JP6904947B2 - 抗ｏｘ４０抗体及びその診断用途 - Google Patents

Description

関連出願
本出願では、２０１５年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／２２２１０５号の利益が主張され、当該仮出願の内容の全体が参照により援用される。

発明の分野
本発明は、ヒトＯＸ４０と反応する（抗ＯＸ４０）抗体及びその使用方法に関する。

関連技術の記載
ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー４リガンド（ＯＸ４０Ｌ及びＣＤ２５２とも呼ばれる）の受容体として機能する、２７７アミノ酸の１回通過Ｉ型膜タンパク質である。ＯＸ４０の活性化は、細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖、生存、及びエフェクター機能を上昇させることが示されている（Curti et al., Cancer Res., Vol. 73, Issue 24, pp. 7189-98（２０１３年１０月３１日））。抗ＯＸ４０抗体が抗腫瘍免疫応答の増強に有用な標的かどうかを決定するため、進行がんの患者において抗ＯＸ４０抗体を試験する臨床試験が、現在進行中である。

本開示は、抗ＯＸ４０抗体及びその使用方法に関する。

ある態様において、ＯＸ４０に特異的に結合することができる抗体、その抗原結合断片、又はその組換えタンパク質が開示される。

ある態様において、配列番号１のアミノ酸２６６−２７７に特異的に結合することができる抗体、その抗原結合断片、又はその組換えタンパク質が開示される。

ある態様において、ＯＸ４０に特異的に結合することができ、ヒトＯＸ４０ポリペプチド（配列番号１）の２６６−２７７を含むエピトープに結合する抗体、その抗原結合断片、又はその組換えタンパク質が開示される。いくつかの実施態様において、抗体は以下の超可変領域（ＨＶＲ）を含む：（ａ）SDNIQ（配列番号２）のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）AVDYNNKPFYANWAKG（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＢＲ−Ｈ２；及び（ｃ）NTFSP（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＢＲ−Ｈ３。いくつかの実施態様において、抗体は、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）をさらに含む：（ａ）ＱSLEESGGRLVAPGGSLTLTCTVSGIDLS（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）WVRQAPGKGLEWIG（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）RFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCAK（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｄ）WGPGTLVTVSS（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４。いくつかの実施態様において、抗体は、以下のＨＶＲをさらに含む：（ａ）QSSQSVYNANHLS（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）YISTPDS（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）CAALNSDEVFT（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。いくつかの実施態様において、抗体は、以下の軽鎖可変ドメインＦＲをさらに含む：（ａ）DPAMTQTPSSTSAAVGGTVTINC（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）WFQQKPGQPPKRLIY（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）GVPPRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYY（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）FGGGTEVVVK（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４。いくつかの実施態様において、抗体は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列、（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、又は（ｃ）（ａ）に記載のＶＨ配列及び（ｂ）に記載のＶＬ配列、を含む。いくつかの実施態様において、抗体は、配列番号１６のＶＨ配列を含む。いくつかの実施態様において、抗体は、配列番号１７のＶＬ配列を含む。

他の実施態様において、抗体は、以下のＨＶＲを含む：（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。いくつかの実施態様において、抗体は以下の軽鎖可変ドメインＦＲをさらに含む：（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｄ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４。

別の態様において、本発明は、以下のＨＶＲを含み、ＯＸ４０に特異的に結合する、単離された抗体を特徴とする：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３。いくつかの実施態様において、抗体は、以下の重鎖可変ドメインのＦＲ及び可変ドメインのＦＲをさらに含む：（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｇ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｈ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４。いくつかの実施態様において、抗体は、配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号１７のＶＬ配列を含む。

別の態様において、本発明は、前記抗体のいずれか１つと、ＯＸ４０への結合について競合する、単離された抗体を特徴とする。

別の態様において、本発明は、前記抗体のいずれか１つと同一のエピトープに結合する、単離された抗体を特徴とする。

いくつかの実施態様において、前記抗体のいずれか１つは、モノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施態様において、モノクローナル抗体は、ウサギモノクローナル抗体であり得る。

いくつかの実施態様において、前記抗体のいずれか１つは、ＩｇＧ抗体（例えばＩｇＧ１抗体）であり得る。

いくつかの実施態様において、前記抗体のいずれか１つは、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体断片であり得る。いくつかの実施態様において、抗体断片は、Ｆａｂ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、及びダイアボディからなる群から選択される。

別の態様において、本発明は、前記抗体のいずれか１つを含むイムノコンジュゲートを特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体をコードする、単離された核酸を特徴とする。別の態様において、本発明は、抗体を発現するための核酸を含むベクター（例えば発現ベクター）を特徴とする。別の態様において、本発明は、前記核酸及び／又はベクターを含む宿主細胞を特徴とする。

いくつかの態様において、前記抗体のいずれか１つは、生体試料におけるＯＸ４０の存在又は発現レベルの検出に用いることができる。いくつかの実施態様において、検出は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光（ＩＦ）、又はイムノブロットによる。いくつかの実施態様において、検出は、ＩＨＣによる。いくつかの実施態様において、試料は、固定された組織を含む。いくつかの実施態様において、固定された組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施態様において、試料は、がん又は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患しやすい対象由来である。

本発明のさらなる態様は、前述の抗体のいずれか１つと生体試料を接触させることと、結合した抗体の存在を検出することとを含む、生体試料におけるＯＸ４０の存在又は発現レベルを検出する方法である。いくつかの実施態様において、検出は、ＩＨＣ、ＩＦ、又はイムノブロットによる。いくつかの実施態様において、検出は、ＩＨＣによる。いくつかの実施態様において、試料は、固定された組織を含む。いくつかの実施態様において、固定された組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施態様において、試料は、がん又は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患しやすい対象由来である。

本出願書のファイルは、少なくとも１点のカラーで作成された図面を含む。カラー図面を伴う本特許又は特許出願のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、庁により提供される。

抗ＯＸ４０抗体についての、一般的な抗体製造方法を示す模式図である。 以下のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞における免疫組織化学（ＩＨＣ）の結果を示す画像である：（Ａ）モック細胞（ネガティブコントロール細胞）；（Ｂ）ＯＸ−４０がトランスフェクトされた細胞（ポジティブコントロール細胞）；（Ｃ）反応性リンパ節；及び（Ｄ）前立腺がん。

Ｉ．定義
用語「抗ＯＸ４０抗体」、「ＯＸ４０に特異的に結合する抗体」及び「ＯＸ４０に結合する抗体」は、十分な親和性を有してＯＸ４０に結合することができる抗体であり、従って診断薬及び／又は治療剤としてＯＸ４０の標的化に有用である抗体を指す。ある実施態様において、無関係の非ＯＸ４０タンパク質に対する抗ＯＸ４０抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される場合、当該抗体のＯＸ４０に対する結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＯＸ４０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施態様において、抗ＯＸ４０抗体は、異なる種由来のＯＸ４０の間で保存されている、ＯＸ４０のエピトープに結合する。

本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片が含まれるが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

参照抗体と「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体のその抗原に対する結合を５０％以上阻害する。例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。

「自己免疫疾患」は、個体自身の組織又は臓器から生じる疾患又は障害、及び個体自身の組織又は臓器に対する疾患又は障害、又はそれらの同時分離若しくは症状発現、又はそれらから結果として生じる状態である。「自己免疫疾患」は、臓器特異的な疾患（すなわち免疫応答が、内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸系及び肝系、腎系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などのような臓器系に対して特異的に向けられるもの）、又は多臓器系に影響し得る全身性疾患（例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性筋炎など）であり得る。非限定的な、代表的な自己免疫疾患には、自己免疫性リウマチ疾患（例えばＲＡ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎・皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎など）、自己免疫性胃腸及び肝障害（例えば炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病など）、血管炎（例えばチャーグ・シュトラウス血管炎を含むＡＮＣＡ陰性血管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎、ウェグナー肉芽腫症、及び顕微鏡的多発血管炎など）、自己免疫性神経障害（例えば多発性硬化症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発ニューロパチーなど）、腎障害（例えば糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びバージャー病など）、自己免疫性皮膚疾患（例えば乾癬、じんましん（urticaria、hives）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマト−デスなど）、血液障害（例えば血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば内耳疾患及び難聴など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、及び自己免疫性内分泌障害（例えば糖尿病関連自己免疫疾患、例えばインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、アジソン病、及び自己免疫性甲状腺疾患（例えばグレーブス病及び甲状腺炎）など）が含まれる。さらに好ましいこのような疾患には、例えばＲＡ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連脈管炎、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎、及び糸球体腎炎が含まれる。

「生体試料」とは、対象又は患者から得られた類似の細胞の集合を意味する。生体試料は、組織試料又は細胞試料であり得る。組織試料又は細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結及び／若しくは保存された臓器又は組織試料又は生検又は吸引物由来の固形組織；血液又は任意の血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；対象の妊娠期又は発生期の任意の時点からの細胞であり得る。生体試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組織培養物又は細胞培養物から入手することもできる。組織試料は、本来その組織と自然に混合しない、防腐剤、抗凝血剤、緩衝剤、定着剤、栄養剤、抗生物質などの化合物を含んでもよい。本明細書における生体試料の例には、腫瘍生検、循環性腫瘍細胞、血清又は血漿、循環性血漿タンパク質、腹水、腫瘍に由来する又は腫瘍様の性質を示す初代細胞培養又は細胞株、並びにホルマリン固定パラフィン包埋の腫瘍の細胞又は凍結された腫瘍の試料などの保存された腫瘍の試料が含まれるが、これらに限定されない。

用語「がん」及び「がん性」は、制御されない細胞成長／増殖を典型的な特徴とする、哺乳動物における生理状態を指す又は説明する。がんの例には、がん腫、リンパ腫（例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。このようながんのより具体的な例には、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃腸がん、膵臓がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん腫、唾液腺がん、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん腫、白血病及び他のリンパ増殖性障害、並びに様々な種類の頭頚部がんが含まれる。

用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分があるきげん供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。

抗体の「クラス」は、その重鎖に所有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２に、さらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

本明細書で用いられる用語「細胞傷害性剤」は、細胞の機能を阻害又は阻止し、かつ／又は細胞死又は破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤には、放射性同位体（例えばＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレーター剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びその断片；抗生物質；小分子毒素又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素などの毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含める）；及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤が含まれるが、これらに限定されない。

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変化する、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には以下が含まれる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化。

本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域が含まれる。ある実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書に別記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載の、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の順序で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

一般の用語「発現のレベル」又は「発現レベル」は、互換的に使用され、生体試料中のポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ、又はアミノ酸産物若しくはタンパク質の量を一般に指す。「発現」は、遺伝子コード情報が細胞中に存在し作動する構造に変換されるプロセスを一般に指す。従って、本発明によれば、遺伝子（例えばＯＸ４０遺伝子）の「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、又はタンパク質の翻訳後修飾を意味し得る。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたタンパク質、又は翻訳後修飾されたタンパク質の断片もまた、それらが選択的スプライシングにより生成された転写物又は分解された転写物に由来したものであろうと、例えばタンパク質分解によるタンパク質の翻訳後プロセシングに由来したものであろうと、発現したとみなされる。いくつかの実施態様において、「発現レベル」は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、イムノブロッティング（例えばウェスタンブロッティング）、免疫蛍光（ＩＦ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、又はフローサイトメトリーを用いて決定された、生体試料中のタンパク質（例えばＯＸ４０）の量を指す。

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」が含まれ、それらには、初代形質転換細胞、及び継代の数にかかわらずそれらに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同一の機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生される抗体のアミノ酸配列、又はヒト抗体のレパートリー若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に発生するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般に、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD, Vols. 1-3, 1991にあるサブグループである。ある実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のKabat et al.にあるサブグループカッパＩである。ある実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat et al.にあるサブグループＩＩＩである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。例えば非ヒト抗体などの抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

本明細書で用いられる用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、かつ／又は構造的に規定されたループを形成し（「超可変ループ」）、かつ／又は抗原に接触する残基を含む（「抗原コンタクト」）抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲ：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。本明細書における例示的なＨＶＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia et al. J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745, 1996）；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含めた、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。特に指示しない限り、本明細書では、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、上掲のKabat et al.に従って番号付けされる。

「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤が含まれるがこれに限定されない、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％又は９９％を上回る純度にまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説としては、例えばFlatman et al. J. Chromatogr. B. 848: 79-87, 2007を参照されたい。

「単離された」核酸とは、その自然の環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、その核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子が含まれるが、その核酸分子は、染色体外又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

「抗ＯＸ４０抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のこのような核酸分子、及び宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するこのような核酸分子が含まれる。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、例えば天然に発生する突然変異を含む又はモノクローナル抗体調製物の製造時に生じる、一般に少量存在する、当然存在し得る変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ／又は同一のエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含めるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部若しくは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製され得る。

参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチドの配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率と定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、一般に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用するなどの、当業者の技能範囲内にある様々な方法で得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは、使用者用書類とともに、米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）に提出され、米国著作権登録番号第ＴＸＵ５１００８７号の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）から一般に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のために、コンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。

ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況においては、所与のアミノ酸配列Ｂとの（to、with）又はそれに対する（against）所与のアミノ酸配列Ａ（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと又はそれに対しある程度の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）の％アミノ酸配列同一性は、次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、完全な一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同一でない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と同一でないことが理解されよう。特に指示しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して、直前の段落に記載されるようにして得られる。

特に指示しない限り、本明細書で使用される用語「ＯＸ４０」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＯＸ４０を指す。この用語は、「全長」の未加工のＯＸ４０、並びに細胞内においてプロセシングによって生じる任意の形態のＯＸ４０を包含する。この用語は、ＯＸ４０の天然に発生する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体をも包含する。例示的な全長ヒトＯＸ４０タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。例示的な全長ヒトＯＸ４０タンパク質のアミノ酸配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４３４８９の下で見出すことができる。

本明細書において、用語「に特異的に結合する」又は「に特異的な」は、生体分子を含む不均一な組成の分子の存在下で標的の存在の決定する、標的と抗体間の結合などの、測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、ある標的（例えば配列番号１のアミノ酸残基２６６−２７７のようなエピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するよりもより強い親和性（affinity、avidity）をもって、より迅速に、かつ／又はより長い期間、結合する抗体である。ある実施態様において、無関係な標的に対する抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、当該標的に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様において、標的に特異的に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施態様において、抗体は、異なる種由来の当該タンパク質の間で保存されている、タンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施態様において、特異的な結合には排他的な結合を含まれ得るが、これは必須ではない。

「対象」又は「個体」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある実施態様において、個体又は対象はヒトである。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原に対する抗体の結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に類似の構造を有し、それぞれのドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えばKindt et al. Kuby Immunology. 6^th ed., page 91, W.H. Freeman and Co., 2007を参照されたい。単独のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、ある特定の抗原に結合する複数の抗体は、その抗原に特異的に結合する１つの抗体に由来するＶＨ又はＶＬドメインを用いて、相補的なＶＬ又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることで、単離され得る。例えばPortolano et al. J. Immunol. 150: 880-887, 1993及びClarkson et al. Clarkson et al. Nature. 352: 624-628, 1991を参照されたい。

本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター並びに導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含有する。ある種のベクターは、それらが動作可能なように連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

ＩＩ．組成及び方法
本発明は、ＯＸ４０に結合する新規の抗体を提供する。本発明の抗体は、例えばＯＸ４０の存在又はＯＸ４０の発現レベル（例えば生体試料中の）を検出するのに有用である。

Ａ．例示的な抗ＯＸ４０抗体
本発明は、例えば診断用途（例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光（ＩＦ）、及びイムノブロット（例えばウェスタンブロット））に有用な抗ＯＸ４０抗体を提供する。ある例において、本発明は、ＯＸ４０のＣ末端エピトープ（例えば配列番号１のアミノ酸残基２６６−２７７）に結合する抗ＯＸ４０抗体を提供する。ＯＸ４０のエピトープは、立体構造依存又は立体構造非依存である様式で認識され得る。

いくつかの事例において、ＯＸ４０のアミノ酸残基２６６−２７７に結合する抗ＯＸ４０抗体には、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１から選択されたアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＨＶＲが含まれる。例えば、いくつかの事例において、抗ＯＸ４０抗体には、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３が含まれる。いくつかの事例において、抗ＯＸ４０抗体には、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３が含まれる。

抗ＯＸ４０抗体がＯＸ４０のアミノ酸残基２６６−２７７に結合し、かつ抗ＯＸ４０抗体に（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３が含まれるいくつかの事例において、抗ＯＸ４０抗体には、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）がさらに含まれる：（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；又は（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４。抗ＯＸ４０抗体がＯＸ４０のアミノ酸残基２６６−２７７に結合し、かつ抗ＯＸ４０抗体に（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３が含まれるいくつかの事例において、抗ＯＸ４０抗体は、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）がさらに含まれる：（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４。

抗ＯＸ４０抗体がＯＸ４０のアミノ酸残基２６６−２７７に結合するいくつかの事例において、抗体には、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３が含まれる。いくつかの事例において、これらの抗ＯＸ４０抗体には、以下のＦＲ：（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４が含まれており、かつ、追加的又は代替的に、（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｇ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｈ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４が含まれ得る。

いくつかの事例において、ＯＸ４０のアミノ酸残基２６６−２７７に結合する抗ＯＸ４０抗体には、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％）、少なくとも９０％（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、又は９４％）、若しくは少なくとも９５％（例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、又は配列番号１６のアミノ酸配列のＶＨ配列が含まれ得る。ある実施態様において、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列（配列番号１６）に対する置換（例えば保存置換）、挿入、又は欠損を有するが、その配列を含む抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０に結合する能力を保持する。ある実施態様において、合計１から１０のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸）が、配列番号１６中で、置換、挿入、及び／又は欠損されている。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠損は、ＨＶＲの外側の領域内（すなわちＦＲ内）で生じる。抗ＯＸ４０抗体には、配列番号１６のＶＨ配列が、その配列の翻訳後修飾を含め、含まれ得る。ある特定の実施態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択された１つ、２つ、又は３つのＨＶＲを含む。

いくつかの事例において、ＯＸ４０のアミノ酸残基２６６−２７７に結合する抗ＯＸ４０抗体には、配列番号１７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％（例えば少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％）、少なくとも９０％（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、又は９４％）、若しくは少なくとも９５％（例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶＬが含まれ得る。ある実施態様において、参照配列（配列番号１７）に対し少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、置換（例えば保存置換）、挿入、又は欠損を有するが、その配列が含まれる抗ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０に結合する能力を保持している。ある実施態様において、合計１から１０のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸）が、配列番号１７中で、置換、挿入、及び／又は欠損されている。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠損は、ＨＶＲの外側の領域内（すなわちＦＲ内）で生じる。抗ＯＸ４０抗体には、配列番号１７のＶＬ配列が、この配列の翻訳後修飾を含め、含まれ得る。ある特定の実施態様において、ＶＬは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択された１つ、２つ、又は３つのＨＶＲを含む。

いくつかの事例において、ＯＸ４０のアミノ酸残基２６６−２７７に結合する抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％（例えば少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％）、少なくとも９０％（例えば少なくとも９１％、９２％、９３％、又は９４％）、若しくは少なくとも９５％（例えば少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％）の配列同一性をそれぞれ有するＶＨ及びＶＬ配列の両方、又は配列番号１６及び１７のアミノ酸配列の配列をそれぞれ有するＶＨ及びＶＬ配列の両方を含み、かつ、それらの配列の翻訳後修飾を含んでも含まなくてもよい。

他の事例において、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの事例において、これらの抗ＯＸ４０抗体は、以下のＦＲを含む：（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４；（ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；（ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；（ｇ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び（ｈ）配列番号１５から選択されたアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４。例えばいくつかの実施態様において、抗ＯＸ４０抗体は、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列の配列をそれぞれ含むＶＨ及びＶＬ配列の両方を含み、かつ、翻訳後修飾を含んでも含まなくてもよい。

本発明は、例えば以下の重鎖及び軽鎖可変領域配列を有する、抗ＯＸ４０抗体ＳＰ１９７などの抗ＯＸ４０抗体を特徴とする。

重鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りである（ＨＶＲ配列に下線）：
QSLEESGGRLVAPGGSLTLTCTVSGIDLSSDNIQWVRQAPGKGLEWIGAVDYNNKPFYANWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCAKNTFSPWGPGTLVTVSS（配列番号１６）

軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りである（ＨＶＲ配列に下線）：
DPAMTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQSVYNANHLSWFQQKPGQPPKRLIYYISTPDSGVPPRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCAALNSDEVFTFGGGTEVVVK（配列番号１７）

いくつかの事例において、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、上述の抗ＯＸ４０抗体のいずれか１つ又は複数と、ＯＸ４０への結合について、競合する抗体である。いくつかの事例において、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、上述の抗ＯＸ４０抗体のいずれか１つ又は複数と、同一又は実質的に同一のエピトープへの結合について、競合する抗体である。

いくつかの事例において、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＯＸ４０抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む、モノクローナル抗体であり得る。ある実施態様において、抗ＯＸ４０抗体は、抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。他の実施態様において、抗体は、全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ抗体（例えばインタクトなＩｇＧ_１抗体）又は本明細書において定義される他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。

本発明の抗ＯＸ４０抗体は、下記の「実施例」により例示されるように生体試料におけるＯＸ４０の存在又は発現レベルの検出に有用であるが、治療用途のために使用又は適合され得ることも、理解されるべきである。

さらなる態様において、上記のいずれかの実施態様に記載の抗ＯＸ４０抗体は、以下のセクション１から５に記載されるように、任意の機能を単独又は組み合わせで組み込むことができる。

１．抗体親和性
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍから１０^−１３Ｍ、例えば１０^−９Ｍから１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。

ある実施態様において、Ｋｄは、以下のアッセイにより記述されるように、目的の抗体のＦａｂ型及びその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により、測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の滴定用の非標識抗原の存在下で最小濃度の（^１２５Ｉ）標識抗原によりＦａｂを平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体コートプレートに結合される抗原を捕獲することによって、測定される（例えばChen et al. J. Mol. Biol. 293: 865-881, 1999を参照）。アッセイの条件を確立するため、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コートされ、その後、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンで２時間から５時間室温（およそ２３℃）でブロックされる。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［^１２５Ｉ］抗原が、目的のＦａｂの段階希釈液と混合される（例えばPresta et al. Cancer Res. 57: 4593-4599, 1997における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで、目的のＦａｂが一晩インキュベートされる。ただし、インキュベーションは、平衡状態に達したことを確実にするため、より長時間（例えば約６５時間）継続してもよい。その後混合物は、室温でのインキュベーション（例えば１時間）のために、捕獲プレートに移される。次いで溶液が除去され、プレートがＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０^ＴＭ）で８回洗浄される。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０^ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）が添加され、プレートがＴＯＰＣＯＵＮＴ ＴＭγ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数される。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合結合アッセイで使用するために選択される。

別の実施態様によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を、２５℃において、〜１０反応単位（ＲＵ）に固定された抗原ＣＭ５チップと共に用いる、表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ社）が、供給業者の指示書に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原は、連結されたタンパク質が約１０反応単位（ＲＵ）に達する流速５μｌ／分における注入に先立って、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（−０．２μＭ）に希釈される。抗原の注入に続いて、１Ｍのエタノールアミンが、未反応基をブロックするために注入される。速度論的な測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）が、２５℃、約２５μｌ／分の流速で、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０^ＴＭ）界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に注入される。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることにより、算出される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として算出される。例えばChen et al. J. Mol. Biol.293: 865-881, 1999を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を上回る場合、会合速度は、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ^ＴＭ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を漸増濃度の抗原の存在下で測定する、蛍光消光技術を用いることにより、決定することができる。

２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、並びに下記の他の断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134, 2003を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えばPluckthun. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Vol. 113, pp. 269-315, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, 1994を参照；国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。

ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al. Nat. Med. 9: 129-134, 2003；及びHollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448, 1993を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134, 2003に記載されている。

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社、ウォルサム、マサチューセッツ州；例えば米国特許第６２４８５１６号を参照）。

抗体断片は、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク質分解並びに組換え宿主細胞（例えば大腸菌又はファージ）による生産が含まれるがこれらに限定されない様々な技術により、作製することができる。

３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書に記載の抗体は、キメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 6851-6855, 1984に記載されている。ある例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類由来の可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから改変されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。

ある実施態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化されているが、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持している。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ例えばＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又は部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部を含み得るであろう。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。

ヒト化抗体及びそれらを作成する方法は、例えばAlmagro et al. Front. Biosci. 13: 1619-1633, 2008で総説されており、例えばRiechmann et al. Nature. 332: 323-329, 1988;Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 10029-10033, 1989；米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号及び第７０８７４０９号；Kashmiri et al. Methods. 36: 25-34, 2005（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記載）；Padlan. Mol. Immunol. 28: 489-498, 1991（「再表面化」を記載）；DaU’Acqua et al. Methods. 36: 43-60, 2005（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにOsbourn et al. Methods 36: 61-68, 2005及びKlimka et al. Br. J. Cancer. 83: 252-260, 2000（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択（guided selection）」アプローチを記載）で、さらに記載されている。

ヒト化のために用いられ得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域（例えばSims et al. J. Immunol. 151: 2296, 1993を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えばCarter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4285, 1992；及びPresta et al. J. Immunol. 151: 2623, 1993を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えばAlmagro et al. Front. Biosci. 13: 1619-1633, 2008を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えばBaca et al. J. Biol. Chem. 272: 10678-10684, 1997及びRosok et al. J. Biol. Chem. 271: 22611-22618, 1996を参照）が含まれるが、これらに限定されない。

４．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の１つはＯＸ４０に対してであり、その他は他の抗原に対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＯＸ４０の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、ＯＸ４０を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化させるために用いられることもあり得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

多重特異性抗体を作製する技術には、異なる特異性を有する２組のイムノグロブリン重鎖の組換え共発現（Milstein et al. Nature. 305: 537, 1983；国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al. EMBO J. 10: 3655, 1991を参照）、及び「ノブ−イン−ホール」エンジニアリング（例えば米国特許第５７３１１６８号を参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；１つ又は複数の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al. Science. 229: 81, 1985を参照）；二重特異性抗体を生産するためにロイシンジッパーを用いること（例えばKostelny et al. J. Immunol. 148(5): 1547-1553, 1992を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を用いること（例えばHollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 6444-6448, 1993を参照）；及び１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）の二量体を用いること（例えばGruber et al. J. Immunol.152: 5368, 1994を参照）；及び例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60, 1991に記載されるように三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。

「オクトパス抗体」を含める３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も、本明細書に含まれる（例えば米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号を参照）。

本明細書中の抗体又は断片には、ＯＸ４０及び別の異なる抗原（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照）に結合する抗原結合部位を含む、「二重作用（Dual Acting）Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」も含まれる。

５．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が、企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが、望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製され得る。このような改変には、例えば抗体のアミノ酸配列中の残基からの欠損、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換が含まれる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有していることを条件として、最終コンストラクトに到達するために、欠損、挿入、及び置換の任意の組み合わせがなされ得る。

ａ）置換、挿入、及び欠損変異体
ある実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸置換を伴う抗体変異体が提供される。置換的変異の目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表１に示す。より実質的な改変は、「例示的置換」の見出しで表１に示し、アミノ酸側鎖のクラスに関してその下でさらに説明する。アミノ酸置換は、目的の抗体、及び所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされたその産物に導入することができる。

表１．例示的な好ましいアミノ酸置換

アミノ酸は、以下の共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１クラスのメンバーを、別のクラスのものに交換することを必然的に伴う。

ある種の置換的変異体は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる研究のために選択された結果として生じる変異体は、親抗体と比較して、ある種の生物学的特性における改変（例えば改善）を有し（例えば向上した親和性、低下した免疫原性）、かつ／又は親抗体のある種の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は、例えば本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔に言えば、１つ又は複数のＨＶＲ残基が変異させられ、変異体抗体がファージ上に表示され特定の生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。

改変（例えば置換）は、ＨＶＲにおいて、例えば、抗体の親和性を向上させるために行われ得る。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基（例えばChowdhury. Methods Mol. Biol. 207: 179-196, 2008を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行われることがあり、結果として得られる変異体ＶＨ又はＶＬが、結合親和性について試験される。二次ライブラリーから構築し再選択することによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. Methods in Molecular Biology. 178: 1-37、O’Brien et al. eds., Human Press, Totowa, NJ, 2001に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施態様において、多様性が、様々な方法（例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば一度に４−６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを用いて、特異的に同定されることがあり得る。特にＨＶＲ−Ｈ３及びＨＶＲ−Ｌ３は、しばしば標的化される。

ある実施態様において、置換、挿入又は欠損は、これらの改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ又は複数のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば本明細書において提供される保存的置換）は、ＨＶＲ内で行われることがあり得る。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記で提供された変異体ＶＨ又はＶＬ配列のある実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含む。

変異誘発のために標的化してもよい抗体の残基又は領域を同定するためのある有用な方法は、Cunningham et al. Science. 244: 1081-1085, 1989に記載の「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）により置換される。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の接点を同定するための抗原抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的化されてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するために、スクリーニングされ得る。

アミノ酸配列挿入物は、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドの長さに及ぶアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合体、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を延長させる酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物が含まれる。

ｂ）グリコシル化変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠損は、１つ又は複数のグリコシル化部位が創出又は削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成することができる。

抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに付着する炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に付着した分枝状の二分枝オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH. 15: 26-32, 1997を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分枝オリゴ糖構造の「幹」におけるＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、ある種の改善された特性を有する抗体変異体を作製するためになされ得る。

ある実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）付着するフコースを欠損する炭水化物構造を有して提供される。例えばそのような抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着する全ての糖構造（例えば複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対し、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７はＦｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体の軽微な配列変異に起因して、２９７位のおよそ±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち２９４位から３００位に位置する場合もあり得る。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば米国特許公報第２００３／０１５７１０８号及び第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249, 2004；及びYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004が含まれる。脱フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃｌ３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545, 1986：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びアルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614, 2004；Kanda et al. Biotechnol. Bioeng. 94(4): 680-688, 2006；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）などの、ノックアウト細胞株が含まれる。

抗体変異体は、例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分される二分オリゴ糖を伴って、さらに提供される。そのような抗体変異体は、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号；米国特許第６６０２６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記載されている。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に、少なくとも１のガラクトース残基を持つ抗体変異体も、提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記載されている。

ｃ）Ｆｃ部位変異体
ある実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される発明（例えばＳＰ１９７）の抗ＯＸ４０抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）の配列を含み得る。

ある実施態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補に、抗体変異体をならしめる、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変異体を企図している。ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／喪失を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイが実施され得る。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイが、抗体が、ＦｃｙＲ結合を欠く（それ故おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にするために実施され得る。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ及びＦｃｙＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch et al. Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492, 1991の４６４頁の表３に総説されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 7059-7063, 1986；Hellstrom et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 82: 1499-1502, 1985；及びBruggemann et al. J. Exp. Med. 166: 1351-1361, 1987に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マジソン、ウィスコンシン州）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:652-656, 1998に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価されることがあり得る。抗体がＣ１ｑに結合できないこと、従ってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが実行されることがあり得る。例えば国際公開第２００６／０２９８７号及び国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えばGazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods. 202: 163, 1996；Cragg et al. Blood. 101: 1045-1052, 2003；及びCragg et al. Blood 103: 2738-2743, 2004を参照）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の測定も、当分野で周知の方法を用いて行うことができる（例えばPetkova et al. Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769, 2006を参照）。

エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体（米国特許第７３３２５８１号）を含めた、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有する、Ｆｃ突然変異体が含まれる。

ＦｃＲへの結合を改善又は減少させたある種の抗体変異体が記載されている。例えば米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号；及びShields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604, 2001を参照されたい。

ある実施態様において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。

いくつかの実施態様において、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol.164: 4178-4184, 2000に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）改変される（すなわち改善又は低減される）結果となる、Ｆｃ領域における改変がなされる。

半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う（Guyer et al. J. Immunol. 117: 587,1976及びKim et al, J. Immunol. 24: 249, 1994）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体は、米国特許出願番号第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ又は複数における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものが含まれる。Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan et al. Nature.322:738-740, 1988；米国特許第５６４８２６０号及び第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。

ｄ）システイン改変抗体変異体
ある実施態様において、システイン改変抗体、例えば抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「チオＭａｂ」を作製することが望ましいことがある。特定の実施態様において、置換される残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、抗体を薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分にコンジュゲートさせ、本明細書中でさらに記載されるように免疫コンジュゲートを作製するために使用することができる。ある実施態様において、次の残基のいずれか１つ又はそれ以上がシステインと置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。

ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本発明の抗ＯＸ４０抗体（例えばＳＰ１９７）は、当技術分野で周知であり容易に入手可能である、追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されることがあり得る。抗体の誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中における安定性故に、製造上の利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であってよく、かつ分枝状又は非分枝状でもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してもよく、１を超えるポリマーが付着する場合、それらは同一か又は異なる分子であってよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が定義された条件下の治療に使用されるかどうかなどが含まれるが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。

他の実施態様において、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。ある実施態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 11600-11605, 2005）。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近傍の細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含むが、これに限定されない。

Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されるような組換え方法及び組成物を用いて製造され得る。ある実施態様において、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体（例えばＳＰ１９７）をコードする、単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。さらなる実施態様において、そのような核酸を含む１つ又は複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。ある実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニのベクター。ある実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳＯ、Ｓｐ２０細胞）である。ある実施態様において、抗ＯＸ４０抗体を作製する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件において上述のような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び必要に応じて宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む。

抗ＯＸ４０抗体（例えばＳＰ１９７）の組換え生産のために、例えば上述のように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載される原核生物細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、抗体は細菌内で作製され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照されたい。大腸菌における抗体断片の発現について記載している、Charlton. Methods in Molecular Biology. Vol. 248, pp. 245-254, B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003も参照されたい。発現の後、抗体は、可溶性画分における細菌の細胞ペーストから単離され、さらに精製され得る。

原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、これらには、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体が産生されることになる、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌株及び酵母株が含まれる。Nat. Biotech. 22: 1409-1414, 2004及びLi et al. Nat. Biotech. 24: 210-215, 2006を参照されたい。

グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。

植物細胞培養物は、宿主として利用され得る。例えば米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号、及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ^ＴＭ技術を記載）を参照されたい。

脊椎動物細胞もまた、宿主として用いられ得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えばGraham et al. J. Gen Virol. 36:59、1977に記載の２９３細胞又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えばMather. Biol. Reprod. 23:243-251、1980に記載のＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）；例えばMather et al. Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞が挙げられる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ”ＣＨＯ細胞を含めるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4216, 1980）；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体作製に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えばYazaki et al. Methods in Molecular Biology. Vol. 248, pp. 255-268, B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003を参照されたい。

Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＯＸ４０抗体は、当分野で周知の様々なアッセイによって同定することができ、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニング又は特徴づけすることができる。

１．結合アッセイ及びその他のアッセイ
ある態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどの周知の方法により、その抗原結合活性について、試験される。

別の態様において、ＯＸ４０への結合について、本明細書に記載される抗体のいずれか１つ（例えば抗ＯＸ４０抗体ＳＰ１９７）と競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。ある実施態様において、このような競合する抗体は、本発明の抗体のいずれか１つ（例えば抗ＯＸ４０抗体ＳＰ１９７）に結合される同一のエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法が、Morris “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology Vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ, 1996）において提供されている。

例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたＯＸ４０は、ＯＸ４０に結合する第一の標識された抗体（例えば抗ＯＸ４０抗体ＳＰ１９７）、及びＯＸ４０への結合について第一の抗体と競合する能力について試験される第二の標識されていない抗体を含む溶液中で、インキュベートされる。第二の抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。コントロールとして、固定化されたＯＸ４０は、第一の標識された抗体を含むが、第二の標識されていない抗体を含まない溶液中で、インキュベートされる。第一の抗体がＯＸ４０に結合することを許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合の抗体が除去され、固定化されたＯＸ４０に結合した標識の量が測定される。固定化ＯＸ４０に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗体が、ＯＸ４０への結合において第一の抗体と競合していることを示している。例えばHarlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual. Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988)を参照されたい。

２．検出アッセイ
ある態様では、アッセイは、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）又は免疫蛍光（ＩＦ）において、ＯＸ４０の存在を検出すのに有用な抗ＯＸ４０抗体を同定するために提供される。ある実施態様において、本発明の抗体は、そのような活性について試験される。

Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明は、放射性同位体などの、１つ又は複数の標識及び／又は薬剤に結合される、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。

ある実施態様において、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が、放射性コンジュゲートの製造のために入手可能である。例には、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性コンジュゲートが検出のために用いられる場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄などを含み得る。

抗ＯＸ４０抗体と標識若しくは薬剤とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダート塩酸）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは標識又は薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）が使用され得る。

本明細書に記載のイムノコンジュゲートは、市販（例えばＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国より）の、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）等が含まれるがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明示的に企図しているが、これらに限定されない。

Ｅ．診断及び検出のための方法、キット及び組成物

ある実施態様において、本明細書において提供される抗ＯＸ４０抗体は、生体試料中のＯＸ４０の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出（する）」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。

ある事例において、診断又は検出の方法に使用するための抗ＯＸ４０抗体（例えばＳＰ１９７）が提供される。例えばある事例において、生体試料におけるＯＸ４０の存在を検出する、下記のような方法が提供される。ある実施態様において、方法は、抗ＯＸ４０抗体がＯＸ４０に結合することを許容する条件下で、本明細書に記載される抗ＯＸ４０抗体を生体試料に接触させること、及び抗ＯＸ４０抗体とＯＸ４０との間で複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法であってよい。本発明の抗ＯＸ４０抗体（例えばＳＰ１９７）は、例えば免疫アッセイにおいて用いることができ、これには、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）免疫組織化学（ＩＦ）、免疫ブロッティング（例えばウェスタンブロッティング）、フローサイトメトリー、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。ある実施態様において、抗ＯＸ４０抗体は、例えばＯＸ４０が患者の選択のためのバイオマーカーであるところのがん免疫療法を伴う、療法に適した対象を選択するために用いられる。

ある事例において、標識された抗ＯＸ４０抗体が提供される。標識には、直接検出される標識又は部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識及び放射性標識など）、並びに例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される、酵素又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。代表的な標識には、ラジオアイソトープ^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン若しくはその誘導体などの蛍光体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）などのルシェフェラーゼ、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの糖オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどのヘテロサイクリックオキシダーゼ、過酸化水素を利用して色素前駆体を酸化する酵素（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼなど）と結合したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれるが、これらに限定されない。

ある事例において、本明細書に記載の抗ＯＸ４０抗体は、ヒト組織試料におけるヒトＯＸ４０の発現を免疫組織化学的に検出するためのキットの一部分である。ある実施態様において、キットには、本明細書に記載の抗体及び検出試薬のセットが含まれている。検出試薬には、抗ＯＸ４０抗体に結合することができる抗体（「二次抗体」と呼ばれる）、二次抗体に連結されるか又は連結されるよう適合された酵素を含める検出可能な実体、及び試料上に色素原又は蛍光体を沈着させる酵素に反応性がある試薬が含まれる。ある実施態様において、二次抗体は、一次抗体が由来する特異的な動物種由来のイムノグロブリンに親和性を有する（「種特異的二次抗体」と呼ぶ）。別の実施態様において、二次抗体は、一次抗体の一次アミノ酸配列中に位置するエピトープタグ、又は一次抗体の反応性側鎖に連結するハプテンなどの、一次抗体に組み入れられたタグに反応性である。別の実施態様において、酵素は、シグナル増幅器を経て、二次抗体に連結される。ＩＨＣのためのシグナル増幅法は、当分野における通常の技能の１つとして知られている。いくつかの実施例において、シグナル増幅には、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ^ＴＭ）としても知られる触媒レポーター沈着法（ＣＡＲＤ）が含まれる。この方法の変法においては、酵素が結合した二次抗体（ＨＲＰコンジュゲート二次抗体など）が、一次抗体に結合する。次に、ＨＲＰ酵素と相互作用する際におそらくフリーラジカルになる、ビオチン化チラミドの基質（チラミンは４−（２−アミノエチル）フェノールである）が用いられる。フェノール系ラジカルは、次いで周囲の物質と素早く反応し、近傍にビオチンを沈着又は固定させる。このプロセスは、さらなる基質（ビオチン化チラミド）を与え、さらに局在化されたビオチンを増大させることにより、繰り返される。最後に、「増幅された」ビオチン沈着物が、蛍光分子に付着したストレプトアビジンで検出される。代替的に、増幅されたビオチン沈着物は、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体で検出することができ、これは次いでＤＡＢと接触されて、褐色の色を生成する。他の例において、シグナル増幅には、試料に結合される一次抗体の部位又はその近傍においてＨＱを沈着するために十分な条件下で、試料をＨＲＰコンジュゲート三次抗体と接触させた後に、試料を過酸化水素及びチラミドＨＱコンジュゲートに接触させることが含まれる。試料は、次いで、ＨＱに特異的に結合する酵素コンジュゲート抗体（ＨＲＰコンジュゲート抗体又はＡＰコンジュゲート抗体）に接触させられる。いくつかの例において、この酵素コンジュゲート抗体は、ＨＲＰコンジュゲート三次抗体と同一である。他の例において、酵素コンジュゲート抗体は、ＨＲＰコンジュゲート三次抗体と異なる抗体である。試料は、次いで、酵素の存在下、検出可能な反応生成物を生産する１つ又は複数の試薬に接触させられる。いくつかの例において、試料は、ＨＲＰの存在下で視覚的に検出可能な産物を生産する、ＨＲＰ基質（過酸化水素など）及び発色原（ＤＡＢなど）に接触させられる。いくつかの例において、シグナル増幅は、ＶＥＮＴＡＮＡ ＯｐｔｉＶｉｅｗ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号７６０−０９９）を用いて、実行される。

診断及び／又は検出のための上述の方法のいずれかが、非コンジュゲート抗ＯＸ４０抗体に代わって、又は加えて、本発明の免疫コンジュゲートを用いて実行されてよいこともまた、理解されるべきである。

Ｆ．生体試料
ある事例において、本発明の抗ＯＸ４０抗体（例えばＳＰ１９７）は、当領域で周知の方法又は本明細書に記載の方法を用いて、生体試料におけるＯＸ４０の存在を検出するために用いることができる。

いくつかの事例において、生体試料には、組織試料又は細胞試料が含まれる。例えば生体試料には、正常患者又はがんの患者由来の細胞又は組織、例えば乳の正常組織及びがんの組織、大腸、結腸、腎臓、骨、脳、筋肉、胃、膵臓、膀胱、卵巣、子宮、並びに心臓、胚、及び胎盤組織などが含まれ得る。

ある事例において、組織試料又は細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された、かつ／又は保存された臓器又は組織試標本又は生検又は吸引液由来の固形組織；血液又はあらゆる血液成分；脳脊髄液、羊水、腹膜液などの体液、又は間質液；対象の妊娠期又は発生期の任意の時点からの細胞であってよい。いくつかの実施態様において、生体試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組織培養物又は細胞培養物から得られる。本明細書における生体試料の例には、腫瘍生検、循環性腫瘍細胞、血清又は血漿、循環性血漿タンパク質、腹水、腫瘍に由来するか又は腫瘍様の性質を示す初代細胞培養又は細胞株、及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）の腫瘍の試料又は凍結された腫瘍の試料などの保存された腫瘍の試料が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施態様において、生体試料は、本質的に組織と自然に混在しない化合物、例えば防腐剤、抗凝血剤、緩衝剤、栄養剤、抗生物質などを含む。ある実施態様において、生体試料は、１つ又は複数の定着剤に露出されている、かつ／又は１つ又は複数の定着剤を含有する。本発明の方法及び組成に用いることができる定着剤には、ホルマリン、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、酢酸、エタノール、アセトン、ピクリン酸、クロロホルム、二クロム酸カリウム及び塩化水銀、及び／又はマイクロ波加熱又は凍結による安定化が含まれる。

いくつかの実施態様において、生体試料は、自己免疫疾患に罹患しているか、自己免疫疾患に罹患しやすいか、又は自己免疫疾患について検査中である対象由来である。ある実施態様において、自己免疫疾患は、自己免疫性リウマチ疾患（例えばＲＡ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎・皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、及び乾癬性関節炎など）、自己免疫性胃腸及び肝障害（例えば炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病など）、血管炎（例えばチャーグ・シュトラウス血管炎を含むＡＮＣＡ陰性血管炎及びＡＮＣＡ関連血管炎、ウェグナー肉芽腫症、及び顕微鏡的多発血管炎など）、自己免疫性神経障害（例えば多発性硬化症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び自己免疫性多発ニューロパチーなど）、腎障害（例えば糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、及びバージャー病など）、自己免疫性皮膚疾患（例えば乾癬、じんましん（ｕｒｔｉｃａｒｉａ、ｈｉｖｅｓ）、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマト−デスなど）、血液障害（例えば血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば内耳疾患及び難聴など）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、及び自己免疫性内分泌障害（例えば糖尿病関連自己免疫疾患、例えばインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、アジソン病、及び自己免疫性甲状腺疾患（例えばグレーブス病及び甲状腺炎）など）である。

他の実施態様において、試料は、がんに罹患しているか、がんに罹患しやすいか、又はがんについて検査中である対象由来である。ある実施態様において、がんとは、がん腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含める）、芽細胞腫、肉腫、白血病、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化器がん、膵がん、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん腫、唾液腺がん腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん、白血病、リンパ増殖性疾患、又は様々なタイプの頭頸部がんである。特定の実施態様において、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膀胱がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、卵巣がん、結腸直腸がん、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、及び悪性黒色腫から選択される。

ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解されるべきである。

実施例１．抗ＯＸ４０抗体の生成
抗ＯＸ４０ウサギモノクローナル抗体は、図１で模式的に示すようにして生成した。簡潔には、アミノ酸残基２６６−２７７のペプチド断片が合成された。免疫化を意図した１２アミノ酸断片が、抗体産生を介する実質的な免疫応答を刺激するためのキャリアタンパク質として広く用いられる、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートされた。ニュージーランド白ウサギが、完全フロイントアジュバントで乳化されたＫＬＨコンジュゲートＯＸ４０抗原、続いて不完全フロイントアジュバントで乳化された一連のＯＸ４０抗原ブースターにより免疫化された。抗体を発現する細胞は、ＯＸ４０を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングされた。全てのＥＬＩＳＡ陽性クローンは、免疫組織化学（ＩＨＣ）により、さらにスクリーニングされ、最も高い特異性を有する抗体を生産するクローンが選択された。抗ＯＸ４０抗体の組換え生産のため、抗体の重鎖配列と軽鎖配列をコードするｃＤＮＡがクローンされ、共トランスフェクションにより発現され、そして、ＩＨＣによりＯＸ４０への結合について、スクリーニングされた。抗ＯＸ４０モノクローナル抗体ＳＰ１９７は、これらの方法により生産され、次いでプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。ＳＰ１９７抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の配列は、以下の通りである。

重鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（ＨＶＲ配列に下線）：
QSLEESGGRLVAPGGSLTLTCTVSGIDLSSDNIQWVRQAPGKGLEWIGAVDYNNKPFYANWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCAKNTFSPWGPGTLVTVSS（配列番号１６）

軽鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（ＨＶＲ配列に下線）：
DPAMTQTPSSTSAAVGGTVTINCQSSQSVYNANHLSWFQQKPGQPPKRLIYYISTPDSGVPPRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCAALNSDEVFTFGGGTEVVVK（配列番号１７）

実施例２．抗ＯＸ４０抗体の診断用途
コントロール細胞及びＦＦＰＥ組織における、ウサギ抗ヒトＯＸ−４０モノクローナル抗体（ＳＰ１９７）の特異的な免疫組織化学（ＩＨＣ）染色が、示されている。ＩＨＣは、ＳｔｄＣＣ１細胞をｕｌｔｒａＶｉｅｗユニバーサルＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ツーソン、アリゾナ州）で調整して用いることで、実施された。一次抗体は、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ ＵＬＴＲＡ自動スライド染色機（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ツーソン、アリゾナ州）において、１６分、３７℃でインキュベートされた。結果は図に示されている。（Ａ）モック細胞（ネガティブコントロール細胞）；（Ｂ）ＯＸ−４０をトランスフェクトされた細胞（ポジティブコントロール細胞）；（Ｃ）反応性リンパ節；及び（Ｄ）前立腺がん。強い膜の染色が、ポジティブコントロール細胞（Ｂ）、並びに反応性リンパ節及び前立腺がんにおいて活性化されたＴ細胞で見られた。

その他の実施態様
前述の発明は、理解を明確にする目的のために、図及び例を通してある程度詳細に説明されているが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

Claims (17)

1. 以下のＨＶＲ(超可変領域)：
   （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
   （ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；
   （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
   （ｄ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
   （ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
   （ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
   を含み、ＯＸ４０に特異的に結合する、単離された抗体であって、
   以下の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインＦＲ（フレームワーク領域）：
   （ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
   （ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
   （ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；
   （ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４；
   （ｅ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
   （ｆ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
   （ｇ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
   （ｈ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
   をさらに含む、抗体。
2. 配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号１７のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の抗体。
3. モノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
4. モノクローナル抗体がウサギモノクローナル抗体である、請求項３に記載の抗体。
5. 抗体がＩｇＧ抗体である、又は抗体がＯＸ４０に特異的に結合する抗体断片であって抗体断片が、Ｆａｂ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２及びダイアボディからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体。
6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の単離された抗体をコードする、単離された核酸。
7. 請求項６に記載の核酸を含むベクター。
8. 請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
9. 請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体を含むイムノコンジュゲート。
10. 請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体に生体試料を接触させること、及び結合した抗体の存在を検出することを含む、生体試料中のＯＸ４０の存在又は発現レベルを検出する方法。
11. 検出がＩＨＣ、ＩＦ又はイムノブロットによる、請求項１０に記載の方法。
12. 試料が固定された組織を含み、固定された組織がＦＦＰＥ組織である、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 試料が、がん又は自己免疫疾患に罹患しているか、罹患しやすい対象由来である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体を含む溶液を含む、自動スライド染色機用の分注器。
15. メモリー及びコンピュータープロセッサーを含む自動スライド染色機であって、メモリーが、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体を用いて組織試料を標識するための自動スライド染色機の運転を制御するためのプロセッサーに指示するための指示書を含む、自動スライド染色機。
16. 請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体を含むキット。
17. 請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体を含む、生体試料中のＯＸ４０の存在又は発現レベルを検出するための薬剤。

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