JPWO2003027142A1 - 新規ｇ蛋白質共役型受容体 - Google Patents
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Abstract
摂食障害又は肥満症の予防及び／又は治療剤の開発に必要な、新規なＧタンパク質共役型レセプターをコードする遺伝子を単離及び同定し、前記レセプターの発現生産系を構築し、摂食障害又は肥満症の予防及び／又は治療に有用な前記レセプター活性を制御する物質を探索するためのスクリーニング法を提供する。
Description
技術分野
本発明は、新規Ｇ蛋白質共役型受容体に関する。
背景技術
医学的に重要な生物学的プロセスの多くが、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝達経路に関与しているタンパク質及び／又はセカンドメッセンジャーにより媒介されることはよく知られている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５１，３５３−３５４，１９９１）。その中でも、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を介して細胞内にシグナルを伝達する細胞膜レセプター群は、「Ｇタンパク質共役型レセプター」と総称されている。現在までに知られている全てのＧタンパク質共役型レセプターは、アミノ末端を細胞外に、カルボキシル末端を細胞内とし、細胞膜を７回貫通する構造を共有するスーパーファミリーを形成していることから、「７回膜貫通型レセプター」と総称される場合もある。Ｇタンパク質共役型レセプターは、様々な生理活性物質の情報を、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質の活性化、そして、それにより引き起こされる細胞内セカンドメッセンジャーの変動を介して、細胞膜から細胞内へと伝達する。三量体型ＧＴＰ結合タンパク質により制御される細胞内セカンドメッセンジャーは、アデニレートシクラーゼを介するｃＡＭＰ、あるいは、フォスフォリパーゼＣを介するＣａ２＋などがよく知られているが、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質を介したチャネルの制御、そして、リン酸化酵素の活性化など、多くの細胞タンパク質がその標的となっていることが最近明らかとなってきた（Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ，Ｔ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，３９９−４２７，１９９７）。Ｇタンパク質共役型レセプターを介して情報を伝達する生理活性物質の中には、神経伝達物質、ホルモン、ケモカイン、脂質由来の情報伝達物質、２価イオン、又はプロテアーゼなど、既存の生理活性物質の多くが含まれる。これらの生理活性物質にはそれぞれ特異的なＧタンパク質共役型レセプターが存在し、その情報を細胞内に伝達する。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、遺伝子のクローニングが先行する場合も多く、内在性リガンドとの対応がとれていないレセプターは、オーファンＧタンパク質共役型レセプターと呼ばれている。近年、充実された化合物ライブラリーと高性能ハイスループットスクリーニングとを組み合わせることで、オーファンＧタンパク質共役型レセプターをターゲットとした薬剤の創製が提唱されている（▲１▼Ｓｔａｄｅｌ，Ｊ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，４３０−４３７，１９９７）。すなわち、多くのＧタンパク質共役型レセプターのセカンドメッセンジャーとなっているｃＡＭＰ又はＣａ２＋の測定、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の指標となるＧＴＰａｓｅ活性、あるいは、ＧＴＰγＳのＧタンパク質結合測定などをハイスループット化することで、化合物ライブラリーからオーファンＧタンパク質共役型レセプターに対するアゴニストをスクリーニングすることが可能であり、その化合物を利用した特異的なアゴニスト及びアンタゴニストの発見、ひいては特定の疾患治療薬の開発が可能であるということである。このような状況下では、新しい疾患の治療ターゲットとなり得る新規Ｇタンパク質共役型レセプターの発見が、Ｇタンパク質共役型レセプターに作用する薬剤創製の最も重要なステップと見なすことができる。
現在までに数百種類のＧタンパク質共役型レセプターが真核生物からクローニングされている。ヒトに関しては百種類以上の内在性リガンドとの対応がとれたＧタンパク質共役型レセプターがクローニングされている。これまでにそれらの受容体をターゲットとする数百種類もの疾患治療薬が利用されている（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．ら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２５，１３８７−１３９２，１９９８）。Ｇタンパク質共役型レセプターが標的となっている疾患は多岐にわたり、中枢神経系、循環器系、炎症免疫系、消化器系、運動器系、又は泌尿器生殖器系それぞれの分野でＧタンパク質共役型レセプターに作用する有効な薬剤が存在する（前述▲１▼Ｓｔａｄｅｌ，Ｊ．ら）。このことは、Ｇタンパク質共役型レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストが疾患の治療剤となる可能性が高いことを示唆し、各種疾患を予防、改善、又は治療する上で重要な役割を果たすと考えられる新たな受容体を同定し、疾患との関わりを解明する必要がある。
ところで、摂食亢進物質として、ニューロペプチドＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ；以下、ＮＰＹと略称する）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、及び膵臓ペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＰ）が知られており［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７８，３７１−９２，２０００；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５９（２ Ｐｔ ２），Ｒ３１７−２３，１９９０；Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，３４１，２００−３，１９８５；Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８０５，２０−８，１９９８；Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，５８，７３１−５，１９９５；及びＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６９（５ Ｐｔ ２），Ｒ９８３−７，１９９５］、これら３種は、ＮＰＹファミリーを構成している。
ＮＰＹファミリーの機能発現は、ＮＰＹ特異的受容体との結合を介して行なわれる（▲２▼Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ａ．Ｇ．及びＨｅｒｚｏｇ，Ｈ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，２９４−８，１９９７）。ＮＰＹファミリーの受容体としては、これまで５つの異なるサブタイプが存在することが知られており、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、及びＹ６が遺伝子レベルで同定されている。Ｙ１受容体は、抹消組織では血管に発現しており、ＮＰＹとの結合により血管収縮を惹起する。一方、Ｙ５受容体は、組織発現分布解析から、摂食に対する関与が示唆されている（前述▲２▼Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ａ．Ｇ．ら）。
ＮＰＹのＧＰＣＲは、摂食障害（前述▲２▼Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ａ．Ｇ．ら）の治療ターゲットであると考えられており、ＮＰＹファミリー阻害剤である、１２２９Ｕ９１、ＢＭＳ−１９２５４８、Ｊ−１０４８７０、及びＢＩＢＰ３２２６等について、抗肥満薬の研究が進められている［Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２６１−６，１９９５；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ，（Ｔｏｋｙｏ），４８，１０５５−９，１９９５；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６６，８８−９１，１９９１；及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１３６−４２，１９９５］。しかしながら、摂食調節の異常に起因する摂食障害、又は肥満症等の疾患に関与するＧタンパク質共役型レセプターとそれに作用する分子について全てが理解されたわけではない。
発明の開示
本発明の課題は、摂食障害又は肥満症の予防及び／又は治療剤の開発に必要な、新規なＧタンパク質共役型レセプターをコードする遺伝子を単離及び同定し、前記レセプターの発現生産系を構築し、摂食障害又は肥満症の予防及び／又は治療に有用な前記レセプター活性を制御する物質を探索するためのスクリーニング法を提供することにある。また、本発明の課題は、摂食作用は抑制するが、摂食以外の作用に影響を与えない物質をスクリーニングするための方法を提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、ＧＰＣＲであるＧＰＲｇ１をコードし、摂食機能を司る視床下部特異的に発現している配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを取得した。そして、ＧＰＲｇ１のセカンドメッセンジャーは、Ｃａ２＋上昇及び／又はｃＡＭＰ抑制であることを見出し、ＧＰＲｇ１を用いた摂食作用を抑制する物質のスクリーニング系を提供した。また、ＧＰＲｇ１に結合するリガンドが結合するＧＰＣＲであり、視床下部及び摂食機能に関連しない様々な組織で発現しているＧＰＲｇ１ｂ並びにこれをコードするポリヌクレオチドを取得した。そして、ＧＰＲｇ１とＧＰＲｇ１ｂを用い、ＧＰＲｇ１活性に影響を与えるが、ＧＰＲｇ１ｂ活性に影響を与えない物質をスクリーニングすることにより、摂食機能のみを特異的に制御する、摂食障害及び／又は肥満症の予防及び／又は治療に有用な物質をスクリーニングするための方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性を示すポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性を示すポリペプチド、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［６］［５］に記載のベクターを含む細胞、
［７］［６］に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法、
［８］［１］又は［２］に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む前記ポリペプチドの活性を制御できる物質をスクリーニングする方法、
［９］（１）［１］又は［２］に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程、および、
（２）［３］に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む、［１］又は［２］に記載のポリペプチドの活性を制御できる物質であって、しかも、［３］に記載のポリペプチドの活性に影響を与えない物質をスクリーニングする方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドとしては、具体的には、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１タンパク質と称することがある）；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性（以下、細胞内Ｃａ２＋増加活性と称することがある）、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性（以下、細胞内ｃＡＭＰ減少活性と称することがある）を示すポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所（好ましくは１〜３箇所、特に好ましくは１箇所）において、全体として１〜５個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞内Ｃａ２＋増加活性、及び／又は（ｂ）細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１タンパク質機能的等価改変体と称する）；あるいは、
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞内Ｃａ２＋増加活性、及び／又は（ｂ）細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチドと称する）
を挙げることができる［以下、これらのポリペプチド（１）〜（４）を総称して、「ＧＰＲｇ１タンパク質群」と称する］。
更に、本発明のポリペプチドとしては、具体的には、
（５）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質と称することがある）；
（６）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド；
（７）配列番号４で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所（好ましくは１〜３箇所、特に好ましくは１箇所）において、全体として１〜５個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質機能的等価改変体と称する）；あるいは、
（８）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチドと称する）
を挙げることができる［以下、これらのポリペプチド（５）〜（８）を総称して、「ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群」と称する］。
本発明のポリペプチドの１つであるＧＰＲｇ１タンパク質、すなわち、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、３５３個のアミノ酸残基からなるヒト由来のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＲｇ１タンパク質は、後述の実施例４に示すように、摂食機能を司る視床下部に発現しており、摂食機能を司るＧＰＣＲである。
本願優先日後に公開されたＷＯ０１／９４５８２（２００１年１２月１３日公開）には、配列番号２で表されるアミノ酸配列が記載されている。しかし、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを取得したことは記載されておらず、本ポリペプチドが摂食機能を司ることは開示も示唆もない。また、本願優先日後に公開されたＷＯ０１／７０９７８（２００１年９月２７日公開）には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なる配列が記載されている。しかし、該配列からなるポリペプチドを取得したこと及び本ポリペプチドの現実的な用途は記載されておらず、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが摂食機能を司ることは開示も示唆もない。
ＧＰＲｇ１タンパク質は、後述の実施例５に示すように、セカンドメッセンジャーがＣａ２＋上昇及び／又はｃＡＭＰ抑制であるＧＰＣＲであり、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す。
本明細書において、或るポリペプチドが「細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施例５に記載の方法）により確認することができる。
すなわち、（１）試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（２）Ｇαタンパク質の一種であるＧｑとＧｉとのキメラタンパク質（例えば、Ｇｑｉ５）、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）血清応答配列（ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ；ＳＲＥ）の下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を連結したプラスミドとを、動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞）に３者同時に遺伝子導入した後、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定する。この際、コントロールとして、（１）試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないコントロール用ベクターと、（２）ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）ＳＲＥの下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミドとを、３者同時に遺伝子導入した動物細胞においても、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定する。
コントロール用発現ベクターを遺伝子導入した細胞に比べて、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを遺伝子導入した細胞におけるルシフェラーゼ活性が上昇していれば、前記試験ポリペプチドが「細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性」を示す、すなわち、「細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性」を示すと判定することができる。
なお、前記「Ｇｑ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧタンパク質である。ホスホリパーゼＣの活性が促進されると、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。
また、前記「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するＧタンパク質である。アデニル酸シクラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下する。
また、本明細書において、新規Ｇタンパク質共役型受容体である本発明のポリペプチドが細胞において「活性化」された状態とは、リガンドとの結合の有無に関わらず、Ｇタンパク質共役型受容体の下流にシグナルが伝達されている状態を意味する。活性型Ｇタンパク質共役型受容体の絶対量が一定量を越えた場合に、本発明のポリペプチドは活性化される。
Ｇタンパク質共役型受容体は、不活性型と活性型との間の平衡状態にあり、リガンドがＧタンパク質共役型受容体に結合することにより、平衡が活性型にシフトする。Ｇタンパク質共役型受容体を過剰に発現させた場合にも、活性型Ｇタンパク質共役型受容体の絶対量が増えるため、リガンド非存在下であっても、活性化され、下流にシグナルが伝達されることが知られている（Ｍｉｌａｎｏ，Ｃ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，５８２−５８６，１９９４）。すなわち、Ｇタンパク質共役型受容体は、リガンドが特定されていない場合であっても、Ｇタンパク質共役型受容体を細胞に過剰発現させることにより、その受容体からのシグナルを検出することが可能な場合がある。後述の実施例５に記載の実験では、本発明のポリペプチドに対するリガンド非存在下であっても、本発明のポリペプチドを過剰発現させることにより、アゴニストの結合による活性化と同じ状態に活性化されている。
本発明による、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド」には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（但し、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すことが必要）を挙げることができる。
本発明において用いることのできるマーカー配列としては、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群の起源は、ヒトに限定されない。例えば、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質機能的等価改変体には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける天然のアレル変異体（但し、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す）、あるいは、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）などのアミノ酸置換で生じたポリペプチド（但し、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す）が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物［例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の天然に存在する機能的等価改変体が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号２で表されるアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。
本発明のＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）のデフォルトパラメーターを用いて得られた値を意味する。なお、デフォルトパラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、
「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、
「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｑｕｅｒｙ配列のフィルター」として「ＳＥＧ」を、
「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」を、
それぞれ使用する。
本発明には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す部分断片も含まれる。
本発明のポリペプチドの１つであるＧＰＲｇ１ｂタンパク質、すなわち、「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、３７４個のアミノ酸残基からなるヒト由来のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＲｇ１ｂタンパク質は、後述の実施例４に示すように、摂食機能を司る視床下部以外にも、様々な組織で発現している。
ＧＰＲｇ１ｂタンパク質は、後述の実施例３に示すように、前記ＧＰＲｇ１タンパク質と高い相同性（４６％）を有しており、ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質には、生体内の同一生理活性物質が結合すると考えられる。
本発明による、「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド」には、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（但し、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合することが必要）を挙げることができる。
本願優先日後に公開されたＷＯ０２／０６４６６（２００２年１月２４日公開）には、配列番号４で表されるアミノ酸配列が記載されている。しかし、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを取得したことは記載されておらず、産業上の利用可能性としては、リガンドの決定、抗体および抗血清の入手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築等の漠然とした用途が記載されているに過ぎず、摂食作用を特異的に抑制する物質のスクリーニングに有用であることは開示も示唆もない。
本発明において用いることのできるマーカー配列としては、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の起源は、ヒトに限定されない。例えば、本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質機能的等価改変体には、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける天然のアレル変異体（但し、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合することが必要）、あるいは、一塩基多型（ＳＮＰ）などのアミノ酸置換で生じたポリペプチド（但し、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合することが必要）が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物［例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の天然に存在する機能的等価改変体が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号４で表されるアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。
本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチドとしては、配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチドが好ましい。
本発明には、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合する部分断片も含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本発明のポリヌクレオチドには、具体的には、
「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＧＰＲｇ１タンパク質）」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１タンパク質機能的等価改変体」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＧＰＲｇ１ｂタンパク質）」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１ｂタンパク質機能的等価改変体」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
あるいは、「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド
が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがより好ましい。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織（例えば、脳・視床下部又は胎児脳）からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法、（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、▲３▼Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｍｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，″Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ″，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくは２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明者は、本発明のポリペプチドのＮ末端にシグナルシークエンスを付加することが可能な発現ベクターを用いることにより、本発明のポリペプチドを細胞膜に過剰発現させることを可能とした。本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明者は、２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いることにより、本発明のポリペプチドを細胞膜に過剰発現させることを可能とした。本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターで形質転換され、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（▲４▼Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。また、発現しようとするポリペプチドの上流に、細胞外への分泌シグナル配列（シグナルシークエンス）、例えば、インフルエンザヘマグルチニンシグナルシークエンスをインフレームで融合することができるようにデザインした発現ベクターを用いることもできる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１９９５−２１９９８，１９９２）。このような発現ベクターとして、例えば、前記ｐＥＦ−ＢＯＳに、シグナルシークエンス及びＦＬＡＧエピトープをコードする配列を導入したプラスミド（ｐＥＦ−ＢＯＳ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｌａｇ ｐｌａｓｍｉｄ）を用いることができる。
宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
また、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（前述▲４▼Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ら）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販の遺伝子導入試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
更に、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
本発明の細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞表面に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＳ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞表面に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、例えば、本発明のポリペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、本発明のポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８，１９９６）。
本発明の細胞の内、ＧＰＲｇ１タンパク質群を発現している細胞、又はその細胞膜を用いると、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群の活性を制御可能な物質をスクリーニングすることができる。本発明のポリペプチドの１つであるＧＰＲｇ１タンパク質は、先に述べたように、摂食機能を司る視床下部に発現しており、摂食機能を司るＧＰＣＲであると考えられる。従って、ＧＰＲｇ１タンパク質の活性を制御することのできる物質は、摂食障害及び／又は肥満症の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用である。従って、本発明の細胞の内、ＧＰＲｇ１タンパク質群を発現している細胞、又はその細胞膜それ自体を、摂食障害及び／又は肥満症治療用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。以下、「ＧＰＲｇ１タンパク質群を発現している細胞」を、本発明のスクリーニング用細胞と称する。
本発明の摂食障害及び／又は肥満症治療用物質スクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明の摂食障害及び／又は肥満症治療用物質スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明の摂食障害及び／又は肥満症治療用物質スクリーニング方法は、受容体として機能するように本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群（好ましくはＧＰＲｇ１タンパク質）を発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ＧＰＲｇ１タンパク質群が活性化されるか否かを分析する工程を含む限り、特に限定されるものではないが、例えば、ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質（例えば、Ｇｑｉ５）、又はＧｑを利用するスクリーニング方法を挙げることができる。
ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑを利用して、摂食障害及び／又は肥満症治療剤の有効成分として有用な、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群の活性を制御する物質をスクリーニングする場合には、本発明のスクリーニング用細胞として、例えば、（１）ＧＰＲｇ１タンパク質群をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（２）Ｇαタンパク質の一種であるＧｑとＧｉとのキメラタンパク質（例えば、Ｇｑｉ５）、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）血清応答配列（ＳＲＥ）の下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を連結したプラスミドとを、３者同時に遺伝子導入した動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞）を用いることができる。
前記の本発明のスクリーニング用細胞と、試験物質とを接触させ、前記細胞内のルシフェラーゼ活性を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、ＧＰＲｇ１タンパク質群が活性化されるか否かを分析する。本発明のスクリーニング用細胞と試験物質とを接触させた場合に、前記細胞内のルシフェラーゼ活性が上昇すれば、前記試験物質は、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群に対するアゴニストであると判定することができる。一方、本発明のスクリーニング用細胞と試験物質とを接触させた場合に、前記細胞内のルシフェラーゼ活性が抑制されば、前記試験物質は、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群に対するアンタゴニストであると判定することができる。
なお、コントロールとして、本発明のスクリーニング用細胞の代わりに、（１）ＧＰＲｇ１タンパク質群をコードするポリヌクレオチドを含まないコントロール用ベクターと、（２）ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）ＳＲＥの下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミドとを、３者同時に遺伝子導入したコントロール用細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験物質によりこれらのコントロール用細胞内のルシフェラーゼ活性が上昇又は抑制しないことを確認することが好ましい。
ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑを利用するスクリーニング方法は、より具体的には、後述の実施例５に示す条件に準じて実施することが好ましい。すなわち、コラーゲンタイプＩをコーティングした２４ウェルプレート（例えば、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ社）に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を１ウェル当たり７ｘ１０４細胞となるように播種し、２４時間培養した後、（１）プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロールとしての空ベクター）（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（２）各プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑ、又はｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５のいずれか１種類のプラスミド（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（３）プラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）（１ウェル当たり２０ｎｇ）とを、遺伝子導入試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、３者同時に遺伝子導入する。遺伝子導入直後に、あるいは、遺伝子導入から所定時間（例えば、１８時間）経過した後に、試験物質を添加し、遺伝子導入から２４時間経過した後、培地を廃棄し、ルシフェラーゼ・アッセイシステム（和光純薬社）の方法に従い、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定する。なお、使用した各プラスミドの詳細については、後述の実施例５を参照されたい。
また、前記ＧＰＲｇ１タンパク質群（好ましくはＧＰＲｇ１タンパク質）を発現している細胞と併せて、本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質群（好ましくはＧＰＲｇ１ｂタンパク質）を発現している細胞を用いると、ＧＰＲｇ１タンパク質群の活性を制御することのできる物質であって、しかも、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の活性に影響を与えない（すなわち、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の活性化及び阻害を行なわない）物質をスクリーニングすることができる。このような物質は、摂食機能のみを特異的に制御することができるため、摂食障害及び／又は肥満症治療用物質として、より好ましい物質である。
なお、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の活性に影響を与えない物質は、例えば、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群を用いた結合実験により、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群に結合する物質を除外することによって選択することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りのない場合には、公知の方法（前述▲３▼Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″）に従って、実施可能である。
《実施例１ 新規ＧＰＣＲタンパク質をコードする遺伝子の単離》
本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質（ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂ）をコードする全長ｃＤＮＡは、以下に示す手順に従って、ＰＣＲにより取得した。
まず、本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１をコードするｃＤＮＡの増幅には、ヒト脳の視床下部由来のｃＤＮＡを鋳型として用いた。ヒト脳の視床下部由来の鋳型ｃＤＮＡは、前記組織由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を購入し、逆転写反応用試薬（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ；ＧＩＢＣＯ社）を用いて逆転写反応を行なうことにより調製した。また、フォワードプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、５％ホルムアミド存在下で、９４℃（２分間）の後、９６℃（５秒間）及び７２℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９６℃（５秒間）及び７０℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、並びに９６℃（５秒間）及び６８℃（１．５分間）からなるサイクルを２０回繰り返すことにより実施した。
その結果、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター（ｄｉｄｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析したところ、配列番号１で表される塩基配列が得られた。
この塩基配列は、１０６２塩基からなるオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列の１番目〜１０６２番目）を有する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝３５３個）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列である。得られた予想アミノ酸配列は、ＧＰＣＲの特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を有していることから、本遺伝子がＧＰＣＲをコードすることが判明した。
本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１ｂをコードするｃＤＮＡの増幅には、ヒト精巣由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として用いた。また、フォワードプライマーとして、配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４℃（２分間）の後、９６℃（５秒間）及び７２℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９６℃（５秒間）及び７０℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、並びに９６℃（５秒間）及び６８℃（１．５分間）からなるサイクルを２０回繰り返すことにより実施した。
その結果、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析したところ、配列番号３で表される塩基配列が得られた。
この塩基配列は、１１２５塩基からなるオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列の１番目〜１１２５番目）を有する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝３７４個）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列である。得られた予想アミノ酸配列は、ＧＰＣＲの特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を有していることから、本遺伝子がＧＰＣＲをコードすることが判明した。
《実施例２ 新規ＧＰＣＲタンパク質（ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂ）のアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索》
実施例１で得られた、本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１のアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索を行なった。ＧＰＲｇ１タンパク質は、既知ＧＰＣＲの中では、ノシセプチン（ＮＯＣＩＣＥＰＴＩＮ）受容体（Ｐ４７７４８；アミノ酸残基数＝３７０個）に対して最も高い相同性（２０％）を示したが、アミノ酸配列が同一の分子は存在しなかった。この結果から、ＧＰＲｇ１タンパク質が新規ＧＰＣＲであることが判明した。
同様に、本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１ｂのアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索を行なった。ＧＰＲｇ１ｂタンパク質は、既知ＧＰＣＲの中では、Ｂ１ブラジキニン（Ｂ１ ＢＲＡＤＹＫＩＮＩＮ）受容体（Ｐ４８７４８；アミノ酸残基数＝３５２個）に対して最も高い相同性（２５％）を示したが、アミノ酸配列が同一の分子は存在しなかった。この結果から、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質が新規ＧＰＣＲであることが判明した。
《実施例３ ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質のアラインメント解析》
ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質のアミノ酸配列での相同性を解析するために、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）のデフォルトパラメーターに従って解析を行なった。［デフォルトパラメーターは既に９頁後半部分で説明済であることより、ここの箇所は削除しました。］
その結果、ＧＰＲｇ１タンパク質とＧＰＲｇ１ｂタンパク質とは、４６％と高い相同性を有することが判明した。ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質には、生体内の同一生理活性物質が結合すると考えられる。
《実施例４ ヒト組織におけるＧＰＲｇ１遺伝子及びＧＰＲｇ１ｂ遺伝子の発現分布》
ＧＰＲｇ１遺伝子の組織発現分布を解析するために、実施例１と同様に、市販のヒト各組織由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を購入し、逆転写反応用試薬（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ；ＧＩＢＣＯ社）を用いて逆転写反応を行なうことにより、ヒト各組織由来ｃＤＮＡを調製した。合成された各ｃＤＮＡを鋳型とし、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＩＧＭＡ）を用いてＰＣＲを行なった。フォワードプライマーとして、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）、及び７２℃（１分間）からなるサイクルを４０回繰り返した。
その結果、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が、摂食機能を司ることが知られている視床下部、全脳、及び胎児脳に由来する各ｃＤＮＡで増幅された。一方、脳梁、小脳、前頭葉、心臓、胎盤、肺、気管支、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、前立腺、精巣、子宮、胎児腎臓、胎児肝臓、及び胎児肺由来の各ｃＤＮＡでは、増幅が確認されなかった。
ＧＰＲｇ１ｂ遺伝子の組織発現分布を解析するために、ＧＰＲｇ１遺伝子の組織発現分布を解析するために先に調製したヒト各組織由来ｃＤＮＡを鋳型とし、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）を用いてＰＣＲを行なった。フォワードプライマーとして、配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃（２分間）の後、９４℃（３０秒間）、５０℃（３０秒間）、及び７２℃（１分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。
その結果、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が、扁桃核、尾状核、海馬、脳梁、黒質、視床、小脳、前頭葉、視床下部、脊髄、脳下垂体、全脳、心臓、胎盤、肺、気管支、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、前立腺、精巣、子宮、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、及び胎児肺に由来するｃＤＮＡで増幅された。この結果から、ＧＰＲｇ１ｂは、摂食機能に関連しない様々な組織で発現していることが判明した。
《実施例５ ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるＧＰＲｇ１タンパク質の発現による細胞内情報伝達系の解析》
実施例１でクローニングしたＧＰＲｇ１の全長ｃＤＮＡを、フォワードプライマーとして、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）によるＰＣＲを行なうことにより増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩで処理し、ｐＥＦ−ＢＯＳ（前述▲４▼Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ及びら）のＸｂａＩ部位に挿入した（以下、得られたプラスミドを、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１と称する）。前記プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１によれば、Ｎ末端にシグナルシークエンスを付加したＧＰＲｇ１タンパク質を発現させることができるため、目的ポリペプチドを細胞膜に高頻度に発現させることができる。
一方、Ｇαタンパク質の一種であるＧｑとＧｉとのキメラタンパク質Ｇｑｉ５を、Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｂ．Ｒ．らの方法（▲５▼Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２７６，１９９３）に従って、Ｇｑ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ．ＸＭ＿０４０９７４）のＣ末端側の５アミノ酸（ＥＹＮＬＶ；配列番号１５）をＧｉのＣ末端の５アミノ酸（ＤＣＧＬＦ；配列番号１６）に置換することにより構築し、ｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングした（以下、構築したプラスミドを、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５と称する）。同様の方法で、ＧｑとＧｏとのキメラタンパク質Ｇｑｏ、ＧｑとＧｓとのキメラタンパク質Ｇｑｓ、Ｇｑ、及びＧ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ．ＢＣＯ１１０９８）についても、それぞれ、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングした（得られた各プラスミドを、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑ、及びｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５と称する）。
具体的には、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５は、鋳型として、ＧｑをコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（前述▲５▼Ｎａｔｕｒｅ）を、フォワードプライマーとして、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿入することにより、調製した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑは、鋳型として、ＧｑをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを、フォワードプライマーとして、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿入することにより、調製した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５は、鋳型として、Ｇ１５をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを、フォワードプライマーとして、配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで処理し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿入することにより、調製した。
コラーゲンタイプＩをコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ社）に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１ウェル当たり７ｘ１０４細胞となるように播種し、２４時間培養した後、（１）プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロールとしての空ベクター）（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（２）各プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑ、又はｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５のいずれか１種類のプラスミド（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（３）プラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）（１ウェル当たり２０ｎｇ）とを、遺伝子導入試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、３者同時に遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間経過した後、培地を廃棄し、ルシフェラーゼ・アッセイシステム（和光純薬社）の方法に従い、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図１に示す。図１に示すように、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１及びプラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃと一緒に、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑを導入した細胞では、細胞内ルシフェラーゼ活性が特異的に上昇しており、ＧＰＲｇ１タンパク質のセカンドメッセンジャーは、Ｃａ２＋上昇及び／又はｃＡＭＰ抑制であることが判明した。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む細胞は、摂食障害及び／又は肥満症治療剤として有効な物質のスクリーニングに有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｔｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１３、１４、１７〜２１の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１はＧＰＲｇ１タンパク質のレポーター活性を示すグラフである。得られた結果のルシフェラーゼ活性値をＹ軸に示す。
記号「Ｇｑｉ５」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５を用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇｑｏ」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏを用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇｑｓ」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓを用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇｑ」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑを用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇ１５」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５を用いた場合の結果を意味する。
本発明は、新規Ｇ蛋白質共役型受容体に関する。
背景技術
医学的に重要な生物学的プロセスの多くが、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝達経路に関与しているタンパク質及び／又はセカンドメッセンジャーにより媒介されることはよく知られている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ，３５１，３５３−３５４，１９９１）。その中でも、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を介して細胞内にシグナルを伝達する細胞膜レセプター群は、「Ｇタンパク質共役型レセプター」と総称されている。現在までに知られている全てのＧタンパク質共役型レセプターは、アミノ末端を細胞外に、カルボキシル末端を細胞内とし、細胞膜を７回貫通する構造を共有するスーパーファミリーを形成していることから、「７回膜貫通型レセプター」と総称される場合もある。Ｇタンパク質共役型レセプターは、様々な生理活性物質の情報を、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質の活性化、そして、それにより引き起こされる細胞内セカンドメッセンジャーの変動を介して、細胞膜から細胞内へと伝達する。三量体型ＧＴＰ結合タンパク質により制御される細胞内セカンドメッセンジャーは、アデニレートシクラーゼを介するｃＡＭＰ、あるいは、フォスフォリパーゼＣを介するＣａ２＋などがよく知られているが、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質を介したチャネルの制御、そして、リン酸化酵素の活性化など、多くの細胞タンパク質がその標的となっていることが最近明らかとなってきた（Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ，Ｔ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，３９９−４２７，１９９７）。Ｇタンパク質共役型レセプターを介して情報を伝達する生理活性物質の中には、神経伝達物質、ホルモン、ケモカイン、脂質由来の情報伝達物質、２価イオン、又はプロテアーゼなど、既存の生理活性物質の多くが含まれる。これらの生理活性物質にはそれぞれ特異的なＧタンパク質共役型レセプターが存在し、その情報を細胞内に伝達する。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、遺伝子のクローニングが先行する場合も多く、内在性リガンドとの対応がとれていないレセプターは、オーファンＧタンパク質共役型レセプターと呼ばれている。近年、充実された化合物ライブラリーと高性能ハイスループットスクリーニングとを組み合わせることで、オーファンＧタンパク質共役型レセプターをターゲットとした薬剤の創製が提唱されている（▲１▼Ｓｔａｄｅｌ，Ｊ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，４３０−４３７，１９９７）。すなわち、多くのＧタンパク質共役型レセプターのセカンドメッセンジャーとなっているｃＡＭＰ又はＣａ２＋の測定、三量体型ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の指標となるＧＴＰａｓｅ活性、あるいは、ＧＴＰγＳのＧタンパク質結合測定などをハイスループット化することで、化合物ライブラリーからオーファンＧタンパク質共役型レセプターに対するアゴニストをスクリーニングすることが可能であり、その化合物を利用した特異的なアゴニスト及びアンタゴニストの発見、ひいては特定の疾患治療薬の開発が可能であるということである。このような状況下では、新しい疾患の治療ターゲットとなり得る新規Ｇタンパク質共役型レセプターの発見が、Ｇタンパク質共役型レセプターに作用する薬剤創製の最も重要なステップと見なすことができる。
現在までに数百種類のＧタンパク質共役型レセプターが真核生物からクローニングされている。ヒトに関しては百種類以上の内在性リガンドとの対応がとれたＧタンパク質共役型レセプターがクローニングされている。これまでにそれらの受容体をターゲットとする数百種類もの疾患治療薬が利用されている（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．ら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２５，１３８７−１３９２，１９９８）。Ｇタンパク質共役型レセプターが標的となっている疾患は多岐にわたり、中枢神経系、循環器系、炎症免疫系、消化器系、運動器系、又は泌尿器生殖器系それぞれの分野でＧタンパク質共役型レセプターに作用する有効な薬剤が存在する（前述▲１▼Ｓｔａｄｅｌ，Ｊ．ら）。このことは、Ｇタンパク質共役型レセプターのアゴニスト又はアンタゴニストが疾患の治療剤となる可能性が高いことを示唆し、各種疾患を予防、改善、又は治療する上で重要な役割を果たすと考えられる新たな受容体を同定し、疾患との関わりを解明する必要がある。
ところで、摂食亢進物質として、ニューロペプチドＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ；以下、ＮＰＹと略称する）、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、及び膵臓ペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＰ）が知られており［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７８，３７１−９２，２０００；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５９（２ Ｐｔ ２），Ｒ３１７−２３，１９９０；Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，３４１，２００−３，１９８５；Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８０５，２０−８，１９９８；Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，５８，７３１−５，１９９５；及びＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６９（５ Ｐｔ ２），Ｒ９８３−７，１９９５］、これら３種は、ＮＰＹファミリーを構成している。
ＮＰＹファミリーの機能発現は、ＮＰＹ特異的受容体との結合を介して行なわれる（▲２▼Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ａ．Ｇ．及びＨｅｒｚｏｇ，Ｈ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，２９４−８，１９９７）。ＮＰＹファミリーの受容体としては、これまで５つの異なるサブタイプが存在することが知られており、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、及びＹ６が遺伝子レベルで同定されている。Ｙ１受容体は、抹消組織では血管に発現しており、ＮＰＹとの結合により血管収縮を惹起する。一方、Ｙ５受容体は、組織発現分布解析から、摂食に対する関与が示唆されている（前述▲２▼Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ａ．Ｇ．ら）。
ＮＰＹのＧＰＣＲは、摂食障害（前述▲２▼Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ，Ａ．Ｇ．ら）の治療ターゲットであると考えられており、ＮＰＹファミリー阻害剤である、１２２９Ｕ９１、ＢＭＳ−１９２５４８、Ｊ−１０４８７０、及びＢＩＢＰ３２２６等について、抗肥満薬の研究が進められている［Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２６１−６，１９９５；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ，（Ｔｏｋｙｏ），４８，１０５５−９，１９９５；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６６，８８−９１，１９９１；及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１３６−４２，１９９５］。しかしながら、摂食調節の異常に起因する摂食障害、又は肥満症等の疾患に関与するＧタンパク質共役型レセプターとそれに作用する分子について全てが理解されたわけではない。
発明の開示
本発明の課題は、摂食障害又は肥満症の予防及び／又は治療剤の開発に必要な、新規なＧタンパク質共役型レセプターをコードする遺伝子を単離及び同定し、前記レセプターの発現生産系を構築し、摂食障害又は肥満症の予防及び／又は治療に有用な前記レセプター活性を制御する物質を探索するためのスクリーニング法を提供することにある。また、本発明の課題は、摂食作用は抑制するが、摂食以外の作用に影響を与えない物質をスクリーニングするための方法を提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、ＧＰＣＲであるＧＰＲｇ１をコードし、摂食機能を司る視床下部特異的に発現している配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを取得した。そして、ＧＰＲｇ１のセカンドメッセンジャーは、Ｃａ２＋上昇及び／又はｃＡＭＰ抑制であることを見出し、ＧＰＲｇ１を用いた摂食作用を抑制する物質のスクリーニング系を提供した。また、ＧＰＲｇ１に結合するリガンドが結合するＧＰＣＲであり、視床下部及び摂食機能に関連しない様々な組織で発現しているＧＰＲｇ１ｂ並びにこれをコードするポリヌクレオチドを取得した。そして、ＧＰＲｇ１とＧＰＲｇ１ｂを用い、ＧＰＲｇ１活性に影響を与えるが、ＧＰＲｇ１ｂ活性に影響を与えない物質をスクリーニングすることにより、摂食機能のみを特異的に制御する、摂食障害及び／又は肥満症の予防及び／又は治療に有用な物質をスクリーニングするための方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性を示すポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性を示すポリペプチド、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［６］［５］に記載のベクターを含む細胞、
［７］［６］に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法、
［８］［１］又は［２］に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む前記ポリペプチドの活性を制御できる物質をスクリーニングする方法、
［９］（１）［１］又は［２］に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程、および、
（２）［３］に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む、［１］又は［２］に記載のポリペプチドの活性を制御できる物質であって、しかも、［３］に記載のポリペプチドの活性に影響を与えない物質をスクリーニングする方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドとしては、具体的には、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１タンパク質と称することがある）；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性（以下、細胞内Ｃａ２＋増加活性と称することがある）、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性（以下、細胞内ｃＡＭＰ減少活性と称することがある）を示すポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所（好ましくは１〜３箇所、特に好ましくは１箇所）において、全体として１〜５個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞内Ｃａ２＋増加活性、及び／又は（ｂ）細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１タンパク質機能的等価改変体と称する）；あるいは、
（４）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞内Ｃａ２＋増加活性、及び／又は（ｂ）細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチドと称する）
を挙げることができる［以下、これらのポリペプチド（１）〜（４）を総称して、「ＧＰＲｇ１タンパク質群」と称する］。
更に、本発明のポリペプチドとしては、具体的には、
（５）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質と称することがある）；
（６）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド；
（７）配列番号４で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所（好ましくは１〜３箇所、特に好ましくは１箇所）において、全体として１〜５個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質機能的等価改変体と称する）；あるいは、
（８）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド（以下、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチドと称する）
を挙げることができる［以下、これらのポリペプチド（５）〜（８）を総称して、「ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群」と称する］。
本発明のポリペプチドの１つであるＧＰＲｇ１タンパク質、すなわち、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、３５３個のアミノ酸残基からなるヒト由来のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＲｇ１タンパク質は、後述の実施例４に示すように、摂食機能を司る視床下部に発現しており、摂食機能を司るＧＰＣＲである。
本願優先日後に公開されたＷＯ０１／９４５８２（２００１年１２月１３日公開）には、配列番号２で表されるアミノ酸配列が記載されている。しかし、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを取得したことは記載されておらず、本ポリペプチドが摂食機能を司ることは開示も示唆もない。また、本願優先日後に公開されたＷＯ０１／７０９７８（２００１年９月２７日公開）には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なる配列が記載されている。しかし、該配列からなるポリペプチドを取得したこと及び本ポリペプチドの現実的な用途は記載されておらず、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが摂食機能を司ることは開示も示唆もない。
ＧＰＲｇ１タンパク質は、後述の実施例５に示すように、セカンドメッセンジャーがＣａ２＋上昇及び／又はｃＡＭＰ抑制であるＧＰＣＲであり、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す。
本明細書において、或るポリペプチドが「細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施例５に記載の方法）により確認することができる。
すなわち、（１）試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（２）Ｇαタンパク質の一種であるＧｑとＧｉとのキメラタンパク質（例えば、Ｇｑｉ５）、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）血清応答配列（ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ；ＳＲＥ）の下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を連結したプラスミドとを、動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞）に３者同時に遺伝子導入した後、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定する。この際、コントロールとして、（１）試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まないコントロール用ベクターと、（２）ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）ＳＲＥの下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミドとを、３者同時に遺伝子導入した動物細胞においても、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定する。
コントロール用発現ベクターを遺伝子導入した細胞に比べて、試験ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを遺伝子導入した細胞におけるルシフェラーゼ活性が上昇していれば、前記試験ポリペプチドが「細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性」を示す、すなわち、「細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性」を示すと判定することができる。
なお、前記「Ｇｑ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、ホスホリパーゼＣの活性を促進するＧタンパク質である。ホスホリパーゼＣの活性が促進されると、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇する。
また、前記「Ｇｉ」は、受容体と共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅因子として機能するＧタンパク質のサブファミリーの１つであって、アデニル酸シクラーゼの活性を抑制するＧタンパク質である。アデニル酸シクラーゼの活性が抑制されると、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度が低下する。
また、本明細書において、新規Ｇタンパク質共役型受容体である本発明のポリペプチドが細胞において「活性化」された状態とは、リガンドとの結合の有無に関わらず、Ｇタンパク質共役型受容体の下流にシグナルが伝達されている状態を意味する。活性型Ｇタンパク質共役型受容体の絶対量が一定量を越えた場合に、本発明のポリペプチドは活性化される。
Ｇタンパク質共役型受容体は、不活性型と活性型との間の平衡状態にあり、リガンドがＧタンパク質共役型受容体に結合することにより、平衡が活性型にシフトする。Ｇタンパク質共役型受容体を過剰に発現させた場合にも、活性型Ｇタンパク質共役型受容体の絶対量が増えるため、リガンド非存在下であっても、活性化され、下流にシグナルが伝達されることが知られている（Ｍｉｌａｎｏ，Ｃ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，５８２−５８６，１９９４）。すなわち、Ｇタンパク質共役型受容体は、リガンドが特定されていない場合であっても、Ｇタンパク質共役型受容体を細胞に過剰発現させることにより、その受容体からのシグナルを検出することが可能な場合がある。後述の実施例５に記載の実験では、本発明のポリペプチドに対するリガンド非存在下であっても、本発明のポリペプチドを過剰発現させることにより、アゴニストの結合による活性化と同じ状態に活性化されている。
本発明による、「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド」には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（但し、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すことが必要）を挙げることができる。
本発明において用いることのできるマーカー配列としては、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群の起源は、ヒトに限定されない。例えば、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質機能的等価改変体には、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける天然のアレル変異体（但し、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す）、あるいは、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）などのアミノ酸置換で生じたポリペプチド（但し、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す）が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物［例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の天然に存在する機能的等価改変体が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号２で表されるアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。
本発明のＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）のデフォルトパラメーターを用いて得られた値を意味する。なお、デフォルトパラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、
「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、
「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、
「Ｑｕｅｒｙ配列のフィルター」として「ＳＥＧ」を、
「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」を、
それぞれ使用する。
本発明には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示す部分断片も含まれる。
本発明のポリペプチドの１つであるＧＰＲｇ１ｂタンパク質、すなわち、「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、３７４個のアミノ酸残基からなるヒト由来のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＲｇ１ｂタンパク質は、後述の実施例４に示すように、摂食機能を司る視床下部以外にも、様々な組織で発現している。
ＧＰＲｇ１ｂタンパク質は、後述の実施例３に示すように、前記ＧＰＲｇ１タンパク質と高い相同性（４６％）を有しており、ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質には、生体内の同一生理活性物質が結合すると考えられる。
本発明による、「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド」には、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（但し、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合することが必要）を挙げることができる。
本願優先日後に公開されたＷＯ０２／０６４６６（２００２年１月２４日公開）には、配列番号４で表されるアミノ酸配列が記載されている。しかし、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを取得したことは記載されておらず、産業上の利用可能性としては、リガンドの決定、抗体および抗血清の入手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築等の漠然とした用途が記載されているに過ぎず、摂食作用を特異的に抑制する物質のスクリーニングに有用であることは開示も示唆もない。
本発明において用いることのできるマーカー配列としては、ペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の起源は、ヒトに限定されない。例えば、本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質機能的等価改変体には、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける天然のアレル変異体（但し、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合することが必要）、あるいは、一塩基多型（ＳＮＰ）などのアミノ酸置換で生じたポリペプチド（但し、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合することが必要）が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物［例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の天然に存在する機能的等価改変体が含まれる。また、これらの天然のポリペプチド、特には、配列番号４で表されるアミノ酸配列を基にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなどが含まれる。
本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチドとしては、配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を有し、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチドが好ましい。
本発明には、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合する部分断片も含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。本発明のポリヌクレオチドには、具体的には、
「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＧＰＲｇ１タンパク質）」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１タンパク質機能的等価改変体」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１タンパク質相同ポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、細胞内Ｃａ２＋増加活性及び／又は細胞内ｃＡＭＰ減少活性を示すポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＧＰＲｇ１ｂタンパク質）」をコードするポリヌクレオチド；
「配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１ｂタンパク質機能的等価改変体」をコードするポリヌクレオチド；
「ＧＰＲｇ１ｂタンパク質相同ポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド；
あるいは、「配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分断片であって、しかも、ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂに結合する生体内生理活性物質が結合するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド
が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号１又は３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがより好ましい。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織（例えば、脳・視床下部又は胎児脳）からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法、（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、▲３▼Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｍｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，″Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ″，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくは２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
本発明者は、本発明のポリペプチドのＮ末端にシグナルシークエンスを付加することが可能な発現ベクターを用いることにより、本発明のポリペプチドを細胞膜に過剰発現させることを可能とした。本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。
また、本発明者は、２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いることにより、本発明のポリペプチドを細胞膜に過剰発現させることを可能とした。本発明の細胞も、本発明の前記発現ベクターで形質転換され、本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（▲４▼Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。また、発現しようとするポリペプチドの上流に、細胞外への分泌シグナル配列（シグナルシークエンス）、例えば、インフルエンザヘマグルチニンシグナルシークエンスをインフレームで融合することができるようにデザインした発現ベクターを用いることもできる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２１９９５−２１９９８，１９９２）。このような発現ベクターとして、例えば、前記ｐＥＦ−ＢＯＳに、シグナルシークエンス及びＦＬＡＧエピトープをコードする配列を導入したプラスミド（ｐＥＦ−ＢＯＳ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｌａｇ ｐｌａｓｍｉｄ）を用いることができる。
宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
また、宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（前述▲４▼Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ら）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販の遺伝子導入試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
更に、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
本発明の細胞は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞表面に本発明のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＳ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、前記細胞の細胞表面に生産される本発明のポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、例えば、本発明のポリペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより、本発明のポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，又はジキトニン等）を用いることにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
本発明のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサーヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，１２３２−１２３８，１９９６）。
本発明の細胞の内、ＧＰＲｇ１タンパク質群を発現している細胞、又はその細胞膜を用いると、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群の活性を制御可能な物質をスクリーニングすることができる。本発明のポリペプチドの１つであるＧＰＲｇ１タンパク質は、先に述べたように、摂食機能を司る視床下部に発現しており、摂食機能を司るＧＰＣＲであると考えられる。従って、ＧＰＲｇ１タンパク質の活性を制御することのできる物質は、摂食障害及び／又は肥満症の治療及び／又は予防剤の有効成分として有用である。従って、本発明の細胞の内、ＧＰＲｇ１タンパク質群を発現している細胞、又はその細胞膜それ自体を、摂食障害及び／又は肥満症治療用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。以下、「ＧＰＲｇ１タンパク質群を発現している細胞」を、本発明のスクリーニング用細胞と称する。
本発明の摂食障害及び／又は肥満症治療用物質スクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ，ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明の摂食障害及び／又は肥満症治療用物質スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明の摂食障害及び／又は肥満症治療用物質スクリーニング方法は、受容体として機能するように本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群（好ましくはＧＰＲｇ１タンパク質）を発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ＧＰＲｇ１タンパク質群が活性化されるか否かを分析する工程を含む限り、特に限定されるものではないが、例えば、ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質（例えば、Ｇｑｉ５）、又はＧｑを利用するスクリーニング方法を挙げることができる。
ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑを利用して、摂食障害及び／又は肥満症治療剤の有効成分として有用な、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群の活性を制御する物質をスクリーニングする場合には、本発明のスクリーニング用細胞として、例えば、（１）ＧＰＲｇ１タンパク質群をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（２）Ｇαタンパク質の一種であるＧｑとＧｉとのキメラタンパク質（例えば、Ｇｑｉ５）、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）血清応答配列（ＳＲＥ）の下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）を連結したプラスミドとを、３者同時に遺伝子導入した動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞）を用いることができる。
前記の本発明のスクリーニング用細胞と、試験物質とを接触させ、前記細胞内のルシフェラーゼ活性を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、ＧＰＲｇ１タンパク質群が活性化されるか否かを分析する。本発明のスクリーニング用細胞と試験物質とを接触させた場合に、前記細胞内のルシフェラーゼ活性が上昇すれば、前記試験物質は、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群に対するアゴニストであると判定することができる。一方、本発明のスクリーニング用細胞と試験物質とを接触させた場合に、前記細胞内のルシフェラーゼ活性が抑制されば、前記試験物質は、本発明のＧＰＲｇ１タンパク質群に対するアンタゴニストであると判定することができる。
なお、コントロールとして、本発明のスクリーニング用細胞の代わりに、（１）ＧＰＲｇ１タンパク質群をコードするポリヌクレオチドを含まないコントロール用ベクターと、（２）ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、（３）ＳＲＥの下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミドとを、３者同時に遺伝子導入したコントロール用細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験物質によりこれらのコントロール用細胞内のルシフェラーゼ活性が上昇又は抑制しないことを確認することが好ましい。
ＧｑとＧｉとのキメラタンパク質、又はＧｑを利用するスクリーニング方法は、より具体的には、後述の実施例５に示す条件に準じて実施することが好ましい。すなわち、コラーゲンタイプＩをコーティングした２４ウェルプレート（例えば、Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ社）に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を１ウェル当たり７ｘ１０４細胞となるように播種し、２４時間培養した後、（１）プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロールとしての空ベクター）（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（２）各プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑ、又はｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５のいずれか１種類のプラスミド（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（３）プラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）（１ウェル当たり２０ｎｇ）とを、遺伝子導入試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、３者同時に遺伝子導入する。遺伝子導入直後に、あるいは、遺伝子導入から所定時間（例えば、１８時間）経過した後に、試験物質を添加し、遺伝子導入から２４時間経過した後、培地を廃棄し、ルシフェラーゼ・アッセイシステム（和光純薬社）の方法に従い、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定する。なお、使用した各プラスミドの詳細については、後述の実施例５を参照されたい。
また、前記ＧＰＲｇ１タンパク質群（好ましくはＧＰＲｇ１タンパク質）を発現している細胞と併せて、本発明のＧＰＲｇ１ｂタンパク質群（好ましくはＧＰＲｇ１ｂタンパク質）を発現している細胞を用いると、ＧＰＲｇ１タンパク質群の活性を制御することのできる物質であって、しかも、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の活性に影響を与えない（すなわち、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の活性化及び阻害を行なわない）物質をスクリーニングすることができる。このような物質は、摂食機能のみを特異的に制御することができるため、摂食障害及び／又は肥満症治療用物質として、より好ましい物質である。
なお、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群の活性に影響を与えない物質は、例えば、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群を用いた結合実験により、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質群に結合する物質を除外することによって選択することができる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りのない場合には、公知の方法（前述▲３▼Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″）に従って、実施可能である。
《実施例１ 新規ＧＰＣＲタンパク質をコードする遺伝子の単離》
本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質（ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂ）をコードする全長ｃＤＮＡは、以下に示す手順に従って、ＰＣＲにより取得した。
まず、本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１をコードするｃＤＮＡの増幅には、ヒト脳の視床下部由来のｃＤＮＡを鋳型として用いた。ヒト脳の視床下部由来の鋳型ｃＤＮＡは、前記組織由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を購入し、逆転写反応用試薬（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ；ＧＩＢＣＯ社）を用いて逆転写反応を行なうことにより調製した。また、フォワードプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、５％ホルムアミド存在下で、９４℃（２分間）の後、９６℃（５秒間）及び７２℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９６℃（５秒間）及び７０℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、並びに９６℃（５秒間）及び６８℃（１．５分間）からなるサイクルを２０回繰り返すことにより実施した。
その結果、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター（ｄｉｄｅｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析したところ、配列番号１で表される塩基配列が得られた。
この塩基配列は、１０６２塩基からなるオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列の１番目〜１０６２番目）を有する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝３５３個）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列である。得られた予想アミノ酸配列は、ＧＰＣＲの特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を有していることから、本遺伝子がＧＰＣＲをコードすることが判明した。
本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１ｂをコードするｃＤＮＡの増幅には、ヒト精巣由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型として用いた。また、フォワードプライマーとして、配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４℃（２分間）の後、９６℃（５秒間）及び７２℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、９６℃（５秒間）及び７０℃（１．５分間）からなるサイクルを５回、並びに９６℃（５秒間）及び６８℃（１．５分間）からなるサイクルを２０回繰り返すことにより実施した。
その結果、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析したところ、配列番号３で表される塩基配列が得られた。
この塩基配列は、１１２５塩基からなるオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列の１番目〜１１２５番目）を有する。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（アミノ酸残基数＝３７４個）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列である。得られた予想アミノ酸配列は、ＧＰＣＲの特徴である７個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を有していることから、本遺伝子がＧＰＣＲをコードすることが判明した。
《実施例２ 新規ＧＰＣＲタンパク質（ＧＰＲｇ１及びＧＰＲｇ１ｂ）のアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索》
実施例１で得られた、本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１のアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索を行なった。ＧＰＲｇ１タンパク質は、既知ＧＰＣＲの中では、ノシセプチン（ＮＯＣＩＣＥＰＴＩＮ）受容体（Ｐ４７７４８；アミノ酸残基数＝３７０個）に対して最も高い相同性（２０％）を示したが、アミノ酸配列が同一の分子は存在しなかった。この結果から、ＧＰＲｇ１タンパク質が新規ＧＰＣＲであることが判明した。
同様に、本発明の新規ＧＰＣＲタンパク質ＧＰＲｇ１ｂのアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索を行なった。ＧＰＲｇ１ｂタンパク質は、既知ＧＰＣＲの中では、Ｂ１ブラジキニン（Ｂ１ ＢＲＡＤＹＫＩＮＩＮ）受容体（Ｐ４８７４８；アミノ酸残基数＝３５２個）に対して最も高い相同性（２５％）を示したが、アミノ酸配列が同一の分子は存在しなかった。この結果から、ＧＰＲｇ１ｂタンパク質が新規ＧＰＣＲであることが判明した。
《実施例３ ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質のアラインメント解析》
ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質のアミノ酸配列での相同性を解析するために、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）のデフォルトパラメーターに従って解析を行なった。［デフォルトパラメーターは既に９頁後半部分で説明済であることより、ここの箇所は削除しました。］
その結果、ＧＰＲｇ１タンパク質とＧＰＲｇ１ｂタンパク質とは、４６％と高い相同性を有することが判明した。ＧＰＲｇ１タンパク質及びＧＰＲｇ１ｂタンパク質には、生体内の同一生理活性物質が結合すると考えられる。
《実施例４ ヒト組織におけるＧＰＲｇ１遺伝子及びＧＰＲｇ１ｂ遺伝子の発現分布》
ＧＰＲｇ１遺伝子の組織発現分布を解析するために、実施例１と同様に、市販のヒト各組織由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を購入し、逆転写反応用試薬（Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ；ＧＩＢＣＯ社）を用いて逆転写反応を行なうことにより、ヒト各組織由来ｃＤＮＡを調製した。合成された各ｃＤＮＡを鋳型とし、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＩＧＭＡ）を用いてＰＣＲを行なった。フォワードプライマーとして、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）、及び７２℃（１分間）からなるサイクルを４０回繰り返した。
その結果、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が、摂食機能を司ることが知られている視床下部、全脳、及び胎児脳に由来する各ｃＤＮＡで増幅された。一方、脳梁、小脳、前頭葉、心臓、胎盤、肺、気管支、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、前立腺、精巣、子宮、胎児腎臓、胎児肝臓、及び胎児肺由来の各ｃＤＮＡでは、増幅が確認されなかった。
ＧＰＲｇ１ｂ遺伝子の組織発現分布を解析するために、ＧＰＲｇ１遺伝子の組織発現分布を解析するために先に調製したヒト各組織由来ｃＤＮＡを鋳型とし、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）を用いてＰＣＲを行なった。フォワードプライマーとして、配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃（２分間）の後、９４℃（３０秒間）、５０℃（３０秒間）、及び７２℃（１分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。
その結果、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が、扁桃核、尾状核、海馬、脳梁、黒質、視床、小脳、前頭葉、視床下部、脊髄、脳下垂体、全脳、心臓、胎盤、肺、気管支、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液腺、副腎、乳腺、前立腺、精巣、子宮、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、及び胎児肺に由来するｃＤＮＡで増幅された。この結果から、ＧＰＲｇ１ｂは、摂食機能に関連しない様々な組織で発現していることが判明した。
《実施例５ ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるＧＰＲｇ１タンパク質の発現による細胞内情報伝達系の解析》
実施例１でクローニングしたＧＰＲｇ１の全長ｃＤＮＡを、フォワードプライマーとして、配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社）によるＰＣＲを行なうことにより増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩで処理し、ｐＥＦ−ＢＯＳ（前述▲４▼Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ及びら）のＸｂａＩ部位に挿入した（以下、得られたプラスミドを、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１と称する）。前記プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１によれば、Ｎ末端にシグナルシークエンスを付加したＧＰＲｇ１タンパク質を発現させることができるため、目的ポリペプチドを細胞膜に高頻度に発現させることができる。
一方、Ｇαタンパク質の一種であるＧｑとＧｉとのキメラタンパク質Ｇｑｉ５を、Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｂ．Ｒ．らの方法（▲５▼Ｎａｔｕｒｅ，３６３，２７４−２７６，１９９３）に従って、Ｇｑ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ．ＸＭ＿０４０９７４）のＣ末端側の５アミノ酸（ＥＹＮＬＶ；配列番号１５）をＧｉのＣ末端の５アミノ酸（ＤＣＧＬＦ；配列番号１６）に置換することにより構築し、ｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングした（以下、構築したプラスミドを、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５と称する）。同様の方法で、ＧｑとＧｏとのキメラタンパク質Ｇｑｏ、ＧｑとＧｓとのキメラタンパク質Ｇｑｓ、Ｇｑ、及びＧ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ Ｎｏ．ＢＣＯ１１０９８）についても、それぞれ、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳにクローニングした（得られた各プラスミドを、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑ、及びｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５と称する）。
具体的には、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５は、鋳型として、ＧｑをコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（前述▲５▼Ｎａｔｕｒｅ）を、フォワードプライマーとして、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿入することにより、調製した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑは、鋳型として、ＧｑをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを、フォワードプライマーとして、配列番号１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｐｅＩで処理し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿入することにより、調製した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５は、鋳型として、Ｇ１５をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを、フォワードプライマーとして、配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで処理し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳのＸｂａＩ部位に挿入することにより、調製した。
コラーゲンタイプＩをコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ社）に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１ウェル当たり７ｘ１０４細胞となるように播種し、２４時間培養した後、（１）プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロールとしての空ベクター）（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（２）各プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓ、ｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑ、又はｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５のいずれか１種類のプラスミド（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、（３）プラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）（１ウェル当たり２０ｎｇ）とを、遺伝子導入試薬（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いて、３者同時に遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間経過した後、培地を廃棄し、ルシフェラーゼ・アッセイシステム（和光純薬社）の方法に従い、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図１に示す。図１に示すように、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＳＳＦ−ＧＰＲｇ１及びプラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃと一緒に、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑを導入した細胞では、細胞内ルシフェラーゼ活性が特異的に上昇しており、ＧＰＲｇ１タンパク質のセカンドメッセンジャーは、Ｃａ２＋上昇及び／又はｃＡＭＰ抑制であることが判明した。
産業上の利用可能性
本発明のポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む細胞は、摂食障害及び／又は肥満症治療剤として有効な物質のスクリーニングに有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｔｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１３、１４、１７〜２１の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１はＧＰＲｇ１タンパク質のレポーター活性を示すグラフである。得られた結果のルシフェラーゼ活性値をＹ軸に示す。
記号「Ｇｑｉ５」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｉ５を用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇｑｏ」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｏを用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇｑｓ」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑｓを用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇｑ」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇｑを用いた場合の結果を意味し、記号「Ｇ１５」は、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−Ｇ１５を用いた場合の結果を意味する。
Claims (9)
- （１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性を示すポリペプチド、あるいは、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、（ａ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内Ｃａ２＋量を増加させる活性、及び／又は（ｂ）細胞において活性化されることにより、前記細胞内ｃＡＭＰ量を減少させる活性を示すポリペプチド。 - 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求の範囲１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求の範囲４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求の範囲５に記載のベクターを含む細胞。
- 請求の範囲６に記載の細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 請求の範囲１又は２に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む前記ポリペプチドの活性を制御できる物質をスクリーニングする方法。
- （１）請求の範囲１又は２に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程、および、
（２）請求の範囲３に記載のポリペプチドを発現している細胞又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む、請求の範囲１又は２に記載のポリペプチドの活性を制御できる物質であって、しかも、請求の範囲３に記載のポリペプチドの活性に影響を与えない物質をスクリーニングする方法。
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