KR20090088911A

KR20090088911A - 인슐린-유사 성장 인자 ｉ 수용체에 대한 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20090088911A
Application number: KR1020097012637A
Authority: KR
Inventors: 한스 콜; 클라우스-페터 퀸켈레; 사무엘 모저; 질케 푀링
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2009-08-20
Also published as: TW200833712A; WO2008077546A1; AR064620A1; IL198778A0; BRPI0722062A2; KR20120080663A; MX2009006333A; CR10810A; US20080226635A1; CN101611059A; JP2010513352A; NZ576956A; US20120076778A1; MA31066B1; AU2007338402A1; RU2009127846A; ECSP099440A; CL2007003726A1; PE20081832A1; EP2102242A1

Abstract

IGF-IR 에 결합하며 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화된 항체로서, 상기 당 사슬 내 푸코스의 양이 20% 내지 50% 인 것을 특징으로 하는 항체는 항종양 치료에서 개선된 특성을 갖는다.

Description

인슐린-유사 성장 인자 Ｉ 수용체에 대한 항체 및 이의 용도 {ANTIBODIES AGAINST INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR I RECEPTOR AND USES THEREOF}

본 발명은 인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-IR) 에 대한 항체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-IR, EC 2.7.112, CD 221 항원) 는 막횡단 단백질 티로신 키나아제의 패밀리에 속한다 (LeRoith, D., 등, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163 ; 및 Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093). IGF-IR 은 IGF-I 에 높은 친화성으로 결합하고, 생체 내에서 상기 리간드에 대한 생리학적 반응을 개시한다. IGF-1R 은 또한 IGF-II 에도 결합하나, 조금 더 낮은 친화성으로 결합한다. IGF-1R 을 포함하는 IGF-1 시스템은 (정상 및 신생물) 세포의 증식 동안 중요한 역할을 수행한다. IGF-1R 은 정상 인간 조직, 예를 들어, 태반, 전립샘, 방광, 신장, 십이지장, 작은 창자, 쓸개, 온쓸개관, 간내 쓸개관, 기관지, 편도, 가슴샘, 유방, 피부기름샘, 타액선, 자궁목 및 자궁관에서 발견된다. IGF-IR 과발현은 세포의 신생물적 변형을 촉진시키고, IGF-IR 이 세포의 악성 변형에 관여한다는 증거가 존재하고, 따라서, 암 치료용 치료제의 개발에 대한 유용한 표적이다 (Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093).

IGF-IR 에 대한 항체는 당업계에 잘 알려져 있고, 시험관 내 및 생체 내에서 그의 항종양 효과에 대해 조사되어 있다 (Benini, S., 등, Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., 등, Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., 등, Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218; Prigent, S.A., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252; Pessino, A., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K.H., 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos, M.A., 등, J. Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963; Soos, M.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221; O'Brien, R.M., 등, EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R., 등, Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A., 등, Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S.L., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P., 등, J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673; KuIl, F.C. Jr., 등 J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D.O., and Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J.R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E.M., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., and Rutter, WJ., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A., 등, FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A., 등, J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q.T., 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281; 및 Kalebic, T., 등, Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T. E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093; Dricu, A., 등, Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn, L., 등, Melanoma Res. 8 (1998) 389-397; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252). IGF-IR 에 대한 항체는 또한, 많은 추가의 공개문헌, 예를 들어, [Arteaga, C.L., 등, Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106; 및 Hailey, J., 등, Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353] 에 기술되어 있다.

특히, αIR3 이라고 하는 IGF-IR 에 대한 모노클로날 항체는 IGF-IR 매개 과정 및 IGF-I 매개 질환, 예컨대 암을 연구하는 목적으로 광범위하게 사용된다. 알파-IR-3 은 [Kull, F.C., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566] 에 의해 기술되었다. 한편, 약 100 개의 공개문헌이 αIR3 의 단독, 및 독소루비신 및 빈크리스틴과 같은 세포독성제와 함께, 그의 항종양 효과에 관한 연구 및 치료적 용도를 다루면서 출판되었다. αIR3 은 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것이 아닌, IGF-I 이 IGF 수용체에 결합하는 것을 억제시키는 것으로 알려진 쥣과 모노클로날 항체이다. αIR3 은 고농도에서 종양 세포 증식 및 IGF-IR 인산화를 자극시킨다 (Bergmann, U., 등, Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H., 등, J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661). IGF-I 이 IGF-IR 에 결합하는 것보다 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 더욱 강력하게 억제시키는 다른 항체 (예를 들어, 1H7, Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252) 가 존재한다. 항체 및 그의 특성 및 특징에 대한 당업계의 요약은 [Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1093] 에 의해 기술되어 있다.

당업계에서 기술된 항체의 대부분은 마우스 기원이다. 그러한 항체는 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 키메라화 또는 인간화와 같은 추가의 변형 없이는 인간 환자의 치료에 유용하지 않다. 이러한 단점을 바탕으로, 인간 항체는 확실히 인간 환자의 치료에서 치료제로서 바람직하다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 상기 기술을 바탕으로, 많은 다양한 표적에 대한 인간 항체를 제조할 수 있다. IGF-IR 에 대한 인간 항체의 예는 WO 2002/053596, WO 2004/071529, WO 2005/016967, WO 2006/008639, US 2005/0249730, US 2005/0084906, WO 2005/058967, WO 2006/013472, US 2003/0165502, WO 2005/082415, WO 2005/016970, WO 2003/106621, WO 2004/083248, WO 2003/100008, WO 2004/087756, WO 2005/005635 및 WO 2005/094376 에 기술되어 있다.

WO 2004/087756 은 IGF-1R 에 결합하고 IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합을 억제하는 항체로서, 인간 IgG1 동종형이고, IGF-I 의 IGF-IR 에의 결합 억제 대 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합 억제의 비율이 1:3 내지 3:1 임을 나타내고, ADCC 에 의해 상기 항체의 100 nM 농도에서 24 시간 후 IGF-IR 발현 세포의 제제 중 20% 이상 세포의 세포사를 유도하는 것을 특징으로 하는 항체를 기술한다.

모노클로날 항체의 세포-매개 효과기 기능은 문헌 [Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; 및 미국 특허 6,602,684] 에 기술된 바와 같이 이 들의 올리고사카라이드 성분의 조작에 의해 증강될 수 있다. 암 면역요법에서 가장 흔히 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 내 Asn297 에서 보존 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 2 개의 착체 바이안테너리 올리고사카라이드를 CH2 도메인 사이에 묻고, 폴리펩티드 주쇄와 넓은 범위에 걸친 접촉을 형성시키는데, 이들의 존재는 항체에 있어서 항체의존자리 세포성 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 기능의 매개에 본질적이다 (Lifely, M.R., 등, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., 등, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. 및 Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). 문헌 [Umana, P., 등. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 및 WO 99/54342] 은 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 β(l,4)-N-아세틸글루코사미닐트란스페라아제 III ("GnTIII") (이등분된 올리고사카라이드의 형성을 촉매화하는 글리코실트란스페라아제) 의 과발현이 항체의 시험관 내 ADCC 활성도를 상당히 증가시킨다는 것을 보여주었다. N297 탄수화물의 조성의 변경 또는 이의 제거는 또한 FcγR 및 Clq 에 결합하는 Fc 결합에의 결합에 영향을 미친다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies 등, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, LC, 등, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).

문헌 [Iida, S., 등, Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887] 은 비푸코실 화 항-CD20 항체의 효능이 푸코실화 항-CD20 의 첨가에 의해 억제되었다는 것을 보여준다. 비푸코실화 및 푸코실화 항-CD20 의 1:9 혼합물 (10 microg/ml) 의 효능은 비푸코실화 항-CD20 단독의 1,000-배 희석액 (0.01 microg/ml) 의 효능보다 못하다. 이들은 비푸코실화 IgG1 (푸코실화 카운터파트를 포함하지 않음) 가 이의 높은 FcgammaRIIIa 결합을 통해 ADCC 에 대한 혈장 IgG 의 억제 효과를 피할 수 있다고 결론지었다. Natsume, A., 등은 문헌 [J. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103] 에서 인간 IgG1-유형 항체의 착체-유형 올리고사카라이드로부터의 푸코스 제거가 항체-의존자리 세포성 세포독성 (ADCC) 의 현저한 증대를 야기한다는 것을 보여준다. 문헌 [Satoh, M., 등, Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173] 은 차세대 치료용 항체로서의 비-푸코실화 치료용 항체를 검토하였다. Satoh 는 비-푸코실화 인간 IgG1 형태로만 이루어지는 항체가 이상적으로 생각된다고 결론지었다. 문헌 [Kanda, Y., 등, Biotechnol. Bioeng. 94 (2004) 680-688] 은 푸코실화 CD20 항체 (96% 푸코실화, CHO/DG44 1H5) 와 비푸코실화 CD20 항체를 비교하였다. 문헌 [Davies, J., 등, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294] 은 CD20 항체에 있어서 ADCC 의 증가는 FcγRIII 에의 결합의 증가와 서로 관련된다는 것을 보고하고 있다.

모노클로날 항체의 세포-매개 효과기 기능을 증강시키는 방법은, 예를 들어, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739 에 기재되어 있 다.

그러나, 여전히 항종양 치료를 필요로 하는 환자에게 납득할 만한 이점이 있는 IGF-IR 에 대한 항체에 대한 요구가 있다. 환자를 위한 적절한 이점은, 간단히 말하여, 항종양제 치료에 의해 야기되는 종양 성장의 감소 및 진행 시간의 뚜렷한 연장이다.

발명의 개요

본 발명은, IGF-IR 에 결합하며 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화된 항체로서, 상기 당 사슬 내 푸코스의 양이 20% 내지 50%, 바람직하게는 20% 내지 40% 인 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다.

상기 양의 푸코스를 포함하는 본 발명에 따른 항체는 부분적으로 푸코실화된 것이라고도 칭한다.

본 발명은, IGF-IR 에 결합하며 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화된 항체로서, FcγRIII 에의 높은 결합 친화성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다.

바람직하게는 항체가 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유형이다. 특히 바람직한 항체는 인간 IgG1 또는 IgG3 유형이다.

바람직하게는 NGNA 의 양이 1% 이하이고, 및/또는 N-말단 알파-1,3-갈락토오스의 양이 1% 이하이다.

바람직하게는 NGNA 의 양이 0.5% 이하, 더욱 바람직하게는 0.1% 이하이고, 심지어는 검출불가능한 수준이다 (LCMS).

바람직하게는 N-말단 알파-1,3-갈락토오스의 양이 0.5% 이하, 더욱 바람직하게는 0.1% 이하이고, 심지어는 검출불가능한 수준이다 (LCMS).

본 발명에 따르면, "푸코스의 양" 은, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정되고, 평균값으로서 계산된 Asn 297 에 부착된 모든 글리코구조 (예, 착체, 하이브리드 및 고(high)-만노스 구조) 의 총합에 대한 Asn297 에서의 당 사슬 내 상기 당의 양을 의미한다 (실시예 4 참조).

당 사슬은 바람직하게는 CHO 세포 내에서 재조합적으로 발현된 IGF-IR 에 결합하는 항체의 Asn297 에 부착된 N-연결 글리칸의 특징을 나타낸다.

본 발명은, 바람직하게는 IGF-IR 에 결합하고, IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합을 억제하는 부분적 푸코실화 항체로서, 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항체를 포함한다:

a) IGF-I 의 IGF-IR 에의 결합 억제의 IC₅₀ 값 대 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합 억제의 IC₅₀ 값의 비율이 1:3 내지 3:1 임을 나타냄;

b) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 및 10 nM 인간 IGF-1 를 함유하는 배지 내의 HT29 세포를 사용한 세포의 인산화 검정에서, 상기 항체가 없는 그러한 검정과 비교했을 때, 5 nM 의 농도에서 IGF-IR 인산화를 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 억제시킴;

c) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내의 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인 산화 검정에서, 상기 항체가 없는 그러한 검정과 비교했을 때, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로서 측정되는 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않음 (신호화 없음, IGF-1 모방 활성 없음).

본 발명에 따른 항체는 항종양 치료를 필요로 하는 환자에게 이점을 제공하며, 종양 성장의 감소 및 종양진행에 대한 유의한 기간 연장을 제공한다. 본 발명에 따른 항체는 IGF 하위조절과 연관된 질환, 특히 종양 질환으로부터 고통받는 환자에 이점을 야기하는 신규 그리고 진보적인 특성을 갖는다. 본 발명에 따른 항체는 전술한 특성을 특징으로 한다.

바람직하게는, 항체는 IGF-IR 에 특이적으로 결합하고, 전술된 비율에서 IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제시키며, IgG1 동종형이고, 부분적 푸코실화되어 있고, 심지어 IGF-IR 과발현 세포에서조차 그의 IC₅₀ 값의 200-배 농도 또는 심지어 20,000-배 농도에서 IGF-IR 신호화를 활성화시키지 않는다.

바람직하게는, 5 nM 의 농도에서 본 발명에 따른 항체는 종양 세포 내 IGF-IR 의 IGF-I 매개 신호 전달을 완전히 억제시킨다.

항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이고, 또한 키메라성 항체 (인간 불변 사슬), 인간화된 항체 및 특히 바람직하게는 인간 항체이다.

항체는 바람직하게는 항체 18 과 경합하여 IGF-IR 인간 (EC 2.7.1.112, SwissProt P08069) 에 결합한다.

항체는 바람직하게는 10^-8 M (K_D) 이하, 바람직하게는 약 10^-9 내지 10^-13 M 의 친화성을 추가의 특징으로 한다.

항체는 바람직하게는 인슐린 수용체에 결합하는 인슐린의 검출가능한 농도 의존성 억제를 나타내지 않는다.

항체는 바람직하게는 IgG1 유형이다.

본 발명에 따른 항체는 비히클 처리된 동물과 비교시 적절한 이종 이식 종양 모델에서 진행 시간을 상당히 연장시키고, 종양 성장을 감소시킨다. 상기 항체는 시험관 내 및 생체 내에서 IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제시키고, 바람직하게는 IGF-I 및 IGF-II 에 대해 대략 동일한 방식으로 억제시킨다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 항체가 중쇄 상보성 결정 영역 CDR3 으로서 SEQ ID NO:1 또는 3 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 상보성 결정 영역 (CDR) 으로서 하기 서열을 포함한다:

a) CDR 로서 SEQ　ID　NO:1 또는 3 의 CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

b) CDR 로서 SEQ　ID　NO:2 또는 4 의 CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.

본 발명에 따른 항체의 중쇄의 바람직한 가변 영역 및 CDR, 특히 CDR3 은 [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germany] 에 기탁된 <IGF-1R> HUMAB 클론 18 (항체 18) 및 <IGF-1R> HUMAB 클론 22 (항체 22) 에 의해 제공된다.

세포주	기탁 번호	기탁일
<IGF-1R> HUMAB-클론 18	DSM ACC 2587	2003.04.10
<IGF-1R> HUMAB-클론 22	DSM ACC 2594	2003.05.09

바람직하게는, 본 발명에 따른 항체가 SEQ ID NO:1 을 포함하는 항체 중쇄 및 SEQ ID NO:2 를 포함하는 항체 경쇄 또는 SEQ ID NO:3 을 포함하는 항체 중쇄 및 항체 경쇄 SEQ ID NO:4 를 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 항체는 바람직하게는 인간 IgG1 유형이다.

이들 항체는 WO 2005/005635 에 상세히 기술되어 있다.

본 발명은 이러한 항체의 재조합 제조 방법을 추가로 제공한다.

각각의 기타 항체 사슬과 함께 본 발명에 따른 항체에 어셈블리할 수 있는 폴리펩티드의 바람직한 헥산은 하기에 정의된다:

바람직하게는, 상기 핵산이 SEQ ID NO:1 을 포함하는 항체 중쇄 및 SEQ ID NO:2 의 항체 경쇄 또는 SEQ ID NO:3 을 포함하는 항체 중쇄 및 SEQ ID NO:4 의 항체 경쇄를 포함하는 본 발명에 따른 항체를 암호화한다.

본 발명은 또한 암, 바람직하게는 유방암, 췌장암, 전립선암, 방광암, 악성 흑색종, 유윙육종, 신경모세포종, 뼈육종, 횡문근육종 및/또는 NSCLC 의 치료 방법으로서, 암을 가진 것으로 진단받은 환자 (및 그러므로 항종양 치료를 필요로 하는 환자) 에게 본 발명에 따른 IGF-IR 에 대한 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 항체는 단독으로, 약학 조성물 내에서, 또는 대안적으로는 EGFR, Her2/neu 또는 에스트로겐 수용체와 같은 암 관련 신호전달경로의 기타 억제제와 병용해서 또는 방사능치료 또는 세포 독성제 또는 그의 프로드러그와 같은 세포 독성 치료와 병용해서 투여할 수 있다. 상기 항체는 약학적 유효량으로 투여된다.

본 발명은 또한 암 치료, 바람직하게는 유방암, 췌장암 및/또는 NSCLC 의 치료 및 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 암 치료, 바람직하게는 유방암, 췌장암, 전립선암, 방광암, 악성 흑색종, 유윙육종, 신경모세포종, 뼈육종, 횡문근육종 및/또는 NSCLC 치료를 위한 본 발명에 따른 항체를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를, 약학적 목적을 위한 항체의 제형물에 유용한 완충제 및/또는 보조제를 임의로 함께 함유하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 발명에 따른 항체를 함유하는 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체 중에 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 약학 조성물을 제조품 또는 키트 중에 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 암 치료용의 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. 상기 항체는 약학적 유효량으로 사용된다.

본 발명은 또한 암, 바람직하게는 유방암, 췌장암 및/또는 NSCLC 의 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 상기 항체는 약학적 유효량으로 사용된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 인간 항체의 제조 방법으로서, 상기 항체를 부분적으로 푸코실화시키는, CHO 숙주 세포에서 IGF-1R 에 결합하는 항체를 암호화하는 핵산을 발현시키고, 상기 세포에서 상기 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법을 포함한다. 본 발명은 이러한 재조합 방법에 의해 수득가능한 항체를 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 GnTIII 및 항-IGF-1R 항체를 재조합적으로 발현할 수 있는 CHO 세포를 포함한다. 이러한 CHO 세포는, GnTIII 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 제 1 DNA 서열, IGF-IR 에 대한 항체의 적어도 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 제 2 DNA 서열, 및 적어도 경쇄의 가변 도메인을 암호화하는 제 3 DNA 서열로 형질변환한 CHO 세포이다. 바람직하게는 제 2 및 제 3 DNA 서열이 인간 IgG1 유형의 IGF-IR 에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화한다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 IGF-1R 에 대한 항체의 제조 방법을 포함한다: GnTIII 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 제 1 DNA 서열, IGF-IR 에 대한 항체의 적어도 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 제 2 DNA 서열, 및 적어도 경쇄의 가변 도메인을 암호화하는 제 3 DNA 서열로 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 세포를 형질전환하는 단계; 발효 배지 내에서 상기 숙주 세포를, 바람직하게는 독립적으로, 상기 제 1, 제 2 및 제 3 DNA 서열을 발현하는 상기 숙주 세포를, 상기 숙주 세포가 상기 항체를 발효 배지로 분비하는 조건 하에서, 배양하는 단계; 및; 상기 항체를 단리시키는 단계.

용어 "항체" 는 본 발명에 따른 특징이 유지되는 한, 전체 항체, 항체 절편, 인간 항체, 인간화된 항체 및 유전자 조작 항체를 비제한적으로 포함하는 다양한 형태의 항체를 포함한다.

"항체 절편" 은 전장 항체의 부위, 일반적으로 적어도 항원 결합 부위 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예에는 항체 절편으로부터 형성된 디아바디 (diabody), 단쇄 항체 분자, 면역독소, 및 다중특이적 항체가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제제를 말한다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체" 는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다.

용어 "키메라성 항체" 는 재조합 DNA 기술에 의해 통상 제조되는, 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 하나 이상의 불변 영역 부위 및 하나의 공급원 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역을 포함하는 모노클로날 항체를 말한다. 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라성 항체가 특히 바람직하다. 그러한 쥣과/인간 키메라성 항체는 쥣과 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 분절 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 포함되는 다른 형태의 "키메라성 항체" 는 본래의 항체의 것에서 개질 또는 변화된 부류 (class) 또는 하위부류의 항체이다. 그러한 "키메라성" 항체를 또한, "부류-스위칭된 항체" 라고도 한다. 키메라성 항체의 제조 방법은 현재 당업계에 잘 알려진 통상의 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술을 포함한다. 예를 들어, [Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; 미국 특허 5,202,238 및 5,204,244] 를 참조한다.

용어 "인간화된 항체" 는 골격 또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 이 모 면역글로불린의 것과 비교해 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 개질된 항체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 쥣과 CDR 이 인간 항체의 골격 영역에 이식되어, "인간화된 항체" 가 제조된다. 예를 들어, [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268-270] 을 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라성 및 이관능성 항체에 대해 상기에서 주지한 항원 인지 서열을 나타내는 CDR 에 상응한다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체" 는 인간 생식선 면역글로불린 서열으로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것이다. 가변 중쇄는 바람직하게는 생식선 서열 DP-50 (GenBank LO6618) 으로부터 유래되고, 가변 경쇄는 바람직하게는 생식선 서열 L6 (GenBank X01668) 로부터 유래되거나, 또는 가변 중쇄는 바람직하게는 DP-61 (GenBank M99682) 로부터 유래되고, 가변 경쇄는 생식선 서열 L15 (GenBank K01323) 로부터 유래된다. 항체의 불변 영역은 인간 IgG1 유형의 불변 영역이다. 그러한 영역은 알로타입일 수 있고, 예를 들어, [Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic acids Res. 28 (2000) 214-218] 및 거기에서 참조된 데이타베이스에 기술되어 있다.

용어 "재조합 인간 항체" 는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는 항체를 말한다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내에서 체세포성 과변이를 받았다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그와 관련된 한편, 본래는 생체 내에서 인간 항체 생식선 저장고 내에 존재할 수 없는 서열이다.

본원에 사용된 바와 같이, "결합" 은 항체가 약 10^-13 내지 10^-8 M (K_D), 바람직하게는, 약 10^-13 내지 10^-9 M 의 친화성으로 IGF-IR 에 결합하는 것을 말한다.

본원에 사용된 용어 "핵산 분자" 는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다.

IgG1 또는 IgG3 유형을 갖는 인간 불변 도메인은 [Kabat, E.A. 등, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)], 및 [Brueggemann, M., 등, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., 등, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527] 에 상세히 기술되어 있다. 예는 SEQ　ID　NOS:5 내지 8 에 나타나 있다. 다른 유용하고 바람직한 불변 도메인은 본 발명에 대한 DSMZ 에 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 수득가능한 항체의 불변 도메인이다.

IgG1, IgG2 또는 IgG3 유형의 불변 도메인은 Asn297 에서 글리코실화되어 있다. 본 발명에 따른 "Asn 297" 은 Fc 영역 내 약 위치 297 에 위치한 아미노산 아스파라긴을 의미하고; 항체의 최소한의 서열 변이를 바탕으로, Asn297 은 또한 일부 아미노산 (보통 ±3 아미노산 이하) 상부 또는 하부에 위치할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 한 항체 (AK18) 에서, "Asn297" 은 아미노산 위치 298 에 위치한다.

본원에 사용된 "가변 영역" (경쇄의 가변 영역 (VL), 중쇄의 가변 영역 (VH)) 은 항체가 항원에 결합하는데 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 짝의 각각을 말한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 구조를 가지고, 각각의 도메인은 그의 서열이 3 개의 "초가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결된 광범위하게 보존된 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-시트 구조를 취하고 있고, CDR 은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 내 CDR 은 골격 영역에 의해 그의 3 차원 구조에서 고정되어 있고, 다른 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 특히 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 있어서 중요한 역할을 하고, 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부위" 는 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 내지 C-말단에서 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 가장 기여하면서 항체의 특징적인 영역이다. CDR 및 FR 영역은 상기 [Kabat, E.A. 등] 의 표준 정의에 따라 결정된다.

인간 IgG1 또는 IgG3 의 글리코실화는 2 개 이하의 Gal 잔기로 종결된 코어 푸코실화된 바이안테나리 (bianntennary) 착체 올리고사카라이드 글리코실화로서 Asn297 에서 일어난다. 이들 구조를 말단 Gal 잔기의 양에 따라, G0, G1 (

1,6 또는

1,3) 또는 G2 글리칸 잔기라고 한다 (Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어, [Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207] 에 의해 기술된다. 비 글리코개질된 CHO 숙주 세포 내에서 재조합적으로 발현되는 항체는 통상 Asn297 에서 85 % 이상의 양으로 푸코실화된다.

본 발명에 따른 부분적 푸코실화 IGF-1R 항체는, GnTIII 활성도를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 핵산을, Fc 영역 내에서 올리고사카라이드를 부분적으로 푸코실화하기에 충분한 양으로 발현하도록 조작된 글리코개질된 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 한 구현예에서, GnTIII 활성도를 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 대안적으로는 숙주 세포의

l,6-푸코실트란스페라아제 활성도가 US 6,946,292 에 따라 감소되거나 또는 제거되어, 글리코개질된 숙주 세포를 생성시킬 수 있다. 항체 푸코실화의 양은, 예를 들어, 발효 조건 (예를 들어, 발효 시간) 에 의하거나 또는 상이한 푸코실화 양을 갖는 둘 이상의 항체의 조합에 의해, 미리 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 IGF-1R 항체는 하기를 포함하는 방법에 의해 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다: (a) 상기 항체의 Fc 영역에 존재하는 올리고사카라이드가 부분적으로 푸코실화된 상기 항체를 제조하는 조건 하에서, GnTIII 활성도를 갖는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현하도록 조작된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 항체를 단리시키는 단계. 한 구현예에서, GnTIII 활성도를 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서, 바람직하게는 만노시다아제 II 의 국소화도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트란스페라아제 I ("GnTI") 의 국소화도메인, 만노시다아제 I 의 국소화도메인, β(l,2)-N-아세틸글루코사미닐트란스페라아제 II ("GnTII") 의 국소화도메인 및

l-6 코어 푸코실트란스페라아제의 국소화도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이종 Golgi 레지던트 폴리펩티드의 Golgi 국소화도메인 및 GnTIII 의 촉매적 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 바람직하게는, Golgi 국소화도메인이 만노시다아제 II 또는 GnTI 유래이다. 추가적 양태에서, 본 발명은 상기 방법을 이용하여 항-IGF-1R 항체의 글리코실화 프로필을 개질하는 방법에 관한 것이다.

또다른 양태에서 본 발명은, GnTIII 활성도를 가지며, 이종 Golgi 레지던트 폴리펩티드의 Golgi 국소화도메인를 포함하는 융합 폴리펩티드를 이용하여, IGF-IR 항체의 글리코실화를 개질하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 GnTIII 의 촉매적 도메인을 포함한다. 또다른 구현예에서, Golgi 국소화도메인은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다: 만노시다아제 II 의 국소화도메인, GnTI 의 국소화도메인, 만노시다아제 I 의 국소화도메인, GnTII 의 국소화도메인 및

l-6 코어 푸코실트란스페라아제의 국소화도메인. 바람직하게는, Golgi 국소화도메인이 만노시다아제 II 또는 GnTI 유래이다.

본 발명에 따르면, IGF-1R 항체의 이러한 개질된 올리고사카라이드가 하이브리드 또는 착체일 수 있다. 바람직하게는 이등분된, 비푸코실화 올리고사카라이드가 하이브리드이다. 또다른 구현예에서는, 이등분된, 비푸코실화 올리고사카라이드가 착체이다.

본원에서 사용되는 바, GnTIII 활성도를 갖는 폴리펩티드란, N-연결 올리고사카라이드의 트리만노실 코어의 β-연결된 만노사이드에 β-1-4 연결로 N-아세틸글루코스아민 (G1cNAc) 잔기가 첨가되는 것을 촉매화할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 이는, 특정 생물학적 검정에서 측정되는 바, β(l,4)-N-아세틸글루코사미닐트란스페라아제 III (또한 Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) 에 의해 β-l,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사미닐-트란스페라아제로서 알려짐 (EC 2.4.1.144)) 의 활성도와 유사한 (동일해야 할 필요는 없음) 효소적 활성도를 나타내는 융합 폴리펩티드를 포함한다 (용량 의존성을 갖거나 또는 갖지 않음). 용량 의존성이 존재하는 경우, GnTIII 의 그것과 동일할 필요는 없지만, GnTIII 와 비교하여, 주어진 활성도에서의 용량 의존성이 실질적으로 유사할 필요가 있다 (즉, 후보 폴리펩티드는 GnTIII 에 대하여 더 큰 활성도를 나타내거나 또는 약 25-배 이하의 더 적은 활성도, 바람직하게는, 약 10-배 이하의 더 적은 활성도, 가장 바람직하게는, 약 3-배 이하의 더 적은 활성도를 나타낼 것임) 본원에서 사용되는 바, Golgi 국소화도메인이란 용어는, Golgi 착체 내 위치에서 폴리펩티드의 엥커링(anchoring) 의 원인이 되는 Golgi 레지던트 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 국소화도메인은 효소의 아미노 말단 "꼬리" 를 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 FcyRIII (CDl6a) 에의 높은 결합 친화성을 보인다. FcγRIII 에의 높은 결합 친화성은, CDl6a/F158 에 있어서, CHO DG44 숙주 세포 내에서 발현된 표준으로서의 wt 항체 (95% 푸코실화) 에 대하여 결합이 10-배 이상 증강되고 (실시예 5 참조), 100 nM 의 항체 농도에서 고정 CD 16a 를 이용한 표면 플라스몬 공진 (SPR) 에 의해 측정된 wt 항체에 대하여 결합이 20-배 이상 증강됨 (실시예 5 참조) 을 나타낸다. FcγRIII 결합은, 종래 기술에 따른 방법에 의해 항체의 Fc 부분의 글리코실화 또는 Fc 부분의 아미노산 서열을 개질함으로써 증가시킬 수 있다. 바람직한 방법이 앞서 기술되었다.

본원에 사용된 용어 "IGF-IR 에의 결합" 은 시험관 내 검정, 바람직하게는 결합 검정에서 항체가 IGF-IR 에 결합하는 것을 의미하고, 여기서 항체는 표면에 결합하고, IGF-IR 의 결합은 표면 플라즈몬 공진 (SPR) 에 의해 측정된다. 결합은 10^-8 M 이하, 바람직하게는, 10^-13 내지 10^-9 M 의 결합 친화성 (K_D) 을 의미한다.

IGF-1R 또는 FcγRIII 에의 결합은 BIA코어 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에 의해 연구될 수 있다. 결합의 친화성은 용어 ka (표적 착체로의 연합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수) 및 K_D (kd/ka) 에 의해 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 IGF-1R 에의 결합에 대하여 10^-9 M 이하, 바람직하게는10^-10 M 이하의 K_D 값을 나타낸다.

IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합은 또한, 본 발명에 따른 항체에 의해 억제된다. 억제는 종양 세포 상의 IGF-IR 에 IGF-I/IGF-II 가 결합하는 것에 대한 검정에서 IC₅₀ 으로서 측정된다. 상기 검정에서, 상기 종양 세포 (예를 들어, HT29) 의 표면에 제공된 IGF-IR 에 결합된 방사성표지된 IGF-I 또는 IGF-II 또는 그의 IGF-IR 결합 절편의 양은 증가하는 농도의 항체가 없는 상태 및 있는 상태에서 측정된다. IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합에 대한 본 발명에 따른 항체의 IC₅₀ 값은 2 nM 이하이고, IGF-I/IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합에 대한 IC₅₀ 값의 비율은 약 1:3 내지 3:1 이다. IC₅₀ 값은 3 개 이상의 독립적 측정의 평균 또는 중앙값으로서 측정된다. 단일 IC₅₀ 값은 범주에서 벗어날 수 있다.

본원에 사용된 용어 "IGF-I 및 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합 억제" 는 시험관 내 검정에서 HT29 (ATCC HTB-38) 종양 세포 표면 상에 제시된 IGF-IR 에 I¹²⁵-표지된 IGF-I 또는 IGF-II 가 결합하는 것을 억제시키는 것을 말한다. 억제는 2　nM 이하의 IC₅₀ 값을 의미한다.

용어 "IGF-IR 발현 세포" 는 세포 당 약 20,000 개 이상의 수용체만큼 IGF-I 수용체를 과발현하는 세포를 말한다. 상기 세포는 예를 들어, NCI H322M 또는 HT29 와 같은 종양 세포주, 또는 IGF-IR 에 대한 발현 벡터로 트랜스펙션한 후 IGF-IR 을 과발현하는 세포주 (예를 들어, 3T3 ATCC CRL1658) 를 말한다. 세포 당 수용체의 양은 [Lammers, R., 등, EMBO J. 8 (1989) 1369-1375] 에 따라 측정된다.

용어 "IGF-IR 인산화의 억제" 는 상기 항체가 없는 검정과 비교했을 때, 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 및 10 nM 인간 IGF-1 을 함유하는 배지 내 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR, 바람직하게는 세포 당 바람직하게는 1.0 내지 1.5 Mio, 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인산화 검정을 말한다. 인산화는 타이로신-인산화된 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. FCS 의 열 비활성화는 보체 시스템의 비활성화를 위해 56 ℃ 로 단기간 가열함으로써 수행된다.

용어 "PKB 인산화의 억제" 는 상기 항체가 없는 검정과 비교했을 때, 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 및 10 nM 인간 IGF-1 을 함유하는 배지 내 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR, 바람직하게는 세포 당 바람직하게는 1.0 내지 1.5 Mio, 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인산화 검정을 말한다. 인산화는 PKB 의 세린 473 에서 인산화된 PKB 에 특이적인 항체 (Akt 1, Swiss Prot Acc. No. P31749) 를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다.

용어 "항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC)" 은 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 파쇄를 말한다. ADCC 는 바람직하게는 단핵구 또는 NK 세포와 같이 백혈구연층으로부터 정제한 효과기 세포 또는 갓 단리한 PBMC 와 같은 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체로 IGF-IR 발현 세포의 제제를 처리함으로써 측정된다.

용어 "IGF-I 매개 신호 전달의 완전한 억제" 는 IGF-IR 의 IGF-I-매개 인산화의 억제를 말한다. 상기 검정을 위해, IGF-IR 발현 세포, 바람직하게는 H322M 세포를 IGF-I 으로 자극시키고, 본 발명에 따른 항체로 처리한다 (5 nM 이상의 항체 농도가 유용함). 이어서, SDS PAGE 를 수행하고, 인산화된 타이로신에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 분석에 의해 IGF-IR 의 인산화를 측정한다. 웨스턴 블롯 상에 인산화된 IGF-IR 을 말하는 밴드가 가시적으로 검출될 수 없다면, 신호 전달의 완전한 억제가 발견된다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 항체 18 로서 IGF-IR 의 동일한 에피토프에의 결합을 보여주거나, 또는 항체 18 에 의한 결합의 입체 장애로 인해 IGF-IR 에의 결합이 억제된다. 결합 억제는 20 ~ 50　nM 의 농도에서 고정화된 항체 18 및 IGF-IR, 및 100　nM 의 농도에서 검출되는 항체를 사용한 SPR 검정에 의해 검출될 수 있다. 50% 이상의 신호 감소는, 항체가 항체 18 과 경합함을 나타낸다. 상기 검정은 고정화된 항체로서 항체 22 를 사용하여 동일한 방식으로 수행될 수 있다.

용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정소를 의미한다. 에피토프는 보통 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기로 이루어져 있고, 보통 특이적인 3 차 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징도 가진다. 구조 및 비구조성 에피토프는, 비구조성 에피토프가 아닌 구조성 에피토프에의 결합이 변성화 용매의 존재 하에서는 상실되는 점에서, 구별된다.

본 발명에 따른 항체는 타이로신의 IGF-IR 인산화 및 바람직하게는 또한 세린의 PKB 인산화를 유사한 정도로 억제시킨다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 종양, 예를 들어, 이종 이식 종양에서와 종양 세포에서 IGF-IR 단백질 수준을 하위조절한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, IGF-IR 발현 세포 (예를 들어, NIH 3T3 세포) 의 증식뿐만 아니라 콜로니 형성 검정에서 종양 세포의 3 차원 성장을 억제시킨다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 항체를 200 nmol/l 의 농도로 사용하여서는 인슐린 수용체 과발현 3T3 세포 상에서의 결합 경합 검정에서 인슐린이 인슐린 수용체에 결합하는 것을 억제시키지 않는다.

본원에 사용된 용어 숙주 세포는 본 발명의 항원-결합 분자 및 폴리펩티드를 생성하도록 조작될 수 있는 임의 종류의 세포 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 개질된 글리코폼을 갖는 항원 결합 분자의 제조를 허용할 수 있고, 이를 위해 조작된다. 숙주 세포는 GnTIII 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드의 증가된 수준의 발현을 위해 추가로 조정되었다. CHO 세포가 숙주 세포로서 바람직하다.

숙주 세포 내에서의 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 그의 절편을 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현은 상기 세포에서 수행되고, 항체를 상기 세포 (파쇄 후의 상청액 또는 세포) 로부터 회수한다.

항체의 재조합 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, [the review articles of Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., 등, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Arzneimittelforschung Drug Res. 48 (1998) 870-880] 에 기술되어 있다.

항체는 전체 세포, 상청액, 세포 파쇄물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태에서 존재할 수 있다. 정제를 수행하여, 다른 세포 성분 또는 다른 오염원, 예를 들어, 다른 세포의 핵산 또는 단백질을 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 잘 알려진 방법을 포함한 표준 기술에 의해 제거한다. [Ausubel, F., 등 (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 을 참조한다.

원생동물에 적합한 대조군 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적으로 관계하도록 위치될 때, "조작적으로 연결된다". 예를 들어, 예비서열 또는 분비 리더를 위한 DNA 는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비단백질로서 발현된다면 폴리펩티드를 위한 DNA 에 조작적으로 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 준다면 코딩 서열에 조작적으로 연결되고; 또는 리보좀 결합 부위는 그것이 번역을 유용하게 하도록 위치된다면 코딩 서열에 조작적으로 연결된다. 일반적으로, "조작적으로 연결된" 은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우, 인접하면서 해독 골격 내에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 연결은 통상의 제한 부위에서 연결에 의해 이루어진다. 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 연결기가 통상의 방식에 따라 사용된다.

모노클로날 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 과정에 의해 하이브리도마 배양 배지로부터 적합하게 분리될 수 있다. 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA 및 RNA 는 통상의 과정을 사용해 쉽게 단리되고, 서열화된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA 및 RNA 의 공급원으로서 작용할 수 있다.

본 발명은 또한, 화학치료제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 절편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성컨쥬게이트) 또는 세포독성제의 프로드러그와 같은 세포독성제에 공액된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 상기 면역컨쥬게이트의 제조에 유용한 제제는 상기 기술되었다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 절편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 절편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사신, 알류리테스포르디 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨락카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 샤란티아 억제제, 쿠르친, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다.

항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤질)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 과 같은 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 [Vitetta, E.S., 등, Science 238 (1987) 1098-1104)] 에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 방사성뉴클레오티드의 항체에의 공액을 위한 실례의 킬레이트제이다. WO　94/11026 을 참조한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형되는, 본 발명에 따른 항체를 함유하는 약학적 조성물과 같은 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한, 병용 치료, 즉 화학치료제 또는 세포독성제 또는 프로드러그와 같은 다른 제제와 병용해서 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 치료는 본 발명의 조성물을 하나 이상의 항-종양제제와 함께 또는 기타 통상의 치료와 함께 포함할 수 있다.

"화학치료제" 는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노사이드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소테레 (독세탁셀), 부술판, 겜시타빈, 시톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡잔트론, 빈크레이스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포사이드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 4,675,187 참조), 멜팔란 및 기타 관련 질소 머스타드가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제" 는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 또는 세포의 파괴를 야기하는 성분을 말한다. 상기 용어는 방사성 동위원소, 화학치료제, 및 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 절편과 같은 독소를 포함하는 것이다.

본원에 사용된 용어 "프로드러그" 는 모 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고, 더욱 활성인 모 형태로 효소적으로 활성화되거나 또는 전환될 수 있는 약학적으로 활성인 성분의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다. 예를 들어, [Wilman, D. E., Biochem. Soc. Trans. 14 (1986) 375-382; 및 Stella, VJ. and Himmelstein, K.J., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: Directed Drug Delivery, Borchardt, R.T., 등 (ed.), Humana Press, Clifton, NJ (1985), pp. 247-267] 을 참조한다. 본 발명의 프로드러그에는 더욱 활성의 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 프로드러그, 티오포스페이트-함유 프로드러그, 술페이트-함유 프로드러그, 펩티드-함유 프로드러그, D-아미노산-개질된 프로드러그, 글리코실화된 프로드러그, β-락탐 고리 프로드러그, 임의 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드러그 또는 임의 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드러그, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 프로드러그가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 프로드러그 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 기술된 화학치료제가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 는 생리학적으로 융화가능한 임의의 그리고 모든 용매, 현탁 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입) 에 적합하다.

"약학적으로 허용가능한 염" 은 항체의 목적하는 생물학적 활성을 유지하고 임의의 목적하지 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 말한다 (예를 들어, [Berge, S.M., 등, J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19] 참조). 그러한 염은 본 발명에 포함된다. 그러한 염의 예에는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염은 염산염과 같이 비독성 무기산으로부터 유도된 염을 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에게 알려질 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 다양할 것이다.

특정 투여 경로에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는, 그의 비활성화를 예방하는 물질로 화합물을 코팅하거나 또는 그러한 물질과 함께 화합물을 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 적절한 담체, 예를 들어 리포좀, 또는 희석제 내에서 개체에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제에는 식염수 및 수성 완충제가 포함된다.

약학적으로 허용가능한 담체에는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 성분을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다.

본원에 사용된 구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된" 은 보통 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관 (transtracheal), 피하, 큐티클하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

이러한 조성물은 또한, 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 멸균 과정 등에 의해, 및 다양한 항박테리아 및 항균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 함입의 둘 다에 의해 수행될 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장성제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 수행될 수 있다.

선별된 투여 경로와 상관 없이, 적합한 수화물 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여량 형태로 제형된다.

본 발명의 약학적 조성물 내 활성 성분의 실제적인 투여 수준은 다양할 수 있어서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대한 목적하는 치료적 반응을 달성하기에 효과적이면서 환자에 독성이지 않은 활성 성분의 양을 수득할 수 있다. 선별된 투여량 수준은 적용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 적용되는 특정 화합물의 분비 속도, 치료 기간, 적용되는 특정 조성물과 병용해서 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강상태 및 이전의 의학적 개인력 등 의료 분야에 잘 알려진 인자를 포함하여 다양한 약물학적 인자에 따라 다를 것이다. 바람직한 투여량은 CHO DG44 와 같이 글리코개질되지 않은 CHO 숙주 세포에서 생성되는 항체의 투여량보다 상당이 더 낮다.

조성물은, 조성물이 주사기에 의해 운반가능할 정도로 유동성이 있고 멸균되어야 한다. 물 외에도, 담체는 바람직하게는 등장성의 완충된 식염수이다.

적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예를 들어, 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리알코올, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 부분적으로 푸코실화된 항체는 NSCLC 의 치료를 위해서는 에를로티니브 (Tarceva

) 와 병용해서, 유방암의 치료를 위해서는 Herceptin

(트라스투주마브) 과 병용해서, 그리고 췌장 종양의 치료를 위해서는 겜시타빈 (Gemzar

) 과 병용해서 유용하다.

하기 실시예, 도면 및 서열 목록은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되고, 본 발명의 진정한 범주는 첨부된 청구항에 나타나 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 나타내는 과정에 변형이 이루어질 수 있음을 이해한다.

도 1 은 샘플 1 및 2 의 방출된 올리고사카라이드의 MALDI-MS-분석을 나타낸다.

도 2 는 실시예 3 에 따라 측정된 종양 부피를 나타낸다 (곡선 1: 대조군, 곡선 2 및 3: 표 5 의 샘플 1 번 및 2 번).

플라스미드

발현 시스템은 CMV 프로모터 시스템 (EP 0323997) 를 포함하였고, 표 1 및 2 에 기술되어 있다. 항체로서, IGF-1R 에 대한 IgG1 항체를 사용하였다 (WO 2005/005635; AK18 또는 AK22).

pETR 2880 (항체 발현 벡터)
성분	길이	설명
IR18HC	1404	AK18 또는 AK22 의 암호화 중쇄
IR18HC	714	AK18 또는 AK22 의 암호화 경쇄
GS	1122	암호화 글루타민-합성효소
SV40E	343	프로모터
hCMV프로모터	1142	프로모터
인트론	947	인트론

pETR 2273 (글리코실화 벡터)
성분	길이	설명
키메라성 MPSV 프로모터 (hCMV 프로모터의 인핸서를 포함함)	875	프로모터
합성 인트론	1324	인트론
GnTIII	1644	N-아세틸글루코사미닐트란스페라아제 III 의 암호화
ManII	3435	만노시다아제 II 의 암호화
pac	600	스트렙토미세스균으로부터의 푸로마이신 아세틸트란스페라아제의 암호화
polyA	49	폴리아데닐화 신호

두 플라스미드 모두를 글루타민 원시영양체 CHO 또는 HEK293 숙주 세포에 코트랜스펙션 (cotransfection) 했다 (EP 0 256 055). 세포주를 혈청 비함유 배지에서 14 일까지 유가식 배양 (fed batch cultivation) 으로서 배양하여, 상이한 양의 푸코실화를 갖는 항체 배치를 생성했다 (샘플 1 ~ 2, CHO). 항체를 상청액으로부터 단리시키고, 크로마토그래피법에 의해 정제했다.

WT 항체 (95% 의 푸코실화를 나타내는 AK18) 를 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주, CHO-DG44 에서 재조합적으로 생성했다 (Flintoff, W.F., 등, Somat. Cell Genet. 2 (1976) 245-261; Flintoff, W.F., 등, Mol. Cell. Biol. 2 (1982) 275-285; Urlaub, G., 등, Cell 33 (1983) 405-412; Urlaub, G., 등, Somat. Cell Mol. Genet. 12 (1986) 555-566). CHO-DG44 세포를 MEM 알파 마이너스 배지 (Gibco No. 22561), 10% 투석된 FCS (Gibco No. 26400-044) 및 2 mmol/L L-글루타민, 100 μM 하이포잔틴, 16 μM 티미딘 (HT 보충제) 내에서 키웠다.

실시예 1

IGF-IR 에의 항-IGF-IR 항체의 친화성의 측정

장비: BIACORE

3000

칩: CM5

커플링: 아민 커플링

완충제: HBS (HEPES, NaCl), pH 7.4, 25 ℃

친화성 측정을 위해, 항 인간 FCγ 항체 (염소에서) 를 IGF-IR 에 대한 글리콜 조작된 항체의 존재에 대해 칩 표면에 커플링시켰다. IGF-IR 세포외 도메인을 용액 내에 다양한 농도로 첨가하였다. 2 분의 IGF-IR-주사에 의해 연합을 측정하고; 3 분 동안 완충제으로 칩 표면을 세정함으로써 해리를 측정하였다. 항체 18 및 22 에 대한 친화성 데이타를 표 3 에 나타냈다.

SPR (BIACORE 3000) 에 의해 측정된 친화성 데이타
항체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
1번	1.98 x 10⁵	2.02 x 10^-4	1.02 x 10^-9
2번	1.86 x 10⁵	2.68 x 10^-4	1.44 x 10^-9

실시예 2

항-IGF-IR HuMAb 에 의한 항체 매개 효과기 기능의 측정

면역 효과기 기작을 유도하는 생성된 HuMAb 항체의 능력을 측정하기 위해, 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 연구를 수행하였다.

ADCC 에서 항체의 효과를 연구하기 위해, H322M, DU145 또는 기타 적절한 IGF-IR 발현 세포 (1 x 10⁶ cell/ml) 를 세포 인큐베이터에서 37 ℃ 에서 25 분 동안 BATDA 용액 (Perkin Elmer) 의 ml 당 1 μl 로 표지하였다. 이후, 세포를 10 ml 의 RPMI-FM/PenStrep 으로 4 회 세정하고, 200 x g 에서 10 분 동안 회전시켜 가라앉혔다. 마지막 원심분리 단계 이전, 세포수를 측정하고, 이후 펠릿으로부터의 RPMI-FM/PenStrep 배지에서 1 x 1O⁵ cell/ml 로 희석시켰다. 세포를 둥근 바닥 플레이트에서 웰 당 5,000 개로 50 μl 의 부피로 플레이팅하였다. HuMAb 항체를 50 μl 부피의 세포 배양 배지에서 25 ~ 0.1 μg/ml 범위의 최종 농도로 50 μl 세포 현탁액으로 첨가하였다. 이어서, 50 μl 의 효과기 세포, 갓 단리한 PBMC 에서 가져온 정제된 효과기 세포를 25:1 범위의 E:T 비율로 첨가하였다. 플레이트를 200 x g 에서 1 분 동안 바로 원심분리한 후, 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 200 x g 에서 10 분 동안 회전시켜 가라앉히고, 20 μl 의 상청액을 수확하여 Optiplate 96-F 플레이트에 옮겼다. 200 μl 의 유로퓸 용액 (Europium solution) (Perkin Elmer, 실온에서) 을 첨가하고, 플레이트를 쉐이커 테이블 상에서 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 형광성을 Perkin Elmer 사의 EU-TDA 프로토콜을 사용해 시분할 형광분석기 (Victor 3, Perkin Elmer) 에서 정량화하였다.

ADCC 에 의한 세포 파쇄의 규모를 각각의 표적 세포로부터의 TDA 의 지속적인 방출에 대해 보정한, 세제에 의해 파쇄된 표적 세포에서의 TDA 형광 증강자의 최대 방출의 % 로서 표시하였다. 결과를 표 4 에 나타냈다.

샘플	특정 종양 세포 파쇄
1번	66%
2번	84%

실시예 3

항체의 글리코구조의 분석

올리고사카라이드 구조를 포함하는 푸코스- 및 비-푸코스 (a-푸코스) 의 상대적 비율을 측정하기 위해, 정제된 항체 물질의 방출된 글리칸을 MALDI-Tof-질량 분석법에 의해 분석했다. 이를 위하여, 단백질 주쇄로부터 올리고사카라이드를 방출시키기 위하여, 0.1M 나트륨 포스페이트 완충제, pH 6.0 중 5mU N-글리코시다아제 F (Prozyme# GKE-5010B) 와 37 ℃ 에서 하룻밤 동안 항체 샘플 (약 50μg) 을 인큐베이션시켰다. 이어서, 방출된 글리칸 구조를 NuTip-Carbon 피펫팁 (Glygen 사로부터 입수: NuTip1-10 μl, Cat.Nr#NT1CAR) 을 이용하여 단리 및 탈염시켰다. 제 1 단계로서, 올리고사카라이드의 결합을 위해, NuTip-Carbon 피펫팁을 3 μL 1M NaOH 및 이후 20 μL 순수(純水) (예를 들어, HPLC-구배 등급, Baker 사제, #4218), 3 μL 30 v/v% 아세트산 및 다시 20 μl 순수로 순차적으로 세정하여 준비했다. 이를 위하여, 각 용액을 NuTip-Carbon 피펫팁 내 크로마토그래피 물질의 상부에 로딩하고, 이를 통해 압착했다. 이후, 상기 N-글리코시다아제 F 소화물을 4 내지 5 회 위 아래로 올렸다 내렸다 함으로써, 10 μg 항체에 해당하는 글리칸 구조를 NuTip-Carbon 피펫팁 내 물질에 결합시켰다. NuTip-Carbon 피펫팁 내 물질에 결합된 글리칸을 앞서 기술된 바와 같은 방식으로 20 μL 순수로 세정하고, 0.5 μL 10% 아세토니트릴 및 2.0 μL 20% 아세토니트릴의 각각으로 단계별로 용리시켰다. 이 단계를 위하여, 용리 용액을 0.5 mL 반응 바이얼 내에 충전하고, 각각을 4 내지 5 회 위 아래로 움직였다. MALDI-Tof 질량 분석법에 의한 분석을 위해, 두 용출액을 배합했다. 이 측정을 위하여, 배합 용출액 0.4 μL 를 MALDI 타겟 상에서 1.6 μL SDHB 매트릭스 용액 (5 mg/ml 으로 20% 에탄올/5mM NaCl 중에 용해된 2.5-디히드록시벤조산/2-히드록시-5-메톡시벤조산 [Bruker Daltonics #209813]) 과 혼합시키고, 적절히 조율된 Bruker Ultraflex TOF/TOF 기기로 분석했다. 통례적으로, 50 ~ 300 샷을 기록하고, 단일 실험으로 정리했다. 얻어진 스펙트럼을 플랙스 분석 소프트웨어 (flex analysis software: Bruker Daltonics 사) 에 의해 평가했고, 검출된 피크의 각각에 대하여 질량을 결정했다. 이후, 상기 피크를 각각의 구조 (예를 들어, 푸코스가 있는 경우와 없는 경우 각각의 착체, 하이브리드 및 올리고- 또는 고-만노스) 에 대해 이론적으로 예상되는 질량을 계산된 질량과 비교함으로써 글리코 구조를 포함하는 푸코스 또는 a-푸코스 (비-푸코스) 로 어사인했다.

하이브리드 구조의 비율을 측정하기 위해, 항체 샘플을 N-글리코시다아제 F 및 엔도-글리코시다아제 H 와 동시에 소화시켰다. N-글리코시다아제 F 는 단백질 주쇄로부터 모든 N-연결 글리칸 구조 (착체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조) 를 방출시켰고, 엔도-글리코시다아제 H 는 글리칸의 환원성 말단에서 두 GlcNAc-잔기 사이에서 추가적으로 모든 하이브리드 유형 글리칸을 절단시켰다. 이후, 이 소화물을 N-글리코시다아제 F 소화된 샘플에 대해 앞서 기술한 바와 동일한 방식으로 처리하고, MALDI-Tof 질량 분석법에 의해 분석했다. N-글리코시다아제 F 소화물 및 조합된 N-글리코시다아제 F / 엔도 H 소화물로부터의 패턴을 비교함으로써, 특정 글리코 구조의 신호의 감소 정도를 이용하여 하이브리드 구조의 상대적 함량을 추정했다.

각 글리코 구조의 상대적 양은 개별 글리콜 구조의 피크 높이 및 검출된 모든 글리코 구조의 피크 높이의 합의 비율로부터 계산되었다. a-푸코스의 상대적 양은 N-글리코시다아제 F 처리된 샘플로 동정된 모든 글리코 구조 (예를 들어, 각각 착체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조) 에 대한 푸코스-결핍 구조의 백분율이다 (표 5 참조).

샘플	a-푸코실화 (%)
1 번	64 %
2 번	61 %
3 번 (HEK293)	79 %

실시예 4

FcgR III (CD16a) 에 대한 항-IGF-IR 항체의 친화성의 측정

His-CD16a 를 CM5-칩 (~660 RU) 의 표면에 아민-커플링시켰다.

장비: Biacore3000

러닝 및 희석 완충제: HBS-P

측정: 25 ℃ 에서 1 데이터 포인트/초; 항체를 100 nM 로 5 분간 주입; 50 μl/분의 유속으로 5 분 간 해리; 12 ℃ 에서 샘플 예비-냉각; 1 분 동안 7.5 mM NaOH/1 M NaCl 을 이용하여 표면 재생. 결과: wt 에 대한 RU: 11; 45% 푸코실화에 대한 RU: 65; 60% 푸코실화에 대한 RU: 72

실시예 5

독성 연구

사이노몰거스 원숭이 (Cynomolgus monkey) 에게 2 주간의 독성 검사를 수행했다. 부분적 푸코실화 항체를 1, 4, 7, 11 일째에 10 mg/kg/일 의 투여량으로 투여했다. wt 항체와 비교시, 전신 상태 및 행동, 체중, 음식물 소비, 혈액학, ECG, 임상 화학 (excl. ALAT), 육안 검사 또는 장기 중량에서 약물 관련 변화가 관찰되지 않았다.

<110> F. Hoffmann-La Roche <120> Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof <130> 24061 <150> EP 06026651 <151> 2006-12-22 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <400> 5 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 990 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 6 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 7 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tca cag gag agc gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 321 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims

IGF-IR 에 결합하며 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화된 항체로서, 상기 당 사슬 내 푸코스의 양이 20% 내지 50% 인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 당 사슬 내 푸코스의 양이 20% 내지 40% 인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, NGNA 의 양이 1% 이하이고, 및/또는 N-말단 알파-1,3-갈락토오스의 양이 1% 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, NGNA 의 양이 0.5% 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 알파 1,3-갈락토오스의 양이 0.5% 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 보여주는 것을 특징으로 하는 항체:

a) IGF-I 의 IGF-IR 에의 결합 억제의 IC₅₀ 값 대 IGF-II 의 IGF-IR 에의 결합 억제의 IC₅₀ 값의 비율이 1:3 내지 3:1 임을 나타냄;

b) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 및 10 nM 인간 IGF-1 를 함유하는 배지 내의 HT29 세포를 사용한 세포의 인산화 검정에서, 상기 항체가 없는 그러한 검정과 비교했을 때, 5 nM 의 농도에서 IGF-IR 인산화를 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 억제시킴;

c) 0.5% 열 비활성화된 태아 소 혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 내의 세포 당 400,000 내지 600,000 개의 분자 IGF-IR 을 제공하는 3T3 세포를 사용한 세포의 인산화 검정에서, 상기 항체가 없는 그러한 검정과 비교했을 때, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로서 측정되는 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않음 (신호화 없음, IGF-1 모방 활성 없음).
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10^-13 내지 10^-9　M (K_D) 의 친화성을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상보성 결정 영역 (CDR) 으로서 하기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:

a) CDR 로서 SEQ　ID　NO:1 또는 3 의 CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

b) CDR 로서 SEQ　ID　NO:2 또는 4 의 CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.
약학적 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 함유하는 약학 조성물.
암 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
제 12 항에 있어서, 항체가 세포독성제, 그의 프로드러그 또는 세포독성 방사선치료와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
항종양 치료가 필요한 환차의 치료 방법으로서, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 상기 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 항체가 세포독성제, 그의 프로드러그 또는 세포독성 방 사선치료와 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
GnTIII 및 항-IGF-1R 항체를 재조합적으로 발현할 수 있는 CHO 세포.
IGF-IR 에 결합하며 Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화된 항체로서, FcγRIII 에의 높은 결합 친화성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료, 바람직하게는 유방암, 췌장암 및/또는 NSCLC 의 치료를 위한 항체.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암, 췌장암 및/또는 NSCLC 의 치료를 위한 항체.