KR20020047006A

KR20020047006A - 인터페론 베타 ｍａｒ 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터

Info

Publication number: KR20020047006A
Application number: KR1020010079227A
Authority: KR
Inventors: 김정도; 황혜연; 김동준; 백광희; 윤엽; 윤재승; 리송알렉스인근
Original assignee: 리송알렉스인근; 주식회사 팬젠
Priority date: 2000-12-15
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2002-06-21
Also published as: KR100529281B1

Abstract

본 발명은 인터페론 베타 MAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터에 관한 것으로, 사람의 인터페론 베타(interferon β) 유전자의 MAR(Nuclear Matrix Attachment Region) 인자를 포함하는 pPGM-1, pGM-2 및 pPGM-3에 관한 것이다. 본 발명의 동물세포 발현벡터는 숙주세포 염색체 내의 삽입 위치에 무관하게 외래 유전자 발현을 증가시키고, 효율적으로 재조합 단백질을 발현한다.

Description

인터페론 베타 ＭＡＲ 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터{EXPRESSION VECTOR FOR ANIMAL CELL CONTAINING NUCLEAR MATRIX ATTACHMENT REGION OF INTERFERON BETA}

본 발명은 인터페론 베타 MAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인터페론 베타 유전자의 MAR 인자(Nuclear Matrix Attachment Region ; 이하 'MAR'라 함)를 포함하는 pPGM-1, pPGM-2 및 pPGM-3에 관한 것이다.

목적 단백질을 대량으로 발현, 수득하여 의약, 산업 등의 용도로 이용하기 위하여 미생물, 식물, 효모, 곤충세포, 동물세포 등의 다양한 발현 시스템이 사용되고 있다. 이 가운데 미생물은 가장 이용하기 쉬운 시스템으로서, 다양한 응용에 적합한 발현 시스템들로 개발되어 상용화되어 있다.

하지만 미생물 발현 시스템은 몇 가지 제한 요인을 가지고 있다. 가장 큰 제한요인은 미생물의 단백질 발현 및 변형기작(당쇄화, 인산화, 아마이드화)이 동물세포와 상이하여 동일 유전자를 미생물 시스템에서 발현시키더라도 발현되는 단백질의 구조나 특성이 본래 단백질과 완전히 동일하지 않다는 것이다. 그로 인하여 미생물 발현시스템을 이용한 재조합 단백질 생성은 합성 후 변형이 거의 일어나지 않아 불활성화 되거나 기능상의 현저한 차이는 없더라도 변형이나 구조에서 부분적인 차이를 가지는 단백질을 발현할 경우가 매우 많은 실정이다. 또한 미생물 발현시스템을 이용한 재조합 단백질의 생산 과정은 미생물의 오염, 미생물의 내독소 오염 등으로 인하여 부차적인 오염물 제거를 수반하여야 하는 번거러움이 따른다.

그에 비해 동물세포 발현시스템은 동물 단백질을 발현시키기에 가장 적합한 시스템임에도 불구하고 미생물 발현시스템에 비해 재조합 단백질의 발현효율이 낮아 생산단가가 높고, 동물세포를 조작 과정이 까다로워 쉽게 산업화되지 못하고 있다. 현재 사용되는 산업용 동물세포주로는 CHO(Chinese Hamster Ovary), BHK(Baby Hamster Kidney), 골수종(myeloma) 등이 있으며, 해당 유전자를 포함하는 발현벡터를 이들 동물세포주에 형질도입하여 목적하는 외래 단백질을 발현시킨다.

동물세포는 당쇄화를 비롯한 다양한 단백질 변형 기작이 유지되고, 배양배지로 단백질을 분비하는 경우 단백질의 수득과 정제 과정이 보다 용이하다. 대부분의 동물세포가 배양 과정에서 혈청 단백질 등의 복합적 첨가물을 반드시 필요로 하는 데 반하여, CHO 세포는 혈청 및 단백질이 첨가되지 않은 배지에서 배양 가능하므로, 재조합 단백질 발현에 가장 적합한 숙주로 활용된다. 또한 CHO 세포는 많은 연구가 선행되어 그 특성이 잘 알려져 있으며, 성장 속도가 빠르고 대량 배양을 위한 현탁 배양(suspension culture)이 가능하다는 이점을 지니고 있다.

일반적으로 동물세포에서 외래 유전자를 발현하고자 할 때 외래 유전자와 선별마크(marker)를 지닌 벡터를 동시에 형질도입(transfection)시킨다. 형질전환된 세포는 선택배지에서 배양하여 선별한다. 하지만 이들의 발현 빈도는 대부분의 경우 매우 낮다. 그 이유 중 하나는 미생물 시스템과 달리 동물세포에서는 이들 외래 유전자가 숙주 세포내 염색체에 삽입되어야 한다는 점이다. 또한 외래유전자가 숙주세포의 염색체에 안정적으로 삽입되어 있는 형질전환체(stable transfectants)를 선별하더라도 그 발현량은 예측하기 어렵다. 이는 각 세포마다 유전자의 삽입 위치가 다르고, 삽입위치에 따라 발현양상이 다르기 때문이다. 따라서 동물세포내 삽입된 외래 유전자의 수와 유전자 발현량은 명확한 상관관계를 가지지 않는다.(Grindleyet al., 1987,Trends Genet. 3, 16-22 ; Kucherlapatiet al., 1984,Crit. Rev. Biochem. 16, 349-381 ; Palmiteret al., 1986,Annu. Rev. Genet. 20, 465-499) 대부분의 경우 동물세포에서의 유전자 발현은 삽입된 주변의 핵산염기에 의하여 억제되어, 안정하게 삽입된 외래 유전자(stably integrated transgenes)라 할지라도 종종 매우 낮은 수준으로 발현된다.(Eissenberget al., 1991,Trends Genet. 7, 335-340; Palmiteret al., 1986,Annu. Rev. Genet. 20, 465-499)

이러한 유전자 위치 특이적 효과로부터 외래유전자의 발현을 보호하기 위한 핵산인자의 이용 가능성이 여러 시스템에서 보고되어 왔다. 상기한 핵산인자로는 완충부위(insulator) 인자 및 핵 격자 구조체 결합 염기 (Nuclear Matrix Attachment Region : 이하 "MAR"라 함) 또는 지지체 접촉부위 (Scaffold Attachment Region : 이하 "SAR"라 함) 등이 활용될 수 있다. 이들의 작용기작은 규명되지 않았지만, 트랜스진(transgene) 구조체에 포함되어 있을 때 삽입 위치와는 무관하게 유전자 발현을 유도하여 그 발현량이 유전자의 카피 수에 따라 결정되는 양상이 나타난다.(McKnight, R.A.et al., 1992,Proc. Natl. Acad. USA.89, 6943 - 6947)

칼로스 등은 인체 아포리포프로테인(apolipoprotein) B 유전자의 MAR 인자를 최소 프로모터 트랜스진 구조체(minimal promoter transgene construct)에 조합하고, 동물세포에서 유전자 발현을 유도하여 그 전사체의 발현을 약 200배 증가시킨 바 있다.(Kaloset al., 1995,Mol. Cell. Biol. 15, 198-207) 이와 유사하게 척추동물세포에서 닭 라이조자임(chicken lysozyme) A 유전자의 MAR 인자와 사람의 인터페론 베타(interferon β) 유전자의 SAR 인자 등도 숙주세포 염색체 내의 삽입 위치에 무관하게 외래 유전자 발현을 증가시키는 성질을 가진 것으로 보고되었다.(Eissenberget al., 1991,Trends Genet. 7, 335-340 ; Klehret al., 1991,Biochemistry30, 1264-1270) 그러나, 이러한 MAR/SAR 인자를 적용하여 CHO 세포주에서 실질적으로 단백질 생산을 증가시키려는 시도나 산업적 채산성이 검증된 사례는 아직 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명은 동물세포에서 외래 단백질의 발현효율을 증가시키는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 숙주세포의 삽입 염색체 위치에 관계없이 다량의 외래 단백질을 발현하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 인터페론 베타 MAR 인자를 포함하여 동물세포에서 외래 단백질 발현 빈도 및 발현량을 증가시키는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 다수 클로닝사이트를 포함하여 외래 유전자의 클로닝에 용이한 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 동물세포에서 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 발현벡터를 제조하기 위하여 pSV-β-gal 벡터를 변형시켜 제조한 벡터의 구조를 도시한 것이고,

도 2는 인터페론 베타 MAR 인자에 의한 양성 세포주 증가를 β-gal 염색법에 의하여 관찰한 것이고,

도 3은 MTX 첨가에 의한 도입 유전자 증폭시 β-gal을 발현하는 양성 세포주의 빈도를 조사한 것이고,

도 4는 G418 선별 배지에서 β-gal 발현 빈도와 발현량을 측정한 것이고,

도 5는 DHFR 선별 배지에서 β-gal 발현 빈도와 발현량을 측정한 것이고,

도 6은 CMV 프로모터 존재시 β-gal 발현 빈도와 발현량을 측정한 것이고,

도 7은 본 발명의 pPGM-1 발현벡터의 구조를 도시한 것이고,

도 8은 본 발명의 pPGM-2 발현벡터의 구조 및 다수 클로닝 부위의 염기서열을 도시한 것이고,

도 9는 본 발명의 pPGM-3 발현벡터의 구조를 도시한 것이고,

도 10은 pPGM-1을 이용하여 제작한 사람의 성장 호르몬 발현 세포주의 발현역가를 웨스턴 블롯에 의하여 분석한 것이고,

도 11은 pPGM-1을 이용하여 제작한 인터페론 베타 발현 세포주의 발현역가를 웨스턴 블롯에 의하여 분석한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인터페론 베타 유전자의 MAR 인자(Nuclear matrix attachment region), 프로모터 및 전사종결인자를 포함하는 동물세포 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 목적 유전자가 도입된 상기의 동물세포 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 동물세포 발현벡터에 외래 유전자를 도입하고, 이를 동물세포에 도입하여 외래 유전자로부터 발현되는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 동물 발현 시스템의 외래 유전자 발현시 위치 특이적 발현억제 현상(position effect)의 극복과 유전자 발현양의 향상을 위하여 최적의 발현벡터를 고안하였다.

본 발명의 동물세포 발현 벡터는 기존의 발현벡터에 유용한 염기서열을 더욱 첨가한 것이다. 상기의 유용 염기서열로, 상업용 동물세포로 흔히 사용되는 CHO(Chinese hamster ovary) 또는 BHK(Baby hamster kidney) 세포 등에서 숙주세포염색체의 위치 특이적 저해 효과로부터 외부 유전자의 발현을 보호하고, 외부 유전자의 발현을 증가시키는 것이다. 바람직한 유용염기서열은 핵 격자 구조체 결합염기(Nuclear Matrix Attachment Region : 이하 "MAR"라 함) 또는 지지체 접촉부위(Scaffold Attachment Region : 이하 "SAR"라 함)이다.

상기 MAR/SAR 인자는 닭 리아소자임 5' MAR (Phi-Van, L. and Stratling, W. H., 1996,Biochemistry35, 10735 - 10742, Gene bank #: X98408), 닭 phi 알파 글로빈 5' MAR (Kraevskii, V.A.et al., 1992,Mol. Biol. 26, 672 - 678, Gene bank #: X64113), CHO DHFR 인트론 MAR (Kas, E. and Chasin, L. A., 1987,J. Mol. Biol. 198, 677 - 692, Gene bank #: X06654), 인간 HPRT 인트론 MAR (Sykes, R. C.et al., 1988,Mol. Gen. Genet. 212, 301 - 309, Gene bank #: X07690), 인간 CSP-B 유전자 플랜킹(flanking) SAR (Hanson, R. D. and Ley, T. J., Gene bank #: M62716), 및 인간 인터페론 베타 유전자 플랜킹 SAR (Mielke, C.et al., 1990,Biochemistry29, 7475 - 7485, Gene bank #: M83137)로 이루어지는 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다.

6 가지의 MAR/SAR 인자를 pSV-β-gal/ver I 또는 pSV-β-gal/ver II에 삽입하여 β-gal 유전자의 발현양상을 조사함으로써 MAR/SAR 인자가 외래 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하였다.

pSV-β-gal/ver I 또는 pSV-β-gal/ver II의 프로모터 상위에 위치하는 6 가지의 MAR/SAR 인자를 각각 삽입하여 시험용 벡터를 완성하였다. 시험용 벡터를 CHO DG44 세포에 도입하여 형질전환주를 제조하였고, β-gal 발현빈도 및 발현양을측정하였다.

인터페론 베타 MAR 인자를 포함하는 재조합 벡터 pSVβ/I는 대조군 pSV-β-gal와 비교하였다. G418 선택배지에서 콜로니 수는 약 3배 증가하였고 β-gal 단백질을 발현하는 양성세포주 발생빈도도 대조군 35 %에 비하여 71 %로 높아짐에 따라, 양성세포주의 수는 6배 증가하였다.

또한 pSVβ/I 형질전환주를 DHFR 선별배지에서 선별한 경우 뉴클레오사이드가 포함되지 않은 초기 선택 배지에서 양성 콜로니가 10배 많이 생성되었다. MTX를 배양배지에 첨가하여 외래 유전자의 증폭을 유도하였을 때 pSVβ/I 형질전환주의 β-gal 양성 콜로니 비율이 전체 콜로니의 90% 이상이었고, 양성 세포수는 대조군인 pSV-β-gal보다 약 7배 증가하였다(도 3).

따라서, 본 발명의 인터페론 베타 MAR 인자는 외래 유전자 및 선별 유전자의 발현 효율을 높여 선별 배지에서 형질전환 세포주의 생장을 크게 증진시키며, 형질전환 세포주를 선택 배지에서 선별하는데 소요되는 기간을 단축시켜 준다.

또한 본 발명은 프로모터 5' 상위에 인터페론 베타 MAR 인자를 포함하는 동물세포 발현벡터들을 제공한다. 상기 동물세포 발현벡터는 pPGM-1, pPGM-2 및 pPGM-3이 바람직하다. 상기 프로모터는 SV40 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하다.

상기 pPGM-1 벡터는 인간 인터페론 베타 유전자의 MAR 인자, SV40 바이러스 프로모터 및 다수 클로닝 부위(MCS)를 포함하는 5409 bp의 벡터로, 다수 클로닝 부위에 외래 유전자를 삽입함으로써 다양한 유전자를 발현할 수 있다. 다수클로닝 부위는 HindIII, NheI, NotI 및 XhoI 절단부위를 포함한다. 상기 pPGM-1 벡터의 염기서열은 서열목록작성기에서 서열번호 1로 작성하였으며, 상기 벡터에 포함된 주요 인자과 그 위치는 표 1 및 도 7에 나타내었다. pPGM-1 벡터는 한국미생물보존센터(Korean Culture Collection of Microorganisms)에 기탁하였으며 해당 기탁번호는 KCCM 10232이다.

서열번호	기능
1 - 413	SV40 바이러스의 초기프로모터와 인핸서
414 - 448	다수클로닝 부위 (MCS)
449 - 584	SV40 바이러스의 small T antigen
1194 - 2054	베타 락타메이즈 (β-lactamase: Amp^R) 유전자
3225 - 5397	인터페론 베타 유전자의 MAR 인자

pPGM-2 벡터는 상기 pPGM-1 벡터의 다수 클로닝 부위를 개조한 것으로, 인터페론 베타 MAR 인자, SV40 프로모터, 다수클로닝 부위를 포함한다. pPGM-2 벡터의 염기서열은 서열번호 2로 작성하였으며, 벡터의 구조는 도 8 및 표 2에 나타내었다. pPGM-2 벡터의 다수 클로닝 부위는 NheI, PmeI, AflII, BamHI, BstXI, EcoRV, BstXI, NotI, XhoI, XbaI, ApaI, PmeI, 및 MluI 절단부위를 포함한다. pPGM-2 벡터는 한국미생물보존센터(Korean Culture Collection of Microorganisms)에 기탁하였으며 해당 기탁번호는 KCCM 10338이다.

서열번호	기능
1 - 413	SV40 프로모터
426 - 445	T7 프로모터
446 - 579	다수클로닝 부위 (MCS)
1331 - 2191	베타 락타메이즈 (β-lactamase: Amp^R) 유전자
3361 - 5534	인터페론 베타 유전자의 MAR 인자

pPGM-3 벡터는 상기 pPGM-1 벡터의 SV40 프로모터를 CMV (Cytomegalovirus) 유래의 프로모터로 치환한 것으로 5601bp로 이루어져 있다. 염기서열은 서열번호 3으로 나타내었고, 구조는 도 9 및 표 3에 도시하였다. pPGM-3 벡터를 한국미생물보존센터(Korean Culture Collection of Microorganisms)에 기탁하며 기탁번호 KCCM 10339을 부여받았다.

서열번호	기능
1 - 611	SV40 프로모터
612-640	다수클로닝 부위 (MCS)
1396-2246	베타 락타메이즈 (β-lactamase: Amp^R) 유전자
3417-5589	인터페론 베타 유전자의 MAR 인자

본 발명의 pPGM-1 벡터, pPGM-2 벡터 및 pPGM-3 벡터는 통상의 벡터에 비하여 외래 단백질을 발현하는 양성세포수, 빈도, 발현량이 모두 우수하다. 따라서, 본 발명의 pPGM-1 벡터, pPGM-2 벡터 및 pPGM-3 벡터는 동물세포에서 외래 단백질을 발현, 생산시키는 용도로 사용가능하며, 효소, 사이토카인 등의 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

또한 본 발명은 인터페론 베타 MAR 인자를 포함하는 벡터에 외래 유전자를 도입하고, 이를 동물세포에 도입하여 제조된 형질전환주를 제공한다. 상기 형질전환주는 선별 마커 또는 MTX 가 첨가된 배지에서 선별된 것이다. 외래 유전자는 재조합 단백질로 발현가능한 모든 종류의 단백질을 암호화하는 유전자이다. 대표적인 것으로는, 인슐린, 사이토카인(인터루킨, 종양괴사인자, 인터페론, 콜로니자극인자, 케모카인 등등), 에리트로포이에틴(erythropoietin) 등이 있다. 형질전환주는 통상의 방법으로 실시가능하다.

또한 본 발명은 인터페론 베타 MAR 인자를 포함하는 벡터에 외래 유전자를 도입하고, 이를 동물세포에 도입하여 외래 유전자로부터 발현되는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 벡터는 pPGM-1(KCCM 10232), pPGM-2(KCCM 10338) 및 pPGM-1(KCCM 10339)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 동물세포는 동물유래 모든 종류의 세포를 의미하며, 가장 바람직하게는 CHO(chinese hamster ovary)이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 1: MAR 또는 SAR 인자의 클로닝

DNA 분리키트(Wizard Genomic DNA purification kit, Promega 미국)를 사용하여 사람 G-2 세포로부터 게놈 핵산(genomic DNA)을 분리하였다. DNA 10ug을ClaI,SmaI,XbaI,XhoI 제한효소로 절단하고, 이후 PCR 과정에 사용하였다. 또한 CHO 세포주, 닭 태아(chickem embryo)에서도 상기와 유사한 과정을 거쳐 PCR에 사용할 DNA를 분리 정제하였다.

상기에서 분리한 게놈 핵산 200 ng을 주형(template)으로 사용하고, 25 pmole의 각 프라이머, 0.5 mM의 dNTP, ExTaq DNA 중합효소(Takara Shuzo Co., Japan)를 첨가하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 각각의 MAR/SAR 인자에 대하여 사용된 프라이머의 염기서열과 PCR로 얻어진 DNA 절편의 크기는 하기 표 4와 같다. 중합효소연쇄반응은 GeneAmp PCR system 9600(Perkin - Elmer Corp, 미국)을 이용하여 실시하였고, PCR 조건은 하기 표 5에 나타내었다.

MSR/SAR 인자	프라이머	서열번호	크기
닭 리아소자임 5' MAR	5'- GGA TCC ATA ATA TAA CTG TA -3'5'- AAG CTT AAA AGA TTG AAG CA -3'	4	1668 bp
		5
닭 phi 알파 글로빈 5' MAR	5'- AAG CTT TTA ACC AAC AAA AA -3'5'- CTG CAG ACC TAA CCT GTC AC -3'	6	619 bp
		7
CHO DHFR 인트론 MAR	5'- TAT ACG TGA ATA GTT TTT CT -3'5'- GAG TTG GAA CTG AGA AGT TC -3'	8	549 bp
		9
인간 HPRT 인트론 MAR	5'- AAG CTT GGT CAA GAA TGC TG -3'5'- GCT GGG CGT GGT GGT GCC TG -3'	10	580 bp
		11
인간 CSP-B 유전자 SAR	5'- GGA TCC CAT TCT CCT TGA TG -3'5'- GAA TTC AAA CAA CTC AAT AG -3'	12	1233 bp
		13
인간 인터페론 베타 SAR	5'- GAA TTC AGC AAG GTC GCC AC -3'5'- TTG TAT CAA CTT TCT ACA AT -3'	14	2174 bp
		15

단계	조 건	주기 수
1	94^oC, 2분	1
2	94^oC, 40초; 65^oC, 40초; 72^oC, 40초	2-31
3	72^oC, 10분	32

상기한 방법으로 닭 리아소자임 5' MAR(Gene bank #: X98408, 이하 "lyso MAR"라 함), 닭 phi 알파 글로빈 5' MAR(Gene bank #: X64113, 이하 "phi-a MAR"라 함), CHO DHFR 인트론 MAR(Gene bank #: X06654, 이하 "DHFR MAR"라 함), 인간 HPRT 인트론 MAR(Gene bank #: X07690, 이하 "HPRT MAR"라 함), 인간 CSP-B 유전자 플랜킹 SAR(Gene bank #: M62716, 이하 "CSP-B MAR"라 함), 및 인간 인터페론 베타유전자 플랜킹 SAR(Gene bank #: M83137, 이하 "인터페론 베타 MAR"라 함) 유전자 단편을 분리하였다.

PCR 산물은 pT7blue(R)(Novagene, 미국) 또는 pCR 2.1(Invitorgen,미국)벡터에 서브클로닝하였다. HPRT MAR, DHFR MAR, lyso MAR는 pT7blue(R) 벡터에 서브클로닝하였으며, phi-a MAR, CSP-B MAR, 인터페론 베타 MAR 는 pCR 2.1 에 서브클로닝하였다.

실시예 2: pSV-β-gal/ver I 및 pSV-β-gal/ver II 벡터의 제조

상기에서 pT7blue(R) 또는 pCR2.1 벡터에 서브클로닝된 다수의 MAR/SAR 인자를 pSV-β-gal('pSVβ'라 함) 벡터의 SV40 프로모터 상위에 효율적으로 클로닝하기 위해 변형된 벡터 pSV-β-gal/ver I 및 pSV-β-gal/ver II를 제작하였다.(도 1)

(1) pSV-β-gal/verI 제조

pSVβ을 주형으로 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머로 PCR을 실시하였고, SV40 프로모터를 포함하는 절편을 수득하였다. 상기 절편은SpeI과HindIII 효소로 처리한 다음, SV40 프로모터를 포함하는 443 bp의 DNA 절편을 진클린 III 키트(Bio 101, 미국)로 정제하였다. 이를SpeI과HindIII 효소로 개환된 pBluescript SK(+) 벡터(Stratagene, 미국)에 서브클로닝하여 pBS/SV40 I을 제조하였다.

pBS/SV40 I는ScaI과HindIII 효소로 잘라서 1240 bp의 DNA 절편을 분리하고, 이를 같은 효소로 처리한 pSVβ에 서브클로닝하여 pSV-β-gal/verI 벡터를 완성하였다.

(2) pSV-β-gal/verII 벡터의 제조

pSVβ을EcoRI과HindIII로 처리하여 420 bp의 절편을 상기와 같은 방법으로 회수한 후, 같은 효소로 개환된 pBluescript SK(+) 벡터에 삽입 연결하여 pBS/SV40 II를 제조하였다.

pBS/SV40 II는 제한효소ScaI과HindIII로 처리하여 SV40 프로모터를 포함하는 단편을 같은 제한효소로 처리된 pSVβ벡터에 삽입 연결함으로써 pSV-β-gal/verII 벡터를 제조하였다.

실시예 3: MAR 인자 및 β-gal 유전자를 포함하는 벡터의 제조

pT7blue(R)/HPRT MAR, pT7blue(R)/DHFR MAR, pT7blue(R)/lyso MAR, pCR 2.1/phi-a MAR, pCR 2.1/CSP-B MAR 및 pCR 2.1/인터페론 베타 MAR에서 MAR 인자를 분리하여 pSVβ/I 또는 pSVβ/II에 클로닝하였다.

pSVβ/I에 phi-a MAR와 HPRT MAR(human HPRT intron MAR)는SpeI/SmaI을 이용하여, 인터페론 베타 MAR와 lyso MAR는ApaI/SpeI를 이용하여 서브클로닝하였다. 제조된 벡터는 pSV-β-gal/phi-a MAR, pSV-β-gal/HPRT MAR, pSV-β-gal/인터페론 베타 MAR(이하 'pSVβI'라 함) 및 pSV-β-gal/lyso MAR 이다.

또한 pSV-β-gal/verII에 DHFR MAR와, CSP-B MAR는BamHI/XbaI을 이용하여 서브클로닝하였다. 제조된 벡터는 각각 pSV-β-gal/DHFR MAR, pSV-β-gal/CSP-B MAR이다.

실시예 4: pCMVβ 및 pCMVβ/I 벡터의 제조

pSVβ/I벡터로부터 MAR 인자를 포함하는SpeI-XhoI 단편을 제거한 다음 다시self-ligation하였다. 이를ApaI과HindIII 처리한 다음 CMV 프로모터 절편을 삽입하여 pCMVβ벡터를 제조하였다. 상기 CMV 프로모터 절편은 pcDNA3.1 벡터에서 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머로 PCR한 것이다. 상기 서열번호 18 및 19은ApaI 또는HindIII 인식서열을 포함한다.

또한 pSVβ/I 벡터를ApaI과HindIII 효소로 처리하고 CMV 프로모터 절편을 이에 삽입하여 pCMVβ/I 벡터를 제조하였다.

즉, pCMVβ는 MAR 인자가 없는 벡터이고, pCMVβ/I은 MAR 인자가 있는 벡터이다.

실시예 5: pSVβ 및 pSVβ/I의 β-gal 유전자 발현 측정

(1) 트랜스펙션

DHFR 유전자가 결손된 CHO 세포주 DG44는 10% 혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 MEM-α배지(α-Minimum Essential Medium, Gibco BRL)에서 배양하였다. 2x10⁵개의 세포를 배지 3 ml과 함께 60 ㎜ 플레이트에 접종하여 형질도입 과정까지 하룻밤 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였다.

형질도입은 리포좀 방법에 따라 수행하였다. 선별 유전자를 가지고 있는 pSV2Neo 또는 pDCH1P 벡터를 각각의 시험용 벡터와 함께 100:1의 몰비로 동시 형질도입하였으며, 대조군으로는 pSVβ벡터를 사용하여 동일한 실험을 수행하였다. 벡터 각 2ug을 지방계면활성제의 일종인 DOSPER(Boehringer Mannheim, 독일), 무혈청 MEM-α배지와 혼합하여 상온에서 45분간 반응시킨 다음, 세척한 세포에 배지와 함께 첨가하여 5시간 배양하고 반응액을 제거하였다. Neo 유전자를 이용한 형질전환주 선별시에는 10 % FBS와 G418 (500ug/ml)이 포함된 MEM-α배지에서 2 주일간 배양하였으며, DHFR 유전자 선별시에는 뉴클레오사이드가 포함되지 않은 MEM-α배지에서 2 주일간 배양하여 β-gal 발현을 분석하였다.

(2) β-gal 발현 양성 세포주의 빈도 측정

β-gal을 발현하는 양성세포를 선별하였다.

100 mm 플레이트에서 배양한 세포를 4 ℃에서 고정액(2% 포름알데하이드와 0.2% 글루타르알데하이드)으로 10분 처리하였다. 1X PBS로 두 번 세척하고, X-gal(1 mg/ml)을 첨가하여 37 ℃에서 반응시켰다.

β-gal 발현 세포는 X-gal을 분해하여 푸른색을 나타내므로 쉽게 식별할 수 있다. Trypsin-EDTA 용액으로 양성세포를 분리한 후, 헤마토사이토미터 (haemacytometer)로 세포수를 측정하였다.

도 2는 pSVβ 또는 pSVβ/I으로 트랜스펙션 후 β-gal을 발현하는 세포를 확인하기 위하여 X-gal을 처리한 사진이다. (a)는 pSVβ로 트랜스펙션된 세포이고, (b)는 pSVβ/I으로 트랜스펙션된 세포이다. 상단의 플레이트사진에서 푸른색을 띠는 양성 세포주가 pSVβ/I 형질전환주에서 현저함을 관찰하였다.

또한 트랜스펙션 후 Neo 유전자 또는 DHFR 유전자를 이용하여 형질전환주를 선별한 다음 β-gal을 발현하는 양성세포를 측정하였다.

표 6은 Neo 선별인자를 이용하여 선별한 DG44/pSVβ 또는 DG44/pSVβ/I의 β-gal 양성세포수를 측정한 것이다. 표 7는 DHFR 선별인자를 이용하여 선별한DG44/pSVβ 또는 DG44/pSVβ/I의 β-gal 양성세포수를 측정한 것이다.

	총 세포수	양성세포수	음성세포수	양성세포빈도(%)
DG44/pSVβ	222	145	77	34.68
DG44/pSVβ/I	659	191	468	71.02

	총 세포수	양성세포수	음성세포수	양성세포빈도(%)
DG44/pSVβ	120	105	15	12.50
DG44/pSVβ/I	350	200	150	42.86

선별인자로 선별하였을 때 형질전환주의 전체 콜로니의 수와 양성 콜로니의 빈도가 동시에 증가하였고, 특히 양성 콜로니의 수가 월등히 증가하였다.

또한 형질전환주(DG44/pSVβ, DG44/pSVβ/I)를 MTX가 첨가된 배지에 적응시켜 유전자 증폭을 유도하였다. MTX 10 nM 및 50 nM에 적응된 형질전환주의 β-gal 발현빈도를 측정하였다. 도 3은 MTX에 적응된 형질전환주의 β-gal 활성도를 측정한 그래프이다. MTX에서 선별된 DG44/pSVβ/I 형질전환주의 90% 이상이 β-gal을 발현하는 것으로 나타났으며, 대조군(pSVβ)에 비하여 7배 많은 양성 콜로니가 생성되었다.

따라서, 인터페론 베타 MAR 인자가 SV40 프로모터의 발현활성을 한층 강화하여 양성세포주의 빈도를 6-10배 증가시켰다. 따라서, 통상의 형질전화주 제조과정에서는 매우 오랜 기간에 걸쳐 형질전환 세포주를 선택 배지에서 선별해 내어야 한다. 하지만 MAR 인자를 사용하여 형질전환 세포주 개발의 소요 기간을 대폭 단축시키는 효과를 가져올 것으로 예상된다. 또한 MAR 인자는 목적 유전자 뿐 아니라 선별 유전자의 발현에도 동시에 영향을 미쳐 결과적으로 선택 배지에서 재조합 세포주의 생장을 크게 증진시킨다.

(3) DG44/pSVβ 및 DG44/pSVβ/I의 β-gal 활성도

상기 β-gal 발현 양성 세포주의 빈도 측정시 사용된 동일한 세포의 β-gal 활성도를 측정하였다.

형질전환주를 48시간 배양하고 1x PBS로 두 번 세척하였다. 1 ml의 STE(0.1 M NaCl, 10 mM Tris-Cl(pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)) 용액을 첨가하여 얼음 위에 놓았다. 스크랩퍼로 세포를 긁어내어 에펜도르프 튜브로 옮겨서 4 ℃, 14000 rpm, 40초간 원심 분리한 후 상등액을 제거하고 100 ul의 0.25 M Tris-Cl(pH 7.5)을 첨가하여 세포와 혼합하였다. 이를 액체 질소에서 얼렸다가 즉시 37 ℃에서 녹이는 과정을 다섯 번 반복하였다. 상기의 분쇄된 세포를 4 ℃ 12000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 새 튜브로 옮겨 분석하였다.

세포 추출액 30 ul, 100×마그네슘 용액(0.1 M MgCl₂, 4.5 M β-mercaptoethanol) 3 ul, 1×ONPG(4 ml/ml in 0.1M sodium phospate (pH 7.5)) 66 ul,0.1 M 소듐포스페이트(pH 7.5) 201 ul를 잘 혼합한 후, 37 ℃에서 노란색으로 변할 때까지 반응을 계속하였다. 1 M Na₂CO₃를 500 ul 첨가한 뒤 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

용액 내의 단백질 양은 bicinchoninic acid (BCA) 방법에 따라 측정하였다. (Smithet al., 1985,Anal. Biochem.150, 76-85)

도 4는 Neo 선별인자를 이용하여 선별한 DG44/pSVβ 또는 DG44/pSVβ/I의β-gal 활성도를 측정한 그래프이다. 도 5는 DHFR 선별인자를 이용하여 선별한 DG44/pSVβ 또는 DG44/pSVβ/I의 β-gal 활성도를 측정한 그래프이다.

MAR 인자가 발현벡터에 존재할 때 β-gal 활성도가 각각 7.5배(도 4) 및 32배(도 5)로 증가하였다. 이는 양성세포의 빈도를 고려하였을 때 양성세포 당 발현된 β-gal 단백질 활성이 크게 증가한 것이다.

실시예 6: pCMVβ 및 pCMVβ/I 의 β-gal 발현측정

실시예 5와 동일한 방법으로 DG44에 pCMVβ 및 pCMVβ/I를 각각 트랜스펙션한 다음 β-gal 양성세포주 및 활성도를 측정하였다.

도 6은 DG44/pCMVβ 및 DG44/pCMVβ/I 의 β-gal 활성도를 나타낸 그래프이고, 표 8은 DG44/pCMVβ 및 DG44/pCMVβ/I의 β-gal 양성세포수를 나타낸 것이다.

	총 세포수	양성세포수	음성세포수	양성세포빈도(%)
DG44/pCMVβ	180	147	33	18.33
DG44/pCMVβ/I	326	79	247	75.77

MAR 인자는 CMV 프로모터하에서도 양성 세포주의 빈도를 18.33 %에서 75.77 %로 증가시켰으며, 전체 콜로니 수는 약 1.8배, 양성 콜로니 수는 약 7.5배 증가시켰다. 따라서 인터페론 베타 MAR 인자의 효과가 SV40 프로모터의 사용에만 국한된 것이 아니며, 본 발명의 MAR 인자가 SV40, CMV 프로모터 및 이를 비롯한 기타 프로모터와의 다양한 조합으로 사용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 7: pPGM-1 벡터의 제조

pSVβ/I 벡터에서 β-gal 유전자 부위를 제거하고, 다수 클로닝 부위(MCS)를도입하여 도 7의 유전자지도를 가지는 pPGM-1 벡터를 제조하였다.

pSVβ/I 벡터의 β-gal 유전자 부위를 포함하는HindIII -BamHI 단편을 제거하고 pMSG(KCCM 10202)의 160 bp의HindIII/BamHI 단편을 삽입하였다. pPGM-1 벡터는 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM 10232를 부여받았다.

실시예 8: pPGM-2 벡터의 제조

pPGM-1 벡터의 다수 클로닝 부위를 보완하여 pPGM-2 벡터를 제조하였다.

pSVβ벡터의HindIII -BamHI 단편을 pMSG(KCCM 10202) 유래의 해당 단편으로 교체하고,EcoRI 효소로 개환하여 인터페론 MAR 인자를 연결하였다. 다시NheI과XhoI 효소를 처리하고 여기에 T7 프로모터 및 다수 클로닝 부위를 포함하는 단편을 삽입하였다. 상기 단편은AvrII 및SalI 제한효소의 인식 서열을 포함하는 PCR 프라이머(서열번호 20 및 서열번호 21)를 사용하여 제작하였다.

도 8은 pPGM-2 벡터의 구조와 다수 클로닝 부위의 염기서열을 나타낸것이며, 상기 벡터를 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM 10338을 부여받았다.

실시예 9: pPGM-3 벡터의 제조

pSVβ벡터의HindIII -BamHI 단편을 pMSG(KCCM 10202) 유래의 해당 단편으로 교체하였다. EcoRI과 NheI을 처리하여 SV40 프로모터를 제거하고 이 부위를 CMV 프로모터로 교체한 다음,EcoRI 효소로 개환하여 인터페론 MAR 인자를 삽입하였다. 상기와 같이 제조된 pPGM-3 발현벡터의 구조는 도 9에 도시하였으며, 해당 기탁번호는 KCCM 10339이다.

실시예 10 : pPGM-1 벡터를 이용한 재조합 단백질 생산

pPGM-1 벡터를 NheI과 XhoI 효소로 처리하여 삽입 유전자를 연결하였다. 상기 유전자는 사람의 성장 호르몬 (Gene Bank #:E01424) 또는 사람의 인터페론 베타 (Gene Bank #:V00534)를 암호화하는 cDNA 이다.

상기와 같이 제조된 발현 벡터를 CHO DG44 세포에 형질도입하고 배지에 첨가된 MTX 농도를 증가시키면서 고발현 형질전환 세포주를 선별하였다. 발현 역가는 도 10 및 11과 같이 웨스턴 블롯에 의하여 측정하였다.

1.08 X 10⁵개의 세포를 12웰 플레이트에 넣고 48 시간 배양한 후 배지를 회수하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 레인 1은 25 ng의 파지티브 대조군 단백질이며 레인 2-5는 선별된 서로 다른 클로니들의 배양액이다. 사람 성장 호르몬의 발현율은 약 20 ㎍/ml/day, 인터페론 베타의 발현율은 약 15 ㎍/ml/day인 것으로 측정되었다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 pPGM-1 벡터, pPGM-2 벡터 및 pPGM-3 벡터는 숙주세포의 주변 염기에 의한 외래 유전자의 발현억제 현상을 개선하고, 발현을 증가시킨다. 또한 본 발명의 발현벡터는 산업적으로 유용한 단백질의 다량 생산에 효과적으로 적용할 수 있으며, 고등동물 본래의 단백질과 동일한 고유의 구조와 기능을 가진 재조합 단백질을 생산할 수 있다.

Claims

(a) 인터페론 베타 유전자의 MAR 인자(Nuclear matrix attachment region);

(b) 프로모터; 및

(c) 전사종결인자;

를 포함하는 동물세포 발현벡터.
제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 SV40 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 동물세포 발현벡터.
제 1항에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 pPGM-1 KCCM 10232인 동물세포 발현벡터.
제 1항에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 pPGM-2 KCCM 10338인 동물세포 발현벡터.
제 1항에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 pPGM-3 KCCM 10339인 동물세포 발현벡터.
목적 유전자가 도입된 제 1항의 동물세포 발현벡터로 형질전환된 세포.
제 6항에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 pPGM-1(KCCM 10232), pPGM-2(KCCM 10338) 및 pPGM-1(KCCM 10339)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 세포.
제 6항에 있어서, 상기 세포는 동물세포 또는 동물 유래세포인 것인 세포.
제 6항에 있어서, 상기 세포는 CHO(chinese hamster ovary)인 것인 세포.
제 1항의 동물세포 발현벡터에 외래 유전자를 도입하고, 이를 동물세포에 도입하여 외래 유전자로부터 발현되는 단백질을 생산하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 동물세포 발현벡터는 pPGM-1(KCCM 10232), pPGM-2(KCCM 10338) 및 pPGM-1(KCCM 10339)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.