ES2617217T3

ES2617217T3 - Vector de expresión para células animales

Info

Publication number: ES2617217T3
Application number: ES12764826.9T
Authority: ES
Inventors: Jaeseung Yoon; Kwanghee Baek; Taeho BYUN; Jeong Soo Park
Original assignee: Pangen Biotech Inc
Current assignee: Pangen Biotech Inc
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: WO2012134215A3; KR20120112254A; CN103492577B; EP2692867A2; WO2012134215A2; BR112013025099A2; US20140038233A1; JP5931174B2; EP2692867A4; CN103492577A; EP2692867B1; KR101385223B1; BR112013025099B1; US9062326B2; MY171316A; JP2014510534A

Abstract

Un vector de expresión para células animales que comprende al menos una copia de elemento de MAR (región de unión a la matriz) y elemento de SAR (región de unión al armazón) en el extremo 5' de un promotor y/o el extremo 3' de un sitio de terminación de la transcripción, todos los cuales están ligados operativamente entre sí dentro del vector de expresión, en donde el promotor es un mutante de promotor de EF1α de ratón y tiene la secuencia génica de SEQ ID Nº 34.

Description

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En la presente invención, cuando se incluyen dos copias de los elementos de MAR de globina ß, los elementos de SAR de CSP-B o los elementos de SAR de interferón ß, es preferible que las dos copias de los elementos de MAR o de SAR se puedan situar continuamente a fin de ser adyacentes entre sí o estar espaciadas una de otra por una región espaciadora relativamente corta.

En la presente invención, el vector puede incluir factores de incremento de la expresión génica incluyendo el elemento de MAR de globina ß, el elemento de SAR de CSP-B y el elemento de SAR de interferón ß como orientación directa o inversa. Aquí, la orientación de cada uno de los factores de incremento de la expresión génica puede ser diferente según la combinación específica de estos factores.

En el Ejemplo de la presente invención, se confirmó que en el caso de usar un mutante de promotor de mEF1α que tiene una secuencia de SEQ ID Nº 34, la productividad del anticuerpo se incrementaba en 5 veces o más en todos los vectores que tenían los elementos de MAR y SAR en comparación con el caso de un promotor de SV40, y particularmente la productividad de un vector pC(F)mEGM(R) se incrementaba en 10 veces o más. Puesto que se analizó que la productividad medida después de sustituir el promotor de SV40 por el promotor de mEF1α y ser adaptada a una concentración de MTX de 0 nM era superior aproximadamente 2 veces en comparación con la productividad asegurada después de amplificar con MTX en el caso de usar el promotor de SV40, el resultado que se describe anteriormente indica que se pueden asegurar líneas celulares de alta expresión sin realizar la amplificación con MTX. Por lo tanto, la presente invención se caracteriza por usar el mutante de promotor de mEF1α que tiene una secuencia de SEQ ID Nº 34.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a células recombinantes o animales transformadas con el vector de expresión para células animales.

Aquí, las células animales pueden ser células CHO, células Hela, células BHK, células NIH/3T3, células COS-1, células COS-7, células CHO-K1, células HEK293 o similares, que son líneas celulares animales generalmente conocidas. También se describen las células SP2/0, células NSO, células PER.C6 o similares.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de una proteína diana usando un vector de expresión para células animales y caracterizado por cultivar la célula animal recombinante a fin de expresar la proteína diana y recuperar la proteína diana.

En la presente invención, el método de producción puede incluir: (a) integrar un gen diana en el vector de expresión para células animales de modo que la expresión sea regulada por el promotor; (b) transfectar células animales con el vector de expresión para células animales en el que está integrado el gen diana; y (c) cultivar la célula animal recombinante transfectada para expresar la proteína diana y recuperar la proteína diana.

En lo sucesivo, la presente invención se describirá con detalle a través de los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solamente para ilustrar la presente invención, y los expertos en la técnica apreciarán que estos Ejemplos no se han de considerar limitativos de un alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 Clonación de elementos de MAR y SAR

Se aseguró ADN de MAR/SAR mediante un método de PCR después de separar ADN genómico usando un estuche de separación de ADN de líneas celulares Hep G-2 (Wizard Genomic DNA purification kit, Promega, EE. UU.).

Se usaron como plantilla 200 ng del ADN genómico separado, y se añadieron 25 pmol de cada cebador, dNTP (0,5 mM) y ADN polimerasa de ExTaq (Takara Shuzo Co., Japón), realizando de ese modo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de los cebadores usados para cada uno de los elementos de MAR/SAR y los tamaños de los fragmentos de ADN obtenidos mediante la PCR se muestran en la siguiente Tabla 1. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó usando un GeneAmp PCR system 9600 (Perkin -Elmer Corp., EE. UU.) y las condiciones de la PCR se mostraban en la siguiente Tabla 2.

Tabla 1

Tabla 2

Elemento de MAR/SAR: Tamaños de ADN Cebador Secuencia Nº

MAR de globina ß humana: 2969 pb imagen6 SEQ ID NO: 1

imagen7: SEQ ID NO: 2

SAR de CSP-B: 1233 pb imagen8 SEQ ID NO: 3

imagen9: imagen10 imagen11 SEQ ID NO:

imagen12: imagen13 imagen14 4

SAR de interferón-ß: 2168 pb imagen15 SEQ ID NO: 5

imagen16: SEQ ID NO: 6

Etapa: Condiciones Ciclo

1: 94°C, 2 min.
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2: 94°C, 40 s; 65°C, 40 s; 72°C, 40 s 2-31

3: 72°C, 10 min. 32

5 Los productos de PCR obtenidos de la MAR de globina ß humana, la SAR de CSP-B y la SAR de interferón-ß se subclonaron en un vector pT7blue (R) (Novagene, EE. UU.) o pCR 2.1 (Invitrogen, EE. UU.). La MAR de globina ß humana se subclonó en el vector pT7blue (R) y la SAR de CSP-B y la SAR de interferón-ß se subclonaron en el vector pCR 2.1.

10 Ejemplo 2: Construcción de vector de expresión para células animales

2-1: Construcción de vectores pSV-β-gal/versión I y versión II

A fin de clonar eficazmente los elementos de MAR y SAR subclonados en el vector pT7blue (R) y el vector pCR 2.1, frente a un promotor de un vector pSV-β-gal, se construyeron los vectores recombinantes pSV-β-gal versión I y versión II.

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5'-GTGCCAGCTT GCATGCCTGC-3'

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para promotor de SV40 y sitio de multiclonación

La PCR para el promotor de SV40 y el sitio de multiclonación se realizó usando un cebador PL1 de sentido (SEQ ID Nº 17) y un cebador PR1 antisentido (SEQ ID Nº 18). El producto de reacción se trató con enzimas de restricción Apa I y Bgl II y a continuación se ligó a un vector pGEM-T/MCSp(A) linealizado construido por adelantado al ser tratado con la misma enzima de restricción que se describe anteriormente, construyendo de ese modo un vector pGEM-T/SVMCSp(A) como un producto intermedio.

SEQ ID Nº 17: Cebador PL1 para fusionar el promotor del virus SV40 y el sitio de multiclonación

5'-CCGGGCCCAT CGATAAGCTT GATCCCGCGC AGCACCATGG CCTGAA-3'

SEQ ID Nº 18: Cebador PR1 para fusionar el promotor del virus SV40 y el sitio de multiclonación

5'-GAAGATCTGC GGCCGCTAGC AAGCTTTTTG CAAAAGCCTA-3'

• Construcción de vector pMS y vector pMSG

El vector pGEM-T/SVMCSp(A) construido en el Ejemplo • se trató con enzimas de restricción Cla I y BamH I, de modo que el fragmento de ADN compuesto por el promotor de SV40, el sitio de multiclonación y un sitio de terminación de la transcripción de SV40 se separó y se purificó. A continuación, el fragmento de ADN purificado se integró en el vector pMS-β-gal/sc linealizado construido en el Ejemplo • al ser tratado con las mismas enzimas de restricción por adelantado, completando de ese modo el vector pMS. A fin de construir el vector pM(R)SG, después de que el vector pSG-β-gal construido anteriormente se tratara con las enzimas de restricción BamH I y Sca I para separar y purificar un fragmento de ADN de 950 pb que tenía una secuencia de GTF del gen de gastrina, el fragmento de ADN purificado se integró en y se ligó al vector pMS linealizado tratado por adelantado con las mismas enzimas de restricción, completando de ese modo un vector pM(R)SG.

2-5: Construcción del vector pSG

A fin de integrar el elemento de MAR/SAR en un extremo 3' del sitio de terminación de la transcripción, se construyó el vector pSG. Después de que el vector de expresión pM(R)SG se tratara con Sma I y Cla I para retirar la MAR del mismo, lo resultante se trató con Klenow para formar extremos romos y a continuación se autoligó, construyendo de ese modo el vector pSG.

2-6: Construcción de los vectores pMSG y pSGM

Después de que el vector de expresión pM(R)SG se tratara con Sac II y Cla I para separar la MAR (R) del mismo, a fin de asegurar MAR (F) (MAR como orientación directa), se construyeron cebadores (SEQ ID Nº 19 y 20) de modo que Sac II/Cla I estuviera incluida en los mismos, realizando de ese modo la PCR. El producto de PCR se separó de un gel de agarosa y se integró en el vector pM(R)SG tratado con las mismas enzimas de restricción, construyendo de ese modo el vector pM(F)SG.

SEQ ID Nº 19: 5'-TTTTCCGCGGTTTTCCTCTTTAG-3'

SEQ ID Nº 20: 5'-TTTTATCGATCCTCCTGAGTAG-3'

Mientras tanto, el vector pSGM, que es un vector de expresión para células animales que contiene el elemento de MAR de globina ß en el extremo 3’ del sitio de terminación de la transcripción, se construyó a través de los procedimientos que se describen posteriormente.

A fin de construir el vector pSGM, se construyeron cebadores (SEQ ID Nº 21 y 22) de modo que incluyeran la enzima de restricción Nar I en ambos extremos de la MAR, y se realizó una PCR usando el pM(R)SG como una plantilla. El producto de PCR se trató con la enzima de restricción Nar I y se integró en el vector pSG tratado con la misma enzima de restricción, construyendo de ese modo los vectores pSGM(R) y pSGM(F).

SEQ ID Nº 21: MAR de β-globina de sentido Nar I

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5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3' (31mero)

SEQ ID Nº 22: MAR de β-globina antisentido Nar I

5'-AAA AGG CGC CTT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3' (31mero)

2-7: Construcción de vectores pISG y pSGI

Un vector pISG, que es un vector de expresión para células animales que incluye el elemento de SAR de interferón ß en el extremo 5’ del promotor, y un vector pSGI, que es un vector de expresión para células animales que incluye el elemento de SAR de interferón ß en el extremo 3’ del sitio de terminación de la transcripción se construyeron a través de los procedimientos que se describen posteriormente.

Un gen de β-gal se retiró del vector pSV-β-gal/SAR de interferón ß (F) (pI (F)S-β-gal) y el sitio de multiclonación (MCS), el sitio de terminación de la transcripción de SV40 y el GTF de gastrina se integraron, construyendo de ese modo el vector pI(F)SG.

Un fragmento Hind III/Pst I que incluía el sitio del gen de β-gal del vector pI(F)S-β-gal se retiró y el fragmento Hind III/Pst I se separó del pM(R)SG tratado con la misma enzima de restricción y se integró, construyendo de ese modo el vector pI(F)SG.

El vector pI(F)SG se trató con la enzima de restricción EcoR I, el elemento de SAR de interferón ß se separó del gel de agarosa y se integró de nuevo en el vector pI(F)SG tratado con la misma enzima de restricción para construir pI(R)SG. Posteriormente, el vector pI(R)SG se confirmó mediante cartografía enzimática de restricción. A fin de construir el vector pSGI, un ligador (SEQ ID Nº 23) que incluían el sitio de la enzima de restricción Nar I se integró en un vector pGEM-T Easy, y el elemento de SAR se trató con la enzima de restricción EcoR I a partir del vector pISG para separar un fragmento de ADN. A continuación, el fragmento de ADN separado se integró en un vector T modificado. De nuevo, lo resultante se escindió mediante la enzima de restricción Nar I y a continuación se integró en el vector pSG tratado con la misma enzima de restricción, construyendo de ese modo los vectores pSGI(F) y pSG(R).

SEQ ID Nº 23: Ligador

5'-GGC CGG CGC CGA ATT CGG CGC C-3'

2-8: Construcción de vectores pCSG y pSGC

Un vector pCSG, que es un vector de expresión para células animales que incluye el elemento de SAR de CSP-B en el extremo 5’ del promotor, y un vector pSGC, que es un vector de expresión para células animales que incluye el elemento de SAR de CSP-B en el extremo 3’ del sitio de terminación de la transcripción se construyeron a través de los procedimientos que se describen posteriormente.

Se realizó una PCR usando pSV-β-gal/SAR de CSP-B (F) (pCS-β-gal) como una plantilla y cebadores (SEQ ID Nº 24 y 10) que incluyen las enzimas de restricción Cla I y Sma I, seguido por tratamiento con las enzimas de restricción Cla I y Sma I, obteniendo de ese modo un fragmento de ADN de SAR de CSP-B. El vector pM(R)SG se trató con las enzimas de restricción Cla I y Sma I para retirar la MAR, seguido por la integración de la SAR de CSP-B tratada con la misma enzima de restricción, construyendo de ese modo el vector pC(R)SG.

SEQ ID Nº 24: SAR de CSP-B de sentido Cla I

5'-AAA AAT CGA TAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3' (30mero)

SEQ ID Nº 10: SAR de CSP-B antisentido Sma I

5'-TCC CCC GGG GAA TTC AAA CAA CTC AAT AGC-3' (30mero)

El elemento de SAR de CSP-B tratado con la enzima de restricción Sac II a partir del vector pC(R)SG se integró en el vector pSG tratado con la misma enzima de restricción, construyendo de ese modo el vector pC(F)SG.

A fin de construir el vector pSGC, se construyeron cebadores (SEQ ID Nº 25 y 26) de modo que incluyeran la enzima de restricción Nar I en ambos extremos de la SAR de CSP-B, y se realizó una PCR usando el pC(F)SG como una

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plantilla. El producto de PCR se trató con la enzima de restricción Nar I y se integró en el vector pSG tratado con la misma enzima de restricción, construyendo de ese modo los vectores pSGC(F) y pSGC(R).

SEQ ID Nº 25: SAR de CSP-B de sentido Nar I

5'-AAA AGG CGC CGA ATT CAA ACA ACT CAA TAG C-3' (31mero)

SEQ ID Nº 26: SAR de CSP-B antisentido Nar I

5'-AAA AGG CGC CAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3' (30mero)

2-9: Construcción de los vectores pMMSG, pMSGM, pMSGC y pMSGI

Un vector pMMSG, que es un vector de expresión para células animales que incluye 2 copias de los elementos de MAR de globina ß en el extremo 5’ del promotor, y un vector pMSGM, que es un vector de expresión para células animales que incluye los elementos de MAR de globina ß en el extremo 5’ del promotor y el extremo 3’ del sitio de terminación de la transcripción, respectivamente, se construyeron a través de los procedimientos que se describen posteriormente.

Se realizó una PCR usando el vector pM(R)SG como una plantilla y cebadores (SEQ ID Nº 21 y 27) que incluían enzimas de restricción Nar I y Cla I en ambos extremos de la MAR. A continuación, el producto de PCR se trató con las enzimas de restricción Nar I y Cla I y se integró en el vector pM(R)SG tratado con la enzima de restricción Cla I, construyendo de ese modo el vector pM(R)M(R)SG.

SEQ ID Nº 21: MAR de β-globina de sentido Nar I

5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3' (31mero)

SEQ ID Nº 27: MAR de β-globina Cla I

5'-AAA ATC GAT TT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3' (31mero)

A fin de construir los vectores pM(R)SGM, pM(R)SGC y pM(R)SGI, los vectores pSGM(F), pSGC(F) y pSGI(F) se trataron con la enzima de restricción Nar I para separar individualmente la MAR de globina ß, el elemento de SAR de CSP-B o el elemento de SAR de interferón ß y se integraron en el vector pM(R)SG tratado con la misma enzima de restricción, construyendo de ese modo los vectores pM(R)SGM(R), pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F) y pM(R)SGI(R).

2-10: Construcción de los vectores pI(R)SGI, pI(R)SGC y pI(R)SGM

Un vector de expresión para células animales que incluye una copia del elemento de SAR de interferón ß en el extremo 5’ del promotor y una copia del elemento de MAR de globina ß, el elemento de SAR de CSP-B y el elemento de SAR de interferón ß en el extremo 3’ del sitio de terminación de la transcripción se construyó a través de los procedimientos que se describen posteriormente.

A fin de construir los vectores pI(R)SGI, pI(R)SGC y pI(R)SGM, se prepararon los elementos de MAR/SAR a partir de los vectores pSGI(F), pSGC(F) y pSGM(F) mediante tratamiento con la enzima de restricción Nar I, respectivamente. Los elementos de MAR/SAR separados y purificados se integraron en un vector pI(R)SG tratado con la enzima de restricción Nar I, construyendo de ese modo los vectores pI(R)SGI(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGC(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGM(R) y pI(R)SGM(F).

2-11: Construcción de los vectores pCCSG, pCSGI, pCSGC y pCSGM

Un vector pCCSG, que es un vector de expresión para células animales que incluye 2 copias del elemento de SAR de CSP-B en el extremo 5’ del promotor, se construyó a través de los procedimientos que se describen posteriormente.

El vector pC(F)SG que incluye el elemento de SAR de CSP-B se trató con la enzima de restricción Hind III para ser separado, y a continuación se realizó la autoligación. De nuevo, lo resultante se trató con las enzimas de restricción

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Nhe I y Spe I para separar y purificar el elemento de SAR de CSP-B y a continuación se integró en el vector pC(F)SG tratado con la enzima de restricción Spe I, construyendo de ese modo un vector pC(F)C(F)SG.

A fin de construir los vectores pC(F)SGI, pC(F)SGC y pC(F)SGM, los elementos de MAR/SAR se separaron de los vectores pSGI(F), pSGC(F) y pSGM(F) mediante tratamiento con la enzima de restricción Nar I, respectivamente. Los elementos de MAR/SAR separados y purificados se integraron en el vector pC(F)SG tratado con la enzima de restricción Nar I, construyendo de ese modo los vectores pC(F)SGI(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGC(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGM(R) y pC(F)SGM(F).

2-12: Construcción de un vector de expresión que incluye promotor de EF1α de ratón y mutante del mismo

Un promotor de EF1α de ratón se separó de ADN genómico asegurado de tejido de saco vitelino de ratón usando un estuche de aislamiento de ADN (DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAGEN).

Se añadieron 200 ng del ADN genómico, 10 pmol de cada cebador (SEQ ID Nº 28 y 29) y agua a Maxime PCR Premix (i-pfu) (Intron biotechnology) a fin de tener un volumen total de 20 μl para realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las condiciones de reacción eran como sigue. Después de un procedimiento de realizar secuencialmente una reacción a 94°C durante 5 minutos, 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 1 minuto y 72°C durante 3 minutos efectuado en un ciclador término durante 25 ciclos, se efectuó una reacción final a 72°C durante 5 minutos, seguido por separación y purificación usando un estuche de separación (GeneAllR Expin™ PCR SV, Geneall).

SEQ ID Nº 28: mEF1α-F

5'-TTT TAT CGA TAG CGG AGT AAG GAA GAG TAG-3

SEQ ID Nº 29: mEF1α-R

5'-TTT TGC TAG CAG CGG TGG TTT TCA CAA CAC-3'

Después de que el promotor de SV40 se retirara del vector de expresión pM(R)SG usando Cla I y Nhe I, un promotor de EF1α de ratón tratado con las mismas enzimas de restricción se integró, construyendo de ese modo un vector de expresión pMmEG.

A fin de sustituir la timina situada en una quinta posición de TATATAA, que es una secuencia TATA del promotor de EF1α de ratón, por adenina, se construyó un cebador de PCR que incluía una secuencia sustituida como la descrita posteriormente, induciendo de ese modo una mutación de un solo par de bases (Jaeger E., 1997).

Después de que se realizara una PCR primaria al mezclar el cebador 1 y 3 (SEQ ID Nº 30 y 32) en un tubo 1 y el cebador 2 y 4 (SEQ ID Nº 31 y 33) en un tubo 2, respectivamente, usando el vector de expresión pMmEG como una plantilla, cada uno de los productos obtenidos en los dos tubos se purificó, y los productos purificados se mezclaron entre sí. A continuación, se realizó una PCR secundaria en las mismas condiciones usando el producto de PCR mixto como una plantilla y el cebador 1 y 4. El producto de PCR se trató con Kpn I y Spe I, y a continuación un mutante de promotor de EF1α de ratón (mEF1α(TA)) se aseguró usando un estuche de separación. Después de que el vector de expresión pMmEG se tratara con Kpn I y Spe I para retirar el promotor de EF1α de ratón, un mutante de promotor de EF1α de ratón (mEF1α(TA), SEQ ID Nº 34) tratado con la misma enzima de restricción se integró, construyendo de ese modo un vector pMmEG(TA).

SEQ ID Nº 30: mEF-tata-1

5'-TCC CAG GGA CCG TCG CTA AAT TCT CAT AAC-3'

SEQ ID Nº 31: mEF-tata-2

5'-GAA CGG TAT AAA AGT GCG GCA GTC GCC TTG-3'

SEQ ID Nº 32: mEF-tata-3

5'-CAA GGC GAC TGC CGC ACT TTT ATA CCG TTC-3'

SEQ ID Nº 33: mEF-tata-4

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4-4: Establecimiento de línea célular cultivada en suspensión transfectada y medida de la productividad de VEGF

Estos vectores de expresión se introdujeron en la línea de células hospedadoras CHO DG44 adaptada al cultivo en suspensión. Después de que las células se añadieran a un matraz a una concentración de 5×105 células/ml y se incubaran a 37°C con agitación durante 24 horas en la incubadora de CO2 al 5%, los vectores de expresión de VEGF y el vector pDCHIP se mezclaron entre sí en una relación molar de 100:1 y se introdujeron conjuntamente en las células CHO mediante electroporación. Después de aproximadamente 3 días de transfección, el medio de cultivo se cambio por un medio selectivo y a continuación el cultivo se realizó de nuevo durante de 2 a 3 semanas.

La línea celular transfectada se cultivó en medio al que se había añadido metotrexato (MTX) y las células adaptadas a cada etapa de MTX se inocularon en una placa de 6 pocillos en 2×105 células/pocillo (2 ml) y se cultivaron durante 4 días. Posteriormente, el fluido de cultivo se recogió y se analizó mediante absorbancia usando un estuche de ELISA (R&D Systems, DY293).

En primer lugar, se midió la velocidad de expresión del VEGF (FIG. 6) usando la absorbancia con respecto a los vectores pI(F)SG, pI(R)SG, pSGI(F), pSGI(R), pC(F)SG, pC(R)SG, pSGC(F), pSGC(R), pM(R)SG, pM(F)SG, pSGM(F) y pSGM(R), y los resultados obtenidos se compararon con los del Ejemplo 4-3 mostrado en la FIG. 5. A partir del resultado, se seleccionaron dos copias de combinaciones de MAR/SAR. Se efectuó una combinación de modo que se seleccionaran I(R), C(F) y M(R) aguas arriba del promotor y los elementos de MAR y SAR como orientación directa e inversa se seleccionaron aguas abajo del sitio de terminación de la transcripción.

Posteriormente, la velocidad de expresión del VEGF se midió mediante la absorbancia con respecto a los vectores pI(R)SGM(F), pI(R)SGM(R), pI(R)SGI(F), pI(R)SGI(R), pI(R)SGC(F), pI(R)SGC(R), pC(F)SGM(F), pC(F)SGM(R), pC(F)SGI(F), pC(F)SGI(R), pC(F)SGC(F), pC(F)SGC(R), pC(F)C(F)SG, pM(R)SGC(F), pM(R)SGC(R), pM(R)SGI(F), pM(R)SGI(R), pM(R)SGM(R) y pM(R)M(R)SG usando la combinación seleccionada. Según se muestra en la FIG. 7, los vectores pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F) y pM(R)M(R)SG tenían una productividad significativamente alta en comparación con otros vectores. Esto es, se confirmaba que en el caso de combinar entre sí el elemento de MAR y el elemento de SAR, la proteína diana se expresaba altamente. Particularmente, el pC(F)SGM(R) tenía una velocidad de expresión significativamente alta en comparación con el vector pM(R)M(R)SG que tenía dos elementos de MAR. Esto indica que una combinación del elemento de MAR y el elemento de SAR es más eficaz que el caso de incluir dos elementos de MAR y la proteína se puede producir a un nivel industrial rentable usando esta combinación.

De nuevo, la velocidad de expresión del VEGF se midió mediante el método de ELISA con respecto a los tres vectores seleccionados (pC(F)SGM(R), pM(R)SGC(F) y pM(R)M(R)SG)) (FIG. 8). Además, la velocidad de expresión del VEGF se midió usando la absorbancia (FIG. 9) con respecto al vector de expresión pC(F)mEGM(R) (SEQ ID Nº 35) de la FIG. 2 en el Ejemplo 2-14 en el que el promotor de SV40 del mismo se sustituía por mutante de promotor de mEF1α, el vector de expresión pM(R)mEGC(F) de la FIG. 3 en el Ejemplo 2-14 y el vector de expresión pM(R)M(R)mEG que tiene un mapa de escisión de la FIG. 4 en el Ejemplo 2-14. Como resultado, según se muestra en las FIG. 8 y 9, después de sustituir el promotor de SV40 por el mutante del promotor de mEF1α, en los casos de los tres vectores, la productividad de VEGF se incrementaba en 5 veces o más. Particularmente, en el caso del vector pC(F)mEGM(R), la productividad se incrementaba en 20 veces o más.

El resultado experimental que se describe anteriormente indica que se obtenía un efecto sinérgico significativo al aplicar el mutante de promotor de mEF1α a la combinación del elemento de MAR y el elemento de SAR.

4-5: Medida de la productividad de proteína de anticuerpo recombinante

Mientras tanto, se construyeron vectores de expresión para proteína de anticuerpo recombinante mediante el método del Ejemplo 4-2 con respecto a los tres tipos de vectores, y las líneas celulares productoras de anticuerpo se transfectaron con los métodos de los Ejemplos 4-4 y se cultivaron en medio selectivo durante de 2 a 3 semanas. Las líneas celulares transfectadas se inocularon en una placa de 6 pocillos en 2×105 células/pocillo (2 ml) y se cultivaron durante 6 días y a continuación se recogió un fluido de cultivo, seguido por analizar una velocidad de expresión de anticuerpo usando un estuche de ELISA (PanGen Biotech., PGK1002).

Como resultado, según se muestra en la FIG. 10, en el caso de usar el mutante de promotor de mEF1α, la productividad del anticuerpo se incrementaba en 3 veces o más en los tres vectores, en comparación con el caso de usar el promotor de SV40. Particularmente, la productividad del vector pC(F)mEGM(R) se incrementaba en 10 veces

o más.

Puesto que se analizaba que la productividad medida después de sustituir el promotor de SV40 por el mutante de promotor de mEF1α y adaptarse a una concentración de MTX de 0 nM era aproximadamente 2 veces superior en comparación con la productividad analizada después de la amplificación con MTX en el caso de usar el promotor de SV40, el resultado que se describe anteriormente indica que se pueden obtener líneas celulares de alta expresión

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Claims

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