KR20100067849A - 도파민 ｄ1 수용체 발현 세포주 및 이를 이용한 신약 개발 방법 - Google Patents

Abstract

도파민 D1 수용체를 과발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현벡터를 이용하여 제작된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법, 및 상기 형질전환체를 이용하는 신약 개발 방법이 제공된다.

Description

도파민 Ｄ1 수용체 발현 세포주 및 이를 이용한 신약 개발 방법{CELL EXPRESSING DOPAMINE D1 RECEPTOR AND METHOD OF DEVELOPING NOVEL DRUGS USING THE CELL}

도파민 D1 수용체를 과발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현벡터를 이용하여 제작된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법, 및 상기 형질전환체를 이용하는 신약 개발 방법이 제공된다.

G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)의 구조적인 특성은 7개의 막통과 도메인(transmembrane domain)을 가지고 있으며, 많은 신경전달물질 (Neurotransmitter), 호르몬 (Hormone), 사이토카인 (Cytokine), 향기 (Odorants), 빛 (Light) 등의 다양한 외부 자극을 세포내부로 전달하는 역할을 한다. 이들의 신호전달체계는 G-단백질 (GTP-결합 단백질; GTP-binding protein)을 통하여 생체내로 신호가 전달되어, 세포 내의 효소 활성 및 이온 채널을 효과기(effector)로 사용하여 성장, 분화, 사멸 등을 조절하게 된다 (Gilman, 1987, Bockaert et al., 1999, Ristiansen, 2004, McCudden et al., 2005). 지난 수 십 년 동안 G-단백질을 포함한 많은 종류의 수용체와 효과기 등에 대한 기능 연구가 수행되었지만, G-단백질의 구조적 및 기능적인 복합성이 외부 자극에 대해 적절하고 특이적인 세포 수준의 반응을 어떠한 작용기전으로 유도하는지는 아직 미지수이다. G-단백질이 신호전달의 중요한 위치를 차지하고 있지만, 단독적으로 신호를 전달하는 것이 아니라 복잡한 다른 여러 종류의 신호전달체계와 협력하고 있으며 가장 중요한 역할을 수행하고 있다. GPCR의 신호전달체계는 마약중독, 항히스타민제, 향정신병 약물, 우울증 치료제 등을 비롯한 수 백가지 약물의 표적으로서 이미 제약 시장의 50% 이상을 차지하고 있으며 계속적으로 이들 수용체를 표적으로 한 새로운 약물 후보물들이 연구 개발 중에 있다 (Hill SJ., 2006). 지금까지의 human genome project를 통하여 분석된 바로는, 약 1,000 종류 이상의 GPCR 유전자가 존재하는 것으로 예상되며, 이 중 약 650여종의 GPCR 유전자가 밝혀졌고, 약 200여 개의 GPCR의 생체 내 리간드가 알려졌으며, 나머지는 생체 내 ligand가 알려지지 않은 orphan GPCR로 분류되어 있다 (Bockaert et al., 1999, Pierce et al., 2002, Rana et al., 2002). GPCR의 다양성뿐만 아니라 또한 중요하게 고려되고 있는 것이 이 수용체들과 상호작용하는 G-단백질이다 (Gudermann et al., 1997, Wess, 1997, Gether et al., 1998). 하나의 G-단백질이 여러 수용체에 의한 반응을 매개하기도 하고 반대로 한 수용체가 여러 G-단백질을 조절하기도 한다.

GPCR은 모노머 형태로 세포막에 존재할 것이라고 생각되어 왔지만, EGF 수용체 또는 사이토카인 수용체와 유사하게 다이머 또는 올리고머 형태로 존재한다는 보고가 있었다 (Bouvier et al., 2001, Lee　 et al., 2000, Milligan, 2004). 호 모올리고머는 세로토닌 수용체 중 하나인 5HT_1B의 post-translational modification에 관하여 연구 중 모노머와 함께 관찰되었으며 (Ng　et al., 1993, Okamoto et al., 1998, Bai et al., 1998), 또한 같은 계열의 5HT_1D에서도 호모올리고머가 존재한다고 보고되었다. 그리고 5HT_1B와 5HT_1D가 헤테로올리고머를 이룬다는 보고도 있었다 (Xie et al., 1999). 또한 도파민 D₂ 수용체와 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarinic acetylcholine receptor) 등 여러 수용체에서도 보고되었다 (Zawarynski et al., 1998, Avissar et al., 1983). 이러한 올리고머는 호모올리고머 이외에도 헤테로올리고머의 형태도 많으며, 기본적으로 올리고머를 이루는 경우도 있으나 리간드에 의해 유발되거나 구조적으로 올리고머를 이루는 경우도 많다. 많은 GPCR 종류와 더불어 올리고머화(oigomerization)가 GPCR의 생리적인 현상을 매우 다양하고 복잡한 방식으로 나타나고 있다. 리간드의 결합을 촉진하거나 방해하는 약물학적 다양성과 세포 내 신호전달의 촉진 및 억제도 올리고머의 기능 중 하나이다.

G-단백질은 수용체의 활성화에 의한 신호를 변환하는 구아노신 트리포스페이트(GTP) 결합 단백질로 세포막에 존재한다 (Offermanns, 2003). G-단백질에 의하여 조절되는 효과기 단백질로는 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylate cyclase), 포스포리페이즈(phospholipase) A2, C 및 D, 등 효소와 Ca^{2 +}, K⁺, 및 Na⁺ 통로 등이 있다. G-단백질은 3개의 소단위체로 이루어진 헤테로트라이머로서 Gα (39~45kDa), Gβ (35~39kDa), Gγ (6~8kDa)으로 이루어져있다 (Hepler et al., 1992, Gudermann et al., 1996, Hamm et al., 1996). GPCR의 신호전달은 불활성 상태에서 G-단백질의 α 소단위체가 GDP (guanosine diphosphate)와 결합하고 있다가 아고니스트 가 수용체와 결합하게 되면 α 소단위체가 GTP와 결합함으로써 활성화되며, 이때 βγ소단위체는 떨어져 나간다. 활성화된 G-단백질은 효과기인 아데닐레이트 사이클레이즈, 포스포리페이즈, 이온 통로 등의 활성을 조절하는데, 이렇게 G-단백질을 경유한 신호 변환은 α소단위체에 있는 GTPase에 의해 GTP가 GDP로 분해되고, βγ소단위체가 원래 위치로 다시 결합함으로서 끝이 난다 (Gilman, 1987, Bockaert et al., 1999, Neubig et al., 2002, Ristiansen, 2004, McCudden et al., 2005).

약물 개발에 있어 GPCR에 결합하는 ligand를 찾아내고, 이를 이용하여 유효물질이나 선도물질을 찾는 방법을 많이 이용하였다 (Lee et al., 2001, Kim et al., 2002). 최근에는 GPCR을 표적으로 하는 약물 개발에 있어서 가장 많이 쓰이는 고속처리검색법 (high-throughput screening:HTP)을 많이 사용하고 있으며, 선택성 (selectivity), 재현성 (reproducibility), 다목적성 (versatility) 등을 목적으로 개발되어 쉽고 빠른 분석이 가능하다는 장점을 가진다 (Pfleger et al., 2005).

Scintillation proximity assay는 신약개발을 위한 GPCR과 ligand나 G-protein 상호작용을 이용한 검색방법으로 β-emission sensitive scintillant가 처리된 microspere가 사용된다. 이 방법은 charge-coupled device를 이용하여 multi-well plate에서 대량의 샘플을 동시에 분석할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나 bead가 가라앉고, assay volume이 작을수록 noise가 증가하는 단점과 화합물에서 발산되는 빛에 의해 간섭현상이 일어 날 수도 있다. 검출의 민감도를 높이기 위해 청색광을 흡수하고 적색광을 방출하는 scintillation imaging bead를 최근에는 많이 사용하고 있다 (Heilker et al., 2005).

현재 형광을 이용한 GPCR 활성의 관찰에 이용되는 기법은 Fluorescence resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET), fluorescence lifetime imaging (FLIM), fluorescence correlation spectroscopy 등이 있다 (Selvin PR., 2000). 이들은 실시간으로 GPCR 입체형태의 변화, ligand-receptor나 protein-protein 상호작용을 관찰할 수 있기 때문에 환경과 수용체 사이의 상호작용을 살아 있는 세포에서 관찰할 수 있다는 장점을 제공하고 있으며 약물 개발에 있어서 중요한 desensitization, oligomerization, second messenger의 위치 등에 관한 정보도 얻을 수 있다.

　최근 GPCR이 의약학적인 신약의 타겟으로 큰 주목을 받는 이유는 GPCR은 세포막에 존재하기 때문에 protein의 활성 억제제와는 다르게, 세포 내로의 약물이동 없이 작용제(agonist)나 길항제(antagonist)로의 약물 개발이 용이하는 것이다 (Morris, 2004). 또한 대부분의 GPCR은 특정 조직과 특정 세포에서만 발현 된다. 이것은 부작용을 최소화한 특수 목적의 약 개발이 가능하다는 장점을 가지게 된다.

이에 본 발명은 GPCR의 대표적 종류인 도파민 수용체 (dopamine receptor) D1을 타겟으로 하는 신약 개발을 위한 기반 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 구체예는 도파민 D1 수용체를 과발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 발현벡터를 이용하여 제작된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 형질전환체를 이용하여 신약을 개발하는 방법을 제공한다.

도파민 D1 수용체를 과발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현벡터를 이용하여 제작된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법, 및 상기 형질전환체를 이용하는 신약 개발 방법이 제공된다.

도파민 (dopamine)은 중추신경계와 일부의 자율신경계 신경절에 있는 카테콜라민 신경전달물질이다. 도파민 신경계는 뇌의 호르몬 조절뇌인 시상하부 (hypothalamus), 대뇌 변연계 (limbic system), 운동조절에 관여하는 선조체 (substantia nigra), 인간의 정신과 지식을 총괄하는 대뇌피질부 (cortex) 등의 네 부위에 주로 분포하고 있다 (Moore et al. 1978). 도파민 수용체는 크게 D1 과 D2 두 가지 type으로 분류하는 것이 가장 일반적이다 (Kebabian et al. 1979). 즉, 아데닐레이트 사이클레이즈를 활성화시켜 cAMP의 형성을 증가시키는 수용체를 D1 type이라고 부르며 반대로 cAMP의 형성을 억제하던가 전혀 영향을 미치지 않는 수용체를 D2 type이라 한다. 양적으로는 D1 type이 더 흔하게 분포하고 있다. 약리학적으로 D1과 D2로 분리되던 도파민 수용체는 분자생물학의 도입으로 이제는 5개로 세분화 되었는데, D1은 D₁와 D₅로 세분화 되었고, D2는 D₂, D₃, 그리고 D₄로 세분화 되었다. 도파민 신경계에 이상이 생기면 호르몬 분비의 이상, 정서 및 기억장애, 파킨슨병 등이 생기게 된다. 이 도파민 신경계의 활동이 과다하게 되면 정신 분열병 증상이 생기는 것으로 알려져 있다.

　본 발명의 구체예에서 도파민 D1 수용체를 dhfr (dehydofolate reductase, DHFR) 유전자가 결핍되어 있는 chinese hamster ovary (CHO) 세포 DG44를 이용하여 과발현 세포주를 개발하고, 도파민 D1 수용체의 활성을 측정할 수 있는 다양한 생화학적 분석방법과 고속처리 검색법을 개발하여 유효물질, 선도물질, 신약 후보 물질 발굴에 이용하고자 하였다. 여러 가지 후보약물 중 좀 더 효과적인 약물을 선별하기 위한 cell-based high-throughput drug screening system 도입 유용성을 확립 하고자 하였다. 그 결과, 포유동물 세포를 이용한 도파민 D1 수용체 발현 세포 주 제조에 성공하였고, 세포주 표면에 발현된 수용체는 대표적인 리간드에 대해 반응하여 세포내의 신호 전달체계를 활성화 시킴을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은, 향후 세포기반 분석시스템을 이용하여 천연물이나 한약제 등으로부터 선도물질을 발굴하는데 있어서 매우 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

본 발명의 일 실시예는 도파민 D1 수용체를 과발현하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 야생형 도파민 D1 수용체 코딩 서열 중 일부 염기가 다른 염기로 치환된 것으로, 이러한 치환은 코딩하는 아미노산 종류에 변화를 가져오지 않기 때문에 도파민 D1 수용체의 기능에는 영향이 없다. 예컨대, 본 발명에 따른 도파민 D1 수용체를 과발현하는 폴리뉴클레오타이드는 사람의 도파민 D1 수용체 유전자인 Accession No. X55760 (서열번호 1)의 도파민 D1 수용체 코딩부위 (서열번호 1의 277번째 염기부터 1617번째 염기까지)의 개시코돈의 첫 번째 염기(서열번호 1의 277번째 염기)를 1bp로 할 때 525 bp 위치의 염기가 t에서 c로 치환되어 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 525 bp 위치에서의 치환은 코딩되는 아미노산의 변화를 유발하지 않으며, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의하여 코딩된 도파민 D1 수용체 (서열번호 3)의 기능은 치환이 없는 야생형으로부터 얻어진 도파민 D1 수용체와 아무런 차이가 없다. 이와 같은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의하여 코딩된 도파민 D1 수용체의 기능은 야생형과 동등함이 실시예에서 수행된 바와 같은 수용체 결합 검정 (receptor binding assay)와 기능 검정 (functional assay) 시험을 통하여 입증되었다.

본 발명의 구체예는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 상기 발현벡터는 포유류 세포 발현에 통상적으로 사용되는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 5' 위치에 MAR 인자 (Nuclear matrix attachment region element) 또는 SAR 인자 (scaffold attachment region element)를 포함하고, 상기 프로모터의 3' 위치에 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형태의 것일 수 있다.

상기 프로모터로서 포유류 세포 발현에 통상적으로 사용되는 모든 프로모터가 사용 가능하며, 예컨대, SV40 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 MAR 또는 SAR는 β-글로빈 MAR (Accession No.L22754), 인터페론 베타 SAR (Accession No.M83137), CSP-B SAR (Accession No. M62716), DHFR intron SAR (Accession No. X06654), HPRT MAR (Accession No. X07690), Chicken lysozyme MAR element (Accession No. X98408), Chicken pi α-type globin MAR (Accession No. X64113) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 발현 벡터는 상기 요소들 외에도 통상적인 선별마커, (예컨대, AMP^R 등) 및 기타 통상적인 요소를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 발현 벡터에 있어서, 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 도입될 모벡터로 사용되는 벡터는 특별한 제한은 없으며, 포유류 세포 발현에 사용되는 모든 벡터가 사용 가능하고. 예컨대, 1 내지 419 부위에 SV40 프로모터, 420 내지 448 부위에 MCS (multi-cloning site), 449 내지 448 부위에 SV40 small T antigen, 1272 내지 2132 부위에 β-락타메이즈: AMP^R, 3322 내지 5523 부위에는 인터페론 베타 MAR인자 (Nuclear matrix attachment region element)를 포함하는 pSI-1, 또는 도 4에 도시된 바와 같은 베타글로빈 MAR 인자를 포함하는 pMSG 벡터를 모벡터로 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 포유류 세포의 도파민 D1 수용체 유전자의 코딩 부위 중 개시코돈의 첫 번째 염기를 1bp로 하여 525 bp 위치의 염기가 c로 치환되고, 1,314 bp 위치의 염기가 c로 치환된 세포주 (형질전환체)를 제공한다.

상기 형질전환체는 포유류 세포에서 해당 위치 염기가 직접 치환된 것이거나, 상기와 같은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 포유류 세포에 도입된 것일 수 있다.

도파민 수용체는 세포막에 위치하는 단백질로서, 이를 동물세포, 특히 포유류 세포에 인위적으로 발현 또는 과발현시키는 경우, 세포외로 분비되는 단백질과 달리, 숙주세포의 사멸을 야기시키기 때문에, 도파민 수용체를 발현하는 동물세포, 바람직하게는 포유류 세포를 얻는 것이 용이하지 않았다. 본 발명자들은 이러한 기술적 결함을 개선하기 위하여, 특정 발현벡터 및/또는 특정 숙주세포를 선별하여 형질전환체를 제작함으로써, 동물세포, 특히 포유류 세포에서 세포 사멸 없이 도파민 수용체를 발현 또는 과발현 하는 동물세포를 제작하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.

상기 포유류 세포는 특별한 제한은 없으며, 예컨대, BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line, 예컨대, NIH3T3), 인간 배아 신장 세포 (Human Embryonic Kidney, 예컨대, HEK 293), 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell, 예컨대, SP2/0) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 포유류 세포는 핵산 합성 경로에 관여하는 효소인 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dehydrofolate reductase, DHFR)가 결핍되어 있는 것이고, 상기 DHFR 결핍 세포주에 DHFR 코딩 유전자 (이하, 'dhfr', Accession No. K01164)를 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드와 함께 도입 (transfection)시켜 본 발명에 따른 형질전환체를 제조할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드와 dhfr 유전자와의 비율은 몰비로 100:0.1 내지 10, 바람직하게는 100: 0.5 내지 5, 더욱 바람직하게는 100: 0.7 내지 2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서의 포유류 세포로의 형질도입 (transfection)은 통상의 방법에 의하여 수행 가능하며, 예컨대, 리포좀을 이용하거나, 전기천공법 (Electroporation) 등에 의하여 수행 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구체예는 도파민 D1 수용체를 과발현하는 형질전환체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은

1) 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; 및

2) 상기 제작된 발현벡터를 포유류 세포에 형질도입시키는 단계

를 포함하는 것일 수 있다.

상기 단계 1)의 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 발현벡터는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 단계 2)에서 상기 포유류 세포는 BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line, 예컨대, NIH3T3), 인간 배아 신장 세포 (Human Embryonic Kidney, 예컨대, HEK 293), 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell, 예컨대, SP2/0) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것으로 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(DHFR)가 결핍되어 있는 것일 수 있고, 형질도입시, 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 발현벡터는 dhfr 유전자 (Accession No. K01164)를 포함하는 발현벡터와 함께 공동형질도입 (cotransfection)될 수 있다. 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 발현벡터와 dhfr 유전자를 포함하는 발현벡터와의 비율은 몰비로 100:0.1 내지 10, 바람직하게는 100: 0.5 내지 5, 더욱 바람직하게는 100: 0.7 내지 2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 포유류 세포로의 형질도입은 통상의 방법에 의하여 수행 가능하며, 예컨대, 리포좀을 이용하여 수행 가능하다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기와 같은 도파민 D1 수용체를 과발현하는 형질전환체를 이용한 도파민 D1 수용체를 표적으로 하는 도파민 D1 수용체 작용 조절제 스크리닝 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 스크리닝 방법은

a) 도파민 D1 수용체를 과발현하는 형질전환체를 준비하는 단계;

b) 상기 형질전환체에 도파민 D1 수용체에 특이적인 리간드를 처리하고, 후보물질과 접촉시키는 단계; 및

c) 상기 후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성을 측정하고, 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성을 측정하여, 후보 물질 처리한 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성과 후보 물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성과 비교하는 단계

를 포함할 수 있다.

상기 단계 a)의 도파민 D1 수용체를 과발현하는 형질전환체는 앞서 설명한 바와 같이 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 제작할 수 있다.

상기 단계 b)에서 리간드 처리와 후보물질 접촉 순서를 특별히 정해진 바 없으며, 실험 설계에 맞게 적절하게 순서를 정하거나 동시에 수행할 수 있다.

상기 후보물질은 특별한 제한이 없으며, 천연물, 천연물의 추출물, 합성 화합물 등일 수 있다. 상기 리간드는 도파민 D1 수용체와 특이적으로 결합하여 세포 신호 전달에 관여하는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대 도파민, 등일 수 있다.

상기 단계 c)에서의 도파민 D1 수용체의 활성은 통상적인 방법으로 측정하며, 예컨대, 형질전환체 내의 도파민 D1 수용체와 이에 특이적으로 결합하는 리간드 (예컨대, 도파민)과의 결합 정도를 측정하거나, 상기 리간드 처리시 생성되는 cAMP 농도를 측정하거나, 이를 모두 측정하여 도파민 D1 수용체의 활성을 측정할 수 있다.

예컨대, 후보물질 처리시 형질전환체 내의 도파민 수용체와 리간드와의 결합 정도가 증가하거나, 생성되는 cAMP의 농도가 증가하는 경우, 상기 후보물질은 도파민 D1 수용체의 작용 증진제로 판단할 수 있으며, 반대로, 후보물질 처리시 형질전환체 내의 도파민 D1 수용체와 리간드와의 결합 정도가 감소하거나, 생성되는 cAMP의 농도가 감소하는 경우, 상기 후보물질은 도파민 D1 수용체의 작용 억제제로 판단할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 도파민 수용체 D2의 활성은 도파민 D2 수용체를 통한 신호전달 (signal transduction)에서 생성되는 산물의 농도를 측정하여 결정할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 의하여 얻어진 도파민 D1 수용체 작용 조절제는 도파민 D1 수용체의 기능 부전 또는 과다 활성에 의하여 유발되는 질병의 치료제로서 사용될 수 있다. 상기에서 스크리닝된 얻어진 도파민 D1 수용체의 작용 증진제는 도파민 신경계의 작용 부전에 따라 발생하는 질병인 정서 및 기억장애, 파킨슨병 등의 치료제로서 사용 가능하며, 도파민 D1 수용체의 작용 억제제 도파민 신경계의 과다 활성에 의하여 야기되는 정신 분열병의 치료제로서 사용 가능하다.

본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이를 포함하는 형질전환체는 향후 세포기반 분석시스템을 통한 천연물이나 한약제 등으로부터 선도물질을 발굴하는데 있어서 매우 유용하다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 들어 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

　

[ 실시예 1] Human D ₁ 수용체 유전자를 발현하는 CHO 세포주의 확립

1.1.　Human D ₁ 수용체 유전자 발현 벡터의 제조

사람의 도파민 D₁ 수용체 cDNA (Accession number: X55760)가 포함된 벡터를 ResGen^TM에서 구입하였다. 구입한 cDNA를 주형으로 하여 단백질 코딩부위의 양 말단에 해당하는 5D1NheI 프라이머와 3D1XhoI 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 1,363bp의 PCR 산물을 얻었고, 그 산물을 pGEM-T easy Vector에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다 (서열번호 2).

이를 보다 상세히 설명하면, 상기 PCR은 pfu 폴리머레이즈(Promega)를 이용하여 수행하였고, 95℃에서 5분동안 변성(denaturation)시키고, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분 과정을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 증폭시켰다. 이렇게 증폭된 PCR 산물을 1％ 아가로오스 젤 상에서 확인하였다. PCR을 통하여 얻은 산물을 pGEM-T easy vector (Promega)에 서브클로닝하였다. 플라스미드 DNA 는 QIAprep

Spin Miniprep kit (QIAGEN)로 분리하였고, DNA 염기 서열을 분석하였다.

상기 PCR 및 서열 분석에 사용된 프라이머는 다음과 같다:

5D1NheI: 5'-CTA GCT AGC CAC CAT GAG GAC TCT GAA CAC (서열번호 4)

Nhe Ⅰ(GCTAGC) - Kozak sequence (GCCACC)

3D1XhoI: 5'-CCG CTC GAG TCA GGT TGG GTG CTG ACC (서열번호 5)

Xho Ⅰ(CTCGAG)

S1D1R: 5'-ATC CTC AAC CTC TGT GTG (서열번호 6)

S2D1R: 5'-GAT CTA CAG GAT TGC TCA (서열번호 7)

S3D1R: 5'-TCA AAG GTG TTG GAA TCA (서열번호 8)

서열번호 2의 D₁ 수용체 염기서열을 X55760과 비교 분석한 결과 525 bp위치의 t는 c로 염기서열이 치환되었음을 확인하였다. 이와 같은 525 bp 위치의 염기서열 변화는 아미노산 변화를 유발하지 않으며, 상기 얻어진 D₁ 수용체는 기능상 야생형과 차이가 없음을 알 수 있다.

D₁ 수용체 유전자의 Accession number X55760과 비교하여 525 bp에 염기서열 돌연 변이가 있음을 확인하고 다음 단계를 진행하였다. 상기 pGEM-T 벡터에 Nhe Ⅰ과 Xho Ⅰ 제한효소를 처리하여 선형화하여, 동일한 제한효소로 선형화한 동물 발현 벡터인 pSI-1 벡터와 라이게이션(ligation) 반응시켜 pSI1-D1를 제작하였다 (도 1 참조). 이 DNA의 염기서열을 분석한 결과 335위치와 716위치의 염기서열이 정상적으로 치환되어 있음을 확인하였다.

이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

발현벡터는 동물세포 발현 벡터인 pSI-1에 D1 수용체 유전자를 삽입하여 사용하였다. pSI-1 벡터는 1 내지 419 부위에 SV40 프로모터, 420 내지 448 부위에 MCS (multi-cloning site), 449 내지 448 부위에 SV40 small T antigen, 1272 내지 2132 부위에 β-락타메이즈: AMP^R, 3322 내지 5523 부위에는 인터페론 베타 SAR인자 (Scaffold Attachment Region element)를 포함하고 있다. 인터페론 베타 MAR인자는 위치 독립적 발현(position-independent expression)을 위한 것으로 외래 유전자를 숙주 염색체에 삽입할 때, 이들 외래 유전자를 각각의 단위체로 인식하게 하여 유전자가 인접한 숙주 염색체 서열에 의해 영향을 받지 않고 발현되는 기능을 한다.

상기에서 얻어진 서열이 확인된 D1 수용체 유전자를 갖는 pGEM-Teasy 벡터를 Nhe I과 Xho I 제한효소 (KOSCHEM)로 처리하여 D1 수용체 유전자를 분리하고, pSI-1 벡터(한국 특허등록 제0529281호에 pPGM-1 vector로 기재)도 같은 제한효소로 처리하고 1％ 아가로오스 젤 상에서 원하는 DNA 밴드를 분리하였고, QIAEX II Extraction Kit(QIAGEN)를 이용하여 D1 수용체 DNA 절편을 정제하였다. 상기 정제된 D1 수용체 DNA와 상기 제한효소 처리된 벡터를 3:1의 몰비로 넣고, T4 DNA 리가아제 (Promega)를 첨가하여 22℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, E.coli JM109 competent cell에 형질 전환하고, LB AMP+ 배지(10 g NaCl. 10 g Bacto-tryptone. 5 g Yeast Extract, 증류수 1 리터/Ampicillin, 0.1 mg/mL, Sigma)에서 배양한 후 QIAprep

Spin Miniprep kit를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다.

상기 E.coli JM109 competent cell은 다음과 같은 방법으로 제작하였다:

1. LB 고체배지에 균주(E. coli)를 streaking하여 하루 동안 배양;

2. Single colony를 따서 100 ml flask에 들어 있는 10 ml TYM broth (2개)에다 접종;

3. Shake incubator(37℃, 3-4hr)에서 cell을 배양하고, 50ml TYM broth가 있는 500 ml flask (2개)에 부어 다시 Shake incubator (1hr)에서 배양;

4. 250 ml TYM broth가 있는 1l flask(2개)에 부어 희석 후 다시 Shaking incubator(1hr)에서 배양;

5. Cell이 OD₆₀₀ 0.6으로 성장했을 때, flask를 ice-water에 넣어 서서히 shaking(rapid cooling);

6. 배양 상태가 차게되었을 때, 250ml의 centrifuge tube 4개에 균등하게 분주하여 4.2krpm으로 spin(15min);

7. 상층액을 버리고 차가운 TfBⅠ을 25ml씩 pellet에 부어 얼음물에서 천천히 흔들면서 재현탁;

8. 4.2krpm으로 respin(8min);

9. 상층액을 버리고 차가운 TfBⅡ을 5ml씩 pellet에 부어 얼음물에서 천천히 흔들면서 재현탁; 및

10. 냉각된 microfuge tube에 0.2ml씩 나누어 부은 후 액체 질소에서 냉동하여 -70℃에 저장.

이와 같이 얻어진 pSI1-D1 플라스미드 DNA 10 μg을 Nar I 제한효소(KOSCHEM)로 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 선형화 한 후 Chroma spin column (Clontech)으로 분리 정제한 후 농도를 측정하였다.

1.2　형질도입 ( Transfection ) 및 세포주 선별

상기에서 얻어진 사람의 D₁ 수용체를 발현하는 pSI1-D1 플라스미드를 Nar I 제한효소로 선형화하고, dhfr 유전자를 발현하는 pDCH1P(목암연구소)와 혼합하여, 리포좀 (dosper^TM) (Roche)을 사용하여 CHO-DG44 세포 (Chasin 박사, 미국)에 공동형질도입(cotransfection)시켰다.

이를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 실험에서 사용한 CHO DG44 세포주는 핵산을 합성하는 경로에 관여하는 효소를 만드는 dhfr (dehydrofolate reductase, DHFR) 유전자가 결핍되어 있는 세포이다. 형질도입 할 때 dhfr 유전자가 포함되어 있는 플라스미드 (pDCH1P)도 동시에 형질도입하여 뉴클레오사이드와 데옥시뉴클레오사이드가 포함되어 있지 않은 10% dFBS w/o MEM-α 배지 (Invitrogen)로 일차 선별하였다.

　CHO 세포 2×10⁵개를 10% FBS MEM-α 배지 2 mL과 함께 6 well에 접종하여 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 형질도입하기 직전에 준비된 세포를 무혈청배지(serum free media)로 두 번 세척하였다. 형질도입은 상기 선형화된 플라스미드 DNA와 pDCH1P DNA (dhfr 유전자를 포함하는 선별마커 DNA)를 100:1의 몰비로 혼합하고, 50 μL의 부피가 되도록 MEM-α 무혈청배지를 1.5 mL 튜브에 혼합하였다. 다른 튜브에는 리포좀 (dosper) 5.3 μg과 MEM-α 무혈청배지를 넣어 최종 부피가　50 μL가 되도록 준비하였다. 그리고 난 후, 상기 두 용액을 혼합하여 상온에서 45분간 반응시킨 후 상기 준비된 세포에 넣어 주고, CO₂ 배양기에서 6시간 동안 배양한 후, 용액을 제거하고, 10% cFBS MEM-α 배지 2 mL 첨가하여 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2 내지 3일 후 형질전환된 세포들이 충분히 자랐을 때, 트립신 2 내지 3 drops을 처리한 후 α-MEM (w/o) + 10% dFBS 배지 2 mL/well 첨가하여 잘 섞어주었다. 세포는 50 μL/5 mL α-MEM(w/o) + 10% dFBS의 농도로　100 mm dish에 분주하여 배양하였다. 2 내지 3일 간격으로 배지를 교환하면서 현미경으로 세포의 상태와 단일 콜로니 생성여부를 관찰하였고, 약 10일 후에 초기 적응된 콜로니을 얻을 수 있었다. 상기 초기 적응된 콜로니들은 트립신 처리하여 떼어낸 후, 6 well plate로 옮겨 배양하였다. 초기 적응된 세포를 6-well plate에 5 x 10⁵ cells/well이 되도록 분주하고, 10 nM MTX(methotrexate)를 포함하는 α-MEM (w/o) + 10% dFBS 배지를 첨가하여 배양하였다. 10 nM MTX에 적응된 세포는 배지에 첨가된 MTX 농도를 100 nM, 1 μM 로 단계적으로 증가시킴으로써 도입 유전자의 증폭을 유도하 였다.

D₁ 수용체를 발현하는 콜로니를 선별하기 위하여, 5D1NheI primer와 3D1XhoI primer를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

상기 RT-PCR은 다음과 같이 수행하였다. 　w/o MEM-α 배지에서 선별한 각각의 콜로니들과 최종 MTX 농도 1 μM까지 적응한 콜로니들의 인간 D1 수용체 유전자가 발현되는지 확인하기 위해 세포로부터 total RNA를 준비하였다. 100 ㎜ dish에 세포를 90% 이상 자라도록 키운 후, 10⁶cell 당 0.2 mL RNA-BEE reagent(Tel-Test Inc.,)를 넣고 잘 혼합하였다. 클로로포름 40 μL 를 첨가하고 볼텍싱하였다. 얼음에 5분간 반응시킨 후, 이를 12,000rpm에서 15분간 원심 분리하고 상층액을 새 튜부로 옮겼다. 여기에 100% 이소프로판올 100 μL를 넣고 상온에서 10분간 두었다가, 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 모든 용액을 제거하고 75% 에탄올 1 mL을 첨가한 후 10,000rpm에서 5분간 원심 분리하고, 에탄올을 모두 제거한 뒤 pellet을 공기 중에 살짝 말렸다. 이를 0.1% DEPC (diethyl pyrocarbonate) water 40 μL에 녹인 후 60℃에서 15분간 처리하였다.

음성 대조군으로서 형질도입하지 않은 CHO 세포에서 추출한 total RNA를 사용하였고, 양성대조군으로서 상기 실시예 1.1에서 제작된 pSI1-D1 DNA를 직접 PCR하였다. RT-PCR 반응은 Titan^TM one tube RT-PCR system　 (Boehringer Mannheim)을 이용하여 수행하였다. 조성은 5×반응버퍼(Boehringer Mannheim) 10 μL, 2.5mM dNTPs (Boehringer Mannheim) 4 μL, 100pmol 프라이머 각각 1 μL, 100 mM DTT 2.5 μL, RNase-free water (Fisher Scientific), template mRNA와 2.5 U의 enzyme (Boehringer Mannheim) 을 50 μL 부피로 맞추어 사용하였다. RT-PCR 조건은 55℃에서 30분간 배양한 뒤 94℃에서 5분간 precycling하고, 다음 33 cycle은 94℃에서 1min, 55℃에서 1min, 72℃에서 2분간 수행하였다. 마지막 cycle은 72℃에서 10분간 수행하였다.

RT-PCR 분석결과 여러개의 D₁수용체를 발현하는 콜로니를 얻었고, 그 중 D1-1, 4, 5, 6, 7 세포주를 선별, 단계적으로 10 nM 100 nM, 1 μM MTX 첨가된 배지에서 배양하여 적응된 세포를 얻었다. 여러 개의 콜로니를 선별하였으나 MTX에 적응시키는 과정에서 잘 적응하지 못하고 죽은 것도 있었고, 적응은 하였으나 세포성장이 너무 느린 콜로니는 제외시켰다. 최종적으로 1μM MTX가 첨가된 배지에서 적응된 D1-7 세포주를 선별하였으며, 2008년 10월 22일자로 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주 은행에 기탁하여 기탁번호 (KCLRF-BP-00188)를 부여받았다.

[ 실시예 2]　Human D ₁ 수용체 발현 세포주 기능성 분석

2.1.　수용체 결합 분석 시험 (Receptor binding assay)

상기 제작된　Human D₁ 수용체 발현 세포 D1-7 (1μM MTX)를 선택하여 수용체 결합 분석 시험을 수행하였다. 상기 Human D1 수용체 발현 세포는 75 cm² flask를 이용하여 대량 배양하였고, 세포가 90% 이상 자라면 배지를 제거하고 PBS buffer로 2회 세척한 후에 2 mL의 1 mM EDTA-PBS buffer를 첨가하여 37℃, 5분 동안 반응시 켜 세포를 수확하였다. 수확된 세포는 PBS buffer로 다시 2회 세척한 후에 Protease Inhibitor (200 μM Phenylmethylsulfonyl Fluoride, 5 μg/mL Leupeptin)가 첨가된 lysis buffer (5 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl2)에 현탁 시킨 후 초음파 분쇄기로 분쇄하였다. 세포파편은 4,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 제거하였고, 상층액은 50,000 rpm에서 30분 동안 초원심 분리하여 세포막 분획이 포함된 침전물을 얻었다. 세포막 분획 침전물을 binding buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl₂)에 녹인 후, Bradford 방법에 의해 농도를 측정하였다.

전체 결합은 상기 얻어진 세포막 분획 (5 내지 10 ㎍/assay)과 D1 수용체에 대한 방사선 동위원소가 표지된 리간드 (radioligand), [³H]-SCH23390(GE Healthcare)를 0, 0.01, 0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, 1, 2, 5, 10nM의 농도로 혼합하여 측정하였고, 비특이적 결합은 같은 조건에 10μM의 방사성 동위원소가 표지되지 않은 리간드인 플루펜틱솔(flupentixol, Sigma)를 첨가하여 수행하였다. 세포막 분획과 binding buffer, 및 비특이적 결합의 경우 방사성 동위원소가 표지되지 않은 리간드를 혼합한 후에 방사선 동위원소가 표지된 리간드를 첨가하여 37℃, 30분동안 반응시켰다. GF/B 필터(Whatman)은 0.3% 폴리에틸렌이민을 실온에서 1시간 동안 처리한 후에 binding buffer(50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl₂, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl₂)로 3회 세척하였다. 진공조건에서 전 처리된 GF/B 필터에 상기 리간드와 세포막 분획의 반응물을 통과 시킨 다음, 상기 필터를 5 mL 의 cold-ice binding buffer로 3회 세척하여 상온에서 건조시켰다. 건조된 필터는 3 mL의 scintillation cocktail 용액에 넣어서 Liquid Scintillation Counter (Wallac 1209RACKBETA)로 cpm값을 측정하였다. 특이적 결합값은 전체 결합 cpm 값에서 비특이적 결합 cpm 값을 빼서 얻었고, cpm 값과 리간드의 농도는 GraphPad Prim 3.03 프로그램 (http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm)을 이용하여 특이적 결합 친화도(specific binding affinity)와 수용체 단백질의 밀도를 계산하였다.

이와 같이 얻은 결과를 도 2에 나타내었다. 특이적 결합 친화도를 나타내는 K_d (equilibrium dissociation constant)는 리간드 농도의 증가에 따라 포화된 cpm값이 반으로 떨어졌을 때의 리간드 농도를 나타내며, B_max (the maximum specific binding to be fit)값은 세포막 분획(membrane fraction) 1㎎에 존재하는 수용체의 농도를 나타낸다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, D₁ 수용체의 K_d는 1.47±0.17nM이고, B_max는 1.44±0.12pmol/㎎ 단백질로 나타났다. 이는 전형적인 binding assay 결과인 B_max 10 내지 1000 fmol, K_d 10 pM 내지 10 nM (B_max의 경우 수용체 유전자가 형질전환 되었을 때는 몇 배 더 값이 커짐)의 범위 내에 포함된다.

2.2. 기능 분석 시험　(Functional assay)

Human D₁ 수용체 발현 세포 중 D1-7 세포를 선별하여 대표적인 리간드인 도 파민에 대하여 정상적으로 반응하는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 D1 수용체 발현 세포주에 리간드를 처리한 후, 신호전달에 의한 세포내의 cAMP의 농도 변화를 cAMP Biotrak Enzyme-immunoassay (EIA) System을 이용하여 측정하였다. 상기　cAMP assay system (cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay System, Amersham Biosciences)은 cAMP-특이적 항체에 퍼옥시다아제 컨쥬게이티드 cAMP와　cAMP간의 경쟁을 이용하여 컨쥬게이티드 cAMP 양을 측정하는 방법이다.

상기 수용체 발현 세포를 96 well plate에 2×10⁴ cells/well 씩 분주하여 18 시간동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후에 무혈청 배지 (serum free media)를 100 μL/well씩 첨가하여 1시간동안 배양하였다. D1 수용체에 대한 대표적인 리간드인 도파민(Sigma)은10 fM 내지 10 μM까지의 농도를 무혈청 배지로 희석하여 준비하였다. 리간드, 500 μM IBMX (Sigma), 및 무혈청 배지를 혼합하여 96 well plate에 첨가한 후 37℃, 20 min동안 반응시켰다. 각 well에 cell lysis buffer(5 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl₂)를 20 μL씩 첨가하여 상온에서 10분 동안 plate shaker를 이용하여 흔들면서 반응시켰다. 세포가 용해되었는지 여부를 현미경으로 관찰한 후에 상층액 만을 취하여 EIA에 이용하였다.

Anti-rabbit Ig 항체가 coating된 EIA plate에 cAMP standard (0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 fmol/well), NSB (Non Specific Binding) (이상, Amersham Biosciences) 및 위에서 얻은 상층액을 각각 100 μL/well씩 첨가하 고, Blank와 NSB well을 제외한 모든 well에 Rabbit anti-cAMP 항체(Amersham Biosciences)를 100 μL/well씩 첨가하여 4℃, 2시간동안 반응시켰다. Blank를 제외한 각 well에 cAMP-퍼옥시다아제 컨쥬게이트 (Amersham Biosciences)를 50 μL/well씩 첨가하여 4℃, 1시간동안 반응시켰다. 세척액(Amersham Biosciences, 0.01 ㅡ phaphate buffer pH 7.5/0.05% Tween 20)으로 4회 세척하고 TMB substrate(3,3,5,5'-tetramethylbenzidine, Amersham Biosciences)를 첨가하여 실온에서 1시간동안 반응시킨 후 반응정지액을 첨가하여 450 nm에서 OD 값을 측정하였다. 측정된 OD 값은 다음의 식으로 percent bound (%B/Bo)값을 얻었고, cAMP standard curve(Amersham Biosciences 제조자 설명서)를 이용하여 시료의 cAMP 농도를 얻었다.

　　　　　　　　　　(Standard 또는 sample OD - NSB OD) ×100

%B/Bo = ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

　　　　　　　　　　　　　　　(Zero standard OD - NSB OD)

상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 분석결과, D₁ 수용체의 도파민의 농도가 증가할수록 생성되는 cAMP의 농도는 증가하였고, EC₅₀은 0.32±0.012 nM 이었다. 따라서, Human D₁R 발현 세포주는 수용체를 통한 신호전달 체계가 활성화 되었음이 확인되었다.

도 1은 pSI1-D1 벡터의 restriction map을 나타낸 것이다.

도 2는 D1 수용체의 binding assay 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 D1 수용체 발현 세포주의 cAMP assay 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 pMSG 벡터의 restriction map을 나타낸 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of KyungHee University <120> CELL EXPRESSING DOPAMINE D1 RECEPTOR AND METHOD OF DEVELOPING NOVEL DRUGS USING THE CELL <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dopamine D1 Receptor Accession No. X55760 <400> 1 gaattcaggg gctttctggt gcccaagaca gtgacctgca gcaagggagt cagaagacag 60 atgtagaaat caagagtgac catccacggg attgacttgg attgccactc aagcggtcct 120 ctcatggaat gttggtgagg ccctctgcca gggaagcaat ctggctgtgc aaagtgctgc 180 ctggtgggga ggactcctgg aaatctgact gacccctatt ccctgcttag gaacttgagg 240 ggtgtcagag cccctgatgt gctttctctt aggaagatga ggactctgaa cacctctgcc 300 atggacggga ctgggctggt ggtggagagg gacttctctg ttcgtatcct cactgcctgt 360 ttcctgtcgc tgctcatcct gtccacgctc ctggggaaca cgctggtctg tgctgccgtt 420 atcaggttcc gacacctgcg gtccaaggtg accaacttct ttgtcatctc cttggctgtg 480 tcagatctct tggtggccgt cctggtcatg ccctggaagg cagtggctga gattgctggc 540 ttctggccct ttgggtcctt ctgtaacatc tgggtggcct ttgacatcat 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gagaccatag acaactgtga ctccagcctc agcaggacat atgccatctc atcctctgta 600 ataagctttt acatccctgt ggccatcatg attgtcacct acaccaggat ctacaggatt 660 gctcagaaac aaatacggcg cattgcggcc ttggagaggg cagcagtcca cgccaagaat 720 tgccagacca ccacaggtaa tggaaagcct gtcgaatgtt ctcaaccgga aagttctttt 780 aagatgtcct tcaaaagaga aactaaagtc ctgaagactc tgtcggtgat catgggtgtg 840 tttgtgtgct gttggctacc tttcttcatc ttgaactgca ttttgccctt ctgtgggtct 900 ggggagacgc agcccttctg cattgattcc aacacctttg acgtgtttgt gtggtttggg 960 tgggctaatt catccttgaa ccccatcatt tatgccttta atgctgattt tcggaaggca 1020 ttttcaaccc tcttaggatg ctacagactt tgccctgcga cgaataatgc catagagacg 1080 gtgagtatca ataacaatgg ggccgcgatg ttttccagcc atcatgagcc acgaggctcc 1140 atctccaagg agtgcaatct ggtttacctg atcccacatg ctgtgggctc ctctgaggac 1200 ctgaaaaagg aggaggcagc tggcatcgcc agacccttgg agaagctgtc cccagcccta 1260 tcggtcatat tggactatga cactgacgtc tctctggaga agatccaacc catcacacaa 1320 aacggtcagc acccaacctg a 1341 <210> 3 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dopamine D1 Receptor Encoded by SEQ ID NO: 2 <400> 3 Met Arg Thr Leu Asn Thr Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val 1 5 10 15 Glu Arg Asp Phe Ser Val Arg Ile Leu Thr Ala Cys Phe Leu Ser Leu 20 25 30 Leu Ile Leu Ser Thr Leu Leu Gly Asn Thr Leu Val Cys Ala Ala Val 35 40 45 Ile Arg Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile 50 55 60 Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Trp 65 70 75 80 Lys Ala Val Ala Glu Ile Ala Gly Phe Trp Pro Phe Gly Ser Phe Cys 85 90 95 Asn Ile Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu 100 105 110 Asn Leu Cys Val Ile Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro 115 120 125 Phe Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Leu Ile 130 135 140 Ser Val Ala Trp Thr Leu Ser Val Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln 145 150 155 160 Leu Ser Trp His Lys Ala Lys Pro Thr Ser Pro Ser Asp Gly Asn Ala 165 170 175 Thr Ser Leu Ala Glu Thr Ile Asp Asn Cys Asp Ser Ser Leu Ser Arg 180 185 190 Thr Tyr Ala Ile Ser Ser Ser Val Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala 195 200 205 Ile Met Ile Val Thr Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Lys Gln 210 215 220 Ile Arg Arg Ile Ala Ala Leu Glu Arg Ala Ala Val His Ala Lys Asn 225 230 235 240 Cys Gln Thr Thr Thr Gly Asn Gly Lys Pro Val Glu Cys Ser Gln Pro 245 250 255 Glu Ser Ser Phe Lys Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val Leu Lys 260 265 270 Thr Leu Ser Val Ile Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe 275 280 285 Phe Ile Leu Asn Cys Ile Leu Pro Phe Cys Gly Ser Gly Glu Thr Gln 290 295 300 Pro Phe Cys Ile Asp Ser Asn Thr Phe Asp Val Phe Val Trp Phe Gly 305 310 315 320 Trp Ala Asn Ser Ser Leu Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp 325 330 335 Phe Arg Lys Ala Phe Ser Thr Leu Leu Gly Cys Tyr Arg Leu Cys Pro 340 345 350 Ala Thr Asn Asn Ala Ile Glu Thr Val Ser Ile Asn Asn Asn Gly Ala 355 360 365 Ala Met Phe Ser Ser His His Glu Pro Arg Gly Ser Ile Ser Lys Glu 370 375 380 Cys Asn Leu Val Tyr Leu Ile Pro His Ala Val Gly Ser Ser Glu Asp 385 390 395 400 Leu Lys Lys Glu Glu Ala Ala Gly Ile Ala Arg Pro Leu Glu Lys Leu 405 410 415 Ser Pro Ala Leu Ser Val Ile Leu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Ser Leu 420 425 430 Glu Lys Ile Gln Pro Ile Thr Gln Asn Gly Gln His Pro Thr 435 440 445 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5D1NheI <400> 4 ctagctagcc accatgagga ctctgaacac 30 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3D1XhoI <400> 5 ccgctcgagt caggttgggt gctgacc 27 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S1D1R <400> 6 atcctcaacc tctgtgtg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S2D1R <400> 7 gatctacagg attgctca 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S3D1R <400> 8 tcaaaggtgt tggaatca 18

Claims (12)

1. 서열번호 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드.
2. 서열번호 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 포유류 세포 발현 벡터.
3. 서열번호 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드가 형질도입된 형질전환체.
4. 제3항에 있어서,

   상기 형질전환체는 상기 폴리뉴클레오타이드가 BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line), 인간 배아 신장 세포 (Human Embryonic Kidney), 및 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell)로 이루어진 군에서 선택된 포유류 세포에 형질도입된 것인 형질전환체.
5. 제4항에 있어서,

   상기 포유류 세포는 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dehydrofolate reductase, DHFR)가 결핍된 것인 형질전환체.
6. 제3항에 있어서,

   기탁번호 KCLRF-BP-00188인 형질전환체.
7. 1) 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; 및

   2) 상기 제작된 발현벡터를 포유류 세포에 형질도입시키는 단계

   를 포함하고,

   상기 포유류 세포는 BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line), 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney) 세포, 및 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell)로 이루어진 군에서 선택된 것으로, 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(DHFR)가 결핍된 것인,

   형질전환체의 제조 방법.
8. 제7항에 있어서,

   상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터는 dhfr 유전자를 포함하는 발현벡터와 100:0.1 내지 10의 몰비로 공동형질도입시키는 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조 방법.
9. a) 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 형질도입된 형질전환체를 준비하는 단계;

   b) 상기 형질전환체에 도파민 D1 수용체에 특이적인 리간드를 처리하고, 후보물질과 접촉시키는 단계; 및

   c) 상기 후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성을 측정하고, 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성을 측정하여, 후보 물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성과 후보 물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체의 활성과 비교하는 단계

   를 포함하는 도파민 D1 수용체 작용 조절제의 스크리닝 방법.
10. 제9항에 있어서,

    상기 도파민 D2 수용체의 활성은 도파민 D2 수용체와 리간드와의 결합 정도, 생성되는 cAMP의 농도, 또는 도파민 D2 수용체를 통한 신호전달에서 생성되는 산물의 농도에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
11. 제10항에 있어서,

    후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체와 리간드와의 결합 정도가 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체보다 증가하거나, 생성되는 cAMP의 농도가 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체보다 감소하는 경우, 상기 후보물질을 도파민 D2 수용체의 작용 증진제로 판단하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
12. 제10항에 있어서,

    후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D1 수용체와 리간드와의 결합 정도 또는 생성되는 cAMP의 농도가 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체보다 감소된 경우 상기 후보물질을 도파민 D1 수용체의 작용 억제제로 판단하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

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