ES2885448T3 - Vector de expresión que tiene capacidad mejorada para expresar un gen - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión que comprende un elemento de la región de unión a matriz (MAR) que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 41 o 40, y un promotor del virus de simio 40 (SV40) unido operativamente a un intrón quimérico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 25 y un gen diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Vector de expresión que tiene capacidad mejorada para expresar un gen

Campo de la presente invención

La presente invención se refiere a un vector de expresión para mejorar la expresión génica, células transformadas por el vector de expresión y un método para producir en masa una proteína diana utilizando las células transformadas. Antecedentes de la presente invención

La producción de anticuerpos y proteínas recombinantes terapéuticas se ha llevado a cabo utilizando células animales en la mayoría de los casos, y se están haciendo esfuerzos para aumentar la eficiencia de la producción.

Por ejemplo, se ha utilizado una línea celular huésped suspendida que se adaptó previamente en un medio sin suero para la selección rápida de una línea celular de alta producción. Además, se han desarrollado continuamente vectores de alta expresión y líneas celulares de alta producción para eliminar o acortar el tiempo necesario para la amplificación de genes. También se han realizado esfuerzos para desarrollar una forma eficiente mediante el uso de un dispositivo de selección celular automatizado en la selección inicial de líneas celulares.

Las líneas celulares de alta producción muestran niveles de expresión de 30 a 80 pcd incluso sin amplificación génica, y las líneas celulares de alta producción se pueden preparar en 4 meses utilizando vectores de alta expresión con base en la región de unión a matriz (MAR) o un elemento ubicuo de apertura de cromatina (UCOE) que es similar a MAR.

Los estudios recientes muestran que la optimización del vector es necesaria para lograr una productividad de anticuerpos de 3 a 5 g/L en seis meses. Recientemente, se sugiere la posibilidad de mejorar la productividad mediante la optimización de un elemento de MAR tal como dual-MAR, múltiple-MAR, trans-MAR, etc., pero existe una necesidad continua de un vector estable con eficiencia de producción mejorada que pueda ser obtenido mediante la introducción de 5'UTR o elemento de intrón.

El documento WO2012046255 describe un vector de expresión para la producción de proteínas y péptidos que comprende un promotor operativamente ligado al gen de interés, genes I y II de TPL y VA, regiones de unión a matriz (MAR)/SAR, marcador antibiótico.

El documento WO200504038 describe vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN de 146 pb capaz de actuar como aislante de cromatina.

El documento WO2013157020 y número de acceso de EBI, BAX25353 describe un potenciador/promotor temprano de SV40.

El documento WO2012134215 y número de acceso de EBI, BAC10530 describe la secuencia del plásmido pC(F) mEGM(R).

El documento US2013323302 describe un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína tirosina quinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFlt-1).

El documento CN102634515 y número de acceso de EBI, BAJ93140 describe la región de control del locus de alfa 1-antitripsina humana (LCR) AAT108lcr.

El documento CN102634515 y número de acceso de EBI, BAJ93143 describe la región de control del locus del gen de la albúmina humana (LCR) E61cr.

Resumen de la presente invención

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un vector de expresión para expresar y producir una proteína diana en una gran cantidad.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una célula transformada por el vector de expresión anterior. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un método para producir una proteína diana en una gran cantidad utilizando las células transformadas.

Para lograr un objetivo de la presente invención como anteriormente, se proporciona un vector de expresión que comprende un elemento de la región de unión a matriz (MAR) que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 41 o 40, y un promotor del virus de simio 40 (SV40), operativamente unido a un intrón quimérico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 25 y un gen diana.

Para lograr otro objetivo de la presente invención como anteriormente, se proporciona una célula transformada por el vector de expresión anterior, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula CHO-K1, una célula CHO-DG44, una célula una célula CHO-S, una célula CHO DUKX-B11, una célula COS3, una célula COS7, una célula COS1, una célula NSO, una célula HeLa, una célula Vero, una célula PER-C6, una célula HepG2 y una célula BHK.

Para lograr otro objetivo más de la presente invención como anteriormente, se proporciona un método para producir en masa una proteína diana cultivando las células transformadas como se definió anteriormente para expresar la proteína diana; y recuperar la proteína diana.

Un vector de expresión de acuerdo con la presente invención muestra una expresión génica superior en comparación con un vector de expresión convencional y, por lo tanto, la expresión de proteína de un gen exógeno se puede incrementar significativamente.

Breve descripción de los dibujos

Los objetivos y características anteriores y otros de la presente invención resultarán evidentes a partir de las siguientes descripciones de la presente invención, cuando se toman junto con los dibujos adjuntos.

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de vectores de luciferasa con respecto a elementos candidatos de MAR.

La Figura 2 muestra el resultado de la expresión de luciferasa de los elementos candidatos de MAR.

La Figura 3 muestra el resultado de la expresión de luciferasa de la prueba del promotor comparativo.

La Figura 4 muestra un diagrama esquemático de vectores de luciferasa con respecto a elementos candidatos de LCR (región de control del locus).

La Figura 5 muestra una estrategia de PCR para preparar el elemento de la LCR Alb E64X4.

Las Figuras 6 y 7 muestran los resultados de la expresión de luciferasa de los elementos candidatos de la LCR. La Figura 8 muestra el proceso de preparación de dCFH (una forma de eliminación del factor H del complemento humano).

La Figura 9 muestra los niveles de expresión de dCFH en células CHO-S.

La Figura 10 muestra los niveles de expresión de dCFH en células 293-F.

La Figura 11 muestra los niveles de expresión de dCFH en células estables CHO-DG44.

Las Figuras 12 y 13 muestran un diagrama esquemático del conjunto 1 de vectores de expresión FIX y su resultado de expresión, respectivamente.

Las Figuras 14 y 15 muestran un diagrama esquemático del conjunto 2 de vectores de expresión FIX y su resultado de expresión, respectivamente.

La Figura 16 muestra un mapa de enzimas de restricción del sistema de expresión de puromicina.

La Figura 17 muestra las estructuras de un par de vectores nuevos, pMS-P-MCS y pMS-D-MC.

Las Figuras 18A y 18B muestran las estructuras de un primer par de vectores nuevos ("par I de vectores nuevos") para la expresión del anticuerpo ER2 (pMS-P-ER2LC y pMS-D-ER2HC), y un par de vectores de MAR (pMSGneo-ER2LC y pMSGneo-ER2HC), respectivamente.

La Figura 19 muestra las estructuras de un segundo par de nuevos vectores ("par II de vectores nuevos") para la expresión del anticuerpo ER2 (pMSI-P-ER2LC y pMSI-D-ER2HC).

Las Figuras 20A y 20B muestran las estructuras de un par de vectores promotores (pS) (pS-P-ER2LC y pS-D-ER2HC), y un par de vectores intrones (pSI-P-ER2LC y pSI-D-ER2HC), respectivamente.

Las Figuras 21A y 21B muestran los niveles de expresión del anticuerpo ER2 en las células adherentes CHO, CHO-K1 y DG44, respectivamente.

Descripción detallada de la presente invención

En la presente invención, para preparar un vector de expresión estable con eficiencia de producción mejorada para la expresión de un gen exógeno en células CHO (ovario de hámster chino) y similares, se identifican elementos que pueden aumentar el nivel de expresión génica entre varios elementos de MAR, elementos de la región de unión a la estructura (SAR), regiones de control de locus (LCR) y elementos del intrón.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un elemento de la región de unión a matriz (MAR) que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 41 o 40, y un promotor del virus de simio 40 (SV40) unido operativamente a un intrón quimérico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 25 y un gen diana

Como se usa en este documento, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico no traducida secuencia arriba de una región codificante, que comprende un sitio de unión para una polimerasa y que tiene una actividad de iniciación de la transcripción para ARNm para genes secuencia abajo. Específicamente, un "promotor" comprende una caja TATA o una región similar a TATA que sirve para iniciar la transcripción por una ARN polimerasa; pero no se limita a las regiones que lo rodean; y puede comprender las regiones que son necesarias para la asociación con proteínas distintas de la ARN polimerasa para regular la expresión.

En la presente invención, el promotor es un promotor de SV40, preferiblemente un promotor de SV40 de la SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con una realización de la presente invención, un vector de expresión de la presente invención, que usa un promotor de SV40, muestra un incremento de expresión de aproximadamente 4 veces en comparación con un promotor de CMV (véase el Ejemplo 1-1).

Además, dicho promotor está operativamente unido a un gen diana, que es un gen exógeno; y como se usa en el presente documento, "unido operativamente" significa que una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión del gen diana y la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína diana están funcionalmente unidas de manera que pueden realizar una función general. El enlace operable a un vector recombinante se puede implementar usando una técnica de ADN recombinante conocida en la técnica; y la escisión y el enlace del ADN específico del sitio se pueden realizar usando una enzima comúnmente conocida en la técnica.

En la presente invención, para los elementos que aumentan la expresión génica, se incluye un elemento de MAR de SEQ ID NO: 41 o 40. El elemento de MAR puede incluirse para constituir un vector de expresión de modo que dicho elemento o elementos puedan estar presentes en el extremo 5'; el extremo 3'; o ambos extremos 5' y 3' del promotor.

Como se usa en este documento, un "elemento de MAR" se refiere a una secuencia de ADN que une temporalmente un dominio de bucle de ADN transcripcionalmente activo a la matriz nuclear (Pienta et al., (1991) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expres., 1: 355-385), y se conocen en la técnica ejemplos de las secuencias de MAR. Cualquier referencia en el presente documento a un elemento de MAR se limita a un MAR de la SEQ ID NO: 40 o 41 a menos que se indique lo contrario.

En la presente invención, con el fin de seleccionar elementos que aumentan la expresión génica, se realizaron pruebas duales (5' y 5' 3') y cis trans utilizando un ensayo de luciferasa con respecto a la beta-globina humana MAR (Yu, J., Bock, JH, Slightom, JL y Villeponteau, B., Gene 139 (2), 139-145 (1994), GenBank No. L22754) y el gen CSP-B humano que flanquea SAR (Hanson, RD y Ley, TJ, Blood, 79 (3), 610 - 618 (1992), GenBank No. M62716); y como resultado, se seleccionaron ciertos elementos deseados (véase el Ejemplo 1-1).

El elemento de MAR anterior puede ser MAR2.2, representado por la SEQ ID NO: 40 o MAR3.0 representado por la SEQ ID NO: 41 aislado de MAR beta-globina humana. El elemento de MAR puede incluirse de manera que el elemento o elementos puedan estar presentes en el extremo 5'; el extremo 3'; o ambos extremos 5' y 3' del promotor.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el elemento puede ser uno designado como 5' MAR2.2, 5' MAR3.0, 3' MAR2.2, 3' MAR3.0, 5'3' MAR2.2 o 5'3' MAR3.0.

Un vector de expresión de acuerdo con la presente invención también comprende un intrón quimérico para aumentar la expresión génica.

Dicho intrón quimérico puede estar representado por la SEQ ID NO: 25 (Backliwal, G., Hildinger, M., Chenuet, S., Wulhfard, S., De Jesus, M., Wurm, f M, Nucleic Acids Res., 36 (15), e96 (2008), GenBank No. JQ795930), pero la presente invención no se limita al mismo. En la presente invención, el efecto sobre el incremento de la expresión génica se confirmó mediante el ensayo de luciferasa (véase el Ejemplo 1-3).

De acuerdo con la presente invención, un vector de expresión que comprende tanto el elemento de MAR como el elemento intrón quimérico muestra un efecto sinérgico sobre la productividad, que conduce al aumento del nivel de expresión génica (véase el Ejemplo 3-3 y la Tabla 9).

De acuerdo con una realización de la presente invención, el nuevo par II de vectores (pMSI-P-ER2LC y pMSI-D-ER2HC) que comprende un elemento de MAR, un promotor de SV y un intrón quimérico muestra un excelente efecto de aumento de la expresión del gen en comparación con un vector promotor convencional, un vector intrón convencional y el nuevo par I de vectores (pMS-PD-ER2LC y pMS-ER2HC) que no contienen un intrón quimérico.

Un vector de expresión de acuerdo con la presente invención puede comprender además un elemento LCR.

En la presente invención, para identificar elementos que aumentan la expresión génica, se realizaron pruebas relacionadas con multímeros (X 1 yX4) y duales (5', 3' y 5' 3') utilizando un ensayo de luciferasa con respecto a AAT108 (precursor de a-1-antitripsina, 120 pb, Se Q ID NO: 13) y Alb E6 (preproproteína de albúmina de suero, 81 pb, SEQ ID NO: 14), que previamente mostraron un efecto de aumento de la expresión del Factor IX como se describe en la Publicación Internacional No. WO 2009/102085, y como resultado, se seleccionaron elementos de LCR preferidos (véase el Ejemplo 1-2).

El elemento de LCR preferido en la presente invención puede ser AAT108X4 representado por la SEQ ID NO: 15, que puede estar comprendido de modo que esté presente solo en el extremo 3' (3' AAT 108X4); o ambos extremos 5' y 3' del vector (5' 3' AAT 108X4). Además, el elemento de LCR puede ser Alb E6X4 que está representado por la SEQ ID NO: 16.

Además, un gen diana cuya expresión está regulada por un promotor puede insertarse en un vector de expresión de la presente invención.

El gen diana es un gen que codifica un producto exógeno a expresar, y puede ser un gen que codifica cualquier tipo de proteína que pueda expresarse como una proteína recombinante. Dicho gen diana comprende un "sitio de clonación múltiple (MCS)", que es una secuencia de ácido nucleico que tiene sitios de escisión de enzimas de restricción, para insertarse en el vector.

El gen diana anterior puede ser uno de los genes relacionados con la coagulación sanguínea y varios genes de anticuerpos; y puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en el gen del factor VII (FVII), el gen del factor VIII (FVIII), el gen del factor IX (FIX), un gen del anticuerpo de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico, el gen de la insulina, el gen de la interleucina, el gen del factor de necrosis tumoral, gen del interferón, gen del factor estimulante de colonias, gen de la quimiocina, gen de la eritropoyetina, gen de la a-fetoproteína, gen de la a-glucosidasa, gen de la a1-antitripsina, gen de la antitrombina, gen de la lipoproteína, gen de la celuloplasmina, gen del fibrinógeno, gen de la glucocerebrosidasa, gen de haptoglobina, gen del plasminógeno, gen de la protrombina y gen de la transferrina, pero no se limita a los mismos. De acuerdo con una realización de la presente invención, el gen diana puede ser el gen de FIX (factor IX) o el gen del anticuerpo ER2 del receptor del factor de crecimiento epidérmico.

El vector de expresión de acuerdo con la presente invención puede comprender cualquier terminador de transcripción conocido convencionalmente. Preferiblemente, puede estar conectado a poliA. Por ejemplo, puede comprender la señal de poliadenilación tardía (poliA) de SV40.

De acuerdo con una realización de la presente invención, un vector de expresión de la presente invención tiene el mapa de escisión de pMSI-P-ER2LC o pMSI-D-ER2HC mostrado en la Figura 19. La Figura 19 ilustra esquemáticamente un vector de expresión que comprende elementos que aumentan la expresión génica, como un elemento de MAR, un elemento intrón quimérico, un promotor de SV40, poli A, etc.

Mientras tanto, la presente invención proporciona una célula transformada por el vector de expresión anterior, en la que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula CHO-K1, una célula CHO-DG44, una célula CHO-S, una célula CHO DUKX-B11, una célula COS3, una célula COS7, una célula COS1, una célula NSO, una célula HeLa, una célula Vero, una célula PER-C6, una célula HepG2 y una célula BHK.

Además, la presente invención proporciona un método para producir una proteína diana en una gran cantidad que comprende: cultivar células transformadas por el vector de expresión anterior, como se definió anteriormente, para expresar una proteína diana, y luego recuperar la proteína diana.

Dicho método puede comprender las etapas de:

(1) insertar un gen diana cuya expresión está regulada por un promotor en el vector de expresión;

(2) transformar una célula como se definió anteriormente con el vector de expresión en el que se insertó el gen diana; y

(3) cultivar la célula transformada por el vector de expresión para expresar una proteína diana y luego recuperar la proteína diana.

El método para insertar un gen diana, transformar una célula y cultivar la célula para expresar una proteína diana y recuperar la proteína diana se puede llevar a cabo utilizando una técnica conocida en la técnica.

La presente invención se describirá con más detalle con los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar más la presente invención sin limitar su alcance.

Ejemplo 1: Selección de elementos

1-1: Selección del elemento de MAR

Con el fin de mejorar los vectores, se seleccionaron como candidatos MAR de la p-globina humana (MAR de p-globina, 3 kb, 2,2 kb) y un gen CSP-B humano que flanquea SAR (1,2 kb). Además, para realizar un ensayo de gen indicador que permita la evaluación indirecta de la expresión de la proteína, se eligió el ensayo de luciferasa considerando la conveniencia del examen.

Se planificó acceder a los efectos de los vectores para el análisis comparando las diferencias en los valores de fluorescencia entre ellos y un vector de control que no contenía el elemento de MAR, los vectores para el análisis se prepararon en consecuencia. Para evaluar los efectos en una situación estable, se seleccionó el vector de luciferasa de luciérnaga pGL4.20 [luc2/Puro] (Promega Inc.), que contenía el gen de resistencia a la puromicina, un marcador de selección de células rápido y fuerte.

En primer lugar, se llevó a cabo la PCR utilizando el vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, V790-20) como plantilla, el conjunto de cebadores de las SEQ ID NO: 1 y 2, y una ADN polimerasa (Ex-Taq, Takara), para obtener fragmentos de ADN que comprenden un promotor de CMV. Luego, la plantilla se desnaturalizó a 94 °C durante 5 min para separar las cadenas de ADN, y las moléculas de ADN se amplificaron repitiendo un proceso de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 56 °C durante 30 segundos y alargamiento a 72 °C durante 1 minuto durante 30 ciclos, seguido de un alargamiento adicional a 72 °C durante 5 min. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se purificaron mediante extracción en gel y se insertaron en el vector plasmídico pCR2.1-TOPO (Invitrogen, K4500-01). La presencia del promotor del CMV representado por la SEQ ID NO: 11 se verificó mediante un mapeo de escisión usando enzimas de restricción y análisis de secuencia de bases, y el promotor del CMV se insertó en el sitio NheI/XhoI en el sitio de clonación múltiple del vector pGL4.20 [luc2/Puro]. El vector resultante se denominó pGL4.2-CMV y se utilizó como vector de control.

A continuación, utilizando el conjunto de cebadores para SAR (SEQ ID NOS: 3 y 4), el conjunto de cebadores para MAR2.2 (SEQ ID NOS: 5 y 6) y el conjunto de cebadores para MAR3.0 (SEQ ID NOS: 7 y 8), SAR, MAR2.2 y MAR3.0 se insertaron respectivamente en los vectores plasmídicos pCR2.1-TOPO por el mismo método que anteriormente. Los vectores preparados se denominaron pCR2.1-SAR, pCR2.1-MAR2.2 y pCR2.1-MAR3.0.

Se utilizaron los vectores pMSG y 5'B1-P1 (véase la patente de Corea No. 408844) como plantillas de PCR para MAR y SAR, respectivamente. Mediante un mapeo de escisión usando enzimas de restricción y análisis de secuencia de bases, se verificó la presencia de SAR, MAR2.2 y MAR3.0 respectivamente representados por las SEQ ID NOS: 39, 40 y 41. En el procedimiento de clonación posterior, todos los insertos se utilizaron después de la escisión con enzimas de restricción y purificación mediante extracción en gel; y los vectores se utilizaron después de la escisión con enzimas de restricción y el tratamiento con fosfatasa alcalina de camarón.

El inserto preparado cortando los vectores pCR2.1-SAR con BamHI se insertó en el vector pGL4.2-CMV preparado cortando con la misma enzima de restricción. Mediante un mapeo de escisión usando enzimas de restricción, se verificó que el fragmento de ADN de SAR deseado estaba presente en la dirección de avance, y el vector resultante se designó como pGL4.2-CMV-3'SAR. A continuación, los insertos preparados cortando el vector pCR2.1-SAR con KpnI y NheI se insertaron respectivamente en el vector pGL4.2-CMV-3'SAR y el vector pGL4.2-CMV que se cortaron con las mismas enzimas de restricción. Mediante un mapeo de escisión utilizando enzimas de restricción, se verificó la presencia de los fragmentos de ADN diana en cada plásmido, y los plásmidos resultantes se designaron como pGL4.2-CMV-5'3'SAR y pGL4.2-CMV-5'SAR, respectivamente.

Para preparar los vectores que comprenden MAR2.2 y MAR3.0, los insertos preparados cortando pCR2.1-MAR2.2 y pCR2.1-MAR3.0 con KpnI y Nhel, respectivamente, se insertaron en los vectores pGL4.2-CMV preparados cortando con las mismas enzimas de restricción, preparando así los vectores pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 y pGL4.2-CMV-5'MAR3.0 primero; y también, los insertos preparados cortando pCR2.1-MAR2.2 y pCR2.1-MAR3.0 con BamHI se insertaron respectivamente en los vectores pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 y pGL4.2-CMV-5'MAR3.0 que se prepararon cortando con la misma enzima de restricción, para preparar los vectores pGL4.2-CMV-5'3'MAR2.2 y pGL4.2-CMV-5'3'MAR3.0. El elemento de MAR se insertó en sentido inverso. La imagen esquemática de los vectores de luciferasa preparados se muestra en la Figura 1.

Los niveles de expresión de luciferasa de los vectores con los elementos candidatos de MAR se midieron usando la línea celular adherente CHO-K1. Se preparó un conjunto de vectores para evaluar el efecto Cis Trans suministrando adicionalmente los vectores preparados anteriormente para que tuvieran 4 veces más moles de elemento SAR o MAR que también se usaron para la transfección.

Usando lipofectamina 2000 (Invitrogen, 11668027), se transfectó la línea celular CHO-K1 (ATCC, CCL-61) con 1,0 |jg del vector de luciferasa de luciérnaga anterior y, después de 48 horas, se cultivó con pases en medio DMEM (Lonza, 112-604F) que contenía puromicina (50 jg/mL). Las células estables se establecieron durante el período de selección de aproximadamente 2-4 semanas. La prueba se llevó a cabo en un total de 3 series, y el análisis de luciferasa de luciérnaga se realizó mediante un sistema de análisis de luciferasa One-glo (Promega, E6110) en el que los valores se corrigieron para el número de células.

El método de análisis de luciferasa de luciérnaga es el siguiente. Primero, los pocillos en los que se estaban cultivando las células se retiraron del medio de cultivo y se lavaron cada uno con 1 mL de 1 x PBS. Las células transfectadas se añadieron con tripsina-EDTA a 100 jL /pocillo y se dejaron reaccionar durante 1 min a 37 °C para separar las células del fondo. A cada pocillo se le añadió 1 mL de medio de cultivo. Después de contar el número de células, las células transformadas se dispensaron en tubos de 1,5 mL, respectivamente, después de la dilución a razón de 1,0 x 105 células/mL (con base en los recuentos de células viables) con medio de cultivo. En una placa blanca de 96 pocillos, las células se colocaron a razón de 100 pL/pocillo para cada ADN analizado. El reactivo de análisis de luciferasa Oneglo, que se había preparado de antemano, se añadió a los pocillos a razón de 100 pL/pocillo y se dejó reaccionar durante 3 min a temperatura ambiente. Utilizando un fotómetro (EG&G Berthold, luminómetro de microplacas LB 96V), se midieron las RLU (unidades de luz relativa) de luciérnaga. Los resultados de la medición con respecto a los vectores de prueba en comparación con pGL4.2-CMV se muestran en la Figura 2 y la Tabla 1.

Como resultado, el elemento 5' MAR mostró el mejor efecto, que mostró un aumento del efecto de 1,6 a 5,3 veces (promedio) en comparación con el vector de control pGL4.2-CMV. Además, no se encontraron diferencias en los efectos entre los MAR simples y duales o entre los MAR Cis y Cis Trans. Como tal, los valores de los resultados de la prueba de los elementos candidatos no mostraron diferencias significativas entre ellos, pero mostraron grandes variaciones y, por lo tanto, los dos elementos, 5'MAR2.2 y 5'MAR3.0, fueron seleccionados principalmente.

Tabla 1

El efecto del elemento de MAR no fue lo suficientemente bueno como se esperaba y, por lo tanto, se evaluaron los efectos de MAR con respecto a los promotores de CMV y SV40. Específicamente, la PCR se realizó usando el vector pGL4.20 como plantilla y usando el conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 9 y 10, para obtener fragmentos de ADN que contenían un promotor de SV40. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se purificaron mediante extracción en gel y se insertaron en el vector plásmido pCR2.1-TOPO. La presencia del promotor de SV40 representado por la SEQ ID NO: 12 se verificó mediante un mapeo de escisión usando enzimas de restricción y análisis de secuencia de ADN. Y luego los vectores pGL4.2-CMV, pGL4.2-CMV-5'MAR2.2 y pGL4.2-CMV-5'MAR3.0 se trataron con Nhel y Xhol para eliminar el promotor de CMV, y el promotor de SV40 se tratado con las mismas enzimas de restricción se insertó allí para preparar los vectores pGL4.2-SV40, pGL4.2-SV40-5'MAR2.2 y pGL4.2-SV40-5'MAR3.0.

El nivel de expresión de luciferasa en la línea celular adherente CHO-K1 se midió mediante el mismo método que en la prueba del elemento candidato MAR. Las células estables se establecieron mediante un período de selección de aproximadamente 2 semanas. La prueba se llevó a cabo en un total de 2 series, y los valores de fluorescencia de luciérnaga se midieron de la misma manera que se describió anteriormente.

Como se muestra en la Figura 3, SV40 mostró un aumento de aproximadamente 4 veces en el efecto en comparación con el promotor de CMV. Entre ellos, el vector pGL4.2-SV40-5'MAR3.0 mostró el mejor resultado, que mostró efectos de aumento de la expresión génica de 9 veces y 2,2 veces en comparación con el grupo de control de CMV y el grupo de control de SV40, respectivamente.

1-2: Selección del elemento de LCR

Entre los elementos de LCR descritos en la publicación internacional de patente No. WO 2009/102085, AAT 108 (precursor de a-1-antitripsina, 120 pb, SEQ ID NO: 13) y Alb E6 (preproproteína de albúmina de suero, 81 pb, SEQ ID NO: 14), que mostraron efectos de aumento de la expresión del factor IX in vivo, se seleccionaron para evaluar los efectos in vitro. Se añadió AAT 108 o Alb E6 a la región 5', la región 3' de la señal poli (A) tardía de SV40 y las regiones 5' y 3' del vector de control pGL4.2-CMV para obtener varios vectores para la prueba (Véase la Figura 4).

Además, dado que los elementos de LCR son de longitud muy corta, se prepararon los vectores en los que 4 copias de los elementos se insertaron de forma múltiple en cada sitio para evaluar el efecto sobre la expresión cuando los elementos se insertaron de forma múltiple.

Usando los vectores (pCR-AAT108LCR, pCR-E6LCR) descritos en la publicación internacional de patente No. WO 2009-102085, el monómero de cada elemento se obtuvo realizando PCR una vez; y el multímero Alb E6X4 se preparó realizando la PCR recombinante 4 veces.

En primer lugar, para obtener un monómero de cada elemento, se utilizaron el conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 17 y 18 y el conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 19 y 20 para Alb E6X1 y AAT108X1, respectivamente. Luego, la plantilla se desnaturalizó a 94 °C durante 2 min para separar las cadenas de ADN, y las moléculas de ADN se amplificaron repitiendo un proceso de desnaturalización a 94 °C durante 15 segundos, hibridación a 55 °C durante 15 segundos y alargamiento a 72 °C durante 1 min durante 30 ciclos, seguido de un alargamiento adicional a 72 °C durante 5 min. Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se purificaron mediante extracción en gel y se insertaron en el vector plásmido pCR2.1-TOPO. La presencia de los genes AAT108 y AlbE6 representados por las SEQ ID NOS: 13 y 14, respectivamente, se verificó mediante un mapeo de escisión usando enzimas de restricción y análisis de secuencia de ADN.

Por otro lado, el multímero Alb E6X4 se preparó realizando la PCR recombinante 4 veces, como se muestra en la Figura 5. La PCR se llevó a cabo mediante el mismo método que el anterior, excepto que el tiempo de hibridación se extendió a 30 segundos. Mediante un análisis de secuencia de ADN, se verificó la presencia del gen Alb E6X4 representado por la SEQ ID NO: 16. El multímero AAT 108X4 (SEQ ID NO: 15) se sintetizó en Genscript Inc.

Para insertar un elemento de LCR en la región 5' del promotor en el vector pGL4.2-CMV, los vectores y el producto de PCR se cortaron con KpnI y Nhel, seguido de ligación. El producto clonado se trató con las mismas enzimas de restricción y se verificó si la banda con el tamaño deseado estaba presente en un gel de ADN. Mediante el procedimiento anterior, se obtuvieron los vectores 5'AAT 108X1, 5'AAT 108X4, 5'Alb E6X1 y 5'Alb E6X4.

Para insertar un elemento de LCR en la región 3' de la señal de poli(A) tardía de SV40 en el vector pGL4.2-CMV, se cortaron el vector pGL4.2-CMV y el elemento Alb E6 con la enzima de restricción BamHI y el elemento AAT 108 se cortó con la enzima de restricción BglII. Los resultantes se insertaron en el vector pGL4.2-CMV usando extremos compatibles. Mediante el procedimiento anterior, se obtuvieron los vectores 3'AAT 108X1, 3'AAT 108X4, 3'Alb E6X1 y 3'Alb E6X4.

Para insertar LCR en la región 5' del promotor y la región 3' de la señal de poli(A) tardía de SV40 en el vector pGL4.2-CMV, los vectores que contenían un elemento de LCR en la región 3' de la señal de poli(A) tardía de SV40 y el producto de PCR preparado anteriormente se cortaron con las enzimas de restricción KpnI y Nhel, seguido de ligación. Mediante el procedimiento anterior, se obtuvieron los vectores 5'3'AAT 108X1, 5'3'AAT 108x 4, 5'3'Alb E6X1 y 5'3'Alb E6X4.

Para evaluar el efecto del elemento de LCR, se sometió a transfección la línea celular adherente CHO-K1. Veinticuatro horas antes de la transfección, se distribuyeron 500 pL de cada cultivo de células CHO-K1 que se subcultivaron en el medio de cultivo DMEM (LONZA, 12-604F) (FBS al 10% p/v) en una placa de 24 pocillos a razón de 0,5X105 células/pocillo. Se mezclaron 800 ng de ADN de prueba (pGL4.2-CMV, 5'AAT 108X1, 5'AAT 108X4, 5'Alb E6X1, 5'Alb E6X4, 5'3'AAT 108X1; 5'3'AAT 108X4, 5'3'Alb E6X1 y 5'3'Alb E6X4, respectivamente) con Opti-MEM (Gibco, 31985­ 088) en un tubo de 1,5 mL hasta el volumen total de 50 pL (basado en 1 pocillo). En otro tubo de 1,5 mL, se mezclaron 2 pL de lipofectamina (Invitrogen, 11668027) con Opti-MEM hasta un volumen total de 50 pL y se dejó reaccionar durante 5 min a temperatura ambiente. Las dos soluciones preparadas anteriormente se mezclaron y se dejaron reaccionar durante 20 min a temperatura ambiente. El resultante se dispensó en los pocillos a razón de 100 pL/pocillo. Veinticuatro horas después, se refrescó el medio en cada pocillo y se añadieron 50 pg/mL de puromicina (Gibco, A11138-03) a los pocillos para la selección de células.

Con respecto a 7 conjuntos, las células estables se establecieron durante el período de selección de aproximadamente 2-4 semanas. Usando las células estables establecidas, el análisis de luciferasa se realizó mediante el sistema de análisis de luciferasa One-glo (Promega, E6110) por el mismo método que el análisis de elemento candidato MAR. Entre los resultados de 7 conjuntos, se eligieron los resultados de 3 conjuntos que mostraron resultados más similares y se compararon los efectos de elementos individuales. Se midió el valor de fluorescencia de luciérnaga de cada elemento y se corrigió por el número de células, que mostró un aumento de 0,54 a 3,94 veces en comparación con el vector pGL4.2-CMV (véase la Figura 6).

Como se muestra en la Figura 6, el elemento que mostró el mejor resultado fue el elemento 5'MAR de 3,0 kb usado convencionalmente, que mostró un efecto de aumento de 0,24 a 9,02 veces (3,94 ± 4,55). A continuación, el elemento 5'3'AAT 108X4 mostró un efecto creciente de 1,79 a 4,67 veces (3,38 ± 1,46).

Para evaluar los efectos de los vectores pGL4.2-CMV-3'Alb E6, pGL4.2-CMV-3'Alb E6X4, pGL4.2-CMV-3'AAT 108X1 y pGL4.2-CMV-3'AAT 108X4 en expresión estable, se realizaron las mismas pruebas que las anteriores. La selección de puromicina se realizó durante 2 semanas y se realizó una serie de pruebas. El resultado se muestra en la Figura 7.

Como se muestra en la Figura 7, el vector pGL4.2-CMV-3'AAT 108X4 mostró un aumento de aproximadamente 2 veces en comparación con el vector pGL4.2-CMV. Se consideró que este resultado podría explicar, aunque indirectamente, que el vector pGL4.2-CMV-5'AAT 108X4 no mostró un aumento promedio superior a 1,15 veces, pero el vector pGL4.2-CMV-5'3'AAT 108X4 mostró un aumento promedio de 3,38 veces (véase la Figura 6).

A partir de los resultados de la prueba de análisis de luciferasa en la condición estable, se identificaron 2 tipos de elementos de LCR efectivos, pero no mostraron una mejora significativa en comparación con el 5'MAR de 3,0 kb usado convencionalmente. Asimismo, considerando las grandes variaciones en la prueba de medición de fluorescencia, los vectores cuyos efectos se verificaron en la presente prueba, vector pGL4.2-CMV-3'AAT 108X4 y el vector pGL4.2-CMV-5'3'AAT 108X4, fueron elegidos y se planeó evaluar directamente sus niveles de expresión de proteínas recombinantes.

1-3: Selección de elementos de intrón

Para evaluar el efecto de un intrón quimérico mediante la expresión de la forma de eliminación del factor H del complemento humano (dCFH), se preparó primero el gen dCFH.

A través de 2 etapas de PCR, se preparó dCFH que tiene un total de 7 SCR (repeticiones de consenso cortas) uniendo los SCR # 1~4 (región reguladora) a los SCR # 18-20 (región de unión), que se seleccionaron entre 20 SCR en el CFH, excluyendo 13 SCR intermedios. En la prueba que se realizó como se indica a continuación, se utilizó como polimerasa la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (Thermo/F-530S); y la plantilla se desnaturalizó a 98 °C durante 30 segundos para separar las cadenas de ADN, y las moléculas de ADN se amplificaron repitiendo un proceso de desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y alargamiento a 72 °C durante 30 segundos durante 30 ciclos, seguido de un alargamiento adicional a 72 °C durante 5 minutos.

El cebador SCR 1 F (SEQ ID NO: 21) contenía el sitio de la enzima de restricción NotI, y el cebador SCR 20 B (SEQ ID NO: 24) contenía el sitio XhoI, de modo que se pueden usar en la clonación futura.

En la primera etapa de la PCR, los SCR # 1 -5 se obtuvieron utilizando pMSGneo-hCFH como plantilla, y utilizando el cebador SCR 1 F (SEQ ID NO: 21) y el cebador SCR 5(18) B (SEQ ID NO: 22) que contenía la región posterior (3') de SCR # 5 y la región frontal (5') de SCR # 18. Además, los fragmentos de SCR # 18-20 se obtuvieron usando pMSGneohCFH como plantilla y usando el cebador SCR 18(5) F (SEQ ID NO: 23) que contenía la región posterior (3') de SCR # 5 y la región frontal (5') de SCR # 18 y el cebador SCr 20 B (SEQ ID NO: 24). Los dos tipos de fragmentos preparados se purificaron y recuperaron con gel Wizard® SV y el sistema Clean-Up (Promega) de PCR.

El método de preparación del pMSGneo hCFH anterior es el siguiente.

En primer lugar, se llevó a cabo la PCR usando el vector pCMV-SPORT6-hCFH (Imagene, #IRATp970B10140D) como plantilla, y usando un par de cebadores (SEQ ID NOS: 47 y 48). La PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: se preparó un total de 50 pL de mezcla de reacción de PCR mezclando 5 ng de pCMV-SPORT6-hCFH, 1 pL de cada cebador (10 nmol/mL), 1 pL de premezcla de PCR (AccuPower ® ProFi Taq p Cr PreMix, Bioneer) y 46 pL de agua destilada; y luego la mezcla se sometió a un proceso de reacción a 94 °C durante 30 segundos, a 65 °C durante 60 segundos, a 65 °C durante 3 minutos y 20 segundos, durante 30 ciclos. Después de que el producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se obtuvieron los fragmentos de genes que codifican hCFH mediante elución en gel.

A continuación, los fragmentos de genes que codifican hCFH y el vector pMSGneo (Mogam Institute, Corea), un vector de cadena principal, se trataron con NotI y XhoI, respectivamente; luego, se ligaron usando ligasa T4 para obtener un vector de expresión de hCFH; y el vector de expresión así preparado se denominó "pMSGneo-hCFH".

La segunda etapa de la PCR se realizó utilizando los 2 tipos de fragmentos obtenidos en la primera etapa de la PCR como plantillas, y utilizando el cebador SCR 1 F (SEQ iD NO: 21) y el cebador SCR 20 B (SEQ ID n O: 24). Con la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (Thermo/F-530S), las plantillas se desnaturalizaron a 98 °C durante 30 segundos para separar las cadenas de ADN, y las moléculas de ADN se amplificaron repitiendo un proceso de desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, y alargamiento a 72 °C durante 45 segundos durante 30 ciclos, seguido de un alargamiento adicional a 72 °C durante 5 min, para obtener el gen dCFH (SEQ ID NO: 46) (Figura 8).

A continuación, se preparó el vector de expresión pcDNA-dCFH.

El vector pMSGneo-dCFH y el vector pcDNA3.1 (+) se cortaron con las enzimas de restricción NotI y XhoI durante aproximadamente 3 horas a 37 °C. Los vectores cortados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa; y los genes dCFH entre los genes pMSGneo-dCFH cortados, y el gen con un tamaño del vector entre los genes pcDNA3.1 (+) cortados se escindieron del gel. Los genes cortados se purificaron y recuperaron con gel Wizard® SV y el sistema Clean-Up de PCR. Los genes cortados se hicieron reaccionar a 16 °C durante aproximadamente 6 horas usando el kit de ligadura de ADN versión 2.1, para preparar el vector de expresión pcDNA-dCFH.

A continuación, se preparó el vector de expresión pcDS-dCFH. El vector pcDNA3.1 (+) y el vector Y11 LC pcIW (véase: Nucleic Acids Res., Septiembre de 2008; 36 (15): e96) se cortaron con enzimas de restricción NheI (NEB/R0131S) y NotI. Los genes cortados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa; y los genes de intrones quiméricos (SEQ ID NO: 25) entre los genes del vector Y11 LC pcIW cortados, y el gen del vector pcDNA3.1 (+) cortados se escindieron del gel. Los genes cortados se purificaron y recuperaron con el gel Wizard® SV y el sistema Clean-Up de PCR. Los genes cortados se hicieron reaccionar a 16 °C durante aproximadamente 6 horas usando el kit de ligadura de ADN versión 2.1, para preparar el vector pcDS-MCS. Además, utilizando el vector pcDS-MCS y el vector pcDNA-dCFH preparados anteriormente, se preparó el vector pcDS-dDFH mediante el método anterior, en el que se insertó el gen dCFH en el sitio de escisión de NheI/NotI del vector pcDS-MCS.

Para asegurar el gen WPRE (SEQ ID NO: 26), se llevó a cabo una PCR usando el vector Y11 LC pcIW como plantilla. En la prueba que se realizó como se indica a continuación, se utilizó como polimerasa la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (Thermo/F-530S); y la plantilla se desnaturalizó a 98 °C durante 30 segundos para separar las cadenas de ADN, y las moléculas de ADN se amplificaron repitiendo un proceso de desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y alargamiento a 72 °C durante 30 segundos durante 30 ciclos, seguido de un alargamiento adicional a 72 °C durante 5 minutos. El cebador WPRE F utilizado en este documento (SEQ ID NO: 27) contenía el sitio XhoI de la enzima de restricción, y el cebador WPRE B (SEQ ID NO: 28) contenía el sitio Xbal, por lo que pueden usarse en la clonación futura. Los productos de PCR obtenidos se purificaron y recuperaron con gel Wizard® SV y el sistema Clean-Up de PCR.

El gen WPRE obtenido mediante la PCR anterior y el vector pcDS-dCFH se cortaron con las enzimas de restricción XhoI y Xbal (NEB/R0145S) a 37 °C durante aproximadamente 1 hora. Los genes cortados se purificaron y recuperaron con gel Wizard® SV y el sistema Clean-Up de PCR. Los genes cortados se hicieron reaccionar a 16 °C durante aproximadamente 3 horas usando el kit de ligadura de ADN Versión 2.1, para preparar el vector pcDSW-dCFH, en el que se insertó el gen WPRE en el sitio de escisión de XhoI/XbaI del vector pcDS-dCFH.

Para verificar el efecto de aumento del nivel de expresión transitorio del intrón quimérico, se preparó la célula CHO-S (Invitrogen, #R800-07). Las células se descongelaron; se sembraron en 30 mL de medio de expresión FreeStyle CHO (Invitrogen, #12651-014) a razón de 3 x 105 células/mL usando escala de Erlenmeyer; y se mantuvieron durante 2~3 pases para que pudieran crecer hasta 1,2~2,0 x 106 células/mL en 2~3 días. Luego, las células se transfectaron con el vector pcDNA-dCFH, el vector pcDS-dCFH y el vector pcDSW-dCFH preparados anteriormente usando el reactivo FreestyleMR Max (Invitrogen, #16447-100). Después de la transfección, se recogió 1 mL de la solución de cultivo una vez al día desde el día 3 al día 7. Utilizando las soluciones de cultivo recogidas, se midió el número de células y la viabilidad; y usando el kit ELISA de factor H del complemento humano (Hycult Biotech, # HK342), se verificaron los niveles de expresión de dCFH (Figura 9).

Las células CHO-S transfectadas con el vector pcDNA-dCFH mostraron el nivel máximo de expresión de aproximadamente 13,025 pg/mL, mientras que las células CHO-S transfectadas con el vector pcDS-dCFH y el vector pcDSW-dCFH mostraron niveles máximos de expresión de aproximadamente 30,757 pg/mL y 48,208 pg/mL, respectivamente. Cada vector mostró un nivel de expresión de aproximadamente 2,4 a 3,7 veces mayor que pcDNA-dCFH.

En segundo lugar, para verificar el efecto de un intrón quimérico, el vector de expresión dCFH preparado se transfectó en células 293-F FreeStyleMR (Invitrogen/R790-07). Se cultivaron células 293-F FreeStyleMR en medio de expresión Freestyle 293 (Gibco/12338-018). Veinticuatro horas antes de la transfección, las células se pasaron a razón de 7 x 105 células/mL.

El día de la transfección, las células se diluyeron en un matraz Erlenmeyer de 125 mL usando medio de cultivo hasta el volumen total de 30 mL a razón de 7 x 106 células/mL. En un tubo de 1,5 mL, se mezclaron 30 pg de plásmidos para transfección (pcDNA-dCFH, pcDS-dCFH y pcDSW-dCFH) y OptiPROMR SFM (Gibco/12309-019) hasta un volumen total de 600 pL. En un tubo nuevo de 1,5 mL, se mezclaron 90 pL de PEI MAX (Polyscience/24765-2) (1 pg/pL) y 510 pL de OptiPROMR SFM. La solución que contenía plásmidos y la solución que contenía PEI MAX se mezclaron y reaccionaron durante 10 min a temperatura ambiente. Mientras se giraba lentamente el matraz Erlenmeyer que contenía las células 293-F, se le añadió la solución mixta. Las células se cultivaron en una incubadora de suspensión de CO2 al 5% a 37 °C con 130 rpm durante 7 días. El medio de cultivo se recogió en un tubo de 1,5 mL durante 7 días a partir del día 3 y se centrifugó durante 3 min a 5.000 rpm para precipitar las células. Luego, se tomó el sobrenadante y usando el kit ELISA de factor H del complemento humano (Hycult Biotech/HK342), se midió el nivel de expresión de dCFH (Figura 10).

Como se muestra en la Figura 10, las células transfectadas con pcDNA-dCFH, pcDS-dCFH y pcDSW-dCFH mostraron niveles de expresión máximos de aproximadamente 138,9 pg/mL, 638,8 pg/mL y 896,7 pg/mL, respectivamente. Las células transfectadas con los vectores que contenían un intrón quimérico mostraron un aumento de aproximadamente 4,6 veces, y las células transfectadas con los vectores que contenían tanto el intrón quimérico como WPRE mostraron un aumento de aproximadamente 6,5 veces, en comparación con el vector de expresión pcDNA-dCFH.

Por último, para verificar el efecto sobre la expresión estable de un intrón quimérico, se prepararon las células CHO-DG44 (DR L. Chasin, Columbia University). Las células se descongelaron; se sembraron en medio MEM a w/HT (Gibco, 12571-063) DFBS al 10% (Biotechnics Research, 7103) a razón de 3 x 106 células/matraz T75; y se mantuvieron durante 2~3 pases para que pudieran crecer hasta una confluencia del 90% en 2~3 días. Luego, el vector pcDNA-dCFH, el vector pcDS-dCFH y el vector pcDSW-dCFH preparados se transfectaron en las células usando el reactivo de transformación Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, #11668-027) a razón de 5 x 106 células/matraz. Después de 48 horas de la transfección, el medio se reemplazó con un medio suplementado con 500 pg/mL de G418 para la selección de células. Mientras se controlaba el crecimiento celular durante aproximadamente una semana, el primer pase se llevó a cabo hasta una confluencia del 80-90%. Si las células mostraron aproximadamente un 80-90% de confluencia en 2 -3 días después del primer pase, se realizaron dos pases más y las células se inocularon en un matraz T75 a razón de 5 X 106 células/matraz de la misma manera, y luego se recogió 1 mL de la solución de cultivo una vez al día desde el día 3 hasta el día 7. El último día del día 7, se contó el número de células y la viabilidad después de tratar las células con tripsina-EDTA al 0,25% (Invitrogen, # 25200-056); y el nivel de expresión de dCFH se midió usando el kit ELISA de factor H del complemento humano (Hycult Biotech, #HK342) (Figura 11).

Como se muestra en la Figura 11, las células CHO-DG44 transfectadas con el vector pcDNA-dCFH mostraron el nivel de expresión máximo de aproximadamente 0,054 pg/mL, mientras que las células CHO-DG44 transfectadas con el vector pcDS-dCFH y el vector pcDSW-dCFH mostraron los niveles de expresión máximos de aproximadamente 0,934 pg/mL y 0,924 pg/mL, respectivamente. Cada vector mostró un nivel de expresión aproximadamente de 17,3 a 17,1 veces mayor que pcDNA-dCFH.

1-4: Selección de elementos adicionales

Se llevó a cabo una selección adicional comparando los niveles de expresión de la proteína FIX (Factor IX) usando los cuatro elementos que se seleccionaron en la selección primaria de elementos de MAR y LCR. Se planificó que los vectores se prepararían eliminando el gen de luciferasa del vector de luciferasa preparado anteriormente e insertando el gen de FIX en el mismo. Para su uso en las nuevas preparaciones de vectores, se preparó un conjunto de cebadores (SEQ ID NOS: 29 y 30) de manera que los cebadores incluyan sitios de enzimas de restricción xhoI, PacI y ApaI en la parte delantera, y sitios de ApaI y FseI en la parte posterior del gene FIX.

A continuación, se llevó a cabo la PCR usando el vector pMSG-FIX, como plantilla, y el conjunto de cebadores (SEQ ID NOS: 29 y 30).

El método de preparación del vector pMSG-FIX es el siguiente. En primer lugar, se extrajo ARNm de células hepáticas humanas utilizando una columna de oligo-dT (Invitrogen, EE. UU.) Para la separación del gen FIX. Después de preparar un conjunto de cebadores (SEQ ID NOS: 49 y 50) que se une con el extremo 5' específico del gen de FIX y la región flanqueante 3' con base en la secuencia del gen de FIX registrada en el banco de genes (Ref.: GenBank acceso No. M11309; 1-2.775 pb), se llevó a cabo RT-PCR utilizando el sistema de RT-PCR de un tubo Titan (Roche) para sintetizar el ADNc de FIX con un tamaño de aproximadamente 1.383 pb (461 aminoácidos), que luego se clonó en el vector pGEM-T (Promega).

El gen de FIX separado se amplificó mediante PCR usando un conjunto de cebadores (SEQ ID NOS: 51 y 52) que incluían NheI y BgIII, y se clonó en el vector pMSG (Mogam Biotechnology Institute, Corea), que es un vector de expresión de células animales. El gen de FIX obtenido de la PCR se escindió usando enzimas de restricción NheI y BgIII (New England Bio Labs, EE.UU.), y luego se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,2% para separar el gen con un tamaño de 1,4 kb. El gen de FIX separado se ligó al vector pMSG que se trató previamente con enzimas de restricción NheI y BgIII, para preparar el vector de expresión FIX. Se transformó E. coli DH5a con la mezcla de ADN, en la que se completaron las reacciones de ligación, utilizando precipitación con CaCh. La E. coli transformada se extendió sobre una placa de LB que contenía 50 pg/mL de ampicilina y se cultivó durante la noche a 37 °C. Después de cultivar las colonias formadas en la placa de cultivo, los plásmidos se aislaron usando el kit mini-Plásmido con filtro QIA (Qiagen, Alemania). Se confirmó que el ADN plasmídico aislado contenía los fragmentos de ADN de FIX mediante el tratamiento con enzimas de restricción NheI/BgIII. El vector de expresión así preparado se denominó "pMSG-FIX".

Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se purificaron mediante extracción en gel y se insertaron en el vector plasmídico pCR2.1-TOPO. La presencia del gen de FIX representado por la SEQ ID NO: 31 se verificó mediante un mapeo de escisión usando enzimas de restricción y análisis de secuencia de ADN. En el vector en el que se eliminó el gen de la luciferasa usando las enzimas de restricción XhoI y FseI, se insertó el gen de FIX usando las mismas enzimas de restricción. La imagen esquemática del conjunto 1 de vectores de expresión de FIX así preparado se muestra en la Figura12.

La expresión de FIX en la línea celular adherente CHO-K1 se midió mediante el mismo método que la prueba de expresión de luciferasa. De la misma manera que se describió anteriormente, se establecieron células estables a través de un período de selección de aproximadamente 2 semanas. La prueba se llevó a cabo en un total de 4 series, y el nivel de expresión de FIX se midió mediante el método ELISA y se corrigió para el número de células.

El método de ELISA para FIX es el siguiente. Los medios de cultivo de los pocillos se recogieron en tubos de 1,5 mL. Cada pocillo se lavó con 1 mL de 1 x PBS. Se añadieron 100 pL/pocillo de tripsina-EDTA a los pocillos, que luego se dejaron reaccionar en una incubadora de células a 37 °C durante un minuto para separar las células transfectadas del fondo. A cada pocillo se le añadió 1 mL de medio de cultivo para recolectar células y se contó el número de células. En el caso de cultivos continuos, las células se cultivaron con pases a 0,5 x 1,0 x 105 células/mL utilizando placas de 12 pocillos, y la selección celular se llevó a cabo utilizando puromicina (50 pg/mL).

Los anticuerpos de captura proporcionados por el conjunto de anticuerpos de pares emparejados para ELISA del antígeno del factor IX humano (Affinity Biological, FIX-EIA) se diluyeron a 1/100 usando un tampón de recubrimiento (tampón de carbonato 50 mM; pH ajustado a 9,6 después de añadir 1,59 g de Na2CO3 y 2,93 g de NaHCO3 a 1 L de agua tridestilada). Los anticuerpos de captura diluidos se dispensaron en una placa ELISA de 96 pocillos a razón de 100 pL/pocillo y se dejaron reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con tampón PBS-Tween. A continuación, se preparó Factor FIX (Benefix, 250 pg/mL) como estándar a través de diluciones a la mitad cada vez desde 50 ng/mL hasta 0,781 ng/mL usando un tampón de dilución. El medio de cultivo recogido primero se diluyó a 1/10, 1/100 y 1/1.000 usando un tampón de dilución (BSA al 1% en 1XPBS), y luego se añadió a los pocillos a razón de 100 pL/pocillo y se dejó reaccionar durante 1 horas y 30 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con tampón PBS-Tween. A cada pocillo se le añadió luego 100 pL de sustrato de peroxidasa de micropocillo TMB y se dejó reaccionar durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadió a cada pocillo 100 pL de H2SO42,5 M para detener la reacción y se leyó la absorbancia usando un lector de microplacas a 450 nm.

Como se muestra en la Figura 13 y la Tabla 2 a continuación, la tendencia general fue similar a los resultados anteriores con la luciferasa. El promotor de SV40 mostró un efecto de aumento aproximadamente 3,4 veces mayor en comparación con el promotor de CMV. El más eficaz fue el vector pGL4.2-SV40-5'MAR3.0, que mostró un efecto de aumento del nivel de expresión de 7 veces y 2,1 veces en comparación con el grupo de control de CMV y el grupo de control de SV40, respectivamente.

Tabla 2

Para examinar los efectos de los elementos de LCR bajo el control del promotor de SV40, los vectores se sometieron a un proceso de clonación para la sustitución del promotor. El promotor de CMV se eliminó de los vectores preparados anteriormente que tenían el promotor de CMV usando enzimas de restricción NheI y XhoI, y el promotor de SV40 se insertó usando las mismas enzimas de restricción. Además, los vectores que tienen la combinación de los vectores 5'MAR y 3'AAT108X4, y 5'3'MAR3.0 se prepararon y usaron en la prueba. La imagen esquemática del conjunto 2 de vectores de expresión de FIX preparado se ilustra en la Figura 14.

La expresión de FIX en la línea celular adherente CHO-K1 se midió mediante el mismo método que para el conjunto 1 de vectores de expresión de FIX. Las células estables se establecieron mediante un período de selección de aproximadamente 2 semanas. La prueba se llevó a cabo en un total de 3 conjuntos, y se midió el nivel de expresión de FIX mediante el método ELISA y se corrigió para el número de células.

Como se muestra en la Figura 15 y la Tabla 3 a continuación, no hubo casos que mostraran un aumento en el nivel de expresión en comparación con el grupo de control de SV40; y en el grupo de candidatos de LCR con un reemplaza del promotor de SV40, ningún vector mostró un nivel de expresión más alto en comparación con pSV40-5'MAR3.0. Como tal, mediante la comparación de los niveles de expresión de FIX, se seleccionaron el promotor de SV40 y el elemento 5'MAR3.0.

Tabla 3

Ejemplo 2: preparación de los nuevos vectores

Los nuevos vectores se prepararon utilizando los elementos seleccionados en el Ejemplo 1.

El vector pSV40-5'MAR3.0-FIX usado en la prueba de comparación de expresión de FIX se trató con la enzima de restricción ApaI para eliminar el gen de FIX y se dejó que se autoligara para obtener el vector pSV40-5'MAR3.0-MCS. El MCS incluyó 4 tipos de sitios de enzimas de restricción: Xhol, PacI, ApaI y FseI.

La región de selección de puromicina en el vector pSV40-5'MAR3.0-MCS se reemplazó con la región de expresión de DHFR para preparar adicionalmente un vector que tiene el gen DHFR. Al examinar los sitios de la enzima de restricción para el reemplazo, se encontró que estaban presentes dos sitios SapI (en la parte delantera y trasera); y el sitio SapI en la parte posterior se eliminó tratando con Sa1I y A flIII y preparando extremos romos usando enzima de Klenow seguido de autoligación. En la Figura 16 se muestra una imagen esquemática del mapa de enzimas de restricción del sistema de expresión de puromicina (pMS-P-MCS).

Como sistema de expresión de DHFR requerido, se usó el del vector pDCH1P, que se había usado convencionalmente en el presente Instituto. En aproximadamente 2,5 kb, incluido el gen DHFR de hámster, flanco 5' y flanco 3', se confirmaron el promotor y la porción de poliA con base en las referencias (Proc Natl Acad Sci., 1991, vol. 88, página 8572; y Mol. Cell. Biol., 1984, Vol.4, página 38) y se diseñaron los cebadores de PCR (SEQ ID NOS: 32 y 33) para reducir el tamaño en aproximadamente 1,5 kb.

La PCR se llevó a cabo utilizando el vector pDCH1P como plantilla para obtener un fragmento de ADN, que luego se insertó en el vector pCR2.1-TOPO y se secuenció (SEQ ID NO: 34). La región de expresión de DHFR cuya secuencia génica se había verificado se insertó en el vector pSV40-5'MAR 3.0-MCS. Los vectores y los insertos se cortaron cada uno con las enzimas de restricción SapI y Sa1I y se conectaron de nuevo. El producto clonado se trató con las mismas enzimas de restricción y se verificó si la banda con el tamaño deseado estaba presente en el gel de ADN. Mediante el procedimiento anterior, se preparó un nuevo par I de vectores (pMS-P-MCS y pMS-D-MCS) (Figura 17).

Con el fin de comparar las capacidades de expresión génica del par preparado de nuevos vectores con los vectores convencionales, se clonó el gen del anticuerpo ER2 (anticuerpo EGFR; véase la patente de Corea No. 1108642) en cada uno del par de nuevos vectores y el vector pMSGneo (Mogam Biotechnology Institute, Corea) que es un vector MAR convencional. Para la clonación en dos tipos de vectores, se añadieron cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo ER2 con sitios XhoI y NheI en la región 5', y sitios PacI y XhoI en la región 3', y luego se llevó a cabo la PCR. Para la PCR, se utilizaron cada uno de los vectores pOptiVEC-ER2HC y pcDNA3.3-ER2LC como plantilla, y el conjunto de HC (SEQ ID NOS: 35 y 36) y el conjunto LC (SEQ ID NOS: 37 y 38) se utilizaron como los cebadores para la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente. El producto de PCR se insertó en el vector pCR2.1-TOPO y se confirmó la secuencia de ADN (SEQ ID NOS: 42 y 43).

Los genes de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo ER2 cuyas secuencias se habían verificado se clonaron en el vector pMSGneo usando enzimas de restricción NheI y XhoI, y también se clonaron respectivamente en el par de nuevos vectores (pMS-P-MCS y pMS-D-MCS) utilizando enzimas de restricción XhoI y PacI.

El producto clonado se trató con las mismas enzimas de restricción y se verificó si la banda con el tamaño deseado estaba presente en el gel de ADN. Como tal, se prepararon 4 vectores, que comprende el nuevo par I de vectores (pMS-P-ER2LC y pMS-D-ER2HC) para la expresión del anticuerpo ER2 y un par de vectores MAR (pMSGneo-ER2LC y pMSGneo-ER2HC) (Figuras 18A y 18B).

Por otro lado, los vectores se prepararon adicionalmente para verificar el efecto de añadir un intrón quimérico al nuevo par I de vectores preparado anteriormente. La PCR se llevó a cabo utilizando el vector pcDS-dCFH como plantilla y utilizando el conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 44 y 45, para obtener un fragmento de ADN, y el producto de PCR se insertó en el vector pCR2.1-TOPO y la secuencia de ADN del intrón quimérico (SEQ ID NO: 25). El nuevo par I de vectores para la expresión del anticuerpo ER2 (vector pMS-P-ER2LC y vector pMS-D-ER2HC) se cortó con XhoI, y los intrones quiméricos tratados con las mismas enzimas de restricción se insertaron respectivamente en el mismo.

Mediante el procedimiento anterior, se preparó el nuevo par II de vectores (pMSI-P-ER2LC y pMSI-D-ER2HC ER2) para la expresión del anticuerpo ER2 (Figura 19).

Se prepararon adicionalmente vectores de expresión de anticuerpos ER2 para verificar las propiedades de los elementos del nuevo par II de vectores.

En cuanto a los vectores con un promotor de SV40 solamente, el vector pS-P-MCS se preparó eliminando el gen de FIX del vector pGL4.2-SV40-FIX por el mismo método que antes, y se preparó el vector pS-D-MCS reemplazando adicionalmente el gen de la puromicina con el gen DHFR. Luego, se insertaron los genes de cadena ligera y pesada de ER2 usando XhoI y PacI, para preparar un par de vectores (pS-P-ER2LC y pS-D-ER2HC) para el vector de expresión del anticuerpo ER2 con el promotor de SV40 (Figura 20A). El intrón quimérico se insertó en los vectores preparados usando la enzima de restricción XhoI para preparar un par de vectores (pSI-P-ER2LC y pSI-D-ER2HC) que comprenden un intrón quimérico (Figura 20B).

Ejemplo 3: Evaluación de la capacidad de expresión génica de los vectores

La capacidad de expresión génica de los nuevos vectores preparados anteriormente se verificó como sigue.

3-1: Evaluación del nuevo par I de vectores y del nuevo par II de vectores para la expresión del anticuerpo ER2 en las líneas celulares adherentes

En primer lugar, se llevó a cabo la expresión del anticuerpo ER2 utilizando el nuevo par I de vectores y el nuevo par II de vectores en las líneas celulares adherentes CHO-K1 y CHO-DG44. Los niveles de expresión se compararon con un par de vectores comerciales dobles y un par de vectores MAR que se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4

Veinticuatro horas antes de la transfección, las células CHO-K1 que se estaban cultivando en el medio de cultivo DMEM (con FBS al 10%) se dispensaron en los pocillos de una placa de 12 pocillos en una cantidad de 500 pL cada una a razón de 0,8 x 105 células/pocillo. Las células CHO-DG44 que se estaban cultivando en el medio de cultivo MEM-a con/HT (Gibco, 12571-063) se dispensaron en los pocillos en una cantidad de 500 pL cada uno a razón de 1,5 x 105 células/pocillo. Veinticuatro horas después de la dispensación, Opti-MEM y el vector de prueba se mezclaron en un tubo de 1,5 mL hasta un volumen total de 50 pL (con base en 1 pocillo). Se mezclaron 47 pL de Opti-MEM y 3 pL de Lipofectamine 2000 en un nuevo tubo de 1,5 mL y se dejaron reaccionar durante 5 min a temperatura ambiente (con base en 1 pocillo). Una vez completada la reacción, los dos tipos de soluciones preparadas anteriormente se mezclaron y se dejaron reaccionar durante 20 min a temperatura ambiente. Veinticuatro horas después, se extrajo cada pocillo del medio transfectado y se lavó con PBS. Se le dispensó tripsina-EDTA (1x) a razón de 100 pL/pocillo y se dejó reaccionar durante 1 minuto a 37 °C para separar las células. Se dispensó el medio de cultivo a la misma razón de 1000 pL/pocillo y se contó el número de células.

Se dispensaron células CHO-K1 en los pocillos de una placa de 12 pocillos a razón de 1,0 x 105 células/pocillo hasta el volumen total de 1 mL; se añadieron al mismo 1.000 pg/mL de G418 (PAA, P11-012) o 50 pg/mL de puromicina de forma apropiada para cada vector; y se llevó a cabo la selección de células. Se dispensaron células DG44 en los pocillos de una placa de 12 pocillos a razón de 1,5 x 105 células/pocillo hasta el volumen total de 1 mL; se le añadieron de forma apropiada 750 pg/mL de G418 o 20 pg/mL de puromicina para cada vector; y se llevó a cabo la selección de células. La transfección se realizó en un total de 2 series, y las muestras se obtuvieron en un total de 3 veces por serie a lo largo de 3 semanas, y se llevó a cabo la prueba de ELISA.

El método ELSIA para ER2 es el siguiente. Se diluyó anti-IgG humana de cabra (específica de Fab) (Sigma, 15260) hasta 5 pg/mL usando un tampón de recubrimiento. Los anticuerpos de captura diluidos se dispensaron en una placa de ELISA de 96 pocillos a razón de 100 pL/pocillo y se dejaron reaccionar durante 2 horas o más a temperatura ambiente. Se lavaron 3 veces usando 300 pL de tampón PBS-Tween 20 al 0,1%. Se le añadió PBS-BSA al 1% a razón de 300 pL/pocillo y se llevó a cabo el bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. El resultante se lavó 3 veces usando 300 pL de tampón PBS-Tween 20 al 0,1%. Se preparó el gen HBIG (2,8 mg/mL) como estándar en las concentraciones de 280, 140, 70, 35, 17,5, 8,75 y 4,375 ng/mL usando PBS-BSA al 1%. Las soluciones de cultivo se diluyeron usando PBS-BSA al 1%. Las soluciones de cultivo estándar y diluidas se dispensaron en una placa de 96 pocilios recubierta con los anticuerpos de captura a razón de 100 pL/pocillo por duplicado y se dejaron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces usando 300 pL de tampón PBS-Tween 20 al 0,1%. Se diluyó anti-IgG humana de cabra (específica de Fc)-HRP (Sigma, A0170) hasta 1/100.000 usando PBS-BSA. La solución diluida se dispensó en la placa a razón de 100 pL/pocillo y se dejó reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. El resultante se lavó 3 veces con 300 pL de tampón PBS-Tween 20 al 0,1%. El sustrato de peroxidasa de micropocillos de TMB se dispensó a razón de 100 pL/pocillo y se dejó reaccionar durante 30 min a temperatura ambiente. Se dispensó H2SO42,5 M a razón de 100 pL/pocillo para detener la reacción y se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas. Se realizó una curva estándar con ajuste de 4 parámetros, y se sustituyó la absorbancia medida de las soluciones de cultivo por los parámetros para calcular las concentraciones.

Como se muestra en la Tabla 5, y las Figuras 21A y 21B, no se pudo verificar el nivel de expresión de Ab ER2 en el par de vectores comerciales dobles en CHO-K1. El par de vectores MAR convencionales, el nuevo par I de vectores y el nuevo par II de vectores mostraron niveles de expresión promedio de aproximadamente 9,7 ng/mL, aproximadamente 14,0 ng/mL y aproximadamente 1.473,2 ng/mL, respectivamente. El nuevo par I de vectores y el nuevo par II de vectores mostraron niveles de expresión aproximadamente 1,4 veces y aproximadamente 151,3 veces más altos que un par de vectores MAR, respectivamente. Además, el nuevo par II de vectores mostró un nivel de expresión aproximadamente 105,4 veces mayor que el nuevo par I de vectores, que mostró que el efecto del intrón quimérico era excelente.

Los niveles de expresión promedio del Ab ER2 del par de vectores comerciales dobles, el par de vectores MAR, el nuevo par I de vectores y el nuevo par II de vectores en la célula CHO DG44 fueron 13,1 ng/mL, 3,8 ng/mL, 27,5 ng/mL y 653,0 ng/mL, respectivamente. El par de vectores comerciales dobles mostró un nivel de expresión aproximadamente 3,5 veces mayor que el par de vectores MAR. El nuevo par I de vectores y el nuevo par II de vectores mostraron niveles de expresión aproximadamente 7,3 y 173,7 veces más altos que el par de vectores MAR, respectivamente. Además, el nuevo par II de vectores mostró un nivel de expresión aproximadamente 23,8 veces mayor que el nuevo par I de vectores.

Tabla 5

3-2: Evaluación del nuevo par II de vectores en la línea celular suspendida

El nuevo par II de vectores se evaluó en líneas celulares en suspensión CHO-S y CD DG44-S.

La línea celular CHO-S (Gibco, A13696-01) se pasó en medio de cultivo CD FortiCHO a razón de 5~6 x 105 células/mL hasta una cantidad requerida, 24 horas antes de la transfección. El día de la transfección, se midieron el número y la viabilidad (necesariamente el 95% o más) de las células. Las células se dispensaron en un matraz de 125 mL a razón de 1 x 106 células/mL usando medio CD FortiCHO (Gibco, A11483-01). Se mezclaron 90 pg del ADN plasmídico con SFM OptiProMR hasta un volumen total de 1,5 mL. Se mezclaron 270 pL de PEI MAX (1 pg/pL) y 1.230 pL de SFM OptiProMR, sin agitación tipo vórtice en absoluto. SFM OptiProMR que contenía PEI MAX se colocó en el Sf M OptiProMR que contenía ADN plasmídico, que luego se mezcló suavemente. Luego, se dejó reaccionar el producto resultante durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadieron gota a gota 3 mL del complejo ADN:PEI producido a las células CHO-S en el matraz de 125 mL preparado de antemano. Las células se cultivaron en una incubadora de CO2 con agitación a 37 °C con agitación a 130-150 rpm y la selección de células se llevó a cabo 48 horas después.

Por otro lado, la línea celular CD DG44-S se preparó mediante el siguiente método. Primero, la línea celular adherente CHO DG44 (cultivada en un medio a-MEM (con) cFBS al 10%) se pasó en 50 mL de medio usando un matraz giratorio de 125 mL con un intervalo de 2 - 3 días, usando el medio libre de suero (HyQ SFM4CHO (Thermo Scientific, Hyclone) Suplemento IX HT), adaptando así las células al cultivo en suspensión. Las células adaptadas se subcultivaron con un intervalo de 2-3 días, con el medio reemplazado de CD CHO EX-CELLMR (Sigma, 143®1C)/L-Glutamina 4 mM/medio de suplemento 1X HT, adaptando así las células al medio. Si el crecimiento de las células fue estable y la viabilidad se mantuvo al 90% o más, y la concentración de las células alcanzó 1-2X10® células/mL, la línea de células huésped CHO DG44-S se sometió a un banco, asegurando así la línea celular.

Veinticuatro horas antes de la transfección, las células se pasaron en CD CHO EX-CELLMR (Sigma, 14361C) a razón de 5-7 x 105 células/mL hasta una cantidad requerida. Las células se dispensaron en un matraz de 125 mL en una cantidad de 15 mL a razón de 2 x 10® células/mL usando un medio CHO Freestyle. Se mezclaron 30 pg de ADN plasmídico con NaCI 150 mM hasta un volumen total de 0,75 mL. Se mezclaron 90 pL de PEI MAX (1 pg/pL) y NaCI 150 mM, sin agitación en absoluto. Se puso NaCl 150 mM que contenía PEI MAX en NaCl 150 mM que contenía el ADN plasmídico y se mezclaron suavemente. Se dejó reaccionar el producto resultante durante 5 min a temperatura ambiente. Se añadieron gota a gota 1,5 mL del complejo ADN:PEI producido a las células CD DG44-S en un matraz de 125 mL preparado de antemano. Las células se cultivaron en una incubadora de CO2 con agitación a 37 °C con 130 rpm durante 5 horas, y la selección de las células se llevó a cabo 48 horas después.

En el caso de CHO-S, la selección de las células se llevó a cabo utilizando el medio de selección que se muestra en la Tabla 6.

Tabla 6

En primer lugar, se contó el número de células transfectadas. Usando el medio de selección adecuado para cada condición, las células se dispensaron en un matraz T-175 en una cantidad de 50 mL a razón de 5 x 105 células/mL. Si el número de células no era suficiente, se redujo el volumen total. Las células se cultivaron en condiciones estáticas en una incubadora de CO2 a 37 °C. Siete días después de la selección, se contó el número de células. Si la viabilidad excedía el 30%, la prueba continuaba a la siguiente etapa, pero si no, se contaba el número de células después de 10-11 días. Si la viabilidad era inferior al 30% incluso después de 11 días, el medio de selección se reemplazó por uno nuevo y el tamaño del matraz tipo T se redujo de modo que la concentración se redujo hasta 3 x 105 células/mL o más. El medio se reemplazó completamente con un intervalo de 3 -4 días, y se verificaron las señales de recuperación, si las había. Si la señal de recuperación estaba presente y la viabilidad estaba en el intervalo de 30-50%, las células se pasaron a un matraz de 125 mL a razón de 3 x 105 células/mL usando el medio de selección adecuado para la condición. Las células se cultivaron en una incubadora de CO2 a 37 °C con agitación a 150 rpm. Con un intervalo de 3 -4 días, las células se pasaron a un matraz de 125 mL en una cantidad de 30 mL a razón de 3 x 10 células/mL, utilizando el medio de selección adecuado para la condición. Si las veces que se diluyó fue de 2 veces o más, el medio no se renovó por completo. Si la viabilidad era del 85% o superior y la densidad de células viables era de 1 x 106 células/mL o superior, se consideró que la selección estaba completa.

Por otro lado, en el caso de CD DG44-S, la selección de la célula se llevó a cabo utilizando el medio de selección que se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7

Se contó el número de células transfectadas. Las células se dispensaron en un matraz de 125 mL en una cantidad de 30 mL cada vez a razón de 5 x 105 células/mL usando un medio de selección adecuado para cada vector. Si el número de células no fuera suficiente, se redujo el volumen total. Las células se cultivaron en una incubadora de CO2 a 37 °C con agitación a 130 rpm. Con un intervalo de 3 -4 días, las células se pasaron a un matraz de 125 mL en una cantidad de 30 mL a 3 x 105 células/mL usando un medio de selección. Si las veces que se diluyó fue de 2 veces o más, el medio no se renovó por completo. Si la viabilidad era del 80% o superior y la densidad de células viables era de 1 x 106 células/mL o superior, se consideró que la selección estaba completa. La transfección se llevó a cabo en un total de 2 series, y las muestras se obtuvieron para un total de 3 veces a lo largo de 3 -4 semanas por cada serie, y se llevó a cabo la prueba de ELISA.

Se llevó a cabo ELISA de ER2 de la misma manera que se describió para las líneas celulares adherentes, y los resultados se muestran en la Tabla 8.

Como se muestra en la Tabla 8 a continuación, con respecto a la productividad de 3 días del anticuerpo ER2 en la línea celular CHO-S, los niveles de expresión del par de vectores comerciales dobles, el par de vectores MAR y el nuevo par II de vectores fueron 0,2 - 0,3 pg/mL, 1,0 - 2,0 pg/mL y 9,5 - 17,0 pg/mL (promedio), respectivamente. En la productividad por lote, las cantidades máximas de producción del par de vectores comerciales dobles, el par de vectores MAR y el nuevo par II de vectores fueron 0,7 pg/mL, 10,3 pg/mL y 35,0 pg/mL (promedio), respectivamente. Por lo tanto, en la productividad por lote, el nuevo par II de vectores de la presente invención mostró efectos de aumento de la expresión de anticuerpos de aproximadamente 50 veces y aproximadamente 3,4 veces o más en comparación con el par de vectores comerciales dobles y el par de vectores m Ar , respectivamente.

Además, en la línea celular CD DG44-S, con respecto a la productividad de 3 días del anticuerpo ER2, los niveles de expresión del par de vectores comerciales dobles, el par de vectores MAR y el nuevo par II de vectores fueron 0,2~ 0,3 |jg/mL, 0,2 ~ 0,25 jg/mL y 1,0 ~ 1,5 jg/mL, respectivamente. En cuanto a la productividad por lote, las cantidades máximas de producción del par de vectores comerciales dobles, el par de vectores MAR y el nuevo par II de vectores fueron 0,7 jg/mL, 0,5 jg/m L y 3,6 jg/m L (promedio), respectivamente.

En la productividad por lote, el nuevo par II de vectores mostró efectos de aumento de la expresión de anticuerpos de aproximadamente 5,1 veces y aproximadamente 7,2 veces o más en comparación con el par de vectores comerciales dobles y el par de vectores MAR, respectivamente.

Tabla 8

3-3: Evaluación de la propiedad de los elementos constitutivos de los nuevos vectores

La evaluación de las propiedades de los elementos constitutivos de los nuevos vectores se llevó a cabo en líneas celulares CHO-S y CD DG44-S. Como se muestra en la Tabla 9 a continuación, los pares de vectores usados en la prueba fueron los siguientes: pS (un par de vectores promotores), pSI (un par de vectores intrones), pMS (el nuevo par I de vectores) y pMSI (el nuevo par II de vectores).

Tabla 9

Se usó el mismo método de evaluación que en el Ejemplo 3-2 como sigue. Se transfectó cada par de vectores y, cuando se completó la selección durante el período de selección, se compararon los niveles de expresión del anticuerpo ER2. Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.

Tabla 10

Como se muestra en la Tabla 10, en la línea celular CHO-S, las selecciones de células con respecto al nuevo par I de vectores, el nuevo par II de vectores, el par de vectores promotores y el par de vectores intrones se completaron en aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 4,5 semanas y aproximadamente 7 semanas, respectivamente. El nuevo par I de vectores y el nuevo par II de vectores que tienen un elemento de MAR mostraron un período de selección aproximadamente 1,8 veces más corto que el par de vectores intrones. Los resultados de la selección mostraron que, en comparación con el par de vectores promotores, las productividades de 3 días del par de vectores

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión que comprende un elemento de la región de unión a matriz (MAR) que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 41 o 40, y un promotor del virus de simio 40 (SV40) unido operativamente a un intrón quimérico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 25 y un gen diana.

2. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el promotor de SV40 tiene la secuencia de nucleótidos de la Se Q ID NO: 12.

3. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un elemento de la región de control del locus (LCR) que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 15 o 16.

4. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el gen diana se selecciona del grupo que consiste en: gen del factor VII (FVII), gen del factor VIII (FVIII), gen del factor IX (FIX), gen del anticuerpo de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico, gen de la insulina, gen de la interleucina, gen del factor de necrosis tumoral, gen del interferón, gen del factor estimulante de colonias, gen de la quimiocina, gen de eritropoyetina, gen de afetoproteína, gen de a-glucosidasa, gen de a1-antitripsina, gen de antitrombina, gen de lipoproteína, gen de celuloplasmina, gen de fibrinógeno, gen de glucocerebrosidasa, gen de haptoglobina, gen de plasminógeno, gen de protrombina y gen de transferrina.

5. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho vector de expresión es pMSI-P-ER2LC o pMSI-D-ER2HC.

6. Una célula transformada por el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula CHO-K1, una célula CHO-DG44, una célula CHO-S, una célula CHO DUKX-B11, una célula COS3, una célula COS7, una célula COS1, una célula NSO, una célula HeLa, una célula Vero, una célula PER-C6, una célula HepG2 y una célula BHK.

7. Un método para producir una proteína diana que comprende:

cultivar las células como se define en la reivindicación 6 para expresar la proteína diana; y

recuperar la proteína diana.