BR112016013109B1

BR112016013109B1 - anticorpo anti-siglec-8, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, composição farmancêutica, seu método de produção e seus usos

Info

Publication number: BR112016013109B1
Application number: BR112016013109-6A
Authority: BR
Inventors: Christopher R. Bebbington; Rustom Falahati; Carolina Rita Sousa Fernandes; David John Matthews; Nenad Tomasevic; Jason Williams; John Leung
Original assignee: Allakos Inc.
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2021-05-11
Also published as: NZ720769A; EP3079719B8; PL3079719T3; CN105916519B; JP2020078336A; KR20210125114A; KR20160095113A; CA2930886A1; RS59567B1; IL245663B; US9546215B2; SG11201604632PA; JP2022082715A; JP6963577B2; US20150203578A1; CY1122329T1; WO2015089117A1; AU2014363944A1; SG10201808835QA; EP3079719A4

Abstract

ANTICORPOS DE ANTI-SIGLEC-8 E MÉTODOS DE SEU USO A presente invenção refere-se a anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano e seu uso no tratamento e na prevenção de desordens mediadas por eosinófilo e/ou desordens mediadas por mastócito, bem como composições e "kits" compreendendo os anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório U.S. No. 61/913.891, depositado em 9 de dezembro de 2013, que é incorporado por referência em sua totalidade.

SUBMISSÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS NO ARQUIVO DE TEXTO ASCII TEXT FILE

[002] O conteúdo da seguinte submissão no arquivo do texto ASCII é incorporado por referência em sua totalidade: uma forma de leitura de computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome do arquivo: 701712000140SeqList.txt, dados registrados: 9 de dezembro de 2014, tamanho: 115 KB).

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano e métodos de tratamento ou prevenção de uma doença mediada por células que expressam Siglec-8.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Siglecs (lecitinas de tipo imunoglobolina de ligação de ácido siálico) são proteínas de superfície de célula de transmembrana de passagem simples encontradas predominantemente em leucócitos e que são caracterizadas por sua especificidade para seus ácidos siáli- cos ligados glicoconjugados de superfície de célula. A família de Si- glecs contém pelo menos 15 membros que são encontrados em mamíferos (Pillai e outros, Annu Rev Immunol., 2012, 30:357-392). Esses membros incluem sialoadesão (Siglec-1), CD22 (Siglec-2), CD33 (Si- glec-3), glicoproteína associada a mielina (Siglec-4), Siglec-5, OBBP1 (Siglec-6), AIRM1 (Siglec-7), SAF-2 (Siglec-8), e CD329 (Siglec-9).Segue-se folha 1a/186 Siglec-8, um membro que é expresso em seres humanos mas não em ra identificar novas proteínas de eosinófilo de ser humano. Além da expressão por eosinófilos, ela é também expressa por mastócitos e basófilos. Siglec-8 reconhece um glicano sulfatado, isto é, 6’-sulfo-sialil Lewis X ou 6’-sulfo-sialil-N-acetil-S-lactosamina, e contém um domínio de pedaço inibitório de base de tirosina de imunorrecepetor intracelular (ITIM) que mostra inibir a função de mastócito.

[005] Juntamente com mastócitos, eosinófilos podem promover uma resposta inflamatória que desempenha um papel funcional benéfico tal como controle de uma infecção em um sítio de tecido específico. Durante uma resposta inflamatória, apoptose de eosinófilos pode ser inibida através da atividade de citocinas de promoção de sobrevivência tais como IL-3 e GM-CSF. No entanto, um aumento de eosinófi- los ativados que não são rapidamente removidos apoptose pode resultar na liberação de proteínas de grânulo de eosinófilo nos sítios já inflamados que podem danificar tecido e leva inflamação a ser ulterior- mente exacerbada. Várias doenças foram mostradas como estando ligadas a atividade de eosinófilo tais como síndrome de Churg Strauss, artrite reumatóide, e asma alérgica (Wechsler e outros, J Allergy Clin Immunol., 2012, 130(3):563-71). Há uma necessidade de terapias que possam controlar a atividade de células imunes envolvidas na inflamação, tal como atividade de eosinófilos e mastócitos.

[006] Estudos anteriores demonstraram que eosinófilos sofrem apoptose quando Siglec-8 é reticulado com anticorpos de camundongo específicos reticulados com anticorpos de camundongo específicos incitados contra a porção intracelular de Siglec-8 (Nutku e outros, Blood, 2003, 336:918-24). Esses anticorpos são descritos na pat. U.S. no. 8.207.305, U.S. Pat. No. 8.197.811, U.S. Pat. No. 7.871.612 e U.S. Pat. No. 7.557.191. No entanto, permanece uma necessidade de desenvolver anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano que reconhecem Siglec-8 de ser humano com alta afinidade e especificidade. Descrição de tais anticorpos de anti-Siglec-8 podem permitir o desenvolvimento do tratamento para doenças mediadas pela atividade de eosinófilos e/ou mastócitos.

[007] Todas as referências relatadas aqui, incluindo pedidos de patentes, publicações de patentes, e literatura científica, são aqui incorporados por referência em sua totalidade, como se cada referência individual fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Provido aqui são anticorpos de anti-Siglec-8 (incluindo anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano), suas composições compreendendo, e métodos de uso dos mesmos.

[009] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo humanizado que especificamente se liga a um Siglec-8 de ser humano, em que a afinidade de ligação e/ou avidez de ligação do anticorpo humanizado a um Siglec-8 de ser humano são mais altas do que a afinidade de ligação e/ou avidez de ligação do anticorpo 2E2 e/ou anticorpo 2C4 ao Si- glec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, o Siglec-8 de ser humano é um dímero. Em algumas concretizações, o Siglec-8 de ser humano compreende um Siglec-8 de ser humano de domínio extracelu- lar fundido a uma região de Fc de uma imunoglobulina. Em algumas concretizações, a região de Fc é uma região de Fc de IgG1 de ser humano. Em algumas concretizações, a região de Fc é uma região de Fc de IgG4 de ser humano. Em algumas concretizações, o Siglec-8 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74.

[0010] Em algumas concretizações, o anticorpo humanizado compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 ou 21. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região de Fc de cadeia pesada compreendendo uma região de Fc de IgG de ser humano. Em outras concretizações, a região de Fc de IgG de ser humano compreende uma IgG1 ou IgG4 de ser humano. Em algumas concretizações, a IgG1 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 76 ou 77. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice de EU como em Kabat. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76. Em algumas concretizações, o anticorpo foi engenheirado para aperfeiçoar atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, o anticorpo compreende duas cadeias pesadas e em que pelo menos uma das duas ou ambas as cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[0011] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo humanizado que especificamente se liga a um Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo tem uma Tm de pelo menos cerca de 70°C a pelo menos cerca de 72°C em um ensaio de deslocamento térm ico. Em algumasconcretizações, o anticorpo tem a Tm a cerca de 70°C, a cerca de 71°C, ou a cerca de 72°C em um ensaio de deslocamen to térmico. Em algumas concretizações, o anticorpo tem a Tm igual ou mais alta em comparação com um anticorpo de 2C4 quimérico. Em algumas concretizações, o anticorpo tem a Tm igual ou mais alta em comparação com um anticorpo tendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.

[0012] Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 ou 21. Em qualquer uma das concre- tizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região de Fc de cadeia pesada compreendendo uma região de Fc de IgG de ser humano. Em outras concretizações, a região de Fc de IgG de ser humano compreende uma IgG1 ou IgG4 de ser humano. Em algumas concretizações, a IgG1 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 76 ou 77. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice de EU como em Kabat. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 76. Em algumas concretizações, o anticorpo foi engenheirado para aperfeiçoar atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fu- cosilada.

[0013] Em ainda um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo humanizado que especificamente se liga a um Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 63 e 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 ou 71. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 11-14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 23-24. Em algumas concretizações, a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 63; e/ou a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 16 ou 21. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região de Fc de cadeia pesada compreendendo uma região de Fc de IgG de ser humano. Em outras concretizações, a região de Fc de IgG de ser humano compreende uma IgG1 ou IgG4 de ser humano. Em algumas concretizações, a IgG1 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. Em algumas concretiza-ções, a IgG4 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser huma- no compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice de EU como em Kabat. Em algumas concretizações, o anticorpo foi enge- nheirado para aperfeiçoar atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fu- cosilada.

[0014] Em ainda um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo humanizado que especificamente se liga a Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2-14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16-24. Em algumas concretizações, o anticorpo foi engenheirado para aperfeiçoar atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[0015] Em ainda um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo humanizado que especificamente se liga a Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2-10; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16-22. Em algumas concretizações, o anticorpo foi engenheirado para aperfeiçoar atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[0016] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo humanizado que especificamente se liga a um Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que (a) a região variável de cadeia pesada compreende: (1) uma HC-FR1 compreendendo a se-quência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 26-29; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos se-lecionada de SEQ ID NOs: 31-36; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 com-preendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 38-43; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 45-46, e/ou (b) a região va-riável de cadeia leve compreende: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 48-49; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 51-53; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 55-58; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Em algumas concretizações, o anticorpo foi engenheirado para aperfeiçoar atividade de cito- toxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[0017] Em ainda um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo isolado que se liga a Siglec-8 de ser humano e mata mastócitos que expressam Siglec-8 por atividade de ADCC. Em algumas concretizações, o anticorpo mata mastócitos que expressam Siglec-8 in vitro (por exemplo, medido em um ensaio de cultura de células como descrito no exemplo 2). Em algumas concretizações, o anticorpo esgota mastóci- tos que expressam Siglec-8 em um indivíduo quando uma quantidade terapeuticamente eficaz é administrada. Em uma outra concretização, o anticorpo esgota pelo menos cerca de 20% (por exemplo, pelo menos dos mastócitos que expressam Siglec-8 em uma amostra obtida a partir do indivíduo em comparação com um nível de linha de base antes do tratamento. Em qualquer uma das concretizações aqui, a amostra pode ser uma amostra de tecido ou uma amostra de fluido biológica. Em algumas concretizações, a amostra de tecido é um ou mais selecionados do grupo que consiste de: pele, pulmão, medula óssea, e pólipos nasais. Em algumas concretizações, a amostra de fluido biológicaé um ou mais selecionados do grupo que consiste de: sangue, lavagem broncoalveolar, e lavagem nasal. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode ser engenheirado para aperfeiçoar atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada. Em outras concretizações, o anticorpo pode ser produzido em uma linha de células tendo uma inativação de alfa1,6-fucosiltransferase (Fut8). Em algumas outras concretizações, o anticorpo pode ser produzido em uma linha de células que ultra-expressa β1,4-N-acetilglicosminiltransferase III (GnT-III). Em outras concretizações, a linha de células adicionalmente ultra-expressa Golgi μ-manosidase II (ManlI). Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender pelo menos uma substituição de aminoácido na região de Fc que aperfeiçoa atividade de ADCC. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo de ser humano. Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo de IgG1 de ser humano. Em algumas concretizações, o anticorpoé um anticorpo de camundongo. Em qualquer uma das concreti- zações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 110. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compre- endendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compre-endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em qualquer uma das concretizações aqui, o indivíduo pode ser um ser humano.

[0018] Em ainda um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo que se liga a um Siglec-8 de ser humano e um Siglec-8 de primata de não humano Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em uma outra concre-tização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode se ligar a um epítopo no domínio 1 de Siglec-8 de ser humano (por exemplo, Domínio 1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112). Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode se ligar a um epítopo no domínio 3 de Siglec-8 de ser humano (por exemplo, Domínio 3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114). Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode se ligar a um epí- topo no domínio 2 de Siglec-8 de ser humano (por exemplo, Domínio 2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113). Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo de ser humano. Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo de camundongo. Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo de IgG1 ou de IgG4 (por exemplo, human IgG1 ou IgG4).

[0019] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo de Sin- glec 8 de anti-humano que se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 116 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 115. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 115. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 116. Em algumas concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109. Em algumas concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110. Em algumas concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111.

[0020] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo humanizado que se liga a um Siglec-8 de ser humano, em que a EC50 na de- pleção de eosinófilos de ser humano ativados e menos do que a EC50 do anticorpo 2E2 ou 2C4 para o Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, a EC50 do anticorpo humanizado é cerca de 85% ou menos do que a EC50 do anticorpo 2E2 ou 2C4 para o Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, a EC50 do anticorpo humanizadoé cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10% ou cerca de 5% ou menos do que a EC50 do anticorpo 2E2 ou 2C4 para o Siglec-8 de ser humano. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo humanizado pode compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo humanizado pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 ou 21. Em algumas concretizações, o anticorpo humanizado compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de ami- noácidos selecionada de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo humanizado pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2-14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16-24. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreenden- do a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) HVR-H2 com-preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região de Fc de cadeia pesada compreendendo uma região de Fc de IgG de ser humano. Em outras concretizações, a região de Fc de IgG de ser humano compreende uma IgG1 ou IgG4 de ser humano. Em algumas concretizações, a IgG1 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 76 ou 77. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice de EU como em Kabat. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76.

[0021] Em um outro aspecto, provido aqui é um ácido nucléico que codifica qualquer anticorpo descrito acima e aqui. Em ainda um outro aspecto, provido aqui é um vetor compreendendo um ácido nucléico descrito aqui. Em uma concretização, the vetor é um vetor de expressão. Em ainda um outro aspecto, provido aqui é uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico descrito aqui. Em algumas concre-tizações, a célula hospedeira expressa e produz o anticorpo.

[0022] Em um outro aspecto, provido aqui é um método de produção de um anticorpo compreendendo cultivo de uma célula hospedeira compreendendo um ou mais ácidos nucléicos que codificam um anticorpo descrito aqui sob uma condição de que produz o anticorpo. Em algumas concretizações, o método ulteriormente compreende recuperação do anticorpo produzido pela célula hospedeira. Também provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 produzido pelo método. Também provido aqui é um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui.

[0023] Em um outro aspecto, provido aqui é uma composição far-macêuticacompreendendo um anticorpo descrito acima e aqui ou um seu fragmento de ligação de antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0024] Em um outro aspecto, provido aqui é uma composição compreendendo um anticorpo ou seu fragmento que especificamente se liga a Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo compreende uma região de Fc e cadeias de carboidrato ligadas a N-glicosídio ligadasà região de Fc, em que menos do que 50% das cadeias de carboidrato ligadas a N-glicosídio na composição contêm um resíduo de fucose. Em algumas concretizações, substancialmente nenhuma das cadeias de carboidrato ligadas a N-glicosídio contêm um resíduo de fucose. Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo de ser humano. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR- L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2-10; e/ou uma região variável de ca- deia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16-22. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR- H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 11-14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 23-24. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de ami- noácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2-14; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16-24. Em qualquer uma das concretizações aqui, a composição pode ulteriormente compreender um veículo far- maceuticamente aceitável. Em qualquer uma das concretizações aqui, a afinidade de ligação e/ou avidez de ligação do anticorpo a um Siglec- 8 de ser humano podem ser mais altas do que a afinidade de ligação e/ou avidez de ligação do anticorpo 2E2 ou 2C4 ao Siglec-8 de ser humano. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode ter a Tm de pelo menos cerca de 70°C para pelo meno s cerca de 72°C em um ensaio de deslocamento térmico. Em algumas concretizações, o anticorpo tem uma Tm de cerca de 70°C, cerca de 7 1°C, ou cerca de 72°C. Em algumas concretizações, o anticorpo tem a Tm igual ou mais alta em comparação com um anticorpo de 2C4 quimérico. Em algumas concretizações, o anticorpo tem a Tm igual ou mais alta em comparação com um anticorpo tendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.

[0025] Em um outro aspecto, provido aqui é um método de tratamento ou prevenção de uma doença mediada por células que expressam Siglec-8 em um indivíduo, o método compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo descrito aqui ou um seu fragmento de ligação de antígeno ou uma composição descrito aqui. Em algumas concretizações, a doença é uma doença mediada por eosinófilo. Em algumas concretizações, a doença é uma doença mediada por mastócito. Em algumas concretizações, a doença é selecionada do grupo que consiste de asma, rinite alérgica, polipose nasal, dermatite atópica, urticária crônica, mastocitose, leucemia eosi- nofílica, e síndrome hipereosinofílica. Em algumas concretizações, a doença é selecionada do grupo que consiste de asma pauci granulocí- tica, hipersensibilidade da via aérea aguda ou crônica, esofagite eosi- nofílica, síndrome de Churg-Strauss, inflamação associada a uma cito- cina, inflamação associada a células que expressam Siglec-8, malignidade associada a células que expressam Siglec-8, urticária física, urti- cária fria, urticária por pressão, penfigóide bolhoso, alergia a alimento, e aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA). Em algumas concretizações, o anticorpo inibe um ou mais sintomas de uma reação alérgica. Em algumas concretizações, a reação alérgica é uma reação de hipersensibilidade de tipo I. Em qualquer uma das concretizações aqui, o indivíduo pode estar sofrendo de asma que não é adequadamente controlada por um corticosteróide inalado, um agonista β2 de ação curta, um agonista β2 de ação prolongada, ou uma sua combinação.

[0026] Em um outro aspecto, provido aqui é um método de deple- ção de mastócitos que expressam Siglec-8 em um indivíduo com-preendendoadministração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga a Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo mata mastócitos que expressam Siglec-8 por atividade de ADCC. Em algumas concretizações, o anticorpo mata mastócitos que expressam Siglec-8 in vitro (por exemplo, medido em um ensaio de cultura de células como descrito no exemplo 2). Em algumas concretizações, o anticorpo esgota pelo menos cerca de 20% dos mastócitos que expressam Siglec-8 em uma amostra obtida a partir do indivíduo em comparação com um nível de linha de base antes do tratamento. Em qualquer uma das concretizações aqui, a amostra pode ser uma amostra de tecido ou uma amostra de fluido biológico. Em algumas concretizações, a amostra de tecido é um ou mais selecionados do grupo que consiste de: pele, pulmão, medula óssea, e pólipos nasais. Em algumasconcretizações, a amostra de fluido biológica é um ou mais selecionados do grupo que consiste de: sangue, lavagem broncoalveolar, e lavagem nasal. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode ser engenheirado para aperfeiçoar atividade de citotoxici- dade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender du-as cadeias pesadas e em que pelo menos uma das duas ou ambas as cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada. Em outras concretiza-ções, o anticorpo pode ser produzido em uma linha de células tendo uma inativação de alfa1,6-fucosiltransferase (Fut8). Em algumas ou-trasconcretizações, o anticorpo pode ser produzido em uma linha de células que ultra-expressa β1,4-N-acetilglicosminiltransferase III (GnT- III). Em outras concretizações, a linha de células adicionalmente ultra- expressa Golgi μ-manosidase II (ManlI). Em qualquer uma das concre-tizaçõesaqui, o anticorpo pode compreender pelo menos uma substi- tuição de aminoácido na região de Fc que aperfeiçoa atividade de ADCC. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo de ser humano. Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo de IgG1 de ser humano. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 106; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 109. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada com- preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 107; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 110. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em uma outra concretização, o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 108; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 111. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região variável de cadeia pesada e uma região va- riável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada com-preende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 com-preendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em qualquer uma das concretizações aqui, o indivíduo tem uma doença mediada por células que expressam Siglec-8. Em algumas concretizações, a doença é selecionada do grupo que consiste de asma, rinite alérgica, polipose nasal, dermatite atópica, urticária crônica, mastocitose, leucemia eosinofílica, e síndrome hipereosinofílica. Em algumas concretizações, a doença é selecionada do grupo que consiste de asma de pauci granulocítica, hipersensibilidade da via aérea aguda ou crônica, esofagite eosinofílica, síndrome de Churg-Strauss, inflamação associada a uma citocina, inflamação associada a células que expressam Siglec-8, malignidade associada a células que expressam Siglec-8, urticária física, urticária fria, urticária por pressão, pen- figóide bolhoso, alergia a alimento, e aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA). Em algumas concretizações, o anticorpo inibe um ou mais sintomas de uma reação alérgica. Em algumas concretizações, a reação alérgica is uma reação de hipersensibilidade de tipo I. Em qualquer uma das concretizações aqui, o indivíduo pode estar sofrendo de asma que não é adequadamente controlada por um corticoste- róide inalado, um agonista β2 de ação curta, um agonista β2 de longa duração, ou uma sua combinação. Em qualquer uma das concretizações aqui, o indivíduo pode ser um ser humano.

[0027] Deve ser entendido que uma, alguma ou todas as proprie- dades das várias concretizações descritas aqui podem ser combinadas para formar outras concretizações da presente invenção. Estes e outros aspectos da invenção se tornarão evidentes por aquele de habilidade na técnica. Essas e outras concretizações da invenção são ulte- riormente descritas pela descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] A FIGURA 1 é um alinhamento de sequência que mostra a comparação de sequências de cadeia pesada de anticorpos humanizados. Resíduos de estrutura dentro de 4Â das CDRs no modelo molecular de anticorpo de 2E1 de camundongo são representados por um*; resíduos dentro de 4Â das CDRs e resíduos de VCI que foram diferentes na estrutura humana aceitante são iluminados em A, retro- mutações destes resíduos na estrutura humana aceitante a camundongo são indicados por @; Mutações somáticas oriundas de linha de germes de ser humano são indicadas por °; se aquele s resíduos fossem diferentes do AF471521 FW e do mou2E2 (isto é, 2E2 de camundongo) ou diferente da estrutura de AF471521 e idêntica ao mou2E2 (isto é, 2E2 de camundongo) dos resíduos correspondentes na estrutura de ser humano aceitante foram retro-mutados em linha de germes de ser humano e são indicados por +. Sequências destacadas na versão 2 da cadeia pesada representam um enxerto direto de mou2E2 (isto é, 2E2 de camundongo) CDRs na família de linhas de germes de ser humano mais próxima (isto é, sequência de linha de germes mais próximas). m2E2 VH corresponde a SEQ ID NO: 1;FW AF471521 de ser humano corresponde a SEQ ID NO: 120; Linha de germes X92218 VH366 corresponde a SEQ ID NO: 121; 2E2 RHA corresponde a SEQ ID NO: 2; 2E2 RHB corresponde a SEQ ID NO: 3; 2E2 RHC corresponde a SEQ ID NO: 4; 2E2 RHD corresponde a SEQ ID NO: 5; 2E2 RHE corresponde a SEQ ID NO: 6; 2E2 RHF corresponde a SEQ ID NO: 7; 2E2 RHG corresponde a SEQ ID NO: 8; IGHV4-59 FW corres- ponde a SEQ ID NO: 122; 2E2 RHA2 corresponde a SEQ ID NO: 9; e 2E2 RHB2 corresponde a SEQ ID NO: 10.

[0029] A FIGURA 2 é um alinhamento de sequência que mostra a comparação de sequências de cadeia leve de anticorpos humanizados. Resíduos de estrutura dentro de 4Â das CDRs no modelo molecular de anticorpo de 2E1 de camundongo são representados por a *; resíduos dentro de 4Â das CDRs e resíduos de VCI que são diferentes na estrutura de ser humano aceitante são indicados por +; retro- mutações destes resíduos in the human FW to camundongo são indicados por @; retro-mutação em linha de germes de ser humano de resíduos os quais na estrutura de X93721 são diferentes do camundongosão indicados por #. m2E2 VK corresponde a SEQ ID NO: 15; X93721 corresponde a SEQ ID NO: 123; Linha de germes X01668 corresponde a SEQ ID NO: 124; m2E2 RKA corresponde a SEQ ID NO: 16; m2E2 RKB corresponde a SEQ ID NO: 17; m2E2 RKC corresponde a SEQ ID NO: 18; m2E2 RKD corresponde a SEQ ID NO: 19; m2E2 RKE corresponde a SEQ ID NO: 20; m2E2 RKF corresponde a SEQ ID NO: 21; e m2E2 RKG corresponde a SEQ ID NO: 22.

[0030] A FIGURA 3 é um alinhamento de sequência que mostra a comparação de sequências de CDR que foram mutadas tanto nas cadeias leve quanto pesada de anticorpos humanizados. Resíduos de CDR que foram mutadas na variante como sendo mais próxima à sequênciade linha de germes são indicados por #. 2E2 RKA corresponde a SEQ ID NO: 16; 2E2 RKF corresponde a SEQ ID NO: 21; 2E2 RKA F-Y mut corresponde a SEQ ID NO: 23; 2E2 RKF F-Y mut corresponde a SEQ ID NO: 24; 2E2 RHA corresponde a SEQ ID NO: 2; 2E2 RHE corresponde a SEQ ID NO: 6; 2E2 RHE S-G mut corresponde a SEQ ID NO: 11; 2E2 RHE E-D mut corresponde a SEQ ID NO: 12; 2E2 RHE Y-V mut corresponde a SEQ ID NO: 13; e 2E2 RHE E-D triplo mut corresponde a SEQ ID NO: 14.

[0031] A FIGURA 4 é um gráfico que mostra uma comparação de ligação de antígeno de Siglec-8 por anticorpos candidatos purificados codificados por 2C4 quimérico ou combinações de 2E2 RHE com mutante de CDR3 de 2E2 RKA, 2E2 RKF, 2E2 RKA CDR3, ou mutante de DR3 de 2E2 RKF, aquecidos por 10 min na temperatura indicada, então resfriados para 4°C antes da realização da EL ISA de ligação de Siglec-8.

[0032] A FIGURA 5 é um gráfico que mostra a Tm de anticorpos de candidatos de 2C4 purificados anticorpos em comparação com ch2C4 (isto é, anticorpo de 2C4 quimérico).

[0033] A FIGURA 6 é um gráfico que mostra a estabilidade de anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano e quiméricos depois de serem congelados a -20°C por 60 minutos e descongelados a temperatura ambiente.

[0034] A FIGURA 7 é um gráfico que mostra morte de eosinófilos com anticorpos de anti-Siglec-8. Leucócitos de sangue periférico totais foram incubados na presença das concentrações de anticorpos de controle e de anti-Siglec-8 indicadas por 16 horas. Redução de números de eosinófilos foi monitorada por citometria de fluxo e foi quantificada como uma perda de células de IL5Ralfa+ negativas a CD16 com alta dispersão lateral (SSCHI).

[0035] A FIGURA 8 é uma série de gráficos que mostra in vitro apoptose e depleção in vivo de mastócitos humanos por anticorpos de anti-Siglec-8. A FIGURA 8A. Atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo mediada por célula NK (ADCC) de anticorpo de IgG4 de HEKA, anticorpo de IgG1 de HEKA não fucosilada e anticorpos de IgG1 de 1H10 quiméricos de baixo teor de fucose nos mastócitos humanos primários oriundos da lavagem peritoneal de camundongos NSGS enxertos com human células tronco hematopoiéti- cas as demonstrated por liberação de LDH a 48 horas. Controle indica um anticorpo de isótipo de IgG1 de ser humano fucosilado que não se liga a Siglec-8. A FIGURA 8B Depleção de mastócitos positivos a Siglec-8 in vivo. Camundogos transgênicos de Siglec-8 seletivamente que expressam Siglec-8 sobre a superfície dos mastócitos em níveis comparáveis com aqueles nos mastócitos humanos que foram tratados intraperitonealmente com anticorpo de IgG4 de HEKA, anticorpo de IgG1 de HEKA não fucosilado, anticorpo de 1C3 de camundongo, ou um anticorpo de controle de isótipo de IgG4 de ser humano que não se liga a Siglec-8. n = 4 camundongos por grupo.

[0036] A FIGURA 9 é um gráfico que mostra inibição de uma reação de hipersensibilidade de tipo I no camundongo humanizado por um anticorpo de IgG4 de anti-Singlec humanizado. Resposta de anafi- laxia cutânea passive foi induzda nas orelhas de camundongos de NSGS enxertados por sensibilização com controle anti-NP-IgE (fornecidoà orelha direita) ou controle de PBS (fornecido à orelha esquerda) e NP-BSA administrado 24 horas depois da sensibilização. Camundongos foram tratados com IgG4 de HEKA ou um a anticorpo de controle de isótipo de IgG4 de ser humano que não se liga a Siglec-8 ou 24 horas pré-sensibilização como indicado por * ou 2 horas pós- sensibilização como indicado por @. Mudança média na espessura da orelha e erros padrão a 3 horas ou 24 horas pós-desafio são mostrados. n = 5 camundongos por grupo para os camundongos tratados com anticorpo de IgG4 de HEKA e n = 4 camundongos por grupo para os camundongos tratados com anticorpo de controle de isótipo.

[0037] A FIGURA 10 é uma série de histogramas que mostram a ligação de anticorpos de anti-Siglec-8 monoclonais de camundongo 2E2, 1C3, e 1H10 a eosinófilos de babuíno ou ser humano (células de CD49+ CD16- SSCalta) como demonstrados por citometria de fluxo. Histogramas mostram uma série de eosinófilos de sangue humano ou de babuíno representado graficamente contra a intensidade de fluores- cência para cada anticorpo em comparação com um anticorpo de controle de isótipo de IgG1 de camundongo que não se liga a Siglec-8.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Definições.

[0039] Antes da descrição da invenção em detalhes, deve ser entendido que Esta invenção não é limitada a composições particulares ou sistemas biológicos, que podem, naturalmente, variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada aqui é para a finalidade de descrição apenas das concretizações particulares, e não se destinam a ser limitante. Como usado neste relatório e as reivindicações anexas, as formas singular "um", "um""o" e "a" incluem referentes plurais a não ser que o contexto claramente indique de outra maneira. Assim, por exemplo, referência a "uma molécula"opccionalmente inclui uma combinação de duas ou mais tais moléculas, e semelhantes.

[0040] O termo "cerca de" como usado aqui refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pela pessoa versada neste campo da técnica. Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) concretizações que são dirigidos àquele valor ou parâmetro per se.

[0041] Deve ser entendido que aspectos e concretizações da invenção descritas aqui incluem "compreendendo,""que consiste," e "que consiste essencialmente de" aspectos e concretizações.

[0042] O termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos de comprimento total que têm uma região de fc de imunoglobolina), composições de anticorpo com espe-cificidadepoliepitópica, anticorpos multispecíficos (por exemplo, anti-corposbiespecíficos, diacorpos, e moléculas de cadeia simples, bem como fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2, e Fv). O termo "imunoglobulina" (Ig) é usada intercambeavelmente com "anticorpo" aqui.

[0043] A unidade de anticorpo de 4 cadeias básica é uma glicopro- teína heterotetramérica constituída de duas cadeias leve idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Um anticorpo de IgM consiste de 5 das unidades de heterotetrâmero básicas juntamente com um po- lipeptídeo adicional chamado de cadeia J, e contém 10 sítios de ligação de antígeno, enquanto anticorpos de IgA compreendem de 2-5 das unidades de 4 cadeias básicas que podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes em combinação com a cadeia de J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias é em geral cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissul- feto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas entre si por um ou mais ligações de dissulfeto dependendo do isótipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes de dissulfato de intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem o N-terminal, um domíniovariável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias alfa e Y e quatro domínios de CH para μ e ε isótipos. Cada cadeia L tem no N-terminal, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante em sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e a CL é alinhada com o primeiro domínio da cadeia pesada constante (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácido particular forme uma interface entre os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve. O emparelhamento de a VH e VL juntos forma um sítio de ligação de antígeno simples. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Básico e Clinical Immunology, 8a ed, Daniel P. Sties, Abba I. Terr e Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, pág. 71 e capítulo 6.

[0044] A cadeia L oriunda de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domí- nio constante de suas cadeias pesadas (CH), imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isótipos. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas de-signadasα, δ, ε, Y e μ, respectivamente.(pag.21)* As classes de Y e α são ulteriormente divididas em subclasses com base das diferenças relativamente menores na função e sequência de CH, por exemplo, seres humanos expressam as seguintes: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Anticorpos de IgG1 podem existir em variantes múltiplas poli- mórficas chamadas alótipos (revista em Jefferis e Lefranc 2009. mAbs Vol 1 Issue 4 1-7) qualquer um dos quais são adequados para o uso na invenção. Variantes alotípicas comuns em populações de ser humanosão aquelas designadas pelas letras a, f, n ,z.

[0045] Um anticorpo "isolado"é um que foi identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente de produção (por exemplo, naturalmente ou recombinantemente). Em algu-masconcretizações, o polipeptídeo isolado está livre de associação com outros componentes oriundos de seu ambiente de produção. Componentes de contaminantes of seu ambiente de produção, tal como aquele que resulta de células transfectadas recombinantes, são materiais que tipicamente interferiria com usos terapêuticos, de diagnóstico ou pesquisa para o anticorpo, e pode incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em algumas concretizações, o polipeptídeo é purificado: (1) para mais do que 95% em peso do anticorpo como determinado por, por exemplo, o método de Lowry, e em algumas concretizações, para mais do que 99% em peso; (1) para um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos de Sequência de aminoácidos interna ou N-terminal por uso de um sequenciador de corpo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de não redução ou redução usando-se Co- omassie blue ou coloração prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro das células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, um anticorpo ou um polipeptídeo isolado é preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0046] O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos subs-tancialmentehomogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreen-dendo a população são idênticas exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural e/ou modificações pós-tradução (por exemplo, isomerizações, amidações) que possam estar estar presentes em quantidade menores. Em algumas concretizações, anticorpos mono- clonais têm uma clivagem C-terminal na cadeia pesada e/ou na cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos de aminoácido são clivados no C-terminal da cadeia pesada e/ou da cadeia leve. Em algumas concretizações, a clivagem C-terminal remove uma lisina C-terminal a partir da cadeia pesada. Em algumas concretizações, anticorpos mo- noclonais tem uma clivagem N-terminal na cadeia pesada e/ou cadeia leve. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos de aminoácido são clivados no N-terminal da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas concretizações formas truncadas de anticorpos monoclonais podem ser feitos por técnicas recombinantes. Em algumas concretizações, anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Em algumas concretizações, anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra os sítios antigênicos múltiplos (tal como anticorpo biespecífico ou um an-ticorpomultiespecífico). O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancial-mentehomogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma, métodos de DNA re- combinantes, tecnologias de exibição de fago, e tecnologias para a produção de anticorpos do tipo humano em animais ou humanos que têm partes ou a totalidade dos locais ou genes de imunoglobulina de ser humano que codificam sequências de imunoglobulinas de ser humano.

[0047] O termo "anticorpo nu" refere-se a um anticorpo que não é conjugado a uma radiomarcador ou porção citotóxica.

[0048] Os termos "anticorpo de comprimento total,""anticorpo intacto" ou "anticorpo inteiro"são usados intercambeavelmente para referir-se a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de anticorpo. Anticorpos especificamente inteiros incluem aqueles com cadeias leve e pesada incluindo uma região de Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa de ser humano) ou suas variantes de sequência de aminoáci- dos. Em alguns casos, o anticorpo intacto pode ter uma ou mais funções efetoras.

[0049] Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo intacto, a ligação de antígenoe/ou a região variável do anticorpo intacto. Exemplos dos fragmentos de anticorpo incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (vide a pat. U.S. No. 5.641.870, Exemplo 2; Zapata e outros, Proteína Eng.8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[0050] Digestão de papaína de anticorpos produziam dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados de fragmentos de "Fab", e um fragmento de "Fc" residual, uma designação de refletir a capacidade de prontamente se cristalizar . O fragmento de Fab consiste de uma cadeia L total juntamente com a região variável domínio da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento de Fab é monovalente com relação a ligação de antígeno, isto é, tem um único sítio de ligação de antígeno. Tratamento de pepsina de um anticorpo fornece um fragmento grande simples F(ab')2 que grosseriamente corresponde a dois fragmentos de Fab ligados a dissulfeto tendo atividade de ligação de antígeno diferente e é ainda capaz de reticular antígeno. Fragmentos de Fab diferem de fragmento de Fabs por ter uns poucos resíduos adicionais no carbóxi terminal do domínio de CH1 incluindo uma ou mais cisteínas oriundas da região de articulação ("hinge") do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína(s) dos domínios constantes portam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo de F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares dos fragmentos de Fab' que têm cisteínas de articulação entre elas. Outros acoplamentos químicos dos fragmentos de anticorpo são também conhecidos.

[0051] O fragmento de Fc compreende as porções carbóxi- terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por sequências na região de Fc, a região que é também teconhecida por receptores de Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.

[0052] "Fv"é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação e reconhecimento de antígeno completo. Este fragmento consiste de um dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e um domínio de região variável de cadeia pesada em estreita associação não covalente. A partir do dobramento desses dois domínios emanam seis laços hipervariáveis (3 laços cada um da cadeia H e L) que contribuem os resíduos de aminoácidos para a ligação de antí- geno e conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, ainda um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígeno, embora em uma afinidade mais baixa do que o sítio de ligação total.

[0053] "Fv de cadeia simples"também abreviada como "sFv" ou "scFv"são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo de VH e de VL ligados em uma cadeia de polipeptídeo simples. Em algumas concretizações, o polipeptídeo de sFv ulteriormente compreende um ligador de polipeptídeo entre the VHe VL domínios que permite que o sFv forme a estrutura desejada para a ligação de antí- geno. Pra uma revisão do sFv, vide Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., SpringerVerlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0054] "Fragmentos funcionais" dos anticorpos da invenção compreendem uma porção de um anticorpo intacto, em geral incluindo a ligação de antígeno ou região variável do anticorpo intacto ou a região de Fv de um anticorpo que retém ou tem capacidade de ligação de FcR modificada. Exemplos dos fragmentos de anticorpo incluem anticorpo linear, moléculas de anticorpo de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[0055] Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos "quiméricos"(imunoglobulinas) em que uma porção cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica com ou homóloga a sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) com ou homólo- ga(s) a sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma outra espécie ou que pertencem a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (a pat. U.S. No. 4,816,567; Mor-rison e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anti-corposquiméricos de interesse aqui incluem anticorpos PRIMATIZED® em que a região de ligação de antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por, por exemplo, imunização de macacos macaque com um antígeno de interesse. Como usado aqui, "anticorpo hu-manizado"é usado como um subconjunto de "anticorpos quiméricos."

[0056] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanizados (por exemplo, de camundongo) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma concretização, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que resíduos oriundos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de uma HVR de uma espécienão humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primatas não humanos tendo a desejada especificidade, afinidade, e/ou capacidade. Em alguns casos, resíduos de FR da imunoglobulina humana substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além do mais, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para ulteriormente refinar desempenho de anticorpo, tal como afinidade de ligação. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que a totalidade ou substancialmente a totalidade dos laços hipervariáveis correspondemàqueles de uma sequência de imunoglobulinas não humana, e a totalidade ou substancialmente a totalidade das regiões de FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulinas humana, embora as regiões de FR possam incluir uma ou mais substituições de resíduos de FR que aperfeiçoam um desepenho de anticorpo, tais como afinidade de ligação, isomerização, imunogenicidade, etc. Em algumas concretizações, o número de substituições de aminoácidos na FR são não mais do que 6 na cadeia H, e na cadeia L, não mais do que 3. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes, vide, por exemplo, Jones e outros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Vide também, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); e a pat. U.S. Nos. 6,982,321 e 7,087,409. Em algumas concretizações, anticorpos humanizados são dirigidos contra um único sítio antigênico. Em algumas concretizações, anticorpos humanizados são dirigidos contra sítios antigênicos múltiplos. Um método de humanização alternativa pe descrito na pat. U.S. no. 7.981.843 e U.S. Publicação de pedido de patente No. 2006/0134098.

[0057] A "região variável"ou "domínio variável"de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo. Os domínios variáveis da cadeia pesada e cadeia leve podem ser chamados de "VH" e "VL", respectivamente. Esses domínios são em geral as partes mais variáveis do anticorpo (em relação a outros anticorpos da mesma classe) e contêm os sítios de ligação de antígeno.

[0058] O termo "região hipervariável,""HVR," ou "HV," quando usado aqui refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam laços estruturalmente definidos. Em geral, anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3), e três naVL (L1, L2, L3). Nos anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que H3 em particular desempenhe um papel único na conferência de especifi-cidade fina para anticorpos. Vide, por exemplo, Xu e outros Immunity 13:37-45 (2000); Johnson e Wu in Métodos in Molecular Biology 248:125 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). De fato, anticorpos de camelídeo de ocorrência natural que consistem de apenas uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência da cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman e outros, Nature 363:446-448 (1993) e Sheriff e outros, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[0059] Uma série de delineações de HVR estão no uso e são incluídas aqui. As HVRs que são regiões de determinação de complementaridade de Kabat (CDRs) são com base na variabilidade de sequência e são a mais comumente usadas (Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). HVRs de Chothia referem, ao invés disso, a localização dos laços estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As HVRs "de contato"são com base em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os resíduos oriundos de cada uma dessas HVRs são observados abaixo. Laço Kabat Chothia Contato

[0060] A não ser que de outra maneira indicado, os resíduos de domínio variável (resíduos de HVR e resíduos de região de estrutura) são numerados de acordo com Kabat e outros, supra.

[0061] Resíduos de "estrutura" ou de "FR"são aqueles resíduos de domínio variável outros que não os resíduos de HVR como aqui definidos.

[0062] A expressão "numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido como em Kabat," e suas variações, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat e outros, supra. Usando-se esse sistema de numeração, a sequência de aminoácidos lineares reais pode conter fewer ou adiçãoal aminoácidos que correspondem a uma shortening de, ou inserção para dentro de, uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incuir um inserto de aminoácido simples (resíduo 52a de acordo com Kabat) depois que o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemploresíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) depois de resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão".

[0063] Uma "estrutura humana aceitante" para as finalidades aqui aqui é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura de VL ou VH derivada de uma estrutura de imunoglobu- lina humana ou uma estrutura de consenso humana. Uma estrutura humana aceitante "derivada de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana pode compreender a sua mesma sequência de aminoácidos, ou pode conter mudanças de sequências de aminoácidos pré-existentes. Em algumas concretizações, o número de mudanças de aminoácidos pré-existentes são 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos.

[0064] "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoá- cidos" com relação a uma sequência de polipeptídeos de referência é definida como a percentagem dos resíduos de aminoácido em uma sequência de candidato que são idênticos com os resíduos de amino- ácidos na sequência de polipeptídeos de referência, depois do alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para conseguir a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Alinhamentos para as finalidades de determinação de percentagem de identidade de sequência de aminoácidos podem ser conseguidos de vários modos que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando-se software de computador publicamentedisponível tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica pode determinar parâmetros apropriados para alinhamentos de sequências, incluindo quaisquer algorítmos necessários para conseguir alinhamento máxima sobre o comprimento total de sequências sendo comparadas. Por exemplo, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dadasequência de aminoácidos A a, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende um certa % de identidade de sequência de aminoácidos a, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada como segue: 100 vezes da fração X/Y

[0065] onde X é o número de resíduos de aminoácido classificados como emparelhamentos idênticos pela sequência naquele alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será apreciado que onde o comprimento de sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento de sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos de A a B não igualarão a % de identidade de sequência de aminoácidos de B a A.

[0066] Um anticorpo que "se liga a", "especificamente se liga a" ou é "específico para" um particular polipeptídeo ou um epítopo em um polipeptídeo particular é um que se liga àquele particular polipeptídeo ou epítopo em um polipeptídeo particular sem substancialmente se ligar a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo. Em al-gumasconcretizações, ligação de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui a um polipeptídeo de não Singlec-8, não relacionado é menos do que cerca de 10% do anticorpo que se liga a Siglec-8 como medida pelos métodos conhecidos na técnica (por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)). Em algumas concretizações, o anticorpo que se liga a um Siglec-8 (por exemplo, proteína de fusão de Fc de Siglec-8 na forma de dímero (SEQ ID NO: 74)) tem uma constante de dissociação (Kd) de <1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 2 nM, < 1 nM, < 0,7 nM, <0 ,6 nM, < 0,5 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo 10-8 M ou menos, por exemplo de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

[0067] O termo "Siglec-8" como usado aqui refere-se a uma proteína de Siglec-8 de ser humano. O termo também inclui variantes de ocorrência natural de Siglec-8, incluindo variantes de união ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um Siglec-8 de ser humano exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 72. A sequência de ami- noácidos de um outro Siglec-8 de ser humano exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 73. Em algumas concretizações, uma proteína de Siglec- 8 de ser humano compreende o domínio extracelular de Siglec-8 de ser humano fundido a uma região de fc de imunoglobolina. A sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de Siglec-8 de ser humano exemplar fundido a uma região de fc de imunoglobolina é mos- trada na SEQ ID NO: 74. A sequência de aminoácidos sublinhada na SEQ ID NO: 74 indica a região de Fc da sequência de aminoácidos de proteína de fusão de Fc de Siglec-8. Sequência de aminoácidos de Siglec-8 de ser humano GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAG DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGT LESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTL TPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQG DATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCP SRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGT GTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVG DTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGEL HYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNP SSKEVRG (SEQ ID NO: 72) Sequência de aminoácidos de Siglec-8 de ser humano GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAG DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGT LESGHPRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTL TPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQG DATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCP SRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGT GTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVG DTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGEL HYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNP SSKEVRG (SEQ ID NO: 73) Sequência de aminoácidos de proteína de fusão de Fc de Siglec-8 GYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAG DRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARK RDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGT LESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTL TPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQG DATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCP SRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGT GTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74)

[0068] Anticorpos que "induzem apoptose" ou são "apoptóticos" são aqueles que induzem morte de célula programada como determinado por ensaios de apoptose padrão, tais como ligação de anexina V, fragmentação de DNA, encolhimento de célula, dilatação de retículo endoplásmico, fragmentação de célula, e/ou formação de vesículas de membrana (chamados corpos apoptóticos). Por exemplo, a atividade apoptótica dos anticorpos de anti-Siglec-8 da presente invenção pode ser mostrada por células de manchamento com anexina V.

[0069] "Funções de efetor" de anticorpo referem-se àquelas ativi-dadesbiológicas atribuíveis à região de Fc (região de Fc de sequência nativa ou região de Fc de variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo, e variam como isótipo de anticorpo. Exemplos do anti-corpofunções de efetor incluem: citotoxicidade dependente de com-plemento e ligação de C1q; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação para baixo de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptores de célula B); e ativação de célula B.

[0070] "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que Ig se- cretadas ligadas sobre receptores de Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) permite que essas células efetoras citotóxi- cas se liguem a uma célula alvo portadora de antígeno e subsequentemente matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são necesários para matar a célula alvo por esse mecanismo. As células primárias para a mediação de ADCC, células de NK, expressam apenas FCYRIII, enquanto que monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. Expressão de Fc nas células hema- topoiéticas está sumarizada na tabela 3 na pág. 464 de Ravetch e Ki- net, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui melhora ADCC. Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito na pat. U.S. no. 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células matadoras (NK) naturais. Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo de animal tal como aquele descrito em Clynes e outros, PNAS USA 95:652-656 (1998). Outras variantes de Fc que alteram a atividade de ADCC e outras propriedades de anticorpo incluem aquelas descritas por Ghetie e outros, Nat Biotech. 15:63740, 1997; Duncan e outros, Nature 332:563-564, 1988; Lund e outros, J. Immunol 147:2657-2662, 1991; Lund e outros, Mol Immunol 29:5359, 1992; Alegre e outros, Transplantation 57:1537-1543, 1994; Hutchins e outros, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995; Jefferis e outros, Immunol Lett. 44:111-117, 1995; Lund e outros, FASEB J9:115-119, 1995; Jefferis e outros, Immunol Lett 54:101-104, 1996; Lund e outros, J Immunol 157:4963-4969, 1996; Armour e outros, Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999; Idusogie e outros, J Immunol 164:4178-4184, 200; Reddy e outros, J Immunol 164:1925-1933, 2000; Xu e outros, Cell Immunol 200:16-26, 2000; Idusogie e outros, J Immunol 166:2571-2575, 2001; Shields e outros, J Biol Chem 276:6591-6604, 2001; Jefferis e outros, Immunol Lett 82:57-65. 2002; Presta e outros, Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002; Lazar e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006; as pats. U.S. Nos. 5.624.821; 5.885.573; 5.677.425; 6.165.745; 6.277.375; 5.869.046; 6.121.022; 5.624.821; 5.648.260; 6.194.551; 6.737.056; 6.821.505; 6.277.375; 7.335.742; e 7.317.091.

[0071] O termo "região de Fc" aqui é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo regiões de Fc de sequência natural e regiões de Fc variantes. Embora as fronteiras de uma região de Fc de uma cadeia pesada de imuno- globulina possam variar, a região de Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida como se estendendo desde um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou desde Pro230, até o terminal de carboxila do mesmo. Regiões de Fc de sequência natural adequadas para uso nos anticorpos da invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Uma substituição de aminoácido simples (S228P de acordo com numeração de Kabat; designada IgG4Pro) pode ser introduzida para abolir a heterogeneidade observada em anticorpo de IgG4 re- combinante. Vide Angal, S. e outros (1993) Mol Immunol 30, 105-108.

[0072] Anticorpo "não-fucosilado"ou "deficiente em fucose" refere- se a uma variante de anticorpo de giicosilação compreendendo uma região de Fc em que uma estrutura de carboidrato ligada à região de Fc reduziu fucose ou carece de fucose. Em algumas concretizações, um anticorpo com fucose reduzida ou carente de fucose aperfeiçoa a função de ADCC. Anticorpos não-fucosilados ou deficientes de fucose têm fucose reduzida em relação à quantidade de fucose no mesmo anticorpo produzido em uma linha de células. Uma composição de an- ticorpo não-fucosilado ou deficiente de fucose contemplada aqui é uma composição em que menos do que cerca de 50% dos glicanos N- ligados, ligados à região de Fc dos anticorpos na composição compreendem fucose.

[0073] Os termos "fucosilação"ou "fucosilado" refere-se à presença de resíduos de fucose dentro dos oligossacarídeos ligados ao esqueleto de peptídio de um anticorpo. Especificamente, um anticorpo fucosilado compreende fucose α (l,6)-ligada no resíduo mais interno de N-acetilglucosamina (GlcNAc) em um dos ou ambos os oligossacarí- deos N- ligados, ligados à região de Fc de anticorpo , por exemplo na posição Asn 297 de um domínio de Fc de IgG1 de ser humano (numeração EU resíduos de região de Fc). Asn297 pode também ser localizada cerca de + 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é entre as posições 294 e 300, devido a minor variações de sequências menores em imunoglobulinas.

[0074] O "grau de fucosilação" é a percentagem de oligossacarí- deos fucosilados em relação a todos os oligossacarídeos identificados por métodos conhecidos na técnica por exemplo, em uma composição tratada com N-glicosidase F avaliada por espectrometria de massa de tempo de vôo de ionização de dessorção de laser auxiliada por matriz (MALDI TOF MS). Em uma composição de um "anticorpo totalmente fucolisado" essencialmente todos os oligossacarídeos compreendem resíduos de fucose, isto é, sãofucosilados. Em algumas concretizações, uma composição de um anticorpo totalmente fucolisado tem um grau de fucosilação de pelo menos cerca de 90%. Correspondentemente, um anticorpo individual em tal composição tipicamente compreenderesíduos de fucose em cada um dos dois oligossacarídeos N- ligados na região de Fc. Inversamente, em uma composição de um anticorpo "totalmente não fucosilado" essencialmente nenhum dos oli- gossacarídeos são fucoslados, e um anticorpo individual em tal com- posição não contém resíduos de fucose em qualquer uma dasu duas oligossacarídeos N-ligados na região de Fc. Em algumas concretizações, uma composição de um anticorpo totalmente não fucosilado tem um grau de fucosilação de menos do que cerca de 10%. Em uma composição de um "anticorpo parcialmente fucosilado" apenas parte dos oligossacarídeos compreendem fucose. Um anticorpo individual em tal composição pode compreender resíduos de fucose em um, um ou ambos os Oligossacarídeos N-ligados na região de Fc, com a condição de que a composição não compreenda essencialmente a todos os anticorpos individuais que carecem de resíduos de fucose nos oli- gossacarídeos N-ligados na região de Fc, nem essencialmente todos os anticorpos individuais que contêm resíduos de fucose em ambos os oligossacarídeos N-ligados na região de Fc. Em uma concretização, uma composição de um anticorpo parcialmente fucosilado tem um grau de fucosilação de cerca de 10% a cerca de 80% (por exemplo, cerca de 50% a cerca de 80%, cerca de 60% a cerca de 80%, ou cerca de 70% a cerca de 80%).

[0075] "Afinidade de ligação"como usada aqui refere-se à força das interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu par de ligação (por exemplo, um antígeno). Em algumas concretizações, a afinidade de um anticorpo para um Siglec-8 (que pode ser um dímero, tal como proteína de fusão de Siglec-8-Fc descrito aqui) pode ser em geral representada por uma constante de dissociação (Kd). Afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos aqui.

[0076] "Avidez de ligação"como usada aqui refere-se à força de ligação de múltiplos sítios de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu par de ligação (por exemplo, um antígeno).

[0077] Uma molécula de ácido nucléico "isolada" que codifica ose anticorpos aqui é uma molécula de ácido nucléico que é identificada e é separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contami- nante com a qual está normalmente associada no ambiente que foi produzido. Em algumas concretizações, o ácido nucléico isolado está livre de associação com todos os componentes associados ao ambiente de produção. As moléculas de ácido nucléico isoladas que codificam os polipeptídeos e anticorpos aqui estão em uma forma outra que não na forma ou configuração em que são encontradas na natureza. As Moléculas de ácido nucléico isoladas portanto são distinguidas a partir de ácido nucléico que codifica os polipeptídeos e anticorpos aqui que existem naturalmente em células.

[0078] O termo "formulação farmacêutica"refere-se a uma preparação que está em tal forma de modo a permitir que a atividade biológica do ingreidente ativo seja eficaz, que contenha nenhum componente adicional que é inaceitavelmente tóxico a um indivíduo ao qual a formulação será administrada. Tais formulações são estéreis.

[0079] "Veículos"como usados aqui incluem veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos à célula ou mamífero sendo exposto aos mesmos nas dosagens e con-centrações empregadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada por pH aquosa. Exemplos de veí-culos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascór- bico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imuno- globulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; amino- ácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginine ou lisina; mo- nossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes de quelação tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contra-íons de formação de sal tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN™, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS™.

[0080] Como usado aqui, o termo "tratamento" refere-se a intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejáveis de tratamento incluem diminuição da taxa de uma progressão de doença, melhoramento ou paliativo do estado da doença, prognóstico de remissão ou aperfeiçoado. Um indivíduo é "tratado" com sucesso, por exemplo, se um ou mais sintomas associados a uma desordem (por exemplo, uma doença mediada por eosinófilo) são mitigadas ou eliminadas. Por exemplo, um indivíduo é "tratado" com sucesso se tratamento resultar no aumento da qualidade de vida aqueles que sofrem de uma doença, diminuição da dose de outras medicações exigidas para o tratamento da doença, redução da frequência de recorrência da doença, diminuição de severidade da doença, atraso do desenvolvimento ou progressão da doença, e/ou prolongamento de sobrevivência de indivíduos.

[0081] Como usado aqui, "em combinação com" refere-se a administração de uma modalidade de tratamento além de uma outra modalidade de tratamento. Como tal, "em combinação com" refere-se a administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou depois de administração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.

[0082] Como usado aqui, o termo "prevenção"inclui provisão de profilaxias com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo. Um indivíduo pode estar predisposto a, suscetível a uma desordem, ou em risco de desenvolver uma doença, mas ainda não foi diagnosticado com a desordem. Em algumas concretizações, anticorpos de anti-Siglec-8 descrito aqui são usados para atrasar o desenvolvimento de uma desordem.

[0083] Como usado aqui, um indivíduo "em risco" de desenvolver uma desordem pode ou não pode ter doença ou sintomas detectáveis da doença, e pode ou não pode ter exibido doença ou sintomas detec- táveis da doença antes dos métodos de tratamento descritos aqui. "Em risco" denotes que um indivíduo tem um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis que se correlacionam com o desenvolvimento da desordem mediada por eosinófilo e/ou mediada por mastóci- to, como conhecido na técnica. Um indivíduo tendo um ou mais destes fatores de risco tem uma probabilidade mais alta de desenvolver a desordem do que um indivíduo sem um ou mais destes fatores de risco.

[0084] Uma "quantidade eficaz" refere-se a pelo menos uma quantidade eficaz, das dosagens e por períodos de tempo necessário, para conseguir o efeito desejado ou indicado, incluindo um resultado terapêutico ou profilático. Uma quantidade eficaz pode ser provida em uma ou mais administrações. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz"é pelo menos a concentração mínima necessária afetar um aperfeiçoamentomensurável de uma desordem particular. Uma quantidade tera- peuticamente eficaz aqui pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do paciente, a capacidade do anticorpo de eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode também ser uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos do anticorpo são excedidos o peso pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilatica- mente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e por períodos de tempo necessários, para conseguir o resultado prolifático desejado.Tipicamente não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes de ou no estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menos do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[0085] Administração "crônica"refere-se a administração do(s) medicamento(s) em um modo contínuo em oposição a modo agudo, de modo que o princpal efeito terapêutico inicial (atividade) por um pe-ríodo de tempo prolongado. Administração "intermitente"é um tratamento que não consecutivamente feito sem interrupção, mas sim é cíclico na natureza.

[0086] Como usado aqui, um "indivíduo"ou a "sujeito"é um mamífero. Um "mamífero"para as finalidades de tratamento inclui seres hmanos, animais domético e de fazendo, e animais de zoo, de esportes ou animais de estimação, tais como cachorros, cavalos, coelhos, gado, porcos, hamsters, gerbilos, camundongos, furões, ratos, gatos, etc. Em algumas concretizações, the individual ou subject é humano.

II. Anticorpos de anti-Siglec-8 e Composições

[0087] Em um aspecto, a invenção provê anticorpos isolados que se ligam a um Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui tem uma ou mais das se-guintescaracterísticas: (1) liga um Siglec-8 de ser humano; (2) se liga a um domínio extracelular de um Siglec-8 de ser humano; (3) liga um Siglec-8 de ser humano com uma afinidade mais alta do que anticorpo de camundongo 2E2 e/ou anticorpo de camundongo 2C4; (4) liga um Siglec-8 de ser humano com uma avidez mais alta do que o anticorpo de camundongo 2E2 e/ou anticorpo de camundongo 2C4; (5) tem uma Tm de cerca de 70°C-72°C ou mais alta em um ensaio de deslocamentotérmico; (6) com um grau de fucosilação reduzida ou é não fu- cosilada; (7) liga um Siglec-8 de ser humano expresso em eosinófilos e induz apoptose de eosinófilos; (8) liga um Siglec-8 de ser humano expresso em mastócitos e esgota mastócitos; (9) liga um Siglec-8 de ser humano expresso em mastócitos e inibe atividade dependentes de FcεRI de mastócitos (por exemplo, liberação de histamina, liberação de PGD2, fluxo de Ca2+, e/ou liberação de β-hexosaminidase, etc.); (10) foi engenheirado para aperfeiçoar atividade de ADCC; (11) liga um Siglec-8 de ser humano expresso em mastócitos e mata mastóci- tos por atividade de ADCC (in vitro, e/ou in vivo); (12) se liga a Siglec-8 de um ser humano ou um primata não humano; (13) se liga a Domínio 1, Domínio 2, e/ou Domínio 3 de Siglec-8 de ser humano, ou liga um Siglec-8 polipeptídeo compreendendo Domínio 1, Domínio 2, e/ou Domínio 3 de Siglec-8 de ser humano (por exemplo, proteínas de fusão descrito aqui); e (14) esgota eosinófilos ativados com uma EC50 menor do que a EC50 de anticorpo de camundongo 2E2 ou 2C4.

[0088] Em um aspecto, a invenção provê anticorpos que se liga a um Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, o Siglec-8 de ser humano compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72. Em algumas concretizações, o Siglec-8 de ser humano compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo in Domínio 1 de Siglec-8 de ser humano, em que Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo in Domínio 2 de Siglec-8 de ser humano, em que Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo in Domínio 3 de Siglec-8 de ser humano, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 116 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 115. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 115. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 116. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epíitopo linear no domínio extracelular de Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo conformacional no domínio extracelular de Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, um anticorpo descrito aqui se liga a um Siglec-8 de ser humano expresso em eosinófilos e induz apoptose de eosinófilos. Em algumas concretizações, um anticorpo descrito aqui se liga a um Siglec-8 de ser humano expresso em mastócitos e esgota mastócitos. Em algumas concretizações, um anticorpo descrito aqui se liga a um Siglec-8 de ser humano expresso em mastócitos e inibe uma atividade mediada por mastócito. Em algumas concretizações, um anticorpo descrito aqui se liga a um Siglec-8 de ser humano expresso em mastócitos e mata mastócitos por atividade de ADCC. Em algumas concretizações, um anticorpo descrito aqui esgota mastócitos e inibe ativação de mastócito. Em algumas concretizações, um anticorpo aqui esgota eosinófilos ativados e inibe ativação de mas- tócito.

[0089] Provido aqui é um anticorpo de anti-Singlec-8 isolado que se liga a Siglec-8 de ser humano e Siglec-8 de primata não humano. Identificação de anticorpos com reatividade cruzada de primata seria útil para testagem pré-clínica de anticorpos de anti-Siglec-8 in nonhuman primates. Em um aspecto, a invenção provê anticorpos que se liga a um Siglec-8 de primata de não humano Em um aspecto, a invenção provê anticorpos que se liga a um Siglec-8 de ser humano e um Siglec-8 de primata de não humano Em algumas concretizações, the Siglec-8 de primata não humano compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 118 ou uma sua porção. Em algumas concretizações, the Siglec-8 de primata não humano compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 119 ou uma sua porção. Em algumas concretizações, o primata não humano é um babuíno (por exemplo, Papio Anubis). Em algumas concretizações, o anticorpo que se liga a um Siglec-8 de ser humano e a Siglec-8 de primata não humano, se liga a um epítopo no domínio 1 de Siglec-8 de ser humano. Em uma outra concretização, Domínio 1 de Siglec-8 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em al-gumasconcretizações, o anticorpo que se liga a um Siglec-8 de ser humano e um Siglec-8 de primata não humano, se liga a um epítopo no domínio 3 de Siglec-8 de ser humano. Em uma outra concretização, Domínio 3 de Siglec-8 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Em algumas concretizações, o anti-corpo que se liga a um Siglec-8 de ser humano e a Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, ou um anticorpo de ser humano. Em algumas concretizações, o anticorpo que se liga a um Siglec-8 de ser humano e a Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo de camundongo. Em algumas concretizações, o anticorpo que se liga a um Siglec-8 de ser humano e a Siglec-8 de primata não humano é um anticorpo de IgG1 de ser humano.

[0090] Em um aspecto, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui is um anticorpo monoclonal. Em um aspecto, um anticorpo de anti- Siglec-8 descrito aqui é um fragmento de anticorpo (incluindo antigenbinding fragment), por exemplo,um fragmento de Fab, Fab‘-SH, Fv, scFv, ou (Fab‘)2. Em um aspecto, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em um aspecto, qualquer um dos anticorpos de anti-Siglec-8 descritos aqui são purificados.

[0091] Em um aspecto, são providos anticorpos de anti-Siglec-8 que competem com de anticorpo de 2E2 de camundongo e de anticorpo de 2C4 de camundongo que se liga a Siglec-8. São também providos anticorpos de anti-Siglec-8 que se ligaao mesmo epítopo que anticorpo de 2E2 de camundongo e anticorpo de 2C4 de camundongo. Em um aspecto, são providos anticorpos de anti-Siglec-8 que competem com qualquer anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui (por exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11) para o qual se liga a Siglec-8. Anticorpos de anti-Siglec-8 que se liga ao mesmo epítopo que qualquer anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui (por exemplo, HEKA, HEKF, 1C3, 1H10, 4F11) são também providos.

[0092] Em um aspecto da inveção, são providos polinucleotídeos que codificam anticorpos de anti-Siglec-8. Em certas concretizações, são providos vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam anticorpos de anti-Siglec-8 are. Em certas concretizações, são providos células hospedeiras compreendendo tais vetores. Em um outro aspecto da inveção, são providos composiçãos compreendendo anticorpos de anti-Siglec-8 ou polinucleotídeos que codificam anticorpos de anti-Siglec-8. Em certas concretizações, uma composição da invenção é uma formulação farmacêutica para o tratamento de uma desordem mediada por eosinófilo e/ou desordem mediada por mastócito, tais como aquelas enumeradas aqui.

[0093] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec- 8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo de camundongo 2C4. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo de camundongo 2E2. Em algumas concretizações, a HVR é uma CDR de Kabat ou uma CDR de Chothia.

[0094] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec- 8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo de camundongo 1C3. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo de camundongo 4F11. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 das sequências de HVR do anticorpo de camundongo 1H10. Em algumas concretizações, a HVR é uma CDR de Kabat ou uma CDR de Chothia.

[0095] Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo no domínio 1 de Siglec-8 de ser humano, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo no domínio 2 de Siglec-8 de ser humano, em que o Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo no domínio 3 de Siglec-8 de ser humano, em que o Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114.

[0096] Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 116 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoá- cido de SEQ ID NO: 115. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o ami- noácido de SEQ ID NO: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 115. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 117 mas não a uma proteína de fusão compreendendo o aminoácido de SEQ ID NO: 116.

[0097] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec- 8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.

[0098] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreen-dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.

[0099] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec- 8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.

[00100] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti- Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 67-70; e/ou em que a região variável de cadeia leve compreende (i) HVR-L1 compreendendo a se-quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, e (iii) HVR-L3 compre-endendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.

[00101] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti- Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 88, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 91, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 97, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 103. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo no domínio 2 de Siglec-8 de ser humano, em que Domínio 2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.

[00102] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti- Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 89, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 98, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 101, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo no domínio 3 de Siglec-8 de ser humano, em que Domínio 3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 114. Em algu-masconcretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a Siglec-8 de ser humano e Siglec-8 de primata não humano.

[00103] Em um outro aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti- Siglec-8 compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada compreende (i) HVR-H1 compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 90, (ii) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93, e (iii) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 96; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo (i) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 102, e (iii) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 105. Em algumas concretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a um epítopo no domínio 1 de Siglec-8 de ser humano, em que o Domínio 1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 112. Em algu-masconcretizações, o anticorpo descrito aqui se liga a Siglec-8 de ser humano e Siglec-8 de primata não humano.

[00104] Um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui pode compreender qualquer sequência de domínio variável de estrutura, com a condição de que o anticorpo retenha a capacidade de ligar Siglec-8 de ser humano. Como usado aqui, regiões de estrutura de cadeia pesada são designadas "HC-FR1-FR4," e cadeia leve framework regions são designadas "LC-FR1-FR4." Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 compreende uma sequência de estrutura de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 26, 34, 38, e 45 (HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3, e HC-FR4, respectivamente). Em algumas concreti- zações, o anticorpo de anti-Siglec-8 compreende uma sequência de estrutura de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 48, 51, 55, e 60 (LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3, e LC-FR4, respectivamente). Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 compreende uma sequência de estrutura de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 48, 51, 58, e 60 (LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3, e LC-FR4, respectivamente).

[00105] Em uma concretização, um anticorpo de anti-Siglec-8 com-preende uma domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hipervariáveis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências de the HC-FR1-HC-FR4 SEQ ID NOs: 26-29 (HC-FR1), SEQ ID NOs: 31-36 (HC-FR2), SEQ ID NOs: 38-43 (HC-FR3), e SEQ ID NOs: 45 ou 46 (HC-FR4), respectivamente; a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Em uma concretização, um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende uma domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hipervariáveis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências da HC-FR1-HC-FR4 SEQ ID NOs: 26-29 (HC-FR1), SEQ ID NOs: 31-36 (HC-FR2), SEQ ID NOs: 38-43 (HC-FR3), e SEQ ID NOs: 45 ou 46 (HC-FR4), respectivamente; a HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; a HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; e a HVR-H3 compreende uma sequência de aminoá- cidos selecionada de SEQ ID NOs: 67-70. Em uma concretização, um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hipervariá- veis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências de LC-FR1-LC-FR4 de SEQ ID NOs: 48 ou 49 (LC-FR1), SEQ ID NOs: 51-53 (LC-FR2), SEQ ID NOs: 55-58 (LC-FR3), e SEQ ID NO: 60 (LC- FR4), respectivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 64; a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em uma concretização, um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de estrutura e regiões hiper- variáveis, em que a sequência de estrutura compreende as sequências de the LC-FR1-LC-FR4 de SEQ ID NOs: 48 ou 49 (LC-FR1), SEQ ID NOs: 51-53 (LC-FR2), SEQ ID NOs: 55-58 (LC-FR3), e SEQ ID NO: 60 (LC-FR4), respectivamente; a HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; a HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; e a HVR-L3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em uma concretização desses anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2-10 e o domínio variável de cadeia leve compreende e sequência de aminoá- cidos selecionada de SEQ ID NOs: 16-22. Em uma concretização desses anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2-10 e o domínio variável de cadeia leve compreende e sequência de aminoáci- dos selecionada de SEQ ID NOs: 23 ou 24. Em uma concretização desses anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e o domínio variável de cadeia leve compreende e sequência de amino- ácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16-22. Em uma concretização desses anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e o domínio variável de cadeia leve compreende e sequência de amino- ácidos selecionada de SEQ ID NOs: 23 ou 24. Em uma concretização desses anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e o domínio variável de cadeia leve compreende e sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em uma concretização desses anticorpos, o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e o domínio variável de cadeia leve compreende e sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00106] Em algumas concretizações, as sequências de HVR de cadeia pesada compreendem as seguintes: a) HVR-H1 (IYGAH (SEQ ID NO: 61)); b) HVR-H2 (VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID NO: 62)); e c) HVR-H3 (DGSSPYYYSMEY (SEQ ID NO: 63); DGSSPYYYGMEY (SEQ ID NO:67); DGSSPYYYSMDY (SEQ ID NO: 68); DGSSPYYYSMEV (SEQ ID NO: 69); ou GSSPYYYGMDV (SEQ ID NO: 70)).

[00107] Em algumas concretizações, as sequências de HVR de cadeia pesada compreendem as seguintes: a) HVR-H1 (SYAMS (SEQ ID NO: 88); DYYMY (SEQ ID NO: 89); ou SSWMN (SEQ ID NO: 90)); b) HVR-H2 (IISSGGSYTYYSDSVKG (SEQ ID NO: 91); RIAPEDGDTEYAPKFQG (SEQ ID NO: 92); ou QIYPGDDYTNYNGKFKG (SEQ ID NO: 93)); e c) HVR-H3 (HETAQAAWFAY (SEQ ID NO: 94); EGNYYGSSILDY (SEQ ID NO:95); ou LGPYGPFAD (SEQ ID NO: 96)).

[00108] Em algumas concretizações, as sequências de FR de cadeia pesada compreendem as seguintes: a) HC-FR1 (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLT (SEQ ID NO: 26); EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLT (SEQ ID NO: 27); QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS (SEQ ID NO: 28); ou QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLT (SEQ ID NO: 29)); b) HC-FR2 (WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 31); WVRQAPGKGLEWLG (SEQ ID NO:32); WVRQAPGKGLEWLS (SEQ ID NO: 33); WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID NO:34); WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 35); ou WVRQPPGKGLEWLG (SEQ ID NO:36)); c) HC-FR3 (RFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 38); RLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 39); RLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 40); RFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 41); RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 42); ou RLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 43)); e d) HC-FR4 (WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 45); ou WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:46)).

[00109] Em algumas concretizações, as sequências de HVR de cadeia leve compreendendo as seguintes: a) HVR-L1 (SATSSVSYMH (SEQ ID NO: 64)); b) HVR-L2 (STSNLAS (SEQ ID NO: 65)); e c) HVR-L3 (QQRSSYPFT (SEQ ID NO: 66); ou QQRSSYPYT (SEQ ID NO: 71)).

[00110] Em algumas concretizações, as sequências de HVR de cadeia leve compreendendo as seguintes: a) HVR-L1 (SASSSVSYMH (SEQ ID NO: 97); RASQDITNYLN (SEQ ID NO: 98); ou SASSSVSYMY (SEQ ID NO: 99)); b) HVR-L2 (DTSKLAY (SEQ ID NO: 100); FTSRLHS (SEQ ID NO: 101); ou DTSSLAS (SEQ ID NO: 102)); e c) HVR-L3 (QQWSSNPPT (SEQ ID NO: 103); QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 104); ou QQWNSDPYT (SEQ ID NO: 105)).

[00111] Em algumas concretizações, as sequências de FR de cadeia leve compreendendo as seguintes: a) LC-FR1 (EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 48); ou EIILTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 49)); b) LC-FR2 (WFQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 51); WFQQKPGQAPRLWIY (SEQ ID NO:52); ou WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 53)); c) LC-FR3 (GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 55); GVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 56); GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 57); ou GIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 58)); e d) LC-FR4 (FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 60)).

[00112] Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 (por exemplo, um anti-Siglec-8 humanizado), anticorpo que especificamente se liga a Siglec-8 de ser humano, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que o anticorpo compreende: (a) domínio variável de cadeia pesada compreendendo: (1) uma HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos sele-cionada de SEQ ID NOs: 26-29; (2) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (3) uma HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos sele-cionada de SEQ ID NOs: 31-36; (4) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (5) uma HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos sele-cionada de SEQ ID NOs: 38-43; (6) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e (7) uma HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos sele-cionada de SEQ ID NOs: 45-46, e/ou (b) um domínio variável de cadeia leve compreendendo: (1) an LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 48-49; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (3) uma LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos sele-cionada de SEQ ID NOs: 51-53; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; (5) uma LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos sele-cionada de SEQ ID NOs: 55-58; (6) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; e (7) uma LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.

[00113] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec- 8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NOs: 2-10 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NOs: 16-22. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma domíniovariável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NOs: 2-10 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NO: 23 ou 24. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NOs: 16-22. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NOs: 11-14 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NO: 23 ou 24. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 6 e/ou compreendendo um domínio va-riável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NO: 16 ou 21.

[00114] Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec- 8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NOs: 106-108 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado de SEQ ID NOs: 109-111. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 106 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 109. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 107 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 110. Em um aspecto, provido aqui é um anticorpo de anti- Siglec-8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 108 e/ou compreendendo um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 111.

[00115] Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2-14. Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoáci- dos selecionada de SEQ ID NOs: 106-108. Em algumas concretizações, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições, inserções ou deleções em relação à se- quência de referência, mas um anticorpo compreendendo aquela se-quência de aminoácidos retém a capacidade de ser ligar a Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, as substituições, inserções ou deleções (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos) ocorrem nas regiões do lado de fora nas HVRs (isto é, nas FRs). Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 106-108.

[00116] Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16-24. Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109-111. Em algumas concretizações, uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência contém substituições, inserções ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo compreendendo que sequência de ami- noácidos retém a capacidade de ser ligar a Siglec-8 de ser humano. Em algumas concretizações, as substituições, inserções ou deleções (por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos) ocorrem nas regiões do lado de fora das HVRs (isto é, in the FRs). Em algumas concretiza- ções, um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 ou 21. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 109-111.

[00117] Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia pesada como mostrado na FIGURA 1 ou na FIGURA 3.

[00118] Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreende um domínio variável de cadeia leve como mostrado na FIGURA 2 ou na FIGURA 3.

[00119] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo de anti- Siglec-8 compreendendo (a) uma, duas ou três HVRs de VH selecionadas daquelas mostradas na FIGURA 1 ou na FIGURA 3 e/ou (b) uma, duas ou três HVRs de VL selecionadas daquelas mostradas na FIGURA 2 ou na FIGURA 3. Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada selecinado daquele mostrado na FIGURA 1 ou na FIGURA 3 e um domínio variável de cadeia leve selecionado daqueles mostrados na FIGURA 2 ou na FIGURA 3.

[00120] Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e/ou um domínio variável de cadeia leve de um anticorpo shown na tabela 3, por exemplo, anticorpo de HAKA, anticorpo de HAKB, anticorpo de HAKC, etc.

[00121] Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas α, δ, ε, Y e μ, respectivamente. As classes y e α são ulteriormente divididos em subclasses, por exemplo, seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Anticorpos de IgG1 podem exisitir em múltiplas variantes polimórficas chamados alótipos (reviewed in Jefferis e Lefranc 2009. mAbs Vol 1 Issue 4 1-7) qualquer um dos quais são adequados para o uso em algumas das concretizações aqui. Variantes alotípicas comuns em populações humanas são aquelas designadas pelas letras a,f,n,z ou suas combinações. Em qualquer uma das concretizações aqui, o anticorpo pode compreender uma região de Fc de cadeia pesada compreendendo uma região de Fc de IgG de ser humano. Em outras concretizações, a região de Fc de IgG de ser humano compreende uma IgG1 ou IgG4 de ser humano. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice de EU como em Kabat. Em algumas concretizações, a IgG1 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. Em algumas concretizações, a IgG4 de ser humano compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 79.

[00122] Em algumas concretizações, provido aqui é um anticorpo de anti-Siglec-8 compreendendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 76 ou 77. Em algumas concretizações, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada compreendendo a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 87; e/ou uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 esgota mastócitos e inibe ativação de mastócito. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 esgota eosinófilos ativados e inibe ativação de mastócito.

1. Afinidade de Anticorpo

[00123] Em alguns aspectos, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui se liga a Siglec-8 de ser humano com cerca da mesma ou mais alta afinidade e/ou avidez mais alta quando comparada anticorpo de camundongo 2E2 e/ou anticorpo de camundongo 2C4. Em certas con-cretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 provido aqui tem uma cons-tante de dissociação (Kd) de < 1 μM, < 150 nM, < 100 nM, < 50 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui se liga a Siglec-8 de ser humano a cerca de 1,5 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 6 vezes, cerca de 7 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 9 vezes ou cerca de 10 vezes de afinidade mais alta do que anticorpo de camundongo 2E2 e/ou anticorpo de camundongo 2C4. Em algumas concretizações aqui, o anticorpo de anti-Siglec-8 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 ou 21.

[00124] Em uma concretização, a afinidade de ligação do anticorpo de anti-Siglec-8 pode be determinad por um ensaio de ressonância de plasmônio de superfície. Por exemplo, o valor de Kd ou Kd pode ser medido por uso de um BIAcore™-2000 ou a BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25° C com lascas de CM5 d e antígeno imobi-lizadas a ~10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensor de dextrano carboximetiladas (CM5, BIAcore® Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N‘-(3-dimetilaminopropyl)- carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções de fornecedores. Anticorpos de captura (por exemplo, anti- humano-Fc) são diluídos com acetato de sódio a 10 mM, pH 4,8, antes da injeção a uma taxa de fluxo de 30 μl/minuto e ulteriormente imobilizada com um anticorpo de anti-Siglec-8. Para medições cinéticas, diluições em série duas vezes de Siglec-8 dimérico são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25° C a uma taxa de fluxo de cerca de 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas usando-se um modelo de ligação de Langmuir um para um simples (BIAcore® Evaluation Software versão 3.2) por ajuste simultâneo dos sensogramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão de koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y., e outros, (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881.

[00125] Em uma outra concretização, interferometria de biocamada pode ser usada para determinar a afinidade de anticorpos de anti- Siglec-8 contra Siglec-8. Em um ensaio exemplar, proteína etiquetada com Siglec-8-Fc é imobilizada sobre sensores de captura de anti- humanos, e incubada com concentrações crescentes de fragmentos de Fab de anti-Siglec-8 de camundongo, quiméricos ou humanizados para se obter medições por afinidade usando-se como um instrumento tal como, por exemplo, the Octet Red 384 System (ForteBio).

[00126] A afinidade de ligação do anticorpo de anti-Siglec-8 pode, por exemplo, também ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson e outros, Anal. Biochem., 107:220 (1980) usando-se técnicas padrão bem conhecidas na técnica relevante. Vide também Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1947).

2. Avidez de anticorpo

[00127] Em uma concretização, a avidez de ligação do anticorpo de anti-Siglec-8 pode ser determinada por um ensaio de ressonância de plasmônio de superfície. Por exemplo, o valor de Kd ou Kd pode ser medido por uso de um BIAcore T100. Anticorpos de captura (por exemplo, cabra-anti-humano-Fc e cabra-anti-camundongo-Fc) são imobilizados em uma lasca de CM5. Células de fluxo podem ser imobilizadas com anticorpos com anticorpos de anti-humano ou com anticorpos de anti-camundongo. O ensaio é conduzido em uma certa tem- peratura e taxa de fluxo, por exemplo, a 25oC a uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Siglec-8 dimérico é diluído no tampão de ensaio em várias concentrações, por exemplo, a uma concentração que varia de 15 nM a 1,88 pM. Anticorpos são capturados e injeções de alto desempenho são conduzidos, seguido por dissociações. Células de fluxo são regenerados com um tampão, por exemplo, glicina a 50 mM pH 1,5. Resultados são em brancos com uma célula de referência vazia e múltiplas injeções de tampão de ensaio, e são analisados com 1:1 parâmetros de ajuste globais.

3. Ensaios de competição

[00128] Ensaios de competição podem ser usados para determinar se dois anticorpos ligarem o mesmo epítopo por reconhecimento de epítopos idênticos ou estericamente de sobreposição ou um anticorpo competitivamente inibe ligação de um outro anticorpo ao antígeno. Esses ensaios são conhecidos na técnica. Tipicamente, antígeno ou an- tígeno que expressam células é imobilizado em uma placa de múltiplas cavidades e a capacidade de anticorpos não marcados de bloquear a ligação de anticorpos marcados é medido. Rótulos comuns para tais ensaios de competição são rótulos radiativos ou rótulos de enzima. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui compete com um anticorpo de 2E2 descrito aqui, para a ligação ao epítopo presente sobre a superfície de célula de uma célula (por exemplo, um eosinófilo). Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui compete com um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, para a ligação ao epítopo presente sobre a superfície de célula de uma célula (por exemplo, um eosinófilo). Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui compete com um anticorpo de 2C4 descrito aqui, para a ligação ao epítopo present sobre a superfície de célula de uma célula (por exemplo, um eosinófilo). Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui compete com um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (como encontrada na pat. U.S. no. 8.207.305), e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (como encontrada na pat. U.S. no. 8.207.305), para a ligação a ao epítopo present sobre a superfície de célula de uma célula (por exemplo, um eosinófilo).

4. Estabilidade térmica

[00129] Em alguns aspectos, um anti-Siglec-8 descrito aqui tem uma temperatura de fusão (Tm) de pelo menos cerca de 70°C, pelo menos cerca de 71°C, ou pelo menos cerca de 72°C em um ensaio de deslocamento térmico. Em um ensaio de deslocamento térmico exemplar, amostras compreendendo um anticorpo de anti-Siglec-8 humanizadosão incubadas com um corante fluorescente (Sypro Orange) para 71 ciclos com aumento de 1°C p por ciclo em um cicl ador térmico de qPCR para determinar a Tm. Em algumas concretizações aqui, o anticorpo de anti-Siglec-8 tem uma Tm similar ou mais alta em comparação com anticorpo de 2E1 de camundongo e/ou anticorpo de 2C4 de camundongo. Em algumas concretizações aqui, o anticorpo de anti- Siglec-8 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e/ou uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoá- cidos selecionada de SEQ ID NOs: 16 ou 21. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 tem uma Tm igual ou mais alta em comparação com um anticorpo de 2C4 quimérico. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 tem um Tm igual ou mais alta em comparação com um anticorpo tendo uma cadeia pesada compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.

5. Ensaios de atividade biológicas

[00130] Em alguns aspectos, um anti-Siglec-8 descrito aqui induz apoptose de eosinófilos. Em alguns outros aspectos, um anti-Siglec-8 descrito aqui esgota mastócitos. Ensaios para a avaliação de apoptose das células são bem conhecidos na técnica, por exemplo, mencha- mento com Annexina V e o ensaio de TUNNEL. Em um ensaio de apoptose de célula exemplar, revestimento da cor de couro fresco oriundo de uma amostra de sangue é ressuspenso em meio e laminadas em uma placa de fundo em U de 96 cavidades. Uma série de diluições em série de 5 vezes de anticorpo de anti-Siglec-8 é adicionado a cada cavidade e a placa é incubada a 37°C a 5% de CO2 po r mais do que quatro horas. As células são fixadas com paraformaldeído diluídas em PBS e manchadas com conjugated anticorpos specific para eosinófilos para a detecção usando-se a microscope. A população de eosinófilos nos leucócitos de sangue periférico totais é avaliada quando o revestimento da cor do couro é incubado na presença do anticorpo de anti- Siglec-8 em comparação com quando o revestimento da cor do couro não é incubado na presença do anticorpo de anti-Siglec-8. Em um outro ensaio exemplar, eosinófilos purificados a partir de uma amostra de sangue (por exemplo, kito de isolamento eosinófilo Miltenyi) são res- suspensos em meio e são cultivados na presença ou na ausência de IL-5 de um dia para o outro. Os eosinófilos cultivados são subsequentemente coletados por centrifugação, são ressuspensos em media, e são laminados em uma placa de fundo em U de 96 cavidades. Uma serie de diluições em série 5 vezes de anticorpo de anti-Siglec-8 é adicionada a cada cavidade e a placa é incubada a 37°C a 5% de CO2 por mais do que quatro horas. As células são fixadas e são manchadas comh Annexina-V usando-se técnicas padrão bem conhecidas na técnica o número de eosinófilos é detectado usando-se um microscópio. A população de eosinófilos na amostra é avaliada quando as células purificadas são incubadas na presença do anticorpo de anti-Siglec- 8 em comparação com quando as células purificadas não são incubadas na presença do anticorpo de anti-Siglec-8.

[00131] Em alguns aspectos, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui induz atividade de ADCC. Em alguns outros aspectos, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui mata mastócitos que expressam Si- glec-8 por atividade de ADCC. Em algumas concretizações, a composição compreende anticorpos de anti-Siglec-8 não fucosilados (isto é, afucosilados). Em algumas concretizações, a composição compreen-dendo anticorpos de anti-Siglec-8 não fucosilados descritos aqui melhora atividade de ADCC em comparação com a composição compreendendo anticorpos de anti-Siglec-8 parcialmente fucosilados. Ensaios para a avaliação de atividade de ADCC são bem conhecidos na técnica e descrito aqui. Em um ensaio exemplar, para medir atividade de ADCC, células efetoras e células alvo são usadas. Exemplos de células efetoras incluem células matadoras (NK) naturais, linfócitos granulares grandes (LGL), células assassinas ativadas por linfocina (LAK) e PBMC compreendendo NK e LGL, ou leucócitos tendo receptores de Fc sobre a superfície de células, tais como neutrófilos, eosinófilos e macrófagos. A célula alvo é qualquer célula que, sobre a superfície de célula, ex-pressaantígenos que anticorpos a serem avaliados podem reconhecer. Um Exemplo de tal célula alvo é um eosinófilo que expressa Siglec-8 sobre a superfície de célula. Um outro Exemplo de tal célula alvo é um mastócito que expressa Siglec-8 sobre a superfície de célula. Células alvo são marcadas com um reagente que permite detecção de citotose. Exemplos de reagentes para a marcação incluem uma substância rádio- ativa tal como cromato de sódio (Na2 51CrO4). Vide, por exemplo, Immu-nology, 14, 181 (1968); J. Immunol. Métodos, 172, 227 (1994); e J. Immunol. Métodos, 184, 29 (1995).

[00132] Em alguns aspectos, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui inibe atividade mediadas por mastócito. Triptase de mastócito foi usado como um biomarcador para uma ativação e número de mastóci- to. Por exemplo, triptase total e ativa bem como histamina, N-metil his- tamina, e 11-beta-prostaglandina F2 podem ser medidas no sangue ou na urina para avaliar a redução em mastócitos. Vide, por exemplo, Publicação de pedido de patente No. US 20110293631 para um ensaio de atividade de mastócito exemplar. Ensaios descritos na Exemplo 2 aqui podem também ser usados para avaliar ADCC e atividade apoptótica de anticorpos de anti-Siglec-8 nos mastócitos.

6. Ensaios de ligação de proteína de fusão

[00133] Ensaios de ligação com proteínas de fusão podem ser usados para determinar o epítopo reconhecido por um anticorpo. Ensaios usando-se proteínas de fusão para o mapeamento de epí- topo são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo uma porção de uma proteína de Siglec-8 fundida a um Ig-Fc de ser humano é imobilizada em uma placa de múltiplas cavidades e a capacidade de anticorpos de ligar à proteína de fuão é medida. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti- Siglec-8 descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115. Em algumasconcretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 116. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui se liga a uma pro-teína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 117. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui se liga a uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 118.

III. Preparação de anticorpo

[00134] O anticorpo descrito aqui é preparado usando-se técnicas disponíveis na técnica para a geração de anticorpos, cujos métodos exemplares são descritos em mais detalhes nas seguintes seções.

1. Fragmentos de anticorpo

[00135] A presente invenção inclui fragmentos de anticorpo. Fragmentos de anticorpo podem ser gerados por meio tradicional, tais como digestão enzimática ou por técnicas recombinantes. Em certas circunstâncias há vantagens de uso de fragmentos de anticorpo, ao invés de anticorpos inteiros. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, vide Hudson e outros (2003) Nat. Med. 9:129-134.

[00136] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção dos fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto e outros, Journal of Biochemical e Biophysical Mé-todos 24:107-117 (1992); e Brennan e outros, Science, 229:81 (1985)). No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo de Fab, Fv e ScFv podem todos serem expressos em e secretados a partir de E. coli, assim permitindo a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab’-SH pode ser diretamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos de F(ab‘)2 (Carter e outros, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab‘)2 podem ser isoladas diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de Fab e F(ab‘)2 com semi-vida aumentada in vivo compreendendo resíduos de epítpo de ligação de receptor de salvamento são descritos na pat. U.S. no. 5.869.046. Outras técnicas para a produção dos fragmentos de anti- corpo estarão evidentes pelo praticante versado. Em certas concretiza-ções, um anticorpo é um fragmento de Fv de cadeia simples (scFv). Vide WO 93/16185; as pats. U.S. Nos. 5.571.894; e 5.587.458. Fv e scFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são des-tituídos de regiões constantes; assim, eles podem ser adequados para a ligação não específica reduzida durante o uso in vivo. Proteínas de fusão de scFv podem ser construídas para fornecer fusão de uma proteína efetora em qalquer o amino o carbóxi terminal de um scFv. Vide An- ticorpoEngineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na pat. U.S. no. 5.641.870, por exemplo. Tais anticorpos lineares podem ser monoespecífico ou biespecífico.

2. Anticorpos humanizados

[00137] A invenção inclui anticorpos humanizados. Vários métodos para a humanização de anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos para dentro dele oriundo de uma fonte que é não humano. Estes resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente chamados de resíduos de "importação", que são tipicamente tirados de um domínio variável de "importação". Humanizaçãopode ser essencialmente realizada após o método de Winter (Jones e outros (1986) Nature 321:522-525; Riechmann e outros (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen e outros (1988) Science 239:1534-1536), por substituição de sequências de região hipervariáveis para as sequências correspondentes de um anticorpo de ser humano. Correspondentemente, tais anticorpos "humanizados"são anticorpos quiméricos (a pat. U.S. No. 4.816.567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de região hi- pervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituído por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.

[00138] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve quanto pesado, a ser usada na formação dos anticorpos humanizados podem ser importantes para reduzir antigenicidade. De acordo com o método "melhor ajustado" assim chamado, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor (por exemplo, camundongo) é triado contra a biblioteca total de sequências de domínio variável de ser humano. A se-quência humana que é masi próxima àquela do roedor é entã aceita como a estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims e outros (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia e outros (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Um outro método usa uma estrutura particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para várias diferentes anticorpos humanizados (Carter e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta e outros (1993) J. Immunol., 151:2623.

[00139] É ulteriormente em geral desejável que anticorpos serem humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para conseguir esse objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando-se modeloos tridimensionais das se-quências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridi-mensionaisestão comericalmente disponíveis e são familiares àqueles, versados na técnica. Programas de computador estão disponíveis que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobolinas de candidato selecionadas. Inspeção dessas exibições permite análise de papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulinas de candida- to, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade sequências de importação da iimunoglobulina de candidato para ligar seu an- tígeno. Desse modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e de modo que a característica de anticorpo desejada, tais como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo, é conseguida. Em geral, os resíduos de região hipervariáveis são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência de ligação de antígeno.

3. Anticorpos humanos

[00140] Anticorpos humanos de anti-Siglec-8 da inveção podem ser formados por combinação de sequência(s) variável(éis) de domínio de clone de Fv selecionada de bibliotecas de exibição de fato derivadas de ser humano com sequência(s) de domíno constante de ser humano conhecido(s). Alternativamente, anticorpos de anti-Siglec-8 monoclo- nais de ser humano da inveção podem ser formados pelo método de hibridoma. Linhas de células de heteromieloma de camundongo- humano e mieloma de ser humano para a produção de anticorpos humanos monoclonais foram descritos, por exemplo, por Kozbor J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur e outros, Monoclonal Produção de anticorpo Techniques, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); e Boerner e outros, J. Immunol., 147: 86 (1991).

[00141] É possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, de imunização, de produção de um repertório total de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene de região de união de cadeia pesada de anticorpo (JH) em camundongos mutantes de linha de germe e quiméricos resulta na inibiçãoa complet de produção de anticorpo endógeno. Transferência do conjunto de genes de imunoglobulina de linha de germe de ser humano em tais camundongos mutantes de linha de germe resul- tarão na produção de anticorpos humanos no desafio de antígeno. Vide, por exemplo, Jakobovits e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits e outros, Nature, 362: 255 (1993); Brugger- mann e outros, Year in Immunol., 7: 33 (1993).

[00142] Embaralhamento de genes pode também ser usado para derivar anticorpos humanosde anticorpos não humanos (por exemplo, roedores), onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo de não humano de partida. De acordo com este método, que é também chamada de "impressão de epítopo", região variável ou de cadeia pesada ou cadeia leve de um fragmento de anticorpo de não humano obtido por técnicas de exibição de fago como descrito aqui é trocado por um repertório de genes de domíno V de ser humano, criando uma população de químeros de scFv ou Fab de cadeianão humana/cadeia humana. Seleção com anígeno resulta no isolamento de um scFv ou Fab quimérico de cadeia não huma- na/cadeia humana em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação de antígeno destruído na remoção do não humano correspondente no clone de exibição de fago primário, isto é, o epítopo governa a escolha de par da cadeia humana. Quando o processo é repetido a fim de substituir cadeia não humana restante, um anticorpo de ser humano é obtido (vide PCT WO 93/06213 publicada em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradidicional de anticorpos não humanos por enxerto de CDR, esta técnica provê anticorpos totalmente humanos, que têm resíduos de FR ou de CDR de origem não humana.

4. Anticorpos biespecíficos

[00143] Anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois diferentes antí- genos. Em certas concretizações, anticorpos biespecíficos são anticorpos humanizados ou de ser humano. Em certas concretizações, uma das especificidades de ligação é para Siglec-8 e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas concretizações, anticorpos biespe- cíficos podem ser ligar a dois diferentes epítopos de Siglec-8. Anticor-posbiespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam Siglec-8. Anticorpos biespecí- ficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos de F(ab‘)2 biespecí- ficos).

[00144] Métodos para a formação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Vide Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983), WO 93/08829 publicada em 13 de maiio de 1993, e Traunecker e outros, EMBO J., 10: 3655 (1991). Para outros detalhes de geração de anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh e outros, Métodos in Enzymology, 121:210 (1986). Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugado". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, ou outra a biotina. Anticorpos de heteroconjugado podem formar o uso de método de reticulação conveniente. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são descritos na pat. U.S. no. 4,676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

5. Anticorpos de Domínio Simples

[00145] Em algumas concretizações, um anticorpo da inveção é um anticorpo de domínio simples. Um anticorpo de domínio simples é uma cadeia de polipeptídeo simples compreendendo a totalidade ou uma porção de domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas concretizações, um anticorpo de domínio simples é um anticorpo de domínio simples de ser humano (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; vide, por exemplo, a pat. U.S. No. 6.248.516 B1). Em uma concretização, um anticorpo de domínio simples consiste da totalidade ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo.

6. Variantes de anticorpo

[00146] Em algumas concretizações, modificação(ões) de sequência de aminoácidos do anticorpos descrito aqui são contempladaa. Por exemplo, pode ser desejável aperfeiçoar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo podem ser preparados por introdução de mudanças apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções para dentro de e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição pode ser feito para chegar no construto final, com a condição de que o construto final possua as características desejadas. As alterações de aminoáci- dos podem ser introduzidas na presente sequência de aminoácidos de anticorpo na hora que a sequência é feita.

[00147] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferidadas para mutagê- nese é chamada "mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aqui, um resíduo ou um grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e trocados por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, ala- nina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antí- geno. Aquelas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições então são refinadas por introdução ulterior ou outras variantes a, ou para, os sítios de substituição. Assim, enquanto o sítio para a introdução de uma variação de sequência de aminoácidos é predeterminada, a natureza da mutação per se não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação de um dado sítio, mutagênese aleatória ou de varre- dura de ala é conduzido no códon alvo ou região e as imunoglobulinas expressas são triadas quanto a atividade desejada.

[00148] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de amino- e/ou carboxil-terminais que variam no comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo uma centena ou mais resíduos, bem como inserções de intrasequência de resíduos de aminoácidos múltiplos ou únicos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de insercio- nais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo a uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a semi-vida de soro do anticorpo.

[00149] Em certas concretizações, um anticorpo da inveção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão ao qual o anticorpo é glico- silado. Glicosidação de polipeptídeos é tipicamente ou N-ligados ou O- ligados. N-ligado refere-se à ligação de uma porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptí- deoss asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qual-queraminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção do carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicolisação poten-cial.Gligolisação de O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5- hidroxilisina possa também ser usada.

[00150] Adição ou deleção of sítos de glicosilação ao anticorpo é covenientemente realizada por alteração daa sequência de aminoáci- dos tal que uma ou mais sequências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicolisação N-ligados) é criada ou é removida. A alteração pode também ser feita pela adição, deleção, ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicolisação O-ligados).

[00151] Onde o anticorpo compreende uma região de Fc, o carboidrato ligado ao mesmo pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato madura que carece de fucose ligada a uma região de Fc do anticorpo são descritos no pedido de patente US No US 2003/0157108 (Presta, L.). Vide também US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Anticorpos com uma bisseção de N- acetilglucosamina (GlcNAc) no carboidrato ligada a uma região de Fc do anticorpo são reportados na WO 2003/011878, Jean-Mairet e outros e a pat. U.S. No. 6.602.684. Umana e outros. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado a uma região de Fc do anticorpo são relatados na WO 1997/30087, Patel e outros Vide, também, WO 1998/58964 (Raju, S.) e WO 1999/22764 (Raju, S.) referência a anticorpos com carboidrato alterado ligado à sua região de Fc. Vide também US 2005/0123546 (Umana e outros) em moléculas de ligação de antígeno com glicolisação modificada.

[00152] Em certas concretizações, uma variante de glicolisação compreende uma região de Fc, em que uma estrutura de carboidrato ligada à região de Fc carece de fucose ou tem fucose reduzida. Tais variantes apefeiçoaram função de ADCC. Opccionalmente, a região de Fc ulteriormente compreende uma ou mais substituições de aminoáci- dos ali que ulteriormente aperfeiçoam ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 de uma região de Fc (numeração de Eu de resíduos). Exemplos de publicações relacionados com anti-corpos"desfucosilados" ou "deficiente de fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki e outros J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki e outros Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhas de células que produzem anticorpos desfucosilados incluem células d Lec13 CHO deficientes na fucosilação de proteín (Ripka e outros Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams e outros, especialmente no Exemplo 11), e linhas de células de inativação, tais como gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células de CHO de ina- tivação (Yamane-Ohnuki e outros Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)), e células que ultra-expressam β1,4-N-acetilglicosminiltransferase III (GnT- III) e Golgi μ-manosidase II (Manll).

[00153] Anticorpos são contemplados aqui que reduziam fucose em relação à quantidade de fucose no mesmo anticorpo produzido em uma célula de CHO de tipo selvagem. Por exemplo, o anticorpo tem uma quantidade menor de fucose do que de outra maneira teria se produzido por células de CHO nativas (por exemplo, uma célula de CHO que produz um padrão de glicosilação nativo, tal como, uma célula de CHO contendo um gene de FUT8 nativo). Em certas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 provido aqui é um em que menos do que cerca de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% dos glica- nos N-ligados thereon compreendem fucose. Em certas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 provido aqui é um em que nenhum dos glicanos N-ligados no mesmo compreendem fucose, isto é, em que o anticorpo esta totalmente sem fucose, ou não tem nenhuma fucose ou é não fucosilada ou é afucosilada. A quantidade de fucose pode ser determinada por cálculo da quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar a Asn297, em relação à soma de todas as gli- coestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas de manose complexa, híbrida e alta) como medidas por espectrometria de massa de MALDI-TOF, como descrito na WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizadoa cerca de posição 297 na região de Fc (numeração de Eu da região de resíduos de Fc); no entanto, Asn297 pode também ser localizado cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre posições 294 e 300, devido a variações de sequência menores nos anticorpos. Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada.

[00154] Em uma concretização, o anticorpo é alterado para aperfeiçoar sua semi-vida de soro. Para aumentar a semi-vida de soro, pode- se incorporar um epítopo de ligação de receptor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na pat. U.S. no. 5.739.277, por exemplo. Como usado aqui, o termo "epí- topo de ligação de receptor de salvamento" refere-se a um epítopo de uma região de Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável por aumento da semi-vida de soro in vivo da molécula de IgG (US 2003/0190311, a pat. U.S. No. 6.821.505; a pat. U.S. No. 6.165.745; a pat. U.S. No. 5.624.821; a pat. U.S. No. 5.648.260; a pat. U.S. No. 6.165.745; a pat. U.S. No. 5.834.597).

[00155] Um outro tipo é uma variante de uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo trocado por um resíduo diferente.Sítios de interesse para a mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR são também contempla-das.Substituições conservadoras são mostradas na tabela 1 sob o aquecimento de "substituições preferidas." Se tais substituições resul-tarem em uma mudança desejável na atividade biológica, então mais mudanças substanciais, "substituições exemplares" denominadas na tabela 1, ou como ulteriormente descritos abaixo na referência a classes de aminos ácidos, podem ser introduzidas e os produtos triados. Tabela 1.

[00156] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas por seleção de substituições que diferem sig nificativamente em seu efeito na manutenção (a) a estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação helicoidal ou folha, (b) a carga ou hidrofobocidade da molécula no sítio alvo, ou c) o volume da cadeia lateral. Aminoáci- dos podem ser agrupados de acordo com similarities nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., págs. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

[00157] (1) não polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

[00158] (2) polar não carregado: Gli (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

[00159] (3) ácido: Asp (D), Glu (E)

[00160] (4) básico: Lys (K), Arg (R), His (H)

[00161] Alternativamente, resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades de cadeia lateral co-muns:

[00162] (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

[00163] (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

[00164] (3) ácido: Asp, Glu;

[00165] (4) básico: His, Lys, Arg;

[00166] (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gli, Pro;

[00167] (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[00168] Substituições não conservadoras vincularão troca de um membro de uma dessas classes para uma outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos para dentro dos sítios de substituição conservadores ou, para dentro dos sítios restantes (não conservados).

[00169] Um do tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos de região hipervariáveis de um anticorpo de origem (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Em geral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para outro desenvol-vimentoserá(ão) modificada(s) (por exemplo, aperfeiçoada(s)) propri-edadesbiológicas em relação ao anticorpo de origem a partir do qual eles são gerados. Um meio conveniente para a geração de tais variantes substitucionais envolve afinidade maturation usando-se exibição de fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervariáveis (por exemplo, sítios de 6-7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada sítio. Os anticorpos assim ge nerated são exibidos a partir de partículas de fago filamentosas com fusão a pelo menos parte de uma proteína de revestimento de fago (por exemplo, o produto de gene III de M13) embalada dentro de cada partícula. As variantes exibidas por fago são então triadas quanto a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). A fim de identificar sítios de região hipervariáveis de candidato para modificação, mutagênese de varredura (por exemplo, varredura de alanina) podem realizar para identificar resíduos de região hipervariáveis que contribuem significativamente para ligação de antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antígeno - anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com técnicas conhecidas na técnica, incluindo aquelas elaboradas aqui. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a triagem usando-se técnicas conhecidas na técnica, incluindo aquelas descritas aqui, e anticorpos com propriedades superiores em uma ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para outros desenvolvimentos.

[00170] Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes de se-quência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métdos incluem, mas não são limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese de PCR, e mutagênese de pacote de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não variante do anticorpo.

[00171] Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácidos em uma região de Fc de anticorpos da inveção, desse modo gerando uma variante de região de Fc. A variante de região de Fc pode compreender uma sequência de região de Fc de ser humano (por exemplo, uma região de Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 de ser humano) compreendendo uma modificação de aminoácido (por exemplo, a substituição) em uma ou mais posições de aminoácido incluindo que de cisteína de articulação. Em algumas concretizações, a variante de região de Fc compreende a região de Fc de IgG4 de ser humano. Em uma outra concretização, a região de Fc de IgG4 de ser humano compreende a substituição de aminoácido S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice de EU como em Kabat.

[00172] De acordo com esta descrição e os ensinamentos na técnica,é contemplado que em algumas concretizações, um anticorpo da inveção pode compreender uma ou mais alterações em comparação com o anticorpo correspondente de tipo selvagem, por exemplo, na região de Fc. Esses anticorpos apesar disso reteriam substancialmente as mesmas características exigidas para utilidade terapêutica em comparação com seu correspondente de tipo selvagem. Por exemplo, it is thought that certas alterações podem ser feitas na região de Fc que resultaria em ligação de C1q alterada (isto é, ou melhorada ou diminuída) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), por exemplo, como descrito na WO99/51642. Vide também Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); a pat. U.S. No. 5.648.260; a pat. U.S. No. 5.624.821; e WO94/29351 com relação a outros Exemplos de variantes de região de Fc. WO00/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpo com ligação aperfeiçoada ou diminuída a FcRs. O conteúdo destas publicações são especificamente incorporados aqui por referência. Vide, também, Shields e outros J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com semi-vidas aumentadas e aperfeiçoadas = que se ligam ao receptor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável para a transferência de IgGs maternal para o feto (Guyer e outros, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim e outros, J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos in US2005/0014934A1 (Hinton e outros). Esses anticorpos compreendem uma região de Fc com uma ou mais more substituições ali que aperfeiçoam ligação da região de Fc a FcRn. Variantes de polipeptídeos com alteradas sequências de aminoácidos de região de Fc e capacidade de ligação de C1q aumentada ou diminuída são descritas na pat. U.S. no. 6.194.551B1, WO99/51642. O conteúdo daquelas publicações de patentessão especificamente incorporadas aqui por referência. Vide, também, Idusogie e outros J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

7. Vetores, Células hospedeiras, e Métodos recombinantes

[00173] Para a produção recombinante de um anticorpo da inveção, o ácido nucléico que codifica é isolado e é inserido para dentro de um vetor replicável para outra clonagem (ampliação do DNA) ou para expressão. DNA que codifica o anticorpo é prontamente isolado e é se- quenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, por uso de sondas de oligonucleotide que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor dependen em parte da célula hospedeira a ser usada. Em geral, células hospedeirassão de origem ou procariótica ou eucariótica (em geral mamífero).Será apreciado que regiões constantes de qualquer isótipo podem ser usados para essa finalidade, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, e que tais regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal. Geração de anticorpos usando-se células hospedeiras procarióticas: a) Construção do Vetor

[00174] Sequências de polinucleotídeos que codificam componentes de polipeptídeo do anticorpo da inveção podem ser obtidas usando-setécnicas recombinantes padrão. Sequências de polinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e sequências de células produtoras de anticorpo tais como células de hibridoma. Alternativamente, polinuceo- tídeos podem ser sintetizados usando-se sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, sequências que codificam os polipeptídeos são inseridas para dentro de um vetor recombinante capaz de replicar e que expressam polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que estão disponíveis e são conhecidos na técnica podem ser usados para a finalidade da presente invenção. Seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácidos nucléicos a serem inseridos para dentro do vetor e a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo de sua função (ampliação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambas) e sua compatibilidade com a célula hospedeira particular em que ela reside. Os componentes de vetor em geral incluem, mas não são limitados a: uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação de ribossoma (RBS), uma sequência de sinal, o inserto de ácido nucléico heterólogo e uma sequência de terminação de transcrição.

[00175] Em geral, vetores de plasmídio contendo sequências de controle e replicação que são derivados da espécie compatível com a célula hospedeira são usados em ligação com esses hospedeiros. O vetor normalmente porta um sítio de replicação, bem como sequências de marcação que são capazes de prover seleção fenotípica nas células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformada usando-se pBR322, um plasmídio derivada de uma espécie de E. coli. pBR322 contém ampicilina de codificação de genes (Amp) e resistência de tetraciclina (Tet) e assim provê meio fácil para a identificação de células transformadas. pBR322, seus derivados, ou outros plasmídios microbianos ou bacteriófago e podem também conter, ou ser modifica- dos para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de de-rivados de pBR322 usados de anticorpos particulares são descritos em detalhes em Carter e outros, a pat. U.S. No. 5.648.237.

[00176] Na adição, vetores de fago contendo sequências de controle e replicação que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em ligação com esses hospedeiros. Por exemplo, bacteriófago tal como ÀGEM.TM.-11 pode ser utilizado na formação de um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como E. coli LE392.

[00177] O vetor de expressão da inveção pode compreender dois ou mais pares de promotor-cístron, que codificam cada um dos componentes de polipeptídeo. Um promotor is uma sequência reguladora não traduzida localizada a montante (5‘) em relação a um cístron que modula sua expressão. Promotores procarióticos tipicamente cãem dentro de duas classes, induzíveis e constitutivos. Promotor induzível é um promotor que inicia níveis aumentados da transcrição do cístron sob seu controle em resposta a mudanças na condição de cultura, por exemplo, a presença ou a ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura.

[00178] Uma grande série de promoteres reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. O promotor selecionado pode ser operacionalmente ligado ao DNA de cístron que codifica a cadeia leve ou pesada por remoção do promotor a partir do DNA da fonte via digestão de enzima de restrição e inserção da sequência de promotores isolada para dentro do vetor da inve- ção. Tanto a sequência de promotores nativa quanto muitos promotores heterólogos podem ser usado para dirigir ampliação e/ou expressão dos genes alvo. Em algumas concretizações, promotores heteró- logos são utilizados, como eles em geral permitem maior transcrição e rendimentos mais altos de gene alvo expresso em comparação com o promotor de polipeptídeo alvo nativo.

[00179] Promoteres adequados para uso com hospedeiros procarió- ticos incluem o promotor de PhoA, os sistemas de promotor de lactose e β-galactamase, um sistema de promotor de triptofano (trp) e promo-toreshíbridos tais como o promotor de tac ou o promotor de trc. No entanto, outros promoteres que são funcionais nas bactérias (tais como outros promotores de fago ou bacteriano conhecidos) são também adequados. Suas sequências de nucleotídeos foram publicadas, desse modo permitindo que um trabalhador versado operacionalmente ligá- las aos cístrons que codificam cadeias pesada e leve alvo (Siebenlist e outros (1980) Cell 20: 269) usando-se ligadores ou adaptadores para fornecer quaisquer sítios de restrição necessários.

[00180] Em um aspecto da inveção, cada cístron dentro do vetor recombinante vetor compreende um componente de sequência de sinal de secreção que dirige translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser parte do DNA de polipeptídeo alvo que é inserido para dentro do vetor. A sequência de sinal selecionada para a finalidade desta invenção seria uma que é reconhecida e é processada (isto é clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e não processem as sequências de sinal nativas aos polipeptí- deos heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica sekecuibada, por exemplo, do grupo que consiste da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes de enterotoxina II estável no calor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma concretização da inveção, as sequências de sinal usadas em ambos os cístrons de um sistema de expressão são sequências de sinal de STII ou suas variantes.

[00181] Em um outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira, e portanto não exige a presença de sequências de sinal de secreção qu cada cístron. Naquele aspecto, cadeias pesada e leve de imunoglobulina são expressas, são dobradas e são montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas cepas hospedeiras (por exemplo, as cepas de trxB de E. coli) provêem con-dições de citoplasma que são favoráveis para a formação de ligação de dissulfeto, desse modo permitindo montagem e dobramento adequado de subunidades de proteína expressas. Proba e Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

[00182] Anticorpos da inveção podem também ser produzidos por uso de um sistema de expressão em que a razão quantitativa de componentes de polipeptídeo expressos pode ser modulada a fim de maximizar o rendimento de anticorpos adequadamente montados e se- cretados da inveção. Tal modulação é realizada pelo menos em parte por forças traducionais de modulação simultânea modulating para o componentes de polipeptídeo.

[00183] Uma técnica para a modulação da força traducional é descrita em Simmons e outros, a pat. U.S. No. 5.840.523. Ela utiliza variantes de região de iniciação traducional (TIR) dentro de um cístron. Para uma dada TIR, uma série de variantes de sequências de aminoá- cidos ou de ácidos nucléicos podem ser criadas com uma faixa de forças traducionais, desse modo provendo um meio conveniente pelo qual ajustar esse fator para o nível de expressão desejado da cadeia específica. Variantes de TIR podemm ser geradas por técnicas de mu- tagênese convencionais que resulta nas mudanças de códon que podem alterar a sequência de aminoácidos. Em certas concretizações, mudanças na sequência de nucleotídeos são silenciosas. Alterações na TIR podem incluir por exemplo, alterações no número ou no espa-çamento de sequências de Shine-Dalgarno, juntamente com alterações na sequência de sinal. Um método para a geração de sequências de sinal mutantes é a geração de um "banco de códons"no início de uma sequência de codificação que não muda a sequência de aminoá- cidos da sequência de sinal (isto é, as mudanças são silenciosas). Isso pode ser realizada por mudanã na terceira posição de cada códon; adicionalmente, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina, e argi- nina, têm múltiplas primeira e segunda posições que podem adicionar complexidade na formação do banco. Este método de mutagênese é descrito em detalhes em Yansura e outros (1992) METHODS: A Companion to Métodos in Enzymol. 4:151-158.

[00184] Em uma concretização, um conjunto def vetores é gerado com uma faixa de forças de TIR para cada cístron ali. Este conjunto limitado provê uma comparação de níveis de expressão de cada cadeia in bem como o rendimento dos produtos de anticorpo desejado sob várias combinações de força de TIR. Forças de TIR podem ser determinadas por quantificação de um nível de expressão de um gene repórter como descrito em detalhes em Simmons e outros a pat. U.S. No. 5,840,523. Based on the translational strength comparison, the desired individual TIRs são selecionados para serem combinados no vetor de expressão construtos da invenção.

[00185] Células hospedeiras procarióticas adequadas para a expressão de anticorpos da inveção incluem Archaebacteria e Eubacte- ria, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem espécies de Escherichia (por exemplo, E. coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia mar- cescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ou Paracoccus. Em uma concretização, células gram-negativas são usadas. Em uma concretização, células de E. coli são usadas como hospedeiros para a invenção. Exemplos de cepas de E. coli incluem cepa W3110 (Bachmann, Cellular e Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) e seus derivadosf, incluindo cepa 33D3 tendo genótipo W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR (a pat. U.S. No. 5.639.635). Outras cepas e seus derivados, tais como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli À 1776 (ATCC 31,537) e E. coli RV308 (ATCC 31,608) são também adequadas. Estes Exemplos são ilustrativos ao invés de limitantes. Métodos para a construção de derivados de qualquer uma das bactérias mencionadas acima tendo defined genótipos são conhecidos na técnica e descrito em, por exemplo, Bass e outros, Proteins, 8:309-314 (1990). É em geral necessário selecionar as bactérias apropriadas levando em consideração replicabilidade do réplicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies de E. coli, Serratia, ou Salmonella podem ser adequadamente usadas como o hospedeiro quando plasmí- dios bem conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são usados para fornecero réplicon. Tipicamente a célula hospedeira secretaria quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores de protease adionais podem ser desejavelmente incorporados na cultura de células.

b) Produção de anticorpo

[00186] Células hospedeiras são transformadas com vetores de ex-pressão descrito acima e são cultivados em meio de nutriente conven-cional modificado quando apropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes, ou ampliação dos genes que codificam as sequências desejadas.

[00187] Meio de transformação que introduz DNA para dentro do hospedeiro procariótico de modo que o DNA é replicável, ou como um elemento extracromossomal ou por integrante cromossomal. Dependendo da célula hospedeira usada, transformação é feita usando-se técnicas padrão apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio que emprega cloreto de cálcio é em geral usado para células bacteria- nas que contêm barreiras de parede de célula substancial. Um outro método para a transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Aina ums outra técnica usada é electroporação.

[00188] Células procarióticas usasdas para produzir o polipeptídeos da inveção são desenvolvidas no meio conhecido na técnica e adequadas para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meio adequado incluem caldo de luria (LB) mais suplementos de nutriente necessários. Em algumas concretizações, o meio também contém um agente de seleção, escolhido com base na construção do vetor de expressão, para seletivamente permitir crescimento de células procarióticas contendo o vetor de expressão. Por exemplo, ampicilina é adicionada a meio para o crescimento das células que expressam genes resistentes a ampicilina.

[00189] Quaisquer suplmentos necessários além de carbono, nitrogênio e fontes de fosfato inorgânicas podem também ser incluídos a concentrações apropriadas introduzidas sozinhas ou como uma mistura com um outro suplemento ou meio tais como fonte de nitrogênio complexo. Opccionalmente o meio de culturas pode conter um ou mais agentes de redução selecionados do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

[00190] As células hospedeiras procarióticas são cultivadas em temperaturas adequadas. Em certas concretizações, para o crecimen- to de E, temperaturas de crescimento variam de cerca de 20° C. a cerca de 39° C.; de cerca de 25° C. a cerca de 37° C.; ou cerca de 30° C. O pH do meio pode ser qualquer pH que varia de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Em certas concretizações, para E. coli, o pH é de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, ou cerca de 7,0.

[00191] Se um promotor induzível for usado no vetor de expressão da inveção, expressão de proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da inveção, promotores de PhoA são usados para o controle de transcrição dos polipeptí- deos. Correspondentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio de limitação de fosfato para a indução. Em certas concretizações, o meio de limitação de fosfato é o meio de C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons e outros, J. Immunol. Métodos (2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores podem ser usados, de acordo com o construto de vetor empregado, como é conhecido na técnica.

[00192] Em uma concretização, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados para dentro de e são recuperados a partir do periplasma das células hospedeiras. Recuperação de proteína tipicamente envolvem rompimento dos microorganism, em geral por tal meio como choque osmótico, sonicação ou lise. Uma vez que célulassão rompidas, fragmentos de células ou células inteiras podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser ultei- riormente purificadas, por exemplo, por cromatografia de resina por afinidade. Alternativamente, proteínas podem ser transportadas no meio de cultura e isoladas ali. Células podem ser removidas a partir da cultura e o sobrenadante de cultura sendo filtrado e concentrado para outras purificação das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser ulteriormente isolados e identficados usando-se métodos comumente conhecidos tais como eletroforese de gel de poliacri- lamida (PAGE) e ensaio de Western blot.

[00193] Em um aspecto da inveção, produção de anticorpo é conduzida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação por carga de alimentação em grande escala estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. Fermentações em grande escala têm pelo menos 1000 litros de capa-cidade, e em certas concretizações, cerca de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores usam impulsionadores de agitador para distribuir oxigênio e nutriente, especialmente glicose. Fermentação em pequena escala refere-se em geral a fermentação em um fer- mentador que é não mais do que cerca de 100 litros na capacidade volumétrica, e pode range from cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.

[00194] Em um processo de fermentação, indução de expressão de proteína é tipicamente iniciada depois das célulsa foram desenvolvidas sob condições adequadas para uma densidade desejada, por exemplo, uma OD550 de cerca de 180-220, em que estágio das células estão na fase estacionária inicial. Uma variedade de indutores pode ser usado, de acordo com o construto de vetor empregado, como é conhecido na técnica e descrito acima. Células podem ser desenvolvidas por períodos mais curtos antes da indução. Células são usualmente induzidas por cerca de 12-50 horas, embora tempos de indução mais longo ou mais curto possam ser usados.

[00195] Para aperfeiçoar o rendimento e qualidade de produção dos polipeptídeos da inveção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para aperfeiçoar o dobramento e montagem adequados dos polipeptídeos de anticorpo secretados, vetores adicionais que que ultra-expressam proteínas de chaperona, tais como proteínas de Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil cis,trans-isomerase com atividade de chaperona) podem ser usadas para co-transformar as células procarióticas hospedeiras. As proteínas de chaperona demonstraram facilitar o dobramento e solubilidade adequados de proteínas heterológias produzidas nas células hospedeiras bacterianas. Chen e outros (1999) J. Biol. Chem. 274:19601- 19605; Georgiou e outros, a pat. U.S. No. 6,083,715; Georgiou e outros, a pat. U.S. No. 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie e outros (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

[00196] Para minimizar proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), certas cepas hospedeiras deficientes para enzimas proteolíticas podem ser usaas para a presente invenção. Por exemplo, cepas de célula hospedeira podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genéti- ca(s) nos genes que codificam proteases bacterianas tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e suas combinações. Algumas cepas deficientes de protease de E. coli estão disponíveis e são descritas em, por exemplo, Joly e outros (1998), supra; Georgiou e outros, a pat. U.S. No. 5,264,365; Georgiou e outros, a pat. U.S. No. 5.508.92; Hara e outros, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

[00197] Em uma concretização, cepas de E. coli deficientes para enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídios que ultra- expressam uma ou mais proteínas de chaperona são usadas as células hospedeiras e no sistema de expressão da inveção.

c) Purificação de anticorpo

[00198] Em uma concretização, a proteína de anticorpo produzida aqui é ulteriormente purificada para se obter preparações que são substancialmente homogêneas para outros ensaios e usos. Métodos de purificação de proteína padrão conhecidos na técnica podem ser empregados. Os seguintes procedimentos são exemplares de proce-dimentos de purificação adequados: fracionação nan imunoafinidade ou colunas de troca de íons, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de troca de cá- tions tais como DEAE, cromatofoculisação, SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio, e filtração de gel usando-se, por exemplo, Sephadex G-75.

[00199] Em um aspecto, Proteína A imobiliziada em uma fase sólida é usada para purificação por imunoafinidade dos produtos de anticorpo da inveção. Proteína A é uma proteína de parede de célula de 41 kD de Staphylococcus aureas que se liga com uma alta afinidade à região de Fc de anticorpos. Lindmark e outros (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida à qual Proteína A é imobilizada pode ser uma coluna com-preendendo uma superfície de sílica ou vidro, ou uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido salicílico. Em algumas aplica-ções, a coluna é revestida com um reagente, tal como glicerol, para pos-sivelmente prevenir aderência não específica de contaminantes.

[00200] Como a primeira etapa de purificação, uma preparação derivada da cultura de células como descrita acima pode ser aplicada sobre uma fase sólido imobilizada por Proteína A para permitir ligação específica do anticorpo de interesse a Proteína A. A fase sólida então seria lavada para remover contaminantes não especificamente ligados à fase sólida. Finalmente o anticorpo de interesse é recuperado a partir da fase sólida por eluição.

Geração de anticorpos usando-se células hospedeiras eucarióticas:

[00201] Um vetor para o uso em uma célula hospedeira eucariótica em geral inclui um ou mais dos seguintes componentes não limitantes: uma sequência de sina, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elmento melhorador, um promotor, e uma sequência de terminação de transcrição.

a) Componente de sequência de sinal

[00202] Um vetor para o uso em uma célula hospedeira eucariótica pode também conter uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específica no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. As sequências de sinal heterólogas selecionadas pode ser uma que é reconhecida e é processada (isto é, clivada por uma peptidade de sinal) pela célula hospedeira. Em expressão de célula de mamífero, sequências de sinal de mamífero bem como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal de herpes simplex gD, estão disponíveis. O DNA para tal região precursora é ligada em quadro de leitura a DNA que codificada o anticorpo.

b) Origem de replicação

[00203] Em geral, uma origem de componente de replicação é necessário para os vetores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem de SV40 pode tipicamente ser usada apenas porque ele contém o promotor precoce.

c) Componente de gene de seleção

[00204] Vetores de clonagem e expressão podem conter uma gene de seleção, também chmado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, meto- trexato, ou tetraciclina, (b) deficiências auxotróficas de complemento, onde relevante, ou (c) fornecimento de nutrientes críticos não disponíveis de meio complexo.

[00205] Um Exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para aprisionar crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas céllu- las que são bem sucedidas transformam com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármaco e assim sobrevivem o regime de seleção. Exemplos de tal uso de seleçõ dominante dos fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[00206] Um outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucléico de anticorpo, tais como DHFR, timidina cinase, metalotioneina-I e -II, genes de metalotio- neina de primata, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.

[00207] Por exemplo, em algumas concretizações, células transformadas com o gene de seleção de DHFR são primeiramente identificadas por cultio de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Em algumas concretizações, uma célula hospedeira apropriada quando DHFR do tipo selvagem é empregada é uma linha de células de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

[00208] Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógena) transfor-madas ou co-transformadas com sequências de DNA que codificam um anticorpo, proteína de DHFR do tipo selvagem, e um outro marcador selecionável tal como aminoglicosídio 3-fosfotransferase (APH) pode ser selecionado por crescimento de células em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Vide a pat. U.S. No. 4,965,199. Células hospedeiras podem incluir NS0, CHOK1, CHOK1SV ou derivados, incluindo linhas de células deficientes em glutamina sintetase (GS). Métodos para o uso de GS como um marcador selecionável para células de mamífero são descritos na pat. U.S. no. 5.122.464 e a pat. U.S. No. 5.891.693.

d) Componente Promotor

[00209] Vetores de expressão e de clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é opera- velmente ligado a ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de inte-resse (por exemplo, um anticorpo). Sequências de promotor são co-nhecidas para eucariotes. Por exemplo, virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 encontrada 30 bases a montante a partir do sítio onde a transcrição é iniciada. Uma outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante a partir do início de transcrição de muitos genes é uma região de CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotidio. Na extremidade 3‘ da maioria dos genes eucarióticos é uma sequência AATAAA que pode ser o sinal paara adição da cauda poli A à extremidade 3‘ da sequência de codificação. Em certas concretizações, qualquer dessas ou todas essas sequências pode(m) ser adequadamente inserida(s) em vetores de expressão eucarióticos.

[00210] A transcrição a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferois controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírus de varíola aviária, adenovirus (tais como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, a retrovírus, vírus da hepatite B e Virus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamífero he- terológos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imu- noglobulina, a partir de promotores de choque térmico, com a condição de que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

[00211] Os promotores adiantados ou tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem viral SV40 de replicação. O promotor adiantado imediato do citomegalovirus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros de mamífero usando-se o vírus de papiloma bovino como um vetor está descrito na pat. U.S. no. 4.419.446. uma modificação desse sistema está descrito na pat. U.S. no. 4.601.978. Vide também Reyes e outros, Nature 297:598-601 (1982), descrevendo a expressão de cDNA de β-interferon humano em células de camundongo sob o controle de um promotor de timidina cinase de vírus de herpes simplex. Alternativamente, a longa repetição terminal do Virus de Sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor.

e) Componente de Elemento Aumentador

[00212] A transcrição de DNA que codifica um anticorpo desta invenção por eucariotas mais altas é frequentemente aumentada por inserção de uma sequência aumentadora para dentro do vetor. Muitas sequências aumentadoras são agora conhecidos a partir de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína, e insulinaa). Tipicamente, no entanto, usar-se-á um aumentador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o aumentador de SV40 no lado final da origem de replicação (pb 100-270), o citomegalovírus aumentador de promotor inicial humano, o aumentador de promotor inicial de cito- megalovírus de camundongo, o aumentador de polioma no lado final da origem de replicação, e aumentadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) descrevendo elementos aumentadores para ativação de promotores eucarióticos. O aumentador pode ser unido no vetor em uma posição 5‘ ou 3‘ à sequência de codificação- de polipeptídeo de anticorpo, mas está em geral localizada em um sítio 5‘ do promotor.

f) Componente de terminação de transcrição

[00213] Vetores de expressão usados em células hospedeiras eu- carióticas podem também conter sequências necessárias para a ter-minação de transcrição para a estabilização do mRNA. Tais sequências estão comumente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5‘ e, ocasionalmente 3‘, de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica um anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino. Vide WO94/11026 e o vetor de expressão descrito ali.

g) Seleção e Transformação de Células Hospedeiras

[00214] Células hospedeiras adequadas para a clonagem ou a ul- tra-expressão do DNA nos vetores aqui incluem células eucariotas mais altas descritas aqui, incluindo células hospedeiras de vertebrado. A propagação de células vertebradas na cultura (cultura de tecidos) se tornou um procedimento rotineiro. Exemplos de linhas de células hos-pedeiras de mamífero são linha de CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim de ser humano (células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham e outros, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês /-DHFR (CHO, Urlaub e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical de ser humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão de ser humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado de ser humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células de TRI (Mather e outros, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células de MRC 5; células de FS4; células de CHOK1, células de CHOK1SV ou derivados e uma linha de hepatomas de ser humano (Hep G2).

[00215] Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima para a produção de anticorpos e são cultivadas em meio de nutriente convencional quando apropriadas para a indução de promotores, a seleção de transformantes, ou a aplicação dos genes que codificam as sequências desejadas.

h) Cultivo de células hospedeiras

[00216] As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis, tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivo de células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer dos meios descritos em Ham e outros, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes e outros, Anal. Biochem. 102:255 (1980), nas pats. U.S. No. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou na pat. U.S. Re. 30,985 pode ser usado como meios de cultura para as células hospedeiras. Quaisquer desses meios pode ser suplementado quando necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimentoepidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídios (tais como adenosine e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™), elementos-traços (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos podemtambém ser incluídos em concentrações adequadas que seriam conhecidas daqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para os técnicos normalmente habiitados no assunto.

i) Purificação do anticorpo

[00217] Quando se usam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, ou diretamente secretada para dentro do meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, o resíduos em partículas, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, por centrifugaçãoou ultrafiltração. Onde o anticorpo é secretado para dentro do meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser primeiramente concentrados usando-se um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponíveil, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas precedentes para inibir proteólise, e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.

[00218] A composição de anticorpos preparada a partir das células pode ser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia de hidroxi- lapatita, eletroforese de gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo uma técnica conveniente. A ade- quabilidade de proteína A como um ligante por afinidade depende da espécie e isótipo de qualquer domínio de Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. Proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas Y1, Y2, ou Y4 de ser humano (Lindmark e outros, J. Immunol. Métodos 62:1-13 (1983)). Proteína G é recomendada para todos os isótipos de camundongo e para Y3 de ser humano (Guss e outros, EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante por afinidade é ligado pode ser agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poros controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processameto mais curtos do que podem ser conseguidos com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio de CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tais como fracionamento sobre uma coluna de troca de íons, precipitação de etanol, HPLC de Fase Reversa, croma- tografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina, cromatografia de SEPHAROSE™ sobre uma resina de troca de ânions ou cátions (tais como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocalização, SDS- PAGE, e precipitação de sulfato de amônio estão também disponíveis dependendo de o anticorpo a ser recuperado.

[00219] Em seguida a qualquer etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a ulterior purificação, por exemplo, por cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH, usando-se um tampão de elui- ção a um pH entre cerca de 2,5-4,5, realizado a baixas concentrações de sal (por exemplo, sal de cerca de 0-0,25M).

[00220] Em geral, várias metodologias para preparar anticorpos para uso em pesquisa, testagem, e uso clínico estão bem estabelecidas na técnica, consistentes com as metodologias supra-descritas e/ou como consideradas adequadas por alguém habilitado na técnica para um anticorpo de interesse.

Produção de anticorpos não-fucosilados

[00222] São providos aqui métodos para preparar anticorpos com grau de fucosilação reduzido. Por exemplo, métodos aqui contemplados incluem, mas não estão limitados a, uso de linhas de células deficientes em fucosilação de proteína (por exemplo, células Lec13 de CHO, alfa-1,6-fucosiltransferase gene células de CHO de redução de gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, células que ultra-expressam β1,4- N-acetilglicosminiltransferase III e além disso que ultra-expressam μ- manosidase II de Golgi, etc.), e adição de um análogo(s) de fucose em um meio de cultura de células usado para a produção do anticorpos. Vide Ripka e outros Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; WO 2004/056312 A1; Yamane-Ohnuki e outros Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); e US Pat. No. 8.574.907. Técnicas adicionais para reduzir o teor de fucose de anticorpos incluem a tecnologia Glimaxx descrita na Publicação de pedido de patente U.S. No. 2012/0214975. Técnicas adicionais para reduzir o teor de fucose de anticorpos também incluem a adição de um ou mais inibitores de glicosidase em um meio de cultura de células usado para a produção do anticorpos. Inibidores de glicosidase incluem α-glucosidase I, α-glucosidase II, e α-manosidase I. Em algumas concretizações, o ihibidor de glicosidase é um ihibidor de α- manosidase I (por exemplo, kifunensina).

[00223] Como usado aqui, "fucosilação núcleo de" refere-se à adição de fucose ("fucosilação") a N-acetilglucosamina ("GlcNAc") no terminal de redução de um glicano N-ligado. São também providos anticorpos produzidos por tais métodos e composiçãos dos mesmos.

[00224] Em algumas concretizações, a fucosilação de cadeias de açúcar complexas N-glicosídio-ligadas ligadas à região (ou domínio) de Fc é reduzida. Como usado aqui, uma "cadeia de açúcar complexa N-glicosídio-ligada" é!! tipicamente ligada a asparagina 297 (de acordo com o número de Kabat), embora uma cadeia de açúcar complexa N- glicosídio-ligada pode também ser ligada a outros resíduos de aspara- gina. A "cadeia de açúcar complexa N-glicosídio-ligada"exclui um tipo de cadeia de açúcar de alto teor de manose, em que apenas manose é incorporada no terminal de não redução da estrutura de núcleo, mas inclui 1) um tipo complexo, em que o lado de terminal de não redução da estrutura de núcleo tem uma ou mais ramificações de galactose-N- acetilglucosamina (também referida como "gal-GlcNAc") e o lado de terminal de não redução de Gal-GlcNAc opccionalmente tem um ácido siálico, N-acetilglucosamina bisseccionante ou semelhante; ou 2) um tipo híbrido, em que o lado de terminal de não redução da estrutura de núcleo tem tanto ramificações da cadeia de açúcar complexa N- glicosídio-ligada de alto teor de manose e cadeia de açúcar complexa N-glicosídio-ligada.

[00225] Em algumas concretizações, a "cadeia de açúcar complexa N-glicosídio-ligada"inclui um tipo complexo em que o lado de terminal de não redução da estrutura de núcleo tem zero, uma ou mais ramificações de galactose-N-acetilglucosamina (também referida como "gal- GlcNAc") e o lado de terminal de não redução de Gal-GlcNAc opccio- nalmente tem ulteriormente uma estrutura tal como um ácido siálico, N-acetilglucosamina bisseccionante ou semelhantes.

[00226] De acordo com os presentes métodos, tipicamente só uma quantidade menor de fucose é incorporada para dentro da cadeia de açúcar complexa N-glicosídio-ligada(s). Por exemplo, em várias con-cretizações, menos do que cerca de 60%, menos do que cerca de 50%, menos do que cerca de 40%, menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 5%, ou menos do que cerca de 1% do anticorpo tem fucosilação de núcleo por fucose em uma composição. Em algumas concretizações, substancialmente nenhuma (isto é, menos do que cerca de 0,5%) do anticorpo tem fucosilação de núcleo por fucose em uma composição. Em algumas concretizações, mais do que cerca de 40%, mais do que cerca de 50%, mais do que cerca de 60%, mais do que cerca de 70%, mais do que cerca de 80%, mais do que cerca de 90%, mais do que cerca de 91%, mais do que cerca de 92%, mais do que cerca de 93%, mais do que cerca de 94%, mais do que cerca de 95%, mais do que cerca de 96%, mais do que cerca de 97%, mais do que cerca de 98%, ou mais do que cerca de 99% do anticorpo é não fusosilado na composição.

[00227] Em algumas concretizações, é aqui provido um anticorpo em que substancialmente nenhuma (isto é, menos do que cerca de 0,5%) das cadeias de carboidrato ligadas a N-glicosídio contém um resíduo de fucose. Em algumas concretizações, é aqui provido um anticorpo em que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpoé não fucosilada.

[00228] Como descrito acima, uma variedade de mamífero sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode be utilizada para expressar um anticorpo. Em algumas concretizações, o meio de culturas não é suplementado com fucose. Em algumas concretizações, uma quantidade eficaz de um análogo de fucose é adicionada ao meio de culturas. Neste contexto, uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade do análogo que é suficiente para diminuir fucose incorporação em uma cadeia de açúcar complexa N-glicosídio-ligada de um anticorpo por pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50%. Em algumas concretizações, anticorpos produzidos pelos presentesmétodos compreendem pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% proteína fucosilada de não núcleo (por exemplo, carece fucosilação de núcleo), quando comparada com anticorpos produzidos a partir de as células hospedeiras cultivadas na ausência de um análogo de fucose.

[00229] O contéudo (por exemplo, a razão) de cadeias de açúcar em que fucose náo está ligada a N-acetilglucosamina na extremidade de redução da cadeia de açúcar versus cadeias de açúcar em que fucose está ligada a N-acetilglucosamina na extremidade de redução da cadeia de açúcar pode ser determinada, por exemplo, como descrito nos Exemplos. Outros métodos incluem hidrólise ou digestão de enzima (vide, por exemplo, Biochemical Experimentation Métodos 23: Method for Studying Glicoprotein Sugar Cadeia (Japan Scientific Societies Press), edited by Reiko Takahashi (1989)), rótulo de fluorescência ou rótulo de radioisóotpo da cadeia de açúcar liberado e então sepração da cadeia de açúcar marcado por cromatografia. Também, as composições das cadeias de açúcar lberadas podem ser determinadas por análise das cadeias pelo método de HPAEC-PAD (vide, por exemplo, J. Liq Chromatogr. 6:1557 (1983)). (Vide em geral U.S. Publicação de pedido de patente No. 2004/0110282.).

IV. Composições

[00230] Em alguns aspectos, também provido aqui são composi- çãos (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo qualquer um dos anticorpos de anti-Siglec-8 descrito aqui. Em alguns aspectos, provido aqui é uma composição compreendendo um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui, em que o anticorpo compreende uma região de Fc e Cadeias de carboidrato ligada a N-glicosídio ligado à região de Fc, em que menos do que cerca de 50% das cadeias de carboidrato ligadas a N-glicosídio contêm um resíduo de fucose. Em alguns aspectos, provido aqui é uma composição compreendendo um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui, em que o anticorpo compreende uma região de Fc e cadeias de carboidrato ligadas a N- glicosídio ligada à região de Fc, em que substancialmente nenhuma das cadeias de carboidrato ligadas a N-glicosídio contêm um resíduo de fucose.

[00231] Formulações terapêuticas são preparadas para a armazenagem por misturação do ingrediente ativo tendo o grau desejado de pureza com ótimos veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceu- ticamente aceitáveis (Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wiklins, Pub., Gennaro Ed., Philadelphia, Pa. 2000). Veículos, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis não tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, antioxidantes incluindo ácido ascórbico, metionina, Vitamina E, metabissulfito de sódio; conservantes, isotonificadores, estabilizadores, complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn- proteína); agentes de quelação tais como EDTA e/ou tensoativos não iônicos.

[00232] Tampões podem ser usadas para controlar o pH em uma faixa que otimiza a eficácia terapêutica, especialmente se estabilidade for dependente de pH. Tampões podem estar presentes em concen- trações que variam de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM. Agentes de tamponamento adequados para uso com a presente invenção incluem tanto ácidos orgânicos ou inorgânicos quanto seus sais. Por exemplo, citrato, fosfato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxa- lato, lactato, acetato. Adicionalmente, tampões podem ser constituídos de histidine e trimetilamina sais tais como Tris.

[00233] ConservantesConservantes podem ser adicionados para prevenir crescimento microbiano, e são tipicamente presentes em uma faixa de cerca de 0,2%-1,0% (w/v). Conservantes adequados para uso com a presente invenção incluem cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; haletos de benzalcônio (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), cloreto de benzetônio; thimerosal, fenol, álcoolbutílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol, 3-pentanol, e m-cresol.

[00234] Agentes de tonicidade, algumas vezes conhecidos como "estabilizadores" podem estar presentes para ajustar ou manter a toni-cidade de líquido em uma composição. Quando usadas com biomolé- culas carregadas, grandes tais como proteínas e anticorpos, elas são frequentemente chamadas "estabilizadores" porque elas podem interagir com os grupos carregados das cadeias laterais de aminoácido, desse modo diminuição do potencial para interações inter e intramolecular. Agentes de tonicidade podem estar presentes em qual- qquer quantidade entre cerca de 0,1% a cerca de 25% em peso ou entre cerca de 1 a cerca de 5% em peso, levando em consoderação as quantidades relativas dos outros ingredientes. Em algumas concretizações, agentes de tonicidade incluem polyhydric álcoois de açúcar poliídricos, álcoois de açúcar triídricos ou mais alto, tais como glicerina, erithritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.

[00235] Excipientes adicionais incluem agentes que podem servir como uma ou mais of the following: (1) agentes de aumento de volu me, (2) aumentadores de solubilidade, (3) estabilizadores e (4) e agentes de prevenção de desnaturação ou aderência à parede de recipiente. Tais excipientes incluem: álcoois de açúcar poliídricos (enumerados acima); aminoácidos tais como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâ- mico, treonina, etc.; açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar tais como sacarose, lactose, lactitol, trealose, estaquiose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribitol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, gli- cerol, ciclitóis (por exemplo, inositol), polietileno glicol; agentes de redução contendo enxofre, tais como uréia, glutationa, ácido tióctico, tio- glicolato de sódio, tioglicerol, α-monotioglicerol e tio sulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular tais como albumina de soro humano, albumina de soro bovino, gelatina ou outras imunoglobulinas; polímeroshidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; monossacarídeos (por exemplo, xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídeos (por exemplo, lactose, maltose, sacarose); trissacarídeos tal como rafinose; e polis- sacarídeos tal como dextrina ou dextrano.

[00236] Tensoativos não iônicos ou detergentes (também conhecidos como "agentes de umectação") podem estar presentes para auxiliar solubilizar o agente terapêutico bem como para proteger a proteína terapêutica contra agregação induzida por agitação, que também permite que a formulação seja expressa para cisalhar surface stress sem causar desnaturação do anticorpo ou da proteína terapêutico ativo. Tensoativos não iônicos estão presentes em uma faixa de cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml ou cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml. Em algumas concretizações, tensoativos não iônicos estão presentes em uma faixa de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% w/v ou cerca de 0,01% a cerca de 0,1% w/v ou cerca de 0,01% a cerca de 0,025% w/v.

[00237] Tensoativos não iônicos adequados incluem polissorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188, etc.), polióis de PLURONIC®, TRITON®, monoéteres de polioxietileno sorbitano (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, óleo de rícino de polioxietileno hidrogenado 10, 50 e 60, glicerol monoestearato, éster de ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. Anionic detergents that pode ser usada incluem sulfato de laurila de sódio, sulfossuccinato de dioctila sódica e sulfonato de dioctila sódico. Detergentes catiônicos incluem cloreto benzalcônio ou cloreto de benzetônio.

[00238] Em ordem para as formulações a serem usadas para a ad-ministração in vivo, elas devem ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril por filtração através de membranas de filtração estéreis. As composições terapêuticas aqui em geral são colocadas em um re-cipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou um frasco de solução intravenosa o intravenous solution tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[00239] A rota de administração é de acordo com métodos conhecidos e aceitos, tais como por bolus ou infusão único ou múltiplos durante um longo período de tempo de um modo adequado, por exemplo, injeção ou infusão por rotas subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional ou intraarticular, administração tópica, inalação ou por liberação sustentada ou por meio de liberação prolongada.

[00240] A formulação aqui pode também conter mais do que um composto ativo quando necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não adversamente afetam entre si. Alternativamente, ou na adição, a composição pode compreender um agente citotóxico, citocina ou agente inibitório de crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para as finalidades pretendidas.

V. Métodos de Tratamento

[00241] Provido aqui são métodos para o tratamento ou prevenção de uma doença mediada por células que expressam Siglec-8 em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui (por exemplo, um anticorpo de anti-Siglec-8 humanizado) ou suas composições. Em algumas concretizações, o indivíduo (por exemplo, um paciente humano) foi diagnosticado com uma desordem mediada por eosinófilo ou está em risco de desenvolver a desordem mediada por eosinófilo. Em algumas concretizações, o indivíduo (por exemplo, um paciente humano) foi diagnosticado com uma desordem mediada por mastócito ou está em risco de desenvolver a desordem mediada por mastócito. Em algumas concretizações, o indivíduo tem uma desordem mediada por eosinófilo ou a desordem mediada por mastócito.

[00242] Provido aqui s métodos de depleção ou redução de eosinó- filos compreendendo administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui (por exemplo, um anticorpo de anti-Siglec-8 humanizado). Em algumas concretizações, a depleção ou a redução de eosinófilos é medida por comparação do número de população de eosinófilos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo com o número de população de eosinófilos em uma amostra oriunda de um indivíduo antes do tratamento com o anticorpo. Em algumas concretizações, a depleção ou a redução de eosinófilos é medida por comparação do número de população de eosinófilos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo com o número de população de eosinófilos em uma amostra oriunda de um outro indivíduo sem o anticorpo tratamento ou número médio de população de eosinó- filos nas amostras oriundas de indivíduos sem o anticorpo tratamento. Em algumas concretizações, a amostra é uma amostra de tecido (por exemplo, uma amostra de pulmão, uma amostra de polipose nasal, etc.). Em algumas concretizações, depleção de redução de eosinófilos é devido a apoptose de eosinófilos ativados. Eosinófilos podem ser ativados ou sensibilizados por citocinas ou hormônios tais como, mas não limtadas a, IL-5, GM-CSF, IL-33, IFN-Y, TNF-α, e leptina. Em al-gumasconcretizações, depleção de redução de eosinófilos é devido a apoptose of resting eosinófilos. Em algumas concretizações, depleção de redução de eosinófilos é devido a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, a pro-dução de eosinófilo de mediadores inflamatório é prevenida ou é reduzida. Mediadores inflamatórios exemplares incluem, mas não são limitados a, espécie de oxigênio reativa, proteínas de grânulo (por exemplo,proteína catiônica de iosinófilo , proteína básica principal, neuroto- xina derivada de eosinófilo, peroxidase de eosinófilo, etc.), mediadores de lipídio (por exemplo, PAF, PGE1, PGE2, etc.) , enzimas (por exemplo, elastase), fatores de crescimento (por exemplo, VEGF, PDGF, TGF-α, TGF-β, etc.), quimiocinas (por exemplo, RANTES, MCP-1, MCP-3, MCP4, eotaxina, etc.) e citocinas (por exemplo, IL-3, IL-5, IL- 10, IL-13, IL-15, IL-33, TNF-α, etc.).

[00243] Providos aqui são também métodos de depleção ou de redução de mastócitos compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui (por exemplo, um anticorpo de anti-Siglec-8 humanizado). Em al-gumasconcretizações, a depleção ou a redução de mastócitos é medida por comparação do número de população de masócitos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido ou uma amostra de fluidobiológico) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo com o número de população de masócitos em uma amostra oriunda de um indivíduo antes do tratamento com o anticorpo. Em al-gumasconcretizações, a depleção ou redução de mastócitos é medida por comparação do número de população de masócitos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido ou uma amostra de fluidobiológico) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo com o número de população de masócitos em uma amostra oriunda de um outro indivíduo sem o tratamento com anticorpo ou númeromédio de população de mastócitos nas amostras oriundas de indivíduos sem o tratamento com anticorpo. Em algumas concretizações, a amostra é uma amostra de tecido (por exemplo, uma amostra de pele, uma amostra de pulmão, uma amostra de medula óssea, uma amostra de polipose nasal, etc.). Em algumas concretizações, a amostraé uma amostra de fluido biológico (por exemplo, uma amostra de sangue, uma amostra broncoalveolar de lavagem, e uma amostra nasal de lavagem). Em algumas concretizações, depleção de redução de mastócitos é devido a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas concretizações, depleção ou redução de mastócitos é a redução ou a prevenção de mediadores inflamatóriosrealizados ou recentemente formados produzidos a partir de mastócitos. Mediadores inflamatórios exemplares incluem, mas não são limitados a, histamina, N-metil histamina, enzimas (por exemplo, triptase, quimase, cathespin G, carboxipeptidase, etc.), mediadores de lipídio (por exemplo, prostaglandina D2, prostaglandina E2, leucotrieno B4, leucotrieno C4, fator de ativação de plaqueta, 11-beta- prostaglandina F2, etc.), quimiocinas (por exemplo, CCL2, CCL3, CCL4, CCL11 (isto é, eotaxina), CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL10, etc.), e citocinas (por exemplo, IL-3, IL-4, IL-5, IL-15, IL-33, GM-CSF, TNF, etc.).

[00244] Providos aqui são também métodos de depleção de mastó- citos que expressam Siglec-8 em um indivíduo compreendendo admi- nistração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui (por exemplo, um anticorpo de anti-Siglec-8 humanizado), em que o anticorpo de anti-Siglec-8 mata mastócitos que expressam Siglec-8 por atividade de ADCC. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 esgota pelo menos cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 100% dos mas- tócitos que expressam Siglec-8 em uma amostra obtida a partir do indivíduo em comparação com um nível de linha de base antes do tratamento. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 esgota pelo menos cerca de 20% dos mastócitos que expressam Siglec- 8 em uma amostra obtida a partir do indivíduo em comparação com um nível de linha de base antes do tratamento. Em algumas concretizações, a depleção ou a mantança de mastócitos é medida por comparação do número de população de masócitos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido ou uma amostra de fluido biológico) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo com o número de população de masócitos em uma amostra oriunda de um indivíduo antes do tratamento com o anticorpo. Em algumas concretizações, a depleção ou a mantança de mastócitos é medida por comparação do número de população de masócitos em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido ou uma amostra de fluido biológico) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo com o número de população de masócitos em uma amostra oriunda de um outro indivíduo sem o tratamento com anticorpo ou número médio de população de mastócitos nas amostras oriundas de indivíduos sem o tratamento com anticorpo. Em algumas concretizações, a amostra é uma amostra de tecido (por exemplo, uma amostra de pele, uma amostra de pulmão, uma amostra de medula óssea, uma amostra de polipose nasal, etc.). Em algumas concretizações, a amostra é uma amostra de fluido biológico (por exemplo, uma amostra de sangue, uma amostra broncoalveolar de lavagem e uma amostra nasal de lavagem). Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 foi engenheirado para aperfeiçoar atividade de ADCC. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 compreende pelo menos uma substituição de aminoácido na região de Fc que aperfeiçoa atividade de ADCC. Em algumas concretizações, pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não fucosilada. Em algumas concretizações, depleção ou matança de mastócitos é a redução ou prevenção de mediadores inflamatórios realizados ou recentemente formados produzidos a partir de mastócitos. Mediadores inflamatórios exemplares incluem, mas não são limitados a, histamina, N-metil histamina, enzimas (por exemplo, triptase, quimase, catepsina G, carboxipeptida- se, etc.), mediadores de lipídio (por exemplo, prostaglandina D2, pros- taglandina E2, leucotrieno B4, leucotrieno C4, fator de ativação de plaqueta, 11-beta-prostaglandina F2, etc.), quimiocinas (por exemplo, CCL2, CCL3, CCL4, CCL11 (isto é, eotaxina), CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL10, etc.), e citocinas (por exemplo, IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, IL-15, IL-33, GM-CSF, TNF, etc.).

[00245] Também providos aqui são métodos de inibição de uma atividade mediada por mastócito compreendendo administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui (por exemplo, um anticorpo de anti-Siglec-8 humanizado). Em algumas concretizações, a inibição de uma atividade mediada por mastócito é medido por comparação da atividade mediada por mastócito em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido ou uma amostra de sangue) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo com a atividade mediada por mastócito em uma amostra oriunda de um indivíduo antes do tratamento com o anticorpo. Em algumas concretizações, a inibição de uma atividade mediada por mastócito é medida por comparação da atividade mediada por mastó- cito em uma amostra (por exemplo, uma amostra de tecido ou uma amostra biológica) oriunda de um indivíduo depois de tratamento com o anticorpo to the uma atividade mediada por mastócito em uma amostra oriunda de um outro indivíduo sem o tratamento com anticorpo ou atividade média mediada por mastócito nas amostras oriundas de indivíduos sem o tratamento com anticorpo. Em algumas concretizações, a amostra é uma amostra de tecido (por exemplo, uma amostra de pele, uma amostra de pulmão, uma amostra de medula óssea, uma amostra de polipose nasal, etc.). Em algumas concretizações, a amostraé uma amostra de fluido biológico (por exemplo, uma amostra de sangue, uma amostra broncoalveolar de lavagem, e uma amostra nasal de lavagem). Em algumas concretizações, inibição de uma atividade mediada por mastócito é a inibição de desgranulação de mastócito . Em algumas concretizações, inibição de uma atividade mediada por mastócito é a inibição de contração de músculo liso da via aérea. Em algumas concretizações, inibição de uma atividade mediada por mas- tócito é o fluxo de inibição de cálcio em mastócitos. Em algumas concretizações, inibição de uma atividade mediada por mastócito é a inibição de liberação de mediadores inflamatórios realizados ou recentemente formados a partir de mastócitos. Mediadores inflamatórios exemplares incluem, mas não são limitados a, histamina, N-metil his- tamina, enzimas (por exemplo, triptase, quimase, catepsina G, carbo- xipeptidase, etc.), mediadores de lipídio (por exemplo, prostaglandina D2, prostaglandina E2, leucotrieno B4, leucotrieno C4, fator de ativação de plaqueta, 11-beta-prostaglandina F2, etc.), quimiocinas (por exemplo, CCL2, CCL3, CCL4, CCL11 (isto é, eotaxin), CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL10, etc.), e citocinas (por exemplo, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-13, IL-15, IL-33, GM-CSF, TNF, etc.).

[00246] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um agente ativo, dependerá do tipo da doença a ser tratada, como definido acima, da severidade e do curso da doença, se o agente é administrado para as finalidades preventivas ou teurapêuti- cas, da terapia anterior, da história clínica do indivíduo e da resposta ao agente, e do critério do médico atendente. O agente é adequadamente administrado ao indivíduo de uma vez ou durante uma série de tratamentos. Em algumas concretizações do método descrito aqui, um intervalo entre as administrações de um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito é cerca de um mês ou mais. Em algumas concretizações, o intervalo entre as administrações é cerca de dois meses, cerca de três meses, cerca de quatro meses, cerca de cinco meses, cerca de seis meses ou mais. Como usado aqui, an interval entre administrations refere-se ao período de tempo entre uma administração do anticorpo e a próxima administração do anticorpo. Como usado aqui, um intervalo de cerca de um mês inclui quatro semanas. Correspondentemente, em algumas concretizações, o intervalo entre as administrações é cerca de quatro semanas, cerca de oito semanas, cerca de doze semanas, cerca de dezesseis semanas, cerca de vinte semanas, cerca de vinte quatro semanas, ou mais. Em algumas concretizações, o tratamento inclui múltiplas administrações do anticorpo, em que o intervalo entre as administrações podem variar. Por exemplo, o intervalo entre a pri-meiraadministração e a segunda administração é cerca de um mês, e o intervalos entre as administrações subsequentes são cerca de três meses. Em algumas concretizações, o intervalo entre a primeira admi-nistração e a segunda administração é cerca de um mês, o intervalo entre a segunda administração e a terceira administração é cerca de dois meses, e o intervalos entre as administrações subsequentes são cerca de três meses. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui é administrado em uma dose plana. Em al-gumasconcretizações, um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 150 a cerca de 450 mg por dose. Em algumas concretizações, o anticorpo de anti-Siglec-8 é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de qualquer um de 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400mg, e 450 mg por dose. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti- Siglec-8 descrito aqui é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 1.0 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em algumas concretizações, um anticorpo de anti- Siglec-8 descrito aqui é administrado a um indivíduo em uma dosagem de cerca de qualquer um de 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0mg/kg, 1,5mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, ou 10,0 mg/kg. Qualquer uma das frequências de dosagem descritas acima pode ser usada.

[00247] Um método de tratamento contemplad oaqui é o tratamento de desordens mediadas por eosinóflio e/ou desordem mediada por mastócitos com um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui. Desordens mediadas por eosinóflio incluem uma desordem ou doença associada a migração de eosinófilo, quimiotaxia, geração, ou granulação. Simi-larmente, desordem mediada por mastócitos incluem uma desordem ou doença associada a migração de mastócito, quimiotaxia, geração, ou granulação. Desordens mediadas por eosinóflio e/ou desordem mediada por mastócitos que são tratáveis com as formulações desta presente invençãoincluem asma, rinite alérgica, polipose nasal, dermatiteatópica, urticária crônica (por exemplo, urticário idiopática crônica e urticária espontânea crônica), mastocitose, leucemia eosinofílica, e síndrome hipereosinofílica. Desordens mediadas por eosinóflio e/ou desordem mediada por mastócitos que são tratáveis com as formulações desta presente invenção também incluem asma pauci granulocí- tica, hipersensibilidade da via aérea aguda ou crônica, esofagite eosi- nofílica, síndrome de Churg-Strauss, inflamação associada a uma cito- cina, inflamação associada a células que expressam Siglec-8, maligni-dade associada a células que expressam Siglec-8, urticária física, urti- cária fria, urticária por pressão, penfigóide bolhoso, alergia a alimento, e aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA).

[00248] Em algumas concretizações dos métodos aqui, um anticorpo de anti-Siglec-8 provido aqui inibe um ou mais sintomas de uma reação alérgica. Em algumas concretizações, a reação alérgica is uma reação de hipersensibilidade de tipo I.

[00249] Rinite alérgica, também conhecida como rinoconjuntivite alérgica ou febre dos fenos, é a manifestação mais comum de uma reação atópica a alergenos inalados, cujas serveridade e a duração são frequentemente correlativas com a intensidade e duração da exposição ao alergeno. É uma doença crônica, que pode primeiramente aparecer em qualquer idade, mas o início é usualmente durante infância ou adolescência. Um ataque típico consiste de rinorréia aquosa profusa, paroximos de espirros, obstrução nasal e coceira do nariz e do palato. Drenagem de musoca pós-nasal também causa dor de garganta, pigarro e tosse. Pode também haver sintomas de blefaroconjun- tivite alérgica, com intensa coceira da conjuntiva e pálpebras, vermelhidão, lacrimejando, e fotofobia. Ataques severos são frequentemente acompanhados por mal-estar sistêmico, fraqueza, fadiga, e algumas vezes, dor muscular depois de períodos intensos de espirros.

[00250] Asma, também conhecida como uma doença da via aérea obstrutiva reversível, é caracterizada por hiperresponsividade da árvore traqueobronquial a irritantes respiratórios e produtos químicos bron- coconstritores, produção de ataques de bufamento, dispnéia, aperto no peito, e tosse que são reversíveis espontaneamente ou com tratamento.É uma doença crônica que envolve a via aérea total, mas varia na severidade de episódios transitórios ocasionais a severos, obstruções crônicas ameaçadores da vida, crônicas. Sinais físicos de um ataque de asma incluem taquipnéia, bufamento audível, e uso dos músculos acessórios de respiração. Pulso rápido e pressão de sangue elevada estão também tipicamente presentes, como são níveis elevados de eosinófilos no sangue periférico e secreções nasais. Asma e atopia podem coexistir, mas apenas cerca de metade de asmáticos são também atópicos, e uma percentagem ainda menor de pacientes atópicos também tem asma. No entanto, atopia e asma não são totalmente independentes naquela asma ocorre mais frequentemente entre indivíduos atópicos do que contra indivíduos não atópicos, especialmente durante a infância. Asma foi ulteriormente historicamente dividida em dois subgrupos, asma extrínseca e asma intrínsica. Adicionalmente, asma envolve inflamação crônica das vias aéreas, exacerbaçõesagudas que variam na frequência entre pacientes diferentes e em resposta a gatilhos ambientais. Em casos severos, remodeloação crônica das vias aéreas pode ocorrer.

[00251] Asma extrínseca, também conhecida como asma alérgica, atópica ou imunológica, é descritiva de pacientes que em geral desen-volvem asma precoce na vida, usualmente durante a meninice ou in-fância. Outras manifestações de atopia, incluindo eczema ou rinite alérgica, frequentemente coexistem. Ataques asmáticos podem ocorrer durante estações de pólen, na presença de animais, ou na exposição a poeira doméstica, travesseiros de penas, ou outros alergenos. Testes de pele mostram reações positivas de pápula-e-rubor aos aler- genos causadores. De modo interessante, concentrações de IgE total no soro são frequentemente elevadas, mas algumas vezes nomais. Asma intrínseca, também conhecida como asma não alérgica ou idio- pática, tipicamente ocorre primeiramente durante vida adulta , depois de uma aparente infeção respiratória . Sintomas incluem obstrução bronquial crônica ou recorrente não relacionada com estações de pólen ou exposição a outros alergenos. Testes de pele são negativos aos alergenos atópicos usuais e a concentração de IgE no soro é normal. Sintomas adicionais incluem sangue na saliva e eosinofilia. Para as finalidades deste pedido de patente, "desordens mediadas por eosinó- flio" incluem tanto a asma alérgica quanto a asma não alérgica. Em algumas concretizações, um indivíduo com uma desordem mediada por eosinófilo(s) e/ou desordem mediada por mastócito(s) está sofrendo de asma que não é adequadamente controlada por um corticoste- róide inalado, um agonista β2 de ação curta, um agonista β2 de ação prolongada, ou uma sua combinação.

[00252] A dermatite atópica, também conhecida como eczema, neu- rodermatite, eczema atópica ou prurigo de Besnier, é uma desordem de pele crônica comum específica de um subconjunto de pacientes com as características familiares e imunológicas de atopia. A característica essencial é uma resposta inflamatória prurítica dérmica, que induz uma erupção da pele caracteríistica, simetricamente distribuída, com predileção por certos sítios. Embora a dermatite atópica seja classificada como uma forma cutânea de atopia, uma vez que ela está associada com rinite alérgica e asma e altos níveis de IgE, a severidade da dermatite, no entanto, nem sempre correlaciona-se com exposição a alergenos na testagem de pele, e dessensibilização (diferentemente de outras doenças alérgicas) não é um tratamento eficaz. Embora um alto teor de IgE no sangue seja confirmador de uma diagnose de asma alérgica, níveis normais não a excluem. O início da doença pode occorrer em qualquer idade, e lesões começam agudamente com pápula eritematosa edematosa ou placa com escamação. A coceira leva a exsudação e encrustação, então uma liquenificação crônica. No nível celular, a lesão aguda é edemosa e a derme é infiltratada com células mononucleares, linfócitos de CD4. Neutrófilos, eosinófilos, células plasmáticas e basófilos são raros, mas mastócitos desgranula- dos estão presentes. Lesões crônicas caracterizam hiperplasia epi-dérmica, hiperceratose e paraceratose, e a derme é infiltrada com células mononucleares, células de Langerhans e mastócitos. Pode haver também áreas focais de fibrose, incluindo envolvimento do perineurio de nervos pequenos.

[00253] Urticária e angioedema referem-se a inchaço físico, eritema e coceira resultantes de receptor estimulado por histamina em vasos sanguíneos cutâneos superficiais, e é a característica cutânea marcante de anafilaxia sistêmica. Anafilaxia sistêmica é a ocorrência de uma reação mediada por IgE simultaneamente em múltiplos órgãos resultante de fármaco, veneno de inseto ou alimento. Ela é causada de repente por IgE induzida por alergeno, carregada por mastócito, resultando em alteração profunda e ameaçadora à vida, no funcionamento de vários órgãos vitais. colapso vascular, obstrução de via aérea agu-da,vasodilatação cutânea e edema, e espasmo muscular gastrointestinal e genitourinário ocorrem quase simultaneamente, embora nem sempre no mesmo grau. A patologia de anafilaxia inclui angioedema e pulmões hiperinfláveis, com tamponamento de mucosa das vias aéreas e atelectase focal. Em um nível celular, os pulmões aparecem similarmente como durante um ataque de asma agudo, com hiperse- creção de glândulas submucosais brônquicas, edema submucosal e mucosal , congestão vascular peribronquial e eosinofilia nas paredes bronquiais. Hemorragia ou edema pulmonar pode estar presente. Espasmo muscular bronqual, hiperinflação, e ainda ruptura de alvéolos pode também estar presente. Características importantes de anafilaxia de ser humano incluem edema, congestão vascular, e eosinophilia na lâmina própria da laringe, traquéia, epiglote e hipofaringe. Exposição ao alergeno pode ser através da ingestão, injeção, inalação o contato com a pele ou membrana de mucosa. A reação começa dentro de se- gundos ou minutos depois da exposição ao alergeno. Pode haver um medo incial ou sentido de morte iminente, seguido rapidamente por sintomas em um ou mais sistemas de órgão alvo: cardiovascular, res-piratório, cutâneo ou gastrointestinal. Os alergenos responsáveis por anafilaxia diferem daqueles comumente associados a atopia. Alimen-tos,fármacos, veneno de insetos ou latex são as fontes comuns. Aler- genos alimentícios incluem aqueles encontrados em crustáceos, mo-luscos (por exemplo, lagosta, camarão, crab), peixe, legumes (por exemplo, amendoins, ervilhas, feijões, alcaçus), sementes (por exemplo sesame, cottonvided, alcaravia, mostarda, semente de linho, grias- spç), nozes, bagas, claras de ovo, trigo sarraceno e leite. Alergenos de fármacos incluem aqueles encontrados em proteínas heterólogas e polipeptídeos, polissacarídeos e fármacos haptênicos. Alergenos de insetos incluem insetos de Hymenoptera, incluindo a abelha, vepos tipo "yellow jacket", vespão, vespa e formiga-de-fogo. While epinefrina is the typical tratamento para anafilaxia, antiistamina ou outros bloque- adores de histamina são tipicamente descritos para urticária menos severa ou reação angiodêmica.

[00254] Polipose nasal é uma doença inflamatória crônica do trato respiratório superior caracterizada por um crescimento do tecido infla-mado na cavidade nasal, e embora a etiologia exata seja desconhecida,é conhecido como tendo a prevalência entre 1 a 5% de adultos (Settipane G A: Epidemiology of pólipos nasais. Allergy Asma Proc, 1996, 17:231-236). Polipose nasal tipicamente apresenta nos homens de 20 anos de idade ou mais velhos e causa obstrução nasal, hipos- mia, e infecções recorrentes com um impacto significativamente mais alto para para qualidade de vida do que rinite alérgica perene (Li e outros, Characterizing T-Cell Phenotypes in Polipose nasal in Chinese Patients, J Investig Allergol Clin Immunol, 2009; Vol. 19(4):276-282). Até um terço de todos os pacientes com polipose nasal são relatados como tendo asma no entanto apenas 7% de pacientes com asma têm polipose nasal. Tipos de células predominates implicados na polipose nasal incluem eosinófilos e mastócitos.

VI. Artigos de Fabricação ou Kits

[00256] Em um outro aspecto, é provido um artigo de fabricação ou kit que compreende um anticorpo de anti-Siglec-8 descrito aqui. O artigo de fabricação ou kit pode ulteriormente compreender intruções para uso do anticorpo nos métodos da inveção. Assim, em certas concretizações, o artigo de fabricação ou kit compreende intruções para o uso de um anticorpo de anti-Siglec-8 nos métodos para o tratamento ou a prevenção de uma desordem mediada por eosinófilo e/ou desordem mediada por mastócito em um indivíduo compreendendo administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo de anti- Siglec-8. Em certas concretizações, o indivíduo é a human. Em algumasconcretizações, o indivíduo tem uma doença selecionada do grupo que consiste de asma, rinite alérgica, polipose nasal, dermatite ató- pica, urticária crônica, mastocitose, leucemia eosinofílica, e síndrome hipereosinofílica. Em certas concretizações, o indivíduo tem uma doença selecionada do grupo que consiste de asma pauci granulocítica, hipersensibilidade da via aérea aguda ou crônica, esofagite eosinofí- lica, síndrome de Churg-Strauss, inflamação associada a uma citocina, inflamação associada a células que expressam Siglec-8, malignidade associada a células que expressam Siglec-8, urticária física, urticária fria, urticária por pressão, penfigóide bolhoso, alergia a alimento, e as- pergilose broncopulmonar alérgica (ABPA).

[00257] O artigo de fabricação ou kit pode ulteriormente compreender um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos com duas câmaras), seringas (tais como seringas com única câmara ou com câmara dupla) e tubos de teste. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de ma terials tais como vidro ou plástico. O recipiente mantém a formulação.

[00258] O artigo de fabricação ou kit pode ulteriormente compreender um rótulo ou um inserto na embalagem, que está no ou associado ao recipiente, pode indicar direções para reconstituição e/ou uso da formulação. O rótulo ou inserto na embalagem pode ulteriormente indicar que a formulação é útil ou é pretendida para modos subcutâneo, intravenoso, ou outros modos de administração para o tratamento ou prevenção de uma desordem mediada por eosinófilo e/ou desordem mediada por mastócito em um indivíduo. O recipiente matendo a for-mulação pode ser um frasco de único uso ou um frasco de múltiplos usos, que permite administração repetida da formulação reconstituída. O artigo de fabricação ou kit pode ulteriormente compreender um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado. O artigo de fabricação ou kit pode ulteriormente incluir outros materiais desejados a partir de um ponto de vista comercial, terapêutico, e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhos, seringas, e insertos na embalagem com intruções para o uso.

[00259] Em uma concretização específica, a presente invenção provê kits para uma única unidade de administração de dose. Tais kits compreendem um recipiente de uma formulação aquosa de anticorpo terapêutico, incluindo ambas as seringas pré-enchidas de câmara única ou de múltiplas câmaras estão disponíveis a partir de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemanha.

[00260] O artigo de fabricação ou kit aqui opccionalmente ulterior- mente compreende um recipiente compreendendo um segundo medicamento, em que o anticorpo de anti-Siglec-8 é um primeiro medicamento e que article ou kit ulteriormente compreende intruções no rótulo ou no inserto na embalagem para o tratamento do indivíduo com o segundo medicamento, em uma quantidade eficaz. Um segundo medicamento exemplar pode ser um anticorpo de anti-IgE, uma anti- istamina, um broncodilatador, um glucocorticóide, uma NSAID, um descongestionante, um supressor de tosse, um analgésico, um anta-gonista de TNF, um antagonista de integrina, um agente imunossu- pressor, um antagonista de IL-4, u m antagonista de IL-13, um antago-nista de IL-4/IL-13 duplo, a DMARD, um anticorpo que se liga a um marcador de superfície de célula B, e/ou um antagonista de BAFF.

[00261] Em uma outra concretização, provido aqui é um artigo de fabricação ou kit compreendendo as formulações descritas aqui para a administração em um dispositivo auto-injetor. Um auto-injector pode be descrito como um dispositivo de injeção que na ativação, fornecerá seu conteúdo sem necessária ação adicional a partir do paciente ou administrator. Elas são particularmente ajustadas para auto-medição de formulações terapêuticas quando a taxa de formulação deve ser constante e o tempo de fornecimento é maior do que uns poucos mo-mentos.

[00262] A invenção será mais totalmente entendida por referência aos seguintes exemplos. Eles não, no entanto, seriam interpretadas como limitantes do escopo da inveção. Deve ser entendido que os Exemplos e concretizações descritos aqui são apenas para as finalidades ilustrativas que várias modificações e mudanças à sua luz serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e campo de ação desse pedido e escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[00263] Siglecs (ligação de ácido siálico, lecitinas de tipo imunoglo- bulina) são proteínas de superfície de célula de transmembrana de passsagem simples encontrados predominantemente nos leucócitos. Siglec-8, uma membrana da família de Siglec, foi primeiramente descrito como parte de esforços para identificar novas proteínas de eosi- nófilo humanas. Além da expressão com eosinófilos humanos, é tam- bém expresso por mastócitos. Siglec-8 reconhece um glicano sulfatado, 6’-sulfo-sialila Lewis X, e contém um domínio de pedaço inibitório com base em tirosina de imunorreceptor intracelular (ITIM) mostrado para inibir função de mastócito. Anticorpos de camundongo para anticorpos de 2C4, 2E2 e Siglec-8 são descritos na pat. U.S. no. 8.207.305; a pat. U.S. No. 8.197.811. a pat. U.S. No. 7.871.612. e a pat. U.S. No. 7.557.191. A sequência de aminoácidos de o domínio variável de cadeia pesada e domínio variável de cadeia leve do anticorpo de 2C4 de anti-Siglec-8 de camundongo pode ser encontrado, por exemplo, na pat. U.S. no. 8.207.305 como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Exemplo 1: Geração e caracterização de anticorpos quiméricos de anti-Siglec-8.

[00264] Anticorpos quiméricos foram gerados a partir do anticorpo de 2E1 de camundongo e anticorpo de 2C4 de camundongo, e foram subsequentemente analisados quanto a atividade de ligação ao Siglec- 8 de ser humano.

Métodos e Resultados Geração de anticorpo de 2E2 quimérico (ch2E2) e anticorpo de 2C4 quimérico (ch2C4)

[00265] Para a geração de um anticorpo de 2E2 quimérico (ch2E2), snap- lisatos de células de 2E2 de hibridoma de camundongo rapidamente congelados foram processados usando-se o kit RNeasy Mini (Qiagen) para isolar RNA total de acordo com protocolo do fabricante . Uma amostra de 3 μg de RNA isolado foi submetido a transcrição reversa para produzir 2E2 cDNA usando-se o kit de síntese de cDNA de primeira fita (first-strand DNA) (GE Life Sciences) de acordo com protocolo do fabricante . cDNA de 2E2 foi subsequentemente amplificado por PCR usando-se a Mistura "Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix" (Thermo Scientific) e as sequências nas reações de PCR fo- ram confirmadas. O cDNA de região variável de cadeia pesada (VH) de imunoglobulina e região variável (VL) de cadeia leve kappa foram amplificados por PCR usando-se a Mistura "Phusion High-Fidelity PCR Master Mix". O resultado de cada reação de PCR foi um produto de amplificação simples que foi purificado usando-se o kit de Purificação de PCR "QIAquick " (Qiagen) de acordo com protocolo do fabricante e a sequência para cada cadeia de imunoglobulina foi obtida. A sequência de consenso da região variável de cadeia leve kappa foi designada 2E2 VK e a sequência de consenso da região variável de cadeia leve pesada foi designada 2E2 VH. A sequência de proteína VK de 2E2 era idêntica àquela do anticorpo de IgG1 de 2C4 de camundongo (vide Kikly e outros, J. Allergy Clin Immunol., 2000; 105:1093-1100) exceto quanto ao primeiro resíduo, onde Gln foi trocado por uma Glu enquanto a a sequência de proteína de 2E2 VH era completamente idêntica àquela de 2C4.

[00266] A construção de vetores de expressão quiméricos implicou a clonagem das regiões variáveis amplificadas para formar vetores de re-gião constante IgG/kappa usando-se a clonagem independente de ligase. Resumidamente, os vetores de pCMV foram digeridos com BfuA1 (BsPM1), o vetor digerido foi purificado por eletroforese de gel, e proje-ções compatíveis no vetor foram gerados por incubação com polimera- se de DNA de T4 e dATP a 100 mM. Para o inserto, sequências de anticorpo foram amplificadas por PCR a partir de cDNA de 2E2 com iniciadores contendo a extremidade 3’ da sequência líder, isto é, iniciador avante (forward), ou o início da região constante (IgG1 ou kappa), isto é, iniciador reverso, seguido pelo início de uma região variável (em cada direção). Os insertos amplificados foram purificados usando-se um kit de purificação de PCR (Qiagen) e projeções complementares foram geradas no inserto por incubação com polimerase de DNA de T4 e dTTP a 100 mM. Vetor e insertos foram incubados a temperatura ambiente e usados para transformar bactérias de TOP10 quimicamente competentes (Invitrogen) que foram subsequentemente laminadas sobre lâminas de cultura contendo canamicina. Vários clones foram isolados e colônias foram triadas por PCR. Clones contendo os produtos de PCR de tamanho correto foram selecionados, DNA foi isolado usando-se um kit de miniprep (Qiagen) e o DNA foi sequenciado.

[00267] Para a geração de um anticorpo de 2C4 quimérico (ch2C4), a região variável de cadeia pesada de 2C4 (VH) e a região variável (VK) de cadeia leve kappa foram sintetizadas (GeneScript) e o mesmo método usado para clonar o anticorpo de 2E2 quimérico foi aplicado. Células de suspensão Expi293 (células de Rim Embriônico de Ser Humano) crescendo em meio de transfecção Expi293 (Invitrogen) e antibióticos foram co-transfectados com construtos que codificam cadeia pesada ch2E2 e cadeia leve de ch2E2 kappa ou construtos que codificam cadeia pesada de ch2C4 e cadeia leve de ch2C4 kappa (1 μg de DNA cada) usando-se Reagente ExpiFectamina 293 provido com o kit de Sistema de Expressão Expi293 (Invitrogen) de acordo com protocolo do fabricante. As células foram criadas em 2 ml de meio de crescimento em lâminas de seis cavidades por 7 dias antes de o meio ser coletado e ensaiado quanto a expressão recombinante de proteína por ELISA.

Atividade de ligação de Siglec-8 de anticorpo quimérico

[00268] Ligação de domínio extracelular (ECD) de Siglec-8 recom- binante de ser humano por anticorpos quiméricos de 2E2 e anticorpos quiméricos de 2C4 de IgG1K foi medida por ELISA. Para o ensaio de ligação de Siglec-8, uma lâmina SpectraPlate de 384 cavidades (Perkin Elmer) foi preparada por cobertura com 30 μL por cavidade de 0,4μg/mL de ECD de Siglec-8 de um dia para o outro a 4°C seguida por remoção da solução de cobertura por lavagem das cavidades no tampão de lavagem (0,1% de Tween 20), e bloqueamento com 90 μL de solução a 5% de BSA/TBS por 2 horas a temperatura ambiente. Diluições em série três vezes de um anticorpo quimérico (ch2E2 ou ch2C4) ou anticorpo de camundongo (m2E2 ou m2C4) em 0,2% de BSA/TBS (concentração de partida foi de 5000 ng/mL) foram adicionadas a cada cavidade coberta. A lâmina foi incubada por 2 horas a temperatura ambiente e as cavidades foram subsequentemente lavadas antes de adição de cabra-anti-human Fc conjugado de peroxidase de Fc de cabra-anti-human (diluição de 1:10000) ou anti-camundongo Fc conjugado de peroxidase de Fc de anti-camundongo (diluição de 1:30000) diluído em 0,2% de solução de BSA/TBS. A lâmina foi incubada por 45 minutos a temperatura ambiente, seguida por lavagem e adição de 30 μL de substrato de K-blue HRP (SkyBio Ltd) a cada cavidade. Depois de incubação a temperatura ambiente por 15 minutos, a reação foi parada por adição de 10 μL de solução de ‘Red Stop’ (SkyBio Ltd) a cada cavidade. A densidade ótica das amostras experimentais foi lida a 650 nm usando-se o leitor de ELISA PHERAStar FS (BMG Labtech).

[00269] Ambos os anticorpos quiméricos ligaram-se completamente a ECD de Siglec-8 com valores de EC50 comparáveis. Anticorpo quimérico ch2E2 ligou-se a ECD de Siglec-8 com um valor inferior de EC50 em comparação com anticorpo de camundongo m2E2 (Tabela 2). Tabela 2. Anticorpoque se liga a ECD de Siglec-8 de ser humano.

Exemplo 2: Geração e caracterização de anticorpos de anti-Siglecanti-Siglec-8 de ser humano.

[00271] A sequência do anticorpo quimérico 2E2 e anticorpo quimérico 2C4 foi usado para desenhar versões humanizadas dos anticorpos 2E2 de camundongo.

Métodos e Results Desenho de anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano

[00272] As sequências de proteína de imunoglobulinas de ser humano e de camundongo oriundas da ‘International Immunogenetics Database 2009’ (Lefranc, MP., Ácido nucléico Res., 2003, 31(1):307- 10) e da ‘Release (Liberação) 5’ da ‘Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest’ (última atualização de 17 de Novembro de1999) (Kabat e outros, NIH National Technical Information Service, 1991, 1-3242) foram usadas para compilar uma base de dados de sequências de imunoglobulinas de ser humano em alinhamento de Kabat. A base de dados compilada continha 10.906 sequências VH e 2.912 sequências VK.

[00273] Um modelo de homologia de regiões variáveis de anticorpo de camundongo 2C4 tinha sido calculado usando-se o programa Modeller (Eswar e outros, Curr. Protoc. Bioinformatics, 2006, Ch. 5:Unit 5.6) incluído na embalagem do Discovery Studio (Accelrys, Inc.). As coordenadas atòmicas de 1a7O.pdb, 1dqd.pdb e 1ORS.pdb eram os mais altos modeloos de identidade de estrutura de sequências para as VH, VL e esqueleto/interface, respectivamente, como determinado pela análise da ‘Basic Local Alignment Search Tool’ (BLAST) da base de dados de estruturas de pdb de anticorpo (Accelrys, Inc.). Esses mode- loos foram usados para gerar 30 modeloos iniciais da estrutura e o mais baixo modelo de energia foi usado para gerar 20 modeloos de laços (com todos os laços de CDR incluídos), com seus 5 melhores de modeloos de laços, usando-se a definição de Kabat para finalmente gerar um modelo final de camundongo 2C4.

[00274] A humanização exigiu a identificação de regiões humanas V adequadas. O programa de análise de sequências de Gibbs (MRCT) foi usado para interrogar as bases de dados de VH e VK de ser humano com sequências de proteínas de VH e VK de 2C4 usando-se vá- rious critérios de seleção. Usando-se o programa do Discovery Studio (Accelrys), resíduos de estrutura (FW) dentro de 4Â dos Resíduos de CDR (definição de Kabat) no modelo final de homologia de anticorpo de camundongo 2C4 foram identificados, e designados como o "envelope de CDR de 4Â". Não havia sequências VH de ser humano compartilhando identidade de comprimento 1, 2 e 3 de CDR com 2C4 que possuísse um elevado envelope de CDR de 4Â e/ou identidade de VCI para VH de 2C4. AF471521 foi o próximo melhor candidato com um tamanho de CDR3 de 14 resíduos com a mais alta classificação de identidade de resíduos de estrutura chave (19/24 4Â envelope e 18/22 VCI), embora as outras sequências tinham diferenças adicionais, que as tonaram em prioridade mais baixa. No entanto, AF471521 tinha 11 mutações somáticas oriundas de seu gene X92218 de VH de linha de germes. A fim de mitigar as mutanções somáticas, qualquer resíduo de estrutura que diferiu de linha de germes e/ou não foi conservado no camundongo foi retro-mutado em sequência de linha de germes de ser humano. Poranto seis resíduos de estrutura foram retro-mutados em linha de germes e os remaining cinco resíduos restantes que diferiam da linha de germes eram resíduos de estrutura chave e eram idênticos à sequência camundongo.

[00275] Uma vez que uma estrutura humana aceitante adequada foi identificada usando-se um modelo de homologia do anticorpo de 2C4, a proteína sintética e sequência de DNA foram projetadas por enxerto das CDRs do anticorpo de 2E2 sobre a estrutura humana aceitante. O projeto inicial de 2E2RHA foi o enxerto de CDR 1, 2 e 3 de VH de 2E2 no FW aceitante de AF471521. Intercalação das CDRs de VH de 2E2 (tonalidade cinza) na sequência de FW de AF471521 resultou no projetado de 2E2RHA, a variante humanizada inicial (FIGURA 1). Cinco resíduos de envelope de CDR de 4Â /VCI, nas posições 24, 48, 49, 67 e 68 de Kabat , não foram conservads em 2E2RHA, e esses foram re tro-mutados para o resíduo equivalente de camundongo, na versão humanizada 2E2RHB ou mutada um de cada vez nas seguintes va-riantes:sequências foram montadas in silico e foram designadas 2E2RHA através de 2E2RHG ( FIGURA 1).

[00276] A fim de humanizar a cadeia leve, uma cadeia kappa de ser foi identificada em um processo similar àquele da cadeia pesada. AY867246 foi a sequência com a identidade mais alta com 2E2 VK no envelope de 4Â CDR /VCI mas tinha seis mutações somáticas. AY867246 foi descartado em favor de X93721, que continha 21/25 4Â envelope e 15/17 VCI e apenas uma mutação somática a partir do gene VK de linha de germes mais próxima , X01668. A estrutura oriunda de X93721 foi usada para projetar o DNA e proteína para os constru- tos humanizados. CDR 1, 2 e 3 de 2E2 VK (tonalidade cinza) foram enxertados no FW aceitante de X93721 para gerar 2E2RKA ( FIGURA 2). Há quatro resíduos de enveleopo de 4Â CDR, 3, 47, 58 e 71não emparelhados em 2E2RKA que foram retro-mutados nos resíduos de camundongo equivalentes na variante 2E2RKB ou individualmente nas seguintes variantes: sequências foram montadas in silico e foram designadas 2E2RKA através de 2E2RKG ( FIGURA 2).

Geração de anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano

[00277] Os genes para 2E2RHA e 2E2RKA foram sintetizados (GenScript) e códon otimizado para sequências humanas. As sequências de estrutura humanas naturais AF471521 e X93721, cadeias leve e pesada, respectivamente, e as sequências de CDR de camundongo naturais foram montadas in silico e designadas2E2RHA através de 2E2RHG e 2E2RKA através de 2E2RKG. Usando-se software algorít- mos (GenScript), as sequências foram otimizadas por mutagênese silenciosa para usar códons preferencialmente utilizados por células humanas e sintetizadas. Construtos de RHA/B e RKA/B foram aplicados por PCR com iniciadores específicos ao vetor de expressão e inserto, como descrito acima no Exemplo 1 para a ampliação por PCR dos anti-corposquiméricos, e inseridos para dentro de vetores de região constante de IgG/kappa por reações de clongem independente de ligase e usados para transformar TOP10 bacteria como descrito no exemplo 1 para a geração de anticorpos quiméricos. RKA e RHA foram subsequentemente modificados por mutagênes de PCR usando-se o kit de mutagênese de sítio-dirigida (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante para se obter todas as variantes de anticorpo de ser humano (FIGURA 1, FIGURA 2, Tabela 3, Tabela 4, e Tabela 5). Tabela 3. Sequências de aminoácidos de variáveis de variantes de an-ticorpo humanizadas e quiméricas

Tabela 4. Sequências de aminoácidos de HVRs oriundas de variantes de anticorpo humanizadas e de 2E2

Tabela 5. Sequências de aminoácidos de FRs oriundas variantes de anticorpo humanizadas e de 2E2

[00278] Clones foram sequenciados e DNA de plasmídio de ex- pressão foi preparado usando-se o kit Plasmid Miniprep Kit (Qiagen) ou PureYield Plasmid Maxiprep System (Promega) de acordo com pro-tocolo do fabricante . Preparações de plasmídio de expressão que co-dificam VH e VK quiméricas ou humanizadas foram usadas para trans- fectar células de Expi293 (Invitrogen) como descrito acima no Exemplo 1. As células foram cultivadas por 7 dias em meio livre de soro, após o que o meio condicionado oriundo das células foi coletado e foi analisado por ELISA para confirmar a produção dos anticorpos.

Ligação de Siglec-8 por anticorpos codificados por contrutos de VH e VK humanizados

[00279] Cadeias leve e pesada humanizadas básicas foram emparelhadas com seus correspondentes quiméricos em uma tentativa de identificar quaisquer problemas grosseiros com o projeto de humanização. Anígeno de Siglec-8 foi usado para medir ligação de anticorpo por ELISA como descrito no exemplo 1. 2E2RHB, quando emparelhado com a cadeia leve quimérica, parecia ser mais potente do que a cadeia pesada de RHA, embora RKB construto em associação com o construto quimérico de cadeia pesada (cVH) ligasse antígeno de Si- glec-8 com a mais alta potência então ambos os construtos de cVK se emparelhassem. Esses resultados confirmaram que projeto de humanização para ambas as cadeias leve e pesada estavam aproximadamente corretos e todo o Siglec-8 ligado mas que outro trabalho foi necessário para identificar anticorpos humanizados adicionais com melhores características de ligação.

Ligação de Siglec-8 por todoso os anticorpos humanizados combinados com correspondente quimérico

[00280] A totalidade de cadeias leve e pesada de anticorpo totalmente humanizado foram combinadas e foram comparadas com o anticorpo quimérico para determinar se substituição dos resíduos de es-truturacanônicas e 4Â e resíduos de interfase foram suficientes para humanizar com sucesso 2E2. Células de Expi293 foram co- transfectadas com combinações de diferentes vetores de cadeia leve humanizados em associação com diferentes vetores de cadeia pesada humanizados. Antígeno de Siglec-8 foi usado para medir ligação de anticorpo por ELISA como descrito no exemplo 1. A ligação desses anticorpos a Siglec8 em comparação com o controle quimérico mostrou que HBKA e HBKB apareciam ser combinações melhores do que HAKA e HAKB (Tabela 6).

Ligação de Siglec-8 por anticorpos totalmente humanizados

[00281] A fim de determinar a importância relativa das substituições de aminoácidos simples na cadeia pesada, as cadeias pesadas humanizadas de RHC (A24V), RHD (V48L), RHE (S49G), RHF (F67L) e RHG (T68S) foram expressas em combinação com todas as variantes de cadeia leve e em comparação com as versões de RHA e RHB e o controle de anticorpo quimérico. Os resultados desses anticorpos que se ligam a Siglec-8 ECD sugeriam que todos estas combinações de anticorpos humanizados ligavam Siglec-8 na mesma potência exceto quanto a famílias RHA, RHF e RHG (com todas as variantes de cadeia leve) (Tabela 6).

[00282] Foi determinado a seguir se mudança do nível de cadeia RKA em RKB, com substituições de aminoácidos simples, afetaria ligação de anticorpo. Ligação de anticorpos que consiste de combinações de todas as variantes de cadeia pesada com cadeias leves RKC (V3I), RKD (V48L), RKE (L47W) e RKF (E58V), em comparação com o anticorpo quimérico e as versões de RKA e RKB foi avaliada. Não apareceu haver uma variante de cadeia leve que significativamente afetou o padrão de ligação (Tabela 6). Adicionalmente, a relevância do resíduo de cadeia leve linha de germes F71Y (RKG) foi também examinado em combinação com todas as variantes de cadeia pesada e os resultados demonstraram que esse resíduo em geral causou um grande declínio na ligação.

[00283] Parecia que HEKA e HEKF foram os melhores anticorpos candidatos contra Siglec-8. Portanto uma ELISA foi realizada para re- testar os anticorpos que ligados com a potência mais alta ao antígeno em comparação com tanto o anticorpo quimérico quanto HEKA e HEKF como controles. Os resultados indicavam que as diferentes combinações de cadeias leves humanizadas e cadeias pesadas humanizadas ligadas de um modo similar a Siglec-8, apesar das combinações com RHA (Tabela 6). Os resultados realçavam que HEKA e HEKF foram candidatos muito bons e foram comparados favoravelmente com o controle positivo quimérico e tinham resíduos de camundongomínimos nas estruturas. Geração de 2E2RH versão 2 e variantes mutadas de CDR

[00284] Uma cadeia pesada humanizada subsequente foi gerada com base no gene de linha de germes gene mais próximo. A sequência de linha de germes de IGHV4-59, a linha de germes mais similar a 2E2VH ( FIGURA 1), foi usada para projetar o enxerto das CDRs de camundongo, foi sintetizada (GenScript) e foi preparada do mesmo modo que os outros construtos descritos acima, para gerar anticorpos humanizados para comparação com a primeira versão de cadeias de RHA e RHB. Adicionalmente, para determinar se o anticorpo poderia tolerar certos resíduos de CDR3 sendo mudados na linha de germes. Três mutações foram introduzidas na CDR3 da cadeia pesada de variante de RHE (mutações simples ou triplas) e uma mutação na CDR3 de cadeia leve de RKA e RKF ( FIGURA 3) por mutagênese de síti- dirigida. Anticorpos contendo RHE mutados ou RKA/RKF mutados foram expressos e foram combinados com o painel completo da cadeia complementar usando-se o mesmo método descrito acima.

[00285] As CDRs de cadeia pesada enxertada para dentro de linha de germes de ser humano quando comparada com as outras versões de cadeia pesada versions. O enxerto direto (RHA2) rompeu comple- tamente a ligação ao antigen e a estrutura de linha de germes com os resíduos de 4Â/VCI retro-mutados para camundongo (RHB2) comportou-se muito similarmente à primeira variante de RHB mas continha 10 resíduos de camundongo em comparação com os 5 de RHB. Os dados de ligação ilustravam a influência de introdução de mutações em CDR3 de ambas as cadeias e sugeriam que as mutações na cadeia pesada tinha um efeito nocivo na ligação a Siglec-8 embora a mutação de cadeia leve por si próprio também não provesse muito aperfeiçoamento, embora os melhores anticorpos eram aqueles contendo RHB (todas as retro-mutações de camundongo) e RHE, o candidato de cadeia pesada (Tabela 6). Tabela 6. Anticorpo que se liga a ECD de Singlec-8 de ser humano.

[00286] Observação: Cada coluna representa uma experiência; NA indica não disponível.

Termoestabilidade de anticorpos candidatos humanizados a altas temperaturas

[00287] A termoestabilidade dos anticorpos humanizados foi com- parada. Os anticorpos foram submetidos a temperaturas mais altas, que variam de -20 a 85°C por 10 minutos, foram resf riados para a temperatura ambiente e foram avaliados em um ensaio de ELISA em uma concentração de EC80 de cada candidato. Os candidatos de anti-corpolíder apareciam estáveis (a FIGURA 4). O HEKA/KF com anticorpos mutados com CDRL3 (isto é, CDR3 da cadeia leve) foram totalmente inativos a 68°C, embora o quimérico fosse inativo a 70°C, temperatura essa em que os candidatos líder HEKA e HEKF eram ainda 25-50% ativos, apenas mostrando inatividade completa a 75°C.

Determinação de Tm de anticorpos candidatos humanizados

[00288] A fim de determinar a temperatura de fusão dos anticorpos líder, o quimérico, HEKA, HEKF e os mesmos candidatos humanizados com a mutação de CDRL3 (isto é, CDR3 da cadeia leve) foram purificados em uma cromatografia por afinidade de 2 etapas e sistema de filtração de gel e foram testados em um ensaio de deslocamento térmico. Anticorpos foram incubados em duas concentjrações diferentes com um corante fluorescente (Sypro Orange) para 71 ciclos com aumento de 1°C por ciclo em um ciclador térmico de qPCR. Tm foi definido como temperatura para 50% de fluorescência máxima. Tm para o quimérico e os cinco anticorpos humanizados confirmavam os resultados obtidos em um ensaio de termoestabilidade: os anticorpos mais estávies foram HEKA e HEKF tendo uma Tm mais alta do que os outros anticorpos humanizados testados. HEKA tem uma Tm mais alta do que o anticorpo quimérico ( FIGURA 5 e Tabela 7). Tabela 7. Tm de e anticorpos humanizados e quiméricos

Afinidade e avidez de anticorpos candidatos humanizados

[00290] Determinação de avidez de anticorpo foi realizada por análise de SPR usando-se uma Biacore T200. Ligação de proteína de ECD de Singlec-8 de ser humano a anticorpos de anti-Siglec-8 de camundongo, quimérico e humanizado foi medida em uma Biacore T100. Os anticorpos de captura (cabra-anti-humano-Fc e cabra-anti- camundongo-Fc oriundo de Jackson Immunoresearch) foram imobilizados em uma lasca de CM5 de acordo com o protocolo do fabricante (Biacore, GE). Célula de fluxo 1, 2 e 3 foram imobilizadas com antihumana, e célula de fluxo 4 com anticorpos de anti-camundongo. O ensaio foi conduzido a 25oC, a uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Tampão de ensaio foi de Tris-HCl a 20 mM pH 8,3, cloreto de sódio a 150 mM, 0,05% de Polissorbato 20, 10% de glicerol, 0,1% de BSA, made em água ultra-pura. Dímeroic Siglec-8 (impurezas de Siglec-8 mono- mérico ou oligomérico foram removidas por cromatografia de exclusão por tamanho) foi diluído em tampão de ensaio de 15 nM a 1,88 pM com diluições de 2x . Anticorpos foram capturados para uma mudança de aproximadamente 120 RU. Injeções de alto desempenho de seis minutos foram realizadas, seguida por dissociações de 120 minutos. Células de fluxo foram regeneradas com glicina a 50 mM e pH 1,5. Resultados foram obtidos com testes duplos em branco com uma célula de referência vazia e injeções de tampão de ensaios múltiplos, e analisados com parâmetros de ajuste global de 1:1.

[00291] A avidez de anticorpos de 2E2 de camundongo e anticorpos de 2E2 quiméricos foi determinada como sendo 28 pM e 16 pM, respectivamente (Tabela 8). As avidezes para os anticorpos humanizados eram 17 pM para HEKA e 21 pM para HEKF que indicaram que a humanização com successo retiveram e melhoraram a atividade de ligação. Tabela 8. Determinação de avidez de anticorpos de camundongo, quiméricos e humanizados

[00292] Determinação de afinidade de anticorpos foi também realizada por interferometria de bio-camada (ForteBio). A ligação de fragmentos de Fab de anticorpos de anti-Siglec-8 de camundongo, quiméricos e humanizados a proteína de Siglec-8 de ser humano foi medida em um ForteBio Octet Red 384. O ensaio foi realizado a 25oC, a uma RPM de 1000 em tampão de ensaio. Tampão de HBS com tampão de 1x ForteBio Kinetics foi feita a partir de soluções de estoque (Biacore BR-10670, ForteBio18-132 respectivamente) em em água ultrapura. Fragmentos de Fab (anticorpos foram digeridos com papaina imobilizada Thermo-Pierce de acordo com as especificações do fabricante) foram diluídos foram diluídos em tampão de ensaio de 50nM a 1,56nM com diluições de 2x. A proteína etiquetada de Fc Siglec-8 foi imobilizada sobre sensores de Captura de Anti-humano a 100nM em tampão de ensaio por 3 min para uma mudança em nm de aproximadamente 1,2. Associações de dois minutos foram realizadas, seguidas por dissociaçõesde 10 minutos. Resultados foram obtidos com teste em branco com um sensor de AHC de referência vazio e analisados em software de análise ForteBio com parâmetros de ajuste global de 1:1 .

[00293] A afinidade de fragmentos de Fab de 2E2 de camundongo e 2E2 quiméricos foi determinada como sendo 536 pM e 585 pM, res- pectivamente (Tabela 9). As afinidades para os anticorpos humanizados foram 464 pM para HEKA e 592 pM para HEKF que indicaram que a humanização com successo reteve a atividade de ligação para esses dois anticorpos humanizados. HEKA tinha uma afinidade monovalente para Siglec-8 do que 2E2 de camundongo e quimérico nesse ensaio. As afinidades para as variantes de anticorpo humanizadas, HEKAmut e HEKFmut, também onde na faixa picomolar com uma KD de 902 pM e 1160 pM, respectivamente. Tabela 9. Afinidade determinação de anticorpos de camundongo, quí- mericos e humanizados

Solubilidade de anticorpos candidatos humanizados

[00294] Os anticorpos candidatos e quiméricos purificados foram sequencialmente concentrados usando-se dispositivos de filtragem de centífuga (Amicon 30K 4 mL, 4000 g 5 min - primeira concentração; Amicon Ultra 0,5 mL 3K, 14000 g - após as concentrações) e a con-centração media a cada etapa. Todas as amostras foram concentradas em total por um fator de até 21-24 sem precipitar e foram testadas por ELISA que mostrou que nenhum tinha perdido potência de ligação a Siglec-8. Os anticorpos não foram propensos a precipitação a con-centrações até pelo menos 25 mg/mL. Especificamente, solubilidade para ch2E2 foi pelo menos 18mg/mL, para HEKA foi pelo menos 25mg/mL, para HEKF foi pelo menos 8 mg/mL, para HEKAmut pelo menos 29 mg/mL, e HEKFmut pelo menos 17 mg/mL.

Agregação de anticorpos candidatos humanizados

[00295] Amostras foram filtradas antes da análise para remover qualquer precipitação de sal ou de proteína e concentrações foram re- medidas. Elas foram então injetadas a 0,4 mL/min para dentro de uma coluna de exclusão por tamanho em um sistema de HPLC e foram analisadas por dispersão de luz de múltiplos ângulos para determinar as massas molares absolutas e foram checadas quanto a agregação. Todas as variante não mostraram nenhum sinal de agregação com um peso molecular médio que varia de 134,9-138,2 kDa, que era a faixa esperada para um monômero de IgG nesta análise (Tabela 10).

[00296] Todas as amostras foram monidispersas (Mw/Mn < 1,05). No entanto, os mapas de análise de distribuição mostraram a presença de variantes de glicosilação (ch2C4, HEKA e HEKFMut). Os mapas de análise de distribuição também mostram a presença de uma espécie de ~105-120k Da em todas as amostras, que poderia ser desintegrada anticorpo ou uma variante de baixa glicolisação. As recuperações de massa estavam entre 82,9-102,8% (massa calculada sobre massa injetada), que indicava boa recuperação de proteína e as amostras não parece aderir à coluna ou contêm agregados insolúveis, que seriam retidos pela coluna de guarda. No geral os dados indicavam que não havia nenhuma agregação significativa em qualquer uma das amostras de anticorpo de anti-Siglec-8 samples analisada (Tabela 10). Tabela 10. Análise de agregaçaõ de anticorpos de variante químericos e variantes humanizados

Estabilidade de congelamento - descongelamento de anticorpos candidatos humanizados

[00297] Anticorpo de ch2C4 quimérico purificado, anticorpos de HEKA e HEKF humanizados, e variantes de anticorpo de HEKAmut e HEKFmut humanizadas foram submetidos a -20°C por 60 minutos, foram descongelados a temperatura ambiente e foram usados em um ensaio de ELISA na concentração de EC80 para cada candidato. HEKA mostrou a estabilidade mais alta nesse ensaio (A FIGURA6).

Atividade de ADCC de anticorpos não fucosilados Materiais

[00299] Tampão de lise de RBC (10X tampão de lise de RBC): Diluir a 1X como dirigido pelo fabricante (eBioscience, 00-4300-54).

[00300] PBS: DPBS sem Ca2+/Mg2+ (Hyclone, SH30028.02).

[00301] RPMI Completo: RPMI-1640 filtrado estéril (Invitrogen) com 10% de FBS.

[00302] Placa de fundo em U de 96 cavidades (Falcon, 353077).

[00303] Ensaio de LDH: ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96 (Promega, G1780)

[00304] Tampão FIX: 1 - 4% de paraformaldeído em PBS. Preparar a partir de 16% de paraformaldeído (grau de EM, livre de metanol) por diluição em PBS (Electron Microscopy Diatom, 50-980-488).

Métodos

[00305] Para testar ADCC e atividade apoptótica de anticorpos de anti-Siglec-8 em eosinófilos, leucócitos de sangue periférico frescos (PBLs) foram incubados com anticorpos de 2E2 de camundongo e quiméricos. Anticorpo Ig1 de 2E2 quimérico de baixo teor de fucose mostrou a matança mais potente de eosinófilos e tinha potência significativamente mais alta do que IgG1 de 2E2 quimérico fucosilada consistente com atividade de ADCC mais alta para a forma de baixo teor de fucose do anticorpo ( FIGURA 7).

[00306] Para a avaliação de atividade de anticorpo de anti-Siglec-8 em leucócitos de sangue periférico totais, PBLs são obtidos por méto-dospadrão a partir de sangue do doador coletado menos do que 24 horas desde a coleta e sáo ressuspensos em Meio de RPMI completo. As células são contadas e ajustadas para 10 x 106/mL em Meio de RPMI completo e laminadas a 100 μL/cavidade em uma placa de fundo em U de 96 cavidades estéril. Anticorpo anti-Siglec-8 é adicionado a uma concentração entre 0,0001 ng/mL to 10 μg/mL. Lâminas são centrifugadas a 200 g por 1 minuto e são incubadas em uma incubadora de 37oC umidificada a 5% de CO2 por > 4 horas. As populações de células são avaliadas por citometria de fluxo para avaliar depleção de eosinófilos e basófilos, por exemplo, usando-se reagentes mostrados na tabela 11 e são avaliadas por citometria de fluxo. Remoção de células granulares positivas a CCR3, negativas a CD16- (alta dispersão lateral) pode ser usada para detectar depleção de eosinófilos. Contagens de basófilos podem ser determinadas, por exemplo, por análise de células de baixo espalhamento positivas a CCR3. Tabela 11. Reagentes

[00307] Para a avaliação da capacidade de anticorpos de anti- Siglec-8 para induzir apoptose em eosinófilos purificados, revestimento da cor de couro fresco coletado menos do que 24 horas uma vez que coletado a partir de uma amostra de sangue ou um produto de sangue é usado. Purificação de eosinófilos é conduzida após as instruções do fabricant (Miltenyi Eosinophil Isolation Kit, 130-092-010). Eosinófilos purificados são ressuspensos a 1 x 106/mL em meio de RPMI Completo e são cultivados na presença ou na ausência de IL-5 (a uma concentração de cerca de 1 ng/mL a cerca de 50 ng/mL) de um dia para o outro. No dia seguinnte, eosinófilos cultivados são coletados por lavagem repetida da placa ou do frasco. As células são centrifugadas a 200 - 400 g por menos do que 10 minutos e são ressuspensas a 1 x 106/mL em meio de RPMI completo. Eosinófilos são laminados a 100μL/cavidade em uma placa de fundo em U de 96 cavidades estéril. 100 uL de reagentes 2X preparados no Meio de RPMI completo são adicionados a cada cavidade e diluições são preparadas as descrito acima. As placas são centrifugadas a 200 g por 1 minuto e são incubadas em uma incubadora a 37oC umidificada a 5% de CO2 por > 4 horas. Manchamento com Anexina-V é realizado de acordo com instruções do fabricante, e apoptóticos e células necróticas são analisados por citometria de fluxo.

[00308] Para avaliação de atividade de ADCC e apoptótica de anticorpos de anti-Siglec-8 em mastócitos isolados, mastócitos humanos são isolados de tecidos humanos de acordo com protocolos publicados (Guhl e outros, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2011, 75:382-384; Kulka e outros, In Current Protocols in Immunology, 2001, (John Wiley & Sons, Inc.)) ou diferenciados de células tronco hematopoiéticas de ser humano, por exemplo, como descrito por Yokoi e outros, J Allergy Clin Immunol., 2008, 121:499-505. Mastócitos purificados são ressus- pensos a 1 x 106/mL em Meio de RPMI completo em um placa de fundo em U de 96 cavidades estéril e são incubados na presença ou absence de anticorpos de anti-Siglec-8 por 30 minutos a concentrações que variam entre 0,0001 ng/ml e 10 μg/ml. Amostras são incubadas por umas outras 4 a 16 horas com e sem células matadoras naturais (NK) purificadas ou PBL fresco para induzir ADCC. Matança de células por apoptose ou ADCC é analisada por citometria de fluxo usando-se anticorpos conjugados fluorescentes para detectar mastócitos (CD117 e FcεR1) e Anexina-V e 7AAD para discriminar células vivas ou mortas. Manchamento com Annexina-V e com 7AAD são realizados de acordo com intruções do fabricante.

Avaliação de atividade de depleção de eosinófilo de anticorpos huma- nizados in vitro

[00309] Anticorpos humanizados foram avaliados quanto sua capacidade de induzir depleção de eosinófilos mediada por Siglec-8 a partir de sangue humano normal in vitro em comparação com o anticorpo de 2E2 de camundongo.

[00310] Leucócitos de sangue periférico (PBL) oriundos de sangue de doador humano coletados menos do que 24 horas depois da coleta foram ressuspensos no meio de RPMI completo [(meio RPMI-1640 (Invitrogen, Número de catálogo A10491-01) suplementado com 10% de soro bovino fetal)]. Células foram ajustadas para 107 por mL em Meio de RPMI completo suplementado com 50 ng/ml de IL-5 humana recombinante (R&D Systems, Número de catálogo 205-IL-025) e laminadas a 100 μL/cavidade em uma placa de fundo em U de 96 cavidadesestéril. Anticorpos de anti-Siglec-8 foram adicionados a concentrações que variam de 0,1 pg/mL e 10 μg/mL (isto é, 1 pg/mL, 10 pg/mL, 0,1 ng/mL, 1 ng/mL, 10 ng/mL, 0,1 μg/mL, 1 μg/mL, e 10 μg/mL) para determinar a reposta de dose e concentração provendo 50% de deple- ção máxima de eosinófilo (EC50). Placas foram centrifugadas a 200 g por 1 minuto e foram incubadas em uma incubadora de 37oC umidifi- cada a 5% de CO2 por 16 horas. Incubação de PBLs com anticorpos de anti-Siglec-8 por 16 horas na presença deeosinófilos sensibilizador por IL-5 a apoptose mediada por Siglec-8. As populações de células foram avaliadas por citometria de fluxo para avaliar depleção de eosi- nófilos. Depleção de eosinófilo foi detectado pela remoção de células granulares positivas a CCR3 (alta dispersão lateral).

[00311] Cada um dos anticorpos humanizados testados, com a exceção do anticorpo de IgG1 de HEKAmut , mostrou potência equivalente ou aumentada (isto é, EC50 mais baixa) em comparação com o anticorpo de 2E1 de camundongo para a depleção de eosinófilos humanos (Tabela 12). A potência de anticorpo para a depleção de eosi- nófilos humanos não era dependente do isótipo como o anticorpo de IgG1 de HEKA e Anticorpo de IgG4 de HEKA mostrou potência similar. Tabela 12. Potência de anticorpos de anti-Siglec-8 de ser humano para a depleção de eosinófilos in vitro

[00312] EC50 média indica concentração de anticorpo semi-máxima exigida para depleção de eosinófilo de 2 ensaios independentes .

Anticorpos de anti-Siglec-8 com um active isótipo ativo são capazes de induzir matança mediada por ADCC de mastócitos humanos in vitro e in vivo.

[00313] Para gerar um anticorpo de anti-Siglec-8 humanizado com atividade de ADCC mediada por receptor de Fc potente, o anticorpo de IgG1 de HEKA foi expresso a partir de uma linha de células de CHO deficiente em fucosil transferase-8 (Lonza, Potelligent CHOK1SV cells) para gerar um anticorpo com carboidratos que carem de alfa1,6 de fucose (isto é, anticorpo não fucosilado). Um anticorpo de anti-Siglec-8 monoclonal de camundongo com um isótipo de IgG2a de camundongo (isto é, anticorpo de 1C3) que reconhece uma diferente região de Si- glec-8 extracelular do que o anticorpo de IgG1 de HEKA foi gerado como descrito no exemplo 3. O anticorpo de 1H10 quimérico contém as regiões V de camundongo anticorpo monoclonal 1H10 e regiões constantes IgG1 kappa humanas. Anticorpo de 1H10 quimérico foi expresso a partir da linha de céulas de 293TS humana cultivadas na presençade Kifunensine a 10 μM para gerar anticorpo de baixo teor de fucose e purificado por cromatografia por afinidade de proteína A.

[00314] A capacidade de anticorpo de IgG1 de HEKA não focalisa- do e anticorpo de baixo teor de fucose de 1H10 quimérico para induzir atividade de ADCC mediada por célula de NK contra mastócitos humanos foi avaliado in vitro. Mastócitos humanos primários isolados por lavagem da cavidade peritoneal de camundongos de NSGS imunode- ficientes enxertados com células tronco hematopoiéticas humanas. Mastócitos foram incubados por 48 horas com 10 μg/ml de anticorpo de IgG1 de HEKA não fucosilado, anticorpo com baixo teor de fucose de 1H10 quimérico, anticorpo de IgG4 de HEKA ou anticorpo de IgG1 humano de controle de isótipo, e com células efetoras de CD56+CD16+ NK humanas purificadas em um efetor para direcionar razão de célula (E:T) de 10,75:1. Atividade de ADCC foi determinada por liberação de LDH usando-se um kit de ensaio de citotoxicidade CytoTox 96 (Promega, Número de catálogo G1780). Anticorpo de IgG1 de HEKA não fucosilado e anticorpo 1H10 quimérico com baixo teor de fucose induced marked ADCC-mediated killing de mastócitos humanos depois de 48 horas ( FIGURA 8A). Liberação de LDH induzido por anticorpo de anti-Singlec-8 com baixo teor de fucose ou não fucosilado foi de 38-53% da liberação de LDH máxima induziu o uso de solução de lise (Promega, Número de catálogo G1821).

[00315] A capacidade de anticorpos de anti-Siglec-8 para depletar Siglec-8-positive mastócitos in vivo foi avaliada em um modelo de camundongo transgênico em que Siglec-8 de ser humano é seletivamente expresso na superfície de mastócitos, eosinófilos e basófilos. Camundongos foram tratados duas vezes por injeção intra-peritoneal com 100 μg de Anticorpo de IgG4 de HEKA, anticorpo humanizado não fu- cosilado de IgG1 de HEKA IgG1, anticorpo de 1C3 de camundongo (de camundongo IgG2a isótipo) ou anticorpo de controle de isótipo de IgG1 humano. As duas injeções intra-peritoneal foram administrados em intervalo de 48 horas e mastócitos peritoneais foram isolados por lavagem do peritôneo 48 horas depois da segunda injeção. Administração de anticorpo de IgG1 de HEKA não fucosilado e anticorpo de 1C3 de camundongo levaram a depleção de mastócitos peritoneais. Em contraste com isso, anticorpo de IgG4 de HEKA não mostrou de- pleção de mastócito significativo, indicando que um isótipo ativo é necessário para depleção in vivo de mastócitos ( FIGURA 8B). Estes resultados demonstram que dois diferentes anticorpos de anti-Siglec-8 com um isótipo ativo, isótipo de IgG2a de camundongo ou isótipo não fucolisado de IgG1 humano, dirigidos contra diferentes regiões do domínio extracelular de Siglec-8, podem depletar mastócitos positivos a Siglec-8 in vivo.

[00316] Estes resultados forarm inesperados uma vez que Siglec-8 foi descrito como sendo rapidamente internalizado e portanto não adequado para a indução de atividade de ADCC. Vide O’Reilly e outros, Trends Pharmacol Sci., 2009, 30(5):240-248.

[00317] Anti-Siglec-8 humanizado inibe uma reação de anafilaxia cutânea passiva induzida por IgE por mastócitos humanos in vivo

[00318] Camundongos imunodeficientes capazes de gerar de mas- tócitos humanos abundantes depois de enxerto com células tronco hematopoiéticas humanas (HSC) foram descritos (Tanaka e outros, J Immunol., 2012, 188(12):6145-55). A cepa de camundongo designada NSGS (The Jackson Laboratory) é um derivado do camundongo de imunodeficiência combinada de severa/não obeso diabético (NOD SCID) com a deleção do gene de cadeia gama de receptor de IL-2 (camundongo de NSG). Camundongos de NSGS são adicionalmente transgênico para 3 citocinas humanas (fator de célula tronco [SCF], IL-3, e GM-CSF) para facilitar enxerto com células tronco hematopoié- ticas humanas. Após enxerto de camundongos de NSGS, células CD34+ humanas geram eosinófilos humanos e números aumentados de mastócitos humanos. Ambos os tipos de células em camundongos de NSGS enxertados expressam Siglec-8 em níveis comparáveis com os níveis sobre os tipos de células correspondentes isolados a partir de tecidos e sangue periférico de ser humano. Assim, esses camun-dongosprovêem um modelo atraente para avaliação de atividade de anticorpos de anti-Siglec-8 sobre células humanas in vivo.

[00319] A fim de avaliar o efeito de anticorpos de anti-Siglec-8 sobre a atividade de mastócitos in vivo, um modelo de inchaço de orelha mediado por IgE foi estabelecido em camundongos de NSGS humanizados. Nesse modelo, anafilaxia cutânea passiva (PCA), uma reação de hipersensibilidade de tipo I, foi induzida por injeção de IgE de anti- hapteno monoclonal específico (IgE de anti-NP) para dentro de uma orelha 24 horas antes da injeção sistêmica de albumina de soro bovino hapteno-conjugada (NP-BSA). IgE de anti-NP quimérico com uma região constante épsilon de ser humano foi usada para assegurar que respostas específicas de mastócitos humanos a hapteno fossem geradas, e as respostas imediatas e de fase tardia foram medidas por mudanças na espessura de orelha .

[00320] Camundongos de NSGS foram enxertados com HSC de CD34+ humano oito a doze semanas antes do ensaio. IgE de anti-NP monoclonal quimérico com uma região constante de ser humano foi injetado intradermicamente em um camundongo a uma dose de 100 ng na orelha direita para sensibilizar mastócitos de pele de ser humano mas não de camundongo e PBS foi injetado intradermicamente na na orelha esquerda. Vinte quatro horas mais tarde, PCA foi induzida por injeção intravenosa de 0,5 mg de NP-BSA. Os camundongos receberam a administração por injeção intravenosa de 0,1 mg de anticorpo anti-Siglec-8 (isto é, Anticorpo de IgG4 de HEKA) ou anticorpo de controle de isótipo de IgG4 de ser humano 24 horas pré- sensibilização ou 2 horas pós-sensibilização com anti-NP IgE. A espessura de orelha foi medida em pontos de tempos até quatro horas de pós-indução e a 24 horas de pós-indução para determinar as respostas de inchaço de fase precoce e de fase tardia, respectivamente.

[00321] Anticorpo de IgG4 de HEKA evitou ou inibiu tanto as reações alérgicas cutâneas de fase precoce e de fase tardia nesse modelo de PCA in vivo (FIGURA 9). Nessemodelo, a reação de fase precoceé dependente da desgranulação de mastócito e liberação de hista- mina ao passo que a reação de fase tardia é dependente da secreção de mastócito de mediadores de novo sintetizados, incluindo citocinas, bem como infiltração de eosinófilo e basófilo. Anticorpo de IgG4 de HEKA também evitou ou inibiu a resposta de PCA em camundongos de NSGS humanizados quando dosadamente administrado ou 24 horas pré-sensibilização ou 2 horas pós-sensibilização com IgE de anti- NP ( FIGURA 9). Nenhum efeito adverso do tratamento com anticorpo foram observados durante o curso dessas experiências.

Exemplo 3: Geração e caracterização dos anticorpos de camundongo de anti-Siglec-8.

[00322] A região extracelular de Siglec-8 é constituída de três domínios do tipo imunoglobulina: um domínio de conjunto V de terminal N único (Domínio 1) que liga ligantes, seguido por dois domínios de conjunto C (Domínios 2 e 3). Anticorpo1C3 é um anticorpo monoclonal de camundongo com uma cadeia pesada de IgG2a e cadeia leve kappa incitadaas contra um domínio extracelular recombinante de Siglec-8 de ser humano (SEQ ID NO: 74). Anticorpos monoclonais 1H10 e 4F11 são anticorpos de camundongo de cadeia pesada de IgG1 e cadeia leve kappa cultivados contra um domínio extracelular recombinan- te de Siglec-8 de ser humano (SEQ ID NO: 74). Vide Tabela 13. Esses anticorpos foram identificados a partir de um crivo de hibridomas para anticorpos que se ligaram a sequências de Siglec-8 recombinantes oriundas de ser humano (SEQ ID NO: 74) e de primatas não humanos (SEQ ID NO: 118). Tabela 13. Sequências de aminoácidos de HVRs oriundas de anticorpos de camundongo 1C3, 1H10, e 4F11

[00323] Para identificar a região compreendendo o epítopo para anticorpos de anti-Siglec-8, proteínas de fusão contendo cada um dos domínios extracelulares de Siglec-8 fundidos a um Fc de Ig de ser humano foram expressas e purificadas de células de CHO. Proteínas de fusão contendo domínio 1 humano (SEQ ID NO: 115), Domínios 1 e 2 (SEQ ID NO: 116); ou Domínios 1, 2, e 3 (SEQ ID NO: 117) foram usadas em ensaios ELISA para determinação da ligação de anticorpos. Em algumas experiências, a especificidade de anticorpos para Siglec-8 de ser humano foi avaliada em comparação com uma proteína de fusão contendo os domínios extracelulares 1, 2, e 3 de Siglec-8 (SEQ ID NO: 118) do babuíno de oliva (Papio anubis) (sequência XP_009193370.1 de referência do National Center for Biotechnology Information).

[00324] Para os ensaios de ligação de anticorpos, lâminas de ELISA (MaxiSorp; Nunc) foram cobertas de um dia para o outro a 4oC com proteína de fusão a 0,2 μg/ml e bloqueadas por 1 hora a temperatura ambiente com BSA a 2% em PBS. Anticorpos a 1 μg/ml foram adicionados e as lâminas foram incubadoas por 2 horas a temperatura ambiente. Depois de lavagem das lâminas, anticorpo secondário con-jugado a peroxidase de rabano picante foi adicionado e as lâminas foram incubadas por 1 hora. Anticorpos secondários foram H+L HRP anti-humanos (Jackson ImmunoResearch, Número de catálogo 709-035149) para anticorpos humanizados ou H+L HRP de anti-camundongo (Jackson ImmunoResearch, Número de catálogo 715-035-151) para anticorpos de camundongo. As lâminas foram desenvolvidas com Substrato TMB (Sigma, Número de catálogo T0440-1L).

[00325] O anticorpo de 2E2 de camundongo e o anticorpo de IgG1 de HEKA ligados à proteína de fusão de Domínio 1, indicando que o epítopo para esses dois anticorpos reside no domínio de ligação de ligante de N-terminal (Tabela 14). Em contraste com isso, anticorpo de 1C3 de camundongo ligou-se à proteína de fusão de Domínio 1 e Domínio 2, mas não demonstrou ligação detectável à proteína de fusão de Domínio 1, indicando que o epítopo para esse anticorpo não está no domínio 2 (Tabela 14). Tabela 14. Ligação de anticorpos de anti-Siglec-8 a epítopos em Si- glec-8 de ser humano

[00326] Os anticorpos 4F11 e 1H10 de camundongo ligaram-se a Siglec-8 de ser humano e a prevista sequência de proteína de Siglec-8 do babuíno de oliva (Papio anubis) (sequência XP_009193370.1 de referência do National Center for Biotechnology Information). Em crivos de ELISA de proteínas de fusão de domínio e em "Western blots" de géis de SDS-PAGE reduzidos, 4F11 reconheceu um epíitopo linear no Domínio 1 de Siglec-8 de ser humano e 1H10 reconheceu um epíi- topo linear that incluiu sequências em Siglec-8 de ser humano Domínio 3. 1C3 não reconheceu sequências desnaturadas em Domínio 2 de Siglec-8 de ser humano indicando que ele reconheceu um epítopo conformacional. Anticorpos 4F11 e 1H10 mostram depleção potente de eosinófilos de leucócitos humanos de sangue periférico na presença de 50 ng/ml de IL-5, com um EC50 de 5,9 e 41 ng/ml, respectivamente (Tabela 15). Anticorpo de 1C3 de camundongo e de anticorpo de 2E2 de camundongo específico para Siglec-8 de ser humano não sofreu reação cruzada com Siglec-8 de babuíno. Tabela 15. Ligação de anticorpos de anti-Siglec-8 a epítopos em Si- glec-8 de ser humano ou de babuíno e atividade de depleção dos anticorpos para eosinófilos humanos

[00327] EC50 Médio indica concentrações de anticorpo semi- máximas médias necessárias para depleção de eosinófilo de 2 ensaios independentes.

[00328] A ligação de anticorpos a eosinófilos de ser humano e de babuíno foi determinada por citometria de fluxo. Preparações de leucócitosde sangue periférico de ser humano ou de babuíno foram rotuladas com quantidades saturantes de anticorpos monoclonais de anti- Siglec-8 2E2, 1C3, e 1H10, ou anticorpo de controle de isótipo de IgG1 de camundongo. Anticorpos de anti-Siglec-8 foram visualizados por uma IgG secundária H+L AlexaFluor 647de anti-camundongo. Eosinó- filos foram identificados usando-se anticorpos monoclonais de prima- tos cruzadamente reativos a CD49d e CD16 juntamente com espalhamento de de granularidade alto. Anticorpo de 1H10 de camundongo ligou-se a eosinófilos de babuíno ou de ser humano enquanto anticorpos de 1C3 e de 2E2 de camundongo ligaram-se a eosinófilos de ser humano mas não sofreram reação cruzada com eosinófilos de babuíno (FIGURA 10). Esses resultados foram inesperados uma vez que outros anticorpos monoclonais de anti-Siglec-8 de camundongo que se ligam a Siglec-8 de ser humano mostraram não reconhecer Siglec-8 de primata não humano. Vide Hudson e outros, J. Clin. Immunol., 2011, 31(6):1045-53. SEQUÊNCIAS Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de 2E2 de camundongo QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLEW LGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALYYC ARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 1) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHA de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHB de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 3) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHC de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHD de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WLSVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 5) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHE de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 6) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHD de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVSVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHG de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVSVIWAGGSTNYNSALMSRFSISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 8) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHA2 de 2E2 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISIYGAHWIRQPPGKGLEW IGVIWAGGSTNYNSALMSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC ARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 9) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHB2 de 2E2 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLE WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada mu- tante de RHE S-G de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYGMEYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHE E-D de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 12) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de RHE Y-V de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 13) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada mutante triplo de RHE de 2E2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 14) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de 2E2 de camundongo QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 15) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de RKA de 2E2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 16) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de RKB de 2E2 EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 17) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de RKC de 2E2 EIILTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 18) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de RKD de 2E2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLWI YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 19) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de RKE de 2E2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 20) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de RKF de 2E2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 21) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de RKG de 2E2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLI YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPF TFGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 22) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de mu- tante de RKA F-Y de 2E2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 23) Sequência de aminoácidos de domínio mutante variável de cadeia leve de RKF F-Y de 2E2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPYT FGPGTKLDIK (SEQ ID NO: 24) Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de IgG1 de HEKA e de cadeia pesada de IgG1 de HEKF EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLISL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 75) Sequência de aminoácidos de HEKA kappa cadeia leve EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 76) Sequência de aminoácidos de HEKF kappa cadeia leve EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSATSSVSYMHWFQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSYPFT FGPGTKLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 77) Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada de IgG1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLISLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP G (SEQ ID NO: 78) Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada de IgG4 (IgG4 contém uma mutação de S228P) ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLISLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVD KRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 79) Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia leve de Ig kappa RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 80) Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de IgG1 de 2E2 e de 2C4 de camundongo QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLE WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQT NSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSS SVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPE VSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEV HTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPA PIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITV EWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFT CSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG (SEQ ID NO: 81) Sequência de aminoácidos de cadeia leve de 2C4 kappa de camundongo EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV KWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSY TCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 82) Sequência de aminoácidos de cadeia leve de 2E2 kappa de camundongo QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINV KWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSY TCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 83) Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de IgG1 de 2E2 e 2C4 quimérica QVQLKRASGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGAHWVRQPPGKGLE WLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTALY YCARDGSSPYYYSMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLISLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 84) Sequência de aminoácidos de cadeia leve de 2C4 kappa quimérica EIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 85) Sequência de aminoácidos de cadeia leve de 2E2 kappa quimérica QIILTQSPAIMSASPGEKVSITCSATSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIY STSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPF TFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 86) Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de IgG4 de HEKA (IgG4 contém uma mutação de S228P) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTIYGAHWVRQAPGKGLE WVGVIWAGGSTNYNSALMSRFTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAV YYCARDGSSPYYYSMEYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLISL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO: 87) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de 1C3 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia) EVQVVESGGDLVKSGGSLKLSCAASGFPFSSYAMSWVRQTPDKRLE WVAIISSGGSYTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAM YYCARHETAQAAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 106) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de 1H10 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com a numeração de Chothia) EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDYYMYWVKQRPEQGLE WIGRIAPEDGDTEYAPKFQGKATVTADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVY YCTTEGNYYGSSILDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 107) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de 4F11 de camundongo (resíduos sublinhados compreendem CDRs H1 e H2 de acordo com numeração de Chothia) QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFRSSWMNWVKQRPGKGL EWIGQIYPGDDYTNYNGKFKGKVTLTADRSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYFCARLGPYGPFADWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 108) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de 1C3 de camundongo QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRW IYDTSKLAYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSN PPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 109) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de 1H10 de camundongo DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQKPDGTVKLLI YFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLP WTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 110) Sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de 4F11 de camundongo QIVLTQSPAIVSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQRPGSSPRLLI YDTSSLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRIESEDAANYYCQQWNSDP YTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 111) Sequência de aminoácidos de Domínio 1 de Siglec-8 de ser humano MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSND CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRP (SEQ ID NO: 112) Sequência de aminoácidos de Domínio 2 de Siglec-8 de ser humano DILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTAR SSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVS (SEQ ID NO: 113) Sequência de aminoácidos de Domínio 3 de Siglec-8 de ser humano YPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPP ARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGS QHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGG (SEQ ID NO: 114) Sequência de aminoácidos de proteína de fusão de domínio 1 de Si- glec-8 de ser humano MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSND CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRPIEGRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 115) Sequência de aminoácidos de Proteína de fusão de Domínios 1 e 2 de Siglec-8 de ser humano MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSND CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGP TTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSIEGRS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 116) Sequência de aminoácidos de Proteína de fusão de Domínios 1, 2, e 3 de Siglec-8 de ser humano MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDP VHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSND CSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTAL THRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGP TTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPW NLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLS WTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHIS LSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 117) Sequência de aminoácidos de Proteína de fusão de Domínios 1, 2, e 3 de Siglec-8 de babuíno MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPKDDWTYSDP VHGYWFRAGDRPYQEAPVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSND CSLSINDARKGDEGSYFFRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTA LTQRPDILIQGTLESGHPRNLTCSVPWACEQRMPPMISWIGTSVSSL GPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPP WNLTVTVFQGDDTASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARL SWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAENPRGSQHI SLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGGIEGRSDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 118) Sequência de aminoácidos de domínios 1, 3 e 3 de Singlec-8 de babuíno MEGDRKYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPKDDWTYSDP VHGYWFRAGDRPYQEAPVATNNPDTEVQAETQGRFQLLGDRWSND CSLSINDARKGDEGSYFFRLERGRMKWSYKSQLNYKAKQLSVFVTA LTQRPDILIQGTLESGHPRNLTCSVPWACEQRMPPMISWIGTSVSSL GPITARFSVLTLIPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTRTVQLDVSYPP WNLTVTVFQGDDTASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARL SWTRGSLTLCPSQPWNPGLLELLRVHVKDEGEFTCQAENPRGSQHI SLSLSLQNEGTGTARPVSEVTLAAVGG (SEQ ID NO: 119)

Claims

1. Anticorpo humanizado que se liga a um Siglec-8 humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (a) a região variável da cadeia pesada compreende: (1) um HC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; (2) um HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (3) um HC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; (4) um HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (5) um HC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (6) um HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; e (7) um HC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 45; e (b) a região variável da cadeia leve compreende: (1) um LC-FR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (2) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (3) um LC-FR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; (4) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; (5) um LC-FR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 ou 58; (6) um HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; e (7) um LC-FR4 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16 ou 21.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc de cadeia pesada compreendendo uma região Fc de IgG humana, opcionalmente a região Fc de IgG humana é uma região IgG1 humana ou uma região Fc de IgG4 humana e, opcionalmente, a IgG4 humana compreende a substituição de aminoácidos S228P, em que os resíduos de aminoácidos são numerados de acordo com o índice da UE como em Kabat.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 ou 77; ou (ii) o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87; e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 76.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que foi engenheirado para aperfeiçoar a atividade de citotoxicidade mediada pela célula, dependente de anticorpo (ADCC).

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ou duas das cadeias pesadas do anticorpo é não-fucosilada.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma região Fc de cadeia pesada compreendendo uma região Fc de IgG humana, opcionalmente a região Fc de IgG humana é uma IgG1 humana ou uma região Fc de IgG4 humana.

8. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucléico, como definido na reivindicação 8, e opcionalmente o vetor é um vetor de expressão.

10. Célula hospedeira de microrganismo transgênico, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucléico, como definido na reivindicação 8.

11. Método de produção do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma linhagem de célula hospedeira de mamífero que tem uma inativação (knockout) em alfa 1,6- fucosiltransferase (Fut-8) e compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, sob uma condição que produz o anticorpo; e opcionalmente ainda compreende recuperar o anticorpo produzido pela célula.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a linhagem de célula hospedeira de mamífero é uma linhagem de célula de ovário de hamster Chinês (CHO).

13. Anticorpo anti-Siglec-8, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método, como definido na reivindicação 11 ou 12.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 13, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido na reivindicação 2, em que o anticorpo compreende uma região Fc e cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeos ligadas à região Fc, em que menos de 50% das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeos contêm um resíduo de fucose.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que substancialmente nenhuma das cadeias de carboidratos ligadas a N-glicosídeo contém um resíduo de fucose.

17. Composição, de qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

18. Composição, de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana.

19. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 13, ou a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição ou medicamento para tratar ou prevenir uma doença mediada por células expressando Siglec-8 em um indivíduo

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença mediada por eosinófilos ou uma doença mediada por mastócitos.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo inibe um ou mais sintomas de uma reação alérgica; e opcionalmente a reação alérgica é uma reação de hipersensibilidade do Tipo I.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste de: asma, rinite alérgica, polipose nasal, dermatite atópica, urticária crônica, mastocitose, leucemia eosinofílica, síndrome hipereosinofílica, asma paucigranulocítica, hipersensibilidade aguda ou crônica das vias aéreas, esofagite eosinofílica, síndrome de Churg-Strauss, inflamação associada a uma citocina, inflamação associada a células que expressam Siglec-8, malignidade associada a células que expressam Siglec-8, urticária física, urticária ao frio, urticária de pressão, penfigóide bolhosa, alergia a alimento, e aspergilose alérgica broncopulmonar (ABPA).

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está sofrendo de asma que não é adequadamente controlada por um corticosteróide inalado, um agonista β2 de curta ação, um agonista β2 de longa ação, ou uma combinação destes.

24. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e 13, ou a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 18.