DE102010018878B4

DE102010018878B4 - Neue Zell-Linie zur Fluoreszenz-basierten Detektion von funktionell aktiven Antikörpern und Autoantikörpern gegen den Beta1-adrenergen Rezeptor

Info

Publication number: DE102010018878B4
Application number: DE102010018878A
Authority: DE
Inventors: Angela Schlipp; Valérie Jahns; Viacheslav O. Nikolaev; Roland Jahns; Martin J. Lohse
Original assignee: Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Current assignee: Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2013-09-26
Anticipated expiration: 2030-05-01
Also published as: DE102010018878A1

Abstract

Zell-Linie, die sowohl einen β1-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor stabil exprimiert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabil transformierte Zell-Linie, umfassend einen β₁-adrenergen Rezeptor und einen zyklischen Adenosinmonophosphat(cAMP)-Sensor, der mindestens eine cAMP-Bindestelle, oder vorzugsweise nur eine cAMP-Bindestelle und mindestens zwei nachweisbare Markierungen aufweist, wobei die erste der zwei nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus und die zweite der nachweisbaren Markierungen am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit lokalisiert ist. Die stabil transformierte Zell-Linie ermöglicht erstmals eine uniforme, sensitive Nachweismethode von cAMP-Konzentrationen. Des Weiteren sind Nukleinsäuremoleküle beschrieben, die sowohl den β₁-adrenergen Rezeptor, als auch den cAMP-Sensor codieren. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren dar, die unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie, eine deutlich uniformere, einheitlichere Detektion und damit Identifikation von Molekülen oder Verbindungen ermöglichen, die Bildung von cAMP oder die biologische und/oder pharmakologische Funktion von Adenylatzyklasen oder Phosphodiesterasen zu modifizieren. Schließlich wird ein Kit offenbart, das die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die erfindungsgemäße Zell-Linie, die sowohl einen β₁-adrenergen Rezeptor, als auch einen cAMP-Sensor stabil exprimiert ist in einer Vielzahl von pharmakologisch relevanten Nachweismethoden einsetzbar, beispielweise zum Screenen von Molekülen und Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP oder die biologische und/oder pharmakologische Funktionen von Adenylatzyklasen oder Phosphodiesterasen zu modifizieren.
Ein Guaninnukleotid(G)-Protein gekoppeltes Signal kann über die entsprechenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) viele zelluläre Reaktionen auslösen, die von der Regulation intrazellulärer Spiegel von cAMP bis hin zur Stimulierung der Gentranskription reichen. Die Mitglieder dieser Rezeptorfamilie wurden in Abhängigkeit von den jeweiligen G-Protein-Subtypen, mit denen sie vorwiegend interagieren, in verschiedene Kategorien gruppiert. So stimulieren Rezeptoren, die an Gs-Proteine koppeln, in vielen Zellen Adenylatzyklase, wohingegen an G_q/11 gekoppelte Rezeptoren über die Aktivierung von Phospholipase C intrazelluläres Kalzium (Ca²⁺) mobilisieren können. Eine Vielzahl von physiologischen Signalen wie z. B. Neurotransmitter, Hormone und Licht wird von Mitgliedern der Familie dieser Sieben-Transmembrandomänen-Rezeptoren erfasst. Diese GPCRs aktivieren G-Proteine, indem sie die Bindung von Guanosintriphosphat (GTP) im Austausch für Guanosindiphosphat (GDP) fördern. Sowohl Gα-als auch Gβγ-Untereinheiten aktivierter G-Proteine regulieren stromabwärts gelegene Effektoren wie z. B. Adenylzyklasen, Phospholipasen oder Innenkanäle. Ein bei der Signalweiterleitung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beteiligtes Signalmolekül stellt das AMP dar.
cAMP ist ein ubiquitärer intrazellulärer sekundärer Botenstoff, der Informationen auf Proteine überträgt, wozu zyklische Nukleotide gesteuerte Innenkanäle, Proteinkinase A (PKA) und „exchange Protein activated by cAMP” (Epac) gehören. Diese Effektoren regulieren wiederum zelluläre Funktionen wie Ca²⁺-Einstrom, Erregbarkeit und Genexpression, als auch Zell-spezifische Prozesse wie Glykogenolyse und Lipolyse. Die Enzyme, von denen man weiß, dass sie den cAMP-Spiegel regulieren, Adenylatzyklase und Phosphodiesterase, sind eingehend untersucht worden (Hepler, Trends Biochem. Sci. 17 (10): 383–7 (1992); Exton, Annu Rev Pharmacol. Toxicol. 36: 481–509 (1996); Beavo, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3 (9): 710–8 (Sep 2002); Ishikawa, Cardiovasc. Pharmacol. 41: 1–4 (2003)).
Ferner gilt cAMP neben Ca²⁺ als universeller Mediator (sekundärer Botenstoff) der bei der Signalweiterleitung von G-gekoppelten Rezeptoren beteiligt ist. G-Protein gekoppelte Rezeptoren spielen bei der Signalweiterleitung einer Vielzahl von biologischen Prozessen, wie Stoffwechsel, Zellwachstum, Zellmigration, Immunabwehr oder Kontraktion von Myokardzellen eine wichtige Rolle (Mcknight, Recent Prog Horm Res 53: 139–59; 160–1 (1998); Prasad, A review Apoptosis 8 (6): 579–86 (2003); Torgersen, Cell Signal 14 (1): 1–9 2002 Jan; Bailey, Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24): 13445–52 (1996); Wang, Mol. Pharmacol. 63 (3): 463–368 (2003); Evans DB, J Cardiovasc Pharmacol.; 8 Suppl 9: 22–29 (1986)). Eine Krankheit, die u. a. durch einen erhöhten intrazellulären Anstieg von cAMP und Ca²⁺ gekennzeichnet ist, stellt die idiopathische dilatative Kardiomyopathie dar.
Die idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist definiert als Erkrankung des Herzmuskels, die durch eine Dilatation zumindest des linken Ventrikels gekennzeichnet ist.
Ferner ist DCM mit einer eingeschränkten systolischen Pumpfunktion des Herzens verbunden. DCM stellt in westlichen Industrienationen die Hauptursache für Herzversagen bei jungen Erwachsenen dar, mit einer Inzidenz von 50–100 Patienten und einer Prävalenz von 300–400 Patienten pro 1 Million Einwohner (Jhund, Circ. 119: 516–523, (2009)). Aufgrund des Mangels an Therapiemöglichkeiten ist die Herztransplantation noch immer als „ultima ratio” bei fortgeschrittener Herzinsuffizienz anzusehen. Etwa ein Drittel der DCM-Erkrankungen wird durch Genmutationen und kardiotoxische Substanzen verursacht, die Ätiologie der verbleibenden zwei Drittel der DCM-Fälle wird hingegen bisher nur unvollständig verstanden. Das häufigste klinische Erscheinungsbild der DCM ist eine Herzinsuffizienz. Durch eine Reduktion des Herzzeitvolumens droht den verschiedenen Organen eine Minderperfusion, woraufhin verschiedene Kompensationsmechanismen durch Aktivierung von Barorezeptoren eingeleitet werden. Durch die Aktivierung des sympathischen Nervensystems werden Adrenalin und Noradrenalin aus dem Nebennierenmark freigesetzt. Diese Botenstoffe stimulieren β₁-adrenerge Rezeptoren, was an Kardiomyozyten einen positiv ino-, chrono-, bathmo- und dromotrope Effekt zur Folge hat. Diese Effekte beruht auf einem intrazellulären Anstieg von cAMP mit Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration. Bei einer Vielzahl von DCM Patienten können herzspezifische Auto-antikörper (AAk) nachgewiesen werden, die sich gegen Membranproteine (wie z. B. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren), mitochondriale Proteine oder Strukturproteine der Kardiomyozyten richten. Zur Klärung der Frage einer möglichen kausalen Bedeutung von anti-β₁-Antikörper (anti-β₁-AK) bei kardiovaskulären Erkrankungen hat der Erfinder die Witebsky'schen Postulate für eine Autoimmunerkrankung in einem human-analogen Rattenmodell umgesetzt (Jahrs, J. Clin. Invest. 113: 1419–1429 (2004)). Alle gegen die zweite extrazelluläre Domäne des humanen β₁-Antikörpers (β₁-EC_II; 100% Homologie Mensch/Ratte) immunisierten Tiere entwickelten hohe anti-β₁-Antikörper Titer und nach circa 8–9 Monaten eine progrediente Herzinsuffizienz. Die klinische Bedeutung funktioneller anti-β₁-Autoantikörper und die klinische Relevanz dieser Autoantikörper-Effekte sind aber weiterhin unklar. Dies liegt teilweise auch an den völlig unterschiedlichen Nachweismethoden und damit einer uneinheitlichen Definition von anti-β₁-Autoantikörper (Jahrs, Trends Cardiovasc Med. 16: 20–24 (2006)). Das postulierte Modell des Wirkmechanismus funktionell aktiver β₁-Autoantikörper geht davon aus, dass agonistisch wirkende Autoantikörper an die β₁-EC_II Domäne binden und eine Konformationsänderung des Rezeptors induzieren, die ähnlich wie bei der Aktivierung durch einen partiellen Agonisten, eine Dissoziation der alpha-Untereinheit von der beta/gamma-Untereinheit des signalvermittelnden G_s-Proteins auslöst. Hierdurch wird die Adenylatzyklase aktiviert, die die cAMP-Bildung katalysiert. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels fuhrt zur Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) und im weiteren Verlauf der Signalkaskade zu einer Erhöhung des zytosolischen Ca²⁺-Spiegels. Das Ergebnis der Aktivierung dieser Signalkaskade ist eine erhöhte Inotropie und Lusitropie des Herzens. Die chronische Aktivierung des β₁-adrenergen Rezeptor-vermittelten Signalwegs kann zur progredienten Herzschwäche führen.
In der Entwicklung von Screeningverfabren auf β-adrenerge Autoantikörper, hat man bisher einige begrenzte Ansätze verfolgt. So wurde bisher u. a. ein aufwendiger dreistufiger Screeningtest eingesetzt, in welchem ein Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA), indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie an Sf9-Zellen, die den β₁-adrenergen Rezeptor exprimieren, sowie ein funktioneller radioaktiver cAMP/PKA Assay mit β₁-adrenergen Rezeptor exprimierenden CHW-Zellen benutzt (Jahns, Circulation. 99: 649–654 (1999); Jahns, J. Am. Coll. Cardiol. 34: 1545–1551 (1999)). Jedoch wurde es erst mit der Entwicklung von cAMP-Sensoren möglich, cAMP-vermittelte pharmakologisch relevante Prozesse zu untersuchen, siehe WO 2005/052186 A1 . In einem solchen System wird der Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) genutzt, d. h. es wurde ein Fluoreszenz-cAMP-Sensor hergestellt, bei dem die cAMP-bindende Domäne eines direkt durch cAMP aktivierten Regulatorproteins (Epac1) eingesetzt wurde, an das C-terminal das verstärkte cyan fluoreszierende Protein (eCFP) und N-terminal an das verstärktegelb fluoreszierende Protein (eYFP) gekoppelt wurde. Dieser Sensor (Epac1-camps) kann in Sängerzellen transient exprimiert werden und weist bei Belichtung mit einer Wellenlänge von 436 nm einen strahlungslosen Energietransfer von eCFP zu eYFP auf, der eine Emission von Licht der Wellenlänge 542 nm zur Folge hat. Bindet cAMP an den Sensor, verändert er seine Konformation und die Distanz zwischen den beiden Fluorophoren wird vergrößert, womit der Energietransfer verringert wird, die Emission bei 542 nm abnimmt und die Emission bei 483 nm zunimmt.
Nikolaev, JACC 50: 423–431 (2007) beschreibt eine Fluoreszenzmethode zum Auffinden von Autoantikörpern unter Verwendung von HEK293 Zellen, welche den β1-adrenergen Rezeptor stabil exprimieren und mit einem Epac1-baierten fluoreszenten cAMP-Sensor transient transfiziert wurden.
WO 99/66324 A2 beschreibt eine Zelle, welche einen β2-adrenergen Rezeptor stabil exprimiert und mit einem cAMP-Konstrukt transient transfiziert wurde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Verfahren und Mittel zur Untersuchung pathogener Prozesse, insbesondere Herzkrankheiten wie z. B. idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie (DCM) über einen längeren Zeitraum, durch Messung der sequenziell zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen Proben zu verfolgen. Das technische Problem wird durch die Bereitstellung einer Zell-Linie gelöst, welche sowohl den β₁-adrenergen Rezeptor, als auch einen cAMP-Sensor stabil exprimiert. Ein erkennbarer Nachteil der im Stand der Technik verwendeten Verfahren, in denen cAMP-Sensoren transient exprimiert werden, ist, dass das Expressionsniveau der Zellen unterschiedlich ist und aufgrunddessen das Verhältnis zwischen der Sensorkonzentration und der Konzentration der übrigen Komponenten des Signalweges nicht konstant bleibt. Die Reaktion der einzelnen Zellen auf Agonisten ist innerhalb eines Experiments nicht einheitlich und die Ergebnisse sind an unterschiedlichen Messtagen auch nur bedingt vergleichbar, da die Transfektion der Zell-Linie, z. B. von HEK293-Zellen für jeden Messtag erneut durchgeführt werden muss. Im Gegensatz dazu kann die erfindungsgemäß stabil transformierte Zell-Linie verwendet werden, um pathologische Zustände zu untersuchen, bei denen man eine mögliche vom β₁-adrenergen Rezeptor vermittelte abnorme cAMP-Signalgebung als pathophysiologisch relevant vorgeschlagen hat oder ansieht. Der Krankheits- bzw. Behandlungsverlauf kann durch sequenzielle Messungen von „Follow-up”-Proben verfolgt werden, wobei erst die erfindungsgemäße stabil transformierte Zell-Linie gewährleistet, dass die an verschiedenen Tagen durchgeführte Messungen untereinander vergleichbar sind. Solche Krankheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Herzkrankheiten, umfassend infektiöse und nicht-infektiöse Herzkrankheiten, ischämische und nicht-ischämische Herzkrankheiten, inflammatorische Herzkrankheiten und Myocarditis, Herzdilatation, idiopathische Kardiomyopathie, idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM), immunologische-Kardiomyopathie, und jede Herzrhythmusstörung einschließlich ventrikulärer und supraventrikuiärer Extrasystolen, sowie atrialer Rhythmusstörungen einschließlich Vorhofflimmern und Vorhofflattern.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung eine stabil transformierte Zell-Linie, die sowohl einen β1-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor stabil exprimiert.
Der Begriff „cAMP-Sensor” umfasst dabei ein chimäres Peptid, mit einer cAMP-Bindeeinheit mit mindestens einer cAMP-Bindestelle und mindestens einer nachweisbaren Markierung, wobei die nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus oder am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit lokalisiert ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der cAMP Sensor dabei ein chimäres Peptid mit mindestens einer cAMP-Bindeeinheit und mit zwei nachweisbaren Markierungen, wobei eine erste der beiden nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus oder am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit lokalisiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der cAMP-Sensor dabei ein chimäres Peptid, mit einer cAMP-Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle und zwei nachweisbaren Markierungen, wobei eine der beiden nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus lokalisiert ist und eine zweite der zwei nachweisbaren Markierungen am Amino-Terminus lokalisiert ist. Der Begriff „chimäres Peptid” bezieht sich gemäß dieser Erfindung auf ein proteinhaltiges Fusionsprotein, umfassend eine cAMP-Bindeeinheit und mindestens einer nachweisbaren Markierung wie hierin beschrieben. Die erfindungsgemäß stabil transformierte Zell-Linie ist besonders nützlich bei der direkten Bestimmung von β₁-adrenerg vermittelten cAMP-Konzentrationen in vitro über einen längeren Zeitraum von beispielsweise 48 Monaten, 24 Monaten, 12 Monaten, oder vorzugsweise 9 Monaten. Demzufolge kann die vom β₁-adrenergen Rezeptor vermittelte cAMP-Konzentration beispielsweise nach 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 36, 42 oder 48 Monaten ermittelt und unter-/miteinander verglichen werden.
Wie in den beiliegenden Beispielen illustriert, zeigt eine stabil transformierte Zell-Linie, die sowohl einen β₁-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor codiert, der ein chimäres Peptid mit nur einer cAMP-Bindestelle enthält, die von zwei Fluoreszenzproteinen am Carboxy- und Amina-Terminus flankiert ist, einen mittels FRET gemessenen Änderung der cAMP-Konzentration in vitro. Im Gegensatz zu einer transient transformierten Zell-Linie ist die Reaktivität der stabil transformierten Zellen auf einen Aktivator (Agonisten) wesentlich uniformer (siehe z. B. ). Die hierin bereitgestellte stabil transformierte Zell-Linie mit mindestens einer cAMP-Bindungsdomäne, vorzugsweise mit nur einer CAMP Bindestelle, ist besonders nützlich bei der Bestimmung der β₁-adrenerg vermittelten Reaktionen von cAMP. Die erfindungsgemäß stabil transformierte Zell-Linie basiert auf einer einzelnen cAMP-Bindungsdomäne (die nur eine einzige cAMP-Bindestelle umfasst). Wie nachstehend dokumentiert ist, ist die erfindungsgemäß stabil transformierte Zell-Linie besonders nützlich bei der Untersuchung von pharmakologischen Ansätzen und/oder Screening-Ansätzen.
Im Hinblick auf die Bedeutung des sekundären Botenstoff-Systems von cAMP hat man mehrere in vitro Ansätze entwickelt, um die cAMP-Spiegel zu bestimmen. Anfänglich beruhten einige dieser Nachweismethoden auf Verfahren zum indirekten Nachweis von cAMP, wie z. B. der Radioimmunassay (RIA), bei dem der cAMP-Gehalt mittels anti-cAMP-Antikörper bestimmt wurden (Kariv, J. Biomol. Screen. 4 (1): 27–32 (1999)). Ein alternatives Verfahren, zur Detektion von cAMP in vitro und/oder in vivo wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzresonanz-Energietransfer(FRET)-basierendes Testsystem, das cAMP-bindende Proteine wie z. B. Epac benutzt, entwickelt ( WO 2005/052186 A1 ). In diesem Testsystem wird der Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zwischen den fluoreszierenden Proteinen (blaugrün fluoreszierendes Protein (CFP) und gelb-fluoreszierendes Protein (YFP), oder Varianten davon (eCFP; eYFP)), die in eine cAMP-Bindedomäne flankieren, genutzt.
Wie hierein dargestellt, bezieht sich der Begriff „cAMP-Bindedomäne mit nur einer cAMP-Bindestelle” auf eine cAMP-Bindeeinheit, die ziemlich klein ist (ungefähr 100 bis 200 Aminosäuren, bevorzugt 120 bis 200, am meisten bevorzugt etwa 130 bis 180 Aminasäuren und die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst (umfassend ungefähr 10 bis 20 Aminosäurereste, bevorzugt 12 bis 18 Aminosäurereste und besonders bevorzugt 13 bis 15 Amimosäurereste). Alternativ ist es vorgesehen, dass der in der erfindungsgemäßen Zell-Linie enthaltene cAMP-Sensor mindestens eine, vorzugsweise 2 cAMP-Bindestellen beinhaltet. Es ist auch vorgesehen, dass die in der erfindungsgemäßen stabil transformierten Zell-Linie enthaltene cAMP-Bindeeinheit nur eine begrenzte und geringe Zahl zusätzlicher Aminosäurereste neben der darin enthaltenen cAMP-Bindestelle umfasst.
Demzufolge umfasst der cAMP-Sensor, wie er in einem chimären Peptid/Konstrukt der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nur eine cAMP-Bindestelle, was auch vom Fachmann leicht zu erkennen ist. Wie vorstehend angeführt worden ist, umfasst eine bevorzugte cAMP-Bindestelle 10 bis 20 Aminosäuren, stärker bevorzugt 13 bis 15 Aminosäuren.
Speziell können, analog zu WO2005/052186A1, monomolekulare cAMP-Sensoren hergestellt werden, die nur eine cAMP Bindestelle enthalten, in denen an bestimmten Positionen der cDNA der cAMP-Bindungsdomänen von menschlichem Epac1 (wie dargestellt in SEQ ID NO: 1), Maus-Epac2 oder der regulatorischen Untereinheit 11 der Maus-PKA Fluoreszenzproteine eingesetzt werden.
Der Begriff „β-adrenerge Rezeptoren (β-AR)” wie hierin verwendet bezieht sich auf den β₁-adrenergen Rezeptor, der für den Fachmann allgemein bekannt sind. So kann beispielweise die codierende Sequenz des humanen β₁-adreneraen Rezeptors aus einer für den Fachmann bekannten Datenbank erhalten werden. So kann beispielweise die hierin verwendete Sequenz (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 5) des humanen β₁-AR (auch bekannt als adrenerger β₁-Rezeptor (ADRB1)) vom Datenbank Eintrag NM_000684 oder NP_000675 erhalten werden.
Der Begriff „β₁-adrenerger Rezeptor” (β₁-AR), wie hierin beschrieben, bezieht sich auf humane β₁-adrenerge Rezeptoren.
Wie vorstehend diskutiert, ist der β₁-adrenerge Rezeptor in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der stabil transformierten Zell-Linie der Erfindung aus der unten aufgeführten Gruppe ausgewählt. Der β₁-adrenerge Rezeptor ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz die durch ein Nukleiusäuremolekül codiert wird, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4
(b) einem Polypeptid das die Aminosäuresequenz hat, wie dargestellt in SEQ ID NO: 5
(c) einem Polypeptid, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie dargestellt in SEQ ID NO: 5
(d) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, das unter stringenten Bedingungen zu dem komplementären Strang der Nukleinsäure, wie definiert in (a) oder (c) hybridisiert, wobei dieses Nukleinsäuremolekül einen β₁-adrenergen Rezeptor oder ein funktionelles Fragment davon codiert;
(e) einem Polypeptid, die von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das eine Aminosäuresequenz codiert, das zumindest zu 70% identisch ist mit einem Polypeptid wie definiert in (a) bis (d) und ein β1-adrenerger Rezeptor ist;
(f) einem Polypeptid gemäß (a) bis (e), wobei zumindest eine Aminosäure deletiert, ausgetauscht, eingefügt oder hinzugefügt, wobei das Polypeptid oder ein fuktionelles Fragment davon ein β1-adrenerger Rezeptor ist;
(g) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure codiert wird, die zu einer Nukleinsäuresequenz wie definiert in (a), (c) und (d) degeneriert ist.
(h) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das eine Aminosäuresequenz codiert wie hinterlegt mit der Nummer DSM ACC 2985.

Diese Konstrukte sind auch besonders nützlich in den hierin bereitgestellten Verfahren und können in den nachstehend beschriebenen Kits enthalten sein.
Nach Transfektion, Selektion und Vereinzelung wurde FRET in der stabil transformierten Zell-Linie gemessen wie es nachstehend ausführlicher beschrieben ist. Zugabe eines Akivators, wie z. B. Isoprenalin führte zu einer Abnahme von FRET zwischen den Fluorophoren, was auf eine cAMP-induzierte Konformationsänderung hindeutet, die zu einer Vergrößerung der Distanz zwischen den Fluorophoren führte.
In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden erleichtert die stabil transformierte Zell-Linie, die neben dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid einen β₁-adrenergen Rezeptor exprimiert, den Nachweis einer Konformationsänderung innerhalb des chimären Peptids der Erfindung auf die Bindung von cAMP hin, was wiederum zu einer Veränderung der Lichtintensität führt, die von den nachweisbaren Markierungen ausgesendet wird. Somit stellt die erfindungsgemäße, stabil transformierte Zell-Linie ein Testsystem dar, das besonders geeignet ist, die vom β₁-adrenergen Rezeptor vermittelten cAMP-Spiegel zu messen.
Wie in den Beispielen illustriert, kann zu der wie nachstehend definierten stabil transformierten Zell-Linie ein Aktivator (Agonist) hinzugegeben werden und man kann die cAMP-Konzentration in dieser Zell-Linie nach Zugabe des Aktivators durch Aufzeichnen von FRET oder BRET (Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer) graphisch verfolgen. In einer” weiteren Ausführungsform kann in den hierein beschriebenen Verfahren der cAMP-Gehalt von einer unbekannten Substanz oder Verbindung gemessen werden, und mit dem cAMP-Gehalt einer Standardkurve (z. B. vom Aktivator) verglichen werden, wodurch anschließend der durch den Aktivator vermittelte cAMP-Gehalt mit dem cAMP-Gehalt einer unbekannten Verbindung oder Substanz in Relation gesetzt werden kann. Somit stellt die Verwendung der vorliegenden Zell-Linie eine allgemein anwendbare, auf Fluoreszenz basierende Technik zur zuverlässigen, uniformen und sequenziellen Bestimmung von cAMP in der stabil transformierten Zell-Linie dar.
Wie nachstehend dargelegt ist, stellt die vorliegende Erfindung darüber hinaus Verfahren zur Identifizierung und zum Screening von Molekülen und Verbindungen bereit, die in der Lage sind, durch die Bindung an den β₁-adrenergen Rezeptor den Gehalt von cAMP und somit die biologische und/oder pharmakologische Funktion von β₁-adrenergen Rezeptoren zu modifizieren.
Insbesondere entwickelten die Erfinder eine stabil transformierte Zell-Linie für die Bestimmung des intrazellulären cAMP-Spiegels in Zellen der stabil transformierten Zell-Linie nach Applikation eines β₁-Agonisten, welches die Nachteile der transient transformierten Zell-Linie überwindet, die im Stand der Technik beschrieben ist.
Wie vorstehend diskutiert, ist es unter der Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie, vorzugsweise mit nur einer cAMP-Bindestelle mit einer hohen Affinität, möglich den β₁-adrenerg vermittelten cAMP-Gehalt über einen längeren Zeitraum (z. B. von mehreren Monaten) sequentiell (longitudinal) reproduzierbar zu messen.
Der „Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)” wie hierin verwendet bezieht sich auf einen nicht-strahlenden Transfer von Anregungsenergie von einem Donor (erster dem Nachweis dienender Teil) auf einen Akzeptor (zweiter dem Nachweis dienender Teil). Die Konformationsänderung der cAMP-Bindeeinheit auf die Bindung von cAMP hin führt zu einer nachweisbaren Veränderung des FRET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen. Falls FRET zum Beispiel erhöht ist, nimmt der Emission-Peak des Akzeptors zu und der Emissions-Peak des Donors ist verringert. Demnach ist das Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors zu der des Donors ein Hinweis auf die Höhe des FRET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen. Die Konformationsänderung des chimären Peptids der Erfindung auf die Bindung von cAMP führt zu einer einer Zunahme der Distanz zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen.
Der Begriff „chimär” wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Molekül, das Sequenzen enthält, die von zwei, drei oder mehr verschiedenen Genen abgeleitet worden sind, die von einer, zwei, drei oder mehr verschiedenen Spezies abgeleitet sein können.
Der Begriff „Peptid” wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Polypeptid oder ein Protein, das aus Aminosäuren zusammengesetzt sein kann, die durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen, d. h. Peptidisostere miteinander verbunden sind und die andere als die 20 Gen-codierten Aminosäuren enthalten können. Die Polypeptide können entweder durch natürliche Prozesse wie z. B. durch post-translationelle Prozessierung modifiziert werden oder durch chemische Modifikationsmethoden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind. Solche Modifikationen sind in Grundlagentexten und in ausführlicheren Monographien gut beschrieben, ebenso wie in einer umfangreichen Forschungsliteratur. Modifikationen können an beliebigen Stellen in einem Polypeptid vorkommen, wozu das Peptidgerüst, die Aminosäureseitenketten und die Amino- oder Carboxy-Termini gehören. Es ist ersichtlich, dass dieselbe Art von Modifikationen in gleichen oder unterschiedlichen Maßen an mehreren Stellen in einem vorgegebenen Polypeptid vorliegen kann. Ein vorgegebenes Polypeptid kann auch viele Arten von Modifikationen enthalten. Polypeptide können verzweigt sein, zum Beispiel infolge von Ubiquitinierung, und sie können zyklisch sein, mit oder ohne Verzweigung. Zyklische, verzweigte und zyklische verzweigte Polypeptide können aus natürlichen posttranslationalen Prozessen herrühren oder durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Modifikationen umfassen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Flaum, kovalente Bindung einer Häm-Gruppe, kovalente Bindung eines Nukleotids oder eines Nukleotidderivats, kovalente Bindung eines Lipids oder eines Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphatidylinosit, Vernetzung, Zyklisierung, Bildung von Disulfidbindungen, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystein, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gammacarboxylierung, Glycosylierung, Bildung von GPI-Ankern, Hydroxylierung, Jodierung, Methylierung, Myristylierung, Oxidation, Pegylierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Hinzufügung von Aminosäuren zu Proteinen wie z. B. Arginylierung und Ubiquitinierung. (siehe z. B. Seiter, Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990); Rattan, Ann NY Acad Sci 663: 48–62 (1992)).
Der Begriff „chimäres Peptid” oder der Begriff „cAMP-Sensor” wie hierin verwendet bezieht sich auf Polypeptid- oder Protein-Konstrukte, die das Ergebnis der Kombination mehrerer Proteine, Proteindomänen und/oder Linkersequenzen zum Zweck des Erreichen der kombinierten Funktionen der Domänen und/oder Linkersequenzen sind, wie nachstehend ausführlicher dargelegt ist. Dies kann durch molekulare Klonierung der Nukleotidsequenzen erreicht werden, die solche Domänen codieren, um eine neue Polynukleotidsequenz zu erzeugen, die das gewünschte chimäre Peptid wie hierin verwendet codiert. Alternativ lässt sich die Erzeugung eines chimären Peptids durch chemisches Verbinden von zwei oder mehr Proteinen bewerkstelligen.
Speziell kann der Begriff „chimäres Peptid” oder der Begriff „cAMP-Sensor” wie hierin verwendet die Struktur A-B-C umfassen, wobei A eine erste nachweisbare Markierung darstellt, B eine cAMP-Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle darstellt und C eine zweite nachweisbare Markierung darstellt. Zum Beispiel kann die cAMP-Bindeeinheit von der regulatorischen Untereinheit (R) einer cAMP-abhängigen Proteinkinase (wie z. B. PKA) sein, von einem Guanin-Nuldeotidaustauschfaktor (z. B. Epac), einem Katabolit-Genaktivator-Protein aus E. coli, einem durch cMMP gesteuerten Ionenkanal, einem durch ein zyklisches Nukleotid gesteuerten Kanal (z. B. HCN), der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) oder dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium. Bevorzugt ist die cAMP-abhängige Proteinkinase PKA, der Guanin-Nucleotidaustauschfaktor Epac1 oder Epac2, der von einem zyklischen Nukleotid gesteuerte Kanal HCN2 (durch Hyperpolarisierung aktivierter durch zyklische Nukleotide gesteuerter K⁺-Kanal), das katabole Genaktivator-Protein ist von E. coli abgeleitet, der durch CAMP gesteuerte Innenkanal ist vom Menschen abgeleitet, die Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) ist vom Menschen abgeleitet und der cAMP-Rezeptor ist von Dictyostelium. Was PKA anbelangt, können die regulatorischen Untereinheiten von PKA I alpha-A oder B; PKA I beta A oder B; PKA II alpha A oder B oder PKA II beta A oder B verwendet werden. Noch stärker bevorzugt sind PKA, Epac1 oder Epac2 von menschlichem Ursprung, von Maus oder von Rate.
Der Begriff „und/oder” wie er hierin verwendet wird, umfasst die Bedeutung von „und”, „oder” insgesamt oder jede andere Kombination der Elemente, die durch diesen Begriff verknüpft sind.
Der Begriff „mindestens zwei nachweisbare Markierungen” wie hierin verwendet bedeutet, dass das chimäre Peptid der Erfindung zwei, drei, vier, fünf oder mehr nachweisbare Markierungen umfassen kann, am meisten bevorzugt sind jedoch Konstrukte, die zwei nachweisbare Markierungen enthalten. Die nachweisbaren Markierungen werden hierin nachfolgend ausführlich beschrieben und können insbesondere Fluoreszenzproteine ebenso wie bio-lumineszente Substanzen umfassen. Gemäß WO2005/052186A1 sind jedoch zwei nachweisbare Markierungen auf einem chimären Peptid der Erfindung am meisten bevorzugt.
Die Begriffe „Amino-Terminus” oder „Carboxy-Terminus” wie hierein verwendet beziehen sich auf den Amino-Terminus und den Carboxy-Terminus der cAMP-Bindeeinheit des chimären Peptids.
Bei dem Begriff „nachweisbare Markierung” handelt es sich bevorzugt um fluoreszente Markierungen oder um biolumineszente Markierungen. Die nachweisbaren Markierungen umfassen auch genetisch codierte und an technisch bearbeiteten Stellen bindende Markierungen (FIAsH-Technologie; siehe unter anderem Adams, J. Am. Chem. Soc. 124: 6063–6076 (2002) oder Griffin, Meth. Enzymol. 327: 565–578 (2000).
Wie hierin diskutiert ist die erfindungsgemäße stabil transformierte Zell-Linie besonders nützlich bei der Bestimmung des cAMP-Gehaltes. Demzufolge ermöglichen die dem Nachweis dienenden Teile/Markierungen, die in dem chimären Peptid der Erfindung vorhanden sind, den Nachweis einer Konformationsänderung innerhalb des chimären Peptids hin, was wiederum ein Hinweis auf eine Veränderung der emmitierten Lichtintensität des Konstrukts ist. Zum Beispiel kann der wie vorstehen definierten stabil transformierten Zell-Linie eine Substanz oder Verbindung hinzugefügt werden und die Änderung des cAMP Gehaltes durch das Messen und/oder Erfassen von FRET oder BRET erfolgen, indem man die Intensitäten der Fluoreszenzemissionen mit einer Standardkurve vergleicht, die ” unter Abwesenheit der Verbindung/Substanz gemessen wurde. Alternativ kann eine solche Standardkurve auch unter der Verwendung eines Aktivators (Agonisten) erhalten werden. Wie die Beispiele zeigen kann Isoprenalin als ein Aktivator (Agonist) von Gs-Proteingekoppelten Rezeptoren eine Erhöhung von cAMP in der Zelle induzieren. Direkte Aktivatoren, welche zur Gruppe der Katecholamine gehören, erzeugen ein nachweisbares FRET-Signal.
Starker bevorzugt handelt es sich bei dem verwendeten Aktivator (Agonist) um Noradrenalin, Adrenalin, Isoprenalin, Denopamin, Dobutamin.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem verwendeten Katecholamin um Isoprenalin.
Bei der Probe, wie sie hierin definiert ist, kann es sich zum Beispiel um eine Zelle handeln, um ein Zell-Lysat, einen Rohextrakt von Zellen, eine Membranpräparation, ein Gewebe oder Bioflüssigkeiten. Bioflüssigkeiten wie hierin verwendet beziehen sich bevorzugt auf Körperflüssigkeiten wie z. B. Samen, Lymphe, Seren, Plasma, Urin, Gelenkflüssigkeit oder Liquor.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probe Blut, Plasma oder Serum. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine weitere Aufreinigung der hierin beschriebenen Probe durchgeführt. Insbesondere wird eine Aufreingung der IminunglobulinG-Fraktion durch Caprylsäurefällung und/oder Antikörper bindende Aufreinigungssäulchen bevorzugt.
In einer Ausführungsform der stabil transformierten Zell-Linie sind diese Nachweismarkierungen Teile eines geteilten fluoreszierenden Proteins (cAMP-Sensors). Bevorzugt handelt es sich bei diesem geteilten fluoreszierenden Protein um ein geteiltes grün fluoreszierendes Protein (geteiltes GFP). Der Begriff „grün fluoreszierendes Protein” oder „GFP”, wie überall in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich auf das GFP, das ursprünglich von Prasher (Prasher, Gene 111: 229–233 (1992)) aus Aequorea victoria cloniert worden ist, und Mutanten davon, die GFP-Aktivität zeigen. Der Begriff „GFP-Aktivität” bezieht sich auf die bekannten Eigenschaften eines GFP, d. h. Fluoreszenzemission auf Anregung mit einem geeigneten Licht hin, die Fähigkeit zu autokatalytischer Reifung, was Faltung in Tertiärstruktur und die Bildung des Chromophors beinhaltet sowie die Unabhängigkeit von irgendwelchen Cofaktoren oder der Versorgung mit metabolischer Energie um die Fluoreszenz ebenso wie die autokatalytische Reifung durchzuführen. Diese Eigenschaften sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind zum Beispiel in einem Übersichtsartikel von Tsien (Tsien, Ann. Rev. Biochem. 67: 509–544 (1998)) dargestellt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann, sofern nichts Anderweitiges angegeben ist, jede nachweisbare Emissionwellenlänge einer GFP-Mutante nützlich sein, um das chimäre Peptid der Erfindung anzuwenden. Im Stand der Technik sind viele GFP-Mutanten beschrieben, in denen spezifische Aminosäurereste substituiert sind, was sich in einer verbesserten Fluoreszenzeffizienz und/oder einer verschobenen Anregungs- und/oder Emissionswellenlänge auswirkt (siehe z. B. Heim, Meth. Enzymol. 302: 408–423 (1999); Heikal, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 11996–12001 (2000)). So kann insbesondere die Mutation von Glutamin an Position 69 zu Methionin die inhärente pH- und Halogenid-Sensitivität von eYFP verringern (Griesbeck, 1 Biol. Chem. 276: 29188–29194 (2001)). Demnach ist es, falls eYFP oder ein Derivat davon, das im Wesentlichen dasselbe Anregungs- und Emissionsspektrum aufweist, als ein dem Nachweis dienender Teil des Fusionsproteins der Erfindung verwendet wird, bevorzugt, dass das eYFP oder das Derivat davon diese Mutation aufweist. Dennoch ist, wie es in den beigefügten Beispielen gezeigt ist, YFP gemäß dieser Erfindung ebenfalls nützlich. Beispiele für GFP-Mutanten, die für die Anwendung der Erfindung nützlich sind, schließen verstärktes gelb fluoreszierendes Protein ((e)YFP), verstärktes blaugrün fluoreszierendes Protein ((e)CFP), (verstärktes) blau fluoreszierendes Protein ((e)BFP), verstärktes grün fluoreszierendes Protein ((e)GFP), dsRed, Citrin und Saphir ein. Innerhalb des Gültigkeitsbereichs der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige GFP-Mutante oder funktionelles Analog von GFP verwendet werden. In einer alternativen Ausfürungsform kann innerhalb des Gültigkeitsbereichs der vorliegenden Erfindung jede beliebige GFP-Mutante oder funktionelles Analog von GFP verwendet werden, solange es Fluoreszenzaktivität zeigt.
Bevorzug sind solche GFP-Varianten/Mutanten von einem Nukleinsäuremolekül codiert, das, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, mit der Nukleotidsequenz hybridisiert, die das Wildtyp-GFP codiert, oder mit Polynukleotiden, die Varianten/Mutanten codieren wie die in WO2005/052186A1 dargestellten Sequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind diese GFP-Mutanten/Varianten verstärktes blaugrün fluoreszierendes Protein (eCFP) und verstärktes gelb fluoreszierendes Protein (eYFP).
In diesem Kontext bedeutet der Begriff „Hybridisierung” unter üblichen Hybridisierungsbedingungen. Diese können niedrig stringente, bevorzugt stringente (d. h. hoch stringente) Hybridisierungsbedingungen sein, wie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, a. a. O. beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Hybridisierung”, dass die Hybridisierung unter „stringenten Hybridisierungsbedingungen” stattfindet, was sich auf eine Übernachtinkubation bei 42 Grad Celsius bezieht, in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (750 mM NaCl, 75 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, einem Scherprozess unterzogene Lachsrogen-DNA enthält, gefolgt von Waschen der Filter in 0.1 × SSC bei etwa 65 Grad Celsius.
Der Begriff „geteiltes fluoreszierendes Protein” bezieht sich auf ein fluoreszierendes Protein, dessen Aminosäuresequenz in zwei Teile geteilt ist, wobei das geteilte fluoreszierende Protein auf Grund einer sekundären räumlichen Verbindung dieser Teile eine dreidimensionale Struktur annimmt, die es ihm ermöglicht, Fluoreszenz zu emittieren, wenn es durch Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird. Es wird zum Beispiel in Erwägung gezogen, dass es sich bei dem geteilten fluoreszierenden Protein um ein geteiltes GFP handelt, wie es von Baird (Baird, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 11241–11246 (1999)) beschrieben worden ist. Gemäß den Lehren des Stands der Technik ist es für einen Fachmann auf dem Gebiet möglich, ein GFP in zwei geteilte GFP-Teile zu teilen um diese zu dem chimären Peptid der Erfindung zu fusionieren. Es ist des Weiteren vorstellbar, dass andere fluoreszierende Proteine als GFP, z. B. diejenigen, die nachstehend erwähnt sind, geteilt werden können, so dass sie auf dieselbe Weise wie das hierin beschriebene geteilte GFP zwei dem Nachweis dienende Teile darstellen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der ersten Nachweismarkierung um einen Energie emittierenden und fluoreszierenden Proteinteil und bei der zweiten Nachweismarkierung um eine fluoreszierende Protein-Markierung oder anders herum. In Verbindung mit dieser Ausführungsform ist es nicht wichtig, auf welchem Teil des chimären Peptids der erste dem Nachweis dienende Teil in Bezug auf den anderen hierin definierten Teil lokalisiert ist, d. h. ob die Nachweismarkierung am Amino- oder am Carboxy-Terminus der cAMP-Bindeeinheit des chimären Peptids der Erfindung lokalisiert ist, ob sie direkt fusioniert ist oder über einen Linker wie vorstehend ausgeführt. Wie vorstehend diskutiert kann eine der Nachweismarkierungen auch innerhalb der cAMP-Bindeeinheit/Domäne platziert sein, wie hierin beschrieben ist. Der Begriff „Messen oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität” bezieht sich auf nachweisbare Markierungen (Proteine), die zur Emission von Strahlungsenergie fähig sind, die (i) Energie in einer geeigneten Form aufnehmen können und (ii) zumindest einen Teil dieser Energie durch Resonanz-Energietransfer (RET) auf die zweite Nachweismarkierung übertragen können, die ein Teil eines fluoreszierenden Proteins ist, welches dadurch zur Emission von Energie angeregt wird. Die Form der Energieaufnahme kann auf eine beliebige Art und Weise vor sich gehen, die für den Fachmann auf dem Gebiet vorstellbar ist, und kann z. B. eine chemische Reaktion (Chemilumineszenz oder Biolumineszenz) oder die Absorption von Strahlung (Fluoreszenz oder Phosphoreszenz) beinhalten.
Der Begriff „Teil eines fluoreszierenden Proteins” bezieht sich auf Proteine, die in der Lage sind, zu fluoreszieren, d. h. Energie von Strahlung einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren, z. B. ultraviolettes oder sichtbares Licht, und diese Energie oder einen Teil davon durch Strahlung zu emittieren, wobei die emittierte Strahlung eine längere Wellenlänge hat als die anregende Strahlung. Es gibt viele Beispiele von fluoreszierenden Proteinen, die in der Literatur beschrieben sind, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, wie z. B. die vorstehend erwähnten GFPs, fluoreszierende Proteine aus nicht-biolumineszanten Organismen der Klasse Anthozoa ( WO 00034318 A1 , WO 00134319 A1 , WO 00/34320 A1 , WO 00/34321 A1 , WO 00/34322 A1 ; WO 00/34323 A1 , WO 00034324 A1 , WO 00/34325 A1 , WO 00/34326 A1 , WO 00/34526 A1 ) oder das fluoreszierende Protein bmFP aus Photobacterium phosphoreum (Karatani, Photochem. Photobiol. 71: 230 (2000)). Bevorzug sind jedoch fluoreszierende Proteine, die ein eYFP und eCFP sind, wie sie in den beigefügten Beispielen verwendet werden.
Der Begriff „Fluoreszenz Resonanz-Energietransfer” (FRET) bezieht sich wie vorstehend angegeben auf einen nicht durch Strahlung ablaufenden Transfer von Anregungsenergie von einem Donor- (erster dem Nachweis dienender Teil) auf ein Akzeptor-Molekül (zweiter dem Nachweis dienender Teil) (Heyduk, Curr, Opin. Biotechnol, 13 (4): 292–6 (2002); Truong, Curr. Opin. Struct. Biol. 11 (5): 573–8 (2001); Issad, Diabetes Metab. 29 (2 Pt 1): 111–7 2003); Boute, Trends Pharmacol. Sci. 23 (8): 351–4 (2002)).
Darüber hinaus können FRET oder BRET wie in den folgenden Figuren und Beispielen gezeigt bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der stabil transformierten Zell-Linie bindet die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit hoher Affinität. Bevorzugt bindet die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit einem K_d im Bereich von 1 nM bis 50 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 1 nM bis 50 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 5 nM bis 40 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 100 nM bis 30 μM, stärker bevorzugt im Bereich von 200 nM bis 20 μM.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der stabil transformierten Zell-Linie ist die cAMP-Bindeeinheit des chimären Peptids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der regulatorischen Untereinheit (R) einer cAMP-abhängigen Proteinkinase, einem Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, einem Katabolit-Genaktivator-Protein, einem cAMP-gesteuerten Ionenkanal, einem durch ein zyklisches Nukleotid gesteuerten Ionenkanal, der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) und dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium.
Die Familie der cAMP-bindenden Proteine umfasst mehr als zehn Proteinsequenzen., die Proteine mit bekannten Funktionen codieren, ebenso wie mehrere Sequenzen, die von einer Suche in Datenbanken nach potenziellen Bindungsstellen für zyklische Nukleotide abgeleitet sind (Dremier, FEBS Lett. 546 (1): 103–7 (2003)). Bis 1998, als Epae1 kloniert und charakterisiert wurde (de Rooij, Nature 396 (6710): 474–7 (1998)), war Proteinkinase A (PKA) als ein einzigartiger cAMP-Effektor in der Zelle allgemein anerkannt. Nach heutigem Kenntnisstand binden mehrere Proteine cAMP und regulieren Zellfunktionen, z. B. Epac 1 und 2, durch zyklische Nukleotide gesteuerte Kanäle (CNGC), kataboles Genaktivatorprotein in E. coli (CAP), Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE). Man hat eine Reihe von Sequenzen identifiziert, die Proteine mit potenzieller cAMP-Bindungsaktivität codieren, aber deren Funktion bleibt schwer fassbar: ein EST-Sequenz von Maus-Embryo (AI595216), die menschliche Sequenz KIAA0313 (AB002311), die Sequenz Im493605 (Dremier, FEBS Lett. 546 (1): 103–7 (2003)). Wie es einem Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich ist, können auch diese Sequenzen für die Konstruktion des chimären Peptids der Erfindung verwendet werden.
Bevorzugt stammt die cAMP-Bindeeinheit von PKA, Epac1, Epac2, dem Katabolit-Genaktivator-Protein von E. coli, dem cAMP-gesteuerten Innenkanal, sowie HCN2 (durch Hyperpolarisierung aktivierter durch zyklische Nukleotide gesteuerter K⁺-Kanal 2), Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) und dem cAMP-Rezeptor von Dictyostelium. Die cAMP-Bindeeinheit von PKA, Epac1, Epac2 oder HCN2 ist bevorzugt menschlichen oder murinen Ursprungs. In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die cAMP Bindeeinheit von Epac1 von menschlichem Ursprung wie hierein dargestellt unter SEQ ID NO: 1. Die cAMP-Bindeeinheit wie hierin verwendet entspricht bevorzugt den Aminosäuresequenzen, die in den folgenden Sequenzen des Sequenzprotokolls gezeigt sind; die Aminosäurereste 203 bis 323 oder bevorzugt 157 bis 316 von Epac1 (SEQ ID NO: 1). Ferner ist dem Fachmann bekannt das Epac1 zusätzlich am N-terminalen Bereich der Aminosäuresequenz (wie hierin dargestellt als SEQ ID NO: 1) eine Polypeptidsequenz umfassen kann wie in dem Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 8 gezeigt. So kann beispeilsweise die hierin verwendete Epac1 Sequenz (SEQ ID NO: 1) zuzüglich eine N-terminalen Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 8) umfassen und vom Datenbankeintrag NM_001098531 erhalten werden.
Die der Veranschaulichung dienenden, beispielhaften hierin verwendeten chimären Peptide/Konstrukte sind auch in dem beigefügten Sequenzprotokoll dokumentiert. Demzufolge bezieht sich SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 7 auf ein chimäres Konstrukt, das eine cAMP-Bindeeinheit umfasst, die nur eine cAMP-Bindestelle umfasst und von Epac1 abgeleitet ist (Aminosäuren E157-E316).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des chimären Peptids der Erfindung sind die nachweisbaren Markierungen fluoreszierende Markierungen, biolumineszierende Markierungen oder biarsensiche-Markierungen (Jahnke, Chembiochem. 3 (2–3): 167–173 (2002)). Bevorzugt sind diese fluoreszierenden Markierungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GFP, YFP, CFP, BFP, Cytrin, Saphir und dsRed, FIAsH, ReAsH, oder Derivate davon. Die biolumineszierende Markierung ist bevorzugt Luciferase, wie insbesondere Renilla-Luciferase oder Glühwürmchen-Luciferase.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist enthält die hierin beschriebene stabil transformierte Zell-Linie fluoreszierenden Markierungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus GFP, YFP, CFP, BFP, Citrin, Saphir und dsRed, FIAsH, ReAsH, oder wobei die biolumineszierenden Markierungen Luciferase (wie insbesondere Renilla-Luciferase oder Glühwürmchen-Luciferase) ist.
Wie vorstehend diskutiert ist die cAMP-Bindeeinheit in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform des chimären Peptids der Erfindung aus der unten folgenden Gruppe ausgewählt. Die bevorzugte cAMP-Bindeeinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer cAMP-Bindeeinheit eines Polypeptides wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6; und
(b) einer cAMP-Bindeeinheit, die zumindest zu 70% mit der cAMP-Bindeeinheit mit der cAMP-Bindeeinheit von (a) identisch ist.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform ist der cAMP-Sensor als chimäres Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem chimären Peptid, das von einem Nukleinsäuremolekül wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 codiert;
(b) einem chimären Peptid, das von einer Aminosäuresequenz wie dargestellt in einem der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 7;
(c) einem chimären Peptid, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polypeptid codiert, das zumindest zu 70% identisch ist mit einem. Polypeptid wie definiert in (a) oder (b) und zur direkten Bestimmung der cAMP Konzentration verwendet werden kann;
(d) einem chimären Peptid, das eine Aminosäuresequenz, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das eine Aminosäuresequenz codiert wie hinterlegt mit der Nummer DSM ACC 2985; und
(e) einem chimären Peptid, das durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, das zu einer DNA-Sequenz, wie definiert in (a) und (c) degeneriert ist.

Diese Konstrukte sind auch besonders nützlich in den hierin bereitgestellten Verfahren und können in den nachstehend beschriebenen Kits enthalten sein.
Der Begriff „Nukleinsäuremolekül” wie hierin verwendet bedeutet DNA oder RNA oder beide in Kombination oder eine beliebige Modifikation davon, die im Stand der Technik bekannt ist (siehe z. B. US 5,525,711 , US 4,711,955 , US 5,792,608 oder EP302175A2 für Beispiele für Modifikationen). Ein solches (solche) Nukleinsäuremolekül(e) ist (sind) einzel- oder doppelsträngig, linear oder ringförmig und ohne jede Größeniimitierung. Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können zum Beispiel aus natürlichen Quellen gewonnen werden oder können synthetisch oder mittels rekombinanter Methoden hergestellt werden, wie z. B. durch PCR. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung DNA-Moleküle, speziell genomische DNA oder cDNA, oder RNA-Moleküle. Bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül als doppelsträngige DNA. Speziell sind die in WO2005/052186A1 offenbarten Nukleinsäuremoleküle, die Polypeptidsequenzen codieren, die in den SEQ ID NOs: 8 bis 20, d. h. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und/oder 20 sowie den Polypeptidsequenzen SEQ ID NOs: 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 und 73 im weiteren Sinne der Erfindung bevorzugt.
Das Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die es codiert, ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, d. h. ein Nukleinsäuremolekül, das mittels einer Technik hergestellt worden ist, die nützlich ist, um Nukleinsäuremoleküle oder Teile davon künstlich zu kombinieren, die vorher nicht wie in dem so erhaltenen chimären Peptid verknüpft waren. Geeignete Methoden sind zum Beispiel im Stand der Technik verfügbar, wie durch Sambrook und Russell (2001), Molecular Cloning. A Loboratory Manual, CSH Press und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989) ebenso wie Vilardaga, Biotechniques 18: 605–606 (1995) dargestellt. Darüber hinaus sind die entsprechenden Methoden in den beigefügten Beispielen erläutert. Diese Methoden umfassen insbesondere Orts-spezifische Mutagenese.
Für die Konstruktion des chimären Peptids kann eine Polynukleotidsequenz verwendet werden, die eine cAMP-Bindeeinheit codiert, wobei die Polynukleotidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% mit einer Nukleotidsequenz aufweist, welche die cAMP-Bindeeinheit einer Polypeptidsequenz codiert wie sie in den vorstehend aufgeführt enthalten ist. Mit einer Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von zum Beispiel mindestens 95% zu einer in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleotidsequenz hat, ist es beabsichtigt, dass die Nukleinsäure identisch mit der Referenzsequenz ist, außer dass die Nukleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro jeweils 100 Nukleotide der Referenznukleotidsequenz enthalten kann, die das Polypeptid codiert. In anderen Worten, um eine Nukleinsäure zu erhalten, die eine Nukleotidsequenz hat, die eine Sequenzidentität von mindestens 95% zu einer Referenznukleotidsequenz aufweist, dürfen bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder mit einem anderen Nukleotid ausgetauscht sein, oder es kann eine Zahl von Nukleotiden von bis zu 5% der Gesamtnukleotide in der Referenzsequenz in die Referenzsequenz eingefügt werden.
Wie vorstehend dargelegt worden ist, ist der Fachmann auf dem Gebiet leicht dazu in der Lage, aus einer vorgegebenen Aminosäuresequenz oder einer vorgegebenen Nucleotidsequenz eine „cAMP-Bindeeinheit/Domäne” und/oder die cAMP-Bindestelle abzuleiten. Entsprechende Verfahren umfassen unter anderem das Verfahren, das in Dremier, FEBS Letters 546: 103–107 (2003); Rehmann, Nat. Struct. Biol. 10: 25–32 (2003) oder Kawasaki, Science 282: 2275–2279 (1998) offenbart worden ist. Die entsprechenden Verfahren umfassen demzufolge Datenbank-Suchen, entweder allein oder in Kombination mit biologischen und/oder biochemischen Assays, z. B. Restriktionsenzymverdau-Assays (und folgende Bindungsstudien von exprimierten Proteinabschnitten/fragmenten an cAMP in vitro und in vivo), Bindungsassays, Kompetitionsassays (zum Beispiel mit markiertem, z. B. radioaktivem cAMP) und dergleichen. Man sollte beachten, dass eine „cAMP-Bindestelle” in der Literatur auch als „PBC” oder „Phosphatbindungskassette” bekannt ist. Eine entsprechende „cAMP-Bindestelle” kann mit Hilfe von analogen Verfahren abgeleitet werden und umfasst normalerweise einen relativ kurzen Abschnitt von Aminosäureresten (bevorzugt zwischen 13 und 15 Aminosäuren, meistens 14 und beginnt normalerweise mit „F” (Phenylalanin) und endet mit einem „A” (Alanin); siehe auch 14 von WO 2005/052186 A1 oder Rehmann (2003), a. a. O.). Ein bevorzugtes Computerprogramm im Zusammenhang mit der Bestimmung von funktionellen Teilen einer gegebenen Aminosäuresequenz ist TBLASTN; siehe auch den Algorithmus, der von Dremier (2003), a. a. O. bekannt ist).
Wie die Bestimmung von „cAMP-bindenden. Domänen/Einheiten” und/oder „cAMP-Bindestellen” kann auch die Identifizierung von Nukleinsäuremolekülen und/oder Polypeptiden, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% mit einer Nukleotidsequenz oder einer Aminosäuresequenz aufweisen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, eine herkömmliche Bestimmung mit bekannten Computerprogrammen umfassen. Eine bevorzugte Methode zur Bestimmung der besten Gesamtübereinstimmung zwischen einer Suchsequenz (einer Sequenz der vorliegenden Erfindung) und einer Zielsequenz, die man auch als globale Sequenzanordnung bezeichnet, kann mit dem FASTDB-Computerprogramm bestimmt werden, das auf dem Algorithmus von Brutlag et al. (Comp. App. Biosc. 6: 237–245 (1990)) beruht. In einer Sequenzanordnung sind die Suchsequenz und die Zielsequenz beide DNA-Sequenzen. Eine RNA-Sequenz kann man vergleichen, wenn man U's zu T's umwandelt. Das Ergebnis dieser globalen Sequenzanordnung wird in Prozent Identität angegeben. Bevorzugte Parameter, die in einer FASTDB-Anordnung von DNA-Sequenzen verwendet werden um den Prozentsatz der Identität zu berechnen, sind: Matrix = einheitlich, k-Tupel = 4, Mismatch-Strafwert = 1, Verbindungs-Strafwert = 30, Länge der Randomisierungsgruppe = 0, Randwert = 1, Lückenstrafwert = 5, Strafwert für Lückengröße = 0,05, Fenstergröße = 500 oder die Länge der zu testenden Nucleotidsequenz, was immer kürzer ist.
In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden kann für die Erzeugung des chimären Peptids eine cAMP-Bindeeinheit verwendet werden, die eine Sequenzidentität von mindestens 70%, 80%, 90% oder 95% zu einer cAMP-Bindeeinheit eines Polypeptids aufweist wie es in den SEQ ID NOs: 2 oder 6 gezeigt oder wie in WO 2005/052186 A1 aufgeführt ist. Besonders bevorzugte sind hierin vorstehend angegeben und umfassen unter anderem die Aminosäurereste 157–316 von Epac1, oder die Aminosäurereste 281–445 von Epac2 (Domäne B), die Aminosäurereste 203–323 von Epac1, die Aminosäurereste 274–416 der regulatorischen Untereinheit II beta von PKA, die Aminosäurereste 544–661 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kaliumkanals 2, die Aminosäurereste 12–98 des Katabolit-Genaktivatorproteins, die Aminosäurereste 473–568 der Neuropathie-Ziel-Esterase oder die Aminosäurereste 628–767 des durch cyclische Nucleotide gesteuerten Kanals 4 (CNG-4).
Der Begriff „zumindest zu 70%” wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Sequenzidentität von 70% oder mehr.
Außer dem Nukleinsäuremolekül oder der Expressionskassette der Erfindung kann der wie in den Beispielen beschrieben Vektor (wie z. B. pCEP4-Epac1) weitere Gene enthalten, wie z. B. Markergene, die eine Selektion dieses Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Im Allgemeinen enthält der Vektor auch einen oder mehrere Replikationsursprünge.
Vorteilhafterweise sind die Nukleinsäuremoleküle, die in den Vektoren enthalten sind, funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft, die Expression ermöglichen, d. h. Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen sicherstellen.
Die Expression des Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung erfolgt in einer stabilen Zelllinie. Prozeduren zur Selektion von stabil transfizierten Zelllinien sind auf dem Fachgebiet bekannt; siehe unter anderem Vilardaga, J. Biol. Chem. 276: 33435–33443 (2001). Bevorzugte Zell-Linien sind CHO-Zellen, HEK 293-, Cos 7-, HeLa-, PC12-, B35-, CHW-, BHK-21, HUVEC-, MyEnd-, HL-1, oder NIH 3T3-Zellen oder sogar primäre Zellen wie primäre Kardiomyozyten, Fibroblasten, Endothel- oder embryonale Stammzellen, wobei es sich bei diesen primären Zellen nicht um menschliche Embryonalzellen handelt.
Der Bergriff „stabil transformierte Zell-Linie” oder „stabile Zell-Linie”, beschreibt die Integration eines DNA-Fragmentes in das Genom einer Zelle. Im Allgemeinen werden bei der Transformation Gene, d. h. nackte DNA übertragen und in das Genom einer Zelle stabil und über einen längeren Zeitraum, vorzugsweise dauerhaft integriert. Durch diesen Einbau erhält die transformierte Zelle (Expressionssystem) einen neuen Gentyp und kann durch Aktivierung der stabil eingebauten DNA-Fragmente einen neuen Phänotyp zeigen. Im Gegensatz dazu beschreibt der Begriff „transient” oder „transient transformierte Zell-Linie”, die Übertragung nackter DNA in eine Zelle, die nicht stabil eingebaut ist.
Der Begriff „Transfektion” und „Transformation” wird hierin als synonym verwendet, und beschreibt den Einbau von DNA-Fragmenten in Zellen.
Eine erfindungsgemäß Zell-Linie, die neben dem β₁-adrenergen Rezeptor einen cAMP-Sensor stabil exprimiert, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig am 10. Dezember 2008 von der Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Sanderring 2, 97070 Würzburg hinterlegt. Die von der Internationalen Hinterlegungsstelle (DSMZ) zugeteilte Eingangsnummer lautet DSM ACC 2985.
Eine klassische Übersicht über verschiedene Expressionssysteme ist zum Beispiel in Methods in Enzymology 153: 385–516 (1987); in Bitter, Methods in Enzymology 153: 516–544 (1987) und in Sawers, Applied Microbiology and Biotechnology 46: 1–9 (1996), Billman-Jacobe, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 500–504 (1996), Hockney, Trends in Biotechnology 12: 456–463 (1994), Griffiths, Methods in Molecular Biology 75: 427–440 (1997) enthalten. Ein Überblick über Hefe-Expressionssysteme wird zum Beispiel von Hensing, Antoine van Leuwenhoek 67: 261–279 (1995), Bussineau, Developments in Biological Standardization 83: 13–19 (1994), Gellissen, Antoine van Leuwenhoek 62: 79–93 (1992), Fleer, Curr. Opin. Biotechnol. 3: 486–496 (1992), Vedvick (Curr. Opin. Biotechnol. 2: 742–745 (1991) und Buckholz, Bio/Technology 9: 1067–1072 (1991) gegeben. Besonders bevorzugte Expressionssysteme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Sf9-Zellen, E. coli – Zellen oder Säugerzellen wie z. B. CHO-Zellen, HEK 293-, Cos 7-, HeLa-, PC12-, B35-, CHW-, BHK-21, HUVEC-, MyEnd-, HL-1, oder NIH 3T3-Zellen.
Die stabile Transformation der Zell-Linie mit einem Nukleinsäuremolekül oder Vektor kann mittels Standardmethoden durchgeführt werden, wie sie zum Beispiel in Sambrook und Russell (2001), a. a. O. beschrieben sind. Die Zell-Linie wird in Nährmedium gezüchtet, das die Erfordernisse der jeweils verwendeten Zell-Linie erfüllt, insbesondere im Hinblick auf den pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration, Belüftung, Antibiotika, Vitamine, Spurenelemente etc. Bevorzugt stammt die Zell-Linie aus einer Säugerzelle, einer Amphibienzelle, einer Fischzelle, einer Insektenzelle, einer Pilzzelle, einer Pflanzenzelle oder einer bakteriellen Zelle oder von einem transgenen nicht-menschliches Tier.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus nicht-menschliche transgene Organismen, d. h. multizelluläre Organismen, die ein Nukleinsäuremolekül umfassen, das ein chimäres Peptid der Erfindung bevorzugt stabil in dessen Genom integriert, mindestens in einem Teil der Zellen dieses Organismus, oder in Teilen davon wie z. B. Geweben oder Organen. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei einem solchen nicht-menschlichen Ursprung des Transgens um ein Säugetier wie eine Maus, eine Ratte, ein Schaf, eine Ziege, ein Schwein, einen Hund, eine Ratte oder ein Pferd.
Die erfindungsgemäße Zell-Linie, die den β₁-adrenergen Rezeptor als auch das chimäre Peptid als cAMP-Sensor stabil exprimiert, ist besonders nützlich in pharmakologischen Studien, bei Screeningverfahren und bei Verfahren zur Identifizierung wie hierin bereitgestellt. Es ist zu beachten, dass gerade für diese Studien nicht nur Zellen, sondern auch Organe oder Teile von Organen dieser nicht-menschlichen transgenen Tiere besonders nützlich sind. Es ist vorgesehen, dass zum Beispiel Herz, Blutgefäße, Muskel, Drüse, Knochen, Niere oder Leber oder Gehirn oder Kulturen von Hirngewebeschnitten des hierin beschriebenen nicht-menschlichen transgenen Tiers bei dem hierin bereitgestellten Screeningverfahren und Verfahren zur Identifizierung verwendet werden. Neben den nicht-menschlichen transgenen Tieren, die Säugetiere sind, ist es auch vorgesehen, dass es sich bei diesen nicht-menschlichen transgenen Organismen auch um ein Amphibium, ein Insekt, ein Pilz oder sogar eine Pflanze handeln kann. Besonders bevorzugte nicht-menschliche Zell-Linien werden aus Zellen von Drosophila, C. elegans, Xenopus ebenso wie Hefen wie S. pombe oder S. cerevisiae oder die Aspergillus-Spezies. Transgene Pflanzen-Zellkulturen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Weizen, Tabak, Petersilie oder Arabidopsis.
Wie hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten Beispielen bildlich dargestellt, ist die die hierin definierte stabil transformierte/transfizierte Zell-Linie besonders nützlich bei Screening-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung von cAMP an das chimäre Peptid oder die biologische und/oder pharmakologische Aktivität von Adenylatzyklasen und/oder Phosphodiesterasen zu modifizieren. Wie die Beispiele zeigen kann Isoprenalin als ein Aktivator (Agonist) von Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren eine Erhöhung von cAMP in der Zelle induzieren. Direkte Aktivatoren von Adenylatzyklase, weiche zur Gruppe. der Katecholamine gehören erzeugen ein nachweisbares FRET-Signal.
Stärker bevorzugt handelt es sich bei dem verwendeten Aktivator (Agonist) um Noradrenalin, Adrenalin, Isoprenalin, Denopamin, Dobutamin.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei denn verwendeten Katecholamin um Isoprenalin.
Stärker bevorzugt handelt es sich bei der stabil transformierten Zell-Linie, wobei die Zell-Linie aus einer Säugerzelle um eine CHO-Zellen, HEK 293-, Cos 7-, HeLa-, PC12-, B35-, CHW-, BHK-21, HUVEC-, MyEnd-, HL-1, oder NIH 3T3-Zellen ebenso wie aus primäre Zellkulturen wie neuronale Kulturen stammt. Wie es einem Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich ist, können auch primäre Zellen oder transgene Tiere, die das chimäre Peptid exprimieren für diese Screening-Verfahren und Verfahren zur Identifizierung eingesetzt werden.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von cAMP in der stabilen transformierten Zell-Linie, umfassend das Zugeben einer Verbindung oder Substanz wie vorstehend definiert oder wie mit Hilfe des erwähnten Verfahrens erhältlich zu der Probe und Messen/Erfassen von FRET oder BRET und Bestimmen der cAMP-Konzentration in der Probe durch Vergleichen der Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve, die unter Abwesenheit der Verbindung oder Substanz erhalten wurde.
Wie bereits hierin vorstehend erklärt, ermöglichen die dem Nachweis dienenden Teile/Markierungen, die in dem chimären Peptid der Erfindung vorhanden sind, den Nachweis einer Konformationsänderung innerhalb des chimären Peptids der Erfindung auf eine Bindung von cAMP hin, was wiederum zu einer Änderung der Lichtintensität führt, die von den dem Nachweis dienenden Teilen/Markierungen emittiert wird, was mittels FRET oder BRET verfolgt werden kann. Die Konformationsänderung der cAMP-Bindeeinheit auf die Bindung von cAMP hin führt zu einer nachweisbaren Veränderung von FRET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen/Markierungen. Eine solche Veränderung kann zum Beispiel aus einem Vergleich der Emissionsspektren einer cAMP-Bindeeinheit in Abwesenheit einer geeigneten bindenden Verbindung, d. h. cAMP, mit derselben cAMP-Bindeeinheit in Anwesenheit einer solchen Verbindung entnommen werden. Wenn zum Beispiel FRET zunimmt, ist der Emission-Peak des Akzeptors erhöht und der Emission-Peak des Donors ist verringert. Somit ist das Verhältnis der Stärke der Emission des Akzeptors zu der des Donors ein Hinweis auf das Maß von RET zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen. Die Konformationsänderung des chimären Peptids auf die Bindung von cAMP hin kann entweder zu einer Abnahme oder zu einer Zunahme der Distanz zwischen den dem Nachweis dienenden Teilen führen. Somit stellt das chimäre Peptid der Erfindung ein monomolekulares Werkzeug bereit, das besonders geeignet ist, die cAMP-Spiegel in einer Probe direkt zu bestimmen. Zum Beispiel kann man das wie vorstehend definierte chimäre Peptid zu einer Probe hinzugeben und man kann, indem man FRET oder BRET misst und/oder erfasst, die cAMP-Konzentration in der stabil transformierten Zell-Linie messen, indem man die Werte der Fluoreszenzemission mit einer Standardkurve vergleicht, die man durch Applikation verschiedener Isoprenalin-Konzentrationen erstellt. Alternativ werden in einer weiteren Ausführungsform die Werte der Fluoreszenzemission mit einem Kontrollwert verglichen, die man unter Abwesenheit einer Verbindung oder Substanz erhielt.
Um ein Beispiel für einen möglichen Assay zur Messung von cAMP in vitro zu geben, kann die hierin beschriebene Zell-Linie transfiziert werden das z. B. ein auf Epac1 basierendes chimäres Peptid codiert, das wie vorstehend beschrieben eCFP und eYFP und beinhaltet und den β₁-adrenergen Rezeptor beinhaltet. Man kann nach Transfektion der Zellen, Selektionierung mit den geeigneten Selektionsantibiotika (wie in Beispielen illustriert Hygromycin für den Epac1-cAMP-Sensor und G418 für den β₁-adrenergen Rezeptor) und Vereinzelung der Klone mit anschließender Untersuchung der Reaktion auf β₁-agonistische (aktivierende) Antikörper stabile Klone der Zell-Linie erhalten. Unter Verwendung dieser stabil transformierten Zell-Linie kann man Emissionsspektren nach Zugabe von verschiedenen Aktivatoren (Agonisten) wie in den Beispielen angegeben messen. Eine Abnahme der Intensität bei 542 nm mit einer Zunahme bei 483 nm stellt einen Verlust an FRET-Signal zwischen eCFP und eYFP dar, Das Verhältnis der Signal-Intensität 542 nm Intensität 483 nm zur cAMP-Konzentration kann für anschließende genaue Messungen der cAMP-Konzentration bei verschiedenen Konzentrationen des Aktivators/Agonisten in Form einer Dosis-Wirkungs-Kurve aufgetragen werden.
In Übereinstimmung mit dem Vorhergehenden kann es sich bei der Probe wie sie hierin definiert ist, zum Beispiel um eine Zelle, um ein Zell-Lysat, einen Rohzellextrakt, eine Membranpräparation, ein Gewebe oder um Bioflüssigkeiten handeln. Bioflüssinkeiten wie hierin verwendet beziehen sich bevorzugt auf Körperflüssigkeiten wie z. B. Samen, Lymphe, Seren, Plasma, Urin, Gelenkflüssigkeit oder Liquor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird aus der hierin beschriebenen Probe die ImmunglobulinG-Fraktion, wie in den Beispielen illustriert (siehe z. B. Beispiel 6), aufgereinigt, gegen einen geeigneten Messpuffer (wie z. B. FRET-Puffer) über Nacht dialysiert und dann in den hierein beschriebenen Verfahren eingesetzt.
Der vorstehend beschriebene Assay, bei dem die stabil transformierte Zell-Linie verwendet wird, zeigt verschiedene Vorteile. Zum Beispiel ist es mit der hierin beschriebenen Zell-Linie möglich Messungen verschiedener Messtage zu vergleichen und somit „Follow-up”-Versuche durchzuführen. Somit kann die stabil transformierte Zell-Linie verwendet werden, pathologische Zustände zu untersuchen, bei denen man eine mögliche über den β/β₁-adrenergen Rezeptor abnorme vermittelte cAMP Signalgebung als pathophysiologisch relevant ermittelt (identifiziert) vorgeschlagen hat (Lohse, Cir. Res, 93: 896–906 (2003)). Solche Krankheiten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Herzkrankheiten, umfassend infektiöse und nicht-infektiöse Herzkrankheiten, ischämische und nicht-ischämische Herzkrankheiten, inflammatorische Herzkrankheiten und Myocarditis, Herzdilatation, idiopathische Kardiomyopathie, idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM), immunologische-Kardiomyopathie, und jede Herzrhythmusstörung einschließlich ventrikulärer und supraventrikulärer Extrasystolen, sowie atrialer Rhytmusstörungen einschließlich Vorhofflimmern und Vorhofflattern.
Der Fachmann auf dem Gebiet kann daher leicht die Verbindungen und die Verfahren der Erfindung verwenden, tun die antagonistischen und/oder antagonistischen Wirkungen und/oder Eigenschaften einer Verbindung/eines Moleküls/einer Substanz am β₁-adrenergen Rezeptor aufzuklären.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäß stabil transformierte Zell-Linie dazu verwendet werden Infektionskrankheiten oder chronisch verlaufende Infektionskrankheiten, die beispielsweise durch einzellige Parasiten (wie z. B. durch Trypanosomen) verursacht mit einer Beeinflussung der β₁-adrenergen Signaltransduktion einhergehen, zu diagnostizieren und in ihrem Verkauf zu beurteilen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäß stabil transformierte Zell-Linie, dazu verwendendet werden, verschiedene Nierenerkrankungen und tropische Infektionskrankheiten (wie z. B. Chagas) zu untersuchen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die über eine chronische Aktivierung des β₁-adrenergen Rezeptors vermittelte Herzkrankheit die idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM).
Somit kann die hierin beschriebene stabil transformierte Zell-Linie für eine auf FRET/BRET basierende Überwachung von cAMP-Spiegeln eingesetzt werden, um die Rolle über eine Aktivierung des β₁-adrenergen Rezeptors vermittelten cAMP-Veränderungen zu ermitteln, in dem man den Gehalt von cAMP nach Inkontaktbringen der Zell-Linie mit einer Flüssigkeit, Verbindung oder Substanz misst. Somit kann die stabil-transformierte Zell-Linie für eine FRET/BRET basierende Überwachung und zur Diagnose vom β₁-adrenergen Rezeptor vermittelte Krankheiten, und hier besonders Herzkrankheiten, eingesetzt werden. Anschließend kann man dieselbe Art der Untersuchung unter Verwendung eines Aktivators durchführen, wodurch eine maximale cAMP-Änderung in der stabil transformierten Zell-Linie erzielt wird.
Demnach ist die hierin beschrieben Zell-Linie, eine stabil transformierte Zell-Linie, die sich besonders für den Nachweis der intrazellulären cAMP-Konzentration nach Stimulation des β₁-adrenergen Rezeptors eignet. Eine solche, stabil transformierte Zell-Linie zeigt verschiedene Vorteile im Vergleich zu der auf dem Fachgebiet beschriebene transient transformierte Zell-Linie. Somit ist es mit der hierein beschriebenen teilungsfähigen stabil transformierten Zell-Linie erstmals möglich über einen längeren Beobachtungs-Zeitraum repititiv (horizontal und longitudinal) den Verlauf und die Rolle/klinischen Effekte der cAMP-Änderungen bzw. des Aktivierungsgrades des β₁-adrenergen Rezeptorsystems in der Pathogenese der hierin beschriebenen Herzkrankheiten zu untersuchen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülen (z. B. Antikörper) oder Substanzen (z. B. Agonisten), die in der Lage sind, an den β₁-adrenergen Rezeptor zu binden oder aber eine Bindung von Molekülen oder Substanzen an den β₁-adrenergen Rezeptor zu verhindern (z. B. Zyklopeptide) und somit entweder eine Produktion/Generierung (Freisetzung) von cAMP zu aktivieren oder aber eine Generierung (Freisetzung) von cAMP zu verhindern/inhibieren, umfassend die Schritte:

(a) des Inkontaktbringen der stabil transformierten Zell-Linie mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en); und
(b) das Messen, inwieweit das (die) zu testende(n) Molekül(en) oder Verbindung(en) zu einer Änderung der Lichtintensität führt (führen), die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten cAMP-Sensor als chimäres Peptid enthalten sind.

Wie hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten Beispielen erläutert, ist die hierin definierte Zell-Linie besonders nützlich bei Screeninwerfahren und bei Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die in der Lage sind, an einen β₁-adrenergen Rezeptors zu binden und diesen zu aktivieren, sowie von Molekülen oder Verbindungen, vorzugsweise zyklische Peptide (Zyklopeptide), die in der Lage sind, eine Bindung anderer Moleküle oder Substanzen (z. B Antikörper) and den β₁-adrenergen Rezeptor zu verhindern. Zum Beispiel kann man die stabil transformierte Zell-Linie mit (einem) zu testenden Molekülen) oder (einer) zu testenden Verbindung(en) in Kontakt bringen. Durch Messen, ob diese(s) zu testende(n) Moleküle) oder diese zu testende(n) Verbindungen zu einer einer Aktivierung des β₁-adrenergen Signalwegs führt und somit eine zu einer Änderung der (Licht-)Intensitäten führt, die von den zwei benachbarten Markierungen emittiert wird, ist es möglich Moleküle oder Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, den β₁-adrenergen Rezeptor zu aktivieren. Wie die Beispiele zeigen, basiert die vorliegende Erfindung auf dem überraschenden Befund, dass man unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie ein uniformes Testsystem entwickelt hat, mit der es möglich ist, basierend auf einer Konformationsänderung und sukzessiven Aktivierung bzw. Modulierung der Aktivität (= veränderten Aktivitätszustand) des β₁-adrenergen Rezeptors, eine Veränderung (Zunahme oder Abnahme) der emittierten Lichtintensitäten zu messen (messbar mittels Veränderungen im FRET oder BRET).
Der Begriff „uniform” beschreibt die eine gleichmäßige, einheitliche und/oder gleichförmige Reaktion der hierin beschriebenen Zell-Linie auf eine Substanz oder Verbindung, beispielsweise auf einen hierin definierten Aktivator/Agonisten.
Die Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen oder Substanzen, die in der Lage sind, den Aktivierungsgrad des β₁-adrenergen Rezeptorsystems zu verändern, kann unter Einsatz einer stabil transformierten Zell-Linie erreicht werden, die neben dem β₁-adrenergen Rezeptor auch einen cAMP-Sensor, wie hierin beschrieben, codiert. Solche Zell-Linien können aus CHO-Zellen, HEK 293-, HeLa-, Cos 7-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen, (primären) Kardiomyozyten, Fibroblasten, Endothel- oder embryonale Stammzellen, (primären) in Kultur gehaltene Nervenzellen, Muskelzellen oder Frosch-Oocyten, wobei es sich bei diesen Zellen nicht um menschliche embryonale Zellen handelt, stammen.
Die stabil transformierte Zell-Linie wird dann mit (einem) zu testenden Molekülen) oder (einer) zu testenden Verbindungen) in Kontakt gebracht und man misst, ob diese(s) Moleküle) oder diese Verbindung(en) zu einer Veränderung in der Energie (Intensitäten) führen, die von den zwei nachweisbaren Markierungen emittiert werden, die in dem wie vorstehend definierten chimären Peptid enthalten sind. Wie die beigefügten Beispiele veranschaulichen, umfassen die besonders bevorzugten Messverfahren die FRET- oder BRET-Messungen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülen oder Verbindungen, die Aktivatoren (Agonisten) oder Inhibitoren (Antagonisten) eines β₁-adrenergen Rezeptors sind, und somit in der Lage sind die Konzentration des, im Verlauf der weiterführenden Signalkaskade gebildeten cAMP zu erhöhen oder zu erniedrigen, umfassend die Schritte:

(a) das Inkontaktbringen der stabil transformierten Zell-Linie mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en);
(b) das Messen, inwieweit das (die) zu testende(n) Molekül(en) oder Verbindung(en) zu einer Änderung der Lichtintensität führt (führen), die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die in dem wie vorstehend definierten cAMP Sensor als chimäres Peptid enthalten sind; und
(c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindungen) gemessen wurde.

Wie hierin vorstehend erwähnt und insbesondere in den beigefügten Beispielen erläutert, ist die hierin beschriebene stabil transformierte Zell-Linie besonders nützlich bei Screeningverfahren und bei Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen, Verbindungen oder Substanzen, die in der Lage sind den Aktivierungsgrad des β₁-adrenergen Rezeptorsystems zu verändern, d. h. β₁-adrenerge Rezeptoren zu aktivieren oder zu hemmen (inhibieren). Durch Messen, oh diese(s) zu testende(n) Molekül(e) oder diese zu testende(n) Verbindungen zu einer Änderung der Energie führt, die von den zwei benachbarten Markierungen emittiert wird, ist es möglich Moleküle, Verbindungen oder Substanzen (wie beispeilsweise Antikörper) zu identifizieren, die in der Lage sind, die Bindung an den β₁-adrenergen Rezeptor zu aktivieren oder zu hemmen. Wie die Beispiele zeigen, basiert die vorliegende Erfindung auf dem überraschenden Befund, dass man unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie ein uniformes Testsystem entwickelt hat mit dem es möglich ist, basierend auf einer Konformationsänderung mit sukzessiver Aktivierung oder Inhibierung des β₁-adrenergen Rezeptors, über eine Veränderung der zellulären cAMP-Konzentration eine Veränderung der Lichtintensität im Sensormolekül Epac-camps zu messen (messbar mittels FRET oder BRET). Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal Mittel und Verfahren bereit, mit denen die Aktivierung (ebenso wie Deaktivierung) oder Hemmung der Bindung eines/einer Moleküls/Substanz oder Verbindung an den β₁-adrenergen Rezeptor, unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie, uniform beobachtet werden kann (wie z. B. in gezeigt). Daher gewährleistet die vorliegende Erfindung eindeutiges Screening ebenso wie Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren (Agonisten), partiellen Agonisten, inversen Agonisten ebenso wie von Antagonisten des. β₁-adrenergen Rezeptors. Bei Antagonisten erfolgt der Nachweis durch die verminderte agonistische Antwort eines nachfolgend applizierten Agonisten. Im Kontext dieser Erfindung ebenso wie in Übereinstimmung mit den pharmakologischen Wissenschaften kann der Begriff „Agonist” auf ein Molekül oder eine Verbindung eingegrenzt werden, das den β₁-adrenergen Rezeptors aktiviert. Als „partielle Agonisten” werden im Fachgebiet Moleküle/Verbindungen definiert, die sich wie Agonisten verhalten, aber die, sogar bei hohen Konzentrationen, den β₁-adrenergen Rezeptors nicht bis zum gleichen maximalen Ausmaß aktivieren können wie Agonisten. Der Begriff „Antagonist” bezieht sich auf Moleküle/Verbindungen, welche den β₁-adrenergen Rezeptor binden allerdings keine Rezeptoraktivierung bewirken.
Folglich gewährleistet gemäß den hierin bereitgestellten Verfahren die Erfindung die Identifrzierung, die Charakterisierung und das Screenen von Verbindungen, Substanzen oder Molekülen, die in der Lage sind, β₁-adrenerge Rezeptoren zu aktivieren, zu desaktivieren oder zu inaktivieren, wobei diese Interaktion zu einer Aktivierung, einer partiellen Aktivierung, einer Hemmung oder einer partiellen Hemmung der biologischen und/oder pharmakologischen Funktion dieses β₁-adrenergen Rezeptors führen kann. Daher gewährleistet die vorliegende Erfindung ein eindeutiges Screening ebenso wie Verfahren. zur Identifizierung von Agonisten, partiellen Agonisten, inversen Agonisten ebenso wie von Antagonisten des β₁-adrenergen Rezeptors. Im Kontext dieser Erfindung ebenso wie in Übereinstimmung mit den pharmakologischen Wissenschaften kann der Begriff „Agonist” oder „volle Agonist” auf ein Molekül oder eine Verbindung eingegrenzt werden, das an den β₁-adrenergen Rezeptor bindet und diesen aktiviert. Als „partielle Agonisten” werden im Fachgebiet Moleküle/Verbindungen definiert, die sich wie Agonisten verhalten, aber die, sogar bei hohen Konzentrationen, den β₁-adrenergen Rezeptor nicht bis zum gleichen maximalen Ausmaß aktivieren können wie volle Agonisten. Der Begriff „inverser Agonist” bezieht sich auf Moleküle/Verbindungen, welche an den entsprechenden β₁-adrenergen Rezeptor binden und dessen (spontane) Aktivität hemmen. Diese inversen Agonisten sind von besonderer Bedeutung und sichtbar, wenn die β₁-adreneregen Rezeptoren intrinsische, von Agonisten unabhängige (Eigen-)Aktivität zeigen. Der Begriff „Antagonist” bezieht sich auf Moleküle/Verbindungen, die an den β₁-adrenergen Rezeptor binden, aber die intrinsische Aktivität des Rezeptors nicht verändern. Diese können auch die Bindung des entsprechenden Liganden des β₁-adrenergen Rezeptors verhindern und sie können die Bindung und Aktivierung des β₁-adrenergen Rezeptors durch deren Agonisten oder partielle Agonisten verbindern.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Antagonist” Moleküle/Substanzen, die in der Lage sind, einen agonistischen Effekt zu inhibieren und/oder zu verringern. Der Begriff „Antagonist” umfasst kompetitive, nicht-kompetitive, funktionelle und chemische Antagonisten wie sie unter anderem in Mutschler, „Arzneimittelwirkungen”, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Deutschland (1986) beschrieben worden sind. Der Begriff „partieller Antagonist” gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Molekül/eine Substanz, das/die in. der Lage ist, die Aktivität von Agonisten durch unter anderem auch nicht-kompetitive Mechanismen unvollständig zu blockieren. Als „Agonisten” werden gemäß dieser Erfindung Moleküle/Substanzen bezeichnet, die eine Affinität zu ebenso wie eine intrinsische Aktivität an einem bestimmten Rezeptor/Rezeptorsystem aufweisen. In den meisten Fällen ist diese intrinsische Aktivität (a) als proportional zu dem Quotienten aus der Wirkung, die durch diesen Agonisten ausgelöst wird (E_A), und der Wirkung, die in einem gegebenen biologischen System maximal erreicht werden kann (E_max), definiert: daher kann die intrinsische Aktivität definiert werden als:
Die höchste relative intrinsische Aktivität ergibt sich aus E_A/E_max = 1. Agonisten mit einer intrinsischen Aktivität von 1 sind volle Agonisten, wohingegen Substanzen/Moleküle mit einer intrinsischen Aktivität von > 0 und < 1 partielle Agonisten sind. Partielle Agonisten zeigen einen dualistischen Effekt, d. h. sie umfassen agonistische ebenso wie antagonistische Wirkungen.
Der Fachmann auf dem Gebiet kann daher leicht die Verbindungen und die Verfahren der Erfindung verwenden, um die agonistischen und/oder antagonistischen Wirkungen und/oder Eigenschaften einer Verbindung/eines Moleküls/einer Substanz aufzuklären, die/das/die gemäß einem beliebigen der vorstehend beschriebenen Verfahren zu identifizieren oder zu charakterisieren ist.
Die Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen, die in der Lage sind, den β₁-adrenergen Rezeptor zu aktivieren, zu desaktivieren oder zu inaktivieren, kann unter Verwendung der hierein beschriebenen stabil transformierten Zell-Linie erreicht werden. Solche Zell-Linie stammen vorzugsweise aus CHO-Zellen, HEK 293-, HeLa-, Cos 7-, PC12- oder NIH 3T3-Zellen, Frosch-Oocyten oder primären Zellen wie primären Kardiomyozyten, Fibroblasten, endothialen oder embryonalen Stammzellen, wobei es sich bei diesen Zellen nicht um menschliche Embryonalzellen handelt.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer β₁-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit, umfassend die Schritte:

(a) das Inkontaktbringen der stabil transformierten Zell-Linie mit einem zu testenden oder zu testenden. Verbindung aus dem Probenmaterial eines Patienten;
(b) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid umfasst ist; und
(c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit des/der Kandidatenmoleküls(e)(Verbindung(en) gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in den Zellen der stabil transformierten Zell-Linie als Reaktion auf das Probenmaterial, im Vergleich zur Standardkurve hindeutet, dass der Patient durch den β₁-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit leidet.

Das „Vergleichen der Änderung der Lichtintensität” wie hierein verwendet bezieht sich auf ein Signal, d. h. eine Veränderung im FRET, welche aus einer routinemäßigen Kontrollmessung (z. B. Probenmaterial von gesunden Patienten) stammt. Alternativ bezieht sich die „Standardkurve” wie hierin verwendet auf ein Signal, d. h. eine Veränderung im FRET, welche durch routinemäßig verwendete Aktivatoren (Agonisten) eines β₁-adrenergen Rezeptors induziert wird, als Referenzverbindung eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Standardantwort, wie in den hierin aufgeführten Beispielen, auf ein Signal, d. h. eine Veränderung im FRET, welches durch die Zugabe von Isoprenalin induziert wird.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnosestellung und zum Verlauf einer β₁-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit über einen Zeitraum von z. B. mindestens 3 bis bin zu 48 Monaten, umfassend die Schritte:

(a) das inkontaktbringen der Zell-Linie mit einem zu testenden Molekül oder zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial eines Patienten;
(b) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid wie hierin definiert umfasst ist; und
(c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit eines des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en) gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in den Zellen der stabil transformierten Zell-Line als Reaktion auf das Probenmaterial (durch in dem Probenmaterial vorhandende agonistisch wirkende Verbindungen), im Vergleich zur Standardkurve hindeutet, dass der Patient an einer über den β₁-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit leidet, und wobei der Gehalt an cAMP horizontal (gleicher Zeitpunkt, verschiedene Patienten) oder longitudinal (gleicher Patient, verschiedende Zeitpunkte) gemessen werden kann.

Bei potenziellen Kandidatenmolekülen oder Gemischen von Kandidatenmolekülen kann es sich unter anderem um Substanzen, Verbindungen oder Zusammensetzungen handeln, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, die in der Natur vorkommen oder die synthetisch, rekombinant und/oder chemisch hergestellt worden sind. Demnach kann es sich bei Kandidatenmolekülen um Antikörper handeln, um Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Aminosäuren und/oder Derivate davon oder um andere Verbindungen, die unter anderem an den β₁-adrenergen Rezeptor bindet und/oder mit diesem interagiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der hierein beschriebenen Erfindung erfolgte die Präparation der hierin beschriebenen Kandidatenmoleküle aus humanem Serum von Probanden (Patienten), die an einer Herz-Krankheit leiden, welche durch idiopathische dilatative Kardiomyopathie vermittelt wird. Hierbei betrug die Ejektionsfraktion der als DCM-Patienten charakterisierten Patientengruppe < 40%. Ebenso wurden Ischämie und Erkrankungen der Koronargefäße, Alkoholmissbrauch sowie andere toxische Einflüsse ausgeschlossen (Jahrs, Circulation. 99: 649–654 (1999)).
Der hierin beschriebene Begriff „Kandidatenmolekül” ist in der vorliegenden Anmeldung mit dem Begriff „das zu testende Molekül, oder die zu testende Verbindung” gleichzusetzen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung einer gewählten Dosis von β₁-adrenergen Rezeptorhomologen bei der Behandlung einer über den β₁-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit, umfassend die Schritte:

(a) das Inkontaktbringen der stabil transformierten Zell-Linie mit einem zu testenden Molekül oder zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial eines Patienten;
(b) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP Sensor als chimäres Peptid umfasst ist; und
(c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit eines des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en) gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in den Zellen der erfindungsgemäßen stabil transformierten Zell-Linie, im Vergleich zur Standardkurve darauf hindeutet, dass die Probe aktivierende Antikörper des Rezeptors aufweist, oder das die gewählte Dosis an β₁-adrenergen Rezeptorhomologen (wie z. B. (Zyklo)peptide) zur Behandlung einer β₁-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit nicht ausreichend ist, und wobei die Dosis so gewählt sein sollte, dass kein erhöhter Gehalt der cAMP-Konzentration in den Zellen der erfindungsgemäßen Zell-Linie im Vergleich zur Standardkurve nachweisbar ist.

Bei β₁-adrenergen Rezeptorhomologen kann es sich unter anderem um Moleküle, Substanzen oder Verbindungen handeln, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, in der Natur vorkommen oder die synthetisch, rekombinant und/oder chemisch hergestellt worden sind.
Speziell sind die β₁-adrenergen Rezeptorhomologe Peptide oder, vorzugsweise Zyklopeptide, die eine Sequenzähnlichkeit mit der ersten (β₁-EC_I), der zweiten (β₁-EC_II) oder der dritten extrazellulären Domäne (β₁-EC_III) eines β₁-adrenergen Rezeptors besitzen. Die dritte extrazellulären Domäne (β₁-EC_III) eines β₁-adrenergen Rezeptors enthält oder besteht aus der Aminosäuresequenz KAFHRELVPDR. Die „ EC_II-immitierenden” Peptide oder Zyklopeptide umfassen die allgemeine Formel (x-x_h-Cys-x-x^a-x^b-x^c-x-Cys-y-x_i-x) oder cyclo(x-x_h-Cys-x-x^a-x^b-x^c-x-Cys-y-x_i-x). In dieser Formel, kann „y” jede Aminosäure außer Cys sein, vorzugsweise kann „y” jede Aminosäure außer Cys und Pro sein. Generell kann „y” jede Aminosäure sein, so lange diese Aminosäure keine intramolekulare Verknüpfung (z. B. eine Disulfidbindung) mit einer anderen Aminosäure des hierein beschriebenen Zyklopeptids (z. B. eine anderes Cys des hierein beschriebenen Zyklopeptids) eingeht. Vorzugsweise kann „y” jede Aminosäure sein, die zu Cys ähnlich ist (das heißt die eine ähnliche chemische Struktur und/oder eine ähnliches biochemisches Verhalten wie Cys aufweist), mit der Ausnahme, dass es keine intramolekulare Verknüpfung (z. B. eine Disulfidbrücke) mit einer anderen Aminosäure eines hierein beschriebenen Zyklopeptids (z. B. mit einem anderen Cys eines hierin beschriebenen Zyklopeptids) oder intermolekulare Bindungen mit endogenen Zellproteinen, die Cys enthalten, eingeht. Vorzugsweise kann „y” jede polare Aminosäure sein, mit der Ausnahme von Cys oder Thr. Speziell, kann „y” in dem hierin beschriebenen (Zyklo)peptid Ser sein. In einem weiteren Beispiel kann „y” auch Selenocystein oder ein Analogon davon sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann „y” auch alpha-Buttersäure (Abu) oder ein Abu-Analog sein. Beispiele für entsprechende (Zyklo)peptide sind: (cyclo)(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly); (cyclo)(Ala-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Gln), und (cyclo)(Ala-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Asn-Arg-Gln).
In einem hierin beschriebenen (Zyklo)peptid (siehe obige Formeln) kann „h” eine Gesamtzahl von 1 bis 15, vorzugsweise 5 bis 9 sein, und/oder „i” kann eine Gesamtzahl von 0 bis 14, vorzugsweise von 1 bis 14. In einer weiteren. Ausführungsform kann „i” eine Gesamtzahl von 0 bis 6, vorzugsweise von 1 bis 6. Demzufolge kann „h” 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 und/oder „i” 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 sein. Vorzugsweise ist „h” 5 oder 9 und oder ist „i” 3 oder 6. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung steht x_h speziell für die Aminosäuresequenz DEARR oder RAESDEARR und/oder x_i steht speziell für Aminosäuresequenz DFV, DFVT oder DFVTNR. In einer weiteren speziellen Ausführungsform steht x_i, für die Aminosäuresequenz AESDEARR und/oder x_i steht im speziellen für die Aminosäuresequenz DFVT.
Das (Zyklo)peptid (siehe obige Formeln), wie hierin beschrieben, beinhaltet nur ein Pro. Demzufolge, ist es bevorzugt, dass weder „y” noch „x”, ausgenommen von genau einem von x^a, x^b und x^c, Pro ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist „x” Pro, „x^b”, wie hierin in einer der obigen Formeln beschrieben, eine saure Aminosäure, wie Asp oder Glu. Beispielsweise, wenn „x” Pro ist, kann x^b eine saure Aminosäure sein, wenn x^b Pro ist, kann x^a eine saure Aminosäure sein, und wenn x^a Pro ist, kann das x, wie hierein in einer der beiden obigen Formeln beschrieben, welches sich zwischen x^a und dem ersten Cys liegt eine saure Aminosäure sein.
Das (Zyklo)peptid (oder der cyclische Teil davon), wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben umfasst 18 bis 25 Aminosäuren. Demzufolge, umfasst das Zyklopeptid der vorliegenden Erfindung 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 oder 25 Aminosäuren, wobei das Zyklopeptid bevorzugt 18, 22 oder 25, besonders bevorzugt 18 oder 22, Aminosäuren umfasst. In einer weniger bevorzugten Ausführungsform kann das Zyklopeptid (oder der cyclische Teil davon) weniger Aminosäuren umfassen, z. B. 16 oder 17 Aminosäuren.
Wie bereits oben erwähnt, können in weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die hierein vorgestellten β₁-adrenerge Rezeptorhomologe mutatis mutandis lineare Peptide sein. Die hierin beschriebenen β₁-adrenergen Rezeptorhomologe können auch (Zyldo)peptide sein, die eine Sequenzähnlichkeit mit der dritten extrazellulären Domäne (β₁-EC_III) besitzen (siehe oben). β₁-adrenerge Rezeptorhomologe sind im Fachgebiet wohlbekannt, unter anderem aus WO 2009/027063 A2 oder in WO 2006/103101 A2 .
Die in WO 2009/027063 A2 und WO 2006/103101 A2 offenbarten β₁-adrenergen Rezeptorhomologe sind im Sinne dieser Erfindung bevorzugt. Besonders bevorzugt sind dabei die in WO 2009/027063 A2 offenbarten Zyklopeptide (jeweils mit den in WO WO 2009/027063 A2 angegebenen weiteren Bevorzugungen).
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist in den β₁ -adrenergen Rezeptorhomologen das Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt, das dem Cystein an Position 131 und/oder 216 je nachdem, ob das β₁-adrenerge Rezeptorhomolog einer Sequenz der ersten (β₁-EC_II) oder der zweiten (β₁-EC_II) extrazellulären Schleife ähnlich ist. Die „andere” Aminosäure kann z. B. ein „y”, wie es für die oben genannten Formeln definiert wurde, sein. Vorzugsweise ist die „andere Aminosäure” Ser, oder ein Ser-Analogon, oder ein Abu, oder ein Abu-Analogon (wie z. B. 2-Aminopropansäure, 2-Aminopentansäure oder 2-Aminohexansäure).
In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform kann es sich bei an den β₁-adrenergen Rezeptorhomologen bindenden mit dem β₁-adrenergen Rezeptor interagierenden Substanzen um β₁-adrenerge Rezeptorblocker handeln. Speziell kann es sich hierbei um β₁-Rezeptorblocker handeln, wobei die β₁-Rezeptorblocker ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus umfassend Atenolol, Metoprolol, Nebivolol, Oxprenolol, Bupranoiol, Betaxolol, Penbutolol, Pindolol, Bisoprolol, Acebutolol, Metipranolol, Carteolol, Celiprolol, Esmolol, Timolol, Levobunolol, Propranolol, Talinonlol, Alprenolol, Sotalol, Cartesolol, Carvedilol und Bisoprolol.
Bei einem potenziellen zu testenden Molekül (Kandidatenmolekül) oder zu testenden Verbindung (Testverbindung) aus dem Probenmaterial kann es sich unter anderem um Substanzen, Verbindungen oder Zusammensetzungen handeln, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, die in der Natur vorkommen oder die synthetisch, rekombinant und/oder chemisch hergestellt worden sind. Demnach kann es sich bei dem zu testenden Molekül oder der zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial um Antikörper handeln, um Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Aminosäuren und/oder Derivate davon oder um andere Verbindungen wie z. B. Ionen, die unter anderem an den β₁-adrenergen Rezeptor binden und/oder mit diesem interagieren.
Wie in den beiliegenden Beispielen illustriert, kann eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die Bestimmung des β₁-agonistischen Potenzials aus Probenmaterial sein. Durch die Aktivierung des β₁-adrenergen Rezeptors wird im weiteren Verlauf der Signalkaskade über die Aktivierung des von stimulatorischen G-Protein und Adenylatzyklase cAMP in den Zellen der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen stabil transformierten Zell-Linie gebildet, was durch den intrazellulären cAMP-Sensor im Zytosol nachgewiesen wird.
Wie hierin bereits vorliegend definiert, umfasst das Probenmaterial vorzugsweise Blut, Plasma oder Serum. Wie in den beiliegenden Beispielen illustriert können diese Substanzen oder Verbindungen insbesondere Antikörper sein, die aus dem Serum aufgereinigt werden (so wie z. B. in Beispiel 6) und anschließend, zum Beispiel in verschiedenen Konzentrationen, unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie auf den vom β₁-adrenergen Rezeptor vermittelten cAMP-Gehalt vermessen werden. Dieser ermittelte cAMP-Gehalt kann mit einer Standardkurve, vorzugsweise von einem Aktivator des β₁-adrenergen Rezeptors (wie z. B. von Isoprenalin) verglichen werden. Somit stellt die Verwendung der vorliegenden stabil transformierten Zell-Linie eine allgemein anwendbare, auf Fluoreszenz basierende Technik, zur Bestimmung von cAMP in der stabil transformierten Zell-Linie dar. Da es sich bei der vorliegenden Zell-Linie, um eine stabil transformierte Zell-Linie handelt können die hierin beschriebenen Verfahren repetitiv (und/oder longitudinal wie z. B. monatlich, alle 3 Monate bis hin zu jährlich wiederholten Messungen) durchgeführt werden.
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird sofort erkennen, dass die Verfahren der Erfindung einen wichtigen Beitrag zur pharmakologischen Forschung darstellen können, insbesondere auf dem Gebiet des Arzneistoffscreenings. So umfassen entsprechende Methoden zum Arzneistoffscreening, die in der Literatur beschrieben worden sind, zum Beispiel Kyranos, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 4: 719–728 (2001); Pochapsky, Curr. Top. Med. Chem”. 1: 427–441 (2001) und Bochats, Curr. Top. Med. Chem. 1: 367–383 (2001).
Die Kandidatenverbindungen oder Testverbindungen können im Prinzip von jeder Quelle genommen werden. Es kann sich dabei um natürlich vorkommende Substanzen handeln, um modifizierte natürlich vorkommende Substanzen, um chemisch synthetisierte Substanzen oder um Substanzen, die von einem transgenen Organismus hergestellt und gegebenenfalls bis zu einem gewissen Grad aufgereinigt und/oder weiter modifiziert worden sind. Praktischerweise kann die Kandidatenverbindung aus einer Bank von Verbindungen stammen, wie sie routinemäßig für Screening-Prozesse eingesetzt werden.
Der Begriff „Inkontaktbringen” bezieht sich auf die Zugabe einer Kandidaten-Verbindung/von Testverbindungen zu der stabil transformierten Zell-Linie auf eine Weise, so dass die Verbindung an der Zelloberfläche oder nach Aufnahme in die Zelle auf die Zelle einwirken kann. Üblicherweise kann die Kandidatenverbindung oder eine Lösung, die diese enthält, zu dem Assay-Gemisch hinzugegeben werden. Schritt (a) der Verfahren der vorliegenden Erfindung, d. h. der „Schritt des Inkontaktbringens” lässt sich ebenso erreichen, indem man der stabil transformierten Zell-Linie eine Probe hinzugibt, die diese Kandidatenverbindung oder eine Vielzahl von Kandidatenverbindungen enthält. Sofern man mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens herausfindet, dass eine solche Probe oder eine Vielzähl von Verbindungen eine Verbindung von Interesse enthält, dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe zu isolieren oder die Originalprobe weiter zu unterteilen, wenn sie zum Beispiel aus einer Vielzahl von verschiedenen Verbindungen besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu verringern, und das Verfahren mit den Teilmengen der Originalprobe zu wiederholen. Je nach Komplexität der Probe kann man die hierin beschriebenen Schritte mehrmals durchführen, bevorzugt bis die nach dem Verfahren der Erfindung identifizierte Probe nur eine begrenzte Zahl von Substanzen oder nur eine Substanz umfasst. Bevorzugt umfasst diese Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften und am meisten bevorzugt sind diese Substanzen identisch.
Der „Mess- oder Identifizierungsschritt” kann gemäß den Erklärungen ausgeführt werden, welche das Messen einer vom β₁-adrenergen Rezeptor vermittelten Veränderung in den Intensitäten des emittierten Lichts der Fusionsproteine betreffen, d. h. der chimären Peptide der Erfindung wie sie hierin vorstehend angegeben sind. Besonders bevorzugt sind optische Messverfahren, die eine Auflösung der Fluoreszenz auf der Ebene von Einzelzellen erlauben, bevorzugt auf der subzellulären Ebene. Geeignete Bildgebungsverfahren sind in der Literatur beschrieben wie z. B. in Periasamy, Methods in Cellular Imaging, (2001), Oxford University Press oder in Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy, 1996, hrsg. von X. F. Wang, Brian Harman, John Wiley and Sons. Sie können Fluoreszenz umfassen, bevorzugt FRET-Mikroskopie, digitale Bildaufnahme, z. B. mit Hilfe einer CCD-Kamera und einer geeigneten Bildauswertungs-Software. Die beigefügten Beispiele stellen auch nützliche Einstellungen bereit, um Kandidatenverbindungen zu messen. Bevorzugt wird Schritt (b) ausgeführt, indem man parallele Kontrollexperimente durchführt. Zum Beispiel kann man die stabil transformierte Zell-Linie, unter entsprechenden Bedingungen beobachten wie in Schritt (a), jedoch ohne diese mit einer Kandidatenverbindung in Kontakt zu bringen. Alternativ kann man die stabil transformierte Zell-Linie, unter entsprechenden Bedingungen beobachten wie in Schritt (a), jedoch dass man die stabil transformierte Zell-Linie mit einem Aktivator des β₁-adrenergen Rezeptors in Kontakt bringt.
Der Bergriff „Dosis” bezieht sich auf die Gabe einer. Menge eines Stoffes, wie z. B. eines hierin definierten β/β₁-Rezeptorhomologs, die dem Patienten zugeführt werden muss um eine bestimmte Wirkung zu erzielen. Hierbei unterscheidet der Fachmann zwischen der totalen Dosis, die während der gesamten Behandlung zugeführt wird. Die totale effektive Dosis bezieht sich auf die bioverfügbare Dosis nach der Gabe eines Stoffes, wie z. B. eines hierein definierten β₁-Rezeptorhomologs. Da in den hierin beschriebenen Verfahren die Aufnahme und Metabolisierung des zugeführten Stoffes keine Rolle spielt, entspricht die totale Dosis der totalen effektiven Dosis.
Demzufolge können potenzielle Kandidatenmoleküle mit einer wie hierein beschriebenen transformierten Zell-Linie, die sowohl einen β₁-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP Sensor (chimäres Peptid) stabil exprimiert, in Kontakt gebracht werden und man kann eine entsprechende Reaktion messen (unter anderem eine Dosis-Reaktion) um eine beliebige Wirkung aufzuklären. welche von dem Kandidatenmolekül verursacht wird. Eine solche Reaktion wird am meisten bevorzugt durch Verfahren gemessen, die hierin bereitgestellt sind, und speziell mittels FRET- oder BRET-Technologie.
Innerhalb des Gültigkeitsbereichs der vorliegenden Erfindung liegen auch Verfahren zur Identifizierung, Charakterisierung und zum Screenen von Molekülen, die in der Lage sind, mit dem β₁-adrenergen Rezeptor zu interagieren, welche sogenannte Hochdurchsatz-Screeningverfahren und ähnliche Ansätze umfassen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Spencer, Biotechnol. Bioeng. 61: 61–67 (1998); Oldenburg, Annu. Rep. Med. Chem 33: 301–311 (1998); Milligan, Trends Pharmacol. Sci. 20: 118–124 (1999)), die man mit Platten mit 96 Vertiefungen, 384 Vertiefungen, 1536 Vertiefungen und mit anderen im Handel erhältlichen Platten durchführt. Bei denn Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung, Charakterisierung und/oder zum Screenen von Molekülen, die in der Lage sind, mit dem β₁-adrenergen Rezeptor zu interagieren, können unter anderem wie hierin definierte transformierte Zell-Linie eingesetzt werden, welche sowohl den β₁-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor (chimäres Peptid) stabil exprimiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Screeningverfahren der Erfindung handelt es sich bei der Änderung der Lichtintensität um eine Zunahme oder eine Abnahme des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) oder Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET).
In einer bevorzugten Ausführungsform entsprechen die in den hierin bereitgestellten Verfahren zu messenden Veränderungen der Reaktion oder der Energie einer Zunahme oder einer Abnahme des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET). Beim FRET sind sowohl Donor als auch Akzeptor, d. h. beide dem Nachweis dienenden Teile, Teile von fluoreszierenden Proteinen, und zur Messung von FRET wird das Fusionsprotein mit Energie versorgt, z. B. mit Strahlung, die für die Emission der Resonanzenergie durch den ersten dem Nachweis dienenden Teil geeignet ist.
Die Effizienz von FRET hängt von der Distanz zwischen den zwei fluoreszierenden Partnern ab. Die mathematische Formel, die FRET beschreibt, ist die folgende: E = R₀ ⁶/(R₀ ⁶ + r⁶), wobei E die Effizienz von FRET ist, r die tatsächliche Distanz zwischen den fluoreszierenden Partnern ist und R₀ die Förster-Distanz ist, bei der der FRET 50% des maximalen FRET-Werts beträgt, der für ein vorgegebenes Paar von FRET-Partnern möglich ist. R₀, die experimentell bestimmt werden kann, hängt von der relativen Orientierung zwischen den Fluoreszenz-Partnern (κ), dem Refraktionsindex des Mediums (n), dem Integral der Überlappung der Emission des Donor- mit der Anregung des Akzeptor-Partners (J(λ)) und der Quantenausbeute des Fluoreszenz-Donor-Partners (Q_D) ab (R₀ ⁶ = 8,79 × 10²⁵ [κ²n^–4Q_DJ(λ)] (in cm⁶). Bei klassischen auf FRET basierenden Anwendungen nimmt man an, dass der Orientierungsfaktor κ² gleich 2/3 ist, was der Wert für Donoren und Akzeptoren ist, die vor dem Energietransfer durch Rotationsdiffusion zufallsmäßig verteilt werden (Lakovicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2. Ausg., S. 370). Demnach nimmt man bei einer zufallsmäßigen Rotationdiffusion an, dass die Veränderung des Verhältnisses nur auf eine Veränderung der Distanz zwischen den Chromophoren zurückzuführen ist. Für senkrechte Dipole ist κ² 0.
Demnach kann eine Abnahme des FRET-Signals mit Hilfe der folgenden Gleichung bestimmt werden: r(t) = A × (1 – e^–t/τ), wobei τ die Zeitkonstante (s) ist und A die Signalstärke. Sofern es für die Berechnung von t erforderlich können Agonisten-unabhängige Veränderungen beim FRET subtrahiert, die auf Photobleichung zurückzuführen waren.
Um FRET für den Nachweis von Agonisten, Antagonisten, partiellen Agonisten und partiellen Antagonisten ebenso wie von inversen Agonisten anzuwenden, ist der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage, geeignete Nachweismarkierungen (die vorstehend definiert sind) für die stabil transformierte Zell-Linie der Erfindung auszuwählen, die einen nachweisbaren FRET zeigen sowie eine nachweisbare Veränderung des FRET auf eine Konformationsänderung in ihrer Struktur. Bevorzugt ist die maximale FRET-Effizienz mindestens 5%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am meisten bevorzugt 80% der Energie, die von der ersten Markierung auf die Anregung hin freigesetzt wird. Außerdem ist es notwendig, dass die zwei Nachweismarkierungen eine spektrale Überlappung aufweisen. Je größer die Überlappung des Emissionsspektrums des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors ist, desto höher ist der Wert von R₀. Akzeptoren mit höheren Extinktionskoeffizienten führen zu höheren R₀-Werten. Im Gegensatz dazu sollte die Überlappung in den Anregungsspektren der beiden dem Nachweis dienenden Teile klein genug sein um eine gleichzeitige Anregung des Akzeptor-Chromophors zu verhindern. Ebenso sollten die Spektren der beiden dem Nachweis dienenden Teile nur in einem Maß überlappen, dass eine Unterscheidung zwischen den zwei Emissionssignalen noch möglich ist.
Wie es in den beigefügten Beispielen ausführlich dargestellt ist, handelt es sich in einer besonders bevorzugten Ausführungsform bei dem ersten dem Nachweis dienenden Teil um verstärktes blaugrün fluoreszierendes Protein (eCFP) und bei dem zweiten dem Nachweis dienenden Teil um verstärktes gelb fluoreszierendes Protein (eYFP).
Es ist gezeigt worden, dass CFP und YFP besonders gut für das chimäre Peptid der vorliegenden Erfindung geeignet sind, da sie eine brauchbare Veränderung im FRET zeigen. eCFP und eYFP sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und Nukleinsäuremoleküle, die die entsprechenden codierenden Sequenzen enthalten, sind im Handel erhältlich, z. B. von Clontech.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruhen die hierin bereitgestellten Verfahren auf dem Nachweis von Veränderungen der Reaktion oder der Energie, die eine Zunahme oder eine Abnahme des biolumineszenten Resonanz-Energie-Transfers (BRET) umfassen. Die BRET-Technologie ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt und unter anderem in Angars, Proc Natl Acad Sci USA. 97: 3684–3689 (2000); in Mercier, J. Biol. Chem. 277: 44925–44931 (2002); in Barcock, J. Biol. Chem 278: 3378–3385 (2003) oder in WO 99/66324 beschrieben. Wie hierin vorstehend dargelegt ist, ist ein bevorzugtes biolumineszierendes Protein Renilla-Luciferase, es kann aber auch Glühwürmchen-Luciferase verwendet werden. Als ein bevorzugter fluoreszierendes Proteinteil in dem chimären Peptid der vorliegenden Erfindung, das Renilla-Luciferase als ein erstes Nachweissystem umfasst, kann verstärktes gelb fluoreszierendes Protein oder ein gelb fluoreszierendes Protein verwendet werden.
Gemäß den hierein bereitgestellten Verfahren handelt es sich bei der stabil transformierte Zell-Linie der vorliegenden Erfindung in einer am meisten bevorzugen Ausführungsform um eine HEK293-Zelle, die sowohl den β-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor exprimiert. Es ist zu beachten, dass im Kontext der vorliegenden Erfindung mehrere Kontrollen verwendet werden können, wie hierein vorstehend bereits kurz erörtert worden ist. Man kann zum Beispiel Aktivatoren verwenden, die sicherstellen, dass eine maximale Veränderung der emittierten Energie auftritt, die gemessen werden kann. Demzufolge kann man die Testmoleküle oder Testverbindungen oder Proben, die allein oder in. Kombination mit solchen Molekülen oder Verbindungen vorliegen, in Parallelexperimenten unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie testen, die in der Lage sind, eine unterschiedliche Reaktion auf eine Konformationsänderung hin auszulösen.
Die Erfindung stellt auch eine diagnostische Zusammensetzung bereit, umfassend die stabil transformierte Zell-Linie, das Nukleinsäuremolekül des β₁-adrenergen Rezeptors und des cAMP-Sensors, und den Aktivator (Agonist). Eine solche diagnostische Zusammensetzung ist bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders nützlich.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit, umfassend die stabil transformierte Zell-Linie, das Nukleinsäuremolekül des β₁-adrenergen Rezeptors und des cAMP Sensors, einen Aktivator, sowie Rezeptorhomologe wie sie vorstehend charakerisiert worden sind.
Die Ausführungsformen, die in Zusammenhang mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung offenbart worden sind, gelten mutatis mutandis auch für das Kit der vorliegenden Erfindung.
Vorteilhafterweise umfasst das Kit der vorliegenden Erfindung ferner wahlweise (a) Reaktionspuffer, Aufbewahrungslösungen, Waschlösungen und/oder übrige Reagenzien oder Materialien, die für die Durchführung von wissenschaftlichen, pharmakologischen und Arzneimittel-Screening-Assays oder dergleichen wie hierin beschrieben erforderlich sind. Darüber hinaus können Teile des Kits der Erfindung einzeln in Röhrchen oder Flaschen oder in Kombination in Behälter oder Einheiten mit mehreren Behältern verpackt werden.
Der Kit der vorliegenden Erfindung kann vorteilhafterweise unter anderem dazu verwendet werden, das wie hierin beschriebene Verfahren zum Nachweis vom von über den β₁-adrenergen Rezeptor vermittelten cAMP-Konzentrationen, auf die hierin Bezug genommen wurde, z. B. zum Screenen von Verbindungen, die in der Lage sind, die Bindung des β₁-adrenergen Rezeptors zu aktivieren oder zu hemmen, ebenso wie Screeningverfahren, die in der Lage sind, die Pathogenese und den Verlauf von über den β₁-adrenergen Rezeptor vermittelten Herzkrankheiten zu beobachten. Die Herstellung der Kits folgt bevorzugt Standardprozeduren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Das Kit der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt nützlich in einem wie hierin bereitgestellten Verfahren.
Auf ähnliche Weise werden Kits bereitgestellt, mindestens eine Verbindung der Erfindung umfassen, insbesondere die stabil transformierte Zell-Linie. Zusätzlich können die Kits auch ein oder mehrere hierein beschriebenen β₁-adrenergen Rezeptorhomologe umfassen. Diese Kits wie sie hierein bereitgestellt sind besonders nützlich bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung und insbesondere bei der Bestimmung von Agonisten des β₁-adrenergen Rezeptors in vitro. Diese Kits ebenso wie die hierin bereitgestellten Verfähren sind auch nützlich bei pharmazeutischen Screenings, was auch „Hochdurchsatz”-Screening umfasst. Der technische Vorteil der stabil transformierten Zell-Linie, der Kits und der Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie als funktioneller Biosensor. Demzufolge sind die stabil-transformierte Zell-Linie, die Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in der Grundlagenforschung nützlich, bevorzugt in der biomedizinischen und/oder biochemischen Forschung sowie bei den hierin beschriebenen Verfahren. Die Erfindung ermöglicht auch die Verwendung spezieller Vorrichtungen, die man einsetzen kann um die cAMP-Konzentration in der stabil transformierten Zell-Linie zu verfolgen. Diese Vorrichtungen sind nützlich bei der Messung von cAMP mit Hilfe der chimären Peptide/Konstrukte der Erfindung. Die Vorrichtungen umfassen unter anderen Lichtquellen, Filtersysteme, Systeme zum Nachweis von Licht. insbesondere Emissionsdetektoren.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie in einem der hierin beschriebenen Verfahren.
Die Abbildungen zeigen:
: Vergleich der FRET-Ratio Änderung von transient versus stabil transformierten HEK-293 Zellen nach Applikation eines β-adrenergen Agonisten. HEK-293 Zellen mit stabil integriertem β₁-adrenergen Rezeptor, wurden zur transienten Expression von Epac1-camps mit dem Vektor pcDNA3Epac1-camps bzw. zur stabilen Expression von Epac1-camps mit dem Vektor pCEP4Epac1-camps transfiziert. Die maximale Lichtintensitätsänderung wurde mittels FRET (im Falle der transient transfizierten Zellen 18 Stunden nach Transfektion) mit dem Agonisten Isoprenalin [10 μM] bestimmt. Die Zugabe des Aktivators (Agonisten) führte in transient bzw. stabil transformierten Zellen zu einer Abnahme von FRET-Ratio, was auf eine cAMP-induzierte Konformationsänderung hindeutet, die zu einer Vergrößerung der Distanz zwischen CFP und YFP führte. Nachweisbare FRET-Änderungen wurden in beiden Zell-Linien beobachtet. Der Mittelwert der FRET-Ratio Änderung (Ratio YFP/CFP) betrug bei transient transfizierten Zellen 0,24 mit einer Standardabweichung von 0,15. Im Gegensatz dazu weist die stabil transformierte Zell-Linie einen Mittelwert von 0,16 mit einer Standardabweichung von 0,01. Die Basalwerte jeder Messung wurden als FRET-Ratio auf den Wert 1 normalisiert und die Veränderung der FRET-Ratio in Bezug gesetzt. Die maximale FRET-Ratio Änderung bei Agonistenapplikation wurde bei jeweils n = 8 Messungen verglichen.
: cAMP-Messungen in vitro. Konzentrations-Wirkungs-Kurve der stabil transformierten Zell-Linie, wie hinterlegt mit der Nummer DSM ACC 2985. Die Zell-Linie wurde stabil mit einem Plasmid transfiziert, das einen cAMP-Sensor codiert (EYFP-E157-E316-ECFP). Das Emissionsspektrum wurde wie in beschrieben, nach Zugabe verschiedener Konzentrationen eines Aktivators (Agonisten) aufgenommen. Eine Abnahme der Signalintensität bei 542 nm, verbunden mit einer Zunahme bei 483 nm zeigt den Verlust des FRET-Signals zwischen CFP und YFP. Das Verhältnis des Quotienten der Signalintensität 483 nm und der Signalintensität 543 nm zur Konzentration des Aktivators (Agonisten) konnte in einer Dosis-Wirkungs-Kurve graphisch verfolgt werden. Bei einer Zugabe von 5 μM eines β₁-adrenergen Aktivators/Agonisten (wie z. B. Isoprenalin) weist die stabil transformierte Zell-Linie eine maximale cAMP-Bildung auf. Die mittlere effektive Konzentration (EC₅₀) von Isoprenalin beträgt 0,2 nM, damit ist die Zell-Linie hochsensitiv für intrazelluläre cAMP-Konzentrationsänderungen im physiologischen Bereich. Die maximale Änderung der FRET-Ratio nach Agonistenapplikation wurde auf 100% normalisiert In einem Kontrollexperiment verursachte die Applikation von FRET-Puffer (50 μl) in Abwesenheit eines Aktivators/Agonisten (wie z. B. Isoprenalin) des β₁-adrenergen Rezeptors keine Änderung der FRET-Ratio (0%).
: Messung des cAMP-Gehaltes in den stabil transformierten Zellen (wie z. B. DSM-ACC 2985) mittels anti-β₁-Antikörpern aus DCM-erkrankten Ratten, die aus mit dem GST/β₁-EC_II-Konstrukt (Jahrs, Eur. J. Pharmacol (1996)) immunisiert wurden. Der Basalwert der FRET Ratio wurde auf den Wert 1 normalisiert. Die anti-β₁-Antikörpervermittelte Reaktion der Zellen betrug 16,9% der maximalen Isoprenalin-induzierten Aktivierung. Der verwendete Caprylsäure-gefällte und über Nacht mittels FRET-Puffer dialysierte anti-β₁-Antikörper wurde in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml eingesetzt, die Endkonzentration des Aktivators betrug 5 μM.
: Kontroll-cAMP-Messung unter Verwendung einer Antikörperpräparation einer NaCl-injizierten Ratte. Der Basalwert der FRET Ratio wurde auf den Wert 1 normalisiert. Die Versuchsbedingungen der FRET-Messung waren identisch zu denjenigen der Messung von anti-β₁-Antikörpern aus positiven Rattenseren (siehe ).
: Messung des cAMP-Gehaltes unter Verwendung eines monoklonalen murinen anti-β₁-Antikörpers. Der Basalwert der FRET Ratio wurden auf den Wert 1 normalisiert. Die anti-β₁-Antikörper vermittelte Reaktion der Zellen betrug 38,2% der maximalen Isoprenalininduzierten Aktivierung. Der verwendete dialysierte Zellkulturüberstand der Hybridomazellen wurde in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml eingesetzt Die Endkonzentration des verwendeten Aktivators (Isoprenalin) betrug 2,5 μM.
: Messung des cAMP-Gehaltes unter Verwendung von anti-β₁-Autoantikörper. Die verwendeten anti-β₁ Autoantikörper wurden aus dem Serum an DCM-erkrankten Patienten mittels Caprylsäure-Fällung (siehe Beispiel 7) isoliert. Der Basalwert der FRET-Ratio ist auf den Wert 1 normalisiert. Die anti-β₁-Autoantikörper vermittelte Reaktion der Zellen beträgt 26,8% der maximalen Isoprenalin-induzierten Aktivierung. Der verwendete dialysierte anti-β₁-Autoantikörper wurde in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml eingesetzt. Die Endkonzentration des Aktivators (Isoprenalin) betrug 2,5 μM.
: Fluoreszenzmessungen der Emissionen der Einzelkanäle (eCFP, Wellenlänge = 483 nm, durchgezogener Graph; eYFP, Wellenlänge = 542 nm, gestrichelter Graph) einer cAMP-Messung unter Verwendung eines anti-β₁-Autoantikörper eines an DCM-erkrankten Patienten ( ). Der humane anti-β₁-Autoantikörper bewirkte eine Reduktion der eYFP-Emissionsintensität bei einem parallelen Anstieg der eCFP-Emissionsintensität. Aus den abgebildeten Emissionsintensitäten der Einzelkanäle errechnet sich die FRET-Ratio (siehe ).
: Vergleich einer cAMP-Messung unter Verwendung von anti-β₁-Autoantikörper eines an DCM erkrankten Patienten, in Abwesenheit (durchgehende Linie) bzw. Anwesenheit (gestrichelte Linie) eines Zyklopeptids. Caprylsäure-gefällte und dialysierte anti-β₁-Autoantikörper sind wurden in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml über einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C unter Schütteln in FRET-Puffer in 40fach molarem Überschuss mit dem Zyklopeptid [cyclo(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly)] inkubiert. Die maximale Reaktion der Zellen auf Isoprenalin wurde auf 100% normalisiert. Die unblockierten, d. h. in Abwesenheit des Zyklopeptids inkubierten anti-β₁-Autoantikörperweisen im Vergleich zur Maximalantwort 10,2% Aktivierung auf, wohingegen die blockierten, d. h. in Gegenwart des Zyklopeptids inkubierten anti-β₁-Autoantikörper der Patientin keine Aktivierung zeigen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1: Konstruktion der verwendeten Vektoren
A) Konstruktion des zur transienten Transformation verwendeten pcDNA3-Vektors
Das DNA-Konstrukt pcDNA3-Epac1, das zur transienten Transformation des cAMP-Sensors in HEK-293 Zellen, die den β₁-adrenergen Rezeptor stabil exprimieren, wurde in einer mehreren Stufen umfassenden Klonierungsstrategie hergestellt. Für die Klonierung des neuen Vektors wurde der Expressionsvektor pcDNA3 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ApaI verdaut. Parallel dazu wurde die cDNA, welche die fluoreszierenden Markierungen codieren, mittels PCR unter Verwendung der jeweiligen Primer
aus den Plasmiden pEYFP und pECFP (Clontech) reamplifiziert und für den späteren Restriktionsverdau mit den Schnittstellen XbaI, NotI und XhoI (eCFP) bzw. HindIII und EcoRI (eYFP) versehen. Die Sequenzen wurden anschließend über die Restriktionsschnittstellen in den Vektor pcDNA3 cloniert. Der neue Vektor wurde mit dem Namen pcDNA3-camps bezeichnet. Parallel dazu wurde die cDNA von menschlichem Epac1 wurde unter der Verwendung nachstehender Primer mittels PCR amplifiziert
und für den späteren Restriktionsverdau mit den Restriktionsschnittellen EcoRI und XbaI versehen. Anschließend werden die Fragmente über die angegebenen Restriktionsschnittstellen in den zuvor konstruierten Vektor pcDNA3 cloniert. Der so konstruierte Vektor wurde mit dem Namen pcDNA3-Epac1 bezeichnet.
B) Konstruktion des zur stabilen Transformation verwendeten pCEP4 Vektors
Zur Herstellung des DNA-Konstrukts pCEP4-Epac1-camps, das zur stabilen Transformation des cAMP-Sensors in HEK-293 Zellen, die den β₁-adrenergen Rezeptor stabil exprimieren, verwendet wurde, wurden die Sequenzen für die cAMP-Bindungsdomänen mit denen von eYFP und eCFP aus dem Vektor pcDNA3-Epac1 mit den Restriktionsenzymen HindIII und XhoI cloniert.
Beispiel 2: Kultivierung der stabil transformierten Zell-Linie DSM ACC 2985
Man kultivierte HEK293-Zellen, die stabil den β₁-adrenergen Rezeptor exprimierten in DMEM mit 4,5 g/L Glucose, 10% fötalem Kälberserum, 200000 U/L Penicillin, 200 mg/L Streptomycin, 2 mM Glutamin, 440 mg/L G418, transfizierte diese Zellen mit 10 μg DNA für den cAMP-Sensor (pCEP4-Epac1-camps), wobei man die Calciumphosphat-Methode verwendete. Transfizierten Zellen wurden mit Hilfe eines Hämocytometers gezählt und verdünnt, sodass eine Zellkonzentration von 10 Zellen pro ml eingestellt wurde. Die Kultivierung der eingestellten Zellsuspension (100 μl) erfolgte in DMEM mit 4,5 g/L Glucose, 10% fötalem Kälberserum, 200000 U/L Penicillin, 200 mg/L Streptomycin, 2 mM Glutamin, 440 mg/L G418 und 50 mg/L Hygromycin bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 7% CO₂ in einer 96-Well-Platte. Transfizierte Zellen wurden nach zehn Tagen fluoreszenzmikroskopisch analysiert, wobei jede Zellkolonie eines Wells für die fluoreszenzmikroskopischen Messungen auf einer 96-Well-Platte ausplattiert wurde. Bei der fluorimetrischen Analyse wurde die FRET-Emission wie in Beispiel 4 und 7 beschrieben vermessen und sowohl der Einfluss eines Agonisten (Isoprenalin), als auch auf einen murinen β₁-adrenergen Antikörper (GST/EC_II) in der Endkonzentration von 0,26 mg pro ml analysiert. Eine auf diese Weise untersuchte Zell-Linie wurde mit der Nummer DSM ACC 2985 als biologisches Material bei der DSMZ hinterlegt.
Beispiel 3: FRET-Messungen und Bildgebung von Zellen
Für fluoreszensmikroskopische Messungen wurden die Zellen in einen Puffer der 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.33 enthielt, in eine Testkammer überführt. Die Testkammer war in einem Zeiss Axiovert 200 Umkehrmikroskop, das mit einem 10 × Olympus air-Objektiv, einem photometrischen System mit zweifacher Emission (Till Photonics), und einer Interline „IMAGO Type QE”-CCD-Kamera ausgestattet war. Die Proben wurden mit Licht der Wellenlänge 436 nm von einem Polychrom IV (Till Photonics) angeregt. Die FRET-Ratio wurde mit Hilfe der Software MetaFluor 5.0r6 (Universal Imaging Corp.), als das Verhältnis der Emission bei 535 ± 15 nm und 480 ± 20 nm nach Anregung bei 436 ± 10 nm hin verfolgt. Die Bilddaten wurden mit der Software Till Vision analysiert und für Überstrahlung von CFP in den 535 nm – Kanal ebenso wie für Photobleichung des Akzeptors korrigiert, um ein korrigiertes Verhältnis F 535 nm/F 480 nm zu erhalten. Für die Messung der durch Aktivatoren (Agonisten) induzierte Veränderungen des FRET zu untersuchen, wurden die Zellen permanent mit Messpuffer und Aktivatoren (Agonisten) umspült.
Beispiel 4: FRET-Messung in vitro
Die stabil transformierte Zell-Line DSM ACC 2985, wurde bei 37°C zu einer Dichte von mindestens 80% Konfluenz auf Poly-D-Lysin gecoatete 96-Well-Platten mit mikroskopie-geeignetem Folienboden ausgebracht und zwölf Stunden in DMEM mit 4,5 g/L Glucose, 10% fötalem Kälberserum, 200000 U/L Penicillin, 200 mg/L Streptomycin, 2 mM Glutamin, 440 mg/L G418 und 50 mg/L Hygromycin bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 7% CO2 inkubiert. Zur fluorimetrischen Analyse wurden die Wells zweimal mit 100 l FRET-Puffer, der 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.33 enthielt, gespült und für 10 min inkubiert. Nach dieser 10 minütigen Inkubation wurden bei 37°C die Fluoreszenzemissionsspektren des Überstands (Anregung bei 436 nm, Emissionsbereich 460 bis 550 nm) aufgenommen.
Beispiel 5: Messung des cAMP-Gehalts
Messungen von cAMP-Gehalts können mit Hilfe eines optischen Verfahrens durchgeführt werden, das auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) zwischen zwei fluoreszierenden Markierungen (z. B. CFP und YFP) basiert, die direkt an eine einzelne cAMP-Bindungsdomäne fusioniert sind. Auf FRET beruhende Messungen von cAMP unter Verwendung der erfingungsgemäß stabilen Zell-Linie, welche mit der Nummer DSM ACC 2985 hinterlegt ist, sind aufgrund einer Konformationsänerung in der cAMP-Bindungsdomäne möglich, was zu einer Vergrößerung der Distanz zwischen beiden fluoreszierenden Markierungen führt. Diese Distanzvergrößerung hat eine Abnahme von FRET zur Folge. Eine Abnahme von FRET wird als eine Vergößerung des Intensitatsverhältnises der Emission von eYFP zu eCFP, das heißt der FRET-Ratio gemessen. Folglich führt die Bindung von cAMPan den cAMP-Sensor zu einer Verringerung der Intensität von YFP bei einer gleichzeitigen Zunahme von CFP, was sich in einer Verringerung des Intensitätsverhältnisses von YFP zu CFP wiederspiegelt. Somit lässt sich unter Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie DSM ACC 2985 mit einem cAMP-Sensor, der auf einer einzelnen cAMP-Bindungsdomänen basiert (die nur eine cAMP-Bindestelle umfassen), der intrazelluläre cAMP-Gehalt in einem physiologischen Bereich zwischen 0 und 200 μM messen.
Beispiel 6: Präparation von ImmunglobulinG (IgG) aus humanem Serum
Die Immunglobulin-Präparation erfolgte aus humanem Serum von Probanden, die an einer Herz-Krankheit leiden, welche durch idiopathische dilatative Kardiomyopathie vermittelt wird. Hierbei betrug die Ejektionsfraktion der als DCM-Patienten charakterisierten Patientengruppe < 40%. Ebenso wurden Ischämie und Erkrankungen der Koronargefäße, Alkoholmissbrauch sowie andere toxische Einflüsse ausgeschlossen (Jahrs, Circulation. 99: 649–654 (1999)). Ferner wurde ImmungloubinG aus Ratten, die gegen die zweite extrazelluläre Domäne des humanen β₁-adrenergen Rezeptors unter Verwendung des GST/beta1-ECII-Fusionproteins immunisiert wurden, gewonnen. Die Präparation der ImmunglobulinG-Fraktion aus humanem Serum erfolgte mittels der Caprylsäure-Fällung. Hierzu wurde ein Volumenanteil Serum mit zwei Volumenanteilen 60 mM Natriumacetat (pH 4,0) versetzt, wobei tropfenweise unter Rühren 0,07 Volumenenteile Caprylsäure zugegeben wurden. Anschließend wurde der Ansatz 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert und dann bei 4°C und 5000 g für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Hilfe einer 14000 MWCO Dialysemembran gegen 5 L FRET-Puffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, pH 7,33) dialysiert und als Testsubstanz in einer Konzentration von 0,26 mg pro ml.
Beispiel 7: Herstellung monoklonaler Antikörper mittels Hybridomazellen
Zellkulturüberständen der Hybridomazellen zur Produktion monoklonaler Antikörper wurden nicht mit Caprylsäure gefällt, sondern direkt dialysiert. Für die Generierung der Hybridomazellen wurde die Myelomzell-Linie SP2/0-Ag14, bezogen von der Deutschen - Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, verwendet. Zur Herstellung der monoklonalen Antikörper wurden Milzzellen von den mit dem Fusionsprotein GST/b_IEC_IIE3 (SEQ ID: ADEARRCYNDPKCSDFVQ), immunisierten Mäusen mit den Meyelomzellen SP2/0-Ag14 nach Standardbedingungen fusioniert und kultiviert.
Beispiel 8: Verwendung der stabil transformierten Zell-Linie DSM ACC 2985
Messungen von cAMP mittels der erfindungsgemäß, stabil transformierten Zell-Linie DSM ACC 2985 eignet sich zur Anwendung bei biologisch, pharmakologisch und Antikörper relevantem Screening von β₁-adrenerg vermittelten Krankheiten (wie z. B. idiopathische dilatative Kardiomyopathie). Hierfür wurde zunächst über einen Zeitraum von vier Minuten die FRET-Emission in Abwesenheit der zu testenden Verbindung visualisiert. Anschließend wurden die in den Beispielen 6 und 7 beschriebenen Antikörperpräparationen in einer Endkonzentration von 0,26 mg pro ml appliziert und der Verlauf des Emissionsprofils wurde über einen Zeitraum von 22 Minuten graphisch verfolgt. Um relative Aussagen über den cAMP-Gehalt treffen zu können, wurde zum Ende einer jeden Messung ein Aktivator (z. B. Isoprenalin) in einer Endkonzentration von 2.5 μM appliziert, um die maximal β₁-adrenerg vermittelten FRET-Emission über einen Zeitraum von sechs Minuten bestimmen zu können. In einer weiteren Andwendungsform wurden Caprylsäure-gefällte und dialysierte anti-β₁-Autoantikörper eines an DCM erkrankten Patienten in einer Endkonzentration von 0.26 mg pro ml für einen Zeitraum von 12 Stunden bei 4°C unter Schütteln in FRET-Puffer bei einem 40-fachen Überschuss von dem Zyklopeptid (cyclo(Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Abu-Asp-Phe-Val-Thr-Gly) inkubiert und anschließend, wie oben beschrieben, der Verlauf des Emissionsprofils über einen Zeitraum von 22 Minuten graphisch verfolgt. Um relative Aussagen über den cAMP-Gehalt treffen zu können, wurde zum Ende einer jeden Messung ein Aktivator (z. B. Isoprenalin) in einer Endkonzentration von 2,5 μM appliziert, um die maximal β₁-adrenerg vermittelte FRET Emission über einen Zeitraum von sechs Minuten bestimmen zu können ( ). Sequenzprotokoll

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Zell-Linie, die sowohl einen β1-adrenergen Rezeptor als auch einen cAMP-Sensor stabil exprimiert.
Stabile Zell-Linie nach Anspruch 1, wobei der cAMP-Sensor als chimäres Peptid umfasst: (a) eine cAMP Bindeeinheit mit mindestens einer cAMP-Bindestelle, und (b) mindestens eine nachweisbare Markierung, wobei die nachweisbare Markierung am Carboxy-Terminus oder am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit von (a) lokalisiert ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der cAMP-Sensor als chimäres Peptid umfasst: (a) eine cAMP-Bindeeinheit mit mindestens einer cAMP-Bindestelle, und (b) mindestens zwei nachweisbare Markierungen, wobei eine erste der zwei nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus und eine zweite der zwei nachweisbaren Markierungen am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit von (a) lokalisiert ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der cAMP-Sensor als chimäres Peptid umfasst: (a) eine cAMP Bindeeinheit mit nur einer cAMP-Bindestelle, und (b) mindestens zwei nachweisbare Markierungen, wobei eine erste der zwei nachweisbaren Markierungen am Carboxy-Terminus und eine zweite der zwei nachweisbaren Markierungen am Amino-Terminus der cAMP-Bindeeinheit von (a) lokalisiert ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit cAMP mit hoher Affinität bindet.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die cAMP-Bindestelle der cAMP-Bindeeinheit mit einem K_D-Wert von 1 μM bis 50 μM bindet.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die cAMP-Bindeeinheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der regulatorischen Untereinheit (R), einer cAMP-abhängigen Proteinkinase, dem Guanin-Nukleotidaustauschfaktor, dem katabolischen Gen-Aktivatorprotein, dem cAMP-vermittelten Innenkanal, der Neuropathie-Ziel-Esterase (NTE) und dem cAMP Rezeptor.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die cAMP-Bindeeinheit aus PKA, Epac1, Epac2, HCN2-Ionenkanal, katabolischem Gen-Aktivatorprotein von E. coli oder dem cAMP Rezeptor von Dictyostelium ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei PKA, Epac1, Epac2 oder der HCN2-Ionenkanal menschlichem oder murinem Ursprung ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die nachweisbaren Markierungen fluoreszierende Markierungen oder biolumineszierende Markierungen sind.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die fluoreszierenden Markierungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus GFP, YFP, CFP, BFP, Cytrin, Saphir und dsRed, FIAsh, ReAsH, oder wobei die biolumineszierenden Markierungen Luciferase (insbesondere Renilla-Luciferase oder Glühwürmchen-Luciferase) ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die cAMP-Bindeeinheit ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus: (a) einer cAMP-Bindeeinheit eines Polypeptides wie dargestellt in SEQ ID NO: 1; und (b) einer cAMP-Bindeeinheit, die zumindest zu 70% mit der cAMP-Bindeeinheit von (a) identisch ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der cAMP-Sensor als chimäres Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem chimären Peptid, das von einem Nukleinsäuremolekül wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 codiert; (b) einem chimären Peptid, das von einer Aminosäuresequenz wie dargestellt in einem der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 7; (c) einem chimären Peptid, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polypeptid codiert, das zumindest zu 70% identisch ist mit einem Polypeptid wie definiert in (a) oder (b) und zur direkten Bestimmung der cAMP Konzentration verwendet werden kann; (d) einem chimären Peptid, das eine Aminosäuresequenz, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das eine Aminosäuresequenz codiert wie hinterlegt mit der Nummer DSM ACC 2985; und (e) einem chimären Peptid, das durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, das zu einer DNA-Sequenz, wie definiert in (a) und (c) degeneriert ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der β1-adrenerge Rezeptor von Mensch-, Maus- oder Ratten-Ursprung ist.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der β1-adrenerge Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz die durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, wie dargestellt in SEQ ID NO: 4; (b) einem Polypeptid das die Aminosäuresequenz hat, wie dargestellt in SEQ ID NO: 5 (c) einem Polypeptid, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, wie dargestellt in SEQ ID NO: 5 (d) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch ein Nukleinsäuremolekül codiert wird, das unter stringenten Bedingungen zu dem komplementären Strang der Nukleinsäure, wie definiert in (a) oder (c) hybridisiert, wobei dieses Nukleinsäuremolekül einen β1-adrenergen Rezeptor oder ein funktionelles Fragment davon codiert; (e) einem Polypeptid, die von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das eine Aminosäuresequenz codiert, das zumindest zu 70% identisch ist mit einem Polypeptid wie definiert in (a) bis (d) und ein β1-adrenerger Rezeptor ist; (f) einem Polypeptid gemäß (a) bis (e), wobei zumindest eine Aminosäure deletiert, ausgetauscht, eingefügt oder hinzugefügt, wobei das Polypeptid oder ein funktionelles Fragment davon ein β1-adrenerger Rezeptor ist; (g) einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleinsäure codiert wird, die zu einer Nukleinsäuresequenz wie definiert in (a), (c) und (d) degeneriert ist. (h) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, das von einem Nukleinsäuremolekül codiert wird, das eine Aminosäuresequenz codiert wie hinterlegt mit der Nummer DSM ACC 2985.
Verwendung der stabilen Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur direkten Bestimmung der cAMP Konzentration in vitro.
Stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Zell-Linie aus einer Säugetierzelle, einer Amphibienzelle, einer Fischzelle, einer Insektenzelle, einer Pilzzelle, einer Pflanzenzelle oder einer Bakterienzelle oder einem transgenen nicht-menschlichen Tier stammt.
Stabile Zell-Linie oder Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Säugetierzelle eine CHO-, DU 249-, HEK 293-, HeLa-, Cos 7-, B35-, CHW-, BHK-21-, HUVEC-, MyEnd, HL-1, PC12-Zelle oder NIH3T3 ist.
Stabile Zell-Linie oder Verwendung nach Anspruch 18, wobei die mit der Nummer DSM ACC 2985 hinterlegte Zelle eine Säugetierzelle HEK 293 ist.
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von cAMP unter Verwendung der stabilen Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15, 17 bis 19, umfassend das Messen/Erfassen des FRET- oder BRET-Signals und das Bestimmen der cAMP-Konzentration durch Vergleichen der Werte der Fluoreszenzemmission mit einer Standardkurve.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Standardkurve mit einem Aktivator (Agonist) gegen den β1-adrenergen Rezeptor erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Aktivator (Agonist) ein Katecholamin ist.
Das Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Katecholamin Noradrenalin, Adrenalin, Isoprenalin, Denopamin oder Dobutamin umfasst.
Verfahren zum Identifizieren von Molekülen oder Substanzen, die an β1-adrenerge Rezeptoren binden, umfassend die Schritte: (a) das Inkontaktbringen der Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15 mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en); und (b) das Messen inwieweit das (die) zu testende(n) Molekül(en) oder Verbindung(en) zu einer Änderung der Lichtintensität führt (führen), die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 13 umfasst ist.
Verfahren zum Screenen von Molekülen oder Substanzen, die Aktivatoren (Agonisten) oder Inhibitoren (Antagonisten) eines β1-adrenergen Rezeptors sind, umfassend die Schritte: (a) das Inkontaktbringen der Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15 mit (einem/einer) zu testenden Molekül(en) oder Verbindung(en); (b) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 13 umfasst ist; und (c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en) gemessen wurde.
Verfahren zur Diagnosestellung einer β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit, umfassend die Schritte: (a) das Inkontaktbringen der Zell-Linie nach einem Ansprüche 1 bis 15 mit einem zu testenden Molekül oder zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial eines Patienten; (b) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP Sensor als chimäres Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 13 umfasst ist; und (c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en) gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in Zellen der stabil transformierten Zell-Linie als Reaktion auf das Probenmaterial, im Vergleich zur Standardkurve hindeutet, dass der Patient an einer β1-adrenergen Rezeptorvermittelten Krankheit leidet.
Verfahren zum Verlauf einer β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit über Zeitraum von mindestens 3 Monaten, unter der Verwendung der stabilen Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15, umfassend die Schritte: (a) das Inkontaktbringen der Zell-Linie mit einem zu testenden Molekül oder zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial eines Patienten; (b) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 13 umfasst ist; und (c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesenheit eines des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en) gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in Zellen der stabil transformierten Zell-Linie als Reaktion auf das Probenmaterial, im Vergleich zur Standardkurve hindeutet, dass der Patient an einer β1-adrenergen Rezeptorvermittelten Krankheit leidet, und wobei der Gehalt an cAMP longitudinal gemessen wird.
Verfahren zur Beurteilung einer gewählten Dosis von β1-adrenergen Rezeptorhomologen bei der Behandlung einer β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit unter der Verwendung der stabilen Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend die Schritte: (a) das Inkontaktbringen der Zell-Linie mit einem zu testenden Molekül oder zu testenden Verbindung aus dem Probenmaterial eines Patienten; (b) das Messen und/oder Nachweisen einer Änderung der Lichtintensität, die durch die nachweisbare Markierung emittiert wird, die von dem cAMP-Sensor als chimäres Peptid wie definiert in einem der Ansprüche 2 bis 13 umfasst ist; und (c) das Vergleichen der Änderung der Lichtintensität mit einer Standardkurve, wie sie in Abwesentheit eines des/der Kandidatenmoleküls(e)/Verbindung(en) gemessen wurde, wobei ein erhöhter Gehalt an cAMP in den Zellen der stabil transformierten Zell-Linie als Reaktion auf das Probenmaterial, im Vergleich zur Standardkurve hindeutet, dass die gewählte Dosis zur Behandlung einer β1-adrenergen Rezeptor-vermittelten Krankheit nicht ausreichend ist, und wobei die Dosis so gewählt sein sollte, dass kein erhöhter Gehalt der cAMP-Konzentration in den Zellen der erfindungsgemäßen Zell-Linie im Vergleich zur Standardkurve nachweisbar ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die β1-adrenergen Rezeptorhomologe ausgewählt sind aus der Gruppe von Zyklopeptiden und β1-Rezeptorblockern.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die β1-Rezeptorblocker ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Atenolol, Metoprolol, Nebivolol, Bisoprolol, Oxyprenolol, Bupranolol, Betaxolol, Pentubolol, Pindolol, Bisoprolol, Acebutalol, Metipranolol, Carteolol, Celiprolol, Esmolol, Timolol, Levobunolol, Propanolol, Talinolol, Alprenolol, Sotalol, Cartesolol, Carvedilol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei die Probe Blut, Plasma oder Serum umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei eine vom β1-adrenergen Rezeptor-vermittelte Krankheit ausgewählt aus der Gruppe von Herzkrankheiten ist, umfassend infektiöse und nicht-infektiöse Herzkrankheiten, ischämische und nicht-ischämische Herzkrankheiten, inflammatorische Herzkrankheiten und Myocarditis, Herzdilatation, idiopathische Kardiomyopathie, idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM), immunologische-Kardiomyopathie, und jede Herzrhythmusstörung einschließlich ventrikulärer und supraventrikulärer Extrasystolen, sowie atrialer Rhythmusstörungen einschließlich Vorhofflimmern und Vorhofflattern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei das zu testende Molekül oder die zu testende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Proteinen, Proteinfragmenten, Peptiden, Aminosäuren und/oder Derivaten davon.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das zu testende Molekül oder die zu testende Verbindung vorzugsweise Antikörper sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 34, wobei das Verfahren ein FRET-basiertes Detektionssystem ist.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend die stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und den Aktivator (Agonist) nach einem der Ansprüche 21 bis 23.
Kit, umfassend die stabile Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
Kit nach Anspruch 37, ferner umfassend einen Aktivator (Agonist) nach einem der Ansprüche 21 bis 23 und die β1-adrenergen Rezeptorhomologe nach Anspruch 29 oder 30.
Verwendung der stabilen Zell-Linie nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 24 bis 28.