JP5270544B2 - 調節核酸配列要素 - Google Patents

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Description

本発明は、TE配列要素といわれているシス作用性核酸配列に関する。このTE配列要素は、好ましくはCHOゲノムに由来する。例えば安定な細胞集団において、それらを発現ベクター中で使用することにより、以前使用された細胞と比較して、望ましい染色体遺伝子座における対象遺伝子の少なくとも2倍の発現が可能となる。
機能的にも薬物動態学的観点からも翻訳後修飾はヒト適合性なので、哺乳動物細胞は複雑な生物医薬品タンパク質の製造に好ましい宿主細胞である。関連する主要な細胞型は、ハイブリドーマ、骨髄腫、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞およびBHK(新生仔ハムスター腎臓)細胞である。宿主細胞は、次第に血清およびタンパク質を含まない製造条件下で培養されるようになった。この理由は、関連する費用の削減、組換えタンパク質の精製における精製の妨害の抑制および病原体(例えばプリオンおよびウイルス)導入の潜在性の抑制である。宿主細胞としてのCHO細胞の使用は次第に普及するようになった。なぜなら、これらの細胞は血清およびタンパク質を含まない培地中での懸濁増殖に適合し、さらに規制機関により安全な産生細胞としてみなされ、認められているからである。
対象の異種遺伝子を発現する安定な哺乳動物細胞株を製造するために、異種遺伝子は一般にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPT)などの選択マーカー遺伝子と共にトランスフェクションにより望ましい細胞株に導入される。単一または別々に同時トランスフェクトしたベクターから出発して、異種遺伝子および選択マーカー遺伝子を宿主細胞内で発現できる。ネオマイシン-ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(NPT遺伝子)を用いる場合、トランスフェクションの2〜3日後、トランスフェクトされた細胞は選択剤、例えばG418を含有する培地に移され、これらの選択条件下で数週間培養される。外因性DNAが組み込まれた出現耐性細胞を単離し、調査して、望ましい遺伝子産物(対象遺伝子)を発現させることができる。
生物医薬品製造のために、高く安定な生産性を有する細胞株が必要とされる。産生細胞のための発現ベクターは、例えば、高い産物発現を可能にするために、強力で通例構成的に発現されるプロモーターおよびエンハンサー、例えばCMVエンハンサーおよびプロモーターを備えている。産物の発現は、可能な限りの期間にわたって保障されなければならないので、ゲノムに産物遺伝子が安定に組み込まれた細胞が選択される。このことは、例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPT)およびジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)などの選択マーカーを用いてなされる。
宿主細胞ゲノムへの発現ベクター組み込の偶然性により、望ましい遺伝子産物を異なるレベルで発現する細胞が得られるが、これはその発現が単に既往のプロモーターまたはプロモーター/エンハンサーの組み合わせの強度によって決定されるわけではないからである。組み込み部位に存在するクロマチン構造は、マイナス方向にもプラス方向にも影響を与えうる。従って、次第にクロマチンレベルでの発現にプラス方向に影響を与えるシス作用性配列要素が発現ベクターに組み込まれるようになった。これらは、例えば、β-グロビン遺伝(Liら、2002)の5'領域およびTCRα遺伝子の3'領域に存在する遺伝子座調節領域(LCR)を含む。それらはクロマチンにおいて共役導入遺伝子の高い組織特異的発現をもたらし、それは位置のその非依存性およびコピー数への依存性を示す。これらの性質は、LCRがその天然組織において、クロマチンを開く事ができることを示している(Ortizら、1997)。β-グロビン遺伝子座が無傷であるが発現されない種々の形態のβ-サラセミアが存在する。発現の欠如の理由は、β-グロビン遺伝子の5'方向における主要な欠失である。このβ-グロビンLCRの欠失は閉じたクロマチン構造をもたらし、これが遺伝子座全体におよび、遺伝子発現の抑制をもたらす(Liら、2002)。LCRは発現細胞のクロマチンにおけるDNAse I高感受性部位(HS)と共局在化している。HSの存在はまた、開いたクロマチンを示す。HSは、一連の転写因子の一般および組織特異的結合部位を含む。転写因子のDNAとの相互作用により、HSの開いたクロマチン構造が生じる(Liら、2002)。多くのLCRは、その機能が多かれ少なかれ互いに分離していることができる多くのHSからなっていることが知られている。例えば、TCRα遺伝子はT細胞組織においてのみ内在性コントロール下で発現される。この遺伝子座は、組織および発現状態に応じて種々のクロマチン状態で存在する。3'領域において、この遺伝子座調節領域は8個のHSを有する。LCRの6kb部分フラグメントであるHS2-6はクロマチンオープニング活性を有し、組織特異的ではない。胸腺において、HS7、8および1(3kb)によりT細胞特異的発現に組織特異性が付与される。すべてのHSの完全な組み合わせにおいてのみ、TCRαLCRは機能的に完全である(Ortizら、1997)。TCRαLCRの個々のHS機能のより正確な細別および詳述は(Ortizら、1999)において見ることができる。LCRは機能的に大変複雑であり、エンハンサー、サイレンサーおよびアイソレーターなどの異なる調節配列からなっている可能性がある。種々のドメイン間のLCR機能の分割の他の例には、TCRγ遺伝子座およびβ-グロビン遺伝子座がある。前者はDNAse I高感受性部位HsAおよびエンハンサー3'ECγ1からなっている。その通常の機能を有することに加えて、TCRγ-LCRはまた、TCRγ遺伝子の組換えに関与すると考えられている(Bakerら、1999)。β-グロビン遺伝子座は、区別できる機能を有する5つのHSを有し、これもまた完全に機能を発揮するためには組織特異的プロモーターを必要とする。DNAメチル化は閉じたクロマチン構造および遺伝子の不活性化を引き起こすので、LCRは、DNAの組織特異的脱メチル化において他の重要な役割を果たしうる。ヒストンアセチル化の亢進により遺伝子発現を活性化する活性化機構もまた可能である(Liら、2002)。
足場/マトリックス付着領域(Scaffold/Matrix Attachment Region;S/MAR)は、細胞核のマトリックスまたは足場の成分にin vitroで高親和性で結合するDNA配列である。それらはクロマチンドメインの構造境界およびおそらくは機能境界を形成する(Zahn-Zabalら、2001)。S/MARはエンハンサーと相互作用して、クロマチンにおけるDNAの利用可能性を局所的に高めることができ、こうして細胞株、トランスジェニック動物および植物における安定に組み込まれた異種遺伝子の発現を増加させることができる(Klehrら、1991;Stiefら、1989;Jenuweinら、1997;Zahn-Zabalら、2001)。しかしながら、それらは位置非依存発現を可能にするために、近接領域から染色体座を完全には遮蔽できない(Poljakら、1994)。トランスフェクション実験において(高)発現細胞クローンまたはトランスジェニック動物の割合を高めるために、MARの作用を用いることができる(McKnightら、1992;Zahn-Zabalら、2001)。しかしながら、MARは、高発現を付与しないが増殖特異的遺伝子の正確な調節に重要な役割を果たしていることが報告されている(McKnightら、1992)。
アイソレーターは、例えば活性クロマチンと不活性なクロマチン間のように互いに影響する近接領域間の中立的境界として定義される(境界領域)。アイソレーターは、エンハンサーの作用を制限するかまたはエンハンサーに対して全DNAドメインを分離することができ、位置効果から安定的にトランスフェクトされたレポーター遺伝子を遮蔽することができる(Bell and Felsenfeld, 1999; Udvardy, 1999)。このように、これらの領域は、発現をゲノム位置に無関係にする。これらの領域はまた、選択圧力の非存在下で導入遺伝子のサイレンシングを抑制することもできる(Pikaartら、1998)。アイソレーターの他の推定される機能は、複製領域の制限である(BellおよびFelsenfeld、1999)。最初に記載されたアイソレーターは、ショウジョウバエ(Drosphila)由来のscsおよびscs’である。それらはhsp70熱ショック遺伝子の境界を構成し、位置効果を抑制する(Udvardyら、1985)。
分離機能を有する他の配列要素として、dhfr遺伝子(チャイニーズハムスター)由来のCpGアイランドを含むGCリッチフラグメントが見いだされた(Poljakら、1994)。このフラグメントは、そのままではレポーター遺伝子発現に何ら影響を示さなかった。しかしながら、発現促進SARおよびレポーター遺伝子間には置かれると、このフラグメントは実質的にSAR配列要素の発現促進作用を抑制することができた。おそらくは、このGCリッチフラグメントは、SAR配列要素のクロマチンオープニング機構を遮断し、その結果としてアイソレーターとして作用すると考えられる。長いCpGアイランドを有する配列要素は、シトシンを5-メチルシトシンに変換するDNAメチルトランスフェラーゼにより認識されるので、高い確率でメチル化される。その結果として、不活性なクロマチンが形成される(Poljakら、1994)。
Aronowらは、ヒトADA遺伝子(アデノシンディアミナーゼ)の第1イントロンにおいて、遺伝子コピー数には依存するが、位置には依存しない発現に実質的に貢献する新規調節配列を明らかにした(Aronowら、1995)。この配列要素はサイズが1kbまでであり、200bp T細胞特異的エンハンサーを挟むときにのみ機能する。2つのセグメントの1つのみが存在する場合またはセグメントの配列および配向が誤って配列されている場合、このことがエンハンサー上のDNAse I高感受性部位の形成を抑制するため、この配列要素は非機能性となる。
特許WO02/081677において、Cobra Therapeutics社は他のクロマチンに影響する配列要素を記載している。偏在性クロマチンオープニング配列要素(Ubiquitous Chromatin Opening Element; UCOE)は、偏在的に発現するハウスホールド遺伝子(ヒトhnRNP A2遺伝子、ヒトβ-アクチン遺伝子、ヒトPDCD2遺伝子)を含む染色体領域における開いたクロマチン構造に関与する。これらすべての遺伝子は、比較的低度にメチル化される非翻訳領域におけるCpGリッチアイランドを有する。CpGアイランドのメチル化の非存在は、この部位で活性クロマチンが存在することを示している。UCOEは、ゲノム環境および細胞または組織の性質と無関係に発現強度を提供するのに役立つ。
Immunex社はまた、発現の増加をもたらすシス作用性DNA配列を記載している(US6,027,915、US6,309,851)。発現増強配列要素（EASE）と呼ばれる配列要素は、哺乳動物細胞において組換えタンパク質の高発現を要求するが、一過性発現系では活性ではなく、LCRおよびS/MARにおいて見られる典型的な配列特性を有さない。オープンリーディングフレームを含有しないので、トランス活性化タンパク質をコードする配列でもない。このフラグメントは14.5kbの長さであり、CHO細胞のゲノムDNA由来であり、安定に組み込まれたレポーター遺伝子の発現を8倍増加させることができる。この配列要素の活性の50%以上が1.8kbの長さのセグメントに限定され、一方でこのセグメントの最初の600塩基対は正確な機能に必須である。高いEASE活性を有する配列セクションのさらなる特性は、多くのHMG-1(Y)結合部位の存在である。HMG-I(Y)タンパク質は高移動度群非ヒストンクロマチンタンパク質のファミリーに属する。これらはまた、“構造転写因子”とも呼ばれ、哺乳動物遺伝子のトランス制御因子の新規カテゴリーを形成する。HMG-I(Y)タンパク質は80リッチ配列を認識し、小さなDNAフォークのそのいわゆるATフック(DNA結合ドメイン)に結合する。これによりDNAトポロジーにおける局所的な変化を引き起こすことができ、その結果として遺伝子発現が修飾される。
米国特許第6,309,841号の著者らは、EASEの作用は組み込まれたプラスミドのMTX誘発増幅と関連していると推定する。MTX誘発遺伝子増幅において、いわゆる切断、融合、架橋のサイクルが存在する。DNA切断の形成と除去をもたらす構造修飾におけるHMG-I(Y)タンパク質の役割を想像するのは容易である。
哺乳動物細胞における遺伝子発現を増加させる他の配列要素は、Kwaksら(2003)に記載されている。これらのいわゆるSTAR配列要素(Stimulatory and Anti-Repressor Element;促進配列要素および抗リプレッサー配列要素)は、500〜2100bp DNAフラグメントを有するヒト遺伝子ライブラリーのスクリーニングから導かれた。スクリーニングは特別に設計されたレポータープラスミドを用いて行われた。レポーター遺伝子の発現は、ヒト遺伝子バンク由来の抗リプレッサー配列要素に機能的に連結されたときにのみ可能であった。このように得られたSTAR配列要素を用いて、著者らは、哺乳動物細胞のゲノムにおける位置効果から導入遺伝子を保護する事ができた。マウスゲノムとの比較から、これらのSTAR配列要素の大部分がヒトおよびマウスゲノムの両方に存在し、これらの2つの種内で高度に保存されていることが示された。
望ましいタンパク質の高発現を示す細胞株を樹立する上で主な問題は、宿主細胞ゲノムの転写活性なまたは不活性な遺伝子座における組換えベクターのランダムで無指向性の組み込みから生じる。結果として、異種遺伝子に関してまったく異なる発現率を示すが、一方で細胞の生産性は一般に正規分布に従う細胞集団が得られる。従って、対象の異種遺伝子の非常に高い発現を示す細胞クローンを同定するために多くのクローンをチェックし試験する必要があり、時間、労働および費用の多大な消費をもたらす。従って、トランスフェクションに用いられるベクター系を改良する試みは、適切なシス作用性配列要素の使用による安定に組み込まれた導入遺伝子の転写を可能にするまたは増加させることにさえも向けられる。クロマチンレベルで作用するシス作用性配列要素は、例えば、既述の遺伝子座調節配列要素、足場-マトリックス付着領域、アイソレーターなどを含む。これらの配列要素のあるものは、周囲のクロマチンの影響から特定の遺伝子を遮蔽する。他のものは、エンハンサー様活性を示すが、これは安定に組み込まれた構築物に限定される。さらに他の配列要素は、これらの機能のいくつかをその中に組み合わせる。しばしば、それらを特定の群に帰属することは明確には可能ではない。従って、安定細胞系において、トランスジェニック産物遺伝子の発現は、かなりの程度まで染色体位置効果の影響下にある。この現象は、異種DNAの組み込み部位におけるクロマチン構造および/または内因性調節配列要素の存在の影響に基づく。これにより、大変変わりやすい発現レベルがもたらされる。従って、細胞の選択中、しばしば産物発現が大変低いかまたは全然ないクローンがしばしば生じる。これらの染色体位置効果は、高レベルの治療用タンパク質を発現する安定な産生細胞株の作製が、一般に時間がかかり、大容量であり、費用のかかるプロセスである理由でもある。高い生産性を有する安定細胞系は、通例、正の選択マーカーと、しばしば薬剤誘発遺伝子増幅(例えばジヒドロ葉酸還元酵素/メトトレキセートまたはグルタミン合成酵素/メチオニンスルホキシミン)とを組み合わせて製造される。複雑なスクリーニングプロセスにおいて、この選択戦略で製造される高く安定な発現を示すプールおよびクローンが研究される。クローンの大部分は、ゼロかまたはせいぜい平均量の産物を産生し、ごくわずかなものが高産生クローンである。混合集団における高産生クローンの割合は、例えば選択マーカーの変異により増加させることができる(Sautter und Enenkel, 2005, WO 2004/050884)。しかしながら、トランスフェクトした細胞集団内の高産生クローンの割合ばかりでなく、個々のクローンそれぞれの特定の生産性をさらに増加させることが望ましい。
安定的にトランスフェクトされた細胞、特にCHO細胞または他の産生関連細胞の比生産性およびトランスフェクションバッチにおける高産生クローンの割合を増加させる必要がある。これにより、最終的により効率的な細胞株開発がなされるべきである。その結果として、短時間でより生産性の高い細胞株を樹立でき、それにより労働、時間および費用を節約できるであろう。
WO97/15664 EP-0-393-438 WO2004/050884 WO02/081677 US6,027,915 US6,309,851 WO01/04306 WO00/34318 WO00/34326 WO00/34526 WO01/27150 US5,122,458 WO94/05785 WO92/08796 WO94/28143 WO03/004704
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本発明は、安定的にトランスフェクトされた細胞における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす調節核酸、特に“TE配列要素”として知られる配列番号1を有する核酸またはそのフラグメントもしくは誘導体に関する。驚いたことに、例えば、宿主ゲノム、例えばCHO-DG44ゲノムに安定に組み込まれたプロモーター、産物遺伝子、選択マーカーおよび場合によりエンハンサーと共に、発現ベクターのこの種のTE配列要素を使用することにより、染色体位置効果が克服され、遮蔽され、あるいは相殺されることが明らかにされた。結果として、トランスフェクションバッチにおける高産生クローンの割合ばかりでなく、絶対発現レベルもまた増加する。
本発明はさらに、転写または発現増強領域である配列番号1のフラグメントまたは誘導体、好ましくはTE配列要素であるTE-00(配列番号2)、TE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-04(配列番号6)、TE-06(配列番号8)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)、TE-12(配列番号14)、TE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)およびTE-21(配列番号21)を含む発現ベクターに関する。小さいサイズを考慮して、サイズTE-06、TE-07およびTE-08ならびにTE-13(配列番号15)が特に好ましい。
配列番号1は、CHO細胞から単離された、ユビキチン/S27a遺伝子のコード領域の上流に位置する配列領域に由来し、細胞のリボソーム代謝において不可欠なタンパク質をコードする遺伝子である。
従来の発現ベクターと比較して、発現ベクターへのシス作用性TE配列要素のさらなる導入により、安定的にトランスフェクトされた細胞プール、特にCHO-DG44細胞プールの最大7倍高い生産性がもたらされる。他方では、CHO-DG44細胞プールの一過性トランスフェクションにおいて、TE配列要素を導入することにより生産性の増加は達成できなかった。従って、安定な細胞プールで観察される生産性の増加は、TE配列要素に存在するエンハンサーに基づくものではない。従って、染色体組み込みは、TE配列要素により引き起こされる生産性の増加に絶対的に必須である。これは、TE配列要素が負の染色体位置効果を抑制、遮蔽または相殺することができるしるしである。結果として、高生産性細胞を選択し、富化するのに特に適合することを特徴とし、従って高産生クローンの単離および同定における所要時間、費用および能力の消費を抑制することができるシス作用性配列要素が製造され、同定された。
本発明の可能な応用は、例えばバイオ医薬品の製造、細胞系アッセイ、物質のハイスループットスクリーニングまたはNMR分光法、他のアッセイなどのための組換えタンパク質産物の産生に必要な高生産性細胞株の開発を含む。より高い比生産性および産物をほとんど発現しない細胞の削減により、より高生産性の細胞株をより短い所要時間で樹立でき、それにより労働および費用を削減できる。他の可能な応用は、頑強な改善された宿主細胞株(例えば抗アポトーシス遺伝子またはグリコシル化遺伝子の導入)、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の製造および遺伝子治療における応用である。
本発明は、先行技術から得られるものではない。
配列番号1を有する核酸は、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)のゲノムから単離された核酸配列である。これはユビキチン/S27a遺伝子のコード領域の上流に位置する配列領域に由来する。
配列番号1を有する核酸は平均GC含量44%を有し、長い領域のGC反復を含まない。このGC含量は、哺乳動物のゲノムDNAに関して記載されている平均GC含量約40%と同程度である(Delgadoら、1998)。newcpgseek(EMBOSS配列分析パーッケージ)を用いるCpGリッチ領域の検索により、GpCとの関連で、絶対的にCpG二量体の頻度増加および/またはCpGの比率増加を示す5つのみの大変短い配列領域が明らかとなった:配列番号1のヌクレオチド2242〜2259(18bp)、3129〜3146(18bp)、3215〜3240(26bp)、3417〜3461(44bp)および3658〜3788(131bp)。この検索結果は、この核酸配列が伸びたCpGアイランドを何ら含まないことを示す。さらに、配列番号1は2つの縦列反復配列(ヌクレオチド2179〜2244およびヌクレオチド1027〜1080)および2つの逆位反復配列(ヌクレオチド8〜47およびヌクレオチド1726〜1766)を含み、これらはEMBOSSプログラムのetandemおよびeinvertedにより同定された。従って、TE-08は1つの逆位反復配列を含む。従って、配列領域1bp〜1578bpにおいては、1つの縦列反復配列および1つの逆位反復配列が存在する。
配列番号1を有する核酸の部分はWO97/15664にすでに記載されており、配列番号1のヌクレオチド1579〜3788はWO97/15664からの配列番号5のヌクレオチド1〜2201に対応するが違いがある。本発明による配列番号1の製造中、クローニングプロセスの結果として、存在するECORI切断部位の充填反応により形成され、4つの追加のヌクレオチドが導入された。追加の4つのヌクレオチドのこの挿入は、WO97/15664からの配列である配列番号5のヌクレオチド357〜358間で生じた。しかしながら、本発明からの配列番号1を有する核酸配列のヌクレオチド1〜1578は、本発明の範囲内の、単離されたこれまで未知であった新規な配列領域を構成する。同様に、WO97/15664は、本発明からの配列番号1またはそのフラグメントもしくは誘導体が、機能的に結合されている対象遺伝子の転写を可能にするプロモーター/エンハンサーの組み合わせにそれらが機能的に結合されているとき、染色体組み込み部位にかかわらず対象遺伝子の転写または発現を増加させることを開示しなかった。それどころか、WO97/15664は、プロモーターとしてのユビキチン/S27a遺伝子の5'UTR配列の使用を開示しており、一方でWO97/15664の図5の位置-161〜-45の配列領域はプロモーター活性に必須である。この配列領域は本発明の配列番号1の核酸およびそれから誘導される配列番号2を有するフラグメント(WO97/15664の図5の位置-161〜-89)に部分的にのみ存在する。配列番号1の他のフラグメントおよび誘導体はこの配列領域をまったく含まない。さらに、本発明の配列番号1の核酸は、BLASTなどの標準的アラインメントアルゴリズムを用いるとき、以下の特許出願に記載の核酸配列であって、シス位置でクロマチンレベルでの発現にもプラス方向に影響を与えうる核酸配列に配列の相同性を示さない:
a)WO00/05393からのUCOE核酸配列
b)US6,309,841からのEASE核酸配列
c)WO03/004704からのSTAR核酸配列。
より複雑なアラインメント戦略を用いても、これらの核酸配列a)〜c)に対する高い配列の相同性は認められなかった。
ベースベクターの概略図。CHO-DG44細胞内で組換えモノクローナルIgG1抗体を発現させるために、Aで示されるベクターを用いた。この場合、“E/P”はCMVエンハンサーおよびハムスターユビキチン/S27aプロモーターの組み合わせであり、“P”は単にプロモーター領域であり、“T”は転写されたmRNAのポリアデニル化に必要な転写終結シグナルである。各転写ユニット内の転写開始の位置および方向は矢印で示される。TE配列要素をクローニングするためにSpeI切断部位(“SpeI”)はプロモーター/エンハンサーの組み合わせの前に存在する。増幅選択マーカージヒドロ葉酸還元酵素は“DHFR”と略称される。選択マーカーネオマイシンホスホトランスフェラーゼは点変異D227Gを含み、よって図において“D227G”と略称される。脳心筋炎ウイルス由来の“IRES”配列要素は、二シストロン性転写ユニット内の内部リボソーム結合部位として機能を果たし、以下の緑色蛍光タンパク質“GFP”の翻訳を可能にする。“HC”および“LC”は、それぞれヒト化モノクローナルIgG1抗体のH鎖およびL鎖をコードする。Bで示されるベクターはCHO-DG44において組換えタンパク質MCP1を発現させるために用いられる。“E/P”はCMVエンハンサーおよびCMVプロモーターの組み合わせであり、“P”は単にプロモーター領域であり、“T”は転写されたmRNAのポリアデニル化に必要な転写の終結シグナルである。各転写ユニット内の転写開始の位置および方向は矢印で示される。TE配列要素をクローニングするために、制限エンドヌクレアーゼ(アダプター)の切断部位を有する配列領域“A”がプロモーターの前に挿入されている。 選択マーカーネオマイシンホスホトランスフェラーゼは点変異F240Iを含み、よって図においてF240Iと略称される。脳心筋炎ウイルス由来のIRES領域はバイシストロン性転写ユニット内の内部リボソーム結合部位として機能を果たし、以下の赤色蛍光タンパク質“dsRed”の翻訳を可能にする。“MCP-1”はヒト単球走化性タンパク質-1をコードする。 MCP-1ベースベクターの概略図。CHO-DG44細胞において組換えタンパク質MCP-1を発現させるためにここで示されるベクターを用いた。“E/P”は、“E/P”の組み合わせであり、CMVエンハンサーおよびCMVプロモーターの組み合わせである。“P”は単にプロモーター領域であり、“T”は転写されたmRNAのポリアデニル化に必要な転写の終結シグナルである。各転写ユニット内の転写開始の位置および方向は矢印で示される。TE配列要素をクローニングするために、制限エンドヌクレアーゼ(アダプター)の切断部位を有する配列領域“A”がプロモーターの前に挿入されている。選択マーカージヒドロ葉酸還元酵素は図において“dhfr”と略称される。脳心筋炎ウイルス由来のIRES配列要素は、バイシストロン性転写ユニット内の内部リボソーム結合部位として機能を果たし、以下の赤色蛍光タンパク質“dsRed”の翻訳を可能にする。“MCP-1”はヒト単球走化性タンパク質-1をコードする。 CHOユビキチン/S27S遺伝子の5'配列。3788bpを含む配列領域(配列番号1)は、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞のゲノムから単離された。これはUb/S27a遺伝子のコード領域の上流に位置し、これはユビキチンユニット(Ub)とリボソームタンパク質の小さなリボソームサブユニット(S27a)の間の融合物である。 TE配列要素00〜12のグラフ表示。この図は、CHOユビキチン/S27a遺伝子のコード領域の上流に位置する、プラスミドにサブクローニングされた3788bpのゲノム配列領域の概略を示す。TE配列要素Aとしても知られるこのゲノム配列(配列番号1)から、異なる長さの部分フラグメント(以後TE配列要素と呼ぶ)が作製された。TE配列要素00(配列番号2)はSac II制限フラグメントとしてこの配列のサブクローンから単離され、ターゲットベクターpBID-HCおよびpBING-LCのSpeI切断部位にクローニングされた。これらはIgGIの重鎖(HC)または軽鎖の遺伝子のいずれかを含んだ(図1A参照)。結果として、TE配列要素00がプロモーターの上流に順配向および逆配向で配置された発現ベクターが形成された。種々のプライマー対を用いてPCRによりTE配列要素01〜12が作製され(図5および6参照)、BamHI/BsrGIによりベースプラスミドpTE4/MCP-1(図1B)およびpTE5/MCP-1(図2)にクローニングされた。 TE配列要素00〜12。この表は、TE-A配列(配列番号1)から作製されたTE配列要素00〜21のサイズならびに開始位置および終止位置を示す。PCRにより作製したフラグメントのために、使用したプライマーがさらに特定されている。この配列要素のサイズグラデーションは約500bpであり、出発配列TE-A(配列番号1)と比較して、5'または3'末端の欠失を有する。 TE配列要素01〜12を合成するためのプライマー。プライマーが5'-3'方向で示されている。名称に“for”を有するプライマーは配列番号1の順配向プライマーであり、“rev”を有するプライマーは逆配向プライマーである。各プライマーは5’末端の6ヌクレオチドとそれに続くBamHIまたはBsrGI切断部位および、配列番号1の配列部分と100%相同の約20〜30ヌクレオチドの配列からなる。配列番号1と相同のプライマーの領域は太字で示されている。配列番号1の配列領域を増幅するために、1つのforプライマーおよび1つのrevプライマーが用いられた。得られたPCR産物を、BamHIおよびBsrGIにより、ベースプラスミドpTE4/MCP-1(図1B)またはpTE5/MCP-1(図2)にクローニングした。 トランスフェクションシリーズBのFACS測定。図は、TE配列要素00を用いない細胞と比較した、TE配列要素00を用いた細胞におけるGFP発現の相対的増加を示す。このために、TE配列要素00の存在および配向のみが互いに異なるプラスミド組み合わせpBING-LCおよびpBID-HCでCHO-DG4細胞をトランスフェクトした。G418を加え、HTを含まない培地でトランスフェクトした細胞プールを2〜3週間選択した後、FACS分析によりGFP蛍光を測定した。陰性対照として用いたトランスフェクトしていないCHO-DG44細胞(DG44)を除いては、各グラフは、いずれの場合にもトランスフェクションシリーズBの10プールからのGFP蛍光の平均の構成要素となる。1プールあたり20000細胞を研究した。“対照”はベースプラスミドpBING-LCおよびpBID-HCを意味し、“逆”はベースベクター内のTE配列要素00の逆配向を意味し、“正”はベースベクター内のTE配列要素00の順配向を示す。 トランスフェクションシリーズCのFACS測定。図は、TE配列要素を含まなかった細胞集団における細胞と比較した、TE配列要素01、02、05、06、08または09を含んだ安定な細胞集団におけるdsRed2発現細胞の割合を示す。このために、上記のTE配列要素の1つをさらに含んだプラスミドpTE4/MCP-1またはそれから得られる誘導体でCHO-DG44細胞をトランスフェクトした。G418を加えた培地でトランスフェクトした細胞プールを3週間選択した後、dsRed2蛍光をFACS分析により測定した。1プールあたり10000細胞を測定し、トランスフェクトしていないCHO-DG44細胞の固有の蛍光を差し引いた。各値は、トランスフェクションシリーズCの6プールからのdsRed2発現細胞のパーセント割合の平均である。 比生産性に対するTE配列要素の影響。この図は、TE配列要素を含まない対照プールと比較した、TE配列要素の存在の結果として得られるIgG1またはMCP-1の発現レベルの変化をグラフで示す。ベースプラスミドpBING-LCおよびpBID-HCまたはpTE4/MCP-1(“対照”)およびそれらから得られる、それぞれがさらにTE配列要素(順配向の“00”(“00正”)および逆配向の“00”(“00逆”)、“01”〜“12”)を含んだ誘導体によるCHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションにより細胞プールを作製した。G418を添加し、HTを含まない培地(シリーズAおよびB)またはG418を添加しHTを含まない培地(シリーズC and D)でトランスフェクトした細胞プールを2〜3週間選択の後、細胞培養上清でELISAによりタンパク質発現を測定し、細胞あたり、および1日当たりの比生産性を算出した。75cm2Tフラスコで継代周期2-2-3日を用いて、数回の継代培養により安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の培養を行った。シリーズAにおいて、プラスミド組み合わせ“00逆”および“00正”から得られた4プールを試験し、そのうち対照3プールを8継代培養にわたって培養で試験し、シリーズBにおいて、各プラスミド組み合わせ10プールを6継代培養で試験し、シリーズCおよびDにおいて、各タイプのプラスミド6プールを6継代培養で試験した。プラスミド組み合わせおよびシリーズのプールの比生産性を平均し、各シリーズにおける対照の平均を1にした。TE配列要素を有するプールの平均比生産性をこれと比較した。 比生産性に対するTE配列要素の影響。この図は、TE配列要素を含まない対照プールと比較した、TE配列要素の存在の結果として得られるIgG1またはMCP-1の発現レベルの変化を表で示す。ベースプラスミドpBING-LCおよびpBID-HCまたはpTE4/MCP-1(“対照”)およびそれらから得られる、それぞれがさらにTE配列要素(順配向の“00”(“00正”)および逆配向の“00”(“00逆”)、“01”〜“12”)を含んだ誘導体によるCHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションにより細胞プールを作製した。G418を添加し、HTを含まない培地(シリーズAおよびB)またはG418を添加しHTを含まない培地(シリーズC and D)でトランスフェクトした細胞プールを2〜3週間選択の後、細胞培養上清でELISAによりタンパク質発現を測定し、細胞あたり、および1日当たりの比生産性を算出した。75cm2Tフラスコで継代周期2-2-3日を用いて、数回の継代培養により安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の培養を行った。シリーズAにおいて、プラスミド組み合わせ“00逆”および“00正”から得られた4プールを試験し、そのうち対照3プールを8継代培養にわたって培養で試験し、シリーズBにおいて、各プラスミド組み合わせ10プールを6継代培養で試験し、シリーズCおよびDにおいて、各タイプのプラスミド6プールを6継代培養で試験した。プラスミド組み合わせおよびシリーズのプールの比生産性を平均し、各シリーズにおける対照の平均を1にした。TE配列要素を有するプールの平均比生産性をこれと比較した。 DHFR選択細胞プールにおける比生産性に対するTE配列要素の影響。この図は、TE配列要素を含まない対照プールと比較した、TE配列要素の存在により引き起こされるMCP-1の発現レベルの変化をグラフの形で示す。ベースプラスミドpTE5/MCP-1(“対照”)または、それぞれがさらにTE配列要素(“01”〜“12”)(シリーズE)を含んだ誘導体でのCHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションにより細胞プールを作製した。HTを含まない培地でトランスフェクトした細胞プールを2〜3週間選択した後、細胞培養上清でELISAによりタンパク質発現を測定し、細胞あたり、および1日当たりの比生産性を算出した。75cm2Tフラスコ中、継代周期2-2-3日で安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の培養を数回の継代培養により行った。各プラスミド変種6プールを6継代培養で培養した。プラスミド変種のプールの比生産性を平均し、対照の平均を1にした。TE配列要素を有するプールの平均比生産性をこれと比較した。 DHFR選択細胞プールにおける比生産性に対するTE配列要素の影響。この図は、TE配列要素を含まない対照プールと比較した、TE配列要素の存在により引き起こされるMCP-1の発現レベルの変化を表の形で示す。ベースプラスミドpTE5/MCP-1(“対照”)または、それぞれがさらにTE配列要素(“01”〜“12”)(シリーズE)を含んだ誘導体でのCHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションにより細胞プールを作製した。HTを含まない培地でトランスフェクトした細胞プールを2〜3週間選択した後、細胞培養上清でELISAによりタンパク質発現を測定し、細胞あたり、および1日当たりの比生産性を算出した。75cm2Tフラスコ中、継代周期2-2-3日で安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の培養を数回の継代培養により行った。各プラスミド変種6プールを6継代培養で培養した。プラスミド変種のプールの比生産性を平均し、対照の平均を1にした。TE配列要素を有するプールの平均比生産性をこれと比較した。 TE配列要素のエンハンサー活性に関する試験。TE配列要素を有する発現ベクターを用いるとき、TE配列要素を含まない対照ベクターと比較して、CHO-DG44細胞の一過性トランスフェクションはMCP-1力価の顕著な増加を示さなかった。従って、TE配列要素01〜12はエンハンサーとしての機能を果たさず、従って、染色体に組み込まれた場合にのみ、発現の顕著な増加をもたらしうる。pTE4/MCP-1(対照)で6プールをトランスフェクトし、それぞれがさらにTE配列要素(“01”〜“12”)を含んだ誘導体をそれから得た。同時に、トランスフェクション効率(SEAP=分泌アルカリホスファターゼ)を測定するために、SEAP発現プラスミドを同時トランスフェクトした。48時間全量で3ml培養した後、細胞培養上清を除去し、ELISAによりMCP-1力価を測定し、SEAP活性を測定した。SEAP発現により測定されたトランスフェクション効率に関してMCP-1力価を補正した。図は、6並行プールの平均および標準偏差値を示す。 他のTE配列要素。これまでの結果は、この図に示された配列番号1のフラグメントの選択もまた遺伝子発現の増加をもたらしうることを示している。本目的は、これらのさらなるTE配列要素のクローニングおよび安定なトランスフェクションにより、機能にとって重要な配列領域の位置をより正確に決めるために配列番号１をさらに厳密に解析することである。 TE配列要素の異なる位置および組み合わせの試験。この図は、このようにして、発現のさらなる増加を達成できるかどうかを研究するために、TE配列要素の異なる位置、配向および組み合わせが用いられた可能な発現ベクターの選択を示す。TE配列要素が産物遺伝子に隣接するばかりでなく、多くの同一または異なる短いTE配列要素、例えばTE配列要素06および08または新規TE配列要素13および14が他の後に接続される 特異的MCP-1発現に対するTE配列要素TE-13〜TE-18の影響。この図は、TE配列要素を含まない対照プールと比較して、TE配列要素の存在からもたらされる、MCP-1の発現レベルの変化を示すグラフである。ベースプラスミドpTE4/MCP-1(“対照”)または、それから得られたそれぞれがさらにTE配列要素(“13”〜“18”)(シリーズF)を含む誘導体を用いるCHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションにより細胞プールを作製した。HT添加培地+G418(400μg/ml)でトランスフェクトした細胞プールを2〜3週間選択した後、細胞培養上清でタンパク質発現をELISAにより測定し、細胞あたり、および1日当たりの比生産性を算出した。75cm2Tフラスコで継代周期2-2-3日を用いて、数回の継代培養により安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の培養を行った。各プラスミド変種のうち、4プールを5〜6継代培養にわたって培養した。プラスミド変種のプールの比生産性を平均し、対照の平均を1にした。TE配列要素を有するプールの平均比生産性をこれと比較した。 MCP-1の発現に対する種々の位置および種々の組み合わせのTE配列要素の影響。この図は、TE配列要素を含まない対照プールと比較した、異なるTE配列要素の存在および組み合わせによりもたらされるMCP-1の発現レベルの変化を示すグラフである。ベースプラスミドpTE4/MCP-1(“対照”)または、それぞれがさらに1つまたは2つのTE配列要素(“06および08、08rev、09rev、A”)(シリーズG)を含む、それから得られる誘導体を用いるCHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションにより細胞プールが作製された。HT添加培地+G418(300(g/ml)でトランスフェクトした細胞プールを2〜3週間の選択した後、細胞培養上清でELISAによりタンパク質発現を測定し、細胞あたり、および1日当たりの比生産性を算出した。継代周期2-2-3日を用いる6ウェルプレート(MAT6)での数回の継代培養により、安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の培養を行った。各プラスミド変種の内、6プールを6継代培養にわたって培養した。プラスミド変種のプールの比生産性を平均し、対照の平均値を1にした。TE配列要素を有するプールの平均比生産性をこれと比較した。 IGG-4抗体を用いるTE配列要素TE-08の試験。ここに示すベクターを、CHO-DG44細胞における組換えモノクローナルIgG4抗体の発現に用いた。この場合は、E/PはCMVエンハンサーおよびプロモーターの組み合わせであり、Pは単にプロモーター領域であり、Tは、転写されたmRNAのポリアデニル化に必要な転写の終結シグナルである。各転写ユニット内の転写開始の位置および方向は矢印で示される。MCP-1-IRES-dsRed2カセットの代わりにL鎖(LC2またはLC3)およびH鎖(HC2またはHC3)の遺伝子をクローニングした(図1Bおよび2)。それらはそれぞれ、ヒト化モノクローナルIgG-4抗体のH鎖およびL鎖をコードする。増幅選択マーカージヒドロ葉酸還元酵素は“dhfr”と略称される。選択マーカーネオマイシンホスホトランスフェラーゼは点変異F240Iを含み、よって図においてF240Iと略称されている。
発明の詳細な説明
この発明の詳細な説明の範囲内で用いられる用語および名称は、以下で定義される意味を有する。一般的な用語“含むこと”または“含む”は、より具体的な用語“からなる”を含む。さらに、用語“単数”および“複数”は限定的に使用されない。
用語“TE配列要素”は調節核酸を示す。
用語“TE配列要素”または“発現促進配列要素”または“転写促進配列要素”または“発現もしくは転写促進核酸配列要素”は、試験では同義で用いられる。これらの用語は、すべて調節核酸配列を指す。
“TE配列要素”または“発現促進配列要素”または“転写促進配列要素”または“発現もしくは転写促進核酸配列要素”は、特に、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)のゲノムから単離された、配列番号1に対する相補配列またはその任意の部分フラグメントもしくは領域、あるいは染色体に安定に組み込まれたとき対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす、配列番号1の誘導体またはその部分、フラグメントもしくは領域を含む配列番号1を意味する。また、配列番号1の多くの同一または異なる部分、フラグメント、領域または誘導体からなり、これはまた互いに対して任意の望ましい配向および任意の望ましいスペースで配置されることができ、あるいは他の調節配列と組み合わされることができ、そして対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす、配列番号1の部分、フラグメント、領域または誘導体の任意の望ましい組み合わせも意味する。用語TE配列要素は、配列番号1それ自身およびその任意の望ましいフラグメント、部分、領域または誘導体の両方を指し得る。
さらにまた、用語“TE配列要素”、“転写促進もしくは発現促進核酸配列要素”またはそのフラグメント、部分、領域もしくは誘導体は、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)の配列の部分に加えて、他の生物からの対応する機能的相同ヌクレオチド配列を含む。そのような他の生物の例は、ヒト、マウス、ラット、サルおよび他の哺乳動物ならびにげっ歯動物、爬虫類、鳥、魚および植物を含む。
“フラグメント”または“部分”または“領域”(これらの用語は同義で用いられる)は、配列番号1の一部またはそれに対する相補配列に対して配列が100%同一の核酸分子(一本鎖または二本鎖)を意味する。制限酵素による消化またはPCRのいずれかにより製造されるフラグメントのクローニングは、フラグメントの末端領域における修飾、すなわち充填反応または分解反応の結果である、追加のヌクレオチドまたはヌクレオチドなしまたはプライマーでさらに導入したヌクレオチドをもたらすことができることが知られている。たとえこれらの配列領域が配列番号1と100%未満の配列同一性を有する場合でも、フラグメントの末端領域におけるこれらの変形物はフラグメントの定義に含まれる。配列番号1の“部分”または“フラグメント”または“領域”は、例えばTE-00(配列番号2)、TE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-04(配列番号6)、TE-05(配列番号7)、TE-06(配列番号8)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)、TE-09(配列番号11)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)、TE-12(配列番号14)、TE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)、TE-21(配列番号21)を含む。好ましくは、安定な染色体組み込みにより、フラグメントは機能的に結合されている対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす。対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす、配列番号1の“部分”または“フラグメント”または“領域”は、例えばTE-00(配列番号2)、TE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-04(配列番号6)、TE-06(配列番号8)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)、TE-12(配列番号14)、TE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)およびTE-21(配列番号21)である。しかしながら、用語“フラグメント”はまた、対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす、任意の望ましい配向の配列番号1の全ての可能な他の部分、特にTE-00(配列番号2)の5'領域に全部または少なくとも一部が存在するものを含む。これは、配列番号1の1bp〜1578bpの部分領域に相当する。フラグメントTE-08(配列番号10)もまた好ましい。
本発明において、“誘導体”は、配列番号1もしくはそれに対する相補配列または配列番号1もしくはそれに対する相補配列の部分もしくはフラグメントもしくは領域と少なくとも70%の配列同一性または少なくとも約80%の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性を有し、特に好ましくは少なくとも約90%の配列同一性を有し最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有し、染色体組み込みによって、対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸分子(一本鎖または二本鎖)を意味する。一方では、配列番号1からの配列の相違は、他の生物由来の相同の内因性ヌクレオチド配列における相違にもとづくことができる。他方では、前記相違は核酸配列の意図的な修飾、例えば少なくとも1以上のヌクレオチドの置換、挿入または欠失に基づくものであることができる。欠失、挿入および置換変異体は、“部位特異的突然変異誘発”および/または“PCRベースの突然変異誘発技術”により製造できる。一例として、対応法は、LottspeichおよびZorbas(1998; Chapter 36.1、さらに引用文献あり)により記載されている。いわゆる標準的アラインメントアルゴリズム、例えば“BLAST” (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) “Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215:403-410; Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996) “Applications of network BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) “PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation.” Genome Res. 7:649-656)を用いて、配列同一性を参照配列（この場合は配列番号1）と一致させることができる。それらの系列に対応するとき、配列を一致させ、標準的アラインメントアルゴリズムを用いて同定することができる。
本発明によれば、“誘導体”はまた、配列番号1または配列番号1のフラグメントもしくは部分もしくは領域の配列またはそれに対する相補的配列とハイブリダイズする核酸分子(一本鎖または二本鎖)を意味する。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下(例えば、5x SSCを含む緩衝液中、65℃でハイブリダイゼーション;0.2x SSC/0.1% SDSにより42℃で洗浄)で行う。対応技術は、一例としてAusubelら(1994)に記載されている。好ましくは、配列番号1の部分またはフラグメントまたは領域は、ヌクレオチド位置1bp〜1578bpの配列領域の全部または少なくとも部分を含む。これはTE-00配列(配列番号2)の5'の配列領域に対応する。フラグメントTE-08(配列番号10)もまた好ましい。
用語“変種”は、特定のトランスフェクション混合物に用いられる発現ベクターを指す。これらは、ベースベクター(pTE4/MCP-1またはpTE5/MCP-1)またはベースベクターの組み合わせ(pBING-LC+pBID-HC)の両方を含み、異なる位置、組み合わせおよび配向の1以上のTE配列要素を含むベースベクターもまた含む。
プライマーの場合は、用語“配向”は配列番号1に関するプライマーの配置を指す。配列順序が配列番号1で示される5'-3'順の配列に対応するすべてのプライマー(=順方向プライマー)は、この配列と同じ配向であり、“順配向(direct orientation)”とも呼ばれる。配列順序が配列番号1で示される配列に相補的なプライマー(=逆方向プライマー)は、この配列に対して反対の配向であり、“逆配向(reverse orientation)”とも呼ばれる。TE配列要素に関連して、本発明において、用語“配向”は対象遺伝子に関する配置を指す。配列番号1で示される配列は、ユビキチン/S27a遺伝子をコードする領域から5'（“上流”とも呼ばれる）に位置するゲノム配列を表す。配列番号1に示されるこの配列を続くユビキチン/S27a遺伝子のコード領域の方向に継続すればこの遺伝子の開始コドンにつながる。従って、この配置は“順配向”と呼ばれる。同様に、本発明において、配列番号1に示される配列またはその任意の望ましい部分、フラグメント、領域もしくは誘導体が、対象遺伝子の開始コドンと同じDNA鎖上の発現ベクターに存在する場合、TE配列要素は順配向である。一方、配列番号1に相補的な配列またはその任意の望ましい部分、フラグメント、領域もしくは誘導体が対象遺伝子の開始コドンと同じDNA鎖上の発現ベクターに存在する場合、そのTE配列要素は“逆配向”である。特記しない限り、TE配列要素に言及する場合、常に両方の配向、すなわち順配向および逆配向の両方を含む/意味する。
“染色体組み込み”は、細胞のゲノム、すなわち細胞の染色体への任意の望ましい核酸配列の組み込みを意味し、場合により、任意の望ましい数、位置および配向の1以上の染色体へ組み込みを意味する。さらに、用語“染色体組み込み”はまた、合成、人工またはミニ染色体への任意の望ましい核酸配列の組み込みを含む。
対象遺伝子
本発明の発現ベクターに含まれる対象遺伝子は、対象産物をコードする任意の長さのヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物または“対象産物”は、一般にタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくはフラグメントまたはその誘導体である。しかしながら、それはRNAまたはアンチセンスRNAであることもできる。対象遺伝子は、その完全長、短縮形、融合遺伝子または標識遺伝子で存在することができる。それはゲノムDNAもしくは好ましくはcDNAまたは対応するフラグメントもしくは融合物であることができる。対象遺伝子はネイティブ遺伝子配列であることもでき、あるいは変異または別な方法で修飾されていることもできる。このような修飾は特定の宿主細胞への適合およびヒト化のためのコドン最適化を含む。対象遺伝子は、例えば、分泌、細胞質、核内局在、膜結合型または細胞表面結合ポリペプチドをコードすることができる。
用語“ヌクレオチド配列”、“ヌクレオチド配列”または“核酸配列”は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびそれらのフラグメントばかりでなく、一本鎖または二本鎖として存在するゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAを示し、遺伝子のコード鎖または非コード鎖を表すことができる。標準法、例えば部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発を用いて核酸配列を修飾することができる(例えばSambrookら(1989)またはAusubelら(1994)に記載されている)。
“コード（する）”は、生物過程において、他のポリマーおよび高分子、例えばrRNA、tRNA、mRNA、他のRNA分子、cDNAまたはポリペプチドの合成のための鋳型として役に立つ、核酸、例えば染色体の遺伝子またはmRNAにおけるヌクレオチドの特異的配列の特性または能力を意味する。よって、転写およびそれに続くmRNAの翻訳により細胞または他の生物系内に望ましいタンパク質が産生される場合、遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常は配列データバンク、例えばEMBLまたはGenBankに記載されてもいるコード鎖ばかりでなく、転写の鋳型としてはたらく遺伝子またはcDNAの非コード鎖もまた、産物またはタンパク質のためのコードと呼ぶことができる。タンパク質をコードする核酸はまた、縮重遺伝コードに基づいて異なるヌクレオチド配列順序を有するが、同じアミノ酸配列のタンパク質をもたらす核酸を含む。タンパク質をコードする核酸配列はイントロンを含むこともできる。
用語“cDNA”は、遺伝子から調製されるmRNAまたは他のRNAからの第2のDNA鎖の逆転写および合成により製造できるデオキシリボ核酸を意味する。cDNAが二本鎖DNA分子として存在する場合、それはコード鎖および非コード鎖の両方を含む。
用語“イントロン”は、任意の長さの非コードヌクレオチド配列を意味する。イントロンは多くの真核遺伝子中に天然に存在し、スプライシングとして知られるプロセスにより、前もって転写されたmRNA前駆体から除去される。正確なリーディングフレームを有するプロセッシングを受けた成熟mRNAを生成してタンパク質合成を成功するために、これには5'および3'末端におけるイントロンの正確な切除ならびに得られたmRNA末端の正確な結合を必要とする。このスプライシングプロセスに関与するスプライス供与部位およびスプライス受容部位、すなわちエクソン-イントロンまたはイントロン-エクソン界面部位に直接位置する配列の多くは現在までに解析されている。概要については、Ohshimaら(1987)を参照のこと。
対象タンパク質/産物
生物医薬品としての重要性を有するタンパク質/ポリペプチドは、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体およびそれらの誘導体もしくはフラグメントを含むが、それに限定されるものではない。一般に、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するポリペプチドおよび/または治療応用もしくは診断応用を有するポリペプチドはすべて使用できる。他の対象タンパク質には、例えば、いわゆる“細胞工学”に従って宿主細胞の性質を変えるのに用いられるタンパク質/ポリペプチド、例えば抗アポトーシスタンパク質、シャペロン、代謝酵素、グリコシル化酵素およびそれらの誘導体またはフラグメントがあるがそれに限定されない。
用語“ポリペプチド”は、アミノ酸配列またはタンパク質に用いられ、任意長のアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、グリコシル化、リン酸化、アセチル化またはタンパク質のプロセシングなどの反応により翻訳後修飾を受けたタンパク質も含む。ポリペプチドの構造は、その生物活性を維持したままでの、例えばアミノ酸の置換、欠失または挿入および他のタンパク質との融合により修飾することができる。加えて、ポリペプチドは多量体化してホモマーおよびヘテロマーを形成することができる。
治療用タンパク質の例は、インスリン、インスリン様成長因子、ヒト成長ホルモン(hGH)および他の増殖因子、受容体、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、エリスロポエチン(EPO)、サイトカイン、例えばインターロイキン(IL)、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、インターフェロン(IFN)-α、-β、-γ、-ωまたは-τ、腫瘍壊死因子(TNF)、例えばTNF-α、βまたはγ、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1ならびにVEGFである。他の例には、モノクローナル、ポリクローナル、多重特異的および一本鎖抗体ならびにそれらのフラグメント、例えばFab、Fab'、F(ab')2、FcおよびFc'フラグメント、免疫グロブリン軽(L)および重(H)鎖ならびにそれらの定常領域、可変領域または超可変領域のみならずFvおよびFdフラグメント(Chamovら、1999)がある。抗体はヒト由来または非ヒト由来であることができる。ヒト化抗体またはキメラ抗体もまた可能である。
Fabフラグメント(抗原結合フラグメント=Fab)は、隣接する定常領域に結合された両方の鎖の可変領域からなる。それらは、例えばパパインなどのプロテアーゼを用いて処理することにより従来の抗体から製造でき、あるいはDNAクローニングにより製造できる。他の抗体フラグメントには、ペプシンでのタンパク質消化により製造できるF(ab')2フラグメントがある。
遺伝子クローニングにより、重鎖の可変領域(VH)および軽鎖の可変領域(VL)のみからなる短縮抗体フラグメントを製造することも可能である。これらはFvフラグメント(可変フラグメント=可変部分のフラグメント)として知られる。これらのFvフラグメントにおいては、定常鎖のシステイン基による共有結合は不可能なので、Fvフラグメントはしばしば他の方法によって安定化される。このために、H鎖およびL鎖の可変領域は、しばしば、約10〜30アミノ酸、好ましくは15アミノ酸の短いペプチドフラグメントにより結合される。これにより、ペプチドリンカーによりVHとVLが結合された単一のポリペプチド鎖が生じる。このような抗体フラグメントはまた、一本鎖Fvフラグメント(scFv)とも呼ばれる。scFv抗体の例は既知であり、記載されている。例えば、Hustonら(1988)を参照のこと。
過去に、多量体scFv誘導体を作製するために種々の戦略が開発されてきた。本目的は、改善された薬物動態学的性質および増加した結合アビディティを有する組換え抗体を作製することである。scFvフラグメントの多量体化を達成するために、それらは多量体化ドメインを有する融合タンパク質として作製される。多量体化ドメインは、例えば、IgGのCH3領域またはロイシンジッパードメインなどのらせん構造体(“コイルドコイル構造体”)であることができる。他の戦略において、多量体化(例えばダイアボディ、トリアボディおよびペンタボディ)のために、scFvフラグメントのVHおよびVL領域間の相互作用が用いられる。
当該技術分野において、用語“ダイアボディ”は二価のホモ二量体scFv誘導体を意味するために用いられる。scFv分子におけるペプチドリンカーを5〜10アミノ酸に短縮することにより、VH/VL鎖の重ね合わせによるホモダイマーの形成がもたらされる。ダイアボディは挿入されたジスルフィド架橋によりさらに安定化されることができる。ダイアボディの例は、文献、例えばPerisicら(1994)において見いだすことができる。
当該技術分野においては、用語“ミニボディ”は二価のホモ二量体scFv誘導体を意味するために用いられる。これは、二量体化領域として免疫グロブリン、好ましくはIgG、最も好ましくはIgG1のCH3領域を含む融合タンパク質からなる。これは、ヒンジ領域(同様にIgGの)およびリンカー領域によりscFvフラグメントと結合する。このようなミニボディの例は、Huら(1996)により記載されている。
当該技術分野において、用語“トリアボディ”は三価のホモ三量体scFv誘導体を意味するために用いられる(Korttら、1997)。リンカー配列を用いないVH-VLの直接融合により三量体の形成がもたらされる。二価、三価または四価の構造を有するミニ抗体として当該技術分野で公知のフラグメントもまたscFvフラグメントの誘導体である。二量体、三量体または四量体コイルドコイル構造体を用いて多量体化が達成される(Packら、1993および1995;Lovejoyら、1993)。
蛍光タンパク質をコードする遺伝子
他の実施形態において、本発明の発現ベクターは、対象遺伝子に機能的に結合されている蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、対象タンパク質/産物および蛍光タンパク質がバイシストロン性mRNAによりコードされるように単一の異種プロモーターの調節下で両遺伝子が転写される。これは、蛍光タンパク質の発現率を用いて、対象タンパク質/産物を大量に産生する細胞を同定することを可能にする。また、蛍光タンパク質をコードする遺伝子の転写は、それ自身のプロモーターの調節下で行われるようにすることができる。
蛍光タンパク質は、例えば緑色、帯青緑色、青色、黄色または他の色の蛍光タンパク質であることができる。1つの特定例は、オワンクラゲ(Aequorea victoria)またはウミシイタケ(Renilla reniformis)から得られる緑色蛍光タンパク質(GFP)およびそれらから開発された変異体である。例えばBennetら、1998;Chalfieら、1994;WO01/04306およびそれらに引用されている文献を参照のこと。
他の蛍光タンパク質およびそれらをコードする遺伝子は、WO00/34318、WO00/34326、WO00/34526およびWO01/27150(これらは参照により本願に組み込まれる)に記載されている。これらの蛍光タンパク質は、非生物発光性生物であるAnthozoa種、例えばAnemonia majano、Clavularia sp.、Zoanthus sp. I、Zoanthus sp. II、Discosoma striata、Discosoma sp. “red”、Discosoma sp. “green”、Discosoma sp. “Magenta”、Anemonia sulcata、Aequorea coerulescensのフルオロフォアである。
本発明に用いられる蛍光タンパク質は、野生型タンパク質に加えて、例えば他のタンパク質またはペプチドに融合させた天然または遺伝子組み換え変異体およびそれらの変種、フラグメント、誘導体または変種を含む。用いられた変異は、例えば、タンパク質の励起もしくは発光スペクトル、発色団の形成、減衰係数または安定性を変えることができる。さらに、哺乳動物細胞または他の種における発現は、コドン最適化により改善されることができる。本発明によれば、蛍光タンパク質はまた、選択マーカー、好ましくはジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)などの増幅選択マーカーと融合させて用いることができる。
蛍光タンパク質により放出される蛍光は、例えば蛍光表示式細胞分離器(FACS)を備えたフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡検査によりタンパク質を検出することを可能にする。
他の調節配列
発現ベクターは、対象遺伝子の発現および好ましくは蛍光タンパク質の発現を可能にする少なくとも1つの異種プロモーターを含む。
用語“プロモーター”は、遺伝子またはそれに機能的に連結された配列の転写を可能にし調節するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび転写の開始部位(転写開始部位)と結合する認識配列を含む。特定の細胞型または宿主細胞内で望ましい配列を発現させるためには、適切な機能的プロモーターが選択されなければならない。構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび抑制プロモーターを含む、種々の供給元からの種々のプロモーターが当業者には明らかであろう。例えば、それらはGenBankなどのデータバンクに寄託されており、または商業的または個々の供給元から個々の領域またはポリヌクレオチド配列にクローニングされた領域として入手することができる。誘導性プロモーターにおいて、プロモーターの活性はシグナルに応じて増減されることができる。誘導性プロモーターの1例はテトラサイクリン(tet)プロモーターである。これは、テトラサイクリン依存性トランスアクチベータータンパク質(tTA)により誘導されうるテトラサイクリンオペレーター配列(tetO)を含む。テトラサイクリンの存在下でtTAのtetOへの結合は阻害される。他の誘導性プロモーターの例は、jun、fos、メタロチオネインおよび熱ショックプロモーターである(Sambrookら、1989;Gossenら、1994もまた参照のこと)。
真核生物における高発現に特に適したプロモーターには、例えばハムスターのユビキチン/S27aプロモーター(WO97/15664)、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの末端反復領域、ヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターがある。他の異種哺乳動物のプロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリンまたは熱ショックプロモーター(単数または複数)である。
発現カセットにおける転写活性を増強/調節するために、対応する異種プロモーターは他の調節配列に機能的に連結されていることができる。
例えば、プロモーターは、転写活性を増強するためにエンハンサー配列に機能的に結合させることができる。このために、例えばCMVまたはSV40エンハンサーなどの1以上のエンハンサーおよび/または数コピーのエンハンサー配列を使用することができる。よって他の実施形態において、本発明の発現ベクターは1以上のエンハンサー/エンハンサー配列を含み、好ましくはCMVまたはSV40エンハンサーを含む。
用語エンハンサーは、シス位置においてプロモーターの活性に影響を及ぼし、それによりこのプロモーターに機能的に連結された遺伝子の転写を刺激するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの作用は位置および配向とは無関係であり、従ってそれらは転写ユニットの前もしくは後、イントロン内またはコード領域内にさえ位置することができる。エンハンサーは転写ユニットの極近傍のみならず、プロモーターからかなり離れた部位でも位置することができる。プロモーターと物理的および機能的に重複することも可能である。独立した領域またはポリヌクレオチド配列にクローニングされた領域(例えばATCCに寄託された、または商業的または個々の供給元から)として入手可能な種々の供給元からの多くのエンハンサー(GenBankなどのデータバンクに寄託されている、例えばSV40エンハンサー、CMVエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー)は当業者には明らかであろう。多くのプロモーター配列はまた、頻繁に使用されるCMVプロモーターなどのエンハンサー配列も含む。ヒトCMVエンハンサーは、今までに同定された最強のエンハンサーの1つである。誘導性エンハンサーの1例はメタロチオネインエンハンサーであり、これはグルココルチコイドまたは重金属により刺激され得る。
他の可能な修飾は、例えば複数のSp1結合部位の導入である。プロモーター配列はまた、転写活性の調節/制御を可能にする調節配列と組み合わされることができる。それと共に、プロモーターを抑制性/誘導性にすることができる。このことは、例えば上方制御または下方制御転写因子の結合部位である配列に結合することにより行うことができる。例えば前記の転写因子Sp1は転写活性にプラス効果を有する。別の例は、アクチベータタンパク質AP1の結合部位であり、転写に対してプラス方向にもマイナス方向にも作用することができる。AP1の活性は、例えば、増殖因子、サイトカインおよび血清などのあらゆる種類の因子により調節されることができる(Faisstら(1992)およびその中の引用文献)。転写効率はまた、1、2、3またはそれ以上の塩基の変異(置換、挿入または欠失)によりプロモーター配列を変え、ついでレポーター遺伝子アッセイにおいてこの変異がプロモーター活性を増強させるかどうかを決定することにより増強させることができる。
基本的に、さらなる調節配列は、異種プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナルならびに他の発現調節配列を含む。誘導性および構成的調節配列は共に種々の細胞型で知られている。
“転写-調節配列”は、一般に発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位ならびにポリアデニル化シグナルを含む。
用語“転写開始部位”は、一次転写産物、すなわちmRNA前駆体に組み込まれている最初の核酸に対応する構築物中の核酸を指す。転写開始部位はプロモーター配列と重複することができる。
用語“転写終結部位”は、通常は対象遺伝子または転写される遺伝子セクションの3'末端に位置し、RNAポリメラーゼによる転写終結をもたらすヌクレオチド配列を指す。
“ポリアデニル化シグナル”は、真核mRNAの3'末端における特定部位での切断および切断された3'末端における約100〜200アデニンヌクレオチド(ポリA尾部)配列の転写後取り込みを引き起こすシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは、切断部位の約10〜30ヌクレオチド上流の配列AATAAAおよび下流に位置する配列を含む。種々のポリアデニル化領域、例えばtk polyA、SV40後期および初期polyAまたはBGH polyAなどが知られている(例えばUS5,122,458に記載されている)。
“翻訳調節配列”は、発現される各ポリペプチドの翻訳開始部位(AUG)、終止コドンおよびポリAシグナルを含む。最適発現にとって、転写または発現レベルで発現に影響を与えうる任意の不適当な可能性のあるさらなる翻訳開始コドンまたは他の配列を除去するために、発現される核酸配列の5'-および/または3'-非翻訳領域を除去、添加または改変することが望ましい場合がある。発現を促進するために、開始コドンのすぐ上流にコンセンサスリボソーム結合部位に挿入することもできる。分泌ポリペプチドを産生するために、対象遺伝子は通例、合成されたポリペプチドをER膜へ、およびそれを介して輸送するシグナル前駆体ペプチドをコードするシグナル配列を含む。シグナル配列は、常にではないがしばしば分泌タンパク質のアミノ末端に位置し、タンパク質がER膜に浸透した後、シグナルペプチダーゼにより切断される。遺伝子配列は、常にではないが通例それ自体のシグナル配列を含む。ネイティブシグナル配列が存在しない場合、公知の方法で異種シグナル配列を導入することができる。この種の多くのシグナル配列が当業者に公知であり、GenBankおよびEMBLなどの配列データバンクに寄託されている。
別の調節配列には、内部リボソーム侵入部位(internal ribosomal entry site;IRES)がある。IRES配列要素は、5'末端メチルグアノシンキャップ(CAP構造)および上流遺伝子とは独立して翻訳開始を機能的に活性化し、動物細胞において単一の転写産物から2つのシストロン(オープンリーディングフレーム)の翻訳を可能にする配列を含む。IRES配列要素は、すぐ下流に位置するオープンリーディングフレームの翻訳のための独立したリボソーム侵入部位を提供する。多シストロン性であることができる細菌mRNA(すなわちそれはmRNAにより交互に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドまたは産物をコードすることができる)と対照的に、動物細胞由来のmRNAの大部分は単シストロン性であり、1つのみのタンパク質または産物をコードする。真核細胞における多シストロン性の転写産物の場合は、最も近い上流である翻訳開始部位から翻訳が開始され、最初の終止コドンで終結され、その後転写産物はリボソームから解離する。従って、翻訳中、mRNAによりコードされる最初のポリペプチドまたは産物のみが産生される。それに反して、転写産物の第2または次のオープンリーディングフレームに機能的に結合されているIRES配列要素を有する多シストロン性の転写産物は、その下流にあるオープンリーディングフレームの続く翻訳を可能にし、それにより真核細胞内で同じ転写産物によりコードされる2以上のポリペプチドまたは産物が産生される。
IRES配列要素は種々の長さおよび種々の起源のものがあり得、例えば脳心筋炎ウイルス(encephalomyocarditis virus; EMCV) または他のピコルナウイルスであり得る。種々のIRES配列およびそれらのベクター構築における使用は文献に記載されている。例えばPelletierら、1988;Jangら、1989;Daviesら、1992;Adamら、1991;Morganら、1992;Sugimotoら、1994;Rameshら、1996;Mosserら、1997を参照のこと。
下流にある遺伝子配列はIRES配列要素の3'末端に機能的に結合されている。すなわち、意図された目的のために遺伝子の発現が影響を受けない、またはわずかに影響を受ける、または十分発現されるようにスペースが選択される。十分な発現のための、IRES配列要素とその下流にある遺伝子の開始コドンの間の最適の許容される距離は、スペースを変え、レポーター遺伝子アッセイを用いるスペースの機能としての発現率を測定することによる簡単な実験により決定できる。
記載されている手段により、異種遺伝子産物の発現に大きな価値がある最適発現カセットを得ることができる。従って、1以上のこれらの手段を用いて得られた発現カセットはさらなる本発明の主題である。
ハムスター-ユビキチン/S27aプロモーター
他の実施形態において、本発明の発現ベクターは、ハムスターのユビキチン/S27aプロモーターを含み、好ましくは対象遺伝子に機能的に結合されているハムスターのユビキチン/S27aプロモーターを含み、そしてより好ましくは対象遺伝子および蛍光タンパク質または選択マーカーをコードする遺伝子に機能的に結合されているハムスターのユビキチン/S27aプロモーターを含む。
ハムスターのユビキチン/S27aプロモーターは、WO97/15664に記載されている強力な同種プロモーターである。このようなプロモーターは、好ましくは、以下の特徴の少なくとも1つを有する:GCリッチ配列領域、Sp1結合部位、ポリピリミジン領域、TATAボックスの不存在。特に好ましいものは、Sp1結合部位を有するがTATAボックスを含まないプロモーターである。また、構成的に活性化され、特に血清含有、低血清および無血清細胞培養条件下で同様に活性を示すプロモーターも好ましい。他の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターであり、特に血清の除去により活性化されるプロモーターである。
特に有利な実施形態は、WO97/15664の図5に含まれるヌクレオチド配列を有するプロモーターである。特に好ましいものは、図5の位置-161〜-45の配列を含むプロモーター配列である。
本特許明細書の実施例に用いられているプロモーターは、それぞれWO97/15664の図5からのフラグメント-372〜+111に対応し、好ましいプロモーターを示す(すなわち好ましいプロモーターはこの配列領域を組み込むべきである)配列を有するDNA分子を含む。
本発明の発現ベクターの製造
本発明の発現ベクターは、理論上、当該技術分野で公知の慣用法、例えばSambrookら(1989)によって記載されている方法により製造できる。Sambrookはまた、ベクターの機能的構成要素、例えば適切なプロモーター(ハムスターユビキチン/S27aプロモーターに加えて)、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナル、抗生物質耐性遺伝子、選択マーカー、複製開始点およびスプライシングシグナルも記載している。従来のクローニングベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミドまたはウイルスベクター、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ベクターおよび単純ヘルペスウイルスばかりでなく合成または人工染色体/ミニ染色体をそれらの製造に使用できる。真核発現ベクターはまた、一般的には、原核性配列、例えば複製起点および、細菌内でベクターの複製および選択を可能にする抗生物質耐性遺伝子も含む。ポリヌクレオチド配列の導入のためのマルチクローニング部位を含む多くの真核発現ベクターが公知であり、一部は種々の会社、例えばStratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, WI ,USAまたはBD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USAから購入することができる。
例えば、異種プロモーター、対象遺伝子(単数または複数)、選択マーカーおよび場合により蛍光タンパク質をコードする遺伝子、さらなる調節配列、例えば内部リボソーム侵入部位(IRES)、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他のシス作用性配列要素、たとえばTE配列要素が当業者に公知の方法で発現ベクターに導入される。本発明の発現ベクターは、最小限、異種プロモーター、対象遺伝子およびTE配列要素を含む。好ましくは、発現ベクターはまた蛍光タンパク質をコードする遺伝子も含む。異種プロモーターとしてユビキチン/S27aプロモーターを使用することが、本発明に特に好ましい。異種プロモーター、好ましくはユビキチン/S27aプロモーター、対象遺伝子およびTE配列要素が機能的に連結されているあるいは機能的に結合されている発現ベクターが特に好ましい。
本明細書において、用語“機能的結合”または“機能的に結合されている”は、意図された機能を発揮できるように配置された2以上の核酸配列または部分配列を指す。例えば、プロモーター/エンハンサー、プロモーター/TE配列要素またはプロモーター/エンハンサー/TE配列要素は、それがシス位置にある結合された遺伝子配列の転写を調節またはモジュレートすることができる場合、コード遺伝子配列に機能的に結合されている。常にではないが、一般に、機能的に結合されているDNA配列は近接しており、2つのコード遺伝子配列が結合されているかあるいは分泌シグナル配列の場合は同じリーディングフレームに存在する。機能的に結合されているプロモーターは一般にコード遺伝子配列の上流に位置するが、必ずしもそれに近接している必要はない。遺伝子配列の転写または発現を助ける限りは、エンハンサーは接近している必要はない。このために、エンハンサーは遺伝子配列の上流であることも下流であることもでき、あるいは遺伝子配列からかなりの距離であることもできる。ポリアデニル化部位は、ポリアデニル化シグナルに対するコード配列により転写が進むように遺伝子配列の3'末端に配置されている場合、遺伝子配列に機能的に結合されている。従来の組換え法、例えばPCR技術、適切な制限酵素切断部位での連結反応またはスプライシングにより結合を行うことができる。適切な制限酵素切断部位が利用可能でない場合、公知の方法で合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターを使用することができる。
一実施形態において、異種プロモーター、好ましくはaユビキチン/S27aプロモーターまたはCMVプロモーター、対象遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子は機能的に連結されている。このことは、例えば対象遺伝子と蛍光タンパク質をコードする遺伝子とが同じ異種プロモーターから出発して発現されることを意味する。特に好ましい実施形態において、二シストロン性mRNAが両遺伝子から合成されるように、IRES配列要素による機能的結合が行われる。本発明の発現ベクターは、さらに、1以上のプロモーターに機能的に作用するエンハンサー領域および/またはTE配列要素を含むことができる。異種プロモーター、好ましくはユビキチン/S27aプロモーターもしくはその修飾体またはCMVプロモーターがエンハンサー領域、例えばSV40エンハンサーまたはCMVエンハンサー領域およびTE配列要素に結合されている発現ベクターが特に好ましい。
基本的には、発現ベクター内の遺伝子の発現は、1以上の転写ユニットから出発して行うことができる。用語転写ユニットは、転写される1以上の遺伝子を含む領域として定義される。転写ユニット内の遺伝子は、このユニット内のすべての遺伝子が同じプロモーター、プロモーター/エンハンサーまたはプロモーター/エンハンサー/TE配列要素の転写調節にあるように互いに機能的に結合されている。遺伝子のこの転写結合の結果として、転写ユニットから2以上のタンパク質または産物が転写され、従って発現されることができる。各転写ユニットは、それらが含まれる遺伝子配列の転写および翻訳に必要な調節配列を含む。各転写ユニットは同一または異なる調節配列を含むことができる。転写ユニット内の遺伝子の機能的結合のために、IRES配列要素またはイントロンを使用することができる。
発現ベクターは、対象遺伝子(単数または複数)、選択マーカーおよび場合により蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現する単一の転写ユニットを含むことができる。また、これらの遺伝子は2以上の転写ユニットに配置されることもできる。転写ユニット内の遺伝子の種々の組み合わせが可能である。本発明の他の実施形態において、1、2またはそれ以上の転写ユニットからなる2以上の発現ベクターを、任意の望ましい順序で同時トランスフェクションまたは連続トランスフェクションにより宿主細胞に挿入することができる。転写ユニットの適切な発現が確実にされるという条件で、各ベクター上の調節配列および遺伝子の任意の組み合わせを選択することができる。必要に応じて、他の調節配列、たとえばTE配列要素および遺伝子、例えばさらなる対象遺伝子または選択マーカーを発現ベクター上に配置することができる。
また、本発明の好ましい発現ベクターは、1以上のTE配列要素を含み、対象遺伝子の代わりに、制限エンドヌクレアーゼの認識配列により対象遺伝子のクローニングを可能にするマルチクローニング部位のみを有する発現ベクターである。各種の制限エンドヌクレアーゼの多数の認識配列ばかりでなく、関連した制限エンドヌクレアーゼも先行技術で公知である。好ましくは、認識配列として少なくとも6ヌクレオチドからなる配列が用いられる。適切な認識配列のリストは、例えばSambrookら(1989)中に見いだすことができる。
また、本発明の好ましい発現ベクターは、対象遺伝子のかわりに制限エンドヌクレアーゼの認識配列による対象遺伝子のクローニングを可能にするマルチクローニング部位のみを有し、さらに発現ベクターの異なる位置に1以上の好ましくはマルチクローニング部位を有し、さらに制限エンドヌクレアーゼの認識配列によりTE配列要素をクローニングすることを可能にする発現ベクターである。各種の制限エンドヌクレアーゼの多数の認識配列ばかりでなく、関連した制限エンドヌクレアーゼも先行技術で公知である。好ましくは、認識配列として少なくとも6ヌクレオチドからなる配列が用いられる。適切な認識配列のリストは例えばSambrookら(1989)中に見いだすことができる。
宿主細胞
本発明の発現ベクターによるトランスフェクションのために、真核宿主細胞が用いられ、好ましくは哺乳動物細胞が用いられ、より具体的にはげっ歯類細胞、たとえばマウス、ラットおよびハムスター細胞株が用いられる。本発明の発現ベクターによる対応する細胞のトランスフェクションの成功により、トランスフォーム細胞、遺伝子改変細胞、組換え細胞またはトランスジェニック細胞がもたらされ、これらもまた本発明の主題である。
本発明のための好ましい宿主細胞は、ハムスター細胞、例えばBHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1およびCHO-DG44細胞またはこれらの細胞株の亜株/子孫である。特に好ましいものはCHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1およびBHK21細胞であり、特にCHO-DG44およびCHO-DUKX細胞である。同様に、適切なものはマウス由来の骨髄腫細胞であり、好ましくはNS0およびSp2/0細胞であり、これらの細胞株の亜株/子孫である。
本発明に用いることができるハムスターおよびマウス細胞の例は、次の表1に示される。しかしながら、生物医薬品タンパク質の産生のための宿主細胞としてこれらの細胞、ヒト、マウス、ラット、サル、げっ歯動物の細胞株（これらに限定されないを含む）他の哺乳動物細胞または酵母、昆虫、鳥および植物細胞（これらに限定されない）を含む真核細胞の亜株および子孫もまた使用できる。
表1:ハムスターおよびマウスの産生細胞株
Figure 0005270544
ポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターの1つを用いる真核宿主細胞のトランスフェクションは、慣用法により行われる(Sambrook ら、1989; Ausubel ら、1994)。トランスフェクションの適切な方法は、例えばリポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、ポリカチオン(例えばDEAEデキストラン)媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクションおよびウイルス感染を含む。本発明によれば、好ましくは構築物が宿主細胞または人工染色体/ミニ染色体のゲノムに組み込まれるかまたは宿主細胞においてエピソームとして安定に含まれる安定なトランスフェクションが行われる。当該の宿主細胞において、最適のトランスフェクション頻度および異種遺伝子の発現をもたらすトランスフェクション法が好ましい。定義により、宿主細胞に挿入されたすべての配列またはすべての遺伝子は宿主細胞との関連で“異種配列”または“異種遺伝子”と呼ばれる。これは、導入される配列または導入される遺伝子が宿主細胞の内因性配列または内因性遺伝子と同一であっても適用される。例えば、ハムスター宿主細胞に導入されるハムスターアクチン遺伝子は定義により異種遺伝子である。
本発明によれば、本明細書記載の本発明の発現ベクターの1つでトランスフェクトした、組換え哺乳動物細胞、好ましくはげっ歯類細胞、最も好ましくはハムスター細胞、例えばCHOまたはBHK細胞が好ましい。
ヘテロ多量体タンパク質、例えばモノクローナル抗体(mAb)の組換え産生において、適切な宿主細胞のトランスフェクションは、理論上は2つの異なる方法により行われることができる。この種のmAbはいくつかのサブユニット、重鎖および軽鎖からなる。これらのサブユニットをコードする遺伝子は、単一のプラスミド上の独立したまたは多シストロン性の転写ユニットに収容することができ、次いでそれを用いて宿主細胞がトランスフェクトされる。これは、宿主細胞のゲノムに組み込んだ後に遺伝子の化学量論的発現量を確実にすることを目的としている。しかしながら、独立した転写ユニットの場合は、これによって異なるタンパク質をコードするmRNAが同じ安定性ならびに転写効率および翻訳効率を示すことが確実にされなければならない。第2の場合では、単一のプロモーターによって多シストロン性の転写ユニット内で遺伝子の発現が起こり、1つの転写産物のみが生成される。IRES配列要素を用いることにより、第2のそれに続くシストロンにおいて遺伝子の高い効率の内部翻訳開始が行われる。しかしながら、これらのシストロンの発現率は第1シストロンよりも低く、いわゆる“キャップ”に依存した転写開始前複合体によるその翻訳開始は、IRESに依存した翻訳開始よりもかなり効率的である。シストロンの正確に等モルの発現を達成するために、例えばIRES配列要素と共に均一な発現率を確かにするさらなるシストロン間の領域を導入することができる(WO94/05785)。
本発明によるいくつかの異種タンパク質を作製する別の可能な方法は、遺伝子が異なる発現ベクターに組み込まれ、異なる時間にトランスフェクトされる遂次トランスフェクションである。例えば、2つのトランスフェクション工程において、抗体の重鎖および軽鎖を交互に細胞に導入することができる。
本発明に好ましいいくつかの異種タンパク質を同時に作製する別の可能な方法は、遺伝子が異なる発現ベクターに別々に組み込まれた同時トランスフェクションである。このことは、遺伝子および遺伝子産物の特定の割合を互いに調節でき、それによってmRNAの安定性ならびに転写および翻訳の効率における任意の相違を相殺する利点を有する。加えて、発現ベクターはその小さなサイズのためにより安定であり、クローニング中にもトランスフェクション中にも取り扱いがより容易である。
従って、本発明の特定の一実施形態において、宿主細胞は、1以上の他の対象タンパク質をコードする遺伝子を有する1以上のベクターでさらにトランスフェクトされ、好ましくは同時トランスフェクトされる。他のベクターまたは同時トランスフェクションに使用されるベクターは、例えば、同じプロモーターの調節下にある、好ましくは同じプロモーター/エンハンサーの組み合わせの調節下にある、または特に好ましくは、同じプロモーター/エンハンサー/TE配列要素の組み合わせの調節下にある、あるいは異なるTE配列要素を有する同じプロモーター/エンハンサーの組み合わせの調節下にある他のタンパク質または対象タンパク質および少なくとも1つの選択マーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素をコードする。
本発明の他の実施形態において、トランスフェクションに使用されるベクターは、任意の組み合わせ、位置および配向の1以上のTE配列要素を含むことができる。
本発明の別の特定の実施形態において、宿主細胞は、少なくとも2つの真核発現ベクターであって、2つのベクターの少なくとも1つは少なくとも対象タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含み、一方他のベクターは任意の組み合わせ、位置および配向の本発明の1以上の核酸を含み、場合により少なくとも1つの対象遺伝子もコードする前記真核発現ベクターで同時トランスフェクトされ、本発明のこれらの核酸は、他のベクターを用いる同時組み込みにより、他の同時トランスフェクトしたベクター上に位置する対象遺伝子に転写または発現促進活性を付与する。
本発明によれば、宿主細胞は、好ましくは無血清条件下で、場合により動物タンパク質/ペプチドを含まない培地で樹立され、順応され、培養される。市販の培地の例は、Ham's F12(Sigma, Deisenhofen, DE)、RPMI-1640(Sigma)、ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM; Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM; Sigma)、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM; Sigma)、CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、無血清CHO-Medium(Sigma)および無タンパク質CHO-Medium(Sigma)を含む。これらの培地のそれぞれには、場合により種々の化合物、例えばホルモンおよび/または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン様成長因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩)、緩衝液(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン、チミジン)、グルタミン、グルコースまたは他の同等の栄養素、抗生物質および/または微量元素を添加することができる。本発明によれば、無血清培地が好ましいが、適切な量の血清を混合した培地を用いて宿主細胞を培養することもできる。1以上の選択マーカー遺伝子を発現する遺伝子改変細胞を選択するために、1以上の選択剤が培地に添加される。
用語“選択剤”は、当該の選択マーカー遺伝子が欠乏する宿主細胞の増殖または生存に影響を与える物質を指す。本発明においては、好ましくは、野生型または好ましくは改変ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む異種宿主細胞の選択のための培地添加剤としてジェネティシン(G418)が用いられる。好ましくは、100〜800μg/mlの培地G418濃度が用いられ、最も好ましくはG418 200〜400μg/培地mlが用いられる。宿主細胞がいくつかの発現ベクターでトランスフェクトされる場合、例えばいくつかの対象遺伝子が宿主細胞に別々に導入される場合、それらは一般に異なる選択マーカー遺伝子を有する。
選択マーカー遺伝子は、培養培地へ対応する選択剤を添加することによりこの遺伝子を含む細胞の特異的選択を可能にする遺伝子である。例として、抗生物質耐性遺伝子を正の選択マーカーとして使用できる。この遺伝子でトランスフォームされた細胞のみが対応する抗生物質の存在下で存在でき、従って選択される。他方では、トランスフォームされない細胞はこれらの選択条件下では増殖または生存することができない。正、負および二機能選択マーカーが存在する。選択剤への耐性を付与するかまたは宿主細胞において代謝または異化欠陥を相殺することにより、正の選択マーカーは選択を可能にし、従って形質転換細胞の濃縮を可能にする。それに反して、選択マーカーのための遺伝子を受け取った細胞は、負の選択マーカーにより選択的に除去することができる。この例は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子であり、同時にアシクロビルまたはガンシクロビルを添加すると細胞中の発現によりその細胞が除去される。増幅選択マーカーを含む本発明に使用される選択マーカーは、選択マーカーがその選択特性を維持している限り、遺伝子改変変異体および変種、フラグメント、機能的等価物、誘導体、ホモログならびに他のタンパク質またはペプチドとの融合物を含む。このような誘導体は、選択に関与すると見なされる領域またはドメインのアミノ酸配列においてかなりの相同性を示す。文献には、二機能(正/負)マーカー(例えばWO92/08796およびWO94/28143参照)を含む多数の選択マーカー遺伝子が記載されている。真核細胞において通例用いられる選択マーカーの例は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HYG)、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、チミジンキナーゼ(TK)、グルタミン合成酵素、アスパラギンシンテターゼの遺伝子ならびにネオマイシン(G418)、ピューロマイシン、ヒスチジノールD、ブレオマイシン、フレオマイシンおよびゼオシンに耐性を付与する遺伝子を含む。
用語“改変ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPT)”は、WO2004/050884に記載のすべての変異体、特にアミノ酸位置227におけるグリシン(Gly、G)に対するアスパラギン酸(Asp、D)の置換を特徴とする変異体D227G(Asp227Gly)および特に好ましくはアミノ酸位置240におけるイソロイシン(Ile、I)に対するフェニルアラニン(Phe、F)の置換を特徴とする変異体F240I(Phe240Ile)を含む。
従って、本発明は、(i)少なくとも1つの対象タンパク質/産物およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(好ましくは改変された)をコードする遺伝子であって、対象遺伝子(単数または複数)が転写または発現を促進するために少なくとも1つのTE配列要素に機能的に結合されている前記遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトし;(ii)種々の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養し;(iii)選択剤、例えばG418の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を選択する工程を含む、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法を含む。好ましくは、トランスフェクトされた細胞は血清無添加で、培地中で培養される。好ましくは、G418の濃度は少なくとも200μg/mLである。しかしながら、この濃度はまた少なくとも400μg/mLであることもできる。
増幅選択マーカー遺伝子
加えて、本発明の細胞は、場合により、増幅選択マーカー遺伝子の増幅をもたらす選択剤の存在下で培養される1以上の遺伝子増幅工程を受けることもできる。
増幅選択マーカーをコードする遺伝子でさらに宿主細胞がトランスフェクトされることが必要条件である。増幅選択マーカーをコードする遺伝子が本発明の発現ベクターの1つ上に存在するかあるいは別のベクターを用いて宿主細胞に導入されることが考えられる。
増幅選択マーカー遺伝子は、通例、特定の培養条件下で真核細胞の増殖に必要な酵素をコードする。例えば、増幅選択マーカー遺伝子はジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードすることができる。この場合は、それらでトランスフェクトした宿主細胞が選択剤メトトレキセート(MTX)の存在下で培養される場合に遺伝子が増幅される。
以下の表2に、本発明に用いることができる他の増幅選択マーカー遺伝子および関連した選択剤の例を示す。これらは、Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990)による概説に記載されている。
表2:増幅選択マーカー遺伝子
Figure 0005270544

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本発明によれば、使用される増幅選択マーカー遺伝子は、好ましくはDHFRの機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、例えばDHFRまたは蛍光タンパク質およびDHFRからの融合タンパク質である。DHFRはプリンの生合成に必要である。DHFR遺伝子を欠く細胞はプリン欠乏培地で増殖できない。従ってDHFR遺伝子は、プリンを含まない培地で培養した細胞内の遺伝子を選択し増幅するための有用な選択マーカーである。DHFR遺伝子と共に用いる選択培地はメトトレキセート(MTX)である。
哺乳動物細胞、好ましくはマウス骨髄腫およびハムスター細胞は、増幅選択マーカーとしてのDHFRの使用のための好ましい宿主細胞である。細胞株CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)およびCHO-GD44(Urlaubら、1983)は、変異の結果としてそれ自身のDHFR活性を有さないので特に好ましい。それ自身の内因性DHFR活性を有さない他の細胞型においてもDHFR誘発増幅を可能にするためには、トランスフェクションプロセスにおいて、メトトレキセートに対する感度が低下したタンパク質をコードする変異DHFR遺伝子を使用することができる(Simonsonら、1983;Wiglerら、1980;Haberら、1982)。
DHFRマーカーは、CHO-DG44またはCHO-DUKXなどのDHFR陰性基本細胞を用いるとき、選択とその後の増幅に特に適している。なぜならこれらの細胞は内因性DHFRを発現せず、従ってプリンを含まない培地では増殖しないからである。従って、本明細書においてはDHFR遺伝子を主要な選択マーカーとして用いることができ、形質転換細胞はヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で選択される。
従って、本発明は、(i)少なくとも1つの対象タンパク質/産物および増幅選択マーカーDHFRをコードする遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、転写または発現を促進するために少なくとも対象遺伝子(単数または複数)が少なくとも1つのTE配列要素に機能的に結合されている、工程;(ii)種々の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程;および、(iii)少なくとも増幅選択マーカー遺伝子の増幅を可能にする選択剤、たとえばメトトレキセートの存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を増幅する工程を含む、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法を含む。好ましくは、トランスフェクトされた細胞は、血清無添加で、増加するMTXの濃度を加えたヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で培養される。好ましくは、第1増幅工程におけるMTXの濃度は少なくとも100nMである。しかしながら、MTXの濃度は少なくとも250nMであることもでき、少しずつ1μMまで増加させることができる。個々の場合において、1μM以上の濃度もまた使用でき、例えば2μMも使用できる。
本発明はまた、(i)少なくとも1つの対象タンパク質/産物、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(好ましくは改変された)および増幅選択マーカーDHFRをコードする遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、転写または発現を促進するために少なくとも対象遺伝子(単数または複数)が少なくとも1つのTE配列要素に機能的に結合されている、前記工程;(ii)種々の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程;(iii)ヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で、選択剤、例えばG418の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を選択する工程;および、(iv)少なくとも増幅選択マーカー遺伝子の増幅を可能にする選択剤、例えばメトトレキセートの存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を増幅する工程、を含む、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法を含む。好ましくは、トランスフェクトされた細胞は、少なくとも200μg/mLのG418、好ましくは400μg/mL以上のG418を添加し、血清無添加で、増加するMTXの濃度を加えたヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で培養される。好ましくは、第1増幅工程におけるMTXの濃度は少なくとも100nMである。しかしながら、MTXの濃度は少なくとも250nMであることもでき、少しずつ1μMまで増加させることができる。個々の場合において、1μM以上の濃度も使用でき、例えば2μMも使用できる。
蛍光表示式細胞分離器(FACS)により形質転換細胞を選択することも可能である。このために、形質転換細胞の選択のために、細菌β-ガラクトシダーゼ、細胞表面マーカーまたは蛍光タンパク質を使用できる(例えばオワンクラゲ(Aequorea victoria)およびウミシイタケ(Renilla reniformis)または他の種由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)ならびにその変種;非生物発光性生物、例えばDiscosoma sp.、Anemonia sp.、Clavularia sp.、Zoanthus sp.、Aequorea coerulescens由来の赤色蛍光タンパク質および他の色の蛍光を発するタンパク質ならびにその変種)。
遺伝子発現および高生産性宿主細胞の選択
用語遺伝子発現は、宿主細胞における異種遺伝子配列の転写および/または翻訳に関する。発現率は、一般に、宿主細胞に存在する対応するmRNAの量に基づくかまたは対象遺伝子によりコードされる、産生される遺伝子産物の量に基づいて決定できる。選択されたヌクレオチド配列の転写により産生されるmRNAの量は、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼ-RNA-プロテクション、細胞RNAのin situハイブリダイゼーションまたはPCR法(例えば定量PCR)により測定できる(Sambrookら、1989;Ausubelら、1994)。選択されたヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、種々の方法、例えば、ELISA、プロテインA HPLC、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物活性の検出、タンパク質の免疫染色に続くFACS分析または蛍光顕微鏡検査、FACS分析または蛍光顕微鏡検査による蛍光タンパク質の直接検出によって測定することもできる(Sambrookら、1989;Ausubelら、1994)。これらの方法により、例えば本発明の配列番号1のTE配列要素またはその任意の部分、フラグメントもしくは領域またはその誘導体もしくは組み合わせが対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらすかどうかを研究する事が可能となる。
“発現、転写または生産性の促進”は、宿主細胞に導入される異種配列、例えば治療用タンパク質をコードする遺伝子の、対照と比較しての発現または合成の促進を意味する。本発明の細胞が本発明記載の方法により培養され、この細胞が少なくとも1.3倍または1.5倍の比生産性の増加を示す場合、あるいは好ましくは2倍の比生産性を示す場合、発現、転写または生産性の促進が存在する。本発明の細胞が少なくとも3倍の比生産性を示す場合もまた発現、転写または生産性の促進が存在する。特に、本発明の細胞が少なくとも4倍の比生産性を示す場合、発現、転写または生産性の促進が存在する。特に、本発明の細胞の比生産性が少なくとも5倍に増加する場合、発現、転写または生産性の促進が存在する。特に、本発明の細胞の比生産性が少なくとも6倍に増加する場合、発現、転写または生産性の促進が存在する。特に、本発明の細胞の比生産性が少なくとも7倍に増加する場合、発現、転写または生産性の促進が存在する。
本発明の発現ベクターの1つを使用しても、本発明の方法の1つを使用しても、発現、転写または生産性の促進を達成できる。
さらなる選択マーカーとして1以上の蛍光タンパク質(例えばGFP)または細胞表面マーカーを含む対応するプロセスを組換え宿主細胞のFACS支援選択と組み合わせることができる。発現上昇を得る他の方法および異なる方法の組み合わせもまた使用でき、例えば、クロマチン構造(例えばLCR、UCOE、EASE、アイソレーター、S/MAR、STAR配列要素)を操作するためのシス作用性配列要素の使用、(人工)転写因子の使用、上方制御内因性または異種遺伝子発現のための天然または合成の薬剤を用いる細胞の処理、mRNAまたはタンパク質の安定性(半減期)の改善、mRNA翻訳の開始の改善、エピソームプラスミドの使用による遺伝子量の増加(複製起点としてのウイルス配列、例えばSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、EBVまたはBPVの使用に基づく)、増幅促進配列の使用(Hemannら、1994)またはDNAコンカテマーに基づくin vitro増幅系(Monacoら、1996)に基づく。
従って、他の実施形態において、本発明は、少なくとも1つの対象異種遺伝子を発現し、(i)本発明の発現ベクターおよび増幅選択マーカー遺伝子のための遺伝子で組換え哺乳動物細胞がトランスフェクトされ;(ii)対象遺伝子(単数または複数)、改変ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を可能にする条件下で哺乳動物細胞が培養され;(iii)哺乳動物細胞の増殖に選択的に作用し、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を発現する細胞の増殖に選択性を与える少なくとも1つの選択剤の存在下で哺乳動物細胞が培養され;(iv)蛍光タンパク質の高発現を示す哺乳動物細胞がフローサイトメトリー分析で選別され;(v)選別された細胞が、増幅選択マーカー遺伝子が発現される条件下で培養され;及び，(vi)培地に選択剤が加えられ、増幅選択マーカー遺伝子の増幅がもたらされることを特徴とする、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法に関する。
本発明によれば、産生細胞が複製され、対象のコード遺伝子産物の製造に用いられる方法もまた好ましい。このために、選択された高生産性の細胞は、好ましくは無血清培地で培養され、かつ好ましくは対象遺伝子の発現を可能にする条件下で浮遊培養にて培養される。対象タンパク質/産物は、好ましくは分泌遺伝子産物として細胞培地から得られる。しかしながら、タンパク質が分泌シグナルなしで発現される場合、遺伝子産物は細胞溶解物から単離されることもできる。他の組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質を実質的に含まない純粋で均一な産物を得るために、通常の精製方法が実施される。まず第1に、細胞および細胞残屑が培地または溶解物から除去される。ついで、例えばイムノアフィニティおよびイオン交換カラム、エタノール沈殿、Sephadex、シリカまたは陽イオン交換樹脂、例えばDEAEによる逆相HPLCまたはクロマトグラフィーによる分別により、望ましい遺伝子産物から混在する可溶性タンパク質、ポリペプチドおよび核酸を除くことができる。組換え宿主細胞により発現される異種タンパク質の精製方法は当業者に公知であり、文献、例えばHarrisら(1995)およびScopes(1988)に記載されている。
本発明の組成物
本発明は、TE-13(配列番号15)もしくはTE-13(配列番号15)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-13(配列番号15)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸に関する。
本発明は、TE-13(配列番号15)もしくはTE-13(配列番号15)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-13(配列番号15)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加もたらす核酸であって、前記フラグメントまたは誘導体が1bp〜1578bp(配列番号01に関して)の核酸領域からの少なくとも1つの配列領域を含む前記核酸に関する。配列領域は、少なくとも10bp、15bp、20bp、50bp、100bpの核酸領域を意味する。
本発明は、TE-13(配列番号15)もしくはTE-13(配列番号15)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-13(配列番号15)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加もたらす核酸であって、フラグメントまたは誘導体がTE-09(配列番号11)またはTE-08(配列番号11)またはTE-13(配列番号15)の少なくとも1つの配列領域を含む前記核酸に関する。同様に、配列領域は少なくとも10bp、15bp、20bp、50bp、100bpの核酸領域を意味する。
対象遺伝子の発現の促進は、例えばELISAにより産物力価を測定することにより測定できる。
好ましい実施形態において、本発明はTE-08(配列番号10)もしくはTE-08(配列番号10)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-08(配列番号10)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含むであって、染色体組み込みによって発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす前記核酸に関する。
ただし、本発明の上記核酸の好ましい実施形態において、同様に前記フラグメントまたは誘導体が1bp〜1578bp(配列番号01に関して)の核酸領域からの少なくとも1つの配列領域を含まなければならない。
本発明の上記核酸の特に好ましい実施形態において、同様に、フラグメントまたは誘導体がTE-09(配列番号11)またはTE-08(配列番号11)またはTE-13(配列番号15)の少なくとも1つの配列領域を含むという条件がある。配列領域は、少なくとも10bp、15bp、20bp、50bp、100bpの核酸領域を意味する。
他の実施形態において、本発明は、配列番号1もしくは配列番号1のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列または配列番号1の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸に関する。
本発明の前記核酸の好ましい実施形態において、同様に、フラグメントまたは誘導体が1bp〜1578bp(配列番号01に関して)の核酸領域からの少なくとも1つの配列領域を含むという条件がある。
本発明の前記核酸の特に好ましい実施形態において、同様に、フラグメントまたは誘導体がTE-09(配列番号11)またはTE-08(配列番号10)またはTE-13(配列番号15)の少なくとも1つの配列領域を含むという条件がある。配列領域は、少なくとも10bp、15bp、20bp、50bp、100bpの核酸領域を意味する。
本発明はまた、配列番号1またはそのフラグメントもしくは誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列を有する対象遺伝子の転写または発現を増加させる核酸(=TE配列要素)であって、対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす前記核酸に関する。
対象遺伝子の発現の増加は、例えばELISAにより産物力価を測定することにより測定できる。
本発明は、特に、
(a)核酸配列TE-13(配列番号15)もしくはTE-08(配列番号10)の領域、または、
(b)それらの相補的核酸配列、または、
(c)(a)もしくは(b)と少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%もしくは85%の配列同一性、特に好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する核酸配列、
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の核酸に関する。
特別な実施形態において、本発明の核酸は少なくとも511bp(=TE-13の長さ、配列番号15)または少なくとも1015bp(=TE-08の長さ、配列番号10)の長さを有する。
好ましい実施形態において、本発明はTE配列要素TE-00(配列番号2)の5'フラグメントに関する。これは1bp〜1578bpの配列番号1の部分またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に対応する。
本発明は、特にTE-13(配列番号15)もしくはTE-08(配列番号10)またはそれらの誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体組み込みによって対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸または転写促進もしくは発現促進核酸配列要素(TE配列要素)に関する。
本発明は、好ましくは単離された核酸または単離された核酸分子または単離された核酸配列または単離された転写促進核酸配列要素または単離されたTE配列要素に関する。
本発明は、特に、TE-08(配列番号10)またはその相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体組み込みによって、発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす単離された核酸に関する。
一実施形態において、核酸または転写促進核酸配列要素または単離された核酸は、TE配列要素配列またはその相補配列の対応する部分、特にTE-00配列の配列領域5’に対応する、配列番号1に関するヌクレオチド位置1bp〜1578bpの配列領域、特に好ましくはTE-13(配列番号15)またはTE-08(配列番号10)と少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%の配列同一性または少なくとも約85%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する配列番号1の(または)TE配列要素の誘導体を含む。
好ましい実施形態において、核酸または転写促進核酸配列要素または単離された核酸は、TE配列要素配列の対応する部分またはそれらの相補配列と少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%の配列同一性または少なくとも約85%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するTE-08核酸(配列番号10)の誘導体または好ましくはTE-13核酸(配列番号15)の誘導体を含む。
他の実施形態において、本発明は、TE配列要素の配列またはTE配列要素の相補配列とハイブリダイズし、特にTE-00配列(配列番号2)の配列領域5’に対応する、配列番号1に関するヌクレオチド位置1bp〜1578bpの配列領域とハイブリダイズし、あるいは特にTE-08領域(配列番号10)とハイブリダイズする核酸または転写促進核酸配列要素または単離された核酸またはTE配列要素の誘導体に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行われる。
別の好ましい実施形態において、本発明の核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)は、TE-00(配列番号2)、TE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-04(配列番号6)、TE-06(配列番号8)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)、TE-12(配列番号14)、TE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)およびTE-21(配列番号21)の中から選択される。
他の実施形態において、核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)は、核酸がTE-00(配列番号2)、TE-06(配列番号8)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)またはTE-12(配列番号14)であり、好ましくはTE-06(配列番号8)であることを特徴とする。
好ましい実施形態において、核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)は、核酸がTE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)であることを特徴とする。
特に好ましい実施形態において、核酸または転写促進配列要素はTE-08(配列番号10)である。
特に好ましい実施形態において、核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)はTE-18(配列番号20)である。
他の実施形態において、核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)は、それがTE-01(配列番号3)のフラグメントまたは誘導体であり、好ましくはTE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)であることを特徴とする。
好ましい実施形態において、本発明の核酸はTE-13(配列番号15)である。
他の実施形態において、本発明の核酸またはフラグメントまたは誘導体は単離された核酸である。
本発明はまた、TE-13(配列番号15)またはTE-08(配列番号10)またはTE-07(配列番号9)またはTE-06(配列番号8)またはこれらの配列のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはこれらの配列の誘導体もしくはこれらの配列のフラグメントの誘導体、好ましくはTE-13(配列番号15)またはTE-08(配列番号10)またはこれらの配列のフラグメントまたはこれらの配列の誘導体もしくはこれらの配列のフラグメントの誘導体もしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含む核酸が異種配列に結合されていることを特徴とする本発明の核酸に関する。
好ましい実施形態において、異種遺伝子配列に結合されている核酸は、発現ベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクターまたは特にターゲティングベクターであることができる。
しかしながら、異種遺伝子配列に結合されている核酸は、任意の他の合成核酸分子例えば合成、人工またはミニ染色体であることもできる。
本発明はさらに、真核発現ベクターが1以上の本発明の核酸または本発明の1以上の転写促進配列要素(TE配列要素)を含むことを特徴とする真核発現ベクターに関する。
特別な実施形態において、この真核発現ベクターはプロモーターおよび/または対象異種遺伝子および/または選択マーカーおよび/または場合によりエンハンサーを含むことを特徴とする。
本発明はさらに、真核発現ベクターが1以上の本発明の核酸または1以上の本発明の転写促進配列要素(TE配列要素)およびプロモーターおよび/または対象異種遺伝子および/または選択マーカーおよび/または場合によりエンハンサーを含むことを特徴とする真核発現ベクターに関する。
他の実施形態において、真核発現ベクターは、それが対象遺伝子の人工的(deliberate)組み込みのためのターゲティングベクターであることを特徴とする。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、プロモーターがヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーター(CMVプロモーター)、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの末端反復領域、アクチン、免疫グロブリンまたは熱ショックプロモーター(単数または複数)などの異種プロモーターであり、好ましくはCMVプロモーターであることを特徴とする。
別の好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、プロモーターが異種プロモーターであり、好ましくはユビキチン/S27a-プロモーターであり、最も好ましくはハムスターユビキチン/S27a-プロモーターであることを特徴とする。
特別な実施形態において、真核発現ベクターは、それが、互いに任意の配向の本発明のいくつかの同一または異なる核酸またはTE配列要素の組み合わせであって、1以上の核酸またはTE配列要素が対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するおよび/または1以上の核酸またはTE配列要素が対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置する前記組み合わせを含むことを特徴とする。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、組み合わせ核酸またはTE配列要素がTE-06(配列番号8)であり、特に好ましくはTE-08(配列番号10)であることを特徴とする。
核酸またはTE配列要素の好ましい組み合わせは、対象遺伝子の前(すなわち5')のTE-06領域(配列番号8)と対象遺伝子の後(すなわち3’)のTE-06領域(配列番号8)および対象遺伝子の後(すなわち3’)の3つのTE-06-領域(配列番号8)である(図13も参照のこと)。
特に好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、1以上のTE-08核酸(単数または複数)または領域(単数または複数)(配列番号10)が対象遺伝子の前(すなわち5')に位置し、かつ1以上が対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置し、好ましくは1つのTE-08領域(配列番号10)が前および後に位置することを特徴とする(図13も参照のこと)。
TE-核酸または領域の他の好ましい組み合わせは、対象遺伝子の前および/または後の2つのTE-08核酸領域(配列番号10)である。
他の実施形態において、真核発現ベクターは、複数個のTE-06-核酸または領域(配列番号8)が対象遺伝子の後(3’)に位置し、好ましくは3個が位置することを特徴とする(図13参照)。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、1以上のTE-08-核酸(単数または複数)または領域(単数または複数)(配列番号10)と1以上のTE-06核酸または領域(単数または複数)(配列番号8)の組み合わせが対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するおよび/または対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置することを特徴とし;好ましい組み合わせは、対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するTE-08核酸または領域(配列番号10)とそれに続くTE-06-核酸または領域(配列番号8)の組み合わせである(図13もまた参照のこと)。
他の実施形態において、真核発現ベクターは、1以上のTE-13核酸または領域(配列番号15)が対象遺伝子の前(5')および/または後(3’)に位置することを特徴とする。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、それがさらにインテグラーゼを含むことを特徴とする。
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は少なくとも2つの真核発現ベクターで同時トランスフェクトされ、2つのベクターの少なくとも1つは少なくとも1つの対象タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含み、他のベクターは任意の組み合わせ、位置および配向で1以上の本発明の核酸を含み、場合により少なくとも1つの対象遺伝子もコードし、これらの本発明の核酸は、他のベクターとの同時組み込みにより、他の同時トランスフェクトしたベクター上に位置する対象遺伝子にそれらの転写または発現促進作用を付与する。
特別な実施形態において、真核発現ベクターは、選択マーカーがDHFRまたはNeoであり、例えばNeo F240Iであることを特徴とする。
本発明はさらに、発現ベクターへの本発明の核酸の組み込みを特徴とする、真核発現ベクターの製造方法に関する。
本発明はさらに、真核宿主細胞が本発明の真核発現ベクターを含むことを特徴とする真核宿主細胞に関する。
特別な実施形態において、真核宿主細胞は高産生クローンであること、すなわちTE配列要素を含まない類似の真核宿主細胞よりも高い比生産性を有することを特徴とする真核宿主細胞であって、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍もしくは10倍までに増加した発現レベルまたは2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上もしくは10倍以上に増加した発現レベルを有し、好ましくは5倍までにまたは3倍以上の発現レベルを有する前記宿主細胞である。
特に好ましい実施形態において、真核宿主細胞は、発現ベクターがゲノムに安定に組み込まれていることを特徴とする。
他の実施形態において、真核宿主細胞はハムスターまたはマウス細胞、例えばCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHK TK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHO duk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKX B1、CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞であり、好ましくはCHO細胞であり、特に好ましくはCHO-DG44細胞である。
他の実施形態において、真核宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、サルまたはげっ歯類細胞株を含むが限定されない哺乳動物細胞である。
他の実施形態において、宿主細胞は酵母、昆虫、鳥および植物細胞を含むが限定されない真核細胞である。
別の特別な実施形態において、真核宿主細胞は、それがさらに抗アポトーシス遺伝子、例えばBCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HLまたはCED-9を含み、好ましくはBcl-xLまたはBCL-2を含み、最も好ましくはBCL-xLを含むことを特徴とする。
本発明はさらに、
(a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、
を特徴とする、高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の開発方法に関する。
本発明はさらに、
(a)少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を含む真核発現ベクターに対象遺伝子(単数または複数)を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、
を特徴とする、高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の開発方法に関する。
特別な実施形態において、本方法は少なくとも1つのさらなる増幅工程を特徴とする。
本発明はまた、
(a)少なくとも対象タンパク質/産物、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(好ましくは改変されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)および増幅選択マーカーDHFRをコードする遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、転写または発現を促進するために少なくとも対象遺伝子(単数または複数)が請求項1〜14のいずれか１項記載の少なくとも1つの核酸に機能的に結合されている、前記工程、
(b)種々の遺伝子発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程、
(c)ヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で、選択剤、例えばG418の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を選択する工程、および、
(d)少なくとも増幅選択マーカー遺伝子の増幅を可能にする選択剤、例えばメトトレキセートの存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を増幅する工程、
を特徴とする、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法に関する。
特定の実施形態において、本方法は、少なくとも200μg/mLのG418、好ましくは400μg/mL以上のG418を添加し、血清無添加で、増加するMTXの濃度を加えたヒポキサンチン/チミジンを含まない培地でトランスフェクトされた細胞が培養されることを特徴とする。
別の特定の実施形態において、本方法は、第1増幅工程におけるMTXの濃度が少なくとも100nMまたは少なくとも250nMであり、1μMまたはそれ以上まで段階的に増加されることを特徴とする。ここの場合において、MTX濃度は2μMであることができる。
別の特別な実施形態において、本方法はさらなるクローニング工程を特徴とする。
本発明の方法の他の実施形態において、宿主細胞はげっ歯類/ハムスター細胞、例えばCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHK TK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHO duk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKX B1、CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞であり、好ましくはCHO細胞であり、特に好ましくはCHO-DG44細胞である。
好ましい本発明の方法において、発現ベクターは選択マーカー、たとえばDHFRまたはNPT、例えばNPT F240IまたはNPT D227Gを含む。
本発明の方法の特に好ましい実施形態において、高産生クローンの割合は2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍もしくは10倍までに増加し、または2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上もしくは10倍以上に増加し、好ましくは5倍までにまたは3倍以上に増加する。
本発明はさらに、
(a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、および、
(d)対象遺伝子(単数または複数)の発現を可能にする条件下で得られた高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、
を特徴とする生物医薬品の製造方法に関する。
本発明はさらに、
(a)少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を含む真核発現ベクターに対象遺伝子(単数または複数)を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、および、
(d)対象遺伝子(単数または複数)の発現を可能にする条件下で得られた高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、
を特徴とする高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の開発方法に関する。
特別な実施形態において、本発明の方法は少なくとも1つのさらなる増幅工程を特徴とする。
特別な実施形態において、本発明の方法は、
(e)対象タンパク質を採取し精製するさらなる工程、
を特徴とする。
本発明はさらに、真核宿主細胞において発現系における対象遺伝子の転写または発現を増加させるための、または生物医薬品を製造するための、真核発現ベクターにおける本発明の核酸または本発明の転写促進領域(TE配列要素)の使用に関する。
本発明はまた、トランスジェニック動物または植物を製造するための本発明の核酸転写または本発明の促進領域(TE配列要素)の使用に関する。
本発明はさらに、遺伝子治療における本発明の核酸または本発明の転写促進領域(TE配列要素)に使用に関する。
本発明は特に、医薬としての、または医薬組成物における本発明の核酸または本発明の転写促進領域(TE配列要素)の使用に関する。
本発明はさらに、本発明の核酸または本発明のTE配列要素(単数または複数)、場合により発現ベクター(単数または複数)、場合により宿主細胞(単数または複数)および場合によりトランスフェクション試薬(単数または複数)からなるキットに関する。
好ましい実施形態において、本発明は、核酸、特に単離された核酸、より正確には、配列番号1またはそのフラグメントもしくは誘導体を有する転写促進または発現促進核酸領域(TE配列要素)であって、染色体組み込みによって対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす前記核酸に関する（TE配列要素TE-00(配列番号2)を除く）。
他の実施形態において、本発明は、TE配列要素TE-00(配列番号2)、TE-04(配列番号6)およびTE-06(配列番号8)を除く本発明の核酸に関する。
他の実施形態において、本発明はTE配列要素TE-00(配列番号2)、TE-04(配列番号6)、TE-05(配列番号7)およびTE-06(配列番号8)を除く本発明の核酸に関する。
対象遺伝子の発現の増加は、例えば、ELISAを用いて産物力価を測定することにより測定できる。
本発明の別の実施形態は、160bpを超える長さの、好ましくは170bpを超える長さの本発明のTE配列要素、フラグメントまたは誘導体に関する。特別な実施形態において、TE配列要素フラグメントは、160bp〜1.2kbまたは170bp〜1kbであり、好ましくは200bpを超えかつ200bp〜1kbの長さである。好ましい実施形態において、TE配列要素フラグメントは、配列番号1の1bp〜1578bpの部分(これは領域TE-00(配列番号2)のフラグメント5’に対応する)にあり、113bpを超える長さ、あるいは132bpを超え、好ましくは160bpを超え、あるいは170bpを超える長さである。特別な実施形態において、TE配列要素フラグメントは113bp〜1.2kbまたは132bp〜1.2kbまたは160bp〜1.2kbであり、好ましくは200bpを超え、200bp〜1kbの長さである。
他の実施形態において、TE配列要素フラグメントは任意の隣接配列を伴わないで存在する。このことは、フラグメントがより大きな配列または配列領域ではないこと、例えば他の配列がその前(5’)または後(3’)に結合されていないことを意味する。別の特別な実施形態において、本発明は、任意のCpGアイランドを含まない本発明の核酸に関する。
TE配列要素を含む真核宿主細胞とTE配列要素を含まない真核宿主細胞とを比較するとき、対象遺伝子の比生産性の7倍までの相対変化を観察できることは、以下の実験から明らかである。
産物力価および比生産性に関するデータ収集により、配列番号1のフラグメントまたは誘導体であるTE配列要素を有するほとんどの細胞プールは、平均して、TE配列要素を含まない細胞プールよりも対象遺伝子を多く発現することが示された。異なる選択マーカー(NPTまたはDHFR)を用いる、2つの独立したトランスフェクションシリーズにおいて、いずれの場合にもTE配列要素01(配列番号3)、02(配列番号4)および08(配列番号10)が最も高い生産性をもたらした。それらは生産性を4〜7倍増加させることができる。確かに、3kbおよび2.5kbのTE配列要素01(配列番号3)および02(配列番号4)はさらに発現ベクターに結合させるには大変大きい。他方では、サイズが1kbしかないTE配列要素08(配列番号10)はより興味深く、これは発現を5〜6倍増加させることができる。TE配列要素06(配列番号8)は、2つのトランスフェクションシリーズにおいて、サイズが381bpしかないのに3倍の比生産性をもたらした。発現ベクターをできるだけ小さくすることは大変に有益である。なぜなら、より小さいベクターは、クローニングおよびトランスフェクション中、一般により安定であり、より扱いやすいからである。従って、TE配列要素06(配列番号8)および08(配列番号10)および13(配列番号15)は、転写促進領域として使用するために特に興味深い。
以下の実施例もまた、TE配列要素03(配列番号5)、04(配列番号6)または07(配列番号9)を含む細胞プールは、対象遺伝子のおおよそ3〜3.5倍の発現を示し、TE配列要素10(配列番号12)、11(配列番号13)または12(配列番号14)を含む細胞プールは対象遺伝子のおおよそ2倍の発現を示したことを示している。
選択マーカーとしてのNPT F240Iと併用したTE配列要素08(配列番号10)は、TE配列要素を含まない対照プールと比較して5倍の、対象遺伝子の比生産性の最大増加を示した。選択マーカーとしてのDHFRと併用したTE配列要素08(配列番号10)は、約6.0のより大きな増加を示す。
さらにまた、選択マーカーとしてDHFRを有する試験シリーズにおけるTE配列要素02(配列番号4)は、6.8倍の対象遺伝子の生産性の増加を示す。
領域13により最大増加(15倍)がもたらされる。
以下の実施例はまた、1つの試験シリーズにおいて、TE配列要素05(配列番号7)および09(配列番号11)を有するプールは、対象遺伝子の発現の増加を示さず、1つの試験シリーズにおいて、対照プールよりも対象遺伝子のより低い発現をも示したことを示す。従って、これらの2つの領域およびおそらくはこれらの配列領域の部分フラグメントは、特定の環境下で抑制作用を有しうるが、いつもそうとは限らない。
さらに、以下の実施例において、試験された異なるTE配列要素の比生産性の相対変化は、主としてベクター系と独立して、すなわち用いられる選択マーカーまたは特定の対象遺伝子と独立して実現される。
以下の実施例はまた、マーカー遺伝子の発現の変化は、対象遺伝子の発現の変化に関連していることを示している。
以下の実施例から、試験したTE配列要素のいずれもが、促進作用を有さないこともまた明らかである。従って、TE配列要素は染色体レベルでの対象遺伝子の発現の増加を引き起こすのみであることは明らかである。
以下の実施例はまた、複数個の同一または異なる短いTE配列要素の組み合わせまたは連結、例えばTE配列要素06および08または21は、さらなる発現促進作用をもたらしうることもまた示している。
実施例
略語
AP:アルカリホスファターゼ
Asp(=D):アスパラギン酸
bp:塩基対
CHO:チャイニーズハムスター卵巣
DHFR:ジヒドロ葉酸還元酵素
ELISA:酵素免疫抗体法
FACS:蛍光表示式細胞分離器
GFP:緑色蛍光タンパク質
Gly(=G):グリシン
HT:ヒポキサンチン/チミジン
IgG:免疫グロブリンG
Ile(=I):イソロイシン
IRES:内部リボソーム侵入部位
kb:キロベース
mAb:モノクローナル抗体
MCP-1:単球走化性タンパク質-1
MTX:メトトレキセート
NPT:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
Phe(=F):フェニルアラニン
SEAP:分泌アルカリホスファターゼ
Ub:ユビキチン
UTR:非翻訳領域
方法
細胞培養およびトランスフェクション
細胞培養フラスコ中、37℃、湿った大気および5%CO2下で、ヒポキサンチンおよびチミジン(HT)(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) を加えた無血清CHO-S-SFMII培地でCHO-DG44/dhfr-/-細胞(Urlaubら、1983)を懸濁細胞として永続的に培養した。コールターカウンターZ2(Beckmann Coulter)またはCedex(Innovatis)で細胞数および細胞生存率を測定し、ついで細胞を1〜3x105/mLの濃度で播種し、2〜3日ごとに継代した。CHO-DG44のトランスフェクションのためにリポフェクタミンプラス試薬(Invitrogen GmbH)を用いた。各トランスフェクション混合物について、製造業者の使用説明書に従って、全部でプラスミドDNA1.0〜1.3μg、リポフェクタミン4μLおよびPlus試薬6μLを混合し、HT添加CHO-S-SFMII培地0.8mL中の6x105細胞に200μLの容量で加えた。細胞インキュベーター中、37℃で3時間インキュベーションした後、HT添加CHO-S-SFMII培地2mLを加えた。48時間の培養時間後、トランスフェクション混合物を採取(一過性トランスフェクション)するかまたは選択にかけた。NPTに基づく選択のためには、トランスフェクションの2日後に、G418(Invitrogen)400μg/mLを含むHT添加CHO-S-SFMII培地に細胞を移した。DHFRに基づく選択のためには、トランスフェクションの2日後に、HTを含まないCHO-S-SFMII培地に細胞を移した。1つの発現ベクターがDHFRを含み、他の発現ベクターがNPT選択マーカーを含む同時トランスフェクションの事象におけるDHFRおよびNPTに基づく選択において、トランスフェクションの2日後に、ヒポキサンチンおよびチミジンを加えずにCHO-S-SFMII培地に細胞を移し、G418(Invitrogen)もまた培地に400μg/mLの濃度で加えた。
組み込まれた異種遺伝子のDHFRに基づく遺伝子増幅は、HTを含まないCHO-S-SFMII培地に5〜2000nMの濃度で選択剤MTX(Sigma, Deisenhofen, DE)を加えることにより行うことができる。
発現ベクター
発現を分析するために、pAD-CMVベクター(Wernerら,1998)に基づき、CMVエンハンサー/ハムスターユビキチン/S27aプロモーター(WO97/15664)またはCMVエンハンサー/CMVプロモーターの組み合わせにより異種遺伝子の発現を媒介する真核発現ベクターを用いた。ベースベクターpBIDは増幅選択マーカー(例えばEP-0-393-438参照)として作用するdhfrミニ遺伝子を含むが、ベクターpBINGにおいてはdhfrミニ遺伝子は改変NPT遺伝子に置き換えられている。これはNPT変種D227G(Asp227Gly)である。NPT変種D227GおよびIRES-GFP遺伝子領域でのpBINGのクローニングは(WO2004/050884)に記載されているように行った。ベースプラスミドpTE4は選択マーカーとしてNPT変種F240I(Phe240Ile)を含み、プラスミドpBINGの誘導体である。NPT変種F240IによるNPT変種D227Gの置換とは別に、GFPもまたベクターpDsRed2からの赤色蛍光タンパク質DsRed2(Clontech, Palo Alto, CA, USA)で置換した。ベースプラスミドpTE5は選択マーカーとしてDHFRを含み、ベクターpBIDG(WO2004/050884)の誘導体であり、この場合も再びベクターpDsRed2からの赤色蛍光タンパク質DsRed2(Clontech, Palo Alto, CA, USA)でGFPを置換した。
ヒト化モノクローナルIgG1抗体を発現させるために、重鎖を1.4kb SalI/SpeIフラグメントとしてプラスミドpBIDにクローニングし、XbaIおよびSalIで消化しプラスミドpBID-HCを得た(図1A)。他方では、軽鎖を0.7kb BamHI/HindIIIフラグメントとしてプラスミドpBINGの切断部位にクローニングし、プラスミドpBING-LCを作製した(図1A)。
ヒトMCP-1 cDNA(Yoshimuraら、1989)を、0.3kb HindIII/EcoRIフラグメントとしてベクターpTE4またはpTE5の対応する切断部位にクローニングし、プラスミドpTE4/MCP-1およびpTE5/MCP-1(それぞれ図1Bおよび図2)を得た。
FACS(蛍光表示式細胞分離器)
BD FACScalibur(BD Bioscience)を用いてフローサイトメトリー分析を行った。FACSは励起波長488nmのヘリウム-アルゴンレーザーを備えている。特定の蛍光タンパク質に適した波長で蛍光強度を吸収し、付属のソフトウェアCell Quest Proを用いて処理した。
ELISA(酵素免疫抗体法)
製造業者の使用説明書(BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, DE)に従って、OptEIA Human MCP-1 Setキットを用い、ELISAにより安定的にまたは一過性にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の上清におけるMCP-1力価を定量した。安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞からの上清におけるIgG1 mAbは、一方ではヤギ抗ヒトIgG Fcフラグメント(Dianova, Hamburg, DE)を用い、他方ではAP標識ヤギ抗ヒトκ-軽鎖抗体(Sigma)を用いて、標準手順のELISA(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, 更新版)により定量した。精製したIgG1抗体を標準品として用いた。式pg/((Ct-Co)t/ln(Ct-Co))により生産性(pg/細胞/日)を算出した。ここで、CoおよびCtはそれぞれ播種時および採取時における細胞数であり、tは培養時間である。
SEAPアッセイ
製造業者の使用説明書(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE)に従って、一過性にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞からの培養上清におけるSEAP力価をSEAPレポーター遺伝子アッセイを用いて定量した。
TE配列要素TE-Aの単離およびクローニング
ユビキチン/S27a遺伝子のコード領域に加えてUb/S27a-プロモーターを含む隣接5´UTR領域を含む、WO97/15664に記載のハムスターゲノム由来の配列から出発して、さらなる上流で今までに知られていない配列領域が単離された。このために、“ネステッドPCR”の鋳型としてアダプターを連結したゲノムCHO-DG44DNAを用いた。アダプターまたはWO97/15664に配列番号5(プライマーUb20:5'-CTCCACACATTTACACATGGACAC-3'(配列番号39))として記載されている配列の5'領域のハムスター配列;WO97/15664からの配列番号5のヌクレオチド62〜85(相補配列)に対応する)に相補性を有するプライマーの組み合わせを用いて第1PCRを行った。ついで、インナーアダプタープライマーおよびインナー(“ネステッド”)ハムスター特異的プライマー(プライマーUb21:5'-GGGTTTCTCTGTGTAATAGCCATG-3'(配列番号40);WO97/15664からの配列番号5のヌクレオチド16〜39(相補配列)に対応する)からなる第2プライマーの組み合わせで第2PCRを行った。既知の配列を有するハムスター特異的プライマー末端から開始し、上流に位置する新規で未知の配列領域に結合する得られたオーバーラップDNAフラグメントをpCR2.1TOPOベクター(Invitrogen)にサブクローニングし、配列決定により分析した。ハムスターUb/S27a遺伝子の上流に、新規な、今までに知られていない全長348bpの配列が得られた。
この新規配列情報に基づいて、前述の“ネステッドPCR”を用い、別のさらなる上流DNA領域を単離した。今回は、アダプタープライマーおよびプライマーUb33(5'-ATCTCACTGTGTCTACCAACTTAG-3'(配列番号41);新規に単離された384bp配列の5'領域に位置する;配列番号1のヌクレオチド1268〜1291(相補配列)に対応する)で第1PCRを行い、インナーアダプタープライマーおよびさらなる内部に位置するハムスター特異的プライマーUb32a(5'-TCTGCACCACCACTACCTGACT-3'(配列番号42);新規に単離された384bp配列内のプライマーUb33から上流に位置する;配列番号1のヌクレオチド1243〜1264(相補配列)に対応する)で第2PCRを行った。得られた増幅された物質をpCR2.1 TOPOベクター(Invitrogen)にサブクローニングし、配列を決定した。それは、ハムスターUb/S27a-遺伝子の上流の別の1239bpの新規な今までに知られていない配列を含んでいた。
オーバーラップPCRフラグメントからの配列情報を用い、PCRにより、プライマーa)Ub34(5'-CTAAGAGTACTTGCCATGAGAGCCTGAA-3'(配列番号43);新規に単離された1239bp配列の最外部の5'末端に位置し;配列番号1(ヌクレオチド1〜14)に部分的にのみ存在する)およびb)Ub35(5'-CATTGATACACCACCAAAGAACTTG-3'(配列番号44);配列番号1のヌクレオチド1941〜1965(相補配列)に対応する)を用いて、今までに単離されたすべての部分フラグメントを含み、WO97/15664からの配列番号5の5'配列領域に383bp伸びたCHO-DG44のゲノムDNAからの接着配列領域を増幅した。
得られた2kb DNAフラグメントを内因性EcoRI切断部位(位置353〜358)を介してWO97/15664に記載の配列番号5の5´UTR領域と連結したが、この切断部位はKlenow DNAポリメラーゼを用いる充填反応で除去された。新規に単離されたゲノム領域における第2内因性EcoRI切断部位を同様に除去し、配列番号1におけるヌクレオチド326〜329が得られたが、これは元のゲノム配列に対する追加である。このようにして、内因性ハムスター配列と比較して、全部で8つの追加のヌクレオチドが配列番号1に挿入された。ハムスターUb/S27a遺伝子から上流に位置する配列領域から得られた3788bp DNAフラグメントを配列番号1を有するTE配列要素Aと呼び、ベクターpBluescript SKM(Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローニングした。
多様なTE発現ベクターの作製
CHOゲノム由来の3.8kbのTE配列要素TE-A(図3、配列番号1)から出発して、PCRにより、TE配列要素TE-Aと比較して5'または3'末端のいずれかが欠失した種々のフラグメントを作製した(図4および図5)。これらのフラグメントを合成するために、順方向および1つの逆方向プライマーの組み合わせを用いた(図5および図6)。クローニング目的で、プライマーにより、フラグメントの5’末端にBamHI切断部位を付着させ、フラグメントの3’末端にBsrGI切断部位を付着させた。このようにして、TE-01〜TE-12と呼ぶ異なる長さの12のTE配列要素を作製した(図4および5)。BsrGIおよびBamHIで消化後、ベースプラスミドpTE4/MCP-1(図1B)またはpTE5/MCP-1(図2)のアダプター領域に順配向でクローニングした。SacII制限酵素消化により、TE-AのサブクローンをフラグメントTE-00(配列番号2)から単離し、プロモーター/エンハンサー領域の5'に位置するSpeI切断部位を介して順配向および逆配向の両方でベースベクターpBING-LC(図1A)またはpBID-HC(図1A)にクローニングした。
TE配列要素の配列
TE-A(配列番号1)
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TE配列要素00(配列番号2)
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TE配列要素01(配列番号3)
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TE配列要素02(配列番号4)
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TE配列要素03(配列番号5)
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TE配列要素04(配列番号6)
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TE配列要素05(配列番号7)
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TE配列要素06(配列番号8)
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TE配列要素07(配列番号9)
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TE配列要素08(配列番号10)
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TE配列要素09(配列番号11)
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TE配列要素10(配列番号12)
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TE配列要素11(配列番号13)
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TE配列要素12(配列番号14)
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GFPおよび免疫グロブリンG1(IgG1)の発現に対するTE配列要素変種TE-00の影響
細胞質に位置するGFP(緑色蛍光タンパク質)および分泌モノクローナルIgG1抗体の発現に対するTE配列要素TE-00の効果を、CHO-DG44細胞を用いる2つの独立した安定なトランスフェクションシリーズで研究した。このために、以下のプラスミドの組み合わせまたはプラスミド変種でCHO-DG44細胞を同時トランスフェクトした:
a)TE配列要素を含まない対照プラスミドpBING-LC(図1A)およびpBID-HC(図1A)
b)順配向でプロモーター/エンハンサーの上流に組み込まれたTE配列要素TE-00を有するpBING-LCおよびpBID-HC
c)逆配向でプロモーター/エンハンサーの上流に組み込まれたTE配列要素TE-00を有するpBING-LCおよびpBID-HC
1つの変種あたり、トランスフェクションシリーズAにおいて4プールを作製し、トランスフェクションシリーズBにおいて、10プールを作製した。等モル量の2つのプラスミドを用いた。同じ総数の分子に達するように、対照混合物におけるシリーズAにおいて用いたDNAの総量は1μgであり、一方、TE配列要素を含む混合物においては量は1.3μgであった。TE配列要素を有するプラスミドは対照プラスミドより1.3倍大きいので、この差異は異なるプラスミドサイズによるものである。トランスフェクション混合物に用いるDNAの量はトランスフェクション効率に影響を有しうるので、シリーズBにおいてDNAの総量を“偽DNA”(=産物遺伝子、TE配列要素および真核選択マーカーを含まないベクター)300ngで収支を合わせ、それにより対照プラスミドを有する混合物が全部でDNA1.3μgを含むようにした。陰性対照として各トランスフェクションシリーズにおいて偽トランスフェクトされたプールもまた試験した。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じ様に処理した。-HT/+G418(400μg/mL)によるトランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行った。選択後、GFP発現細胞の割合をFACSにより測定した。2つのトランスフェクションシリーズにおけるプロットオーバーレイにおける変種の比較により、対照プラスミドでのプールよりもTE配列要素00でのプールにおいてGFP発現細胞の割合が高いことが明らかとなった(図7)。TE配列要素が順配向または逆配向のいずれかでプラスミドに存在するプール間でいかなる相違も見いだせなかった。従って、TE配列要素00の作用、すなわち混合集団における高い生産性を有する細胞の割合の増加はそれらの配向とは無関係であった。
加えて、プールのIgG1力価および比生産性を6〜8継代培養(継代周期2-2-3日)にわたって測定した。この場合もやはり、TE配列要素00を含む細胞プールは、平均してTE配列要素を含まない細胞プールよりも多く発現したことが確認された(図9、シリーズAおよびB)。両方のシリーズにおいて、TE配列要素の存在の結果として2倍のプール生産性を明らかにする事ができたが、発現プラスミドにクローニングされた領域の配向は関連はなかった。
MCP-1の発現に対するTE配列要素TE-01〜TE-12の影響
CHO-DG44細胞の3つの安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズC、DおよびE)において、TE配列要素を含まない場合の発現と比較して、分泌MCP-1の発現に対するTE配列要素TE-01〜TE-12の効果を調べた。3つのシリーズすべてにおいて、プラスミド変種1つについて6プールを作製した。ベースプラスミドは、シリーズCおよびDにおいてはpTE4/MCP-1(図1B;選択マーカーNPT-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)であり、シリーズEにおいてはpTE5/MCP-1(図2;選択マーカーDHFR=ジヒドロ葉酸還元酵素)とした。これらは、TE配列要素なし(=対照混合物)またはプロモーター/エンハンサーの上流に順配向のTE配列要素TE-01〜TE-12の1つを含んでいた。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する影響を最小化するために、全部でプラスミドDNA1.2μgを用いた。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜10.7kbの間で変化した。しかしながら、すべての混合物において、試験プラスミドの分子の総数を一定に保つことができるようにするために、より小さいプラスミド分子を有する混合物において、産物遺伝子もTE配列要素も任意の真核選択マーカーも含まないいわゆる偽プラスミドでDNAの総量の収支を合わせた。陰性対照として各トランスフェクションシリーズにおいて偽トランスフェクトされたプールもまた試験した。すなわちトランスフェクション混合物のDNAを加えないこと以外は同じ様に処理した。シリーズCおよびDにおいてHT添加CHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、シリーズEにおいてHTを含まないCHO-S-SFMIIを用いて、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行った。
選択後、dsRed2発現細胞の割合をFACSで測定した。図8は、シリーズCからのトランスフェクトされた生細胞の蛍光の相対的割合を示す。対照プールと比較して、TE配列要素TE-01、TE-02またはTE-08を含むプールはdsRed2発現細胞を約3〜3.5倍多く含み、領域TE-06を有するプールはdsRed2発現細胞をおおよそ2倍含んでいた。他方では、フラグメントTE-05およびTE-09を有するプールにおいては、対照と比較して、dsRed2発現細胞の割合の明らかな増加は認められなかった。
加えて、MCP-1産物力価および比生産性もまた6継代培養(継代周期2-2-3日)にわたって上昇した。図9(シリーズCおよびD)および図10(シリーズE)は相対的特異的MCP-1生産性を示す。選択マーカーとしてのNPT-F240Iと併用した、係数5．3を有する領域TE-08は、TE配列要素を含まないと対照プールと比較して特異的MCP-1生産性の最大増加を示した(図9)。選択マーカーとしてDHFRと組み合わされたとき、この変種で6倍の増加が達成された(図10)。TE配列要素01、02および03は、対照プールと比較して、NPT選択プールにおいて4〜4.5倍の生産性の増加を示し(図9)、DHFR選択プールにおいて2.6〜6.8倍の生産性の増加を示した(図10)。300bpの長さしかないTE配列要素06もまた、すべてのシリーズにおいて、2.5〜3.2倍生産性を増加させることができた(図9および10)。フラグメントTE-04およびTE-07を用いて達成される増加もまた同様な程度の大きさであった(図10)。少し長いフラグメントTE-10、TE-11およびTE-12を用いたプールは、倍のMCP-1発現を示した(図9および10)。明らかに、これらすべてのプールにおいて、産物をほとんど発現しない細胞数は低下し、従って全体的に、細胞集団における高産生クローンの割合は上昇した。このことは、TE配列要素が負の染色体位置効果を抑制、遮蔽または相殺することができるしるしである。
それに反して、すでにdsRed2-発現(図8)で見られたように、フラグメントTE-05およびTE-09の使用により、対照と比較して発現を増加させることはできず、場合によっては低下することさえもあった(図9および10)。従って、これらの配列領域におけるこれらの領域または部分フラグメントは、抑制作用を有しうる。全体として、観察されたMCP-1発現の変化は、安定な細胞プールにおけるdsRed2発現細胞の割合と関連があった。
エンハンサー活性に対するTE配列要素TE-01〜TE-12の試験
CHO-DG44細胞の一過性トランスフェクションにより、観察された産物発現増加が実際にTE配列要素のクロマチンオープニング作用に基づくものかどうか、あるいはエンハンサー活性に基づくものかどうかを確認するために試験を行った。一過性トランスフェクションにおいて、ゲノムはプラスミドに組み込まれないので、遺伝情報はプラスミドから直接読み取られる。従って、染色体位置効果は存在しえない。それにもかかわらず遺伝子発現にプラス効果が存在する場合、TE配列要素に存在するエンハンサーにこの効果を帰することができる。このようなエンハンサーは、位置および配向にかかわらずシス位置のプロモーターの活性に作用し、機能的に結合されている遺伝子の転写を刺激することができる。
図11に示す一過性発現研究において、ベースプラスミドpTE4/MCP-1(=対照;図1B)または、それぞれがプロモーター/エンハンサーの上流にTE配列要素TE-01〜TE-12の1つをさらに含むその誘導体で6プールをトランスフェクトした。48時間後、全量で3mLの培養物を採取し、ELISAにより細胞培養上清でMCP-1力価の測定を行った。SEAP発現プラスミドでの同時トランスフェクション(トランスフェクション混合物あたりプラスミドDNA100ngを添加)およびそれに続くSEAP活性の測定によりトランスフェクション効率の相違を補正した。図11は6つの平行プール(parallel pool)からの平均を示す。細胞培養上清におけるMCP-1力価は、すべてのプールにおいて大変類似しており、TE配列要素を含まない対照プラスミドpTE4/MCP-1からの発現に有意差は存在しなかったことをデータは示している。従って、安定的にトランスフェクトされた細胞プールにおける一部のTE配列要素によりもたらされた2倍以上の生産性の増加は、TE配列におけるエンハンサーの存在に基づくものではない。TE配列要素によりもたらされる発現の促進のためには、染色体組み込みが絶対に本質的である。
他のTE配列要素の産生および異なるTE配列要素の位置および組み合わせの試験
実施例2に記載の方法と同様に、配列番号1の他の部分フラグメントまたはそれらの誘導体を作製し、実施例3および5に記載されているように、生産性に対するそれらのプラス効果を試験することができる。可能なフラグメントのいくつかの実施例を図12に示す。今までに得られた結果は、例えば、図12に示す配列番号1の領域は遺伝子発現の増加をもたらすことができることを示す。安定なトランスフェクションシリーズにおいて、機能にとって重要な配列領域の位置を捜し当てさらに絞り込むために、比生産性に対するそれらの作用に関して、これらの新規TE配列要素をさらに厳密に解析される。特異的配列領域への機能の絞込みおよびそれに関連したフラグメントの長さの可能な短縮は、発現ベクターの効率的な使用に効率的な使用に有利である。なぜなら、より小さい発現プラスミドはより安定であり、クローニング中にもトランスフェクション中にも取り扱いがより容易である。
さらにまた、プラスミド内での互いに任意の配向および任意の位置の同様または異なるフラグメント領域を計画する事が可能である。どの組み合わせが発現における最も可能な増加をもたらすかに関する研究もまた、安定なトランスフェクションシリーズにおいて実施する事ができる。限定するものではないが、いくつかの実施形態を図13に示す。従って、例えば、TE配列要素TE-06およびTE-08が、産物遺伝子の両側に隣接すかまたは交互に配置される場合、発現のさらなる増加をもたらすことができるかどうかを研究により決定できるであろう。同様に、短いTE配列要素の連結、たとえばTE配列要素06および08と同一または異なる領域の連結もまたさらなる発現促進作用をもたらしうることもまた考えられる。
さらなるTE配列要素
TE配列要素13(配列番号15)
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TE配列要素14(配列番号16)
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TE配列要素15(配列番号17)
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TE配列要素16(配列番号18)
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TE配列要素17(配列番号19)
caaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc
TE配列要素18(配列番号20)
gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc
TE配列要素21(配列番号21)
cttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag
MCP-1の発現に対するTE配列要素RE-13〜TE-18の影響
TE配列要素を含まない場合の発現との比較により、CHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズF)において分泌MCP-1の発現に対するTE配列要素TE-13〜TE-18の効果を研究した。プラスミド変種1つについて4プールを作製した。すべてのシリーズにおいて、ベースプラスミドはpTE4/MCP-1とした(図1B;選択マーカーNPT-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)。種々のプラスミド変種は、TE配列要素なし(=対照混合物)またはプロモーター/エンハンサーの上流に順配向のTE配列要素TE-13〜TE-18の1つを含んでいた(図12)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する影響を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いた。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜8.2kbの間で変化した。陰性対照として各トランスフェクションシリーズにおいて偽トランスフェクトされたプールもまた同時に試験した。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じ様に処理した。HT添加CHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行った。
5〜6継代培養にわたってMCP-1産物力価および比生産性を得た(継代周期2-2-3日)。図14(シリーズF)は相対的特異的MCP-1生産性を示す。領域のそれぞれは、平均MCP-1発現の増加をもたらす。配列要素13を用いて最大増加(15倍)が得られたが、これは配列要素08により得られた10倍増加をも超えている。
MCP-1の発現に対する種々の位置および種々の組み合わせのTE配列要素の影響
CHO-DG44細胞の2つの安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズGおよびH)において、TE配列要素を含まない場合の発現と比較して、分泌MCP-1の発現に対する発現プラスミドにおける種々の組み合わせおよび種々の位置のTE配列要素TE-06およびTE-08の効果を研究する。両方のシリーズにおいて、プラスミド変種1つについて6プールを作製する。ベースプラスミドはpTE4/MCP-1である(図1B;選択マーカーNPT=ネオマイシン=ホスホトランスフェラーゼF240I)。異なるプラスミド変種は、TE配列要素なし(=対照混合物)またはエンハンサー/プロモーター領域のまえのTE-08もしくはTE-Aまたはエンハンサー/プロモーター領域の前のTE-06およびTE-08の組み合わせまたはエンハンサー/プロモーター領域の前の逆配向のTE-08もしくはTE-09(シリーズG)のいずれかを含む。シリーズHにおいて、配列要素TE-06およびTE-21またはTE-08をエンハンサー/プロモーター領域(E/P)の前およびさらに終結シグナル(T)の後に用いる(図13)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の効果を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜10.2kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールもまた試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。HT添加CHO-S-SFMII+G418(300μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
6継代培養にわたってMCP-1産物力価および比生産性を得る(継代周期2-2-3日)。図15はシリーズGの相対的特異的MCP-1生産性を示す。これらの配列要素のすべては平均MCP-1発現の増加をもたらす。配列要素TE-Aにより最大の増加(4倍)が得られる。発現カセットの前後に配列要素TE-06およびTE-21またはTE-08を用いることによっても増加が引き起こされる。
2つの免疫グロブリンG-4(IgG-4)の発現に対するTE配列要素TE-08の影響
CHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズJ)において、TE配列要素を含まない場合の発現との比較により、2つのIgG-4抗体の発現に対するTE配列要素TE-08の効果を試験する。ベースプラスミドpBIN-LC2またはpBIN-LC3およびpBID-HC2またはpBID-HC3で24プールを作製し、pBIN-LC2/TE08またはpBIN-LC3/TE08およびpBID-HC2/TE08またはpBID-HC3/TE08で24プールを作製する(図16;選択マーカーNPT=ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240Iおよびdhfr=ジヒドロ葉酸還元酵素)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の影響を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.1kb〜7.5kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールを試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。HTを含まないCHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
4継代培養(継代周期2-2-3日)にわたってIgG-4産物力価および比生産性を得る。配列要素08は、IgG4抗体の発現における平均発現率の増加をもたらす。さらに、配列要素TE-08により、高生産性の細胞プールを見いだす可能性を高めることができる。
293F細胞におけるタンパク質発現に対するTE配列要素の影響
HEK293 freestyle細胞の安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズK)において、TE配列要素を含まない場合のMCP-1発現と比較して、分泌MCP-1の発現に対する種々のTE配列要素の効果を研究する。ベースプラスミドはpTE-4/MCP-1である(図1B;選択マーカーNPT=ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)。エンハンサー/プロモーターの上流に、順配向で領域TE-08、TE-13およびTE-Aを用い、各プラスミド変種について7〜10プールを作製する。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の効果を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜10.2kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールを試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。293SFM II培地+4mMグルタミン+G418(100μg/ml)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
5〜6継代培養(継代周期2-2-3日)にわたってMCP-1産物力価および比生産性を得る。
酵素(SEAP)の発現に対するTE配列要素TE-08の影響
CHO-DG44 細胞の安定なトランスフェクション シリーズ (シリーズ L)において、TE配列要素を含まない場合のSEAP発現と比較して、酵素(SEAP)の発現に対するTE配列要素 TE-08の効果を研究する。各プラスミド変種について6プールを作製する。ベースプラスミドはpTE-4/SEAPである。これはSEAPのためのMCP-1-IRES-DsRed2発現カセットと交換することにより作製される。配列要素TE-08はアダプターAにクローニングされる(図1B;選択マーカーNPT=ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の効果を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.6kb〜7.6kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールを試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。HT添加CHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
市販のSEAPアッセイ(Clontech)を用い、6継代培養(継代周期2-2-3日)にわたって得られた相対的SEAP発現を測定する。

Claims (27)

  1. TE-01（配列番号３）、TE-02（配列番号４）、TE-08（配列番号１０）、TE-13（配列番号１５）、および、TE-18（配列番号２０）の中から選択される、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸。
  2. TE-08(配列番号10)である、請求項１記載の核酸。
  3. TE-13(配列番号15)である、請求項１記載の核酸。
  4. 異種配列に結合している、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸。
  5. 請求項１〜４の1つに記載の核酸およびプロモーターを含むことを特徴とする真核発現ベクターであって、請求項１〜４の1つに記載の核酸が前記プロモーターの上流に位置する前記ベクター。
  6. 請求項１〜４記載の１以上の同一または異なる核酸の組み合わせを含む請求項５記載の真核発現ベクターであって、前記１以上の核酸が対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するおよび/または前記１以上の核酸が対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置することを特徴とする、前記真核発現ベクター。
  7. 組み合わされた核酸の１つがTE-08(配列番号10)であることを特徴とする、請求項６記載の真核発現ベクター。
  8. 1以上のTE-08核酸(配列番号10)が対象遺伝子の前(すなわち5')に位置し、1以上が対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置することを特徴とする、請求項５記載の真核発現ベクター。
  9. 請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸を発現ベクターへ組み込むことを特徴とする真核発現ベクターの製造方法。
  10. 請求項５〜８のいずれか１項記載の真核発現ベクターを含み、前記真核発現ベクターがゲノムに安定に組み込まれていることを特徴とする真核宿主細胞。
  11. 真核宿主細胞が高産生クローンであること、すなわちTE配列要素を含まない類似の真核宿主細胞よりも高い比生産性を有することを特徴とする請求項１０記載の真核宿主細胞であって、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍もしくは10倍までに増加した発現レベルまたは2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上もしくは10倍以上に増加した発現レベルを有する前記宿主細胞。
  12. 宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０または１１記載の真核宿主細胞。
  13. 宿主細胞がCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHKTK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKXB1、CHO-DG44、CHOPro-5、V79、B14AF28-G3、またはCHL細胞である、請求項１２記載の真核宿主細胞。
  14. 抗アポトーシス遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の真核宿主細胞。
  15. 抗アポトーシス遺伝子が、BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HLまたはCED-9である、請求項１４記載の真核宿主細胞。
  16. (a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに請求項１〜５のいずれか１項記載の少なくとも1つの核酸を組み込む工程、
    (b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
    (c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、
    を特徴とする、高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の作製方法。
  17. (a)少なくとも対象タンパク質/産物、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよび増幅選択マーカーDHFRをコードする遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、転写または発現を促進するために少なくとも対象遺伝子が請求項１〜５のいずれか１項記載の少なくとも1つの核酸に機能的に結合されている、前記工程、
    (b)種々の遺伝子発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程、
    (c)ヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で、選択剤の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を選択する工程、および、
    (d)少なくとも増幅選択マーカー遺伝子の増幅を可能にする選択剤の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を増幅する工程、
    を特徴とする、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法。
  18. 対象タンパク質のグリコシル化を改善する方法と組み合わされる、請求項１６または１７記載の方法。
  19. 宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１６〜１８のいずれか１項記載の方法。
  20. 宿主細胞がCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHKTK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKXB1、CHO-DG44、CHOPro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞である、請求項１９記載の方法。
  21. (a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに請求項１〜５のいずれか１項記載の少なくとも1つの核酸を組み込む工程、
    (b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、
    (c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、および、
    (d)対象遺伝子の発現を可能にする条件下で得られた高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、
    を特徴とする生物医薬品の製造方法。
  22. (e)対象タンパク質を採取し精製するさらなる工程を含む、請求項２１記載の方法。
  23. 真核宿主細胞において発現系における対象遺伝子の転写または発現を増加させるための、または生物医薬品を製造するための、真核発現ベクターにおける請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸の使用。
  24. 非ヒトトランスジェニック動物または植物を製造するための、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸の使用。
  25. 非ヒト動物の遺伝子治療における請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸の使用。
  26. 医薬組成物の調製における請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸領域の使用。
  27. 請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸、発現ベクター、宿主細胞からなるキット。
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