ES2361971T3

ES2361971T3 - Proteínas fluorescentes de especies sin bioluminiscencia de la clase de los antozoos, genes codificantes de tales proteínas y sus usos.

Info

Publication number: ES2361971T3
Application number: ES99966135T
Authority: ES
Inventors: Sergey Anatolievich Lukyanoy; Arcady Fedorovich Fradkov; Yulii Aleksandrovich Labas; Mikhail Vladimirovich Matz
Original assignee: Clontech Laboratories Inc
Current assignee: Takara Bio USA Inc
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2011-06-24
Anticipated expiration: 2019-12-10
Also published as: EP1135532A1; WO2000034320A1; JP2002531146A; WO2000034526A1; JP2016165299A; ATE502116T1; EP1135532A4; WO2000034319A1; DE69943286D1; EP1135532B1; JP4618891B2; JP5963391B2; JP2010268798A

Abstract

Un ácido nucleico en un entorno distinto de su entorno natural cuya secuencia codifica una proteína fluorescente de un organismo antozoo sin bioluminiscencia seleccionado de los géneros Anemonia, Clavularia y Discosoma, en que: (a) dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores, el primero de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y el segundo de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:37; o (b) dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40; o (c) dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42; o (d) dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. "roja" y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44; o (e) dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

[0001] Esta invención se refiere al campo de la biología molecular. Más específicamente, esta invención se refiere a nuevas proteínas fluorescentes de especies sin bioluminiscencia de la clase de los antozoos, a procedimientos para la identificación de las secuencias de ADN que codifican las proteínas, a los genes que codifican dichas proteínas y a sus usos.

Descripción de la técnica relacionada

[0002] El marcaje fluorescente es una herramienta particularmente útil para marcar una proteína, célula u organismo de interés. Tradicionalmente, una proteína de interés se purifica y después se conjuga covalentemente con un derivado fluoróforo. Para los estudios in vivo, el complejo proteína-colorante se introduce después en las células de interés mediante micropipeteado o por un procedimiento de permeabilización reversible. Sin embargo, las etapas de unión y de introducción del colorante hacen que el procedimiento sea laborioso y difícil de controlar. Un procedimiento alternativo para el marcaje de proteínas de interés es la concatenación o fusión del gen que expresa la proteína de interés con un gen que expresa un marcador y la expresión posterior del producto de fusión. Los marcadores típicos para este procedimiento de marcaje de proteínas incluyen la -galactosidasa, la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana. Sin embargo, estos marcadores requieren sustratos exógenos o cofactores y, por lo tanto, son de uso limitado para estudios in vivo.

[0003] Un marcador que no requiere un cofactor o sustrato exógeno es la proteína verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria, una proteína con un máximo de excitación a 395 nm, un segundo pico de excitación a 475 nm y un máximo de emisión a 510 nm. La GFP es una proteína de 238 aminoácidos, en que los aminoácidos 65-67 están implicados en la formación del cromóforo.

[0004] Los usos de la GFP para el estudio de la expresión génica y la localización de proteínas se discuten en detalle por Chalfie y col. en Science 263 (1994), 802-805 y Heim y col. en Proc. Natl. Acad. Sci. 91 (1994), 1250112504. Adicionalmente, Rizzuto y col. discuten en Curr. Biology 5 (1995), 635-642, el uso de la GFP natural como herramienta de visualización de orgánulos subcelulares en células, mientras que Kaether y Gerdes describen en Febs Letters 369 (1995), 267-271, la visualización del transporte de proteínas a lo largo de la ruta de secreción mediante la GFP natural. La expresión de la GFP en células vegetales se discute por Hu y Cheng en Febs Letters 369 (1995), 331-334, mientras que la expresión de la GFP en embriones de Drosophila se describe por Davis y col. en Dev. Biology 170 (1995), 726-729.

[0005] Las estructuras cristalográficas de la GFP natural y de la GFP mutante S65T revelan que la estructura terciaria de la GFP se asemeja a un barril (Ormö y col., Science 273 (1996), 1392-1395; Yang y col., Nature Biotechnol. 14 (1996), 1246-1251). El barril consta de láminas  en una estructura compacta, en cuyo centro una hélice α que contiene el cromóforo queda protegida por el barril. La estructura compacta confiere gran estabilidad a la GFP en condiciones diversas y/o duras, como el tratamiento con proteasa, lo que hace que la GFP sea un indicador de gran utilidad, en general. Sin embargo, por su estabilidad, la GFP no es óptima para la determinación de sucesos a corto plazo o repetitivos.

[0006] Se está llevando a cabo gran cantidad de investigación para mejorar las propiedades de la GFP y para producir reactivos de GFP útiles y optimizados para diversos fines de investigación. Se han desarrollado nuevas versiones de la GFP, por ejemplo un ADN de GFP “humanizado” que produce una proteína cuya síntesis se incrementa en células de mamíferos (Haas y col., Current Biology 8 (1996), 315-324; Yang y col., Nucleic Acids Research 24 (1996), 4592-4593). Una proteína humanizada tal es la “proteína verde fluorescente mejorada” (EGFP). Otras mutaciones de la GFP han resultado en versiones que emiten luz azul, cian y verde amarillenta. Sin embargo, a pesar de la gran utilidad de la GFP, otras proteínas fluorescentes con propiedades similares o diferentes a las de la GFP serían de utilidad en la técnica. Nuevas proteínas fluorescentes resultan en la posibilidad de nuevos colores

o la producción de fluorescencia dependiente del pH. Otros beneficios de proteínas fluorescentes nuevas incluyen las posibilidades de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FERT) basadas en nuevos espectros y una mejor adecuación para mayor excitación.

[0007] En su tesis de diploma “Zur Biologie der Ökotypen von Anemonia sulcata (Pennant)”, 1996, Jörg Wiedenmann describe sus intentos de clasificar Anemonia sulcata según su entorno. Al hacer esto, el autor examina el hábitat, el color de los tentáculos, el genotipo y la agresividad del comportamiento. Al examinar el color de los tentáculos, el autor determina que este se debe en parte a zooxantelas y en parte a los colores propios de la anémona, que el autor describe como proteínas fluorescentes fijadas genéticamente.

[0008] La técnica anterior es deficiente en proteínas fluorescentes nuevas de las que se conozcan las secuencias codificantes de ADN. La presente invención satisface esta necesidad existente desde hace mucho tiempo en la técnica.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0009] La presente invención se dirige a un ácido nucleico en un entorno distinto de su entorno natural, cuya secuencia codifica una proteína fluorescente, en que dicha proteína fluorescente es una proteína de un organismo antozoo sin bioluminiscencia seleccionado de los géneros Anemonia, Clavularia, Zoanthus y Discosoma y en que:

(a): dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores, el primero de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y el segundo de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:37; o

(b): dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40; o

(c): dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42; o

(d): dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. “roja” y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44; o

(e): dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46.

[0010] Se describe un procedimiento para la identificación de una secuencia de ADN codificante de una proteína fluorescente que comprende la etapa de cribado en busca de la existencia de una secuencia de ácido nucleico en una muestra, en que la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido con una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:3, 5, 8, 11, 12 y 14. La existencia de la secuencia de ácido nucleico identifica la secuencia de ADN codificante de la proteína fluorescente.

[0011] También se describe un procedimiento para la identificación de una secuencia de ADN codificante de una proteína fluorescente que comprende la etapa de cribado en busca de la existencia de una secuencia de ácido nucleico en una muestra, en que la secuencia de ácido nucleico hibrida con un cebador seleccionado del grupo que consta de SEQ ID NO:4, 6, 7, 9, 10, 13, 15 y 16. La existencia de la secuencia de ácido nucleico identifica la secuencia de ADN codificante de la proteína fluorescente.

[0012] También se describe un procedimiento para el análisis de una proteína fluorescente en una célula que comprende las etapas de la expresión en la célula de una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína fluorescente con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:55-63; y la medida de una señal fluorescente procedente de la proteína. Este procedimiento comprende además una etapa de clasificación de la célula según la señal. Preferentemente, la célula se clasifica por clasificación de células activadas por fluorescencia. Con mayor preferencia, la secuencia de ácido nucleico comprende un gen de interés codificante de una proteína de interés fusionada con la proteína fluorescente, en que la proteína de interés es distinta de la proteína fluorescente. La señal fluorescente detectada indica la presencia en la célula del gen de interés y además de la proteína de interés. Al identificar una localización intracelular de la proteína fluorescente también se identifica una localización intracelular de la proteína de interés.

[0013] Otros aspectos, características y ventajas adicionales de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones de la invención preferidas actualmente que se indican con el fin de su desvelado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0014]

La figura 1 muestra la estrategia de RACE 3’ modificada usada para aislar los fragmentos diana. Las secuencias de los oligonucleótidos usados se muestran en la tabla 2. Dp1 y Dp2 son los cebadores degenerados usados en la primera y en la segunda reacción de PCR, respectivamente (véanse las secuencias de los cebadores degenerados en las tablas 3 y 4).

La figura 2A muestra un alineamiento múltiple de proteínas fluorescentes nuevas. La numeración se basa en la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria. Se comparan entre sí dos proteínas de Zoanthus y cuatro de Discosoma: los restos idénticos a los correspondientes en la primera proteína de la serie se representan por guiones. Los huecos introducidos se representan por puntos. En la secuencia de la GFP de A. victoria se subrayan los tramos que forman láminas ; los restos cuyas cadenas laterales forman el interior del barril  están sombreados (según Yang y col., Nature Biotechnol. 14, 1246-1251 (1996). La figura 2B muestra la parte N-terminal de cFP484, que no tiene homología con las otras proteínas. El supuesto péptido señal está subrayado.

La figura 3 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Anemonia majano amFP486.

La figura 4 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Clavularia cFP484.

La figura 5 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Zoanthus zFP506.

La figura 6 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Zoanthus zFP538.

La figura 7 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Discosoma striata dsFP483.

La figura 8 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Discosoma drFP583.

La figura 9 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Anemonia sulcata asFP600. Esta proteína no es realización de la presente invención.

La figura 10 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Discosoma dgFP512. Esta proteína no es realización de la presente invención.

La figura 11 muestra el espectro de excitación y emisión de la proteína fluorescente nueva de Discosoma dmFP592. Esta proteína no es realización de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0015] Según se usa en este documento, el término “GFP” se refiere a la proteína fluorescente verde básica de Aequorea victoria, incluyendo versiones anteriores de la GFP de la técnica, manipuladas para producir mayor fluorescencia o fluorescencia de colores diferentes. La secuencia de la GFP de Aequorea victoria (SEQ ID NO:54) ha sido desvelada en Prasher y col., Gene 111 (1992), 229-33.

[0016] Según se usa en este documento, el término “EGFP” se refiere a una variante mutante de la GFP que tiene dos sustituciones de aminoácidos: F64L y S65T (Heim y col., Nature 373 (1995), 663-664). El término “humanizada” se refiere a cambios en la secuencia del ácido nucleico de la GFP para optimizar los codones para la expresión de la proteína en células humanas (Yang y col., Nucleic Acids Research 24 (1996), 4592-4593).

[0017] De acuerdo con la presente invención pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch y Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); “DNA cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1985); “Transcription and Translation” (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney ed. 1986); “Immobilized Cells and Enzymes” (IRL Press 1986); B. Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984).

[0018] Un vector es un replicón, como un plásmido, fago o cósmido al que puede unirse otro segmento de ADN para conseguir la replicación del segmento unido.

[0019] Una molécula de ADN se refiere a la forma polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina), bien en forma monocatenaria o como hélice bicatenaria. Este término se refiere solamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula y no la limita a ninguna forma terciaria concreta. Por lo tanto, este término incluye el ADN bicatenario que se encuentra, entre otros, en moléculas lineales de ADN (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas.

[0020] Una “secuencia codificante” de ADN es una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vivo al colocarla bajo el control de las secuencias de regulación apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5’ (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3’ (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamíferos) y secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción pueden localizarse en el lado 3’ de la secuencia codificante.

[0021] Según se usa en este documento, el término “hibridación” se refiere al proceso de asociación de dos hebras de ácido nucleico para formar un dúplex antiparalelo estabilizado por medio de puentes de hidrógeno entre restos de las hebras opuestas de ácido nucleico.

[0022] El término “oligonucleótido” se refiere a una molécula de poca longitud (menos de 100 bases) de ácido nucleico.

[0023] Las “secuencias de regulación de ADN” según se usan en este documento son secuencias de control transcripcional y traduccional, como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que producen y/o regulan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora.

[0024] Una “secuencia promotora” es una región de regulación de ADN capaz de unirse a la polimerasa de ARN en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante situada secuencia abajo (en la dirección 3’). Para el fin de la definición de la presente invención, la secuencia promotora está limitada en su extremo 3’ por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende secuencia arriba (en la dirección 5’) para incluir el mínimo número de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del nivel de fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de unión a proteínas responsables de la unión a la polimerasa de ARN. Los promotores eucarióticos contendrán frecuentemente, pero no siempre, cajas “TATA” y cajas “CAT”. Para el funcionamiento de los diversos vectores de la presente invención pueden usarse diversos promotores, incluyendo promotores inducibles.

[0025] Según se usa en este documento, los términos “endonucleasas de restricción” y “enzimas de restricción” se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN bicatenario en una secuencia específica o cerca de esta.

[0026] Una célula ha sido “transformada” o “transfectada” por un ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede integrarse o no (ligado covalentemente) en el genoma de la célula. En procariotas, levaduras y células de mamíferos, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episómico como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable es aquella en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma, de modo que se hereda por las células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota de establecer líneas celulares o clones compuestos por una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un “clon” es una población de células derivadas de una única célula o antepasado común por mitosis. Una “línea celular” es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante numerosas generaciones.

[0027] Una región “heteróloga” de la construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN de mayor tamaño, que no se encuentra asociado con la molécula de mayor tamaño en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen estará flanqueado habitualmente por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. En otro ejemplo, el ADN heterólogo incluye una secuencia codificante en una construcción en la que la se han unido entre sí partes de genes de dos fuentes diferentes para producir como producto una proteína de fusión. Las variaciones alélicas de mutaciones de origen natural no dan lugar a una región heteróloga de ADN según se define en este documento.

[0028] Según se usa en este documento, el término “gen indicador” se refiere a una secuencia codificante unida a un promotor heterólogo o a elementos potenciadores y cuyo producto puede analizarse fácilmente y de manera cuantificable al introducir la construcción en tejidos o células.

[0029] Se prefiere que los aminoácidos descritos en este documento estén en la forma isomérica “L”. Las secuencias de aminoácidos se indican en el código de una letra (A: alanina; C: cisteína; D: ácido aspártico; E: ácido

5 glutámico; F: fenilalanina; G: glicina; H: histidina; I: isoleucina; K: lisina; L: leucina; M: metionina; N: asparragina; P: prolina; Q: glutamina; R: arginina; S: serina;T: treonina; V: valina; W: triptofano; Y: tirosine; X: cualquier resto). NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. Se usa J. Biol. Chem. 243 (1969) 3552-59 para atenerse a la nomenclatura estándar de polipéptidos.

10 [0030] La presente invención se dirige a una proteína fluorescente aislada y purificada, seleccionada del grupo que consta de amFP486, cFP484, zFP506, zFP538, dsFP483 y drFP583.

[0031] En este documento se describe un procedimiento para la identificación de una secuencia de ADN

15 codificante de una proteína fluorescente que comprende la etapa del cribado en busca de la existencia de una secuencia de ácido nucleico en una muestra, en que la secuencia de ácido nucleico codifica un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:3, 5, 8, 11, 12 y 14. La existencia de la secuencia de ácido nucleico identifica la secuencia de ADN codificante de la proteína fluorescente.

20 [0032] También se describe un procedimiento para la identificación de una secuencia de ADN codificante de una proteína fluorescente que comprende la etapa del cribado en busca de la existencia de una secuencia de ácido nucleico en una muestra, en que la secuencia de ácido nucleico hibrida con un cebador seleccionado del grupo que consta de SEQ ID NO:4, 6, 7, 9, 10, 13, 15 y 16. La existencia de la secuencia de ácido nucleico identifica la secuencia de ADN codificante de la proteína fluorescente.

25 [0033] Además se describe un procedimiento para el análisis de una proteína fluorescente en una célula que comprende las etapas de la expresión en la célula de una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína fluorescente con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto de SEQ ID NO:55-63; y la medida de una señal fluorescente procedente de la proteína. Este procedimiento comprende además una etapa de

30 clasificación de la célula según la señal. Preferentemente, la célula se clasifica por clasificación de células activadas por fluorescencia. Con mayor preferencia, la secuencia de ácido nucleico comprende un gen de interés codificante de una proteína de interés fusionada con la proteína fluorescente, en que la proteína de interés es distinta de la proteína fluorescente. La señal fluorescente detectada indica la presencia en la célula del gen de interés y además de la proteína de interés. Al identificar una localización intracelular de la proteína fluorescente también se identifica

35 una localización intracelular de la proteína de interés.

[0034] Los ejemplos siguientes se incluyen con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invención y no se pretende que sean limitantes de la presente invención en ningún modo.

40 Material biológico

[0035] Se identificaron nuevas proteínas fluorescentes de varios géneros de antozoos que no presentan ninguna bioluminiscencia pero tienen color fluorescente al observarlos con la luz blanca habitual o con luz ultravioleta. Se eligieron seis especies (véase la tabla 1).

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TABLA 1

Especies de antozoos usadas en este estudio

Especie: Área de origen Color fluorescente

Anemonia majano: Pacífico occidental puntas de los tentáculos verde brillante

Clavularia sp: Pacífico occidental tentáculos y disco oral verde brillante

Zoanthus sp.: Pacífico occidental tentáculos y disco oral verde amarillento

Discosoma sp. “roja”: Pacífico occidental manchas rojo anaranjadas en el disco oral

Discosoma striata: Pacífico occidental bandas verde azuladas en el disco oral

Discosoma sp. “magenta”: Pacífico occidental disco oral ligeramente púrpura

Discosoma sp. “verde”: Pacífico occidental manchas verdes en el disco oral

Anemonia sulcata: Mediterráneo puntas de los tentáculos púrpura

EJEMPLO 2

Preparación de ADNc

5 [0036] El ARN total de la especie de interés se aisló según el protocolo de Chomczynski y Sacchi (Chomczynski P. y col., Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159). La primera hebra de ADNc se sintetizó con 1-3 µg de ARN total mediante el kit de síntesis de ADNc SMART PCR (CLONTECH) según el protocolo suministrado, con la única alteración de que el “cebador para síntesis de ADNc” suministrado en el kit se sustituyó por el cebador TN3 (5’CGCAGTCGACCG(T)13, SEQ ID NO:1) (tabla 2). Después se prepararon muestras de ADNc amplificado según se

10 describe en el protocolo suministrado, con la excepción de que los dos cebadores usados para PCR fueron el cebador TS (5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT, SEQ ID NO:2) (tabla 2) y el cebador TN3 (tabla 2), los dos en la concentración de 0,1 µM. Se llevaron a cabo de veinte a veinticinco ciclos de PCR para la amplificación de una muestra de ADNc. El ADNc amplificado se diluyó veinte veces en agua y en los procedimientos siguientes se usó 1 µl de esta dilución.

15

TABLA 2

Oligonucleótidos usados para la síntesis de ADNc y RACE

imagen1

20

EJEMPLO 3

Diseño de oligonucleótidos

25 [0037] Para aislar fragmentos de ADNc de proteínas fluorescentes nuevas se llevaron a cabo reacciones de PCR con cebadores degenerados. Los cebadores degenerados se diseñaron para coincidir con la secuencia del ARNm de las regiones predichas como de máxima invariabilidad en la familia de las proteínas fluorescentes. Se eligieron cuatro de estos tramos (tabla 3) y se diseñaron variantes de cebadores degenerados. Todos estos cebadores se dirigieron al extremo 3’ del ARNm. Todos los oligonucleótidos se purificaron en gel antes de su uso. La

30 tabla 2 muestra los oligonucleótidos usados para la síntesis de ADNc y RACE.

TABLA 3

imagen1

5 EJEMPLO 4

Aislamiento de fragmentos 3’ de ADNc de las nFP

[0038] Para el aislamiento de los fragmentos diana se usó la estrategia de RACE 3’ modificada (véase la

10 figura 1). La estrategia de RACE requirió dos etapas de PCR consecutivas. En la primera etapa de PCR se usaron un primer cebador degenerado (tabla 4) y el cebador T7-TN3 (SEQ ID NO:17) que tiene una parte 3’ idéntica al cebador TN3 usado para la síntesis de ADNc (véase la secuencia de T7-TN3 en la tabla 2). La razón de la sustitución por el cebador de mayor longitud T7-TN3 en esta etapa de PCR fue la supresión efectiva de la amplificación de fondo que tiene lugar al usar el cebador de menor longitud TN3, en particular cuando el cebador T7

15 TN3 se usa a baja concentración (0,1 _M) (Frohman y col., (1998) PNAS USA 85, 8998-9002). En la segunda etapa de PCR se usaron el cebador TN3 (SEQ ID NO:1, tabla 2) y un segundo cebador degenerado (tabla 4).

TABLA 4

imagen1

[0039] La primera reacción de PCR se realizó de la manera siguiente: 1 µl de la muestra de ADNc amplificado diluida 20 veces se añadió a la mezcla de reacción que contenía la mezcla de la polimerasa Advantage KlenTaq 1x con el tampón suministrado (CLONTECH), dNTP 200 µM, el primer cebador degenerado a una concentración de 0,3 µM (tabla 4) y el cebador T7-TN3 (SEQ ID NO:17) 0,1 µM en un volumen total de 20 µl. Los ciclos realizados fueron (termociclador Hybaid OmniGene, modo de control de tubo): un ciclo de 95°C, 10 s; 55°C, 1 min; 72°C, 40 s; 24 ciclos de 95°C, 10 s; 62°C, 30 s; 72°C, 40 s. La reacción se diluyó después 20 veces en agua y 1 µl de esta dilución se añadió a una segunda reacción de PCR que contenía la mezcla de la polimerasa Advantage KlenTaq 1x con el tampón suministrado por el fabricante (CLONTECH), dNTP 200 µM, el segundo cebador degenerado a una concentración de 0,3 µM (tabla 4) y el cebador TN3 0,1 µM. Los ciclos realizados fueron (termociclador Hybaid OmniGene, modo de control de tubo): un ciclo de 95°C, 10 s; 55°C (para GEG/GNG o PVM) o 52°C (para NFP), 1 min; 72°C, 40 s; 13 ciclos de 95°C, 10 s; 62°C (para GEG/GNG o PVM) o 58°C (para NFP), 30 s; 72°C, 40 s. El producto de la reacción de PCR se clonó en el vector PCR-Script (Stratagene) según el protocolo del fabricante.

[0040] Se probaron diferentes combinaciones de cebadores degenerados en las reacciones primera y segunda de PCR con el ADN de cada especie hasta encontrar una combinación que resultó en una amplificación específica, lo que indica que se detectó una banda intensa del tamaño esperado (aproximadamente 650-800 pb para NGH y GEG/GNG y 350-500 pb para NFP y PVM, a veces acompañadas de bandas menores) en un gel de agarosa después de las dos reacciones de PCR. Las combinaciones de cebadores elegidas para las diferentes especies de la clase de los antozoos se listan en la tabla 4. Algunas otras combinaciones de cebadores también resultaron en la amplificación de fragmentos del tamaño correcto, pero la secuencia de estos fragmentos no mostró ninguna homología con las otras proteínas fluorescentes identificadas o con la GFP de Aequorea victoria.

EJEMPLO 5

Obtención de copias de ADNc de longitud completa

[0041] Después de la secuenciación de los fragmentos 3’ obtenidos de los ADNc de las nuevas proteínas fluorescentes se sintetizaron dos cebadores anidados dirigidos al extremo 5’ por cada ADNc (tabla 5) y los extremos 5’ de los ADNc se amplificaron entonces mediante dos reacciones de PCR consecutivas. En la siguiente reacción de PCR se usó la nueva estrategia de “step-out PCR” para suprimir la amplificación de fondo. La mezcla de la reacción de “step-out” contenía la mezcla de la polimerasa Advantage KlenTaq 1x con el tampón suministrado por el fabricante (CLONTECH), dNTP 200 µM, el primer cebador específico del gen (véase la tabla 5) 0,2 µM, el cebador T7-TS (SEQ ID NO:18) 0,02 µM, el cebador T7 (SEQ ID NO:19) 0,1 µM y 1 µl de la muestra de ADNc amplificado diluida 20 veces en un volumen total de 20 µl. Los ciclos realizados fueron (termociclador Hybaid OmniGene, modo de control de tubo): 23-27 ciclos de 95°C, 10 s; 60°C, 30 s; 72°C, 40 s. El producto de la amplificación se diluyó 50 veces en agua y 1 µl de esta dilución se añadió a la segunda reacción de PCR (anidada). La reacción contenía la mezcla de la polimerasa Advantage KlenTaq 1x con el tampón suministrado (CLONTECH), dNTP 200 µM, el segundo cebador específico del gen 0,2 µM y el cebador TS (SEQ ID NO:2) 0,1 µM en un volumen total de 20 µl.

5 Los ciclos realizados fueron (termociclador Hybaid OmniGene, modo de control de tubo): 12 ciclos de 95°C, 10 s; 60°C, 30 s; 72°C, 40 s. Después el producto de la amplificación se clonó en el vector pAtlas (CLONTECH) según el protocolo del fabricante.

[0042] Se señala que las tres últimas líneas de la tabla 5 no se refieren a realizaciones de la presente 10 invención.

TABLA 5

imagen1

EJEMPLO 6

Expresión de las nFP en E. coli

[0043] Para preparar una construcción de ADN para la expresión de las nuevas proteínas fluorescentes se sintetizaron dos cebadores para cada ADNc: un cebador “secuencia abajo” dirigido al extremo 5’ con el sitio de hibridación localizado en la región UTR 3’ del ADNc y un cebador “secuencia arriba” dirigido al extremo 3’ correspondiente al sitio de inicio de la traducción (sin incluir el primer codón ATG) (tabla 6). Los dos cebadores tenían extensiones 5’ codificantes de un sitio para una endonucleasa de restricción; además, el cebador secuencia arriba se diseñó para permitir la clonación del producto de PCR en el vector pQE30 (Quiagen), de tal manera que resultó en la fusión de los marcos de lectura de la etiqueta de 6xHis codificada por el vector y la proteína. La reacción de PCR se realizó de la manera siguiente: 1 µl de la muestra de ADNc amplificado diluida 20 veces se añadió a una mezcla que contenía la mezcla de la polimerasa Advantage KlenTaq 1x con el tampón suministrado por el fabricante (CLONTECH), dNTP 200 µM, el cebador secuencia arriba 0,2 µM y el cebador secuencia abajo 0,2 µM en un volumen final total de 20 µl. Los ciclos realizados fueron (termociclador Hybaid OmniGene, modo de control de tubo): 23-27 ciclos de 95°C, 10 s; 60°C, 30 s; 72°C, 40 s. El producto de esta etapa de amplificación se purificó por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol y después se clonó en el vector pQE30 mediante las endonucleasas de restricción correspondientes a la secuencia de los cebadores según protocolos estándar.

[0044] Todos los plásmidos se amplificaron en E. coli XL-1 Blue y se purificaron mediante kits de minipreparación de ADN plasmídico (CLONTECH). Los clones recombinantes se seleccionaron por el color de las colonias y se cultivaron en 3 ml de medio LB (suplementado con 100 µg/ml de ampicilina) a 37°C durante la noche. Un volumen de 100 µl del cultivo incubado durante la noche se transfirió a 200 ml de medio LB recién preparado que contenía 100 µg/ml de ampicilina y se incubó a 37°C, 200 rpm hasta una DO600 de 0,6-0,7. Después se añadió IPTG 1 mM al cultivo y se continuó la incubación a 37°C durante otras 16 horas. Las células se recogieron y la proteína recombinante, que incorporaba etiquetas de 6xHis en el extremo N se purificó por medio de la resina de afinidad metálica TALONTM según el protocolo del fabricante (CLONTECH).

[0045] Se señala que las últimas tres líneas de la tabla 6 no se refieren a realizaciones de la presente invención.

imagen2

imagen1

EJEMPLO 7

Nuevas proteínas fluorescentes y ADNc codificantes de estas proteínas

5 [0046] Se encontraron nueve ADNc de longitud completa codificantes de proteínas fluorescentes y se produjeron nueve proteínas fluorescentes nuevas (SEQ ID NO:55-63). Las propiedades espectrales de las nuevas proteínas fluorescentes aisladas se muestran en la tabla 7 y los espectros de emisión y de excitación de las nuevas proteínas se muestran en las figuras 3-11.

10 [0047] Se señala que las proteínas asFP600, dgFP512 y dmFP592 (SEQ ID NO:61-63) no son realizaciones de la presente invención.

TABLA 7

imagen3

[0048] El alineamiento múltiple de las proteínas fluorescentes se muestra en la figura 2A. La numeración se basa en la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria (GFP, SEQ ID NO:54). Las secuencias de aminoácidos de las proteínas fluorescentes nuevas se marcan como SEQ ID NO:55-63. Se comparan entre sí dos proteínas de

20 Zoanthus y cuatro de Discosoma: los restos idénticos a los correspondientes en la primera proteína de la serie se representan por guiones. Los huecos introducidos se representan por puntos. En la secuencia de la GFP de A. victoria se subrayan los tramos que forman láminas ; los restos cuyas cadenas laterales forman el interior del barril  están sombreados. La figura 2B muestra la parte N-terminal de cFP484, que no tiene homología con otras proteínas. El supuesto péptido señal está subrayado.

25 [0049] En este documento se han citado las referencias siguientes.

1.: Ormo y col., (1996) Science 273: 1392-1395.

2.: Yang, F. y col., (1996) Nature Biotech 14: 1246-1251.

3.: Cormack y col., (1996) Gene 173, 33-38.

4.: Haas y col., (1996) Current Biology 6, 315-324.

5.: Yang y col., (1996) Nucleic Acids Research 24, 4592-4593.

6.: Ghoda y col., (1990) J. Biol. Chem. 265: 11823-11826.

7.: Prasher D.C. y col., (1992) Gene 111:229-33.

8.: Kain y col., (1995) Biotechniques 19(4):650-55.

9.: Chomczynski P. y col., (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159.

10.: Frohman y col., (1998) PNAS USA, 85, 8998-9002.

Lista de secuencias

[0050]

<110> Lukyanov, Sergey A. Labas, Yulii A. Matz, Mikhail V. Fradkov, Arcady F.

<120> Proteínas fluorescentes de especies sin bioluminiscencia de la clase de los antozoos, genes codificantes de tales proteínas y sus usos

<130> D6196PCT

<141> 10-12-1999

<150> 09/210.330

<151> 11-12-1998

<160> 63

<210> 1

<211> 25

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador TN3 usado para la síntesis de ADNc y RACE

<400> 1 cgcagtcgaccgttttttttttttt 25

<210> 2

<211> 23

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador TS usado para la síntesis de ADNc y RACE

<400> 2 aagcagtggtatcaacgcagagt 23

<210> 3

<211> 6

<212> Proteína

<213> Aequorea victoria

<220>

<222> 21

<223> secuencia de aminoácidos de un tramo clave en el que se basa el cebador NGH; Xaa en la posición 21 representa desconocido

<400> 3

imagen1

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> <221> unión del cebador

<222> 12

<223> cebador NGH usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes; n en la posición 12 representa cualquiera de las cuatro bases

<400> 4 gayggctgcgtnaayggdca 20

<210> 5

<211> 5

<212> Proteína

<213> Aequorea victoria

<220>

<222> 31...35

<223> secuencia de aminoácidos de un tramo clave en el que se basan los cebadores GEGa y GEGb

<400> 5

imagen1

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador GEGa usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes

<400> 6 gttacaggtgarggmgargg 20

<210> 7

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador GEGb usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes

<400> 7 gttacaggtgarggkgargg 20

<210> 8

<211> 5

<212> Proteína

<213> Aequorea victoria

<220>

<222> 31...35

<223> secuencia de aminoácidos de un tramo clave en el que se basan los cebadores GNGa y GNGb

<400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador GNGa usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes

<400> 9 gttacaggtgarggmaaygg 20

<210> 10

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador GNGb usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes

<400> 10 gttacaggtgarggkaaygg 20

<210> 11

<211> 5

<212> Proteína

<213> Aequorea victoria

<220>

<222> 127...131

<223> secuencia de aminoácidos de un tramo clave en el que se basa el cebador NFP

<400> 11

imagen1

<210> 12

<211> 5

<212> Proteína

<213> Aequorea victoria

<220>

<222> 127...131

<400> 12

imagen1

25 <210> 13

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador NFP usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes

<400> 13 ttccayggtrtgaayttycc 20

<210> 14 35 <211> 4

<212> Proteína

<213> Aequorea victoria

<220>

<222> 134...137

<223> secuencia de aminoácidos de un tramo clave en el que se basan los cebadores PVMa y PVMb

<400> 14 Gly Pro Val Met

<210> 15

<211> 21 45 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<222> 15

<223> cebador PVMa usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes; n en la posición 15 representa cualquiera de las cuatro bases

<400> 15 cctgccrayggtccngtmatg 21

<210> 16

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<222> 15

<223> cebador PVMb usado para el aislamiento de proteínas fluorescentes; n en la posición 15 representa cualquiera de las cuatro bases

<400> 16 cctgccrayggtccngtkatg 21

<210> 17

<211> 47

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador T7-TN3 usado para la síntesis de ADNc y RACE

<400> 17 gtaatacgactcactatagggccgcagtcgaccgttttttttttttt 47

<210> 18

<211> 45

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador T7-TS usado para la síntesis de ADNc y RACE

<400> 18 gtaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt 45

<210> 19

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador T7 usado para la síntesis de ADNc y RACE

<400> 19 gtaatacgactcactatagggc 22

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Anemonia majano

<400> 20 gaaatagtcaggcatactggt 21

<210> 21

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Anemonia majano

<400> 21 gtcaggcatactggtaggat 20

<210> 22

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Clavularia sp.

<400> 22 cttgaaatagtctgctatatc 21

<210> 23

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Clavularia sp.

<400> 23 tctgctatatcgtctgggt 19

<210> 24

<211> 23

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Zoanthus sp.

<400> 24 gttcttgaaatagtctactatgt 23

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Zoanthus sp.

<400> 25 gtctactatgtcttgaggat 20

<210> 26

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Discosoma sp. “roja”

<400> 26 caagcaaatggcaaaggtc 19

<210> 27

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<400> 27 cggtattgtggccttcgta 19

<210> 28

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Discosoma striata

<400> 28 ttgtcttcttctgcacaac 19

<210> 29

<211> 17

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Discosoma striata

<400> 29 ctgcacaacgggtccat 17

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Anemonia sulcata

<400> 30 cctctatcttcatttcctgc 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Anemonia sulcata

<400> 31 tatcttcatttcctgcgtac 20

<210> 32

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Discosoma sp. “magenta”

<400> 32 ttcagcaccccatcacgag 19

<210> 33

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<400> 33 acgctcagagctgggttcc 19

<210> 34

<211> 22

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador específico del gen usado para RACE 5’ para Discosoma sp. “verde”

<400> 34 ccctcagcaatccatcacgttc 22

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> unión del cebador

<400> 35 attatctcagtggatggttc 20

<210> 36

<211> 31

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia arriba usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de

Anemonia majano

<400> 36 acatggatccgctctttcaaacaagtttatc 31

<210> 37

<211> 34

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia abajo usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de

Anemonia majano

<400> 37 tagtactcgagcttattcgtatttcagtgaaatc 34

<210> 38

<211> 29

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Clavularia sp.

<400> 38 acatggatccaacatttttttgagaaacg 29

<210> 39

<211> 28

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Clavularia sp.

<400> 39 acatggatccaaagctctaaccaccatg 28

<210> 40

<211> 31

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Clavularia sp.

<400> 40 tagtactcgagcaacacaaaccctcagacaa 31

<210> 41

<211> 28

<212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> unión del cebador

Zoanthus sp.

<400> 41 acatggatccgctcagtcaaagcacggt 28

<210> 42

<211> 32

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Zoanthus sp.

<400> 42 tagtactcgaggttggaactacattcttatca 32

<210> 43

<211> 31

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia arriba usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de Discosoma sp. “roja”

<400> 43 acatggatccaggtcttccaagaatgttatc 31

<210> 44

<211> 29

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia abajo usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de Discosoma sp. “roja”

<400> 44 tagtactcgaggagccaagttcagcctta 29

<210> 45

<211> 28

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Discosoma striata

<400> 45 acatggatccagttggtccaagagtgtg 28

<210> 46

<211> 28

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Discosoma striata

<400> 46 tagcgagctctatcatgcctcgtcacct 28

<210> 47

<211> 31

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Anemonia sulcata

<400> 47 acatggatccgcttcctttttaaagaagact 31

<210> 48

<211> 28

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

Anemonia sulcata

<400> 48 tagtactcgagtccttgggagcggcttg 28

<210> 49

<211> 30

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia arriba usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de Discosoma sp. “magenta”

<400> 49 acatggatccagttgttccaagaatgtgat 30

<210> 50

<211> 26

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia abajo usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de Discosoma sp. “magenta”

<400> 50 tagtactcgaggccattacgctaatc 26

<210> 51

<211> 31

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia arriba usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de Discosoma sp. “verde”

<400> 51 acatggatccagtgcacttaaagaagaaatg 31

<210> 52

<211> 29

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador

<223> cebador secuencia abajo usado para obtener la región codificante de longitud completa de las nFP de Discosoma sp. “verde”

<400> 52 tagtactcgagattcggtttaatgccttg 29

<210> 53

<211> 33

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> unión del cebador 5 <223> oligonucleótido TS usado para la síntesis de ADNc y RACE

<400> 53 aagcagtggtatcaacgcagagtacgcrgrgrg 33

<210> 54

<211> 238 10 <212> Proteína

<213> Aequorea victoria

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de la GFP

<400> 54

imagen3

imagen1

<210> 55

<211> 229

<212> Proteína

<213> Anemonia majano

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de amFP486

<400> 55 <210> 56

imagen1

<211> 266

<212> Proteína

<213> Clavularia sp.

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de cFP484

<400> 56 <210> 57 <211> 230

imagen4

imagen1

<212> Proteína

<213> Zoanthus sp.

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de zFP506

<400> 57 <210> 58

imagen1

<211> 230

<212> Proteína

<213> Zoanthus sp.

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de zFP538

<400> 58

imagen1

<210> 59

<211> 232

<212> Proteína

<213> Discosoma striata

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de dsFP483

<400> 59 <210> 60

imagen1

<211> 225

<212> Proteína

<213> Discosoma sp. “roja”

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de drFP583

<400> 60 <210> 61

imagen1

<211> 232

<212> Proteína

<213> Anemonia sulcata

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de asFP600

35

<400> 61

imagen1

<210> 62

<211> 231

<212> Proteína

<213> Discosoma sp. “verde”

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de dgFP512

<400> 62 <210> 63

imagen1

<211> 235

<212> Proteína

<213> Discosoma sp. “magenta”

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de dmFP592

<400> 63

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico en un entorno distinto de su entorno natural cuya secuencia codifica una proteína fluorescente de un organismo antozoo sin bioluminiscencia seleccionado de los géneros Anemonia, Clavularia y Discosoma, en que:

(a)

dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores, el primero de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y el segundo de los cuales consta de la secuencia de SEQ ID NO:37; o

(b)

dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40; o

(c)

dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42; o

(d)

dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. “roja” y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44; o

(e)

dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46.
2.

Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Anemonia majano y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:36 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:37.
3.

Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Clavularia sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:38 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:40.
4.

Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Zoanthus sp. y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:41 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:42.
5.

Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Discosoma sp. “roja” y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:43 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:44.
6.

Un ácido nucleico según la reivindicación 1, en que dicha proteína fluorescente es de Discosoma striata y dicho ácido nucleico puede amplificarse con un par de cebadores compuesto de un primer cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:45 y un segundo cebador que consta de la secuencia de SEQ ID NO:46.
7.

El ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en que dicho ácido nucleico está aislado.
8.

Una construcción que comprende un vector y un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9.

Una célula transformada con un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10.

Un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en que la secuencia del ácido nucleico puede amplificarse con un cebador seleccionado del grupo que consta de SEQ ID NO:4, 6, 7, 9, 10, 13, 15 y 16.
11.

Una proteína fluorescente codificada por el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 presente en un entorno distinto de su entorno natural.