CN105849268B - 具有改进的基因表达能力的表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有改进的基因表达能力的表达载体、由所述表达载体转化的细胞，以及通过使用所述细胞来大量生产靶蛋白的方法。与典型的动物细胞表达载体相比，根据本发明的表达载体显示出更优异的基因表达能力，因此，可以显著提高异源基因的蛋白质表达。

Description

具有改进的基因表达能力的表达载体
技术领域
本发明涉及用于改进基因表达的表达载体、由所述表达载体转化的细胞以及通过使用所述经转化的细胞来大量生产靶蛋白的方法。
背景技术
在大多数情况下，已经通过使用动物细胞进行了治疗性重组蛋白和抗体的生产，并且正在努力提高生产效率。
例如，在无血清培养基中预适应的悬浮宿主细胞系已被用于快速选择高生产细胞系(producer cell line)。此外，已经不断开发高表达载体和高生产细胞系以消除或缩短基因扩增所需的时间。还在努力地开发一种通过在细胞系的初始选择中使用自动化的细胞选择装置的有效方法。
高生产细胞系显示出30至80pcd的表达水平(甚至是在没有基因扩增时)，并且高生产细胞系可通过使用基于基质附着区(matrix attachment region，MAR)或类似于MAR的普遍存在的染色质开放元件(ubiquitous chromatin opening element，UCOE)的高表达载体而在4个月内制备。
最近的研究表明，载体优化对于在六个月内实现3g/L至5g/L的抗体生产率是必需的。最近，对MAR元件(例如双-MAR、多-MAR、反式-MAR等)的优化暗示了生产率提高的可能性，但是仍持续需要可通过引入5’UTR或内含子元件来获得具有改善的生产效率的稳定载体。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供用于大量表达和生产靶蛋白的表达载体。
本发明的另一个目的是提供由上述表达载体转化的细胞。
本发明的再一个目的是提供通过使用所述经转化的细胞来大量生产靶蛋白的方法。
为了实现如上所述的本发明的一个目的，提供了包含可操作地连接的猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)启动子、支架附着区(scaffold attachment region，SAR)或基质附着区(MAR)元件以及嵌合内含子的表达载体。
为了实现如上所述的本发明的另一个目的，提供了由上述表达载体转化的细胞。
为了实现如上所述的本发明的再一个目的，提供了通过培养所述经转化的细胞来大量生产靶蛋白的方法。
与常规表达载体相比，根据本发明的表达载体显示出优异的基因表达，因此，可以显著提高外源基因的蛋白质表达。
附图说明
通过本发明的以下描述结合所附附图，本发明的上述目的和特征以及其他目的和特征将变得明显。
图1示出了关于MAR候选元件的萤光素酶(luciferase)载体的示意图。
图2示出了MAR候选元件的萤光素酶表达结果。
图3示出了比较启动子测试的萤光素酶表达结果。
图4示出了关于LCR(基因座控制区(locus control region))候选元件的萤光素酶载体的示意图。
图5示出了用于制备Alb E64×4LCR元件的PCR策略。
图6和7示出了LCR候选元件的萤光素酶表达结果。
图8示出了dCFH(人补体因子H的缺失形式(deletion form of human complementfactor H))的制备过程。
图9示出了dCFH在CHO-S细胞中的表达水平。
图10示出了dCFH在293-F细胞中的表达水平。
图11示出了dCFH在CHO-DG44稳定细胞中的表达水平。
图12和13分别示出了FIX表达载体组1的示意图及其表达结果。
图14和15分别示出了FIX表达载体组2的示意图及其表达结果。
图16示出了嘌呤霉素(Puromycin)表达系统的限制性酶图谱。
图17示出了一对新载体pMS-P-MCS和pMS-D-MC的结构。
图18A和18B分别示出了用于ER2抗体表达的第一对新载体(“新载体对I”)(pMS-P-ER2LC和pMS-D-ER2HC)以及一对MAR载体(pMSGneo-ER2LC和pMSGneo-ER2HC)的结构。
图19示出了用于ER2抗体表达的第二对新载体(“新载体对II”)(pMSI-P-ER2LC和pMSI-D-ER2HC)的结构。
图20A和20B分别示出了一对启动子载体(pS)(pS-P-ER2LC和pS-D-ER2HC)以及一对内含子载体(pSI-P-ER2LC和pSI-D-ER2HC)的结构。
图21A和21B分别示出了在CHO贴壁细胞CHO-K1和DG44中ER2抗体的表达水平。
具体实施方式
在本发明中，为了制备用于在CHO(中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary))细胞等中表达外源基因之具有改进生产效率的稳定表达载体，在多种MAR元件、支架附着区(scaffoId attachment region，SAR)元件、基因座控制区(locus control region，LCR)和内含子元件中鉴定出可提高基因表达水平的元件。
因此，本发明提供了包含可操作地连接的SV40(猿猴病毒40(simian virus 40))启动子、支架附着区(SAR)或基质附着区(MAR)元件以及嵌合内含子的表达载体。
如本文所使用的术语“启动子”是指编码区上游(upstream)的非翻译核酸序列，其包含聚合酶结合位点并且对于下游基因具有mRNA转录起始活性。具体地，“启动子”包含通过RNA聚合酶来起始转录的TATA盒或TATA样区域；但并不限于围绕其的区域；并且可包含对于与除RNA聚合酶之外的蛋白质缔合以调控表达而言必需的区域。
在本发明中，启动子可包括SV40启动子或其变体，优选由SEQ ID NO：12表示的SV40启动子。启动子变体是指这样的变体，其中启动子序列的某一部分通过添加、缺失或替换而被修饰以提高基因表达。
根据本发明的一个实施方案，与CMV启动子相比，本发明的使用SV40启动子的表达载体显示出约4倍的表达提高(参见实施例1-1)。
此外，这样的启动子与为外源基因的靶基因可操作地连接；如本文所使用的“可操作地连接(operably linked)”意指调控靶基因表达的核酸序列和编码靶蛋白的核酸序列功能性连接以使得他们可执行一般功能。可使用本领域中已知的重组DNA技术来实现与重组载体的可操作地连接；并且可使用本领域通常已知的酶进行位点特异性DNA切割和连接。
在本发明中，可包括用于提高基因表达的元件的SAR或MAR元件。可包括SAR或MAR元件来构成表达载体以使得这样的元件可存在于启动子的5’端、3’端或者5’和3’端二者。
如本文所使用的“MAR元件”是指暂时将转录活性DNA环状结构域附着至核基质(Nuclear matrix)的DNA序列(Pienta等，(1991)Crit.Rev.Eukaryotic Genne Expres.，1：355-385)，MAR序列的实例在本领域中是已知的。
在本发明中，为了选择提高基因表达的元件，针对人β-珠蛋白MAR(Yu，J.，Bock，J.H.，Slightom，J.L.和Villeponteau，B.，Gene 139(2)，139-145(1994)，基因库No.L22754)和人CSP-B基因侧翼(flanking)SAR(Hanson，R.D.和Ley，T.J.，Blood，79(3)，610-618(1992)，基因库No.M62716)使用萤光素酶测定(luciferase assay)进行了双重(5’和5’+3’)和顺式+反式相关测试(cis+trans related test)；结果是筛选出某些合乎期望的元件(参见实施例1-1)。
上述MAR或SAR元件可以是由SEQ ID NO：39表示的人CSP-B SAR；从人β球蛋白MAR分离的由SEQ ID NO：40表示的MAR2.2或由SEQ ID NO：41表示的MAR3.0。可包括SAR或MAR元件以使所述元件可存在于启动子的5’端、3’端或者5’和3’端二者。
根据本发明的一个实施方案，所述元件可以是被命名为5’MAR2.2、5’MAR3.0、3’MAR2.2、3’MAR3.0、5’3’MAR2.2或5’3’MAR3.0的一个元件。
根据本发明的表达载体可包含嵌合内含子(Chimeric intron)以提高基因表达。
这样的嵌合内含子可以由SEQ ID NO：25表示(Backliwal，G.，Hildinger，M.，Chenuet，S.，Wulhfard，S.，De Jesus，M.，Wurm，F.M.，Nucleic Acids Res.，36(15)，e96(2008)，基因库No.JQ795930)，但本发明不限于此。在本发明中，通过萤光素酶测定来确认基因表达提高的效果(参见实施例1-3)。
根据本发明，包含MAR元件和嵌合内含子元件二者的表达载体显示出生产率的协同效应，从而导致基因表达水平提高(参见实施例3-3和表9)。
根据本发明的一个实施方案，与常规启动子载体、常规内含子载体以及不含嵌合内含子的新载体对I(pMS-P-D-ER2LC和pMS-ER2HC)相比，包含MAR元件、SV启动子和嵌合内含子的新载体对II(pMSI-P-ER2LC和pMSI-D-ER2HC)表现出优异的基因表达提高效果。
根据本发明的表达载体还可包含LCR元件。
在本发明中，为了鉴定提高基因表达的元件，针对AAT108(α-1-抗胰蛋白酶前体，120bp，SEQ ID NO：13)和Alb E6(血清白蛋白前原蛋白，81bp，SEQ ID NO：14)(其先前显示出提高因子IX表达的效果，如在国际公布No.WO 2009/102085中公开的)使用萤光素酶测定进行了多聚体(×1和×4)和双重(5’、3’和5’+3’)相关测试，结果是筛选出优选的LCR元件(参见实施例1-2)。
在本发明中优选的LCR元件可以是由SEQ ID NO：15表示的AAT108×4，其可以这样的方式被包含：使其仅存在于载体的3’端(3’AAT 108×4)；或5’和3’端二者(5’3’AAT 108×4)。另外，LCR元件可以是由SEQ ID NO：16表示的Alb E6×4。
此外，表达受启动子调控的靶基因可被插入到本发明的表达载体中。
靶基因是编码待表达的外源产物的基因，且可以是编码可被表达为重组蛋白的任何类型蛋白质的基因。这样的靶基因包括“多克隆位点(multiple cloning site，MCS)”(其是具有限制性酶切位点的核酸序列)以便被插入到载体中。
上述靶基因可以是血液凝固相关基因和多种抗体基因中的一种；且可以选自，例如：因子VII(factor VII，FVII)基因、因子VIII(factor VIII，FVIII)基因、因子IX(factorIX，FIX)基因、表皮生长因子受体家族抗体基因(epidermal growth factor receptorfamily)、胰岛素基因、白细胞介素基因、肿瘤坏死因子基因、干扰素基因、集落刺激因子基因、趋化因子基因、促红细胞生成素基因、甲胎蛋白基因、α-葡糖苷酶基因、α1-抗胰蛋白酶基因、抗凝血酶基因、脂蛋白基因、血浆铜蓝蛋白(celluloplasmin)基因、纤维蛋白原基因、葡糖脑苷脂酶基因、触珠蛋白基因、纤维蛋白溶酶原基因、凝血酶原基因和转铁蛋白基因，但不限于此。根据本发明的一个实施方案，靶基因可以是FIX(因子IX(factor IX))基因或表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)ER2抗体基因。
根据本发明的表达载体可包含任何常规已知的转录终止子。优选地，它可以连接至polyA。例如，它可包含SV40晚期聚腺苷酸化信号(polyA)。
根据本发明的一个实施方案，本发明的表达载体具有图19所示的pMSI-P-ER2LC或pMSI-D-ER2HC的酶切图谱。图19示意性地示出了包含提高基因表达的元件(例如MAR元件、嵌合内含子元件、SV40启动子、polyA等)的表达载体。
同时，本发明提供了由上述表达载体转化的细胞。
如本文中所使用的细胞可以是通常已知的动物细胞，并且可以优选地选自：CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-S细胞、CHO DUKX-B11细胞、COS3细胞、COS7细胞、COS1细胞、NSO细胞、HeLa细胞、Vero细胞、PER-C6细胞、HepG2细胞和BHK细胞，但不限于此。
另外，本发明提供了使用上述表达载体生产靶蛋白的方法。更具体地，本发明提供了用于大量生产靶蛋白的方法，其包括：培养由上述表达载体所转化的细胞以表达靶蛋白，然后回收所述靶蛋白。
这样的方法可包括以下步骤：
(1)将表达受启动子调控的靶基因插入到表达载体中；
(2)用其中插入了靶基因的表达载体转化细胞；以及
(3)培养由所述表达载体所转化的细胞以表达靶蛋白，然后回收所述靶蛋白。
用于插入靶基因、转化细胞和培养细胞以表达靶蛋白以及回收所述靶蛋白的方法可通过使用本领域中已知的技术来实施。
用以下的实施例更详细地说明本发明。以下实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范围。
实施例1：元件的选择
1-1：MAR元件的选择
为了改进载体，选择人β-珠蛋白的MAR(β-globin MAR、3kb，2.2kb)和人CSP-B基因侧翼SAR(1.2kb)作为候选物。另外，为允许间接评价蛋白表达而进行报告基因测定(reporter gene assay)，考虑检查的方便性，选择萤光素酶测定。
计划通过比较待分析载体与不含MAR元件的对照载体之间的萤光值的差异来评价待分析载体的效果，相应地制备待分析载体。为了评价在稳定情况下的效果，选择pGL4.20[luc2/Puro]萤火虫(Firefly)萤光素酶载体(Promega Inc.)，其含有嘌呤霉素抗性基因，一种快速且强效的细胞选择标志物。
首先，使用pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen，V790-20)作为模板，SEQ ID NO：1和2的引物组以及DNA聚合酶(Ex-Taq，Takara)进行PCR以获得包含CMV启动子的DNA片段。然后，使模板在94℃下变性5分钟以使DNA链分离，并通过在94℃变性30秒，在56℃退火30秒和在72℃延伸1分钟的过程重复30个循环，随后在72℃再延伸5分钟来扩增DNA分子。将通过PCR扩增的DNA片段通过凝胶提取纯化，并插入到pCR2.1-TOPO质粒载体(Invitrogen，K4500-01)中。通过使用限制性酶的酶切图谱和碱基序列分析验证由SEQ ID NO：11表示的CMV启动子的存在，并将CMV启动子插入到pGL4.20[luc2/Puro]载体的多克隆位点中的NheI/XhoI位点中。将所得载体命名为pGL4.2-CMV并用作对照载体。
接着，使用SAR(SEQ ID NO：3和4)的引物组，MAR2.2(SEQ ID NO：5和6)的引物组和MAR3.0(SEQ ID NO：7和8)的引物组通过如上所述的相同方法分别将SAR、MAR2.2和MAR3.0插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。将制备的载体命名为pCR2.1-SAR、pCR2.1-MAR2.2和pCR2.1-MAR3.0。
将pMSG和5’B1-P1载体(参见韩国专利No.408844)分别用作MAR和SAR的PCR模板。通过使用限制性酶的酶切图谱和碱基序列分析验证分别由SEQ ID No：39、40和41表示的SAR、MAR2.2和MAR3.0的存在。随后的克隆过程中，所有的插入物在用限制性酶切割，并通过凝胶提取纯化后使用；载体在用限制性酶切割，并用虾碱性磷酸酶处理后使用。
将用BamHI切割pCR2.1-SAR载体制备的插入物插入到用相同限制性酶切割制备的pGL4.2-CMV载体中。通过使用限制性酶的酶切图谱，验证所需的SAR DNA片段以正向存在，并将所得载体命名为pGL4.2-CMV-3’SAR。接着，将用KpnI和NheI切割pCR2.1-SAR载体制备的插入物分别插入到用相同限制酶切割的pGL4.2-CMV-3’SAR载体和pGL4.2-CMV载体中。通过使用限制性酶的酶切图谱验证在每个质粒中存在靶DNA片段，将所得质粒分别命名为pGL4.2-CMV-5’3’SAR和pGL4.2-CMV-5’SAR。
为了制备包含MAR2.2和MAR3.0的载体，将分别用KpnI和NheI切割pCR2.1-MAR2.2和pCR2.1-MAR3.0制备的插入物插入到用相同的限制酶切割制备的pGL4.2-CMV载体中，从而首先制备pGL4.2-CMV-5’MAR2.2和pGL4.2-CMV-5’MAR3.0载体；并且，将用BamHI切割pCR2.1-MAR2.2和pCR2.1-MAR3.0制备的插入物分别插入到用相同限制酶切割制备的pGL4.2-CMv-5’MAR2.2和pGL4.2-CMV-5’MAR3.0载体中以制备pGL4.2-CMV-5’3’MAR2.2和pGL4.2-CMV-5’3’MAR3.0载体。MAR元件以相反方向插入。所制备的萤光素酶载体的示意图示于图1中。
使用贴壁细胞系CHO-K1测量具有MAR候选元件的载体的萤光素酶表达水平。通过为如上制备的载体额外提供同样用于转染的4倍摩尔的SAR或MAR元件来制备用于评价顺式+反式效应的载体组。
使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668027)将CHO-K1细胞系(ATCC，CCL-61)转染1.0μg的上述萤火虫萤光素酶载体，48小时后，在含有嘌呤霉素(50μg/mL)的DMEM培养基(Lonza，112-604F)中传代培养。通过约2至4周的选择期建立稳定细胞。以总计3组进行测试，并通过One-glo萤光素酶分析系统(Promega，E6110)进行萤火虫萤光素酶分析，其中相对细胞数目值进行校正。
萤火虫萤光素酶分析方法如下。首先，将其中培养细胞的孔除去培养基，各自通过1mL的1×PBS洗涤。向经转染的细胞添加100μL/孔胰蛋白酶-EDTA，并使其在37℃下反应1分钟以便从底部分离细胞。每个孔中添加1mL的培养基。在对细胞计数后，经转化的细胞在用培养基稀释至1.0×105个细胞/mL(基于活细胞计数(viable cell))后分别分装到1.5mL的管中。对于每个测试的DNA，向96孔白色板中以100μL/孔放置细胞。将预先制备的One-glo萤光素酶分析试剂以100μL/孔添加至孔中，并使其在室温下反应3分钟。使用光度计(EG&GBerthold，微孔板光度计(Microplate luminometer)LB 96V)测量萤火虫RLU(相对光单位(Relative light units))。关于测试载体与pGL4.2-CMV相比的的测量结果示于图2和表1中。
结果是，5’MAR元件显示出最好的效果，与pGL4.2-CMV对照载体相比，其表现出效果(平均值)提高1.6至5.3倍。此外，没有发现单、双MAR之间或顺式(Cis)和顺式+反式(Cis+Trans)MAR之间有效果差异。因此，候选元件的测试结果值表明它们之间没有显著差异，但显示出大的变异(variation)，因此，主要选择两个元件5’MAR2.2和5’MAR3.0。
表1
MAR元件的效果并不如预期的好，因此针对CMV和SV40启动子评价了MAR的效果。具体地，使用pGL4.20载体作为模板并且使用SEQ ID Nos：9和10的引物组进行PCR以获得含有SV40启动子的DNA片段。通过PCR扩增的DNA片段通过凝胶提取进行纯化并插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。通过使用限制性酶的酶切图谱和DNA序列分析验证由SEQ ID NO：12表示的SV40启动子的存在。然后用NheI和XhoI处理pGL4.2-CMV、pGL4.2-CMV-5’MAR2.2和pGL4.2-CMV-5’MAR3.0载体以除去CMV启动子，并将用相同的限制性酶处理的SV40启动子插入其中以制备pGL4.2-SV40、pGL4.2-SV40-5’MAR2.2和pGL4.2-SV40-5’MAR3.0载体。
用与在MAR候选元件测试相同的方法测量在贴壁细胞系CHO-K1中萤光素酶的表达水平。通过约2周的选择期建立稳定细胞。以总计2组进行测试，并以如上所述的相同的方式测量萤火虫萤光值。
如图3中所示，与CMV启动子相比，SV40显示出效果提高约4倍。其中，pGL4.2-SV40-5’MAR3.0载体显示出最好的结果，与CMV对照组和SV40对照组相比，其表现出分别为9倍和2.2倍的基因表达提高效果。
1-2：LCR元件的选择
在国际专利公开号wO2009/102085中公开的LCR元件中，选择显示出体内提高因子IX表达效果的AAT 108(α-1抗胰蛋白酶前体，120bp，SEQ ID NO：13)和Alb E6(血清白蛋白前原蛋白，81bp，SEQ ID NO：14)来评价体外(in vitro)效果。将AAT 108或Alb E6添加到SV40晚期poly(A)信号的5’区、3’区以及pGL4.2-CMV对照载体的5’区和3’区二者以获得用于测试的多种载体(参见图4)。
此外，由于LCR元件长度很短，制备了每个位点多重插入有4份元件拷贝的载体以评价多重插入元件对表达的影响。
使用在国际专利公开号wO 2009-102085中公开的载体(pCR-AAT108LCR，PCR-E6LCR)，通过进行一次性PCR获得各元件的单体(monomer)；通过进行4次重组PCR制备AlbE6×4多聚体。
首先，为了获得各元件的单体，针对Alb E6×1和AAT108×1分别使用SEQ ID No：17和18的引物组和SEQ ID No：19和20的引物组。然后，使模板在94℃下变性2分钟以使DNA链分离，并将在94℃变性15秒，55℃退火15秒和在72℃延伸1分钟的过程重复30个循环，随后在72℃再延伸5分钟来扩增DNA分子。将通过PCR扩增的DNA片段通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。通过使用限制性酶的酶切图谱和DNA序列分析验证分别由SEQ ID No：13和14表示的AAT108和AlbE6基因的存在。
另一方面，通过进行4次重组PCR制备Alb E6×4多聚体，如图5所示。通过如上所述的相同方法进行PCR，不同之处在于退火时间延长至30秒。通过DNA序列分析验证由SEQ IDNO：16表示的AlbE6×4基因的存在。在Genscriptlnc合成AAT 108×4多聚体(SEQ ID NO：15)。
为了将LCR元件插入到pGL4.2-CMV载体启动子的5’区域，用KpnI和NheI切割载体和PCR产物，随后进行连接(ligation)。用相同的限制性酶处理克隆的产物，验证在DNA凝胶上是否存在具有所需尺寸的条带。通过上述方法得到5’AAT 108×1、5’AAT 108×4、5’AlbE6×1以及5’Alb E6×4载体。
为了将LCR元件插入到pGL4.2-CMV载体中SV40晚期poly(A)(SV40late poly(A))信号的3’区，用BamHI限制性酶切割pGL4.2-CMV载体和Alb E6元件并用BglII限制性酶切割AAT 108元件。使用相容末端(compatible end)将产物插入到pGL4.2-CMV载体中。通过上述方法得到3’AAT 108×1、3，AAT 108×4、3，Alb E6×1和3，Alb E6×4载体。
为了将LCR插入到pGL4.2-CMV载体中启动子的5’区域和SV40晚期poly(A)信号的3’区，用限制性酶KpnI和NheI切割在SV40晚期poly(A)信号的3’区含有LCR元件的载体和上述制备的PCR产物，随后进行连接。通过上述方法得到5，3，AAT 108×1、5，3，AAT 108×4、5，3，Alb E6×1以及5’3’Alb E6×4载体。
为了评价LCR元件的效果，将CHO-K1贴壁细胞系进行转染。转染前24小时，将在DMEM(LONZA，12-604F)(w/v 10％FBS)培养基中传代培养的500μL的各CHO-K1细胞培养物以0.5×105个细胞/孔分配到24孔平板中。在1.5mL管中将800ng的测试DNA(分别为pGL4.2-CMV、5’AAT 108×1、5’AAT 108×4、5’Alb E6×1、5’Alb E6×4、5’3’AAT 108×1、5’3’AAT108×4、5’3’Alb E6×1以及5’3’Alb E6×4)与Opti-MEM(Gibco，31985-088)混合以达到50μL的总体积(基于1个孔)。在另一些1.5mL管中，将2μL的脂质体(Invitrogen，11668027)与Opti-MEM混合以达到50μL的总体积，并使其在室温下反应5分钟。将上述制备的两种溶液混合，并使其在室温下反应20分钟。将所得物以100μL/孔分配到孔中。24小时后，将各孔中的培养基更新并向孔中添加50μg/mL嘌呤霉素(Gibco，A11138-03)用于细胞选择。
针对7组，通过约2至4周的选择期建立稳定细胞。使用建立的稳定细胞，通过One-glo萤光素酶分析系统(Promega，E6110)用与MAR候选元件分析相同的方法进行萤光素酶分析。在7组的结果中，选择显示出最相似结果的3个组的结果，并对各元件的效果进行了比较。测量每个元件的萤火虫萤光值并相对细胞数目进行校正，与pGL4.2-CMV载体相比，其表现出0.54至3.94倍的提高(参照图6)。
如图6中所述，显示出最好的结果的元件是通常使用的5’MAR 3.0kb元件，其显示出0.24至9.02(3.94+4.55)倍提高效果。接着，5’3’AAT 108×4元件显示出1.79至4.67(3.38+1.46)倍提高效果提。
为了评价pGL4.2-CMV-3’AIb E6、pGL4.2-CMV-3’AIb E6×4、pGL4.2-CMV-3’AAT108×1和pGL4.2-CMV-3’AAT 108×4载体在稳定表达中的效果，进行如上所述的相同测试。进行2周的嘌呤霉素选择，并进行1组测试。结果示于图7中。
如图7所示，与pGL4.2-CMV载体相比，pGL4.2-CMV-3’AAT 108×4载体显示为约2倍的提高。认为这个结果或许可解释(尽管是间接地)pGL4.2-CMV-5’AAT 108×4载体显示出不超过1.15倍的平均提高，但pGL4.2-CMV-5’3’AAT 108×4载体显示出3.38倍的平均提高(见图6)。
从稳定条件下萤光素酶分析测试的结果鉴定出两种类型的有效LCR元件，但与常规使用的5’MAR 3.0kb相比，其未显示出显著改进。此外，考虑到萤光测量试验中大的变异，选择在本测试中验证了其效果的载体，即pGL4.2-CMV-3’AAT 108×4载体和pGL4.2-CMV-5’3’AAT 108×4载体并计划直接评价其重组蛋白质的表达水平。
1-3：内含子元件的选择
为了通过人补体因子H的缺失形式(Deletion form of the human complementfactor H，dCFH)的表达来评价嵌合内含子的效果，首先制备dCFH基因。
通过2步PCR，将SCR#1～4(调控区(Regulatory region))与SCR#18～20(结合区(Binding region))连接来制备具有总共7个短共有重复(short consensus repeat，SCR)的dCFH，所述SCR选自CFH中的20个SCR，不包括13个中间SCR。在如下将要进行的测试中，Phusion高保真DNA聚合酶(Therme/F-530S)用作聚合酶；将模板在98℃下变性30秒以使DNA链分离，并将在98℃变性10秒，在55℃退火30秒，在72℃延伸30秒的过程重复30个循环，随后在72℃下再延伸5分钟来扩增DNA分子。
SCR 1F引物(SEQ ID NO：21)含有限制性酶NotI位点，SCR 20B引物(SEQ ID NO：24)含有xhoI位点，所以他们可用于将来的克隆。
在PCR的第一步中，使用pMSGnee-hCFH作为模板并且使用含有SCR#5的后(3’)区和SCR#18的前(5’)区的SCR 1F引物(SEQ ID NO：21)和SCR 5(18)B引物(SEQ ID NO：22)获得SCR#1～5。另外，使用pMSGneo-hCFH作为模板并且使用含有SCR#5的后(3’)区和SCR#18的前(5’)区的SCR 18(5)F引物(SEQ ID NO：23)和SCR 20B引物(SEQ ID NO：24)获得SCR片段#18～20。将所制备的2种片段用SV凝胶和PCR净化系统(Promega)进行纯化和回收。
上述pMSGneo hCFH的制备方法如下。
首先，使用pCMV-SPORT6-hCFH载体(Imagene，#IRATp970B10140D)作为模板并且使用引物对(SEQ ID No：47和48)进行PCR。如下所述进行PCR反应：通过以下步骤制备总计50μL的PCR反应混合物：混合5ng的pCMV-SPORT6-hCFH、1μL的每种引物(10nmol/mL)、1μL的PCR预混合物(ProFi Taq PCR预混合物，Bioneer)和46μL的蒸馏水；然后将混合物进行94℃下30秒，65℃下60秒，65℃下3分钟20秒的反应过程，进行30个循环。将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳后，通过凝胶洗脱(gel elution)获得编码hCFH的基因片段。
然后，分别用NotI和XhoI处理编码hCFH的基因片段和pMSGneo载体(MogamInstitute，Korea)(一种骨架载体)；然后，使用T4连接酶(ligase)将其连接以获得hCFH的表达载体；由此制备的表达载体命名为“pMSGneo-hCFH”。
使用在PCR的第一步中获得的2种片段作为模板并且使用SCR1F引物(SEQ ID NO：21)和SCR 20B引物(SEQ ID NO：24)进行PCR的第二步骤。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo/F-530S)，将模板在98℃下变性30秒以使DNA链分离，并通过在98℃变性10秒，在55℃退火30秒以及在72℃延伸45秒的过程重复30个循环，随后在72℃再延伸5分钟来扩增DNA分子以获得dCFH基因(SEQ ID NO：46)(图8)。
接着，制备表达载体pcDNA-dCFH。
用NotI和XhoI限制性酶将pMSGneo-dCFH载体和pcDNA3.1(+)载体在37℃下酶切约3小时。将经切割的载体在琼脂糖凝胶上进行电泳并从所述胶上切下在经切割的pMSGneo-dCFH基因中的dCFH基因和在经切割的pcDNA3.1(+)基因中具有载体尺寸的基因。将切下的基因用Sv凝胶和PCR净化系统进行纯化和回收。使用DNA连接试剂盒2.1版使经切割的基因在16℃下反应约6小时以制备pcDNA-dCFH表达载体。
然后，制备pcDS-dCFH表达载体。用NheI(NEB/R0131S)和NotI限制性酶切割pcDNA3.1(+)载体和Y11LC pcIw载体(参见：Nucleic Acids Res.，2008年9月；36(15)：e96)。将经切割的基因在琼脂糖凝胶上进行电泳并从所述胶中切下在经切割的Y11LC pcIW载体基因中的嵌合内含子基因(SEQ ID NO：25)和经切割的pcDNA3.1(+)载体基因。将切下的基因用Sv凝胶和PCR净化系统进行纯化和回收。使用DNA连接试剂盒2.1版将经切割基因在16℃下反应约6小时以制备pcDS-MCS载体。另外，使用如上制备的pcDS-MCS载体和pcDNA-dCFH载体通过如上所述的方法制备pcDS-dDFH载体，其中dCFH基因被插入到pcDS-MCS载体的NheI/NotI切割位点。
为了确保获得WPRE基因(SEQ ID NO：26)，使用Y11LC pcIW载体作为模板进行PCR。在如下将要进行的测试中，将Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo/F-530S)作为聚合酶；将模板在98℃下变性30秒以使DNA链分离，并通过将在98℃变性10秒，55℃退火30秒以及在72℃延伸30秒的过程重复30个循环，随后在72℃再延伸5分钟来扩增DNA分子。本文所使用的wPRE F引物(SEQ ID NO：27)含有限制性酶XhoI位点，wPRE B引物(SEQ ID NO：28)含有XbaI位点，所以它们可用于将来的克隆。将所得到的PCR产物用SV凝胶和PCR净化系统进行纯化和回收。
用XhoI和XbaI(NEB/R0145S)限制性酶将通过上述PCR获得的wPRE基因和pcDS-dCFH载体在37℃下酶切约1小时。将经切割的基因用Sv凝胶和PCR净化系统进行纯化和回收。使用DNA连接试剂盒2.1版使经切割基因在16℃下反应约3小时以制备pcDSW-dCFH载体，其中WPRE基因被插入到pcDS-dCFH载体的XhoI/XbaI切割位点。
为了验证嵌合内含子提高瞬时表达水平的效果，制备了CHO-S细胞(Invitrogen，#R800-07)。将细胞解冻；使用锥形瓶规模(Erlenmeyer scale)将细胞以3×105个/mL接种到30mL的Freestyle CHO表达培养基(Invitrogen，#12651-014)中；并保持2至3代以使他们在2至3天内能长到1.2×106至2.0×106个细胞/mL。然后，使用FreestyleTM Max试剂(Invitrogen，#16447-100)用以上制备的pcDNA-dCFH载体、pcDS-dCFH载体和pcDSw-dCFH载体转染细胞。转染后，从第3天到第7天每天一次收集1mL的培养液。使用所收集的培养液测量细胞的数目和生存力；使用人补体因子H ELISA试剂盒(Hycult biotech，#HK342)验证dCFH表达水平(图9)。
转染有pcDNA-dCFH载体的CHO-S细胞显示出约13.025μg/mL的最高表达水平，而转染有pcDS-dCFH载体和pcDSw-dCFH载体的CHO-S细胞分别显示出约30.757μg/mL和48.208μg/mL的最高表达水平。每种载体比pcDNA-dCFH显示出高约2.4至3.7倍的表达水平。
其次，为了验证嵌合内含子的效果，将制备的dCFH表达载体转染到FreeStyleTM293-F细胞(Invitrogen/R790-07)中。在FreeStyle 293表达培养基(Gibco/12338-018)中培养FreeStyleTM 293-F细胞。转染前24小时，将细胞以7×105个细胞/mL进行传代。
在转染的当天，在125mL的锥形瓶(erlenmeyer flasks)中用培养基将细胞稀释至总体积30mL，7×106个细胞/mL。在1.5mL管中，将30μg用于转染的质粒(pcDNA-dCFH、pcDS-dCFH和pcDSW-dCFH)和OptiPROTM SFM(Gibco/12309-019)混合至总体积600μL。在新的1.5mL管中，将90μL的PEI MAX(Polyscience/24765-2)(1μg/μL)和510μL的OptiPROTM SFM混合。将含有质粒的溶液和含有PEI MAX的溶液混合并在室温下反应10分钟。当含有293-F细胞的锥形瓶缓慢转向时，将混合的溶液添加至其中。将细胞在5％CO2悬浮培养箱中于37℃下以130rpm培养7天。从第3天将培养基收集在1.5mL管中，持续7天，并在5000rpm下离心3分钟以使细胞沉淀。然后，取出上清液并使用人补体因子H ELISA试剂盒(Hycult biotech/HK342)测量dCFH表达水平(图10)。
如图10中所示，转染有pcDNA-dCFH、pcDS-dCFH和pcDSw-dCFH的细胞分别显示出约138.9μg/mL、638.8μg/mL和896.7μg/mL的最大表达水平。与pcDNA-dCFH表达载体相比，转染有含嵌合内含子的载体的细胞显示出约4.6倍的提高，转染有含嵌合内含子和wPRE二者的载体的细胞显示出约6.5倍的提高。
最后，为了验证嵌合内含子对稳定表达的影响，制备了CHO-DG44细胞(DRL.Chasin，Columbia University)。将细胞解冻；将其以3×106细胞/T75瓶接种到MEMαw/HT(Gibco，12571-063)+10％DFBS(Biotechnics research，7103)培养基中；并保持2至3代以使他们在2至3天内能长到90％的汇合(confluency)。然后，使用2000转化试剂(Invitrogen，#11668-027)将制备的pcDNA-dCFH载体、pcDS-dCFH载体和pcDSW-dCFH载体转染到细胞中，5×106个细胞/瓶。转染后48小时，用补充有500μg/mL的G418的培养基替换该培养基以用于细胞选择。同时监测细胞生长约一周，在80％至90％汇合时进行第一次传代。在第一次传代后，如果细胞在2至3天内显示出80％至90％的汇合，则再传代两次，并且以相同的方式将细胞以5×106个细胞/瓶接种到T75瓶中，然后从第3天至第7天每天一次收集1mL的培养液。在7天的最后一天，在用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invirtogen，#25200-056)处理细胞后对细胞数目和生存力进行计数；使用人补体因子H ELISA试剂盒(Hycultbiotech，#HK342)测量dCFH表达水平(图11)。
如图11所示，转染有pcDNA-dCFH载体的CHO-DG44细胞显示出约0.054μg/mL的最高表达水平，而转染有pcDS-dCFH和pcDSw-dCFH载体的CHO-DG44细胞分别显示出约0.934μg/mL和0.924μg/mL的最高表达水平。每种载体比pcDNA-dCFH显示出高约17.3至17.1倍的表达水平。
1-4：额外元件的选择
通过比较使用四个元件(其为在初始选择MAR和LCR元件时所选择的)的FIX(因子IX)蛋白质表达水平进行额外选择。计划通过从上述制备的萤光素酶载体中除去萤光素酶基因并将FIX基因插入到其中来制备载体。对于在新载体制备物中的使用，制备引物组(SEQID NO：29和30)以使引物在FIX基因的前面包括XhoI、PacI和ApaI限制性酶位点并且在FIX基因的后面包括ApaI和FseI位点。
然后，使用pMSG-FIX载体作为模板以及引物组(SEQ ID NO：29和30)进行PCR。
pMSG-FIX载体的制备方法如下。首先，使用寡聚-dT柱(Invitrogen，USA)从人肝(liver)细胞中提取mRNA以分离FIX基因。在制备引物组(SEQ ID No：49和50)后，使用Titanone tube RT-PCR系统(Roche)进行RT-PCR以合成具有约1,383bp(461个氨基酸)大小的FIXcDNA，然后将其克隆到pGEM-T载体(Promega)中，所述引物组基于在基因库中登记的FIX基因序列(Ref.；Genbank登录号1至2775碱基对)与FIX基因特异性的5’端和3’侧翼区结合。
使用包括NheI和Bg1II的引物组(SEQ ID NO：51和52)通过PCR扩增分离的FIX基因，并将其克隆到pMSG载体(Mogam Biotechnology institute，Korea)中，pMSG载体是动物细胞表达载体。使用NheI和Bgl II限制性酶(New England Bio Labs，USA)对从PCR得到的FIX基因进行切割，然后进行1.2％琼脂糖凝胶电泳以分离1.4kb大小的基因。将分离的FIX基因与预先用NheI和Bg1II限制性酶处理的pMSG载体连接以制备FIX表达载体。使用氯化钙沉淀法用其中已完成连接反应的DNA混合物转化大肠杆菌DH5α。将经转化的大肠杆菌涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上并在37℃下培养过夜。将在培养平板上形成的克隆进行培养后，使用QIA过滤型小型质粒试剂盒(filter mini-Plasmid Kit；Qiagen，Germany)分离质粒。通过用NheI/Bg1II限制性酶处理来确认分离的质粒DNA含有FIX DNA片段。由此制备的表达载体命名为“pMSG-FIX”。
将通过PCR扩增的DNA片段通过凝胶提取进行纯化并插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。通过使用限制性酶的酶切图谱和DNA序列分析验证由SEQ ID NO：31表示的FIX基因的存在。使用相同的限制性酶将FIX基因插入到其中用XhoI和FseI限制性酶除去萤光素酶基因的载体中。由此制备的FIX表达载体组1的示意图示于图12。
用与萤光素酶表达测试相同的方法测量在贴壁细胞系CHO-K1中的FIX表达。在与上述相同的方式中，通过约2周的选择期建立稳定细胞。在总计4组中进行测试，通过ELISA法测量FIX的表达水平并相对细胞数目进行校正。
FIX ELISA方法如下。将孔中的培养基收集到1.5mL管中。各孔用1mL的1×PBS洗涤。将100μL/孔的胰蛋白酶-EDTA添加至孔中，然后将其在37℃下在细胞培养箱中反应1分钟以从底部分离经转染的细胞。每个孔中添加1mL培养基以收集细胞，并对细胞的数目进行计数。在连续培养的情况下，使用12孔板将细胞以0.5×105至1.0×105细胞/mL传代培养并使用嘌呤霉素(50μg/mL)进行细胞选择。
使用包被缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液；在添加1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3至1L的三级蒸馏水后将pH调至9.6)将由用于人因子IX抗原(human Factor IX antigen)(Affinity Biological，FIX-EIA)ELISA的配对抗体组(Matched-Pair Antibody set)提供的捕获抗体(Capture antibody)稀释至1/100。将经稀释的捕捉抗体以100μL/孔分配到96孔ELISA板中，并使其在室温下反应2小时。将孔用PBS-吐温缓冲液洗涤3次。然后使用稀释缓冲液通过1/2逐级稀释从50ng/mL至0.781ng/mL制备因子FIX(Benefix，250μg/mL)作为标准物(Standard)。使用稀释缓冲液(1％BSA 1×PBS)将首先收集的培养基稀释至1/10、1/100和1/1000，然后以100μL/孔添加至孔中，并使其在室温下反应1小时30分钟。将孔用PBS-吐温缓冲液洗涤3次。每孔添加100μL的TMB微孔过氧化物酶底物(microwell peroxidasesubstrate)，并使其在室温下反应10分钟。然后每孔添加100μL的2.5M H2SO4以终止反应，并用微板读数器在450nm读取吸光度。
如图13和下表2所示，总体趋势类似于先前萤光素酶的结果。与CMV启动子相比，SV40启动子显示出高约3.4倍的提高效果。最有效的是pGL4.2-SV40-5’MAR3.0载体，与CMV对照组和SV40对照组相比，其分别显示出7倍和2.1倍表达水平提高的效果。
表2
为了检查在SV40启动子的控制下LCR元件的效果，使载体进行克隆过程以替换启动子。使用NheI和XhoI限制性酶从上述制备的具有CMV启动子的载体中除去CMV启动子，并使用相同的限制性酶插入SV40启动子。另外，制备具有5’MAR和3’AAT 108×4组合的载体和5’3’MAR3.0载体并在测试中使用。制备的FIX表达载体组2的示意图示于图14中。
通过与FIX表达载体组1相同的方法测量在贴壁细胞系CHO-K1中FIX的表达。通过约2周的选择期建立稳定细胞。在总计3个组中进行测试，通过ELISA法测量FIX的表达水平并相对细胞数目进行校正。
如图15和下表3中所示，没有示例显示出与SV40对照组相比表达水平提高；在具有替换的SV40启动子的LCR候补组中，与pSV40-5’MAR3.0相比，没有载体显示出较高的表达水平。因此，通过比较FIX表达水平选择SV40启动子和5’MAR3.0元件。
表3
实施例2：新载体的制备
使用实施例1中选择的元件制备新载体。
将在FIX表达比较测试中使用的pSV40-5’MAR3.0-FIX载体用ApaI限制性酶处理以除去FIX基因，并使其自连接以获得pSV40-5’MAR3.0-MCS载体。MCS包括4种类型的限制性酶位点：XhoI、PacI、ApaI和FseI。
将在pSV40-5’MAR3.0-MCS载体中的嘌呤选择区用DHFR表达区替换以额外制备具有DHFR基因的载体。在检查用于替换的限制性酶位点后，发现存在两个SapI位点(在前面和后面)；并通过用Sa1I和Af1III处理除去在后面的SapI位点并使用klenow酶制备平末端(blunt end)，然后自连接。嘌呤霉素表达系统(pMS-P-MCS)的限制性酶图谱的示意图示于图16中。
至于所需的DHFR表达系统，使用已在本研究机构常规使用的pDCH1P载体。在包括仓鼠DHFR基因的约2.5kb中，基于参考文献(Proc Natl Acad Sci.，1991，第88卷.第8572页；和Mol.Cell.Biol.，1984，第4卷，第38页)确认5’侧翼和3’侧翼、启动子和polyA部分并设计用于将尺寸减小至约1.5kb的PCR引物(SEQ ID No：32和33)。
使用pDCH1P载体作为模板进行PCR获得DNA片段，然后将其插入到pCR2.1-TOPO载体中并测序(SEQ ID NO：34)。将已经验证了基因序列的DHFR表达区插入到pSV40-5’MAR3.0-MCS载体中。载体和插入物各自用SapI和Sa1I限制性酶切割并再次连接。用相同的限制性酶处理克隆的产物，并验证DNA凝胶上是否存在所需尺寸的条带。通过上述过程，制备新载体对I(pMS-P-MCS和pMS-D-MCS)(图17)。
为了比较制备的新载体对与常规载体的基因表达能力，将ER2抗体(EGFR抗体；参见韩国专利No.1108642)基因克隆到每对新载体和pMSGneo载体(Mogam BiotechnologyInstitute，Korea)(其是常规的MAR载体)中。为了克隆到两种载体中，将ER2抗体的轻链和重链二者在5’区添加XhoI和NheI位点并且在3’区添加PacI和XhoI位点，然后进行PCR。对于PCR，pOptiVEC-ER2HC和pcDNA3.3-ER2LC载体分别用作模板，且HC(SEQ ID NO：35和36)组和LC(SEQ ID NOs：37和38)组分别用作重链和轻链的引物。将PCR产物插入到pCR2.1-TOPO载体中并确认DNA序列(SEQ ID NO：42和43)。
使用NheI和XhoI限制性酶将其序列已被验证的ER2抗体的轻链和重链基因克隆到pMSGneo载体中，并且还使用XhoI和PacI限制性酶将其分别克隆到新载体对(pMS-P-MCS和pMS-D-MCS)中。
用相同的限制性酶处理克隆的产物，并验证DNA凝胶上是否存在具有所需尺寸的条带。因此，制备了4种载体，其包括用于ER2抗体表达的新载体对I(pMS-P-ER2LC和pMS-D-ER2HC)和MAR载体对(pMSGneo-ER2LC和pMSGneo-ER2HC)(图18A和18B)。
另一方面，额外制备载体以验证向以上制备的新载体对I添加嵌合内含子的效果。使用pcDS-dCFH载体作为模板并且使用引物组SEQ ID No：44和45进行PCR以获得DNA片段，并将PCR产物插入到pCR2.1-TOPO载体中，并验证嵌合内含子的DNA序列(SEQ ID NO：25)。用XhoI切割用于ER2抗体表达的新的载体对I(pMS-P-ER2LC载体和pMS-D-ER2HC载体)，并将用相同的限制性酶处理的嵌合内含子分别插入其中。通过上述过程，制备了用于ER2抗体表达的新载体对II(pMSI-P-ER2LC和pMSI-D-ER2HC ER2)(图19)。
额外制备ER2抗体表达载体以验证新载体对II的元件性质。
至于仅具有SV40启动子的载体，用如上所述相同的方法通过从pGL4.2-SV40-FIX载体中除去FIX基因制备pS-P-MCS载体，并通过进一步用DHFR基因替换嘌呤霉素基因来制备pS-D-MCS载体。然后，使用XhoI和PacI将ER2的轻链和重链基因插入其中以制备用于ER2抗体表达的具有SV40启动子的载体对(pS-P-ER2LC和pS-D-ER2HC)(图20A)。使用XhoI限制性酶将嵌合内含子插入到制备的载体中以制备包含嵌合内含子的载体对(pSI-P-ER2LC和pSI-D-ER2HC)(图20B)。
实施例3：载体的基因表达能力的评价
如下验证了上述制备的新载体的基因表达能力。
3-1：贴壁细胞系中用于ER2抗体表达的新载体对I和新载体对II的评价
首先，在CHO-K1和CHO-DG44贴壁细胞系中进行使用新载体对I和新载体对II的ER2抗体表达。将表达水平与表4中所示的商业化的双载体对和MAR载体对进行比较。
表4
转染前24小时，将在DMEM(w/10％FBS)培养基中培养的CHO-K1细胞以0.8×105个细胞/孔，每孔500μL的量分配到12孔板的孔中。将在MEM-αw/HT(Gibco，12571-063)培养基中培养的CHO-DG44细胞以1.5×105个细胞/孔，每孔500μL的量分配到孔中。分配后24小时，将Opti-MEM和测试载体在1.5mL管中混合以达到50μL的总体积(基于1个孔)。将47μL的Opti-MEM和3μL的脂质体2000在一个新的1.5mL管中混合，并使其在室温下反应5分钟(基于1个孔)。反应完成后，将以上制备的两种溶液混合并使其在室温下反应20分钟。24小时后，从各孔除去转染的培养基并用PBS洗涤。将胰蛋白酶-EDTA(1×)以100μL/孔分配到其中并使其在37℃下反应1分钟以分离细胞。将培养基以1000μL/孔分配到其中并对细胞数目进行计数。
将CHO-K1细胞以1.0×105个细胞/孔分配到12孔板的孔中以达到1mL的总体积；对于每种载体，向其中适当地添加1000μg/mL的G418(PAA，P11-012)或50μg/mL的嘌呤霉素；并进行细胞选择。将DG44细胞以1.5×105个细胞/孔分配到12孔板的孔中以达到1mL的总体积；对于每种载体，向其中适当地添加750μg/mL的G418或20μg/mL的嘌呤霉素；并进行细胞选择。在总计2个组中进行转染，在整个3周内以总计每组3次获得样品，并进行了ELISA试验。
ER2ELSIA方法如下。将山羊抗-人IgG(Fab-特异性(Fab-specific))(Sigma，I5260)用包被缓冲液稀释至5μg/mL。将稀释的捕捉抗体以100μL/孔分配到96孔ELISA板中，并使其在室温下反应2小时或更长时间。将其用300μL的PBS-0.1％Tween 20缓冲液洗涤3次。以300μL/孔向其中添加PBS-1％BSA，并在室温下封闭2小时。将所得物用300μL的PBS-0.1％Tween 20缓冲液洗涤3次。使用PBS-1％BSA以280ng/mL、140ng/mL、70ng/mL、35ng/mL、17.5ng/mL、8.75ng/mL和4.375ng/mL的浓度制备HBIG基因(2.8mg/mL)作为标准。使用PBS-1％BSA稀释培养液。将标准的和经稀释的培养溶液以100μL/孔的重复分配到包被有捕获抗体的96孔板中，并使其室温下反应1小时。用300μL的PBS-0.1％Tween 20缓冲液将各孔洗涤3次。使用PBS-BSA将山羊抗-人IgG(Fc特异性)-HRP(Sigma，A0170)稀释至1/100,000。将经稀释的溶液以100μL/孔分配到平板中，并使其在室温下反应1小时。将所得物用300μL的PBS-0.1％Tween 20缓冲液洗涤3次。将TMB微孔过氧化物酶底物以100μL/孔进行分配，并使其在室温下反应30分钟。将2.5M H2SO4以100μL/孔进行分配以停止反应，并使用微板读数器在450nm下测量吸光度。用4-参数拟合(parameter fitting)制成标准曲线(standardcurve)并用测量的培养液的吸光度替代参数来计算浓度。
如表5和图21A和21B所示，无法验证在CHO-K1中ER2Ab在商业化的双载体对中的表达水平。常规MAR载体对、新载体对I和新载体对II显示平均表达水平分别为约9.7ng/mL、约14.0ng/mL和约1473.2ng/mL。新载体对I和新载体对II分别比MAR载体对显示出高约1.4倍、约151.3倍的表达水平。此外，新载体对II比新载体对I显示出高约105.4倍的表达水平，这显示嵌合内含子的效果是优异的。
CHO DG44细胞中商业化的双载体对、MAR载体对、新载体对I和新载体对II的ER2抗体的平均表达水平分别为13.1ng/mL、3.8ng/mL、27.5ng/mL和653.0ng/mL。商业化的双载体对比MAR载体对显示出高约3.5倍的表达水平。新载体对I和新载体对II分别比MAR载体对显示出高约7.3倍和173.7倍的表达水平。此外，新载体对II显示出比新载体对I高约23.8倍的表达水平。
表5
3-2：在悬浮的细胞系中新载体对II的评价
在CHO-S和CD DG44-S悬浮细胞系中对新载体对II进行了评价。
转染前24小时，在CD FortiCHO培养基中以5×105至6×105个细胞/mL将CHO-S细胞系(Gibco，A13696-01)进行传代以达到所需量。在转染的当天，测量细胞的数目和生存力(viability)(必需为95％或更高)。使用CD FortiCHO培养基(Gibco，A11483-01)将细胞以1×106个细胞/mL分配到125mL瓶中。将90μg的质粒DNA与OptiProTMSFM混合以达到1.5mL的总体积。270μL的PEI MAX(1μg/μL)和1230μL的OptiPro TM SFM混合，绝对不要进行涡旋(vortexing)。将含有PEI MAX的OptiProTM SFM置于含有质粒DNA的OptiProTM SFM中，然后将其轻轻混合。然后，使所得物在室温下反应5分钟。将3mL所产生的DNA：PEI复合物逐滴添加至预先制备的125mL瓶中的CHO-S细胞中。将细胞在CO2振荡培养箱(shaking incubator)中于37℃在130rpm至150rpm搅拌下进行培养，48小时后进行细胞选择。
另一方面，通过以下方法制备CD DG44-S细胞系。首先，使用125mL旋转瓶以2至3天的间隔将CHO DG44贴壁细胞系(在α-MEM(w/)+10％cFBS培养基中培养的)在50mL培养基中进行传代，使用无血清培养基(HyQ SFM4CHO(Thermo Scientific，Hyclone)+1x HT补充物(Supplement))，从而使细胞适应悬浮培养。使用Ex CELLTM CD CHO(Sigma，14361C)/4mM L-谷氨酰胺/1X HT补充培养基的替换培养基将适应好的细胞以2至3天的间隔进行传代培养，从而使细胞适应培养基。如果该细胞的生长稳定且生存力保持在90％或更高，并且所述细胞的浓度达到1×106至2×106个细胞/mL，将CHO DG44-S宿主细胞系存库(banking)，从而确保细胞系。
转染前24小时，将细胞在Ex-CELLTM CD CHO(Sigma，14361C)以5×105至7×105个细胞/mL传代至所需量。使用Freestyle CHO培养基将细胞以2×106个细胞/mL，15mL的量分配到125mL瓶中。30μg的质粒DNA与150mM NaCl混合以达到0.75mL的总体积。将90μL的PEIMAx(1μg/μL)和150mM NaCl混合，绝对不要进行涡旋。将含有PEI MAx的150mM Na Cl置于含有质粒DNA的150mM NaCl中并轻轻混合。使所得物在室温下反应5分钟。将1.5mL所产生的DNA：PEI复合物逐滴添加至预先制备的125mL瓶中的CD DG44-S细胞中。将细胞在CO2振荡培养箱中在37℃培养以130rpm培养5小时，并在48小时后进行细胞选择。
在CHO-S的情况下，使用表6所示的选择培养基进行细胞选择。
表6
首先，将转染的细胞数目进行计数。使用适于各种条件的选择培养基，将细胞以5×105细胞/mL，50mL的量分配到T-175瓶中。如果细胞的数量不够，则减少总体积。将细胞在CO2培养箱中在37℃下于静态条件下培养。选择后7天，将细胞的数目进行计数。如果生存力超过30％，将测试继续进行至下一步骤，但是如果没有超过，则10至11天后对细胞的数目进行计数。如果甚至是在11天后生存力仍小于30％，则用新的选择培养基替换该选择培养基，并减小T-瓶的尺寸以使得浓度变为3×105个细胞/ml或更高。以3至4天的间隔将培养基完全更换，并检查恢复信号(如果有的话)。如果存在恢复信号且生存力在30％至50％的范围内，使用适合该条件的选择培养基将细胞在125mL瓶中以3×105个细胞/mL进行传代。将细胞在CO2培养箱中在37℃下以150rpm进行搅拌培养。以3至4天的间隔，使用适合该条件的选择培养基在125瓶中将细胞以3×10个细胞/mL，30mL的量进行传代。如果稀释倍数为2倍或更高，不完全更新培养基。如果生存力为85％或更高且活细胞密度为1×106个细胞/mL或更高时，认为选择完成。
另一方面，在CD DG44-S的情况下，使用表7中所示的选择培养基进行细胞选择。
表7
载体 CD DG44-S选择培养基的成分
新载体对II 含有2.5μg/mL嘌呤霉素的EX-CELL<sup>TM</sup> CD CHO
MAR，商业双载体 含有100μg/mLG418的EX-CELL<sup>TM</sup> CD CHO
将经转染的细胞的数目进行计数。使用适于各种载体的选择培养基，将细胞以5×105个细胞/mL，每瓶30mL的量分配到125mL瓶中。如果细胞的数量不够，则降低总体积。将细胞在CO2培养箱中在37℃下以130rpm进行搅拌培养。以3至4天的间隔，使用选择培养基在125mL瓶中将细胞以3×105细胞/mL，30mL的量进行传代。如果稀释倍数为2倍或更高，则不完全更新培养基。如果生存力为80％或更高且活细胞密度为1×106个细胞/mL或更高时，则认为选择完成。在总计2组中进行转染，在整个3至4周内以每组总计3次获得样品，并进行ELISA试验。
以对于贴壁细胞系所描述的相同方式进行ER2ELISA，其结果示于表8中。
如下表8所示，关于在CHO-S细胞系中ER2抗体的3天生产率，商业化的双载体对、MAR载体对和新载体对II的表达水平分别为0.2μg/mL至0.3μg/mL、1.0μg/mL至2.0μg/mL以及9.5μg/mL至17.0μg/mL(平均)。关于批量生产率，商业化的双载体对、MAR载体对和新载体对II的最大生产量分别为0.7μg/mL、10.3μg/mL和35.0μg/mL(平均)。因此，关于批量生产率，与商业化的双载体对和MAR载体对相比，本发明的新载体对II分别显示出约50倍和约3.4倍或更高的抗体表达提高效果。
另外，在CD DG44-S细胞系中，关于ER2抗体的3天生产率，商业化的双载体对、MAR载体对和新载体对II的表达水平分别为0.2μg/mL至0.3μg/mL、0.2μg/mL至0.25μg/mL和1.0μg/mL至1.5μg/mL。关于批量生产率，商业化的双载体对、MAR载体和新载体对II的最大生产量分别为0.7μg/mL，0.5μg/mL和3.6μg/mL(平均)。
关于批量生产率，与商业化的双载体和MAR载体对相比，新载体对II分别显示约5.1倍和约7.2倍或更高的抗体表达提高效果。
表8
3-3：新载体的组成元件的性质评价
在CHO-S和CD DG44-S细胞系中进行新载体的组成元件的性质评价。如下面的表9所示，在测试中使用的载体对如下：pS(启动子载体对)、pSI(内含子载体对)、pMS(新载体对I)和pMSI(新载体对II)。
表9
如下所述使用与实施例3-2相同的评价方法。转染每对载体，并且当通过选择期完成选择后，比较ER2抗体表达水平。结果示于下表10。
表10
如表10所示，在CHO-S细胞系中，关于新载体对I、新载体对II、启动子载体对和内含子载体对的细胞选择是分别在约4周、约4.5周和约7周内完成。具有MAR元件的新载体对I和新载体对II比内含子载体对显示出约1.8倍更短的选择期。选择结果表明，与启动子载体对相比，内含子载体对、新载体对I和新载体对II的3天的生产率分别提高18.4倍、1.8倍和20.6倍；内含子载体对、该新载体对I和新载体对II的PCD(皮克/细胞/日期(Picogram/cells/date))分别提高13.3倍、1.0倍和26.1倍。
在CD DG44-S细胞系中，关于四个载体的细胞选择都是在约三周内完成。与在CHO-S中不同，使所有载体在类似的时间段内完成了适应。此外，发现，与启动子载体对相比，内含子载体对、新载体对I和新载体对II的3天的生产率分别提高13.8倍、2.4倍、64.8倍；内含子载体对、新载体对I和新载体对II的PCD分别提高14.7倍、3.8倍、86.4倍。
总之，当MAR元件与内含子元件一起使用而不是单独使用时，观察到3天的生产率和PCD有约1.6至2.0倍的协同效应。
虽然本发明已经描述了关于上述具体的实施方案，但应认识到，本领域技术人员可对本发明作出的多种修改和变化也落入由所附的权利要求所限定的本发明的范围内。

Claims (8)

1.表达载体，其包含可操作地连接的猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）启动子、由SEQ ID NO:41表示的基质附着区（matrix attachment region，MAR）元件以及由SEQ IDNO:25表示的嵌合内含子（chimeric intron），
其中所述表达载体具有图19中公开的pMSI-P-ER2LC或pMSI-D-ER2HC的结构；并且
其中所述pMSI-P-ER2LC的ER2LC区和所述pMSI-D-ER2HC的ER2HC区被靶基因替换。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述SV40启动子由SEQ ID NO:12表示。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其还包含由SEQ ID NO:15或16表示的基因座控制区（locus control region，LCR）元件。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其中表达受所述启动子调控的靶基因被插入到所述表达载体中。
5.权利要求4所述的表达载体，其中所述靶基因选自：
因子VII（factor VII，FVII）基因、因子VIII（factor VIII，FVIII）基因、因子IX（factor IX，FIX）基因、表皮生长因子受体家族（epidermal growth factor receptorfamily）抗体基因、胰岛素基因、白细胞介素基因、肿瘤坏死因子基因、干扰素基因、集落刺激因子基因、趋化因子基因、促红细胞生成素基因、甲胎蛋白基因、α-葡糖苷酶基因、α1-抗胰蛋白酶基因、抗凝血酶基因、脂蛋白基因、血浆铜蓝蛋白基因、纤维蛋白原基因、葡糖脑苷脂酶基因、触珠蛋白基因、纤维蛋白溶酶原基因、凝血酶原基因以及转铁蛋白基因。
6.由权利要求1至5中任一项所述的表达载体转化的细胞。
7.权利要求6所述的细胞，其中所述细胞选自：CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-S细胞、CHO DUKX-B11细胞、COS7细胞、COS3细胞、COS1细胞、NSO细胞、HeLa细胞、Vero细胞、PER-C6细胞、HepG2 细胞以及BHK细胞。
8.用于生产靶蛋白的方法，其包括：
培养由权利要求4或5所述的表达载体转化的细胞以表达所述靶蛋白；和
回收所述靶蛋白。
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