BR112014019825B1 - Glicoengenharia quimioenzimática de anticorpos e fragmentos fc dos mesmos - Google Patents

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Abstract

glicoengenharia quimioenzimática de anticorpos e fragmentos fc dos mesmos. a presente invenção proporciona mutantes endo-s recombinantes que exibem atividade de hidrólise reduzida e atividade de transglicosilação aumentada para a síntese das glicoproteínas, em que uma desejada oxazolina sialilada ou oxazolina oligossacarideo sintética é adicionada a um aceptor g1cnac-proteína de núcleo fucosilado ou não fucosilado. tais mutantes endo-s recombinantes são úteis para a remodelação de glicosilação eficiente domínio igg1-fc para fornecer diferentes glicoformas de anticorpos que portam estruturalmente fc n-glicanos bem definidos.

Description

DIREITOS DO GOVERNO NA INVENÇÃOIÕQ
[001] Esta invenção foi feita com o apoio do governo com os números de concessão GM080374 e GM096973 concedidos pelo National Institutes of Health. 0 governo tem determinados direitos na invenção.
REFERENCIA CRUZADA Ã PEDI DOS RELACIONADOS
[002] O pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA N ° 61/597.468 depositado em 10 de fevereiro de 2012, o conteúdo do qual é incorporado no presence documento por referência, para todos os fins. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Campo da Invenção
[004] A invenção refere-se a síntese da glicoproteinas, e mais particu.larm.ente, ã utilização de uma Endo S mutante ê recombinanbe, uma endo-PN^acetíIglucosaminldase de Strepcococcus pyogenes t que possui atividadetransglicosilação e atividade de hidrólise limitada de mode permitindo a remodelação de glícosilação eficiente do domínio anticorpo-Fc.
[005] Descrição da técnica Relacionada
[006] Os anticorpos monoclonais [mAb) dc tipo IgG, são uma importante classe de proteínas terapêuticas utilizadas para o tratamento de câncer, doenças auto-imunes é infecciosas. (,1-A) Anticorpos IgG são compostos de duas cadelas pesadas e duas cadeias leves que estão associadas para formar três domínios distintos da proteína, incluindo dais domínios Fab variáveis e um dominie coustanre Fc (cristallzável) ligado por uma região de dobradiça flexível.. Os domínios de Fab. são responsáveis pela ligação ao antigeno, enquanto que o domínio Fc está envolvido em funções eferores mediadas pelo receptor Fc, tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e cita toxicidade dependente de complemento (CDC) . (2/ 4) 0dominio Fc é um hótnodimêro que porta dois N-glicanos nas locais de N-glicosilação conservados (N297). Os E>1igossacarídeos ligados são do tipo complexo biantenar com. considerável heterogeneidade estrutural, em que o núcleo de heptassacarídeo M-ligado pode ser diferencialmenre decorado com fucose nuclear (Fuc), bissectriz M-acetiIglucosamina (GldNAc) , galactose terminal (Gal), e ácido siálico terminal { Sia) como mostrado na Figura 1, (5-1) Estudos estruturais de raios^X cristalográficos e RMN indicam que os glicanos Fc sâo colocados entre os dois subdomínio.s CH2/CH3 e têm múltiplas interações não cõvalentes corn os domínios Fc. (8-14) Estes estudos têm mostrado que a ligação de diferentes glicanos Fc pode ter impacto distinto sobre as conformações dó domínio Fc, implicando um papel importante da gl. icosilaçâo na manutenção de uma. adequada estrutura de domínio Fc para interações com receptores Fc respectivos associados com as funções efetoras do anticorpo (8-14) .
[007] Foi ainda demonstrado que as estruturas finas de N-glioanos Fc são determinantes importantes das atividades de pro- e anti-iílflãmatôrias de anticorpos. (2, 15) , por exemplo, a falta de fucose de núcleo, bem. como a ligação de uma porção GlcNAc bíssector, aumenta dramaticamente a afinidade do anticorpo para o receptor Fc-yllla (FcyRIIIa), que é responsável pela citotoxlcidade celular dependente de anticorpos (ADCC). (11, 16-18) Assim, mAbs com baixo teor de fucose são. procurados, para a melhoria da eficácia ántioânaer in vivo. (19, 20) Por outro lado, a gliccfoπna FC a-2 , 6-sialilada terminal, um componente menor daimunoglobulina intravenosa (IVTG) reunidos a partir dos soros de milhares de doadores de sangue saudáveis, foi recentemente identificado como a espécie ativa para a atividade anti-inflamatória de IViG em um modelo de rato deartrite xeumatôide £ÃR) . £21-23) Contudo, IgG: disponíveis comerciaImente, incluindo anticorpos monoclonais e IVIG, tipicamente existem como misturas de glicofo.rmas que não são ideais para as suas respectivas atividades terapêuticas. Por exemplo, as glicoformas Fc maiores de anticorpos monoclonais atualmente utilizados para o tratamento do câncer são de núcleo fucosilado que possuem uma afinidade xelativamentê baixa para o receptor de ativação FαyRIIIa, demonstrando pouca eficácia particularmente para aqueles pacientes com o polimorfismo alélico EdyRHIa-FlSS de baixa afinidade. £2, 19, 20)
[008] O impacto da glicosilação sobre as funçõesbiológicas e- resultado terapêutico de anticorpos. IgG tem estimulado grande interesse no desenvolvimento de métodos para' controlar a glicosilaçáo de anticorpos. Uma abordagem é a de controlar os perfis de glícosilação durante a produção por meio de engenharia do caminho biossintético de glicano em vários sistemas de expressão, incluindo células hospedeiras de mamífero, de plantas e de levedura (24-30}. Esse controle de glicosilação, resultou na produção de bãixo-fuCQse eu não fucosilado anticorpos monoclonais com a melhoria da atividade ADCC. Porém, as glicoformas que podem ser geradas por esta abordagem tem sido limitadas, e na maioria dos casos, um controle completo a uma gli.coforma homogênea definida é difícil.
[009] Uma análise recente dos vários fármacos de glicoproteínas terapêuticas disponíveis no mercado, incluindo rituximab anticorpo monoclonal, indicou modificações significativas dos perfis de glícosilação de diferentes lotes produzidos em diferentes períodos. [311 Esta análise implica o desafio na manutenção de urna produção consistente de fármacos à base de glicoproteínas e também levanta preocupações regulatórias, como alterações da glícosilação Fc seria mais provável impactar a eficácia terapêutica.
[0010J Uma abordagem alternativa para lidar com a inconsistência e heterogeneidade na glícosilação deglicoproteinas é a realização de remodelação deglícosilação através aparaçáo dos N-glican.os heterogêneos e ampliar as cadeias de açúcar por glícosilação enzimática. (32, 33) Tal glícosilação enzimática foi recén tementedescrito usando uan método guimioenzimat ico para remodelação de glícosilação Fc que tira proveito da atividade transglicosilação de várias endoglicosidases e seus mutanres glicosíntase usando glicano oxazolinas como seus substratos (34-36) Esta abordagem de remodelação consiste em duas etapas: aparaçâo dó todas bs N-glicanos heterogêneos por um endogÍleosidase para deixar apenas o primeiro GlcNAc no(s) local(is) de glícosilação e, em seguida, voltar a adicionar uma estrutura bem definida de N-glicanos em bloco por meio de uma reação de transglicosilação catalisada por endoglicosidase. (32)
[0011] Um trabalho recente demonstrou que a engenharia de glícosilação de domínio de XgG-Fc pode ser conseguida por uma combinação a expressão em células CHO ou de levedura do domínio Fc e a sua subsequente remodelação quimióénzíltlática através de uma abordagem desglicasilaçào / reglicosllaçâo enzimática. (34-36) Foi demonstrado que a end.o-PN-acetílglucosamínidase de Arthrobscterprotophorifiiae, endoA, ê altamente eficiente para glicõsilat o domínio Fc contendo GlcNAc utilizando vários oxazolinas de núcleo d.e N-glicano sintéticas como substratos. (34, 35) No entanto, as limitações do estado atual dõ método são evidentes: (a) nem endoA nem endoM (outra endoglicosida se de Mucor hiemalis) foi capaz de transformar domínio I.gG-Fc Eucosilado-núcleo., (35) as principals qlicofórmas de mAbs recombinantes e IV1G; (B) rtutãntes EndpD eram capazes de fixar um núcleo ManuGlcNAc a um domínio de GlcNAc-Fc fucosilado, (36) , mas nentium dos endoD, endoA, endoM, e seus mutantes £36-39) eram capazes de transferir N-glicano tipo complexo intacto a domínio GlcNAc-Fc ou fucosilados ou não fucosilado; e £c) a remodelação de glicosilação de anticorpos IgG dê comprimento completo intactos com N- glicanos de tipo complexo ainda esta para ser alcançado.
[0012] Em uma tentativa de desenvolver um sistema degllcosí lação / glicosilação enzimática e.ficiebte para remodelação de glicosilação de glicoproreina, atenção se voltou para endoS, uma endo-β-N-acetilglicosaminidase (ENGaseJ de Streptococcus pyogenes, que é capaz de hidrolisar os Fc N-glicanos de anticorpos IgG intactos por clivar a ligação (31, 4-glicosídica no núcleo quitobiose des M-glicanos. (40^-42). Endo-S possui atividade de transgjicosilaçâo, tal como o capaz de utilizar MansGlcNAc oxâzolina como substrato doador para glicüsllax um aceptor de GlcNAc. No entanto, a Endo-S de tipo selvagem também possui atividade Itídrolitioa altamente ativa, de modo que o produto IgG glicosilado também está sujeito a hidrólise rápida se a Endo-S de tipo selvagem é utilizada para a síntese e remodelação de glicosilação.
[0013] A luz das atividades acima conhecidas de Endo S, seria vantajoso proporcionar um mutante de Endo-S que apresenta uma atividade de transglicosilar com atividade de hidrolização reduzida.
SÜMÁRIO DA INVENÇÃO
[0D14] A presente invenção proporciona mutantes selecionados e Endo-S recombinantes dos mesmos, que exibem atividade de hidrólise reduzida e atividade de transglicosilação aumentada para a síntese de anticorpos IgG a fragmentos Fc destes, em que uma cadeia de açúcar desejado é adicionado a um aceptor GicNAc-IgG de núcleo fuccsilado ou não fucosilado .Como tal, a presente invenção permite a. síntese e remodelação de anticorpos terapêuticos e fragmentos Fc dos mesmo para proporcionar certas atividades biológicas, tais como, o tempo de meia-vida prolongada in vivo, menor imunogenicidade, a atividade in vivo melhorada, aumenta da capacidade de direcionamento, e/bu a capacidade de entregar um agente terapêutico.
[0015] Em um aspecto, a presente invenção proporciona a atividade transglicasilação de uma endo-PN- acetilglucosamiπdase de Streptococcus pyogenes ISEQ ID NO: 1) e seus, mutantes, em que os mutantes têm pelo menos de homologia ao mesmo e exibem atividade detransglicosiLação em aceptores de GlcNÃc-IgG tanto de núcleo fucosilados como não fucosilado^ em que as endoglieosidases permitem a transferência de umoligossacarídeo (sob a> forma de uma oxazolina de açúcar ativado] em bloco para um GicNAc-IgG fucosilad.QS ou não fucosilado (ou um fragmento Fc do mesmo) de modo a formar uma nova glicoforma de IgG (ou um. seu. fragmenta Fc) .
[0016] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona mutantes Endo-S que mostram mia road amente uma maior eficácia de transglicoáilação ou atividade hidrolitica de produto diminuída, ou abolida;. Mutantes incluem preferência mutações sítio-específicas, incluindo uma mutação Asp-233. Os mtãntes incluem, mas nâo estão limitados, a, D233Q (SEQ ID MO: 2} e D233A (SEQ ID MQ: 3)
[0017] Em um outro. aspecto, a presente invenção proporciona um método quimioendimático para a preparação de gllcoformas de núcleo fucosilado ou não fucosilado homogêneAS de anticorpos. IgG, que compreende:á. proporcionaR um aceptor selecionado a partir do grupo que consiste de um GlcNAc-IqG DE núcleo fucosilado, GlcNAc- IgG de núcleo não fucosilado ou fragmentos de IgG-Ec correspondentes; eb. reagir D aceptor cbm um substrato de doador, incluindo uma porção de oligossacarideo ativado, na presença de mutantes Endo-S-Asp 233 de Streptococcus pyogenes para transferir a porção de αligossacarideo ativado para o aceptor e produzir a gl icoptoteína Eucosilada ou não fucosliada homogênea.
[0018] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação de uma IgG de núcleo fucosilado ou fragmento IgG-Fc tendo uma porção oligossacarideo predeterminada, que compreende:a. proporcionar um aceptor de IgG de núcleo fucosilado que compreende um. resíduo N-acec ilglucosamina de núcleo fucosilado ligada a asparagine (GlcNAc); eb. enzimaticamente reagir o aceptor de IgG de núcleo fucosilado corn' utn doador de oligossacarideo ativado na presença de mutante de S-Etidoglicosidase D233Q [,3EQ 1D MÕ: 21 e D233A Í.SEQ ID NCh: 3j , em, que o. doador de αligαssacarideo ativado porta uma porção o,l igos sacar ideo que compreende um. número e o tipo de resíduos de açúcar predeterminado, em que a porção do o ligos sacar ideo está Ligada de forma covalente ao aceptor de IgG: de núcleo fucosilado, preparando-se assim a IgG de núcleo f.ucosilada ou fragmento IgG-Fc tendo a porção de ollgossacarídeo predeterminada.
[0019] Em ainda outro aspecto., a presente invenção proporciona uma porção de oligossacarideo ativado, tal como glicano ou o ligo.s sacar ideo o.xazolina-, fluoreto de glicosila, glicosil azlda ou um glicósido de arlla, tal como um substrato doador para a síntese de glicoproteinas de núcleo fucosilado homogêneas ou glicoproteinas não fucosiladas. De preferência, a porção de oligo.ssacar ideo ativado è um oligossacarideo oxazolina.
[0020] Em um outro aspecto, a presente invenção refere- se a um método quiíuioenzimátieo para a preparação de um anticorpo de monâmeros fucasilados õu não fúcosilados homogêneos ou um fragmento Ec do mesmo, dito método compreendendo:proporcionar um apeptof selecionado a partir do GlcNAc- an.ticorpo de núcleo fucosilado ou não fucosilado ou um fragmento Fc do mesmo; ereagir o aceptor com um substrato de doador na presença de um mutante Endo-S Asp—233 de Straptçcoccus pyogenes, em que o substrato doador compreenda um componente oligossacarideo predeterminado com um número e tipo de resíduos de açúcar definidos, e tipos de ligação específicos, fornecendo assim o anticorpo de monômero fucosilado ou não fucosilado homogêneo ou um fragmento Fc do mesmo. Em uma modalidade, uma GlcNAc fucosilado contendo, proteína é um alfa-1-6- fucosil-GlcNAc-a proteína.
[0021] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de remodelar um anticorpo ou seu fragmento Fc com um aligoss.acar ideo possuindo um componente aligos sacar idea predeterminado com um número e tipo de resíduos de açúcar definidos e com tipos específicos de ligação, compreendendo õ método:a. proporcionar um anticorpo de núcleo fucosilado ou fragmento Fedo mesmo que compreende Fc N-glicanos;b. tratar o anticorpo de núcleo fucosilado óu fragmento Fc cofii uma encio-enzima dê hidrólise para produzir uma porção GlcNAc ligada a Asn; ec. unir o oligossacarideo à porção GlcNAc ligada a Asn na presença de um mutante de Endo-S tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em S.EQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, adicionando assim o componente oligossacarideo predeterminado.
[0022] Em. um outro aspecto, a presente invenção refere- se a um método de remodelação de uma IgG de núcleo fucosilado ou não fucosilado ou fragmento IgG-Fc com um oligossacarideo possuindo um componente oligossacaríd.eo predeterminado com um número e tipo de residues de açúcar definidos e com os tipos de ligação específicos, o método compreendendo:a. proporcionar uma IgG de núcleo fucosilado ou nao fucosilado ou fragmento. IgG-Fc obtido a partir de fontes naturais ou recombinante.s que portam N-glicanoshet e rogâ neos; b. tratar a IgG ou fragmento IgG-Fc natural ou recombinante com uma endo-enzima luma eridogli cos Idase de tipo selvagem ou urn eπdogi ices ida se mutante corn atividade hidtolitica eficiente} para hidrolisar a ligação entre os dois resíduos de GlcNAc posicionados mais próximos do domínio peptidico formando assim uma proteína desglicosilad.a portando um aceptor de GlcNAc de núcleo fucosilado ou não fucosilado; ec. unir o componente oligossacarideos pré-determinada ao aceptor de GlcNAc para reconstituir a ligaçào beta-1,4-glicosídica através trans.glic.osl lação com um mutante Endo-S Asp-233 de Streptococcus pyogenes, assim acrescentando u componente oligossacarídea pré-determinado para remodelar o IgG de núcleo fucosilado ou não fucosilado ou fragmento IgG-Ec.
[0023] Oligossacarideos oxazolinas aplicáveis incluem, mas não se 1 Lmirando a, tipo elevado teor de manose, tipo híbrido, oxazolina sialoglicano e N-glícano tipo complexe, bem como os seus derivados modificados selétivamente, tais como aqueles com etiquetas especificas. De preferência, di, tri-, tetra-, penta-, hexíl-, hepta-, octil-, nona-, deca-2 ou undecaasacarídeo oxazolinas são utilizados comosubstratos doadores para a síntese quimioenzimática aitamen.te eficiente de -anticorpos IgG de núcleo fuco.silados ou não fucosilado homogêneos e fragmentos de IgG-Fc,
[0024] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refete-se a um método para sintetizar um anticorpo ou fragmento modificado do. mesmo, compreendendo o método;a. proporcionar um anticorpo IgG naturalmente existente, um anticorpo recombitiante ou um dominio Fc que porta Fc N- glicanos como precursores; b. Deglicosilar Fc utilizando uma eπdogllcosidase, tal como uma Endo-S selvagem para deglicosilar o domínio Fc para formar um. aceptor de GlcNAc; em que o aceptor de GlcNAc é posicionado na região Fc do anticorpo e o. aceptor de GlcNAc é ou núcleo fucosilado ou não fucosilado; èc. transglicosi lar o aceptor de GlcNAc no anticorpo IgG naturalmente existente, o anticorpo recombinante ou o domínio Fc com uma ol igossacarideo oxatolina ou uma oxazolina sialoglicano tendo um número predeterminado de residues de açúcar sob a catálise de uma enzima selecionada a partir do grup.O que consiste em mutantes Endo-S incluindo a SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, para formar o anticorpo modificado com um número predeterminado de resíduos de açúca r.
[0025] Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de remodelar uma imunoglobulina intravenosa [IVTGJ exibindo glicoformas-Fc sialiladas, ométodo que compreende:a. proporcionar uma IVIG portando Fc N-glicanos;b. Fc deglicosilar os. Fc N-glicanos usando uma endoglícosidasé incluindo Endo-S selvagem para formar aceptores GlcNAc; em que os aceptores de GlcNAc são posicionados na região Fc da IVIG e os aceptores de GlcNAc ou são fucosilados ou não fucosilado; ec. transglicosi lar os aceptores de GlcNAc com uma oxazóiina sialoglicano tendo um número predeterminado de resíduos de açúcar sob a catálise de uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em inuta.ntes Enda-S incluindo SEQ EQ NO; 2 e SEQ ED NO: 3, para formar uma IVIG 3 iali1 ada.
[0026] Um outro aspecto da presente invenção proporciona uma composição contendo preparação de IVIG que corapreen.de pelo «ienes 901 de glicoformas F'c siailiadas homogêneas para aumentar a atividade anti-inflamatória, em que as glicoformas Fc siaiiladãs são sintetizadas usando um mutante de Streptococcus pyogenes Endo-£ Asp-233 era combinação com uma porção GlcNAc posicionada na região Fc de uma IVIG desgliaosilada e lima oxazolina sialogl icarno tendo um número predeterminado de resíduos de açúcar.
[0027] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método pata a síntese de anticorpos IgG de núcleo fucosllado ou não fucosilado homogêneos ou fragmentos de IgG-Fc, o método que compreende:a. proporcionar ura anticorpo IgG natural ou recombinante ou fragmento IgG-Fc, em que a IgG recombinante ou IgG-Fc é produzida a partir de um sistema de expressão de proteína típica, incluindo mas não limitada a leveduras, insetos, plantas, e qualquer sistema de expressão de mamífero;bi remover os N-glicanos de uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em Endo-H, Endo-A, Endo-S, e/ou endo-F3 para formar um proteína contendo GlcNAc de núcleo fucosilado ou não fucosilado;c. proporcionar uma oxazolina de açúcar ou de oxazolina sialoglicano com um componente oligossacarideo desejado que compreende um número e tipo de residues de açúcar na cadeia definido; ed. enzimaticamente transglicosílar a proteína contendo GlcNAc fucosilado ou não fucosilado com uma cxazolina dê açúcar rendo um número desejado de resíduos de açúcar ou oxazolina sialoglicano tendo um número desejado de acúcar e de resíduos de ácido siálico cora uma endoglicosidase selecionada a partir do grupo que consiste era mutantes de Streptococcus pyogenes Endo-S Asp -233, formando assim um anticorpo IgG de núcleo fucosí.lados ou não fucosilad homogênea o ou fragmento IgG-Fc possuindo uma extensão do número desejado de resíduos de açúcar e/ou ácido siálico.
[0028] Èst.á previsto que a pligossacarideo oxazolina ou oxazolina sialoglicano tendo um componente oligossacarideo predeterminado com um número e tipo de resíduos de açúcar definido pode compreender ainda uma. etiqueta ou porção adicional, incluindo, um agente terapêutico ou fármaco, tais como para o tratamento: de câncer, HIV ou outros virus, substâncias que ativam os receptores na membrana plasmática das células, agentes que afetam a química intracelular, agentes que afetam física celular, genes, análogos do gene, RNA, análogos de RNA, DNA, análogos de DNA, sequências de arninoácido.s dos receptores dê superfície, tais como CCR5 ou CD4, estrutura antigênica que tem afinidade para um anticorpo específico.; sequências de aminoácidos de ligandos de receptores, tais como gpl20, gp41 ou gplGO, antagonistas de receptores, bloqueadores dos receptores, enzimas, substratos de enzimas, inibidores de enzimas, moduladores de enzimas, proteínas terapêuticas, análogos de proteínas, metabolites, análogos de metabolites, oligonucleotideos, análogos de oligonucleotideos, antígenos, análogos de antígenos, anticorpos ou os seus fragmentos, análogos de anticorpo, um anticorpo diferente do anticorpo modificado, que ê reativo a outra bactéria receptora, virus, ions inorgânicos, ions metálicos, agregados de metais, polímeros, compostos fluorescentes e quaisquer combinações dos me smos.
[0029] Como tal, a presente invenção proporciona ainda um dispositivo de administração pára a administração de um fàrmaco ou agente terapêutico possuindo uma atividade biológica para tratar um estado, o dispositivo de administração que compreende: um fragmento de IgG-Fc ou IgG remodelada tendo uma cadeia de açúcar pré-determinada ou sialoglicano e um agente terapêutico ou fármaco ligado ao resíduo de açúcar terminal ou ácido siálico.
[0030] A presente invenção prevê a modificação de anticorpos monoclonais relacionados cora o HIV, incluindo, mas não limitado a 17b, 48d, A32, CU, 2G12, F24Q, IgGlbl2, 19e, X5, TNX-355 e F91, todos .03 quais estão disponíveis comercialmente.
[0031] Outros anticorpos relacionados com o câncer o.u outras doenças também podem ser remodelados para ura ajuste individual a determinados receptores, aumentando assim a atividade biológica, os anticorpos monoclonais podem incluir, mas não estão limitados a, cetuximab, rituximab, muromonab-CD3, abciximab, daclizumab, basiliximab, palivizumab, infliximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamicin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, adalimmnab, omalizumab, tositumαmab, I- 131 tositumomab, efalizumab, bevacizumab, panitumumab, pertuzuraab, natalizumab, etanercept, IGbllOl [Aphton), volociximab (Biogen Idee and PDL BioPharm), Anti-CDSO mAb (Biogen Idee), Anti-CD23 mAb (Biogen Idel), CAT-3088 (Cambridge Antibody Technology):, C-DP-791 (Imcioné), eraptuzumab {ImmunomedicsJ , MDX-010 (Medaεex and BMS), MDX-06O (Medarex), MDX^070 (Medarex), matuzumab (Merck), CP-675,2Q6 (Pfizer), CAL (Roche), SGN-30 (Seattle Genetics), zanolimumab (Seronα and Genmab), adecaturauraab (Sereno), oεegovomab (United Therapeutics), nimotαzumab (YM Bioscience), ABT-^74 (Abbott Laboratories), denosumab (.Amgen), AM 108 (Amgen), AMG 714 (Amgen), fontolizαmab (Biogen Idee arid PDL BioPharm) , daclizuroiab (Biogent Idee and PDL BioPharm), golirπumab (Centocor and Schering-Plough), CNTO 1275 (Centocor], ocrelizumab (Genetech and Roche] , HuMax-CD20 (Genmab), belimumab (PGS and G5K), epratuzumab (Immunomedics) , MLN1202 (Millennium Pharmaceuticals), visllizumab (PDL BioPharm], tocilizuinab (Roche), ocrerlizurnab (Roche), certolizumab pegol [UC0, formerly Celltech), eculiztunab (Alexion Pharmaceuticals), pexelizumab (Alexion Pharmaceuticals and Procter & Gamble), abeiximab (Centocor), ranibizimumab (Genetech), mepolizurnab (GSK), TNX-355 (TanoX), αu MYO-Q2S (Wyeth),.
[0032] Ainda uro outro aspecto da invenção refere-se a um método de remodelar um anticorpo que inclui inicialmente uma cadeia de açúcar heterogéneo, o método que compreende: a. remover a cadeia de açúcar heterogênea do anticorpo com uma endoglicosidase para deixar uma única porção GlcNAc fucosilada ou não fucosilada ligada a um local de glicosilação original; eb. transferir um núcleo oligossacarideo ou oxazolina sialoglicano com, pelo menos, uma etiqueta para a porção GlcNAc fucosilado ou, não fucosilado por uma transglicosilação catalisada por endoglicosidase para se obter um anticorpo etiquetado, em que a endogl i.co si da se é selecionada a partir do grupo que consiste em mutantes de Endo-S incluindo SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3.
[0033] A porção de etiqueta pode incluir, mas não está limitada a, antigenos, fãrmacos terapêuticos, tais como para o câncer ou o HIV, toxinas, sondas fluorescentes, biotina, espécies de PEG, lipídeos ou nucleotideos.
[0034] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição que compreende pelo menos um mutante de Streptococcus pyogenes Endo-S Asp-233 selecionado a partir do grupo que consiste era D233Q (SEQ ID NO: 2) e D233A (SEQ ID No: 3) .
[0035] Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona uma preparação substancia Imente homogênea deutn anticorpo de núcleo fucosilado ou não fucosilado ou um fragmento Ec do mesmo tendo uma porção oligossacarídeo predeterminada, em que a preparação subatancialmetite homogénea é produzida por qualquer um dos métodos acima mencionados, Também sào fornecidas composições que compreendem tais preparações homogêneas.
[0036] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento utilizando um anticorpo remodelado rendo um estado de glicosilação desejado e/óu forma sialilada .em uma quantidade suficiente para modular a atividade biológica do indivíduo tratado.
[0037] Outros aspectos, características e modalidades da invenção serã.o mais evidentes a partir da divulgação que se segue e reivindicações anexas.BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0038] A Figura 1 mostra as estruturas da um anticorpo IgG e típico dos Fc N-glicanos. a) Estrutura da Alfa espinha dorsal de IgG humana, mostrando regions funcionais (modelados com base no código PDB 1H3HJ : b) A estrutura de um comprimento total de bi-antennaiy tipo complexo de N- gllcanos ligados a Asn-297 no domínio
Figure img0001
Figure img0002
[0039] A Figura 2 mostra o alinhamento da sequência de eridoscopia (SEQ ID NO: 4) e EπdoF3 (SEQ ID NO: 5].
[0040] Figuras 3 A e B mostram o esquema para a remodelação de glicosilação de rituximab para glicoformas naturais e seleti vamente modiíicados homogêneas .
Figure img0003
Figure img0004
[0041] A Figura 4 mostra a SDS-PAGE e análise de ESI-MS de remodelação de glícosilação de rituximab, (a) a análise de SDS-PAGE: pista 0, marcadores de proteína; Pista lz rituximab comercial; Pista 2, EndoS rituximab de- glicosilado (1); Pista 3, produto de transglicosilação (31 a partir da reação catalisada por Endos-D233A entre (1) e oxazolina slaloglicanα (2); Pista 4, produto de transglícosiiação da reação catalisada por Endos-D233Q de (1) e (2) ; pista 5, o produto de transglicosilação 15) a partir da catalisada reação por endos-D233Q entre o rituximab desgliαosilado (1) e Man3GlcNAc oxazolina (4); pista 6r o produto de transglicosilação (7) a partir da reação catalisada por endoS-D233Q entre o rituximab desg lícosilad.o (1) e N3Man3GlcNAõ oxazolina (6) . (b) ESI-MS (depois de- desconvoLuçào) da cadeia pesada do rituximab comercial, (e) ESI-MS do rituximab de-gliõõsilado (1) . (d) ESI-MS do produto transgl i.cosilaçào (3). (e) ESI-MS doproduto de transglicosilação (5). [f) ESI-MS do produto de transglicosilação (7).
[0042] As Figuras 5 A e B mostram a remodelação enzimát ica para glicof orma não-tucosilada homogênea derituximab
Figure img0005
Sia) .
[0043] A Figura 6 mostra a SDS-PAGE e análise de ESI-MS de glícoengenharia do rituximab para a glicoforma G2 não fucosilada. (a) análise de SDS-PAGE: pista 0, marcadores de proteína; Pista 1, rituximab comercial; Pista 2, o rituximab de-qlicosilado por endoS (1) ; Pista 3, o. produto def’jcosiladα (8); Pista 4, a glicoforma G2 modi ficada por g Li ccengenharia. (b) ESI-MS (depois de desconvoluçao) dacadeia pesada do rituximab defucosilado (8). (c) ESI-MS da cadeia pesada do rituximab modificada por glicoengenhaxia G2 I ID) .
[0044] A figura 7 mostra o glicpengenhar ia de Fc de sitio especifico de IVIG humano.
Figure img0006
[0045] A Figura 8 mostra os perfis de HPLC fluorescences de N-glicanos marcados com 2ÁB a partir de Fab e Fc de IVIG. a) a partir Fc de IVIG nativa; bj a partir de Fc de IVIG modificada por gllcoengenharia; Cl a partir de Fab de IVIG Tjativo; d) a partir de1 Fab de IVIG modificado por glicoengenharia.: As estruturas de glicano. incluem os .seguintes componentes:
Figure img0007
Figure img0008
[0046] Figuras 9 A-C mostram sansoqramas SPR típicos de ligação de G2-rituximab e rituximab comercial, com respectivos receptores Fey: FcyRHIa-V15.8 [A], FcyRIIIa-F158 (iB), e EeyRIIb £C) . Qs anticorpos foram imobilizados por captura de Proteína A e a ligação foi analisada por injeção dos respectivos receptores Fcy em unia série de diluições de 2 vezes a partir de 40 pg/ml (1,33 mM).
[0047] A Figura 10 mostra a MALDI-TOF MS dos Fc N-glicanos liberados pelo tratamento com PNGase F com osmesmos símbolos., conforme definido na Figura 1.
[0048] A Figura 11 mostra a MALDI-TOF MS dos Fc N-glicanos liberados por tratamento com, EndoS com os mesmos símbolos., conforme definido na Figura 1.
[0049] As Figuras 12 A-C mostram a análise por LC-MS de rituximab; a) ó perfil de LC rituximab reduzido'; b) ESI-MS da cadeia leve; c) MS decorivoluido da cadeia leve; d) ESIMS da cadeia pesada; ej deconvoluidos MS da cadeia pesada.
[0050] A Figura 13 mostra o perfil de HPLC fluorescente de N-glicanos marcados com 2-AB liberados das amostras de rituximab comercial e modificado por glicoengenharia por tratamento com PNGase F, a) a partir de rituximab comercial; b) a partir de rituximab sialilado (3); c) a partir do rituximab não fucosilado (10) .
Figure img0009
Figure img0010
[0051] Ã Figura 14 mostra a análise de SDS-PAGE de transglicosilação por BndoS do tipo selvagem. Pista 0, .marcadores de proteína; Pista 1, rituximab comercial; Pista 2, rituximab de-=gl icos ilada por EndoS (11; Pista 3' a pista 7, o monitoramento da reação de transglicosilação entre rituximab de-glicosilado (1) e oxarolina sialoglicano (2): Pista 3,15 minutos; Pista 4, 30 min; Pista 5, 1 h; Pista 6, 2 h; Pista 7, 4 h.
[0052] As Figuras 15. A e B mostram o monitoramento de L.C-MS para defucosilação de Fuc (of2,6) GlcNAc-rituximab (1) com a a-fucoaidase de rim de bovino. Os perfis deconvoluidos ES1-MS de cadeia pesadã do rituximab forammostrados (FG-Rx, cadeia pesada de Fuc («2,. 6) GlcíNAc- rituximab; G-Bx, cadeia pesada de GlcNAc-rituximab)- al incubação com a a-fucosidase, durante 2 dias; b) aincubação com a ct-fucasidase, durante 7 dias; c) aincubação com a o-fucosidase, durante 14 dias; e dj a incubação com a o-fucosidase, durante 20 dias.
[0053] A Figura 16 mostra a análise de 3DS-PÃGE de glicoengenharía de IVIG. Pista 0, marcador de proteína; Pista 1, IVIG comercial; Pista 2f IVIG (11) após desglicosilação por EndoS; Pista 3, IVIG (12) depois de transglicosilação catalisada por Endos-D233Q com oxazolina sialogliõano,
[0054] Figura 13 A e B mostram os residues de aminoácidos d® mutantss de Streptococcus pyogenes Eπdo-S- Asp 233 D233Q [SEQ ID NO: 2) e D233A (SEQ ID No: 31, respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALRADA DA INVENÇÃO
[0055] A presente invenção proporciona novos mutantes glicosintase Endos Asp 2.33 que. apresentam uma eficiência notável transglicosilação capaz de transferir N-glicanos do tipo complexo de glicano oxazolinas ativados para desglieosilar anticorpos intactos sem hidrólise do produto. Verificoi3"Se aqui que os mutantes glicosintase Endos A.sp 233 agiram de forma eficiente tanto em núcleo fucosilado como nào fucosilado domínio GlcNAc-Fc de anticorpos intactos para fornecer várias glicoformas IgG definidos. Além disso, anticorpos e ímunoglobulinas intravenosas foram transformados em glicoformas Ec totalmente sialiladas com o aumento da atividade anti-inflamatória. Ainda adi cionalmente, a presente invenção proporciona uma glicoforma homogênea possuindo um aumento da atividade de ADCC com atividade de ligação ao receptor FCyTXla reforçada e glicoformas marcadas com azida, que pode ainda ser transformados em outros glicoformas.
[0056] A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular, microbioLogia, biologia celular e ADN recombinante, que estão dentro da perícia na téniea. Veja-se, por exemplo, Sambrook, et al, CLONAGEM MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual, 2 a edição (19’6 9) ; Current Protocols in MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel, et al θds, (1987)..); a série METHODS IM ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.J: PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. 11995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE IR. I. Freshney, ed, (1987)).
[0057] Entende-se qus os aspectos da presente invenção aqui descrita incluem "composto" e/ou "consistindo es.senc ia Imente em" aspectos.
[0058] Definições
[0059] Tal como utilizado aqui na especí ficaçào, "um" ou "uma” podem significar um ou mais. Como é usado no presente documento nas reivindicações, quando usado juntamente com a palavra "que compreende", as palavras ’’um1' ou "uma" podem significar um ou mais do que um. Como é usado no presente documento "outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[0060] Como é usado no presente documento, "atividade biológica" refere-se ás propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas, incluindo, por exemplo, a afinidade molecular ou efeitos bioquímicos ou fisiológicos resultante, afinidade para o receptor ou o efeito fisiológico ou bioquímico resultante, afinidade não- de receptor ou efeito bioquímico ou fisiológico., eficácia, biodlsponibilidade, absorção, distribuição, metabolismo ou eliminação.
[0061] Como é usado no presente documento, "açúcar" refere-se a uma molécula contendo um carboidrato oxidada ou não oxidado, incluindo, mas não limitado a, um oligossacarídeo ou pαlissacarideo., incluindo, por exemplo, Núacet ilgluGDsaπiina, ftiãnose, galactose, ácido Placet ilneuremindco (ácido siãl ico), glicose, frutose, fucose, sorbose/ ramnose, Manoeptulcse, N- acetilgalactosarnina, a dihidroxiacetona, xilose, xiiuLose, arabinose, gliceraldeido, sacarose, Lactose, maltose, treaiose, celobiose ou qualquer combinação facto de a L-ou D-isotnera. Sugar refere ainda, que, essas moléculas produzidas .ma Lura Imente, recombinant®, sinteticamente, e/ou semi - si ntet icamente
[0062] Como é usado no presente documento, "homogêneo'* refere-se a glicoproteinas de núcleo fucosilado ou glicoproteinas não fucosiladas em que o componente oligossacarídeo compreende pelo menos 75%, mais prefecencialrtlentè pelo menos 80*, pelo menos 85 B OU pelo menos 90S, e mais preferivelmente pelo menos 95^ do mesmo número e tipos de resíduos de açúcar.
[0063] Como é usado no presente documento, "proteína” ou "glicoproteina" é interrautável com os termos peptídeo e glicopeptideos,
[0064] Como ê usado no presente documento, "homologia" refere-se à sequência de aminoácidoa com a identidade ou semelhança entre dois polipeptídeos substancial é tendo, pelo menos, 90^, e mais preferencialmente pelo menos 95% de semelhança com um polipept ideo d'ô referência. Para pollpeptídeos, o comprimento de comparação para obter as homologies percentuais acima descritas entre sequências será geralmente de pelo menos 25 aminoáeidos, a 1 te mat ivamente pelo menos 50 aminoácidos, mais provavelmente, pelo menos 100 aminoácidos e mais provavelmente 200 aminoácidos ou mais. Pqlipeptídeos substaπαialmente idênticos ou honiôlõgõ® incluem adições, deleções, tru.ncagens internas cu inserções, substituições conservatives e não conservatives, ou outras modificações, localizadas em posições da sequência de aminoácidos que não destroem a função do endogliuosidase. Õs peritos na arte reconhecerão os inúmecos aminoáeidos que podem ser modificados ou substituídos por outros resíduos quimicamente semelhantes, sem alterar substancia Lmenre a atividade.
[0065] Como é usado no presente documento, "modular" refere-se a um aumento du uma diminuição na "atividade biológica", tal como definido acima, quando, comparada com um anticorpo de engenharia de glicosiíação da presente invenção para um anticorpo não modificado por engenharia deglicosilação,
[0066] Como é usado no presente documento, "molécula de imunoglobulina" ou "anticorpos" refere-se a moléculas que contêm um local de ligação ao antigeno que se liga especificamente a um antigeno ou a uma região Fc, que se liga aos receptores celulares. Estruturalmente, o anticorpo mais simples que ocorre naturaImante (por exemplo, IgG) compreende quatro cadeias polipeptidicas, duas pesadas (H) e duas cadeias leves (L) inter-cadeias ligadas por pontes dissulfeto. As imunoglobulinas naturais constituem uma grande família de moléculas que inclui vários tipos de moléculas, tais como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. O termo também abrange anticorpos híbridos, ou anticorpos alterados, e seus fragmentos, incluindo Fc ffagtnent (s),
[0067] os anticorpos podem ser fragmentados utilizando técnicas convencionais, tal como aqui descritas e os fragmentos pesquisados quanto à utilidade da mesma moda como descrito para os anticorpos inteiros. Um fragmento Fab de uma molécula de imunoglobullna é uma proteína muitimérica que consiste da porção de uma molécula de imunoqlobulina que contêm as porções im.unoiog icamente ativas de uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve de imunoglobulina cova lent emente acoplados em conjunto e é capaz de se combinar especificamente com um antigeno. Os fragmentos Fab e Fc podem ser preparados por digestão proteolitica de moléculas de irnunoglobulina substancialmente intactas com papaína, utilizando métodos que são bem conhecidos, na técnica. íJo entanto, um fragmento Fab ou Fc também podem ser preparados através da expressão èit Lima célula hospedeira adequada as porções desejadas da cadeia pesada de imunoglobulina e cadeia leve de imunoglobulina, utilizando métodos conhecidos na arte.
[0068] Como é usado no presente documento, com respeite a anticorpos, "substancialmente puro" significa separado desses contaminantes que o acompanham no seu estado natural oil as contaminantes produzidos ou utilizados no processo de obtenção do anticorpo. Este termo inclui ainda o produto desejado com estado de giicosilãçãõ único, seja ou não se este estado inclui giicosilãçãõ em um único local ou, vários locais. Tipicamente, o anticorpo é substancia Imente puro, quando constitui pelo menos 6.0$, em peso, do anticorpo na formulação. Por exemplo, o anticorpo na preparação é pelo menos cerca de 73 6, em. certas modalidades, pelo menos, cerca de 80s, em certas modalidades de cerca de 85^, em certas modalidades, polo menos, cerca de 90%, em certas modalidades, pelo menos, cerca de 95^, e mais pεefeεencialmence, pelo menos cerca de 99Ê, em peso, do anticorpo desejado. Um anticorpo substancialmente puro inclui um anticorpo produzido n at ura Intente, de formarecombinante ou sinteticamente.
[0069] Como é usado no presente documento, "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade que resulta em uma melhoria ou reraed lação do.s sintomas da doença ou condição.
[0070] Os anrigsnos úteis para a união como uma etiqueta a uma glic.oprot eína de núcleo fucosilados ou não fucosilado modificada da presente invenção e mais preferivelmente um anticorpo ou um seu fragmento pode ser um antigeno estranho, um antigeno endógeno, os seus fragmentos ou variantes possuindo a mesjma atividade funcional .
[0D71] Como é usado no presente documento, "antigeno endógeno" refere-se a uma proteína ou parte dela que está naturalmente presente no animal receptor de células ou tecido, tal como uma proteína celular, um agente imunorregulador, ou um agente terapêutico.
[0072] Como é usado no presente documento., "antigeno estranho" refere-se a uma proteína ou ura seu fragmento, que ê estranha para a célula ou tecido animal receptor, incluindo, mas nào limitado a, uma proteína vital, uma proteína do parasita, um agente iraunorregulador ou uma agente terapêutico.
[0073] 0 antigeno estranho pode sèr uma proteína, umfragmento antigênico, ou fragmentos antiqênicos deste que se originam a partir de agentes patogênicos virais e parasitárias.
[0074] Em alternativa, o antigeno estranho pode set codificado por ura gene sintética e pode ser construído usando métodos convencionais de ADN recombinante; o gene sintético pode expressar antigenos ou partes dele que se originam de patαgenαs virais e parasita. Estes parógenos podem ser infecciosos em hospedeiros humanos., animais domésticos e animais silvestres.
[0075] 0 antigeno estranho pode ser qualquer moléculaque é expressa por qualquer agente patogênico virai ou parasita, antes ou durante a entrada, a colonização, ou a replicação dentro do animal hospedeiro.
[0076] Os agentes patogênicos virais, a partir do qual os antigenos virais são derivados incluem, mas não estão limitados a, ortomixovírús, tal como o virus da gripe (ID de Taxonomia: 59*771) ; retrovirus, tais como o R5V, HTLV-1 (ID de Taxonomia: 39015) e HTLV-II (ID de Taxonõmia: 11909); Herpes virus, como EBV (ID de Taxonõmia: 10295), CMV Cl D de Taxonomia: 10359) ou o virus do herpes simplex (n° ATCC: VR-1487); Lentivirus, tais como o HIV-1 (ID de Taxonomia: 12721] e o HIV-2 (ID de Taxonomia: 11709); Rabdovirus, tais como a raiva; Pícõtnovírus, tais como poliovirus (ÍD de Taxonomia: 12080); Poxvirus, tal como vaccinia (ID de Taxonomia: 10245); Rotavirus (ID dê Taxonomia: 10912); é Parvovirus, tais como vírus adeno- a.ssõciado 1 (ID de Taxonomia: 85106).
[0077] Exemplos de antigenos virais incluem, mas não estão limitados a, os antigenos do virus da imunodeficiência humana Nef (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV, N’ de Cat. de depósito 1'83; Nα GeπBaπk AF238278) , Gag, Eπv (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV, N° de Cat. de deposito 2433;.. Nα GenBank. Ü39362) , Tar (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV, N° de Cat. de depósito 827 ; N° GeπBank ML3137), Rev (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV, N° de Cat. de depósito 2088;. M° GeπBank L14572)y Pol (National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV, Nβ de Cat. de depósito 238;. N° GenBank AJ237568) e de células T e B epitopos de células de gpl20i o aπtigeno de sdperf iαi-e da hepatite B (N° GeπBank AE043578); antigenos rotavirus, como VP4 ÍN° GenBank AJ293721) e VP7 (Nrj GenBank AY003871); antigenos do virus da gripe, tais cotuo a hemaglutInina (N° GenBank AJ404627); n ucleop.ro tel na (ND GenBank AJ289B72) ; e antigenos do virus, de herpes simplex,, tais come timidina cinase (N° de acesso GenBank AB0473781.
[0078] Os agentes patogênicos bacterianos, a partir do qual os antigenos bacteriaπos são derivados, incluem., mas não estão limitados a, Hycαbactorium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp,, E. poli, Rickettsia spp., Listeria spp. Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp. e Bore-Ilia burgdorferi.
[0079] Exemplos de antigenos protetores de agentes patogênicos bacterian.es incluem os antigenos somáticos de E. coli enterotoxigênicas, tais como o antigeno CFA/I fimbriais e a subunidad.e B não tóxica da toxina termo- lábil; pertactina de Bordetella pertussis, a adenilato^ cielase-hemolisina de B. pertussis, um fragmento C da toxina do tétano de Clostridium tetani, OspA de Horellia burgdorferi, proteínas paxacristalinas ã superfície da camada de protecção de Rickettsia pro^arekíi e Rickettsia typ.hi, listeriolisina (também conhecido como "blo ‘*e" f-íly *‘l e/ou a superóxido dismutase (também conhecido como’' SOD "e" p60 ") de Listeria monocytogenes, a urease deHelicobacter pylori, e o domínio: de ligação ao receptor de tor.ina letal e/ou o aπtigeno protetor de Bacillus anthrak.
[0080] Exemplos de antigenos de armas biológicas ou patógenos incluem, mas nâo estão limitados ã, varíola, antraz, tularemia, peste, Listeria, brucelose, hepatite, vaccinia, micobactérias, coxsackie, tuberculose, malária, erhlichosis e meningite bacteriana.
[0081] Os parasitas patogênicos, a partir do qual os antigenos de parasitas são derivados, incluem, mas não estão limitados a, Plasmodium spp., tais coma o Plasmodium falciparum (nD ATCC:- 50145},* Tripanossoma spp., tais como Trypanosoma cruzi (n° ATCC: 50797]; Glare! ia .spp, tais como Giardia intestinal is [nD ATCC: 30888D); Boophilus spp., Babesia spp-., tais corno Babesia microti (nB ATCC: 30221); . Entamoeba spp., tais como .Entamoeba histolytica (no ATCC: 30015); Eimería spp., tais como Èimerià máxima (n° ATCC 40357).; Leishmania spp,, (ID de Taxonqmia: 38568); Schistosoma spp., tais como Schistosoma mansoni (N° GenBank AZ301495); Brugia spp., tais como Brugia malayi (N° GenBank BE352806]; Pascida spp., tais como Fasciola hepática (ND GenBank AF2B6903); Dirofilaria spp., tal como Dixofliaria immitis (N° GenBank AF'008300).; Wuchereria spp., tais como íVochereria bancrofti IN* GenBank AF250’996) ; e Onchocerea spp;como Onchocerca volvulus (N° GenBank BE588251], .
[0082] Como exemplos de antigenos de parasitas incluem,- mas não estão limitados a, os antigenos do estágio de pré- erittoeitãrios do Plasmodium spp. , tais como o antigeno circunsporozoito de Plasmodium falciparum GenBank.M22982) P. vívaA* (N0 de acesso GenBank M20670); os antigenos da estágio de fígado de Plasmodium sppt tãis como ó antigeno de estágio de fígado 1 (tal como referida como LSA-l; N° GenBank AF0B6802); antigenos do estágio merotoíto de Plasmodium spp; tal como o antigeno de superfície de merozoíto 1 (também referido αomα MSA-1 ou de MSP-1; Na GenBank AF19941D); os antigenos de superfície de Entamoeba histolytica, tais camo a ILectina especifica de galactose (N°: de acesso GenBank M59850] ou a proteína rica etn serina de Entamoeba histolytica; as proteínas de superfície de Leishmania spp, como 63 kDa glicoprotelna (qp63j de Leishmanis major (N° GenBaπk Y00647} o.u a glicoproteina de 46 kDa (gp46) de Leishmania major; paramiosiπa de Erugia malayi (bJ° GenBaπk. U77590], a isomerase triose-fosfato de Schistosoma mansoni (N° GenBaπk W.06781], a proteína semelhante a globing secretada de Triohosrrangy 1us colubriformis (Nα GenBaπk M63263); as glutationa-S- transferas.es de Fasciola hepatica (N° GenBank M77682) ; Schistosoma bovis IN"3 GenBank M77682J ; S. japonic.um (N° GenBank U58012.) e KLH de Schistosoma japαnicum e S. bovis (Bashir, et al, supra)..
[0083] Exemplos de antigenos específicos de tumores incluem antígeno específico da prostata (PSA), TAG-72 e CEA; cirosinase humana (ND GenBank M27160); proteína relacionada com a tirosiπase (também referida como TRP;GenBank All3293.3) ; e antigenos peptidiCos específicos de tumores.
[0084] Como exemplos de antigenos de transplante incluem a molécula CD3 sobre as células T e antigenos de histoccrapatibilidade, tais como HLA A, HLA-B, HLA-C, BLA DR e HLA.
[0085] Exemplos de antigenos auto-imunes incluem a cadeia IAS β, que é útil em vacinas terapêuticas contra a encefalomielite auto-imune (Na GenBank DB8762); descarboxilase do ácido glatâmico., o que é útil em vacinas terapêuticas contra a diabetes tipo 1 ínsulino-dependente (No GenBank NMDI344 5).; receptor de tirottofina (TSHR), o que é útil em vacinas terapêuticas contra a doença de Grave (Na GenBank NM0D0369) e da proteína relacionada com a tirosinase 1, o que é útil em vacinas terapêuticas contra o vitiligo CN° GenBank MMOÚ’0550) .
[0086] Pármacos anti-HIV que podem ser utilizados para a construção dos anticorpos ou fragmentos marcados destes incluem, mas não estão limitados a agentes antivirals, taiscomo inibidores de F.T nucleosideos, inibidoxes/antagonistas
[0087] Inibidores / antagonistas do CCR5, tais corno SCH- C, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK-220, análogos de RANTES, AK602, UK-427, 8.57, anticorpos monoclonais; e inibidores de entrada virai, tais como Fuzeon (T-2D) (enífuvirt ida) , NB-2, NB-64, T-649, T-1249, C-SCH, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK- 220 , análogos de RANTES, AK602, UK-427, 857; e análogos funcionais ou seus equivalentes.
[0088] Admite-se que muitas glicoproteinas dê núcleo fucosilado e glicoproteínas não fucosiladas diferentes podem ser modificadas de acordo com os métodos da presente invenção, ou utilizadas como um ag.ente terapêutico para a conjugação a um açúcar terminal, incluindo mas não se limitando a, hormônio adrenocorticotrópico (ACTH); derivados do hormônio adrenocorticotrófico (por exemplo, ebitatide); angiotensins; da angiotensins II; asparaginase; psprídeos natriuréticos atriais; peptídeos atriais diuréticos de sódio; bacítracina; beta-endorfinas; fatores de coagulação sanguínea VII, VIII e IX; fator tímico sanguíneo (FTS); derivados do fator tímico sanguíneo; bombesina; fator morfogênico ósseo (BMP); proteína morfogenétíca óssea; bradicinina; ceruleina; polipeptideo do gene da calcitonina (CGRP); calcitoninas; CCK-8; fatores de crescimento de células (por exemplo, EGF; TGF-alfa; TGF- beta; FDGF; FGF ácido; FGF básico); ceruleina; quimiocinas; colecistoquinina; colecistoquinina-8; colecistoquinina- pancreozimina (CCK-FZ); colistina; fatores estimuladores de colônias (por exemplo CSF; GCSF; GMCSF; MCSF); fator de liberação de corticotropina (CRF); citocinas; desmopressins; dinorfina; dipeptídeo; dismutase; dinorfina; eledoisina; endorfinas; endotelina; peptídeos endotelina- antíagonista; endoterinas; encef alinas; derivados de encefalina; fator de crescimento epidérmico (EGF); eritropoietina (EPO); hormônio folículg-estimulante (FSH); galanina; polipeptideo inibidor gástrico; polipeptideo de Liberação de gastrlna (GRP) ; gastrinas; G-CSF; glucagon; glutationa peroxidase; glutatio-peroxidase; gonadotrofinas (por exemplo, gon.adotrotina coriônica humana e alfa e beta, subunidades das mesmas); gramícidina; gramieIdinas; fator de crescimento (EGF); hormônio liberador de fator dé crescimento [GRD; hormônios de crescimento; hormônio liberador do hormônio (LH.RH) ; polipeptideo natriurético artrial humano (h-ANP); lactogênio placentário humano; insulina; fatores de crescimento semelhantes â insulina (IGF-I; IG'F-11); interferon; interferões (por exemplo, alfa-beta^e gama-interferôes); interleucinas (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ID, 11 e 12); polipeptídeo intestinal (VIP); kalicreina; quiotorfiria; luliberina; hormônio luteinizante (LH); hormônio liberador do hormônio lαteiπizaπte (LH-P.H) ; cloreto de lisozima; hormônio estimulante de melanócitos (MSH) ; melanophore hormônio estimulante; melitina; mαtilina; muramilico; mutamildipeptideo; fator de crescimento do nervo (NGF) ; fatores nutricionais nervo (por exemplo, NT-3; NT-4; CNTF; GDWF; BDNF) ; neuropeptides Y; heurotensina; oxitocína; pancreastatina; polipeptídeo pancreàtico; pancreozimina; hormônio da paratireóide (PTB); pentagastrina; polipeptídeo YY; polipept idees de .ativação ciclase pituitária (adenil PACAPs); plaquetas derivadas do fator de crescimento; poiimixina B; prolactina; polipeptídeo que estimula a síntese de proteína; Proteína relacionada com PTH; relaxina; renina; secretina; fator timo soro; somatomedinas; somatosta tinas derivados; superóxido dismutase; taftsin; tetragastrina; trombopoietina (TPO); fator humoral tímíco (THF); timopoietina; timosina; timostimulina; hormônio liberador de hormônio da tireoide; hormônio estimulante da tireóide (T.SH) ; hormônio liberador de tiotrofina (TRH1 ; tripsina; tuft-sina; fator de crescimento do tumor (TG.F-alfa) ; fator de necrose tumoral (TNF); tirocidina; urogastrona; uroquinase; polipeptídeo intestinal vasoativo; e vasopressina.
[0089] glicoproteínas de núcleo fucosilado e não fucosiladas são importantes classes de biomoléculas que desempenham um papel crucial em muitos acontecimentos biológicos, tais como a adesão celular, metastase de tumores., infecções patogênicas, e resposta imune. Como indicado aqui anteíionr.ente, um dos principais problemas em estudos estruturais e funcionais de glicoproteínas fucosiladas ou não fucosiladas é a sua micro- tietero.gene idade estrutural. Glicoproteínas fucosiladas õu não fucosiladas naturais e recombinantes são geralmente produzidas como uma mistura de glicoformas que diferem apenas na estrutura dos oligossacarideos pendentes.
[0090] As glicopro* õínas remodeladas, tais como anticorpos podem ser submetidas a outras modificações estruturais que são necessárias ou de.se j adas, incluindo, sem limitação, a transferência de glicosila, e a ligação seletiva (por exemplo, química clique, reação de Staudinger, etc), para introduzir o grupos funcionais adicionais ou etiquetas. Os grupos funcionais podem ser de qualquer tipo adequado, incluindo, sem limitação, as toxinas, os antigenos específicos (tais como alfa-Gal), espécies radioativas, espécies fotoativas, PEGS, etc A glicoproteina pode ser teagido cataliticamente em uma reação de cicloadição. de "química clique" da funcionalidade de azida da glicoproteina com um alcino tendo a porção funcional de interesse. A azida e grupos funcionais alcino podem ser ligados nos respectivos componentes de ligação, e a glicoproteina pode ser funcionalizada corn urna funcionalidade alcinilo e reagida com um composto funcionalizado por azida, incluindo a porção de interesse. Também será apreciado que outros pares de ligação podem ser concebidos para que a reação química clique.
[0091] Os anticorpos de núcleo fucosilado s não fucosliados ou seus fragmentos, produzidos de acordo com os métodos aqui descritos, podem ser usados, para o diagnóstico e terapia^ Cerca de dois terços das proteínas terapêuticas. tais como os anticorpos monoclonais utilizados no mercado ê/ou atualmente em ensaios clínicos são glicoproteínas. No encanto, a heterogeneidade estrutural em diferentes glicoformas de glicoproteínas naturais e recombinantés apresenta uma barreira importante no desenvolvimento de medicamentos à base de glicoproteínas, já que glicoformas diferentes podem ter diferentes atividades biológicas e controlar a glicosilação da uma glicoforma homogênea é extremamente difícil durante a expressão. A descoberta anterior da atividade de transglicosilaçâo de uma classe de endoglicosidases representa um grande avanço no campo da engenharia de glicosilação para melhorar os potenciais terapêuticos e de diagnóstico das glicoproteínas e os mutantes de Endo-S da presente invenção são capazes de transglicosilat glicoproteínas de núcleo fucosilado e não fiscos liadas naturais e recombinant es sem os aspectos negativos da hidrólise.
[0092] As caracterisLicas e vantagens da presente invenção são mais completamente ilustradas através dos seguintes, exemplos não limitativos.Exemplos
[0093] Geração die Mutantes EndoS Glicosintase e seu uso para Remodelação de glicosilação da Anticorpo Monoclonal Intacto Rituiximab
[0094] Glicosintases foram anteriormente feitas a partir de várias endoglicosidases GH85 (ENGases), incluindo endoA, endoM, e endoD> por mutagênese dirigida ao local de uma resíduo de asparagina chave (Asn) responsável pela promoção, de formação intermédia de ion oxazolinio durante a hidrólise (36. - 39, 43} é um endoS endoglicosidasepertencente â família das gliçosideo hidrolases 18 (GHilÊÍ, (40/ 41) , que é da mesma família de GH como EndoFl, EndoF2, e EndoF'3 que foram recent emente mostrado que possuem atividade de transglicosilação Í44), Com base no pressuposto de que a hidrólise catalisada por EndoS támbéfti passa por um mecanismo assistido por substrato envolvendo a formação de um intermediário íon oxazolinio, como demonstrado por outras endoglic.osidases GH18, tais comp EndoF3, (45) glicosintases potenciais de endoS foram criados por meio da identificação e a mutação do resíduo responsável pela promoção da formação de ions oxazolinío. Estudos estruturais e de mutagênese anteriores sobre EndoFl demonstraram que um resíduo de ácido aspártico na posição 165 (D165), em vez de um resíduo de as.paragina como nas enzimas da família GH85, é responsável, por promover a formação de oxaíúlina e que o residuo El 67 é o ácido/base geral para hidrólise catalítica [45J,. O alinhamento de sequências de EndoS com EndoF3 (Figura 2) , levou, à identificação dé dois resíduos chave em EndoS para a catálise: o residuo D233 (correspondente a D165 em EndoF3) responsável por promover a formação de ions oxazolinio e o E235 residuo (equivalente a E167 de RndoFJ) como o resíduo ácido/base geral na hidrólise de glicano como mostrado na Figura 2,. Funcíonalmente, o residuo D2 33 deve ser também equivalente a N171, N175f e N322 nas, endogli cosi das es GU.B5, éndoÃ, endoM, e EndoD, respectivamente. Assim, após a abordagem, para a criação de g 1 icosintases endoA/ endoM, e EndoD que procedem um mecanismo assistido por substrato via um intermediário de ío.n oxãzolínio, (36-39) dois murantes específicos, D233A (SEQ ID NO: 2) e D233Q (SEQ ID NO: 3), como mostrado na Figura 17, fo.ram gierados por mutagênese dirigida ao local de EndoS (SEQ ID NO: 1). Estes mutantes, assim como as EndõS do tipo selvagem, foram expressos em Escherichia coll em alto rendimento (30 — 40 mg/L) , como uma proteína de fusão GST e purificou-se por meio de cromato.graf ia de afinidade de glutationa.
[0095] Õ rituximab, um anticorpo monoclonal terapêutico, foi utilizado como um modelo de mAb para examinar a atividade de desglico.silaçâo e atividade transglicDSildçãó potencial das enzimas. Os principais glicanos Fc die rituximab comercial são oligossacarideos de núcleo fucosilado biantenares de tipo complexo que transportam 0-2 porções de galactose, nomeados gliCoforitas G0F, GIF e G2F, respectivamente, como revelado por análise de espectrometria de massa de Ionização e dessorção a làser assistida por matriz de tempo de voo (MALDI-TOF MS.) dos N- glicanos liberados pela PNGase F, como mostrado na Figura 10. Tratamento de rituximab com a proteína de fusão GST- EndoS (aqui referida como EndoS do tipo selvagem ou EndóS) resultou em üinã desglicõsilação rápida para se obter os correspondentes Fc N-glicanos (com .apenas uma GlcNAc na extremidade redutora), como mostrado na Figura 11, e o rituximab desgl icoa ílado que porta a porção de dissa.carideo GlcNAc fucosilado (Fucal,GGlcNAc) nos locais de glicosilação (N297). Estes resultados confirmam a atividade notável de Hidrólise de glicano Fc das endoS de tipo selvagem em IgG intacta, implicando a sua utilidade na primeira etapa para a remodelação da glicosilação de mAbs.. O potencial de transqlicosilação de EndoS e seus mutantes, em seguida, foi examinado usando o rituximab desglicosilado como o aceptor e vários oxazolinas glicano sintéticas como os substratos de doadores, como representado nas Figuras 3 A e B. O processo de remodelação de glicosilação foi monitorizado poε eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-^PAGE) e espectcometria de massa de crαmatografia líquida (LC-MS) , tai cαrqo mestrado na Figura 4. A cadeia pesada e cadeia leve de rituximab apareceu a cerca de 50 kDa e cerca de 25 kPa,respectivamente, sob condições redutoras (a, pista 1, na Figura 4AJ . Após desglícosilação com EndoS de tiposelvagem, a cadeia pesada apareceu como uma única banda a aproximadamente 48 kDa, sugerindo que a remoção dos dois N- glicanos (cada um ã partir de uma cadeia pesada) de rituximab (a, pista 2, na Figura 4A) . A incubação do rituximab desglicoβilado (1) e a oxazolina sialoglicano sintética (2) (ver Figura 3A para estruturas) (razão molar doador/aceptor, 50:1) com o mutante En.dos-D233A deu um produto de transglicosilação (3), cuja cadela pesada apareceu como uma banda única que era de cerca de 2 kDa maior do que a do. rituximab desglicosilado (1) (a, pisca 3, a Figura 4A) . Este resultado sugere que um novo N-gllcano foi ligado a cada uma das cadeias pesadas de Fc* A incubação de (1) e (2) cam Endas-D.233Q deu o mesmo produto de transglicosilaçâo (a, pisca 4, Figura 4A) . Curiosamente, um transglicosilaçâo essencíalmente quantitativa para o domínio Fc do anticorpo intacto fαi alcançado dentro de 1 h de incubação, Verltiçou-se que um tempo de incubação (10 h) não levam á hidrólise do produto de transglicosilaçâo. Estes resultados indicam que os dois mutantes de EndoS são novas glicosintases eficazes que permitam a glicosilação de IgG intacta desglicosilada com o N-glicano de tipo complexo, sem a hidrólise do produto.
[0096] O transglicosilaçâo foi ainda caracterizada por análise por LC-MS, A cadeia pesada e cadeia leve de rituximab foram separadas sob urna condição de LCHMâ, coma se mostra na Figura 12. A desconvolução dos dados MS da cadeia Leve deu uma massa de 23 044, o que era consistente com a massa calculada de cadeia leve de rituximab (M = 23 042 Da} (47) . A desconvelução dos dados de MS da cadeia pesada deu três espécies distintas m/z, 50508, 50670, e 50834, como mostra □ gráfico B, na Figura 4 A, que estavam em boa concordância com a massa teórica de glicoformas cadeia pesada; GQF, M = 50 515 Da; GIF, M = 50 677 Da; e G2F, M = 50 839 Da; respectivamente. (47) A espectroítiètrla. de massa de ionização de spεay deelérrons deconvoluidos (ESI-MS) da cadeia pesada do rituximab desglicosilada (1) mostrou uma única espécie de 491 420, como mostra o gráfico C ná Figura 4B, o qual condi? bem com uma cadeia pesada carregando uma porção dissacarideo Fucαl,βGlcNAc (calculado, M ~ 49 420 Da). Após, a remodelação de glícosilação, um único pico a 51426 foi observado ã partir da cadeia pesada, do produto de transglicosilação (3) , com uma adição de 2,006 Da à cadeia pesada desglicosilada do rituximab, como mostra o gráfico d na Figura 4B. Este resultado indica a fixação de um sialoglicano da oxazcdina açúcar correspondente (2) à cadeia pesada, h banda única em SDS-PAGE e espectros de MS puros do produto de transglicosilação sugerem <21 aram ente que a transglicosilação foi essencialmente quantitativa sobre os dois sítios de glícosilação do domínio Fc no rituximab (glícosilação incompleta de qualquer um des dois locais do homodímero Fc resultaria na observação de cadeia pesado Fucol, 6Glc'NAc após a redução, M - 49 420 DaJ . Para confirmar ainda que o W-glicano. foi especificamente ligado ao GlcNAc do domínio Fc, o conjunto de M-gliCãnos foram liberados a partir do rituximab glicα-remodeladα (3) por txatam.enta cam PNGase F, que hidrolisa «specificamente a ligação amida entre a ligação Asn -glicano.. Os N-glicanos liberados foram marcadas pela marcação fluorescente 2- aminobenz.aoüida (2-AB) e foram submet idas a cromatogra fia fluorescence líquida de alta eficiência (HPLCJ e análise por MS. A análise por LC-MS revelou clararaente que c N- glicatiõ liberada era esperado o N-glicano tipo, complexo biantenar portando núcleo de fucose e os ácidos aiálicos terminais, que consistia em cerca de 92t de N-glicarios disialilados e cerca de de N-glicanos monosialilados, tal como mostrado na Figura 13b. A composição de N-glicanos foi bem consistente com a relação encontrada na oxazolina N-q.licano cor respondent es C2) utilizada pata a tian.sgliaosüaçãc. Este resultado confirma que a transferência de N-glicanos foi especificamente ligado ao primer de GlcNAc no rituximab desglicosiladõ.
[0097] Os resultados apresentados no presente documento representam o primeiro relatório de remodelação de glicosilação de um anticorpo monoclonal IgG intacto, com uma transferência em bloco de um N-glicano natural de tipo complexo de tamanho completo ao domínio Fc através de um protocolo, degl icosilação-reglicosilaçào altamente eficiente habilitado, pelo uso combinado de EndoS e glicosintase baseado em EndoS. Apôs a conclusão da transglicosilação, a produto foi purificado por meio de uma cromat ograf ia de afinidade de proteína A simples, dando a glicoforma homogênea bθm definida. Deve-se salientar que o rituximab comercial contém apenas traços de glicoforma stalllada, como mostrado na Figura 13a. Uma vez que Fc e IqG sialiladas foram propostas como tendo atividade anti- inflamatória,, o rituximab modificado por glicoengenharia portando Fc N-glicanos totalmente sialiladcxs podem ter uma função anti-inflamatória, assim potencialmente a expandir a sua cobertura terapêutica de tratamento do câncer para o tratamento de doenças auto-imunes. (31, 22)
[0098] Além da oxazolina N-glica.nos de tipo complexo sialllada (2), os mutantes EndciS foram igualmente eficientes para usar o oxasolina de núcleo de Ma u 3 Glc 5'Ac (4) (48] Ê o N3Pían3GlcNAç oxazolina etiquetada com azido (6) (49) para glicoengenharia de rituximab, levando à formação, das correspondentes glicoformas homogêneas, (5) e (7), respectivamente, como mostrado na Figura 3A. 0 ESl-MS deconvoluido da; cadeia pesada do produto de transglicosilaçâo [5J mostrou uma única espécie de 50 112, como mostra o grài Lco e na Figura 4C, que correspondeu bem com. a massa molecular calculada (M - 50 109 Da) da cadeia pesada de rituximab carregando um glicano Man3GlcNAe2. Da mesma fornia^ o ESÍ-MS deconvoluido da cadeia pesada de produto de trãnsgl idosilação (7) mostrou uma única espécie de 50 143, tal como mostrado no gráfico f na Figura 4C, que estava em boa concordância corn a massa mdlfecular calculada (M - 50 134 Da) dã cadeia pesada de rituximab portando um M3Man3GlcNAc2 glicano. Novamente, estes resultados indicam que a transglicosilaçâo. ê essencialmente quantitativa. Deve notar-se que a diminuição da razão molar de doador/adeptor de 25:1 ainda resultou na txansformação eficiente, implicando a eficiência notável transglicosilaçâo dos mutantes endoS glicosintase. Em particular, a introdução seletiva de funcionalidade az.idã no núcleo da Fc de N- glicanos em anticorpos monoclonais intactos permitirá mais modificações especificas de local de anticorpos através da química clique, (50, 51) que pode ser utilizada para fins de etiquetagem e de direcionamento, cu para expandir a diversidade de glicoformas anticorpos para estudos da relação estrutura-atividade.
[0099] EndoS de. tipo selvagem também foi testado para transglicosilação de rituximab degiicosilato (1) com as oxazo.linas gl icano (2 e 4) sob as mesmas condições que os mutantes com EndoS e observou-se que apenas a formação transitória dos produtos transglicosilação correspondentes foi encontrado como monitorizado por LC-MS, provavelmente devido á hidrólise rápida in situ dos produtos pela enzima do tipo selvagem. Recentemente, Scanlan, Davis e colaboradores relataram um estudo independente sobre a especificidade de substrato de EndoS e demonstrou que EndoS de tipo selvagem poderia usar Man3GlcNAc oxazolina para transglicosilação eficiente de IgG desqlicosilada. (42) Para fazer face a esta aparente discrepância de observações, a eficiência de transglicosilação de EndoS de tipo selvagem foi reavaliada a uma temperatura inferior (4aC) utilizando uma quantidade muito menor de enzima, seguindo o. relatório recente (42]. Usando êstã condição modificada., transglicosí Lação significativa foi observada para a rituximab dssglicosilada (1) com o complexo oxazolina açúcar (2) pelos endoS de tipo selvagem no período de incubação inicial, mas o produto foi graduaIrnente hidrolisado quando a, incubação continuou, como mostrado na Figura 14. Assim, a condição d.e reação deve ser cuidadosamente controlada a fim de prender o produto de transglicosilação quando de EndoS tipo selvagem é usada. Para aplicação prática, os mutantes glicosintase EndoS devem ser a escolha para transglicosilação eficiente e completa, uma vez. que são desprovidos de produto atividade hidrolítica.
[00100] Glicoenqenharia de Rituximab para fornecerglicoforma G2 Nâo fucosilada e galactosilada
[00101] Pata a terapia anticâncer, glicoformas de IgG não fucosiladas são desejáveis, uma vez qu.e- foi previamente demonstrado que mAbs com baixa teor de fucose do FC N- glicanos mostrou atividade ADCC melhorada in vitro e maior eficácia anticâncer in vivo, especialmente para aqueles pacientes portadores do alelo F158 de baixa afinidade do receptor FcYlIIa. (16-19, 52) no método eficiente disponível para transformar eficientemente um mAb fucosilado existente (a principal glicoforma de mAb recombinants produzido em células de mamífero) a um mAb não fucosilado. Para resolver esse problema, uma série de cr- fucosidases disponíveis comercialmente foram testadas, mas nenhum pode remover o cri, õ-f uccse no rituximab intacto, ver esquema nas Figuras 5 A e B, Estes resultados implicam que a porção «1,6-fucose pode ser protegida pelo domínio Fc e/ou o N-glicano complexo, tornando-os inacessíveis para ct- fucosidases. Foi teorizado que, após deglicosilação, a glicoforma Fuc(al, 6}GlcNAc resultante de rituximab poderia ser mais acessível a ct-f uc.osidases. Por conseguinte, a atividade de várias or-f iicosidases disponíveiscomereialmente foi testada no rituximab desglicosilado (1) que carrega apenas a porção Fuc (al, 6) GlcNAc. Verificou-se que uma a-fucosidase inespecifica de rim bovino tinha uma atividade moderada e foi capaz de remover o residue de fucose a partir do rituximab desglicosilada (1) para dar o rituximab contendo GlcNAc (B) (ver Figuras 15 A e B) . Apesar de que uma quantidade relativamente grande de a- fucosidase e urn tempo de reação prolongado foram necessários para alcançar um defuõosilação completa do rituximab EndioS-desgl icos ilada devido à atividade moderada de a α -fucosidase, a descoberta desta atividade α - fucosidase fornece uma forma alternative para obter o precursor defucosilado rituximab (â) para mais glicoengenharia.
[00102] Em seguida, determinon-se que as glLcõsintases EndQS-D2 33A e Endq5-D233Q também foram eficientes para reconhecer o GlcNAc não fucosilado em (8) para a transglicosilação com uma oxazolina N-glicano sialilada (9)para fornecer a glicoforma G2 homogênea, nãofucosilada (10) em uma conversão essencialmente quantitativa, Figura 5. O produto foi purificado porcromatografia de afinidade de proteína A. A identidade e pureza do produto modificada por glicoengenharia í10] foram confirmadas por SDS-PAGE e análise por LC-MS, como se mostra na Figura 6. O rituximab defuαosilado (8) mostrou uma única espécie de 49 224 (figura 6b), o que confirma a remoção da fucose (calculado para a cadeia pesada de GlcNAc-rituximab, M = <9 9 274 Da) . 0 ESI-MS deconvoluido da cadeia pesada do produto de transglicosilação (10) apareceu como uma única espécie de 50 695 (Figura Sc), o que correspondeu bem com a massa molecular calculada (M = 50 693 Da] de cadeia pesada de rituximab portando um. N-glicano tipo complexo asialilado biantenar, Gal2.GlcNAc2Man3GlcNAc2. Em um estudo comparativo,, verificou-se também que, embora os mutantes D233A e D233Q reconheceram tanto o GlcNAc- rituximab fucosilado (1) como GlcNAc-rituximab não. fucosilado (3) como aceptores para transglicosilação, os dois mutantes glicosintase preferiram o GlcNAc-GlcNAc- rituximab fucosilado (1) como aceptor, com uma reação de transglicosilaçâo mais rápida do que o ac.eptor não fucosilado (8) (dados nao mostrados). Tomados em conjunto, estes resultados experimentais revelaram uma abordagem enzimática combinada para fazer a glicoforma homogênea não fucosllada e totalmente gálactosilada a partir de anticorpos monoclõnais comercialmente disponíveis. 0 rituximab não fucosilado e galactosilado resultante deverá ter funções efetoras AD.CC e CDC melhoradas, tal como sugerido pot estudos anteriormente. (2, 16-20, 52)
[00103] Glicoengenharia de Fc específica de local de IVIG para fornecer glicoformas IVIG totalmente Fc sialiladas
[00104] A remodelação de glicosilação bem sucedida de rituximab levou, ao exame do método quimioenzlmático para glicoengenharia de IVIG com o objetivo de aumentar a sua atividade anti-inflarriatárla. IVIG são frações de IgG agrupadas purificadas a partir do plasma de milhares de doadores saudáveis. Estudos recentes têm sugerido que uma glicoforma Fc menor, ct2,6-sialilada é a espécie ativa na IVIG que confere a atividade anti-inflamatória, como demonstrado em um modelo de rato com artrite reumatõide. (21, 22, 53, 54] Uma vez que as glicoformas Fc sialiladas são componentes secundários em IVIG, (55), a dependência de atividade anti-inflamatória de IVIG na sialilação de Fc terminal pode explicar em parte por que uma dose elevada (1-2 g/kg) de infusão d.e IVIG é necessária para conferir proteção. A sialilação direta de Fc e IVIG foi tentada usando ofl,, 6-sialiltransferase humana (ST6Gal-I), mas a .eficiência foi baixa, e na maioria dos casos, apenas glicoformas monosialiladas, foram obtidos como produtos principais. (22, 56) Além disso, cerca de 30 i dos domínios FAB em IVIG são N-glicosiLadas e o enriqueGi.meri.tci de lecriπa glicoformas Fc sialiladas de IVIG, seria menos eficaz guando os qlicanos FAB são sialilados. (2, 57) Portanto, seria altamente desejável se glicõengenharia Fc- especifica com N-glicanos slalilados puedesse ser alcançado sem alterar a glicosilação de FAB.
[00105] Verificou-se que endoS era capa.Z: de desglicosi la r selerivamente c domínio Fc de IVIG sem hidrolisar os N- glicanos aos domínios FAB sob condições suaves. Além disso, o domínio Fc de IVIG desglicosilada (11) poderia ser glicosilado selet ivamente corri uma oxazolina s la log 11 cano (2) pelo mutante EndoS-D233.Q para dar o Fc IVIG totalmente sialilada 112), como mostrado na Figura 7. Ã glicoengenharia primeiro foi monitorada por análise de SDS- E'AGE. A desglicosi lação e reglicosi lação ds IVIG foram aparentes como se mostra na alteração do tamanho da banda da cadeia pesada, como mostrado na Figura 16. Para caracterizar ainda mais a seletividade de local da glicoengenharia de IVIG, os domínios de Fab e Fc foram desconectados por digestão por papaína. (58) 0 domínio Fc foi isolado por cromatografia de afinidade de proteína A e os domínios FAB deixados no fluxo de passagem foram isolados por cromatografia de exclusão de tamanho no sistema de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). Em seguida, os N-glicanos de Fc e FAB foram liberados separadamente por tratamento com PNGase F, marcada corn 2- amlnabenzamida (2-AB), (59) e analisados por HPLC (detecção fluarescente e quantificação) e caracterização por MS. Os perfis FAB e Fc N-glicano antes e depois glicoengenharia de IVIG foram mostrados na Figura 8. Verificou-se que os padrões de glicosilação Fc de 1V1G foram mais complexos do que a glicosilação Fc de anticorpo monoclonal com rituximab. Além das glicofoxmas GO.F, G1F e G2F como. os principais componentes, havia uma quantidade significativa de glicoformas monosialiladas (picos 2 e 7) (aproximadamente 10$) e glicoformas contendo GlcNAc bissecí.onal (picos 13-15) (51) (Figura 8a). A glicosilação Fc após glicoengenhariã (através de EndoS-deglicosilação e transglicosilaçâo posterior com oxazolina sialoglicano (21 por EndoSl-D233Q) mostrou os glicanos totalmente siali lados (picos 1 e 6) como as principais glicoformas (> 90ij (Figura 8b). Curiosamente, os padrões de glicosilação FAB foram semelhantes antes e depois do processo de glicoengenharia (comparar com a figura â, c e d), exceto a geração de uma pequena quantidade da glicoforma totalmente aialilada (pico 6). Estes resultados indicam que o processo de remodelação de glicosilação à base de EndoS é altamente seletiva para os N-glicanos de Fc de anticorpos de IgG intactos, mesmo na presença de glicosilação de FAB. A seletividade notável é alta eficiência da atual abordagem de glicoengenharia de Fc fornecem uma nova via para transformar o IVIG comercial em preparação de IVIG totalmente Fc-sialilada.s que se espera que exiba atividade anti-inflamatória aumentada, coma demonstrado em estudos anteriores usando um modelo de camundongo. ( 21, 22, 53, 54)
[00106] Ligaçáo do Rituximab Modificado por glicoengenhariã para o Recep;or Fcy estimulador (FcYRIIIa) e do Receptor Fcy Inibidor (FcyRIlb)
[00107] A afinidade das glicoformas remodeladas do rituximab para os respectivos receptores (FcYRHla-F158, FcyRIITa-Vl58, e FcyRIlb) foi examinada por análise de re.ssonáncia de plasmõn de superfície (SFR) . As glic-O formas de rituximab foram imobilizadas por local especifico am chips de uma proteína e os receptores de Fey θm várias concentrações foram' injetados como analitos, seguindo os procedimeatos relatados recentemente (35). Como asperado, a glicoforma G2 não fucosilada mostrou melhoria significativa de afinidade tanto pata ps receptores Fcylfla de âlta afinidade como de baixa afinidade, FcyRllIa-F15B e FcyRIlIa-Vl 58,. quando comparado com o rituximab, disponível comercialmente, como mostrado na Figura 9. Os valores de Kd para a ligação da glicoforma G2 (10) para o FcyRIIla-F158 e FcyRIIIa-V15B foram 123 t 11 e 12 i 2 nM, respect ivamente, que foram obtidos através do ajuste dos dados de ligação com um modelo de estado estacionário 01:01 usando o software de avaliação BIAcore TIDO. Por outro lado, os. valores de KD para a ligação do rituximab comercial para o FcyRIIIa-F'158 e FcyRIIIa-V15B foram estimados como sendo 1042 1 155 e 2 52 i 18 nM, respectivamente. Assim,, a afinidade da glicoforma G2 modificada por glicoengenharia para os para os receptores Fcy de baixa afinidade e de alta afinidade (FcyRIÍía-Fl58 o FcyRllIa-Vl58) foi de cerca de 9 vezes e 20 vezes maior do que o rituximab comercial, respectivamente. Por outro lado, a glicoforma G2 e o rituximab comercial demonstraram afinidade comparável para o inibidor do receptor Fcy FcyRIIb com os valores de KD de 2,3 ± 0,5 e 2,0 ± 0,7 μM, respectivamente. Estes resultados revelam um ganho claro de funções benéficas para o rituximab modificado por glicoengenharia. Deve-se salientar que uma preparação eficiente de qlicoformas FcyRIlIa de alta afinidade de ligação é clinicamente significativo para abordar a questão do polimorfismo receptor ’Fcy encontrado em pacientes com câncer que aào menos ou nào responsivos ao t racamento com anticorpos monoclonais comuns, Nestes pacientes, o alelo FcyBIHa-Fl&S tem uma baixa afinidade para os mA.bs' terapêuticos, tais como rituximab, em comparação com o receptor de elevada afinidade, o alelo FcyRIIIa-V158. (52, 60, 61), Funções efetoras mediadas pelo receptor Fcy foram também sugeridas ser um mecanismo importante para conseguir a imunidade protetora de anticorpos neutrallzantes de HIV, (62) Assim, a abordagem glícoengenhari a descrita ,no presente documento pode encontrar amplas aplicações na produção de várias glicoformas definidas de anticorpos monoclonais valiosos para os estudos funcionais, bem. como para aplicações biomédi ca_s ,
[00108] Uma abordagem eficiente para glicoengenhari.a quimioenzimática de anticorpos IgG intactas é descrita no presente documente. As duas novas g1icosintaaes baseados em EndoS geradas pelo local de mutagênese dirigida demonstram uma ampla especificidade de substrato capaz de transferir N-glicanos sialilados e asialilados e do tipo complexo, assim como núcleo de N-glicanos modificados seletivamente das oxazolinas glicanos correspondentes aos anticorpos intactos Fc-desglicosil.ados. Além disso, a abordagem de desglicosilação / reglicosilação é eficaz para ambos os anticorpos IgG, de núcleo fucosilado e não fucosilado quando um ot-f ucosidase é adequadamente combinada. Estas notas descobertas aumentatn significativamente o alcance do método quimioenzimático e tornada possível umatransformação eficiente dos anticorpos monoclonais intactos em várias glicoformas berrí definidas que sào até aqui difícil de obter pôr métodos já existentes. Espera-se que esta abordagem glicoenqenharia possa facilitar o desenvolvimento de produtos biológicos biosimilares e/ou biomelhorados que possuem uma eficácia terapêutica e/ou obter novas funções. Materiais e métodos
[00109] Anticorpo monoclonal rituximab (rituxan, Genentech Inc. , South San Francisco, CA) e IVIG foram adquiridos através Premium Health Services Inc. (Columbia, MD) . S-ialoglicano oxa∑αlina (2) e oxa∑olina die tipo asialo- glicaπo complexo (5J foram sintetizadas seguindo procedimento relatada ant ericr nienLee. (38, 46). αl- fucosidase de rim bovino foi adquirida da Sigma (St. Louis, MO) e Prozyme (Hayward, CA ). Endo-PN-acetilglucosaminidase de Ãrthrobacter protophonniae (endoA) e endo-PN- acet ilglucosatriiriidase de' Mu cor hiemalis .(endoM) e seus mutantes foram produzidos em excesso em E. coli seguindo os procedimentos relatados (38). PNGase F foi adquirido a partir de New England Biolabs (Ipswich , MA).
[00110] Cromatografia Liquida de Espectrometria de Massa (LC-M5)
[00111] A LC-MS foi realizada em um sistema LXQ (Thermo Scientific) com uma coluna Hypersil GOLD (1,9 mμ, 50 x 2,1 mm,). As amostras de IgG. foram tratadas com 0,5% de β- mercaptoetanol e aquecidas a .60 °C durante 15 min, em seguida, submetida a medição LC-MS. Ã análise foi realizada a 60°C,: efetuando, a eluição com um gradiente linear de 1040% de MeCN contendo 0„ 1% de acido fórmic.o em 10 min a umcaudal de 0,25 rnL / min.
[00112] Espectrometria de Massa de ionização de Electron spray de (E5I-MS) e Espectrometria de Massa de Ionização e dessorçào a laser assistida por matriz de tempo de voo (MALDI-TOP MS)
[00113] Os espectros ESI-MS forem medidos em um único espectrômetro de massa quádruplo Waters Micromass ZQ-4000. 0 MALDI-TOF MS foi realizada em um espectrômetro de massa Autoflex II MALDI-TOF (Bruker Daltoni.cs, Billerica, MA). 0 instrumento f.oi calibrado usando o kit de calibração ProteoMass Peptide MALDI-MS (MSCAL2, Sigma / Aldirich). A matriz ds ácido 2, 5-di-hidroxibenzóíc.o (DH.B) foi utilizada para os glicanos neutros e 2 ’,4',61-trihidrαxiaαetofenpna (THAPJ foi utilizada para õs glicanos ácidos.
[00114] Sobre-expressão e purificação de EndoS e Mutantes
[00115] EndoS de tipo selvagem foi produzida em excesso em E, call e purificada de acordo com os procedimentos relatados anteriormente, (40, 63) usando o plasmideo pGEX- EndoS que foi gentilmente oferecido pelo D_t, M. Collin (Universidade de Lund, Suécia). Os dois mutantes de EndoS, D233A e D233Q, foram gerados usando o kit de mutagênese dirigida ao local GeneArt (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O plasmideo pGEX-EndoS foi utilizado como molde, e LA Taq polimera.se (Takara, Japão) foi utilizada para a PCR. As mutações foram confirmadas por sequenclamento de ADN e transformado em BL21 (DE3) . Os transformantes foram cultivadas em meio Luria-Bertani que contém 100 mg/L de carbenIcilina e induzidos com 0,1 mM de isopropil-PD-tlogalactopiranosideo durante 16 h a 25cC. As células foram colhidas por centrifugação a 1700g durante 15 min a 4°C. 0 sedimento celular foi suspenso em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) com lisozima e PMSF. A mistura de lise foi centrifugada a 16000g durante 20 min a 4°C. Apds a centrifugação, o sobrenadante da lise celular foi aplicado a 3 mL de 50% de resina de glutationa- Sepharose 4B (GE Healthcare). As amostras foram incubadas ã 25°C durante .60 min com agitação suave. A resina foi aplicada a uma coluna d.e 10 mi, (PD-CO de GE Healthcare! e lavou-se cinco vezes c.om PBS. 500 μL de tampão de eluição de glutationa (50 mH Tris-HCl, glutations 10 mW, pH 8,0] foi adicionado a coluna, incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min, recolheu-se, e, era seguida, repetiu-se três vezes. As frações eluidas foram reunidas e submetidas a diàlise contra tampão de fosfato de sódio (50 mH, pH 7,0) durante a noite a 4cC. As amostras de proteína foram então concentradas utilizando filtros Amicon de ultra centrífuga de 10 kDa (Mill ipore] .. As amostras de proteína concentradas foram analisadas por SDS^-PAGE, e a concentração d.e proteinã foi quantificada utilizando úm espectrofotâmèt.ro 2000c Nano-Ürop. O rendimento da produção excessiva dos endoS de tipo selvagem foi de aproximadamente 40 mg/L, e o rendimento para .os mutantes foi de aproximadamente 30 mg/L.
[00116] Desgliçosilaçâo de Rituximab por EndoS de tipo, selvagem para dar (Euoal,6) GlcNAc-Rituximab (1)
[00117] Rituximab comercial [20 mg) em tampão Tris-Cl (50 mM, pH 8,0, 2 ml) foi In.cub.adó com EndoS (30 μg) a 37 °C durante 1 h. as análises LC-MS e de SDS-PAGE indicaram que a divagem completa dos N-glicanos na cadeia pesada. A mistura de reação foi submetida a cromatografia de afinidade em uma cõluna dè proteinã A- resina agarose (5 mL) qU'É foi pré-e.quilibrada com um tampão Tris-Cl (20 mM, pH 8,0). A coluna foi lavada com Tris-Cl (20 mM, pH 8,0, 25 mL) e giicina-HCl (20 mM, pH 5,0, 20 MJ, sucessivamente. A IgG ligada foi liberada com gllcina-HCl (100 mM, pH 2,5, 20 mL),. e as frações de eluição foram imediatamente neutralizadas com tampão Tris-Cl (1,0 M, pH 8,8). As frações contenda os fragmentos Fc foram combinadas e concentradas por filtração centrifuga (filtro centrífuga Amicon Ultra, Millipore, Billerica, MA) para dar (Fuc cri, 6) GlcNAc-rituximab |li (18 mg). LC-MS: calculado para a cadela pesada de (Fuc ctl,6) GlcNAc-r itux.imab (1), M = 49 420 Da£ (47j encontrado (m/z) , 49 420 (dados dedescónvolução).
[00118] Transglicosilação de (Fuçai, 6) GlcNAc-Rituximab Oil com Sialoglicano de oxazolina (2) por Mutantes de EndoS D.233A ou D233Q
[00119] Uma solução de (Fucal,6) GlcNAc^rituximab (1) (.10 mg) e sialoglicano-oxarolina (2) (10 mg) era tampão Tris (50 ffiM, pH 7,4, 2 ml) foi incubada com o mutante de EndoS D233A ou D233Q (200 pg) , a 30°C. Foram recolhidas amostras em intervalos e foram analisadas por LC-MS. Apôs 2-3 h, a monitorização LC-MS indicou a reação completa de (Fuccxl,6) Gl cNAc-rituximab (1) para dar o produto. de transglicosilação (3) que porta os N-glicanos completamente sialilados. A mistura de reação foi submetida a uma croraatografia de afinidade em uma coluna de agarose- proteina A de acordo com o procedimento descrito acima. As frações contendo o produto foram combinadas e concentradas por ultracentrifugação para dar o rituximab si a Lil ado (3) (11 mg, quantitativo). LC-MS: calculado para a cadeia pesada de (3) que porta o N^glicano totalmente sialilaclo de, M = 51 421 Da; encontrado (m/z), 51 4 26 (dados de desconvolução).
[00120] Transglicosilação de (Fuco'1,6) GlcNAc-Ritux imab (1) com ManUGlcNAc oxazolina (4) e Man3GlcNAc oxazolina .etiquetada com azida (6) por endo5-D233Q
[00121] A transglicosilação foi realizada como descrito para a preparação de (3J para dar os produtos correspondentes. A análise por LC-MS de rituximabmodificado por glicoengenharia [5 e 7): calculado para a cadeia pesada de (5) que porta o Msn3.GlcNAc2 N-glic.aπos fucosilados, M = 50 109 Da; encontrado (rti/z), 50 112 [dados de desconvolução); calculado para a cadeia pesada de (7] portando o azido-Man3GlcMAc2 N-glicano fucosilado, M = 50 134 Pa; encontrado (πi/z), 50 143 (dados de desconvolução).
[00122] Defucosilaçào de (Fucαl,6) GlcHAc-Situximab (1)por urna Fucosidase de rim bovino
[00123] Urea solução de (Fucαl,6l GlcNAc-rituximab (1) (2 mg) em tampão fosfato (50 mH, pH 5,5, 200 μl) contendo azida de sódio a 0,05 foi incubada com o fucosidase de rim bovino (Frozyme, 5 U) a 37°C. Foram recolhidas amostras em intervalos e foram analisados por LC-MS. Após 20 dias, o acompanhamento LC-MS indicou o defucosilação completa de (Fucofl,6l GlcNAc-rituximab (1) pata dar o produto, GlcNAc- rituximab (2). A mistura de reação foi submetida a cromatogxafia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguindo o procedimento descrito acima. As frações contendo o produto foram combinadas e concentradas por ultracentrifuqação para dar GlcNAc-rituximab (2) (2 mg,quantitativo). LC-MS; calculado para a cadeia pesada de GlcNAe-rituxlrnab [2] portador de uma porção GlcNAc, M = 49 274 Da; encontrado (m/z), 49 274 [dados de deconvolúçâo).
[00124] Transglicosilaçâo de GlcNAc-Rituximab (4) com Glicano oxazolina de tipo complexo Asialliado (5) p.or D233Q Mutant
[00125] Uma solução de Gl.cMAc—rituximab (4) [2 trig) eoxazolina (5) (5 mg) em tampão Tris (50 mM, pH 7,4, 0,5 mlr) foi incubada com o endoS-D233Q (200 μg) a 37 "C. Foram recolhidas amostras em intervalos e foram analisados por LC-MS. Apôs 2 h, a monitorização LC-MS indicou a reação cotupleta de 4 para se obter o produto de transglicosilação correspondente (6) , A mistura de reação foi submetida a cromatografiã de afinidade em uma coluna de proteinã A. As frações contendo o produto foram combinadas e concentradas por ultracentrifugação para dar a glicofo.rma não fucosilada de rituximab (6) í2 mg, quantitativo). LC-MS: calculado parã a cadeia pesada de (6) que porta o N-glicano não fucosilado, M = 50 693 Da; encontrado (m/z) , 50 695 (dadosde desconvolução).
[00126] Desglicosi i açao sitio especifica no: Fc Domínio deIVIG por EndoS
[00127] IVIG comercial [20 mg) em tampão Tris-Cl (50 mM, pH 8,0, 2 ml) foi incubada com EndoS (SEQ ID NO: 1} (30 pg) , a 37 °C durante 1 h. O resíduo foi sujeito a cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A para se obter o (Fucal, 6| GlcNAc-lGIV (20 mg, quantitativo), em que os N-glicanos de Fc foram removidos, deixando a GlcNAc al, 6-fucosilado. nos Locais N297,
[00128] Transglicosilação de (Fucal,6) GlcNAc-IVIG com □xazQ.li.na Sialoglidano (2) por D233Q Mutant
[00129] Uma solução de ((Fucal,6) GlcNAc-IGIV (3 mg) e siaioglicano-oxaz.olina (2) (3 mg) em tampão Tris [50 mM, pH 7,4, 2 ml) foi incubada com õ mutante D23 3Q ( SEQ ID NO: 2) (60 pg) , a 30pC. Após 2 h, a análise de SDS-PAGE indicou a reação completa de (Fucal>6) GlcNAc-TVIG para dar o produto de transglicosilação. A mistura de reação foi submetida a cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A para proporcionar o IVIG remodeLado-glico (3 mg, quantitativo), em que os N-glicanos de Fc foram remodelados para os N- glicanus de tipo complexo totalmente sialilados.
[00130] Experimentos dê ligação de Ressonância plasmõnica de Superfície (SPR)
[00131] A ligação entre as diferentes glícoformas de receptores de IgG: e Fey foi medida por ressonância plasmõnica de superfície (SPR) , utilizando um, instrumento Biacore T100 (GE Healthcare, EUA). Uma proteína de 5000 RU Eõi imobilizado em um chip de biosgensor CM5 (GE Healthcare) utilizando uma química de acoplamento de amina primária padrão a pH 4,5 para capturar a.s diferentes glicoformas de IgG. Uma célula de fluxo de referência foi preparada de modo semelhante, sem injeção de proteína A. Cada glicoforma individual de IgG em tampão HBS-P (HEPES 10 mM pH 1,4-, HaCl 0,15 M, 0,05t v/v de tensioativo P2ÕJ foi injetado a 10 pL/rnin à proteína à de superfície e atingiu o nível de captura de 150 RU. A diluição em série de receptores FcylIIa e Fcyllb foi injetada em 10 pL/tnin. Depois de cada ciclo, a superfície foi regenerada através da injeção de 10 mM de HC1 a 10 μL/min durante 30 s. Os dados foram ajustado em um modelo de ligação 01:01 Langmuir usando software de avaliação BIAcore TI 00 para obter os dados de constante. de equilíbrio (KD).
[00133] Referências
[00134] Os conteúdos de todas as referências aqui citadas são incorporadas no presente documento por referência para todos os fins.
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Claims (7)

1. Método de preparação de um anticorpo de núcleo fucosilado ou não fucosilado ou um fragmento Fc do mesmo tendo uma porção oligossacarídeo predeterminada,caracterizado pelo fato de que o método compreende:proporcionar um anticorpo IgG ou um fragmento IgG-Fc, que compreende um aceptor de GlcNAc de núcleo fucosilado ou não fucosilado; eenzimaticamente reagir o aceptor de GlcNAc de núcleo fucosilado ou não fucosilado com um doador de oligossacarídeo ativado utilizando um mutante de Streptococcus pyogenes Endoglicosidase-S Asp233, em que o doador de oligossacarídeo ativado é uma oxazolina oligossacarídeo sintética ou oxazolina sialilada, em que o mutante Endoglicosidase-S é selecionado a partir de um mutante que compreende uma mutação dirigida ao local D233Q (SEQ ID NO: 2) ou D233A (SEQ ID NO: 3), em que o doador de oligossacarídeo ativado porta uma porção oligossacarídeo ativado que compreende um número e tipo predeterminados de resíduos de açúcar, no qual através de uma reação enzimática, a porção de oligossacarídeo ativado é ligada de forma covalente ao aceptor de GlcNAc de núcleo fucosilado ou não fucosilado, preparando-se assim o anticorpo fucosilado ou não fucosilado ou fragmento Fc com a porção de oligossacarídeo predeterminada.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a oxazolina oligossacarídeo sintética é um di-, tri-, tetra-, penta-, hexil-, hepta-, octil-, nona-, -deca ou undecassacarídeo oxazolina.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o núcleo fucosilado GlcNAc- aceptor é uma alfa-1-6-fucosil-GlcNAc contendo anticorpo ou fragmento Fc.
4. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de núcleo fucosilado ou não fucosilado é um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste em ibalizumab, cetuximab, rituximab, muromonab-CD3, abciximab, daclizumab, basiliximab, palivizumab, infliximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamicin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, adalimumab, omalizumab, tositumomab, I-131 tositumomab, efalizumab, bevacizumab, panitumumab, pertuzumab, natalizumab, etanercept, volociximab, um anti- CD80 mAb, um anti-CD23 mAb, alacizumab, pegol, eraptuzumab, ipilimumab, iratumumab, matuzumab, tremilimumab, zanolimumab, adecatumumab, oregovomab, nimotuzumab, briakinumab, denosumab, fontolizumab, daclizumab, golimumab, ustekinumab, ocrelizumab, ofatumumab, belimumab, epratuzumab, plozalizumab visilizumab, tocilizumab, ocrerlizumab, certolizumab pegol, eculizumab, pexelizumab, abciximab, ranibizimumab, mepolizumab e stamulumab.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o doador ativado de oligossacarídeo é uma oxazolina de oligossacarídeo sintética, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende:(a) proporcionar um anticorpo IgG com núcleo fucosilado ou não fucosilado ou um fragmento IgG-Fc, que compreende N-glicanos heterogêneos ou indesejáveis; e(b) remover os N-glicanos heterogêneos ou indesejados por uma enzima selecionada a partir de Endo S ou Endo-A para formar o anticorpo IgG ou fragmento IgG-Fc compreendendo o aceptor de GlcNAc com núcleo fucosilados ou não fucosilado.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a enzima usada para remover os N-glicanos heterogêneos ou indesejados é Endo S.
7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um mutante Streptococcus pyogenes Endo-S Asp-233 selecionado a partir do grupo que consiste em D233Q (SEQ ED NO: 2) e D233A (SEQ ID No: 3).
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