JP2014510534A - 動物細胞発現ベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、増加した遺伝子の発現能を有する動物細胞発現ベクターに関し、より詳細には、プロモータの５’末端、転写終結因子の３’末端、または前記プロモータの５’末端と前記転写終結因子の３’末端の両側に遺伝子の発現増加因子であるＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクターに関する。本発明に係る動物細胞発現ベクターは、従来の動物細胞発現ベクターより非常に優れた遺伝子の発現増加能を示すことで、前記動物細胞発現ベクターを用いて外来遺伝子のタンパク質発現を顕著に増加させることができる。特に、本発明に係る動物細胞発現ベクターは、ＭＴＸ増幅がなくても高発現の細胞株の確保を可能にするため、非常に有用である。

Description

本発明は、増加した遺伝子の発現能を有する動物細胞発現ベクターに関する。

標的タンパク質を大量に発現、取得して医薬、産業などの用途に利用するために、微生物、植物、酵母、昆虫細胞、動物細胞などの様々な発現システムが用いられている。このうち、微生物は最も利用しやすいシステムであって、様々な応用に適する発現システムとして開発して商用化されている。

しかし、微生物発現システムは、いくつかの制限要因を有している。最大の制限要因は、微生物のタンパク質発現および修飾メカニズム（グリコシル化、リン酸化、アミド化）が動物細胞と相違しており、同じ遺伝子を微生物システムで発現させても発現するタンパク質の構造や特性が本来のタンパク質と完全に一致しないということである。そのため、微生物発現システムを用いた組み換えタンパク質の生成は、合成後に修飾がほとんど起こらず、不活性化するか、機能における顕著な差はなくても修飾や構造における部分的な差を有するタンパク質を発現することが非常に多い。また、微生物発現システムを用いた組み換えタンパク質の生産過程は、微生物の汚染、又は微生物の内毒素汚染などによって副次的な汚染物を除去しなければならないという不都合が伴う。

これに対し、動物細胞発現システムは、動物タンパク質を発現するために最も好適なシステムであるにもかかわらず、微生物発現システムより組み換えタンパク質の発現効率が低く、生産コストが高く、動物細胞の操作過程が煩雑であるため、容易に産業化されていない。現在用いられている産業用の動物細胞株としては、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ）、骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）などが挙げられ、当該遺伝子を含む発現ベクターをこれらの動物細胞株に形質導入して、標的の外来タンパク質を発現させる。

動物細胞は、グリコシル化をはじめ、様々なタンパク質修飾メカニズムを維持し、培養培地にタンパク質を分泌する場合、タンパク質の取得と精製過程がより容易である。ほとんどの動物細胞が培養過程で血清タンパク質などの複合的な添加物を必ず要する反面、ＣＨＯ細胞は、血清およびタンパク質が添加されていない培地で培養できることにより、組み換えタンパク質の発現に最も好適な宿主として活用される。また、ＣＨＯ細胞は、多くの先行研究によりその特性がよく知られており、成長速度が速く、大量培養のための懸濁培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）が可能であるという利点を有している。

通常、動物細胞で外来遺伝子を発現しようとする際、外来遺伝子と標識（ｍａｒｋｅｒ）を有するベクターを同時に形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、形質転換した細胞は、選択培地で培養して選別する。しかし、ほとんどの場合、これらの発現頻度は非常に低い。その理由の一つは、微生物システムとは異なり、動物細胞では、これらの外来遺伝子が宿主細胞内の染色体に挿入されなければならないという点である。また、外来遺伝子が宿主細胞の染色体に安定して挿入されている形質転換体（ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）を選別しても、その発現量を予測することは困難である。これは、各細胞ごとに遺伝子の挿入位置が異なり、挿入位置に応じて発現パターンが異なるためである。したがって、動物細胞内に挿入された外来遺伝子の数と遺伝子の発現量は、明確な相関関係を有しない（Grindley et al., 1987, Trends Genet. 3, 16-22; Kucherlapati et al., 1984, Crit. Rev. Biochem. 16, 349-381; Palmiter et al., 1986, Annu. Rev. Genet. 20, 465-499）。ほとんどの場合、動物細胞における遺伝子の発現は、挿入された周辺の核酸塩基によって抑制され、安定的に挿入された外来遺伝子（ｓｔａｂｌｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）であっても、時々、非常に低いレベルで発現する（Eissenberg et al., 1991, Trends Genet. 7, 335-340; Palmiter et al., 1986, Annu. Rev.Genet . 20, 465-499）。

このような遺伝子位置特異的な影響から外来遺伝子の発現を保護するための核酸因子の利用の可能性が様々なシステムから報告されてきた。前記核酸因子としては、緩衝部位（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）因子および核マトリックス付着領域（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＭＡＲ」とする）または足場付着領域（Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ：以下、「ＳＡＲ」とする）などを活用してもよい。これらの作用メカニズムは明らかになっていないが、トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）構造体に含まれている際、挿入位置とは無関係に遺伝子の発現を誘導して、その発現量が遺伝子のコピー数に応じて決まる（McKnight, R.A. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. USA.89, 6943-6947）。カロスらは、ヒトアポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｂ遺伝子のＭＡＲ因子を最小プロモータトランスジーン構造体（ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に組み合わせ、動物細胞で遺伝子の発現を誘導して、その転写体の発現を約２００倍増加させた（Kalos et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15, 198-207）。同様に、脊椎動物細胞においてニワトリリゾチーム（ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）Ａ遺伝子のＭＡＲ因子と、ヒトインターフェロンβ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ β）遺伝子のＳＡＲ因子なども宿主細胞染色体内の挿入位置とは無関係に外来遺伝子の発現を増加させる性質を有すると報告された（Eissenberg et al., 1991, Trends Genet. 7, 335-340; Klehr et al., 1991, Biochemistry 30, 1264-1270）。しかし、このような特定のβグロビンＭＡＲ因子、特定のＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子または特定のインターフェロンβＳＡＲ因子の組み合わせを用いて、細胞株において実質的にタンパク質の生産を増加させるための試みや産業的な採算性が検証された事例はまだ報告されていない。

本背景技術の部分に記載の前記情報は、単に本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであって、そのため、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって公知の先行技術を形成する情報が含まれていないことがある。

本発明の目的は、作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端および／または前記転写終結因子の３’末端に１コピー以上のＭＡＲ因子及びＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクターを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記動物細胞発現ベクターで形質転換された組み換え動物細胞を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記動物細胞発現ベクターを用いた標的タンパク質の生産方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端および／または前記転写終結因子の３’末端に１コピー以上のＭＡＲ因子またはＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクターを提供する。

また、本発明は、作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端および／または前記転写終結因子の３’末端に１コピー以上のβグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子およびインターフェロンβＳＡＲ因子からなる群から選択される遺伝子の発現増加因子を含む動物細胞発現ベクターを提供する。

また、本発明は、作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端および／または前記転写終結因子の３’末端に遺伝子の発現増加因子であるＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクターを提供する。

また、本発明は、作動可能に連結されたプロモータまたは転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端および／または前記転写終結因子の３’末端に遺伝子の発現増加因子であるβグロビンＭＡＲ因子およびＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクター（ここで、前記プロモータは、マウスＥＦ１αプロモータ変異体であることを特徴とする）を提供する。

また、本発明は、前記動物細胞発現ベクターで形質転換された組み換え微生物を提供する。

また、本発明は、前記動物細胞発現ベクターで形質転換された組み換え動物細胞を提供する。

また、本発明は、前記組み換え動物細胞を培養して標的タンパク質を発現させてから回収することを特徴とする標的タンパク質の生産方法を提供する。

また、本発明は、配列番号３４で表される塩基配列を有するマウスＥＦ１αプロモータ変異体を提供する。

本発明の他の特徴および具現例は、下記の詳細な説明および添付の特許請求の範囲より、さらに明らかになる。

各ベクター別に含有された様々なＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子の組み合わせを概略的に示す一構成図である。 ｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）発現ベクターの開裂地図である。 ｐＭ（Ｒ）ｍＥＧＣ（Ｆ）発現ベクターの開裂地図である。 ｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ｍＥＧ発現ベクターの開裂地図である。 ｐＩ（Ｆ）ＳＧ、ｐＩ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＩ（Ｆ）、ｐＳＧＩ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧ、ｐＣ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＣ（Ｆ）、ｐＳＧＣ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧ、ｐＭ（Ｆ）ＳＧ、ｐＳＧＭ（Ｆ）、ｐＳＧＭ（Ｒ）ベクターを懸垂培養宿主細胞株に形質導入させた後、ＶＥＧＦ生産量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。 ｐＩ（Ｆ）ＳＧ、ｐＩ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＩ（Ｆ）、ｐＳＧＩ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧ、ｐＣ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＣ（Ｆ）、ｐＳＧＣ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧ、ｐＭ（Ｆ）ＳＧ、ｐＳＧＭ（Ｆ）、ｐＳＧＭ（Ｒ）ベクターを懸濁培養宿主細胞株に形質導入させた後、ＶＥＧＦ生産量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。 ｐＩ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＳＧ、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｒ）、およびｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ＳＧベクターについてＶＥＧＦ生産量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。 ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、およびｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ＳＧについてＶＥＧＦ生産量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。 図８のベクターのＳＶ４０プロモータをｍＥＦ１αプロモータ変異体で置換した後、ＶＥＧＦ生産量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。ここで、ｐｍＥＦ１ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ^＊は、ｍＥＦ１αプロモータ変異体を示す。 図９のベクターの標的タンパク質を組み換え抗体タンパク質で置換した後、組み換え抗体タンパク質の生産量を測定した結果を示す図である。ここで、ｐｍＥＦ１ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ^＊は、ｍＥＦ１αプロモータ変異体を示す。 ｐＭ（Ｒ）ＳＧ、ｐＭｈＥＧ、ｐＭｃＥＧ、ｐＭｍＥＧおよびｐＭｍＥＧ（ＴＡ）の組み換え抗体タンパク質生産量を測定した結果を示す図である。

ここで特に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家により通常理解されているものと同じ意味を有する。通常、本明細書で用いられる名称は、本技術分野においてよく知られており、通常使用されるものである。

本発明は、遺伝子の発現能が増加した動物細胞発現ベクターに関し、作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端、前記転写終結因子の３’末端、または前記プロモータの５’末端と前記転写終結因子の３’末端の両側に遺伝子の発現増加因子であるＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクターに関する。

本発明者らは、外来遺伝子の発現の際、遺伝子の発現量の著しい増加のために、動物細胞として知られているＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞またはＢＨＫ（Ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞などにおいて、宿主細胞染色体の位置特異的な阻害効果から外部遺伝子の発現を保護し、外部遺伝子の発現を増加させる因子を見出した。

具体的に、核マトリックス付着領域（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ：以下ＭＡＲ）とＳＡＲ（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を用いて、前記ＭＡＲ因子またはＳＡＲ因子が、プロモータの５’末端部位または転写終結因子の３’末端に１コピー以上、または２コピー以上含まれるようにベクターを作製し、発現ベクターの性能を比較分析した。

まず、前記ＭＡＲ因子またはＳＡＲ因子の塩基配列を確保するために、当該細胞からゲノム核酸を分離した後、ゲノム核酸対象ＰＣＲ法およびサブクローニング法により大腸菌細胞ベクターにクローニングして、様々なＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子を確保した。前記ＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子は、ヒトβグロビンＭＡＲ（Yu, J., Bock, J. H., Slightom, J. L. and Villeponteau, B., Gene 139(2), 139-145 (1994), gene bank #：L22754）、ヒトＣＳＰ−Β遺伝子フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ＳＡＲ（Hanson, R. D. and Ley, T. J., gene bank #：M62716）、およびヒトインターフェロンβ遺伝子フランキングＳＡＲ（Mielke, C., Kohwi, Y., Kohwi-Shigematsu, T. and Bode, J., Biochemistry 29, 7475-7485 (1990), gene bank #：M83137）からなる群から選択することが好ましい。

本発明において、前記動物細胞発現ベクターは、作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端および前記転写終結因子の３’末端それぞれに、βグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子およびインターフェロンβＳＡＲ因子からなる群から選択される遺伝子の発現増加因子を１コピー以上含む動物細胞発現ベクターであってもよい。

または、前記動物細胞発現ベクターは、作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端または前記転写終結因子の３’末端にβグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子およびインターフェロンβＳＡＲ因子からなる群から選択される遺伝子の発現増加因子を１コピー以上含む動物細胞発現ベクターであってもよい。

特に、前記遺伝子の発現増加因子は、２コピー以上を含んでもよく、プロモータの５’末端に２コピー以上の前記遺伝子の発現増加因子を含有するか、転写終結因子の３’末端に２コピー以上の遺伝子の発現増加因子を含有してもよい。または、プロモータの５’末端または転写終結因子の３’末端にそれぞれ１コピー以上の遺伝子の発現増加因子を含有させることで、著しい外来遺伝子の発現増加を誘導することができる。

なお、より好ましくは、前記プロモータの５’末端、前記転写終結因子の３’末端、または前記プロモータの５’末端及び前記転写終結因子の３’末端の両側に、遺伝子の発現増加因子であるＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子の両方を含んでもよい。

本発明において、本発明における「プロモータ」は、ポリメラーゼに対する結合部位を含み、プロモータ下流遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する、暗号化領域の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）の非翻訳領域の核酸配列を意味する。具体的に、「プロモータ」とは、転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基に対して上流に存在し、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担当するＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックスに類似した領域が含まれるが、必ずしもこれらの領域の前後に限定されず、この領域以外に、発現調節のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が集合するために必要な領域を含んでもよい。本発明において、前記プロモータは、ＳＶ４０プロモータまたはＣＭＶ来由のプロモータであってもよく、ＥＦ−１αプロモータを含んでもよく、これらのプロモータの変異体もまた本発明に含まれてもよい。ここでの変異体は、遺伝子の発現増加のために、プロモータ配列の一部を付加、欠失、または置換した変異体を意味する。

なお、前記プロモータは、外来遺伝子である標的遺伝子の発現を誘導するために作動可能に連結されており、ここで、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を果たすように、核酸発現調節配列と標的タンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結されていることを意味する。組み換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野において公知の遺伝子組み換え技術を用いて行ってもよく、部位特異的なＤＮＡ切断および連結には、当該技術分野において一般的に知られている酵素などを使用する。

本発明において、前記標的遺伝子は、発現しようとする外来産物をコードする遺伝子であって、組み換えタンパク質として発現可能なすべての種類のタンパク質を暗号化する遺伝子である。このようなタンパク質の代表的な例としては、インスリン、サイトカイン（インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、ケモカイン等）、エリトロポエチンなどが挙げられ、このような標的遺伝子は、前記ベクターに挿入できるように、制限酵素であるか切断部位が導入されている核酸配列である「クローニングサイト」を含む。

本発明において、遺伝子増加発現因子としては、βグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子、インターフェロンβＳＡＲ因子が挙げられ、ここで、「ＭＡＲ（ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、転写的に活性のＤＮＡループドメインを核マトリックス（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ）として知られたタンパク質ネットワークに一時的に付着させるＤＮＡ配列を指すものである（Pienta et al. (1991) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expres. 1：355-385）。ＭＡＲ配列の例は当業界でよく知られている。

本発明において、前記転写終結因子には、従来知られている任意の転写終結因子が含まれてもよい。好ましくは、ガストリン転写終結因子であってもよく、これにｐｏｌｙＡが連結されたものであってもよい。例えば、ヒト成長ホルモンポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙＡ）、ウシ成長ホルモンポリアデニレーションシグナルまたはＳＶ４０ウイルスポリアデニレーションシグナルが含まれてもよい。

本発明者らは、ｍＲＮＡ安定性増加により発現ベクターの効率を向上させるために、遺伝子の転写終結において必須のｐｏｌｙ−Ａシグナル、切断部位、及び終結部位が正確に知られているヒトガストリン（ｇａｓｔｒｉｎ）遺伝子転写終結部位（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を選別および作製して、本発明の発現ベクターに適用した。前記ガストリンは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素地図（ｍａｐ）において、ｐｏｌｙ−Ａシグナル、切断部位、及び終結部位が含まれる６０３ｂｐの断片からなっており、ｐｏｌｙ−Ａシグナルと切断部位とは１５ｂｐ離れており、終結部位は、ｐｏｌｙ−Ａシグナルから約２２０ｂｐ離れて位置する。前記のように位置したガストリンの転写終結部位で転写が終結し、切断部位でｍＲＮＡの切断およびｐｏｌｙ−Ａが生じる。

本発明において、前記動物細胞発現ベクターは、プロモータの５’末端または前記転写終結因子の３’末端に１コピーのβグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子またはインターフェロンβＳＡＲ因子を含むベクターであってもよい。

本発明において、前記遺伝子の発現増加因子の組み合わせは、例えば、図１に示された構成であってもよく、図１は動物細胞発現ベクターのうち、遺伝子の発現増加因子、プロモータ、ＰｏｌｙＡ、及びターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）の結合順序を概略的に示したものであって、ここで、プロモータは、ＳＶ４０、ＥＦ１−ａｌｐｈａプロモータ、又はＥＦ１−ａｌｐｈａプロモータ変異体であり、そしてＭＡＲ／ＳＡＲは、βグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子またはインターフェロンβＳＡＲ因子である。

本発明において、前記動物細胞発現ベクターは、プロモータの５’末端または前記転写終結因子の３’末端に、またはプロモータの５’末端および転写終結因子の３’末端にＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子を含むベクターであってもよい。ここで、前記ＭＡＲ因子と前記ＳＡＲ因子は、互いに隣接するか互いにコーディング配列または非コーディング配列によって分離していることを特徴としてもよい。

本発明の一具体例として、前記動物細胞発現ベクターは、プロモータの５’末端に１コピーのβグロビンＭＡＲ因子を含み、そして前記転写終結因子の３’末端に１コピーのＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を含むベクターであってもよい。

本発明の一具体例として、前記動物細胞発現ベクターは、プロモータの５’末端に１コピーのβグロビンＭＡＲ因子を含み、前記転写終結因子の３’末端に１コピーのインターフェロンβＳＡＲ因子を含むベクターであってもよい。

本発明の一具体例として、前記動物細胞発現ベクターは、プロモータの５’末端に１コピーのＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を含み、前記転写終結因子の３’末端に１コピーのβグロビンＭＡＲ因子を含むベクターであってもよい。

本発明の一具体例として、前記動物細胞発現ベクターは、プロモータの５’末端に１コピーのインターフェロンβＳＡＲ因子を含み、前記転写終結因子の３’末端に１コピーのβグロビンＭＡＲ因子を含むベクターであってもよい。

本発明において、２コピーのβグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子、インターフェロンβＳＡＲ因子が含まれる場合、前記２コピーのＭＡＲ因子またはＳＡＲ因子は、好ましくは、互いに隣り合うように連続しているか比較的短いスペーサ領域によって離隔していてもよい。

本発明において、前記ベクターは、βグロビンＭＡＲ因子、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子、インターフェロンβＳＡＲ因子をはじめ、遺伝子の発現増加因子の正方向体または逆方向体を含むことを特徴としてもよい。ここで、それぞれの遺伝子の発現増加因子の方向性は、これらの因子の特定の組み合わせごとに好ましい方向体が異なる。

本発明の一実施例では、配列番号３４の塩基配列を有するｍＥＦ１プロモータ変異体を用いた場合、ＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子を有するベクターにおける抗体生産性が、ＳＶ４０プロモータを用いた場合より、すべてのベクターで５倍以上増加しており、特に、ｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）ベクターの生産性は、１０倍以上増加することを確認した。このような結果は、ＳＶ４０プロモータを用いた場合においてＭＴＸ増幅後に確保された生産性より、ＳＶ４０プロモータをｍＥＦ１プロモータで置換してＭＴＸ濃度０ｎＭの適応後に測定した生産性が、約２倍高く分析されたため、ＭＴＸ増幅なしに高発現の細胞株の確保が可能になったことを示す。そのため、本発明は、ｍＥＦ１プロモータ変異体を使用することを一つの特徴とする。したがって、本発明は、他の観点では、配列番号３４で表される塩基配列を有するマウスＥＦ１αプロモータ変異体に関する。

本発明は、他の観点では、前記動物細胞発現ベクターで形質転換された組み換え微生物または組み換え動物細胞に関する。

ここで、動物細胞は、通常知られている動物細胞株であるＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、又はＨＥＫ２９３細胞などであってもよく、その他にも、ＳＰ２／０、ＮＳＯ、又はＰＥＲ．Ｃ６であってもよい。

本発明は、他の観点では、動物細胞発現ベクターを用いた標的タンパク質の生産方法に関し、前記組み換え動物細胞を培養して標的タンパク質を発現させ、回収することを特徴とする方法に関する。

本発明において、前記生産方法は、（ａ）前記動物細胞発現ベクターに前記プロモータによって発現が調節されるように標的遺伝子を挿入する段階と、（ｂ）前記標的遺伝子が挿入された動物細胞発現ベクターで動物細胞を形質転換させる段階と、（ｃ）前記形質転換された組み換え動物細胞を培養して標的タンパク質を発現させ、回収する段階と、を含むことを特徴としてもよい。

以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈しないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。

≪実施例１．ＭＡＲおよびＳＡＲ因子のクローニング≫
ＭＡＲ／ＳＡＲ ＤＮＡは、Ｈｅｐ Ｇ−２細胞株からＤＮＡ分離キット（Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いてゲノム核酸（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を分離した後、ＰＣＲ法により確保した。

前記で分離したゲノム核酸２００ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用し、２５ｐｍｏｌｅの各プライマー、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を添加して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。それぞれのＭＡＲ／ＳＡＲ因子について用いられたプライマーの塩基配列とＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の大きさは、下記表１のとおりである。重合酵素連鎖反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ、米国）を用いて実施し、ＰＣＲ条件は、下記表２に示した。

このように得られたヒトβグロビンＭＡＲ、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ及びインターフェロンβＳＡＲのＰＣＲ産物は、ｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、米国）またはｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）ベクターにサブクローニングした。ヒトβグロビンＭＡＲは、ｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクターにサブクローニングし、ＣＳＰ−Ｂ ＭＡＲおよびインターフェロンβＳＡＲは、ｐＣＲ２．１にサブクローニングした。

≪実施例２：動物細胞発現ベクターの製造≫
２−１：ｐＳＶ−β−ｇａｌ／ｖｅｒｓｉｏｎ Ｉと、ｖｅｒｓｉｏｎ ＩＩベクターの製造
前記でｐＴ７ｂｌｕｅ、ｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングされたＭＡＲおよびＳＡＲ因子をｐＳＶ−β−ｇａｌベクターのプロモータの前部に効率よくクローニングするために組み換えｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩ（ｖｅｒｓｉｏｎ Ｉ）とバージョンＩＩ（ｖｅｒｓｉｏｎ ＩＩ）ベクターとを作製した。

ｐＳＶ−β−ｇａｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）のＳＶ４０プロモータを制限酵素Ｓｐｅ Ｉ−Ｓｍａ Ｉ−Ａｐａ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉを含むプライマー（配列番号７）と、３’末端にＨｉｎｄ ＩＩＩを含むプライマー（配列番号８）を作製してＰＣＲを行った後、ＳＶ４０プロモータを含む４４３ｂｐのＳｐｅ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片をアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）からＢＩＯ １０１社製のｇｅｎｅ ｃｌｅａｎ ＩＩＩ ｋｉｔで分離精製して回収した後、この断片を同じ制限酵素であるＳｐｅ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで処理して開環したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）（米国のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）ベクターに挿入連結し、まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０ Ｉプロモータベクターを作製した。次に、前記で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０ Ｉプロモータベクターを制限酵素Ｓｃａ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで処理して、ＳＶ４０プロモータを含む断片を前記のような方法によりアガロースゲルから分離精製して回収した後、同じ制限酵素で処理して開環したｐＳＶ−β−ｇａｌベクターに挿入連結することで、バージョンＩベクターを完成した（ｐＳＶ−β−ｇａｌ／ｖｅｒｓｉｏｎ Ｉ）。

配列番号７：Ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐＳＶ−ｂｅｔａ−ｇａｌ／ｖｅｒ １ ｖｅｃｔｏｒ
５’−ＧＣＡＣＴＡＧＴＣＣ ＣＧＧＧＣＣＣＡＴＧ ＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴ ＣＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴ−３’

配列番号８：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐＳＶ−ｂｅｔａ−ｇａｌ／ｖｅｒ １ ｖｅｃｔｏｒ
５’−ＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴ ＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣ ＴＡＧＧＣＣＴＣＣ−３’

また、組み換えｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩＩベクターを作製するために、ｐＳＶ−β−ｇａｌベクターをＥｃｏＲ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで処理して、ＳＶ４０プロモータを含む４２０ｂｐのＥｃｏＲ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を前記のような方法により分離精製して回収した後、この断片を同じ制限酵素であるＥｃｏＲ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで処理して開環したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクターに挿入連結することで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０ ＩＩプロモータベクターを作製した。次に、前記で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０ ＩＩプロモータベクターを制限酵素Ｓｃａ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで処理してＳＶ４０プロモータを含む断片を前記のような方法によりアガロースゲルから分離精製して回収した後、同じ制限酵素で処理して開環したｐＳＶ−β−ｇａｌベクターに挿入連結することで、バージョンＩＩベクターを完成した（ｐＳＶ−β−ｇａｌ／ｖｅｒｓｉｏｎ ＩＩ）。

２−２：ＭＡＲ／ＳＡＲ因子およびβ−ｇａｌ遺伝子を含むベクターの製造
実施例１で作製されたｐＴ７ｂｌｕｅ／βグロビンＭＡＲベクターを制限酵素Ｓｐｅ ＩとＳｍａ Ｉで処理してβグロビンＭＡＲ因子を含有する３ｋｂサイズのＤＮＡ断片をアガロースゲルから分離精製して回収した後、同じ制限酵素であるＳｐｅ ＩとＳｍａ Ｉで処理して開環した組み換えｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩベクターに挿入連結して、βグロビンＭＡＲ因子クローニングを完了した（ｐＭＳ−β−ｇａｌ）。挿入されたβグロビンＭＡＲ因子の方向性を知るために、制限酵素βグロビンＭＡＲ因子に存在し、且つ組み換えｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩベクターに存在する制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで処理して逆方向体であることを確認した。

ｐＣＲ２．１／インターフェロンβＳＡＲおよびｐＣＲ２．１／ＣＳＰ−Ｂ ＭＡＲからＭＡＲ／ＳＡＲ因子を分離して、前記のような方法によりｐＳＶ／ＩまたはｐＳＶ／ＩＩにクローニングした。インターフェロンβＳＡＲは、ＡｐａＩ／ＳｐｅＩを用いてｐＳＶ−β−ｇａｌ／ｖｅｒｓｉｏｎ Ｉにサブクローニングして、ｐＳＶ−β−ｇａｌ／インターフェロンβＳＡＲ（Ｆ）（ｐＩＳ−β−ｇａｌ）をそれぞれ製造した。ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲは、ｐＣＲ２．１／ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲから、Ｓｐｅ ＩとＳｍａ Ｉ制限酵素を含むプライマー（配列番号９、配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った後、Ｓｐｅ Ｉ／Ｓｍａ Ｉ制限酵素で処理して分離し、同じ制限酵素で処理されたｐＳＶ−β−ｇａｌ／ｖｅｒ ＩＩにサブクローニングして、ｐＳＶ−β−ｇａｌ／ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ（ｐＣＳ−β−ｇａｌ）を製造した。

配列番号９：ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ Ｓｅｎｓｅ
５’−ＴＴＴ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＴ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＧＡ−３’

配列番号１０：ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
５’−ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＡＴ ＡＧＣ−３’（３０ｍｅｒ）Ｓｍａ Ｉ

２−３：ガストリン遺伝子の転写終結部位の確保およびｐＳＧ−β−ｇａｌベクターの製造
ガストリン遺伝子の転写終結部位（ＧＴＦ）のうちセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を配列番号１１で合成し、アンチセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）を配列番号１２番で合成して、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）した。結合反応産物を制限酵素ＢａｍＨ ＩとＰｓｔ Ｉで処理した後、予め同じ制限酵素で処理して開環したｐＳＶ−β−ｇａｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）に連結挿入して、ｐＳＧ−β−ｇａｌベクターを完成した。

配列番号１１：Ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
５’−ＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡ ＧＧＡＴＡＡＴＡＴＡ ＴＧＧＴＡＧＧＧＴＴ ＣＡＴＡＧＣＣＡＧＡ ＧＴＡＡＣＣＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴ ＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴ ＴＴＡＴＴＴＴＧＡＧ ＣＴＧＣＡＧ−３’

配列番号１２：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐＳＧ ｖｅｃｔｏｒ
５’−ＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡ ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡ ＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴ ＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧ ＧＣＴＡＴＧＡＡＣＣＣＴＡＣＣＡＴＡＴＡ ＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡ ＴＣＣＧＣＴ−３’

２−４：ｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターの製造
βグロビンＭＡＲリバースプライマーとＳＰＡ−ＧＴＦを同時に適用したベクターを重合酵素連鎖反応法（ＰＣＲ）により製造した。ｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターを製造するために、実施例２−２のｐＭＳ−β−ｇａｌと実施例２−３のｐＳＧ−β−ｇａｌを鋳型とし、３セットの重合酵素連鎖反応を実施した後、反応産物を特定の制限酵素で処理して連結することで、ｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターを完成した。

（１）βグロビンＭＡＲ因子の重合酵素連鎖反応
ｐＭＳ−β−ｇａｌを鋳型とし、センスプライマーＭＬ１（配列番号１３）とアンチセンスプライマーＭＲ１（配列番号１４）を用いてＰＣＲを実施した。得られた反応産物を制限酵素Ｓａｃ ＩＩとＣｌａ Ｉで処理して切断した後、予め同じ制限酵素で処理して開環したｐＭＳ−β−ｇａｌベクターに連結挿入して一段階のサブクローニングを完了し、中間ベクター産物であるｐＭＳ−β−ｇａｌ／ｓｃベクターを作製した。

配列番号１３：ＭＬ１ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ ＭＡＲ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐＭＳ ｖｅｃｔｏｒ
５’−ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＣ ＣＣＧＧＧＣＣＴＣＣ ＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧ ＧＧＧＡＣＴ−３’

配列番号１４：ＭＲ１ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ ｇｌｏｂｉｎ ＭＡＲ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐＭＳ ｖｅｃｔｏｒ
５’−ＴＴＧＧＧＧＣＣＣＡ ＴＣＧＡＴＴＴＴＴＣ ＣＴＣＴＴＴＡＧＧＴ ＴＣＴＣ−３’

（２）マルチクローニングサイトおよび転写終結部位を含む重合酵素連鎖反応
センスプライマーＴＬ１（配列番号１５）とアンチセンスプライマーＴＲ１（配列番号１６）を用いてｐＳＧ−β−ｇａｌベクターのガストリン転写終結部位のＰＣＲを行った。反応産物を制限酵素処理することなく直接クローニングできるように作製されたＴＡクローニングベクターの一種であるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（米国のＰｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングを実施し、ベクター作製中間産物であるｐＧＥＭ−Ｔ／ＭＣＳｐ（Ａ）ベクターを作製した。

配列番号１５：ＴＬ１ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｎ ｐＳＧ ｖｅｃｔｏｒ
５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴ ＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡ ＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴ ＴＧＣＡＧＣＴＴＡ−３’

配列番号１６：ＴＲ１ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｎ ｐＳＧ ｖｅｃｔｏｒ
５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＴ ＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣ−３’

（３）ＳＶ４０プロモータとマルチクローニングサイト部分の重合酵素連鎖反応
センスプライマーＰＬ１（配列番号１７）とＰＲ１（配列番号１８）を用いてＳＶ４０プロモータとマルチクローニングサイト部分のＰＣＲを行った。反応産物を制限酵素Ａｐａ ＩとＢｇｌ ＩＩで処理した後、予め同じ制限酵素で処理して開環した前記で作製されたベクターｐＧＥＭ−Ｔ／ＭＣＳｐ（Ａ）ベクターに連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ／ＳＶＭＣＳｐ（Ａ）ベクターを中間産物として作製した。

配列番号１７：ＰＬ１ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｆｕｓｉｎｇ ＳＶ４０ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ
５’−ＣＣＧＧＧＣＣＣＡＴ ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴ ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＣ ＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧ ＣＣＴＧＡＡ−３’

配列番号１８：ＰＲ１ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｆｕｓｉｎｇ ＳＶ４０ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ
５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣ ＧＧＣＣＧＣＴＡＧＣ ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧ ＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡ−３’

（４）ｐＭＳベクターおよびｐＭＳＧベクターの作製
（３）で作製したｐＧＥＭ−Ｔ／ＳＶＭＣＳｐ（Ａ）ベクターを制限酵素Ｃｌａ ＩとＢａｍＨ Ｉで処理して、ＳＶ４０プロモータ、マルチクローニングサイトおよびＳＶ４０転写終結部位からなるＤＮＡ断片を分離精製した後、予め同じ制限酵素で処理して開環した（１）で作製したｐＭＳ−β−ｇａｌ／ｓｃベクターに挿入し、ｐＭＳベクターを完成した。ｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターを作製するために、前記で作製したｐＳＧ−β−ｇａｌベクターを制限酵素ＢａｍＨ ＩとＳｃａ Ｉで処理して、ガストリンのＧＴＦ塩基配列を有する９５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した後、予め同じ制限酵素で処理して開環させたｐＭＳベクターに連結挿入し、ｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターを完成した。

２−５：ｐＳＧベクターの作製
転写終結因子の３’末端にＭＡＲ／ＳＡＲ因子を挿入するためにｐＳＧベクターを作製した。ｐＭ（Ｒ）ＳＧ発現ベクターからＳｍａ ＩとＣｌａ Ｉで処理してＭＡＲを除去した後、Ｋｌｅｎｏｗ処理を施して、平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）としてからまた接合させてｐＳＧベクターを製造した。

２−６：ｐＭＳＧおよびｐＳＧＭベクターの作製
ｐＭ（Ｒ）ＳＧ発現ベクターから、Ｓａｃ ＩＩとＣｌａ Ｉで処理してＭＡＲ（Ｒ）を分離した後、ＭＡＲ（Ｆ）（ＭＡＲの正方向体）を確保するために、Ｓａｃ ＩＩ／３Ｃｌａ Ｉが含まれるようにプライマー（配列番号１９、及び配列番号２０）を作製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、アガロースゲルから分離した後、同じ制限酵素で処理されたｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターに挿入し、ｐＭ（Ｆ）ＳＧを作製した。

配列番号１９：５’−ＴＴＴＴＣＣＧＣＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＧ−３’
配列番号２０：５’−ＴＴＴＴＡＴＣＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧ−３’

一方、転写終結因子の３’末端にβグロビンＭＡＲ因子を含有した動物細胞発現ベクターであるｐＳＧＭを下記のような過程により作製した。

ｐＳＧＭベクターを作製するために、ＭＡＲの両末端にＮａｒ Ｉ制限酵素を含むようにプライマー（配列番号２１、及び配列番号２２）を作製してｐＭ（Ｒ）ＳＧを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＮａｒ Ｉ制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理されたｐＳＧベクターに挿入して、ｐＳＧＭ（Ｒ）およびｐＳＧＭ（Ｆ）ベクターを製造した。

配列番号２１：β−ｇｌｏｂｉｎ ＭＡＲ Ｓｅｎｓｅ Ｎａｒ Ｉ
５’−ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＣＴ Ａ−３’（３１ｍｅｒ）

配列番号２２：β−ｇｌｏｂｉｎ ＭＡＲ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎａｒ Ｉ
５’−ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＴＴ ＣＴＣ Ｃ−３’（３１ｍｅｒ）

２−７：ｐＩＳＧおよびｐＳＧＩベクターの製造
プロモータの５’末端にインターフェロンβＳＡＲ因子を含有した動物細胞発現ベクターであるｐＩＳＧと、転写終結因子の３’末端にインターフェロンβＳＡＲ因子を含有した動物細胞発現ベクターであるｐＳＧＩを下記のような過程により作製した。

ｐＳＶ−β−ｇａｌ／インターフェロンβＳＡＲ（Ｆ）（ｐＩ（Ｆ）Ｓ−β−ｇａｌ）ベクターからβ−ｇａｌ遺伝子部位を除去し、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、ＳＶ４０転写終結部位およびガストリンのＧＴＦを導入してｐＩ（Ｆ）ＳＧベクターを製造した。

ｐＩ（Ｆ）Ｓ−β−ｇａｌベクターのβ−ｇａｌ遺伝子部位を含むＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｐｓｔ Ｉ断片を除去し、同じ制限酵素で処理されたｐＭ（Ｒ）ＳＧからＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｐｓｔ Ｉ断片を分離した後、挿入してｐＩ（Ｆ）ＳＧを製造した。

ｐＩ（Ｆ）ＳＧベクターは、ＥｃｏＲ Ｉ制限酵素で処理した後、インターフェロンβＳＡＲ因子をアガロースゲルから分離し、同じ制限酵素で処理されたｐＩ（Ｆ）ＳＧベクターにまた挿入した後、制限酵素地図（Ｅｎｚｙｍｅ ｍａｐｐｉｎｇ）によりｐＩ（Ｒ）ＳＧベクターを製造した。ｐＳＧＩベクターを製造するために、Ｎａｒ Ｉ制限酵素配列を含むｌｉｎｋｅｒ（配列番号２３）をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙに挿入し、ｐＩＳＧベクターから、ＳＡＲ因子をＥｃｏＲ Ｉ制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を分離した後、変形されたＴベクターに挿入した。またＮａｒ Ｉ制限酵素で切断した後、同じ制限酵素で処理されたｐＳＧベクターに挿入して、ｐＳＧＩ（Ｆ）およびｐＳＧ（Ｒ）ベクターを作製した。

配列番号２３：Ｌｉｎｋｅｒ
５’−ＧＧＣ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＣＧＣ Ｃ−３’

２−８：ｐＣＳＧおよびｐＳＧＣベクターの製造
プロモータの５’末端にＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を含有した動物細胞発現ベクターであるｐＣＳＧと、転写終結因子の３’末端にＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を含有した動物細胞発現ベクターであるｐＳＧＣを下記のような過程により作製した。

ｐＳＶ−β−ｇａｌ／ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ（Ｆ）（ｐＣＳ−β−ｇａｌ）を鋳型とし、Ｃｌａ ＩとＳｍａ Ｉ制限酵素を含むプライマー（配列番号２４、及び配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った後、Ｃｌａ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ制限酵素で処理してＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ ＤＮＡ断片を得た。ｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターをＣｌａ Ｉ、及びＳｍａ Ｉ制限酵素で処理してＭＡＲを除去した後、同じ制限酵素で処理して確保されたＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲを挿入し、ｐＣ（Ｒ）ＳＧ ｖｅｃｔｏｒを作製した。

配列番号２４：ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ Ｓｅｎｓｅ Ｃｌａ Ｉ
５’−ＡＡＡ ＡＡＴ ＣＧＡ ＴＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＡＣ ＧＣＣ ＡＡＧ−３’（３０ｍｅｒ）

配列番号１０：ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｍａ Ｉ
５’−ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＡＴ ＡＧＣ−３’（３０ｍｅｒ）

ｐＣ（Ｒ）ＳＧベクターからＳａｃ ＩＩ制限酵素で処理されたＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子は、同じ制限酵素で処理されたｐＳＧベクターにまた挿入して、ｐＣ（Ｆ）ＳＧベクターを作製した。

ｐＳＧＣベクターを作製するために、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲの両末端にＮａｒ Ｉ制限酵素を含むようにプライマー（配列番号２５、配列番号２６）を作製して、ｐＣ（Ｆ）ＳＧを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、Ｎａｒ Ｉ制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理されたｐＳＧベクターに挿入して、ｐＳＧＣ（Ｆ）およびｐＳＧＣ（Ｒ）ベクターを作製した。

配列番号２５：ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ Ｓｅｎｓｅ Ｎａｒ Ｉ
５’−ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＡＡ ＡＣＡ ＡＣＴ ＣＡＡ ＴＡＧ Ｃ−３’（３１ｍｅｒ）

配列番号２６：ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎａｒ Ｉ
５’−ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＡＣ ＧＣＣ ＡＡＧ−３’（３０ｍｅｒ）

２−９：ｐＭＭＳＧ、ｐＭＳＧＭ、ｐＭＳＧＣおよびｐＭＳＧＩベクターの製造
プロモータの５’末端にβグロビンＭＡＲ因子を２コピー含有した動物細胞発現ベクターであるｐＭＭＳＧと、プロモータの５’末端および転写終結因子の３’末端にそれぞれβグロビンＭＡＲ因子を１コピーずつ含有した動物細胞発現ベクターであるｐＭＳＧＭを下記のような過程により作製した。

ｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターを鋳型とし、ＭＡＲの両末端にＮａｒ ＩとＣｌａ Ｉ制限酵素を含むプライマー（配列番号２１、配列番号２７）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物は、Ｎａｒ ＩとＣｌａ Ｉ制限酵素で処理し、Ｃｌａ Ｉ制限酵素で処理されたｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターに挿入して、ｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ＳＧベクターを製造した。

配列番号２１：β−ｇｌｏｂｉｎ ＭＡＲ Ｓｅｎｓｅ Ｎａｒ Ｉ
５’−ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＴＡ ＧＣＴ ＧＧＧ ＡＣＴ Ａ−３’（３１ｍｅｒ）

配列番号２７：β−ｇｌｏｂｉｎ ＭＡＲ Ｃｌａ Ｉ
５’−ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＴＡＧ ＧＴＴ ＣＴＣ Ｃ−３’（３１ｍｅｒ）

ｐＭ（Ｒ）ＳＧＭ、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣおよびｐＭ（Ｒ）ＳＧＩベクターを製造するために、ｐＳＧＭ（Ｆ）、ｐＳＧＣ（Ｆ）、ｐＳＧＩ（Ｆ）ベクターをＮａｒ Ｉ制限酵素で処理して、βグロビンＭＡＲ、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子またはインターフェロンβＳＡＲ因子をそれぞれ分離し、同じ制限酵素で処理されたｐＭ（Ｒ）ＳＧに挿入して、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｆ）およびｐＭ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｒ）ベクターを製造した。

２−１０：ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ、及びｐＩ（Ｒ）ＳＧＭベクターの製造
プロモータの５’末端にインターフェロンβＳＡＲ因子１コピーを、転写終結因子の３’末端にβグロビンＭＡＲ、ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲおよびインターフェロンβＳＡＲ因子１コピーを含有した動物細胞発現ベクターは、下記のような過程により作製した。

ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ、及びｐＩ（Ｒ）ＳＧＭベクターを製造するために、ｐＳＧＩ（Ｆ）、ｐＳＧＣ（Ｆ）およびｐＳＧＭ（Ｆ）ベクターから、Ｎａｒ Ｉ制限酵素で処理して、ＭＡＲ／ＳＡＲ因子をそれぞれ分離した。分離精製されたＭＡＲ／ＳＡＲ因子は、Ｎａｒ Ｉ制限酵素で処理されたｐＩ（Ｒ）ＳＧベクターに挿入して、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｒ）およびｐＩ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｆ）ベクターを製造した。

２−１１：ｐＣＣＳＧ、ｐＣＳＧＩ、ｐＣＳＧＣ、およびｐＣＳＧＭベクターの製造
プロモータの５’末端にＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を２コピー含有した動物細胞発現ベクターであるｐＣＣＳＧは、下記のような過程により作製した。

ＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を含んでいるｐＣ（Ｆ）ＳＧベクターは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素で処理して分離した後、セルフライゲーション（ｓｅｌｆ ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた。また、Ｎｈｅ ＩおよびＳｐｅ Ｉ制限酵素で処理してＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を分離精製した後、Ｓｐｅ Ｉ制限酵素で処理されたｐＣ（Ｆ）ＳＧベクターに挿入して、ｐＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＳＧベクターを製造した。

ｐＣ（Ｆ）ＳＧＩ、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＣ、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭベクターを製造するために、ｐＳＧＩ（Ｆ）、ｐＳＧＣ（Ｆ）およびｐＳＧＭ（Ｆ）ベクターから、Ｎａｒ Ｉ制限酵素で処理して、ＭＡＲ／ＳＡＲ因子をそれぞれ分離した。分離精製されたＭＡＲ／ＳＡＲ因子は、Ｎａｒ Ｉ制限酵素で処理されたｐＣ（Ｆ）ＳＧベクターに挿入して、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）およびｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｆ）ベクターを製造した。

２−１２：マウスＥＦ１αプロモータおよびその変異体を含む発現ベクターの製造
マウスＥＦ１αプロモータは、ＤＮＡ分離キット（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｍｏｕｓｅ ｙｏｌｋ ｓａｃ ｔｉｓｓｕｅから確保されたゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）から分離した。

Ｍａｘｉｍｅ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ（ｉ−ｐｆｕ）（Ｉｎｔｒｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌの各プライマー（配列番号２８、及び配列番号２９）および水を総２０μＬになるように添加して重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。反応条件は、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）で、最初９４℃で５分から、９４℃で３０秒、５６℃で１分、７２℃で３分間の重合反応につながる過程を２５サイクル行い、最後に７２℃で５分間重合反応を行って、分離キット（ＧｅｎｅＡｌｌ^Ｒ Ｅｘｐｉｎ（商標） ＰＣＲ ＳＶ、Ｇｅｎｅａｌｌ）を用いて分離精製した。

配列番号２８：ｍＥＦ１α−Ｆ
５’−ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＣＧＧ ＡＧＴ ＡＡＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＡＧ−３

配列番号２９：ｍＥＦ１α−Ｒ
５’−ＴＴＴ ＴＧＣ ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＣＡＣ−３’

ｐＭ（Ｒ）ＳＧ発現ベクターから、まずＣｌａＩ、及びＮｈｅＩを用いてＳＶ４０プロモータを除去した後、同じ制限酵素で処理されたマウスＥＦ１αプロモータを挿入し、ｐＭｍＥＧ発現ベクターを製造した。

マウスＥＦ１プロモータのＴＡＴＡ ｂｏｘ塩基配列であるＴＡＴＡＴＡＡの５番目に位置したチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）で置換するために、下記のような置換された塩基配列を含むＰＣＲプライマーを作製して、１塩基対の変異（ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導した（Ｊａｅｇｅｒ Ｅ．，１９９７）。

ｐＭｍＥＧ発現ベクターを鋳型とし、１番チューブに１番および３番プライマー（配列番号３０、配列番号３２）、２番チューブには２番および４番プライマー（配列番号３１、配列番号３３）をそれぞれ混合して１次ＰＣＲを行い、二つのチューブからのそれぞれの産物を精製した後、またその産物を混合してこれを鋳型とし、１番および４番プライマーを用いて２次ＰＣＲを同じ条件で行った。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩ、ＳｐｅＩで処理した後、分離キットを用いてマウスＥＦ１αプロモータ変異体（ｍＥＦ１α（ＴＡ））を確保した。ｐＭｍＥＧ発現ベクターは、ＫｐｎＩ、及びＳｐｅＩで処理してマウスＥＦ１αプロモータを除去した後、同じ制限酵素で処理されたマウスＥＦ１αプロモータ変異体（配列番号３４）を挿入し、ｐＭｍＥＧ（ＴＡ）を作製した。

配列番号３０：ｍＥＦ−ｔａｔａ−１
５’−ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＣＧ ＴＣＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＡＣ−３’

配列番号３１：ｍＥＦ−ｔａｔａ−２
５’−ＧＡＡ ＣＧＧ ＴＡＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＴＣ ＧＣＣ ＴＴＧ−３’

配列番号３２：ｍＥＦ−ｔａｔａ−３
５’−ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＡＣ ＴＧＣ ＣＧＣ ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＴＡ ＣＣＧ ＴＴＣ−３’

配列番号３３：ｍＥＦ−ｔａｔａ−４
５’−ＧＣＴ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＣＡＡ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＡＡ ＴＴＣ−３’

２−１３：ｐｍＥＧ発現ベクターの製造
ｐＣ（Ｒ）ＳＧベクターをＳａｃ Ｉ制限酵素で処理してＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲを除去した後、セルフライゲーション（Ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、またＣｌａ ＩおよびＮｈｅ Ｉ制限酵素で処理してｐＧを製造した。ｐＭｍＥＧベクターをＣｌａ ＩおよびＮｈｅ Ｉ制限酵素で処理してマウスＥＦ１α変異体を分離した後、同じ制限酵素で処理されたｐＧに挿入し、ｐｍＥＧベクターを製造した。

２−１４：ｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）／ｐＭ（Ｒ）ｍＥＧＣ（Ｆ）／ｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ｍＥＧ発現ベクターの製造
発現効能の高いＭＡＲ／ＳＡＲを２コピー含む発現ベクターにマウスＥＦ１αプロモータ変異体を挿入し、下記のように発現ベクターを製造した。

ｐＭｍＥＧ（ＴＡ）発現ベクターをＣｌａ ＩおよびＮｈｅ Ｉ制限酵素で処理してマウスＥＦ１αプロモータ変異体を分離し、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、及びｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ＳＧ発現ベクターを同じ制限酵素で処理してＳＶ４０プロモータを除去した後、分離されたマウスＥＦ１αプロモータ変異体を挿入して、図２の開裂地図を有するｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）、図３の開裂地図を有するｐＭ（Ｒ）ｍＥＧＣ（Ｆ）、図４の開裂地図を有するｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ｍＥＧ発現ベクターを製造した。

ここで、製造された前記ｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）ベクター（配列番号３５）の情報は、下記のとおりである。

≪実施例３：形質転換された細胞株の作製≫
３−１：懸垂培養宿主細胞株を用いた形質導入
ＤＨＦＲ遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞株ＤＧ４４（Ｄｒ．ｃｈａｓｉｎ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、１０％の血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が添加されたＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で培養した。２×１０^５個の細胞を培地２ｍＬとともに６ウェルプレートに接種し、形質導入の過程まで３７℃、５％のＣＯ_２培養器で一晩培養した。

形質導入は、リポソーム法により行った。商用ベクターであるｐＳＰ７２ベクターにＤＨＦＲ遺伝子を導入したｐＤＣＨ１Ｐベクターをそれぞれの試験用ベクターとともに１００：１のモル比で同時に形質導入した。ベクター各２μｇを脂肪界面活性剤（ｆａｔ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の一種であるＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（ＭＥＲＣＫ、ドイツ）および無血清ＭＥＭ培地と混合して、常温で４５分間反応させた後、洗浄した細胞に培地とともに添加して６時間培養し、反応液を除去した。ＤＨＦＲ遺伝子を用いた形質転換細胞株の選別の際、ヌクレオシドが含まれていないＭＥＭ培地で２週間培養して初期適応細胞を確保した後、連続して１０ｎＭと１００ｎＭ ＭＴＸに適応させて、それぞれ安定発現株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を確保した。

３−２：懸濁培養宿主細胞株を用いた形質導入
懸濁培養に適応されたＣＨＯ ＤＧ４４宿主細胞株は、商業用の無血清培地で継代培養した。形質導入の前日に継代培養を行い、ｐＤＣＨ１Ｐベクターとそれぞれの試験用ベクターを電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって形質導入した。ＤＨＦＲ遺伝子を用いた形質転換細胞株の選別は、ヌクレオシドが含まれていない商業用の無血清培地で２週間培養して初期適応細胞を確保し、連続してＭＴＸに適応させ、それぞれ安定発現株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を確保した。

≪実施例４：実験例：発現力価確認実験≫
４−１：組み換えＶＥＧＦタンパク質を発現する発現ベクターの作製
前記でｐＴ７ｂｌｕｅ、ｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングされた組み換えタンパク質遺伝子を確保した後、前記実施例２で作製されたそれぞれのベクターは組み換えタンパク質遺伝子と同じ制限酵素で切断してから挿入して発現ベクターを作製した。

実施例２で作製されたベクターの遺伝子の発現に対する有効性を検証するために、ＶＥＧＦ（ｈｕｍａｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）の遺伝子をセンスプライマー（配列番号３６）とアンチセンスプライマー（配列番号３７）を用いてＰＣＲした。ＰＣＲ産物は、Ｎｈｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理してＶＥＧＦ遺伝子を確保し、実施例で作製されたベクターを同じ制限酵素で切断してから挿入して発現ベクターを作製した。

配列番号３６：ｖｅｇｆ−５
５’−ＣＴＡ ＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧ−３’

配列番号３７：ｖｅｇｆ−３
５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＴＧＴＣＡＣ−３’

４−２：組み換え抗体タンパク質を発現する発現ベクターの作製
実施例で作製されたベクターの遺伝子の発現に対する有効性を検証するために、組み換え抗ＣＤ２０抗体遺伝子の発現ベクターを作製した。

保有中の組み換え抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）遺伝子は、Ｂｇｌ ＩＩおよびＸｈｏ Ｉ制限酵素で処理し、軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）は、Ｎｈｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉでそれぞれ処理した後、同じ制限酵素で処理された実施例のベクターに挿入して発現ベクターを作製した。

４−３：形質転換された懸垂培養細胞株の確立
前記発現ベクターをＣＨＯ ＤＧ４４に導入した。２×１０^５ｃｅｌｌを６ウェルプレートに投入して３７℃で５％のＣＯ_２で２４時間培養した後、前記発現ベクター２μｇとＤＨＦＲミニ遺伝子を１００：１の割合で混合した後、リポフェクタミンまたはＤｏｓｐｅｒなどの脂質を用いた方法によりＣＨＯ細胞にともに導入した。導入してから約６時後、培養液を成長培地に変更し、また４８時間培養した。

前記形質転換された細胞株は、細胞選別剤であるＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を細胞培養選別培地（熱処理および透析されたＦＢＳを１０％含むヌクレオシドのないＭＥＭ−α培地）に、０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭの順に順次増加させた選別培地で培養することで、各ＭＴＸ濃度に適応して健康に育つように各濃度段階で２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２ｍＬ）に接種して４日培養した後、培養液を回収してＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ２９３）を用いて吸光度を分析した。

ｐＩ（Ｆ）ＳＧ、ｐＩ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＩ（Ｆ）、ｐＳＧＩ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧ、ｐＣ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＣ（Ｆ）、ｐＳＧＣ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧ、ｐＭ（Ｆ）ＳＧ、ｐＳＧＭ（Ｆ）、及びｐＳＧＭ（Ｒ）ベクターについてＶＥＧＦ生産量を、吸光度を用いて測定した結果は、図５のとおりである。

４−４：形質転換された懸濁培養細胞株の確立およびＶＥＧＦ生産性の測定
前記発現ベクターを懸濁培養に適応されたＣＨＯ ＤＧ４４に導入した。５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でフラスコ培養容器に投入して３７℃で５％のＣＯ_２で２４時間振とう培養した後、前記ＶＥＧＦ発現ベクターとｐＤＣＨ１Ｐ発現ベクターを１００：１の割合で混合した後、前記穿孔法でＣＨＯ細胞にともに導入した。導入してから約３日後、培養液を選別培地に変更し、更に２〜３週間培養した。

前記形質転換された細胞株は、細胞選別剤であるＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を細胞培養選別培地に添加して培養し、各段階で適応が完了した細胞は、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２ｍＬ）で６ウェルプレートに接種して４日間培養した後、培養液を回収して、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＤＹ２９３）を用いて吸光度を分析した。

まず、ｐＩ（Ｆ）ＳＧ、ｐＩ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＩ（Ｆ）、ｐＳＧＩ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧ、ｐＣ（Ｒ）ＳＧ、ｐＳＧＣ（Ｆ）、ｐＳＧＣ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧ、ｐＭ（Ｆ）ＳＧ、ｐＳＧＭ（Ｆ）、ｐＳＧＭ（Ｒ）ベクターについてＶＥＧＦ生産量を吸光度を用いて測定し（図６）、実施例４−３の図５の結果と比較し、２コピー以上のＭＡＲ／ＳＡＲ組み合わせを構成する因子を選別した。これにより、プロモータの上端にはＩ（Ｒ）、Ｃ（Ｆ）およびＭ（Ｒ）を選別し、転写終結因子の下端にはＭＡＲおよびＳＡＲ因子の正方向体および逆方向体の両方を含むように組み合わせた。

次に、前記選別された組み合わせにより、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＩ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＣ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＳＧ、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｆ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＩ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｒ）、およびｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ＳＧベクターについてＶＥＧＦ生産量を吸光度を用いて測定した結果、図７に示されたように、ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、およびｐＭ（Ｒ）ＳＧＭ（Ｒ）が他のベクターより著しい高い水準の生産性を示すことが分かった。すなわち、ＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子をともに組み合わせた場合、高い標的タンパク質の発現を示すことが確認できた。特に、ＭＡＲ因子を２個有するｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ＳＧよりｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）が極めて高い発現量を有することが分かった。これは、２個のＭＡＲ因子を含むことよりＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子を組み合わせることが、さらに効果的であることを示し、このような組み合わせにより産業的採算性を有する水準のタンパク質の生産が可能になったことを意味する。

また、前記選別された３種のベクター（ｐＣ（Ｆ）ＳＧＭ（Ｒ）、ｐＭ（Ｒ）ＳＧＣ（Ｆ）、およびｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ＳＧ）についてＶＥＧＦ生産量をＥＬＩＳＡ法で測定し（図８）、これらのＳＶ４０プロモータをｍＥＦ１αプロモータ変異体で置換した実施例２−１４の図２の開裂地図を有するｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）（配列番号３５）、図３の開裂地図を有するｐＭ（Ｒ）ｍＥＧＣ（Ｆ）、図４の開裂地図を有するｐＭ（Ｒ）Ｍ（Ｒ）ｍＥＧ発現ベクターについて、ＶＥＧＦ生産量を吸光度を用いて測定した結果（図９）、図８および図９に示されたように、ｍＥＦ１プロモータ変異体で置換した後、３種のベクターがいずれもＶＥＧＦ生産性が５倍以上増加したことが分かり、特に、ｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）ベクターの生産性は、２０倍以上増加した。

このような実験結果は、ＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子の組み合わせにマウスｍＥＦ１プロモータ変異体を適用させることによるシナジー効果として、極めて著しい効果の上昇をもたらすことを示す。

４−５：組み換え抗体タンパク質生産性の測定
一方、３種のベクターについて、実施例４−２の方法にしたがって組み換え抗体タンパク質のための発現ベクターを作製した後、実施例４−３および４−４の方法にしたがって抗体生産細胞株は同じ方法で形質転換させた後、選別培地で２〜３週間培養した。形質転換された細胞株は、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２ｍＬ）で６ウェルプレートに接種して６日間培養した後、培養液を回収してＥＬＩＳＡキット（ＰａｎＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，ＰＧＫ１００２）を用いて抗体発現率を分析した。

結果、図１０に示されたように、ｍＥＦ１プロモータ変異体を用いた場合、３種のベクターのいずれも抗体生産性が、ＳＶ４０プロモータを用いた場合より３倍以上増加し、特に、ｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）ベクターの生産性は、１０倍以上増加した。

このような結果は、ＳＶ４０プロモータを用いる場合においてＭＴＸ増幅後に分析された生産性より、ＳＶ４０プロモータをｍＥＦ１プロモータで置換してＭＴＸ濃度０ｎＭの適応後に分析された生産性が、約２倍高かったため、ＭＴＸ増幅なしに高発現の細胞株の確保が可能になったことを示す。すなわち、本発明に係るＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子の組み合わせにマウスｍＥＦ１αプロモータ変異体を組み合わせることで、従来技術より産業的に採算性のある水準まで生産性が高く向上することが確認できた。

一方、組み換え抗体の生産においてもマウスｍＥＦ１プロモータ変異体を適用する際、ＭＡＲ因子とＳＡＲ因子を組み合わせた場合、２コピーのＭＡＲ因子を用いた場合より生産性が極めて著しく向上したため、このような実験結果は、ＭＡＲ因子およびＳＡＲ因子の組み合わせにマウスｍＥＦ１プロモータ変異体を適用することで、シナジー効果が生じることを示す。

４−６：マウスＥＦ１αプロモータ変異体の効果の確認
実施例２−１２で作製したマウスＥＦ１αプロモータの変異体の効率をテストするために、ヒトＥＦ１αプロモータを挿入したｐＭｈＥＧベクターおよびＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）ＥＦ１αプロモータを挿入したｐＭｃＥＧベクターをさらに作製した後、マウスＥＦ１αプロモータおよび前記実施例２−１２の変異体と比較した。

まず、ｐＭｈＥＧベクターを次のように作製した。ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ｖｅｃｔｏｒのヒトＥＦ１プロモ−タ部位を下記の配列番号３８および３９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。

配列番号３８：５’−ＴＣＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＡＧ ＴＴ ＣＧＴ ＧＡＧ Ｇ−３’

配列番号３９：５’−ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＴＧ ＴＴＣ ＡＣＧ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＡＴＧ−３’

次に、ＰＣＲ産物をＣｌａＩ、及びＮｈｅＩ制限酵素で処理して１％のアガロースゲルから分離精製した後、同じ制限酵素で処理されたｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターに挿入し、ｐＭｈＥＧを作製した。

なお、ｐＭｃＥＧベクターを次のように作製した。継代培養中のＣＨＯ ＤＧ４４ ｃｅｌｌをマイクロチューブに１×１０^６ｃｅｌｌ投入して３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して細胞を確保し、ＤＮＥＡＳＹ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＣＨＯ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを準備した後、下記の配列番号４０および４１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＨＯ ＥＦ１ プロモ−タを取得した（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ１８８３９３）。

配列番号４０：ｃｈＥＦ１Ａ−Ｆ
５’−ＴＡＴ ＣＧＡ ＴＡＧ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＡＧ ＧＡＡ ＧＧＧ ＴＡＧ−３’

配列番号４１：ｃｈＥＦ１Ａ−Ｒ
５’−ＴＧＣ ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＧＧ ＴＧＧ ＴＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＣＡＣ−３’

ＰＣＲ産物をＣｌａＩ、及びＮｈｅＩ制限酵素で処理して１％のアガロースゲルから分離精製した後、同じ制限酵素で処理されたｐＭ（Ｒ）ＳＧベクターに挿入し、ｐＭｃＥＧを作製した。

次に、実施例２−４のｐＭ（Ｒ）ＳＧ、実施例２−１２のｐＭｍＥＧおよびｐＭｍＥＧ（ＴＡ）と前記ｐＭｈＥＧベクターおよびｐＭｃＥＧベクターを実施例４−５と同じ方法により組み換え抗体を生産した。

結果、図１１に示されたように、マウスＥＦ１αプロモータを用いた場合、ヒトＥＦ１αプロモータやＣＨＯ ＥＦ１αプロモータを用いた場合より高い生産性を示し、配列番号３４のマウスＥＦ１αプロモータを用いた場合には、ＳＶ４０プロモータを用いた場合およびマウスＥＦ１αプロモータを用いた場合などより非常に著しい生産性の向上をもたらすことが確認できた。

Claims (22)

1. 作動可能に連結されたプロモータおよび転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端、前記転写終結因子の３’末端、または前記プロモータの５’末端及び前記転写終結因子の３’末端の両側に、遺伝子発現増加因子であるＭＡＲ因子及びＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクター。
2. 前記ＭＡＲ因子及び前記ＳＡＲ因子は、互いに隣接するか互いにコーディング配列または非コーディング配列によって分離していることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
3. 前記ＭＡＲ因子または前記ＳＡＲ因子は、正方向体または逆方向体を含むことを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
4. 前記ＭＡＲ因子はβグロビンＭＡＲ因子であることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
5. 前記ＭＡＲ因子はＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ２２７５４の塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
6. 前記ＳＡＲ因子はＣＳＰ−ＢＳＡＲ因子またはインターフェロンβＳＡＲ因子であることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
7. 前記ＣＳＰ−ＢＳＡＲ因子はＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ６２７１６の塩基配列を有することを特徴とする請求項６に記載の動物細胞発現ベクター。
8. 前記インターフェロンβＳＡＲ因子はＧｅｎＢａｎｋ番号Ｍ８３１３７の塩基配列を有することを特徴とする請求項６に記載の動物細胞発現ベクター。
9. 前記プロモータは、ＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータまたはＥＦ１−ａｌｐｈａプロモータであることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
10. 前記プロモータは、マウスＥＦ１−ａｌｐｈａプロモータ変異体であることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
11. 前記プロモータ変異体は配列番号３４で表される塩基配列を有することを特徴とする請求項１０に記載の動物細胞発現ベクター。
12. 前記転写終結因子の５’末端にｐｏｌｙ−Ａシグナルが連結されていることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
13. 前記プロモータにより発現が調節される標的遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項１に記載の動物細胞発現ベクター。
14. 作動可能に連結されたプロモータ及び転写終結因子を含む動物細胞発現ベクターであって、前記プロモータの５’末端、前記転写終結因子の３’末端、または前記プロモータの５’末端及び前記転写終結因子の３’末端の両側に、遺伝子発現増加因子であるβグロビンＭＡＲ因子およびＣＳＰ−Ｂ ＳＡＲ因子を含む動物細胞発現ベクターであり、ここで、前記プロモータは、マウスＥＦ１αプロモータ変異体であることを特徴とする動物細胞発現ベクター。
15. 配列番号３５の塩基配列を有するｐＣ（Ｆ）ｍＥＧＭ（Ｒ）ベクターであることを特徴とする請求項１４に記載の動物細胞発現ベクター。
16. 前記プロモータにより発現が調節される標的遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項１４に記載の動物細胞発現ベクター。
17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の動物細胞発現ベクターで形質転換された組み換え微生物。
18. 請求項１３または請求項１６に記載の動物細胞発現ベクターで形質転換された組み換え動物細胞。
19. 前記動物細胞はＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＨＥＫ２９３細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項１８に記載の組み換え動物細胞。
20. 前記動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１９に記載の組み換え動物細胞。
21. 請求項１８の組み換え動物細胞を培養して標的タンパク質を発現させた後、回収することを特徴とする標的タンパク質の生産方法。
22. 配列番号３４で表される塩基配列を有するマウスＥＦ１αプロモータ変異体。