ES2904993T3 - Métodos para la producción de glicoproteínas recombinantes con glicosilación modificada - Google Patents

Abstract

Una célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente, que comprende genes exógenos que codifican una fucosidasa, y una enzima Endo S, en la que la célula de mamífero hospedante modificada produce glicoproteínas que tienen glicosilación modificada en comparación con las glicoproteínas producidas por una contraparte de tipo salvaje.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la producción de glicoproteínas recombinantes con glicosilación modificada

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La glicosilación es importante para las estructuras y funciones de las glicoproteínas. Por ejemplo, se sugiere que la glicosilación afecta el plegamiento de proteínas (y de este modo, la estabilidad) y/o las bioactividades de las glicoproteínas. La demanda de glicoproteínas recombinantes terapéuticas, especialmente de anticuerpos monoclonales, ha crecido con fuerza en las últimas dos décadas. Estudios anteriores revelan que las diferencias menores en las estructuras de glicanos de las glicoproteínas recombinantes pueden afectar las actividades biológicas y la farmacocinética de las glicoproteínas. Por ejemplo, la darbepoetina alfa es un análogo hiperglicosilado de la eritropoyetina humana recombinante (EPO) con dos sitios de glicosilación adicionales ligados a N. La N-glicosilación adicional aumenta el porcentaje de masa molecular en hidratos de carbono y prolonga significativamente la vida media sérica de la darbepoetina alfa, en comparación con la EPO endógena y recombinante. Además, para un anticuerpo terapéutico cuya eficacia se basa principalmente en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), se han desarrollado enfoques tanto quimioenzimáticos como genéticos para eliminar el resto de fucosa central en la porción Fc para aumentar la potencia del efecto de ADCC inducido por ese anticuerpo.

Sin embargo, los métodos actualmente disponibles para remodelar la glicosilación a menudo requieren múltiples enzimas y/o múltiples etapas, lo que da como resultado costes elevados para fabricar proteínas recombinantes modificadas por glicoingeniería.

La solicitud de patente europea EP 2141237 describe un método para la producción de proteínas recombinantes de glicoingeniería en células que también están diseñadas para expresar una fucosilasa o un mutante de la misma (por ejemplo, FUCA1). La solicitud de patente internacional WO2008/071418 da a conocer que los anticuerpos desglicosilados por endoglicosilasa EndoS perdieron su bioactividad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se basa en el desarrollo de células de animal hospedantes modificadas genéticamente capaces de producir glicoproteínas tales como anticuerpos que tienen glicosilación modificada, incluyendo desfucosilación y monoglicosilación. Tales células de animal hospedantes se diseñaron para expresar en exceso tanto i) una o más de las fucosidasas como ii) endoglicosidasas. Inesperadamente, los cambios en la maquinaria de glicosilación celular en las células de animal hospedantes no dieron como resultado efectos adversos en relación con la síntesis de glicoproteínas y el crecimiento de la célula hospedante.

Por consiguiente, la presente descripción proporciona una célula de animal hospedante modificada por ingeniería genética que es una célula de mamífero, que expresa excesivamente una fucosidasa y una endoglicosidasa, que es la enzima Endo S, en la que la célula de animal hospedante produce glicoproteínas que tienen glicosilación modificada en comparación con la contraparte de tipo salvaje. En algunos ejemplos, la fucosidasa puede ser una fucosidasa de mamífero o una fucosidasa bacteriana, por ejemplo FUCA1 humana, FUCA2 humana, fucosidasa de Cricetulus griseus, a1,6-fucosidasa de Chryseobacterium meningosepticum alfa-L-1, o fucosidasa bacteriana BF3242. Alternativamente o además, la endoglicosidasa puede ser una enzima Endo S, por ejemplo una enzima que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. En algunos ejemplos, la célula de animal hospedante modificada genéticamente expresa (i) FUCA1 humana, FUCA2 humana, fucosidasa de Cricetulus griseus, a1,6-fucosidasa de Chryseobacterium meningosepticum alfa-L-1, o fucosidasa bacteriana BF3242, y (ii) una Endo S (tal como SEQ ID NO: 11).

La célula de animal hospedante modificada genéticamente descrita aquí puede expresar además una glicoproteína, que puede ser exógena (no expresada en la célula animal nativa del mismo tipo). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo, una proteína de fusión Fc, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento, o una enzima.

En la invención, la célula de animal hospedante modificada genéticamente es una célula de mamífero, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de mieloma de rata, una célula de riñón de cría de hámster (BHK), una célula de hibridoma, o una célula de Namalwa.

También se describen aquí métodos para producir glicoproteínas que tienen patrones de glicosilación modificados (por ejemplo, desfucosilada o monoglicosilada) usando cualquiera de las células de animal hospedantes modificadas por ingeniería genética descritas aquí. El método puede comprender (i) proporcionar una célula de animal hospedante que exprese (a) una glicoproteína y (b) una fucosidasa y una endoglicosidasa; cultivar la célula de animal hospedante en condiciones que permitan producir la glicoproteína y la fucosidasa y la endoglicosidasa; (ii) recolectar la célula de animal hospedante o el sobrenadante de cultivo para aislar la glicoproteína, y opcionalmente (iii) aislar la glicoproteína. El método puede comprender además (iv) analizar el patrón de glicosilación de la glicoproteína.

Además, la presente descripción presenta un método para preparar cualquiera de las células de animal hospedantes modificadas genéticamente descritas aquí. El método puede comprender (i) introducir en una célula de animal uno o más vectores de expresión, que codifican colectivamente una fucosidasa y una endoglicosidasa, y opcionalmente (ii) introducir en la célula de animal un vector de expresión que codifica una glicoproteína. El método puede comprender además seleccionar células transformadas que expresan la fucosidasa, la endoglicosidasa, y la glicoproteína.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una ilustración esquemática que muestra las estructuras de diversos N-glicanos. A: glicanos ligados a N típicos de glicoproteínas. B: N-glicanos desfucosilados. C: N-glicanos que tienen un azúcar reductor mono-Nacetilglucosamina (monoglicosilado).

La Figura 2 es una ilustración esquemática de un vector de expresión ejemplar para producir una fucosidasa. A: mapa de un plásmido ejemplar que porta un gen de fucosidasa. B: un casete de expresión ejemplar para expresar una fucosidasa o una endoglicosidasa S.

La Figura 3 incluye diagramas que muestran la producción de anticuerpo h4B12 de monoazúcar afucosilado homogéneo (GlcNAc) mediante la expresión transitoria del anticuerpo en células hospedantes modificadas para expresar una fucosidasa y/o una endoglicosidasa. A: una ilustración esquemática de la producción de anticuerpos de monoazúcar afucosilado homogéneo (GlcNAc). B: un gráfico que muestra la glicosilación del anticuerpo 4B12 producido en células hospedantes diseñadas para expresar FUCA1 humana, FUCA2 humana, fucosidasa de C. griseus, o a1,6-fucosidasa de Chryseobacterium meningosepticum alfa-L-1, según se determina por LC/MS/MS. C: diagrama que muestra la expresión transitoria de una fucosidasa o una endoglicosidasa como se indica en las células CHO detectadas por transferencia Western. D: un gráfico que muestra el anticuerpo h4B12 producido en células CHO que expresan una fucosidasa o una endoglicosidasa como se indica, teniendo el anticuerpo una glicoforma de monoazúcar libre de fucosa homogéneo (GlcNAc), según se determina por LC/MS/MS. Un N-glicano homogéneo se refiere a la relación de ese N-glicano (por ejemplo, un N-glicano afucosilado) a los N-glicanos totales en una glicoproteína tal como un anticuerpo.

La Figura 4 incluye diagramas que muestran la producción de anticuerpo rituximab de monoazúcar afucosilado homogéneo (GlcNAc) mediante la expresión transitoria del anticuerpo en células hospedantes modificadas para expresar una fucosidasa y/o una endoglicosidasa. A: un gráfico que muestra la glicosilación del anticuerpo rituximab producido en células hospedantes modificadas para expresar diversas fucosidasas o endoglicosidasas como se indica. B: un diagrama que muestra la expresión transitoria de una fucosidasa (carril izquierdo) o una endoglicosidasa (carril derecho) como se indica en las células CHO según se detecta mediante transferencia Western.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se describen aquí células de mamífero hospedantes modificadas genéticamente capaces de producir glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteínas exógenas tales como anticuerpos) que tienen patrones de glicosilación modificados (por ejemplo, patrones de N-glicosilación modificados tales como N-glicanos desfucosilados o glicanos de monoazúcar). Dichas células de animal hospedantes se manipulan para expresar en exceso tanto una fucosidasa como una endoglicosidasa. Opcionalmente, la célula de animal hospedante también se modifica por ingeniería genética para expresar una glicoproteína exógena tal como un anticuerpo.

La estructura de un N-glicano complejo típico de glicoproteínas producidas en células de mamíferos de tipo salvaje se muestra en la Figura 1, panel A. Tal N-glicano complejo contiene un resto de Nacetilglucosamina (GlcNAc) unido a un sitio de glicosilación, un resto de asparagina (Asn) de una glicoproteína, y un resto de fucosa se une a ese resto de Asn en un enlace alfa1,6. Las células de animal hospedantes modificadas genéticamente son capaces de producir glicoproteínas (por ejemplo, endógenas o exógenas) que tienen N-glicanos modificados, tales como N-glicanos desfucosilados, un ejemplo de los cuales se proporciona en la Figura 1, panel B, y N-glicanos monoazucarados, en los que solo un resto de GlcNAc se une al sitio de glicosilación de Asn (Figura 1, panel C). Una glicoproteína que tiene glicosilación modificada se refiere a una glicoproteína que porta al menos un glicano, tal como un N-glicano, que es estructuralmente diferente de los glicanos de la glicoproteína producida en la contraparte de tipo salvaje de la célula de animal hospedante modificada genéticamente. Un glicano desfucosilado se refiere a cualquier glicano que no contenga un resto de alfa1,6-fucosa o ningún resto de fucosa.

A. Fucosidasa

Una fucosidasa es una enzima que rompe la fucosa. Esta enzima escinde los restos de fucosa de un glicano que los contiene. La fucosidasa para uso en la fabricación de células de animal hospedantes modificadas genéticamente puede ser una fucosidasa de mamífero o una fucosidasa bacteriana. En algunas realizaciones, la fucosidasa es una enzima de tipo salvaje, por ejemplo una enzima bacteriana de tipo salvaje o una enzima de mamífero de tipo salvaje, tal como una enzima humana. Las secuencias de aminoácidos y las secuencias nucleotídicas codificantes de una serie de fucosidasas ejemplares se proporcionan a continuación (incluyendo una etiqueta His en el término C):

Fucosidasa humana FUCA1:

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCQPPRRYTPDWPSLDSRPLPAWFDEAKFGVFIHWGVFSVPA WGSEWFWWHWQGEGRPQYQRFMRDNYPPGFSYADFGPQFTARFFHPEEWADLFQAAGAKY WLTTKHHEGFTNWPSPVSWNWNSKDVGPHRDLVGELGTALRKRNIRYGLYHSLLEWFHP LYLLDKKNGFKTQHFVSAKTMPELYDLVNSYKPDLIWSDGEWECPDTYWNSTNFLSWLYN DSPVKDEVWNDRWGQNCSCHHGGYYNCEDKFKPQSLPDHKWEMCTSIDKFSWGYRRDMA LSDVTEESEIISELVQTVSLGGNYLLNIGPTKDGLIVPIFQERLLAVGKWLSINGEAIYA SKPWRVQWEKNTTSVWYTSKGSAVYAIFLHWPENGVLNLESPITTSTTKITMLGIQGDLK WSTDPDKGLFISLPQLPPSAVPAEFAWTIKLTGVKHHHHHH

Secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 2; codones optimizados)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgc cagccccctcggagatacacccctgactggccttccctggactccagacctctgcccgct tggtttgacgaggccaagttcggcgtgttcatccactggggcgtgttctccgtgcctgcc tggggctctgagtggttctggtggcattggcagggcgagggcagacctcagtaccagcgg ttcatgcgggacaactacccccctggcttctcctacgccgacttcggccctcagttcacc gcccggttcttccaccctgaggaatgggccgatctgttccaggccgctggcgccaaatac gtggtgctgaccaccaagcaccacgagggcttcaccaactggccctcccccgtgtcctgg aactggaactctaaggacgtgggcccccaccgggatctcgtgggagaactgggaaccgcc ctgcggaagcggaacatcagatacggcctgtaccactccctgctggaatggttccacccc ctgtacctgctggacaagaagaacggcttcaagacccagcacttcgtgtccgccaagacc atgcccgagctgtacgacctcgtgaactcctacaagcccgacctgatttggagcgacggc gagtgggagtgccccgacacctattggaactccaccaactttctgtcctggctgtacaac gactcccctgtgaaggacgaggtggtcgtgaacgacagatggggccagaactgctcctgt caccacggcggctactacaactgcgaggacaagttcaagccccagtccctgcccgaccac aagtgggagatgtgcacctctatcgacaagttctcctggggctaccggcgggacatggcc ctgtctgatgtgaccgaggaatccgagatcatctccgagctggtgcagaccgtgtccctg ggcggcaactacctgctgaacatcggccctaccaaggacggcctgatcgtgcccatcttc caggaacggctgctggccgtgggcaagtggctgtctatcaacggcgaggccatctacgcc tccaagccttggcgagtgcagtgggagaagaacaccacctccgtgtggtacacctccaag ggctctgccgtgtacgccatcttcctgcactggcccgagaacggcgtgctgaacctggaa tcccccatcaccacctctaccaccaagatcaccatgctgggcatccagggcgacctgaag tggtccaccgaccctgacaagggcctgttcatctccctgccccagctgcctccttccgct gtgcctgctgagttcgcctggaccatcaagctgaccggcgtgaagcaccaccaccatcac cattga

Fucosidasa humana FUCA2:

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCHSATRFDPTWESLDARQLPAWFDQAKFGIFIHWGVFSVPS FGSEWFWWYWQKEKIPKYVEFMKDNYPPSFKYEDFGPLFTAKFFNANQWADIFQASGAKY IVLTSKHHEGFTLWGSEYSWNWNAIDEGPKRDIVKELEVAIRNRTDLRFGLYYSLFEWFH PLFLEDESSSFHKRQFPVSKTLPELYELVNNYQPEVLWSDGDGGAPDQYWNSTGFLAWLY NESPVRGTWTNDRWGAGSICKHGGFYTCSDRYNPGHLLPHKWENCMTIDKLSWGYRREA GISDYLT IEELVKQLVETVSCGGNLLMNIGPTLDGTISWFEERLRQMGSWLKVNGEAIY ETHTWRSQNDTVTPDVWYTSKPKEKLVYAIFLKWPTSGQLFLGHPKAILGATEVKLLGHG QPLNWISLEQNGIMVELPQLTIHQMPCKWGWALALTNVIHHHHHH

Secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 4; codones optimizados)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgc cactccgccaccagattcgaccccacctgggagtctctggacgccagacagctgcccgct tggtttgaccaggccaagttcggcatcttcatccactggggcgtgttctccgtgcccagc ttcggctctgagtggttctggtggtactggcagaaagagaagatccccaaatacgtggag ttcatgaaggacaactacccccccagctttaagtacgaggacttcggccccctgttcacc gccaagttcttcaacgccaaccagtgggccgacatcttccaggcctctggcgccaagtac atcgtgctgacctccaagcaccacgagggcttcaccctgtggggctccgagtactcctgg aactggaacgccatcgacgagggccccaagcgggacatcgtgaaagaactggaagtggcc atccggaaccggaccgacctgagattcggcctgtactactccctgttcgagtggttccac cccctgtttctggaagatgagtcctccagcttccacaagcggcagttccccgtgtccaag accctgcccgagctgtacgagctcgtgaacaactaccagcccgaggtgctgtggagtgac ggggatggtggtgcccccgatcagtactggaactctaccggcttcctggcctggctgtac aacgagtctcctgtgcggggcaccgtcgtgaccaacgatagatggggcgctggctccatc tgcaagcacggcggcttctacacctgttccgaccggtacaaccccggccatctgctgcct cacaagtgggagaactgcatgaccatcgacaagctgtcctggggctacagaagagaggcc ggcatctccgactacctgacaatcgaggaactcgtgaagcagctggtggaaaccgtgtcc tgcggcggcaacctgctgatgaacatcggccctaccctggacggcaccatctccgtggtg ttcgaggaacggctgcggcagatgggctcctggctgaaagtgaacggcgaggccatctac gagacacacacctggcggtcccagaacgacaccgtgacccctgacgtgtggtacaccagc aagcccaaagaaaagctggtgtatgccatcttcctgaagtggcctacctccggccagctg ttcctgggccaccctaaggctatcctgggcgccaccgaagtgaaactgctgggccatgga cagcccctgaactggatctccctggaacagaacggcatcatggtggaactgccccagctg accatccatcagatgccctgcaaatggggctgggccctggccctgaccaacgtgatccac catcaccaccaccactga

Fucosidasa de Cricetulus griseus (hámster chino) FUCA2

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCKSSRRYDPTWESLDRRPLPSWFDQAKFGIFIHWGVFSVPS FGSEWFWWYWQKEKRPKFVDFMNNNYPPGFKYEDFGVLFTAKFFNASQWADILQASGAKY LVLTSKHHEGFTLWGSEYSWNWNAVDEGPKRDIVKELKVAITKNTDLRFGLYYSLFEWFH PLFLEDKLSSFQKRQFPISKMLPELYELVNKYQPDILWTDGDGGAPDRYWNSTGFLAWLY NESPVRNTWTNDRWGAGSICKHGGYYTCSDRYNPGHLLPHKWENCMTIDQFSWGYRREA VISDYLTIEELVKQLVETVACGGNLLMNIGPTLDGIIPVIFEERLRQMGMWLKVNGEAIY ETQPWRSQNDTATPDVWYTYKPEEKIVYAIFLKWPVSRELFLEQPIGSLGETEVALLGEG KPLTWTSLKPNGIIVELPQLTLHQMPCKWGWTLALTNVTHHHHHH

Secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 6; codones optimizados)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgc aagtcctctcggagatacgaccccacctgggagtccctggacagaaggcctctgcccagt tggttcgaccaggccaagttcggcatcttcatccactggggcgtgttctccgtgcccagc ttcggctctgagtggttctggtggtactggcagaaagagaagcggcccaagttcgtggac ttcatgaacaacaactacccccctggctttaagtacgaggacttcggcgtgctgttcacc gccaagttcttcaacgcctcccagtgggccgacatcctgcaggcttccggcgctaagtac ctggtgctgacctccaagcaccacgagggctttaccctgtggggctccgagtactcctgg aactggaacgccgtggacgagggccctaagcgggacatcgtgaaagaactgaaggtggcc atcaccaagaacaccgacctgagattcggcctgtactactccctgttcgagtggttccac cccctgtttctggaagataagctgtccagcttccagaagcggcagttccccatctccaag atgctgcccgagctgtacgagctcgtgaacaagtaccagcctgacatcctgtggaccgac ggggatggtggcgcccctgacagatactggaactctaccggcttcctggcctggctgtac aacgagtcccctgtgcggaacaccgtcgtgaccaacgacagatggggcgctggctccatc tgcaagcacggcggctactacacctgttccgaccggtacaaccccggccatctgctgcct cacaagtgggagaactgcatgacaatcgaccagttctcctggggctaccggcgcgaggcc gtgatctctgactacctgaccatcgaggaactcgtgaagcagctggtggaaaccgtggcc tgtggcggcaacctgctgatgaacatcggccctaccctggacggcatcatccccgtgatc ttcgaggaacggctgcggcagatgggcatgtggctgaaagtgaacggcgaggccatctac gagacacagccttggcggtcccagaacgacaccgccacacctgacgtgtggtacacctac aagcccgaagagaagatcgtgtacgccatcttcctgaagtggcccgtgtccagagagctg tttctggaacagcccatcggctccctgggcgagacagaagtggctctgctgggcgagggc aagcctctgacctggacctccctgaagcccaatggcatcatcgtggaactgccccagctg accctgcaccagatgccctgtaaatggggctggaccctggccctgaccaacgtgacccac caccaccatcaccactga

a l ,6-fucosidasa de Chryseobacterium meningosepticum

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCHNVSEGYEKPADPLWQNLEQWQDLKFGLEMHWGTYSQWG IVESWSLCPEDESWTQRKPEHGKSYNEYVKNYENLQTTFNPVQFNPQKWADATKKAGMKY WFTTKHHDGFAMFDTKQSDYKITSSKTPFSKNPKADVAKEIFNTFRDNGFRIGAYFSKP DWHSDDYWWSYFPPKDRNVNYDPQKYPARWENFKKFTFNQLNEITSNYGKIDILWLDGGW VRPFHTIDPNIEWQRTIKVEQDIDMDKIGTMARKNQPGIIIVDRTVPGKWENYVTPEQAV

PEHALSIPWESCITMGDS FSYVPNDNYKSSQKIIETLIRIISRGGNYLMNIAPGPNGDYD AWYERLKEISGWMDKNQSAVFTTRALAPYHESDFYYTQSKDGKIVNVFHISEKSNYQAP SELSFSIPENINPKTVKVLGISSQIKWKKKGNKIHVQLPEERTKLNYSTVIQITQHHHHH H

Secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 8; codones optimizados)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggcgctagatgc cacaatgtgtccgagggctacgagaagcccgccgaccctctggtggtgcagaacctggaa cagtggcaggacctgaagttcggcctgttcatgcactggggcacctactcccagtggggc atcgtggaatcctggtccctgtgccctgaggacgagtcttggacccagcggaagcctgag cacggcaagtcctacaacgagtacgtgaagaactacgagaacctgcagaccaccttcaac cccgtgcagttcaacccccagaagtgggccgacgccaccaagaaagccggcatgaaatac gtggtgttcaccaccaagcaccacgacggcttcgccatgttcgacaccaagcagtccgac tacaagatcacctcctccaagacccccttcagcaagaaccccaaggccgacgtggccaaa gagattttcaacaccttccgggacaacggcttccggatcggcgcctacttctccaagcct gactggcactccgacgactactggtggtcctacttcccacccaaggaccggaacgtgaac tacgaccctcagaaataccccgccagatgggagaacttcaagaagttcaccttcaatcag ctgaacgagatcaccagcaactacggcaagatcgacatcctgtggctggacggcggatgg gtgcgacccttccacaccatcgaccccaacatcgagtggcagcggaccatcaaggtggaa caggacatcgacatggacaagatcggcaccatggcccggaagaaccagcccggcatcatc atcgtggaccggaccgtgcctggcaagtgggagaattacgtgacccccgagcaggccgtg cctgagcatgccctgtctatcccttgggagtcctgtatcacaatgggcgacagcttctcc tacgtgcccaacgacaactacaagtcctcccagaagatcatcgagacactgatcaggatc atctccagaggcggcaactacctgatgaatatcgcccctggccccaacggcgactacgac gctgtggtgtacgagcggctgaaagaaatctccggctggatggataagaaccagtccgcc gtgtttaccacccgggctctggccccttaccacgagtccgacttctactacacccagtcc aaggacggaaagatcgtgaacgtgttccacatctccgagaagtccaactaccaggccccc tccgagctgtccttcagcatccccgagaacatcaaccccaagaccgtgaaggtgctgggc atctccagccagatcaagtggaagaagaagggcaacaagatccacgtgcagctgcccgag gaacggaccaagctgaactactccaccgtgatccagatcacccagcaccaccaccatcac cactga

Fucosidasa bacteriana BF3242

Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9)

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCQQKYQPTEANLKARSEFQDNKFGIFLHWGLYAMLATGEWT MTNNNLNYKEYAKLAGGFYPSKFDADKWVAAIKASGAKYICFTTRHHEGFSMFDTKYSDY NIVKATPFKRDWKELADACAKHGIKLHFYYSHIDWYREDAPQGRTGRRTGRPNPKGDWK SYYQEMNNQLTELLTNYGPIGAIWFDGWWDQDINPDFDWELPEQYALIHRLQPACLVGNN HHQTPFAGEDIQIFERBLPGENTAGLSGQSVSHLPLETCETMNGMWGYKITDQNYKSTKT LIHYLVKAAGKDANLLMNIGPQPDGELPEVAVQRLKEVGEWMSKYGETIYGTRGGLVAPH DWGVTTQKGNKLYVHILNLQDKALFLPIVDKKVKKAWFADKTPVRFTKNKEGIVLELAK VPTDVDYWELTIDHHHHHH

Secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 10; codones optimizados)

atgagagtgcctgctcagctgctgggactgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgc

cagcagaagtaccagcccaccgaggccaacctgaaggccagatccgagttccaggacaac

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gctaagcacggcatcaagctgcacttctactactcccacatcgactggtacagagaggac

gccccccagggcagaaccggcagaagaacaggcagacccaaccccaagggcgactggaag

tcctactaccagtttatgaacaaccagctgaccgagctgctgaccaactacggccccatc

ggcgccatttggttcgacgggtggtgggaccaggacatcaaccccgacttcgactgggag

ctgcccgagcagtacgccctgatccacagactgcagcccgcctgtctcgtgggcaacaac

caccaccagaccccctttgccggcgaggacatccagattttcgagcgggatctgcccggc

gagaacaccgctggactgtctggccagtccgtgtcccatctgcccctggaaacctgcgag

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ctgatccactacctcgtgaaagccgctggcaaggacgccaacctgctgatgaacatcggc

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gtgcccaccgacgtggactacgtggtggaactgaccatcgaccaccatcatcaccaccac

tga

En algunas realizaciones, la fucosidasa puede ser una enzima (por ejemplo, una enzima de tipo salvaje) que comparte al menos 85% (por ejemplo, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) de identidad de secuencia en comparación con cualquiera de las fucosidasas ejemplares proporcionadas anteriormente (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9, así como otras fucosidasas descritas aquí).

El “porcentaje de identidad” de dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína descritas aquí. Cuando existen espacios entre dos secuencias, se puede utilizar Gapped BLAST, como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

Las fucosidasas de mamíferos que se pueden usar en la construcción de células de animal hospedantes modificadas genéticamente incluyen, pero no se limitan a, las descritas en los números de acceso de GenBank NP_114409.2, XP_003811598.1, AAH03060.1, EHH53333.1, XP_001127152.1, XP_010360962.1, XP_006084558.1, XP_004263802.1, XP_007171384.1, XP_006075254.1, XP_010982011.1, NP_001004218.1, y XP_010964137.1.

Las fucosidasas bacterianas que se pueden usar en la construcción de células de animal hospedantes modificadas genéticamente incluyen, pero no se limitan a, las descritas en los números de acceso de GenBank WP_008769537.1, WP_032568292.1, EYA08300.1, WP_005780841.1, EXY26528.1, WP_044654435.1, WP_029425671.1, WP_022470316.1, CDA84816.1, WP_004307183.1, y WP_008025871.1.

B. Endoglicosidasa

Una endoglicosidasa es una enzima que rompe los enlaces glicosídicos entre dos monómeros de azúcar en un glicano, liberando así oligosacáridos de glicoproteínas o glicolípidos. La endoglicosidasa para uso en la presente descripción (por ejemplo, una enzima de tipo salvaje) es endoglicosidasa S. En la siguiente tabla se proporcionan enzimas endoglicosidasas ejemplares:

Otras enzimas endoglicosidasas adecuadas incluyen aquellas que comparten al menos 85% (por ejemplo, 90%, 95%, 98% o 99%) de identidad de secuencia con una de las enzimas descritas aquí. Se espera que las enzimas que tienen una alta homología de secuencia (por ejemplo, al menos 85% de identidad de secuencia) con cualquiera de las endoglicosidasas enumeradas anteriormente posean la misma actividad biológica. Tales enzimas (por ejemplo, enzimas de tipo salvaje) se pueden recuperar de una base de datos de genes tal como GenBank utilizando una de las enzimas enumeradas anteriormente como consulta.

En la invención, la endoglicosidasa usada aquí es una enzima Endo S.

Endo S es una endoglicosidasa que escinde específicamente N-glicanos en los primeros restos de GlcNAc unidos a los sitios de glicosilación de Asn de los dominios Fc en moléculas de IgG nativas, lo que da como resultado moléculas de IgG monoglicosiladas, es decir, una molécula de IgG que tiene una única GlcNAc unida a un sitio de glicosilación de Asn. La secuencia de aminoácidos y la secuencia nucleotídica codificantes se proporcionan a continuación:

Secuencia de aminoácidos de Endo S (SEQ ID NO: 11):

MRVPAQLLGLLLLWLPGARCAQHDSLIRVKAEDKWQTSPSVSAIDDLHYLSENSKKEFK EGLSKAGEVPEKLKDILSKAQQADKQAKVLAEMKVPEKIAMKPLKGPLYGGYFRTWHDKI SDPAEKDKVNSMGELPKEVDLAFVFHDWIKDYSLFWQELATKHVPILNKQGTRVIRTIPW RFLAGGDHSGIAEDTQKYPNTPEGNKALAKAIVDEYVYKYNLDGLDVDIERDSIPKVNGK ESNENIQRSIAVFEEIGKLIGPKGADKSRLFIMDSTYMADKNPLIERGAPYIDLLLVQVY GIQGEKGDWDPVARKPEKTMEERWESYSKYIRPEQYMVGFSFYEENAGSGNLWYDINERK DDHNPLNSEIAGTRAERYAKWQPKTGGVKGGIFSYAIDRDGVAHQPKKYSDDEKRTNKAI KDITDGIVKSDYKVSKALKKVMENDKSYELIDQKDFPDKALREAVIAQVGSRRGDLERFN GTLRLDNPDIKSLEGLNKLKKLAKLELIGLSQITKLDSSVLPENIKPTKDTLVSVLETYK NDDRKEEAKAIPQVALTISGLTGLKELNLAGFDRDSLAGIDAñSLTSLEKVDLSKNKLDL AAGTENRQIFDVMLSTVSNRVGSNEQTVTFDHQKPTGHYPNTYGTTSLRLPVGEGKIDLQ SQLLFGTVTNQGTLINSEADYKAYQEQLIAGRRFVDPGYAYKNFAVTYDAYKVRVTDSTL GVTDEKKLSTSKEETYKVEFFSPTNGTKPVHEAKWVGAEKTMMVNLAAGATVIKSDSHE NAKKVFDGAIEYNPLSFSSKTSITFEFKEPGLVKYWRFFNDITRKDDYIKEAKLEAFVGH LEDDSKVKDSLEKSTEWVTVSDYSGEAQEFSQPLDNISAKYWRVTVDTKGGRYSSPSLPE LQILGYRLPLTHDYKDDDDK

Secuencia nucleotídica de Endo S (SEQ ID NO: 12; codones optimizados)

atgagagtgcctgctcagctgctgggcctgctgctgctgtggctgcctggtgctagatgc gcccagcacgactccctgatcagagtgaaggccgaggacaaggtggtgcagacctcccct tccgtgtccgccatcgacgacctgcactacctgtccgagaactccaagaaagagttcaaa gagggcctgtccaaggccggcgaggtgcccgaaaagctgaaggacatcctgagcaaggct cagcaggccgacaagcaggccaaggtgctggccgagatgaaggtgccagagaagatcgcc atgaagcccctgaagggccctctgtacggcggctacttcagaacctggcacgacaagacc tccgaccccgccgagaaggacaaagtgaactccatgggcgagctgcccaaagaggtggac ctggccttcgtgttccacgactggaccaaggactactccctgttctggcaggaactggcc accaagcacgtgcccaccctgaacaagcagggcaccagagtgatccggacaatcccctgg cggtttctggctggcggcgaccactctggaatcgccgaggatacccagaagtaccccaac acccccgagggcaacaaggccctggctaaggccatcgtggacgagtacgtgtacaagtac aacctggacggcctggacgtggacatcgagcgggactccatccctaaagtgaacggcaaa gagtccaacgagaacatccagcggtctatcgccgtgttcgaggaaatcggcaagctgatc ggccccaagggcgccgacaagtcccggctgttcatcatggactccacctacatggccgat aagaaccccctgatcgagagaggcgccccttacatcgatctgctgctggtgcaggtgtac ggcatccagggcgagaagggcgattgggaccctgtggcccggaagcctgaaaagaccatg gaagagagatgggagtcctactccaagtacatccggcccgagcagtatatggtgggattc agcttctacgaggaaaacgccggctccggcaacctgtggtacgacatcaacgagcggaag gacgaccacaaccctctgaactccgagatcgccggcacccgggctgagagatacgctaag

tggcagcccaagaccggcggagtgaagggcggcatcttctcctacgccatcgatagggat ggcgtggcccaccagcctaagaaggtgtccgacgacgagaagcggaccaacaaggctatc aaggacatcaccgacggcatcgtgaagtccgactacaaggtgtccaaagccctgaagaaa gtgatggaaaacgacaagagctacgagctgatcgaccagaaggacttccccgataaggcc ctgcgcgaggccgtgattgctcaagtgggctccagacggggcgacctggaaagattcaac ggcaccctgcggctggacaaccccgacatcaagtccctggaaggcctgaacaaactgaag aagctggccaagctggaactgatcggactgtcccagatcacaaagctggactcctccgtg ctgcctgagaacatcaagcccaccaaggacaccctggtgtccgtgctggaaacctacaag aacgacgaccggaaagaggaagccaaggccatccctcaggtggccctgaccatctctggc ctgaccggcctgaaagagctgaatctggccggcttcgaccgggattccctggctggaatc gatgccgcctctctgacctccctggaaaaagtggacctgtctaagaacaagctggatctg gctgccggcaccgagaaccggcagatcttcgacgtgatgctgtccaccgtgtccaacaga gtgggcagcaacgagcagaccgtgaccttcgaccaccagaagcccaccggccactaccct aacacctacggcaccacctccctgagactgcctgtgggcgagggcaagatcgacctgcag tcccagctgctgttcggcaccgtgaccaaccagggcacactgatcaactccgaggccgat tacaaggcctaccaggaacagctgatcgctgggcggagattcgtggaccctggctacgct tacaagaacttcgccgtgacctacgatgcctacaaagtgcgcgtgaccgactccaccctg ggcgtgacagacgaaaagaagctgagcacctccaaagaagagacatacaaggtggaattc ttctcccccaccaatggcaccaagcctgtgcatgaggctaaggtggtcgtgggcgccgag aaaaccatgatggtcaacctggccgctggcgccaccgtgatcaagtctgactctcacgag aatgccaaaaaggtgttcgacggcgccatcgagtacaatcctctgagcttctccagcaag accagcatcaccttcgagtttaaagaacccggcctcgtgaaatactggcggttcttcaac gatatcacccgcaaggacgactacatcaaagaggctaagctggaagccttcgtgggccat ctggaagatgactccaaagtgaaggactctctggaaaagtccaccgagtgggtcaccgtg tctgactactctggcgaggcccaggaattctcccagcccctggacaacatctccgccaag tattggagagtgaccgtggacaccaagggcggacggtacagctctcctagcctgcccgag ctgcagatcctgggctacagactgcctctgacccacgactataaggacgacgacgacaaa

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En algunas realizaciones, una enzima Endo S descrita aquí puede ser una enzima (por ejemplo, una enzima de tipo salvaje) que comparte al menos 85% (por ejemplo, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) de identidad de secuencia en comparación con SEQ ID NO: 11. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en los números de acceso de GenBank EQB24254.1, WP_037584019.1, WP_012679043.1, y ADC53484.1.

C. Células de animal hospedantes modificadas genéticamente

Las células de animal hospedantes descritas aquí se manipulan genéticamente para expresar en exceso una o más enzimas que tienen actividades modificadoras de glicanos específicas (por ejemplo, glicosidasa o glicol-transferasa). Una célula de animal hospedante modificada genéticamente es una célula de animal que porta materiales genéticos exógenos (no nativos), tales como genes exógenos que codifican una o más de las fucosidasa y endoglicosidasa descritas aquí. Una célula hospedante que expresa excesivamente una enzima se refiere a una célula hospedante modificada genéticamente que expresa la enzima en un nivel mayor (por ejemplo, 20%, 50%, 80%, 100%, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, 1.000 veces, 104 veces o 105 veces más alto) que el de la enzima en la contraparte de tipo salvaje de la célula hospedante, es decir, el mismo tipo de célula que no contiene la misma modificación genética que la célula hospedante modificada genéticamente. En algunas realizaciones, un gen que codifica una enzima exógena como se describe aquí puede introducirse en una célula de animal parental adecuada para producir la célula de animal hospedante modificada genéticamente descrita aquí. Una enzima exógena se refiere a una enzima que no existe en la célula parental utilizada para producir la célula de animal hospedante modificada.

Las células de animal hospedantes modificadas genéticamente como se describe aquí, que son capaces de producir glicoproteínas que tienen glicosilación modificada en comparación con la contraparte de tipo salvaje, pueden prepararse mediante la tecnología recombinante de rutina. En algunos casos, se puede insertar un promotor fuerte en dirección 5’ de un gen endógeno de fucosidasa y/o endoglicosidasa para mejorar su expresión. En otros casos, los materiales genéticos exógenos que codifican una o más fucosidasas y/o endoglicosidasas pueden introducirse en una célula hospedante parental para producir las células de animal hospedantes modificadas genéticamente como se describe aquí.

Un gen que codifica una fucosidasa o endoglicosidasa como se describe aquí se puede insertar en un vector de expresión adecuado (por ejemplo, un vector viral o un vector no viral) usando métodos bien conocidos en la técnica. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Por ejemplo, el gen y el vector pueden ponerse en contacto, en condiciones adecuadas, con una enzima de restricción para crear extremos complementarios en cada molécula que puedan emparejarse entre sí y unirse con una ligasa. Alternativamente, los enlazadores de ácido nucleico sintéticos pueden ligarse a los extremos de un gen. Estos enlazadores sintéticos contienen secuencias de ácido nucleico que corresponden a un sitio de restricción particular en el vector. En algunas realizaciones, el gen de la fucosidasa o endoglicosidasa está contenido en un casete de expresión que comprende uno o más de los siguientes elementos: una secuencia de Kozak y una secuencia de péptido señal, que se encuentran en el término N de la enzima, y una etiqueta proteica (por ejemplo, FLAG, etiqueta de His, incluyendo proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP), y glutationa-S-transferasa (GST)). La etiqueta proteica se puede ubicar en el término N o en el término C de la enzima. Véase, por ejemplo, Figura 2, panel B.

Además, el vector de expresión puede contener, por ejemplo, algunos o todos los siguientes: un gen marcador seleccionable, tal como el gen de neomicina para la selección de transfectantes estables o transitorios en células de mamífero; secuencias potenciadoras/promotoras del gen temprano inmediato del CMV humano para niveles elevados de transcripción; señales de terminación de la transcripción y de procesamiento del ARN de SV40 para la estabilidad del ARNm; orígenes de replicación del polioma SV40 y ColE1 para la replicación episomal adecuada; múltiples sitios de clonación versátiles; y promotores de ARN T7 y SP6 para la transcripción in vitro de ARN sentido y antisentido. Los vectores y métodos adecuados para producir vectores que contienen transgenes son bien conocidos y están disponibles en la técnica. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Si se van a usar dos o más enzimas en la construcción de las células de animal hospedantes descritas aquí, por ejemplo dos o más fucosidasas, dos o más endoglicosidasas, o una combinación de fucosidasa y endoglicosidasa, los genes que codifican las dos o más enzimas pueden insertarse en vectores de expresión separados o se pueden insertar en un vector de expresión común diseñado para producir múltiples proteínas.

Los vectores de expresión para producir la fucosidasa y/o endoglicosidasa pueden introducirse en células hospedantes parentales adecuadas, incluyendo, pero sin limitarse a, células de mieloma murino (por ejemplo, células NSO), células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (por ejemplo, HEK293), y células de retinoblastoma humano (por ejemplo, PER.C6). La selección de una línea celular hospedante adecuada, que está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica, dependería del equilibrio entre la necesidad de una alta productividad y la necesidad de producir el producto que tenga las propiedades deseadas.

En algunos casos, los vectores de expresión se pueden diseñar de manera que se puedan incorporar al genoma de las células mediante recombinación homóloga o no homóloga mediante métodos conocidos en la técnica. Los métodos para transferir vectores de expresión a las células hospedantes parentales incluyen, pero no se limitan a, transferencia de genes mediada por virus, transferencia mediada por liposomas, transformación, transfección y transducción, por ejemplo transferencia de genes mediada por virus, tal como el uso de vectores basados en virus de ADN tales como adenovirus, virus adenoasociados, y virus del herpes, así como vectores basados en retrovirus. Los ejemplos de modos de transferencia de genes incluyen, por ejemplo, ADN desnudo, precipitación con CaPO4, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección celular, y vectores virales, ADN asistido por adyuvantes, pistola de genes, catéteres. En un ejemplo, se usa un vector viral. Para mejorar el suministro de vectores no virales a una célula, el ácido nucleico o la proteína se pueden conjugar con anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen a antígenos de la superficie celular. En los métodos descritos aquí, pueden usarse liposomas que también incluyen un anticuerpo dirigido a diana o un fragmento del mismo.

Un “vector viral”, como se describe aquí, se refiere a un virus o una partícula viral producidos de manera recombinante que comprende un polinucleótido para ser administrado a una célula hospedante, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores retrovirales tales como vectores lentivirales, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, y similares. En aspectos en los que la transferencia génica está mediada por un vector retrovírico, una construcción de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma retroviral o parte del mismo, y un gen terapéutico.

Las células de animal hospedantes modificadas genéticamente pueden comprender el uso de un casete de expresión creado para la expresión constitutiva o inducible del gen o genes introducidos. Tal casete de expresión puede incluir elementos reguladores tales como un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, y una señal de poliadenilación. Los elementos se pueden unir operativamente al gen que codifica la proteína de superficie de interés de modo que el gen esté operativo (por ejemplo, se expresa) en las células hospedantes.

Puede usarse una variedad de promotores para la expresión de la fucosidasa y/o endoglicosidasa (así como cualquier glicoproteína exógena como se describe aquí). Los promotores que se pueden usar para expresar la proteína son bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, el promotor temprano intermedio del citomegalovirus (CMV), una LTR viral tal como la LTR del virus del sarcoma de Rous, la LTR del VIH, la LTR de1HTLV-1, el promotor temprano del virus del simio 40 (SV40), el promotor de E. coli lac UV5, y el promotor tk del virus del herpes simple.

También se pueden usar promotores regulables. Dichos promotores regulables incluyen los que utilizan el represor de tetraciclina (tetR) [Gossen, M., y Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]. Otros sistemas incluyen el dímero FK506, VP16 o p65 que usa astradiol, RU486, difenol murislerona, o rapamicina. Los sistemas inducibles están disponibles de Invitrogen, Clontech y Ariad.

La eficacia de algunos promotores inducibles se puede incrementar con el tiempo. En tales casos, la eficacia de tales sistemas se puede mejorar insertando múltiples represores en tándem, por ejemplo TetR ligado a un TetR por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). Alternativamente, se puede esperar al menos 3 días antes de evaluar la función deseada. Si bien puede ocurrir algo de silenciamiento, se puede minimizar usando un número adecuado de células, preferiblemente al menos 1x104, más preferiblemente al menos 1x105, aún más preferiblemente al menos 1x106, y aún más preferiblemente al menos 1x107. Para mejorar la eficacia de este sistema se puede mejorar la expresión de las proteínas deseadas por medios conocidos. Por ejemplo, utilizando el Elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). Véanse Loeb, V. E., et al., Human Gene Therapy 10:2295-2305 (1999); Zufferey, R., et al., J. of Virol. 73:2886-2892 (1999); Donello, J. E., et al., J. of Virol. 72:5085-5092 (1998).

Los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para practicar los métodos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a, señal de poliadenilación de colágeno I humano, señal de poliadenilación de colágeno II humano, y señal de poliadenilación de SV40.

El material genético exógeno que incluye el gen de la fucosidasa y/o el gen de la endoglicosidasa (así como un gen de la glicoproteína como se describe aquí) unido operativamente a los elementos reguladores puede permanecer presente en la célula como una molécula citoplásmica funcional, una molécula episomal funcional, o puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula. El material genético exógeno se puede introducir en las células en las que permanece como material genético separado en forma de plásmido. Alternativamente, se puede introducir en la célula ADN lineal, que puede integrarse en el cromosoma. Al introducir ADN en la célula, se pueden añadir reactivos que promueven la integración del ADN en los cromosomas. Las secuencias de ADN, que son útiles para promover la integración, también pueden incluirse en la molécula de ADN. Alternativamente, se puede introducir ARN en la célula.

Pueden usarse marcadores seleccionables para monitorizar la captación del transgén deseado en las células de animal hospedantes descritas aquí. Estos genes marcadores pueden estar bajo el control de cualquier promotor o un promotor inducible. Estos son conocidos en la técnica, e incluyen genes que cambian la sensibilidad de una célula a un estímulo tal como un nutriente, un antibiótico, etc. Los genes incluyen aquellos para neo, puro, tk, resistencia a múltiples fármacos (MDR), etc. Otros genes expresan proteínas que pueden detectarse fácilmente, tales como la proteína verde fluorescente (GFP), la proteína azul fluorescente (BFP), la luciferasa, y LacZ.

D. Producción de glicoproteínas con glicosilación modificada

Las células de animal hospedantes modificadas genéticamente pueden usarse para producir glicoproteínas (por ejemplo, endógenas o exógenas) que tienen patrones de glicosilación modificados. En algunas realizaciones, la célula hospedante parental que se utiliza para producir las células de animal hospedantes modificadas descritas anteriormente ya porta un gen o genes que codifican una glicoproteína exógena. En otras realizaciones, un gen o múltiples genes que codifican una glicoproteína de interés se pueden introducir en las células de animal hospedantes modificadas genéticamente que expresan una o más fucosidasa y/o endoglicosidasa mediante métodos conocidos en la técnica o descritos aquí.

Las células de animal hospedantes modificadas genéticamente capaces de producir tanto una glicoproteína de interés como una o más de las fucosidasas y endoglicosidasas pueden cultivarse en condiciones adecuadas que permitan la expresión de estas proteínas. Las células y/o el medio de cultivo se pueden recolectar, y la glicoproteína de interés puede aislarse y purificarse de las células y/o del medio de cultivo mediante tecnología de rutina. El patrón de glicosilación de la glicoproteína así producida puede determinarse mediante tecnología de rutina, por ejemplo LC/MS/MS, para confirmar la modificación de la glicosilación.

En algunos ejemplos, la glicoproteína de interés es un anticuerpo. Los anticuerpos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, abciximab (glicoproteína IIb/IIIa; enfermedad cardiovascular), adalimumab (TNF-a, diversos trastornos autoinmunes, por ejemplo artritis reumatoide), alemtuzumab (CD52; leucemia linfocítica crónica), basiliximab (receptor de IL-2Ra (CD25); rechazo de trasplante), bevacizumab (factor de crecimiento endotelial vascular A; diversos cánceres, por ejemplo cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, glioblastoma, cáncer de riñón; degeneración macular húmeda relacionada con la edad), catumaxomab, cetuximab (receptor de EGF, diversos cánceres, por ejemplo cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello), certolizumab (por ejemplo, certolizumab pegol) (TNF alfa; enfermedad de Crohn, artritis reumatoide), daclizumab (receptor IL-2Ra (CD25); rechazo de trasplante), eculizumab (proteína del complemento C5; hemoglobinuria paroxística nocturna), efalizumab (CD11a; psoriasis), gemtuzumab (CD33; leucemia mielógena aguda (por ejemplo, con caliqueamicina)), ibritumomab tiuxetan (CD20; linfoma no de Hodgkin (por ejemplo, con itrio-90 o indio-111)), infliximab (TNF alfa; diversos trastornos autoinmunes, por ejemplo artritis reumatoide), muromonab-CD3 (receptor de linfocitos T CD3; rechazo de trasplante), natalizumab (alfa-4 (a4) integrina; esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn), omalizumab (IgE; asma relacionada con la alergia), palivizumab (epítopo de la proteína F del RSV; infección por el virus sincitial respiratorio), panitumumab (receptor de EGF; cáncer, por ejemplo cáncer colorrectal), ranibizumab (factor de crecimiento endotelial vascular A; degeneración macular húmeda relacionada con la edad), rituximab (CD20; linfoma no de Hodgkin), tositumomab (CD20; linfoma no de Hodgkin), trastuzumab (ErbB2; cáncer de mama).

En algunos ejemplos, la glicoproteína de interés es una citocina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, interferones (por ejemplo, IFN-a, INF-p, o INF-g), interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12), y factores estimulantes de colonias (por ejemplo, G-CSF, GM-CSF, M-CSF). El IFN puede ser, por ejemplo, interferón alfa 2a o interferón alfa 2b. Véanse, por ejemplo, Mott HR y Campbell ID. “Four-helix bundle growth factors and their receptors: protein-protein interactions.” Curr Opin Struct Biol. 1995 Feb; 5(1): 114-21; Chaiken IM, Williams WV. “Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines: towards de novo mimetics design.” Trends Biotechnol. 1996 Oct; 14(10):369-75; Klaus W, et al., “The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution”. J. Mol Biol., 274(4):661-75, 1997, para una discusión más detallada de algunas de estas citocinas.

La proteína de interés también puede ser una proteína de citocina que tenga una estructura similar a una o más de las citocinas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, la citocina puede ser una citocina de clase IL-6, tal como el factor inhibidor de leucemia (LIF) o la oncostatina M. En algunas realizaciones, la citocina es aquella que en la naturaleza se une a un receptor que comprende una subunidad transductora de señal GP130. Otras proteínas de interés del haz de cuatro hélices incluyen la hormona del crecimiento (GH), la prolactina (PRL), y el lactógeno placentario. En algunas realizaciones, la proteína diana es un agente estimulante de la eritropoyesis, por ejemplo (EPO), que también es una citocina de haz de cuatro hélices. En algunas realizaciones, un agente estimulante de la eritropoyesis es una variante de EPO, por ejemplo darbepoetina alfa, también denominada proteína estimulante de la eritropoyesis novedosa (NESP), que se manipula para contener cinco cadenas de hidratos de carbono unidas a N (dos más que la HuEPO recombinante). En algunas realizaciones, la proteína comprende cinco hélices. Por ejemplo, la proteína puede ser un interferón beta, por ejemplo interferón beta-Ia o interferón beta-Ib, que (como se apreciará) a menudo se clasifica como una citocina de haz de cuatro hélices. En algunas realizaciones, una proteína diana es IL-9, IL-10, IL-11, IL-13 o IL-15. Véase, por ejemplo, Hunter, CA, Nature Reviews Immunology 5, 521 -531,2005, para la discusión de ciertas citocinas. Véase también Paul, WE (ed.), Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6th ed., 2008.

[0054] Además, la proteína de interés puede ser una proteína aprobada por la Food & Drug Administration de los Estados Unidos de América (o una autoridad reguladora equivalente, tal como la Agencia de Evaluación del Medicamento Europea) para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno en seres humanos. Dichas proteínas pueden o no ser aquellas para las que se haya ensayado una versión PEGilada en ensayos clínicos y/o haya sido aprobada para su comercialización. En algunos casos, la proteína de interés es una proteína de fusión Fc, que incluye, pero no se limita a, abatacept, entanercept, proteína de fusión IL-2-Fc, proteína de fusión CD80-Fc, y proteína de fusión PDL1-Fc.

Además, la proteína de interés puede ser un factor neurotrófico, es decir, un factor que promueve la supervivencia, el desarrollo y/o la función de las células de linaje neural (cuyo término, como se usa aquí, incluye células progenitoras neurales, neuronas, y células gliales, por ejemplo astrocitos, oligodendrocitos, microglía). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína diana es un factor que promueve el crecimiento de neuritas. En algunas realizaciones, la proteína es factor neurotrófico ciliar (CNTF; una proteína de haz de cuatro hélices), o un análogo del mismo tal como Axokine, que es una versión modificada del factor neurotrófico ciliar humano con un truncamiento de 15 aminoácidos del término C y dos sustituciones de aminoácidos, que es de tres a cinco veces más potente que el CNTF en ensayos in vitro e in vivo, y tiene propiedades de estabilidad mejoradas.

Alternativamente, la proteína de interés puede ser una enzima, por ejemplo una enzima que es importante en el metabolismo u otros procesos fisiológicos. Como se conoce en la técnica, las deficiencias de enzimas u otras proteínas pueden conducir a una variedad de enfermedades. Dichas enfermedades incluyen enfermedades asociadas con defectos en el metabolismo de hidratos de carbono, metabolismo de aminoácidos, metabolismo de ácidos orgánicos, metabolismo de porfirinas, metabolismo de purinas o pirimidinas, trastornos de almacenamiento lisosómico, coagulación sanguínea, etc. Los ejemplos incluyen enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Pompe, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia de asparaginasa, porfiria, hemofilia, y angioedema hereditario. En algunas realizaciones, una proteína es un factor de coagulación (por ejemplo, factor VII, VIIa, VIII o IX). En otras realizaciones, una proteína es una enzima que desempeña un papel en el metabolismo de los hidratos de carbono, el metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo de los ácidos orgánicos, el metabolismo de las porfirinas, el metabolismo de las purinas o pirimidinas, y/o el almacenamiento lisosómico, en los que la administración exógena de la enzima alivia al menos en parte la enfermedad.

Además, la proteína de interés puede ser una hormona, tal como la insulina, la hormona del crecimiento, la hormona luteinizante, la hormona estimulante del folículo, y la hormona estimulante del tiroides. La proteína de interés también puede ser un factor de crecimiento, que incluye, pero no se limita a, adrenomedulina (AM), angiopoyetina (Ang), factor de motilidad autocrina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor del crecimiento epidérmico (EGF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor 9 de diferenciación del crecimiento (GDF9), factor de curación, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento derivado del hepatoma (HDGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor estimulante de la migración (MSF), miostatina (GDF-8), factor de crecimiento nervioso (NGF) y otras neurotrofinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), trombopoyetina (TPO), factor alfa de crecimiento transformante (TGF-a), factor beta de crecimiento transformante (TGF-b), factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y factor de crecimiento placentario (PGF).

Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede utilizar, basándose en la descripción anterior, la presente invención en su máxima extensión. Las siguientes realizaciones específicas, por lo tanto, deben interpretarse como meramente ilustrativas, y no limitantes del resto de la descripción de ninguna manera.

EJEMPLOS

MÉTODOS

i. Construcción de vectores de expresión para producir una fucosidasa o una endoglicosidasa.

Para construir vectores de expresión para una fucosidasa o una endoglicosidasa, se aisló el gen de la fucosidasa o endoglicosidasa mediante tecnología de rutina, y se sometió a optimización de codones basada en el uso de codones de células de hámster. Los genes sintéticos fueron preparados por GeneArt Corp., y se clonaron en el vector pcDNA3.1 B(-) Myc-His (Invitrogen, US) en los sitios de restricción Bgl II/EcoR I. (Figura 2, panel A). El casete de expresión de una alfa-fucosidasa comprende, desde 5’ hasta 3’, una secuencia de Kozak, una secuencia líder de Igk, la secuencia codificante de la fucosidasa, y una secuencia que codifica una etiqueta His. Figura 2, panel B. El casete de expresión de una endoglicosidasa comprende, desde 5’ hasta 3’, una secuencia de Kozak, una secuencia líder de Igk, la secuencia codificante de la endoglicosidasa, y una secuencia que codifica una etiqueta Flag. Figura 2, panel B.

ii. Preparación de anticuerpo desfucosilado

Una línea celular productora de anticuerpos se mantuvo a 0,3~3,0 x 106 células viables/ml en un medio completo, medio CD FortiCHO™ suplementado con L-glutamina 8 mM y agente anti-aglutinante a una dilución 1:100 (Life Technologies, USA). Las células se mantuvieron en una plataforma de agitación configurada a 130-150 rpm en una incubadora con 8% de CO².

Para producir anticuerpos desfucosilados, las células productoras de anticuerpos indicadas anteriormente se transfectaron con el vector de expresión que codifica una alfa-fucosidasa descrita anteriormente mediante el reactivo FreeStyleMAX (Life Technologies, USA), según el protocolo del fabricante. Las células transfectadas se cultivaron en un medio que comprendía 4 g/l de glucosa, y el medio se cambió cada dos días. Las células se recolectaron cuando la viabilidad celular cayó por debajo del 70%. El sobrenadante del cultivo clarificado se recogió y se purificó mediante cromatografía de proteína A.

iii. Análisis de glicosilación de anticuerpos

Los anticuerpos recombinantes preparados según los métodos descritos aquí se redujeron, se alquilaron, y se digirieron durante la noche con tripsina en presencia de amortiguador de bicarbonato de amonio 25 mM (pH~8) a 37°C. Se añadió una disolución de PNGasa F (3 pl, Roche) a 200 pl de la muestra digerida, y la mezcla se incubó durante otras 16 horas a 37°C. Los glicanos liberados se separaron de los péptidos usando un cartucho Sep-Pak® C18 (Waters). El Sep-Pak C18 se lavó con acetonitrilo, seguido de agua. La muestra digerida con PNGasaF se cargó en el cartucho, y los glicanos liberados se eluyeron con etanol al 1% mientras los péptidos permanecieron unidos al Sep-Pak C18. Los oligosacáridos proteicos liberados se purificaron primero usando una columna de carbón de grafito poroso (PhyNexus), y después se permetilaron. Todos los experimentos de espectrometría de masas se realizaron utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Tribrid mediante infusión directa en la fuente de nanoelectropulverización.

RESULTADOS

1. Producción de anticuerpos h4B12, rituximab, y omalizumab que tienen glicoforma monoazucarada (GlcNAc)

Se pudo preparar una glicovariante de monosacárido a partir de la variante de diazúcar mencionada anteriormente mediante una reacción de escisión de fucosidasa. La búsqueda de una serie de enzimas disponibles y el análisis de glicol-péptido por LC/MS/MS indicó que, con condiciones de reacción de escisión optimizadas, se pudo lograr una des-fucosidación eficiente usando una a-1,6-fucosidasa, y que una mayor eficiencia de escisión está asociada con una relación NF/N más baja. Alternativamente, se pudo obtener una glicovariante de monoazúcar con dos enzimas de reacción combinadas en secuencia, incluyendo una endoglicosidasa (Endo S) y una a-1,6-fucosidasa. La glicovariante mono-GlcNAc resultante se mostró en la Figura 3, panel A.

Los resultados muestran que Endo-S eliminó >90% de glicanos unidos a N de la cadena pesada de h4B12, rituximab y omalizumab producidos en las células CHO modificadas descritas aquí. La capacidad de desfucosilación de cinco tipos diferentes de fucosidasas: FUCA1, FUCA2, fucosidasa de Cricetulus griseus, a1,6-fucosidasa de Chryseobacterium meningosepticum alfa-L-1, y BF3242 son 5,8%, 9,1%, 17,7%, 11,5 y 68%, respectivamente, con respecto a los anticuerpos h4B12 producidos en las células CHO que expresan cada una de las fucosidasas. Figura 3, panel B. La expresión de las enzimas se detectó mediante transferencia Western como se muestra en la Figura 3, panel C.

2-Desoxi-2-fluoro L-fucosa es un análogo de fucosa fluorado. Puede metabolizarse dentro de las células hospedantes para generar un inhibidor de fucosiltransferasas basado en un sustrato. Cuando se cultivan células CHO productoras

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente, que comprende genes exógenos que codifican una fucosidasa, y una enzima Endo S, en la que la célula de mamífero hospedante modificada produce glicoproteínas que tienen glicosilación modificada en comparación con las glicoproteínas producidas por una contraparte de tipo salvaje.

2. La célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente de la reivindicación 1, en la que la fucosidasa es una fucosidasa de mamífero o una fucosidasa bacteriana.

3. La célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, que expresa además una glicoproteína.

4. La célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que expresa (i) FUCA1 humana, FUCA2 humana, fucosidasa de Cricetulus griseus, a1,6-fucosidasa de Chryseobacterium meningosepticum alfa-L-1, o fucosidasa bacteriana BF3242, y (ii) una Endo S.

5. Un método in vitro para producir una glicoproteína desfucosilada, que comprende:

proporcionar una célula de mamífero hospedante modificada genéticamente que expresa una glicoproteína, y que comprende genes exógenos que codifican una fucosidasa, y una enzima Endo S;

cultivar la célula de mamífero hospedante en condiciones que permitan producir la glicoproteína, la fucosidasa, y la enzima Endo S; y

recoger la célula de mamífero hospedante o el sobrenadante del cultivo para aislar la glicoproteína;

opcionalmente que comprende además aislar la glicoproteína y/o analizar el patrón de glicosilación de la glicoproteína.

6. El método in vitro de la reivindicación 5, en el que la fucosidasa es una fucosidasa de mamífero o una fucosidasa bacteriana.

7. La célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en el que la glicoproteína es exógena.

8. La célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente o el método in vitro de la reivindicación 7, en el que la glicoproteína es un anticuerpo, una proteína de fusión Fc, una citocina, una hormona, un factor de crecimiento, o una enzima.

9. La célula de mamífero hospedante aislada modificada genéticamente o el método in vitro de la reivindicación 8, en el que la célula de mamífero hospedante es una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de mieloma de rata, una célula de riñón de cría de hámster (BHK), una célula de hibridoma, o una célula de Namalwa.

10. Un método in vitro para preparar la célula de mamífero hospedante modificada genéticamente de la reivindicación 1, que comprende introducir en una célula de mamífero hospedante uno o más vectores de expresión, que codifican colectivamente una fucosidasa, y una enzima Endo S.

11. El método in vitro de la reivindicación 10, que comprende además introducir en la célula de mamífero hospedante un vector de expresión que codifica una glicoproteína.