUCA2, 크리세툴루스 그리세우 스(Cricetulus griseus) 푸코시다제, 알파-L-1 크리세오박테리움 메닝고셉티 쿰(Chryseobacterium meningosepticum) α1,6-푸코시다제, 또는 박테리아 푸코시다제 BF3242일 수 있다. 대안적으로 또는 이에 더해, 엔도글리코시다제는 엔도 S 효소, 예를 들어, 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 효소일 수 있다. 일부 예에서, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포는 (i) 인간 FUCA1, 인간 FUCA2, 크리세툴루스 그리세우스 푸코시다제, 알파-L-1 크리세오박테리움 메닝고셉티쿰 α1,6-푸코시다제, 또는 박테리아 푸코시다제 BF3242, 및 (ii) 엔도 S(예컨대 서열 11)을 발현한다.

본원에 기술된 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포는 외인성(동일 유형의 천연 동물 세포에서 발현되지 않음)일 수 있는 당단백질을 더 발현한다. 예는 항체, Fc-융합 단백질, 시토카인, 호르몬, 성장 인자, 또는 효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 예에서, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포는 포유류 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 쥐 골수종 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 하이브리도마 세포, 나말와(Namalwa) 세포, 배아 줄기 세포, 또는 수정란이다.

또한, 임의의 본원에 기술된 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 사용한 변형된(예를 들어, 탈푸코실화된 또는 단일글리코실화된) 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하는 방법이 본원에 기술된다. 본 방법은 (i) (a) 당단백질, 및 (b) 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 발현하는 숙주 동물 세포를 제공하는 단계; 숙주 동물 세포를 당단백질 및 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 생산하도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계; (ii) 당단백질을 단리하기 위해 숙주 동물 세포 또는 배양 상등액을 수집하는 단계, 및 임의로 (iii) 당단백질을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 (iv) 당단백질의 글리코실화 패턴을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.

나아가, 본 개시내용은 임의의 본원에 기술된 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 (i) 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 총괄적으로 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 동물 세포로 도입하는 단계, 및 임의로 (ii) 당단백질을 코딩하는 발현 벡터를 동물 세포로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 및 당단백질을 발현하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항이 아래의 설명에 나타나 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 장점은 다음의 도면 및 여러 실시양태의 상세한 설명, 및 첨부된 청구항으로부터도 명백할 것이다.

도 1은 다양한 N-글리칸의 구조를 보여주는 개략도이다. 1a: 당단백질의 전형적인 N-연결 글리칸. 1b: 탈푸코실화된 N-글리칸. 1c: 단일-N아세틸글루코사민 환원당을 갖는(단일글리코실화된) N-글리칸.
도 2는 푸코시다제를 생산하는 예시적인 발현 벡터의 개략도이다. 2a: 푸코시다제 유전자를 수반하는 예시적인 플라스미드의 지도. 2b: 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제 S를 발현하는 예시적인 발현 카세트(cassette).
도 3은 푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제를 발현하도록 조작된 숙주 세포에서 항체의 일시적 발현에 의해 균일한 무푸코실화된 단당(GlcNAc) 항체 h4B12의 생산을 보여주는 도표를 포함한다. 3a: 균일한 무푸코실화된 단당(GlcNAc) 항체 생산의 개략도. 3b: LC/MS/MS에 의해 결정된, 인간 FUCA1, 인간 FUCA2, 씨. 그리세우스(C. griseus) 푸코시다제, 알파-L-1, 또는 씨. 메닝고셉티쿰(C. meningosepticum) α1,6-푸코시다제를 발현하도록 조작된 숙주 세포에서 생산된 항체 4B12의 글리코실화를 보여주는 차트. 3c: 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 검출된, CHO 세포에서 표시된 바와 같이 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제의 일시적 발현을 보여주는 도표. 3d: 표시된 바와 같이 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제를 발현하는 CHO 세포에서 생산된 항체 h4B12를 보여주는 차트, 항체는 LC/MS/MS에 의해 결정된 바와 같이 균일한 무-푸코스(fucose-free) 단당(GlcNAc) 당형태(glycoform)를 갖는다. 균일한 N-글리칸은 당단백질, 예컨대 항체의 N-글리칸(예를 들어, 무푸코실화된 N-글리칸) 대 총 N-글리칸 비를 지칭한다.
도 4는 푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제를 발현하도록 조작된 숙주 세포에서 항체의 일시적 발현에 의해 균일한 무푸코실화된 단당(GlcNAc) 항체 리툭시맙(rituximab)의 생산을 보여주는 도표를 포함한다. 4a: 표시된 바와 같이 다양한 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제를 발현하도록 조작된 숙주 세포에서 생산된 항체 리툭시맙의 글리코실화를 보여주는 차트. 4b: 웨스턴 블롯에 의해 검출된, CHO 세포에서 표시된 바와 같이 푸코시다제(좌측 레인) 또는 엔도글리코시다제(우측 레인)의 일시적 발현을 보여주는 도표.

유전적으로 조작된 숙주 동물 세포, 예컨대 변형된 글리코실화 패턴(예를 들어, 변형된 N-글리코실화 패턴, 예컨대 탈푸코실화된 N-글리칸 또는 단당 글리칸)을 갖는 당단백질(예를 들어, 외인성 당단백질, 예컨대 항체)을 생산할 수 있는 포유류 세포가 본원에 개시된다. 이러한 숙주 동물 세포는 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 과도하게 발현하도록 조작될 수 있다. 임의로, 숙주 동물 세포는 또한 외인성 당단백질, 예컨대 항체를 발현하도록 조작될 수 있다.

야생형 포유류 세포에서 생산된 당단백질의 전형적인 복합 N-글리칸의 구조는 도 1a에서 보여진다. 이러한 복합 N-글리칸은 글리코실화 부위에 부착된 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기, 당단백질의 아스파라긴(Asn) 잔기, 및 알파1,6-연결로 Asn 잔기에 부착된 푸코스 잔기를 함유한다. 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포는 변형된 N-글리칸, 예컨대 그의 한 예가 도 1b에 제공되어 있는 탈푸코실화된 N-글리칸 및 오직 GlcNAc 잔기만이 Asn 글리코실화 부위에 부착된 단당 N-글리칸 (도 1c)을 갖는 (예를 들어, 내인성 또는 외인성) 당단백질을 생산할 수 있다. 변형된 글리코실화를 갖는 당단백질은 하나 이상의 글리칸, 예컨대 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포의 야생형 대응물에서 생산된 당단백질의 글리칸과 구조적으로 상이한 N-글리칸을 수반하는 당단백질을 지칭한다. 탈푸코실화된 글리칸은 알파1,6-푸코스 잔기 또는 임의의 푸코스 잔기를 함유하지 않는 임의의 글리칸을 지칭한다.

A. 푸코시다제

푸코시다제는 푸코스를 분해하는 효소이다. 이 효소는 푸코스 잔기를, 이를 함유하는 글리칸으로부터 절단한다. 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포 제조에 사용하기 위한 푸코시다제는 포유류 푸코시다제 또는 박테리아 푸코시다제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 푸코시다제는 야생형 효소, 예를 들어, 야생형 박테리아 효소 또는 야생형 포유류 효소, 예컨대 인간 효소이다. 여러 예시적인 푸코시다제의 아미노산 서열 및 코딩 뉴클레오티드 서열이 아래에 제공된다 (C-말단의 His-태그 포함):

일부 실시양태에서, 푸코시다제는 상기에 제공된 임의의 예시적인 푸코시다제(예를 들어, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 또는 서열 9, 뿐만 아니라 본원에 기술된 다른 푸코시다제)와 비교하여, 85 % 이상(예를 들어, 90 %, 93 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 %)의 서열 동일성을 공유하는 효소(예를 들어, 야생형 효소)일 수 있다.

두 아미노산 서열의 "백분율 동일성"은 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의, 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된 알고리즘을 사용하여 결정하였다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)로 도입되어 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 대해 상동인 아미노산 서열을 얻도록, XBLAST 프로그램, 점수=50, 워드길이(wordlength)=3으로 수행할 수 있다. 두 서열 간 갭(gap)이 존재하는 곳에, 갭드(Gapped) BLAST를 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기술된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용할 수 있다.

유전적으로 조작된 숙주 동물 세포 제작에 사용할 수 있는 포유류 푸코시다제는 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NP_114409.2, XP_003811598.1, AAH03060.1, EHH53333.1, XP_001127152.1, XP_010360962.1, XP_006084558.1, XP_004263802.1, XP_007171384.1, XP_006075254.1, XP_010982011.1, NP_001004218.1, 및 XP_010964137.1 하에서 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

유전적으로 조작된 숙주 동물 세포 제작에 사용할 수 있는 박테리아 푸코시다제는 진뱅크 수탁 번호 WP_008769537.1, WP_032568292.1, EYA08300.1, WP_005780841.1, EXY26528.1, WP_044654435.1, WP_029425671.1, WP_022470316.1, CDA84816.1, WP_004307183.1, 및 WP_008025871.1 하에서 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

B. 엔도글리코시다제

엔도글리코시다제는 글리칸의 두 당 단량체 사이의 글리코시드 결합을 분해하여, 이로써 올리고당을 당단백질 또는 당지질로부터 방출시키는 효소이다. 본 개시내용에 사용하기 위한 엔도글리코시다제(예를 들어, 야생형 효소)는 엔도글리코시다제 D, 엔도글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 H, 및 엔도글리코시다제 S를 포함한다. 각 아속(subgenus)의 예시적인 엔도글리코시다제 효소가 아래 표에서 제공된다:

다른 적절한 엔도글리코시다제 효소는 본원에 기술된 효소 중 하나에 대해 85 % 이상(예를 들어, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 99 %)의 서열 동일성을 공유하는 것을 포함한다. 임의의 상기-열거된 엔도글리코시다제와 높은 서열 상동성(예를 들어, 85 % 이상의 서열 동일성)을 갖는 효소는 동일한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 예상된다. 이러한 효소(예를 들어, 야생형 효소)는 쿼리(query)로서 상기 열거된 효소 중 하나를 사용하여, 유전자 데이터베이스, 예컨대 진뱅크로부터 검색할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 엔도글리코시다제는 엔도 S 효소이다. 엔도 S는 천연 IgG 분자의 Fc 도메인의 Asn 글리코실화 부위에 부착된 첫 번째 GlcNAc 잔기에서 N-글리칸을 특이적으로 절단하며, 단일글리코실화된 IgG 분자, 즉, Asn 글리코실화 부위에 부착된 단일 GlcNac를 갖는 IgG 분자를 가져오는 엔도글리코시다제이다. 아미노산 서열 및 코딩 뉴클레오티드 서열이 아래에 제공된다:

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 엔도 S 효소는 서열 11과 비교하여, 85 % 이상(예를 들어, 90 %, 93 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 %)의 서열 동일성을 공유하는 효소(예를 들어, 야생형 효소)일 수 있다. 예는 진뱅크 수탁 번호 EQB24254.1, WP_037584019.1, WP_012679043.1, 및 ADC53484.1 하에서 기술된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

C. 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포

본원에 기술된 숙주 동물 세포는 특이적인 글리칸-변형 활성을 갖는 하나 이상의 효소(예를 들어, 글리코시다제 또는 글리콜-트랜스퍼라제)를 과도하게 발현하도록 유전적으로 조작되었다. 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포는 외인성(비-천연) 유전 물질, 예컨대 본원에 기술된 하나 이상의 엔도글리코시다제 및 푸코시다제를 코딩하는 외인성 유전자를 수반하는 동물 세포이다. 효소를 과도하게 발현하는 숙주 세포는 숙주 세포, 즉, 유전적으로 조작된 숙주 세포와 같은 동일한 유전적 변형을 함유하지 않는 동일한 유형의 세포의 야생형 대응물에서의 효소의 것을 초과하는(예를 들어, 20 %, 50 %, 80 %, 100 %, 2-배, 5-배, 10-배, 50-배, 100-배, 1,000-배, 10⁴-배, 또는 10⁵-배 더 높은) 수준의 효소를 발현하는 유전적으로 조작된 숙주 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 외인성 효소를 코딩하는 유전자를 본원에 기술된 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 생산하도록 적절한 부모 동물 세포로 도입할 수 있다. 외인성 효소는 조작된 숙주 동물 세포를 만드는 데에 사용한 부모 세포에 존재하지 않는 효소를 지칭한다.

야생형 대응물과 비교하여 변형된 글리코실화를 갖는 당단백질을 생산할 수 있는, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 통상적인 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다. 일부 예에서, 강한 프로모터를 내인성 푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제 유전자의 상류에, 그의 발현을 증진시키도록 삽입할 수 있다. 다른 예에서, 하나 이상의 푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제를 코딩하는 외인성 유전 물질을 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 생산하도록 부모 숙주 세포로 도입할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제를 코딩하는 유전자를 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 적절한 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터)에 삽입할 수 있다. 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press]. 예를 들어, 유전자 및 벡터를, 서로 쌍을 이룰 수 있고 리가제(ligase)로 함께 결합할 수 있는 각 분자의 상보적인 말단을 생성하도록, 제한 효소로 적절한 조건 하에서 접촉시킬 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커(linker)를 유전자의 말단에 결찰(ligated)시킬 수 있다. 이들 합성 링커는 벡터의 특정 제한 부위에 대응하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 실시양태에서, 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제의 유전자는 하나 이상의 다음의 요소를 포함하는 발현 카세트에 함유된다: 효소의 N-말단에 위치한 코작(Kozak) 서열 및 신호 펩티드 서열, 및 단백질 태그(예를 들어, FLAG, His-태그, 예를 들어 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함한다). 단백질 태그는 효소의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 예를 들어, 도 2b를 참조한다.

추가적으로, 발현 벡터는 예를 들어, 다음 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: 선택적 마커 유전자, 예컨대 포유류 세포에서 안정 또는 일시적 형질감염체(transfectant)의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 최조기 유전자(immediate early gene)의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40의 RNA 프로세싱 및 전사 종결 신호; 적당한 에피솜(episomal) 복제를 위한 SV40 폴리오마(polyoma) 기원의 복제 및 ColE1; 다양한 다수의 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내(in vitro) 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 트랜스진(transgene)을 함유하는 벡터를 생산하는 적절한 벡터 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 입수가능하다. 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press].

만일 둘 이상의 효소를 본원에 기술된 숙주 동물 세포, 예를 들어, 둘 이상의 푸코시다제, 둘 이상의 엔도글리코시다제, 또는 푸코시다제 및 엔도글리코시다제의 조합을 제작하는 데에 사용한다면, 둘 이상의 효소를 코딩하는 유전자를 별도의 발현 벡터에 삽입하거나 다수의 단백질을 생산하기 위해 설계된 보통의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제를 생산하기 위한 발현 벡터를, 쥐의 골수종 세포(예를 들어, NSO 세포), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, HEK293), 및 인간 망막모세포종(retinoblastoma) 세포(예를 들어, PER.C6)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 적절한 부모 숙주 세포로 도입할 수 있다. 당업자의 지식 내에서의 적절한 숙주 세포주의 선택은, 높은 생산성에 대한 필요 및 원하는 성질을 갖는 생성물 생산에 대한 필요성 간의 균형에 의존할 수 있다.

일부 예에서, 발현 벡터를, 이들이 당업계에 알려진 방법에 의한 상동 또는 비-상동 재조합에 의해 세포의 게놈에 포함될 수 있도록 설계할 수 있다. 부모 숙주 세포로 발현 벡터를 전이하는 방법은, 바이러스 매개 유전자 전이, 리포솜 매개 전이, 형질전환, 형질감염 및 형질도입, 예를 들어, 바이러스 매개 유전자 전이, 예컨대 DNA 바이러스에 기반한 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스 및 헤르페스 바이러스, 뿐만 아니라 레트로바이러스 기반 벡터의 사용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유전자 전이 방식의 예는, 예를 들어, 네이키드(naked) DNA, CaPO₄ 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공(electroporation), 원형질 융합, 리포펙션(lipofection), 세포 미세주사(microinjection), 및 바이러스 벡터, 아주반트-지원(adjuvant-assisted) DNA, 유전자 총(gene gun), 카테터(catheter)를 포함한다. 한 예에서, 바이러스 벡터를 사용한다. 세포로 비-바이러스 벡터의 전달을 증진시키기 위해, 핵산 또는 단백질을 세포 표면 항원에 결합하는 항체 또는 이들의 결합 절편과 컨쥬게이션(conjugate) 할 수 있다. 표적 항체 또는 이들의 절편을 또한 포함하는 리포솜을 본원에 기술된 방법에 사용할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 "바이러스 벡터"는 생체내 (in vivo ), 생체외 (ex vivo) 또는 시험관내로 숙주 세포로 전달될 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합적으로 생산된 바이러스 또는 바이러스 입자를 지칭한다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 포함한다. 유전자 전이가 레트로바이러스 벡터에 의해 매개되는 측면에서, 벡터 구조체는 레트로바이러스 게놈 또는 이들의 일부, 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

유전적으로 조작된 동물 숙주 세포는 도입된 유전자(들)의 구성적 또는 유발성 발현을 위해 생성된 발현 카세트의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 발현 카세트는 조절 요소, 예컨대 프로모터, 개시 코돈, 종결 코돈, 및 폴리아데닐화(polyadenylation) 신호를 포함할 수 있다. 요소를 관심 표면 단백질을 코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결(operably linked)할 수 있어, 유전자가 숙주 세포에서 작동 가능하게 된다 (예를 들어, 발현된다).

다양한 프로모터를 푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제 (뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같은 임의의 외인성 당단백질)의 발현에 사용할 수 있다. 단백질을 발현하는 데에 사용할 수 있는 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있으며, 시토메갈로바이러스(CMV) 중조기(intermediate early) 프로모터, 바이러스 LTR, 예컨대 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 시미안(simian) 바이러스 40(SV40) 조기(early) 프로모터, 이. 콜라이(E. coli) lac UV5 프로모터 및 헤르페스 심플렉스 tk 바이러스 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

조절가능 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 이러한 조절가능 프로모터는 테트라사이클린 억제자(tetR)를 사용하는 것을 포함한다 (문헌 [Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)]; 문헌 [Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998)]; 문헌 [Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]). 다른 시스템은 FK506 이량체, 아스트라디올을 사용하는 p65 또는 VP16, RU486, 디페놀 뮤리슬레론 또는 라파마이신을 포함한다. 유발성 시스템은 인비트로젠(Invitrogen), 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)로부터 입수가능하다.

일부 유발성 프로모터의 유효성은 시간에 걸쳐 증가할 수 있다. 이러한 경우, 실시자는 다수의 억제자를 일렬로 삽입함으로써 (예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 TetR와 연결된 TetR) 이러한 시스템의 유효성을 증진시킬 수 있다. 대안적으로, 실시자는 원하는 기능을 스크리닝하기 전에 3 일 이상을 기다릴 수 있다. 일부 침묵(silencing)이 발생할 수 있으나, 이를 적절한 수의 세포, 바람직하게는 1x10⁴이상, 보다 바람직하게는 1x10⁵이상, 보다 바람직하게는 1x10⁶이상, 및 훨씬 보다 바람직하게는 1x10⁷이상을 사용하여 최소화시킬 수 있다. 실시자는 이 시스템의 유효성을 증진시키는 알려진 수단에 의해 원하는 단백질의 발현을 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 사용한다. 문헌 [Loeb, V. E., et al., Human Gene Therapy 10:2295-2305 (1999)]; 문헌 [Zufferey, R., et al., J. of Virol. 73:2886-2892 (1999)]; 문헌 [Donello, J. E., et al., J. of Virol. 72:5085-5092 (1998)]을 참조한다.

본원에 기술된 방법을 실시하기에 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호, 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

조절 요소에 작동 가능하게 연결된 푸코시다제 유전자 및/또는 엔도글리코시다제 유전자 (뿐만 아니라 본원에 기술된 바와 같은 당단백질 유전자)를 포함하는 외인성 유전 물질은 기능하는 세포질 분자, 기능하는 에피솜 분자로서 세포안에 남아있을 수 있거나 이는 세포의 염색체 DNA로 통합될 수 있다. 외인성 유전 물질을 이것이 플라스미드 형태의 별도의 유전 물질로서 남아있는 세포로 도입할 수 있다. 대안적으로, 염색체로 통합될 수 있는 선형 DNA를 세포로 도입할 수 있다. DNA를 세포로 도입할 때, 염색체로 DNA 통합을 촉진하는 시약을 첨가할 수 있다. 통합을 촉진하는 데에 유용한 DNA 서열은 또한 DNA 분자에 포함될 수 있다. 대안적으로, RNA를 세포로 도입할 수 있다.

선택적 마커를 본원에 기술된 숙주 동물 세포로 원하는 트랜스진의 흡수를 관찰하는 데에 사용할 수 있다. 이들 마커 유전자를 임의의 프로모터 또는 유발성 프로모터의 제어 하에 둘 수 있다. 이들은 당업계에 알려져 있으며 자극, 예컨대 영양, 항생제, 등에 대한 세포 감수성을 변화시키는 유전자를 포함한다. 유전자는 neo, puro, tk, 다제내성(MDR), 등을 위한 것을 포함한다. 다른 유전자는 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 루시퍼라제, 및 LacZ를 쉽게 스크리닝 할 수 있는 단백질을 발현한다.

D. 변형된 글리코실화를 갖는 당단백질 생산

유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 (예를 들어, 내인성 또는 외인성) 당단백질을 생산하는 데에 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기에 기술된 조작된 숙주 동물 세포를 생산하는 데에 사용하기 위한 부모 숙주 세포는 이미 외인성 당단백질을 코딩하는 유전자(들)를 수반한다. 다른 실시양태에서, 관심 당단백질을 코딩하는 유전자 또는 다수의 유전자를 당업계에 알려지거나 본원에 기술된 방법에 의해 하나 이상의 푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제를 발현하는 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포로 도입할 수 있다.

관심 당단백질 및 하나 이상의 푸코시다제 및/또는 엔도글리코시다제 둘 다를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 이들 단백질을 발현하도록 하는 적절한 조건 하에서 배양할 수 있다. 세포 및/또는 배양 배지를 수집할 수 있으며 관심 당단백질을 통상적인 기술에 의해 세포 및/또는 배양 배지로부터 단리하고 정제할 수 있다. 이렇게 생산된 당단백질의 글리코실화 패턴을 통상적인 기술, 예를 들어, LC/MS/MS에 의해, 글리코실화의 변형을 확인하기 위해 결정할 수 있다.

일부 예에서, 관심 당단백질은 항체이다. 예시적인 항체는 앱식시맙(abciximab) (당단백질 IIb/IIIa; 심혈관 질환), 아달리무맙(adalimumab) (TNF-α, 다양한 자가-면역 장애, 예를 들어, 류마티스성 관절염), 알렘투주맙(alemtuzumab) (CD52; 만성 림프성 백혈병), 바실릭시맙(basiliximab) (IL-2Rα 수용체 (CD25); 이식 거부), 베바시주맙(bevacizumab) (혈관 내피 성장 인자 A; 다양한 암, 예를 들어, 대장암, 비-소세포 폐암, 교모세포종(glioblastoma), 신장암; 습성 연령-관련 황반변성(wet age-related macular degeneration)), 카투막소맙(catumaxomab), 세툭시맙(cetuximab) (EGF 수용체, 다양한 암, 예를 들어, 대장암, 두경부암), 세톨리주맙(certolizumab) (예를 들어, 세톨리주맙 페골(pegol)) (TNF 알파; 크론(Crohn)병, 류마티스성 관절염), 다클리주맙(Daclizumab) (IL-2Rα 수용체 (CD25); 이식 거부), 에쿨리주맙(eculizumab) (보체 단백질 C5; 발작성 야간혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)), 에팔리주맙(efalizumab) (CD11a; 건선(psoriasis)), 젬투주맙(gemtuzumab) (CD33; 급성 골수 백혈병 (예를 들어, 칼리케아미신(calicheamicin)과 함께)), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan) (CD20; 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma) (예를 들어, 이트륨-90 또는 인듐-111과 함께)), 인플릭시맙(infliximab) (TNF 알파; 다양한 자가면역 장애, 예를 들어, 류마티스성 관절염) 뮤로모납(Muromonab)-CD3 (T 세포 CD3 수용체; 이식 거부), 나탈리주맙(natalizumab) (알파-4(α4) 인테그린; 다발성 경화증, 크론병), 오말리주맙(omalizumab) (IgE; 알레르기-관련 천식), 팔리비주맙(palivizumab) (RSV F 단백질의 에피토프; 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus) 감염), 파니투무맙(panitumumab) (EGF 수용체; 암, 예를 들어, 대장암), 라니비주맙(ranibizumab) (혈관 내피 성장 인자 A; 습성 연령-관련 황반변성), 리툭시맙 (CD20; 비-호지킨 림프종), 토시투모맙(tositumomab) (CD20; 비-호지킨 림프종), 트라스투주맙(trastuzumab) (ErbB2; 유방암)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 예에서, 관심 당단백질은 시토카인이다. 예는 인터페론(예를 들어, IFN-α, INF-β, 또는 INF-γ), 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12), 및 콜로니 자극 인자 (예를 들어, G-CSF, GM-CSF, M-CSF)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. IFN은 예를 들어, 인터페론 알파 2a 또는 인터페론 알파 2b일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mott HR and Campbell ID. "Four-helix bundle growth factors and their receptors: protein-protein interactions." Curr Opin Struct Biol. 1995 Feb;5(1):114-21]; 문헌 [Chaiken IM, Williams WV. "Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines : towards de novo mimetics design." Trends Biotechnol. 1996 Oct;14(10):369-75]; 문헌 [Klaus W, et al., "The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution". J. Mol Biol., 274(4):661-75, 1997]을 특정 이들 시토카인의 추가적인 논의에 대해 참조한다.

관심 단백질은 또한 하나 이상의 상기 언급된 시토카인과 유사한 구조를 갖는 시토카인 단백질일 수 있다. 예를 들어, 시토카인은 IL-6 클래스 시토카인, 예컨대 백혈병 억제 인자 (LIF) 또는 온코스타틴(oncostatin) M일 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 자연에서 GP130 신호 도입 서브유닛을 포함하는 수용체와 결합하는 것이다. 다른 관심 4-헬릭스 다발 단백질은 성장 호르몬(GH), 프로락틴(PRL), 및 태반 락토겐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 조혈 자극제, 예를 들어, 역시 4-헬릭스 다발 시토카인인 (EPO)이다. 일부 실시양태에서, 조혈 자극제는 EPO 변이체(variant), 예를 들어, 5 개의 N-연결 탄수화물 사슬(둘 초과의 재조합 HuEPO)을 함유하도록 조작된, 신규 조혈 자극 단백질(NESP)로 명명된 다베포에틴 알파이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 5 개의 헬릭스를 포함한다. 예를 들어, 단백질은 (이해될 바와 같이) 종종 4-헬릭스 다발 시토카인으로 분류되는 인터페론 베타, 예를 들어, 인터페론 베타-1a 또는 인터페론 베타-1b일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, 또는 IL-15이다. 예를 들어, 문헌 [Hunter, CA, Nature Reviews Immunology 5, 521-531, 2005]을, 특정 시토카인의 논의에 대해 참조한다. 또한 문헌 [Paul, WE (ed.), Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6th ed., 2008]을 참조한다.

이에 더해, 관심 단백질은 미국 식품의약국(US Food & Drug Administration) (또는 동등한 규제 기구, 예컨대 유럽 의약품 평가 기관(European Medicines Evaluation Agency))에 의해 인간의 질환 또는 장애를 치료하는 데에 사용하기 위해 승인된 단백질일 수 있다. 이러한 단백질은 페길화된(PEGylated) 버전이 임상 시험에서 시험되고(거나) 판매 승인된 것일 수 있거나 아닐 수 있다. 일부 예에서, 관심 단백질은 아바타셉트(abatacept), 엔타네르셉트(entanercept), IL-2-Fc 융합 단백질, CD80-Fc 융합 단백질, 및 PDL1-Fc 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는 Fc-융합 단백질이다.

나아가, 관심 단백질은 신경영양 인자, 즉, 신경 계통 세포(본원에서 사용된, 신경 전구 세포, 뉴론, 및 아교 세포, 예를 들어, 성상세포, 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte), 미세아교세포를 포함하는 용어)의 생존, 발달 및/또는 기능을 촉진하는 인자일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표적 단백질은 신경돌기 성장을 촉진하는 인자이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 섬모 신경영양 인자 (CNTF; 4-헬릭스 다발 단백질) 또는 이들의 유사체, 예컨대 C 말단의 15 아미노산 말단절단(truncation) 및 두 아미노산 치환을 갖는 변형된 버전의 인간 섬모 신경영양 인자인 악소카인(Axokine)이며, 시험관내 및 생체내 분석에서의 CNTF보다 3 내지 5 배 강하며 개선된 안정성 성질을 갖는다.

대안적으로, 관심 단백질은 효소, 예를 들어, 대사 또는 다른 생리학적 과정에 중요한 효소일 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 효소 또는 다른 단백질의 결핍은 다양한 질환을 일으킬 수 있다. 이러한 질환은 탄수화물 대사, 아미노산 대사, 유기산 대사, 포르피린 대사, 퓨린 또는 피리미딘 대사, 리소좀 저장 장애, 혈액 응고, 등의 결함과 연관된 질환을 포함한다. 예는 파브리(Fabry)병, 고셔(Gaucher)병, 폼페(Pompe)병, 아데노신 데아미나제 결핍, 아스파라기나제 결핍, 포르피린증, 혈우병, 및 유전성 혈관부종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 응고 또는 응집 인자(예를 들어, 인자 VII, VIIa, VIII 또는 IX)이다. 다른 실시양태에서, 단백질은 탄수화물 대사, 아미노산 대사, 유기산 대사, 포르피린 대사, 퓨린 또는 피리미딘 대사, 및/또는 리소좀 저장에서 역할을 하는 효소이며, 효소의 외인성 투여가 질환을 적어도 일부 경감시킨다.

나아가, 관심 단백질은 호르몬, 예컨대 인슐린, 성장 호르몬, 황체형성 호르몬, 여포-자극 호르몬, 및 갑상선-자극 호르몬일 수 있다. 관심 단백질은 또한 아드레노메둘린(adrenomedullin)(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동성 인자, 골 형태형성 단백질(BMP), 뇌-유도 신경영양 인자(BDNF), 상피 성장 인자(EGF), 에리트로포이에틴(EPO) 섬유아세포 성장 인자(FGF), 아교 세포주-유도 신경영양 인자(GDNF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자-9(GDF9), 치유(healing) 인자, 간세포 성장 인자(HGF) 간세포암(hepatoma)-유도 성장 인자(HDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 이동-자극 인자(MSF), 미오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF) 및 다른 뉴로트로핀(neurotrophin), 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 태반 성장 인자(PGF)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 성장 인자일 수 있다.

추가적인 부연설명 없이, 당업자가 상기 설명에 기반하여 본 발명을 그의 최대한도로 활용할 수 있음이 이해된다. 따라서, 다음의 구체적인 실시양태는, 단지 예시적이고, 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 나머지를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개문헌은 본원에 참조된 대상 또는 목적을 위해 참조로서 포함된다.

실시예

방법

i. 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제를 생산하는 발현 벡터의 제작.

푸코시다제 또는 엔도글리코시다제에 대한 발현 벡터를 제작하기 위해, 푸코시다제 또는 엔도글리코시다제 유전자를 통상적인 기술에 의해 단리하였으며 햄스터 세포의 코돈 사용에 기반한 코돈 최적화를 실시하였다. 합성 유전자는 진아트 코포레이션(GeneArt Corp.)에 의해 제조되었으며 pcDNA3.1 B(-) Myc-His 벡터(인비트로젠, 미국)의 제한 부위 Bgl II/EcoR I로 클로닝하였다 (도 2a). 알파-푸코시다제의 발현 카세트는, 5'에서 3'까지, 코작 서열, Igk 선도 서열, 푸코시다제의 코딩 서열, 및 His-태그를 코딩하는 서열을 포함한다 (도 2b). 엔도글리코시다제의 발현 카세트는, 5'에서 3'까지, 코작 서열, Igk 선도 서열, 엔도글리코시다제의 코딩 서열, 및 Flag 태그를 코딩하는 서열을 포함한다 (도 2b).

ii. 탈푸코실화된 항체의 제조

항체 생산 세포주를 8 mM L-글루타민 및 1:100 희석된 응집방지제(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국)가 보충된 CD 포티(forti)CHO™ 배지인 완전 배지에서 0.3 내지 3.0 × 10⁶ 생존가능 세포/mL로 유지하였다. 세포를 8 % CO₂ 인큐베이터에서 130 내지 150 rpm의 진탕 플랫폼(shaking platform) 설정으로 유지하였다.

탈푸코실화된 항체를 생산하기 위해, 상기에 언급된 항체-생산 세포를, 제조사의 프로토콜에 따라 프리스타일맥스(FreeStyleMAX) 시약(라이프 테크놀로지스, 미국)에 의해 상기에 기술된 알파-푸코시다제를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 4 g/L의 글루코스를 포함하는 배지에 배양하였으며 배지를 하루 걸러 바꿔주었다. 세포 생존율이 70 % 미만으로 떨어질 때 세포를 회수하였다. 정화된(Clarified) 배양 상등액을 수집하였으며 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

iii. 항체의 글리코실화 분석

본원에 기술된 방법에 따라 제조한 재조합 항체를 환원시키고, 알킬화시키고 37 ℃에서 25 mM 중탄산암모늄 완충액 (pH~8)의 존재 하에서 트립신으로 밤새 소화하였다. PNG아제(PNGase) F 용액(3 μL, 로슈(Roche))을 200 μL의 소화된 샘플에 첨가하고, 혼합물을 추가의 16 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 방출된 글리칸을 셉-팩(Sep-Pak)® C18 카트리지(워터스(Waters))를 사용하여 펩티드로부터 분리하였다. 셉-팩 C18을 아세토니트릴로, 이후 물로 세척하였다. PNG아제F 소화된 샘플을 카트리지에 로딩하였으며, 펩티드가 셉-팩 C18에 결합된 채 남아있는 동안, 방출된 글리칸을 1 % 에탄올로 용출시켰다. 방출된 단백질 올리고당을 먼저 다공질 그래파이트 탄소 컬럼(파이넥서스(PhyNexus))을 사용하여 정제하였으며, 이후 과메틸화(permethylated)시켰다. 모든 질량 분석 실험은 나노-전자분무 공급원으로 직접적인 주입을 통해 오비트랩 퓨전 트리브리드(Orbitrap Fusion Tribrid) 질량 분석기를 사용하여 수행하였다.

결과

1. 단당 ( GlcNAc ) 당형태를 갖는 항체 h4B12 , 리툭시맙 , 및 오말리주맙의 생산

단당류 당변이체(glycovariant)를 푸코시다제 절단 반응에 의해 상기 언급된 이-당(di-sugar) 변이체로부터 만들 수 있었다. LC/MS/MS에 의한 글리콜-펩티드 분석 및 여러 입수가능한 효소로부터의 검색은, 최적화된 절단 반응 조건으로, α-1,6-푸코시다제를 사용하여 효율적인 탈푸코시드화(de-fucosidation)를 달성할 수 있으며, 더 높은 절단 효율이 더 낮은 NF/N 비와 연관됨을 나타내었다. 대안적으로, 단당 당변이체를, 엔도글리코시다제(엔도 S) 및 α-1,6-푸코시다제를 포함하는 서열에 합쳐진 두 반응 효소로 얻을 수 있다. 얻어진 단일-GlcNAc 당변이체가 도 3a에서 보여진다.

결과는 엔도-S가, 본원에 기술된 조작된 CHO 세포에서 생산된 h4B12, 리툭시맙, 및 오말리주맙의 중쇄의 N-연결 글리칸을 >90 % 제거하였음을 보여준다. 다섯 개의 상이한 유형의 푸코시다제: FUCA1, FUCA2, 크리세툴루스 그리세우스 푸코시다제, 알파-L-1, 크리세오박테리움 메닝고셉티쿰 α1,6-푸코시다제, 및 BF3242의 탈푸코실화능은, 각 푸코시다제를 발현하는 CHO 세포에서 생산된 h4B12 항체와 관련하여 각각 5.8 %, 9.1 %, 17.7 %, 11.5 및 68 %이다 (도 3b). 효소의 발현은 도 3c에서 보여진 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.

2-데옥시-2-플루오로 L-푸코스는 플루오린화 푸코스 유사체이다. 이것은 푸코실트랜스퍼라제의 기질-기반 억제물질(inhibitor)을 생성하도록 숙주 세포 내에서 대사될 수 있다. 일시적으로 푸코시다제 BF3242 및 엔도-S를 발현하는 항체-생산 CHO 세포를 배양할 때, CHO 세포에서 생산된 항체에 연결된 99.89 %의 N-글리칸은 단일글리코실화된다 (GlcNAc-Ig-Fc) (도 3d).

리툭시맙을 생산하는 CHO-35D6 세포를 BF3242 및 엔도-S을 위한 발현 벡터로 안정 형질감염시켰다. 세포를 100 내지 400 μg/ml G418의 존재 하에서 배양하였다. 이렇게 생산된 항체는 17 내지 19 %의 GlcNAc-Ig-Fc를 함유한다(도 4a).

효소 발현을 도 4b에서 보여진 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.

유사한 결과를 푸코시다제 및 엔도 S 둘 다를 발현하도록 조작된 CHO 세포에서 생산된 오말리주맙에서 관찰하였다.

이러한 효율은 균일한 글리칸 형태를 갖는 항체의 제조에 있어서의 트랜스글리코실화에 대한 중요한 단계를 나타낸다.

다른 실시양태

본 명세서에 개시된 모든 특징을 임의의 조합으로 합칠 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징을 동일한, 동등한, 또는 유사한 목적을 수행하는 대안적인 특징에 의해 대체할 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 오직 동등하거나 유사한 특징의 포괄적인 시리즈의 예일 뿐이다.

상기 설명으로부터, 당업자는 쉽게 본 발명의 필수적인 특성을 확인할 수 있으며, 이들의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 본 발명을, 다양한 용도 및 조건에 이를 적응시키도록 다양한 변화 및 변형을 행할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태가 또한 본 청구항에 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Fountain Biopharma Inc. <120> METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS WITH CONTROLLED GLYCAN FORM <130> F0720.70001WO00 <150> US 61/954,337 <151> 2014-03-17 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Gln Pro Pro Arg Arg Tyr Thr Pro Asp Trp Pro Ser 20 25 30 Leu Asp Ser Arg Pro Leu Pro Ala Trp Phe Asp Glu Ala Lys Phe Gly 35 40 45 Val Phe Ile His Trp Gly Val Phe Ser Val Pro Ala Trp Gly Ser Glu 50 55 60 Trp Phe Trp Trp His Trp Gln Gly Glu Gly Arg Pro Gln Tyr Gln Arg 65 70 75 80 Phe Met Arg Asp Asn Tyr Pro Pro Gly Phe Ser Tyr Ala Asp Phe Gly 85 90 95 Pro Gln Phe Thr Ala Arg Phe Phe His Pro Glu Glu Trp Ala Asp Leu 100 105 110 Phe Gln Ala Ala Gly Ala Lys Tyr Val Val Leu Thr Thr Lys His His 115 120 125 Glu Gly Phe Thr Asn Trp Pro Ser Pro Val Ser Trp Asn Trp Asn Ser 130 135 140 Lys Asp Val Gly 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aaaagctggt gtatgccatc ttcctgaagt ggcctacctc cggccagctg 1200 ttcctgggcc accctaaggc tatcctgggc gccaccgaag tgaaactgct gggccatgga 1260 cagcccctga actggatctc cctggaacag aacggcatca tggtggaact gccccagctg 1320 accatccatc agatgccctg caaatggggc tgggccctgg ccctgaccaa cgtgatccac 1380 catcaccacc accactga 1398 <210> 5 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Lys Ser Ser Arg Arg Tyr Asp Pro Thr Trp Glu Ser 20 25 30 Leu Asp Arg Arg Pro Leu Pro Ser Trp Phe Asp Gln Ala Lys Phe Gly 35 40 45 Ile Phe Ile His Trp Gly Val Phe Ser Val Pro Ser Phe Gly Ser Glu 50 55 60 Trp Phe Trp Trp Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Arg Pro Lys Phe Val Asp 65 70 75 80 Phe Met Asn Asn Asn Tyr Pro Pro Gly Phe Lys Tyr Glu Asp Phe Gly 85 90 95 Val Leu Phe Thr Ala Lys Phe Phe Asn Ala Ser Gln Trp Ala Asp Ile 100 105 110 Leu Gln Ala Ser Gly Ala Lys Tyr Leu Val Leu Thr Ser Lys His His 115 120 125 Glu Gly Phe 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acaactaccc ccctggcttt aagtacgagg acttcggcgt gctgttcacc 300 gccaagttct tcaacgcctc ccagtgggcc gacatcctgc aggcttccgg cgctaagtac 360 ctggtgctga cctccaagca ccacgagggc tttaccctgt ggggctccga gtactcctgg 420 aactggaacg ccgtggacga gggccctaag cgggacatcg tgaaagaact gaaggtggcc 480 atcaccaaga acaccgacct gagattcggc ctgtactact ccctgttcga gtggttccac 540 cccctgtttc tggaagataa gctgtccagc ttccagaagc ggcagttccc catctccaag 600 atgctgcccg agctgtacga gctcgtgaac aagtaccagc ctgacatcct gtggaccgac 660 ggggatggtg gcgcccctga cagatactgg aactctaccg gcttcctggc ctggctgtac 720 aacgagtccc ctgtgcggaa caccgtcgtg accaacgaca gatggggcgc tggctccatc 780 tgcaagcacg gcggctacta cacctgttcc gaccggtaca accccggcca tctgctgcct 840 cacaagtggg agaactgcat gacaatcgac cagttctcct ggggctaccg gcgcgaggcc 900 gtgatctctg actacctgac catcgaggaa ctcgtgaagc agctggtgga aaccgtggcc 960 tgtggcggca acctgctgat gaacatcggc cctaccctgg acggcatcat ccccgtgatc 1020 ttcgaggaac ggctgcggca gatgggcatg tggctgaaag tgaacggcga ggccatctac 1080 gagacacagc cttggcggtc ccagaacgac accgccacac ctgacgtgtg gtacacctac 1140 aagcccgaag agaagatcgt gtacgccatc ttcctgaagt ggcccgtgtc cagagagctg 1200 tttctggaac agcccatcgg ctccctgggc gagacagaag tggctctgct gggcgagggc 1260 aagcctctga cctggacctc cctgaagccc aatggcatca tcgtggaact gccccagctg 1320 accctgcacc agatgccctg taaatggggc tggaccctgg ccctgaccaa cgtgacccac 1380 caccaccatc accactga 1398 <210> 7 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 7 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys His Asn Val Ser Glu Gly Tyr Glu Lys Pro Ala Asp 20 25 30 Pro Leu Val Val Gln Asn Leu Glu Gln Trp Gln Asp Leu Lys Phe Gly 35 40 45 Leu Phe Met His Trp Gly Thr Tyr Ser Gln Trp Gly Ile Val Glu Ser 50 55 60 Trp Ser Leu Cys Pro Glu Asp Glu Ser Trp Thr Gln Arg Lys Pro Glu 65 70 75 80 His Gly Lys Ser Tyr Asn Glu Tyr Val Lys Asn Tyr Glu Asn Leu Gln 85 90 95 Thr Thr Phe Asn Pro Val Gln Phe Asn Pro Gln Lys Trp Ala Asp Ala 100 105 110 Thr Lys Lys Ala Gly Met Lys 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acctgaagtt cggcctgttc atgcactggg gcacctactc ccagtggggc 180 atcgtggaat cctggtccct gtgccctgag gacgagtctt ggacccagcg gaagcctgag 240 cacggcaagt cctacaacga gtacgtgaag aactacgaga acctgcagac caccttcaac 300 cccgtgcagt tcaaccccca gaagtgggcc gacgccacca agaaagccgg catgaaatac 360 gtggtgttca ccaccaagca ccacgacggc ttcgccatgt tcgacaccaa gcagtccgac 420 tacaagatca cctcctccaa gacccccttc agcaagaacc ccaaggccga cgtggccaaa 480 gagattttca acaccttccg ggacaacggc ttccggatcg gcgcctactt ctccaagcct 540 gactggcact ccgacgacta ctggtggtcc tacttcccac ccaaggaccg gaacgtgaac 600 tacgaccctc agaaataccc cgccagatgg gagaacttca agaagttcac cttcaatcag 660 ctgaacgaga tcaccagcaa ctacggcaag atcgacatcc tgtggctgga cggcggatgg 720 gtgcgaccct tccacaccat cgaccccaac atcgagtggc agcggaccat caaggtggaa 780 caggacatcg acatggacaa gatcggcacc atggcccgga agaaccagcc cggcatcatc 840 atcgtggacc ggaccgtgcc tggcaagtgg gagaattacg tgacccccga gcaggccgtg 900 cctgagcatg ccctgtctat cccttgggag tcctgtatca caatgggcga cagcttctcc 960 tacgtgccca acgacaacta caagtcctcc cagaagatca tcgagacact gatcaggatc 1020 atctccagag gcggcaacta cctgatgaat atcgcccctg gccccaacgg cgactacgac 1080 gctgtggtgt acgagcggct gaaagaaatc tccggctgga tggataagaa ccagtccgcc 1140 gtgtttacca cccgggctct ggccccttac cacgagtccg acttctacta cacccagtcc 1200 aaggacggaa agatcgtgaa cgtgttccac atctccgaga agtccaacta ccaggccccc 1260 tccgagctgt ccttcagcat ccccgagaac atcaacccca agaccgtgaa ggtgctgggc 1320 atctccagcc agatcaagtg gaagaagaag ggcaacaaga tccacgtgca gctgcccgag 1380 gaacggacca agctgaacta ctccaccgtg atccagatca cccagcacca ccaccatcac 1440 cactga 1446 <210> 9 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 9 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Gln Gln Lys Tyr Gln Pro Thr Glu Ala Asn Leu Lys 20 25 30 Ala Arg Ser Glu Phe Gln Asp Asn Lys Phe Gly Ile Phe Leu His Trp 35 40 45 Gly Leu Tyr Ala Met Leu Ala Thr Gly Glu Trp Thr Met Thr Asn Asn 50 55 60 Asn Leu Asn Tyr Lys Glu Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Gly Phe Tyr Pro 65 70 75 80 Ser Lys Phe Asp Ala Asp Lys Trp Val Ala Ala Ile Lys Ala Ser Gly 85 90 95 Ala Lys Tyr Ile Cys Phe Thr Thr Arg His His Glu Gly Phe Ser Met 100 105 110 Phe Asp Thr Lys Tyr Ser Asp Tyr Asn Ile Val Lys Ala Thr Pro Phe 115 120 125 Lys Arg Asp Val Val Lys Glu Leu Ala Asp Ala Cys Ala Lys His Gly 130 135 140 Ile Lys Leu His Phe Tyr Tyr Ser His Ile Asp Trp Tyr Arg Glu Asp 145 150 155 160 Ala Pro Gln Gly Arg Thr Gly Arg Arg Thr Gly Arg Pro Asn Pro Lys 165 170 175 Gly Asp Trp Lys Ser Tyr Tyr Gln Phe Met Asn Asn Gln Leu Thr Glu 180 185 190 Leu Leu Thr Asn Tyr Gly Pro Ile Gly Ala Ile Trp Phe Asp Gly Trp 195 200 205 Trp Asp Gln Asp Ile Asn Pro Asp Phe Asp Trp Glu Leu Pro Glu Gln 210 215 220 Tyr Ala Leu Ile His Arg Leu Gln Pro Ala Cys Leu Val Gly Asn Asn 225 230 235 240 His His Gln Thr Pro Phe Ala Gly Glu Asp Ile Gln Ile Phe Glu Arg 245 250 255 Asp Leu Pro Gly Glu Asn Thr Ala Gly Leu Ser Gly Gln Ser Val Ser 260 265 270 His Leu Pro Leu Glu Thr Cys Glu Thr Met Asn Gly Met Trp Gly 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tcttcctgca ctggggcctg tacgccatgc tggctactgg cgagtggacc 180 atgaccaaca acaacctgaa ctacaaagag tacgctaagc tggctggcgg cttctacccc 240 tccaagttcg acgccgacaa atgggtggcc gccatcaagg cctctggcgc caagtacatc 300 tgcttcacca cccggcacca cgagggcttc tccatgttcg acaccaagta ctccgactac 360 aacatcgtga aggccacccc cttcaagcgg gacgtcgtga aagagctggc cgacgcctgc 420 gctaagcacg gcatcaagct gcacttctac tactcccaca tcgactggta cagagaggac 480 gccccccagg gcagaaccgg cagaagaaca ggcagaccca accccaaggg cgactggaag 540 tcctactacc agtttatgaa caaccagctg accgagctgc tgaccaacta cggccccatc 600 ggcgccattt ggttcgacgg gtggtgggac caggacatca accccgactt cgactgggag 660 ctgcccgagc agtacgccct gatccacaga ctgcagcccg cctgtctcgt gggcaacaac 720 caccaccaga ccccctttgc cggcgaggac atccagattt tcgagcggga tctgcccggc 780 gagaacaccg ctggactgtc tggccagtcc gtgtcccatc tgcccctgga aacctgcgag 840 acaatgaacg gcatgtgggg ctacaagatc accgaccaga actacaagtc caccaagaca 900 ctgatccact acctcgtgaa agccgctggc aaggacgcca acctgctgat gaacatcggc 960 ccccagcctg acggcgagct gcctgaagtg gctgtgcagc ggctgaaaga agtgggagag 1020 tggatgtcta agtacggcga gactatctac ggcaccagag gcggcctggt ggcccctcat 1080 gattggggcg tgaccaccca gaagggcaac aagctgtacg tgcacatcct gaacctgcag 1140 gacaaggccc tgttcctgcc catcgtggac aagaaagtga agaaagccgt ggtgttcgcc 1200 gacaagaccc ccgtgcggtt caccaagaac aaagagggca tcgtgctgga actggccaag 1260 gtgcccaccg acgtggacta cgtggtggaa ctgaccatcg accaccatca tcaccaccac 1320 tga 1323 <210> 11 <211> 920 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 11 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Ala Gln His Asp Ser Leu Ile Arg Val Lys Ala Glu 20 25 30 Asp Lys Val Val Gln Thr Ser Pro Ser Val Ser Ala Ile Asp Asp Leu 35 40 45 His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Lys Glu Gly Leu Ser 50 55 60 Lys Ala Gly Glu Val Pro Glu Lys Leu Lys Asp Ile Leu Ser Lys Ala 65 70 75 80 Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Lys Val Leu Ala Glu Met Lys Val Pro 85 90 95 Glu Lys Ile Ala Met Lys Pro Leu Lys Gly Pro Leu Tyr Gly Gly Tyr 100 105 110 Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro Ala Glu Lys Asp Lys 115 120 125 Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val Asp Leu Ala Phe Val 130 135 140 Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe Trp Gln Glu Leu Ala 145 150 155 160 Thr Lys His Val Pro Thr Leu Asn Lys Gln Gly Thr Arg Val Ile Arg 165 170 175 Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp His Ser Gly Ile Ala 180 185 190 Glu Asp Thr Gln Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu Gly Asn Lys Ala Leu 195 200 205 Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asn Leu Asp Gly 210 215 220 Leu Asp Val Asp Ile Glu Arg Asp Ser Ile Pro Lys Val Asn Gly Lys 225 230 235 240 Glu Ser Asn Glu Asn Ile Gln Arg Ser Ile Ala Val Phe Glu Glu Ile 245 250 255 Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Ala Asp Lys Ser Arg Leu Phe Ile 260 265 270 Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro Leu Ile Glu Arg Gly 275 280 285 Ala Pro Tyr Ile Asp Leu Leu Leu Val Gln Val Tyr Gly Ile Gln Gly 290 295 300 Glu Lys Gly Asp Trp Asp Pro Val Ala Arg Lys Pro Glu Lys Thr Met 305 310 315 320 Glu Glu Arg Trp Glu Ser Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu Gln Tyr 325 330 335 Met Val Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gly Ser Gly Asn Leu 340 345 350 Trp Tyr Asp Ile Asn Glu Arg Lys Asp Asp His Asn Pro Leu Asn Ser 355 360 365 Glu Ile Ala Gly Thr Arg Ala Glu Arg Tyr Ala Lys Trp Gln Pro Lys 370 375 380 Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp 385 390 395 400 Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Val Ser Asp Asp Glu Lys Arg Thr 405 410 415 Asn Lys Ala Ile Lys Asp Ile Thr Asp Gly Ile Val Lys Ser Asp Tyr 420 425 430 Lys Val Ser Lys Ala Leu Lys Lys Val Met Glu Asn Asp Lys Ser Tyr 435 440 445 Glu Leu Ile Asp Gln Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg Glu Ala 450 455 460 Val Ile Ala Gln Val Gly Ser Arg Arg Gly Asp Leu Glu Arg Phe Asn 465 470 475 480 Gly Thr Leu Arg Leu Asp Asn Pro Asp Ile Lys Ser Leu Glu Gly Leu 485 490 495 Asn Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Leu Glu Leu Ile Gly Leu Ser Gln 500 505 510 Ile Thr Lys Leu Asp Ser Ser Val Leu Pro Glu Asn Ile Lys Pro Thr 515 520 525 Lys Asp Thr Leu Val Ser Val Leu Glu Thr Tyr Lys Asn Asp Asp Arg 530 535 540 Lys Glu Glu Ala Lys Ala Ile Pro Gln Val Ala Leu Thr Ile Ser Gly 545 550 555 560 Leu Thr Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu Ala Gly Phe Asp Arg Asp Ser 565 570 575 Leu Ala Gly Ile Asp Ala Ala Ser Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val Asp 580 585 590 Leu Ser Lys Asn Lys Leu Asp Leu Ala Ala Gly Thr Glu Asn Arg Gln 595 600 605 Ile Phe Asp Val Met Leu Ser Thr Val Ser Asn Arg Val Gly Ser Asn 610 615 620 Glu Gln Thr Val Thr Phe Asp His Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr Pro 625 630 635 640 Asn Thr Tyr Gly Thr Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Gly Glu Gly Lys 645 650 655 Ile Asp Leu Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln Gly 660 665 670 Thr Leu Ile Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Glu Gln Leu 675 680 685 Ile Ala Gly Arg Arg Phe Val Asp Pro Gly Tyr Ala Tyr Lys Asn Phe 690 695 700 Ala Val Thr Tyr Asp Ala Tyr Lys Val Arg Val Thr Asp Ser Thr Leu 705 710 715 720 Gly Val Thr Asp Glu Lys Lys Leu Ser Thr Ser Lys Glu Glu Thr Tyr 725 730 735 Lys Val Glu Phe Phe Ser Pro Thr Asn Gly Thr Lys Pro Val His Glu 740 745 750 Ala Lys Val Val Val Gly Ala Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu Ala 755 760 765 Ala Gly Ala Thr Val Ile Lys Ser Asp Ser His Glu Asn Ala Lys Lys 770 775 780 Val Phe Asp Gly Ala Ile Glu Tyr Asn Pro Leu Ser Phe Ser Ser Lys 785 790 795 800 Thr Ser Ile Thr Phe Glu Phe Lys Glu Pro Gly Leu Val Lys Tyr Trp 805 810 815 Arg Phe Phe Asn Asp Ile Thr Arg Lys Asp Asp Tyr Ile Lys Glu Ala 820 825 830 Lys Leu Glu Ala Phe Val Gly His Leu Glu Asp Asp Ser Lys Val Lys 835 840 845 Asp Ser Leu Glu Lys Ser Thr Glu Trp Val Thr Val Ser Asp Tyr Ser 850 855 860 Gly Glu Ala Gln Glu Phe Ser Gln Pro Leu Asp Asn Ile Ser Ala Lys 865 870 875 880 Tyr Trp Arg Val Thr Val Asp Thr Lys Gly Gly Arg Tyr Ser Ser Pro 885 890 895 Ser Leu Pro Glu Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Pro Leu Thr His 900 905 910 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 915 920 <210> 12 <211> 2763 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 12 atgagagtgc ctgctcagct gctgggcctg ctgctgctgt ggctgcctgg tgctagatgc 60 gcccagcacg actccctgat cagagtgaag gccgaggaca aggtggtgca gacctcccct 120 tccgtgtccg ccatcgacga cctgcactac ctgtccgaga actccaagaa agagttcaaa 180 gagggcctgt ccaaggccgg cgaggtgccc gaaaagctga aggacatcct gagcaaggct 240 cagcaggccg acaagcaggc caaggtgctg gccgagatga aggtgccaga gaagatcgcc 300 atgaagcccc tgaagggccc tctgtacggc ggctacttca gaacctggca cgacaagacc 360 tccgaccccg ccgagaagga caaagtgaac tccatgggcg agctgcccaa agaggtggac 420 ctggccttcg tgttccacga ctggaccaag gactactccc tgttctggca ggaactggcc 480 accaagcacg tgcccaccct gaacaagcag ggcaccagag tgatccggac aatcccctgg 540 cggtttctgg ctggcggcga ccactctgga atcgccgagg atacccagaa gtaccccaac 600 acccccgagg gcaacaaggc cctggctaag gccatcgtgg acgagtacgt gtacaagtac 660 aacctggacg gcctggacgt ggacatcgag cgggactcca tccctaaagt gaacggcaaa 720 gagtccaacg agaacatcca gcggtctatc gccgtgttcg aggaaatcgg caagctgatc 780 ggccccaagg gcgccgacaa gtcccggctg ttcatcatgg actccaccta catggccgat 840 aagaaccccc tgatcgagag aggcgcccct tacatcgatc tgctgctggt gcaggtgtac 900 ggcatccagg gcgagaaggg cgattgggac cctgtggccc ggaagcctga aaagaccatg 960 gaagagagat gggagtccta ctccaagtac atccggcccg agcagtatat ggtgggattc 1020 agcttctacg aggaaaacgc cggctccggc aacctgtggt acgacatcaa cgagcggaag 1080 gacgaccaca accctctgaa ctccgagatc gccggcaccc gggctgagag atacgctaag 1140 tggcagccca agaccggcgg agtgaagggc ggcatcttct cctacgccat cgatagggat 1200 ggcgtggccc accagcctaa gaaggtgtcc gacgacgaga agcggaccaa caaggctatc 1260 aaggacatca ccgacggcat cgtgaagtcc gactacaagg tgtccaaagc cctgaagaaa 1320 gtgatggaaa acgacaagag ctacgagctg atcgaccaga aggacttccc cgataaggcc 1380 ctgcgcgagg ccgtgattgc tcaagtgggc tccagacggg gcgacctgga aagattcaac 1440 ggcaccctgc ggctggacaa ccccgacatc aagtccctgg aaggcctgaa caaactgaag 1500 aagctggcca agctggaact gatcggactg tcccagatca caaagctgga ctcctccgtg 1560 ctgcctgaga acatcaagcc caccaaggac accctggtgt ccgtgctgga aacctacaag 1620 aacgacgacc ggaaagagga agccaaggcc atccctcagg tggccctgac catctctggc 1680 ctgaccggcc tgaaagagct gaatctggcc ggcttcgacc gggattccct ggctggaatc 1740 gatgccgcct ctctgacctc cctggaaaaa gtggacctgt ctaagaacaa gctggatctg 1800 gctgccggca ccgagaaccg gcagatcttc gacgtgatgc tgtccaccgt gtccaacaga 1860 gtgggcagca acgagcagac cgtgaccttc gaccaccaga agcccaccgg ccactaccct 1920 aacacctacg gcaccacctc cctgagactg cctgtgggcg agggcaagat cgacctgcag 1980 tcccagctgc tgttcggcac cgtgaccaac cagggcacac tgatcaactc cgaggccgat 2040 tacaaggcct accaggaaca gctgatcgct gggcggagat tcgtggaccc tggctacgct 2100 tacaagaact tcgccgtgac ctacgatgcc tacaaagtgc gcgtgaccga ctccaccctg 2160 ggcgtgacag acgaaaagaa gctgagcacc tccaaagaag agacatacaa ggtggaattc 2220 ttctccccca ccaatggcac caagcctgtg catgaggcta aggtggtcgt gggcgccgag 2280 aaaaccatga tggtcaacct ggccgctggc gccaccgtga tcaagtctga ctctcacgag 2340 aatgccaaaa aggtgttcga cggcgccatc gagtacaatc ctctgagctt ctccagcaag 2400 accagcatca ccttcgagtt taaagaaccc ggcctcgtga aatactggcg gttcttcaac 2460 gatatcaccc gcaaggacga ctacatcaaa gaggctaagc tggaagcctt cgtgggccat 2520 ctggaagatg actccaaagt gaaggactct ctggaaaagt ccaccgagtg ggtcaccgtg 2580 tctgactact ctggcgaggc ccaggaattc tcccagcccc tggacaacat ctccgccaag 2640 tattggagag tgaccgtgga caccaagggc ggacggtaca gctctcctag cctgcccgag 2700 ctgcagatcc tgggctacag actgcctctg acccacgact ataaggacga cgacgacaaa 2760 tga 2763

Claims

유전적으로 조작된 숙주 동물 세포가 변형된 글리코실화를 갖는 당단백질을 생산하는, 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 발현하는 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제1항에 있어서, 푸코시다제가 포유류 푸코시다제 또는 박테리아 푸코시다제인, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 엔도글리코시다제가 엔도 S 효소인, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질을 더 발현하는, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제4항에 있어서, 당단백질이 외인성인, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제4항 또는 제5항에 있어서, 당단백질이 항체, Fc-융합 단백질, 시토카인, 호르몬, 성장 인자, 또는 효소인, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제6항에 있어서, 당단백질이 항체인, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 세포가 포유류 세포인, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제8항에 있어서, 포유류 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 쥐 골수종 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 하이브리도마 세포, 나말와 세포, 배아 줄기 세포, 또는 수정란인, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 푸코시다제 및 엔도글리코시다제를 둘 다 발현하는, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 인간 FUCA1, 인간 FUCA2, 크리세툴루스 그리세우스 푸코시다제, 알파-L-1 크리세오박테리움 메닝고셉티쿰 α1,6-푸코시다제, 또는 박테리아 푸코시다제 BF3242, 및 (ii) 엔도 S를 발현하는, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포.
(a) 당단백질, 및 (b) 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 발현하는 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포를 제공하는 단계;
숙주 동물 세포를 당단백질 및 푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 생산하도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
당단백질을 단리하기 위해 숙주 동물 세포 또는 배양 상등액을 수집하는 단계
를 포함하는, 탈푸코실화된 당단백질의 생산 방법.
제12항에 있어서, 푸코시다제가 포유류 푸코시다제 또는 박테리아 푸코시다제인 생산 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 엔도글리코시다제가 엔도 S 효소인 생산 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질이 외인성인 생산 방법.
제15항에 있어서, 당단백질이 항체, Fc-융합 단백질, 시토카인, 호르몬, 성장 인자, 또는 효소인 생산 방법.
제16항에 있어서, 당단백질이 항체인 생산 방법.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포가 포유류 세포인 생산 방법.
제18항에 있어서, 포유류 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 쥐 골수종 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 하이브리도마 세포, 나말와 세포, 배아 줄기 세포, 또는 수정란인 생산 방법.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포가 푸코시다제 및 엔도글리코시다제를 둘 다 발현하는 것인 생산 방법.
제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질을 단리하는 단계를 더 포함하는 생산 방법.
제12항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질의 글리코실화 패턴을 분석하는 단계를 더 포함하는 생산 방법.
푸코시다제, 엔도글리코시다제, 또는 둘 다를 총괄적으로 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 동물 세포로 도입하는 단계를 포함하는, 제1항의 유전적으로 조작된 숙주 동물 세포의 제조 방법.
제23항에 있어서, 당단백질을 코딩하는 발현 벡터를 동물 세포로 도입하는 단계를 더 포함하는 제조 방법.