CN101613678A

CN101613678A - 稳定表达β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的MDCK细胞系的建立

Info

Publication number: CN101613678A
Application number: CN 200910076948
Authority: CN
Inventors: 步志高; 陈伟业; 陈化兰
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2009-01-14
Filing date: 2009-01-14
Publication date: 2009-12-30

Abstract

本发明提供一种MDCK－ST3GAL I细胞系，具体地本发明提供一株稳定表达β－半乳糖苷α－2，3－唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的MDCK细胞系，其保藏号为CGMCC No.2620，本发明还提供一种构建所述MDCK－ST3GAL I细胞系的方法，以及提高禽流感病毒生长滴度和噬斑形成能力的方法，本发明还提供将所述MDCK－ST3GAL I细胞系用于研究禽流感病毒2，3连接受体倾向性的应用；用于禽流感病毒受体结合特性变异株监测的应用；用于抗禽病毒药物的筛选的应用；用于中和抗体的测定的应用；用于大规模生产细胞培养疫苗的应用。

Description

稳定表达β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的MDCK细胞系的建立

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地本发明涉及工程细胞系克隆MDCK-ST3GAL I及其构建方法，更具体地涉及一株工程细胞系克隆MDCK-ST3GAL I，其保藏号为：CGMCC No.2620，以及所述细胞系在提高禽流感病毒分离株的生长滴度及噬斑形成能力，对于禽流感病毒受体结合特性变异株监测、抗禽流感病毒药物的筛选、中和抗体的测定乃至大规模生产细胞培养疫苗生产中的应用。

背景技术

流感病毒表面的血凝素(HA)与细胞表面唾液酸寡糖受体结合侵染宿主细胞，禽流感病毒倾向识别α-2，3连接型受体(NeuAc α-2，3-Gal)，人流感病毒倾向识别α-2，6连接型受体(NeuAc α-2，6-Gal)。流感病毒不同毒株间在受体识别倾向性及亲和能力上存在显著差异，进而影响其对宿主细胞的感染、增殖和扩散能力。

病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一。目前多用鸡胚来分离流感病毒，其次是MDCK等细胞。当前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗。哺乳动物细胞生产的疫苗在动物模型显示出比较好的保护作用。MDCK细胞被认为是培养甲型和乙型流感病毒最合适的细胞系，两家机构也已经接受用MDCK和Vero细胞生产疫苗。

流感病毒由于抗原转换或抗原漂移常导致新的变异抗原的出现，因此疫苗株需要经常更换。当前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗，尽管采取了有效的纯化工艺，但是仍然存在着许多不足。不仅成本昂贵，而且鸡胚的残留物可能引起过敏反应，更主要的问题是近来发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本的有所不同，即鸡胚来源的病毒在鸡胚连续传代后常常引起HA的变异，这种变异也可能发生在病毒其它节段，结果使鸡胚来源的疫苗不能与人群中的流行毒株完全匹配。另外，不是所有的病毒都适合疫苗生产，一些病毒在鸡胚的细胞中产量很低。因此，当前要解决的问题是获得高产的母株，然后与流行毒株的HA和NA重配，使疫苗株既保持高产的特性，又具有流行毒株抗原性的特点。

MDCK来源的病毒经过连续传代后，保持了抗原的稳定性，通过MDCK细胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似。此外近年来出现的流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，故在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。然而，该两种细胞无细胞核，沉积慢，一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果，同时在“U”型孔板中，很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空洞。但MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。但MDCK细胞由于受体丰度较低，对病毒的敏感性会随其代数增加而下降，故MDCK细胞在实验室传20代以上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏感性。MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此在病毒分离时同时采用鸡胚和MDCK细胞两套系统。部分毒株虽具备在MDCK等哺乳动物细胞的复制增殖能力，但由于受体丰度较低，造成病毒滴度低，形成蚀斑能力弱，给进一步深入研究乃至疫苗和抗病毒药物研制造成极大困难。提高MDCK工程细胞系表面受体丰度，有可能改进禽流感病毒分离株的生长滴度及蚀斑形成能力。

β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)催化唾液酸与半乳糖α-2，3连接形式组成受体。本研究首次建立了提高禽流感病毒2，3连接型受体丰度的MDCK细胞系-MDCK-ST3GAL I。通过稳定表达ST3GAL I，可以增强ST3GAL I催化唾液酸与半乳糖以α-2，3形式连接的效力，从而提高MDCK细胞表面α-2，3连接型受体丰度。该稳定表达细胞系细胞表面α-2，3连接型受体丰度显著高于MDCK细胞，与MDCK相比，部分禽流感病毒分离株在MDCK-ST3GAL I上形成蚀斑更大，生长滴度更高。

稳定表达ST3GAL I的MDCK细胞系建成后，预期更适于禽流感病毒的生长，无论是病毒滴度还是蚀斑形成能力都要更高，也反向证明了禽流感病毒对α-2，3连接型受体的倾向性，不仅为研究α-2，3连接型受体提供了便捷的工具，对于我们监测禽流感病毒变异株的出现、对禽流感病毒进行受体结合特性的实时监测、及时发现受体结合特性转换的毒株也有广泛的应用价值。同时，在我们抗病毒药物筛选、疫苗株筛选及用于细胞培养疫苗的生产方面都显示出良好的应用前景。

发明内容

在本发明的一个方面，提供表达ST3GAL I的MDCK-ST3GAL I细胞系。在一个实施方案中，所述MDCK-ST3GAL I细胞系是保藏号为：CGMCC No.2620的细胞系。在一个实施方案中，所述MDCK细胞系含有编码ST3GAL I的基因。在一个实施方案中，所述编码ST3GAL I的基因序列如SEQ ID NO：1所显示。在一个实施方案中，所述ST3GAL I的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所显示。在一个实施方案中，所述编码ST3GAL I的基因序列来自鸡。

在本发明的另一个方面，提供构建MDCK-ST3GAL I细胞系的方法，所述方法包括将ST3GAL I的开放阅读框cDNA序列克隆至MDCK细胞系中。在一个实施方案中，所述ST3GAL I的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所显示。在一个实施方案中，所述ST3GAL I的基因序列如SEQ ID NO：1所显示。在一个优选实施方案中，将ST3GAL I的开放阅读框cDNA序列与真核表达载体连接，将所述真核表达载体转染到MDCK细胞系中。在一个实施方案中，所述真核表达载体是pIRES2-eGFP。

在本发明的另一个方面，提供一种提高禽流感病毒生长滴度以及噬斑形成能力的方法，该方法包括，将病毒毒株接毒于本发明构建的MDCK-ST3GAL I细胞系中。在一个实施方案中，所述病毒是禽流感病毒毒株。在一个实施方案中，所述病毒是禽流感病毒毒株H5N1亚型或H9N2亚型。在一个实施方案中，病毒在所述细胞系上的培养条件为37℃，5％CO₂。

在本发明的另一个方面，提供将本发明构建的MDCK-ST3GAL I细胞系用于提高禽流感病毒生长滴度以及噬斑形成能力的应用。

在本发明的另一个方面，提供将本发明构建的MDCK-ST3GAL I细胞系用于研究禽流感病毒2，3连接受体倾向性的应用。

在本发明的另一个方面，提供将本发明的构建的MDCK-ST3GAL I细胞系对于禽流感病毒受体结合特性变异株监测的应用。

在本发明的另一个方面，提供将本发明的构建的MDCK-ST3GAL I细胞系用于抗禽病毒药物的筛选的应用。

在本发明的另一个方面，提供将本发明的构建的MDCK-ST3GAL I细胞系用于中和抗体的测定的应用。

在本发明的另一个方面，提供将本发明的构建的MDCK-ST3GAL I细胞系用于大规模生产细胞培养疫苗的应用。

更具体地，在本发明的一个实施方案中，将鸡ST3GAL I的起始密码子前加入利于真核表达的Kozak序列，将所述基因序列连入真核表达载体pIRES2-eGFP，构建成真核表达质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I，将其转染MDCK细胞，构建成稳定表达ST3GAL I的MDCK细胞系，本发明的一株阳性MDCK-ST3GAL I细胞克隆于2008年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No2620。所述细胞系中2，3连接型受体含量显著高于MDCK细胞(至少两倍以上)，无论是禽流感病毒毒株H5N1亚型还是H9N2亚型在MDCK-ST3GAL I细胞系上测定的滴度高于或等于在MDCK细胞上测定的结果，并且这两株不同亚型的毒株较之在原代MDCK细胞上形成的蚀斑个体更大，边缘清晰，且数量也较多。

附图简述：

图1：PCR扩增目的基因ST3GAL I

M：DL2000marker

1：扩增出约1000bp的条带，与扩增的目的基因ST3GAL I大小相符

图2：质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I酶切鉴定

M：DL2000marker

1：质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I经Sac I/BamH I双切切出约1000bp的条带，即连入的目的基因大小，与预期结果相符

图3：pIRES2-eGFP质粒图谱

图4：G418耐受细胞生长曲线

横坐标：时间(天数)

纵坐标：细胞存活率(％)

选择在10-14天把细胞全部杀死的浓度作为G418的筛选浓度，即800μg/ml

图5：MDCK与MDCK-ST3GAL I细胞形态观察

上：倒置显微镜下观察细胞，MDCK与MDCK-ST3GAL I并无明显形态差异

下：荧光显微镜下观察细胞，MDCK-ST3GAL I可见清晰的绿色荧光，证明eGFP的表达，间接证明目的基因ST3GAL I的表达；而MDCK细胞并无绿色荧光

图6：MDCK与MDCK-ST3GAL I细胞株RT-PCR鉴定结果

M：DL2000marker

C：MDCK细胞对照

1-5：五株筛选出的细胞克隆，可见有两株筛选出的细胞克隆(4，5)扩增出了约1000bp的条带，与目的基因ST3GAL I大小相符

图7：流式细胞仪检测MDCK-ST3GAL I细胞绿色荧光蛋白的表达量

左：MDCK细胞对照

右：MDCK-ST3GAL I细胞，对照MDCK细胞荧光强度集中在10⁰-10¹道数区，而被测细胞主要集中在10³道数区，70％以上的细胞被检出有绿色荧光蛋白的表达，间接说明目的基因ST3GAL I的表达

图8：流式细胞仪检测MDCK-ST3GAL I细胞和MDCK细胞对不同连接型特异性凝集素的反应性。MAA与2，3连接型反应；SNA与2，6连接型反应。

A：MDCK细胞对照

B：MDCK-ST3GAL I细胞对照

C：MDCK细胞与MAA结合

D：MDCK-ST3GAL I细胞与MAA结合

E：MDCK细胞与SNA结合

F：MDCK-ST3GAL I细胞与SNA结合

MDCK-SG3GAL I细胞中50％以上的被测细胞荧光强度道数区由对照MDCK细胞的10¹-10²变为10²-10³(C，D)，说明ST3GALI基因在MDCK细胞中的稳定表达显著提高了MDCK细胞表面α-2，3连接型受体的丰度。而2，6连接型受体含量在两种细胞中并没有显示出明显差异(E，F)。

图9：不同禽流感病毒毒株TCID₅₀测定结果

不同毒株在MDCK-ST3GAL I细胞上测定的滴度高于在MDCK细胞上测定的结果。

1：DKFJ/01/02(H5N1)

2：DKGX/53/02(H5N1)

3：A/Chicken/Shandong/6/96(H9N2)

4：SD/PR8-HA A198T/T200K(H9N2)

5：A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)

6：SD/PR8-HA Q234L/D256N(H9N2)

7：SD/PR8-HA T213A/D218N/V224L(H9N2)

图10：不同禽流感病毒毒株的蚀斑形成实验

采用结晶紫染色，形成的蚀斑呈白色，背景呈紫色。DKFJ/01/02(H5N1)及A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)这两株不同亚型的毒株在MDCK-ST3GAL I上均生长良好，较之在原代MDCK细胞上形成的蚀斑个体更大，边缘清晰，数量更多。

A：DKFJ/01/02(H5N1)在MDCK-ST3GAL I细胞上形成的蚀斑

B：DKFJ/01/02(H5N1)在MDCK细胞上形成的蚀斑

C：A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)在MDCK-ST3GAL I细胞上形成的蚀斑

D：A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)在MDCK细胞上形成的蚀斑

E：病毒10000倍(10⁴)稀释在MDCK-ST3GAL I细胞上形成的蚀斑

F：病毒10000倍(10⁴)稀释在MDCK细胞上形成的蚀斑

G：病毒100000(10⁵)稀释在MDCK-ST3GAL I细胞上形成的蚀斑

H：病毒100000倍(10⁵)稀释在MDCK细胞上形成的蚀斑

图11：鸡ST3GAL I基因核苷酸序列和编码氨基酸序列

实施例

下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1真核表达质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I的构建

材料与方法

试剂与仪器

Trizol、反转录酶M-MLV购自Invitrogen公司；pMD18-T载体、oligodT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自TaKaRa公司；质粒pIRES2-eGFP购自BD Biosciences Clontech；T4DNA连接酶购自MBI公司；胶回收试剂盒购自上海华舜公司，质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司；CEQ8000自动测序仪为Beckman公司产品。

鸡beta-galactoside alpha-2，3-sialyltransferase I(ST3GAL I)基因的克隆

鸡beta-galactoside alpha-2，3-sialyltransferase I(ST3GAL I)基因(Accession NO.NM_205217)全长为1029bp的开放阅读框架(ORF)为生物公司合成，用oligo 6软件设计引物：

pf：tagagctcgccgccaccATGGTGACCGTGCGCAAG

pr：aactcgagTTAGCGGCCCTTGAAGAAC

在起始密码子ATG前加入了利于真核表达的Kozak序列(斜体表示)，同时在ORF两端引入了便于进入步克隆的两个酶切位点Sac I和Xho I(下划线表示)。

目的片段连在pMD18-T载体上，称为pMD18-T-ST3GAL I，以该质粒为模板进行PCR。反应参数见下表。

PCR产物经胶回收试剂盒回收后进一步用Sac I/Xho I双切切下目的片段与经Sac I/Sal I双切处理的真核表达载体pIRES2-eGFP连接(Xho I与Sal I为同尾酶)，获得真核表达质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I。鉴定正确后按照Qiagen质粒中提试剂盒操作说明制备转染用质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I，鉴定正确、测定浓度后可用于转染。

结果

本实验通过PCR在目的基因ORF两端人为引入了利于真核表达的Kozak序列及便于下一步克隆的两个酶切位点Sac I和Xho I(PCR结果见图1)，利用这两个酶切位点将目的基因连入真核表达载体pIRES2-eGFP(载体图谱见图3)，获得真核表达质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I。使用SacI/BamH I双酶切鉴定结果显示目的基因正确的连在了真核表达载体pIRES2-eGFP上(酶切鉴定结果见图2)。该表达载体含有巨细胞病毒(CMV)启动子序列及SV40加尾信号和终止序列，不仅能够在细胞内稳定表达外源基因ST3GAL I，载体还带有新霉素抗性基因neo及绿色荧光蛋白基因eGFP，便于用G418抗性及绿色荧光蛋白标记双重筛选。测定pIRES2-eGFP-ST3GAL I质粒浓度为11.5μg/μl，OD260/280为1.82，表明我们制备的转染质粒质量合格，可以用于下一步转染

实施例2MDCK-ST3GAL I细胞系的构建

材料与方法

试剂与仪器

G418、DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine 2000Regeant购自Invitrogen公司；胎牛血清购自GIBCO公司；MDCK细胞用含5％胎牛血清的DMEM培养液(购自gibco公司)培养。倒置显微镜为Olympus产品，荧光倒置显微镜为ZEISS公司产品。DIG Glyan Differentiation Kit为Roche产品。

确定筛选培养基中合适的G418浓度

MDCK细胞接种24孔细胞培养板待长至80％满时加入G418使其浓度分别为200、400、600、800、1000、1200μg/ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每日观察细胞生长状况，记录细胞死亡情况。培养两周后绘制细胞生长曲线确定G418的筛选浓度。

脂质体Lipofectamine 2000转染贴壁细胞及抗性细胞克隆的筛选

接种约1-3×105MDCK细胞至6孔板，培养至细胞密度约为80％～90％时可用于转染。将Lipofectamine 2000 Regeant及质粒pIRES2-eGFP-ST3GAL I溶液平衡至室温，在离心管内准备下列混合液：溶液A，稀释1μg质粒DNA溶于100μl无血清的培养液中；溶液B，稀释10μl Lipofectamine 2000至100μl无血清的培养液中。室温孵育5min后混合上述溶液，再室温孵育30min，使之形成DNA-脂质体复合物，同时用不含抗生素及血清的培养液洗涤细胞2次。将DNA-脂质体复合物覆盖于细胞表面，补加不含抗生素及血清的培养液至总体积为2ml，37℃、5％CO2培养箱培养6小时后移除培养物，更换为新鲜的含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养。

24小时后胰酶消化细胞，按1∶10的比例传代至96孔板中，用含有800μg/mL G418的5％胎牛血清DMEM培养液为压力筛选培养液继续培养，每孔200μl，每3天换液，持续G418筛选2周后，可见有抗性细胞生长。为防止交叉污染，对照MDCK细胞不进行pIRES2-eGFP空质粒转染，使细胞在含有G418的培养液中培养至死亡。选择生长状态良好的抗性细胞集落，继续用含有800μg/ml G418的压力筛选培养液稀释至细胞密度为0.5个/100μl，铺于96孔板中，每孔200μl。持续G418筛选2周后选择表达水平最高的克隆再次按有限稀释法进行单细胞克隆筛选以确保筛选出单个抗性细胞集落。筛选出的细胞胰酶消化后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板扩大培养并按常规方法冻存细胞。

RT-PCR鉴定

筛选出的细胞株与正常MDCK细胞分别铺于6孔板，每株细胞铺一个孔，调整细胞密度使每株细胞密度相当，待长满后胰酶消化收集细胞。按Trizol法从细胞中提取总RNA，步骤如下：按10cm²/ml的比例加入1mlTrizol液室温放置5min使其充分裂解，转至离心管，以0.2ml氯仿/mlTrizol加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15sec。不要使用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4℃12,000g离心15min。小心取上层水相于一新的离心管，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇，室温放置10min，4℃12,000g离心10min。弃上清，按每1ml Trizol液加入至少1ml75％乙醇的比例加入75％乙醇，温和振荡离心管悬浮沉淀，4℃7500g离心5min。室温或真空干燥5-10min，用无RNA酶的水溶解RNA，55℃-60℃水浴10min可促进RNA溶解，但不能让RNA沉淀完全干燥，那样会极大地降低其可溶性。部分溶解的RNA样品其A_260/280比值＜1.6。RNA还能被100％甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在-70℃。以上实验所有枪头、离心管、水、75％乙醇均用DEPC处理并高压，全程戴手套进行实验。

提出的总RNA按如下体系反转录成cDNA，步骤如下：首先加入提取的总RNA溶液20μl、Oligo dT 3μl、dNTP mix 4μl，轻振混匀后65℃水浴8min。之后取出反应管迅速置于冰上再依次加入下列试剂：RNA酶抑制剂(RNaseOUT)1μl、DTT 3μl、5×Buffer 8μl、M-MLV 1μl，总反应体系为40ul，37℃水浴2-3小时后即反转录成cDNA。同样以上实验所有枪头、离心管也均用DEPC处理并高压，全程戴手套进行实验。

以反转录成的cDNA为模板，以pf和pr为引物参照实施例1的反应参数进行PCR扩增。

结果

筛选培养基中G418浓度的选择

我们选择能在10-14天把细胞全部杀死的浓度作为G418的筛选浓度。根据细胞生长曲线(图4)，G418浓度在700～800μg/ml之间时，细胞于10-14天全部死亡。因此选择800μg/ml为实验中MDCK细胞的压力筛选培养基中G418的浓度。

RT-PCR鉴定结果

由RT-PCR结果(图6)可见，有两株筛选出的细胞株扩增出1000bp的条带，且条带单一、清晰，与目的基因大小一致。而对照组正常MDCK细胞未见有扩增条带。说明我们的目的基因已整合进MDCK细胞中。将这两株细胞按常规方法扩增冻存，选用其中一株进行后续实验，命名为MDCK-ST3GAL I。

目的细胞的筛选

正常MDCK细胞近似棱形，贴壁生长。转染质粒后，使用G418浓度为800μg/ml的5％胎牛血清的DMEM培养液进行筛选，获得抗性细胞克隆。在含G418的培养液中，未转染质粒的细胞死亡。将获得的抗性细胞混合克隆用G418进行系列稀释、鉴定、选择后得到单克隆抗性细胞株。荧光显微镜下可见清晰的绿色荧光，证明eGFP表达，也间接证明目的基因ST3GAL1的表达成功，MDCK-ST3GAL I与正常MDCK细胞未见明显的形态差异(图5)。持续传代过程中我们使用无G418培养液培养仍可见绿色荧光的表达，同时在后续的RT-PCR鉴定过程中我们也使用的是无G418培养液培养的细胞株，说明目的基因已整合进MDCK细胞基因组中可持续表达。

真核表达载体pIRES2-eGFP含有巨细胞病毒(CMV)启动子序列及SV40加尾信号和终止序列，可以在多种细胞内表达外源基因。将鸡ST3GAL I的开放阅读框序列cDNA克隆至pIRES2-eGFP质粒中，构建成pIRES2-eGFP-ST3GAL I表达质粒，转染MDCK细胞，构建成稳定表达ST3GAL I的MDCK细胞系。

在本部分研究工作中，我们对构建好的MDCK-ST3GAL I细胞系进行了RT-PCR鉴定，同时在无G418压力筛选下持续传代细胞株，结果显示外源基因仍可持续稳定表达至少10代以上。这些鉴定结果说明，在所得单克隆细胞株中，ST3GAL I基因开放阅读框序列cDNA已整合进入MDCK细胞基因组中，能够随着MDCK细胞传代而稳定持续地转录和表达。在筛选过程中我们发现，有限稀释法筛选过程中加入至少20％的细胞母液更有利于少量甚至单个细胞的生长，而重复一次有限稀释法筛选对于选出稳定表达目的基因的单细胞克隆是必要的。RT-PCR鉴定结果为阳性的细胞克隆都是经两次有限稀释筛选出的细胞克隆。之后我们还使用Westernblot对MDCK-ST3GAL I细胞系与MDCK细胞进行了鉴定，方法参照DIG Glyan Differentiation Kit的方法进行，但实验结果并未显示出明显差异，进一步探究其原因，可能是细胞不同时期表达产物的量不同，Westernblot方法从敏感性、特异性等方面还不足已检测出两种细胞系的某一组份表达量的差别，也促使我们采用更加敏感与精确的方法如流式细胞术来检测目的基因的表达量。

国外研究者已将人流感病毒受体组份2，6连接基因ST6GAL I整合进MDCK细胞构建成稳定表达细胞系(12，19)，用以研究人流感病毒对2，6连接型受体的亲合能力，同时用来监测对神经氨酸酶抑制剂(NAI)呈耐药性的突变毒株的出现。之前对于流感病毒受体的研究更多的集中在人流感病毒2，6连接型受体，但当禽流感病毒突破种间限制感染人时，要求我们对于流感受体的研究更加广泛与深入。本研究首次成功构建稳定表达ST3GAL I的MDCK细胞系MDCK-ST3GAL I，通过增强ST3GAL I催化唾液酸与乳糖以α2，3形式连接的效力以期提高MDCK细胞表面NeuAcα-2，3-Gal受体丰度。该稳定表达细胞系的建立，不仅为禽流感病毒2，3连接受体倾向性提供了重要的研究工具，对于禽流感病毒受体结合特性变异株监测、抗禽病毒药物的筛选、中和抗体的测定乃至大规模生产细胞培养疫苗生产应用，具有广泛应用前景。

实施例3流式细胞仪检测ST3GAL I的表达

材料与方法

试剂与仪器

流式细胞仪为Beckman产品。DIG Glyan Differentiation Kit(CatNo.11210238001)、Anti-digoxigenin-rhodamine均购自Roche公司。

流式细胞检测ST3GAL I的表达

MDCK与MDCK-ST3GAL I分别铺于六孔板各三个孔。待细胞密度约为90％时(每孔细胞约为1.5×106个细胞)，胰酶消化，分别收集每孔细胞，加少量含血清的培养液以中和胰酶活性，收集细胞沉淀。用含10mMGlycine的PBS洗两次，再用Buffer 1(50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、1mM MgCl₂、1mM MnCl₂、1mM CaCl₂，PH 7.5)洗一次。用配置好的封闭液Blocking Solution (10倍稀释Blocking Solution于TBS中，TBS：0.05MTris-HCl、0.15M NaCl，PH 7.5)均匀重悬细胞沉淀，在冰上封闭1小时。之后按上述方法重复洗涤步骤，再分别用MAA、SNA及空白对照(即不加一抗)同样处理MDCK与MDCK-ST3GAL I，即1μl一抗(或不加)于30μlBuffer 1中均匀重悬细胞沉淀，冰上孵育1小时。重复洗涤步骤，再用1μl罗丹明标记抗地高辛二抗(Anti-digoxigenin-rhodamine，Roche)于30μlBuffer 1中均匀重悬细胞沉淀，冰上孵育1小时，最后PBS洗涤三次后可用于流式检测。(12，19)

结果

目的基因的表达与荧光强度成正相关，相对荧光强度单位用“道数”表示(X轴)。本实验中，我们构建的MDCK-ST3GAL I细胞系有绿色荧光蛋白eGFP的表达，因此可以不做特殊处理直接用于流式细胞仪的检测。由图7可知，至少70％以上的细胞被检出有绿色荧光蛋白的表达，对照MDCK细胞荧光强度集中在10⁰-10¹道数区，而被测细胞主要集中在10³道数区，同荧光显微镜下观察的结果相符，证明我们经过两次单克隆筛选，选出了比较纯一的表达外源基因的细胞克隆。

为了检测α-2，3及α-2，6连接型受体在MDCK及MDCK-SG3GAL I的含量，我们使用地高辛标记的两种凝集素作为一抗检测α-2，3及α-2，6连接型受体的表达量：黑接骨木果凝集素(Sambucus nigra agglutinin，SNA)特异性识别2，6连接型唾液酸，高丽槐黄柏甙凝集素(Maackia amurensisagglutinin，MAA)特异性识别2，3连接型唾液酸(Roche)。罗丹明标记抗地高辛抗体为二抗。检测结果显示，MDCK-SG3GAL I细胞中α-2，3连接型受体含量著高于MDCK细胞，50％以上的被测细胞荧光强度道数区由对照MDCK细胞的10¹-10²变为10²-10³。说明ST3GAL I基因在MDCK细胞中的稳定表达显著提高了MDCK细胞表面α-2，3连接型受体的丰度。而2，6连接型受体含量在两种细胞中并没有显示出明显差异(图8)。

流式细胞仪检测目的基因的表达

流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting，FACS)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术，是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。近20年来，国内外在FACS上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大FACS的应用领域和使用效果。FACS在免疫组织化学中的应用也大致相同，并注重了在临床应用的推广。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

在本部分实验中，我们使用了特异识别2，3连接型唾液酸受体的MAA与特异识别2，6连接型唾液酸受体的SNA为抗体检测不同连接型受体的表达。1958年，S.H.Madin和N.B.Darby从表观正常的成年雌性科克猎犬的肾建立了MDCK(NBL-2)细胞株。α-2，3与α-2，6连接型受体在MDCK细胞上都表达，因此它成为研究流感病毒的主要细胞，广泛用于流感病毒分离、增殖、中和试验及抗病毒药物筛选。前面提到MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，其原因可能是受体在MDCK细胞上丰度较低造成的(20，23)。MDCK细胞上α-2，6连接型受体丰度要比α-2，3型受体丰度低(6，9，18)。目前已建成提高α-2，6连接型受体表达量的MDCK细胞系以提高对人流感病毒的敏感性。本研究建立了MDCK-ST3GAL I细胞系以提高α-2，3连接型受体的丰度。流式检测结果证明我们建立的MDCK-ST3GAL I细胞系中α-2，3连接型受体的丰度要显著高于MDCK细胞。

此外，有研究证实α-2，3与α-2，6-唾液酸转移酶由于竞争相同作用底物而导致一方的过表达将抑制另一方的表达(21)，但在本研究中2，6连接型受体含量在MDCK-ST3GAL I及MDCK细胞中并没有显示出明显差异，其原因可能是：ST3Gal III、ST3Gal IV、ST6GAL I等的作用底物为Gal(β1，4)GlcNAc，而ST3Gal I、ST3Gal II等的作用底物为Gal(β1，3)GalNAc；SNA、MAA特异性识别不同底物生成的不同连接型的唾液酸受体(10，21)。因此，提高ST3GAL I的表达量不一定能够显著抑制2，6连接型唾液酸受体的表达量。

实施例4TCID₅₀的测定与病毒蚀斑

材料与方法

毒株与试剂

H5N1：DKFJ/01/02

DKGX/53/02

H9N2：A/Chicken/Shandong/6/96

SD/PR8-HA A198T/T200K

A/Chicken/Guangxi/10/99

SD/PR8-HA Q234L/D256N

SD/PR8-HA T213A/D218N/V224L

以上毒株(1，2)都来自于有温和型禽流感症状的养禽场，病禽表现喷嚏，咳嗽，流泪，产蛋下降、下痢等症状，死淘率升高，并且大部分禽群有细菌混合感染。采集患病禽病料标本或泄殖腔、喉头棉拭子后送往哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室进行疾病诊断和病毒分离并保存。

“r”表示采用反向遗传技术获救的病毒(5，13)，并且利用定点突变技术人为的对某些位点进行了突变(1，2)。TPCK胰蛋白酶为Sigma产品

TCID₅₀的测定

MDCK与MDCK-ST3GAL I细胞分别铺于96孔板，待细胞密度至80％-90％时用无血清DMEM洗两次以洗去死细胞及残留血清后可用于接毒。于冰上在离心管中用无血清DMEM将病毒液作连续10倍梯度稀释，从10-1-10-10。将稀释好的病毒接种到96孔板中，每一稀释度接种4个孔，每孔接种100μl。其中H9N2病毒稀释液中加入TPCK胰蛋白酶，并使其终浓度为0.5μg/ml。37℃、5％CO2培养箱感作1小时，每20分钟晃匀一次。感作完毕后弃去毒液，加入无血清DMEM，每孔200μl，H9N2病毒中还需加入终浓度为0.5μg/mlTPCK胰蛋白酶。H5N1亚型病毒培养48小时、H9N2亚型病毒培养72小时后分别吸取上清50μl血凝板中，加入等体积1％鸡红细胞悬液，20分钟后观察每孔的血凝活性，以血凝活性的有无代表细胞病变的有无，按Reed-Muench法(4)计算结果。

病毒蚀斑

MDCK与MDCK-ST3GAL I细胞分别铺于六孔板，待细胞密度至80％-90％时用无血清DMEM洗两次以洗去死细胞及残留血清后可用于接毒。用无血清DMEM 10倍梯度稀释病毒至10-8，每个稀释度接一个孔，每孔500μl，H9N2病毒稀释液中加入TPCK胰蛋白酶，使其终浓度0.5μg/ml。37℃、5％CO2培养箱感作1小时，每20分钟晃匀一次。感作完毕后弃去毒液，2×DMEM与2％低熔点琼脂糖溶液等体积混匀后铺胶于细胞表面使之完全覆盖，H9N2病毒凝胶液中需加入TPCK胰蛋白酶，使其终浓度为0.5μg/ml。待胶液凝固后倒置于细胞培养箱继续培养，72小时后结晶紫(0.1％结晶紫溶于20％甲醇中)染色观察结果。(12，19)结果

TCID₅₀测定结果

为检测提高2，3连接型受体丰度的MDCK-ST3GAL I细胞是否更适于禽流感病毒增殖，我们在H5N1及H9N2亚型毒株中各选择了几株测定其TCID50，实验结果(图9)测试的毒株中，不论是H5N1亚型还是H9N2亚型，在MDCK-ST3GAL I细胞上测定的滴度高于在MDCK细胞上测定的结果，初步说明我们构建的MDCK-ST3GAL I细胞系因2，3连接型受体丰度提高而比MDCK细胞更适于禽流感病毒的增殖。

TCID₅₀测定结果

病毒蚀斑

图10显示了DKFJ/01/02(H5N1)及A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)两株病毒进行病毒蚀斑实验的结果。实验结果表明，这两株不同亚型的毒株在MDCK-ST3GAL I上均生长良好，较之在原代MDCK细胞上形成的蚀斑个体更大，边缘清晰，且数量也较多，进一步证明我们构建的MDCK-ST3GAL I细胞系更适合禽流感病毒的增殖。

理论上讲，提高ST3GAL I表达可提高α-2，3连接型受体的丰度，所以我们构建的MDCK-ST3GAL I细胞系要比MDCK细胞对禽流感病毒更加敏感，而在其上测定的TCID50值也应该比在MDCK上测定的高。实验结果与预期相符，所测试的7个毒株中，不论是H5N1亚型还是H9N2亚型，对MDCK-ST3GAL I细胞更加敏感，病毒滴度均略高于在MDCK细胞上测得的结果。另外，氨基酸位点的突变可能影响禽流感病毒HA与宿主细胞受体的结合能力，而提高受体含量的MDCK-ST3GAL I细胞系对这些改变却更加敏感。已有报道发现对抗流感药物Zanamivir或Oseltamivir敏感性下降的变异株出现。若突变位点发生在HA受体结合位点上或其附近，则导致病毒与细胞受体亲合力下降。因此，我们构建的MDCK-ST3GALI细胞系也成为监测禽流感病毒变异的便捷工具。

病毒蚀斑又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，即蚀斑。从理论上讲，一个病毒粒可以形成一个蚀斑。反之，每产生一个蚀斑也就说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。但实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活。因此，以蚀斑形成单位(plaqueforming unit，PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度似乎更为确切。相比其它技术而言，蚀斑技术还是测定病毒悬液中感染病毒含量的一个准确方法。因为组织培养细胞的敏感性比较一致，培养条件也易统一。

蚀斑技术主要用于病毒纯化，亦即挑选病毒克隆株。由于病毒的遗传变异，一般所用的病毒悬液或所谓的病毒株，实际上都是由许多在特性上不尽一致的病毒粒子组成的混杂群体。应用蚀斑技术，也就是根据蚀斑的不同的性状、产斑条件和产斑时间等进行挑斑，可以从这类混杂群体中挑选出各个不同的纯化病毒，亦即克隆株。近年来，许多弱毒疫苗株就是能过蚀斑技术选育而成。而在弱毒疫苗的生产中，也需要经常地通蚀斑技术选出克隆株，借以保证疫苗株稳定的免疫原性和弱毒性。过去认为流感病毒在细胞传代后会出现感染力下降的情况(23)，另外由于受体丰度较低，用流感病毒感染MDCK细胞也很难取得比较高的血凝单位，通常在160血凝单位以下。然而根据物种进化的原理，如果流感病毒在MDCK连续传代两代以上而不出现毒力下降或血凝单位下降，那么可以认为病毒应该在细胞上有感染力的病毒颗粒存活下来(5)。而筛选出在细胞上高产毒株的意义在于可以和流行毒株表面抗原基因进行重配，从而获得在哺乳动物细胞上高产的流感疫苗株。

流感病毒由于抗原转换或抗原漂移常导致新的变异抗原的出现，因此疫苗株需要经常更换(8)。当前获得批准生产的是鸡胚来源的灭活疫苗，尽管采取了有效的纯化工艺，但是仍然存在着许多不足。不仅成本昂贵，而且鸡胚的残留物可能引起过敏反应，更主要的问题是鸡胚来源的病毒在鸡胚连续传代后常常引起HA的变异，这种变异也可能发生在病毒其它节段(14，15，17，22)，结果使鸡胚来源的疫苗不能与人群中的流行毒株完全匹配。应用哺乳动物细胞生产的疫苗在动物模型显示出比较好的保护作用(16)。MDCK细胞被认为是培养甲型和乙型流感病毒最合适的细胞系(7)。MDCK来源的病毒经过连续传代后，保持了抗原的稳定性(11)。然而不是所有的病毒都适合疫苗生产，一些病毒在鸡胚的细胞中产量很低。RMS(nationlicensure in reference member state)和MRP(mutual recognition procedure)已经接受用MDCK和Vero细胞生产疫苗。因此，当前要解决的问题是获得高产的母株，然后与流行毒株的HA和NA重配，使疫苗株既保持高产的特性，又具有流行毒株抗原性的特点(8)。

工业实用性

禽流感病毒在相同条件下在本发明提供的MDCK-ST3GAL I细胞系上成斑能力远远高于在MDCK细胞上的成斑能力，PFU更高，其产斑时间与MDCK细胞差别不大。使用MDCK-ST3GAL I细胞系可用于提高禽流感病毒产量并且用该细胞系避免了鸡胚来源灭活疫苗中鸡胚的残留物带来的副反应效应，可用于研究禽流感病毒2，3连接受体倾向性；用于禽流感病毒受体结合特性变异株监测；用于抗禽病毒药物的筛选；用于中和抗体的测定；以及用于大规模生产细胞培养疫苗中具有广泛的应用。

参考文献

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23Zambon，M.，and F.G.Hayden.Global Neuraminidase InhibitorSusceptibility Network.Position statement：global neuraminidaseinhibitor susceptibility network.Antiviral Res.2001 49：147-156。

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>稳定表达β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶I(ST3GAL I)的MDCK细胞系的建立

<130>IB083409

<160>2

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>1029

<212>DNA

<213>鸡

<400>1

atggtgaccg tgcgcaagcg caacgtgaag gtgttcacct tcgccttcgt gctgatcacc 60

gtgacctcct tcctgctgaa ctacaagcac caggtgacca tgaccacctg ggaccccaag 120

cacatcatct cccagttctc cgagcaggtg cgcaagctga tcaagttccc ccgccgcccc 180

tgctcctgct ccacctgcat ctccgagctg ggccactccc tgtggttcga ccagcgcttc 240

aactccacca tgcagccctt cctgacctcc cagaacgccc tgatccccga ggactcctac 300

cgetggtggc tgaagctgca gggcgagaag tcccccaaga acatcaacga caccctgaag 360

gagctgttcg gcatcatccc cggcgaccgc gaccccctgc aggagcgcgg caccttctcc 420

tgccgccgct gcgccgtggt gggcaactcc ggcaacctgc gccagtccca gtacggccag 480

gacatcgact cccacgactt cgtgctgcgc atgaaccgcg cccccaccat cggctacgag 540

tccgacgtgg gctccaagac cacccaccac ttcgtgtacc ccgagtccta caaggagctg 600

gccgagaacg tgtccatgat cgtgatcccc ttcaagaccc tggacctgcg ctggatcgtg 660

accgccctga ccaccggcac catcaacttc acctacgtgc ccgtgccccg caagatcaag 720

gtgcgcaagg agaaggtgct gatctacaac ccctccttca tcaagtacgt gtacgagaac 780

tggctgcaga accacggccg ctacccctcc accggcctgc tgtccgtgat cttcgccctg 840

cacgtgtgcg acgaggtgaa cgtgtacggc ttcggcgccg actccaaggg ccactggcac 900

cactactggg agaacaacgc ctccgccggc gccttccgcc agaccggcgt gcacgacggc 960

gacttcgagt tcaacgtgac cctgaccctg gcctccatcg agaagatcaa gttcttcaag 1020

ggccgctaa 1029

<210>2

<211>342

<212>PRT

<213>鸡

<400>2

Met Val Thr Val Arg Lys Arg Asn Val Lys Val Phe Thr Phe Ala Phe

1 5 10 15

Val Leu Ile Thr Val Thr Ser Phe Leu Leu Asn Tyr Lys His Gln Val

20 25 30

Thr Met Thr Thr Trp Asp Pro Lys His Ile Ile Ser Gln Phe Ser Glu

35 40 45

Gln Val Arg Lys Leu Ile Lys Phe Pro Arg Arg Pro Cys Ser Cys Ser

50 55 60

Thr Cys Ile Ser Glu Leu Gly His Ser Leu Trp Phe Asp Gln Arg Phe

65 707 5 80

Asn Ser Thr Met Gln Pro Phe Leu Thr Ser Gln Asn Ala Leu Ile Pro

85 90 95

Glu Asp Ser Tyr Arg Trp Trp Leu Lys Leu Gln Gly Glu Lys Ser Pro

100 105 110

Lys Asn Ile Asn Asp Thr Leu Lys Glu Leu Phe Gly Ile Ile Pro Gly

115 120 125

Asp Arg Asp Pro Leu Gln Glu Arg Gly Thr Phe Ser Cys Arg Arg Cys

130 135 140

Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Gln Ser Gln Tyr Gly Gln

145 150 155 160

Asp Ile Asp Ser His Asp Phe Val Leu Arg Met Asn Arg Ala Pro Thr

165 170 175

Ile Gly Tyr Glu Ser Asp Val Gly Ser Lys Thr Thr His His Phe Val

180 185 190

Tyr Pro Glu Ser Tyr Lys Glu Leu Ala Glu Asn Val Ser Met Ile Val

195 200 205

Ile Pro Phe Lys Thr Leu Asp Leu Arg Trp Ile Val Thr Ala Leu Thr

210 215 220

Thr Gly Thr Ile Asn Phe Thr Tyr Val Pro Val Pro Arg Lys Ile Lys

225 230 235 240

Val Arg Lys Glu Lys Val Leu Ile Tyr Asn Pro Ser Phe Ile Lys Tyr

245 250 255

Val Tyr Glu Asn Trp Leu Gln Asn His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly

260 265 270

Leu Leu Ser Val Ile Phe Ala Leu His Val Cys Asp Glu Val Asn Val

275 280 285

Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Lys Gly His Trp His His Tyr Trp Glu

290 295 300

Asn Asn Ala Ser Ala Gly Ala Phe Arg Gln Thr Gly Val His Asp Gly

305 310 315 320

Asp Phe Glu Phe Asn Val Thr Leu Thr Leu Ala Ser Ile Glu Lys Ile

325 330 335

Lys Phe Phe Lys Gly Arg

340

Claims

1.一种表达ST3GAL I的MDCK-ST3GAL I细胞系，其含有ST3GALI的编码基因序列。

2.根据权利要求1所述的MDCK-ST3GAL I细胞系，其中所述ST3GAL I的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的MDCK-ST3GAL I细胞系，其中所述编码ST3GAL I的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1-3项任一项所述的MDCK-ST3GAL I细胞系，其中在所述编码ST3GAL I的基因序列前加入Kozak序列。

5.根据权利要求1所述的MDCK-ST3GAL I细胞系，其是保藏号为CGMCC No.2620的MDCK-ST3GAL I细胞系。

6.一种构建权利要求1所述的MDCK-ST3GAL I细胞系的方法，所述方法包括将编码ST3GAL I的开放阅读框cDNA序列克隆至MDCK细胞系中。

7.权利要求6的方法，其中首先将编码ST3GAL I的开放阅读框cDNA序列与真核表达载体连接，再将所述真核表达载体转染到MDCK细胞系中。

8.一种提高禽流感病毒生长滴度以及噬斑形成能力的方法，该方法包括，将禽流感病毒毒株接毒于权利要求1-5任一项的MDCK-ST3GAL I细胞系中。

9.权利要求1-5任一项的MDCK-ST3GAL I细胞系用于提高禽流感病毒生长滴度以及噬斑形成能力的应用，用于研究禽流感病毒2，3连接受体倾向性的应用；用于禽流感病毒受体结合特性变异株监测的应用；用于抗禽病毒药物的筛选的应用；用于中和抗体的测定的应用；用于大规模生产细胞培养疫苗的应用。