JP2009544293A - 調節核酸配列要素 - Google Patents
調節核酸配列要素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009544293A JP2009544293A JP2009521178A JP2009521178A JP2009544293A JP 2009544293 A JP2009544293 A JP 2009544293A JP 2009521178 A JP2009521178 A JP 2009521178A JP 2009521178 A JP2009521178 A JP 2009521178A JP 2009544293 A JP2009544293 A JP 2009544293A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- nucleic acid
- gene
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims description 196
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 350
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 210
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 113
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 93
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 93
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 74
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 59
- -1 promoters Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 342
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 142
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 142
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 124
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 89
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 43
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 claims description 35
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 34
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 33
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 26
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 24
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 21
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 20
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 20
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 17
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims description 16
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 11
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 10
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 101100216424 African swine fever virus (strain E-70 MS44) LMW5-HL gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101150039936 ced-9 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 claims description 2
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 claims 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 29
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 abstract description 27
- 101000849522 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 40S ribosomal protein S13 Proteins 0.000 abstract description 25
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 abstract description 21
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 9
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 65
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 65
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 52
- 239000000047 product Substances 0.000 description 50
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 46
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 46
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 29
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 27
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 27
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 26
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 26
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 24
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 24
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 21
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 17
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 16
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 16
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 16
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 15
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 15
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 15
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 14
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 102220544466 Tyrosine 3-monooxygenase_D227G_mutation Human genes 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 9
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 6
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 6
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 6
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 5
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 5
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 5
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 241000006271 Discosoma sp. Species 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000049983 HMGA1a Human genes 0.000 description 3
- 108700039142 HMGA1a Proteins 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 241001512733 Zoanthus sp. Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical class N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241001531066 Aequorea coerulescens Species 0.000 description 2
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000006720 Clavularia sp. Species 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 101710197208 Regulatory protein cro Proteins 0.000 description 2
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 108700042076 T-Cell Receptor alpha Genes Proteins 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000046768 human CCL2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 101150111412 npt gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNIZHKITBISILC-RPKMEZRRSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methyloxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical group C1=NC(C(NC(N)=N2)=O)=C2N1[C@]1(C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O QNIZHKITBISILC-RPKMEZRRSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710196692 Actin A Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 241000242763 Anemonia Species 0.000 description 1
- 241001512986 Anemonia majano Species 0.000 description 1
- 241000242762 Anemonia sulcata Species 0.000 description 1
- 241000242757 Anthozoa Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100346429 Arabidopsis thaliana MRF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000018 Chemokine CCL2 Human genes 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001512730 Discosoma striata Species 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 1
- 101710168537 High mobility group protein B1 Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100434309 Homo sapiens ADA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000611939 Homo sapiens Programmed cell death protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 description 1
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091439 Major capsid protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108700042082 T-Cell Receptor gamma Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102100030246 Transcription factor Sp1 Human genes 0.000 description 1
- 101710085924 Transcription factor Sp1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- CFQGDIWRTHFZMQ-UHFFFAOYSA-N argon helium Chemical compound [He].[Ar] CFQGDIWRTHFZMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical class N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000011965 cell line development Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091006090 chromatin-associated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical group N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000006195 histone acetylation Effects 0.000 description 1
- 108010025934 hnRNP A2 Proteins 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine S-imide-S-oxide Natural products CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001711 protein immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000001812 small ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
米国特許第6,309,841号の著者らは、EASEの作用は組み込まれたプラスミドのMTX誘発増幅と関連していると推定する。MTX誘発遺伝子増幅において、いわゆる切断、融合、架橋のサイクルが存在する。DNA切断の形成と除去をもたらす構造修飾におけるHMG-I(Y)タンパク質の役割を想像するのは容易である。
配列番号1は、CHO細胞から単離された、ユビキチン/S27a遺伝子のコード領域の上流に位置する配列領域に由来し、細胞のリボソーム代謝において不可欠なタンパク質をコードする遺伝子である。
本発明は、先行技術から得られるものではない。
配列番号1を有する核酸は平均GC含量44%を有し、長い領域のGC反復を含まない。このGC含量は、哺乳動物のゲノムDNAに関して記載されている平均GC含量約40%と同程度である(Delgadoら、1998)。newcpgseek(EMBOSS配列分析パーッケージ)を用いるCpGリッチ領域の検索により、GpCとの関連で、絶対的にCpG二量体の頻度増加および/またはCpGの比率増加を示す5つのみの大変短い配列領域が明らかとなった:配列番号1のヌクレオチド2242〜2259(18bp)、3129〜3146(18bp)、3215〜3240(26bp)、3417〜3461(44bp)および3658〜3788(131bp)。この検索結果は、この核酸配列が伸びたCpGアイランドを何ら含まないことを示す。さらに、配列番号1は2つの縦列反復配列(ヌクレオチド2179〜2244およびヌクレオチド1027〜1080)および2つの逆位反復配列(ヌクレオチド8〜47およびヌクレオチド1726〜1766)を含み、これらはEMBOSSプログラムのetandemおよびeinvertedにより同定された。従って、TE-08は1つの逆位反復配列を含む。従って、配列領域1bp〜1578bpにおいては、1つの縦列反復配列および1つの逆位反復配列が存在する。
a)WO00/05393からのUCOE核酸配列
b)US6,309,841からのEASE核酸配列
c)WO03/004704からのSTAR核酸配列。
より複雑なアラインメント戦略を用いても、これらの核酸配列a)〜c)に対する高い配列の相同性は認められなかった。
この発明の詳細な説明の範囲内で用いられる用語および名称は、以下で定義される意味を有する。一般的な用語“含むこと”または“含む”は、より具体的な用語“からなる”を含む。さらに、用語“単数”および“複数”は限定的に使用されない。
用語“TE配列要素”は調節核酸を示す。
用語“TE配列要素”または“発現促進配列要素”または“転写促進配列要素”または“発現もしくは転写促進核酸配列要素”は、試験では同義で用いられる。これらの用語は、すべて調節核酸配列を指す。
さらにまた、用語“TE配列要素”、“転写促進もしくは発現促進核酸配列要素”またはそのフラグメント、部分、領域もしくは誘導体は、チャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)の配列の部分に加えて、他の生物からの対応する機能的相同ヌクレオチド配列を含む。そのような他の生物の例は、ヒト、マウス、ラット、サルおよび他の哺乳動物ならびにげっ歯動物、爬虫類、鳥、魚および植物を含む。
用語“変種”は、特定のトランスフェクション混合物に用いられる発現ベクターを指す。これらは、ベースベクター(pTE4/MCP-1またはpTE5/MCP-1)またはベースベクターの組み合わせ(pBING-LC+pBID-HC)の両方を含み、異なる位置、組み合わせおよび配向の1以上のTE配列要素を含むベースベクターもまた含む。
“染色体組み込み”は、細胞のゲノム、すなわち細胞の染色体への任意の望ましい核酸配列の組み込みを意味し、場合により、任意の望ましい数、位置および配向の1以上の染色体へ組み込みを意味する。さらに、用語“染色体組み込み”はまた、合成、人工またはミニ染色体への任意の望ましい核酸配列の組み込みを含む。
本発明の発現ベクターに含まれる対象遺伝子は、対象産物をコードする任意の長さのヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物または“対象産物”は、一般にタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくはフラグメントまたはその誘導体である。しかしながら、それはRNAまたはアンチセンスRNAであることもできる。対象遺伝子は、その完全長、短縮形、融合遺伝子または標識遺伝子で存在することができる。それはゲノムDNAもしくは好ましくはcDNAまたは対応するフラグメントもしくは融合物であることができる。対象遺伝子はネイティブ遺伝子配列であることもでき、あるいは変異または別な方法で修飾されていることもできる。このような修飾は特定の宿主細胞への適合およびヒト化のためのコドン最適化を含む。対象遺伝子は、例えば、分泌、細胞質、核内局在、膜結合型または細胞表面結合ポリペプチドをコードすることができる。
用語“cDNA”は、遺伝子から調製されるmRNAまたは他のRNAからの第2のDNA鎖の逆転写および合成により製造できるデオキシリボ核酸を意味する。cDNAが二本鎖DNA分子として存在する場合、それはコード鎖および非コード鎖の両方を含む。
生物医薬品としての重要性を有するタンパク質/ポリペプチドは、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体およびそれらの誘導体もしくはフラグメントを含むが、それに限定されるものではない。一般に、アゴニストもしくはアンタゴニストとして作用するポリペプチドおよび/または治療応用もしくは診断応用を有するポリペプチドはすべて使用できる。他の対象タンパク質には、例えば、いわゆる“細胞工学”に従って宿主細胞の性質を変えるのに用いられるタンパク質/ポリペプチド、例えば抗アポトーシスタンパク質、シャペロン、代謝酵素、グリコシル化酵素およびそれらの誘導体またはフラグメントがあるがそれに限定されない。
Fabフラグメント(抗原結合フラグメント=Fab)は、隣接する定常領域に結合された両方の鎖の可変領域からなる。それらは、例えばパパインなどのプロテアーゼを用いて処理することにより従来の抗体から製造でき、あるいはDNAクローニングにより製造できる。他の抗体フラグメントには、ペプシンでのタンパク質消化により製造できるF(ab')2フラグメントがある。
当該技術分野においては、用語“ミニボディ”は二価のホモ二量体scFv誘導体を意味するために用いられる。これは、二量体化領域として免疫グロブリン、好ましくはIgG、最も好ましくはIgG1のCH3領域を含む融合タンパク質からなる。これは、ヒンジ領域(同様にIgGの)およびリンカー領域によりscFvフラグメントと結合する。このようなミニボディの例は、Huら(1996)により記載されている。
当該技術分野において、用語“トリアボディ”は三価のホモ三量体scFv誘導体を意味するために用いられる(Korttら、1997)。リンカー配列を用いないVH-VLの直接融合により三量体の形成がもたらされる。二価、三価または四価の構造を有するミニ抗体として当該技術分野で公知のフラグメントもまたscFvフラグメントの誘導体である。二量体、三量体または四量体コイルドコイル構造体を用いて多量体化が達成される(Packら、1993および1995;Lovejoyら、1993)。
他の実施形態において、本発明の発現ベクターは、対象遺伝子に機能的に結合されている蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、対象タンパク質/産物および蛍光タンパク質がバイシストロン性mRNAによりコードされるように単一の異種プロモーターの調節下で両遺伝子が転写される。これは、蛍光タンパク質の発現率を用いて、対象タンパク質/産物を大量に産生する細胞を同定することを可能にする。また、蛍光タンパク質をコードする遺伝子の転写は、それ自身のプロモーターの調節下で行われるようにすることができる。
蛍光タンパク質は、例えば緑色、帯青緑色、青色、黄色または他の色の蛍光タンパク質であることができる。1つの特定例は、オワンクラゲ(Aequorea victoria)またはウミシイタケ(Renilla reniformis)から得られる緑色蛍光タンパク質(GFP)およびそれらから開発された変異体である。例えばBennetら、1998;Chalfieら、1994;WO01/04306およびそれらに引用されている文献を参照のこと。
本発明に用いられる蛍光タンパク質は、野生型タンパク質に加えて、例えば他のタンパク質またはペプチドに融合させた天然または遺伝子組み換え変異体およびそれらの変種、フラグメント、誘導体または変種を含む。用いられた変異は、例えば、タンパク質の励起もしくは発光スペクトル、発色団の形成、減衰係数または安定性を変えることができる。さらに、哺乳動物細胞または他の種における発現は、コドン最適化により改善されることができる。本発明によれば、蛍光タンパク質はまた、選択マーカー、好ましくはジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)などの増幅選択マーカーと融合させて用いることができる。
蛍光タンパク質により放出される蛍光は、例えば蛍光表示式細胞分離器(FACS)を備えたフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡検査によりタンパク質を検出することを可能にする。
発現ベクターは、対象遺伝子の発現および好ましくは蛍光タンパク質の発現を可能にする少なくとも1つの異種プロモーターを含む。
用語“プロモーター”は、遺伝子またはそれに機能的に連結された配列の転写を可能にし調節するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび転写の開始部位(転写開始部位)と結合する認識配列を含む。特定の細胞型または宿主細胞内で望ましい配列を発現させるためには、適切な機能的プロモーターが選択されなければならない。構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび抑制プロモーターを含む、種々の供給元からの種々のプロモーターが当業者には明らかであろう。例えば、それらはGenBankなどのデータバンクに寄託されており、または商業的または個々の供給元から個々の領域またはポリヌクレオチド配列にクローニングされた領域として入手することができる。誘導性プロモーターにおいて、プロモーターの活性はシグナルに応じて増減されることができる。誘導性プロモーターの1例はテトラサイクリン(tet)プロモーターである。これは、テトラサイクリン依存性トランスアクチベータータンパク質(tTA)により誘導されうるテトラサイクリンオペレーター配列(tetO)を含む。テトラサイクリンの存在下でtTAのtetOへの結合は阻害される。他の誘導性プロモーターの例は、jun、fos、メタロチオネインおよび熱ショックプロモーターである(Sambrookら、1989;Gossenら、1994もまた参照のこと)。
発現カセットにおける転写活性を増強/調節するために、対応する異種プロモーターは他の調節配列に機能的に連結されていることができる。
例えば、プロモーターは、転写活性を増強するためにエンハンサー配列に機能的に結合させることができる。このために、例えばCMVまたはSV40エンハンサーなどの1以上のエンハンサーおよび/または数コピーのエンハンサー配列を使用することができる。よって他の実施形態において、本発明の発現ベクターは1以上のエンハンサー/エンハンサー配列を含み、好ましくはCMVまたはSV40エンハンサーを含む。
基本的に、さらなる調節配列は、異種プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナルならびに他の発現調節配列を含む。誘導性および構成的調節配列は共に種々の細胞型で知られている。
用語“転写開始部位”は、一次転写産物、すなわちmRNA前駆体に組み込まれている最初の核酸に対応する構築物中の核酸を指す。転写開始部位はプロモーター配列と重複することができる。
用語“転写終結部位”は、通常は対象遺伝子または転写される遺伝子セクションの3'末端に位置し、RNAポリメラーゼによる転写終結をもたらすヌクレオチド配列を指す。
“ポリアデニル化シグナル”は、真核mRNAの3'末端における特定部位での切断および切断された3'末端における約100〜200アデニンヌクレオチド(ポリA尾部)配列の転写後取り込みを引き起こすシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは、切断部位の約10〜30ヌクレオチド上流の配列AATAAAおよび下流に位置する配列を含む。種々のポリアデニル化領域、例えばtk polyA、SV40後期および初期polyAまたはBGH polyAなどが知られている(例えばUS5,122,458に記載されている)。
下流にある遺伝子配列はIRES配列要素の3'末端に機能的に結合されている。すなわち、意図された目的のために遺伝子の発現が影響を受けない、またはわずかに影響を受ける、または十分発現されるようにスペースが選択される。十分な発現のための、IRES配列要素とその下流にある遺伝子の開始コドンの間の最適の許容される距離は、スペースを変え、レポーター遺伝子アッセイを用いるスペースの機能としての発現率を測定することによる簡単な実験により決定できる。
記載されている手段により、異種遺伝子産物の発現に大きな価値がある最適発現カセットを得ることができる。従って、1以上のこれらの手段を用いて得られた発現カセットはさらなる本発明の主題である。
他の実施形態において、本発明の発現ベクターは、ハムスターのユビキチン/S27aプロモーターを含み、好ましくは対象遺伝子に機能的に結合されているハムスターのユビキチン/S27aプロモーターを含み、そしてより好ましくは対象遺伝子および蛍光タンパク質または選択マーカーをコードする遺伝子に機能的に結合されているハムスターのユビキチン/S27aプロモーターを含む。
ハムスターのユビキチン/S27aプロモーターは、WO97/15664に記載されている強力な同種プロモーターである。このようなプロモーターは、好ましくは、以下の特徴の少なくとも1つを有する:GCリッチ配列領域、Sp1結合部位、ポリピリミジン領域、TATAボックスの不存在。特に好ましいものは、Sp1結合部位を有するがTATAボックスを含まないプロモーターである。また、構成的に活性化され、特に血清含有、低血清および無血清細胞培養条件下で同様に活性を示すプロモーターも好ましい。他の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターであり、特に血清の除去により活性化されるプロモーターである。
特に有利な実施形態は、WO97/15664の図5に含まれるヌクレオチド配列を有するプロモーターである。特に好ましいものは、図5の位置-161〜-45の配列を含むプロモーター配列である。
本特許明細書の実施例に用いられているプロモーターは、それぞれWO97/15664の図5からのフラグメント-372〜+111に対応し、好ましいプロモーターを示す(すなわち好ましいプロモーターはこの配列領域を組み込むべきである)配列を有するDNA分子を含む。
本発明の発現ベクターは、理論上、当該技術分野で公知の慣用法、例えばSambrookら(1989)によって記載されている方法により製造できる。Sambrookはまた、ベクターの機能的構成要素、例えば適切なプロモーター(ハムスターユビキチン/S27aプロモーターに加えて)、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナル、抗生物質耐性遺伝子、選択マーカー、複製開始点およびスプライシングシグナルも記載している。従来のクローニングベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミドまたはウイルスベクター、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ベクターおよび単純ヘルペスウイルスばかりでなく合成または人工染色体/ミニ染色体をそれらの製造に使用できる。真核発現ベクターはまた、一般的には、原核性配列、例えば複製起点および、細菌内でベクターの複製および選択を可能にする抗生物質耐性遺伝子も含む。ポリヌクレオチド配列の導入のためのマルチクローニング部位を含む多くの真核発現ベクターが公知であり、一部は種々の会社、例えばStratagene, La Jolla, CA, USA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Promega, Madison, WI ,USAまたはBD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USAから購入することができる。
また、本発明の好ましい発現ベクターは、1以上のTE配列要素を含み、対象遺伝子の代わりに、制限エンドヌクレアーゼの認識配列により対象遺伝子のクローニングを可能にするマルチクローニング部位のみを有する発現ベクターである。各種の制限エンドヌクレアーゼの多数の認識配列ばかりでなく、関連した制限エンドヌクレアーゼも先行技術で公知である。好ましくは、認識配列として少なくとも6ヌクレオチドからなる配列が用いられる。適切な認識配列のリストは、例えばSambrookら(1989)中に見いだすことができる。
また、本発明の好ましい発現ベクターは、対象遺伝子のかわりに制限エンドヌクレアーゼの認識配列による対象遺伝子のクローニングを可能にするマルチクローニング部位のみを有し、さらに発現ベクターの異なる位置に1以上の好ましくはマルチクローニング部位を有し、さらに制限エンドヌクレアーゼの認識配列によりTE配列要素をクローニングすることを可能にする発現ベクターである。各種の制限エンドヌクレアーゼの多数の認識配列ばかりでなく、関連した制限エンドヌクレアーゼも先行技術で公知である。好ましくは、認識配列として少なくとも6ヌクレオチドからなる配列が用いられる。適切な認識配列のリストは例えばSambrookら(1989)中に見いだすことができる。
本発明の発現ベクターによるトランスフェクションのために、真核宿主細胞が用いられ、好ましくは哺乳動物細胞が用いられ、より具体的にはげっ歯類細胞、たとえばマウス、ラットおよびハムスター細胞株が用いられる。本発明の発現ベクターによる対応する細胞のトランスフェクションの成功により、トランスフォーム細胞、遺伝子改変細胞、組換え細胞またはトランスジェニック細胞がもたらされ、これらもまた本発明の主題である。
本発明のための好ましい宿主細胞は、ハムスター細胞、例えばBHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1およびCHO-DG44細胞またはこれらの細胞株の亜株/子孫である。特に好ましいものはCHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1およびBHK21細胞であり、特にCHO-DG44およびCHO-DUKX細胞である。同様に、適切なものはマウス由来の骨髄腫細胞であり、好ましくはNS0およびSp2/0細胞であり、これらの細胞株の亜株/子孫である。
本発明に用いることができるハムスターおよびマウス細胞の例は、次の表1に示される。しかしながら、生物医薬品タンパク質の産生のための宿主細胞としてこれらの細胞、ヒト、マウス、ラット、サル、げっ歯動物の細胞株(これらに限定されないを含む)他の哺乳動物細胞または酵母、昆虫、鳥および植物細胞(これらに限定されない)を含む真核細胞の亜株および子孫もまた使用できる。
本発明によれば、本明細書記載の本発明の発現ベクターの1つでトランスフェクトした、組換え哺乳動物細胞、好ましくはげっ歯類細胞、最も好ましくはハムスター細胞、例えばCHOまたはBHK細胞が好ましい。
本発明に好ましいいくつかの異種タンパク質を同時に作製する別の可能な方法は、遺伝子が異なる発現ベクターに別々に組み込まれた同時トランスフェクションである。このことは、遺伝子および遺伝子産物の特定の割合を互いに調節でき、それによってmRNAの安定性ならびに転写および翻訳の効率における任意の相違を相殺する利点を有する。加えて、発現ベクターはその小さなサイズのためにより安定であり、クローニング中にもトランスフェクション中にも取り扱いがより容易である。
本発明の別の特定の実施形態において、宿主細胞は、少なくとも2つの真核発現ベクターであって、2つのベクターの少なくとも1つは少なくとも対象タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含み、一方他のベクターは任意の組み合わせ、位置および配向の本発明の1以上の核酸を含み、場合により少なくとも1つの対象遺伝子もコードする前記真核発現ベクターで同時トランスフェクトされ、本発明のこれらの核酸は、他のベクターを用いる同時組み込みにより、他の同時トランスフェクトしたベクター上に位置する対象遺伝子に転写または発現促進活性を付与する。
従って、本発明は、(i)少なくとも1つの対象タンパク質/産物およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(好ましくは改変された)をコードする遺伝子であって、対象遺伝子(単数または複数)が転写または発現を促進するために少なくとも1つのTE配列要素に機能的に結合されている前記遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトし;(ii)種々の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養し;(iii)選択剤、例えばG418の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を選択する工程を含む、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法を含む。好ましくは、トランスフェクトされた細胞は血清無添加で、培地中で培養される。好ましくは、G418の濃度は少なくとも200μg/mLである。しかしながら、この濃度はまた少なくとも400μg/mLであることもできる。
加えて、本発明の細胞は、場合により、増幅選択マーカー遺伝子の増幅をもたらす選択剤の存在下で培養される1以上の遺伝子増幅工程を受けることもできる。
増幅選択マーカーをコードする遺伝子でさらに宿主細胞がトランスフェクトされることが必要条件である。増幅選択マーカーをコードする遺伝子が本発明の発現ベクターの1つ上に存在するかあるいは別のベクターを用いて宿主細胞に導入されることが考えられる。
増幅選択マーカー遺伝子は、通例、特定の培養条件下で真核細胞の増殖に必要な酵素をコードする。例えば、増幅選択マーカー遺伝子はジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードすることができる。この場合は、それらでトランスフェクトした宿主細胞が選択剤メトトレキセート(MTX)の存在下で培養される場合に遺伝子が増幅される。
哺乳動物細胞、好ましくはマウス骨髄腫およびハムスター細胞は、増幅選択マーカーとしてのDHFRの使用のための好ましい宿主細胞である。細胞株CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)およびCHO-GD44(Urlaubら、1983)は、変異の結果としてそれ自身のDHFR活性を有さないので特に好ましい。それ自身の内因性DHFR活性を有さない他の細胞型においてもDHFR誘発増幅を可能にするためには、トランスフェクションプロセスにおいて、メトトレキセートに対する感度が低下したタンパク質をコードする変異DHFR遺伝子を使用することができる(Simonsonら、1983;Wiglerら、1980;Haberら、1982)。
DHFRマーカーは、CHO-DG44またはCHO-DUKXなどのDHFR陰性基本細胞を用いるとき、選択とその後の増幅に特に適している。なぜならこれらの細胞は内因性DHFRを発現せず、従ってプリンを含まない培地では増殖しないからである。従って、本明細書においてはDHFR遺伝子を主要な選択マーカーとして用いることができ、形質転換細胞はヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で選択される。
用語遺伝子発現は、宿主細胞における異種遺伝子配列の転写および/または翻訳に関する。発現率は、一般に、宿主細胞に存在する対応するmRNAの量に基づくかまたは対象遺伝子によりコードされる、産生される遺伝子産物の量に基づいて決定できる。選択されたヌクレオチド配列の転写により産生されるmRNAの量は、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼ-RNA-プロテクション、細胞RNAのin situハイブリダイゼーションまたはPCR法(例えば定量PCR)により測定できる(Sambrookら、1989;Ausubelら、1994)。選択されたヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、種々の方法、例えば、ELISA、プロテインA HPLC、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物活性の検出、タンパク質の免疫染色に続くFACS分析または蛍光顕微鏡検査、FACS分析または蛍光顕微鏡検査による蛍光タンパク質の直接検出によって測定することもできる(Sambrookら、1989;Ausubelら、1994)。これらの方法により、例えば本発明の配列番号1のTE配列要素またはその任意の部分、フラグメントもしくは領域またはその誘導体もしくは組み合わせが対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらすかどうかを研究する事が可能となる。
さらなる選択マーカーとして1以上の蛍光タンパク質(例えばGFP)または細胞表面マーカーを含む対応するプロセスを組換え宿主細胞のFACS支援選択と組み合わせることができる。発現上昇を得る他の方法および異なる方法の組み合わせもまた使用でき、例えば、クロマチン構造(例えばLCR、UCOE、EASE、アイソレーター、S/MAR、STAR配列要素)を操作するためのシス作用性配列要素の使用、(人工)転写因子の使用、上方制御内因性または異種遺伝子発現のための天然または合成の薬剤を用いる細胞の処理、mRNAまたはタンパク質の安定性(半減期)の改善、mRNA翻訳の開始の改善、エピソームプラスミドの使用による遺伝子量の増加(複製起点としてのウイルス配列、例えばSV40、ポリオーマ、アデノウイルス、EBVまたはBPVの使用に基づく)、増幅促進配列の使用(Hemannら、1994)またはDNAコンカテマーに基づくin vitro増幅系(Monacoら、1996)に基づく。
本発明は、TE-13(配列番号15)もしくはTE-13(配列番号15)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-13(配列番号15)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸に関する。
本発明は、TE-13(配列番号15)もしくはTE-13(配列番号15)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-13(配列番号15)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加もたらす核酸であって、前記フラグメントまたは誘導体が1bp〜1578bp(配列番号01に関して)の核酸領域からの少なくとも1つの配列領域を含む前記核酸に関する。配列領域は、少なくとも10bp、15bp、20bp、50bp、100bpの核酸領域を意味する。
対象遺伝子の発現の促進は、例えばELISAにより産物力価を測定することにより測定できる。
好ましい実施形態において、本発明はTE-08(配列番号10)もしくはTE-08(配列番号10)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-08(配列番号10)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含むであって、染色体組み込みによって発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす前記核酸に関する。
ただし、本発明の上記核酸の好ましい実施形態において、同様に前記フラグメントまたは誘導体が1bp〜1578bp(配列番号01に関して)の核酸領域からの少なくとも1つの配列領域を含まなければならない。
他の実施形態において、本発明は、配列番号1もしくは配列番号1のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列または配列番号1の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸に関する。
本発明の前記核酸の好ましい実施形態において、同様に、フラグメントまたは誘導体が1bp〜1578bp(配列番号01に関して)の核酸領域からの少なくとも1つの配列領域を含むという条件がある。
本発明の前記核酸の特に好ましい実施形態において、同様に、フラグメントまたは誘導体がTE-09(配列番号11)またはTE-08(配列番号10)またはTE-13(配列番号15)の少なくとも1つの配列領域を含むという条件がある。配列領域は、少なくとも10bp、15bp、20bp、50bp、100bpの核酸領域を意味する。
本発明はまた、配列番号1またはそのフラグメントもしくは誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列を有する対象遺伝子の転写または発現を増加させる核酸(=TE配列要素)であって、対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす前記核酸に関する。
対象遺伝子の発現の増加は、例えばELISAにより産物力価を測定することにより測定できる。
(a)核酸配列TE-13(配列番号15)もしくはTE-08(配列番号10)の領域、または、
(b)それらの相補的核酸配列、または、
(c)(a)もしくは(b)と少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%もしくは85%の配列同一性、特に好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する核酸配列、
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の核酸に関する。
好ましい実施形態において、本発明はTE配列要素TE-00(配列番号2)の5'フラグメントに関する。これは1bp〜1578bpの配列番号1の部分またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に対応する。
本発明は、特にTE-13(配列番号15)もしくはTE-08(配列番号10)またはそれらの誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体組み込みによって対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸または転写促進もしくは発現促進核酸配列要素(TE配列要素)に関する。
本発明は、好ましくは単離された核酸または単離された核酸分子または単離された核酸配列または単離された転写促進核酸配列要素または単離されたTE配列要素に関する。
一実施形態において、核酸または転写促進核酸配列要素または単離された核酸は、TE配列要素配列またはその相補配列の対応する部分、特にTE-00配列の配列領域5’に対応する、配列番号1に関するヌクレオチド位置1bp〜1578bpの配列領域、特に好ましくはTE-13(配列番号15)またはTE-08(配列番号10)と少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%の配列同一性または少なくとも約85%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する配列番号1の(または)TE配列要素の誘導体を含む。
好ましい実施形態において、核酸または転写促進核酸配列要素または単離された核酸は、TE配列要素配列の対応する部分またはそれらの相補配列と少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%の配列同一性または少なくとも約85%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するTE-08核酸(配列番号10)の誘導体または好ましくはTE-13核酸(配列番号15)の誘導体を含む。
別の好ましい実施形態において、本発明の核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)は、TE-00(配列番号2)、TE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-04(配列番号6)、TE-06(配列番号8)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)、TE-12(配列番号14)、TE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)およびTE-21(配列番号21)の中から選択される。
好ましい実施形態において、核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)は、核酸がTE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)であることを特徴とする。
特に好ましい実施形態において、核酸または転写促進配列要素はTE-08(配列番号10)である。
特に好ましい実施形態において、核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)はTE-18(配列番号20)である。
他の実施形態において、核酸または転写促進配列要素(TE配列要素)は、それがTE-01(配列番号3)のフラグメントまたは誘導体であり、好ましくはTE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)であることを特徴とする。
好ましい実施形態において、本発明の核酸はTE-13(配列番号15)である。
他の実施形態において、本発明の核酸またはフラグメントまたは誘導体は単離された核酸である。
好ましい実施形態において、異種遺伝子配列に結合されている核酸は、発現ベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスベクターまたは特にターゲティングベクターであることができる。
しかしながら、異種遺伝子配列に結合されている核酸は、任意の他の合成核酸分子例えば合成、人工またはミニ染色体であることもできる。
特別な実施形態において、この真核発現ベクターはプロモーターおよび/または対象異種遺伝子および/または選択マーカーおよび/または場合によりエンハンサーを含むことを特徴とする。
本発明はさらに、真核発現ベクターが1以上の本発明の核酸または1以上の本発明の転写促進配列要素(TE配列要素)およびプロモーターおよび/または対象異種遺伝子および/または選択マーカーおよび/または場合によりエンハンサーを含むことを特徴とする真核発現ベクターに関する。
他の実施形態において、真核発現ベクターは、それが対象遺伝子の人工的(deliberate)組み込みのためのターゲティングベクターであることを特徴とする。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、プロモーターがヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーター(CMVプロモーター)、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの末端反復領域、アクチン、免疫グロブリンまたは熱ショックプロモーター(単数または複数)などの異種プロモーターであり、好ましくはCMVプロモーターであることを特徴とする。
特別な実施形態において、真核発現ベクターは、それが、互いに任意の配向の本発明のいくつかの同一または異なる核酸またはTE配列要素の組み合わせであって、1以上の核酸またはTE配列要素が対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するおよび/または1以上の核酸またはTE配列要素が対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置する前記組み合わせを含むことを特徴とする。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、組み合わせ核酸またはTE配列要素がTE-06(配列番号8)であり、特に好ましくはTE-08(配列番号10)であることを特徴とする。
核酸またはTE配列要素の好ましい組み合わせは、対象遺伝子の前(すなわち5')のTE-06領域(配列番号8)と対象遺伝子の後(すなわち3’)のTE-06領域(配列番号8)および対象遺伝子の後(すなわち3’)の3つのTE-06-領域(配列番号8)である(図13も参照のこと)。
TE-核酸または領域の他の好ましい組み合わせは、対象遺伝子の前および/または後の2つのTE-08核酸領域(配列番号10)である。
他の実施形態において、真核発現ベクターは、複数個のTE-06-核酸または領域(配列番号8)が対象遺伝子の後(3’)に位置し、好ましくは3個が位置することを特徴とする(図13参照)。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、1以上のTE-08-核酸(単数または複数)または領域(単数または複数)(配列番号10)と1以上のTE-06核酸または領域(単数または複数)(配列番号8)の組み合わせが対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するおよび/または対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置することを特徴とし;好ましい組み合わせは、対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するTE-08核酸または領域(配列番号10)とそれに続くTE-06-核酸または領域(配列番号8)の組み合わせである(図13もまた参照のこと)。
好ましい実施形態において、真核発現ベクターは、それがさらにインテグラーゼを含むことを特徴とする。
別の好ましい実施形態において、宿主細胞は少なくとも2つの真核発現ベクターで同時トランスフェクトされ、2つのベクターの少なくとも1つは少なくとも1つの対象タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含み、他のベクターは任意の組み合わせ、位置および配向で1以上の本発明の核酸を含み、場合により少なくとも1つの対象遺伝子もコードし、これらの本発明の核酸は、他のベクターとの同時組み込みにより、他の同時トランスフェクトしたベクター上に位置する対象遺伝子にそれらの転写または発現促進作用を付与する。
特別な実施形態において、真核発現ベクターは、選択マーカーがDHFRまたはNeoであり、例えばNeo F240Iであることを特徴とする。
本発明はさらに、真核宿主細胞が本発明の真核発現ベクターを含むことを特徴とする真核宿主細胞に関する。
特別な実施形態において、真核宿主細胞は高産生クローンであること、すなわちTE配列要素を含まない類似の真核宿主細胞よりも高い比生産性を有することを特徴とする真核宿主細胞であって、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍もしくは10倍までに増加した発現レベルまたは2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上もしくは10倍以上に増加した発現レベルを有し、好ましくは5倍までにまたは3倍以上の発現レベルを有する前記宿主細胞である。
特に好ましい実施形態において、真核宿主細胞は、発現ベクターがゲノムに安定に組み込まれていることを特徴とする。
他の実施形態において、真核宿主細胞はハムスターまたはマウス細胞、例えばCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHK TK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHO duk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKX B1、CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞であり、好ましくはCHO細胞であり、特に好ましくはCHO-DG44細胞である。
他の実施形態において、真核宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、サルまたはげっ歯類細胞株を含むが限定されない哺乳動物細胞である。
別の特別な実施形態において、真核宿主細胞は、それがさらに抗アポトーシス遺伝子、例えばBCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HLまたはCED-9を含み、好ましくはBcl-xLまたはBCL-2を含み、最も好ましくはBCL-xLを含むことを特徴とする。
(a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、
を特徴とする、高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の開発方法に関する。
(a)少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を含む真核発現ベクターに対象遺伝子(単数または複数)を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、
を特徴とする、高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の開発方法に関する。
特別な実施形態において、本方法は少なくとも1つのさらなる増幅工程を特徴とする。
(a)少なくとも対象タンパク質/産物、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(好ましくは改変されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)および増幅選択マーカーDHFRをコードする遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、転写または発現を促進するために少なくとも対象遺伝子(単数または複数)が請求項1〜14のいずれか1項記載の少なくとも1つの核酸に機能的に結合されている、前記工程、
(b)種々の遺伝子発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程、
(c)ヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で、選択剤、例えばG418の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を選択する工程、および、
(d)少なくとも増幅選択マーカー遺伝子の増幅を可能にする選択剤、例えばメトトレキセートの存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を増幅する工程、
を特徴とする、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法に関する。
別の特定の実施形態において、本方法は、第1増幅工程におけるMTXの濃度が少なくとも100nMまたは少なくとも250nMであり、1μMまたはそれ以上まで段階的に増加されることを特徴とする。ここの場合において、MTX濃度は2μMであることができる。
別の特別な実施形態において、本方法はさらなるクローニング工程を特徴とする。
本発明の方法の他の実施形態において、宿主細胞はげっ歯類/ハムスター細胞、例えばCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHK TK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHO duk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKX B1、CHO-DG44、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞であり、好ましくはCHO細胞であり、特に好ましくはCHO-DG44細胞である。
本発明の方法の特に好ましい実施形態において、高産生クローンの割合は2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍もしくは10倍までに増加し、または2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上もしくは10倍以上に増加し、好ましくは5倍までにまたは3倍以上に増加する。
(a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、および、
(d)対象遺伝子(単数または複数)の発現を可能にする条件下で得られた高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、
を特徴とする生物医薬品の製造方法に関する。
(a)少なくとも1つの本発明の核酸または1つの本発明のTE配列要素を含む真核発現ベクターに対象遺伝子(単数または複数)を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、および、
(d)対象遺伝子(単数または複数)の発現を可能にする条件下で得られた高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、
を特徴とする高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の開発方法に関する。
特別な実施形態において、本発明の方法は少なくとも1つのさらなる増幅工程を特徴とする。
(e)対象タンパク質を採取し精製するさらなる工程、
を特徴とする。
本発明はさらに、真核宿主細胞において発現系における対象遺伝子の転写または発現を増加させるための、または生物医薬品を製造するための、真核発現ベクターにおける本発明の核酸または本発明の転写促進領域(TE配列要素)の使用に関する。
本発明はまた、トランスジェニック動物または植物を製造するための本発明の核酸転写または本発明の促進領域(TE配列要素)の使用に関する。
本発明はさらに、遺伝子治療における本発明の核酸または本発明の転写促進領域(TE配列要素)に使用に関する。
本発明は特に、医薬としての、または医薬組成物における本発明の核酸または本発明の転写促進領域(TE配列要素)の使用に関する。
好ましい実施形態において、本発明は、核酸、特に単離された核酸、より正確には、配列番号1またはそのフラグメントもしくは誘導体を有する転写促進または発現促進核酸領域(TE配列要素)であって、染色体組み込みによって対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす前記核酸に関する(TE配列要素TE-00(配列番号2)を除く)。
他の実施形態において、本発明は、TE配列要素TE-00(配列番号2)、TE-04(配列番号6)およびTE-06(配列番号8)を除く本発明の核酸に関する。
他の実施形態において、本発明はTE配列要素TE-00(配列番号2)、TE-04(配列番号6)、TE-05(配列番号7)およびTE-06(配列番号8)を除く本発明の核酸に関する。
対象遺伝子の発現の増加は、例えば、ELISAを用いて産物力価を測定することにより測定できる。
他の実施形態において、TE配列要素フラグメントは任意の隣接配列を伴わないで存在する。このことは、フラグメントがより大きな配列または配列領域ではないこと、例えば他の配列がその前(5’)または後(3’)に結合されていないことを意味する。別の特別な実施形態において、本発明は、任意のCpGアイランドを含まない本発明の核酸に関する。
TE配列要素を含む真核宿主細胞とTE配列要素を含まない真核宿主細胞とを比較するとき、対象遺伝子の比生産性の7倍までの相対変化を観察できることは、以下の実験から明らかである。
選択マーカーとしてのNPT F240Iと併用したTE配列要素08(配列番号10)は、TE配列要素を含まない対照プールと比較して5倍の、対象遺伝子の比生産性の最大増加を示した。選択マーカーとしてのDHFRと併用したTE配列要素08(配列番号10)は、約6.0のより大きな増加を示す。
さらにまた、選択マーカーとしてDHFRを有する試験シリーズにおけるTE配列要素02(配列番号4)は、6.8倍の対象遺伝子の生産性の増加を示す。
領域13により最大増加(15倍)がもたらされる。
さらに、以下の実施例において、試験された異なるTE配列要素の比生産性の相対変化は、主としてベクター系と独立して、すなわち用いられる選択マーカーまたは特定の対象遺伝子と独立して実現される。
以下の実施例はまた、マーカー遺伝子の発現の変化は、対象遺伝子の発現の変化に関連していることを示している。
以下の実施例から、試験したTE配列要素のいずれもが、促進作用を有さないこともまた明らかである。従って、TE配列要素は染色体レベルでの対象遺伝子の発現の増加を引き起こすのみであることは明らかである。
以下の実施例はまた、複数個の同一または異なる短いTE配列要素の組み合わせまたは連結、例えばTE配列要素06および08または21は、さらなる発現促進作用をもたらしうることもまた示している。
略語
AP:アルカリホスファターゼ
Asp(=D):アスパラギン酸
bp:塩基対
CHO:チャイニーズハムスター卵巣
DHFR:ジヒドロ葉酸還元酵素
ELISA:酵素免疫抗体法
FACS:蛍光表示式細胞分離器
GFP:緑色蛍光タンパク質
Gly(=G):グリシン
HT:ヒポキサンチン/チミジン
IgG:免疫グロブリンG
Ile(=I):イソロイシン
IRES:内部リボソーム侵入部位
kb:キロベース
mAb:モノクローナル抗体
MCP-1:単球走化性タンパク質-1
MTX:メトトレキセート
NPT:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
Phe(=F):フェニルアラニン
SEAP:分泌アルカリホスファターゼ
Ub:ユビキチン
UTR:非翻訳領域
細胞培養およびトランスフェクション
細胞培養フラスコ中、37℃、湿った大気および5%CO2下で、ヒポキサンチンおよびチミジン(HT)(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, DE) を加えた無血清CHO-S-SFMII培地でCHO-DG44/dhfr-/-細胞(Urlaubら、1983)を懸濁細胞として永続的に培養した。コールターカウンターZ2(Beckmann Coulter)またはCedex(Innovatis)で細胞数および細胞生存率を測定し、ついで細胞を1〜3x105/mLの濃度で播種し、2〜3日ごとに継代した。CHO-DG44のトランスフェクションのためにリポフェクタミンプラス試薬(Invitrogen GmbH)を用いた。各トランスフェクション混合物について、製造業者の使用説明書に従って、全部でプラスミドDNA1.0〜1.3μg、リポフェクタミン4μLおよびPlus試薬6μLを混合し、HT添加CHO-S-SFMII培地0.8mL中の6x105細胞に200μLの容量で加えた。細胞インキュベーター中、37℃で3時間インキュベーションした後、HT添加CHO-S-SFMII培地2mLを加えた。48時間の培養時間後、トランスフェクション混合物を採取(一過性トランスフェクション)するかまたは選択にかけた。NPTに基づく選択のためには、トランスフェクションの2日後に、G418(Invitrogen)400μg/mLを含むHT添加CHO-S-SFMII培地に細胞を移した。DHFRに基づく選択のためには、トランスフェクションの2日後に、HTを含まないCHO-S-SFMII培地に細胞を移した。1つの発現ベクターがDHFRを含み、他の発現ベクターがNPT選択マーカーを含む同時トランスフェクションの事象におけるDHFRおよびNPTに基づく選択において、トランスフェクションの2日後に、ヒポキサンチンおよびチミジンを加えずにCHO-S-SFMII培地に細胞を移し、G418(Invitrogen)もまた培地に400μg/mLの濃度で加えた。
組み込まれた異種遺伝子のDHFRに基づく遺伝子増幅は、HTを含まないCHO-S-SFMII培地に5〜2000nMの濃度で選択剤MTX(Sigma, Deisenhofen, DE)を加えることにより行うことができる。
発現を分析するために、pAD-CMVベクター(Wernerら,1998)に基づき、CMVエンハンサー/ハムスターユビキチン/S27aプロモーター(WO97/15664)またはCMVエンハンサー/CMVプロモーターの組み合わせにより異種遺伝子の発現を媒介する真核発現ベクターを用いた。ベースベクターpBIDは増幅選択マーカー(例えばEP-0-393-438参照)として作用するdhfrミニ遺伝子を含むが、ベクターpBINGにおいてはdhfrミニ遺伝子は改変NPT遺伝子に置き換えられている。これはNPT変種D227G(Asp227Gly)である。NPT変種D227GおよびIRES-GFP遺伝子領域でのpBINGのクローニングは(WO2004/050884)に記載されているように行った。ベースプラスミドpTE4は選択マーカーとしてNPT変種F240I(Phe240Ile)を含み、プラスミドpBINGの誘導体である。NPT変種F240IによるNPT変種D227Gの置換とは別に、GFPもまたベクターpDsRed2からの赤色蛍光タンパク質DsRed2(Clontech, Palo Alto, CA, USA)で置換した。ベースプラスミドpTE5は選択マーカーとしてDHFRを含み、ベクターpBIDG(WO2004/050884)の誘導体であり、この場合も再びベクターpDsRed2からの赤色蛍光タンパク質DsRed2(Clontech, Palo Alto, CA, USA)でGFPを置換した。
ヒトMCP-1 cDNA(Yoshimuraら、1989)を、0.3kb HindIII/EcoRIフラグメントとしてベクターpTE4またはpTE5の対応する切断部位にクローニングし、プラスミドpTE4/MCP-1およびpTE5/MCP-1(それぞれ図1Bおよび図2)を得た。
BD FACScalibur(BD Bioscience)を用いてフローサイトメトリー分析を行った。FACSは励起波長488nmのヘリウム-アルゴンレーザーを備えている。特定の蛍光タンパク質に適した波長で蛍光強度を吸収し、付属のソフトウェアCell Quest Proを用いて処理した。
製造業者の使用説明書(BD Biosciences Pharmingen, Heidelberg, DE)に従って、OptEIA Human MCP-1 Setキットを用い、ELISAにより安定的にまたは一過性にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞の上清におけるMCP-1力価を定量した。安定的にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞からの上清におけるIgG1 mAbは、一方ではヤギ抗ヒトIgG Fcフラグメント(Dianova, Hamburg, DE)を用い、他方ではAP標識ヤギ抗ヒトκ-軽鎖抗体(Sigma)を用いて、標準手順のELISA(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., 1994, 更新版)により定量した。精製したIgG1抗体を標準品として用いた。式pg/((Ct-Co)t/ln(Ct-Co))により生産性(pg/細胞/日)を算出した。ここで、CoおよびCtはそれぞれ播種時および採取時における細胞数であり、tは培養時間である。
製造業者の使用説明書(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE)に従って、一過性にトランスフェクトされたCHO-DG44細胞からの培養上清におけるSEAP力価をSEAPレポーター遺伝子アッセイを用いて定量した。
ユビキチン/S27a遺伝子のコード領域に加えてUb/S27a-プロモーターを含む隣接5´UTR領域を含む、WO97/15664に記載のハムスターゲノム由来の配列から出発して、さらなる上流で今までに知られていない配列領域が単離された。このために、“ネステッドPCR”の鋳型としてアダプターを連結したゲノムCHO-DG44DNAを用いた。アダプターまたはWO97/15664に配列番号5(プライマーUb20:5'-CTCCACACATTTACACATGGACAC-3'(配列番号39))として記載されている配列の5'領域のハムスター配列;WO97/15664からの配列番号5のヌクレオチド62〜85(相補配列)に対応する)に相補性を有するプライマーの組み合わせを用いて第1PCRを行った。ついで、インナーアダプタープライマーおよびインナー(“ネステッド”)ハムスター特異的プライマー(プライマーUb21:5'-GGGTTTCTCTGTGTAATAGCCATG-3'(配列番号40);WO97/15664からの配列番号5のヌクレオチド16〜39(相補配列)に対応する)からなる第2プライマーの組み合わせで第2PCRを行った。既知の配列を有するハムスター特異的プライマー末端から開始し、上流に位置する新規で未知の配列領域に結合する得られたオーバーラップDNAフラグメントをpCR2.1TOPOベクター(Invitrogen)にサブクローニングし、配列決定により分析した。ハムスターUb/S27a遺伝子の上流に、新規な、今までに知られていない全長348bpの配列が得られた。
CHOゲノム由来の3.8kbのTE配列要素TE-A(図3、配列番号1)から出発して、PCRにより、TE配列要素TE-Aと比較して5'または3'末端のいずれかが欠失した種々のフラグメントを作製した(図4および図5)。これらのフラグメントを合成するために、順方向および1つの逆方向プライマーの組み合わせを用いた(図5および図6)。クローニング目的で、プライマーにより、フラグメントの5’末端にBamHI切断部位を付着させ、フラグメントの3’末端にBsrGI切断部位を付着させた。このようにして、TE-01〜TE-12と呼ぶ異なる長さの12のTE配列要素を作製した(図4および5)。BsrGIおよびBamHIで消化後、ベースプラスミドpTE4/MCP-1(図1B)またはpTE5/MCP-1(図2)のアダプター領域に順配向でクローニングした。SacII制限酵素消化により、TE-AのサブクローンをフラグメントTE-00(配列番号2)から単離し、プロモーター/エンハンサー領域の5'に位置するSpeI切断部位を介して順配向および逆配向の両方でベースベクターpBING-LC(図1A)またはpBID-HC(図1A)にクローニングした。
TE-A(配列番号1)
ccatgagagcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatagcccggatgtgtggaactgcatcttgggacgagtagttttagcaaaaagaaagcgacgaaaaactacaattcccagacagacttgtgttacctctcttctcatgctaaacaagccccctttaaaggaaagcccctcttagtcgcatcgactgtgtaagaaaggcgtttgaaacattttaatgttgggcacaccgtttcgaggaccgaaatgagaaagagcatagggaaacggagcgcccgagctagtctggcactgcgttagacagccgcgg
gatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatagcccggatgtgtggaactgcatcttgggacgagtagttttagcaaaaagaaagcgacgaaaaactacaattcccagacagacttgtgttacctctcttctcatgctaaacaagccccctttaaaggaaagcccctcttagtcgcatcgactgtgtaagaaaggcgtttgaaacattttaatgttgggcacaccgtttcgaggaccgaaatgagaaagagcatagggaaacggagcgcccgagctagtctggcactgcgttagacagccgcgg
gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag
caaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag
acctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag
ctatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag
caggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag
Cttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagcgactataaccagatag
Gcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttc
Gcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatc
gcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagg
gcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc
gcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcag
gcctgaagacctgagttgatacccagaacccagatcaagatggaggagagaaccagccccactaagctgtcccctgacccccataaatgcctccctgtccagttatgccacacaatgataggtgaatacagaaaaacacccttcctttagacactaagcggattcctcttacgcataccagttaagtgatagttcttaggcttcaactcagcactttaaaaagtttatattttgcaatgctggggactaaattagggttgtgcacatgctaagtaagcactctacttttgtatcacattttaataattgtaagaattaattcgtgaaatagtagctgagacaatagatttgtttctttcatgtgggaactgctgtgtgtgcttcttgctgatgcaaacaaggtcaaatactttattccccagtgtctgcctagccctgtaacacttctctattatacaatgaccacaaataattaggtgagtgggttttgtttcattttaaattgttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccctcatatttgaagtattttattctttgcagtgttgaatatcaattctagcacctcagacatgttaggtaagtaccctacaactcaggttaactaatttaatttaactaatttaaccccaacactttttctttgtttatccacatttgtggagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgctcggatcattctaccttttgtttaaaaaatgttagtccaggggtggggtgcactgtgaaagtctgagggtaacttgctggggtcagttctttccactataggacagaactccaggtgtcaactctttactgacagaaccatccaaatagccctatctaattttagttttttatttatttattttttgtttttcgagacagggtttctctgtggctttggaggctgtcctggaactagctcttgtagaccaggctggtctcgaactcagagatccacctgcctctgcctcctgagtgctgggattaaaggcatgcgccaccaacgcttggctctacctaattttaaaagagattgtgtgtcacaagggtgtcatgtcgccctgcaaccaccccccccccaaaaaaaaaaaaaaaaaaacttcactgaagctgaagcacgatgatttggttactctggctggccaatgagctctagggagtctcctgtcaaacagaatctcaacaggcgcagcagtcttttttaaagtggggttacaacacaggtttttgcatatcaggcattttatctaagctatttcccagccaaaaatgtgtattttggaggcagcagagctaatagattaaaatgagggaagagcccacacaggttattaggaagataagcatcttctttatataaaacaaaaccaaaccaaactggaggaggtctacctttagggatggaagaaaagacatttagagggtgcaatagaaagggcactgagtttgtgaggtggaggactgggagagggcgcaaccgctttaactgtcctgttttgcctattttttggggacagcacatgttcctatttttcccaggatgggcaatctccacgtccaaacttgcggtcgaggactacag
細胞質に位置するGFP(緑色蛍光タンパク質)および分泌モノクローナルIgG1抗体の発現に対するTE配列要素TE-00の効果を、CHO-DG44細胞を用いる2つの独立した安定なトランスフェクションシリーズで研究した。このために、以下のプラスミドの組み合わせまたはプラスミド変種でCHO-DG44細胞を同時トランスフェクトした:
a)TE配列要素を含まない対照プラスミドpBING-LC(図1A)およびpBID-HC(図1A)
b)順配向でプロモーター/エンハンサーの上流に組み込まれたTE配列要素TE-00を有するpBING-LCおよびpBID-HC
c)逆配向でプロモーター/エンハンサーの上流に組み込まれたTE配列要素TE-00を有するpBING-LCおよびpBID-HC
CHO-DG44細胞の3つの安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズC、DおよびE)において、TE配列要素を含まない場合の発現と比較して、分泌MCP-1の発現に対するTE配列要素TE-01〜TE-12の効果を調べた。3つのシリーズすべてにおいて、プラスミド変種1つについて6プールを作製した。ベースプラスミドは、シリーズCおよびDにおいてはpTE4/MCP-1(図1B;選択マーカーNPT-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)であり、シリーズEにおいてはpTE5/MCP-1(図2;選択マーカーDHFR=ジヒドロ葉酸還元酵素)とした。これらは、TE配列要素なし(=対照混合物)またはプロモーター/エンハンサーの上流に順配向のTE配列要素TE-01〜TE-12の1つを含んでいた。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する影響を最小化するために、全部でプラスミドDNA1.2μgを用いた。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜10.7kbの間で変化した。しかしながら、すべての混合物において、試験プラスミドの分子の総数を一定に保つことができるようにするために、より小さいプラスミド分子を有する混合物において、産物遺伝子もTE配列要素も任意の真核選択マーカーも含まないいわゆる偽プラスミドでDNAの総量の収支を合わせた。陰性対照として各トランスフェクションシリーズにおいて偽トランスフェクトされたプールもまた試験した。すなわちトランスフェクション混合物のDNAを加えないこと以外は同じ様に処理した。シリーズCおよびDにおいてHT添加CHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、シリーズEにおいてHTを含まないCHO-S-SFMIIを用いて、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行った。
加えて、MCP-1産物力価および比生産性もまた6継代培養(継代周期2-2-3日)にわたって上昇した。図9(シリーズCおよびD)および図10(シリーズE)は相対的特異的MCP-1生産性を示す。選択マーカーとしてのNPT-F240Iと併用した、係数5.3を有する領域TE-08は、TE配列要素を含まないと対照プールと比較して特異的MCP-1生産性の最大増加を示した(図9)。選択マーカーとしてDHFRと組み合わされたとき、この変種で6倍の増加が達成された(図10)。TE配列要素01、02および03は、対照プールと比較して、NPT選択プールにおいて4〜4.5倍の生産性の増加を示し(図9)、DHFR選択プールにおいて2.6〜6.8倍の生産性の増加を示した(図10)。300bpの長さしかないTE配列要素06もまた、すべてのシリーズにおいて、2.5〜3.2倍生産性を増加させることができた(図9および10)。フラグメントTE-04およびTE-07を用いて達成される増加もまた同様な程度の大きさであった(図10)。少し長いフラグメントTE-10、TE-11およびTE-12を用いたプールは、倍のMCP-1発現を示した(図9および10)。明らかに、これらすべてのプールにおいて、産物をほとんど発現しない細胞数は低下し、従って全体的に、細胞集団における高産生クローンの割合は上昇した。このことは、TE配列要素が負の染色体位置効果を抑制、遮蔽または相殺することができるしるしである。
CHO-DG44細胞の一過性トランスフェクションにより、観察された産物発現増加が実際にTE配列要素のクロマチンオープニング作用に基づくものかどうか、あるいはエンハンサー活性に基づくものかどうかを確認するために試験を行った。一過性トランスフェクションにおいて、ゲノムはプラスミドに組み込まれないので、遺伝情報はプラスミドから直接読み取られる。従って、染色体位置効果は存在しえない。それにもかかわらず遺伝子発現にプラス効果が存在する場合、TE配列要素に存在するエンハンサーにこの効果を帰することができる。このようなエンハンサーは、位置および配向にかかわらずシス位置のプロモーターの活性に作用し、機能的に結合されている遺伝子の転写を刺激することができる。
実施例2に記載の方法と同様に、配列番号1の他の部分フラグメントまたはそれらの誘導体を作製し、実施例3および5に記載されているように、生産性に対するそれらのプラス効果を試験することができる。可能なフラグメントのいくつかの実施例を図12に示す。今までに得られた結果は、例えば、図12に示す配列番号1の領域は遺伝子発現の増加をもたらすことができることを示す。安定なトランスフェクションシリーズにおいて、機能にとって重要な配列領域の位置を捜し当てさらに絞り込むために、比生産性に対するそれらの作用に関して、これらの新規TE配列要素をさらに厳密に解析される。特異的配列領域への機能の絞込みおよびそれに関連したフラグメントの長さの可能な短縮は、発現ベクターの効率的な使用に効率的な使用に有利である。なぜなら、より小さい発現プラスミドはより安定であり、クローニング中にもトランスフェクション中にも取り扱いがより容易である。
TE配列要素13(配列番号15)
gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatc
caaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagg
gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagg
acctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc
caaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc
gttgctattttagagacaggatttcttgcaaacctggttggtcttaaactccgtatgtagctgagaatgaccttgaaaaccttcctgtcccacccctcaaattccagaattatagacacccaccacatggcttaataagtaaacaacaacaataaaagcatgacttctgggtctggagggagggcttgccagttaagagcaatggatactttcccatagaacctgggtttgactcccagcactaacctacatggtgatagtgatgcagcagacatacatgagggcaacacacacatgggcacatacacacgcacccgcccaccatggcttttcccccatcacttagacagccatatttaaacgtagtggagccaggctggggtggtggcccacacctttaatcccagcactccagaaggcagaggtaggcggatctctgtgggtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccatagagaaaccctatctcaaaaaactgaaacaacaacaacaacaaaacaaaataaaaaaacaacaaaagaatcttagtggttcagtggttccacacacaggaaagtagaaagggccttgatgggaaggttttcagagggaggagtatggatgagacaggatgatagtgaaaagaactcaaattaattaaatatttgaaactatctaagaataaaagctaaaatatttaaaattacagtcaggtagtggtggtgcagagggctaagttggtagacacagtgagatccaggccagccagggctacctagtgagaccttgttcaaataactaataaaatatacaaaataaaggagacaccacaataattttgaaatgtaaaagactaaatttaccttttatattgatgagttggataaaaaaatcaatttaccagagaacataaagtagtcccatcaaagacaaaagcaatatatgattaaactctaatttaaaagtttgttagagcctggcaacgtggcacatacctttaatcccagcaccagggagacagaggccatcctggtctaaaaagtgatctccaggacagccatggctattacacagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaaattagtgtccatgtgtaaatgtgtggagtatgcttgtcatgccacatacagaggtagagggcagtttatgggagtcagttcctattcttcctttatgggggacctggggactgaactcaggtcatcaggcttggcagaaagtgcattagctcacggagccttatcattggcgaaagctctctcaagtagaaaatcaatgtgtttgctcatagtgcaatcattatgtttcgagaggggaagggtacaatcgttggggcatgtgtggtcacatctgaatagcagtagctccctaggagaattaattccaagttctttggtggtgtatcaatgcccttaaaggggtcaacaactttttttccctctgacaaaactatcttcttatgtccttgtccc
cttgcggtcgaggactacagtcattttgcaggtttccttactgtatggcttttaaaacgtgcaaaggtgaccattaaccgtttcacgctgggagggcacgtgcggctcagatgcttcctctgactgagggccaggagggggctacacggaagaggccacacccgcacttgggaagactcgatttgggcttcagctggctgagacgccccagcaggctcctcggctacaccttcagccccgaatgccttccggcccataacccttcccttctaggcatttccggcgaggacccaccctcgcgccaaacattcggccccatcccccggtcctcacctgaatctctaactctgactccagagtttagagactataaccagatag
TE配列要素を含まない場合の発現との比較により、CHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズF)において分泌MCP-1の発現に対するTE配列要素TE-13〜TE-18の効果を研究した。プラスミド変種1つについて4プールを作製した。すべてのシリーズにおいて、ベースプラスミドはpTE4/MCP-1とした(図1B;選択マーカーNPT-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)。種々のプラスミド変種は、TE配列要素なし(=対照混合物)またはプロモーター/エンハンサーの上流に順配向のTE配列要素TE-13〜TE-18の1つを含んでいた(図12)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する影響を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いた。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜8.2kbの間で変化した。陰性対照として各トランスフェクションシリーズにおいて偽トランスフェクトされたプールもまた同時に試験した。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じ様に処理した。HT添加CHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行った。
5〜6継代培養にわたってMCP-1産物力価および比生産性を得た(継代周期2-2-3日)。図14(シリーズF)は相対的特異的MCP-1生産性を示す。領域のそれぞれは、平均MCP-1発現の増加をもたらす。配列要素13を用いて最大増加(15倍)が得られたが、これは配列要素08により得られた10倍増加をも超えている。
CHO-DG44細胞の2つの安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズGおよびH)において、TE配列要素を含まない場合の発現と比較して、分泌MCP-1の発現に対する発現プラスミドにおける種々の組み合わせおよび種々の位置のTE配列要素TE-06およびTE-08の効果を研究する。両方のシリーズにおいて、プラスミド変種1つについて6プールを作製する。ベースプラスミドはpTE4/MCP-1である(図1B;選択マーカーNPT=ネオマイシン=ホスホトランスフェラーゼF240I)。異なるプラスミド変種は、TE配列要素なし(=対照混合物)またはエンハンサー/プロモーター領域のまえのTE-08もしくはTE-Aまたはエンハンサー/プロモーター領域の前のTE-06およびTE-08の組み合わせまたはエンハンサー/プロモーター領域の前の逆配向のTE-08もしくはTE-09(シリーズG)のいずれかを含む。シリーズHにおいて、配列要素TE-06およびTE-21またはTE-08をエンハンサー/プロモーター領域(E/P)の前およびさらに終結シグナル(T)の後に用いる(図13)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の効果を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜10.2kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールもまた試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。HT添加CHO-S-SFMII+G418(300μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
6継代培養にわたってMCP-1産物力価および比生産性を得る(継代周期2-2-3日)。図15はシリーズGの相対的特異的MCP-1生産性を示す。これらの配列要素のすべては平均MCP-1発現の増加をもたらす。配列要素TE-Aにより最大の増加(4倍)が得られる。発現カセットの前後に配列要素TE-06およびTE-21またはTE-08を用いることによっても増加が引き起こされる。
CHO-DG44細胞の安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズJ)において、TE配列要素を含まない場合の発現との比較により、2つのIgG-4抗体の発現に対するTE配列要素TE-08の効果を試験する。ベースプラスミドpBIN-LC2またはpBIN-LC3およびpBID-HC2またはpBID-HC3で24プールを作製し、pBIN-LC2/TE08またはpBIN-LC3/TE08およびpBID-HC2/TE08またはpBID-HC3/TE08で24プールを作製する(図16;選択マーカーNPT=ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240Iおよびdhfr=ジヒドロ葉酸還元酵素)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の影響を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.1kb〜7.5kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールを試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。HTを含まないCHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
4継代培養(継代周期2-2-3日)にわたってIgG-4産物力価および比生産性を得る。配列要素08は、IgG4抗体の発現における平均発現率の増加をもたらす。さらに、配列要素TE-08により、高生産性の細胞プールを見いだす可能性を高めることができる。
HEK293 freestyle細胞の安定なトランスフェクションシリーズ(シリーズK)において、TE配列要素を含まない場合のMCP-1発現と比較して、分泌MCP-1の発現に対する種々のTE配列要素の効果を研究する。ベースプラスミドはpTE-4/MCP-1である(図1B;選択マーカーNPT=ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)。エンハンサー/プロモーターの上流に、順配向で領域TE-08、TE-13およびTE-Aを用い、各プラスミド変種について7〜10プールを作製する。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の効果を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.7kb〜10.2kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールを試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。293SFM II培地+4mMグルタミン+G418(100μg/ml)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
5〜6継代培養(継代周期2-2-3日)にわたってMCP-1産物力価および比生産性を得る。
CHO-DG44 細胞の安定なトランスフェクション シリーズ (シリーズ L)において、TE配列要素を含まない場合のSEAP発現と比較して、酵素(SEAP)の発現に対するTE配列要素 TE-08の効果を研究する。各プラスミド変種について6プールを作製する。ベースプラスミドはpTE-4/SEAPである。これはSEAPのためのMCP-1-IRES-DsRed2発現カセットと交換することにより作製される。配列要素TE-08はアダプターAにクローニングされる(図1B;選択マーカーNPT=ネオマイシンホスホトランスフェラーゼF240I)。トランスフェクション混合物におけるDNAの異なる量に起因するトランスフェクション効率に対する任意の効果を最小化するために、いずれの場合にも全部でプラスミドDNA1.2μgを用いる。導入されたTE配列要素のサイズに応じてプラスミドサイズは6.6kb〜7.6kbの間で変化する。陰性対照として、各トランスフェクションシリーズと同時に偽トランスフェクトされたプールを試験する。すなわちトランスフェクション混合物にDNAを加えないこと以外は同じに処理する。HT添加CHO-S-SFMII+G418(400μg/mL)を用い、トランスフェクションの2日後に安定的にトランスフェクトされた細胞の選択を行う。
市販のSEAPアッセイ(Clontech)を用い、6継代培養(継代周期2-2-3日)にわたって得られた相対的SEAP発現を測定する。
Claims (45)
- TE-13(配列番号15)もしくはTE-13(配列番号15)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-13(配列番号15)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸。
- TE-08(配列番号10)もしくはTE-08(配列番号10)のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはTE-08(配列番号10)の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸。
- 配列番号1もしくは配列番号1のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列または配列番号1の誘導体もしくはそれらのフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列を含み、染色体に組み込まれると発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加をもたらす核酸であって、前記フラグメントまたは誘導体が1bp〜1578bpの核酸領域からなる少なくとも1つの配列領域を有する、前記核酸。
- TE配列要素を含まない対照と比較した発現系における対象遺伝子の転写または発現の増加が、例えばELISAにより産物力価を測定することにより、決定されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸。
- (a)核酸配列TE-13(配列番号15)もしくはTE-08(配列番号10)の領域、または、
(b)それらの相補的核酸配列、または、
(c)(a)もしくは(b)と少なくとも約70%の配列同一性、好ましくは少なくとも約80%もしくは85%の配列同一性、特に好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する核酸配列、
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項1〜4のいずれか1項記載の核酸。 - 核酸が少なくとも511bp(=TE-13の長さ、配列番号15)または少なくとも1015bp(=TE-08の長さ、配列番号10)の長さを有することを特徴とする、請求項5記載の核酸。
- 核酸がTE-00(配列番号2)、TE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-04(配列番号6)、TE-06(配列番号8)、TE-07(配列番号9)、TE-08(配列番号10)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)、TE-12(配列番号14)、TE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)およびTE-21(配列番号21)の中から選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載の核酸。
- TE-00(配列番号2)、TE-06(配列番号8)またはTE-21(配列番号21)、TE-10(配列番号12)、TE-11(配列番号13)またはTE-12(配列番号14)であり、好ましくはTE-06(配列番号8)であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項記載の核酸。
- TE-01(配列番号3)、TE-02(配列番号4)、TE-03(配列番号5)、TE-07(配列番号9)またはTE-08(配列番号10)であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項記載の核酸。
- TE-08(配列番号10)である、請求項9記載の核酸。
- TE-01(配列番号3)のフラグメントまたは誘導体であり、好ましくはTE-13(配列番号15)、TE-14(配列番号16)、TE-15(配列番号17)、TE-16(配列番号18)、TE-17(配列番号19)、TE-18(配列番号20)であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載の核酸。
- TE-13(配列番号15)である、請求項11記載の核酸。
- 核酸またはフラグメントまたは誘導体が単離された核酸である、請求項1〜12のいずれか1項記載の核酸。
- TE-13(配列番号15)またはTE-08(配列番号10)またはTE-07(配列番号9)またはTE-06(配列番号8)またはTE-21(配列番号21)またはこれらの配列のフラグメントもしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列またはこれらの配列の誘導体もしくはこれらの配列のフラグメントの誘導体もしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列、好ましくはTE-13(配列番号15)またはTE-08(配列番号10)またはこれらの配列のフラグメントまたはこれらの配列の誘導体もしくはこれらの配列のフラグメントの誘導体を含む核酸、が異種配列に結合していることを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項記載の核酸。
- 請求項1〜14の1つに記載の核酸を含むことを特徴とする真核発現ベクター。
- プロモーターおよび/または対象異種遺伝子および/または選択マーカーおよび/または場合によりエンハンサーを含むことを特徴とする請求項15記載の真核発現ベクター。
- 請求項1〜14記載の1以上の同一または異なる核酸の組み合わせを含む請求項15〜16のいずれか1項記載の真核発現ベクターであって、前記1以上の核酸が対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するおよび/または前記1以上の核酸が対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置することを特徴とする、前記真核発現ベクター。
- 組み合わされた核酸がTE-06(配列番号8)および好ましくはTE-08(配列番号10)であることを特徴とする、請求項17記載の真核発現ベクター。
- 1以上のTE-08核酸 (配列番号10)と1以上のTE-06核酸 (配列番号8)またはTE-21核酸 (配列番号21)の組み合わせが、対象遺伝子の前(すなわち5')および/または対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置するが、対象遺伝子の前(すなわち5')に位置するTE-08核酸(配列番号10)とそれに続くTE-06-核酸(配列番号8)またはTE-21核酸(配列番号21)の組み合わせが好ましいことを特徴とする請求項17または18記載の真核発現ベクター。
- 1以上のTE-08核酸(配列番号10)が対象遺伝子の前(すなわち5')に位置し、1以上が対象遺伝子の後(すなわち3’)に位置し、好ましくは1つのTE-08核酸が前に位置し、1つのTE-08核酸が後に位置することを特徴とする、請求項17記載の真核発現ベクター。
- 2つのプラスミドに配置された請求項1〜14のいずれか1項記載の1以上の核酸を含むことを特徴とする、請求項15〜20のいずれか1項記載の真核発現ベクター。
- 選択マーカーがDHFRまたはNeoであり、例えばNeoF240Iであることを特徴とする、請求項15〜21のいずれか1項記載の真核発現ベクター。
- 請求項1〜14のいずれか1項記載の核酸を発現ベクターへ組み込むことを特徴とする真核発現ベクターの製造方法。
- 請求項15〜23のいずれか1項記載の真核発現ベクターを含むことを特徴とする真核宿主細胞。
- 真核宿主細胞が高産生クローンであること、すなわちTE配列要素を含まない類似の真核宿主細胞よりも高い比生産性を有することを特徴とする請求項24記載の真核宿主細胞であって、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍もしくは10倍までに増加した発現レベルまたは2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上もしくは10倍以上に増加した発現レベルを有し、好ましくは5倍までにまたは3倍以上の発現レベルを有する前記宿主細胞。
- 発現ベクターがゲノムに安定に組み込まれていることを特徴とする、請求項24または25記載の真核宿主細胞。
- 宿主細胞が哺乳動物細胞、例えばCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHKTK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKXB1、CHO-DG44、CHOPro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞であり、好ましくはCHO細胞であり、特に好ましくはCHO-DG44細胞である、請求項24〜26のいずれか1項記載の真核宿主細胞。
- 抗アポトーシス遺伝子、例えばBCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HLまたはCED-9をさらに含み、好ましくはBcl-xLまたはBCL-2をさらに含み、最も好ましくはBCL-xLをさらに含むことを特徴とする、請求項24〜27の1つに記載の真核宿主細胞。
- (a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに請求項1〜14のいずれか1項記載の少なくとも1つの核酸を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、
を特徴とする、高生産性の安定的にトランスフェクトされた真核宿主細胞株の作製方法。 - さらなる増幅工程を含む、請求項29記載の方法。
- さらなるクローニング工程を含む、請求項29または30記載の方法。
- (a)少なくとも対象タンパク質/産物、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(好ましくは改変された)および増幅選択マーカーDHFRをコードする遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、転写または発現を促進するために少なくとも対象遺伝子が請求項1〜14のいずれか1項記載の少なくとも1つの核酸に機能的に結合されている、前記工程、
(b)種々の遺伝子発現を可能にする条件下で細胞を培養する工程、
(c)ヒポキサンチン/チミジンを含まない培地で、選択剤、例えばG418の存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を選択する工程、および、
(d)少なくとも増幅選択マーカー遺伝子の増幅を可能にする選択剤、例えばメトトレキセートの存在下で細胞を培養することによりこれらの同時に組み込まれた遺伝子を増幅する工程、
を特徴とする、組換え哺乳動物細胞を作製し選択する方法。 - 少なくとも200μg/mLのG418、好ましくは400μg/mL以上のG418を添加し、血清無添加で、増加するMTXの濃度を加えたヒポキサンチン/チミジンを含まない培地でトランスフェクトされた細胞が培養されることを特徴とする、請求項32記載の方法。
- 第1増幅工程におけるMTXの濃度が少なくとも100nMまたは少なくとも250nMであり、1μMまたはそれ以上まで段階的に増加されることを特徴とする、請求項32または33記載の方法。
- 対象タンパク質のグリコシル化を改善する方法と組み合わされる、請求項29〜34のいずれか1項記載の方法。
- 宿主細胞が哺乳動物細胞、例えばCHO、NS0、Sp2/0-Ag14、BHK21、BHKTK-、HaK、2254-62.2(BHK-21亜株)、CHO-K1、CHO-DUKX(=CHOduk-、CHO/dhfr-)、CHO-DUKXB1、CHO-DG44、CHOPro-5、V79、B14AF28-G3、CHL細胞であり、好ましくはCHO細胞であり、特に好ましくはCHO-DG44細胞である、請求項29〜35のいずれか1項記載の方法。
- 発現ベクターがDHFRまたはNeoなどの選択マーカーを含み、例えばNeoF240Iを含む、請求項29〜36のいずれか1項記載の方法。
- 高産生クローンの割合が2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍もしくは10倍までに増加し、または2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上もしくは10倍以上に増加し、好ましくは5倍までにまたは3倍以上に増加する、請求項29〜37のいずれか1項記載の方法。
- (a)対象遺伝子を含む真核発現ベクターに請求項1〜14のいずれか1項記載の少なくとも1つの核酸を組み込む工程、
(b)この発現ベクターで真核宿主細胞をトランスフェクトする工程、
(c)高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を選択する工程、および、
(d)対象遺伝子の発現を可能にする条件下で得られた高生産性のトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程、
を特徴とする生物医薬品の製造方法。 - (e)対象タンパク質を採取し精製するさらなる工程を含む、請求項39記載の方法。
- 真核宿主細胞において発現系における対象遺伝子の転写または発現を増加させるための、または生物医薬品を製造するための、真核発現ベクターにおける請求項1〜14のいずれか1項記載の核酸の使用。
- トランスジェニック動物または植物を製造するための、請求項1〜14のいずれか1項記載の核酸の使用。
- 遺伝子治療における請求項1〜14のいずれか1項記載の核酸の使用。
- 医薬としての、または医薬組成物における請求項1〜14のいずれか1項記載の核酸領域の使用。
- 請求項1〜14のいずれか1項記載の核酸、発現ベクター、宿主細胞および場合によりトランスフェクション試薬からなるキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06117862.0 | 2006-07-26 | ||
EP06117862 | 2006-07-26 | ||
PCT/EP2007/055954 WO2008012142A1 (de) | 2006-07-26 | 2007-06-15 | Regulatorische nukleinsäureelemente |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009544293A true JP2009544293A (ja) | 2009-12-17 |
JP5270544B2 JP5270544B2 (ja) | 2013-08-21 |
Family
ID=37441548
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009521178A Active JP5270544B2 (ja) | 2006-07-26 | 2007-06-15 | 調節核酸配列要素 |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20080124760A1 (ja) |
EP (1) | EP2049671B1 (ja) |
JP (1) | JP5270544B2 (ja) |
KR (1) | KR101485853B1 (ja) |
CN (1) | CN101517085B (ja) |
AR (1) | AR061472A1 (ja) |
AU (1) | AU2007278368B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0714594A2 (ja) |
CA (1) | CA2658595C (ja) |
CY (1) | CY1113711T1 (ja) |
DK (1) | DK2049671T3 (ja) |
EA (1) | EA016880B1 (ja) |
ES (1) | ES2401654T3 (ja) |
HK (1) | HK1134107A1 (ja) |
IL (1) | IL196676A0 (ja) |
MX (1) | MX2009000781A (ja) |
NO (1) | NO20090057L (ja) |
NZ (1) | NZ575115A (ja) |
PL (1) | PL2049671T3 (ja) |
PT (1) | PT2049671E (ja) |
SI (1) | SI2049671T1 (ja) |
TW (1) | TW200815591A (ja) |
WO (1) | WO2008012142A1 (ja) |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120258496A1 (en) | 2010-09-27 | 2012-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Production of low fucose antibodies in h4-ii-e rat cells |
WO2012139195A1 (en) | 2011-04-13 | 2012-10-18 | National Research Council Of Canada | EXPRESSION SYSTEM WITH SAR ELEMENT FROM IFNα2 |
CN104334184B (zh) | 2011-10-28 | 2017-12-29 | 普罗典娜生物科学有限公司 | 识别α‑突触核蛋白的人源化抗体 |
CN113881702A (zh) * | 2011-12-22 | 2022-01-04 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途 |
CA2863953A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Neotope Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
EP3689904A1 (en) | 2013-03-13 | 2020-08-05 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
US10513555B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
WO2015004632A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize iapp |
WO2015004633A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp) |
WO2015075635A2 (en) | 2013-11-19 | 2015-05-28 | Prothena Biosciences Limited | Monitoring immunotherapy of lewy body disease from constipation symptoms |
WO2015136471A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg1-3 |
TW201623331A (zh) | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子(mcam)抗體類及使用彼等之相關方法 |
KR20160127825A (ko) | 2014-03-12 | 2016-11-04 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | 항-mcam 항체 및 관련된 사용 방법 |
WO2015136472A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg4-5 |
WO2015155694A1 (en) | 2014-04-08 | 2015-10-15 | Prothena Biosciences Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
TWI718122B (zh) | 2015-01-28 | 2021-02-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
TWI769570B (zh) | 2015-01-28 | 2022-07-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
TWI781507B (zh) | 2015-01-28 | 2022-10-21 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
HUE054624T2 (hu) * | 2015-02-02 | 2021-09-28 | Meiragtx Uk Ii Ltd | A génexpresszió szabályozása az alternatív splicing aptamer által közvetített modulálásával |
WO2017046774A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
WO2017046776A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
WO2017149513A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
WO2017153953A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
WO2017153955A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
JP7170316B2 (ja) | 2016-05-02 | 2022-11-14 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | タウ免疫療法 |
AU2017259038B2 (en) | 2016-05-02 | 2024-05-23 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing Tau |
EP3452509A1 (en) | 2016-05-02 | 2019-03-13 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
WO2017208210A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
EP3478716A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
WO2018007922A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
JP7016470B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-02-07 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
CN110881274A (zh) | 2017-05-02 | 2020-03-13 | 普罗塞纳生物科学有限公司 | 识别tau的抗体 |
CA3076313A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Prothena Biosciences Limited | Dosing regimes for treatment of synucleinopathies |
WO2020034097A1 (en) * | 2018-08-14 | 2020-02-20 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | Transcriptional regulatory element and its use in enhancing the expression of exogenous protein |
CR20210272A (es) | 2018-11-26 | 2021-07-14 | Forty Seven Inc | Anticuerpos humanizados contra c-kit |
SG11202108414UA (en) | 2019-03-03 | 2021-08-30 | Prothena Biosciences Ltd | Antibodies recognizing tau |
JP7412860B2 (ja) | 2020-10-16 | 2024-01-15 | 株式会社奥村組 | 泥水式シールド掘進機および泥水式シールド掘進機における圧縮空気の圧力調整方法 |
US20240191215A1 (en) * | 2021-04-21 | 2024-06-13 | Janssen Biotech, Inc. | Materials and methods for improved phosphotransferases |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11513572A (ja) * | 1995-10-24 | 1999-11-24 | ドクトル カルル トーマエ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ハムスターの強力な同種プロモーター |
JP2006507829A (ja) * | 2002-11-29 | 2006-03-09 | ベーリンガー インゲルハイム ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト | 発現ベクター、異種遺伝子生成物の製造方法およびこのような生成物を高濃度で製造する組換え細胞の選別方法 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
EP0393438B1 (de) | 1989-04-21 | 2005-02-16 | Amgen Inc. | TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs |
JP3150340B2 (ja) | 1990-11-13 | 2001-03-26 | イムネクス コーポレイション | 二機能選択可能融合遺伝子 |
US5786166A (en) | 1991-10-25 | 1998-07-28 | University Of Tennessee Research Corporation | Methods for determining effects of a compound on the activity of bacterial periplasmic oxidoreductase enzymes |
DE4228458A1 (de) | 1992-08-27 | 1994-06-01 | Beiersdorf Ag | Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung |
AU6953394A (en) | 1993-05-21 | 1994-12-20 | Targeted Genetics Corporation | Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene |
ATE275628T1 (de) * | 1996-01-11 | 2004-09-15 | Immunex Corp | Expressionssteigernde sequenzelemente (ease) für eukaryontische expressionssysteme |
WO2000034326A1 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Fluorescent proteins from non-bioluminescent species of class anthozoa, genes encoding such proteins and uses thereof |
WO2000034325A1 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Fluorescent proteins from non-bioluminescent species of class anthozoa, genes encoding such proteins and uses thereof |
ATE502116T1 (de) | 1998-12-11 | 2011-04-15 | Clontech Lab Inc | Fluoreszierende proteine aus nicht- biolumineszenten arten der klasse anthozoa, gene die diese proteine kodieren und deren verwendungen |
AUPP967999A0 (en) * | 1999-04-09 | 1999-05-06 | North Western Health Care Network | Viral variants |
WO2001004306A1 (en) | 1999-07-12 | 2001-01-18 | Genentech, Inc. | Expression vectors and methods |
AU783767B2 (en) | 1999-10-14 | 2005-12-01 | Takara Bio Usa, Inc. | Anthozoa derived chromophores/fluorophores and methods for using the same |
WO2002081677A2 (en) | 2001-04-05 | 2002-10-17 | Ml Laboratories Plc | Improved gene expression |
DE60236334D1 (de) | 2001-07-04 | 2010-06-17 | Chromagenics Bv | DNS-Sequenzen mit anti-repressor Aktivität |
US7384744B2 (en) * | 2002-11-29 | 2008-06-10 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products |
MXPA05005481A (es) | 2002-11-29 | 2005-07-25 | Boehringer Ingelheim Pharma | Nuevos genes de la fosfotransferasa de neomicina y procedimiento para la seleccion de celulas recombinantes de produccion elevada. |
US7344886B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-03-18 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product |
-
2007
- 2007-06-13 US US11/762,240 patent/US20080124760A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-14 TW TW096121483A patent/TW200815591A/zh unknown
- 2007-06-15 SI SI200731174T patent/SI2049671T1/sl unknown
- 2007-06-15 KR KR1020097004079A patent/KR101485853B1/ko active IP Right Grant
- 2007-06-15 CA CA2658595A patent/CA2658595C/en active Active
- 2007-06-15 EP EP07730192A patent/EP2049671B1/de active Active
- 2007-06-15 NZ NZ575115A patent/NZ575115A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-06-15 JP JP2009521178A patent/JP5270544B2/ja active Active
- 2007-06-15 WO PCT/EP2007/055954 patent/WO2008012142A1/de active Application Filing
- 2007-06-15 PT PT77301927T patent/PT2049671E/pt unknown
- 2007-06-15 DK DK07730192.7T patent/DK2049671T3/da active
- 2007-06-15 EA EA200900212A patent/EA016880B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-06-15 CN CN2007800359296A patent/CN101517085B/zh active Active
- 2007-06-15 PL PL07730192T patent/PL2049671T3/pl unknown
- 2007-06-15 BR BRPI0714594-2A patent/BRPI0714594A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-06-15 ES ES07730192T patent/ES2401654T3/es active Active
- 2007-06-15 AR ARP070102632A patent/AR061472A1/es active Pending
- 2007-06-15 AU AU2007278368A patent/AU2007278368B2/en active Active
- 2007-06-15 MX MX2009000781A patent/MX2009000781A/es active IP Right Grant
-
2009
- 2009-01-06 NO NO20090057A patent/NO20090057L/no not_active Application Discontinuation
- 2009-01-22 IL IL196676A patent/IL196676A0/en unknown
-
2010
- 2010-01-28 HK HK10100907.0A patent/HK1134107A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-07-23 US US12/842,468 patent/US9045776B2/en active Active
-
2013
- 2013-02-21 CY CY20131100160T patent/CY1113711T1/el unknown
-
2015
- 2015-04-29 US US14/699,182 patent/US9708626B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11513572A (ja) * | 1995-10-24 | 1999-11-24 | ドクトル カルル トーマエ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | ハムスターの強力な同種プロモーター |
JP2006507829A (ja) * | 2002-11-29 | 2006-03-09 | ベーリンガー インゲルハイム ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト | 発現ベクター、異種遺伝子生成物の製造方法およびこのような生成物を高濃度で製造する組換え細胞の選別方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6011046885; Mol. Cell. Biol. Res. Commun. Vol. 4, 2000, p. 206-211 * |
JPN6011046887; Gene Vol. 236, 1999, p. 63-77 * |
JPN6011046890; J. Biol. Chem. Vol. 266, No. 33, 1991, p. 22678-22688 * |
JPN6011046892; J. Immunol. Vol. 169, 2002, p. 873-881 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101485853B1 (ko) | 2015-01-23 |
AR061472A1 (es) | 2008-08-27 |
CA2658595C (en) | 2016-05-31 |
IL196676A0 (en) | 2011-08-01 |
AU2007278368A1 (en) | 2008-01-31 |
EP2049671A1 (de) | 2009-04-22 |
NO20090057L (no) | 2009-02-16 |
PL2049671T3 (pl) | 2013-05-31 |
US20150337333A1 (en) | 2015-11-26 |
US9045776B2 (en) | 2015-06-02 |
AU2007278368B2 (en) | 2013-12-19 |
US20100311121A1 (en) | 2010-12-09 |
ES2401654T3 (es) | 2013-04-23 |
CN101517085A (zh) | 2009-08-26 |
CY1113711T1 (el) | 2016-06-22 |
DK2049671T3 (da) | 2013-04-08 |
SI2049671T1 (sl) | 2013-04-30 |
JP5270544B2 (ja) | 2013-08-21 |
US9708626B2 (en) | 2017-07-18 |
CA2658595A1 (en) | 2008-01-31 |
BRPI0714594A2 (pt) | 2013-02-19 |
HK1134107A1 (en) | 2010-04-16 |
EP2049671B1 (de) | 2012-12-19 |
CN101517085B (zh) | 2013-08-07 |
EA016880B1 (ru) | 2012-08-30 |
NZ575115A (en) | 2011-10-28 |
PT2049671E (pt) | 2013-01-24 |
TW200815591A (en) | 2008-04-01 |
KR20090046887A (ko) | 2009-05-11 |
MX2009000781A (es) | 2009-01-29 |
US20080124760A1 (en) | 2008-05-29 |
WO2008012142A1 (de) | 2008-01-31 |
EA200900212A1 (ru) | 2009-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5270544B2 (ja) | 調節核酸配列要素 | |
ES2421152T3 (es) | Nuevos elementos reguladores | |
JP4489424B2 (ja) | 染色体に基くプラットホーム | |
JP7087061B2 (ja) | Cho細胞内の組込み部位 | |
JP5835636B2 (ja) | 抗体高生産性細胞の樹立のための発現ベクター及び抗体高生産性細胞 | |
US7968700B2 (en) | Expression augmenting DNA fragments, use thereof, and methods for finding thereof | |
CN104278032A (zh) | 一种新型双启动子结构单元 | |
JP2012526535A (ja) | NoCRの発現が低下した改良細胞系及びその使用 | |
JP2011504741A (ja) | 新規組換え配列 | |
JP2006507829A (ja) | 発現ベクター、異種遺伝子生成物の製造方法およびこのような生成物を高濃度で製造する組換え細胞の選別方法 | |
JPWO2010023787A1 (ja) | 遺伝子発現安定化エレメント |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110905 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111202 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111209 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120203 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120302 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121112 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130308 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130328 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20130402 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130424 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130509 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5270544 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |