CN101466402A - 糖基化改造的抗体治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产糖基化改造的抗体的方法和使用所述糖基化改造的抗体治疗患者，特别是癌症患者或具有免疫疾病或病症的患者的方法。本发明还涉及生产用于治疗具有不响应常规抗体治疗的多态性的患者的糖基化改造的抗体的方法。本发明还涉及通过糖基化改造改进抗体生物活性的方法。本发明还涉及使用糖基化改造的抗体调节抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法。

Description

糖基化改造的抗体治疗

相关申请的交叉引用

[0001]本申请要求享有2006年6月9日提交的题为“实体瘤的Fc受体多态性作为抗体介导的治疗的预后”的美国临时申请60/812,322的权益，并要求享有2007年1月29日提交的题为“糖基化改造的抗体治疗”的美国临时申请60/897,966的权益。这些优先权文件的内容通过引用被整体并入本文。

背景技术

[0002]单克隆抗体(mAb)作为治疗人疾病如癌症的一类重要的治疗剂而出现[1、2]。癌症治疗目前使用的mAb是IgG型，是在哺乳动物细胞(CHO细胞或小鼠NSO细胞系等)中生产的。识别抗原并与靶如肿瘤细胞结合之后，mAb可以触发各种效应功能，包括：1)抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；2)补体依赖性的细胞毒性(CDC)；和/或3)信号转导变化，例如，诱导细胞凋亡。

[0003]已知在Fc结构域的保守糖基化位点(N297)处适当的糖基化是在mAb和Fc受体(FcR)之间发生有效的相互作用和FcR-介导效应功能，包括抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性的细胞毒性(CDC)所必需的。已证实除去N-聚糖严重地损害ADCC和CDC。另一方面，不同形式的糖基化(即糖基化状态)发挥显著不同的效应，一些是有利的，其它则是有害的。例如，在Fc-γ受体IIIa(FcgRIIIa)介导的ADCC的效力方面，去岩藻糖基化的糖基化HERCEPTIN显示出比具有α-1，6-连接的岩藻糖残基的HERCEPTIN多至少50倍的活性[2b]。利妥昔单抗(Ritximab)和其它mAb报道了相似的结果[2c、2d]。遗憾的是，重组mAb目前是通过基因工程生产的，得到的抗体蛋白以混合的糖基化状态(也称为mAb的糖形(glycoform))存在，其中可能仅存在少量活性较大的糖形(例如，去岩藻糖基化的和/或等分的含有GlcNAc的N-聚糖)或者活性较大的糖形可能以5个或更多个糖形的组件存在。由于其基因工程来源，所有目前市售的mAb得到的均是mAb糖形的混合物。

此外，糖基化状态通过例如增加或降低ADCC而影响基于抗体的治疗。

[0004]ADCC总效力中的另一个因素是Fc γ受体(FcgR)的多态性性质。例如，具有FcgRIIIa(CD16a)的纯合的氨基酸位置158缬氨酸/缬氨酸(V/V)等位基因[2e]或具有Fc γ受体IIa(FcgRIIa)氨基酸位置131组氨酸/组氨酸(H/H)等位基因的淋巴瘤患者显示出对利妥昔单抗(rituxmab)治疗更高的响应率。FcgRIIIa(CD16a)158V等位基因和Fc gRIIa(FcgRIIa，CD32)131H等位基因分别比苯丙氨酸(F)等位基因和精氨酸(R)等位基因具有更高的对人IgG1的亲和力，导致更有效的ADCC[3]。经多变量分析，这两个Fc γ受体(FcgR)的多态性独立地预期更长的无进展生存期[4]。鉴于此，纯化或制备具有优化了对特定FcgR多态性的亲和力以增强ADCC、CDC等的特定糖基化状态的重组mAb在治疗上是有利的。

[0005]典型的免疫球蛋白G(IgG)抗体由两条轻链和两条重链组成，所述两条轻链和两条重链彼此缔合而形成通过柔性铰链区连接的三个主要的结构域：两个相同的抗原结合(Fab)区和恒定(Fc)区。IgG-Fc区是同型二聚体，其中两个C_H3结构域通过非共价相互作用配对。两个C_H2结构域不配对，但是每个结构域均在Asn-297处具有保守的N-糖基化位点。抗体进行识别和与靶细胞结合之后，将通过抗体的Fc区与效应细胞上的配体如FcgR(FcgRI、FcgRII和FcgRIII)和补体的C1q组分的结合而触发ADCC和其它效应功能。抗体的必要效应功能依赖于抗体Fc区的适当糖基化[5、6]。IgG-Fc N-聚糖天然以具有相当异质性的双触角复合体存在。已表明不同的IgG-Fc糖基化状态诱发显著不同的效应功能。Jeffries等已证实N297-聚糖的核心结构(Man3GlcNAc2)，特别是开始的三个残基(ManGlcNAc2)是赋予抗体IgG-Fc的显著稳定性和效应子活性所必需的[7-9]。结构研究提示所述N-聚糖可能主要通过稳定Fc结构域的构象而发挥其效应[8、10、11]。

[0006]几个组已报道核心N297-聚糖中β-1，4-连接平分型GlcNAc残基的存在可显著地增强抗体的ADCC活性[12-14]。后续研究提示缺乏α-1，6-连接的岩藻糖残基，而不是存在平分型GlcNAc可能在增强抗体的ADCC活性中发挥更大作用[15]。此外，其它组也已报道了各种结论，末端Gal残基可能会或不会正向影响效应功能[16-19]。值得注意的是，这些研究涉及在哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)中表达的人IgG的异种糖基化状态，而从此混合物中分离具有特定糖基化状态的人IgG极其困难。少量高活性物质的杂质即可显著地干扰结果和数据解读。因此，鉴于各种报道，尚未确定特异性IgG-Fc N-聚糖结构(即糖基化状态)对生物活性的影响的明确关系。

[0007]细胞内糖基化改造作为获得用于结构研究和用于生物医学应用的人样同种糖蛋白的有吸引力的方法应运而生[6，14，20-24]。例如，在重组CHO细胞系中GnTIII基因(负责向N-聚糖添加平分型GlcNAc)的过表达导致产生具有增加数量的平分型GlcNAc的mAb，其显示出增加的ADCC活性(通过所述mAb对FcgRIII更高亲和力的结合)[13、14]。在FucT-8敲除CHO细胞(缺乏α-1，6-岩藻糖基转移酶)中表达mAb导致mAb的非岩藻糖基化或低岩藻糖含量糖基化状态，所述mAb显示出增强的ADCC[25、26]。更近地，Gerngross等改造了酵母毕赤酵母(Pichiapastoris)系统以从头表达人样mAb，其产生缺乏α-1，6-岩藻糖部分的典型的双触角复合体型N-聚糖[6]。细胞内糖改造显示出非常大的生产具有增加数量的所需糖基化状态的糖蛋白的潜能。但是，预先存在的的细胞内糖改造方法导致产生具有各种糖基化状态的异种mAb。此外，表达系统的戏剧性遗传工程可造成宿主系统的不稳定和表达效率低下。因此，本领域长期以来一直需要生产具有特定糖基化状态的同种重组mAb和使用它们治疗需要其的受治疗者的方法。

[0008]根据下文出于公开目的而给出的本发明实施方案的描述，其它和进一步的对象、特征和优点将是清楚可见的。

发明概述

[0009]在一个实施方案中，本发明涉及产生糖基化改造的抗体的方法，所述方法包括检测样品中的Fc受体(FcR)多态性，其中所述多态性与对单克隆抗体(mAb)响应度差有关；将所述mAb的Fc区去糖基化；然后用糖连接所述mAb的去糖基化Fc区以生产与未糖基化改造的mAb相比具有增加的生物活性的糖基化改造的抗体。本发明进一步涉及所述方法，其中mAb是IgG抗体，在某些实施方案中是IgG1抗体。本发明进一步涉及所述方法，其中用糖连接所述mAb的去糖基化Fc区通过转糖基反应执行，例如，如以产生β-1，4连接。

[0010]在某些实施方案中，所述去糖基化步骤包括从Fc区去除至少一个岩藻糖、N-聚糖、甘露糖或类似物。

[0011]在另一个实施方案中，本发明涉及产生糖基化改造的抗体的方法，所述方法包括检测样品中的Fc受体(FcR)多态性，其中所述多态性与对单克隆抗体(mAb)响应度差有关；将所述mAb去岩藻糖基；切割具有异种N-聚糖的mAb，其中所述N-聚糖是在所述mAb N-297位置处连接的糖；然后用糖连接所述去岩藻糖基化和切割的mAb以生产与未糖基化改造的mAb相比具有增加的生物活性的糖基化改造的抗体。本发明进一步涉及所述方法，其中mAb是IgG抗体，在某些实施方案中是IgG1抗体。本发明进一步涉及所述方法，其中用糖连接所述去岩藻糖基化和切割的mAb通过转糖基反应来进行，例如，如以产生β-1，4连接。

[0012]在另一个实施方案中，本发明涉及产生糖基化改造的抗体的方法，所述方法包括检测样品中的FcR多态性，

其中所述多态性与对单克隆抗体(mAb)响应度差有关；对所述mAb的Fc区去糖基化；然后用糖连接所述mAb的去糖基化Fc区以生产与未糖基化改造的mAb相比具有增加的生物活性的基本上纯的糖基化改造的抗体。本发明进一步涉及所述方法，其中mAb是IgG抗体，在某些实施方案中是IgG1抗体。本发明进一步涉及所述方法，其中用糖连接所述去糖基化的mAb通过转糖基反应来进行，例如，如以产生β-1，4连接。

[0013]在另一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症受治疗者的方法，所述方法包括检测样品中的FcR多态性，其中所述多态性与对抗体治疗响应度差有关；产生糖基化改造的抗体，其中所述糖基化改造的抗体与所述抗体治疗相比具有增加的生物活性；然后为所述癌症受治疗者施用所述糖基化改造的抗体。

[0014]在另一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症受治疗者的方法，所述方法包括检测样品中的FcR多态性，其中所述多态性与对抗体治疗响应度差有关；确定糖基化改造的抗体，其中所述糖基化改造的抗体与所述抗体治疗相比具有增加的生物活性；然后为所述癌症受治疗者施用所述糖基化改造的抗体。

[0015]在另一个实施方案中，本发明涉及治疗具有免疫相关疾病或病症的受治疗者的方法，所述方法包括检测样品中的FcR多态性，其中所述多态性与对抗体治疗响应度差有关；产生糖基化改造的抗体，其中所述糖基化改造的抗体与所述抗体治疗相比具有增加的生物活性；然后为所述具有免疫相关疾病或病症的受治疗者施用所述糖基化改造的抗体。

[0016]在另一个实施方案中，本发明涉及治疗需要其的受治疗者的方法，其中所述方法包括施用糖基化改造的抗体，其中所述抗体诱导或抑制共刺激分子或途径。

本发明进一步涉及所述方法，其中需要其的受治疗者包括癌症受治疗者或具有免疫相关疾病或病症的受治疗者。本发明进一步涉及所述方法，其中需要其的受治疗者具有或不具有FcR多态性。本发明进一步涉及所述方法，其中共刺激分子或途径在靶细胞或靶细胞之外的另一细胞中受到诱导或抑制。

[0017]在另一个实施方案中，本发明涉及控制毒性的方法，所述方法包括为需要其的受治疗者施用糖基化改造的抗体，其中所述糖基化改造的抗体与未糖基化改造的抗体相比时具有调节生物活性的对FcR的解离常数。

[0018]本文描述的方法可应用于其中需要的受治疗者和/或靶具有或缺乏FcR多态性的情况。

[0019]本发明进一步涉及所述方法，其中所述调节包括生物活性的增加或降低。

[0020]在另一个实施方案中，本发明涉及调节抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括施用糖基化改造的抗体。

[0021]本发明所述方法拥有调节的ADCC，其意味着起始(对照)mAb的生物活性的增加或降低。本发明进一步涉及所述方法，其中相应的FcR是效应子受体，如Fc-g受体(FcgR)。

[0022]在另一个实施方案中，本发明涉及使用具有需要的糖基化状态的抗体，确定所述糖基化状态对生物活性的影响以治疗需要其的受治疗者的方法。

[0023]在另一个实施方案中，本发明涉及通过本文描述的方法产生的抗体和包含所述抗体的组合物。本发明进一步涉及所述方法，其中抗体是mAb，优选为IgG抗体，在某些实施方案中是IgG1抗体。

预期的非示例性抗体包括治疗型糖基化改造的抗体，其中起始抗体包括但不限于，西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、阿达木单抗、奥马珠单抗(omalizumab)、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普(etanercept)、IGN101(Aphton)、瓦罗西昔单抗(volociximab)(Biogen Idec和PDL BioPharm)、抗-CD80 mAb(Biogen Idec)、抗-CD23mAb(Biogen Idel)、CAT-3888(Cambridge Antibody Technology)、CDP-791(Imclone)、依帕珠单抗(eraptuzumab)(Immunomedics)、MDX-010(Medarex和BMS)、MDX-060(Medarex)、MDX-070(Medarex)、马妥珠单抗(Merck)、CP-675，206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN-30(SeattleGenetics)、札木单抗(Serono和Genmab)、阿德木单抗(Sereno)、奥戈伏单抗(United Therapeutics)、尼妥珠单抗(YMBioscience)、ABT-874(Abbott Laboratories)、地诺苏单抗(Amgen)、AM 108(Amgen)、AMG 714(Amgen)、芳妥珠单抗(Biogen Idec和PDL BioPharm)、达利珠单抗(Biogent Idec和PDL BioPharm)、戈利木单抗(Centocor和Schering-Plough)、CNTO 1275(Centocor)、ocrelizumab(Genetech和Roche)、HuMax-CD20(Genmab)、贝利单抗(HGS和GSK)、依帕珠单抗(Immunomedics)、MLN1202(Millennium Pharmaceuticals)、维西珠单抗(PDL BioPharm)、托珠单抗(Roche)、ocrerlizumab(Roche)、塞妥珠单抗(certolizumab pegol)(UCB，以前的Celltech)、依库珠单抗(AlexionPharmaceuticals)、培克珠单抗(Alexion Pharmaceuticals和Procter &Gamble)、阿昔单抗(Centocor)、雷珠单抗(Genetech)、美泊利珠单抗(GSK)、TNX-355(Tanox)或MYO-029(Wyeth)。

[0024]另一实施方案涉及生产具有需要的糖基化状态的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：a)除去一个或多个糖，b)化学合成糖，和c)将所述化学合成的糖酶促连接至(i)所述抗体或(ii)与所述抗体连接的糖。

[0025]另一实施方案涉及第[0024]段所述方法，其中所述化学合成的糖包含噁唑啉环。

[0026]另一实施方案涉及第[0024]或[0025]段所述方法，其中所述酶是内切糖苷酶，所述酶促连接包含转糖基作用。

[0027]另一实施方案涉及第[0024]-[0026]段所述方法，其中所除去的糖是天冬酰胺连接的糖，多肽在步骤a)之后在所述天冬酰胺处保留N-乙酰葡萄糖胺，并且所述酶促连接是与所述N-乙酰葡萄糖胺连接。

[0028]另一实施方案涉及第[0024]-[0027]段所述方法，其中所述抗体是单克隆抗体，并且所述方法得到基本上纯的单克隆抗体。

[0029]另一实施方案涉及第[0024]-[0028]段所述方法，其中所述化学合成的糖在步骤c)之后形成非天然的糖(carbohydrate)结构。

[0030]另一实施方案涉及第[0024]-[0029]段所述方法，其中所述基本上纯的单克隆抗体包含能够调节生物活性的糖基化状态。

[0031]另一实施方案涉及第[0024]-[0030]段所述方法，其中所述生物活性是(i)对Fcg受体的结合亲和力或(ii)抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。

[0032]另一实施方案涉及第[0024]-[0031]段所述方法，其中所述单克隆抗体包括西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101、瓦罗西昔单抗、抗-CD80mAb、抗-CD23 mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠单抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675，206、CAL、SGN-30、札木单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、ABT-874、地诺苏单抗、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、CNTO 1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、贝利单抗、依帕珠单抗、MLN1202、维西珠单抗、托珠单抗、ocrerlizumab、塞妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、雷珠单抗、美泊利珠单抗、TNX-355或MYO-029。

[0033]另一实施方案涉及包含具有基本上纯的糖基化状态的抗体的抗体组合物。

[0034]另一实施方案涉及第[0033]段所述抗体组合物，其中所述糖基化状态包含至少四个糖。

[0035]另一实施方案涉及第[0033]或[0034]段所述的抗体组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。

[0036]另一实施方案涉及第[0033]-[0035]段所述抗体组合物，其中所述单克隆抗体包含西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101、瓦罗西昔单抗、抗-CD80 mAb、抗-CD23 mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠单抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675，206、CAL、SGN-30、札木单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、ABT-874、地诺苏单抗、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、CNTO 1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、贝利单抗、依帕珠单抗、MLN1202、维西珠单抗、托珠单抗、ocrerlizumab、塞妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、雷珠单抗、美泊利珠单抗、TNX-355或MYO-029。

[0037]另一实施方案涉及评价糖多肽生物活性的方法，所述方法包含如下步骤：a)生产具有选定的糖基化状态的糖多肽的基本上纯的群体，和b)测量所述糖多肽的生物活性。

[0038]另一实施方案涉及第[0037]段所述方法，其中所述糖多肽是抗体，并且所述生物活性是(i)对Fcg受体的结合亲和力或(ii)抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。

[0039]另一实施方案涉及第[0038]段所述方法，其中所述抗体包含单克隆抗体。

[0040]另一实施方案涉及第[0038]-[0039]段所述方法，其中所述生物活性是体内抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。

[0041]另一实施方案涉及第[0038]-[0040]段所述方法，其中所述单克隆抗体包含西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101、瓦罗西昔单抗、抗-CD80mAb、抗-CD23 mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠单抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675，206、CAL、SGN-30、札木单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、ABT-874、地诺苏单抗、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、CNTO 1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、贝利单抗、依帕珠单抗、MLN1202、维西珠单抗、托珠单抗、ocrerlizumab、塞妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、雷珠单抗、美泊利珠单抗、TNX-355或MYO-029。

[0042]另一实施方案涉及改进基于抗体的治疗的结果的方法，所述方法包含如下步骤：a)为受治疗者确定在所述受治疗者中存在的Fcg受体等位基因，和b)使用包含被选择用于(i)增加对所述受治疗者中存在的Fcg受体等位基因的结合亲和力或(ii)增加抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性的基本上纯的糖基化状态的单克隆抗体治疗所述受治疗者。

[0043]另一实施方案涉及第[0042]段所述方法，其中所述Fcg受体等位基因是氨基酸158的FcgIIIa受体的等位基因或氨基酸131的FcgIIa受体的等位基因。

[0044]另一实施方案涉及选择单克隆抗体的糖基化状态的方法，所述方法包含如下步骤：a)确定免疫细胞上的Fcg受体等位基因，和b)选择相对于具有异种糖基化状态的源单克隆抗体调节下列活性的糖基化状态：i)抗体依赖性细胞的细胞毒性，ii)补体依赖性的细胞毒性，iii)Fcg受体结合亲和力或iv)单克隆抗体诱导的细胞信号转导事件的糖基化状态。

[0045]另一实施方案涉及生成单克隆抗体的生物等效物的方法，所述方法包含如下步骤：a)确定预先存在的单克隆抗体的糖基化状态，

和b)使用第[0024]-[0027]段所述方法生产与所述预先存在的单克隆抗体具有基本上相同的糖基化状态的单克隆抗体。

[0046]在另一个实施方案中，本发明涉及调节补体依赖性的细胞毒性(CDC)的方法，所述方法包括施用糖基化改造的抗体。

[0047]另一实施方案指向通过生产具有需要的糖基化状态的抗体生成市售MAb的通用生物等效物的方法，所述方法包含如下步骤：a)除去一个或多个糖，b)化学合成所述市售MAb中存在的糖，c)对于每个糖，将化学合成的糖酶促连接至(i)所述抗体或(ii)与所述抗体连接的糖，和d)按与所述市售MAb中存在的糖形比率基本上相似的比例混合所述MAb糖形，得到与市售抗体的糖形组成基本上匹配的抗体糖形组成。

[0048]另一实施方案指向使用生产具有基本上纯的糖基化状态的抗体的方法通过鉴定优选的MAb糖形对市售MAb或已处于临床开发中的MAb来改进效力、降低毒性和/或降低剂量，所述方法包含如下步骤：a)除去所鉴定的MAb的一个或多个糖，b)化学合成所述MAb中存在的优选糖，和c)将化学合成的糖酶促连接至(i)所述抗体或(ii)与所述抗体连接的糖。

[0049]另一实施方案指向选择用于临床开发在具有Fc g受体等位基因的群体中使用的mAb糖形的方法，所述方法包含如下步骤：a)测试mAb糖形针对所述群体中存在的Fcg受体等位基因的生物活性，和b)选择用于临床开发的能够(i)增加对所述群体中存在的Fcg受体等位基因的结合亲和力或(ii)增加抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性的mAb糖形。

[0050]另一实施方案指向第[0049]段所述方法，其中所述Fcg受体等位基因是针对氨基酸158的FcgIIIa受体的等位基因或针对氨基酸131的FcgIIa受体的等位基因。

[0051]另一实施方案指向产生具有异种糖基化状态的预先存在的单克隆抗体的基本上纯的糖形的方法，所述方法包括如下步骤：使用权利要求1-4所述方法生产所述预先存在的单克隆抗体中存在的两个或多个糖形，测试所述两个或多个糖形的生物活性或毒性以确定所述预先存在的单克隆抗体的具有较高生物活性或较低毒性的优选的糖形，和使用第[0024]-[0027]段所述方法来生产具有基本上纯的优选的糖基化状态的在步骤b)中鉴定的具有较高生物活性或较低毒性的单克隆抗体糖形。

[0052]上文相当广泛地列出了本发明的特征和技术优点以便可更好地理解下文的发明详述。构成本发明权利要求的主题的本发明的其它特征和优点将在下文中被描述。本领域技术人员应理解，所公开的构想和特定实施方案可容易用作修饰或设计执行与本发明相同的目的的其它结构的基础。本领域技术人员还应理解，所述等效构建物不应背离根据所附权利要求提出的本发明的精神和范围。当与附图一起考虑时，将能从下文的说明中更好地理解被认为是本发明特征(就其组织和方法这两个方面来说)的新特征，以及进一步的目的和优点。但是，应明确理解，提供的每幅图仅是出于说明和描述的目的，而非意在定义本发明的界限。

附图说明

[0053]图1举例说明了天然杀伤(NK)细胞与肿瘤细胞的相互作用。

[0054]图2描述了抗体糖基化状态的实例。

[0055]图3描述了对基因组DNA的FcgRIII等位形式的限制性内切酶分析。在限制性内切酶酶切消化之前，通过用苯酚抽提对40mL PCR粗产物进行洗涤，然后在进行乙醇沉淀之前进行一次苯酚/异戊基-氯仿(isoamyl-chloroform)抽提。对于Rsa I单酶切，使用15单位Rsa I在37℃过夜消化15mL洗涤过的PCR产物，使用1X孵育缓冲液，终体积为20mL。对于双酶切消化，使用20单位Rsa I在37℃过夜消化25mL洗涤过的PCR产物，使用1X孵育缓冲液，终体积为30mL，然后加入50单位Eco130 I限制性内切酶(1X孵育缓冲液)，在37℃孵育过夜。通过在3％(w/w)琼脂糖凝胶(TAE缓冲液)上电泳对所有产物进行分析。#1 DNA指示FcgRIIIa F/F，#2 DNA指示杂合F/V，#3 DNA指示纯合的V/V。

[0056]图4描述了对来自基因组DNA的FcgRII等位形式的限制性内切酶分析。DNA是从3个不同的个体纯化而得的，在PCR之后，使用BstUI酶消化所述产物。在琼脂糖凝胶上分离所述产物，然后使用溴化乙锭染色。鉴定了三个可能的基因型。

[0057]图5列出了应用于IgG或IgG-Fc结构域的通过组合的细胞方法和化学酶法的糖基化改造方法。

[0058]图6显示了基本上纯的寡糖噁唑啉的合成实例。

[0059]图7显示了产生具有基本上纯的寡糖内容的肽群体的糖基转移酶反应实例。

[0060]图8显示了产生具有基本上纯的由核心的N-连接五糖Man3GlcNAc2构成的糖基化状态的核糖核酸酶B酶群体的糖基转移酶反应实例。

[0061]图9显示了产生新型非天然糖结构的寡糖合成方案。

[0062]图10显示了与HNSCC细胞系(Tu 167、Tu 159或O12SCC)一起孵育的新鲜分离的NK细胞。A.未处理；B.使用10ug/mL西妥昔单抗处理。在孵育16小时之后通过⁵¹Cr分析进行评估，并进行三个重复。对于每个实验均使用K562细胞系作为阳性对照，数据未显示。NK纯度均大于90％。

[0063]图11A显示了重组酵母IgG₁-Fc结构域蛋白的SDS-PAGE。泳道1是具有起始酵母N-聚糖的产物。泳道2显示了末端-A去糖基化的IgG₁-Fc结构域蛋白。泳道3显示了使用合成的六糖噁唑啉进行化学酶法转糖基作用之后的泳道2中的去糖基化蛋白。11B显示了重组酵母IgG₁-Fc结构域蛋白的SDS-PAGE。泳道1是具有起始酵母N-聚糖的产物。泳道2显示了使用合成的六糖噁唑啉进行化学酶法转糖基作用之后的转糖基蛋白。泳道3-4和5-6分别显示PNG酶F去糖基化的泳道1的起始酵母产物和泳道2的转糖基IgG₁-Fc结构域蛋白。

发明详述

[0064]如本说明书所用，“一个”或“一种”可指一个或多个。如本文的权利要求所用的，当与词“包含”联合使用时，所述词“一个”或“一种”可指一个或多于一个。如本文所用，“另一个”可指至少第二个或更多个。

[0065]如本文所用，“样品”典型地指任何类型的生物来源材料，其包括但不限于从受治疗者分离的细胞、体液、组织或器官，包括例如血液、血浆、血清、粪便物、尿液、精液、骨髓、胆汁、脑脊液、淋巴液、皮肤样品、皮肤的外部分泌物、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血液细胞、器官或活检。

[0066]如本文所用，“生物活性”指药物动力学和药物代谢动力学性质，包括例如，分子亲和力或所造成的生物化学或生理学效应、受体亲和力或所造成的生物化学或生理学效应、非受体亲和力或生物化学或生理学效应、效力、生物利用度、吸收、分布、代谢或消除。

[0067]如本文所用，“糖”指氧化或未氧化的含糖分子，包括但不限于单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖，包括例如N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖、半乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、葡萄糖、果糖、岩藻糖、山梨糖、鼠李糖、甘露庚酮糖、N-乙酰半乳糖胺、二羟丙酮、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘油醛、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖，寡糖噁唑啉、前述任何糖的非天然变体或类似物或其L-或D-异构体的任何组合。糖进一步指通过天然、重组、合成、和/或半合成方式生产的此类分子。

[0068]如本文所用，“响应度差”指与群体的大部分相比，响应率降低、初始响应率降低、存活率降低或上文定义的“生物活性”降低。

[0069]如本文所用，“抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性”(ADCC)指其中抗体通过包被靶细胞使得它们易受免疫细胞攻击的免疫响应。

[0070]如本文所用，“调节”指将糖基化改造的抗体与未糖基化改造的抗体(起始抗体、对照或其它等效术语)进行比较时，上文定义的生物活性的增加或降低。

[0071]如本文所用，“癌症”指一种病理生理状态，其中细胞的特征在于异常的和增生性细胞生长，以及在成人或儿童中急性或慢性地通过侵入直接生长到相邻组织中或通过转移在远端位点生长诱导所述生长的能力，包括但不限于癌和肉瘤，如急性成淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤(小脑或大脑的)、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑瘤(例如，室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层、视觉途径和下丘脑胶质瘤)、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(例如，胃肠道的类癌瘤)、未知原发部位癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、慢性骨髓增生病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因斯肿瘤家族、肝外胆管癌、眼癌(例如，眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(例如，颅外、生殖腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈部癌、鳞状细胞头颈部癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰岛细胞癌(例如，内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、喉癌、白血病、唇和口腔癌(oral cavity cancer)、肝癌、肺癌(例如，非小细胞)、淋巴瘤、巨球蛋白血症、骨/骨肉瘤的恶性纤维组织细胞瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、潜伏原发的转移性鳞状颈癌、口腔癌(mouth cancer)、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤/血浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓发育异常综合征、骨髓发育异常/骨髓增生性疾病、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌(oral cancer)、口腔癌(oral cavity cancer)、骨肉瘤、口咽癌、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、生殖细胞肿瘤)、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、鼻窦和鼻腔癌症、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、血浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞泽里综合征、皮肤癌(例如，非黑色素瘤或黑色素瘤)、小肠癌症、幕上原始神经外胚层肿瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤(例如妊娠)、儿童期和成年期的罕见癌症、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、维耳姆斯氏瘤和女性的癌症。

[0072]如本文所用，“与免疫相关的疾病或病症”指其中免疫系统增强或受到抑制，或其中免疫系统的组分引起、介导或以其它方式参与发病或死亡的疾病或病症。

还包括其中刺激或干预免疫响应对所述疾病或病症的进程具有改善效应的疾病。此术语包括免疫介导炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染性疾病、免疫缺陷疾病、癌症等，包括例如，系统性红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病、类风湿关节炎、儿童慢性关节炎、脊柱关节病、系统性硬化症(例如，硬皮病)、特发性炎性肌病(例如，皮肌炎、多发性肌炎)、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、结节病、自身免疫性溶血性贫血(例如，免疫全血细胞减少、阵发性睡眠性血红蛋白尿症)、自身免疫性血小板减少症(例如，特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症、血栓性血小板减少性紫癜)、甲状腺炎(例如，格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、儿童淋巴细胞甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(例如，肾小球肾炎、间质性肾炎)、中枢和外周神经系统的脱髓鞘病(例如，多发性硬化症)、特发性脱髓鞘性多发性神经病或格林-巴利综合征、多发性肌炎、混合性结缔组织病、甲亢、重症肌无力、自身免疫肝病、自身免疫肾病、血管炎(例如川崎氏病或颞动脉炎)、自身免疫血液病、特发性间质性肺炎、过敏性肺炎、自身免疫皮肤病、自身免疫心脏病、心肌炎、自身免疫不孕症、贝切特氏病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、肝胆疾病(例如，传染性肝炎和其它非嗜肝病毒)、自身免疫慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性肠道疾病(例如，溃疡性结肠炎：克罗恩氏病)、麸质过敏性肠病、惠普尔氏病、自身免疫或免疫介导的皮肤疾病包括大疱性皮肤病、白癜风、多形性红斑和接触性皮炎、银屑病、性传播疾病、过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹、肺部免疫性疾病如嗜酸性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病、病毒性疾病(例如，AIDS(HIV感染)、甲、乙、丙、丁和戊型肝炎、疱疹)、细菌感染、真菌感染、原生动物感染和寄生虫感染。

[0073]如本文所用，关于抗体，“基本上纯的”指与在其天然状态下伴随其的污染物或在获得所述抗体的过程中产生或使用的污染物分离。此术语进一步包括具有单个糖基化状态的需要的产物，无论此状态包括单个位点或多个位点的糖基化。典型地，当抗体构成制备物中的抗体的至少60％(重量)时，即认为其是基本上纯的。例如，制备物中的抗体为需要的抗体的至少约75％、在某些实施方案中至少约80％、在某些实施方案中约85％、在某些实施方案中至少约90％、在某些实施方案中至少约95％和最优选地至少约99％(重量)。基本上纯的抗体包括天然、重组或合成生产的抗体。

[0074]如本文所用，“糖基化状态”指抗体具有特定或需要的糖基化模式。“糖形”是包含特定糖基化状态的抗体。所述糖基化模式包括，例如在mAb的位置N-297处连接一个或多个糖，其中所述糖是天然的、重组的、合成或半合成生产的。作为实例，图2提供了具有包含在位置N-297处与至少一个N-聚糖连接的IgG₁和缺乏α-1，6-岩藻糖的糖基化状态的mAb。

[0075]如本文所用，“抗体”指称为免疫球蛋白的免疫系统相关的蛋白和其独立的功能片段。每个抗体由连接形成“Y”形分子的四个多肽-两条重链和两条轻链组成。使用蛋白酶处理抗体可以切割所述蛋白产生包括抗体的可变末端的Fab或抗原结合片段和/或恒定区片段Fc。恒定区确定破坏抗原使用的机制(例如ADCC)。抗体根据其恒定区结构和免疫功能而被划分为五个主要类别：IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。这些类别包括亚类，如IgG_1-4。抗体可以是多克隆或单克隆。

[0076]如本文所用，“多肽”指包含共价连接在一起的两个或多个氨基酸的分子。“糖多肽”指进一步包含至少一个共价连接至所述多肽的糖的多肽。

[0077]如本文所用，术语“治疗”指向受治疗者施用治疗有效量的抗体，以便所述受治疗者的疾病得到改善。所述改善是症状的任何改善或矫正。所述改善是可观测的或可测量的改善。因此，本领域技术人员理解，治疗可改善病情，但是可能无法彻底治愈所述疾病。具体地，癌症患者的改善可包括肿瘤稳定、肿瘤收缩、进程时间增加、存活增加或生命质量的改善。自身免疫疾病患者的改善可包括炎症实验值的改善、血细胞计数的改善、皮疹的改善或生活质量的改善。

[0078]如本文所用，术语“治疗有效量”指使疾病或疾患的症状得到改善或矫正的量。

[0079]如本文所用，术语“受治疗者”用来指根据本文描述的方法向其施用抗体组合物的任何哺乳动物受治疗者。在具体实施方案中，本发明方法用于治疗人受治疗者。另一实施方案包括治疗患癌症的人受治疗者。

[0080]NK细胞FcgR多态性

[0081]抗原呈递细胞(APC)如NK细胞在抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)中具有重要作用。NK细胞拥有结合IgG的细胞表面受体FcgR，结合IgG有助于与相邻FcgR交联和活化NK细胞，导致ADCC[26b]。与FcgR结合的亲和力以及造成的活化和细胞毒效应受受体多态性的影响。例如，在氨基酸158处具有FcgRIIIa(CD16a)的纯合缬氨酸/缬氨酸(V/V)等位基因或在氨基酸131处具有FcgRIIa组氨酸/组氨酸的等位基因的淋巴瘤患者显示出对利妥昔单抗治疗更高的响应率。V等位基因的FcgRIIIa(CD16a)和H等位基因的FcgRIIa(CD32)分别比苯丙氨酸(F)的等位基因和精氨酸(R)的等位基因对人IgG1具有更高的亲和力，产生更加有效的ADCC[3]。经多变量分析，这两个FcgR多态性独立地预期更长的无进展生存期[4]。

[0082]NK细胞表达的FcgRIIIa等位基因和ADCC之间的相关性最近已得到体外证实。此研究中使用了HNSCC细胞系TU 167、TU 159和O12SCC。ADCC分析是使用HNSCC细胞作为靶细胞和纯的NK细胞作为效应细胞而进行的。将靶细胞与150μCi Cr-51(Amersham，Piscataway，NJ)在37℃孵育1小时，每15分钟充分混合一次，然后用培养基洗涤两次。接着将所述细胞与10ug/mL西妥昔单抗、10ug/mL人IgG1同种型或仅培养基在37℃再孵育30分钟，然后洗涤两次以除去未结合的抗体。将效应物和靶细胞涂布到96孔板并孵育过夜。收集细胞裂解上清液，然后将其与Optiphase Supermix闪烁液(Perkin Elmer，Boston MA)混合，在MicroBeta 1450闪烁计数器(Wallac，Turku Findland)中计数。将结果表示为特异性裂解的百分比：[(实验cpm-自发cpm)x 100]/(最大cpm-自发cpm)。

[0083]图10A显示了不存在抗体时未处理的新鲜NK细胞，每个FcgRIIIa多态性均与HNSCC细胞系一起孵育。使用⁵¹Cr测量的它们的杀伤能力范围为0-26％，中值范围为5-15％。图10B表示西妥昔单抗处理的HNSCC细胞系与NK细胞孵育的平均杀伤。与未处理的HNSCC细胞系相比，西妥昔单抗处理的HNSCC细胞系显示出显著更高的杀伤活性。此外，当与10μg/mL西妥昔单抗的HNSCC细胞系孵育时，FcgRIIIa多态性V/V介导的杀伤优于V/F和F/F。一般而言，效应物与靶细胞的比值为50:1时，所有细胞系在与FcgRIIIa F/F NK供体孵育时均显示低的细胞毒活性，与FcgRIIIa F/V NK供体孵育时显示中等的细胞毒活性，与FcgRIIIa V/V NK供体孵育时显示高的细胞毒活性。

[0084]这些数据提供了CD16a多态性与针对HNSCC的不同的抗体依赖性的细胞毒性水平有关的体外证据。假定每个NK FcgRIIIa多态性基因型与西妥昔单抗的Fc部分的不同结合亲和力引起NK介导的细胞毒性的差异。在治疗开始时知道患者具有的多态性可以预测总的肿瘤响应和单克隆抗体的临床结果。最后，优化NK FcgRIIIa等位基因与结合的mAb的Fc部分的结合将会改进每个多态性的ADCC。对FcgRIIIa(CD16a)158F等位基因具有改进的亲和力的糖结构渗透的mAb对于增强在这些等位基因的携带者的治疗结果特别重要。

[0085]实施例1：FcgRIIIa受体(CD16a)和FcgRIIa(CD32)等位基因多态性的检测

[0086]为了确定糖基化改造的mAb在具有各种基因型的患者中诱导ADCC的能力或确定非糖改造mAb的响应度，使用例如基于PCR的策略表征FcgRIIa位置131和FcgRIIIa位置158的等位基因变体。首先，从人肿瘤细胞系、人唾液、人PBMC或石蜡包埋组织中分离基因组DNA，将其用作PCR扩增的模板。

[0087]A.使用PCR扩增和限制性内切酶消化来检测FcgIIIa受体(CD16a)等位基因的多态性。

[0088]根据GenBank中的可用序列(FcgRIIIa的登录号为X52645，Nieto等，2000)进行引物设计。此方案使用向所有扩增产物的一端引入新的RsaI位点的引物和在所述两个FcgRIIIa等位基因之一中产生新的StyI(或Eco130 I)位点的第二个引物。有义引物(5’-ATAAGGTCACATATTTACAGAATGGCCAAG-3’)(SEQ ID NO：1)和反义引物(5’-CAGTCTCTGAAGACACATTTTTACTCCGTA-3’)(SEQID NO：2)扩增含有所述多态性位点的147bp片段。用粗体显示的所述有义引物的错配在FcgRIIIa基因的任一等位基因，而不是FcgRIIIb基因中产生限制酶切位点(StyI)。所述反义引物中的错配在FcgRIIIa(仅V等位基因)和FcgRIIIb基因中产生限制酶切位点(RsaI)。对于FcgRIII，由于序列相似性，FcgRIIIa和b基因均得到扩增。例如，为了区分FcgRIIIa的等位基因，执行了两次限制性内切酶消化，一次用RsaI消化，第二次消化使用StyI或Eco130 I(StyI和Eco130 I二者识别相同的序列)。表1显示了FcgRIIIa的两个等位基因的限制性内切酶消化模式，图3说明了实际的限制性内切酶消化。

[0089]表1

 

基因型	RSAI	RSAI+Eco130I
			FcgRIIIa V/V	仅119bp	119bp+91bp
FcgRIIIa V/F	147bp+119bp	119bp+91bp
			FcgRIIIa F/F	147bp+119bp	仅119bp

[0090]B.使用PCR扩增和限制性内切酶消化检测FcgRIIa受体的限制酶切多态性。

[0091]引物设计是基于McKenzie等，1996，其使用有义引物(5’-GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC-3’)(SEQ ID NO：3)和反义引物(5’-CAACAGCCTGACTACCTATTACGCGGG-3’)(SEQ ID NO：4)扩增含有所述多态性位点的366bp片段。当相邻核苷酸为G，而不是当相邻核苷酸为A时，所述有义引物的一个核苷酸置换(用粗体显示)将向所述PCR产物引入BstUI剪切位点。向所述反义引物中引入第二个BstU I以控制消化。两个引物的扩增将在两个等位基因的两种产物的C末端引入限制性内切酶位点。但是只有一个等位基因将含有第二个限制酶切(精氨酸(R))位点。当用限制性内切酶BstUI消化所述PCR产物时，R等位基因将被消化两次，产生短产物(323bp)，而含有组氨酸的等位基因将只被剪切一次，产生343bp条带。图4举例说明了将会观察到的三种可能的类型。产物A和B分别是纯合个体精氨酸(R/R)和组氨酸(H/H)的消化产物。产物C显示了杂合个体(R/H)证实的情况。在所述反向引物的末端设计了BstUI内部对照，以确保成功的BstUI消化。

[0092]C.多态性检测和与基于抗体的治疗的关联。

[0093]按上文的A.和B.部分描述的方法检测多态性之后，接下来进行基于抗体的治疗响应度的关联。可选地，基于抗体的治疗的响应度可在多态性检测之后确定。

对于特定多态性，临床医师或其它适当的专业人员通过确定携带特定多态性的患者是否响应使用糖基化改造的或非糖基化改造的抗体的治疗来确定糖基化改造的或非糖基化改造的抗体治疗的响应度。通过将多态性与糖基化改造的或非糖基化改造的抗体治疗的响应度关联，可以预测对糖基化改造的或非糖基化改造的抗体的响应度。

[0094]预言性实施例2：抗体的同质制备物。

[0095]为了获得具有特定糖基化状态的mAb的同质制备物，利用了兼有高细胞表达产量和使用化学酶法转糖基的体外糖基化改造的系统[27-30]。结合化学合成内切酶的寡糖噁唑啉底物的力量，此方法允许制备一系列确定的mAb糖基化状态(天然或非天然)或其IgG-Fc结构域，而这又允许系统地分析IgG糖基化和ADCC活性的结构-活性关系。按照Jeffries等的开创性工作，使用无铰链的人IgG-Fc即

(aa231-447)作为模式系统，其中Fc的铰链区已被缺失[7、31]。使用此截短的Fc形式而不是完整的人抗体IgG或IgG-Fc作为模式系统极大地简化了合成以及后续的结构-功能关系研究。无铰链的IgG-Fc实验的结果可通过完整的IgG的表达和转糖基作用证实。此外，IgG的Fc部分可通过与生产具有同质的、合成的糖成分的新的Fc片段相同的转糖基作用过程进行表达和修饰。

[0096]至少两个表达系统可以用于表达所述无铰链的IgG-Fc。本发明不受本文描述的表达系统的限制。一个表达系统是先前用于过量产生人

糖蛋白的CHO-K1细胞系统[7、31]。编码

基因(aa231-447)的质粒按照与报道的方法完全相同的方法构建，使用可商业途径获得的质粒pg1 L243H作为C_H g1基因的来源[7、31]。所述系统产生具有异种N-聚糖的

糖蛋白。另一表达系统是高产量的酵母突变体表达系统，其产生具有连接了高甘露糖型寡糖的IgG-Fc糖蛋白。经过量产生和后续的纯化之后，用内切-F2或内切-M和岩藻糖苷酶(以除去CHO-细胞系表达的异种糖链)的混合物处理或用内切-H或内切-A(以除去所述酵母系统产生的高甘露糖型寡糖)处理得到的糖蛋白

。这将除去所有异种N297-聚糖，而仅保留所述糖基化位点处连接的最内部的GlcNAc。然后以得到的含有GlcNAc的IgG-Fc作为转糖基作用的受体底物，在合适的内切酶或其突变体的催化下回加糖噁唑啉的各种同型寡糖[30]。使用各种合成的糖噁唑啉作为供体底物，ENG酶催化的转糖基作用提供具有确定的寡糖结构的

、Fc结构域蛋白和mAb的各种糖基化状态。这些包括具有岩藻糖和具有平分型GlcNAc结构的N-聚糖核心结构。它还包括可进一步参与ADCC活性的选定修饰结构。图5中描述了一般的方法。除了上文描述的方法之外，此方法还应用于完整的IgG抗体制备物。本公开的范围或广度也不受限制，并包括例如，在第7,138,371号美国专利(DeFrees等)[32]中描述的方法、肽和抗体。

[0097]实施例3：糖噁唑啉的设计和合成实例。

[0098]ENG酶是一类水解N-糖蛋白的核心N，N’-二乙酰几丁二糖部分中的β-1，4-糖苷键以释放所述N-聚糖的内切糖苷酶。但是，一些ENG酶如原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)的内切-A和冻土毛霉(Mucor hiemalis)的内切-M，拥有转糖基作用活性并能够将释放的N-聚糖转移至GlcNAc-肽受体以形成新的糖多肽。内切-A和内切-M可以将大型完整的寡糖一步转移至GlcNAc-肽受体以形成新的糖多肽，从而允许高度集中地合成糖多肽而无需保护基团。化学酶法方法具有低转糖基作用产率(一般为5-20％)、产物水解和仅使用天然N-聚糖作为供体底物的限制。为了解决这些问题，我们使用合成的寡糖噁唑啉(保留机制中形成的假想的噁唑啉鎓离子中间体的模拟物)作为糖多肽合成的供体底物。我们合成了与N-聚糖核心对应的二-和四糖噁唑啉。测试寡糖噁唑啉是否是动力学上比天然N-聚糖更有利的有效的N-糖多肽合成的底物。图6显示了基本的合成方案[33]。

[0099]实施例4：将寡糖噁唑啉底物转糖基至HIV gp41片段。

[0100]接下来我们使用大型受体GlcNAc-C34测试了内切-A催化的二-和四糖噁唑啉的转糖基作用(图7)。发现所述寡糖也可通过内切-A而被有效转移至所述大型GlcNAc-C34，以分别形成糖肽14(73％)和15(75％)。通过ESI-MS和NMR分析对所述糖肽进行表征。对糖多肽15的进一步结构表征是通过链霉蛋白酶消化进行的，该消化产生单个Asn-连接的寡糖，1H NMR、ESIMS和Dionex HPAEC分析表明，其与真实的Asn-连接的核心戊糖Man3GlcNAc2Asn相同。还观察到虽然Man-β1，4-GlcNAc-噁唑啉和Man3GlcNAc-噁唑啉充当转糖基作用的有效底物，但得到的糖多肽ManGlcNAc2-C34(14)却抗内切-A水解，而糖多肽Man3GlcNAc2-C34(15)仅被内切-A缓慢水解。这些结果显示，寡糖噁唑啉是比基态N-糖肽活性更大的底物，因而在动力学上有利于产物积累。

[0101]实施例5：非天然六糖(Gal2Man3GlcNAc)噁唑啉的合成。

[0102]我们设计和合成了非天然六糖(Gal2Man3GlcNAc)噁唑啉，其具有两个与Man3-GlcNAc核心中的末端甘露糖残基β-1，4-连接的半乳糖残基。此六糖衍生物是双触角复合体类型N-聚糖的不具有互连的GlcNAc部分的模拟物(图9)。用小GlcNAc-肽Ac-Asn(GlcNAc)-Ile-Thr作为受体进行模式反应。通过反相HPLC监测酶学反应。内切-A对具有六糖噁唑啉的受体的糖基化基本上在30分钟内完成，形成具有基本上纯的糖基化状态的糖多肽，产率为98％。

[0103]实施例6：寡糖噁唑啉底物向核糖核酸酶B的转糖基作用。

[0104]为了检测所述化学酶法方法合成和重构糖蛋白的可行性，选择牛核糖核酸酶B作为模式系统。用内切-H处理核糖核酸酶B将除去N-聚糖，仅保留Asn-34位点处最内侧的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)，产生基本上纯的GlcNAc-RB。发现，当所述六糖噁唑啉6(图8)和GlcNAc-RB(摩尔比，2:1)在存在内切-A的条件下被孵育(磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，23℃)时，GlcNAc-RB糖基化产生转糖基产物10。此转化在2h反应后基本上是定量的，以96％的产率分离到基本上纯的糖蛋白产物。相似地，内切-A催化的GlcNAc-RB与四糖噁唑啉11的反应以82％的产率产生基本上纯的携带核心N-连接五糖Man3GlcNAc2的糖蛋白12。核心N-连接五糖(Man3GlcNAc2)与蛋白的有效连接为用各种糖基转移酶通过所述核心的顺序糖基化快速组装各种糖基化状态提供了重要的起始结构。

[0105]实施例7：六糖向重组Fc结构域的转糖基作用。

[0106]通过PCR扩增人IgG1-Fc结构域的编码序列，将其克隆至酵母表达载体pYES2/CT(INVITROGEN)。将得到的IgG1-Fc-pYES2/CT转化入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的OCH-1突变体[44]并进行表达。SDS-PAGE证实纯的IgG1-Fc被糖基化，PNG酶F处理揭示大量N-聚糖被除去。天然IgG1-Fc在还原条件下显示为35KDa条带，其对应于单体形式，但是在天然条件下显示为70KDa条带，表明所述纯的IgG1-Fc连接为二聚体，这同在天然IgG1结构中的发现一致。纯化表达的糖蛋白，将其用作转糖基作用的靶蛋白。

[0107]为了检测所述化学酶法重构抗体糖形的可行性，我们使用上文所述的在酵母中生产的IgG1-Fc部分。我们的初步研究揭示内切-A可以成功地除去酵母表达的IgG1-Fc的异种高甘露糖型N-聚糖以生产GlcNAc-IgG₁-Fc，其显示为约33KDa的条带(图5和11A-B)。将六糖噁唑啉(Gal2Man3GlcNAc-噁唑啉)用作这些抗体转糖基反应的模式糖噁唑啉。先前已证实此糖噁唑啉是内切-A转糖基作用重构核糖核酸酶B的优秀底物[30]。当将GlcNAc-IgG1-Fc与所述六糖噁唑啉在存在内切-A的条件下孵育时，形成新糖基化的IgG1-Fc，其在SDS-PAGE上显示为与原始重组的糖基化的IgG1-Fc相似的大小(图11A和B)。此结果表明，所述转糖基作用对IgG1-Fc和核糖核酸酶B模式系统的效应相同。为了证实转移的寡糖被连接到所述蛋白的GlcNAc上，我们使用PNG酶F处理所述新形成的糖基化IgG1-Fc，仅当所述聚糖是以GlcNAc-Asn键形式进行连接时，PNG酶F才可以除去所述N-聚糖。如图11B所示，处理原始的IgG1-Fc和重构的糖基化IgG1-Fc得到了如通过SDS-PAGE所判断的具有相同大小的去糖基化IgG1-Fc。这些数据表明如所预期，所述转糖基作用六糖被连接到由内切-A形成的GlcNAc-Asn上。进一步通过MALDI-TOF和ESI质谱进行详细的N-聚糖分析。

[0108]表皮生长因子受体(EGFR)和mAb C225(西妥昔单抗)。

[0109]EGFR是受体酪氨酸激酶erbB家族的成员。当配体结合时，发生二聚化和寡聚化，进而活化细胞质蛋白酪氨酸激酶。接着是下游和第二信使信号转导，通过活化转录因子和上调细胞周期蛋白D1促进细胞增殖和存活/抗凋亡[33b]。

[0110]过表达可见于各种实体瘤，并与更晚期、增加的淋巴结转移、更短的无复发存活和总存活有关[33c]。Ang等证实在SCCHN中的过表达与降低的存活和独立预测的局部复发有关[33d]。使用针对晚期SCCHN的嵌合mAb C225(西妥昔单抗)进行的针对EGFR的定向治疗，结合标准放化疗方案作为重要的治疗就应运而生。

西妥昔单抗是针对EGFR配体-结合结构域的IgG1单克隆抗体，其阻止酪氨酸激酶的活化。II和III期试验已证实使用西妥昔单抗得到改善的结果[33e、33c]。

[0111]预言性实施例8：寡糖噁唑啉底物向mAb C225和其

对应部分的转糖基作用。

[0112]将具有与ASN297的异种糖连接的人-小鼠嵌合的EGF受体抗体mAB C225或mAB C225的

版本(version)用内切-H处理，留下了ASN297上最内侧的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。将内切-H处理的mAB C225与核心N-连接五糖(Man3GlcNAc2)11和内切-H或具有转糖基作用活性的相似的糖酵解酶混合。常规纯化技术产生基本上纯的、同质糖基化的mAb C225。进一步使用标准糖转移酶反应对所述核心N-连接五糖进行其它糖基化修饰，以产生各种基本上纯的mAb C225糖基化状态。参见，例如[40]。

[0113]预言性实施例9：糖基化改造的

 mAb C225抗体的效应功能。

[0114]首先通过受体结合分析对

 mAB C225的各种糖基化状态的效应功能进行测试。测试了多种FcgR，包括FcgRIIb(抑制性受体)、FcgRIIIa 158V和FcgRIIIa 158F(受体多态性)。所述结合分析遵循报道的方案[6]。结合研究揭示一组特定的糖基化状态对FcgRIIIa(V和F两种变体)显示出高亲和力的结合，而对FcgRIIb具有低亲和力。鉴定出特定的糖基化状态显示改进的结合性质。

[0115]还通过竞争性抑制分析(遵循报道的方案)[7、8、31]确定

的各种糖基化状态与人FcgRI相互作用的能力检测了它们的效应功能。简单而言，用γ-IFN刺激U937白细胞以诱导分化和人FcgRI的表达。用人源化IgG1敏化靶JY细胞。与系列浓度的特定糖基化状态的

 C225和光泽精孵育之后，将所述敏化JY细胞与U937效应细胞混合，测量超氧化物产生(用化学发光的变化表示)。比较

 C225的不同的糖基化状态的抑制活性。此研究揭示了N-聚糖中的单个糖残基如何影响效应功能。特别是，此研究清楚地阐明了平分型GlcNAc残基在增强效应功能中的作用。除了上文描述的结构-关系活性研究之外，此方法还应用于完整IgG抗体表达和糖基化重构，以生产与效应细胞，如刺激ADCC活性的NK细胞具有高亲和力结合的糖基化状态。总之，这些研究提供了关于IgG-Fc上的N-聚糖的功能性作用的重要信息，为通过特定糖基化状态增强治疗性单克隆抗体的效应功能提供了基础。

[0116]糖基化改造的mAb的结构-功能关系的分析。

[0117]ADCC的体外模型对于初始鉴定糖基化改造的mAb的功能是有用的，而体内模型提供支持临床转化的进一步的数据。为了具体地评估糖基化改造形式的C225或其它治疗抗体对诱导ADCC的效用，使用复合的异种移植SCID小鼠模型(已清除内源小鼠NK)继承性地转移带有确定的FcgR多态性的NK细胞[34、35]。使用此系统允许评估用于诱导ADCC的糖基化改造的抗体[36、37、38]。优选地，所述NK细胞来自V/V或F/F(在FcgRIIIa的氨基酸158处)或H/H或R/R(在FcgRIIa的氨基酸131处)纯合个体。

[0118]使用不同的肿瘤细胞系评估具有基本上纯的糖基化状态的糖改造的C225 mAb(天然结构或无铰链)。M24met是已知在此模式系统中响应C225抗体治疗的黑色素瘤细胞系。此细胞系表达EGFR的突变形式，所述突变形式与小鼠和嵌合225 mAb二者均结合，但是不产生酪氨酸激酶磷酸化和后续的EGFR信号转导。通过FACS分析可用的黑色素瘤细胞系鉴定了其它不表达EGFR的黑色素瘤细胞系。用在细胞表面表达的无功能的EGFR突变体稳定转染EGFR-/-细胞。使用接种野生型EGFR阳性黑色素瘤细胞系如A431和M21的小鼠比较CHO细胞系产生的C225和C225糖改造的形式，所述糖改造形式显示含有M24met的ADCC和/或稳定转染的黑色素瘤细胞系。

[0119]预言性实施例10：EGFR突变人肿瘤细胞系在体内的生长。

[0120]使用M24met和/或转染无功能的、表达的EGFR(例如激酶活性突变体)的人SCCHN细胞系确定SCID/SCID小鼠的生长曲线。具体地，在肿瘤接种之前三天，通过尾静脉注射抗脱唾液酸1.1抗体耗尽动物的内源NK细胞。共6只动物(2只动物/组)皮内注射0.1ml PBS中的1 x 10⁵、1 x 10⁶或1 x 10⁷个细胞。隔日测量肿瘤生长，当肿瘤达到体重的约10％时，当肿瘤溃疡时，当所述动物无法进食或进水时或当研究人员认为所述动物处于发病前状况时，处死动物。在处死时，检查肺、肝脏和脾是否存在转移性疾病。这些研究确定了肿瘤接种和生长成SCID小鼠的参数。

[0121]预言性实施例11：继承性地转移至SCID小鼠后人NK细胞的存活。

[0122]我们使用variomacs珠从棕黄层血液(buffy coat blood)纯化了CD56阳性细胞。为了除去NKT细胞，从此群体耗尽了CD3阳性细胞。在人NK转移之前三天，通过IV注射抗脱唾液酸1.1抗体清除小鼠的内源NK细胞。在转移当天，用CFSE对NK细胞进行染色，然后通过尾静脉或腹腔注射继承性地转移1 x 10⁶、1 x 10⁷或5 x 10⁷个细胞(0.5cc PBS)。每周处死一个动物/组，对它们的外周血、骨髓和脾进行CFSE阳性细胞的存在和增殖的分析。为了确保内源NK清除的效力，使用这些相同的器官系统评估小鼠NK的存在。这些研究确定了NK继承性地转移到SCID小鼠中的参数。

[0123]预言性实施例12：糖改造的C225 mAB的体内评估。

[0124]第0天，注射抗脱唾液酸1.1抗体以清除内源小鼠NK细胞。在第3天，注射黑色素瘤肿瘤细胞系，允许根据预言性实施例10的结果形成肿瘤。在第6天，根据预言性实施例11的结果继承性地转移人NK细胞。可选择继承性地转移的NK细胞以覆盖所有的CD16a和CD32多态性组合，进而鉴定特定受体等位基因的最佳糖基化结构。在第7、14和21天，根据[39]中的方案注射C225 mAB或具有基本上纯的糖基化状态的糖改造的C225 mAB。治疗组如表2所示(糖C225是糖改造的C225 mAb或无铰链的等效物)。

[0125]表2

 

组	#动物	NK转移	mAb	目的
					1	5	无	无	肿瘤生长对照
2	5	无	C225	C225对照
					3	5	无	糖C225	糖C225对照
4	5	是	无	NK的天然抗肿瘤活性
					5	5	是	C225	C225的ADCC活性
6	5	是	糖C225	糖C225的ADCC活性
					7	5	是	FcgIIIa受体(CD16a)	mAB对照，其封闭CD16a和抑制ADCC活性

[0126]预言性实施例13：糖改造的C225 mAb与具有异种糖基化的亲本C225 mAb的比较性体内评估。

[0127]根据预言性实施例13的结果，对具有基本上纯的糖基化状态的C225 mAb和前体C225 mAb进行了体内比较。具有基本上纯的糖基化状态的C225在抑制肿瘤生长和/或降低转移中更有效。

[0128]增加C225 mAb效力的糖基化状态将通过增加所述mAb诱导ADCC的能力来实现这一点。因此，鉴定的糖结构将适合改进诱导ADCC的任何mAb的效力，所述mAb包括但不限于西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101(Aphton)、瓦罗西昔单抗(Biogen Idec和PDL BioPharm)、抗-CD80 mAb(Biogen Idec)、抗-CD23 mAb(Biogen Idel)、CAT-3888(Cambridge Antibody Technology)、CDP-791(Imclone)、依帕珠单抗(Immunomedics)、

MDX-010(Medarex和BMS)、MDX-060(Medarex)、MDX-070(Medarex)、马妥珠单抗(Merck)、CP-675，206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN-30(Seattle Genetics)、札木单抗(Serono和Genmab)、阿德木单抗(Sereno)、奥戈伏单抗(United Therapeutics)、尼妥珠单抗(YMBioscience)、ABT-874(Abbott Laboratories)、地诺苏单抗(Amgen)、AM108(Amgen)、AMG 714(Amgen)、芳妥珠单抗(Biogen Idec和PDLBioPharm)、达利珠单抗(Biogent Idec和PDL BioPharm)、戈利木单抗(Centocor和Schering-Plough)、CNTO 1275(Centocor)、ocrelizumab(Genetech和Roche)、HuMax-CD20(Genmab)、贝利单抗(HGS和GSK)、依帕珠单抗(Immunomedics)、MLN1202(Millennium Pharmaceuticals)、维西珠单抗(PDL BioPharm)、托珠单抗(Roche)、ocrerlizumab(Roche)、塞妥珠单抗(UCB，以前的Celltech)、依库珠单抗(AlexionPharmaceuticals)、培克珠单抗(Alexion Pharmaceuticals和Procter &Gamble)、阿昔单抗(Centocor)、雷珠单抗(Genetech)、美泊利珠单抗(GSK)、TNX-355(Tanox)或MYO-029(Wyeth)。

[0129]糖改造的C225(西妥昔单抗)的示例性医学应用。

[0130]SCCHN的种族差异。

[0131]如上所述，FcgRIIIa和FcgRIIa的特定等位基因与mAb诱导ADCC的效力降低相关联。这些遗传变异很可能代表具有频率差异的不同的种族和民族组。人们对民族组，特别是非洲裔美国人间的癌症差异的公共健康影响的认识日益增加。构建了部分肿瘤登记，以便可以评估癌症结果以了解疾病行为和改善癌症结果。已显示多个解剖部位的肿瘤的癌症发病率和结果存在种族差异[41]。

[0132]与主要是北欧后裔的人(白人)相比，非洲裔美国人的SCCHN发病率增加。在1973-1995年间，非洲裔美国男性的口腔癌和咽癌的发病率增加了39.7％，死亡率增加了1.8％，而白人男性相应的发病率和死亡率分别降低了17.6％和35.7％[42]。女性的趋势相似，但是数量级更小。

[0133]此外，口腔癌已上升为非洲裔美国男性第四大经常诊断到的癌症(白人男性最常见的第十一位)，年发病率为20.4/10⁶[42]。仅前列腺癌、肺癌和结肠癌在此组中具有更大的发病率；在SEER计划评估的11个种族和民族组中，没有其它组的口腔癌发病率排在前五位。SCCHN肿瘤是35-54岁的非洲裔美国男性中第四大癌症死亡因素。

[0134]非洲裔美国人在更小的年龄诊断出更晚期的头颈部癌。Tumor Registries of the East Orange，New Jersey VA Medical Center andSchool of Medicine and Dentistry之前的一份综述揭示，70％的年龄在45岁以下的诊断案例是非洲裔美国人。此组的61％呈现III或IV期；非洲裔美国人和白人晚期疾病的两年存活率分别为23％和40％。Hoffman报道了国家癌症数据库(National Cancer Database)的数据，1985-1994年间有295,000个头颈部癌案例；发现非洲裔美国人患晚期疾病(III或IV期)的比率是57.6％，而白人仅40.3％[43]。在控制病期和流行病学因素之后仍然存在显著的结果差异。

[0135]我们最近对我们机构在马里兰大学医学院的实践的总结与其他人观察到的晚期SCCHN癌症结果的种族差异相同。我们评估了103位每周进行一次卡铂和紫杉醇(Taxol)方案和定量辐射(70.2Gy)治疗的患者。非洲裔美国人(42％)和白人(58％)在年龄、性别、临床分期、肿瘤部位和治疗持续时间上相似。非洲裔美国人比白人具有更高的未调整的疾病复发率(分别为57％和37％，p＝0.05)，且更经常失败(分别为27％和12％，p＝0.06)。在执行多变量分析时，非洲裔美国人独立地比白人具有增加的复发可能性。IV期疾病和口咽肿瘤也是重要的复发预测对象。

[0136]我们在一组20位非洲裔美国人中评估了EGFR表达。我们确定了可重复的免疫组织化学染色(IHC)方案，EGFR着色指数(SI)如Ang等[33d]先前所述。先前的工作显示，与具有低EGFR表达的HNSCC患者相比，具有高EGFR表达(>平均吸光度的中值)的SCCHN的患者具有高度显著更低(分别为P＝0.0006和P＝0.0016)的总存活和无病存活率和高度地显著更高(P＝0.0031)的局部复发率[33d]。在20位非洲裔美国人的组织样品中，所有样品均具有EGFR阳性IHC染色。根据肿瘤分化的平均SC染色如下所示：良好至中度分化的SC＝3.2；中度分化的SC＝2.9；中度至差分化的SC＝2.8；差分化的SC＝2.4。整个组的SI中值为67.5。

[0137]根据在非洲裔美国人的非恶性组织中的EGFR表达结果，我们确定了适当的样本量以确定非洲裔美国人是否具有相对较高的EGFR表达。计算需要的样本量以保守地检测非洲裔美国人和白人之间20％的EGFR表达SI差异，显著性水平α＝0.05，幂(1-β)＝0.90。根据我们先前对非洲裔美国人中EGFR表达的实验，我们记录的平均SI为68.7，并假设白人的SI小20％。用于根据上述标准检测实验和对照肿瘤生长差异的样本量为：

[0138]n＝[2*σ²*f(α，β)]/[(x_AA-x_W)²]

[0139]其中n是每个组的样本量；x_AA-x_W分别是非洲裔美国人和白人的平均EGFR表达SI，σ表示标准偏差(13.6)。最后，f(α，β)是α，β的函数，显著性水平α＝0.05和幂(1-β)＝0.90，数量级为10.5。根据这些数据，我们的治疗组n＝21。我们将样品四舍五入，上调约10％至n＝25，以考虑意外的技术失误或丢失随访数据。

[0140]预言性实施例14：EGFR表达的回顾性分析。

[0141]使用上述免疫组织化学染色方案，使用

BENCHMARK系统(Tucson，AZ)，用针对EGFR(表皮生长因子受体，31G7克隆)的抗体对石蜡包埋的SCCHN组织切片染色。使用

 ACIS(Automated Cellular Imaging System，San JuanCapistrano，CA)分析染色的载玻片，其使用图像采集技术以基于颜色、色纯度和样品中的染色强度定量EGFR染色。

EGFR阳性染色的测量范围是0(未检测到染色)至4+(最大染色)。染色强度(SI)的测量范围为0(未检测到染色)至194(最大染色)。ACIS用来报告SI的数值范围与Ang等[33d]报道的方案中使用的范围相当。确定所述组的EGFR表达，过表达基于高于所述组的染色强度中值的染色强度水平[33d]。

[0142]使用

 9.0(Carey，NC)进行所有统计学计算。使用卡方检验比较非洲裔美国人和白人的EGFR表达。相对于白人受治疗者的肿瘤，用染色强度测量的非洲裔美国人的肿瘤中的EGFR表达更高。

[0143]预言性实施例15：FcgRIIIa和FcgRIIa多态性的回顾性分析。

[0144]我们确定非洲裔美国人的组织样品中FcgRIIIa(158F/V)和FcgRIIa(131H/R)二者的多态性频率。我们从患者的唾液、血液或从甲醛固定石蜡包埋的肿瘤样品中纯化了DNA。按上文所述方法进行两种Fc受体的等位基因多态性分析，如图3和4所示。使用卡方检验分析比较了非洲裔美国人和白人受治疗者的FcgR多态性频率。FcgRIIIa(158F)和/或FcgRIIa(131R)在非洲裔美国人中更常见。

[0145]预言性实施例16：接受C225(西妥昔单抗)mAb的患者的复发情况的回顾性分析。

[0146]分析的患者组包括同时接受放化疗和西妥昔单抗的患者。我们会评估未调整的局部复发和无疾病率。此外，我们会执行多变量回归分析以调整疾病和人口统计学变量，以确定EGFR表达、NK FcgR多态性或种族/民族性是否独立地预测复发。所有统计学计算将使用统计软件包9.0(Carey，NC)执行。在SCCHN患者中，EGFR过表达是复发的统计学上有效的独立预言者，并且这与种族/民族组间的差异相关。此外，我们根据对C225治疗的临床响应和FcgR亲和力和多态性之间的相关性，证实ADCC机制在治疗响应中具有重要作用。

如上所述，可以优化针对EGFR的单克隆抗体，如C225(西妥昔单抗)的Fc糖组成。改造Fc糖使之对患者的FcgR等位基因具有最佳的亲和力，进而改进结合和随后的ADCC。可选地，基于使用种族或民族FcgR的等位基因频率替代个体化遗传图谱，来选择C225糖内容而使最佳结合的概率最大化。

[0147]参考文献

[0148]本说明书提及的所有专利和公布均指示本发明所属领域技术人员的水平。本文的所有专利和公布均通过引用并入本文，就像特异性地和单独地指出每个独立的公布均通过引用整体并入本文。下列所有参考文献均已在本专利申请中引用：

[0149][1]Adams，G.P.和Weiner，L.M.2005.Monoclonal antibodytherapy of cancer(癌症的单克隆抗体治疗).Nat Biotechnol 23：1147-1157.

[0150][2]Carter，P.2001.Improving the efficacy of antibody-basedcancer therapies(改进基于抗体的癌症治疗的效力).Nat Rev Cancer1：118-129.

[0151][2b]Shields，Robert L.等.Lack of Fucose on Human IgG1N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human FcγRIII andAntibody-dependent Cellular Toxicity(人IgG1 N-连接寡糖缺乏岩藻糖改进了与人FcγRIII的结合和抗体依赖性的细胞毒性)，J.Biol.Chem.，第277卷，第30期，26733-26740，2002年7月26日。

[0152][2c]Shinkawa，Toyohide等.The Absence of Fucose butNot the Presence of Galactose or Bisecting N-Acetylglucosamine of HumanIgG1 Complex-type Oligosaccharides Shows the Critical Role of EnhancingAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity(人IgG1复合类型寡糖缺乏岩藻糖而不是存在半乳糖或平分型N-乙酰葡萄糖胺显示出对增强抗体依赖性的细胞毒性的重要作用).J.Biol.Chem.，2003年1月；278：3466-3473.

[0153][2d]Niwa，Rinpei等.Defucosylated Chimeric Anti-CCChemokine Receptor 4 IgG1 with Enhanced Antibody-Dependent CellularCytotoxicity Shows Potent Therapeutic Activity to T-Cell Leukemia andLymphoma(具有增强的抗体依赖性的细胞毒性的去岩藻糖基化的嵌合抗-CC趋化因子受体4 IgG1显示了对T-细胞白血病和淋巴瘤的强治疗活性).Cancer Res.2004 64：2127-2133

[0154][2e]Wu，J.，等，A novel polymorphism of FcgRIIIa(CD16a)alters receptor function and predisposes to autoimmune disease(新的FcgRIIIa(CD16a)多态性改变了受体功能并预示自身免疫疾病).J ClinInvest，1997.100(5)：第1059-70页。

[0155][3]Weng，W.K.和R.Levy，Two immunoglobulin G fragmentC receptor polymorphisms independently predict response to rituximab inpatients with follicular lymphoma(两种免疫球蛋白G片段C受体多态性在患有滤泡性淋巴瘤的患者中独立预期对利妥西单抗的响应).J ClinOncol，2003.21(21)：第3940-7页。

[0156][4]Weng，W.K.，等，Clinical outcome of lymphoma patientsafter idiotype vaccination is correlated with humoral immune response andimmunoglobulin G Fc receptor genotype(淋巴瘤患者进行独特型疫苗接种后的临床结果与体液免疫响应和免疫球蛋白G Fc受体基因型有关).JClin Oncol，2004.22(23)：第4717-24页。

[0157][5]Jefferis，R.2005.Glycosylation of recombinant antibodytherapeutics(重组抗体的糖基化治疗).Biotechnol Prog 21：11-16.

[0158][6]Li，H.，Sethuraman，N.，Stadheim，T.A.，Zha，D.，Prinz，B.，Ballew，N.，Bobrowicz，P.，Choi，B.K.，Cook，W.J.，Cukan，M.，Houston-Cummings，N.R.，Davidson，R.，Gong，B.，Hamilton，S.R.，Hoopes，J.P.，Jiang，Y.，Kim，N.，Mansfield，R.，Nett，J.H.，Rios，S.，Strawbridge，R.，Wildt，S.和Gerngross，T.U.2006.Optimization ofhumanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris(在糖改造的毕赤酵母(Pichia pastoris)中优化人源化IgG).Nat Biotechnol 24：210-215.

[0159][7]Lund，J.，Takahashi，N.，Popplewell，A.，Goodall，M.，Pound，J.D.，Tyler，R.，King，D.J.和Jefferis，R.2000.Expression andcharacterization of truncated forms of humanized L243 IgG1.Architecturalfeatures can influence synthesis of its oligosaccharide chains and affectsuperoxide production triggered through human Fc-g receptor I(截短形式的人源化L243 IgG1的表达和表征。结构特征可以影响其寡糖链合成和影响通过人Fc-g受体I触发的超氧化物产生).Eur J Biochem267：7246-7257.

[0160][8]Mimura，Y.，Church，S.，Ghirlando，R.，Ashton，P.R.，Dong，S.，Goodall，M.，Lund，J.和Jefferis，R.2000.The influence ofglycosylation on the thermal stability and effector function expression ofhuman IgG1-Fc：properties of a series of truncated glycoforms(糖基化对人IgG1-Fc的热稳定性和效应功能表达的影响：一系列截短的糖形的特性).Mol Immunol 37：697-706.

[0161][9]Krapp，S.，Mimura，Y.，Jefferis，R.，Huber，R.和Sondermann，P.2003.Structural analysis of human IgG-Fc glycoformsreveals a correlation between glycosylation and structural integrity(对人IgG-Fc糖形的结构分析揭示糖基化和结构完整性之间的相关性).J MolBiol 325：979-989.

[0162][10]Mimura，Y.，Sondermann，P.，Ghirlando，R.，Lund，J.，Young，S.P.，Goodall，M.和Jefferis，R.2001.Role of oligosaccharideresidues of IgG1-Fc in Fc g RIIb binding(IgG1-Fc寡糖残基在Fc g RIIb结合中的作用).J Biol Chem 276：45539-45547.

[0163][11]Sondermann，P.，Huber，R.，Oosthuizen，V.和Jacob，U.2000.The 3.2-A crystal structure of the human IgG1 Fc fragment-FcgRIII complex(人IgG1 Fc片段-Fc gRIII复合体的3.2-A晶体结构).Nature 406：267-273.

[0164][12]Lifely，M.R.，Hale，C.，Boyce，S.，Keen，M.J.和Phillips，J.1995.Glycosylation and biological activity of CAMPATH-1Hexpressed in different cell lines and grown under different cultureconditions(在不同的细胞系中表达和在不同的培养条件下生长的CAMPATH-1H的糖基化和生物活性).Glycobiology 5：813-822.

[0165][13]Umana，P.，Jean-Mairet，J.，Moudry，R.，Amstutz，H.和Bailey，J.E.1999.Engineered glycoforms of an antineuroblastomaIgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity(具有优化的抗体依赖性的细胞毒活性的神经母细胞瘤抗体IgG1的改造的糖形).Nat Biotechnol 17：176-180.

[0166][14]Davies，J.，Jiang，L.，Pan，L.Z.，LaBarre，M.J.，Anderson，D.和Reff，M.2001.Expression of GnTIII in a recombinantanti-CD20 CHO production cell line：Expression of antibodies with alteredglycoforms leads to an increase in ADCC through higher affinity for FC gRIII(GnTIII在重组抗-CD20抗体CHO生产细胞系中的表达：具有改变的糖形的抗体的表达通过增加对FC g RIII亲和力导致ADCC的增加).Biotechnol Bioeng 74：288-294.

[0167][15]Shinkawa，T.，Nakamura，K.，Yamane，N.，ShoJi-Hosaka，E.，Kanda，Y.，Sakurada，M.，Uchida，K.，Anazawa，H.，Satoh，M.，Yamasaki，M.，Hanai，N.和Shitara，K.2003.The absence offucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamineof human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role ofenhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity(人IgG1复合类型寡糖缺乏岩藻糖而不是存在半乳糖或平分型N-乙酰葡萄糖胺显示出对增强抗体依赖性的细胞毒性的重要作用).J Biol Chem 278：3466-3473.

[0168][16]Kumpel，B.M.，Rademacher，T.W.，Rook，G.A.，Williams，P.J.和Wilson，I.B.1994.Galactosylation of human IgGmonoclonal anti-D produced by EBV-transformed B-lymphoblastoid celllines is dependent on culture method and affects Fc receptor-mediatedfunctional activity(EBV转化的B-类淋巴母细胞细胞系产生的人IgG单克隆抗-D抗体的半乳糖基化依赖于培养方法并影响Fc受体介导的功能活性).Hum Antibodies Hybridomas 5：143-151.

[0169][17]Kumpel，B.M.，Wang，Y.，Griffiths，H.L.，Hadley，A.G.和Rook，G.A.1995.The biological activity of human monoclonalIgG anti-D is reduced by beta-galactosidase treatment(β-半乳糖苷酶治疗降低人单克隆IgG抗-D抗体的生物活性).Hum Antibodies Hybridomas6：82-88.

[0170][18]Boyd，P.N.，Lines，A.C.和Patel，A.K.1995.Theeffect of the removal of sialic acid、galactose and total carbohydrate on thefunctional activity of Campath-1H(除去唾液酸、半乳糖和总糖对Campath-1H的功能活性的影响).Mol Immunol 32：1311-1318.

[0171][19]Lund，J.，Takahashi，N.，Pound，J.D.，Goodall，M.，Nakagawa，H.和Jefferis，R.1995.Oligosaccharide-protein interactions inIgG can modulate recognition by Fc g receptors(IgG中的寡糖-蛋白相互作用可以调节Fc g受体对其的识别).Faseb J 9：115-119.

[0172][20]Stanley，P.1992.Glycosylation engineering(糖基化工程).Glycobiology 2：99-107.

[0173][21]Hollister，J.，Grabenhorst，E.，Nimtz，M.，Conradt，H.和Jarvis，D.L.2002.Engineering the protein N-glycosylation pathway ininsect cells for production of biantennary，complex N-glycans(改造昆虫细胞中的蛋白N-糖基化途径以生产双触角、复杂N-聚糖).Biochemistry41：15093-15104.

[0174][22]Choi，B.K.，Bobrowicz，P.，Davidson，R.C.，Hamilton，S.R.，Kung，D.H.，Li，H.，Miele，R.G.，Nett，J.H.，Wildt，S.和Gerngross，T.U.2003.Use of combinatorial genetic libraries tohumanize N-linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris(使用组合遗传文库在毕赤酵母中人源化N-连接糖基化).Proc Natl Acad Sci U S A100：5022-5027.

[0175][23]Hamilton，S.R.，Bobrowicz，P.，Bobrowicz，B.，Davidson，R.C.，Li，H.，Mitchell，T.，Nett，J.H.，Rausch，S.，Stadheim，T.A.，Wischnewski，H.，Wildt，S.和Gerngross，T.U.2003.Production ofcomplex human glycoproteins in yeast(在酵母中生产复杂的人糖蛋白).Science 301：1244-1246.

[0176][24]Wildt，S.和Gerngross，T.U.2005.The humanizationof N-glycosylation pathways in yeast(酵母N-糖基化途径的人源化).NatRev Microbiol 3：119-128.

[0177][25]Niwa，R.，Sakurada，M.，Kobayashi，Y.，Uehara，A.，Matsushima，K.，Ueda，R.，Nakamura，K.和Shitara，K.2005.Enhancednatural killer cell binding and activation by low-fucose IgG1 antibodyresults in potent antibody-dependent cellular cytotoxicity induction at lowerantigen density(增强的天然杀伤细胞结合和被低岩藻糖IgG1抗体活化在较低抗原密度下产生强的抗体依赖性的细胞毒性诱导).Clin CancerRes 11：2327-2336.

[0178][26]Yamane-Ohnuki，N.，Kinoshita，S.，Inoue-Urakubo，M.，Kusunoki，M.，Iida，S.，Nakano，R.，Wakitani，M.，Niwa，R.，Sakurada，M.，Uchida，K.，Shitara，K.和Satoh，M.2004.Establishment of FUT8knockout Chinese hamster ovary cells：an ideal host

cell line for producing completely defucosylated antibodies withenhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity(FUT8敲除的中国仓鼠卵巢细胞的建立：生产具有增强的抗体依赖性的细胞毒性的完全去岩藻糖基化的抗体的理想宿主细胞系).Biotechnol Bioeng 87：614-622.

[0179][26b]Sautes-Fridman C，C.L.，Cohen-Solal J，Fridman W，Fc Gamma Receptors：A Magic Link with the Outside World(Fc γ受体：与外界的神奇连接).Scientific Communications，2003：第148-151页。

[0180][27]Li，B.，Zeng，Y.，Hauser，S.，Song，H.和Wang，L.X.2005.Highly efficient endoglycosidase-catalyzed synthesis ofglycopeptides using oligosaccharide oxazolines as donor substrates(使用寡糖噁唑啉作为供体底物的高效内切糖苷酶催化的糖肽合成).J.Am.Chem.Soc.127：9692-9693.

[0181][28]Li，H.，Li，B.，Song，H.，Breydo，L.，Baskakov，I.V.和Wang，L.X.2005.Chemoenzymatic Synthesis of HIV-1 V3Glycopeptides Carrying Two N-Glycans and Effects of Glycosylation on thePeptide Domain(携带两个N-聚糖的HIV-1V3糖肽的化学酶法合成和糖基化对肽结构域的影响).J Org Chem 70：9990-9996.

[0182][29]Zeng，Y.，Wang，J.，Li，B.，Hauser，S.，Li，H.和Wang，L.X.2006.Glycopeptide Synthesis throughendo-Glycosidase-Catalyzed Oligosaccharide Transfer of Sugar Oxazolines：Probing Substrate Structural Requirement(通过内切糖苷酶催化的糖噁唑啉寡糖转移的糖肽合成：探索底物结构要求).Chem.Eur.J.12：3355-3364.

[0183][30]Li，B.，Song，H.，Hauser，S.和Wang，L.X.2006.AHighly Efficient Chemoenzymatic Approach Toward GlycoproteinSynthesis(糖蛋白合成的高效化学酶法方法).Org.Lett.8：3081-3084.

[0184][31]Watt，G.M.，Lund，J.，Levens，M.，Kolli，V.S.，Jefferis，R.和Boons，G.J.2003.Site-specific glycosylation of anaglycosylated human IgG1-Fc antibody protein generates neoglycoproteinswith enhanced function(糖基化的人IgG1-Fc抗体蛋白的位点特异性糖基化产生具有增强的功能的拟糖蛋白).Chem Biol 10：807-814.

[0185][32]第7,138,371号美国专利

[0186][33]Bing Li，Ying Zeng，Steven Hauser，Haijing Song和Lai-Xi Wang，Highly Efficient Endoglycosidase-Catalyzed Synthesis ofGlycopeptides Using Oligosaccharide Oxazolines as Donor Substrates(使用寡糖噁唑啉作为供体底物的高效内切糖苷酶催化的糖肽合成)，J.AM.CHEM.SOC.2005，127，9692-9693.

[0187][33b]Bazley，L.A.和W.J.Gullick，The epidermal growthfactor receptor family(表皮生长因子受体家族).Endocr Relat Cancer，2005.12(增刊)1：第S17-27页。

[0188][33c]Choong，N.W.和E.E.Cohen，Epidermal growth factorreceptor directed therapy in head and neck cancer(头颈部癌的表皮生长因子受体定向治疗).Crit Rev Oncol Hematol，2006.57(1)：第25-43页。

[0189][33d]Ang，K.K.等，Impact of epidermal growth factorreceptor expression on survival and pattern of relapse in patients withadvanced head and neck carcinoma(表皮生长因子受体表达对患有晚期头颈部癌的患者的存活和复发模式的影响).Cancer Res，2002.62(24)：第7350-6页。

[0190][33e]Bonner，J.A.，等，Radiotherapy plus cetuximab forsquamous-cell carcinoma of the head and neck(头颈部鳞状细胞癌的放疗加西妥昔单抗治疗).N Engl J Med，2006.354(6)：第567-78页。

[0191][34]Tournoy，K.，S.Depraetere，P.Meuleman，G.Leroux-Roels，R.Pauwels.1998.Murine interleukin 2 receptor chainblockade improves human leukocyte engraftment in severe combinedimmunodeficient(SCID)mice(小鼠白介素2受体链封闭改进了人白细胞向重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠的植入).Eur.J.Immunol 28：3221.

[0192][35]Shibata，S.，T.Asano，A.Noguchi，H.Kimura，A.Ogura，M.Naiki，K.Doi.1998.Enhanced engraftment of human peripheralblood lymphocytes into anti-murine interferon-monoclonalantibody-treated C.B.-17-scid mice(增强的人外周血淋巴细胞向抗小鼠干扰素单克隆抗体处理的C.B.-17-scid小鼠的植入).Cell.Immunol.183：60.

[0193][36]Mueller BM，Romerdahl CA，Trent JM，Reisfeld RA.Suppression of spontaneous melanoma metastasisin scid mice with anantibody to the epidermal growth factor receptor(用针对表皮生长因子受体的抗体抑制scid小鼠中的自发性黑色素瘤转移).Cancer Res.1991年4月15日；51(8)：2193-8.

[0194][37]Goldstein NI，Prewett M，Zuklys K，Rockwell P，Mendelsohn J.Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidermalgrowth factor receptor in a human tumor xenograft model(表皮生长因于受体的嵌合抗体在人肿瘤异种移植模型的生物效力).Clin CancerRes.1995年11月；1(11)：1311-8.

[0195][38]Naramura M，Gillies SD，Mendelsohn J，Reisfeld RA，Mueller BM.Therapeutic potential of chimeric and murine anti-(epidermalgrowth factor receptor)antibodies in a metastasis model for humanmelanoma(嵌合的小鼠抗-(表皮生长因子受体)抗体在人黑色素瘤的转移模型中的治疗潜能).Cancer Immunol Immunother.1993年10月；37(5)：343-9.

[0196][39]Naramura M，Gillies SD，Mendelsohn J，Reisfeld RA，Mueller BM.Therapeutic potential of chimeric and murine anti-(epidermalgrowth factor receptor)antibodies in a metastasis model for humanmelanoma(嵌合的小鼠抗-(表皮生长因子受体)抗体在人黑色素瘤的转移模型中的治疗潜能).Cancer Immunol Immunother.1993年10月；37(5)：343-9.

[0197][40]Hodoniczky J，Zheng YZ，James DC.Control ofrecombinant monoclonal antibody effector functions by Fc N-glycanremodeling in vitro(通过在体外重构Fc N-聚糖控制重组单克隆抗体效应功能).Biotechnol Prog.2005年11-12月；21(6)：1644-52.

[0198][41]Ward，E.等，Cancer disparities by race/ethnicity andsocioeconomic status(癌症的种族/民族性和社会经济地位差异).CACancer J Clin，2004.54(2)：第78-93页。

[0199][42]NationalCancerInstitute，SEER Cancer StatisticsReview 1973-1995(1973-1995年SEER癌症统计回顾).[网页]，1998.

[0200][43]Hoffman，H.T.等，The National Cancer Data Basereport on cancer of the head and neck(国家癌症数据库关于头颈部癌的报告).Arch Otolaryngol Head Neck Surg，1998.124(9)：第951-62页。

[0201][44]Nakayama，K.，T.Nagasu，Y.Shimma，J.Kuromitsu和Y.Jigami.1992.OCH1 encodes a novel membrane boundmannosyltransferase：outer chain elongation of asparagine-linkedoligosaccharides(OCH1编码新的膜结合甘露糖基转移酶：天冬酰胺-连接的寡糖外侧链的延长).EMBO J.11：2511-2519.

[0202]Jemal，A.，等，Cancer statistics(癌症统计学)，2004.CACancer J Clin，2004.54(1)：第8-29页。

[0203]Shuch，B.等，Racial disparity of epidermal growth factorreceptor expression in prostate cancer(前列腺癌中表皮生长因子受体表达的种族差异).J Clin Oncol，2004.22(23)：第4725-9页。

[0204]Coura，R.等，An alternative protocol for DNA extraction fromformalin fixed and paraffin wax embedded tissue(从甲醛固定和石蜡包埋的组织中抽提DNA的替代方案).J Clin Pathol，2005.58(8)：第894-5页。

[0205]Yang，S.H.等，Mutations in the tyrosine kinase domain of theepidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer(非小细胞肺癌中表皮生长因子受体酪氨酸激酶结构域的突变).Clin Cancer Res，2005.11(6)：第2106-10页。

[0206]虽然已详细描述了本发明和其优点，但是应理解，本文可执行各种更改、置换和改变，而不背离所附权利要求中确定的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围不预期局限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方案。

本领域普通技术人员根据本发明的公开内容将容易理解，可根据本发明利用与本文描述的相应实施方案执行基本上相同的功能或达到基本上相同的结果的预先存在的的或待开发的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤。因此，所附权利要求意在将此类过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤包括在其范围中。

序列表

<110>UNIVERSITY OF MARYLAND，BALTIMORE

<120>糖基化改造的抗体治疗

<130>HO-P03490WO0

<150>US 60/812,322

<151>2006-06-09

<150>US 60/897,966

<151>2007-01-29

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>合成的

<400>1

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>合成的

<400>2

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>合成的

<400>3

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>合成的

<400>4

Claims (25)

1.一种生产具有需要的糖基化状态的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：

a)除去一个或多个糖，

b)化学合成糖，和

c)将所述的化学合成的糖酶促连接至(i)所述抗体或(ii)与所述抗体连接的糖。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述化学合成的糖包含噁唑啉环。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是内切糖苷酶，并且所述酶促连接包含转糖基作用。

4.如权利要求1-3所述的方法，其中所除去的糖是天冬酰胺连接的糖，多肽在步骤a)之后在天冬酰胺处保留N-乙酰葡萄糖胺，并且所述酶促连接是与所述N-乙酰葡萄糖胺的连接。

5.如权利要求1-4所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体，并且所述方法产生基本上纯的单克隆抗体。

6.如权利要求1-5所述的方法，其中所述化学合成的糖在步骤c)之后产生非天然的糖结构。

7.如权利要求5-6所述的方法，其中所述基本上纯的单克隆抗体包含能够调节生物活性的糖基化状态。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述生物活性是(i)对Fcg受体的结合亲和力或(ii)抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。

9.如权利要求5-8所述的方法，其中所述单克隆抗体包含西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101、瓦罗西昔单抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠单抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木单抗b、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、ABT-874、地诺苏单抗、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、CNTO 1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、贝利单抗、依帕珠单抗、MLN1202、维西珠单抗、托珠单抗、ocrerlizumab、塞妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、雷珠单抗、美泊利珠单抗、TNX-355或MYO-029。

10.一种抗体组合物，其包含具有基本上纯的糖基化状态的抗体。

11.如权利要求10所述的抗体组合物，其中所述糖基化状态包含至少四个糖。

12.如权利要求10-11所述的抗体组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。

13.如权利要求12所述的抗体组合物，其中所述单克隆抗体包含西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101、瓦罗西昔单抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠单抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、ABT-874、地诺苏单抗、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、CNTO 1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、贝利单抗、依帕珠单抗、MLN1202、维西珠单抗、

托珠单抗、ocrerlizumab、塞妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、雷珠单抗、美泊利珠单抗、TNX-355或MYO-029。

14.一种评价糖多肽的生物活性的方法，所述方法包括如下步骤：

a)生产具有选定的糖基化状态的糖多肽的基本上纯的群体，和

b)测量所述糖多肽的生物活性。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述糖多肽是抗体，并且所述生物活性是(i)对Fcg受体的结合亲和力或(ii)抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述抗体包含单克隆抗体。

17.如权利要求15-16所述的方法，其中所述生物活性是体内抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。

18.如权利要求16-17所述的方法，其中所述单克隆抗体包含西妥昔单抗、利妥西单抗、莫罗莫那-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英利昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利株单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101、瓦罗西昔单抗、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、依帕珠单抗、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、札木单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、尼妥珠单抗、ABT-874、地诺苏单抗、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗、达利珠单抗、戈利木单抗、CNTO 1275、ocrelizumab、HuMax-CD20、贝利单抗、依帕珠单抗、MLN1202、维西珠单抗、托珠单抗、ocrerlizumab、塞妥珠单抗、依库珠单抗、培克珠单抗、阿昔单抗、r雷珠单抗、美泊利珠单抗、TNX-355或MYO-029。

19.一种改进基于抗体的治疗的结果的方法，所述方法包括如下步骤：

a)为受治疗者确定所述受治疗者中存在的Fcg受体等位基因，和

b)用包含被选择用于(i)增加对所述受治疗者中存在的Fcg受体等位基因的结合亲和力或(ii)增加抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性的基本上纯的糖基化状态的单克隆抗体治疗所述的受治疗者。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述Fcg受体的等位基因是氨基酸158的FcgIIIa受体的等位基因或氨基酸131的FcgIIa受体的等位基因。

21.一种为单克隆抗体选择糖基化状态的方法，所述方法包括如下步骤：

a)确定免疫细胞上的Fcg受体等位基因，和

b)选择相对于具有异种糖基化状态的源单克隆抗体调节下列活性的糖基化状态：

i)抗体依赖性的细胞毒性，

ii)补体依赖性的细胞毒性，

iii)Fcg受体结合亲和力，或

iv)单克隆抗体诱导的细胞信号传导事件。

22.一种生成单克隆抗体的生物等效物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)确定预先存在的单克隆抗体的糖基化状态，和

b)使用如权利要求1-4所述的方法来生产与所述预先存在的单克隆抗体具有基本上相同的糖基化状态的单克隆抗体。

23.一种选择用于临床开发在具有Fcg受体等位基因的群体中使用的单克隆抗体的糖形的方法，所述方法包括如下步骤：

a)测试单克隆抗体的糖形针对所述群体中存在的Fcg受体等位基因的生物活性，和

b)选择用于临床开发的能够(i)增加对所述群体中存在的Fcg受体等位基因的结合亲和力或(ii)增加抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性的单克隆抗体的糖形。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述Fcg受体等位基因是针对氨基酸158的FcgIIIa受体等位基因或针对氨基酸131的FcgIIa受体等位基因。

25.一种生成具有异种糖基化状态的预先存在的单克隆抗体的基本上纯的糖形的方法，所述方法包括如下步骤：

a)使用如权利要求1-4所述的方法来生产在所述预先存在的单克隆抗体中存在的两个或多个糖形，

b)测试所述两个或多个糖形的生物活性或毒性以确定具有更高的生物活性或更低的毒性的预先存在的单克隆抗体的优选的糖形，和

c)使用如权利要求1-4所述的方法来生产具有基本上纯的优选糖基化状态的在步骤b)中鉴定的具有更高的生物活性或更低的毒性的单克隆抗体的糖形。

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