WO2015099513A1 - 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터 - Google Patents

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WO2015099513A1
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김정섭
윤성태
곽희천
오미숙
이수민
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재단법인 목암생명공학연구소
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Definitions

  • the present invention relates to an expression vector having increased gene expression capacity, a cell transformed with the expression vector, and a method for mass production of a target protein using the transformed cell.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Production of therapeutic recombinant proteins and antibodies is mostly done using animal cells, and efforts are being made to increase the efficiency of the system.
  • high-productivity cell lines express about 30 to 80 pcd without gene amplification, and are mainly based on matrix attachment sites (MAR) or similar ubiquitous chromat in opening element (UCOE) factors. High-producing vectors are used to produce highly productive cell lines within 4 months.
  • MAR matrix attachment sites
  • UCOE ubiquitous chromat in opening element
  • Another object of the present invention to provide a cell transformed using the expression vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for mass production of a target protein using the transformed cells.
  • the present invention provides a cell transformed by the expression vector.
  • the present invention provides a method for producing a large amount of the target protein by culturing the transformed cells. Since the expression vector according to the present invention shows a very good gene expression ability compared to the conventional expression vector, it is possible to significantly increase the protein expression of foreign genes. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The above and other objects and features of the present invention will become apparent from the following description of the invention in conjunction with the accompanying drawings:
  • FIG. 1 illustrates a luciferase vector diagram of MAR candidate factors.
  • Figure 2 shows the luciferase expression results of MAR candidates.
  • Figure 3 shows the luciferase expression results of the promoter comparison test.
  • 4 shows a luciferase vector schematic of locus control region (LCR) candidate factors.
  • Figure 5 shows the PCR strategy for the production of Alb E6 X 4 LCR factor.
  • 6 and 7 show the luciferase expression results of LCR candidate factors.
  • Figure 8 shows the manufacturing process of the delet ion form of human complement factor H (dCFH).
  • 11 shows dCFH expression levels in CH0-DG44 stabilized cells.
  • 12 and 13 show a schematic diagram of the FIX expression vector set 1 and the result of FIX expression amount thereof, respectively.
  • Figure 16 shows a restriction map of Puromycin expression system.
  • FIG. 17 shows the structures of the novel vector pairs pMS-P-MCS and pMS-D-MCS, respectively.
  • 18A and 18B show the structure of novel vector pair l (pMS-P-ER2LC and PMS-D-ER2HC) for expression of ER2 antibody and MAR vector pair (pMSGneo_ER2LC and pMSGneo-ER2HC), respectively.
  • Figure 19 shows the structure of novel vector pair 2 (pMSI-P-ER2LC and PMSI-D-ER2HC) for ER2 antibody expression.
  • 20A and 20B show the structure of promoter vector (pS) pairs (pS-P-ER2LC and PS-D-ER2HC); and intron vector (pSI) pairs (pSI_P_ER2LC and pSI-I) -ER2HC, respectively.
  • pS promoter vector
  • pSI intron vector
  • 21A and 21B show ER2 in CHOKl and DG44 cells, CH0 adherent cell lines, respectively. The amount of antibody expression is shown.
  • various MAR factors and scaffold attachment region (SAR) factors to produce expression vectors with stable and improved production efficiency when foreign genes are expressed in CHO (chinese hamster ovary) cells, etc.
  • Locus control region (LCR) factors and intron factors were selected to increase gene expression.
  • the SV40 simi an virus 40
  • SAR or MAR factor
  • it provides an expression vector comprising a chimeric intron.
  • Promoter 'in the present invention means a non-ready nucleic acid sequence upstream of the coding region, including a binding site for the polymerase and having a transcription initiation activity of the promoter lower gene to m NA.
  • Promoter means a non-ready nucleic acid sequence upstream of the coding region, including a binding site for the polymerase and having a transcription initiation activity of the promoter lower gene to m NA.
  • RNA polymerase includes a TATA box or a TATA box-like region that plays a role in initiating transcription, but is not necessarily limited to before and after these regions, in addition to this region, proteins other than RNA polymerase for expression regulation. It may also include the area necessary for this association.
  • the promoter may include an SV40 promoter or a variant thereof, and preferably, the SV40 promoter represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the variant of the promoter refers to a variant in which a part of the promoter sequence is added, deleted, or substituted to increase gene expression.
  • the expression vector of the present invention exhibits about 4 times better expression amount synergy compared to the CMV promoter by using the SV40 promoter (see Example 1-1).
  • the promoter expresses its expression in a target gene, which is a foreign gene. It is operably linked to induce wherein "operably linked” refers to a functional link between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest to perform a general function. Operative linkage with recombinant vectors can be accomplished using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation employs enzymes or the like generally known in the art. In the present invention, in order to select a gene expression factor, it may include a SAR or MAR factor.
  • the SAR or MAR factor may be the 5 'end of the promoter; 3 'end; Or it may be included to be present together at the 5 'and 3' end to constitute an expression vector.
  • MAR factor means a DNA sequence that temporarily attaches a transcriptionally active DNA loop domain to a nuclear matrix (Pienta et al., (1991) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expres., 1: 355-385), examples of MAR sequences are known in the art.
  • human beta globin MAR (Yu, J., Bock, JH, Slightom, JL and Vi 1 leponteau, B., Gene 139 (2), 139-145 (1994), Luciferase for Genbank NO.L22754) and human CSP-B gene flanking SAR (Hanson, RD and Ley, TJ, Blood, 79 (3), 610-618 (1992), Genbank NO.M62716) Dual (5 'and 5' + 3 '), and cis + trans related tests were performed using lucif erase assay, resulting in the selection of preferred factors (see Example 1-1).
  • the SAR or MAR factor is a human CSP-B SAR, a SAR represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39, a MAR2.2 represented by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40 isolated from human beta globin MAR, or a base of 41 It may be MAR3.0 represented by the sequence.
  • the SAR or MAR factors may be included to be present together at the 5 'end, 3' end, or 5 'and 3' end of the promoter. According to one embodiment of the invention, it is referred to as 5 'MAR2.2, 5' MAR3.0, 3 'MAR2.2, 3' MAR3.0, 5'3 'MAR2.2 or 5'3' MAR3.0 May be factored out.
  • the expression vector according to the present invention may include chimeric introns to increase gene expression.
  • the chimeric intron may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25 (Baddiwal, G., Hildinger, M., Chenuet, S., Wulhfard, S., De Jesus, M., Wurm, FM, Nucleic Acids Res , 36 (15), e96 (2008), Genbank NO.JQ795930), but the present invention is not limited thereto.
  • the luciferase analysis was performed using the chimeric intron factor to confirm the effect of increasing gene expression (see Examples 1-3).
  • an expression vector including a MAR factor and a chimeric intron factor synergistic effects may be exhibited in the productivity part, thereby increasing the amount of gene expression (see Example 3-3 and Table 9).
  • novel vector pair 2 (pMSI 'P-ER2LC and pMSI-D_ER2HC) comprising a MAR factor, SV promoter and chimeric introns, existing promoter vectors, intron vectors, and chimeric introns
  • the expression vector according to the present invention may further comprise an LCR factor.
  • Preferred LCR factor in the present invention is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15
  • the expression vector according to the present invention can be inserted into the target gene whose expression is controlled by the promoter.
  • the target gene may be a gene encoding a foreign product to be expressed, and may be a gene encoding all kinds of proteins expressible as recombinant proteins.
  • This gene of interest includes a "multiple cloning site” (MCS), a nucleic acid sequence into which a restriction enzyme cleavage site has been introduced for insertion into the vector.
  • MCS multiple cloning site
  • the target gene may include a blood coagulation-related gene and various antibody genes.
  • the FVlKfactor VII gene, the FVIII gene, the Factor IX gene, and the epidermal growth factor receptor family factor receptor family) antibody genes insulin genes, cytokines (interleukin, tumor necrosis factor, interferon, colony stimulating factor, chemokine) gene, erythropoietin gene, ⁇ -fetoprotein gene, ⁇ -glucosidase gene, ⁇ - Antitrypsin gene, antithrombin gene, lipoprotein gene, serloplasmin gene, fibrinogen gene, glucocerebrosidase gene, haptoglobin gene, plasminogen gene, prothrombin gene and transferrin gene But it is not limited thereto.
  • a factor IX gene or an epidermal growth factor receptor ER2 antibody gene may be used.
  • the expression vector according to the present invention may include any transcription terminator known in the art.
  • p 0 iyA is connected, and may include, for example, an SV40 late polyadenylation signal (polyA).
  • the expression vector of the present invention is characterized by having a cleavage map of PMSI-P-ER2LC and pMSI-D-ER2HC disclosed in FIG.
  • FIG. 19 schematically illustrates an expression vector including a MAR factor, a chimeric intron factor, an SV40 promoter, polyA, and the like, which are gene expression increasing factors.
  • the present invention provides a cell transformed with the expression vector.
  • the cell may be a generally known animal cell, preferably CH0-K1 cell, CH0-DG44 cell, CH0-S cell, CHO DUK-BI I cell C0S7 cell, C0S3 cell, C0S1 cell, NS0 Cells, HeLa cells, Vero cells, PER-C6 cells, HepG2 cells and BHK cells may be selected from the group consisting of cells, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for producing a target protein using the expression vector. More specifically, it provides a method for producing a large amount of the target protein, comprising the step of culturing the cell transformed by the expression vector to express and recover the target protein.
  • the method includes, for example, (1) inserting a target gene whose expression is controlled by a promoter into the expression vector; (2) transforming the cell with the expression vector into which the target gene is inserted; And (3) culturing the transformed cells to express and recover the desired protein.
  • a method of inserting a gene of interest, transforming a cell, culturing the same, expressing and recovering a protein of interest, and the like may be performed using techniques well known in the art.
  • the present invention will be described in more detail based on the following examples. The following examples are only for illustrating the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.
  • MAR Factor Selection To improve vector selection, Î ⁇ ⁇ ⁇ -globin MAR of the 3 ⁇ 4-globin MAR (3kb, 2.2kb) and human CSP-B gene tanking SAR (1.2kb) were selected. The luciferase assay was selected in consideration of the convenience of the test in order to perform a reporter gene assay capable of indirectly evaluating protein expression.
  • DNA fragment containing CMV promoter by PCR using 1 (+) vector (Invi trogen, V790-20) as a template and PCR using primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2 and DNA polymerase (Ex-Taq, Takara) Got. Denature the template at 94 ° C for 5 minutes to separate DNA strands, and then repeat 30 times at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 56 ° C for 30 seconds and extension for 1 minute at 72 ° C. Amplification was performed at 72 ° C. for an additional 5 minutes. DNA fragments amplified by PCR were purified through gel extraction, followed by PCR2. 1-T0P0 plasmid vector (Invi trogen, K4500-01) was inserted.
  • the cleavage map and sequencing analysis using restriction enzymes confirmed the presence of the CMV promoter represented by SEQ ID NO: 11, which was inserted into the Nhel / Xhol region of the pGL4.20 [luc2 / Puro] vector multicloning region. It was named -CMV and used as a control vector.
  • a primer set for SAR (SEQ ID NOs 3 and 4), a primer set for MAR2.2 (SEQ ID NOs 5 and 6) and a primer set for MAR3.0 (SEQ ID NO 7) And 8) were used to insert SAR, MAR2.2, and MAR3.0 into the PCR2.1—TOPO plasmid vector, respectively.
  • the vector thus prepared was named pCR2.1-SAR, PCR2.1-MAR2.2 and pCR2.1-MAR3.0.
  • PCR templates for MAR and SAR were used as pMSG and 5 'B1-P1 vector (see Korean Patent No. 408844), respectively.
  • SAR, MAR2.2, and MAR3.0 represented by SEQ ID NOs: 39, 40, and 41 was confirmed by cleavage map and sequencing using restriction enzymes. Since the cloning operation, all inserts were purified by gel extraction after restriction enzyme cleavage, and the vector was used by treating shrimp alkaline phosphatase after restriction enzyme cleavage.
  • the prepared pCR2.1-SAR vector was cut with BamHI to prepare an insert, and then inserted into the prepared PGL4.2-CMV vector.
  • the cleavage map using restriction enzymes confirmed that the desired SAR DNA fragment was present in the forward direction, and was named pGL4.2— (: -3'SAR.
  • the pCR2.1-SAR vector was cleaved with Kpnl and Nhel.
  • the prepared inserts were inserted into the P GL4.2-CMV-3'SAR vector and the pGL4.2-CMV vector digested with the same restriction enzyme, respectively.
  • PGL4 obtained by cutting pCR2.1-MAR2.2 and P CR2.1-MAR3.0 with Kpnl and Nhel, respectively, to prepare a vector containing MAR2.2 and MAR3.0 with the same restriction enzyme PGL4.2-CMV-5'MAR2.2 and pGL4.2-CMV-5'MAR3.0 vectors were prepared first by inserting them into the .2-CMV vector and then again the pCR2.1-MAR2.2 and PCR2.1 vectors.
  • Inserts obtained by cleaving -MAR3.0 with BamHI were inserted into pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 and pGL4.2-CMV-5 'MAR3.0 vectors digested with the same restriction enzyme, respectively, to pGL4.2- CMV-5'3'MAR2.2 and pGL4.2-CMV-5'3 'MAR3.0 vectors were prepared.
  • the MAR factor it was inserted in the reverse direction.
  • FIG. 1 Luciferase expression levels of the vectors of MAR candidates prepared as shown in FIG. 1 were measured in the adherent cell line CH0-K1.
  • Each SA or MAR factor was additionally supplied to the prepared vector at a molar ratio of 4 times, and a set for confirming the Cis + Trans effect was further configured and used for transformation together.
  • Lipofectamine 2000 (Invitrogen, in a CH0-K1 cell line (ATCC, CCL-61)
  • Firefly luciferase vector of 1.0 was used to transform the Firefly luciferase vector of 1.0 and then passaged in DMEM medium (Lonza, 112-604F) containing puromycin (50 ug / mL) after 48 hours. Stabilizing cells were constructed after a selection period of about 2-4 weeks. The experiment was carried out in total 3 sets, and Firefly luciferase analysis was performed by correcting the number of firefly fluorescence by cell number with one-glo luciferase assay system (Promega, E6110).
  • Firefly luciferase analysis method is as follows. First, after removing the culture medium of the well in which the cells are cultured, lxPBSlmL was added to each well and washed. 100 L / well of trypsin-EDTA was transformed into the transformed cells, and the cells were removed from the bottom by reacting for 1 minute in a 37 ° C cell incubator. Each well was dispensed with 1 mL of culture medium. After measuring the number of cells, each transformed cell type was diluted in culture medium in 1.5 mL flow and contained 1.0X10 5 cells / mL (based on viable cells). 100 ⁇ per test DNA on 96-well white plate! Transfer to wells.
  • One-glo luciferase assay reagent prepared in advance was added to 100 ⁇ 7 wells, and then reacted at room temperature for 3 minutes. Firefly RLUCRelative light units were measured using a photometer (EG & G Berthold, Mi crop late luminometer LB 96V).
  • the measurement results of the test vectors for pGL4.2-CMV are shown in Figure 2 and Table 1.
  • the most effective factor was the 5 'MAR factor, which was 1.6-5.3 times higher than the pGL4.2-CMV control vector.
  • there was no difference in effect between single MAR and double MAR and no difference between Cis and Cis + Trans MAR was not large and the variation is large.
  • the effect of the MAR factor was not as good as expected, so we compared the effects of MAR on CMV and SV40 promoters.
  • PCR was performed using the primer sets of SEQ ID NOs: 9 and 10 using the PGL4.20 vector as a template to obtain DNA fragments containing the SV40 promoter.
  • DNA fragments amplified by PCR were purified via gel extraction, followed by pCR2. 1-TOP0 Inserted into plasmid vector.
  • the presence of the SV40 promoter represented by SEQ ID NO: 12 was confirmed by cleavage map and sequencing using restriction enzymes.
  • the pGL4.2-CMV, pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 and pGL4.2-CMV-5 'MAR3.0 vectors were then treated with restriction enzymes Nhel and Xhol to remove the CMV promoter and then PGL4.2-SV40, pGL4.2-SV40-5'MAR2.2 and pGL4.2-SV40—5 'MAR3.0 vectors were prepared by inserting the SV40 promoter.
  • Luciferase expression was measured in the same manner as the test of MAR candidate factors in the adherent cell line CH0-K1. Stabilizing cells were constructed over a selection period of about 2 weeks. The experiment was conducted in two sets in total, and Firefly fluorescence values were measured in the same manner as mentioned above.
  • the SV40 promoter showed a synergistic effect about 4 times compared to the CMV promoter.
  • the most effective was P GL4.2-SV40-5'MAR3.0 vector, which showed 9 times higher expression than CMV control and 2.2 times higher expression than SV40 control.
  • LCR factor selection MT 108 (alpha-1-antitrypsin precursor, 120bp, SEQ ID NO: 13) showing synergistic effect of Factor IX expression in vivo among LCR factors disclosed in WO02009 / 102085 And Alb E6 (serum albumin prep protein, 81bp, SEQ ID NO: 14) were selected to evaluate the effect in vitro (/ ro).
  • a vector containing MT 108 and Alb E6 was prepared in both the promoter 5 'region of the pGL4.2—CMV control vector and the 3' region and 5'3 'of the SV40 late poly (A) signal (see FIG. 4). ).
  • the length of the LCR factor is very short, to evaluate the effect on the expression when multiple insertion was performed, a vector was inserted into each of the four multiplexing of each factor.
  • the vector (pCR ⁇ MT1081cr, pCR-E61cr) disclosed in International Patent Publication No. W02009-102085 was used as a template, and monomers of each factor were subjected to one-time PCR. Alb E6X4 multimers were prepared by four rounds of recombinant PCR. First, in order to obtain monomers of each factor, primer sets of SEQ ID NOs: 17 and 18 were used for AlbE6xi, and primer sets of SEQ ID NOs: 19 and 20 were used for AAT 108X1.
  • DNA fragments amplified by PCR were purified by gel extraction and then inserted into a pCR2.1-TOP0 plasmid vector.
  • the cleavage map and sequence analysis using restriction enzymes confirmed the presence of AAT108 and Alb E6 genes represented by SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively.
  • AlbE6X4 multimer was produced by recombinant PCR four times as shown in FIG. Only the annealing time of the PCR conditions was extended to 30 seconds and the remaining conditions were performed identically. The sequence analysis confirmed the presence of the AlbE6x4 gene described in SEQ ID NO: 16.
  • MT 108X4 multimer (SEQ ID NO: 15) was produced by requesting from Genscript.
  • the pGL4.2-CMV vector and Alb E6 were cleaved using restriction enzyme BamHI.
  • restriction enzyme Bglll it was inserted into the pGL4.2-CMV vector using a compatible end, thereby allowing 3'AAT 108X1, 3'AAT 108X4, 3'Alb E6X1 and 3'Alb. Obtained an E6X4 vector.
  • LCR factors were added to SV40 late poly (A) signal 3 'region using restriction enzymes Kpnl and Nhel. The ligation was carried out after processing the vector containing the PCR preparation product prepared above and cutting it. Through this, 5'3'MT 108X1, 5'3'AAT 108x4, 5'3'Alb E6X1, and 5'3'Alb E6x4 vectors were obtained.
  • Test DNA in 1.5 mL tubes on a 1 well basis (pGL4.2-CMV, 5'AAT 108X1, 5'AAT 108x4, 5'Alb E6X1, 5'Alb E6X4, 5'3'AAT 108X1, 5'3'AAT 800 ng of 108X4, 5'3'Alb E6X1, and 5'3'Alb E6X4) were mixed with Opt i -MEM (Gibco, 31985-088) to a total volume of 50 uL.
  • Lipofectamine Invitrogen
  • 11668027 was mixed with Opt i -MEM to a total volume of 50 yL, and reacted at room temperature for 5 minutes.
  • the two solutions were mixed with each other and reacted at room temperature for 20 minutes. 100 L was dispensed into each well. After 24 hours the medium was changed and cell selection was initiated by treatment with 50 ⁇ g / mL puromycin (Gibco, A11138-03).
  • Stabilized cells were constructed after a selection period of about 2-4 weeks for a total of 7 sets. Luciferase analysis was performed on the constructed stabilized cells using the One-glo luciferase assay system (Promega, E6110) in the same manner as in the analysis of MAR candidates. The results were taken to compare the effects of each factor. Firefly fluorescence value of each factor was measured by cell number, and the average result was 0.54 to 3.94 times compared to the pGL4.2-CMV vector (FIG. 6).
  • the factor that showed the best effect was the 5'MAR 3.0kb factor used in the past, which showed a 0.24 to 9.02 (3.94 ⁇ 4.55) fold synergistic effect.
  • the 5'3'AAT 108X4 factor is 1.79 to 4.67 (3.38 ⁇ 1.46) showed synergistic effect.
  • Effects of pGL4.2-CMV-3'Alb E6, pGL4.2-CMV-3'Alb E6X4, pGL .2-CMV-3 'AAT 108x1 and pGL4.2-CMV-3'AAT 108x4 Vectors The same test was conducted as above to confirm. Puromycin selection was performed over two weeks and one set of tests was performed. The results are shown in FIG. As shown in FIG.
  • SCRs are connected by connecting SCR Nos. 1 to 4 (ReguLatory region) and SCRs 18 to 20 (Binding region), except for 13 intermediate SCRs, out of 20 short consensus repeats (SCRs) of CFH through two-step PCR.
  • DCFH was produced.
  • the polymerase was Phus ion High-Fide lity DNA polymerase (Thermo I F-530S), denature the template for 30 seconds at 98 ° C for DNA strand separation, then denature for 10 seconds at 98 ° C, anneal for 30 seconds at 55 ° C, and extension for 30 seconds at 72 ° C. was repeated 30 times and then amplified in a manner of further extension at 72 ° C for 5 minutes.
  • the SCR 1 F primer (SEQ ID NO: 21) contained the restriction enzyme Notl site, and the SCR 20 B primer (SEQ ID NO: 24) contained the Xhol site for future cloning.
  • pMSGneo-hCFH was used as a template.
  • SCR 1 F primer SEQ ID NO: 21
  • SCR 5 back (3 ') region SCR 5 (18') front primer (5 ') region were included.
  • SEQ ID NO: 22 was used to obtain fragments SCR 1-5.
  • SCR 18 (5) F primer SEQ ID NO: 23
  • SCR 20 B primer SEQ ID NO: 23
  • PCR is P CMV-SP0RT6-hCFH each primer in the 5 ng (10 nmol / mL) 1 ⁇ 1, PCR pre-mix li UAccuPower ® ProFi Taq PCR PreMix, Bioneer) and combined with distilled water 46 common PCR banung of total 50 u L after creating the common compound, the common banung compound was carried out by 94 ° for 30 sec at C, 65 ° C at 60 seconds and 65 ° C 3 minutes 20 seconds in 30 cycles banung. The PCR product was subjected to electrophoresis on a 0.8% agarose gel, followed by gel elut ion to obtain a gene fragment encoding hCFH.
  • pMSGneo vector (Mark Cancer Institute, Korea) was treated with Not l and Xhol as the gene fragment encoding the obtained hCFH and backbone vector, respectively, and then ligated using T4 ligase (Hgase) to express hCFH expression vector.
  • T4 ligase Hgase
  • the expression vector thus prepared was named "pMSGneo-hCFH”.
  • two fragments obtained through the first-step PCR were used as templates, and the SCR 1 F primer (SEQ ID NO: 21) and the SCR 20 B primer (SEQ ID NO: 24) were used.
  • Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo I F-530S) was used as a polymerase, and the template was denatured at 98 ° C for 30 seconds for DNA strand separation, and then denatured at 98 ° C for 10 seconds, and 55 ° C.
  • the 30-second annealing at 30 ° C the process of extending for 45 seconds at 72 ° C 30 times, and then amplified by further extending for 5 minutes at 72 ° C to obtain a dCFH gene (SEQ ID NO: 46) (Fig. 8).
  • a pcDNA-dCFH expression vector was produced.
  • the pMSGneo-dCFH vector and pcDNA3.1 (+) vector were digested at 37 ° C. for about 3 hours using Notl and Xhol restriction enzymes.
  • the cleaved vector was electrophoresed with an agarose gel, and the dCFH gene was cut out of the gel in the pMSGneo-dCFH cleaved gene, and the pcDNA3.1 (+) vector cut out the vector size gene from the gel.
  • the genes cut out from the gels were separated and recovered by Promega's Wizard ® SV gel and PCR cleanup system.
  • the cleaved genes were reacted for about 6 hours at 16 ° C using DNA ligation kit Ver.2.1 to produce pcDNA-dCFH expression vector.
  • the pcDS—dCFH expression vector was then constructed.
  • p C DNA3.1 (+) vector and Yll IX pcIW vector see Ate / e / c Acids Res., 2008 Sep; 36 (15): e96) Nhel (NEB /
  • the cleaved gene was electrophoresed with agarose gel, and in the Yll IX pcIW cleaved gene, the chimeric intron gene (SEQ ID NO:
  • PCR was performed with the Yll IX pcIW vector as a template to secure the WPRE gene (SEQ ID NO: 26).
  • the test proceeding as follows, Phusion High-Fidel i ty DNA polymerase (Thermo I F-530S) was used, the template was denatured at 98 ° C for 30 seconds to separate DNA strands, and then at 98 ° C. The procedure of denaturation for 10 seconds, annealing for 30 seconds at 55 ° C., and extension for 30 seconds at 72 ° C. was repeated 30 times, and then amplified by further extension for 5 minutes at 72 ° C.
  • the WPRE F primer (SEQ ID NO: 27) used contained a restriction enzyme Xhol site and the WPRE B primer (SEQ ID NO: 28) contained an Xbal site for future cloning.
  • Product obtained by PCR was recovered and purified with Promega's Wizard ® SV Gel and PCR Clean-up System.
  • the WPRE gene and pcDS-dCFH vector obtained through the PCR were digested at 37 ° C for about 1 hour using Xhol and Xbal (NEB I R0145S) restriction enzymes. Are cut gene was recovered and purified by Wizard ® SV Gel and PCR Clean-up System Promega Corporation. The cleaved genes were reacted at 16 ° C. for about 3 hours using the DNA ligation kit Ver .2.1 to prepare a pcDSW-dCFH vector in which the WPRE gene was inserted into the Xhol I / Xbal cleavage site of the vector of pcDS-dCFH.
  • CH0-S cells (111 ⁇ 0 £ 611, # R800-07) were prepared to confirm the transient expression increase effect of the chimeric intron. After thawing the cells, FreeStyle CH0 expression medium (Invi trogen,) in 125 mL Erlenmeyer scale.
  • CHO-S cells transformed with pcDNA-dCFH vector showed a maximum expression of about 13.025 Ug / mL, compared to 30.757 ug / mL for CH0-S cells transformed with pcDS-dCFH vector,
  • the pcDSW-dCFH vector was 48.208 yg / mL, which showed 2.4 and 3.7 times higher expression levels than pcDNA-dCFH.
  • the dCFH expression vector prepared to confirm the effect of the chimeric intron was transformed into FreeStyle TM 293-F cells (Invitrogen I R790-07). FreeStyle TM 293-F cells were cultured in Freestyle 293 expression medium (Gibco I 12338-018).
  • a new 1.5 mL tube was mixed with 90 uL of PEI MAX (Polyscience I 24765-2) (1 yg / uL) and 510 OptiPRO TM SFM.
  • the solution containing the plasmid and the solution containing PEI MAX were mixed with each other, and then reacted at room temperature for 10 minutes. Rotate the Erlenmeyer flask containing 293-F cells slowly and add the mixed solution. Incubated for 7 days at 130 rpm in 5% CO 2 and 37 ° C suspension incubator. After culturing for three days from 3 days to the culture medium obtained in 1.5mL tube, the cells were precipitated by centrifugation at 5000 rpm for 3 minutes. Then, the supernatant was taken and the amount of dCFH expression was confirmed using human complement factor H, ELISA kit (Hycult biotech I HK342) (FIG. 10).
  • the expression level of the cells transformed with pcDNA-dCFH showed a maximum expression level of 138.9 yg / mL, and a maximum of 638.8 ug / mL for pcDS-dCFH and a maximum of 896.7 ug / mL for pcDSW-dCFH.
  • the expression level was shown.
  • the transformation of the vector containing chimeric introns showed a 4.6-fold increase compared to the pcDNA-dCFH expression vector, and a 6.5-fold increase when the chimeric introns and WPRE were present.
  • CH0-DG44 cells (Dr L. Chasin, Columbia Universi ty) were prepared. After cell thawing confluence (2-3 days after seeding with MEM alpha w / HT (Gibco, 12571-063) + 10% DFBS (Biotechni cs research, 7103) medium in 3 X 10 6 cel ls / T75 flasks) conf luency) It has maintained 2-3 passages to grow to 90% level.
  • the flask shows a growth rate of 80-90% on the 2nd to 3rd day after the first passage, pass the passage twice and inoculate the T75 flask with 5 X 10 6 cells in the same manner.
  • 1 mL of the culture solution was collected once a day from the time point of the day to the 7th day.
  • the cells were treated with 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen, # 25200-056) to measure the cell light-receiving viability, and dCFH expression was measured using human complement factor H and ELISA kit (Hycult biotech, # HK342). It was confirmed (FIG. 11).
  • CH0-DG447 cells transformed with pcDNA-dCFH vector showed up to about 0.054 ug / mL, compared with the maximum value of CHCH) G447 transformed with pcDS-dCFH vector.
  • About 0.934 yg / mL and pcDSW-dCFH vector showed 0.924 yg / mL, which showed 17.3 times and 17.1 times higher expression levels than pcDNA-dCFH.
  • PCR was performed using the pMSG-FIX vector as a template and the above primer sets (SEQ ID NOs: 29 and 30).
  • the manufacturing method of the pMSG-FIX vector is as follows. First, mRNA was extracted from human liver cells using oligo-dT column (Invitrogen, USA) for FIX gene isolation. FIX gene (Ref .; Genbank accession No.
  • the isolated FIX gene was amplified by PCR with primer sets (SEQ ID NOs: 51 and 52) including Nhel and BgUI, and cloned into pMSG vector (Mok Cancer Institute, Korea), which is an animal cell expression vector.
  • the FIX gene obtained by the PCR was cut with Nhe I and Bglll restriction enzymes (New England Bio Labs, USA), and agarose gel electrophoresis was used to isolate a gene of about 1.4 kb in size.
  • the isolated FIX gene was restricted to Nhel and Bglll.
  • FIX expression vector was prepared by ligation with pMSG vector previously treated with enzyme.
  • the conjugated DNA complexes were transformed into E. coli DH5a by CaCl 2 precipitation. Transformed E. coli was sprinkled on LB plates containing 50 yg / niL ampicillin and incubated overnight at 37 ° C. After incubating colonies on the culture plate, the QIA filter mini-P
  • the expression vector thus prepared was named "pMSG—FIX”.
  • DNA fragments amplified by PCR were purified via gel extraction and then inserted into a PCR2.1-T0PO plasmid vector.
  • the presence of the FIX gene described in SEQ ID NO: 31 was confirmed by cleavage map and sequencing using restriction enzymes.
  • the FIX gene was inserted into the vector from which the luciferase gene was removed using restriction enzymes Xhol and Fsel using the same restriction enzyme.
  • the schematic diagram of the FIX expression vector set 1 thus prepared is shown in FIG. 12.
  • the degree of FIX expression was measured in the same manner as the luciferase expression test in the adherent cell line CH0-K1. Stabilizing cells were constructed through a selection period of about 2 weeks as described above. The experiment was carried out in a total of four sets, FIX expression was measured by the ELISA method and corrected by the number of cells.
  • FIX ELISA method is as follows. Culture medium in the wells was harvested in 1.5 mL lavs. Each well was washed with 1 mL of 1 XPBS. Transformed cells were aliquoted in trypsin-EDTA 100 ⁇ wells and reacted for 1 minute in a 37 ° C cell incubator to remove cells from the bottom. Each well was dispensed with 1 mL of culture medium to obtain cells, and the number of cells was measured. When continuing to culture the cells were passaged at 0.5 ⁇ 1.0X 10 5 cel ls / mL based on a 12 well plate, and cell selection was carried out with puromycin (50 yg / mL).
  • Matched-pair antibody set for ELISA of human FactorIX antigen (Matched-Pai r
  • the capture antibody (capture ant ibody) provided by Ant ibody set for ELISA of human Factor IX ant igen, Af fity Biological, FIX-EIA was coated with 1.59 g N in 1 L of 50 mM carbonate buffer and tertiary distilled water. After adding C0 3 and 2.93 g NaHC0 3 , the pH was adjusted to ⁇ 00 using a pH of 9.6). 100 ⁇ well diluted capture antibody was dispensed on a 96 well ELISA plate, and then reacted at room temperature for 2 hours.
  • Factor FIX Factor FIX (Benef ix, 250 yg / mL) was prepared via half dilution from 50 ng / niL to 0.781 ng / mL using dilution buffer. Dilute the culture medium initially collected 1/10, 1/100 and 1/1000 dilutions were made with buffer (13 ⁇ 4 BSA in 1 XPBS). After dispensing the plate into 100 ⁇ 7 well, it was reacted at room temperature for 1 hour 30 minutes. Wash three times using PBS-TW One buffer. ⁇ microwell peroxidase substrate was dispensed in 100 ⁇ wells and reacted at room temperature for 10 minutes. 2.5 ⁇ H 2 SO 4 was dispensed in 100 ⁇ wells to stop the reaction and measured at 450 nm of microplate reader.
  • the SV40 promoter was found to be about 3.4 times higher than CMV.
  • the most effective was PGL4.2-SV40— 5 'MAR3.0 vector, which is 7 times higher than CMV control and 2. 1 times higher than SV40 control. The effect could be seen.
  • the expression level was not increased compared to the SV40 promoter control group, but the vector having an excellent expression level than pSV40-5 'MAR3.0 was not found in the LCR candidate group replaced with the SV40 promoter.
  • the SV40 promoter and 5 'MAR3.0 factor were selected through comparison of the FIX expression levels.
  • Example 2 New vector production A new vector was produced using the factors selected in Example 1 above.
  • MCS contains four restriction enzyme sites: Xhol, Pad, Apal and Fsel.
  • a vector with the DHFR gene was further prepared by replacing the puromycin selection portion with a DHFR expression portion in the pSV40-5'MAR3.0-MCS vector.
  • the restriction enzyme site was checked for replacement, it was confirmed that the Sapl site existed in two places back and forth. To remove.
  • a schematic diagram of the restriction enzyme map of the puromycin expression system (pMS-P-MCS) is shown in FIG. 16.
  • the required DHFR expression system was to use the pDCHIP vector used in the existing cattle.
  • Promoter and polyA sections at about 2.5 kb, including the hamster DHFR gene, 5 'plate, and 3' flank was designed to reduce the PCR primer to about 1.5 kb (SEQ ID NOs: 32 and 33).
  • pDCHIP vector was PCR performed as a template to obtain DNA, which was inserted into PCR2.1-T0P0 vector to confirm the gene sequence (SEQ ID NO: 34).
  • the gene sequence was inserted into the pSV4 ()-5'MAR 3.0-MCS vector for the identified DHFR expression part.
  • the restriction enzymes Sapl and Sail were used to cut the vector and the insert, respectively, and then reconnect.
  • PCR using p0pt iVEC-ER2HC and pcDNA3.3-ER2LC vectors as templates, respectively, primers used HC (SEQ ID NOs: 35 and 36) set for heavy chain and LC (SEQ ID NOs 37 and 38) set for light chain It was performed by. PCR products were pCR2. Insertion into the 1-T0P0 vector confirmed the gene sequence (SEQ ID NOs: 42 and 43).
  • the light and heavy chain genes of the sequenced ER2 antibodies were cloned into pMSGneo vectors using Nhel and Xhol restriction enzymes, and also novel vector pairs (pMS-P-MCS and pMS-D-) using Xhol and Pacl restriction enzymes. MCS), respectively.
  • the cloning product was treated with the same restriction enzymes to determine if a band of the desired size was present on the DNA gel to identify novel vector pair 1 (PMS-P-ER2LC and pMS-er ER2HC) and MAR vector pair (pMSGneo-) for ER2 antibody expression.
  • Four vectors of ER2LC and pMSGneo-ER2HC) were completed (FIGS. 18A and 18B).
  • DNA was obtained by PCR using the primer set of SEQ ID NOs: 44 and 45 using the pcDS-dCFH vector as a template, and the PCR product was expressed in pCR2. Insertion into the 1-TOP0 vector confirmed the gene sequence of the chimeric intron (SEQ ID NO: 25).
  • the pMS-P-ER2LC vector and pMS_D-ER2HC vector which are novel vector pair 1 for ER2 antibody expression, were digested with Xhol and chimeric introns treated with the same restriction enzyme were inserted.
  • novel vector pair 2 (pMSI-P-ER2LC and pMSI-D-ER2HC ER2) for E 2 antibody expression was completed (FIG. 19).
  • An ER2 antibody expression vector was further constructed to understand the factor properties of the novel vector pair 2.
  • the vector with only the SV40 promoter was prepared by removing the FIX gene using the pGL4.2-SV40-FIX vector to produce the pS-P-MCS vector and further replacing the puromycin gene with the DHFR gene.
  • pS-D-MCS vectors were constructed.
  • the ER2 light and heavy chains were then inserted using restriction enzymes Xhol and Pacl to prepare pS-P-ER2LC and pS-D—ER2HC vectors, ER2 antibody expression vector pairs with the SV40 promoter (FIG. 20A).
  • CH0-K1 cells incubated in DMEM (w / 10% FBS) culture medium were dispensed at 500 U L in 12 well plates to 0.8 ⁇ 10 5 cells / well.
  • CH0-DG44 cells incubated in MEM alpha w / HT (Gibco, 12571-063) culture medium were dispensed at 500 to 1.5X10 5 cells / well.
  • Opti-MEM and the test vector were mixed to a total volume of 50 iL in a 1.5 mL tube per well. A new 1.5 mL tube was mixed with 47 uL of Opti-MEM and 20003 uL of lipofectamine in a 1-well standard and reacted at room temperature for 5 minutes.
  • the ER2 ELISA method is as follows. Goat anti-human IgG (Fab-speci f ic) (Sigma,
  • PBS-1% BSA was added per 300 ⁇ wells and blocked for 2 hours at room temperature.
  • PBS-0.13 ⁇ 4 Washed three times using Tween 20 buffer 300.
  • the Hbig gene (2.8 mg / mL) to be used as a standard was prepared at 280, 140, 70, 35, 17.5, 8.75 and 4.375 ng / mL using PBS-1% BSA.
  • Cultures were diluted using PBS-BSA. Standard and diluted cultures were diluted with dupl i cat ion in 96-well plates coated with capture antibody. After dispensing into wells, the mixture was reacted at room temperature for 1 hour.
  • PBS-0 Washed three times using 1% Tween 20 buffer 300.
  • Goat anti-human IgG (Fc specificity) -HRP (Sigma, A0170) was diluted to 1/100, 000 using PSB—BSA. Plates were dispensed into 100 ⁇ wells and reacted at room temperature for 1 hour. PBS-0. Washed three times using 13 ⁇ 4 Tween 20 buffer 300 ii L. TMB microwell peroxidase substrates were dispensed in 100 ⁇ wells and reacted for 30 minutes at room temperature. 2.5 ⁇ H 2 SO 4 was dispensed in 100 ⁇ wells to stop the reaction and measured at 450 nm using a microplate reader. The concentration was calculated by creating a standard curve with 4—parameter fitting and substituting the measured absorbance of the culture.
  • a commercial double vector pair was not able to confirm ER2 Ab expression in CH0-K1 cells.
  • the expression level of the existing MAR vector pair was about 9.7 ng / mL, the new vector pair 1 on the average of about 14.0 ng / mL, and the new vector pair 2 on the average of about 1473.2 ng / mL.
  • the new vector pair 1 was found to be about 1.4 times higher than the MAR vector pair, and the new vector pair 2 was about 151.3 times higher than the MAR vector pair.
  • the average expression of ER2 Ab in CHO DG44 was 13.1 ng / mL for commercial double vector pairs, 3.8 ng / mL for MAR vector pair, 27.5 ng / mL for new vector pair 1 and 653.0 ng / mL for new vector pair 2. Seemed. Commercial double vector pairs have less expression than MAR vector pairs.
  • new vector pair 1 is about 7.3 times, new vector pair
  • the cells were passaged to the required amount in an amount of 5-6 ⁇ 10 5 cells / mL in CD FortiCHO medium. On the day of transformation, cell number and viability (viability, necessarily greater than 95%) were measured. In a 125 niL flask were dispensed in CD FortiCHO medium (Gibco, A11483-01) at 1 ⁇ 10 6 cells / mL. 90 plasmid DNA was mixed to a total volume of 1.5 mL using OptiPro TM SFM. 270 uLPEI MAX (1 yg / iiL) and 1230 uL of OptiPro TM SFM were mixed.
  • OptiPro TM SFM with PEI MAX was placed in OptiPro TM SFM with plasmid DNA and mixed gently. And it was reacted at room temperature for 5 minutes. 3 mL of the DNA: PEI complex thus prepared was dropped dropwise into a 125 mL flask CH0-S cell prepared in advance. Cell selection was performed after 48 hours of incubation at 130-150 rpm in a 37 ° C. and CO 2 shaking incubator. On the other hand, the CD DG44-S cell line was prepared according to the following method.
  • CHO DG44 adherent cell lines (cultivated in a-MEM (w /) + 10% cFBS medium) were prepared using serum-free medium (HyQ SFM4CH0 (Thermo Scientific, Hyclone) + IX HT Supplement) at intervals of 2 to 3 days. Subcultured in 50 mL medium using an mL spinner flask was subjected to suspension culture. Adapted cell lines were changed to EX-CELL TM CD CHO (Sigma, 14361C) / 4 mM L-glutamine / IX HT Supplement medium and subcultured in medium with passages at 2-3 days intervals.
  • serum-free medium HyQ SFM4CH0 (Thermo Scientific, Hyclone) + IX HT Supplement
  • Cell growth was established by banking the CHO DG44-S host cell line when the cell concentration reached 1 ⁇ 2 ⁇ 10 6 cells / mL with stable cell growth and survival of more than 90%. Twenty four hours prior to transformation, the cells were passaged to the required amount in EX-CELL TM CD CHO (Sigma, 14361C) in an amount of 5-7 X10 5 cells / mL. In a 125 mL flask, 2 ⁇ 10 6 cells / mL was dispensed at 15 mL using Freestyle CH0 medium. 30 lig of plasmid DNA was mixed with 150 mM NaCl to a total volume of 0.75 mL.
  • the number of transformed cells was measured. 50 mL of 5 ⁇ 10 5 cells / mL was dispensed into ⁇ - ⁇ 75 flasks using a selection medium for each condition. If the number of cells is low, the total volume is enjoyed. Incubated at 37 ° C and CO 2 incubator. After 7 days of screening, the number of cells was measured. If the viability exceeds 30%, enter the next step, if not satisfied, the cell number was measured after 10-11 days. After 11 days, if the viability was less than 30%, the size of the T-flask was reduced to 3X10 5 cells / mL and replaced with a new selection medium. The medium was completely replaced every 3-4 days and checked for recovery signs.
  • Table 71 The number of transformed cells was measured. 30 mL of 5 ⁇ 10 5 cells / mL was dispensed into a 125 ml flask using a selection medium for each vector. If the number of cells is low, the total volume is reduced. Incubation at 130 rpm in a 37 ° C and CO 2 mixed incubator. Passage was performed at 30 mL using a selection medium at 3 ⁇ 10 5 cells / mL in a 125 ml flask at 3-4 day intervals. Complete media changes were not made when the lime drainage was 2 or more. When the viability was 80% or more and the viable cell density was 1 ⁇ 10 6 cells / mL or more, selection was completed. Transformation was carried out in total 2 sets and ELISA test was performed by taking samples in total 3 times over 3-4 weeks per set.
  • the ER2 ELISA method was performed in the same manner as described for the adherent cell line, and the results are shown in Table 8.
  • ER2 antibody 3-day productivity in the CH0-S cell line was 0.2-0.3 u / mL for commercial double vector pairs, 1.0-2.0 W g / mL for MAR vector pairs and new vector pair 2. Cases showed an average expression level of 9.5-17.0 ug / mL.
  • the maximum yield was 0.7 ug / mL for commercial double vector pairs, 10.3 ug / mL for MAR vector pairs, and 35.0 pg / mL for new vector pair 2. Therefore, the novel vector pair 2 according to the present invention was confirmed to have an effect of increasing the expression level of the antibody about 50 times or more than the commercial double vector and about 3.4 times the MAR vector pair on the basis of batch productivity.
  • ER2 antibody 3-day productivity in the CD DG44-S cell line was 0.2-0.3 ug / mL for commercial double vector pairs, 0.2-0.25 ug / mL for MAR vector pairs, and 1 to 1.5 g / mL for new vector pair 2. Seemed.
  • the maximum yield was 0.7 ug / mL for commercial double vector pairs, 0.5 ug / mL for MAR vector pairs and 3.6 yg / mL for new vector pair 2.
  • the antibody expression level was increased by about 5.1 times compared to the commercial double vector and about 7.2 times higher than the MAR vector pair. [Table 8]
  • Each vector pair used in the test consisted of pS (promoter vector pair), pSI (intron vector pair), pMS (new vector pair 1) and pMSI (new vector pair 2) as shown in Table 9 below.
  • the evaluation method was the same as the method performed in Example 3-2. After transforming each vector pair, the expression levels of ER2 antibodies were compared at the time point at which selection was completed. The results are shown in Table 10 below.
  • cell selection was completed in about 4 weeks for the new vector pairs 1 and 2, about 4.5 weeks for the promoter vector pair, and about 7 weeks for the intron vector pair.
  • the screening period was about 1.8 times faster than the new vector pair 1 and 2 with the MAR factor.
  • 3 days productivity compared to promoter vector pair was 18.4 times higher for intron vector pair, 1.8 times for new vector pair 1 and 20.6 times for new vector pair 2, and intron vector pair for PCD (Pi cogram / cel ls / date) 13.3 times, new vector pair 1 increased 1.0 times and new vector pair 2 increased 26. 1 times.

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Abstract

본 발명은 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포 및 상기 세포를 이용하여 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 발현벡터는 종래의 동물세포 발현벡터에 비하여 매우 우수한 유전자 발현능을 나타내므로 외래 유전자의 단백질 발현을 현저하게 증가시킬 수 있다.

Description

명세서
증가된유전자발현능을 갖는발현백터
발명의 분야 본 발명은 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현백터， 상기 발현백터로 형질전환된 세포 및 상기 형질전환된 세포를 이용하여 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 배경기술 치료용 재조합 단백질 및 항체의 생산은 대부분 동물 세포를 이용해서 이루어지고 있는 실정이며， 시스템의 효율성을 높이기 위한 노력이 진행 중에 있다.
예를 들어， 고생산성 세포주의 빠른 선별을 위해 무혈청 배지에 미리 적웅된 현탁 숙주 세포주를 사용하거나， 또는 유전자 증폭에 필요한 시간을 없애거나 단축하기 위한 고-발현백터 및 고생산성 숙주세포를 지속적으로 개발하고 있다. 또한 세포주 선별 자동화기기를 초기 세포주 선별에 이용하는 방법을 통해서 효율적인 개발을 위해 노력하고 있다.
현재 고생산성 세포주는 유전자 증폭 없이도 30~80 pcd정도의 발현량을 나타내고 있으며， 주로 매트릭스 부착 부위 (matr ix at tachment region , MAR)나 이와 유사한 UCOE (ubiqui tous chromat in opening element ) 인자를 바탕으로 한 고 -발현백터를 사용하여 4개월 내에 고생산성 세포주를 제조하고 있다.
최근 추세인 6개월 이내에 3~5g/L 항체생산성으로 경쟁력을 확보하기 위해서는 백터 최적화가 필요하다. 최근에는 듀얼 -MAR, 멀티플 -MAR, 트랜스 -MAR 등과 같이 MAR 인자의 최적화를 통해 생산성 향상의 가능성이 제시되고 있으나， 5 ' UTR이나 인트론 인자 도입으로 인한 안정적이고 생산 효율성이 개선된 백터가 여전히 필요하다. 발명의 요약 따라서， 본 발명의 목적은， 목적 단백질을 대량으로 발현 및 수득하기 위한 발현백터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은， 상기 발현백터를 이용하여 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은， 상기 형질전환된 세포를 이용하여 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은， 작동가능하게 연결된 SV40 (simi an vi rus 40)프로모터 ; SAR (scaffold at tachment region) 또는 MAR인자; 및 키메릭 인트론을 포함하는 발현백터를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은， 상기 발현 백터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은， 상기 형질전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 발현백터는 종래의 발현백터에 비하여 매우 우수한 유전자 발현능을 나타내므로 외래 유전자의 단백질 발현을 현저하게 증가시킬 수 있다. 도면의 간단한설명 본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다:
도 1 은 MAR 후보 인자들의 루시퍼라제 ( luci f erase) 백터 모식도를 나타낸 것이다. 도 2는 MAR후보 인자들의 루시퍼라제 발현 결과를 나타낸 것이다. 도 3은 프로모터 비교시험의 루시퍼라제 발현 결과를 나타낸 것이다. 도 4 는 LCR ( locus control region) 후보 인자들의 루시퍼라제 백터 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 Alb E6 X 4 LCR 인자의 제작을 위한 PCR 전략을 나타낸 것이다. 도 6 및 7은 LCR후보인자들의 루시퍼라제 발현 결과를 나타낸 것이다. 도 8은 dCFH (delet ion form of human complement factor H) .제작 과정을 나타낸 것이다.
도 9는 CH0-S 세포에서 dCFH 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 10은 293-F 세포에서 dCFH 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 11은 CH0-DG44 안정화 세포에서 dCFH 발현 수준을 나타낸 것이다. 도 12 및 13은 각각 FIX발현백터 세트 1의 모식도 및 이의 FIX 발현량 결과를 나타낸 것이다.
도 14 및 15는 각각 FIX 발현백터 세트 2의 모식도 및 이의 FIX 발현량 결과를 나타낸 것이다.
도 16 은 푸로마이신 (Puromycin) 발현 시스템의 제한효소맵을 나타낸 것이다.
도 17 는 신규백터 쌍 pMS-P-MCS 및 pMS-D-MCS 의 구조를 각각 나타낸 것이다.
도 18A 및 18B 는 각각 ER2 항체 발현용 신규백터 쌍 l(pMS-P-ER2LC 및 PMS-D-ER2HC)； 및 MAR 백터 쌍 (pMSGneo_ER2LC 및 pMSGneo-ER2HC)의 구조를 나타낸 것이다.
도 19 는 ER2 항체 발현용 신규백터 쌍 2(pMSI-P-ER2LC 및 PMSI-D-ER2HC)의 구조를 나타낸 것이다.
도 20A 및 20B 는 각각 프로모터 백터 (pS) 쌍 (pS-P-ER2LC 및 PS-D-ER2HC)； 및 인트론 백터 (pSI ) 쌍 (pSI_P_ER2LC 및 pSI-I)-ER2HC)의 구조를 나타낸 것이다.
도 21A 및 21B 는 각각 CH0 부착 세포주인 CHOKl 및 DG44 세포에서 ER2 항체 발현량을 나타낸 것이다. 발명꾀 상세한설명 본 발명에서는 CHO(chinese hamster ovary) 세포 등에서 외래 유전자 발현 시 안정적이고 생산 효율성이 개선된 발현백터를 제조하기 위하여， 다양한 MAR인자와 스캐폴드 부착부위 (scaf fold attachment region, SAR) 인자， 로커스 조절부위 ( locus control region, LCR) 인자， 인트론 인자들 중에서 유전자 발현량을 증가시키는 인자들을 선별하였다.
따라서， 본 발명에서는 작동가능하게 연결된 SV40(simi an virus 40) 프로모터; SAR 또는 MAR 인자; 및 키메릭 인트론을 포함하는 발현백터를 제공한다. 본 발명에서 "프로모터' '는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 m NA로의 전사개시 활성을 가지는， 암호화 영역의 상위 (upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 구체적으로， "프로모터' '란,
RNA 폴리머라제에 전사를 개시시키는 기능을 담당하는 TATA 박스 또는 TATA 박스 유사의 영역이 포함되지만， 반드시 이들 영역의 전후에 한정되는 것은 아니고, 이 영역 이외에， 발현조절을 위해 RNA 폴리머라아제 이외의 단백질이 회합하기 위해 필요한 영역을 포함할 수도 있다.
본 발명에 있어서， 상기 프로모터는 SV40 프로모터 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 12의 염기 서열로 표시되는 SV40 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터의 변이체는 유전자 발현 증가를 위해 프로모터 서열의 일부를 부가， 결실， 또는 치환한 변이체를 의미한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 발현백터는 SV40프로모터를 사용함으로 인하여 CMV 프로모터와 비교하여 약 4배 정도 우수한 발현량 상승 효과를 나타낸다 (실시예 1-1 참고) .
또한, 상기 프로모터는 외래 유전자인 목적 유전자에 이의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 여기서， "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 백터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며， 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 본 발명에서는 유전자 증가 발현 인자를 선별하기 위하여， SAR 또는 MAR 인자를 포함할 수 있다.상기 SAR또는 MAR인자는 프로모터의 5' 말단; 3' 말단; 또는 5' 및 3' 말단에 함께 존재하도록 포함되어 발현백터를 구성할 수 있다. 본 발명에서 "MAR 인자"는 전사적으로 활성인 DNA 루프 도메인을 핵 매트릭스 (Nuclear matrix)에 일시적으로 부착시키는 DNA 서열을 의미하며 (Pienta et al.， (1991) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expres. , 1:355-385), MAR서열의 예는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에서는 유전자 증가 발현 인자를 선별하기 위하여, 인간 베타 글로빈 MAR(Yu, J. , Bock, J. H., Slightom, J. L. and Vi 1 leponteau, B.， Gene 139(2), 139-145(1994), Genbank NO. L22754) 및 인간 CSP-B 유전자 플랭킹 (flanking) SAR(Hanson, R. D. and Ley, T. J.， Blood, 79(3), 610-618(1992), Genbank NO. M62716)를 대상으로 루시퍼라제 분석 (lucif erase assay)을 이용하여 듀얼 (5' 및 5'+3')， 및 시스+트랜스 관련 테스트를 수행하였고， 그 결과 바람직한 인자를 선별하였다 (실시예 1-1 참고).
상기 SAR 또는 MAR 인자는， 인간 CSP-B SAR로서 서열번호 39의 염기 서열로 표시되는 SAR, 인간 베타 글로빈 MAR로부터 분리한 서열번호 40의 염기 서열로 표시되는 MAR2.2, 또는 서열번호 41의 염기서열로 표시되는 MAR3.0일 수 있다. 상기 SAR또는 MAR인자들은 프로모터의 5' 말단， 3' 말단， 또는 5' 및 3' 말단에 함께 존재하도록 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, 5' MAR2.2, 5' MAR3.0, 3' MAR2.2, 3' MAR3.0, 5'3' MAR2.2또는 5'3' MAR3.0로 지칭된 인자들일 수 있다. 본 발명에 따른 발현백터는 유전자 발현을 증가시키기 위하여 키메릭 인트론 (Chimeric intron)을 포함할 수 있다.
상기 키메릭 인트론은 서열번호 25의 염기서열로 표시될 수 있으나 (Baddiwal， G.， Hildinger, M. , Chenuet , S.， Wulhfard, S.， De Jesus, M.， Wurm, F. M. , Nucleic Acids Res. , 36(15), e96 (2008)， Genbank NO. JQ795930), 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 상기 키메릭 인트론 인자를 이용하여 루시퍼라제 분석하여 유전자 발현량 증가 효과를 확인하였다 (실시예 1-3 참고). 본 발명에 따르면, MAR 인자와 키메릭 인트론 인자를 함께 포함하는 발현백터의 경우， 생산성 부분에서 시너지 효과를 나타내어 유전자 발현량을 증가시킬 수 있다 (실시예 3-3 및 표 9 참고).
본 발명의 일 실시양태에 따르면, MAR 인자， SV 프로모터 및 키메릭 인트론을 포함하는 신규백터 쌍 2(pMSIᅳ P-ER2LC 및 pMSI-D_ER2HC)는， 기존의 프로모터 백터， 인트론 백터， 및 키메릭 인트론을 포함하지 않는 신규백터 쌍 KpMS-P— ER2LC 및 pMS-D-ER2HC)과 비교하여 우수한 유전자 발현량 증가 효과를 나타낸다. 본 발명에 따른 발현백터는 LCR 인자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 유전자 증가 발현 인자를 선별하기 위하여， 국제특허공개 거 1W02009/102085호에 개시된 Factor IX 발현의 상승효과를 보인 MT
108(알파 -1-항트립신 전구체， 120bp, 서열번호 13)과 Alb E6(혈청 알부민 프렙 단백질， 81bp, 서열번호 14)을 대상으로 루시퍼라제 분석을 이용하여 다합체 (XI 및 X4), 및 듀얼 (5'， 3' 및 5'+ 3') 관련 테스트를 수행하였고， 그 결과 바람직한 LCR 인자를 선별하였다 (실시예 1-2 참고).
본 발명에서 바람직한 LCR 인자는 서열번호 15의 염기 서열로 표시되는
MT108X4일 수 있으몌 백터의 3' 말단에만 존재하도록 (3' AAT 108X4) 또는 5'과 3' 말단 양측에 함께 존재하도록 (5'3' AAT 108X4)포함할 수 있다. 또한， 상기 LCR 인자는 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 Alb E6X4일 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 발현백터에는 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 유전자가 삽입될 수 있다.
상기 목적 유전자는 발현하고자 하는 외래 산물을 코딩하는 유전자로서， 재조합 단백질로 발현가능한 모든 종류의 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 이러한 목적 유전자는 상기 백터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열인 "다중 클로닝 부위 (multiple cloning site, MCS)"를 포함한다.
상기 목적 유전자는 혈액 응고 관련 유전자 및 여러 가지 항체 유전자 등을 들 수 있으며, 예를 들어， FVlKfactor VII) 유전자, FVIII(factor VIII) 유전자， FIX( factor IX) 유전자， 표피 성장 인자 수용체 패밀리 (epidermal growth factor receptor family) 항체 유전자， 인술린 유전자， 사이토카인 (인터루킨， 종양괴사인자， 인터페론， 콜로니자극인자， 케모카인) 유전자, 에리트로포이에틴 유전자， α-페토프로테인 유전자， α-글루코시다제 유전자， αΐ-안티트립신 유전자， 안티트롬빈 유전자， 리포프로테인 유전자, 세를로플라즈민 유전자， 피브리노겐 유전자， 글루코세레브로시다제 유전자， 합토글로빈 유전자， 플라즈미노겐 유전자， 프로트롬빈 유전자 및 트랜스페린 유전자로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면， FIX( factor IX) 유전자 또는 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor) ER2 항체 유전자 등을 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 발현백터는 종래 알려진 임의의 전사 종결인자가 포함될 수 있다. 바람직하게는， p0iyA가 연결된 것으로서, 예를 들면, SV40 late 폴리아데닐레이션 신호 (polyA)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면， 본 발명의 발현백터는 도 19에 개시된 PMSI-P-ER2LC 및 pMSI-D-ER2HC의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 도 19는 유전자 발현 증가인자인 MAR인자， 키메릭 인트론 인자， SV40프로모터， polyA등을 포함하는 발현백터를 개략적으로 도시한 것이다. 한편， 본 발명은 상기 발현백터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명에서 상기 세포는 일반적으로 알려져 있는 동물 세포일 수 있으며， 바람직하게는 CH0-K1세포， CH0-DG44세포， CH0-S세포, CHO DUK-BI I세포 C0S7세포， C0S3세포, C0S1세포， NS0세포， HeLa세포， Vero세포， PER-C6세포， HepG2 세포 및 BHK 세포로 이루어진 군에서 선택되는 세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 본 발명은 상기 발현백터를 이용한 목적 단백질의 생산방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 발현백터에 의해 형질 전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시킨 후 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 예를 들어 ( 1) 상기 발현백터에， 프로모터에 의하여 발현이 조절되는 목적 유전자를 삽입하는 단계; (2) 상기 목적 유전자가 삽입된 발현백터로 세포를 형질 전환시키는 단계; 및 (3) 상기 형질 전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시켜 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 목적 유전자를 삽입하고， 세포를 형질전환하고， 이를 배양하여 목적 단백질을 발현시켜 회수하는 방법 등은 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 이하， 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 실시예 1: 인자선별
1-1 : MAR 인자 선별 백터를 개량하기 위해서 ¾간 베타-글로빈 유전자의 ΜΑί β -globin MAR, 3kb, 2.2kb)와 인간 CSP-B 유전자 플탱킹 SAR( 1.2kb)를 후보로 선정하였다. 그리고 단백질 발현을 간접적으로 평가할 수 있는 리포터 유전자 분석 (reporter gene assay)을 수행하기 위해 시험의 편의성을 고려하여 루시퍼라제 분석을 선정하였다.
MAR 인자가 들어있지 않은 대조 백터와 형광 값의 차이를 비교하여 효과를 확인하기로 하였고，분석용 백터 제작을 수행하였다. 안정화 상황에서의 효과를 확인하기 위하여 신속하고 강한 세포선별 마커인 푸로마이신 저항성 유전자가 들어있는 pGL4.20[ luc2/Puro] Fi ref ly루시퍼라제 백터 (Promega사)를 선정하였다.
먼저， pcDNA3. 1(+) 백터 ( Invi trogen, V790-20)를 주형으로 하여 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트와 DNA폴리머라제 (Ex-Taq, Takara)를 이용하여 PCR을 수행하여 CMV프로모터를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 이에 DNA 가닥 분리를 위하여 94°C에서 5 분간 주형을 변성시키고， 이후 94°C에서 30 초간 변성， 56°C에서 30초간 어닐링 및 72°C에서 1분간 연장의 과정을 30회 반복한 다음， 72°C에서 5 분간 추가 연장하는 방식으로 증폭하였다. PCR 에 의해 증폭된 DNA 단편을 겔 추출을 통하여 정제한 다음， PCR2. 1-T0P0 플라스미드 백터 ( Invi trogen , K4500-01)에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호 11 로 표시되는 CMV 프로모터의 존재를 확인하였으며， 이를 pGL4.20[ luc2/Puro] 백터 다중클로닝 부위의 Nhel/Xhol 부위에 삽입하여 pGL4.2-CMV로 명명하고 대조백터로 사용하였다.
다음으로， SAR에 대한 프라이머 세트 (서열번호 3 및 4)， MAR2.2에 대한 프라이머 세트 (서열번호 5 및 6)와 MAR3.0 에 대한 프라이머 세트 (서열번호 7 및 8)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 SAR, MAR2.2 및 MAR3.0 을 각각 PCR2.1— T0P0플라스미드 백터에 삽입하였다. 이렇게 제조된 백터는 pCR2.1-SAR, PCR2.1-MAR2.2 및 pCR2.1-MAR3.0으로 명명하였다.
MAR와 SAR에 대한 PCR주형으로는 각각 pMSG및 5' B1-P1 백터 (대한민국 특허 제 408844 호 참고)를 사용하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호 39， 40 및 41 로 표시되는 SAR, MAR2.2 및 MAR3.0 의 존재를 각각 확인하였다. 이후 클로닝 작업 시 모든 인서트는 제한효소 절단 후 겔 추출을 통해 정제하여 사용하였고， 백터는 제한효소 절단 후 새우 알칼라인 포스파타아제를 처리하여 사용하였다.
상기에서 제조한 pCR2.1-SAR 백터를 BamHI 으로 절단하여 인서트를 준비한 후 동일한 제한효소로 절단하여 준비된 PGL4.2-CMV 백터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도를 통하여 목적하는 SAR DNA 단편이 정방향으로 존재함을 확인하였으며， pGL4.2— (： -3'SAR 로 명명하였다. 그 다음 pCR2.1-SAR 백터를 Kpnl 과 Nhel 으로 절단하여 준비된 인서트를 동일 제한효소로 절단한 PGL4.2-CMV-3'SAR 백터와 pGL4.2-CMV 백터에 각각 삽입하였다. 각각의 플라스미드는 제한효소를 이용한 개열 지도를 통하여 목적하는 DNA 단편이 존재함을 확인하였으며， 이들을 각각 pGL4.2-CMV-5'3'SAR 및 pGL4.2-CMV-5 ' SAR로 명명하였다.
MAR2.2 와 MAR3.0 를 포함하는 백터를 제작하기 위해， pCR2.1-MAR2.2 및 PCR2.1-MAR3.0 을 각각 Kpnl 과 Nhel 으로 절단하여 준비된 인서트를 동일 제한효소로 절단한 pGL4.2-CMV 백터에 삽입하여 pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 와 pGL4.2-CMV-5'MAR3.0 백터를 먼저 제작한 다음， 다시 pCR2.1-MAR2.2 및 PCR2.1-MAR3.0 을 BamHI 으로 절단하여 얻은 인서트를 동일 제한효소로 절단한 pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 와 pGL4.2-CMV-5 ' MAR3.0 백터에 각각 삽입하여 pGL4.2-CMV-5'3'MAR2.2 와 pGL4.2-CMV-5 ' 3 ' MAR3.0 백터를 제작하였다. MAR 인자의 경우에는 역방향으로 삽입하였다. 제작된 루시퍼라제 백터의 모식도는 도 1에 도시되어 있다. 부착세포주인 CH0-K1 에서 상기 도 1 과 같이 제작된 MAR후보 인자들의 백터들에 대한 루시퍼라제 발현정도를 측정하였다. 상기 제작된 백터에 각각의 SA 또는 MAR인자를 4배의 몰비로 추가로 공급하여 Cis+Trans효과를 확인하기 위한 세트도 추가로 구성하여 함께 형질전환에 사용하였다.
CH0-K1 세포주 (ATCC, CCL-61)에 리포펙타민 2000(Invitrogen,
11668027)을 이용하여， 1.0 의 상기 Firefly루시퍼라제 백터를 형질전환한 다음， 48 시간 이후 푸로마이신 (50 ug/mL)이 포함된 DMEM 배지 (Lonza, 112-604F)에서 계대배양하였다. 약 2~4 주간의 선별 기간을 거쳐서 안정화 세포를 구축하였다. 실험은 총 3 세트로 진행이 되었고， 구축된 안정화 세포에 대하여 One-glo 루시퍼라제 분석 시스템 (Promega, E6110)으로 Firefly 형광 수치를 세포수로 보정하여 Firefly루시퍼라제 분석을 수행하였다.
Firefly 루시퍼라제 분석 방법은 다음과 같다. 먼저， 세포를 배양하고 있는 웰의 배양 배지를 제거한 후，각 웰 당 lxPBSlmL씩을 넣어 세척하였다. 형질 전환된 세포에 트립신 -EDTA 100 L/웰씩 분주하고, 37°C 세포 배양기에서 1 분간 반웅시켜 세포를 바닥에서 떼어 내었다. 각 웰에 배양 배지를 lmL 씩 분주하였다. 세포 수를 측정한 후, 형질전환 세포 종류별로 1.5 mL류브에 배양 배지로 희석하여 1.0X105 cells/mL (viable cell 기준)씩 담았다. 96웰 화이트 플레이트에 테스트 DNA 1종류 당 100 μ! 웰로 옮겨 담았다. 미리 제조해 놓은 One-glo 루시퍼라제 분석 시약을 100μΐ7웰씩 넣은 후 3 분간 상온에서 반응시켰다. 광도계 (EG&G Berthold, Mi crop late luminometer LB 96V)를 이용하여 Firefly RLUCRelative light units)를 측정하였다. pGL4.2-CMV 에 대한 시험 백터들의 측정 결과를 도 2 및 표 1에 나타내었다. 측정 결과 가장 좋은 효과를 보인 인자는 5' MAR 인자로 pGL4.2-CMV 대조군 백터 대비 평균 1.6 내지 5.3 배 상승효과를 보였다. 또한 단일 MAR와 이중 MAR간의 효과 차이 및 Cis 와 Cis+Trans MAR간의 효과 차이는 나타나지 않았다. 이에， 후보 인자들 간의 시험결과 값의 차이가 크지 않고 변이가 커서
5'MAR2.2와 5'MAR3.0두 가지 인자를 1차 선별하였다. 【표 1】
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MAR 인자의 효과가 기대했던 수준만큼의 결과가 나오지 않아 CMV 프로모터와 SV40 프로모터에 대한 MAR 효과를 비교해 보았다.
구체적으로 PGL4.20 백터를 주형으로 하여 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 SV40 프로모터를 포함하는 DNA단편을 얻었다. PCR 에 의해 증폭된 DNA 단편을 겔 추출을 통하여 정제한 다음， pCR2. 1-TOP0 플라스미드 백터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호 12 로 표시되는 SV40 프로모터의 존재를 확인하였다. 그 다음 pGL4.2-CMV, pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 및 pGL4.2-CMV-5 ' MAR3.0 백터에 제한효소 Nhel 및 Xhol 을 처리하여 CMV 프로모터를 제거한 후， 동일한 제한효소로 처리된 SV40 프로모터를 삽입하여 pGL4.2-SV40, pGL4.2-SV40-5'MAR2.2 및 pGL4.2-SV40—5 ' MAR3.0 백터를 제작하였다.
부착세포주인 CH0-K1 에서 MAR 후보 인자들의 테스트와 동일한 방법으로 루시퍼라제 발현정도를 측정하였다. 약 2 주간의 선별 기간을 거쳐서 안정화 세포를 구축하였다. 실험은 총 2 세트로 진행이 되었고， Firefly 형광 수치를 상기 언급한 것과 동일한 방식으로 측정하였다.
도 3 에서 보는 바와 같이 , CMV프로모터 대비 SV40 프로모터가 약 4 배 정도 상승효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 가장 효과가 좋았던 것은 PGL4.2-SV40-5'MAR3.0 백터로 CMV대조군 대비 9배， SV40대조군 대비 2.2배의 발현량 상승효과를 나타내었다.
1-2: LCR 인자 선별 국제특허공개 제 W02009/102085 호에 개시된 LCR 인자들 중 생체내 vivo) 에서 Factor IX 발현 상승효과를 보인 MT 108(알파 -1-항트립신 전구체， 120bp, 서열번호 13)과 Alb E6(혈청 알부민 프렙단백질, 81bp, 서열번호 14)을 선정하여 시험관내 (/ ro)에서 효과를 평가하였다. 이를 위하여， pGL4.2— CMV 대조군 백터의 프로모터 5' 영역 및 SV40 late poly(A) 시그날의 3' 영역 및 5'3' 양쪽 모두에 MT 108과 Alb E6를 넣은 백터를 제작하였다 (도 4 참고). 또한 LCR 인자의 길이가 매우 짧기 때문에 다중 삽입시켰을 때 발현에 미치는 효과를 평가하기 위해 각각의 위치에 각 인자를 4 개씩 다중 삽입시킨 백터를 제작하였다.
국제특허공개 제 W02009-102085 호에 개시된 백터 (pCRᅳ MT1081cr , pCR-E61cr)를 주형으로 하여 각 인자의 단량체 (monomer)는 1 회 PCR 을 통해 얻었으며， Alb E6X4다합체는 4차례에 걸친 재조합 PCR을 통해 제작하였다. 먼저 각 인자의 단량체를 얻기 위해서， AlbE6xi의 경우 서열번호 17및 18 의 프라이머 세트를 사용하였고， AAT 108X1 의 경우 서열번호 19 및 20 의 프라이머 세트를 사용하였다. DNA가닥 분리를 위하여 94°C에서 2 분간 주형을 변성시키고， 이후 94°C에서 15초간 변성， 55°C에서 15초간 어닐링 및 72°C에서 1 분간 연장의 과정을 30 회 반복한 다음， 72°C에서 5 분간 추가 연장하는 방식으로 증폭하였다. PCR에 의해 증폭된 DNA단편을 겔 추출을 통하여 정제한 다음， pCR2.1-TOP0 플라스미드 백터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호 13및 14로 각각 표시되는 AAT108과 Alb E6유전자의 존재를 확인하였다.
한편， AlbE6X4다합체는 도 5에 개시된 바와 같이 4차례에 걸친 재조합 PCR 을 통해 제작하였다. PCR 조건의 어닐링 시간만 30 초로 연장하고 나머지 조건은 동일하게 수행하였다. 염기서열 분석을 통하여 서열번호 16 로 기재된 AlbE6x4유전자의 존재를 확인하였다. MT 108X4다합체 (서열번호 15)의 경우 Genscript 회사에 의뢰하여 제작하였다.
PGL4.2-CMV 백터의 프로모터 5'영역에 LCR 인자를 삽입하기 위해， 제한효소 Kpnl 과 Nhel 을 이용하여 백터와 PCR 제작 산물을 절단한 후， 라이게이션 (ligation)을 진행하였다. 클로닝 산물에 대해 동일한 제한효소를 처리하여 DNA 겔 상에서 원하는 크기의 밴드가 존재하는지 확인하였다. 이를 통해 5'AAT 108X1, 5'AAT 108X4, 5'Alb E6X1, 및 5'Alb E6X4 백터를 획득하였다.
PGL4.2-CMV 백터의 SV40 late poly(A) 시그날 3'영역에 LCR 인자를 삽입하기 위해， pGL4.2-CMV 백터와 Alb E6 인자의 경우 제한효소 BamHI 을 이용하여 절단하였고, MT 108 인자의 경우 제한효소 Bglll를 이용하여 절단한 후, 양립 말단 (compatible end)을 이용하여 pGL4.2-CMV백터에 삽입하였다.이를 통해 3'AAT 108X1, 3 'AAT 108X4, 3'Alb E6X1 및 3'Alb E6X4 백터를 획득하였다. PGL4.2-CMV백터의 프로모터 5'영역과 SV40 late poly(A)시그날 3'영역에 LCR을 삽입하기 위해서 제한효소 Kpnl과 Nhel을 이용하여 SV40 late poly(A) 시그날 3'영역에 LCR 인자들이 들어있는 백터와 상기에서 제조한 PCR 제작 산물을 처리하여 절단한 후 라이게이션을 진행하였다. 이를 통해 5'3'MT 108X1, 5'3'AAT 108x4， 5'3'Alb E6X1, 및 5'3'Alb E6x4백터를 획득하였다.
LCR 인자의 효과를 확인하기 위해， CH0— K1 부착 세포주에 형질전환을 수행하였다. 형질전환 수행 24시간 전에 DMEM (LONZA, 12-604F)(w/v 10% FBS) 배양 배지에서 계대중인 CH0-K1 세포를 24 웰 폴레이트에 0.5X105 eel Is/웰이 되도톡 500 uL씩 분주하였다. 1 웰 기준으로 하여 1.5 mL 튜브에 테스트 DNA (pGL4.2-CMV, 5'AAT 108X1, 5'AAT 108x4, 5'Alb E6X1, 5'Alb E6X4, 5'3'AAT 108X1, 5'3'AAT 108X4， 5'3'Alb E6X1, 및 5'3'Alb E6X4) 800 ng을 총 부피 50uL가 되도록 Opt i -MEM (Gibco, 31985-088)과 섞어주었다.다른 1.5mL튜브에 리포펙타민 (Invitrogen, 11668027) 2 를 총 부피 50 yL 가 되도록 Opt i -MEM과 섞어준 후， 상온에서 5분간 반웅시켰다. 위의 2가지 용액을 서로 섞고 상온에서 20 분간 반응시켰다. 각 웰에 100 L 씩 분주하였다. 24 시간 이후 배지를 바꿔주고 50 μ g/mL 푸로마이신 (Gibco, A11138-03)을 처리하여 세포 선별을 시작하였다.
총 7 세트에 대해 약 2~4 주간의 선별 기간을 거쳐 만들어진 안정화 세포를 구축하였다. 구축된 안정화 세포에 대하여 One-glo 루시퍼라제 분석 시스템 (Promega, E6110)을 이용하여 MAR 후보인자 분석 시와 동일한 방법으로 루시퍼라제 분석을 수행하였다.7세트의 결과 중 가장 비슷한 경향성을 보이는 3 가지 세트의 결과를 취하여 각 인자들의 효과를 비교하였다. 각 인자들의 Firefly 형광 수치를 세포 수로 보정하여 측정한 결과， pGL4.2-CMV 백터 대비 평균 0.54내지 3.94배의 결과를 나타냈다 (도 6).
도 6 에서 보는 바와 같이， 가장 좋은 효과를 보인 인자는 기존에 사용하고 있는 5'MAR 3.0kb 인자였으며 이는 0.24 내지 9.02 (3.94±4.55)배 상승효과를 보였다. 다음으로 5'3'AAT 108X4 인자가 1.79 내지 4.67 (3.38±1.46)배 상승효과를 보였다. pGL4.2-CMV-3'Alb E6, pGL4.2-CMV-3'Alb E6X4, pGL .2-CMV-3 'AAT 108x1 및 pGL4.2-CMV-3'AAT 108x4 백터의 안정화 발현 상황에서 효과를 확인하기 위해 상기와 동일한 시험을 수행하였다. 2 주간에 걸쳐 푸로마이신 선별을 수행하였으며 1세트의 시험을 수행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7 에서 보는 바와 같이， pGL4.2-CMV-3'AAT 108x4 백터의 경우 PGL4.2-CMV 백터 대비 약 2 배가 상승하는 결과를 확인할 수 있었다. 이는 pGL4.2-CMV-5'AAT 108x4 백터의 경우 평균 1.15 배 상승하는데 그쳤지만， pGL4.2-CMV-5'3'AAT 108X4 백터의 경우 평균 3.38 배 상승효과를 보였다는 점을 간접적으로 설명해주는 결과라 생각하였다 (도 6 참고). 안정화 상황에서 루시퍼라제 분석 시험 결과 2 가지의 효과 있는 LCR 인자들을 확인할 수 있었지만， 기존에 사용하고 있던 5'MAR 3.0kb 에 비해 뛰어난 점을 확인할 수는 없었다. 또한, 형광 측정에 대한 시험의 편차가 크기 때문에 이번 시험을 통해 효과가 확인된 pGL4.2-CMV-3'AAT 108 4 백터와 PGL4.2-CMV-5'3'AAT 108 4 백터를 선정하여 재조합 단백질 발현량을 직접 비교하기로 하였다. 1-3： 인트론 인자 선별 결실형 인간 보체 인자 H(Deletion form of human com lement factor H, FH)의 발현을 통한 키메릭 인트론의 효과를 확인하기 위해 우선 dCFH 유전자를 제작하였다.
2단계의 PCR을 거쳐 CFH의 20개의 short consensus repeat (SCR) 중， 중간 SCR 13개를 제외한 SCR 1~4번 (ReguLatory region)과 SCR 18~20번 (Binding region)을 연결하여 총 7 개의 SCR 을 지닌 dCFH 를 제작하였다. 아래와 같이 진행하는 시험에서 중합효소는 Phus ion High-Fide lity DNA폴리머라제 (Thermo I F-530S)를 사용하였고， DNA 가닥 분리를 위하여 98°C에서 30 초간 주형을 변성시키고， 이후 98°C에서 10 초간 변성， 55°C에서 30 초간 어닐링， 72°C에서 30 초간 연장의 과정을 30 회 반복한 다음， 72°C에서 5 분간 추가 연장하는 방식으로 증폭하였다.
SCR 1 F 프라이머 (서열번호 21)에는 제한효소 Not l 부위가, SCR 20 B 프라이머 (서열번호 24)에는 Xhol 부위가 들어있어 추후에 클로닝에 이용할 수 있게 하였다.
1 단계 PCR 에서는 pMSGneo-hCFH 를 주형으로 하여 SCR 1 F 프라이머 (서열번호 21)와 SCR 5번의 뒷부분 (3 ' )영역과 SCR 18번의 앞부분 (5 ' )영역이 포함된 SCR 5(18) B 프라이머 (서열번호 22)를 이용하여 SCR 1-5 번 단편을 얻었다. 또한 pMSGneo-hCFH를 주형으로 하여 SCR 5번 뒷부분 (3 ' ) 영역과 SCR 18번 앞부분 (5 ' ) 영역이 포함된 SCR 18(5) F프라이머 (서열번호 23)와 SCR 20 B 프라이머 (서열번호 24)를 이용하여 SCR 18-20 번 단편을 얻었다. 이렇게 얻어진 2 가지 단편을 Promega 사의 위자드 ® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템 (Wi zard® SV Gel and PCR C lean-Up system)으로 정제하여 회수하였다. 이때， 상기 pMSGneo-hCFH 의 제조방법은 다음과 같다. 먼저， PCMV-SP0RT6-hCFH 백터 ( Imagene , #IRATp970B10140D)를 주형으로 프라이머쌍 (서열번호 47 및 48)을 이용하여 PCR 을 수행하였다. PCR 은 PCMV-SP0RT6-hCFH 5 ng 에 각 프라이머 ( 10 nmol /mL) 1 μ 1 , PCR 프리 -믹스 l i UAccuPower® ProFi Taq PCR PreMix , Bioneer ) 및 증류수 46 를 흔합하여 총 50 u L의 PCR 반웅 흔합물을 만든 후， 상기 반웅 흔합물을 94°C에서 30초， 65°C에서 60 초 및 65°C에서 3 분 20 초간 30 사이클로 반웅시켜 수행하였다. 상기 PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기영동한 후, 겔 용리 (gel elut ion)를 수행하여 hCFH를 코딩하는 유전자 단편을 수득하였다.
이어서， 상기 수득한 hCFH 를 코딩하는 유전자 단편과 백본 백터로서 pMSGneo 백터 (목암연구소， 한국)를 각각 Not l 및 Xhol 으로 처리한 다음， T4 리가아제 ( Hgase)를 이용하여 라이게이션하여 hCFH 의 발현 백터를 수득하였으며， 이렇게 제조된 발현 백터를 "pMSGneo-hCFH"로 명명하였다. 2단계 PCR은 1단계 PCR을 통해 얻은 2가지 단편을 주형으로 하고, SCR 1 F 프라이머 (서열번호 21)와 SCR 20 B 프라이머 (서열번호 24)를 이용하였다. 중합효소는 Phusion High-Fidel ity DNA 폴리머라제 (Thermo I F-530S)를 사용하였고， DNA가닥 분리를 위하여 98°C에서 30초간 주형을 변성시키고， 이후 98°C에서 10 초간 변성， 55°C에서 30 초간 어닐링， 72°C에서 45 초간 연장의 과정을 30 회 반복한 다음， 72°C에서 5 분간 추가 연장하는 방식으로 증폭하여 dCFH 유전자 (서열번호 46)를 얻었다 (도 8). 다음으로 pcDNA-dCFH 발현 백터를 제작하였다.
pMSGneo-dCFH 백터와 pcDNA3.1(+) 백터를 Notl 과 Xhol 제한효소를 사용하여 37°C에서 약 3 시간 동안 절단하였다. 절단한 백터를 아가로스 겔로 전기영동하여 pMSGneo-dCFH 절단 유전자에서는 dCFH 유전자를 겔에서 오려내었고, pcDNA3.1(+) 백터는 백터 크기의 유전자를 겔에서 오려내었다. 겔에서 오려낸 유전자들은 Promega 사의 위자드 ® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 분리 정제하여 회수하였다. 절단된 유전자들을 DNA라이게이션 키트 Ver.2.1를 이용하여 16°C에서 약 6시간 동안 반웅시켜 pcDNA-dCFH발현 백터를 제작하였다.
이어서 pcDS— dCFH 발현 백터를 제작하였다. pCDNA3.1(+) 백터와 Yll IX pcIW 백터 (Ate/e/c Acids Res. , 2008 Sep; 36(15) :e96 참고)를 Nhel (NEB /
R0131S)과 Notl 제한효소로 절단하였다. 절단한 유전자를 아가로스 겔로 전기영동하여 Yll IX pcIW 절단 유전자에서는 키메릭 인트론 유전자 (서열번호
25)를 겔에서 오려내었고， pcDNA3.1(+) 백터는 백터 크기의 유전자를 겔에서 오려내었다. 겔에서 오려낸 유전자들은 Promega 사의 위자드 ® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 분리 정제하여 회수하였다. 절단된 유전자들을 DNA 라이게이션 키트 Ver.2.1 를 이용하여 16°C에서 약 6 시간 동안 반웅시켜 pcDS-MCS백터를 제작하였다. 또한， 제작한 pcDS-MCS백터와 pcDNAᅳ dCFH백터를 대상으로 하여 위와 같은 방법을 통해 pcDS-MCS 의 백터의 Nhel/Notl 절단 부위에 dCFH 유전자가 삽입된 pcDS-dCFH 백터를 제작하였다.
WPRE유전자 (서열번호 26)를 확보하기 위해 Yll IX pcIW백터를 주형으로 PCR 을 실시하였다. 아래와 같이 진행하는 시험에서 중합효소는 Phusion High-Fidel i ty DNA폴리머라제 (Thermo I F-530S)를 사용하였고， DNA가닥 분리를 위하여 98°C에서 30 초간 주형을 변성시키고， 이후 98°C에서 10 초간 변성， 55°C에서 30초간 어닐링， 72°C에서 30초간 연장의 과정을 30회 반복한 다음， 72°C에서 5 분간 추가 연장하는 방식으로 증폭하였다. 사용한 WPRE F 프라이머 (서열번호 27)에는 제한효소 Xhol 부위와 WPRE B 프라이머 (서열번호 28)에는 Xbal 부위가 들어있어 추후에 클로닝에 이용할 수 있게 하였다. PCR을 통해 얻어진 산물은 Promega 사의 위자드 ® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하여 회수하였다.
상기 PCR을 통해 획득한 WPRE 유전자와 pcDS-dCFH 백터를 Xhol 과 Xbal (NEB I R0145S) 제한효소를 사용하여 37°C에서 약 1 시간 동안 절단하였다. 절단한 유전자들은 Promega 사의 위자드 ® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템으로 정제하여 회수하였다. 절단된 유전자들을 DNA 라이게이션 키트 Ver .2.1 을 이용하여 16°C에서 약 3 시간 동안 반웅시켜 pcDS-dCFH 의 백터의 Xhol I /Xbal 절단 부위에 WPRE 유전자가 삽입된 pcDSW-dCFH 백터를 제작하였다. 키메릭 인트론의 일시적 발현량 증가 효과를 확인하기 위해 CH0-S 세포( 111 ^0£611 , #R800-07)를 준비하였다. 세포 해동 후 125 mL 에를렌마이어 스케일 (Er lenmeyer scale)에서 FreeStyle CH0 발현 배지 ( Invi trogen,
#12651-014)로 3 X 105 cel ls/mL, 30 mL 로 시딩하고， 2~3 일 후 1.2~2.0 106 cel ls/mL 수준까지 자라날 수 있도록 2~3 계대 정도 유지하였다. 이후， 상기 제조한 pcDNA-dCFH벡터， pcDS-dCFH백터 및 pcDSf-dCFH백터를 Freestyle™ Max 시약 ( Invi trogen, #16447-100)을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환 후， 3 일 경과 시점부터 7 일째까지 하루 한 차례 배양액을 1 mL 씩 회수하였다. 회수한 배양액을 통하여 세포 수와 생존율을 측정하였으며, 인간 보체 인자 H, ELISA 키트 (Hycult biotech, #HK342)를 이용하여 dCFH 발현량을 확인하였다 (도 9) . pcDNA-dCFH 백터가 형질 전환된 CHO-S 세포의 경우 최대 약 13.025 Ug/mL 의 발현 정도를 보였으며， 그에 비해 pcDS-dCFH 백터가 형질 전환된 CH0-S세포의 경우 최대 약 30.757 ug/mL, pcDSW-dCFH백터는 48.208 yg/mL로 각 백터별로 pcDNA-dCFH 대비 약 2.4배와 3.7배의 높은 발현 정도를 보였다. 두 번째로 키메릭 인트론의 효과를 확인하기 위해 제작한 dCFH 발현 백터를 FreeStyle™ 293-F 세포 (Invitrogen I R790-07)에 형질전환하였다. Freestyle 293 발현 배지 (Gibco I 12338-018)에 FreeStyle™ 293-F 세포를 배양하였다. 형질전환 24시간 전에 세포를 7X105 cells/mL로 계대하였다. 형질전환 당일 날， 125ml 삼각 플라스크 (erlenmeyer flasks)에 배양 배지를 이용하여 7X106cells/mL로 총 부피가 30mL이 되도록 희석하였다.1.5 mL 튜브에 형질전환용 플라스미드 (pcDNA-dCFH, pcDS-dCFH 및 pcDSW-dCFH) 30yg과 OptiPRO™ SFM (Gibco I 12309-019)을 이용하여 총 부피가 600 uL가 되도록 섞어주었다. 새로운 1.5 mL 튜브에 90 uL 의 PEI MAX (Polyscience I 24765-2) (1 yg/uL)와 510 의 OptiPRO™ SFM을 섞어주었다. 플라스미드가 들어있는 용액과 PEI MAX가 들어있는 용액을 서로 섞어준 후,상온에서 10분간 반웅시켰다. 293-F 세포가 들어있는 삼각 플라스크를 천천히 돌리면서 섞어준 용액을 넣어주었다. 5% C02 및 37°C 현탁 배양기에서 130 rpm 으로 7 일간 배양하였다.3일 이후부터 7일간 배양한 배지를 1.5mL튜브에 획득한 후， 5000 rpm 에서 3 분간 원심 분리하여 세포를 침전시켰다. 그 후， 상층액을 취하고 인간 보체 인자 H, ELISA 키트 (Hycult biotech I HK342)를 이용하여 dCFH 발현량을 확인하였다 (도 10).
도 10 에서 보는 바와 같이， pcDNA-dCFH 가 형질전환된 세포에서는 최대 138.9 yg/mL의 발현 수준을 보여주었고， pcDS—dCFH의 경우 최대 638.8 ug/mL 그리고 pcDSW-dCFH 의 경우 최대 896.7 ug/mL 의 발현 수준을 보여주었다. 키메릭 인트론이 존재하는 백터를 형질 전환한 경우 pcDNA-dCFH 발현 백터 대비 약 4.6 배 상승하는 결과를 보여주었고, 키메릭 인트론과 WPRE 가 함께 존재하는 경우 약 6.5배 상승하는 결과를 보여주었다. 마지막으로， 키메릭 인트론의 안정적 발현량 증가 효과를 확인하기 위해
CH0-DG44세포 (Dr L. Chasin, Columbia Universi ty)를 준비하였다. 세포 해동 후 MEM 알파 w/ HT (Gibco, 12571-063) + 10% DFBS (Biotechni cs research, 7103) 배지에서 3 X 106 cel ls/T75 플라스크로 시딩 후 2~3 일 후 컨플루언시 (conf luency) 90% 수준까지 자라날 수 있도록 2~3 계대 정도 유지하였다. 이후， 상기 제조한 pcDNA-dCFH백터， pcDS-dCFH백터 및 pcDSW-dCFH 백터를 리포펙타민 ® 2000 형질전환 시약 (Invi trogen, #11668-027)을 이용하여 5 X 106 cel ls/플라스크의 세포에 형질전환하였다. 형질전환 후， 48 시간 경과하여 세포 선별을 위해 G418 500 g/mL 을 첨가한 배지로 교환해 주었다. 일주일 가량 세포의 성장을 살피면서 플라스크가 80~90% 차게 되었을 때 1 차 계대를 해주었다. 1 차 계대 후 2~3 일에 플라스크가 80-90%가 차는 정도의 성장속도를 보이면 두 번 정도 계대를 진행 한 후 T75 플라스크에 5 X 106 세포를 동일하게 T75 플라스크에 접종한 뒤, 3 일 경과 시점부터 7 일째까지 하루 한 차례 배양액을 1 mL 씩 회수하였다. 마지막 7 일째에는 세포에 0.25% 트립신 -EDTA ( Invitrogen, #25200-056)를 처리하여 세포 수광 생존율을 측정하였으며， 인간 보체 인자 H, ELISA 키트 (Hycult biotech, # HK342)를 이용하여 dCFH 발현량을 확인하였다 (도 11) .
도 11 에서 보는 바와 같이， pcDNA-dCFH 백터가 형질 전환된 CH0-DG447 세포의 경우 최대 약 0.054 u g/mL 의 발현 정도를 보였으며, 그에 비해 pcDS-dCFH 백터가 형질 전환된 CHCH)G447 의 경우 최대 약 0.934 y g/mL, pcDSW-dCFH 백터는 0.924 y g/mL로 각 백터별로 pcDNA-dCFH 대비 약 17.3배와 17.1배의 높은 발현 정도를 보였다. 1-4： 추가 인자 선별
MAR 및 LCR 인자 선별 시 1 차 선별했던 4 가지 인자들을 이용하여 FIX
(Factor IX) 단백질 발현량을 비교하는 방법으로 추가 선별을 진행하였다. 상기에서 제조된 루시퍼라제 백터에서 루시퍼라제 유전자를 제거하고 FIX 유전자를 삽입하는 방법으로 백터 제작을 하기로 하였고， 이후 신규백터 제작에 사용하기 위해서 FIX유전자 앞쪽에 Xhol, Pad및 Apal제한효소 부위가 포함되도록, 뒤쪽에는 Apal 및 Fsel 부위가 포함되도록 프라이머 세트 (서열번호 29 및 30)를 제작하였다.
이어， pMSG-FIX 백터를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트 (서열번호 29 및 30)를 사용해서 PCR을 수행하였다.
상기 pMSG-FIX백터의 제조방법은 다음과 같다. 먼저， FIX유전자 분리를 위해서 인간 간 (liver) 세포로부터 oligo-dT column (Invitrogen, USA)을 이용하여 mRNA를 추출하였다.유전자 은행에 등록된 FIX유전자 (Ref.; Genbank accession No. Ml 1309； 1 ~ 2775 bp) 염기서열에 근거하여 FIX유전자 특이적인 5' 말단과 FIX 3' 플탱킹 부위에 결합하는 프라이머 세트 (서열번호 49 및 50)를 제작한 후 티탄 원 튜브 (Titan one tube) RT-PCR 시스템 (Roche)으로 RT-PCR을 실시하여 약 1,383 bp (461 아미노산) 크기의 FIX cDNA 를 합성하고 pGEM-T 백터 (Promega)에 클로닝하였다.
분리된 FIX유전자를 Nhel과 BgUI 를 포함하는 프라이머 세트 (서열번호 51 및 52)로 PCR 하여 증폭한 후 동물세포 발현백터인 pMSG 백터 (목암연구소， 한국)에 클로닝하였다. 상기 PCR 로 얻어진 FIX 유전자를 Nhe I 과 Bglll 제한효소 (New England Bio Labs, USA)로 자른 후 아가로스 겔 전기영동으로 약 1.4 kb 크기의 유전자를 분리하였으며, 상기 분리된 FIX 유전자를 Nhel 과 Bglll 제한효소로 미리 처리된 pMSG백터와 접합 (ligation)하여 FIX발현백터를 제조하였다. 접합 반웅이 끝난 DNA 흔합물을 E. coli DH5a 에 CaCl2 침전법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli는 50 yg/niL암피실린이 포함된 LB 플레이트에 뿌려 37°C에서 하루 밤 동안 배양하였다. 배양 플레이트에 생긴 콜로니를 배양한 후 QIA 필터 미니 -플라스미드 키트 (filter mini-Plasmid Kit;
Qiagen, Germany)를 이용하여 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드
DNA 를 Nhel /Bglll 제한효소를 처리하여 FIX DNA 단편이 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 제조된 발현 백터를 "pMSG— FIX "로 명명하였다. PCR 에 의해 증폭된 DNA 단편을 겔 추출을 통하여 정제한 다음， PCR2.1-T0P0 플라스미드 백터에 삽입하였다. 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석을 통하여 서열번호 31 로 기재된 FIX 유전자의 존재를 확인하였다. FIX 유전자는 제한효소 Xhol 및 Fsel 을 이용하여 루시퍼라제 유전자가 제거된 백터에 동일한 제한효소를 사용하여 삽입하였다. 이렇게 제작된 FIX 발현백터 세트 1의 모식도는 도 12에 도시하였다. 부착세포주인 CH0-K1 에서 루시퍼라제 발현 테스트와 동일한 방법으로 FIX 발현정도를 측정하였다. 상기 기재한 바와 동일하게 약 2 주간의 선별 기간을 거쳐서 안정화 세포를 구축하였다. 실험은 총 4 세트로 진행이 되었고, FIX발현량을 ELISA 방법으로 측정하여 세포수로 보정하였다.
FIX ELISA 방법은 다음과 같다. 웰에 있는 배양 배지를 1.5 mL 류브에 수거하였다. 각 웰 당 1 XPBS 1 mL 씩 넣어 세척하였다. 형질 전환된 세포를 트립신 -EDTA 100 μ ΐ 웰씩 분주하고 37 °C 세포 배양기에서 1 분간 반웅시켜 세포를 바닥에서 떼어 내었다. 각 웰에 배양 배지 1 mL 씩을 분주하여 세포를 획득한 후， 세포 수를 측정하였다. 세포를 계속 배양해 나갈 경우 12 웰 플레이트 기준 0.5~1.0X 105 cel ls/mL 로 계대를 수행하며， 푸로마이신 (50 y g/mL)으로 세포 선별을 수행하였다.
인간 FactorIX 항원의 ELISA 용 매치-쌍 항체 세트 (Matched-Pai r
Ant ibody set for ELISA of human Factor IX ant igen, Af f inity Biological , FIX-EIA)에서 제공하고 있는 포착 항체 (Capture ant ibody)를 코팅 버퍼 (50 mM 카보네이트 버퍼， 3차 증류수 1 L에 1.59g N C03및 2.93g NaHC03를 넣어준 후， pH를 9.6으로 적정 )를 이용하여 1八 00으로 회석하였다. 96웰 ELISA플레이트에 100 μ ΐ 웰씩 희석한 포착 항체를 분주한 후， 상온에서 2시간 동안 반웅시켰다.
PBS-트원 버퍼를 이용하여 3 차례 세척하였다. 표준 (Standard)으로서 사용할
Factor FIX (Benef ix, 250 y g/mL)을 희석 버퍼를 사용하여 50 ng/niL부터 0.781 ng/mL 까지 1/2 단계희석을 통해 준비하였다. 처음에 수거한 배양 배지를 희석 버퍼 (1¾ BSA in 1 XPBS)를 이용하여 1/10， 1/100 및 1/1000 회석하였다. 플레이트에 100 μ!7웰로 분주한 후， 상온에서 1 시간 30 분 동안 반웅시켰다. PBS-트원 버퍼를 이용하여 3 차례 세척하였다. ΤΜΒ 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 (mi crowel l peroxidase substrate)을 100 μ ΐ 웰씩 분주하고 상온에서 10 분간 반웅시켰다. 2.5Μ H2S04 를 100 μΐ 웰씩 분주하여 반응을 멈추고, 마이크로플레이트 리더 450 nm에서 측정하였다.
도 13 및 하기 표 2 에서 보는 바와 같이， 전체적인 경향성은 이전 루시퍼라제 결과와 비슷하게 나타났다. CMV 대비 SV40 프로모터가 약 3.4 배 정도 상승효과가 확인되었고， 가장 효과가 좋았던 것은 PGL4.2-SV40— 5 'MAR3.0 백터로 CMV대조군 대비 7배, SV40대조군 대비 2. 1배의 발현량 상승효과를 볼 수 있었다.
【표 2]
Figure imgf000026_0001
LCR 인자들의 경우 SV40 프로모터 상황에서의 효과를 관찰하기 위하여 프로모터를 치환하는 클로닝을 수행하였다. 기존 CMV프로모터를 지닌 백터에서 제한효소 Nhel 과 Xhol 을 사용하여 CMV 프로모터를 제거한 후， 동일한 제한효소로 SV40 프로모터를 삽입하였다. 추가로 5 'MAR 와 3 'AAT 108x4 의 2 가지 인자를 가진 조합과 5' 3 'MAR3.0 백터도 제작하여 시험에 사용하였고， 제작된 FIX 발현백터 세트 2의 모식도는 도 14에 도시하였다. 상기 FIX 발현백터 세트 1 과 동일하게 부착세포주인 CH0-K1 에서 FIX 발현정도를 측정하였다. 약 2 주간의 선별 기간을 거쳐서 안정화 세포를 구축하였다. 실험은 총 3 세트로 진행되었고， FIX 발현량을 ELISA 방법으로 측정하여 세포 수로 보정하였다.
도 15 및 하기 표 3 에서 보는 바와 같이， SV40 프로모터 대조군 대비 발현량이 증가하는 경우가 보이지는 않았지만 SV40 프로모터로 교체한 LCR 후보군에서 pSV40-5 'MAR3.0 보다 발현량이 뛰어난 백터는 확인되지 않았다. 이에， FIX 발현량 비교를 통해 SV40 프로모터와 5 'MAR3.0 인자를 선정하였다.
【표 3】
Figure imgf000027_0001
실시예 2: 신규백터 제작 상기 실시예 1 을 통해 선별된 인자들을 이용하여 신규백터를 제작하였다.
FIX 발현 비교 시험에 사용했던 pSV4()-5'MAR3.0-FIX 백터를 제한효소
Apal 을 처리하여 FIX 유전자를 제거한 후， 자가-라이게이션하여 pSV40-5'MAR3.0-MCS 백터를 확보하였다. MCS에는 Xhol, Pad, Apal 및 Fsel의 4가지 제한효소 부위가 포함되어 있다.
pSV40-5'MAR3.0-MCS 백터에서 푸로마이신 선별 부분을 DHFR 발현 부분으로 교체하여 DHFR 유전자를 가진 백터를 추가로 제조하였다. 교체를 위해서 제한효소 부위를 확인해 보면 Sapl 부위가 앞뒤로 2 군데 존재하는 것으로 확인되었고，뒤쪽의 경우 Sail과 ΑΠΙΠ를 처리한 후 클레노브 (klenow) 효소로 블런트 말단 (blunt end)을 만들어서 자가-라이게이션하여 제거하였다. 푸로마이신 발현 시스템 (pMS-P-MCS)의 제한효소 맵의 모식도를 도 16 에 나타내었다. 필요한 DHFR발현 시스템은 기존 소 내에서 사용하던 pDCHIP백터의 것을 이용하기로 하였다. 햄스터 DHFR 유전자와 5' 플탱크， 3' 플랭크 포함하여 약 2.5 kb에서 프로모터와 polyA부분을 참고문헌 (Proc. Natl. Acad. Sci. , 1991， vol88. p8572; 및 Mol . Cell. Biol. , 1984, Vol.4, p38)에서 확인하여 약 1.5 kb로 줄여서 PCR프라이머를 디자인하였다 (서열번호 32 및 33).
pDCHIP 백터를 주형으로 PCR 을 수행하여 DNA 를 얻었고, 이를 PCR2.1-T0P0 백터에 삽입하여 유전자 서열을 확인하였다 (서열번호 34). 유전자 서열이 확인된 DHFR 발현 부분에 대해 pSV4()-5'MAR 3.0-MCS 백터에 삽입하는 과정을 거쳤다. 제한효소 Sapl 과 Sail 을 이용하여 백터와 삽입체를 각각 절단한 후 다시 연결하였다. 클로닝 산물에 대해 동일한 제한효소를 처리하여
DNA 겔 상에서 원하는 크기의 밴드가 존재하는지 확인하였다. 이러한 과정을 통해 신규백터 쌍 (pMS-P-MCS 및 pMS-D-MCS)이 완성되었다 (도 17). 완성된 신규백터 쌍의 유전자 발현능을 기존 백터와 비교하기 위해서， 상기 신규백터 쌍 및 기존의 MAR 백터인 pMSGneo 백터 (목암연구소， 한국) 각각에 ER2 항체 (EGFR 항체， 대한민국 특허 제 1108642 호 참고) 유전자를 클로닝하였다. 두 가지 백터에 클로닝하기 위해서 ER2 항체의 중쇄， 경쇄 모두 5 '영역에는 제한효소 Xhol 및 Nhel 부위를， 3 '영역에는 제한효소 Pacl 및 Xhol 부위를 추가하여 PCR 을 수행하였다. PCR 은 주형으로 각각 p0pt iVEC-ER2HC 및 pcDNA3.3-ER2LC 백터를 이용하였으며， 프라이머는 중쇄의 경우 HC (서열번호 35 및 36)세트를， 경쇄의 경우 LC (서열번호 37및 38)세트를 사용하여 수행하였다. PCR 산물은 pCR2. 1-T0P0 백터에 삽입하여 유전자 서열을 확인하였다 (서열번호 42 및 43) .
서열이 확인된 ER2 항체의 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자를 Nhel 및 Xhol 제한효소를 이용해서 pMSGneo 백터로 클로닝하였으며， 또한 Xhol 및 Pacl 제한효소를 이용해서 신규백터 쌍 (pMS-P-MCS 및 pMS-D-MCS)에 각각 클로닝하였다. 클로닝 산물에 대해 동일한 제한효소를 처리하여 DNA 겔 상에서 원하는 크기의 밴드가 존재하는지 확인하여 ER2 항체 발현용의 신규백터 쌍 1 (PMS-P-ER2LC 및 pMS-으 ER2HC) 및 MAR 백터 쌍 (pMSGneo-ER2LC 및 pMSGneo-ER2HC)의 4개의 백터를 완성하였다 (도 18A 및 18B) . 한편， 앞서 제작한 신규백터 쌍 1 에 키메릭 인트론을 추가하였을 때의 효과를 확인하기 위한 백터를 추가 제작하였다. pcDS-dCFH 백터를 주형으로 서열번호 44및 45의 프라이머 세트를 이용해서 PCR을 수행하여 DNA를 얻었고, PCR 산물은 pCR2. 1-TOP0 백터에 삽입하여 키메릭 인트론의 유전자 서열 (서열번호 25)을 확인하였다. ER2 항체 발현용 신규백터 쌍 1 인 pMS-P-ER2LC 백터와 pMS_D-ER2HC 백터를 Xhol 으로 절단하고， 동일 제한효소를 처리한 키메릭 인트론을 각각 삽입하였다. 이러한 과정을 통해 본 발명에 따른 E 2 항체 발현용 신규백터 쌍 2 (pMSI-P-ER2LC 및 pMSI-D-ER2HC ER2)가 완성되었다 (도 19) . 신규백터 쌍 2 의 인자 특성을 파악하기 위한 ER2 항체 발현 백터를 추가로 제작하였다.
SV40 프로모터만 가진 백터는 pGL4.2-SV40-FIX 백터를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 FIX 유전자를 제거하여 pS-P-MCS 백터를 제작하고， 추가로 푸로마이신 유전자를 DHFR 유전자로 교체하는 방법으로 pS-D-MCS 백터를 제작하였다. 이후 ER2 경쇄와 중쇄를 제한효소 Xhol 및 Pacl 를 이용하여 삽입하여 SV40 프로모터를 갖는 ER2 항체 발현 백터 쌍인 pS-P-ER2LC 및 pS-D— ER2HC벡터를 제작하였고 (도 20A) , 이렇게 제조된 백터에 키메릭 인트론을 제한효소 Xhol 을 이용하여 삽입하여 키메릭 인트론 포함 백터 쌍인 PSI-P-ER2LC 및 pSI-D-ER2HC 백터를 제작하였다 (도 20B) . 실시예 3: 백터의 유전자발현능평가 앞서 제작한 신규백터들의 유전자 발현능을 다음과 같이 확인하였다.
3-1： 부착 세포주에서의 ER2 항체 발현용 신규백터 쌍 1 및 2의 평가 먼저， CH0-K1 부착 세포주와 CH0-DG44 부착 세포주를 대상으로 신규백터 쌍 1및 2를 이용한 ER2항체 발현을 수행하여 표 4에 개시된 상용더블백터 쌍 및 MAR 백터 쌍과 발현량을 비교하였다.
【표 4】
Figure imgf000030_0001
PMS-P-ER2LC
신규백터 쌍 1
pMS— D-ER2HC
PMSI-P-ER2LC
신규백터 쌍 2
PMSI-D-ER2HC
형질전환 24 시간 전에， DMEM (w/ 10% FBS) 배양 배지에서 배양 중인 CH0-K1 세포를 12 웰 플레이트에 0.8X105 cells/웰이 되도록 500 UL 씩 분주하였다. MEM알파 w/HT(Gibco, 12571-063)배양 배지에 배양 중인 CH0-DG44 세포는 1.5X105 cells/웰이 되도록 500 씩 분주하였다. 분주 24시간 후, 1 웰 기준 1.5 mL 튜브에 Opti-MEM 과 테스트 백터를 총 부피 50 iL 가 되도록 섞어 주었다. 새로운 1.5 mL튜브에 1 웰 기준 Opti-MEM 47 uL 와 리포펙타민 20003 uL를 섞어준 후 상온에서 5분간 반웅시켰다. 반웅 완료 후， 상기에서 제조한 2가지 용액을 섞어주고 상온에서 20분간 반웅시켰다. 24시간 이후， 각 웰에 형질전환 되어있는 배지를 걷어내고 PBS 를 이용하여 세척하였다. 트립신 -EDTA(lx)를 100μΐ 웰씩 분주하고 37°C에서 1 분간 반웅시켜 세포를 떼어 내었다. 배양 배지를 1000μΐ 웰씩 분주하고 세포 수를 측정하였다.
CH0-K1 세포의 경우 12 웰 플레이트에 L0X105 eel Is/웰로 총 부피 1 mL이 되도록 분주하고， 각 백터에 맞게 G418(PAA, P11-012)은 1000 yg/mL로， 푸로마이신은 50 yg/mL 로 첨가하여 세포 선별을 수행하였다. DG44 의 경우 12 웰 플레이트에 1.5X105 eel Is/웰로 총 부피 1 mL 이 되도록 분주하고， 각 백터에 맞게 G418은 750 yg/mL로， 푸로마이신은 20 yg/mL로 첨가하여 세포 선별을 수행하였다. 형질전환은 총 2 세트를 수행하였으며 세트 당 3 주간에 걸쳐 총 3차례에 걸쳐 샘플을 획득하여 ELISA시험을 수행하였다.
ER2 ELISA방법은 다음과 같다. 염소 항 -인간 IgG (Fab-speci f ic)(Sigma,
15260)을 코팅 버퍼를 이용하여 5 yg/mL로 희석하였다.96웰 ELISA플레이트에 각 웰당 100 nl 씩 회석한 포착 항체를 분주한 후， 상은에서 2 시간 이상 반웅시켰다. PBSᅳ 0.1% Tween20 버퍼 300 를 이용하여 3 차례 세척하였다.
PBS-1%BSA를 300 μΐ 웰 당 넣고 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다 . PBS-0.1¾ Tween 20버퍼 300 를 이용하여 3차례 세척하였다. 표준으로서 사용할 Hbig 유전자 (2.8 mg/mL)를 PBS-1% BSA를 사용하여 280， 140 , 70， 35， 17.5, 8.75 및 4.375 ng/mL로 준비하였다. 배양액을 PBS- BSA를 이용하여 회석하였다. 포착 항체가 코팅되어 있는 96 웰 플레이트에 표준과 희석한 배양액을 dupl i cat ion 으로 100 μ ! 웰로 분주한 후， 상온에서 1 시간 동안 반웅시켰다. PBS-0. 1% Tween 20 버퍼 300 를 이용하여 3차례 세척하였다. 염소 항 -인간 IgG(Fc 특이성) -HRP (Sigma, A0170)를 PSB— BSA 를 이용하여 1/100 , 000 로 희석하였다. 플레이트에 100 μ ΐ 웰로 분주한 후， 상온에서 1 시간 동안 반웅시켰다. PBS-0. 1¾ Tween 20버퍼 300 ii L를 이용하여 3차례 세척하였다. TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질을 100 μ ΐ 웰씩 분주하고 상온에서 30 분간 반웅시켰다. 2.5Μ H2S04 를 100 μ ΐ 웰씩 분주하여 반응을 멈추고, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm 에서 측정하였다. 4—파라미터 피팅 (parameter f i tt ing)으로 표준커브 (standard curve)를 작성하고 배양액의 측정된 흡광도를 대입하여 농도를 산출하였다.
하기 표 5， 및 도 21A및 21B에서 보는 바와 같이 , CH0-K1세포에서 상용 더블백터 쌍은 ER2 Ab발현량을 확인할 수 없었다. 기존 MAR백터 쌍의 경우 약 9.7 ng/mL ,신규백터 쌍 1의 경우 평균 약 14.0 ng/mL ,그리고 신규백터 쌍 2의 경우 평균 약 1473.2 ng/mL의 발현량을 보였다. 신규백터 쌍 1은 MAR 백터 쌍 대비 발현량이 약 1.4 배 높은 것을 확인할 수 있었고， 신규백터 쌍 2 는 MAR 백터 쌍 대비 약 151.3 배 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한， 신규백터 쌍 1 대비 약 105.4 배 높은 것으로 나타나 키메릭 인트론의 효과가 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
CHO DG44 에서 ER2 Ab 평균 발현량이 상용 더블백터 쌍 13. 1 ng/mL , MAR 백터 쌍 3.8 ng/mL ,신규백터 쌍 1은 27.5 ng/mL그리고 신규백터 쌍 2는 653.0 ng/mL 의 발현량을 보였다. 상용 더블백터 쌍은 MAR 백터 쌍 대비 발현량이 약
3.5배 높은 것을 확인할 수 있었고，신규 백터 쌍 1은 약 7.3배，신규 백터 쌍
2 는 약 173.7 배 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한， 신규 백터 쌍 2 는 신규 백터 쌍 1 대비 약 23.8배 높은 것으로 나타났다. 【표 5】
Figure imgf000033_0001
3-2： 현탁 세포주에서의 신규백터 쌍 2의 평가 현탁 세포주인 CH0-S 와 CD DG44-S 세포주에서 신규백터 쌍 2 를 평가하였다.
CH0-S세포주 (Gibco, A13696-01)의 경우， 형질전환 수행 24시간 전에 CD FortiCHO 배지에서 5~6x 105 cells/mL 의 양으로 필요량에 맞추어 계대하였다. 형질전환 수행 당일, 세포 수와 생존력 (viability, 반드시 95% 이상)을 측정하였다. 125 niL 플라스크에 1X106 cells/mL 로 CD FortiCHO 배지 (Gibco, A11483-01)에 분주하였다. 90 의 플라스미드 DNA 를 OptiPro™ SFM 를 이용하여 총 부피가 1.5mL이 되도록 섞어주었다.270 uLPEI MAX(1 yg/iiL)와 OptiPro™ SFM 1230 uL 를 섞어주었다. 이때 절대 보텍싱 (vortexing)하지 않았다. PEI MAX 가 포함된 OptiPro™ SFM 을 플라스미드 DNA 가 포함된 OptiPro™ SFM 에 넣어주고 부드럽게 섞어주었다. 그리고 5 분간 상온에서 반웅시켰다. 이렇게 생성된 DNA: PEI 복합체 3 mL를 미리 준비해 놓은 125 mL 플라스크 CH0-S 세포에 한 방울씩 떨어뜨려주었다. 37°C 및 C02 흔합 배양기 (shaking incubator)에서 130-150 rpm으로 배양하고 48 시간 후에 세포 선별을 수행하였다. 한편， CD DG44-S 세포주의 경우 다음과 같은 방법에 따라 제조되었다. 먼저， CHO DG44 부착세포주 ( a-MEM(w/) + 10% cFBS 배지에서 배양)를 무혈청배지 (HyQ SFM4CH0 (Thermo Scientific, Hyclone) + IX HT Supplement)를 이용하여 2~3 일 간격으로 125 mL스피너 플라스크를 이용하여 50 mL 배지에서 계대 배양하면서 부유배양에 적웅시켰다. 적응된 세포주를 EX-CELL™ CD CHO (Sigma, 14361C)/4mM L-글루타민 /IX HT Supplement 배지로 바꾸어 2~3 일 간격으로 계대 배양하면서 배지에 적웅시켰다. 세포의 성장이 안정적이고， 생존율이 90%이상 유지되면서 세포의 농도가 l~2 x 106cells/mL에 도달했을 때 CHO DG44-S숙주 세포주를 뱅킹 (banking)하여 확립하였다. 형질전환 수행 24 시간 전에 EX-CELL™ CD CHO (Sigma, 14361C)에서 5-7 X105 cells/mL 의 양으로 필요량에 맞추어 계대하였다. 125mL 플라스크에 2X106 cells/mL 로 Freestyle CH0 배지를 이용하여 15 mL 로 분주하였다. 30 lig의 플라스미드 DNA를 150mMNaCl을 이용하여 총 볼륨이 0.75 mL이 되도록 섞어주었다.90 uLPEI MAX(1 yg/ L)와 150 mM NaCl을 섞어주었다. 이때 절대 볼텍싱하지 않았다. PEI MAX 가 포함된 150 mM NaCl 을 플라스미드 DNA 가 들어있는 150mMNaCl에 넣어주고 부드럽게 섞어주었다.그리고 5분간 상온에서 반응시켰다. 이렇게 생성된 DNA:PEI 복합체 1.5 mL를 미리 준비해 놓은 125 mL 플라스크 CD DG44-S 세포에 한 방울씩 떨어뜨려 주었다. 37°C 및 C02 흔합 배양기에서 130 rpm으로 5 시간 동안 배양하였다. 15 mL 의 EX-CELL™ CD CHO (Sigma, 14361C) 배지를 첨가하여 130 rpm 으로 배양한다. 48 시간 후에 세포선별을 수행하였다.
CH0-S 의 경우 하기 표 6 에 기재된 바와 같은 선별 배지를 준비하여 세포 선별을 진행하였다. 【표 6】
Figure imgf000035_0001
먼저， 형질 전환한 세포 수를 측정하였다. 각 조건에 맞는 선별 배지를 이용하여 Τ-Γ75플라스크에 5X105 cells/mL로 50 mL씩 분주하였다. 만약 세포 수가 모자라면 총 볼륨을 즐이도록 하였다. 37°C 및 C02 배양기에서 정치 배양하였다. 선별 수행 7일 후， 세포 수를 측정하였다. 생존력이 30%를 넘으면 다음 단계로 진입하고, 만족하지 못할 경우 10-11 일 후에 세포 수를 측정하였다. 11 일 이후에도 생존력이 30% 미만일 경우 T-플라스크의 사이즈를 줄여 3X105 cells/mL 이상이 되도록 새로운 선별배지로 교체해 주었다. 3~4일 간격으로 배지를 완전히 교체해주고 회복 신호가 보이는지 확인하였다. 회복 신호를 보이며 생존력이 30-50%를 나타낼 경우 125ml 플라스크에 3X105 cells/mL 로 조건에 맞는 선별 배지를 이용하여 계대하였다. 37°C 및 C02 흔합 배양기에서 150 rpm 으로 배양하였다. 3~4 일 간격으로 125 플라스크에 3X10 cells/mL 로 조건에 맞는 선별배지를 이용하여 30 mL 로 계대하였다. 희석 배수가 2이상일 경우 완전한 배지 교환을 하지 않았다. 생존력이 85%이상이고 생존 세포 밀도가 IX 106 cells/mL 이상일 경우 선별이 완료된 것으로 하였다. 한편， CD DG44-S 세포주의 경우 하기 표 7 에 기재된 내용에 따라 선별 배지를 준비하여 세포 선별을 진행하였다.
【표 71
Figure imgf000035_0002
형질 전환한 세포수를 측정하였다. 각 백터별 조건에 맞는 선별배지를 이용하여 125ml 플라스크에 5X105 cells/mL로 30 mL씩 분주하였다. 만약 세포 수가 모자라면 총 부피를 줄이도록 하였다. 37°C 및 C02 흔합 배양기에서 130 rpm 으로 배양하였다. 3-4 일 간격으로 125ml 플라스크에 3X105 cells/mL 로 선별배지를 이용하여 30 mL 로 계대를 수행하였다. 회석 배수가 2 이상일 경우 완전한 배지 교환을 하지 않았다. 생존력이 80% 이상이고 생존 세포 밀도가 1X106 cells/mL 이상일 경우 선별이 완료된 것으로 하였다. 형질전환은 총 2 세트를 수행하였으며 세트 당 3~4 주간에 걸쳐 총 3 차례에 걸쳐 샘플을 획득하여 ELISA 시험을 수행하였다.
ER2 ELISA 방법은 상기 부착 세포주에서 기재한 바와 동일한 방식으로 수행하였으며， 그 결과를 표 8에 나타내었다.
하기 표 8에서 보는 바와 같이, ER2항체 3일 생산성은 CH0-S세포주에서, 상용 더블백터 쌍은 0.2-0.3 u /mL, MAR백터 쌍의 경우 1.0-2.0 Wg/mL그리고 신규백터 쌍 2 의 경우 평균 9.5~17.0 ug/mL 수준의 발현량을 보였다. 배치 생산성의 경우, 최대 생산량이 상용 더블백터 쌍은 0.7 ug/mL, MAR 백터 쌍의 경우 10.3 ug/mL, 신규백터 쌍 2 의 경우 평균 35.0 pg/mL 수준의 결과를 보였다. 따라서， 본 발명에 따른 신규백터 쌍 2 는 배치 생산성 기준으로 상용 더블백터 대비 약 50배， MAR 백터 쌍 대비 약 3.4배 이상의 항체 발현량 증가 효과를 확인할 수 있었다.
또한， CD DG44-S 세포주에서 ER2 항체 3 일 생산성은 상용 더블백터 쌍 0.2-0.3 ug/mL, MAR 백터 쌍 0.2-0.25 ug/mL, 신규백터 쌍 2 는 1 ~1.5 g/mL 의 발현량을 보였다. 배치 생산성의 경우， 최대생산량이 상용 더블백터 쌍은 0.7 ug/mL, MAR 백터 쌍의 경우 0.5 ug/mL, 신규백터 쌍 2의 경우 평균 3.6 yg/mL수준의 결과를 보였다.신규백터 쌍 2는 배치 생산성 기준으로 상용 더블백터 대비 약 5.1배， MAR백터 쌍 대비 약 7.2배 이상의 항체 발현량 증가 효과를 확인할 수 있었다. 【표 8]
Figure imgf000037_0001
3-3： 신규백터 구성인자에 대한 특성평가
CH0-S및 CD DG44-S세포주에서 신규백터 구성인자의 특성을 평가하였다. 시험에 사용한 각 백터 쌍은 하기 표 9 에서 보는 바와 같이 pS (프로모터 백터 쌍)， pSI (인트론 백터 쌍)， pMS (신규백터 쌍 1) 및 pMSI (신규백터 쌍 2)로 구성하였다.
【표 9】
Figure imgf000037_0002
평가 방법은 상기 실시예 3-2 에서 수행한 방법과 동일한 방식으로 각각의 백터 쌍을 형질전환한 후 선별기간을 거쳐 선별이 완료된 시점에서 ER2 항체 발현량을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
【표 10】
Figure imgf000038_0001
표 10에서 보는 바와 같이， CH0-S세포주의 경우， 신규백터 쌍 1및 2는 약 4 주， 프로모터 백터 쌍은 약 4.5 주， 인트론 백터 쌍은 약 7 주 만에 세포선별이 완료되었다. MAR인자가 있는 신규백터 쌍 1및 2가 인트론 백터 쌍 대비 선별기간이 약 1.8 배 빠른 것으로 확인되었다. 선별 결과 프로모터 백터 쌍 대비 3 일 생산성은 인트론 백터 쌍 18.4 배， 신규백터 쌍 1 은 1.8 배， 신규백터 쌍 2 는 20.6 배 증가하였고， PCD(Pi cogram/cel ls/date)의 경우에는 인트론 백터 쌍 13.3 배， 신규백터 쌍 1 은 1.0 배 그리고 신규백터 쌍 2 는 26. 1배 증가하였다.
CD DG44-S세포주의 경우， 4가지 백터구성 모두 약 3주 만에 세포선별이 완료되었다. CH0-S 와는 다르게 모든 백터들이 비슷하게 적웅되었다. 또한， 프로모터 백터 쌍 대비 3 일 생산성은 인트론 백터 쌍 13.8 배， 신규백터 쌍 1은 2.4배，신규백터 쌍 2는 64.8배 증가하였고， PCD의 경우에는 인트론 백터 쌍 14.7배， 신규백터 쌍 1은 3.8배， 신규백터 쌍 2는 86.4배 증가하였다. 결론적으로 MAR 인자와 인트론 인자를 각각 따로 사용하는 것보다 같이 사용하는 경우 3 일 생산성과 PCD 부분에서 약 1.6 내지 2.0 배 정도의 시너지 효과가 있는 것으로 확인되었다. 본 발명을 상기의 구체적인 실시예와 관련하여 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 당 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있다.

Claims

특허청구의 범위
1. 작동가능하게 연결된 SV40(simian virus 40) 프로모터; 스캐폴드 부착부위 (scaffold attachment region, SAR) 또는 매트릭스 부착부위 (matrix attachment region, MAR) 인자; 및 키메릭 인트론 (chimeric intron)을 포함하는 발현백터.
2. 제 1 항에 있어서，
상기 SV40 프로모터가 서열번호 12의 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 발현백터.
3. 제 1 항에 있어서，
상기 SAR 인자가 서열번호 39의 염기서열로 표시되고， MAR 인자가 서열번호 40 또는 서열번호 41의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는， 발현백터.
4. 제 1 항에 있어서ᅳ
상기 키메릭 인트론이 서열번호 25의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는， 발현백터.
5. 제 1 항에 있어서，
상기 발현백터가 서열번호 15 또는 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 로커스 조절부위 ( locus control region, LCR) 인자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현백터.
6. 제 1 항에 있어서，
상기 발현백터가 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는, 발현백터.
7. 제 6 항에 있어서，
상기 목적 유전자가， FVI Kfactor VI I )유전자， FVI l Kfactor VI I I )유전자 FIX(factor IX) 유전자， 표피 성장 인자 수용체 패밀리 (epidermal growth factor receptor fami ly) 항체 유전자， 인슐린 유전자， 인터루킨 유전자， 종양괴사인자 유전자， 인터페론 유전자， 콜로니자극인자 유전자， 케모카인 유전자， 에리트로포이에틴 유전자， α -페토프로테인 유전자， a-글루코시다제 유전자， α ΐ-안티트립신 유전자， 안티트롬빈 유전자， 리포프로테인 유전자， 세를로플라즈민 유전자, 피브리노겐 유전자， 글루코세레브로시다제 유전자, 합토글로빈 유전자，플라즈미노겐 유전자， 프로트롬빈 유전자 및 트랜스페린 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는， 발현백터.
8. 제 1 항에 있어서，
상기 발현백터가 도 19에 개시된 pMSI-P-ER2LC 또는 pMSI-D_ER2HC의 개열 지도를 갖는 것을 특징으로 하는， 발현백터.
9. 게 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 발현 백터에 의해 형질전환된 세포.
10. 제 9 항에 있어서，
상기 세포가 CH0-K1세포, CH0-DG44세포， CH0-S세포， CHO DUK-BI I 세포， C0S7세포， C0S3세포， C0S1세포， NS0세포， HeLa세포, Vero세포, PER-C6 세포， HepG2 세포 및 BHK 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는， 세포.
11. 게 6항 또는 제 7항의 발현백터에 의해 형질 전환된 세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시킨 후 회수하는 단계를 포함하는， 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법 .
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