JP6963577B2 - 抗シグレック−8抗体およびその使用の方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参考として本明細書に援用される、2013年12月9日に出願された米国仮特許出願第61/913,891号に対する優先権を主張する。
ASCIIテキストファイルにおける次の提出の内容は、その全体を参照により本明細書に組み入れられる:コンピュータ可読形式(CRF)の配列表(ファイル名:701712000140SeqList.txt、記録された日付:2014年12月9日、サイズ:115KB)。
本発明は、抗ヒトシグレック−8抗体、およびシグレック−8を発現する細胞によって媒介される疾患を処置または予防する方法に関する。
シグレック(シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン)は、主に白血球に存在し、細胞表面の複合糖質に付着したシアル酸に対するその特異性によって特徴付けられる、1回膜貫通細胞表面タンパク質である。シグレックファミリーは、哺乳動物において見出される少なくとも15種のメンバーを含有する(Pillaiら、Annu Rev Immunol.、2012年、30巻:357〜392頁)。これらのメンバーは、シアロアドヘシン(sialoadhesion)(シグレック−1)、CD22(シグレック−2)、CD33(シグレック−3)、ミエリン関連糖タンパク質(シグレック−4)、シグレック−5、OBBP1(シグレック−6)、AIRM1(シグレック−7)、SAF−2(シグレック−8)およびCD329(シグレック−9)を含む。ヒトにおいて発現されるが、マウスにおいては発現されないメンバーであるシグレック−8は、新規ヒト好酸球タンパク質を同定する試みの一環として最初に発見された。好酸球による発現に加えて、これは、肥満細胞および好塩基球によっても発現される。シグレック−8は、硫酸化グリカン、すなわち、6’−スルホ−シアリルルイスXまたは6’−スルホ−シアリル−N−アセチル−S−ラクトサミンを認識し、肥満細胞機能を阻害することが示された細胞内免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)ドメインを含有する。
以前の研究は、シグレック−8が、シグレック−8の細胞外部分に対して産生された特異的マウス抗体と架橋されると、好酸球が、アポトーシスを起こすことを実証した(Nutkuら、Blood、2003年、336巻:918〜24頁)。これらの抗体は、米国特許第8,207,305号、米国特許第8,197,811号、米国特許第7,871,612号および米国特許第7,557,191号に記載されている。しかし、依然として、高い親和性および特異性でヒトシグレック−8を認識するヒト化抗シグレック−8抗体を開発する必要がある。斯かる抗シグレック−8抗体の発見は、好酸球および/または肥満細胞の活性によって媒介される疾患のための処置の開発を可能にすることができる。
特許出願、特許公報および科学文献を含む本明細書に引用されるあらゆる参考文献は、個々の参考文献それぞれが具体的かつ個別に参照によりその全体が本明細書に組み入れられると示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
ヒトシグレック−8に結合するヒト化抗体であって、前記ヒトシグレック−8に対する前記ヒト化抗体の結合親和性またはアビディティーが、前記ヒトシグレック−8に対する抗体2E2または2C4の結合親和性またはアビディティーよりも高い抗体。
(項目2)
ヒトシグレック−8に結合するヒト化抗体であって、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約70℃のTmを有する抗体。
(項目3)
熱シフトアッセイにおいて少なくとも約70℃から少なくとも約72℃のTmを有する、項目2に記載の抗体。
(項目4)
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の抗体。
(項目5)
配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16もしくは21から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
(項目6)
ヒトIgG Fc領域を含む重鎖Fc領域を含む、項目1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
(項目7)
前記ヒトIgG Fc領域が、ヒトIgG1またはヒトIgG4を含む、項目6に記載の抗体。
(項目8)
前記ヒトIgG4が、アミノ酸置換S228Pを含み、ここで、前記アミノ酸残基は、Kabatにおける通りのEUインデックスに従ってナンバリングされている、項目7に記載の抗体。
(項目9)
配列番号75のアミノ酸配列を含む重鎖、および/または配列番号76もしくは77から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
(項目10)
配列番号87のアミノ酸配列を含む重鎖、および/または配列番号76のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
(項目11)
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)活性を改善するように操作されている、項目1〜9のいずれか一項に記載の抗体。
(項目12)
前記抗体の前記重鎖の少なくとも1または2つが、フコシル化されていない、項目1〜11のいずれか一項に記載の抗体。
(項目13)
ヒトシグレック−8に結合するヒト化抗体であって、
(a)重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号67〜70から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、あるいは
(b)重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む抗体。
(項目14)
配列番号11〜14から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号23〜24から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目13に記載の抗体。
(項目15)
配列番号2〜14から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16〜24から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトシグレック−8に結合するヒト化抗体。
(項目16)
配列番号2〜10から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16〜22から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトシグレック−8に結合するヒト化抗体。
(項目17)
ヒトシグレック−8に結合するヒト化抗体であって、
(a)
(1)配列番号26〜29から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号31〜36から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号38〜43から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3および
(7)配列番号45〜46から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR4
を含む重鎖可変領域、および/または
(b)
(1)配列番号48〜49から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号51〜53から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号55〜58から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3および
(7)配列番号60のアミノ酸配列を含むLC−FR4
を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
(項目18)
(a)
(1)配列番号26のアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号34のアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号38のアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3および
(7)配列番号45のアミノ酸配列を含むHC−FR4
を含む重鎖可変領域、および/または
(b)
(1)配列番号48のアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号51のアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号55のアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3および
(7)配列番号60のアミノ酸配列を含むLC−FR4
を含む軽鎖可変領域
を含む、項目17に記載のヒト化抗体。
(項目19)
(a)
(1)配列番号26のアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号34のアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号38のアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3および
(7)配列番号45のアミノ酸配列を含むHC−FR4
を含む重鎖可変領域、および/または
(b)
(1)配列番号48のアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号51のアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号58のアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3および
(7)配列番号60のアミノ酸配列を含むLC−FR4
を含む軽鎖可変領域
を含む、項目17に記載のヒト化抗体。
(項目20)
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)活性を改善するように操作されている、項目13〜19のいずれか一項に記載の抗体。
(項目21)
前記抗体の前記重鎖の少なくとも1または2つが、フコシル化されていない、項目13〜20のいずれか一項に記載の抗体。
(項目22)
項目1〜21のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
(項目23)
項目22に記載の核酸を含むベクター。
(項目24)
発現ベクターである、項目23に記載のベクター。
(項目25)
項目22に記載の核酸を含む宿主細胞。
(項目26)
抗体を産生する方法であって、前記抗体を産生する条件下で、項目25に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
(項目27)
前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収するステップをさらに含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
項目26または27に記載の方法によって産生された抗シグレック−8抗体。
(項目29)
項目1〜21および28のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
(項目30)
ヒトシグレック−8に特異的に結合する抗体を含む組成物であって、前記抗体が、Fc領域と、前記Fc領域に連結されたN−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、ここで、前記N−グリコシド結合型炭水化物鎖の50%未満がフコース残基を含有する、組成物。
(項目31)
前記N−グリコシド結合型炭水化物鎖のうち実質的に全てが、フコース残基を含有しない、項目30に記載の組成物。
(項目32)
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目30または31に記載の組成物。
(項目33)
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、項目30〜32のいずれか一項に記載の組成物。
(項目34)
前記抗体が、配列番号2〜10から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16〜22から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目33に記載の組成物。
(項目35)
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号67〜70から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、項目30〜32のいずれか一項に記載の組成物。
(項目36)
前記抗体が、配列番号11〜14から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号23〜24から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目35に記載の組成物。
(項目37)
前記抗体が、配列番号2〜14から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16〜24から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目30〜32のいずれか一項に記載の組成物。
(項目38)
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目30〜37のいずれか一項に記載の組成物。
(項目39)
ヒトシグレック−8に対する前記抗体の結合親和性またはアビディティーが、前記ヒトシグレック−8に対する抗体2E2または2C4の結合親和性またはアビディティーよりも高い、項目30〜38のいずれか一項に記載の組成物。
(項目40)
前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約70℃のTmを有する、項目30〜39のいずれか一項に記載の組成物。
(項目41)
前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約70℃から少なくとも約72℃のTmを有する、項目40に記載の組成物。
(項目42)
ヒトシグレック−8に結合し、ADCC活性によりシグレック−8を発現する肥満細胞を死滅させる、単離された抗体。
(項目43)
治療有効量が投与される場合、対象においてシグレック−8を発現する肥満細胞を枯渇させる、項目42に記載の抗体。
(項目44)
処置前のベースラインレベルと比較した場合に、前記対象から得られる試料における前記シグレック−8を発現する肥満細胞の少なくとも約20%を枯渇させる、項目43に記載の抗体。
(項目45)
前記試料が、組織試料または生体液試料である、項目44に記載の抗体。
(項目46)
前記組織試料が、皮膚、肺、骨髄および鼻ポリープからなる群から選択される1種または複数である、項目45に記載の抗体。
(項目47)
前記生体液試料が、血液、気管支肺胞洗浄液および鼻洗浄液からなる群から選択される1種または複数である、項目45に記載の抗体。
(項目48)
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)活性を改善するように操作されている、項目42〜47のいずれか一項に記載の抗体。
(項目49)
前記抗体の前記重鎖の少なくとも1または2つが、フコシル化されていない、項目42〜48のいずれか一項に記載の抗体。
(項目50)
アルファ1,6−フコシル基転移酵素(Fut8)ノックアウトを有する細胞株において産生される、項目49に記載の抗体。
(項目51)
β1,4−N−アセチルグルコサミン転移酵素III(GnT−III)を過剰発現する細胞株において産生される、項目49に記載の抗体。
(項目52)
前記細胞株が、ゴルジμ−マンノシダーゼII(ManII)をさらに過剰発現する、項目51に記載の抗体。
(項目53)
ADCC活性を改善するFc領域における少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、項目48に記載の抗体。
(項目54)
ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目42〜53のいずれか一項に記載の抗体。
(項目55)
ヒトIgG1抗体である、項目42〜54のいずれか一項に記載の抗体。
(項目56)
マウス抗体である、項目42〜53のいずれか一項に記載の抗体。
(項目57)
(a)(i)配列番号88のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号91のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、および/または(i)配列番号97のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号100のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号103のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変領域、
(b)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号92のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号95のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、および/または(i)配列番号98のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号101のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号104のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変領域、
(c)(i)配列番号90のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号93のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、および/または(i)配列番号99のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変領域
を含む、項目42〜56のいずれか一項に記載の抗体。
(項目58)
(a)配列番号106のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号109のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(b)配列番号107のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(c)配列番号108のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号111のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目57に記載の抗体。
(項目59)
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、項目42〜56のいずれか一項に記載の抗体。
(項目60)
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号67〜70から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、項目42〜56のいずれか一項に記載の抗体。
(項目61)
ヒトシグレック−8および非ヒト霊長類シグレック−8に結合する抗体。
(項目62)
前記非ヒト霊長類が、ヒヒである、項目61に記載の抗体。
(項目63)
(a)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号92のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号95のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、および/または(i)配列番号98のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号101のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号104のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変領域、
(b)(i)配列番号90のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号93のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、および/または(i)配列番号99のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変領域
を含む、項目61または62に記載の抗体。
(項目64)
前記抗体が、ヒトシグレック−8のドメイン1におけるエピトープに結合し、ここで、ドメイン1は、配列番号112のアミノ酸配列を含む、項目61〜63のいずれか一項に記載の抗体。
(項目65)
前記抗体が、ヒトシグレック−8のドメイン3におけるエピトープに結合し、ここで、ドメイン3は、配列番号114のアミノ酸配列を含む、項目61〜63のいずれか一項に記載の抗体。
(項目66)
ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目61〜65のいずれか一項に記載の抗体。
(項目67)
マウス抗体である、項目61〜66のいずれか一項に記載の抗体。
(項目68)
IgG1抗体である、項目61〜67のいずれか一項に記載の抗体。
(項目69)
前記対象が、ヒトである、項目43〜60のいずれか一項に記載の抗体。
(項目70)
項目42〜69のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
(項目71)
項目70に記載の核酸を含むベクター。
(項目72)
発現ベクターである、項目71に記載のベクター。
(項目73)
項目70に記載の核酸を含む宿主細胞。
(項目74)
抗体を産生する方法であって、前記抗体を産生する条件下で、項目73に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
(項目75)
前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収するステップをさらに含む、項目74に記載の方法。
(項目76)
項目74または75に記載の方法によって産生された抗シグレック−8抗体。
(項目77)
対象においてシグレック−8を発現する細胞によって媒介される疾患を処置または予防する方法であって、項目1〜22、28、42〜69および76のいずれか一項に記載の抗体または項目30〜41のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
(項目78)
前記疾患が、好酸球媒介性疾患である、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記疾患が、肥満細胞媒介性疾患である、項目77に記載の方法。
(項目80)
前記抗体が、アレルギー反応の1種または複数の症状を阻害する、項目77に記載の方法。
(項目81)
前記アレルギー反応が、I型過敏症反応である、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される、項目77に記載の方法。
(項目83)
前記疾患が、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)からなる群から選択される、項目77に記載の方法。
(項目84)
前記対象が、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β2アゴニスト、長時間作用型β2アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患う、項目74〜83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
対象においてシグレック−8を発現する肥満細胞を枯渇させる方法であって、前記対象に、ヒトシグレック−8に結合する有効量の抗体を投与するステップを含み、前記抗体が、ADCC活性によりシグレック−8を発現する肥満細胞を死滅させる方法。
(項目86)
前記抗体が、処置前のベースラインレベルと比較した場合に、前記対象から得られる試料における前記シグレック−8を発現する肥満細胞の少なくとも約20%を枯渇させる、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記試料が、組織試料または生体液試料である、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記組織試料が、皮膚、肺、骨髄および鼻ポリープからなる群から選択される1種または複数である、項目87に記載の方法。
(項目89)
前記生体液試料が、血液、気管支肺胞洗浄液および鼻洗浄液からなる群から選択される1種または複数である、項目87に記載の方法。
(項目90)
前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)活性を改善するように操作されている、項目85〜89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記抗体の前記重鎖の少なくとも1または2つが、フコシル化されていない、項目85〜90のいずれか一項に記載の方法。
(項目92)
前記抗体が、アルファ1,6−フコシル基転移酵素(Fut8)ノックアウトを有する細胞株において産生される、項目91に記載の方法。
(項目93)
前記抗体が、β1,4−N−アセチルグルコサミン転移酵素III(GnT−III)を過剰発現する細胞株において産生される、項目91に記載の方法。
(項目94)
前記細胞株が、ゴルジμ−マンノシダーゼII(ManII)をさらに過剰発現する、項目93に記載の方法。
(項目95)
前記抗体が、ADCC活性を改善するFc領域における少なくとも1個のアミノ酸置換を含む、項目90に記載の方法。
(項目96)
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目85〜95のいずれか一項に記載の方法。
(項目97)
前記抗体が、ヒトIgG1抗体である、項目85〜96のいずれか一項に記載の方法。
(項目98)
前記抗体が、
(a)(i)配列番号88のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号91のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、かつ/または(i)配列番号97のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号100のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号103のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変領域、
(b)(i)配列番号89のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号92のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号95のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、および/または(i)配列番号98のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L2を含む軽鎖可変領域、
(c)(i)配列番号90のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号93のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含む重鎖可変領域、および/または(i)配列番号99のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む軽鎖可変領域
を含む、項目85〜97のいずれか一項に記載の方法。
(項目99)
前記抗体が、
(a)配列番号106のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号109のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(b)配列番号107のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(c)配列番号108のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号111のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、項目85〜97のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号67〜70から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、項目85〜97のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
前記対象が、シグレック−8を発現する細胞によって媒介される疾患を有する、項目85〜101のいずれか一項に記載の方法。
(項目103)
前記抗体が、アレルギー反応の1種または複数の症状を阻害する、項目85〜102のいずれか一項に記載の方法。
(項目104)
前記アレルギー反応が、I型過敏症反応である、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される、項目102に記載の方法。
(項目106)
前記疾患が、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)からなる群から選択される、項目102に記載の方法。
(項目107)
前記対象が、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β2アゴニスト、長時間作用型β2アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患う、項目85〜106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
項目42〜69および76のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
(項目109)
項目1〜22、28、42〜69および76のいずれか一項に記載の抗体または項目30〜41のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
本発明に関して詳細に記載する前に、本発明が、当然ながら変動し得る特定の組成物または生命システムに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用されている用語法が、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定を目的としないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている通り、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、内容がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「分子(a molecule)」と言及される場合、2個またはそれを超える斯かる分子の組合せその他を任意選択で含む。
100×分数X/Y
(式中、Xは、AおよびBの該プログラムのアライメントにおける配列により同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さが、アミノ酸配列Bの長さに等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性が、Aに対するBの%アミノ酸配列同一性に等しくならないことが認められよう。
一態様において、本発明は、ヒトシグレック−8に結合する単離された抗体を提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、次の特徴のうち1種または複数を有する:(1)ヒトシグレック−8に結合する;(2)ヒトシグレック−8の細胞外ドメインに結合する;(3)マウス抗体2E2および/またはマウス抗体2C4よりも高い親和性でヒトシグレック−8に結合する;(4)マウス抗体2E2および/またはマウス抗体2C4よりも高いアビディティーでヒトシグレック−8に結合する;(5)熱シフトアッセイにおいて約70℃〜72℃またはそれより高いTmを有する;(6)低下した程度のフコシル化を有するかまたはフコシル化されていない;(7)好酸球上に発現されたヒトシグレック−8に結合し、好酸球のアポトーシスを誘導する;(8)肥満細胞上に発現されたヒトシグレック−8に結合し、肥満細胞を枯渇させる;(9)肥満細胞上に発現されたヒトシグレック−8に結合し、肥満細胞のFcεRI依存性活性(例えば、ヒスタミン放出、PGD2放出、Ca2+フラックスおよび/またはβ−ヘキソサミニダーゼ放出等)を阻害する;(10)ADCC活性を改善するように操作された;(11)肥満細胞上に発現されたヒトシグレック−8に結合し、ADCC活性により肥満細胞を死滅させる(in vitroおよび/またはin vivoで);(12)ヒトおよび非ヒト霊長類のシグレック−8に結合する;(13)ヒトシグレック−8のドメイン1、ドメイン2および/またはドメイン3に結合する、またはヒトシグレック−8のドメイン1、ドメイン2および/またはドメイン3を含むシグレック−8ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されている融合タンパク質)に結合する;ならびに(14)マウス抗体2E2または2C4のEC50に満たないEC50で活性化された好酸球を枯渇させる。
(a)
(1)配列番号26〜29から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR1、
(2)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、
(3)配列番号31〜36から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR2、
(4)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2、
(5)配列番号38〜43から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR3、
(6)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3および
(7)配列番号45〜46から選択されるアミノ酸配列を含むHC−FR4
を含む重鎖可変ドメイン
および/または
(b)
(1)配列番号48〜49から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR1、
(2)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、
(3)配列番号51〜53から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR2、
(4)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2、
(5)配列番号55〜58から選択されるアミノ酸配列を含むLC−FR3、
(6)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3および
(7)配列番号60のアミノ酸配列を含むLC−FR4
を含む軽鎖可変ドメイン
を含む抗体が本明細書において提供される。
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、マウス抗体2E2および/またはマウス抗体2C4と比較した場合に、ほぼ同じもしくはより高い親和性および/またはより高いアビディティーでヒトシグレック−8に結合する。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗シグレック−8抗体は、≦1μM、≦150nM、≦100nM、≦50nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM(例えば、10−8Mまたはそれに満たない、例えば、10−8M〜10−13M、例えば、10−9M〜10−13M)の解離定数(Kd)を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、マウス抗体2E2および/またはマウス抗体2C4よりも約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍または約10倍高い親和性で、ヒトシグレック−8に結合する。本明細書における一部の実施形態において、抗シグレック−8抗体は、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/または配列番号16もしくは21から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗シグレック−8抗体の結合アビディティーは、表面プラズモン共鳴アッセイにより決定することができる。例えば、KdまたはKd値は、BIAcore T100を使用することにより測定することができる。捕捉抗体(例えば、ヤギ−抗ヒト−Fcおよびヤギ−抗マウス−Fc)は、CM5チップ上に固定化される。フローセルは、抗ヒトまたは抗マウス抗体により固定化することができる。ある温度および流速、例えば、25℃、流速30μl/分でアッセイを行う。二量体シグレック−8は、アッセイバッファーにおいて様々な濃度で、例えば、15nM〜1.88pMに及ぶ濃度で希釈する。抗体を捕捉し、高速注射、続いて解離を行う。バッファー、例えば、50mMグリシンpH1.5でフローセルを再生する。空の参照セルおよび複数のアッセイバッファー注射により結果をブランク作成し、1:1グローバルフィットパラメータにより解析する。
競合アッセイを使用して、2種の抗体が、同一もしくは立体的に重複するエピトープを認識することにより、同じエピトープに結合するか、または一方の抗体が、抗原への別の抗体の結合を競合的に阻害するか決定することができる。このようなアッセイは、本技術分野で公知である。典型的には、抗原または抗原発現細胞が、マルチウェルプレートに固定化され、標識抗体の結合を遮断する非標識抗体の能力が測定される。斯かる競合アッセイに一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、細胞(例えば、好酸球)の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、本明細書に記載されている2E2抗体と競合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、細胞(例えば、好酸球)の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、細胞(例えば、好酸球)の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、本明細書に記載されている2C4抗体と競合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、細胞(例えば、好酸球)の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(米国特許第8,207,305号に見出されるものと同様に)および配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(米国特許第8,207,305号に見出されるものと同様に)を含む抗体と競合する。
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8は、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約70℃、少なくとも約71℃または少なくとも約72℃の融解温度(Tm)を有する。例示的な熱シフトアッセイにおいて、ヒト化抗シグレック−8抗体を含む試料を、qPCRサーマルサイクラーにおいて1サイクル毎に1℃増加させつつ71サイクルにわたり蛍光色素(Sypro Orange)と共にインキュベートして、Tmを決定する。本明細書における一部の実施形態において、抗シグレック−8抗体は、マウス2E2抗体および/またはマウス2C4抗体と比較した場合に、同様のまたはより高いTmを有する。本明細書における一部の実施形態において、抗シグレック−8抗体は、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16もしくは21から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、抗シグレック−8抗体は、キメラ2C4抗体と比較した場合に同じまたはより高いTmを有する。一部の実施形態において、抗シグレック−8抗体は、配列番号84のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号85のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と比較した場合に同じまたはより高いTmを有する。
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8は、好酸球のアポトーシスを誘導する。一部の他の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8は、肥満細胞を枯渇させる。細胞のアポトーシスを評価するためのアッセイは、本技術分野において周知であり、例えば、アネキシンVによる染色およびTUNNELアッセイが挙げられる。例示的な細胞アポトーシスアッセイにおいて、血液試料由来の新鮮バフィーコートを培地に再懸濁し、96ウェルU字底プレートで平板培養する。抗シグレック−8抗体の一連の系列5倍希釈を各ウェルに添加し、このプレートを37℃、5%CO2で4時間より長くインキュベートする。PBSに希釈したパラホルムアルデヒドで細胞を固定し、顕微鏡を使用した検出のための好酸球に特異的なコンジュゲートされた抗体で染色する。バフィーコートが抗シグレック−8抗体の存在下でインキュベートされないときと比較した場合に、バフィーコートが抗シグレック−8抗体の存在下でインキュベートされたときの総末梢血白血球における好酸球集団を評価する。別の例示的なアッセイにおいて、血液試料から精製された好酸球(例えば、Miltenyi好酸球単離キット)を培地に再懸濁し、IL−5の存在または非存在下で一晩培養する。培養した好酸球をその後、遠心分離によって収集し、培地に再懸濁し、96ウェルU字底プレートで平板培養する。抗シグレック−8抗体の一連の系列5倍希釈を各ウェルに添加し、このプレートを37℃、5%CO2で4時間より長くインキュベートする。本技術分野において周知の標準技法を使用して細胞を固定し、アネキシン−Vで染色し、顕微鏡を使用して好酸球の数を検出する。精製された細胞が抗シグレック−8抗体の存在下でインキュベートされないときと比較した場合に、精製された細胞が抗シグレック−8抗体の存在下でインキュベートされたときの試料における好酸球集団を評価する。
融合タンパク質による結合アッセイを使用して、抗体によって認識されるエピトープを決定することができる。エピトープマッピングのために融合タンパク質を使用したアッセイは、本技術分野で公知である。例えば、ヒトIg−Fcに融合されたシグレック−8タンパク質の部分を含む融合タンパク質を、マルチウェルプレートに固定化し、融合タンパク質に結合する抗体の能力を測定する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、配列番号115のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、配列番号116のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、配列番号117のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体は、配列番号118のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。
本明細書に記載されている抗体は、抗体を作製するための本技術分野において利用できる技法を使用して調製されるが、そのうち例示的な方法について次のセクションでより詳細に記載する。
本発明は、抗体断片を包含する。抗体断片は、酵素消化等の伝統的な手段または組換え技法によって作製することができる。ある特定の状況下で、全抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。ある特定の抗体断片の概説に関しては、Hudsonら(2003年)Nat. Med.9巻:129〜134頁を参照されたい。
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、本技術分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された1個または複数のアミノ酸残基を有することができる。このような非ヒトアミノ酸残基は多くの場合、「移入」残基と称され、これは典型的には、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、高頻度可変領域配列をヒト抗体の相当する配列の代わりに置換することにより、Winterの方法に従って行うことができる(Jonesら(1986年)Nature 321巻:522〜525頁;Riechmannら(1988年)Nature 332巻:323〜327頁;Verhoeyenら(1988年)Science 239巻:1534〜1536頁)。したがって、斯かる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たないものが、非ヒト種由来の相当する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかの高頻度可変領域残基およびおそらくいくつかのFR残基が、齧歯類抗体における類似性部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
本発明のヒト抗シグレック−8抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるFvクローン可変ドメイン配列(複数可)と公知ヒト定常ドメイン配列(複数可)を組み合わせることにより構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗シグレック−8抗体は、ハイブリドーマ方法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor、J. Immunol.、133巻:3001頁(1984年);Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁(Marcel Dekker, Inc.、New York、1987年);およびBoernerら、J. Immunol.、147巻:86頁(1991年)によって記載されている。
二重特異性抗体は、少なくとも2種の異なる抗原に対し結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性のうち一方は、シグレック−8に対するものであり、他方は、他のいずれかの抗原に向けられている。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、シグレック−8の2種の異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体を使用して、シグレック−8を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。
一部の実施形態において、本発明の抗体は、シングルドメイン抗体である。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体もしくは部分または軽鎖可変ドメインの全体もしくは部分を含む単一のポリペプチド(polyeptide)鎖である。ある特定の実施形態において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である(Domantis,Inc.、Waltham、Mass.;例えば、米国特許第6,248,516(B1)号を参照)。一実施形態において、シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体または部分からなる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体のアミノ酸配列修飾(複数可)が企図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましくなり得る。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することにより、あるいはペプチド合成により調製することができる。斯かる修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および/またはそれへの挿入および/またはその置換を含む。欠失、挿入および置換のいずれかの組合せを為して、最終構築物に到達することができるが、この最終構築物が、所望の特徴を保有することを条件とする。アミノ酸変更は、配列が作成されるときに対象抗体アミノ酸配列に導入することができる。
(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)無電荷極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)
(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向性に影響を与える残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明の抗体の組換え産生のため、これをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)または発現のために複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは、従来手順を使用して(例えば、抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離および配列決定される。多くのベクターを利用できる。ベクターの選択は、一部には、使用するべき宿主細胞に依存する。一般に、宿主細胞は、原核生物または真核生物(一般には哺乳動物)起源のいずれかである。IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE定常領域を含むいかなるアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用してもよく、いかなるヒトまたは動物種から斯かる定常領域を得てもよいことが認められよう。
a)ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等、抗体産生細胞から単離および配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはPCR技法を使用して合成することができる。得られた後に、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクターに挿入する。利用できる本技術分野で公知の多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入されるべき核酸のサイズおよびベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現またはその両方)およびこれが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて様々な構成成分を含有する。ベクター構成成分として、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入物および転写終結配列が一般に挙げられるがこれらに限定されない。
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するための、必要に応じて修飾された従来の栄養培地において培養される。
一実施形態において、本明細書における産生された抗体タンパク質は、さらに精製されて、さらなるアッセイおよび使用のために実質的に均一な調製物を得る。本技術分野で公知の標準タンパク質精製方法を用いることができる。次の手順は、適した精製手順に例示的である:免疫親和性またはイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、DEAE等、シリカまたはカチオン交換樹脂におけるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈殿および例えば、Sephadex G−75を使用したゲル濾過。
真核生物宿主細胞における使用のためのベクターは一般に、次の非限定的構成成分のうち1種または複数を含む:シグナル配列、複製起点、1種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
真核生物宿主細胞における使用のためのベクターは、目的の成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的な切断部位を有する、シグナル配列または他のポリペプチドを含有することもできる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞により認識およびプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)配列となり得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。斯かる前駆体領域のためのDNAは、抗体をコードするDNAに読み取り枠でライゲーションされる。
一般に、複製起点構成成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない。例えば、SV40起点は、典型的には、初期プロモーターを含有するという理由でのみ使用することができる。
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも命名される選択遺伝子を含有することができる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する、(b)関連する場合、栄養要求性欠乏を補完する、または(c)複合培地から得ることができない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、目的のポリペプチド(例えば、抗体)をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。プロモーター配列は、真核生物で公知である。例えば、実際ではあらゆる真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ25〜30塩基上流に位置するATリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から70〜80塩基上流に見出された別の配列は、CNCAAT領域であり、Nは、いかなるヌクレオチドでもよい。大部分の真核生物遺伝子の3’端には、コード配列の3’端へのポリAテイルの付加のためのシグナルとなり得るAATAAA配列がある。ある特定の実施形態において、これらの配列のいずれかまたは全てを、真核生物発現ベクターに適切に挿入することができる。
高等真核生物による本発明の抗体をコードするDNAの転写は、多くの場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン)から現在公知である。しかし典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例として、複製起点の後方(late side)(bp100〜270)のSV40エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについて記載するYaniv、Nature 297巻:17〜18頁(1982年)も参照されたい。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列に対し5’位または3’位においてベクターにスプライスすることができるが、一般に、プロモーターから5’の部位に位置する。
真核生物宿主細胞において使用される発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列を含有することもできる。斯かる配列は、真核生物またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合により3’非翻訳領域から一般的に利用できる。このような領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結構成成分の1種は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026およびそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
本明細書におけるベクターにおけるDNAのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載されている高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)における脊椎動物細胞の繁殖は、ルーチン手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1系列(COS−7、ATCC CRL 1651);ヒト胚性腎臓系列(懸濁培養における育成のためにサブクローニングされた293または293細胞、Grahamら、J. Gen Virol.36巻:59頁(1977年));ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77巻:4216頁(1980年));マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol. Reprod.23巻:243〜251頁(1980年));サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット(buffalo rat)肝臓細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51);TRI細胞(Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci.383巻:44〜68頁(1982年));MRC5細胞;FS4細胞;CHOK1細胞、CHOK1SV細胞または派生体およびヒトヘパトーマ系列(Hep G2)である。
本発明の抗体の産生に使用される宿主細胞は、種々の培地において培養することができる。HamのF10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、Sigma)、RPMI−1640(Sigma)およびダルベッコ変法イーグル培地((DMEM)、Sigma)等、市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Hamら、Meth. Enz.58巻:44頁(1979年)、Barnesら、Anal. Biochem.102巻:255頁(1980年)、米国特許第4,767,704号;同第4,657,866号;同第4,927,762号;同第4,560,655号;もしくは同第5,122,469号;WO90/03430;WO87/00195;または米国再発行特許(U.S. Pat. Re.)30,985に記載されている培地のいずれかを宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、ホルモンおよび/または他の増殖因子(インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子等)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩等)、バッファー(HEPES等)、ヌクレオチド(アデノシンおよびチミジン等)、抗生物質(GENTAMYCIN(商標)薬物等)、微量元素(マイクロモル濃度範囲内の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義)ならびにグルコースまたは等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。他のいずれかの補充物質が、当業者に公知の適切な濃度で含まれていてもよい。温度、pHその他等、培養条件は、発現のために選択された宿主細胞により以前に使用された条件であり、当業者には明らかとなろう。
組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内に産生することができる、あるいは培地に直接的に分泌することができる。抗体が、細胞内に産生される場合、第1のステップとして、宿主細胞または溶解された断片のあらゆる粒子状デブリは、例えば、遠心分離または限外濾過により除去することができる。抗体が、培地に分泌される場合、斯かる発現系から得た上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを使用して先ず濃縮することができる。PMSF等、プロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解を阻害するために前述ステップのいずれかに含まれていてよく、抗生物質が、偶発的な夾雑物の成長を予防するために含まれていてよい。
フコシル化の程度が低下した抗体を調製するための方法が本明細書に提供されている。例えば、本明細書において企図される方法として、タンパク質フコシル化が欠損した細胞株の使用(例えば、Lec13 CHO細胞、アルファ−1,6−フコシル基転移酵素遺伝子ノックアウトCHO細胞、β1,4−N−アセチルグルコサミン転移酵素IIIを過剰発現する細胞およびゴルジμ−マンノシダーゼIIをさらに過剰発現する細胞等)および抗体の産生に使用される細胞培養培地におけるフコースアナログ(複数可)の添加が挙げられるがこれらに限定されない。Ripkaら、Arch. Biochem. Biophys.249巻:533〜545頁(1986年);米国特許出願公開第2003/0157108(A1)号、Presta, L;WO2004/056312(A1);Yamane−Ohnukiら、Biotech. Bioeng.87巻:614頁(2004年);および米国特許第8,574,907号を参照されたい。抗体のフコース含量を低下させるための追加的な技法は、米国特許出願公開第2012/0214975号に記載されているGlymaxx技術を含む。抗体のフコース含量を低下させるための追加的な技法は、抗体の産生に使用される細胞培養培地における1種または複数のグリコシダーゼ阻害剤の添加も含む。グリコシダーゼ阻害剤は、α−グルコシダーゼI、α−グルコシダーゼIIおよびα−マンノシダーゼIを含む。一部の実施形態において、グリコシダーゼ阻害剤は、α−マンノシダーゼIの阻害剤である(例えば、キフネンシン)。
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体のいずれかを含む組成物(例えば、医薬組成物)も本明細書に提供される。一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体を含む組成物であって、抗体が、Fc領域と、Fc領域に連結されたN−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、N−グリコシド結合型炭水化物鎖の約50%未満が、フコース残基を含有する組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体を含む組成物であって、抗体が、Fc領域と、Fc領域に連結されたN−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、N−グリコシド結合型炭水化物鎖の実質的に全てが、フコース残基を含有しない組成物が本明細書において提供される。
対象においてシグレック−8を発現する細胞によって媒介される疾患を処置または予防するための方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体(例えば、ヒト化抗シグレック−8抗体)またはその組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、対象(例えば、ヒト患者)は、好酸球媒介性障害と診断された、または好酸球媒介性障害の発症リスクがある。一部の実施形態において、対象(例えば、ヒト患者)は、肥満細胞媒介性障害と診断された、または肥満細胞媒介性障害の発症リスクがある。一部の実施形態において、対象は、好酸球媒介性障害または肥満細胞媒介性障害を有する。
別の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−8抗体を含む、製造品またはキットが提供される。製造品またはキットは、本発明の方法における抗体の使用のための説明書をさらに含むことができる。よって、ある特定の実施形態において、製造品またはキットは、個体における好酸球媒介性障害および/または肥満細胞媒介性障害を処置または予防するための方法であって、有効量の抗シグレック−8抗体を個体に投与するステップを含む方法における抗シグレック−8抗体の使用のための説明書を含む。ある特定の実施形態において、個体は、ヒトである。一部の実施形態において、個体は、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される疾患を有する。ある特定の実施形態において、個体は、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)からなる群から選択される疾患を有する。
キメラ抗シグレック−8抗体の作製および特徴付け
マウス2E2抗体およびマウス2C4抗体からキメラ抗体を作製し、その後、ヒトシグレック−8への結合活性に関して解析した。
キメラ2E2抗体(ch2E2)およびキメラ2C4抗体(ch2C4)の作製
キメラ2E2抗体(ch2E2)の作製のため、RNeasy Miniキット(Qiagen)を使用して、急速凍結したマウスハイブリドーマ2E2細胞ライセートを処理して、製造元のプロトコールに従って全RNAを単離した。製造元のプロトコールに従って第1鎖cDNA合成キット(GE Life Sciences)を使用して、単離されたRNAの3μg試料を逆転写して2E2 cDNAを産生した。2E2 cDNAをその後、Phusion Flash High−Fidelity PCRマスターミックス(Thermo Scientific)を使用したPCRにより増幅し、PCR反応物における配列を確認した。免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)cDNAおよびカッパ軽鎖可変領域(VL)を、Phusion High−Fidelity PCRマスターミックスを使用してPCR増幅した。各PCR反応の結果は、単一の増幅産物であり、製造元のプロトコールに従ってQIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用してこれを精製し、免疫グロブリン鎖毎の配列を得た。カッパ軽鎖可変領域のコンセンサス配列を2E2 VKと命名し、重軽鎖可変領域のコンセンサス配列を2E2 VHと命名した。2E2 VKタンパク質配列は、GlnがGluに置き換えられた第1の残基を除いて、マウス2C4 IgG1抗体(Kiklyら、J. Allergy Clin Immunol.、2000年;105巻:1093〜1100頁を参照)と同一であったが、2E2 VHタンパク質配列は、2C4と完全に同一であった。
キメラ2E2およびキメラ2C4 IgG1K抗体による組換えヒトシグレック−8細胞外ドメイン(ECD)の結合をELISAにより測定した。シグレック−8結合アッセイのため、ウェル当たり30μLの0.4μg/mLシグレック−8 ECDで一晩4℃にてコーティングし、続いて洗浄バッファー(0.1%Tween20)におけるウェル洗浄によりコーティング溶液を除去し、90μLの5%BSA/TBS溶液で2時間室温にてブロッキングすることにより、384ウェルSpectraPlate(Perkin Elmer)を調製した。0.2%BSA/TBSにおけるキメラ抗体(ch2E2またはch2C4)またはマウス抗体(m2E2またはm2C4)の3倍系列希釈(出発濃度は5000ng/mL)を、各コーティングされたウェルに添加した。このプレートを2時間室温でインキュベートし、ウェルをその後洗浄し、続いて、0.2%BSA/TBS溶液に希釈したヤギ抗ヒトFcペルオキシダーゼコンジュゲート(1:10000希釈)または抗マウスFcペルオキシダーゼコンジュゲート(1:30000希釈)を添加した。プレートを45分間室温でインキュベートし、続いて洗浄し、各ウェルに30μL K−blue HRP基質(SkyBio Ltd)を添加した。室温15分間のインキュベーション後に、各ウェルへの10μLのRed Stop溶液(SkyBio Ltd)の添加により反応を停止させた。ELISAリーダーPHERAStar FS(BMG Labtech)を使用して、650nmにおける実験試料の光学密度を読み取った。
ヒト化抗シグレック−8抗体の作製および特徴付け
キメラ抗体2E2およびキメラ抗体2C4の配列を使用して、マウス2E2抗体のヒト化バージョンを設計した。
ヒト化抗シグレック−8抗体の設計
International Immunogenetics Database 2009(Lefranc, MP.、Nucleic Acid Res.、2003年、31巻(1号):307〜10頁)およびKabat Database Release 5 of Sequences of Proteins of Immunological Interest(最終アップデート1999年11月17日)(Kabatら、NIH National Technical Information Service、1991年、1〜3242頁)から得たヒトおよびマウス免疫グロブリンのタンパク質配列を使用して、Kabatアライメントにおけるヒト免疫グロブリン配列のデータベースを編集した。編集されたデータベースは、10,906種のVHおよび2,912種のVK配列を含有した。
2E2RHAおよび2E2RKAの遺伝子を合成し(GenScript)、ヒト配列にコドン最適化した。天然ヒトフレームワーク配列AF471521およびX93721、それぞれ重および軽鎖、ならびに天然マウスCDR配列をin silicoでアセンブルし、2E2RHA〜2E2RHGおよび2E2RKA〜2E2RKGと命名した。ソフトウェアアルゴリズム(GenScript)を使用して、ヒト細胞によって優先的に利用されるコドンを使用するようにサイレント変異誘発により配列を最適化し、合成した。RHA/BおよびRKA/B構築物を、キメラ抗体のPCR増幅に関する実施例1の上述の通り、発現ベクターおよび挿入物に対する特異的プライマーによりPCR増幅し、キメラ抗体の作製に関して実施例1に記載されている通り、リガーゼ非依存的クローニング反応によりIgG/カッパ定常領域ベクターへと挿入し、TOP10細菌の形質転換に使用した。RKAおよびRHAをその後、製造元のプロトコールに従って、QuickChange Lightning部位特異的変異誘発キット(Stratagene)を使用したPCR変異誘発により修飾して、全ヒト抗体バリアントを得た(図1、図2、表3、表4および表5)。
ヒト化設計に伴う何らかの著しい問題を同定する試みにおいて、基本のヒト化重および軽鎖を、そのキメラカウンターパートとペアにした。シグレック−8抗原を使用して、実施例1に記載されている通り、ELISAにより抗体結合を測定した。2E2RHBは、キメラ軽鎖とペアになった場合、RHA重鎖よりも強力であると思われたが、重鎖キメラ構築物(cVH)に会合したRKB構築物は、ペア化cVK構築物の両方よりも高い効力でシグレック−8抗原に結合した。これらの結果は、重および軽鎖両方のためのヒト化設計が、おおよそ正確であり、全てシグレック−8に結合したが、さらなる研究が、より優れた結合特徴を有する追加的なヒト化抗体の同定に必要とされることを確認した。
完全ヒト化抗体重および軽鎖を組み合わせ、キメラ抗体と比較して、4Åおよびカノニカルフレームワーク残基ならびに界面残基の置き換えが、2E2のヒト化成功に十分であるか決定した。Expi293細胞を、異なるヒト化重鎖ベクターに会合した異なるヒト化軽鎖ベクターの組合せでコトランスフェクトした。シグレック−8抗原を使用して、実施例1に記載されている通り、ELISAにより抗体結合を測定した。キメラ対照と比較した、シグレック8へのこれらの抗体の結合は、HBKAおよびHBKBが、HAKAおよびHAKBよりも優れた組合せであると思われることを示した(表6)。
重鎖における単一アミノ酸置換の相対的な重要性を決定するために、ヒト化重鎖RHC(A24V)、RHD(V48L)、RHE(S49G)、RHF(F67L)およびRHG(T68S)を全軽鎖バリアントと組み合わせて発現させ、RHAおよびRHBバージョンならびにキメラ抗体対照と比較した。シグレック−8 ECDに結合するこれらの抗体の結果は、これらのヒト化抗体組合せが全て、ファミリーRHA、RHFおよびRHG(全軽鎖バリアントと)を除いて、同じ効力でシグレック−8に結合したことを示唆した(表6)。
その後のヒト化重鎖は、最も近縁の生殖系列遺伝子に基づき作製した。2E2VHと最も類似の生殖系列であるIGHV4−59生殖系列配列(図1)を使用して、マウスCDRのグラフトを設計し、上述の他の構築物と同じ方式で合成(GenScript)および調製して、第1のバージョンのRHAおよびRHB鎖との比較のためのヒト化抗体を作製した。加えて、抗体が、生殖系列に変化されたある特定のCDR3残基に耐容性を示し得るか決定するために、部位特異的変異誘発により、RHEバリアント重鎖のCDR3に3個の変異を導入し(単一およびトリプル変異)、RKAおよびRKF軽鎖のCDR3に1個の変異(図3)を導入した。上述の同じ方法を使用して、RHE変異またはRKA/RKF変異を含有する抗体を発現させ、相補鎖の完全パネルと組み合わせた。
注記:各段は、1つの実験を表す;NAは、入手不可能を示す。
ヒト化抗体の熱安定性を比較した。抗体を、−20〜85℃に変動する、より高い温度に10分間付し、室温へと冷却し、各候補のEC80濃度におけるELISAアッセイにおいて評価した。リード抗体候補は、安定的に思われた(図4)。HEKA/KFとCDRL3(すなわち、軽鎖のCDR3)変異抗体は、68℃において完全に不活性であったが、キメラは、70℃で不活性であり、この温度において、リード候補HEKAおよびHEKFは、依然として25〜50%活性を有し、75℃でようやく完全不活性を示した。
リード抗体の融解温度を決定するために、キメラ、HEKA、HEKFおよびCDRL3(すなわち、軽鎖のCDR3)変異を有する同じヒト化候補を、2ステップ親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過システムにおいて精製し、熱シフトアッセイにおいて検査した。2種の異なる濃度で抗体を蛍光色素(Sypro Orange)と共に、qPCRサーマルサイクラーにおいてサイクル毎に1℃増加させつつ71サイクルインキュベートした。Tmは、50%最大蛍光の温度として定義された。キメラおよび5種のヒト化抗体のTmは、熱安定性アッセイで得られた結果を確認した:最も安定的な抗体は、検査した他のヒト化抗体よりも高いTmを有するHEKAおよびHEKFであった。HEKAは、キメラ抗体よりも高いTmを有する(図5および表7)。
Biacore T200を使用したSPR解析により、抗体アビディティー決定を行った。マウス、キメラおよびヒト化抗シグレック−8抗体へのヒトシグレック−8 ECDタンパク質の結合をBiacore T100において測定した。捕捉抗体(ヤギ−抗ヒト−Fcおよびヤギ−抗マウス−Fc、Jackson Immunoresearch製)を製造元のプロトコール(Biacore、GE)に従ってCM5チップに固定化した。フローセル1、2および3を抗ヒトで、フローセル4を抗マウス抗体で固定化した。アッセイを25℃、流速30μl/分で行った。アッセイバッファーは、超純水において作成した20mM Tris−HCl pH8.3、150mM塩化ナトリウム、0.05%ポリソルベート20、10%グリセロール、0.1%BSAであった。二量体シグレック−8(単量体および多量体シグレック−8の不純物は、分子ふるいクロマトグラフィーにより除去した)を、アッセイバッファーにおいて15nMから1.88pMへと2倍希釈で希釈した。およそ120RUの変化まで抗体を捕捉した。6分間高速注射、続いて120分間解離を行った。フローセルを50mMグリシンpH1.5で再生した。結果は、空の参照セルおよび複数のアッセイバッファー注射により二重にブランク作成し、1:1グローバルフィットパラメータにより解析した。
遠心分離フィルター装置(Amicon 30K 4mL、4000g、5分間 − 最初の濃縮;Amicon Ultra 0.5mL 3K、14000g − 次の濃縮)を使用して、精製されたキメラおよび候補抗体を逐次的に濃縮し、各ステップで濃度を測定した。全試料を沈殿することなく総計で最大21〜24倍に濃縮し、ELISAにより検査したところ、シグレック−8に対する結合効力を失ったものはないことが示された。抗体は、少なくとも25mg/mLまでの濃度で沈殿する傾向がなかった。特に、ch2E2の溶解度は、少なくとも18mg/mLであり、HEKAは、少なくとも25mg/mL、HEKFは、少なくとも8mg/mL、HEKAmutは、少なくとも29mg/mL、HEKFmutは、少なくとも17mg/mLであった。
解析に先立ち試料を濾過し、いかなる塩またはタンパク質沈殿も除去し、濃度を再度測定した。続いて、これを0.4mL/分で、HPLCシステムにおける分子ふるいカラムへと注射し、多角度光散乱により解析して、絶対モル質量を決定し、凝集をチェックした。全バリアントが、134.9〜138.2kDaに及ぶ平均分子量による凝集の徴候を示さなかったが、この結果は、この解析におけるIgG単量体の予想の範囲であった(表10)。
精製されたキメラch2C4抗体、ヒト化HEKAおよびHEKF抗体ならびにヒト化HEKAmutおよびHEKFmut抗体バリアントを、60分間−20℃に付し、室温で解凍し、候補毎にEC80濃度におけるELISAアッセイにおいて使用した。HEKAが、このアッセイにおいて最高の安定性を示した(図6)。
材料
RBC溶解バッファー(10×RBC溶解バッファー):製造元の指示通りに1×へと希釈(eBioscience、00−4300−54)。
好酸球における抗シグレック−8抗体のADCCおよびアポトーシス活性を検査するために、新鮮末梢血白血球(PBL)を、キメラおよびマウス2E2抗体と共にインキュベートした。低フコースキメラ2E2 IgG1抗体は、好酸球の最も強力な死滅を示し、フコシル化キメラ2E2 IgG1よりも有意に高い効力を有し、低フコース型の抗体のより高いADCC活性と一貫した(図7)。
マウス2E2抗体と比較した場合の正常ヒト血液由来の好酸球のシグレック−8媒介性枯渇を誘導するその能力に関してヒト化抗体をin vitroで評価した。
平均EC50は、2回の独立的アッセイの好酸球枯渇に必要とされる平均最大半量抗体濃度を示す。
強力なFc受容体媒介性ADCC活性を有するヒト化抗シグレック−8抗体を作製するために、フコシル基転移酵素8を欠損するCHO細胞株(Lonza、ポテリジェント(Potelligent)CHOK1SV細胞)からHEKA IgG1抗体を発現させて、α1,6フコースを欠如する糖質を有する抗体(すなわち、非フコシル化抗体)を作製した。HEKA IgG1抗体とは異なるシグレック−8の細胞外領域を認識する、マウスIgG2aアイソタイプを有するマウスモノクローナル抗シグレック−8抗体(すなわち、1C3抗体)を実施例3に記載されている通りに作製した。キメラ1H10抗体は、マウスモノクローナル抗体1H10のV−領域およびヒトIgG1カッパ定常領域を含有する。10μMキフネンシンの存在下で培養したヒト293TS細胞株からキメラ1H10抗体を発現させて、低フコース抗体を作製し、プロテインA親和性クロマトグラフィーにより精製した。
ヒト造血幹細胞(HSC)の生着後に大量のヒト肥満細胞を作製することができる免疫不全マウスが記載されている(Tanakaら、J Immunol.、2012年、188巻(12号):6145〜55頁)。NSGSと命名されたマウス系統(Jackson Laboratory)は、IL−2受容体ガンマ鎖遺伝子の欠失を有する非肥満糖尿病/重度複合免疫不全(NOD SCID)マウスの派生体である(NSGマウス)。NSGSマウスはその上、ヒト造血幹細胞の生着を容易にするため、3種のヒトサイトカイン(幹細胞因子[SCF]、IL−3およびGM−CSF)についてトランスジェニックである。NSGSマウスの生着後に、ヒトCD34+細胞は、ヒト好酸球および増強された数のヒト肥満細胞を作製する。生着NSGSマウスにおける両方の細胞型は、ヒト末梢血および組織から単離される相当する細胞型におけるレベルに匹敵するレベルでシグレック−8を発現する。よって、このようなマウスは、in vivoでのヒト細胞における抗シグレック−8抗体の活性の評価のための魅力的なモデルを提供する。
マウス抗シグレック−8抗体の作製および特徴付け
シグレック−8の細胞外領域は、3個の免疫グロブリン様ドメインで構成される:リガンドに結合する特有のN末端V−セットドメイン(ドメイン1)と、続く2個のC−セットドメイン(ドメイン2および3)。抗体1C3は、ヒトシグレック−8の組換え細胞外ドメイン(配列番号74)に対して産生されたIgG2a重鎖およびカッパ軽鎖を有するマウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体1H10および4F11は、ヒトシグレック−8の組換え細胞外ドメイン(配列番号74)に対して産生されたマウスIgG1重鎖およびカッパ軽鎖抗体である。表13を参照されたい。これらの抗体は、ヒト(配列番号74)および非ヒト霊長類(配列番号118)由来の組換えシグレック−8配列に結合した抗体のハイブリドーマスクリーニングから同定された。
平均EC50は、2回の独立的アッセイの好酸球枯渇に必要とされる平均最大半量抗体濃度を示す。
配列
Claims (14)
- 対象においてシグレック−8を発現する細胞によって媒介される疾患の処置または予防のための、ヒト化抗体を含む組成物であって、前記ヒト化抗体はヒトシグレック−8に特異的に結合し、前記抗体が、Fc領域と、前記Fc領域に連結されたN−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、ここで、前記組成物中の前記N−グリコシド結合型炭水化物鎖の50%未満がフコース残基を含有する、組成物。
- 前記N−グリコシド結合型炭水化物鎖のうち実質的に全てが、フコース残基を含有しない、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号63のアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号66のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、請求項1または2に記載の組成物であって、
ここで、必要に応じて、前記抗体が、配列番号2〜10から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16〜22から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1または2に記載の組成物。 - 前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、(i)配列番号61のアミノ酸配列を含むHVR−H1、(ii)配列番号62のアミノ酸配列を含むHVR−H2および(iii)配列番号67〜70から選択されるアミノ酸配列を含むHVR−H3を含み、かつ/または前記軽鎖可変領域が、(i)配列番号64のアミノ酸配列を含むHVR−L1、(ii)配列番号65のアミノ酸配列を含むHVR−L2および(iii)配列番号71のアミノ酸配列を含むHVR−L3を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記抗体が、配列番号11〜14から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号23〜24から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項4に記載の組成物。
- 前記抗体が、配列番号2〜14から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および/または配列番号16〜24から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- ヒトシグレック−8に対する前記抗体の結合親和性またはアビディティーが、前記ヒトシグレック−8に対する抗体2E2または2C4の結合親和性またはアビディティーよりも高い、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも70℃のTmを有し、必要に応じて、前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも70℃から少なくとも72℃のTmを有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記疾患が、好酸球媒介性疾患または肥満細胞媒介性疾患である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体が、アレルギー反応の1種または複数の症状を阻害し、必要に応じて、前記アレルギー反応が、I型過敏症反応である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記疾患が、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−8を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)からなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記対象が、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β2アゴニスト、長時間作用型β2アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患う、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
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