JP6830576B2 - エンドm変異体、及びn結合型糖鎖含有化合物又はn結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法 - Google Patents
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Description
また、エンドMのアミノ酸を改変した変異体(グライコシンターゼ)は、目的とするN結合型糖鎖由来の構造を含む糖鎖供与体の糖鎖を糖鎖受容体に効率よく糖鎖転移できることが報告されている(例えばUmekawa他、[J.Biol.Chem.,Vol.285(1),511−521,(2010)]参照)。
このように、エンドMは、酵素-化学的な糖蛋白質調製における重要なツールとしての地位を確立してきた(例えば山本憲二他、[日本応用糖質科学会誌,Vol.3(2),31−38,(2013)]参照)。
また、コアフコースを含有するN結合型糖鎖を有する免疫グロブリンGを加水分解するエンド酵素〔エンドS(例えばCollin他、[EMBO J.,Vol.20(12),3046−3055,(2001)]参照)〕も報告されており、エンドSの変異体は、糖鎖供与体を糖鎖転移して免疫グロブリンGの糖鎖を目的の糖鎖に変換できることも報告されている(例えば国際公開第2013/120066号参照)。
Muramatsu他、[J.Biochem.,Vol.129(6),923−928,(2001)]及びFan他、[J.Biol.Chem.,Vol.287(15),11272−11281,(2012)]に記載のエンド酵素(エンドD)は、一部のハイマンノース型糖鎖にしか作用しないという問題点を有する。
Collin他、[EMBO J.,Vol.20(12),3046−3055,(2001)]及び国際公開第2013/120066号に記載のエンドSは、コアフコースを含有する複合型糖鎖を基質とすることはできるものの、ハイブリッド型糖鎖、ハイマンノース型糖鎖及びそれらに由来する構造の誘導体を基質とすることはできない。さらに、免疫グロブリンG(IgG)に結合したN結合型糖鎖以外にはほとんど作用しないという難点を有している。
このように、コアフコースを含有するN結合型糖鎖を加水分解し、さらに糖鎖転移によってコアフコースを有するN結合型糖鎖を有する糖蛋白質を調製することが可能なエンドMの変異体が望まれていた。
<1> 配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、下記反応式(1)で表される加水分解反応を触媒する活性を有するエンドM変異体、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基以外の1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して80%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ下記反応式(1)で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドM変異体である。
本開示においてYに結合するGlcNAcは、GlcNAcの1位の還元末端の炭素に結合するグリコシド結合の酸素原子又は水酸基を含まない。
<2> 前記反応式(1)中、Yがペプチド又は蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基である<1>に記載のエンドM変異体である。
<4> 前記反応において、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率(糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数)が0.2〜20.0である<3>に記載のN結合型糖鎖含有化合物又はN結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法である。
数値範囲を表す「〜」はその上限及び下限の数値を含む範囲を表す。
「糖鎖転移活性」とは、エンドM又はエンドM変異体が、糖鎖供与体を糖鎖受容体に転移させ、新たな生成物を生成する(糖鎖転移する)能力をいう。
またアミノ酸残基の表記方法としては、3文字表記及び1文字表記のどちらかで表記する。
<条件>
・溶離液:0.1体積%のTFAを含有した純水(A)と0.1体積%のTFAを含有したアセトニトリル(B)を体積比((A):(B))9:1で混合後、脱気した溶液
・流速:0.5mL/min
・検出波長:214nm(UV−PDA)
なおHPLC用の分析用カラムとしては、順相系及び逆相系のどちらでもよく、順相系ではアミノカラム、逆相系ではODS(オクタデシルシリル)カラムが挙げられる。
すなわち、反応後の溶液に一定量のアセトンを加え、溶解した部分を乾燥後、一定量のDHBA溶液(20mg/mLの2,5−ジヒドロキシ安息香酸を50%メタノール水溶液に溶解させた溶液)に溶解させる。その後、溶解させた溶液の一部をMALDI−TOF MS分析用のplateにスポットし乾燥させ、UltrafleXtreme JA−1 (Bruker Daltonics社製)もしくはautoflex speed−tko1リフレクタシステム(Bruker Daltonics社製)によって、下記の条件にて測定することで、反応後の生成物の質量を確認できる。
<条件>
・測定モード:positive ion mode,及びreflector mode
・測定電圧:25kv及び1.5kv〜2.5kv
・測定分子量の範囲:0〜4000(m/z)及び45000〜60000(m/z)
・積算回数:20000〜40000及び1000〜8000
糖鎖転移収量及び糖鎖転移収率については、糖鎖供与体と糖鎖受容体とを溶解させた溶液に、エンドM変異体を添加し、所定温度、所定時間インキュベート後に、得られた溶液中に生成した生成物を、例えば、上記のTLC、HPLC及びMALDI−TOF MSで測定することによって同定し、さらにその収量や収率を確認することができる。
糖を形成する炭素の位置は、還元末端を1位、その隣の炭素原子を2位のように表し、それらの炭素原子それぞれに結合する水酸基又は酸素原子を1位の水酸基又は1位の酸素原子のように表し、グリコシド結合を表す場合には、単に「GlcNAcの1位とGlcNAcの4位とのグリコシド結合」のように示す。なお、これらの2以上の単糖が結合したものをオリゴ糖といい、その誘導体はオリゴ糖誘導体と称する。すなわち、N結合型糖鎖はオリゴ糖である。オリゴ糖中の単糖部分のことを「糖ユニット」と称することがある。
上記に従い、例えば前記反応式(1)中の(A)について示すと、そのキトビオシル部位(−GlcNAcβ1−4GlcNAc−)の非還元末端側のグルコサミニル基(GlcNAc)は、そのGlcNAcの1位の酸素原子を含まず、かつ4位の酸素原子を含むことを示す。還元末端側のYに結合するGlcNAcは、1位の酸素原子を含まず、4位及び6位の酸素原子を含むことを示す。また、フコシル基(Fuc)は、1位の酸素原子を含まず、2位から4位までの水酸基を含むことを表す。
なお、ManやGlcNAcにおいて、グリコシド結合していない2位、3位、4位及び6位の炭素は、水酸基が結合していることを示す。
また、糖鎖を説明する表現として、単糖を3つ含む糖鎖は3糖、5つ含む場合は5糖、のように称することもある。
また「糖ペプチド」又は「糖蛋白質」は、それらのペプチドやポリペプチド部分に、N結合型糖鎖が少なくとも1つ以上存在していることを意味し、特に説明されない限り、複数のN結合型糖鎖の種類は1種のものも、2種以上のものも含む。
糖質加水分解酵素では、基質となる糖鎖を酵素の触媒領域で認識し、活性残基が基質に作用することによって、反応が進行する。このため、酵素が基質に作用するためには、まず酵素が基質を収容した後に認識し、さらに活性残基が基質の適切な部位に作用しなくてはならない。今回、発明者は、エンドMがコアフコースを有するN結合型糖鎖に作用しないのは、エンドMの触媒領域のいずれかのアミノ酸がコアフコース部分の収容を妨げていることによるものと考え、そのアミノ酸残基を探索した結果、251番目のトリプトファンであることを見出した。さらに、通常、触媒残基付近のアミノ酸残基を置換した場合、酵素活性は著しく低下することが多いが、本開示では、触媒領域の構造が類似するエンドA、エンドD及びエンドMを詳細に比較検討し、そのアミノ酸残基を適切なもの、つまり触媒領域の物性への影響を与えないようなアミノ酸に置換することによって、コアフコースを含むN結合型糖鎖を触媒領域に収容させた後に強く認識できるようになり、高い加水分解活性及び糖鎖転移活性を達成することができたものと考えられる。
また、エンドMは、これまでの報告により、N結合型糖鎖の還元末端GlcNAcについて、幅広い種類の置換基を有するものを基質とすることが知られている。加えて、該還元末端GlcNAcについても、特開2008−22779号公報に示されるように、4,6シスジオール部位を有していれば、他の構造でもエンドMの基質となることが知られている。
従って、エンドM変異体も、同じような幅広い化合物を基質とすることができる。
本開示のエンドM変異体は、配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、下記反応式(1)で表される加水分解反応を触媒する活性を有するエンドM変異体、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基以外の1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して80%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ下記反応式(1)で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドM変異体(エンドM変異体ホモログ)である。
エンドM変異体としては、W251N変異体又はW251A変異体、あるいは上記の本開示の変異体ホモログであることで、コアフコースを有するN結合型糖鎖の加水分解を十分に行うことができる。さらに、W251N変異体又はW251A変異体がより好ましく、W251N変異体が特に好ましい。
従って、本開示におけるエンドM変異体ホモログは、エンドMの触媒領域を含む500残基程度のアミノ酸配列の長さを有していれば、エンドM変異体ホモログとしての加水分解活性を有すると予想できる。なお本開示のエンドM変異体ホモログが有する加水分解活性は、反応式(1)で表される加水分解反応を同じ条件下で行った場合に、エンドM(WT)が有する加水分解活性の150%以上であることを意味する。
また、加水分解反応において、一般式(1)の(A)で表される基質のYがアシルアミノ基である場合には、反応溶液中のエンドM変異体(もしくはエンドM変異体ホモログ)の濃度は、0.01μg/μL〜40μg/μLであることが好ましい。0.01μg/μL以上であることで、加水分解反応をより速やかに進行させることができ、40μg/μL以下であることで、エンドM変異体の緩衝液への溶解性を向上させ、かつより経済的である。中でも0.01μg/μL〜30μg/μLであることが好ましく、さらに0.02μg/μL〜20μg/μLであることが特に好ましい。
本開示におけるエンドM変異体は、前記反応式(1)の(A)で表される基質、すなわち下記一般式(3)で表される基質を加水分解する。
また、X3及びX4としては、上記の各糖質由来の基の還元末端GlcNAcがβ1−4である基、が挙げられる。
また、X5及びX6としては、上記の各糖質由来の基の還元末端GlcNAcがβ1−6である基、が挙げられる。
X1〜X6が上記の場合には、Z1は水素原子でもGlcNAcβ1−4であってもよい。
さらに、X1〜X6がすべて水素原子である場合も挙げられる。
Yとしては、エンドM変異体の加水分解活性を低下させるものでなければ、特に限定されない。例えば、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アラルキル基、アルキルエステル基、アリールエステル基、アミノ基、アシルアミノ基、イミド基、アジド基、カルボキシル基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基又はハロゲン基が挙げられ、これらの基の中で、アルコキシ基、アシルアミノ基、アリールオキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アルキルスルホニルオキシ基及びアリールスルホニルオキシ基が挙げられる。これらの置換基は、さらに置換基を有していてもよい。
この場合に、該糖蛋白質のポリペプチド部分は、1種類であっても2種類以上であってもよい。
なお、糖蛋白質の純度は、例えば、SDS−PAGEによる方法によって同様に確認できる。
また、有していてもよい置換基の数は1〜20であり、好ましくは1〜10である。20以下であることでエンドM変異体の加水分解活性又は糖鎖転移活性をより高めることができる。
エンドM変異体の加水分解のための基質としては、上記の他に、下記一般式(5)で示すようなN結合型糖鎖の還元末端のGlcNAcを還元アミノ化したオリゴ糖誘導体も用いることができる。
R2としては特に限定されないが、例えば、炭素数1〜12のアルキル基、炭素数1〜12のアルケニル基、炭素数7〜20のアラルキル基、炭素数6〜16のアリール基及びピリジル基が挙げられる。これらの置換基の中で、芳香環及び複素環上の水素原子はさらに、ハロゲン原子、炭素数1〜6のアルキルアミノ基、アミノ基、シアノ基、炭素数1〜6のアルキルシアノ基、カルバモイル基、カルボキシル基、スルホン酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、炭素数1〜10のアルカノイル基又は炭素数1〜10のアシルオキシ基で置換されていてもよい。
加水分解反応は、エンドM変異体および前記一般式(1)の(A)で表される基質を溶解させた溶液中で行われる。反応に用いる溶液としては、エンドM変異体の加水分解活性を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酒石酸緩衝液などが挙げられる。これらの緩衝液は、単独でも組み合わせて用いられてもよい。
上記の中でも、リン酸緩衝液が好ましく、具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウムが好ましく、より好ましくはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。
また、リン酸緩衝液の濃度としては、10mM〜250mMが好ましく、10mM〜150mMがより好ましく、より好ましくは20mM〜100mMである。10mM以上とすることで緩衝能力を高めてエンドM変異体の加水分解活性を高め、250mM以下とすることで、同じくエンドM変異体の加水分解活性を高めることができる。
本開示においては、上記のエンドM変異体の存在下、糖鎖供与体と、下記一般式(1)で表される糖鎖受容体と、を反応させることによりN結合型糖鎖含有化合物又はN結合型糖鎖含有蛋白質を製造するN結合型糖鎖含有化合物又はN結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法を提供することができる。
糖鎖受容体としては、前記一般式(1)で表されるものであれば、エンドM変異体の糖鎖転移活性を阻害するものでない限り、特に限定されない。また、一般式(1)中のYの好ましい範囲は、前記一般式(4)と同じである。
また、Yが蛋白質を含むものは、上記のように、市販の試薬や食品を購入して得られる糖蛋白質、あるいは食品や天然物を一般的な抽出分離法によって得られた糖蛋白質に対し、本開示のエンドM変異体もしくは市販のエンド酵素で加水分解することで容易に調製できる。
しかし、これらの中でも、本開示のエンドM変異体が、基質特異性の幅広さから好適である。本開示のエンドM変異体で、糖鎖変換の目的となる糖蛋白質の不要なN結合型糖鎖の非還元末端側部位を遊離させ、所望のN結合型糖鎖の非還元末端側部位を新たに導入することができるので有利である。
糖鎖供与体としては、エンドM変異体が糖鎖受容体に糖鎖転移できるものであれば、特に限定されない。例えば、前記一般式(3)に示すような、N結合型糖鎖を有する化合物、ペプチド及び蛋白質、あるいは下記一般式(7)のような、非還元トリマンノシルGlcNAc含有糖鎖の還元末端GlcNAcがオキサゾリン化された誘導体が挙げられる。これらの糖鎖供与体は、糖鎖受容体が存在することで、エンドM変異体により非還元末端側糖鎖が効率的に糖鎖転移される。
しかし、高い糖鎖転移収量および糖鎖転移収率で、糖鎖受容体に糖鎖転移させるという観点からは、下記一般式(7)に示すようなトリマンノシルGlcNAc含有糖鎖の還元末端GlcNAcがオキサゾリン化された誘導体が好ましい。
反応、すなわち糖鎖転移反応は、エンドM変異体、糖鎖供与体及び糖鎖受容体を溶解させた溶液中で行われる。反応に用いる溶液としては、エンドM変異体の糖鎖転移活性を阻害しないものであれば特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酒石酸緩衝液などが挙げられる。これらの緩衝液は、単独でも組み合わせて用いられてもよい。
上記の中でも、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログの糖鎖転移活性の点から、リン酸緩衝液が好ましく、具体的には、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウムが好ましく、より好ましくはリン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。
また、リン酸緩衝液の濃度としては、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログの糖鎖転移活性の点から、10mM〜250mMが好ましく、20mM〜150mMがより好ましく、より好ましくは50mM〜100mMである。10mM以上とすることで緩衝能力を高め、250mM以下とすることで、エンドM変異体又はエンドM変異体ホモログの糖鎖転移活性を高め、糖鎖転移収率及び糖鎖転移収量を高めることができる。
なお、エンドM変異体の加水分解活性、糖鎖転移収量及び糖鎖転移収率は、上記のように、例えば、TLC、SDS−PAGE、HPLC又はMALDI−TOF MSによる測定方法等によって確認することができる。
上記の反応において、反応を開始してから所定時間後に、さらに糖鎖供与体とエンドM変異体を添加してもよく、この操作によって、糖鎖転移収量をさらに高めることができる。この場合には、糖鎖転移収量を高める観点からは、初めの糖鎖供与体投入時から、3時間〜48時間まで反応を行うことが好ましい。
また、本開示のN結合型糖鎖含有化合物又はN結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法では、多くの種類の糖鎖供与体を用いて、対応する多くの種類のN結合型糖鎖を高い割合で含有する化合物又はN結合型糖鎖を含有する蛋白質が得られるため、得られたものは糖鎖標品としても有用である。
(エンドMにおけるアミノ酸の変異位置の決定)
エンドA及びエンドDは、アミノ酸配列の一次構造による比較から、共にGHファミリー85に属し、両者共にN結合型糖鎖を加水分解する酵素であることが知られている。上記のように、エンドAはコアフコースを含有するN結合型糖鎖を加水分解しないが、エンドDは加水分解する。
一方、エンドAはYinらの文献[PLoS One,Vol.4,4658(2009)]及びLingらの文献[J.Mol.Biol.,Vol.389(1),1(2009)]、エンドDはAbbotらの文献[J.Biol.Chem.,Vol.284,11676(2009)]によって、N結合型糖鎖の一部を有する化合物との共結晶の立体構造解析が報告されている。図1Aは、エンドAとM3N1−チアゾリン誘導体との共結晶における触媒領域の立体モデルを示し、図1Bは、エンドDとM3N1−チアゾリン誘導体との共結晶における触媒領域付近の立体モデルを示す。
エンドM変異体として、G125W変異体、Q128A変異体、Q128S変異体,W228H変異体、W251A変異体及びW251N変異体を下記のように調製した。
本実施例で用いられる、エンドM変異体は、梅川らの文献[J.Biol.Chem.Vol.285(1),511−521,(2010)]に記載される方法に従って調製した。配列番号1のアミノ酸配列の全長をコードするDNAを、市販の蛋白質発現ベクター(pET23b、Novagen社製)のマルチクローニングサイトにあるBamHIおよびXhoIサイトに導入したプラスミドDNA(pET23b−EndoM−His6)を鋳型とし、下記表1に示すように、変異するアミノ酸をコードしたForward primer用のオリゴDNAとReverse primer用のオリゴDNA(配列番号2〜13)を用い、各エンドM変異体調製のための蛋白質発現用ベクターを構築した。この調製方法によって、各エンドM変異体のC末端領域に6つのヒスチジン(6×His、ヒスタグ)が融合した蛋白質を得ることができる。
〈Cy−1の条件〉
・10×KOD−Plus-緩衝液:5μL
・2mM dNTP:5μL
・25mM MgSO4:2.4μL
・鋳型となるプラスミド(100ng/μL):0.1μL(10ng)
・Forward primer(10μM):1μL(10pmol)
・Reverse primer(10μM):1μL(10pmol)
・KOD−plus:1μL
・2回蒸留後滅菌した水:35.4μL
〈Cy−2の条件〉
・ステップ1;温度95℃、2分間インキュベート
・ステップ2;温度95℃、30秒間インキュベート
・ステップ3;温度55℃、1分間インキュベート
・ステップ4;温度68℃、6分30秒間インキュベート
・ステップ5;ステップ2からステップ4までを16サイクル
・ステップ6;ステップ5後に温度68℃5分間インキュベート
・ステップ7;ステップ6後に4℃でインキュベート
なお、エンドM(WT)においては、上記の変異導入の操作を行わずに、上記文献による方法によって、エンドMをコードするDNAが導入されたベクター(pET−EndoM−His6)で形質転換されたBL21(DE3)を調製し、下記のようにエンドMを発現させ、精製することで得られた。
pET23b−ΔEndoM−His6を有するBL21(DE3)を、アンピシリン(Amp)100μg/mL含有のLB培養液5mLで前培養(37℃、12時間)した後、その1mL(OD値、0.5〜2.0)を100mLのアンピシリン(Amp)100μg/mL含有のLB培養液に添加し、そのまま振盪培養(19℃、38時間)を行った。培養後の菌体を遠心分離(3300×g,10分間、4℃)により回収後、1mMのPMSF溶液を含むBugBusterMasterMix(Novagen社製)5mLを加え、室温で10分間、浸透しながらインキュベートすることにより、菌体の溶解物を得た。得られた溶解物を室温、21500×g,15分間遠心することで沈殿物を除去し、得られた上清に500mMのイミダゾール溶液を終濃度20mMとなるように添加し、1mL用のヒスタグ精製用カラム(Ni2+−charged Hi−trap chelating column、GE Healthcare(GE)社製)にそのまま供した。その後、20mMイミダゾール、0.5MのNaCl及び1mMのジチオトライトール(DTT)を含む20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)を上記カラムに10ml加えることよってカラムに結合したヒスタグを有しない蛋白質等を除去した後、カラムに結合したタンパク質を、100mMのイミダゾール、0.5MのNaCl及び1mMのDTTを含む20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)を4mLを加え、カラムから流出する溶液を1mlずつ分画(フラクション)し、その後さらに150mMのイミダゾール、0.5MのNaCl及び1mMのDTTを含む20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)の4mLを加え、カラムから流出する溶液を1mlずつ分画(フラクション)した。それぞれのフラクション(1mLずつ、計8本)についてSDS−PAGEを行うことで、含有する蛋白質を確認した。その後、これらのフラクションのうち、精製された蛋白質を含むフラクションを集め、限外ろ過膜を有する遠心フィルターユニット(分画分子量30,000、Amicon Ultra、ミリポア社製)を用い、0.15MのNaClを含む20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)を加えて何度も遠心濃縮を繰り返すことで、前記緩衝液への置換及び蛋白質の濃縮を行った。さらに20mMのリン酸緩衝液(pH7.2)中で透析(Slide−A−Lyzer Dialysis Casette、分画分子量7kDa、Thermo Scientific社製)を行い、その一部をMono−Qカラム(孔径5mm×長さ50mm、GE社製)を接続させた中圧クロマトグラフィー[FPLC system(AKTA explorer、GE社製)]によって精製した。クロマトグラフィー操作においては、20mMのリン酸緩衝液(pH7.2)(A)と1MのNaClを含む20mMのリン酸緩衝液(pH7.2)(B)とを用い、NaClの直線的な濃度勾配を加え、各フラクションに分画した。得られた各フラクションについて、SDS−PAGEを行うことで含有する蛋白質の確認を行い、精製されたエンドM変異体を含むフラクションを集め、上記同様の限外ろ過膜を有する遠心フィルターユニットによって濃縮し、実施例に使用するエンドM変異体を含む溶液を得た。得られた各変異体についてのSDS−PAGEの結果を図3に示す。
生成物の確認に用いたM3N1は東京化成工業株式会社製を、生成物の確認及び糖鎖転移反応に用いたSialo−glyco oxazoline(SG−oxazoline)、N1−biotin及びF1N1−biotinは、東京化成工業株式会社製のものをそのまま用いた。また、その他のエンドM変異体の加水分解反応に用いる試薬、エンドM変異体の精製に用いる試薬、下記測定に用いる試薬はすべて市販のもの(特に示さない場合、東京化成工業株式会社製のもの)を用いた。
エンドM変異体の加水分解反応[前記反応式(1)]の基質に用いたM3F−biotinとM3−biotinは、図4に示す合成ルートによって調製した。図中の括弧内は化合物番号を示す。
M3-biotin及びM3F-biotinの調製においては、図4の化合物(1)に示す4糖誘導体を出発物質に用いた。
〈化合物(2)の調製〉
化合物(1)30mg(0.015mmol)に、アセトニトリル0.6ml,トルエン0.5ml及びイオン交換水0.3mlを加えて溶解させた後、0℃に冷却して硝酸セリウムアンモニウム82mgを加え、0℃で7時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーで出発物質[化合物(1)]の消失を確認した後、反応後溶液を酢酸エチルで希釈し、水相を、水、飽和重曹水、飽和食塩水の順でそれぞれ分液処理を行った。回収した有機層を、減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[充填剤:PSQ100B(富士シリシア社製)、展開液(体積比):トルエン/酢酸エチル=3/2]にて精製し、化合物(2)20mgを収率70%で得た。
化合物(2)150mg(0.079mmol)を塩化メチレン1.5mlに溶解させ、0℃に冷却した後にトリクロロアセトニトリル80mμl及びジアザビシクロウンデセン1.1μlを加え、0℃で1時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて、化合物(2)の消失及び生成物の生成を確認した後、シリカゲルPSQ60Bを用いて濾過を行った。濾液を減圧濃縮することで、化合物(3)160mgを収率99.3%で得た。
アルゴン雰囲気下、塩化メチレン1mL中、化合物(3)160mg(0.079mmol)と、化合物(A)(Fuc1−6GlcNAc−PrNHZ)140mg(0.139mmol)とを、モレキュラーシーブ4Aの混合物を、−20℃に冷却した。冷却後に、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル0.8μlを加え、−20℃で1時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて化合物(3)の消失及び生成物の生成を確認した後、反応溶液にさらにトリエチルアミン2μlを加えて反応を停止させた。
これを上記同様の方法にて濾過した後、濾液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[充填剤:PSQ100B、展開液(体積比):塩化メチレン/メタノール=100/1]にて精製を行い、化合物(4)120mgを収率54%で得た。
(4)の構造は、1H−NMR(400MHz、CDCl3)スペクトル法にて解析し、0.99ppm付近に、フコシル基の6位メチル水素由来のピークが存在することから確認できた。
アルゴン雰囲気下、塩化メチレン1mL中、化合物(3)320mg(0.157mmol)、化合物(B)(GlcNAc−PrNHZ)320mg(0.471mmol)及びモレキュラーシーブ4Aの混合物を、上記化合物(4)と同様の操作によって化合物(4’)235mgを収率57%で得た。(4’)の構造は、1H−NMR(400MHz、CDCl3)スペクトル法にて解析し、5.15ppm付近に、グルコサミニル基の還元末端炭素に結合する水素由来のピークが存在することから確認できた。
化合物(4)20mg(0.0069mmol)を1−ブタノール2mlに溶解させ、無水エチレンジアミン28μlを加えて還流しながら23時間撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて化合物(4)の消失及び生成物の生成を確認し、さらにニンヒドリン反応によるアミノ基の生成の確認を行い陽性であることを確認した後、反応後溶液にトルエンを加えて減圧濃縮することで、シロップ状の残渣を得た。得られた残渣をメタノール2mlに溶解させ、さらに無水酢酸130μlを加え、室温で30分撹拌した。その後、薄層クロマトグラフィーを用いて出発物質の消失及び生成物の生成の確認し、トリエチルアミン0.19mlを加えて反応を停止した。得られた溶液を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[充填剤:PSQ100B、展開液(体積比):塩化メチレン/メタノール=50/1]にて精製を行い、化合物(5)12mgを収率69%で得た。
(5)の構造は、1H−NMR(400MHz、CDCl3)スペクトル法にて解析し、1.64ppmおよび1.84ppm付近に、アセトアミド基のメチル水素由来のピークが存在することから確認された。
化合物(5)の調製において、化合物(4)の代わりに化合物(4’)75mg(0.029mmol)を用いた他は、同様の操作を行い、化合物(5’)38mgを収率62%で得た。
化合物(5)の構造は、1H−NMR(400MHz、CDCl3)スペクトル法にて解析し、1.61ppmおよび1.85ppm付近に、アセトアミド基のメチル水素由来のピークが存在することから確認された。
化合物(5)10mg(0.0048mmol)を、テトラヒドロフラン1.4ml、エタノール1.4ml、イオン交換水0.7ml及び酢酸0.4mlを混合させた溶液に溶解させ,パラジウム炭素(パラジウム約5%含有)12mgを加え、水素雰囲気下、45℃で24時間撹拌させた。その後、薄層クロマトグラフィー[展開液(体積比):酢酸エチル/メタノール/イオン交換水/酢酸=2/2/2/1]にて化合物(4)の消失及び生成物の生成を確認し、さらに反応後溶液(懸濁液)を、ゲル濾過クロマトグラフィー[充填剤:セファデックスLH−20(GE社製)、溶出液(体積比):イオン交換水/メタノール=1/1)]によって分離精製した。
分離後に得られた化合物(6)を含むフラクションを回収し、減圧濃縮して得られた残渣をイオン交換水に溶解させ、さらに凍結乾燥を行うことで、化合物(6)の凍結乾燥粉末5.2mgを収率98.5%で得た。
化合物(6)の構造は、1H−NMRスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。
化合物(6)の調製において、化合物(5)の代わりに化合物(5’)23mg(0.011mmol)を用いた他は、同様の操作を行い、化合物(6’)の凍結乾燥粉末9.5mgを収率96.0%で得た。
化合物(6’)の構造は、1H−NMRスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。
化合物(6)8.0mg(0.0071mmol)をジメチルスルホキシド1mlに溶解させ、D−ビオチン N−スクシンイミジル3.6mg(0.0107mmol)を加えて5時間撹拌した。得られた懸濁液を、ゲル濾過クロマトグラフィー[充填剤:セファデックスLH−20、溶出液(体積比):イオン交換水/メタノール=1/1]によって分離精製した。分離後に得られたM3F−ビオチンを含むフラクションを回収し、減圧濃縮して得られた残渣をイオン交換水に溶解させ、さらに凍結乾燥を行うことで、M3F−biotin[化合物(7)]の凍結乾燥粉末8.3mgを収率88%で得た。
(7)の構造は1H−NMR及び13C−NMRスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。
13C−NMR(D2O)δ: 104.50, 103.16, 103.01, 102.38, 101.57, 101.29.
化合物(7’)の調製において、化合物(6)の代わりに化合物(6’)9mg(0.0092mmol)を用いた他は、同様の操作を行い、化合物(7’)の凍結乾燥粉末9.8mgを収率89%で得た。
化合物(7’)の構造は、1H−NMRスペクトル法にて確認した。結果の詳細を以下に示す。
13C−NMR (D2O) δ: 103.23 , 102.09 , 101.75 , 101.08 , 100.31.
コアフコースを含有する糖蛋白質として、以下の性質を有する市販のリツキシマブ製剤(リツキサン、全薬工業株式会社製)を実施例3として用いた。
・分子量:144510
・構造:可変領域の一部がマウス型に置換されたヒト型IgG1
・機能:分化抗原CD20を抗原とする
・調製:リツキシマブをコードする遺伝子発現構成体をチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)に導入し、その後に発現誘導を行って調製
上記のように、CHOから生産されるリツキサンが有するN結合型糖鎖は、ほとんどがコアフコースを有していることが知られており、例えば、Shieldsらの文献[J.Biol.Chem.,Vol.277,26733(2002)]及びRajuらの文献[Bioprocess Int.,Vol.4,44(2003)]、Liらの文献[mAbs,Vol.5,565(2013)]に詳しく記載されている。
リツキサン800μgを400μLの40mMの炭酸アンモニウムに溶解させ、10 mMジチオスレイトール(DTT)を添加して55度にて45分間インキュベートした。その後、室温まで冷却した後、終濃度30mMとなるようにヨードアセタミドを添加し、さらにチューブを遮光して、1時間室温にてさらに静置した。次いで、5μgのトリプシン(Modified Sequence Grade Trypsin、プロメガ社製)を加え、37度で16時間インキュベートすることによって、リツキサンをペプチドにまで消化した。得られたリツキサンペプチドは、乾燥後、5%酢酸に溶解し、得られた溶液を、C18カートリッジカラムにアプライした。その後、C18カラムを5%酢酸で洗浄した後、該カラムに結合したペプチド・糖ペプチドを20%の2-プロパノールを含む5%酢酸および40%の2−プロパノールを含む5%酢酸によって、順次溶出し、溶出後に回収した溶液を遠心濃縮によって乾燥させ、リツキサンペプチドを得た。なお、得られたリツキサンペプチドは、N結合型糖鎖を有する糖ペプチドを、全リツキサンペプチドの質量に対して10質量%程度有する混合物である。
コアフコースを含有する糖蛋白質であるヒトトランスフェリン(hLF)は、市販品(L3770、シグマ−アルドリッチ社製)をそのまま用いた。なお、Yuらの文献[Glycobiology,Vol.21,206(2011)]に記載されるように、hLF中のほとんどがコアフコースを含有する複合型糖鎖を2つ有することが知られている。
(TLC)
下記反応後の溶液2μLを、薄層クロマトグラフィー(TLC、Silica gel60、Merck社製)にスポットし、展開溶媒(1−ブタノール/酢酸/水:3/2/2)によって展開し、オルシノール法、すなわち2Mの硫酸に溶解させた0.2体積%のオルシノール溶液に浸漬した後、110℃で10分程度加熱することで呈色させた。呈色したプレートは市販のスキャナー装置で画像化した。
反応後の溶液10μLに、10μLの0.1体積%トリフルオロ酢酸(TFA)を添加し、HPLC測定の試料として用いた。HPLC測定は、分析用のカラム[Cosmosil 5C18 AR−II(孔径4.6mm×長さ150mm、ナカライテスク社製)]を装備したHPLCシステム[分離モジュール:e2569(ウオータース社製)、フォトダイオードアレイ検出器:2999(ウオータース社製)]により下記の条件で行った。
〔条件〕
・溶離液:0.1体積%のTFAを含有した純水(A)と0.1%のTFAを含有したアセトニトリル(B)を体積比((A):(B))9:1で混合後、脱気した溶液
・流速:0.5mL/min
・検出波長:214nm(UV−PDA)
反応後の溶液に80μLの冷アセトンを加え、−80℃で30分静置した。その後、17400×gで10分間遠心し、上清を別チューブに移し濃縮遠心によって乾燥後、10μLの純水に溶解させた。得られた溶液2μLをTLCによって確認し、1μLを3μLのDHBA溶液(20mg/mLの2,5−ジヒドロキシ安息香酸を50%メタノール水溶液に溶解させた溶液)に溶解させた。得られた溶液の2μLずつを、MALDI−TOF MS分析用のplateにスポットし乾燥させ、MALDI−TOF MS分析を、Ultrafle Xtreme JA(ブルーカー・ダルトニクス社製)もしくはautoflex speed−tko1リフレクタシステム(ブルーカー・ダルトニクス社製)を用い、下記の測定条件で行った。
・測定モード:ポジティブイオンモード,及びリフレクターモード
・測定電圧:25kv及び1.5kv〜2.5kv
・測定分子量の範囲:m/z0〜4000及び45000〜60000
・積算回数:20000〜40000及び1000〜8000
また、MS/MS測定は、上記のMALDI−TOF MS測定によって得られた、所定のm/z値を有するシグナルをプリカーサーイオンとして用い、アルゴンガスを使用して行った。
SDS−PAGEによる測定は、市販のスラブゲル用の装置(日本エイドー株式会社製の恒温式2連ミニスラブゲル電気泳動装置)を用い、10%のポリアクリルアミドゲルを、40mAで60分間電気泳動後に、ゲルをクマシブリリアントブルーで染色し、得られたゲルを評価した。マーカーは、Protein Marker Broad Range(2−212kDa)(NEB社製)を用いた。なお、検出においては、ゲル撮影装置(スキャナーGT−X970、エプソン社製)を用いた。
〔実施例1〕
1.5mLのマイクロチューブ中に、エンドM変異体としてW251A変異体の1μgと、基質(反応式(1)の(A))としてM3−biotin又はM3F−biotinの10μgと、を30mMのリン酸ナトリウム水溶液(pH6.0)10μLに溶解させた後、恒温槽中、30℃でインキュベートした。所定時間のインキュベート後に、95℃で5分間の熱処理によって反応を停止し、反応後の溶液を得た。得られた溶液について、TLC、HPLC及びMALDI−TOF MSによる測定を行い、加水分解活性を算出した。
表2に示すように、実施例1のW251A変異体をW251N変異体、エンドM,G125W変異体、G128A変異体、Q128S変異体又はW228H変異体に変更した以外は同様にして、実施例2又は比較例1〜5での反応後の溶液を得た。得られた各溶液は、実施例1と同様の方法で測定し、加水分解活性を算出した。
反応時間20分後でのTLC測定の結果を図5に示す。図5中、矢印は基質及び加水分解後の生成物のTLC上での位置を示す。結果から、M3−biotinに対しては、エンドM及びエンドM変異体のすべてが、反応時間20分以内で加水分解を完了することが示された。一方、M3F−biotinに対しては、W251A変異体及びW251N変異体を添加した場合にのみ、加水分解物〔Man3GlcNAc(M3N1,反応式(1)の(B)に相当)及びFucα1−6GlcNAc−biotin(F1N1−biotin、反応式(1)の(C)に相当)〕を生じることが示された。しかし、W251A変異体及びW251N変異体以外のエンドM変異体を添加した場合にはほとんど加水分解物を生じていないことが示された。
また、HPLCによる解析から、M3F−biotinに対する加水分解後の生成物の量を算出し、反応時間(インキュベートした時間)と、加えたエンドM変異体又はエンドMの質量から、特異的加水分解活性(μmol/(min・mg))及び相対活性を算出した。なお、相対活性については、エンドMのM3F−biotinに対する前記活性を1とした場合のエンドM変異体の各基質に対する相対活性として示した。結果を表2に示す。
このように、エンドMの251番目のトリプトファン残基を適切なアミノ酸に置換することが、コアフコースを有するN結合型糖鎖の加水分解に極めて重要であることが示された。
実施例3として、W251N変異体の糖ペプチドを含むリツキサンペプチドに対する加水分解反応を行った。
上記で調製したリツキサンペプチド200μgを100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)400μlに溶解しW251N変異体4μgを添加し、30℃で16時間反応させた。反応終了後、反応後溶液を遠心濃縮によって乾燥させ、5%酢酸に再溶解した後、得られた溶液をC18カラムにアプライした。アプライ後に、該カラムへの非結合画分を回収し、凍結乾燥することで、エンドM変異体による加水分解によって遊離したN結合型糖鎖画分の乾燥物を得た。当該乾燥物を次のマススペクトロメトリーによる糖鎖分析に供した。
上記の乾燥物は、Anumulaらの文献〔Anal.Biochem.Vol.203,101−108〕による定法に従って完全メチル化を行ってから、MALDI−TOF/TOF MS分析によって糖鎖の分子量とフラグメントパターンによる糖鎖の構造推定を行った。なお、当該分析には、2,5−dihydrobenzoic acidをマトリックスとして用いた。以下、上記の各加水分解後に得られた乾燥物を、上記のMALDI−TOF/TOF MS分析によって行った結果を、「各加水分解後のMS分析の結果」と称することがある。
実施例3において、W251N変異体4μgの代わりにエンドM(WT)4μgを用いた他は実施例3と同じにして、リツキサンペプチドに対する加水分解反応を行い、マススペクトロメトリーによる糖鎖分析を行った。
実施例3において、W251N変異体4μg及び100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)の代わりにエンドS(ニューイングランドバイオラボ社製)100U及びNEB社製のG6 bufferを用いた他は実施例3と同じにして、リツキサンペプチドに対する加水分解反応を行い、マススペクトロメトリーによる糖鎖分析を行った。
結果を図8A〜図8Cに示す。図8Aは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、エンドM(WT)による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、MALDI−TOF MSによって測定した結果を示し、図8Bは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、W251N変異体による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、MALDI−TOF MSによって測定した結果を示し、図8Cは、リツキサンから調製した糖ペプチドに対し、エンドSによる加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、MALDI−TOF MSによって測定した結果を示す。なお、図8A〜図8C中の黒の四角はN―アセチルグルコサミン、灰色の丸はマンノース、白い丸はガラクトース、黒のひし形はN―アセチルノイラミン酸を示す。
結果から、遊離したN結合型糖鎖は、比較例6では、図8Aに示すように、m/z 1416.8 (HexNAc3Hex3)のピークが弱く検出されるのみであった。一方、実施例3では、図8Bに示すようにm/z 1171.7,1416.8,1620.9,1825.0,2187.1,2548.3とそれぞれHexNAc2Nex2,HexNAc3Hex3,HexNAc3Hex4,HexNAc3Hex5, NeuAc1HexNAc3Hex5,NeuAc2HexNAc3Hex5に相当するピークが検出された。また、図8A〜図8Cに、各ピークのMALDI−TOF/TOF分析の結果から得られたフラグメントパターンから推定される糖鎖構造を示す。推定された糖鎖構造においては、実施例3と、図8Cに示す参考例1とが一致することが示された。
このように、W251N変異体は、コアフコースを含有する様々な種類の複合型糖鎖等が結合した糖ペプチドに対して、エンドSと同様に加水分解活性を有することが示された。
実施例4として、W251N変異体のヒトラクトフェリン(hLF)に対する加水分解を行った。
10μgのhLF(L3770、シグマ−アルドリッチ社製)を溶解した100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)20μlに、2μgのW251N変異体を添加し30℃で16時間反応させた、
反応後の溶液にSDS−PAGE用のサンプルバッファーを等量加え、5分間沸騰水中で加熱し、SDS−PAGE用の試料を得た。次に、各レーン中にhLFが0.5μg含まれるようにSDS−PAGE用の7.5%のポリアクリルアミドゲルのウェルにアプライし、SDA−PAGEを行った。SDA−PAGE後のゲルの染色は、クマシー染色により行った。
実施例4において、W251N変異体の代わりにエンドM(WT)2μgを用いた他は実施例4と同じにして、hLFに対する加水分解反応を行い、反応後の溶液についてSDS−PAGEを行った。
実施例4において、W251N変異体及び100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)20μlの代わりにエンドS(ニューイングランドバイオラボ社製)100U及びNEB社製G6 bufferを用いた他は実施例4と同じにして、hLFに対する加水分解反応を行い、反応後の溶液についてSDS−PAGEを行った。
各反応後の溶液についてSDS−PAGEの結果を図9に示す。各レーンの上部には、加水分解反応に用いたエンド酵素の種類を示す。図9中、矢印の始点は、終点が示す各バンドにおいて推定される蛋白質名を表す。DG―hLFは、1つのあるいは2つのN結合型糖鎖が、エンド酵素によって加水分解されたhLFを意味する。native hLFは、N結合型糖鎖が加水分解されていないhLFを意味する。
結果から、加水分解を行っていないhLF(Control)では、80kDaより少し上に2つの糖鎖を持つnative hLFに相当するバンドが認められる。またごく一部は3本の糖鎖を持つと推定されることから更に上に分離される。
比較例8、すなわち、エンドSによる加水分解反応の場合には、Controlよりも低分子量側にバンドが出現することから、エンドSによる加水分解反応によって、hLF(native hLF)から少なくとも1つの糖鎖が遊離したと考えられる。比較例7、すなわちエンドM(WT)による加水分解反応の場合も、同様にControlよりも低分子量側にバンドが出現することから、少なくとも1つの糖鎖が該hLFから脱離したと考えられる。なお、エンドM(WT)はコアフコースを有しないN結合型糖鎖を加水分解しないが、該hLFにはコアフコースを有しないN結合型糖鎖も含まれていると考えられるので、比較例7においては、エンドM(WT)が、hLF中のそれらのN結合型糖鎖を加水分解したものと考えられる。
一方、実施例4、すなわちW251N変異体による加水分解反応の場合には、比較例7及び8で見られた低分子量側のバンド以外にも、さらに低分子量側のバンドが現れることから、少なくとも2つの糖鎖がhLFから遊離したことが示された。従って、W251N変異体は、エンドSには加水分解できないhLFが有するN結合型糖鎖に対しても加水分解活性を有することが示された。
このように、W251N変異体は、コアフコースを含有する糖タンパク質糖鎖に対しても、加水分解活性を有することが示された。
実施例5として、W251N変異体のhLFに対する加水分解反応を行った。
上記で調製したhLF100μgを100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)100μlに溶解しW251N変異体20μgを添加し、30℃で16時間反応させた。反応終了後、反応後溶液を遠心濃縮によって乾燥させ、5%酢酸に再溶解した後、得られた溶液をC18カラムにアプライした。アプライ後に、該カラムへの非結合画分を回収し、凍結乾燥することで、エンドM変異体による加水分解によって遊離したN結合型糖鎖画分の乾燥物を得た。当該乾燥物を次のマススペクトロメトリーによる糖鎖分析に供した。
上記の乾燥物は、Anumulaらの文献〔Anal.Biochem.Vol.203,101−108〕による定法に従って完全メチル化を行ってから、MALDI−TOF/TOF MS分析によって糖鎖の分子量とフラグメントパターンによる糖鎖の構造推定を行った。なお、当該分析には、2,5−dihydrobenzoic acidをマトリックスとして用いた。以下、上記の各加水分解後に得られた乾燥物を、上記のMALDI−TOF/TOF MS分析によって行った結果を、「各加水分解後のMS分析の結果」と称することがある。
実施例5において、W251N変異体20μgの代わりにエンドM(WT)20μgを用いた他は実施例5と同じにして、hLFに対する加水分解反応を行い、マススペクトロメトリーによる糖鎖分析を行った。
結果を図10A及び図10Bに示す。図10Aは、hLFに対し、エンドM(WT)による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、MALDI−TOF MSによって測定した結果を示し、図10Bは、hLFに対し、W251N変異体による加水分解反応を行った後に遊離した糖鎖を、MALDI−TOF MSによって測定した結果を示す。なお、図10A及び図10B中の黒の四角はN―アセチルグルコサミン、灰色の丸はマンノース、白い丸はガラクトース、黒のひし形はN―アセチルノイラミン酸を示す。
結果から、エンドM(WT)を用いた場合も、W251N変異体を用いた場合もともにN結合型糖鎖が加水分解したものと推定されるシグナルが得られた。一方、主なシグナルとして、m/z 1335(Hex5HexNAc1)、m/z 1621(Hex4HexNAc3)、m/z 1825(Hex5HexNAc3)、m/z 2000(dHex1Hex5HexNAc3)、m/z 2187(NeuAc1Hex5HexNAc3)を検出した。また、図10A及び図10Bに、各ピークのMALDI−TOF/TOF分析の結果から得られたフラグメントパターンから推定される糖鎖構造を示す。
このように、W251N変異体処理において、エンドM(WT)処理のものよりもシグナルが強く、多くの糖鎖が遊離したことが示唆された。本結果は、実施例5のSDS−PAGEの結果に矛盾しないことが示された。
実施例6として、W251N変異体のリツキサン(抗体、IgG1)に対する加水分解反応を行った。
上記の市販のリツキサン200μgを、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.25)100μlに溶解させ、膜濃縮装置[分画分子量10000、アミコンウルトラ15(メルクミリポア社製)]にて4℃で、緩衝液の交換を行った。緩衝液の交換によって得られたリツキサン(IgG1)200μgが溶解した50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.25)100μLに、W251N変異体の1mgを0時間後、24時間後、48時間後にそれぞれ加え、恒温槽(EYELA社製、THERMISTOR TEMPPET T−80)中、37℃で振盪しながらインキュベートした。インキュベートした時間(以下、反応時間と称する)が0時間後(A)、24時間後(B)、48時間後(C)、72時間後(D)に、反応後溶液から一部をサンプルとして採取し、各サンプルをさらに還元処理した後、MALDI−TOFでMS分析を行った。結果を、図11で示す。図11に示すように、反応時間の経過につれて、N結合型糖鎖が結合した重鎖の分子量に相当する位置のピークが減少し、代わりにN結合型糖鎖を有しない重鎖の質量の位置に相当するピークが増大することから、反応時間の経過によって、リツキサンのN結合型糖鎖が遊離したことが示された。また、48時間後から72時間後の間に、原料のIgG(リツキサン)のN結合型糖鎖が加水分解されて生じた加水分解物((Fucα1−6)GlcNAc−IgG、m/z 49502))のピーク(m/z 49502)が、原料のピークよりも高くなることが示された。
〔実施例7〕
糖鎖転移反応は、下記の組成条件の溶液20μLを、1.5mLのマイクロチューブ中に作成した後、恒温槽中、30℃で60分インキュベートすることで行った。
〔条件〕
・糖鎖供与体:5mMのSG−oxazoline
・糖鎖受容体:5mMのF1N1−biotin
・エンドM変異体:0.66μgのW251N変異体
・緩衝液濃度とpH及び溶液全体の体積:25mMリン酸ナトリウム(pH6.5)20μL
インキュベート後に、95℃で5分間の熱処理によって反応を停止し、反応後の溶液を得た。得られた溶液を乾燥し20mg/mLのDHBA溶液に溶解してMALDI−TOF MS分析に処した。
下記表3に示すように、比較例10では、実施例7における糖鎖受容体を同濃度のN1−biotinに、比較例11では、実施例7におけるエンドM変異体を同質量のN175Q変異体に、比較例12では、比較例11における糖鎖受容体を同濃度のF1N1−biotinにそれぞれ変えた他は同じ条件で反応を行い、反応後溶液を同様にMALDI−TOF MS分析に処した。
図12に、実施例及び比較例で行った糖鎖転移反応についての概要を示す。図12が示すように、W251N変異体又はN175Q変異体の糖鎖転移反応によって、N1−biotin又はF1N1−biotinと、SG−oxazolineと、がそれぞれ縮合した
生成物、SG−biotin又はSGF−biotinが検出された。
以下に詳細を示す。
一方、Aに示すように、糖鎖受容体としてN1−biotinを用いた比較例10では、縮合生成物に相当するピークは検出できなかった。
また、エンドM変異体としてN175Qを用いた比較例11(図13のC)では、糖鎖受容体であるN1−biotinとSG−oxazolineが縮合した生成物、すなわちSG−biotinのナトリウムイオン付加体(NeuAc2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2−biotin[M+3Na−2H]+)に相当すると考えられるシグナル(m/z2573.9)が検出された。
一方、Dに示すように、糖鎖受容体としてF1N1−biotinを用いた比較例12では、縮合生成物に相当するシグナルは検出できなかった。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (4)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、下記反応式(1)で表される加水分解反応を触媒する活性を有するエンドM変異体、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基がアスパラギン又はアラニンであるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号1で示されるアミノ酸配列の251番目のアミノ酸残基以外の1個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加又は置換により、前記アミノ酸配列に対して90%以上の相同性の範囲内で修飾されたアミノ酸配列を有し且つ下記反応式(1)で表される加水分解反応を触媒する活性を有しているエンドM変異体。
(反応式(1)中、Xは糖質由来の基、Yは一価の置換基を示す。GlcNAcはN−アセチルグルコサミニル基を表し、β1−4はGlcNAcの1位とGlcNAcの4位とのβグリコシド結合を表す。Fucはフコシル基を表し、α1−6はFucの1位とGlcNAcの6位とのαグリコシド結合を表す。GlcNAc−OHは、GlcNAcの還元末端の炭素に水酸基が結合していることを示す。H−GlcNAcは、GlcNAcの4位の酸素原子に水素原子が結合していることを示す。) - 前記反応式(1)中、Yがペプチド又は蛋白質に由来する構造を含むアシルアミノ基である請求項1に記載のエンドM変異体。
- 請求項1又は請求項2に記載のエンドM変異体の存在下、
糖鎖供与体と、
下記一般式(1)で表される糖鎖受容体と、
を反応させることによりN結合型糖鎖含有化合物又はN結合型糖鎖含有蛋白質を製造するN結合型糖鎖含有化合物又はN結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法。
(一般式(1)中、Yは1価の置換基を示す。GlcNAcはN−アセチルグルコサミニル基を表し、Fucはフコシル基を表し、α1−6はFucの1位とGlcNAcの6位とのαグリコシド結合を表す。) - 前記反応において、糖鎖供与体の糖鎖受容体に対するモル比率(糖鎖供与体のモル数/糖鎖受容体のモル数)が0.2〜20.0である請求項3に記載のN結合型糖鎖含有化合物又はN結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法。
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