CN107109370B

CN107109370B - O-聚糖唾液酸化的重组糖蛋白及用于生产其的细胞系

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Publication number: CN107109370B
Application number: CN201580072695.7A
Authority: CN
Inventors: 西尔克·维辛; 延斯·韦尔费尔; 妮科尔·福斯特
Original assignee: Cevec Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Cevec Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2015-01-07
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2035-12-15
Also published as: EP3242935A1; US20170342390A1; US10081798B2; IL253339A0; DK3242935T3; SG11201704571WA; AU2015376273A1; CN107109370A; KR102013712B1; ZA201703767B; US20200095562A1; KR20170094454A; RU2017127276A; JP6395943B2; MY187076A; RU2017127276A3; EP3242935B1; HK1243728A1; BR112017014769A2; WO2016110302A1

Abstract

本发明涉及经遗传修饰以过表达β‑半乳糖苷a‑2,3‑唾液酸转移酶1(ST3Gal1)、优选人类ST3Gal1的细胞系，其可以用于生产具有高度或完全唾液酸化的O‑连接的GalNAc聚糖(GalNAc O‑聚糖)、优选核1GalNAc O‑聚糖的重组糖蛋白，本发明还涉及相应的重组糖蛋白。另外，本发明涉及表达重组糖蛋白的相应方法、增加重组糖蛋白的唾液酸化程度的方法以及降低GalNAc O‑聚糖的微异质性的方法。最后，本发明涉及上述细胞系用于生产重组糖蛋白、用于增加重组糖蛋白的唾液酸化程度以及用于降低重组糖蛋白的O‑连接的GalNAc聚糖的微异质性的相应用途。

Description

O-聚糖唾液酸化的重组糖蛋白及用于生产其的细胞系

技术领域

本发明涉及经遗传修饰(genetically modified)以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)、优选人类ST3Gal1的细胞系，所述细胞系可用于生产具有高度或完全唾液酸化的(sialylated)O-连接的GalNAc聚糖(GalNAc O-聚糖)、优选核1GalNAc O-聚糖的重组糖蛋白，本发明还涉及相应的重组糖蛋白。另外，本发明涉及表达重组糖蛋白的相应方法、增加重组糖蛋白唾液酸化程度的方法和降低GalNAc O-聚糖的微异质性的方法。最后，本发明涉及上述细胞系用于生产重组糖蛋白、用于增加重组糖蛋白的唾液酸化程度和用于降低重组糖蛋白的O-连接的GalNAc聚糖的微异质性的相应用途。

背景技术

由于它们的临床重要性，治疗性蛋白质的发展在过去几年中被大大加快。然而，由于难以获得具有有利糖基化模式的蛋白质，治疗性蛋白质的发展通常被耽误，特别是对于复杂的糖基化蛋白质。这通常导致次优的药理学性质，如例如降低的血清半衰期或提高的免疫原性。

另一个缺点是由于翻译后修饰(post-translational modification)中的变异导致的治疗性蛋白质的异质性，特别是糖结构的异质性。这可能导致不同生产批次之间的产品质量不一致。因此，为了促进治疗性蛋白质的发展，重要的是实现均匀的翻译后修饰。

糖基化是最常见的翻译后修饰。几乎所有的生物药物都需要正确的糖基化以便显示出最佳的治疗效果。通常，糖基化是指糖与蛋白质表面的共价连接，其中糖连接到天冬酰胺残基产生N-连接的聚糖(N-聚糖)，或连接到丝氨酸或苏氨酸残基产生O-连接的聚糖(O-聚糖)。最常见的O-连接的聚糖组是GalNAc O-聚糖，其中丝氨酸或苏氨酸与N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)连接，N-乙酰基-半乳糖胺进而与另外的单糖连接。如本文所使用的，术语”O-连接的聚糖”或”O-聚糖”总是涉及GalNAc O-聚糖。如上所述，糖基化模式在分子之间可以非常多样化，因为连接的形式可以在单糖顺序、分支模式和长度(微异质性)方面不同。此外，并非所有糖基化位点都被完全占据(宏异质性)。

糖基化影响蛋白质的溶解度、它们对蛋白水解的抗性以及它们与其它蛋白质或蛋白质受体如例如ASGPR(去唾液酸糖蛋白受体)的结合性能，并因此影响血浆中糖蛋白的半衰期。

对于小于约50kDa的小尺寸蛋白质，清除主要通过肾清除进行。除了蛋白质的大小之外，蛋白质表面电荷也对肾清除有影响，因为肾脏中高度带电的蛋白质的过滤被降低。

对于大尺寸蛋白质，通过特异性和/或非特异性肝摄取，清除主要发生在肝脏中。特异性摄取介体的实例是ASGPR，其特异性结合非唾液酸化的N-连接的糖蛋白与末端半乳糖。由于这种受体的作用，以末端唾液酸覆盖相邻的碳水化合物半乳糖的糖蛋白，与在N-连接的聚糖上具有末端半乳糖残基的非唾液酸化的对应物相比，半衰期提高了多达至100倍。其他受体特异性结合甘露糖、N-乙酰基-葡萄糖胺或岩藻糖并且从体系中清除具有这些末端糖的糖蛋白。

从这个角度来看，包含高度末端唾液酸化的天然N-糖基化模式对治疗性蛋白质至关重要，因为它决定了治疗性蛋白质的药代动力学性质。此外，糖蛋白上具有适当键合的末端唾液酸降低了糖蛋白的免疫原性。

获得接近天然糖结构和高度唾液酸化的最重要的策略是，在能够将哺乳动物样(mammalian-like)糖结构与蛋白质连接的细胞系中产生重组蛋白，例如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。然而，CHO细胞缺乏催化唾液酸的2,6-连接所需的酶，因此它们只能催化2,3-连接。此外，除了N-乙酰神经氨酸(唾液酸；NeuAc)之外，它们还将N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)连接至聚糖，其是一种在人类中不合成的糖，因此在注入到人体中时是免疫原性的。因此，更好的策略是由源自人细胞的细胞系如CAP细胞(源自人羊水细胞(amniocyte))或HEK293细胞(源自人胚肾细胞)产生治疗性蛋白质。然而，在发酵期间，从哺乳动物细胞系分泌的治疗性蛋白质的唾液酸化通常是不完全的。

由于唾液酸化对于蛋白质的药代动力学特征的重要性，进行了大量的努力来增加唾液酸化程度。N-连接的糖基化的完全唾液酸化的有益效果是很好理解的，但是对于O-糖基化的效果知道的相对较少。因此，到目前为止，所有旨在改善唾液酸化的细胞工程工作都注重于N-连接的糖结构。

O-连接的GalNAc聚糖总是具有连接到丝氨酸或苏氨酸的α-连接的N-乙酰基半乳糖胺残基。GalNAc可以用如半乳糖、GlcNAc、岩藻糖或唾液酸的残基进行扩展。对于O-连接的GalNAc糖基化，可以区分四个主要核结构，核1(GalGalNAc)、核2(GalGlcNAcGalNAc)、核3(GlcNAcGalNAc)和核4(GlcNAc2GalNAc)(图1)。通常例如利用磷酸盐、硫酸盐、羧酸或唾液酸进一步修饰末端。O-连接的GalNAc聚糖在保持完全折叠的蛋白质的结构、赋予蛋白酶稳定性中起作用。图2显示了核1和核2GalNAc O-聚糖的生物合成。

尽管公认末端唾液酸对N-连接的聚糖关于治疗性蛋白质半衰期的增加有显著的积极影响，但是在O-连接的GalNAc聚糖处的末端唾液酸的可能效果和O-连接的结构的确切外观不太清楚。

人类胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP6)具有五个O-连接的糖基化位点，并且与去糖基化形式相比，O-糖基化形式的血液清除率降低，表明了O-连接的聚糖的一般参与，但唾液酸的作用仍不清楚。B细胞激活因子受体3(BR3)-Fc具有多个O-连接的糖基化位点，并且唾液酸化水平在制造过程中会变化。分离不同的形式，可以显示，由于在肝中的摄取和降解，特别是通过非实质细胞介导的清除，BR3-Fc的去唾液酸化的O-连接的聚糖上的暴露的半乳糖与快速清除相关联。有趣的是，随着去唾液酸GalNAc的增加，也观察到与唾液酸化的Gal增加有关的清除率的降低，表明末端去唾液酸Gal可能是清除信号。脂联素(脂肪细胞分泌的胰岛素敏化激素)具有三个推定的O-连接的糖基化位点，这对于多聚体形成是不必要的，但与唾液酸化的蛋白质相比，去唾液酸化蛋白质的血浆清除被加速。迄今为止，还没有描述在糖蛋白重组表达过程中会影响O-连接的GalNAc聚糖的唾液酸化或结构的方法。

发明内容

因此，本发明的技术问题是提供具有高度或完全唾液酸化的GalNAc O-聚糖的重组糖蛋白以及能够重组产生这种蛋白质的细胞系。此外，应提供表达重组糖蛋白、增加重组糖蛋白的唾液酸化程度和降低GalNAc O-连接的聚糖的微异质性的相应方法，以及上述细胞系用于生产重组糖蛋白、增加重组糖蛋白的唾液酸化程度和降低GalNAc O-连接聚糖的微异质性的用途。

上述技术问题的解决方案由权利要求中所述的实施方式来实现。

特别地，在第一方面，本发明涉及动物细胞系，优选昆虫、禽类或哺乳动物细胞系，更优选哺乳动物、特别是人类的细胞系，所述细胞系经遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)。

如在此也在下文其他转移酶的背景下所使用的术语“经遗传修饰以过表达ST3Gal1的细胞系”，表明在遗传修饰后，与它们在遗传修饰之前相比，细胞系的各个细胞显示出更高的蛋白质(例如唾液酸转移酶)活性。

允许给定蛋白质的过表达的遗传修饰没有特别限制并且是本领域已知的。在一个具体实例中，细胞系包含编码ST3Gal1的内源基因，如例如，人类细胞系。在这种情况下，可以通过将启动子、增强元件(enhancing element)和/或稳定元件(stabilizing element)在适合于引起所述核酸的过表达的位置插入到细胞基因组中从而对细胞进行遗传修饰。这可以通过使用TALENS、Zn-指蛋白、CRISPR-CAS9或本领域已知的其它方法的同源重组来完成。因此，在优选的实施方式中，细胞系包含编码ST3Gal1的内源基因和任选的编码ST3Gal4和/或ST6Gal1的内源基因，并且进一步具有从由启动子、增强无件和稳定元件组成的组中选择的至少一种遗传元件，所述至少一种遗传元件在适合于引起ST3Gal1和任选的ST3Gal4和/或ST6Gal1的过表达的一个或多个位置被插入到基因组中。合适的启动子、增强元件和稳定元件没有特别限制并且本领域已知的。例如，启动子包括组成型启动子(例如CMV、EF1α、SV40、RSV、UbC、CAG、BOS或PGK启动子)和诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)或本领域已知的其它诱导型启动子。另外，增强元件(增强子)包括CMV增强子、β-球蛋白增强子、免疫球蛋白增强子和PGK增强子。另外，稳定元件(染色质元件)包括基质附着区(MARS)、基因座控制区(LCR)和普遍存在的作用染色质开放元件(UCOE)。

可替换地，在细胞不包含编码ST3Gal1的内源基因的情况下，或另外，在细胞确实包含编码ST3Gal1的内源基因的情况下，可以通过将编码ST3Gal1的核酸引入细胞来实现细胞的遗传修饰。将核酸引入细胞的方法没有特别限制并且在本领域中是已知的。例如，可以通过电穿孔、核转染、显微注射、通过病毒载体(例如慢病毒载体)、基于试剂的方法(例如脂质、磷酸钙、阳离子聚合物)或本领域已知的其它方法，将所述核酸以环状或线性形式引入细胞。核酸可以通过附加系统瞬时或稳定地引入细胞中，或通过将核酸稳定整合到基因组中。所述核酸可以以一种或多种表达载体的形式(例如pcDNA、pCEP、pLenti、pEntr、pDest、pEF、pEAK、pCMV、pStbl或本领域中已知的其它表达载体)存在于细胞中。ST3Gal1的表达可以在组成型启动子(例如CMV、EF1α、SV40、RSV、UbC、CAG、BOS或PGK启动子)、内源启动子或诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子或本领域已知的其它诱导型启动子)的控制下进行。此外，编码ST3Gal1的核酸可以作为一个连续核酸存在，或者可以作为单独的核酸存在，例如作为单独的表达载体。除了编码区和启动子之外，所述核酸可以含有合适的限制性位点、Kozak序列、核糖体结合位点、染色质调节元件、选择盒、附加型复制系统(例如Epstein-Barr核抗原和ori P，或SV40ori和SV40T-大抗原)、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接信号和本领域已知的多聚腺苷酸化信号。因此，在优选的实施方式中，细胞系包含编码β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)的外源核酸和任选的编码β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)和/或β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)的外源核酸。

用于转染细胞系的编码ST3Gal1的合适基因没有特别限制，并且包括来自任何来源的编码具有ST3Gal1活性的蛋白质的任何基因，即催化唾液酸与连接到Thr或Ser的Gal-酸与连接到基因，并且包括结构的连接的蛋白质。优选地，此种基因选自于编码ST3Gal1蛋白的ST3Gal1基因，所述ST3Gal1蛋白在其氨基酸序列(特别是C-端受体结合位点的基序(motif)3)中包含保守的共有序列(H/C/R)(Y/H/F)(W/Y/F)(E/D/H/Y)，其中特别优选序列HYWE(SEQ ID NO:5)。图14显示了各种物种的ST3Gal1的氨基酸序列的比对，其涵盖包含催化结构域的人类ST3Gal1的氨基酸191至340，并显示了所述共有序列。更优选地，基因选自于编码ST3Gal1蛋白的ST3Gal1基因，所述ST3Gal1蛋白包含与人类ST3Gal1的氨基酸263至321具有至少50％、优选75％且更优选90％％同一性的氨基酸序列。更优选地，基因选自于来源于多个物种的ST3Gal1基因组成的组，所述多个物种选自于由智人(SEQ ID NO:1)、黑猩猩(SEQ ID NO:6)、猕猴(SEQ ID NO:7)、野猪(SEQ ID NO:8)、褐家鼠(SEQ ID NO:9)、小家鼠(SEQ ID NO:10)、盲小鼹形鼠(SEQ ID NO:11)、短尾负鼠(SEQ ID NO:12)、家兔(SEQID NO:13)、灰地鼠(SEQ ID NO:14)、家犬(SEQ ID NO:15)、家猫(SEQ ID NO:16)、家马(SEQID NO:17)、原鸡(SEQ ID NO:18)、原鸽(SEQ ID NO:19)、扬子鳄(SEQ ID NO:20)、矛尾鱼(SEQ ID NO:21)和玻璃海鞘(SEQ ID NO:22)组成的组，其中特别优选哺乳动物S3Gal1基因，特别是人类ST3Gal1基因。

在进一步优选的实施方式中，细胞系被进一步遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)，优选人类ST3Gal4，和/或被进一步遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)，优选人类ST6Gal1。各种遗传修饰优选如上对ST3Gal1所定义。此外，编码ST3Gal4的合适基因和编码ST6Gal1的合适基因没有特别限制，并且包括任何来源的编码具有相应活性的蛋白质的任何基因。再次，特别优选哺乳动物基因，特别是人类基因。

根据本发明的细胞系可以源自本领域已知的细胞系，例如哺乳动物细胞系。在优选的实施方式中，本发明的细胞系可源自番鸭细胞(AGE.

)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)、Madin Darby犬肾细胞(MDCK)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肝癌细胞系(HepG2Huh7)、人类胚胎肾293(HEK293)细胞、人神经前体细胞(AGE1.

和NC5T11)、人胚胎成视网膜细胞(Per.C6)、骨髓瘤细胞系(HMCLs、MM.1、U266、RPMI8226)、CML肿瘤细胞系(NM、NM-F9)、混合HEK293和淋巴瘤细胞(HKB11)或人类羊水细胞(CAP；参见EP 1230 354 B1)，其中优选CHO细胞、HEK293细胞和CAP细胞，并且特别优选CAP细胞。

在本文中，CAP细胞是包含编码腺病毒基因产物的核酸的永久性羊水细胞系，特别是腺病毒型5(Ad5)、E1A和E1B区域。CAP细胞源自用编码Ad5E1A和E1B的核酸转化的原代人羊水细胞(primary human amniocyte)。

因此，在优选的实施方式中，根据本发明的细胞系可以来源于包含编码腺病毒E1和pIX区、优选从nt.505至4079的腺病毒型5(Ad5)的E1和pIX区的基因产物的至少一种核酸，其中E1A处于鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子的控制下，而E1B和pIX表达由其天然启动子控制。E1B下游内含子、接头受体和多聚A(polyA)信号由SV40的相应基序取代。

对于哺乳动物细胞系描述的任何或全部上述优选和/或具体实施方式可以以任何方式彼此组合。

在进一步方面，本发明涉及具有被唾液酸化至至少80％程度的GalNAc O-聚糖的重组糖蛋白。

如本文所使用的，术语“重组糖蛋白”指示相应的糖蛋白在遗传修饰的生物或细胞中生物技术生产。

根据本发明的糖蛋白具有被唾液酸化至至少80％、优选至少82％、更优选至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％或至少99％程度的GalNac O-聚糖。优选地，根据本发明的糖蛋白具有被唾液酸化至95％以上的程度的GalNac O-聚糖。在本上下文中，如本文使用的术语“被唾液酸化至至少X％程度的O-聚糖”表明给定糖蛋白制剂中所有末端GalNac O-聚糖单糖部分的X％为唾液酸(N-乙酰神经氨酸；NeuAc)。

在优选的实施方式中，本发明糖蛋白的GalNac O-聚糖的至少80％、优选至少82％、更优选至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少95.5％、至少96％、至少96.5％、至少97％、至少97.5％或至少98％是核1GalNAc O-聚糖，即具有以下核结构的GalNac O-聚糖，

GP-Ser/Thr-O-GalNAc-Gal-

其中GP是糖蛋白，Ser/Thr-O是糖蛋白的丝氨酸或苏氨酸氨基酸侧链，GalNAc是N-乙酰半乳糖胺且Gal是半乳糖(图1)。

在优选的实施方式中，根据本发明的糖蛋白具有被二唾液酸化(disialylated)至至少25％、优选至少30％、更优选至少35％、至少37.5％、至少40％、至少42.5％或至少45％的程度的核1GalNAc O-聚糖。在本上下文中，如本文使用的术语“被二唾液酸化至至少X％的程度的核1GalNAc O-聚糖”指示全部核1GalNAc O-聚糖的X％具有两个末端唾液酸部分。在本上下文中，图11显示了糖蛋白C1酯酶抑制剂(C1 Inh)的各种制剂中六种主要O-聚糖物质的相对量。

可以如本文所述产生各种重组糖蛋白，例如通过与重组糖蛋白一起过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)，以及可选地通过β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4(ST3Gal4)和/或β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6Gal1)的另外的过表达。优选地，所述糖蛋白在如本文所述的根据本发明的细胞系中产生。

在相关实施方式中，本发明的重组糖蛋白的GalNAc O-聚糖的特征在于减少的微异质性，即给定的糖蛋白制剂中降低的GalNAc O-聚糖结构和组成的多样性。可以如本文所述生产各种重组糖蛋白，例如通过与重组糖蛋白一起过表达ST3Gal1，以及可选地通过ST3Gal4和/或ST6Gal1的另外的过表达。优选地，所述糖蛋白在如本文所述的根据本发明的细胞系中产生。

对根据本发明的特定糖蛋白没有特别限制，条件是所述糖蛋白具有GalNAc O-聚糖并且满足GalNAc O-聚糖唾液酸化的各自要求。优选地，所述糖蛋白是哺乳动物糖蛋白，更优选人类糖蛋白。糖蛋白可以选自于由生长因子、肽激素、细胞因子、酶、抗体、抗体片段、凝血因子和蛋白酶抑制剂组成的组。优选地，糖蛋白选自于由肝细胞生长因子(HGF)、促红细胞生成素(EPO)、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)、von-Willebrand-因子(vWF)和C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂；C1 Inh)组成的组，其中，特别优选C1 Inh。

因此，在特别优选的实施方式中，本发明涉及重组C1酯酶抑制剂(C1-抑制剂；C1Inh)，优选重组人类C1 Inh，其具有被唾液酸化至至少80％程度的GalNAc O-聚糖。对于重组糖蛋白描述的所有上述优选的和/或具体实施方式一般也适用于重组(人类)C1 Inh的该具体实施方式。

对于重组糖蛋白描述的任何或所有上述优选的和/或具体实施方式可以以任何方式彼此组合。

在进一步的方面，本发明涉及用于表达具有被唾液酸化至至少80％的程度的GalNAc O-聚糖的重组糖蛋白的方法，涉及用于增加重组糖蛋白的GalNAc O-聚糖唾液酸化程度的方法，并且涉及用于降低重组糖蛋白的GalNAc O-聚糖的微异质性的方法，所有所述方法包含与重组糖蛋白一起过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)的步骤(step of overexpressing with the recombinant glycoproteins aβ-galactoside α-2,3-sialyltransferase 1(ST3Gal1)，利用重组糖蛋白过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1(ST3Gal1)的步骤)。

在特别的实施方式中，所述方法包含步骤：

(a)提供根据本发明的细胞系；

(b)在所述细胞系中表达感兴趣的糖蛋白(glycoprotein of interest，目标糖蛋白)；和

(c)与感兴趣的糖蛋白一起，过表达ST3Gal1和任选的选自于由ST3Gal4和ST6Gal1组成的组中的一种或多种。

另外，本发明的方法可以包含步骤：

(d)分离感兴趣的糖蛋白。

在这些方面中，对于本发明的重组糖蛋白和本发明的细胞系描述的所有定义和优选的和/或具体实施方式在适用的情况下以类似的方式应用。

特别地，在所述方法中产生的重组糖蛋白、或在所述方法中唾液酸化程度增加的重组糖蛋白、或在所述方法中GalNAc O-聚糖微异质性被降低的重组糖蛋白可以是如上定义的本发明的任何糖蛋白。另外，本发明的方法的步骤(a)中提供的细胞系可以是如上定义的本发明的任何细胞系。

用于在本发明的细胞系中表达蛋白质的方法没有特别限制并且在本领域中是已知的。在本上下文中，在所述细胞系中表达感兴趣的糖蛋白的步骤(b)涵盖在实际表达糖蛋白之前将相应的编码核酸转染到所述细胞系中。此外，从细胞培养物中分离感兴趣的糖蛋白的装置没有特别限制并且在本领域中是已知的。

在相关的方面，本发明涉及根据本发明的细胞系用于生产具有被唾液酸化至至少80％的程度的GalNAc O-聚糖的重组糖蛋白和/或用于提高重组糖蛋白的唾液酸化程度和/或用于降低重组糖蛋白的GalNAc O-聚糖微异质性的用途。

在这些方面中，对于本发明的重组糖蛋白和本申请的细胞系所描述的所有定义和优选的和/或具体实施方式在适用的情况下以类似的方式应用。

特别地，在所述用途中产生的重组糖蛋白、或在所述用途中提高了唾液酸化程度的重组糖蛋白、或在所述用途中降低了GalNAc O-聚糖微异质性的重组糖蛋白可以是如上定义的本发明的任何糖蛋白。此外，本发明所用的细胞系可以是如上所定义的本发明的任何细胞系。

附图说明

图1：

可以区分开的四个主要的核GalNAc O-连接的糖基化结构。

GalNAc O-连接的聚糖含有连接至丝氨酸或苏氨酸的α-连接的N-乙酰基半乳糖胺残基。GalNAc可以使用残基如半乳糖、GlcNAc、岩藻糖或唾液酸来扩展。可以区分四个主要核结构，核1(GalGalNAc)、核2(GalGlcNAcGalNAc)、核3(GlcNAcGalNAc)和核4(GlcNAc2GalNAc)。这些核结构可被进一步扩展和支化。

图2：

核1和核2GalNAc O-聚糖的生物合成。

生物合成的第一步是将GalNAc与蛋白主链中的特定丝氨酸或苏氨酸残基连接，产生所谓的Tn-抗原。然后酶C1GalT-1催化半乳糖与GalNAc的连接，因此形成了也称为T-抗原的核1结构的基础。核1用作C2Gnt的底物，C2Gnt催化GlcNAcβ1-6连接的分支的合成，产生核2结构。核1结构也可以被ST3Gal1另外的唾液酸化，产生单唾液酸化的Gal1-3(NeuAc2-6)GalNAc或二唾液酸化的NeuAc2-3Gal1-3(NeuAc2-6)GalNAc。

图3：

在大鼠中单次静脉注射重组C1 Inh(CAP C1 Inh、CAP C1 Inh ST3Gal4、CAP C1 Inh ST3Gal1/ST3GAL4库(pool，池)A和库B)或Berinert后的C1 Inh血清浓度。

在注射了Berinert(来源于人类血浆的C1 Inh)或表达为CAP C1 Inh、CAP C1 InhST3Gal4或CAP C1 Inh ST3Gal1/ST3GAL4的重组C1 Inh的大鼠中进行了药代动力学研究。在Sprague Dawley雌性大鼠中静脉推注10mg/kg剂量后，在不同时间点测定残留hC1 Inh量：5min、10min、15min、20min、30min、60min、2h、4h、6h和24h。通过ELISA检测残留C1Inh的百分比。对于每只动物，将C1 Inh浓度归一化为5分钟时的浓度＝100％。相对于注射后的时间拟合数值并绘图。从每个组(n＝4，除了Berinert n＝7)，显示了一只代表性动物的图。

图4：

在大鼠中单次静脉注射重组C1 Inh(CAP C1 Inh、CAP C1 Inh ST3Gal4、CAP C1 Inh ST3Gal1/ST3GAL4库A和库B)或Berinert后，C1 Inh的血清半衰期。

在注射了Berinert(来源于人类血浆的C1 Inh)或表达为CAP C1 Inh、CAP C1 InhST3Gal4或CAP C1 Inh ST3Gal1/ST3GAL4的重组C1 Inh的大鼠中进行了药代动力学研究。在Sprague Dawley雌性大鼠中静脉推注10mg/kg剂量后，在不同的时间点测定残留hC1 Inh量：5min、10min、15min、20min、30min、60min、2h、4h、6h和24h。通过ELISA检测残留C1 Inh的百分比。对于每只动物，将C1 Inh浓度归一化为5分钟时的浓度＝100％。相对于注射后的时间拟合数值并绘图。所示出的是t1/2(n＝4，Berinert n＝7)的平均值，误差线＝±SD。

图5：

不同重组C1 Inh(CAP C1 Inh、CAP C1 Inh ST3Gal4、CAP C1 InhST3Gal1/ ST3GAL4库A和库B)或Berinert的测定AUC值。

比较不同重组糖优化C1 Inh样品之间的生物利用度。显示的是AUC(n＝4，Berinert n＝7)的平均值，误差线＝±SD。

图6：

从CAP细胞系表达的具有和不具有偶联表达的ST3Gal1和/或ST3Gal4的C1 Inh的 N-连接的糖基化分析以及添加的免疫印迹分析。

与Berinert相比，在CAP细胞中表达的纯化的重组C1 Inh在SDS PAGE中迁移较慢。ST3Gal1和ST3Gal4的表达导致重组C1 Inh在通过PNG酶(PNGase)去除N-糖基化后向Berinert转变，表明剩余的O-连接的聚糖的质量降低。在37℃使用500U PNG酶F(PNGaseF)(NEB)消化100ng纯化的在糖改良的C1表达细胞系中表达的重组C1 Inh，随后在4-12％Bis-Tris凝胶上分离(分子量标记：MagicMark^TM XP Western蛋白质标准品)。

图7：

在存在或不存在唾液酸转移酶的情况下在CAP细胞中表达的重组C1 Inh的ECL凝集素免疫印迹(lectin immunoblot)。

鸡冠刺桐(Erythrina crista galli)(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接末端半乳糖。因此，ECL印迹中的信号减弱意味着唾液酸化量增加。Berinert的N-连接的聚糖几乎完全被唾液酸化，来自过表达ST3Gal4的CAP细胞的C1 Inh也几乎完全被唾液酸化。来自过表达ST3Gal1/4的CAP细胞的C1 Inh显示稍高量的去唾液酸的N-聚糖。相比之下，纯化自不存在过表达唾液酸转移酶的CAP细胞的未经修饰的C1 Inh在ECL印迹中提供了强信号，表明有一定量的去唾液酸的N-聚糖。作为加载对照，用神经氨酸酶处理相同的样品以从聚糖结构中除去整个唾液酸含量(分子量标记：MagicMark^TM XP Western蛋白质标准品)。

图8：

在存在或不存在唾液酸转移酶的情况下在CAP细胞中表达的重组C1 Inh的PNA凝集素免疫印迹。

通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后，在CAP细胞中重组C1 Inh的O-连接的唾液酸化量。花生凝集素(PNA)在O-连接的聚糖上检测β1-3连接的末端半乳糖。因此，PNA凝集素印迹中降低的信号意味着O-聚糖的半乳糖残基的唾液酸化水平升高。从过表达ST3Gal1的CAP细胞的细胞培养上清液纯化的C1 Inh不显示信号，表明O-聚糖完全唾液酸化。对于血浆来源的C1 Inh，Berinert也同样如此(分子量标记：MagicMark^TM XP Western蛋白质标准品)。

图9：

通过IEF分析比较rhC1 Inh同种型模式。

由于不同C1 Inh的主链是相同的，所以IEF的变化很可能是由于唾液酸含量的变化引起的。在具有另外的表达ST3Gal4的CAP中表达的C1 Inh产生修饰的C1 Inh，其与未修饰的C1 Inh相比仅稍朝向阳极位移，表明每分子唾液酸总量有少量增加。相比之下，ST3Gal1的另外的表达导致显著的C1 Inh向阳极位移，表明每分子的唾液酸总量显著增加。

图10：

与Berinert相比，在具有或不具有另外的过表达ST3Gal1和/或ST3GAL4的条件下表达的蛋白质的CAP C1 Inh O-聚糖的MALDI-TOF质谱分析。

(A)CAP C1 Inh样品的分析显示出高丰度的具有核2结构和末端半乳糖的单唾液酸化O-聚糖。(B)C1 Inh的表达与ST3Gal4的过表达的结合也产生大量具有核2结构和末端半乳糖的单唾液酸化O-聚糖。(C)C1 Inh的表达与ST3Gal4和ST3Gal1的过表达的结合导致朝向核1O-聚糖结构的转变，其是单或二唾液酸化的，但没有任何末端半乳糖残基。核2结构几乎无法检测。(D)Berinert的O-糖基分析显示，仅存在核1O-聚糖，其主要是单唾液酸化的而没有末端半乳糖残基。

图11：

与Berinert相比，在具有或不具有ST3Gal1和/或ST3GAL4过表达的条件下在CAP细胞中表达的C1 Inh的MALDI-TOF质谱结果的概要。

显示的是六种主要聚糖物种相对于相同聚糖总量的量。由MALDI-TOF产生的聚糖片段或可忽略的信号不用于该分析。在不具有另外的过表达ST3Gal1或ST3Gal4的CAP C1Inh样品中，即CAP C1 Inh，可以检测到的主要是具有核2结构的O-聚糖(Gal1-3(Gal1-GlcNAc1-6)GalNAc-ol_核2)(m/z 983)、或NeuAc2-3Gal1-3(Gal1-4GlcNAc1-6)GalNAc-ol(m/z 1344)、Gal1-3(NeuAc2-3Gal1-4GlcNAc1-6)GalNAc-ol(m/z 1344)和NeuAc2-3Gal1-3(NeuAc2-3Gal1-4GlcNAc1-6)GalNAc-ol(m/z 1706))。核1结构很少被检测到。ST3Gal4的另外的表达导致向核1结构的轻微转变(NeuAc2-3Gal1-3GalNAc-ol_核1)。有趣的是，CAP细胞中的C1 Inh的表达与ST3Gal1的过表达相结合导致专属表达NeuAc2-3Gal1-3GalNAc-ol(核1)，分别为Gal1-3(NeuAc2-6)GalNAc-ol(m/z 895)和NeuAc2-3Gal1-3(NeuAc2-6)GalNAc-ol(m/z 1256)。该图中的“Hex”表示己糖。

图12：

不同的核1和核2GalNAc O-聚糖结构。

MALDI-TOF质谱分析表明，不同样品组在核1或核2O-聚糖结构的两个不同簇中。

图13：

在存在或不存在唾液酸转移酶的情况下，在CAP细胞中表达的重组HGF的ECL和PNA 凝集素免疫印迹。

(A)鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖。因此，ECL印迹中的信号减弱意味着唾液酸化量增加。ST3Gal4或ST3Gal1/4的过表达导致N-连接的聚糖的唾液酸化增加，而与未修饰的C1 Inh相比，ST3Gal1的过表达没有影响。(B)通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后CAP细胞中重组HGF的唾液酸化量。花生凝集素(PNA)检测O-连接的聚糖上的β1-3连接的末端半乳糖。因此，PNA凝集素印迹中降低的信号意味着O-聚糖的半乳糖残基的唾液酸化水平升高。来自过表达ST3Gal1的CAP细胞的细胞培养物上清液导致信号的显著降低，表明O-聚糖的唾液酸化增加(分子量标记：MagicMark^TMXP Western蛋白质标准品)。

图14：

ST3Gal1的结构域和序列比对。

A)ST3Gal1唾液酸转移酶的结构域。TM，跨膜结构域；干(Stem)，干区；L，唾液酰基基序L(长)；唾液酰基基序S(短)；3，唾液酰基基序III；VS，唾液酸基基序VS(非常短)。L基序参与CMP-Sia的结合，基序S参与CMP-Sia以及受体的结合，基序3和VS包含催化共有序列并且参与结合受体。B)来自人类、哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼类和海鞘的ST3Gal1C末端序列的比对。所有物种中相同的氨基酸残基以浅灰色阴影表示，大多数物种相同的氨基酸以深灰色表示和相似氨基酸嵌段以中灰色表示。基序3读取物中的催化活性氨基酸的共有序列(H/C/R)(Y/H/F)(W/Y/F)(E/D/H/Y)(相应位置优选的氨基酸以粗体显示)。

图15：

在存在或不存在唾液酸转移酶的条件下，293F细胞中表达的重组C1 Inh的ECL和 PNA凝集素免疫印迹。

(A)鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖。ST3Gal4或ST3Gal1/4的过表达导致N-连接的聚糖的唾液酸化增加，而单独的ST3Gal1的过表达与未修饰的C1 Inh相比没有效果。神经氨酸酶催化从寡糖中水解N-乙酰基-神经氨酸残基，因此神经氨酸酶处理的样品用作阳性对照。(B)通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后293F细胞中重组C1 Inh的唾液酸化量。来自过表达ST3Gal1的293F细胞的细胞培养物上清液导致信号的显著降低，表明O-聚糖的唾液酸化增加。神经氨酸酶处理的样品作为阳性对照(分子量标记：MagicMark^TM XP Western蛋白质标准品)。

图16：

在存在或不存在唾液酸转移酶的情况下，在CHO-K1细胞中表达的重组C1 Inh的 PNA凝集素免疫印迹。

通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后CHO-K1细胞中重组C1 Inh的唾液酸化量。来自过表达ST3Gal1的CHO-K1细胞的细胞培养物上清液显示出显著降低的信号，表明与从CHO-K1 C1 Inh对照细胞纯化的C1 Inh相比，O-聚糖的唾液酸化增加。相同蛋白质样品的蛋白质印迹分析用作加载对照(分子量标记：MagicMark^TM XP Western蛋白质标准品)。

图17：

在存在或不存在唾液酸转移酶的情况下，在MDCK.1细胞中表达的重组C1 Inh的 ECL和PNA凝集素免疫印迹。

(A)鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖。MDCK.1细胞中ST3Gal1的过表达对N-连接的聚糖的唾液酸化量没有影响。(B)通过PNA凝集素免疫印迹测试MDCK.1细胞中ST3Gal1过表达后重组C1 Inh的唾液酸化量。来自过表达ST3Gal1的MDCK.1细胞的细胞培养物上清液显示出显著降低的信号，表明O-聚糖的唾液酸化增加。(分子量标记：MagicMark^TM XP Western蛋白质标准品)。

具体实施方式

在以下实施例中将进一步说明本发明，但不限于此。

实施例

实验程序：

细胞培养和发酵

在补充有6mM稳定的谷氨酰胺(biochrom，德国)的化学成分确定不含动物成分的CAP-CDM培养基(CEVEC药物，德国)中或在补充有4mM稳定的谷氨酰胺(biochrom，德国)的无血清PEM培养基(生命科技(Life Technologies))中，悬浮培养永久性人类羊水细胞系CAP1D5。

在补充有4mM稳定的谷氨酰胺(biochrom，德国)的Freestyle 293表达培养基(生命科技)中悬浮培养来自生命科技的293F细胞。

在补充有10％FBS和2mM稳定的谷氨酰胺(biochrom，德国)的F12-K培养基(生命科技)中培养贴壁CHO-K1细胞(ATCC,CCL-61)。

在EMEM培养基(ATCC)或补充有10％FBS和2mM稳定的谷氨酰胺(biochrom，德国)的DMEM F-12(ATCC)中培养贴壁MDCK.1细胞(ATCC,CRL-2935)。

在5％CO₂和185rpm下，在摇瓶(Corning，125mL(25mL wv)或3000mL(1000mL wv))中在37℃下培养CAP细胞和293F细胞。在发酵过程中，使用10％CAP-CDM料液(CEVEC药物，德国)和4mM稳定的谷氨酰胺(biochrom，德国)在d3、d5和d7喂养CAP细胞。在6cm或10cm细胞培养皿(TPP)或225cm²细胞培养皿(BD)中，在37℃,5％CO₂下培养贴壁CHO-K1和MDCK.1细胞。

克隆

为了产生在本发明中使用的细胞系，相继地使用编码修饰酶ST3Gal1和/或ST3Gal4的糖结构的核酸构建体以及特异性重组蛋白对细胞进行核转染。仅使用稳定的细胞系。表1列出了创建的所有细胞系。

表1：在本发明中使用的稳定细胞系。

细胞系	重组蛋白	唾液酸转移酶的过表达
			CAP-C1 Inh	C1 Inh	/
CAP-C1 Inh-ST3Gal1	C1 Inh	ST3Gal1
			CAP-C1 Inh-ST3Gal4	C1 Inh	ST3Gal4
CAP-C1 Inh-ST3Gal1/4	C1 Inh	ST3Gal1/ST3Gal4
			CAP-HGF	HGF	/
CAP-HGF-ST3Gal1	HGF	ST3Gal1
			CAP-HGF-ST3Gal4	HGF	ST3Gal4
CAP-HGF-ST3Gal1/4	HGF	ST3Gal1/ST3Gal4
			293F-C1 Inh	C1 Inh	/
293F-C1 Inh-ST3Gal1	C1 Inh	ST3Gal1
			293F-C1 Inh-ST3Gal1/4	C1 Inh	ST3Gal1/ST3Gal4
CHO-C1 Inh	C1 Inh	/
			CHO-C1 Inh-ST3Gal1	C1 Inh	ST3Gal1
MDCK.1-C1 Inh	C1 Inh	/
			MDCK.1-C1 Inh-ST3Gal1	C1 Inh	ST3Gal1

为了设计ST3Gal1cDNA，前体蛋白和成熟蛋白的序列信息基于数据库条目UniProtQ11201(SEQ ID NO:1)。为了克隆，将ClaI限制性位点和Kozak序列加入到人类ST3Gal1cDNA的起始密码子的5'，并且将EcoRV限制性位点插入到终止密码子的3'，该终止密码子要被插入到pStbl-Puro-CMV-MCS(-)载体中的ClaI和EcoRV限制性位点之间，产生表达质粒pStbl-Puro-CMV-ST3Gal1。该载体含有驱动感兴趣的基因表达的CMV启动子，随后是用于改进的剪接介导的mRNA转运的SV40内含子和用于插入感兴趣的基因的多克隆位点。选择标记(Puromycin)由人类泛素(UbC)启动子驱动。在GeneArt(德国，生命科技)进行cDNA合成。

为了设计ST3Gal4cDNA，前体蛋白和成熟蛋白的序列信息基于数据库条目UniProtQ11206(SEQ ID NO:2)。为了克隆，将ClaI限制性位点和Kozak序列加入到人类ST3Gal4cDNA的起始密码子的5'，并且将EcoRV限制性位点加入到终止密码子的3'，该终止密码子要被插入到pStbl-Puro-CMV-MCS(-)载体的ClaI和EcoRV限制性位点之间，产生表达质粒pStbl-Puro-CMV-ST3Gal4。在GeneArt(德国，生命科技)进行cDNA合成。

核转染和库生成

使用核转染剂(Nucleofector)(LONZA)以适合的核转染剂试剂盒(KitV；CAP细胞，293F，和CHO或KitT；MDCK.1细胞)根据制造商的方案进行核转染。简言之，在培养物指数增长阶段，通过离心(150g，5min)收获1×10⁷个细胞并且再悬浮于100μl完全核转染剂溶液中并且与总共5μg质粒混合。使用X001程序(CAP和293F细胞)、U024程序(CHO-K1)或P029程序(MDCK.1)进行核转染。脉冲后，将细胞回收在完整的细胞培养基中。细胞如前所述进行培养。

核转染72至96h之后，使用5μg/ml杀稻瘟菌素(治疗性蛋白质)和/或200μg/ml新霉素(pStbl-neo-CMV-ST3Gal4)和/或2μg/ml嘌呤霉素(pStbl-Puro-CMV-ST3Gal1)对细胞进行选择，以生成稳定的库。

重组C1 Inh在大鼠中的药代动力学研究

在注射有Berinert(来源于人类血浆的C1 Inh)或纯化的表达为CAP C1 Inh、CAPC1 Inh ST3Gal4或CAP C1 Inh ST3Gal1/ST3GAL4的重组C1 Inh的大鼠中进行可比较的药代动力学研究。

在Sprague Dawley雌性大鼠中静脉推注10mg/kg剂量后在不同的时间点测定残留hC1 Inh浓度：5min、10min、15min、20min、30min、60min、2h、4h、6h和24h。

在图3中，示出了单次静脉注射重组C1 Inh或Berinert后，C1 Inh的血清浓度。通过ELISA检测残留C1 Inh的百分比。对于每只动物，将C1 Inh浓度归一化为5分钟时的浓度＝100％。相对于注射后的时间对数值进行拟合并绘图。从每个组(n＝4，除了Berinert n＝7)，显示了一只代表性动物的图表。在图5中，展示了不同形式的C1 Inh的曲线下面积(AUC)的计算。

MALDI-TOF-质谱分析

为了使样品脱盐，用氯仿-甲醇将100μ0蛋白质沉淀两次，并通过真空旋转干燥。在50μL NaBH₄(1M于50mM NaOH中)在氩气下通过在50℃下温育过夜以对聚糖进行β-消除。在使用Dowex50×8(H+)脱盐并且通过从酸化的甲醇中共蒸馏甲酯来除去硼酸盐之后，如本领域已知的将干燥的残留物进行甲基化。在UltrafleXtreme仪器(Bruker Daltonics)上进行MALDI-MS。通过1:1与基质(在50％乙腈/0.1％TFA中的α-氰基-4-羟基肉桂酸)混合将甲基化聚糖糖醇应用到不锈钢靶上。通过MS1和MS2中的正离子检测进行分析(后源-衰变型式)。不同的聚糖物种的鉴别基于：i)分子离子，其提供关于单糖组成的信息；和ii)MS2分析中的碎片(B、C、Y和Z离子)。

PNG酶F消化

PNG酶F是在N-连接的糖蛋白的最内侧GlcNAc和天冬酰胺残基之间切割的酰胺酶。因此，用PNG酶F处理C1 Inh蛋白后，残留下蛋白主链和O-连接的聚糖。由于在CAP细胞中表达的血浆源性人类C1 Inh和C1 Inh之间的蛋白质主链相等，因此PNG酶F处理间接地传递关于O-聚糖结构的信息。

按照制造商的说明书进行PNG酶F消化。简言之，在37℃下使用500U PNG酶F(NEB)将100ng纯化的蛋白质培育1h。随后，在根据制造商的说明书在还原条件下在NuPAGE Novex4-12％Bis-Tris凝胶上对样品进行分离。通过印迹模块(Invitrogen)(30V下60min，在RT下)将分离的蛋白质转移到Amersham Hybond ECL膜上(100V下60min，在RT下)。在RT下使用PBSTB(磷酸盐缓冲盐水，pH＝7.4，补充有0.1％吐温20和1％BSA)将将膜封闭1小时。然后，使用在PBSTB稀释1:10000的小鼠单克隆C1 Inh特异性HRP-标记抗体培育膜。使用PBST(磷酸盐缓冲盐水pH＝7.4补充有0.1％吐温20)洗涤膜之后，使用Pierce ECL WB底物试剂盒通过化学发光检测器(INTAS)检测蛋白质。

凝集素免疫印迹

凝集素是结合特定碳水化合物结构的蛋白质。因此，生物素偶联的凝集素可用于分析N-连接的和O-连接的聚糖。鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖，花生凝集素(PNA)检测O-连接的聚糖上的β1-3连接的末端半乳糖，接骨木凝集素(Sambucus nigra agglutinin)(SNA)优先与2,6-连接的唾液酸结合，而朝鲜槐凝集素(Maackia amurensis lectin)(MAL)优先与2,3-连接的唾液酸结合。

如上所述分离具有或不具有共同表达ST3Gal1和/或ST3Gal4的纯化的蛋白质或细胞培养物上清液，并印迹到Hybond ECL硝酸纤维素膜(GE医疗保健)上。使用PBSTB(磷酸盐缓冲盐水，pH＝7.4，补充有0.1％吐温20和1％BSA)在RT下将膜封闭1h。然后，使用在PBSTB中稀释1:2000(MAL 1:400)的凝集素培育膜。在使用PBST(磷酸盐缓冲盐水，pH＝7.4，补充有0.1％吐温20)洗涤膜之后，使用链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶在RT下将膜染色1h(在PBSTB中稀释1:1000)。使用抗链亲和素IgG和抗IgG-HRP放大HRP信号。使用Pierce ECLWB底物试剂盒通过化学发光检测器(INTAS)检测蛋白质。

IEF分析

进行等电聚焦(IEF)，以分别分析纯化自CAP C1 Inh细胞或纯化自使用ST3Gal4和/或ST3Gal1转染的CAP C1 Inh细胞的C1 Inh的等电点(pI)。唾液酸化程度与给定的蛋白质酸度相关，并因此与其pI相关。IEF分析根据制造商的方案(Invitrogen)进行。简言之，将5μ言纯化的蛋白质装载在pH3-7凝胶上并进行电泳(1h 100V，1h 200V，30min 500V)。使用SimplyBlue SafeStain根据制造商的方案(Invitrogen)对蛋白质进行染色。

实施例1：

蛋白酶抑制剂C1酯酶抑制剂(C1 Inh)属于丝氨酸蛋白酶超家族。其主要功能是抑制补体系统以防止自发激活。500aa蛋白是高度糖基化的，具有7个预测的N-聚糖和8个预测O-连接的聚糖。

使用编码以ScaI线性化的ST3Gal4的载体核转染先前稳定转染以表达人类重组C1抑制剂(rhC1 Inh,SEQ ID NO:3)(CAP-C1 Inh)的人羊水细胞细胞系CAP 1D5的细胞，以促进构建体稳定整合到基因组中。载体含有药物表达盒，用于选择线性化构建体向基因组中的稳定整合。在库生成后，通过有限稀释使获得的稳定CAP-C1 Inh-ST3Gal4库经历单细胞克隆。分析选择的克隆以证实ST3Gal4的表达。然后用编码ST3Gal1基因的基因对表达ST3Gal4的CAP单细胞克隆进行进一步核转染。用抗生素选择细胞以获得稳定共表达rhC1Inh、人类ST3Gal4和ST3Gal1(CAP-C1 Inh-ST3Gal1/4)的细胞库。

为了产生足够量的重组C1 Inh，如实验程序中所描述的培养所生成的过表达人类C1 Inh的CAP-C1 Inh细胞系。随后，如下所述，从下列细胞系的细胞培养物上清液中纯化C1Inh：CAP-C1 Inh、CAP-C1 Inh-ST3Gal4、和CAP-C1 Inh-ST3Gal1/4(库A和B)。

分析细胞培养物上清液或纯化的重组C1 Inh和Berinert以测定糖结构。

使用C1 Inh特异性抗体的免疫印迹(图6)显示，纯化自血浆的C1 Inh(Berinert)在电泳过程中迁移更快，表明与来自CAP细胞的重组C1 Inh相比质量降低。唾液酸转移酶ST3Gal1与ST3Gal4组合的过表达同样提高迁移速度。通过PNG酶消化从蛋白质主链切割N-连接的聚糖后，这种效果甚至更明显，表明更快的迁移实际上是由于剩余的O-连接的聚糖的尺寸差异引起的。

为了确定N-连接的聚糖的唾液酸化程度，进行ECL凝集素免疫印迹。鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖。因此，ECL印迹中的信号减弱意味着唾液酸化量增加。如图7所示，Berinert的N-连接的聚糖几乎完全被唾液酸化。来自过表达ST3Gal4的CAP细胞的C1 Inh的N-聚糖同样地被唾液酸化，来自过表达ST3Gal1/4的CAP细胞的C1 Inh显示出稍高量的去唾液酸的N-聚糖。相比之下，纯化自不存在过表达唾液酸转移酶的CAP细胞的C1 Inh在ECL印迹中产生强烈的信号，指示了大量的去唾液酸的N-聚糖。

首先通过PNA凝集素免疫印迹，测试过表达ST3Gal1后的CAP细胞中重组C1 Inh的O连接的聚糖的唾液酸化程度。花生凝集素(PNA)检测O-连接的聚糖上的β1-3连接的末端半乳糖。因此，PNA凝集素印迹中的信号减弱意味着O-聚糖的半乳糖残基的唾液酸化水平升高。如图8所示，从过表达ST3Gal1的CAP细胞的细胞培养物上清液纯化的C1 Inh不显示信号，表明了O-聚糖的完全唾液酸化。对于血浆来源的C1 Inh,Berinert也是如此。

凝集素印迹的结果可以通过等电聚焦(IEF)确认。由于不同C1 Inh的主链是相同的，IEF的变化很可能是由于唾液酸含量的变化引起。如图9所示，通过ST3Gal4的另外的表达，所得到的经修饰的C1 Inh向阳极略微位移，表明每分子唾液酸总量的少量增加。相比之下，ST3Gal1的另外的表达导致C1 Inh朝向阳极的显著位移，表明唾液酸总量显着增加。

在图10中，显示了O-连接的聚糖的详细MALDI-TOF-质谱。在图11中，通过概述不同O-聚糖结构的峰强度总结了这些数据。图12示出了所获得的数据的解释。在没有ST3Gal1或ST3Gal4的另外的过表达的CAP C1 Inh样品中，即CAP C1 Inh，可检测的O-聚糖的75％是仅具有35％唾液酸化的O-聚糖且不具有末端半乳糖残基的核2结构(Gal1-3(Gal1-GlcNAc1-6)GalNAc-ol_核2)(m/z 983)或NeuAc2-3Gal1-3(Gal1-4GlcNAc1-6)GalNAc-ol(m/z1344)、Gal1-3(NeuAc2-3Gal1-4GlcNAc1-6)GalNAc-ol(m/z 1344)和NeuAc2-3Gal1-3(NeuAc2-3Gal1-4GlcNAc1-6)GalNAc-ol(m/z 1706))。核1结构仅很少被检测到。ST3Gal4的另外的表达导致向向核1结构转变(68.7％)(NeuAc2-3Gal1-3GalNAc-ol_核1)。有趣的是，CAP细胞中C1 Inh的表达与ST3Gal1的过表达相结合，导致排他性表达核1 O-聚糖(99.1％)，其几乎完全被唾液酸化(98.5％)而不具有任何末端半乳糖残基，特别是(NeuAc2-3Gal1-3GalNAc-ol，分别Gal1-3(NeuAc2-6)GalNAc-ol(m/z 895)和NeuAc2-3Gal1-3(NeuAc2-6)GalNAc-ol(m/z 1256)。

为了确定不同的糖改良的重组体C1 Inh、CAP-C1 Inh-ST3Gal4和CAP-C1 Inh-ST3Gal1/4相对于来自CAP细胞(野生型)的重组C1 Inh或血浆来源的C1 Inh(Berinert)的血清半衰期，进行药代动力学研究。

在对不同样品的浓度时间曲线进行归一化后，显而易见的是，不同的样品聚簇成具有几乎相同形状和曲线进展的两个不同组：一方面，没有进一步表达任何唾液酸转移酶的CAP C1 Inh与CAP-C1 Inh-ST3Gal4一起，另一方面，CAP-C1 Inh-ST3Gal1/4与血浆来源的人类C1 Inh,Berinert一起(图3)。一组中的物质按照相同的药代动力学以相同的方式被从血液流中除去。

虽然单独的ST3Gal4的过表达对重组表达的C1 Inh的血清半衰期没有有益的影响，但是ST3Gal1的另外的共表达使血清半衰期增强了约6倍(图4)。与未修饰的C1 Inh相比，AUC和生物利用度增加约6倍，并且相当于测量的Berinert的AUC值(图5)。简言之，这些结果指明，对于展示N-聚糖以及O-聚糖的糖蛋白，O-聚糖的宽唾液酸化与N-聚糖一样重要。

实施例2：

肝细胞生长因子是成熟实质肝细胞的有效促分裂原，似乎是肝营养因子，并且作为广谱组织和细胞类型的生长因子。728aa大小的蛋白质含有4个预测的N-聚糖和1个预测的O-连接的聚糖。

使用编码ST3Gal4、ST3Gal1的载体或编码以ScaI线性化的ST3Gal4和ST3Gal1的载体核转染稳定表达人重组肝细胞生长因子(SEQ ID NO:4)的CAP 1D5细胞，以促进构建体稳定整合到基因组中。载体含有药物表达盒，其有助于细胞的选择，在该细胞中，线性化构建体稳定整合到基因组中。在库生成之后，如实验程序中所描述的培养所获得的稳定CAP细胞库、CAP-HGF、CAP-HGF-ST3Gal1、CAP-HGF-ST3Gal4和CAP-HGF-ST3Gal1/4。通过ECL和PNA凝集素印迹检测含有重组人类HGF的细胞培养物上清液，以确定存在的N-和O-连接的糖结构。

鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖。因此，ECL印迹中的信号减弱意味着唾液酸化的量增加。如图13所示，ST3Gal4或ST3Gal1/4的过表达导致N-连接的聚糖的唾液酸化增加，而ST3Gal1的过表达没有影响。

通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后CAP细胞中重组HGF的唾液酸化量。花生凝集素(PNA)检测O-连接的聚糖上的β1-3连接的末端半乳糖。因此，PNA凝集素印迹中的信号减少意味着O-聚糖的半乳糖残基的唾液酸化水平升高。如图13所示，单独的ST3Gal1或与ST3Gal4组合的过表达导致重组HGF的O-聚糖的唾液酸化显著增加。

实施例3：

为了研究在唾液酸转移酶ST3Gal1的过表达之后，观察到的糖蛋白的O-聚糖的唾液酸化增加是否是用于制备用于药物生产/或生物医学研究的重组蛋白质或病毒的不同细胞系的共同特征，进行了下列实验。

使用编码ST3Gal1的载体或编码以ScaI线性化的ST3Gal1和ST3Gal4的载体核转染293F细胞(生命科技，R-970-07)、永生化人胚胎肾细胞，以促进构建体稳定整合到基因组中。载体含有药物表达盒，其有助于细胞的选择，该细胞中线性化构建体稳定整合到基因组中。在库生成之后，使用编码hC1 Inh的基因进一步核转染所获得的稳定293F细胞库、293F-ST3Gal1和293F-ST3Gal1/4以及野生型293F细胞。使用抗生素对细胞进行选择以获得稳定表达i)rhC1 Inh，ii)rhC1 Inh和人类ST3Gal1，iii)rhC1 Inh、人类ST3Gal1和人类ST3Gal4的细胞库。如在方法章节中描述的从含有细胞培养物上清液的C1 Inh纯化C1 Inh并且通过ECL和PNA凝集素印迹检查，以确定存在的N-和O-连接的糖结构。

鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖。因此，ECL印迹中的信号减弱意味着唾液酸化量增加。如图15所示，ST3Gal1/4的过表达导致N-连接的聚糖的唾液酸化增加，而单独的ST3Gal1的过表达没有影响。

通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后的293F细胞中重组C1 Inh的唾液酸化量。花生凝集素(PNA)检测O-连接的聚糖上的β1-3连接的末端半乳糖。因此，PNA凝集素印迹中降低的信号意味着O-聚糖的半乳糖残基的唾液酸化水平升高。如图15所示，ST3Gal1单独或与ST3Gal4组合的过表达导致重组人C1 Inh的O-聚糖的唾液酸化显著增加。

实施例4：

将CHO-K1(ATCC，CCL-61)细胞系作为来自成年中国仓鼠卵巢活组织检查的亲本CHO细胞系的亚克隆。

为了研究在非人哺乳动物细胞系中是否也发生所观察到的在人唾液酸转移酶ST3Gal1的过表达后O连接的聚糖的唾液酸化增加，在存在或不存在唾液酸转移酶ST3Gal1的情况下，在这些细胞中表达人C1 Inh。

使用编码以ScaI线性化的ST3Gal1的载体核转染CHO-K1细胞，以促进构建体稳定整合到基因组中。载体含有药物表达盒，其有利于选择具有稳定整合到基因组中的线性化构建体的细胞。在库生成之后，使用编码hC1 Inh的基因进一步核转染所获得的稳定CHO-K1细胞库、CHO-ST3Gal1和野生型CHO-K1细胞。使用抗生素选择细胞以获得稳定表达i)rhC1Inh，ii)rhC1 Inh和人类ST3Gal1的细胞库。

如方法章节中所描述的扩增细胞。为了生产含有人类C1 Inh的细胞培养物上清液，将细胞接种于10cm细胞培养皿中，使用1xPBS广泛地洗涤接种3d后的细胞以去除胎牛血清，随后加入新鲜的无血清培养基。四天后，收获细胞培养物上清液，通过离心并通过0.22收获过滤器过滤除去细胞和细胞碎片。如方法章节中所描述的，纯化C1 Inh。

通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后的CHO-K1细胞中重组C1 Inh的O-聚糖的唾液酸化量。花生凝集素(PNA)检测O-连接的聚糖上β1-3连接的末端半乳糖。因此，PNA凝集素印迹中降低的信号意味着O-聚糖的半乳糖残基的唾液酸化水平升高。如图16所示，单独的ST3Gal1的过表达导致重组人C1 Inh的O-聚糖的唾液酸化的显著增加。

实施例5：

稳定转染犬MDCK.1细胞(ATCC,CRL-2935)。进一步稳定转染所得到的稳定MDCK.1细胞池、MDCK.1-ST3Gal1和野生型MDCK.1细胞，以获得稳定表达i)rhC1 Inh，ii)rhC1 Inh和人ST3Gal1的细胞库。

如方法章节中所描述的扩增MDCK.1细胞。为了生产含有人C1 Inh的细胞培养物上清液，将细胞接种于225cm²细胞培养皿中，使用1xPBS广泛地洗涤接种2d后的细胞以除去胎牛血清，随后加入新鲜的无血清培养基。五天后，收获细胞培养物上清液，通过离心并通过0.22收获过滤器过滤除去细胞和细胞碎片。如方法章节中所描述的纯化C1 Inh并且通过ECL和PNA凝集素印迹检查以确定存在的N-和O-连接的糖结构。

鸡冠刺桐(ECL)凝集素检测N-连接的聚糖上的β1-4连接的末端半乳糖。因此，ECL印迹中的信号减弱意味着唾液酸化的量增加。如图17所示，ST3Gal1的过度表达不会导致N-连接的聚糖的唾液酸化增加。

通过PNA凝集素免疫印迹测试过表达ST3Gal1后的MDCK.1细胞中重组C1 Inh的O-聚糖的唾液酸化量。花生凝集素(PNA)检测O-连接的聚糖上的β1-3连接的末端半乳糖。因此，PNA凝集素印迹中的信号减少意味着O-聚糖的半乳糖残基的唾液酸化水平升高。如图17所示，单独的ST3Gal1的过表达导致重组人C1 Inh的O-聚糖的唾液酸化的显著增加。

讨论：

在上述实验中，催化唾液酸从CMP-唾液酸转移到含半乳糖的底物的ST3Gal1单独地或与ST3Gal4组合在哺乳动物细胞中过表达。

ST3Gal1的过表达导致共表达的O-糖基化重组蛋白的几乎完全唾液酸化。此外，GalNAc O-聚糖的异质性显著降低。

令人惊讶的是，单独的ST3Gal4的过表达对检查的糖蛋白的药代动力学特征没有影响，而ST3Gal1的附加过表达和由此导致的GalNAc O-聚糖唾液酸化程度的升高使血清半衰期增加了约6倍。

为了提高其药代动力学特征，修饰治疗性蛋白质的聚糖结构是非常有效的工具。在本发明的情况下，特别地解决了治疗性蛋白质的两个常见弱点，第一是有限的血清半衰期以及第二是糖结构的异质性。这可以通过强制表达ST3Gal1酶来实现，生产分泌的糖蛋白显示几乎完全唾液酸化的GalNAc O-聚糖。

本发明不限于来自一个宿主的一种特定细胞系，而是适用于大范围的动物细胞系。另外，它不限于糖蛋白的一个特定组，而适用于含有至少一种GalNAc O-连接的聚糖的各种糖蛋白，例如生长因子、肽激素、细胞因子、酶、抗体、抗体片段、凝血因子或蛋白酶抑制剂。

本发明涉及以下氨基酸序列和核苷酸序列。

SEQ ID NO:1

人类ST3Gal1

SEQ ID NO:2

人类ST3Gal4

SEQ ID NO:3

人类C1 Inh

SEQ ID NO:4

人类HGF

SEQ ID NO:5

ST3Gal1基序3共有序列

HYWE 4

SEQ ID NO:6

黑猩猩ST3Gal1

SEQ ID NO:7

猕猴ST3Gal1

SEQ ID NO:8

野猪ST3Gal1

SEQ ID NO:9

褐家鼠ST3Gal1

SEQ ID NO:10

小家鼠ST3Gal1

SEQ ID NO:11

盲小鼹形鼠ST3Gal1

SEQ ID NO:12

短尾负鼠ST3Gal1

SEQ ID NO:13

家兔ST3Gal1

SEQ ID NO:14

灰地鼠ST3Gal1

SEQ ID NO:15

家犬ST3Gal1

SEQ ID NO:16

家猫ST3Gal1

SEQ ID NO:17

家马ST3Gal1

SEQ ID NO:18

原鸡ST3Gal1

SEQ ID NO:19

原鸽ST3Gal1

SEQ ID NO:20

扬子鳄ST3Gal1

SEQ ID NO:21

矛尾鱼ST3Gal1

SEQ ID NO:22

玻璃海鞘ST3Gal1

序列表

<110> 塞维克制药有限责任公司

<120> O-聚糖唾液酸化的重组糖蛋白及用于生产其的细胞系

<130> C 4674WO - kl

<150> EP15000016.4

<151> 07.01.2015

<160> 22

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 340

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

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<212> PRT

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50 55 60

Thr Arg Cys Ile Glu Glu Gln Arg Val Ser Ala Trp Phe Asp Glu Arg

65 70 75 80

Phe Asn Arg Ser Met Gln Pro Leu Leu Thr Ala Lys Asn Ala His Leu

85 90 95

Glu Glu Asp Thr Tyr Lys Trp Trp Leu Arg Leu Gln Arg Glu Lys Gln

100 105 110

Pro Asn Asn Leu Asn Asp Thr Ile Arg Glu Leu Phe Gln Val Val Pro

115 120 125

Gly Asn Val Asp Pro Leu Leu Glu Lys Arg Leu Val Ser Cys Arg Arg

130 135 140

Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Lys Glu Ser Tyr Tyr Gly

145 150 155 160

Pro Gln Ile Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Lys Ala Pro

165 170 175

Thr Glu Gly Phe Glu Ala Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr His His Phe

180 185 190

Val Tyr Pro Glu Ser Phe Arg Glu Leu Ala Gln Glu Val Ser Met Ile

195 200 205

Leu Val Pro Phe Lys Thr Thr Asp Leu Glu Trp Val Ile Ser Ala Thr

210 215 220

Thr Thr Gly Arg Ile Ser His Thr Tyr Val Pro Val Pro Ala Lys Ile

225 230 235 240

Lys Val Lys Lys Glu Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys

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Tyr Val Phe Asp Arg Trp Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr

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Gly Ile Leu Ser Val Ile Phe Ser Leu His Ile Cys Asp Glu Val Asp

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Leu Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly Asn Trp His His Tyr Trp

290 295 300

Glu Asn Asn Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp

305 310 315 320

Gly Asp Phe Glu Ser Asn Val Thr Thr Ile Leu Ala Ser Ile Asn Lys

325 330 335

Ile Arg Ile Phe Lys Gly Arg

340

<210> 9

<211> 340

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 9

Met Val Asn Met Arg Lys Arg Thr Leu Lys Tyr Leu Thr Phe Phe Leu

1 5 10 15

Leu Phe Ile Phe Leu Thr Ser Phe Val Leu Asn Tyr Ser Asn Ser Gly

20 25 30

Val Pro Ser Ala Trp Phe Pro Lys Gln Met Val Leu Glu Phe Ser Glu

35 40 45

Asn Phe Arg Lys Phe Ile Lys Ser Gln Pro Cys Thr Cys Arg His Cys

50 55 60

Ile Ser Gln Gly Lys Val Ser Tyr Trp Phe Asp Gln Arg Phe Asn Lys

65 70 75 80

Thr Met Gln Pro Leu Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Met Glu Glu Asp

85 90 95

Thr Tyr Arg Trp Trp Leu Arg Leu Gln Arg Glu Arg Lys Pro Asn Asn

100 105 110

Leu Ser Asp Thr Val Lys Glu Leu Phe Arg Leu Val Pro Gly Asn Val

115 120 125

Asp Pro Met Leu Asn Lys Arg Leu Val Gly Cys Arg Arg Cys Ala Val

130 135 140

Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Lys Asp Ser Ser Tyr Gly Pro Glu Ile

145 150 155 160

Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr Val Gly

165 170 175

Phe Glu Ala Asp Val Gly Ser Arg Thr Thr His His Leu Val Tyr Pro

180 185 190

Glu Ser Phe Arg Glu Leu Gly Glu Asn Val Asn Met Val Leu Val Pro

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Gln Glu Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr Val Phe

245 250 255

Asp Asn Trp Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly Ile Leu

260 265 270

Ser Val Ile Phe Ser Ile His Ile Cys Asp Glu Val Asp Leu Tyr Gly

275 280 285

Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu Asn Asn

290 295 300

Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly Asp Phe

305 310 315 320

Glu Tyr Asn Val Thr Thr Thr Leu Ala Ala Ile Asn Lys Ile Arg Ile

325 330 335

Phe Lys Gly Arg

340

<210> 10

<211> 337

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 10

Met Arg Arg Lys Thr Leu Lys Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Phe Leu Thr Ser Phe Val Leu Asn Tyr Ser Asn Thr Gly Val Pro Ser

20 25 30

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Arg Phe Ile Lys Ser Gln Pro Cys Thr Cys Arg His Cys Ile Ser Gln

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Asp Lys Val Ser Tyr Trp Phe Asp Gln Arg Phe Asn Lys Thr Met Gln

65 70 75 80

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85 90 95

Trp Trp Leu Arg Leu Gln Arg Glu Arg Lys Pro Asn Asn Leu Ser Asp

100 105 110

Thr Val Lys Glu Leu Phe Arg Leu Val Pro Gly Asn Val Asp Pro Met

115 120 125

Leu Asn Lys Arg Leu Val Gly Cys Arg Arg Cys Ala Val Val Gly Asn

130 135 140

Ser Gly Asn Leu Lys Asp Ser Ser Tyr Gly Pro Glu Ile Asp Ser His

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Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Lys Ala Pro Thr Val Gly Phe Glu Ala

165 170 175

Asp Val Gly Ser Arg Thr Thr His His Leu Val Tyr Pro Glu Ser Phe

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr Val Phe Asp Asn Trp

245 250 255

Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly Ile Leu Ser Ile Ile

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Phe Ser Ile His Ile Cys Asp Glu Val Asp Leu Tyr Gly Phe Gly Ala

275 280 285

Asp Ser Lys Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu Asn Asn Pro Ser Ala

290 295 300

Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly Asp Phe Glu Tyr Asn

305 310 315 320

Ile Thr Thr Thr Leu Ala Ala Ile Asn Lys Ile Arg Ile Phe Lys Gly

325 330 335

Arg

<210> 11

<211> 340

<212> PRT

<213> 盲小鼹形鼠

<400> 11

Met Val Asn Leu Arg Lys Lys Ile Val Lys Trp Leu Thr Phe Leu Leu

1 5 10 15

Leu Phe Val Phe Leu Thr Ser Cys Phe Leu Asn Tyr Ser Asn Ser Gly

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Val Pro Ile Thr Trp Phe Pro Lys Gln Met Val Leu Glu Leu Ser Glu

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Asn Phe Gln Lys Leu Ile Lys Gln Arg Pro Cys Thr Cys Thr His Cys

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Ile Ser Gln Ser Lys Val Ser Ser Trp Phe Asp Gln Arg Phe Asn Gln

65 70 75 80

Thr Met Gln Pro Leu Leu Thr Ala Ser Asn Ala Met Met Glu Glu Asp

85 90 95

Thr Tyr Gln Trp Trp Leu Arg Leu Gln Arg Glu Arg Lys Pro Asn Asn

100 105 110

Leu Ser Asp Ile Val Lys Glu Leu Phe Ser Leu Val Pro Gly Asn Val

115 120 125

Asp Pro Val Leu Asp Lys Arg Ser Val Gly Cys Arg Arg Cys Ala Val

130 135 140

Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Ala Ser Ser Tyr Gly Ser Asp Ile

145 150 155 160

Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr Val Gly

165 170 175

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180 185 190

Glu Ser Phe Arg Glu Leu Gly Glu Asn Val Asn Met Val Leu Val Pro

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210 215 220

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Ser Val Ile Phe Ser Met His Val Cys Asp Glu Val Asp Leu Tyr Gly

275 280 285

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290 295 300

Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly Asp Phe

305 310 315 320

Glu Ser Asn Val Thr Thr Thr Leu Ala Ser Ile Asn Lys Ile Arg Ile

325 330 335

Phe Lys Gly Arg

340

<210> 12

<211> 342

<212> PRT

<213> 短尾负鼠

<400> 12

Met Ala Ala Ile Lys Lys Lys Arg Leu Lys Val Phe Thr Phe Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Ser Leu Thr Ser Phe Phe Leu Asn Tyr Ala His Thr Thr

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His Phe Lys Arg Phe Met Lys Tyr Pro Gln Arg Pro Cys Ser Cys Ser

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Asp Val Asp Pro Leu Leu Gln Lys Gly Pro Leu Ile Cys Arg Arg Cys

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Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Lys Glu Ser His Tyr Gly Lys

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Asp Ile Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr

165 170 175

Ala Gly Phe Glu Val Asp Val Gly Arg Lys Thr Thr His His Leu Val

180 185 190

Tyr Pro Glu Ser Phe Arg Glu Leu Ala Gly Asn Val Ser Met Ile Leu

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Val Asn Arg Glu Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr

245 250 255

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260 265 270

Ile Leu Ser Val Ile Leu Ser Leu His Ile Cys Asp Lys Val Asp Leu

275 280 285

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290 295 300

Asn Asn Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly

305 310 315 320

Asp Phe Glu Ser Asn Val Thr Ser Thr Leu Ala Ser Leu Asn Lys Ile

325 330 335

Arg Ile Phe Lys Gly Arg

340

<210> 13

<211> 340

<212> PRT

<213> 家兔

<400> 13

Met Val Thr Pro Arg Lys Arg Thr Leu Lys Ala Leu Ala Phe Leu Met

1 5 10 15

Leu Phe Ile Phe Leu Thr Ser Phe Leu Leu Asn Tyr Ser His Thr Met

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Asn Leu Arg Lys Leu Ile Lys Thr Arg Pro Cys Thr Cys Ala His Cys

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Val Gly Gln Arg Lys Leu Ser Ala Trp Phe Asp Glu Arg Phe Asn Gln

65 70 75 80

Thr Met Gln Pro Leu Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Met Glu Glu Asp

85 90 95

Thr Tyr Arg Trp Trp Leu Lys Leu Gln Arg Glu Lys Lys Pro Asn Asn

100 105 110

Leu Asn Asp Thr Ile Lys Glu Leu Phe Ser Val Val Pro Gly Asp Val

115 120 125

Asp Pro Val Leu Glu Lys Arg Ser Val Gly Cys Arg Arg Cys Ala Val

130 135 140

Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Glu Ser Ser Tyr Gly Pro Asp Ile

145 150 155 160

Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Lys Ala Pro Thr Val Gly

165 170 175

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180 185 190

Glu Ser Phe Arg Glu Leu Gly Glu Asn Val Ser Met Val Leu Val Pro

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Gln Asp Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr Val Phe

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Asp Asn Trp Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly Ile Leu

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Ser Val Ile Phe Ser Met His Ile Cys Asp Glu Val Asp Leu Tyr Gly

275 280 285

Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu Asn Asn

290 295 300

Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Ala Asp Phe

305 310 315 320

Glu Ser Asn Val Thr Ala Thr Leu Ala Ala Ile Asn Lys Ile Arg Ile

325 330 335

Phe Lys Gly Arg

340

<210> 14

<211> 340

<212> PRT

<213> 灰地鼠

<400> 14

Met Met Thr Thr Gln Lys Lys Val Leu Lys Val Leu Thr Phe Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Ile Phe Leu Thr Ser Phe Val Leu Asn Phe Ala His Thr Thr

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Val Pro Ala Ala Trp Phe Pro Lys Gln Met Val Leu Glu Leu Ser Gln

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Asn Leu Arg Lys Leu Ile Lys Pro Pro Pro Cys Thr Cys Thr His Cys

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Ile Ser Gln Arg Lys Val Ser Ala Trp Phe Asp Lys Arg Phe Asn Gln

65 70 75 80

Thr Val Gln Pro Leu Leu Thr Ala His Asn Ala Val Leu Glu Glu Asp

85 90 95

Thr Tyr Gln Trp Trp Leu Arg Leu Gln Arg Glu Lys Lys Pro Ser Asn

100 105 110

Leu Ser Asp Thr Ile Arg Glu Leu Phe Ser Val Val Pro Gly Asn Val

115 120 125

Asp Pro Val Leu Glu Lys Lys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Cys Ala Val

130 135 140

Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Glu Ser Ser Tyr Gly Pro Glu Ile

145 150 155 160

Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr Val Gly

165 170 175

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180 185 190

Glu Ser Phe Arg Glu Leu Gly Glu Asp Val Ser Met Ile Leu Val Pro

195 200 205

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210 215 220

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Gln Asp Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr Val Phe

245 250 255

Asp Asn Trp Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly Ile Leu

260 265 270

Ser Val Ile Phe Ser Leu His Val Cys Asp Glu Val Asp Leu Tyr Gly

275 280 285

Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu Asn Asn

290 295 300

Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly Asp Phe

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Glu Ser Asn Val Thr Ala Thr Leu Ala Ala Ile Asn Lys Ile Arg Ile

325 330 335

Phe Thr Gly Arg

340

<210> 15

<211> 342

<212> PRT

<213> 家犬

<400> 15

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1 5 10 15

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Asn Val Asp Pro Leu Leu Glu Lys Arg Ser Val Gly Cys Arg Arg Cys

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Val Lys Lys Asp Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr

245 250 255

Val Phe Asp Ser Trp Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly

260 265 270

Ile Leu Ser Val Ile Phe Ser Leu His Ile Cys Asp Glu Val Asp Leu

275 280 285

Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu

290 295 300

Asn Asn Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly

305 310 315 320

Asp Phe Glu Ser Asn Val Thr Ala Thr Leu Ala Ser Ile Asn Lys Ile

325 330 335

Arg Ile Phe Lys Gly Arg

340

<210> 16

<211> 342

<212> PRT

<213> 家猫

<400> 16

Met Val Thr Val Arg Lys Arg Thr Leu Lys Val Leu Thr Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Phe Ile Phe Leu Thr Ser Phe Phe Leu Asn Tyr Ser His Thr Met

20 25 30

Val Ala Thr Thr Trp Phe Pro Lys Gln Met Val Val Glu Leu Ser Glu

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Asn Phe Lys Lys Phe Met Lys Tyr Ala His Arg Pro Cys Thr Cys Ala

50 55 60

Arg Cys Ile Gly Gln Gln Arg Val Ser Pro Trp Phe Asp Glu Arg Phe

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Asn Asn Leu Asn Asp Thr Ile Lys Glu Leu Phe Gln Val Val Pro Gly

115 120 125

Asn Val Asp Pro Leu Leu Glu Lys Lys Ser Gly Gly Cys Arg Arg Cys

130 135 140

Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Glu Ser Trp Tyr Gly Pro

145 150 155 160

Gln Ile Asp Gly His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Lys Ala Pro Thr

165 170 175

Ala Gly Phe Glu Ala Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr His His Leu Val

180 185 190

Tyr Pro Glu Ser Phe Arg Glu Leu Gly Glu Asn Val Ser Met Val Leu

195 200 205

Val Pro Phe Lys Thr Thr Asp Leu Glu Trp Val Val Ser Ala Thr Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Ile Ser His Thr Tyr Val Pro Val Pro Ala Lys Ile Lys

225 230 235 240

Val Lys Lys Asn Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr

245 250 255

Val Phe Asp Asn Trp Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly

260 265 270

Ile Leu Ser Val Ile Phe Ser Leu His Ile Cys Asp Glu Val Asp Leu

275 280 285

Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu

290 295 300

Asn Asn Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly

305 310 315 320

Asp Phe Glu Ser Asn Val Thr Ala Thr Leu Ala Ser Ile Asn Lys Ile

325 330 335

Arg Ile Phe Lys Gly Arg

340

<210> 17

<211> 342

<212> PRT

<213> 家马

<400> 17

Met Ala Thr His Arg Arg Arg Ile Leu Lys Val Leu Thr Leu Leu Ile

1 5 10 15

Leu Phe Ile Phe Leu Thr Ser Phe Phe Leu Asn Tyr Ser His Thr Val

20 25 30

Val Thr Thr Ala Trp Phe Pro Lys Gln Met Val Leu Glu Leu Ser Glu

35 40 45

Asn Phe Lys Lys Leu Val Gln Tyr Ser His Arg Pro Cys Ser Cys Ala

50 55 60

Arg Cys Ile Gly Gln Gln Lys Val Ser Ser Trp Phe Asp Glu Arg Phe

65 70 75 80

Asn Arg Ser Met Gln Pro Leu Leu Thr Val Gln Asn Ala Phe Leu Glu

85 90 95

Glu Asp Ala Tyr Asn Trp Trp Leu Arg Leu Gln Arg Glu Lys Glu Pro

100 105 110

Ser Asn Leu Asn Asp Thr Ile Lys Glu Leu Phe Arg Val Val Pro Gly

115 120 125

Asn Val Asp Pro Leu Leu Gly Lys Arg Ser Val Gly Cys Arg Arg Cys

130 135 140

Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Lys Glu Ser Ser Tyr Gly Pro

145 150 155 160

Gln Ile Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Lys Ala Pro Thr

165 170 175

Ala Gly Phe Glu Ala Tyr Val Gly Ser Lys Thr Thr His His Leu Val

180 185 190

Tyr Pro Glu Ser Phe Arg Glu Leu Gly Glu Asn Val Ser Met Val Leu

195 200 205

Val Pro Phe Lys Thr Thr Asp Leu Glu Trp Val Val Ser Ala Thr Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Ile Ser His Thr Tyr Val Pro Val Pro Ala Lys Ile Lys

225 230 235 240

Val Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ile Tyr His Pro Ala Phe Ile Lys Tyr

245 250 255

Val Phe Asp Asn Trp Leu Gln Gly His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly

260 265 270

Ile Leu Ser Val Ile Phe Ser Leu His Ile Cys Asp Glu Val Asp Leu

275 280 285

Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Arg Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu

290 295 300

Asn Asn Pro Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly

305 310 315 320

Asp Phe Glu Ser Asn Val Thr Ala Thr Leu Ala Ser Ile Asp Lys Ile

325 330 335

Arg Ile Phe Lys Gly Arg

340

<210> 18

<211> 342

<212> PRT

<213> 原鸡

<400> 18

Met Val Thr Val Arg Lys Arg Asn Val Lys Val Phe Thr Phe Ala Phe

1 5 10 15

Val Leu Ile Thr Val Thr Ser Phe Leu Leu Asn Tyr Lys His Gln Val

20 25 30

Thr Met Thr Thr Trp Asp Pro Lys His Ile Ile Ser Gln Phe Ser Glu

35 40 45

Gln Val Arg Lys Leu Ile Lys Phe Pro Arg Arg Pro Cys Ser Cys Ser

50 55 60

Thr Cys Ile Ser Glu Leu Gly His Ser Leu Trp Phe Asp Gln Arg Phe

65 70 75 80

Asn Ser Thr Met Gln Pro Phe Leu Thr Ser Gln Asn Ala Leu Ile Pro

85 90 95

Glu Asp Ser Tyr Arg Trp Trp Leu Lys Leu Gln Gly Glu Lys Ser Pro

100 105 110

Lys Asn Ile Asn Asp Thr Leu Lys Glu Leu Phe Gly Ile Ile Pro Gly

115 120 125

Asp Arg Asp Pro Leu Gln Glu Arg Gly Thr Phe Ser Cys Arg Arg Cys

130 135 140

Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Gln Ser Gln Tyr Gly Gln

145 150 155 160

Asp Ile Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr

165 170 175

Ile Gly Tyr Glu Ser Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr His His Phe Val

180 185 190

Tyr Pro Glu Ser Tyr Lys Glu Leu Ala Glu Asn Val Ser Met Ile Val

195 200 205

Ile Pro Phe Lys Thr Leu Asp Leu Arg Trp Ile Val Thr Ala Leu Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Ile Asn Phe Thr Tyr Val Pro Val Pro Arg Lys Ile Lys

225 230 235 240

Val Arg Lys Glu Lys Val Leu Ile Tyr Asn Pro Ser Phe Ile Lys Tyr

245 250 255

Val Tyr Glu Asn Trp Leu Gln Asn His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly

260 265 270

Leu Leu Ser Val Ile Phe Ala Leu His Val Cys Asp Glu Val Asn Val

275 280 285

Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly His Trp His His Tyr Trp Glu

290 295 300

Asn Asn Ala Ser Ala Gly Ala Phe Arg Gln Thr Gly Val His Asp Gly

305 310 315 320

Asp Phe Glu Phe Asn Val Thr Leu Thr Leu Ala Ser Ile Glu Lys Ile

325 330 335

Lys Phe Phe Lys Gly Arg

340

<210> 19

<211> 342

<212> PRT

<213> 原鸽

<400> 19

Met Val Val Val Arg Arg Arg Asn Val Lys Val Phe Thr Phe Ala Phe

1 5 10 15

Leu Leu Ile Thr Val Thr Ser Phe Leu Leu Asn Tyr Thr His Gln Val

20 25 30

Thr Thr Thr Thr Trp Asp Pro Arg His Leu Val Met Gln Phe Ser Glu

35 40 45

Gln Val Gln Lys Leu Phe Lys Tyr Pro Arg Arg Pro Cys Ser Cys Arg

50 55 60

Ser Cys Ile Ser Glu Leu Gly His Ser Leu Trp Phe Asp Gln Arg Phe

65 70 75 80

Asn Ser Thr Met Gln Pro Phe Leu Thr Ser Gln Asn Ala Leu Ile Pro

85 90 95

Glu Asp Ser Tyr Arg Trp Trp Leu Lys Leu Gln Gly Glu Lys Thr Pro

100 105 110

Lys Asn Ile Asn Ala Thr Leu Lys Glu Leu Phe Glu Phe Ile Pro Gly

115 120 125

Asp Gly Asp Pro Leu Gln Glu Arg Gly Thr Ser Thr Cys Arg Arg Cys

130 135 140

Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Leu Gln Ser Gln Tyr Gly Gln

145 150 155 160

Asp Ile Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr

165 170 175

Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr His His Phe Val

180 185 190

Tyr Pro Glu Ser Tyr Lys Glu Leu Ala Glu Asn Val Ser Met Ile Leu

195 200 205

Ile Pro Phe Lys Thr Leu Asp Leu Arg Trp Ile Val Thr Ala Leu Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Ile Asn Phe Thr Tyr Val Pro Val Pro Arg Lys Ile Lys

225 230 235 240

Val Lys Lys Glu Lys Ile Leu Ile Tyr Asn Pro Thr Phe Met Lys Tyr

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Val Tyr Glu Asn Trp Leu Gln His His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly

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Leu Leu Ser Leu Ile Phe Ala Leu His Val Cys Asp Glu Val Asn Val

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Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Arg Gly His Trp His His Tyr Trp Glu

290 295 300

Asn Asn Gly Ser Ala Gly Ala Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Gly

305 310 315 320

Asp Phe Glu Phe Asn Val Thr Leu Thr Leu Ala Ser Ile Glu Lys Ile

325 330 335

Asn Phe Phe Lys Gly Arg

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<210> 20

<211> 339

<212> PRT

<213> 扬子鳄

<400> 20

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1 5 10 15

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115 120 125

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130 135 140

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Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr Val Gly Phe

165 170 175

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Ser Phe Lys Glu Leu Pro Glu Asn Val Ser Met Ile Val Ile Pro Phe

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210 215 220

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225 230 235 240

Glu Lys Ile Leu Val Tyr His Pro Asp Phe Leu Lys Tyr Val Phe Asp

245 250 255

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260 265 270

Val Val Phe Ala Leu His Val Cys Asp Glu Val Asn Leu Tyr Gly Phe

275 280 285

Gly Ala Asn Ser Lys Gly His Trp His His Tyr Trp Glu Asn Asn Pro

290 295 300

Ser Ala Gly Ala Phe Arg Gln Thr Gly Val His Asp Gly Asp Phe Glu

305 310 315 320

Ser Asn Ile Thr Ser Thr Leu Ala Ala Val Asn Lys Ile His Leu Phe

325 330 335

Lys Gly Arg

<210> 21

<211> 333

<212> PRT

<213> 矛尾鱼

<400> 21

Met Ala Arg His Asn His Arg Ile Met Trp Leu Leu Thr Ile Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Val Tyr Met Val Ile Tyr Asp Met Gly Glu Asp Lys Gln

20 25 30

Lys Leu Ile Lys Ile Pro Ser Ile Arg Arg Leu Ser Gly Arg Thr Ile

35 40 45

Val Leu Asp Lys Lys Leu Cys Ser Cys Glu Lys Cys Val Ser Glu Lys

50 55 60

Glu Glu Ser Ala Trp Phe Asp Glu Arg Phe Asp Pro Asn Phe Gln Pro

65 70 75 80

Ile Leu Met Thr Glu Val Gln Asp Ile Pro Ser His Ala Leu Gln Trp

85 90 95

Trp Leu Ser Leu Gln Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Asn Leu Ser Glu Ser

100 105 110

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115 120 125

Arg Asp Pro Ala His Cys Arg Lys Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly

130 135 140

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145 150 155 160

Val Ile Arg Met Asn Arg Ala Arg Thr Ala Gly Phe Glu Pro Asp Val

165 170 175

Gly Ile Lys Thr Thr His His Leu Met Tyr Pro Glu Ser Ser Gln Asp

180 185 190

Leu Gln Pro Gly Val His Leu Val Leu Leu Pro Phe Lys Ile Met Asp

195 200 205

Phe Glu Trp Ile Arg Ser Ala Leu Thr Thr Gly Glu Ile Thr Arg Thr

210 215 220

Tyr Phe Arg Val Gln Gln Phe Ile Lys Ala Asp Lys Asp Lys Val Leu

225 230 235 240

Ile Ile Asn Pro Thr Phe Phe Lys Tyr Val Cys Asp His Trp Thr Glu

245 250 255

His His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly Met Thr Ala Leu Val Phe Ala

260 265 270

Leu His Ile Cys Asp Glu Val Ser Val Phe Gly Tyr Gly Ala Asp Ser

275 280 285

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290 295 300

Phe Arg Arg Thr Gly Val His Ser Gly Asp Phe Glu Ser Gln Ile Ile

305 310 315 320

Lys Lys Leu Ala Asp Glu Gly Lys Ile Ile Phe Tyr Lys

325 330

<210> 22

<211> 379

<212> PRT

<213> 玻璃海鞘

<400> 22

Met Leu Ile Asn Phe Lys Leu Ser Arg Val Ile Ala Met Leu Leu Val

1 5 10 15

Val Ala Ile Phe Leu Thr Tyr Ser Trp Leu Leu Leu Trp Ser Thr Lys

20 25 30

Thr Ala Leu Gln Thr Asn Arg Lys Asn Lys Ala Gly Gln Asp Glu Val

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130 135 140

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145 150 155 160

Phe Ala Arg Leu Thr His Asp Arg Glu Ala Gly Cys Arg Ser Cys Ala

165 170 175

Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Ile Leu Asn Ser Asn Tyr Gly Asn Val

180 185 190

Ile Asp Gly His Asp Phe Val Ile Arg Met Asn Lys Gly Pro Thr Tyr

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Val Pro Phe Gln Pro Leu Asp Ile Lys Trp Leu Leu Ser Ala Leu Thr

245 250 255

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260 265 270

Cys Asp Lys Ser Lys Ile Thr Ile Ile Ser Pro Thr Phe Ile Arg Tyr

275 280 285

Val His Asp Arg Trp Thr Gln His His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly

290 295 300

Leu Leu Ala Leu Ile Tyr Ala Leu His Glu Cys Asp Glu Val Asp Val

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325 330 335

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Leu Leu Arg Val His Arg Ser Glu Gln Ser Ser

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Claims

1.一种经遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1（ST3Gal1）的细胞系，所述细胞系被进一步遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4（ST3Gal4），所述细胞系生产具有被唾液酸化至至少80%的程度的GalNAc O-聚糖的糖蛋白，相比于没有唾液酸化的糖蛋白，所述糖蛋白具有增加的血清半衰期。

2.根据权利要求1所述的细胞系，所述细胞系被进一步遗传修饰以过表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1（ST6Gal1）。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的细胞系，其中所述细胞系包含编码ST3Gal1和ST3Gal4的内源基因以及可选的编码ST6Gal1的内源基因，并且进一步具有选自由启动子、增强元件和稳定元件组成的组中的至少一种遗传元件，所述遗传元件在适合于引起ST3Gal1和ST4Gal4以及可选的ST6Gal1的过表达的一个或多个位置被插入到基因组中。

4.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中所述细胞系包含编码ST3Gal1和ST3Gal4的外源核酸以及任选的编码ST6Gal1的外源核酸。

5.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中所述细胞系是哺乳动物细胞系。

6.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中所述细胞系源自选自由AGE.CR®细胞、Vero细胞、MDCK细胞、BHK细胞、CHO细胞、HEK293细胞、HepG2细胞、Huh7细胞、AGE1.HN®细胞、NC5T11细胞、Per.C6细胞、HMCLs细胞、MM.1细胞、U266细胞、RPMI18226细胞、HKB11细胞、NM细胞、NM-F9细胞和CAP细胞组成的组的细胞系。

7.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中所述细胞系源自包含编码腺病毒E1和pIX区域的基因产物的至少一种核酸的人类原代羊水细胞。

8.根据权利要求1或2所述的细胞系，其中所述细胞系是人类细胞系。

9.一种具有被唾液酸化至至少80%的程度的GalNAc O-聚糖的重组糖蛋白，其中在根据权利要求1至8中任一项所述的细胞系中生产所述糖蛋白，其中所述GalNAc O-聚糖的至少80%是核1 GalNAc O-聚糖，其中所述核1 GalNAc O-聚糖被二唾液酸化至至少25%的程度。

10.根据权利要求9所述的重组糖蛋白，具有被唾液酸化至至少95%的程度的GalNAc O-聚糖。

11.根据权利要求9或10所述的重组糖蛋白，其中所述糖蛋白选自由酶、抗体、抗体片段、凝血因子和蛋白酶抑制剂组成的组。

12.根据权利要求9或10所述的重组糖蛋白，其中所述糖蛋白选自由肝细胞生长因子（HGF）、促红细胞生成素（EPO）、因子VIII（FVIII）、因子IX（FIX）、von-Willebrand-因子（vWF）和C1酯酶抑制剂（C1-抑制剂；C1 Inh）组成的组。

13.根据权利要求9或10所述的重组糖蛋白，其中所述糖蛋白是人类糖蛋白。

14.根据权利要求9或10所述的重组糖蛋白，其中所述糖蛋白为生长因子。

15.根据权利要求9或10所述的重组糖蛋白，其中所述糖蛋白为肽激素。

16.根据权利要求9或10所述的重组糖蛋白，其中所述糖蛋白为细胞因子。

17.一种用于表达具有被唾液酸化至至少80%的程度的GalNAc O-聚糖的重组糖蛋白的方法，包括与所述重组糖蛋白一起过表达β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1（ST3Gal1）以及β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶4（ST3Gal4）的步骤。

18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括与所述重组糖蛋白一起过表达β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1（ST6Gal1）的步骤。