JP2002531146A

JP2002531146A - Ａｎｔｈｏｚｏａ綱の非生物発光性種由来の蛍光タンパク質、そのようなタンパク質をコードする遺伝子、およびそれらの使用

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Publication number: JP2002531146A
Application number: JP2000586958A
Authority: JP
Inventors: セルゲイアナトリエビッチルキャム，; アルカディフェドロビッチフラドコフ，; マーリイアレクサンドロビッチラバス，; ミハイルウラディミロビッチマッツ，
Original assignee: クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2002-09-24
Anticipated expiration: 2019-12-10
Also published as: EP1135532A1; WO2000034320A1; WO2000034526A1; JP2016165299A; ATE502116T1; EP1135532A4; WO2000034319A1; ES2361971T3; DE69943286D1; EP1135532B1; JP4618891B2; JP5963391B2; JP2010268798A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ａｎｔｈｏｚｏａ綱由来の非生物発光生物由来の新規な蛍光タンパク質（具体的には、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質）に関する。その蛍光タンパク質をコードする核酸配列を同定する方法、さらにそのタンパク質を分析する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、新規な蛍
光タンパク質、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法、および
それらの使用に関する。

【０００２】（関連技術の説明）蛍光標識は、目的のタンパク質、細胞、または生物を標識するための特に有用
なツールである。伝統的に、目的のタンパク質は精製され、次いで蛍光団誘導体
に共有結合的に結合体化される。インビボ研究のために、次いで、タンパク質−
色素複合体が、マイクロピペッティングまたは可逆的透過化処理の方法を使用し
て、目的の細胞に挿入される。しかし、色素吸着工程および色素挿入工程は、プ
ロセスを、骨が折れかつ制御することが困難にする。目的のタンパク質を標識す
る代替的な方法は、目的のタンパク質を発現する遺伝子を、マーカーを発現する
遺伝子に連結または融合させ、次いで融合産物を発現することである。タンパク
質標識のこの方法のための代表的なマーカーは、β−ガラクトシダーゼ、ホタル
ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼである。しかし、これらのマーカーは
、外因性の基質または補因子を必要とし、従ってインビボ研究のためには用途が
限定される。

【０００３】外因性補因子または基質を必要としないマーカーは、クラゲであるＡｅｑｕｏ
ｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、このタ
ンパク質は、３９５ｎｍに最大励起を有し、４７５ｎｍに第２の励起ピークおよ
び５１０ｎｍに最大発光を有する。ＧＦＰは、２３８アミノ酸タンパク質であり
、アミノ酸６５〜６７が発色団の形成に関与する。

【０００４】遺伝子発現およびタンパク質局在の研究のためのＧＦＰの使用は、Ｃｈａｌｆ
ｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３（１９９４）、８０２−８０５頁、およびＨｅ
ｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（１９９４）、１２５０
１−１２５０４によって詳細に議論される。さらに、Ｒｉｚｚｕｔｏら、Ｃｕｒ
ｒ．Ｂｉｏｌｏｇｙ５（１９９５）、６３５−６４２は、細胞中で細胞内オル
ガネラを可視化するためのツールとしての野生型ＧＦＰの使用を議論するが、一
方ＫａｅｔｈｅｒおよびＧｅｒｄｅｓ、ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓ３６９（１
９９５）、２６７−２７１は、野生型ＧＦＰを使用して、分泌経路に沿ったタン
パク質輸送の可視化を報告する。植物細胞におけるＧＦＰの発現は、Ｈｕおよび
Ｃｈｅｎｇ、ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓ３６９（１９９５）、３３１〜３３４
によって議論されるが、一方Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚におけるＧＦＰ発現は、Ｄ
ａｖｉｓら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ１７０（１９９５）、７２６〜７２９に
よって記載される。

【０００５】野生型ＧＦＰおよび変異型ＧＦＰＳ６５Ｔの結晶構造は、ＧＦＰの三次元構
造がバレルに類似することを示す（Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３（１９
９６）１３９２〜１３９５；Ｙａｎｇら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．１４（１９９６）、１２４６−１２５１）。バレルは、コンパクトな構造中の
βシートからなり、ここで、その中心において、発色団を含有するαヘリックス
は、バレルによって遮蔽されている。コンパクトな構造は、ＧＦＰを、多様な条
件下および／または厳しい条件下（例えば、プロテアーゼ処理）で非常に安定に
して、一般に、ＧＦＰを極度に有用なレポーターにする。しかし、ＧＦＰの安定
性は、短期間の事象または反復する事象を決定することについて、ＧＦＰを最適
より下にする。

【０００６】多数の研究が行われており、種々の研究目的のために、ＧＦＰの特性を改善し
、そして、有用かつ最適化されたＧＦＰ試薬を生成する。ＧＦＰの新しいバージ
ョンが開発され（例えば、「ヒト化」されたＧＦＰＤＮＡ）、そのタンパク質
産物が哺乳動物細胞中で合成を増大される（Ｈａａｓら、ＣｕｒｒｅｎｔＢｉ
ｏｌｏｇｙ６（１９９６）３１５〜３２４；Ｙａｎｇら、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２４（１９９６）４５９２〜４５９３）。そのよ
うな１つのヒト化タンパク質は、「増強されたグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦ
Ｐ）」である。ＧＦＰへの他の変異は、ブルー光、シアン光、およびイエロー−
グリーン光放射バージョンを生じた。ＧＦＰの大きな有用性に関わらず、ＧＦＰ
に類似しているかまたは異なる特性を有する他の蛍光タンパク質が、当該分野に
おいて有用である。新規な蛍光タンパク質は、可能な新規な色を生じるか、また
はｐＨ依存性の蛍光を生成する。より大きな励起についての新規なスペクトルお
よびより良好な適合性に基づいて、新規な蛍光タンパク質の他の有用な利点には
、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の可能性を含む。

【０００７】先行技術は、そのＤＮＡコード配列が公知である新規な蛍光タンパク質におい
て不完全である。本発明は、当該分野におけるこの長年にわたる必要性を満足す
る。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄ
ｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およびｄｍ
ＦＰ５９２からなる群より選択される、単離および精製された蛍光タンパク質に
関する。

【０００９】本発明の１つの実施形態において、サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニ
ングする工程を包含する、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方
法が提供され、ここで上記核酸配列は、配列番号３、５、８、１１、１２、およ
び１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコードする。上記核酸
配列の存在は、上記蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。

【００１０】本発明の別の実施形態において、サンプル中の核酸配列の存在をスクリーニン
グする工程を包含する、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法
が提供され、ここで上記核酸配列は、配列番号４、６、７、９、１０、１３、１
５、および１６からなる群より選択されるプライマーとハイブリダイズする。上
記核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する。

【００１１】本発明のさらに別の実施形態において、細胞中で蛍光タンパク質を分析する方
法が提供され、上記方法は、上記細胞中で配列番号５５〜６３からなる群より選
択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する
工程；および上記タンパク質からの蛍光シグナルを測定する工程を包含する。こ
の方法はさらに、上記シグナルに従って上記細胞を分別する工程を包含する。好
ましくは、上記細胞は、蛍光活性化細胞分別法によって分別される。なお好まし
くは、上記核酸配列が、上記蛍光タンパク質に融合された目的のタンパク質をコ
ードする目的の遺伝子を含み、ここで上記目的のタンパク質は上記蛍光タンパク
質と異なる。検出された蛍光シグナルは、上記細胞中の上記目的の遺伝子の存在
を、およびさらに、上記目的のタンパク質の存在を示す。上記蛍光タンパク質の
細胞内局在を同定することによって、上記目的のタンパク質の細胞内局在もまた
、同定される。

【００１２】本発明の他のおよびさらなる局面、特色、および利点は、開示の目的のために
与えられる本発明の現在好ましい実施形態の以下の記載から明白である。

【００１３】（発明の詳細な説明）本明細書において用いる場合、用語「ＧＦＰ」は、Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃ
ｔｏｒｉａ由来の塩基性のグリーン蛍光タンパク質をいう。これには、より大き
い蛍光を提供するかまたは異なる色で蛍光発光するように操作されたＧＦＰの先
行技術のバージョンを含む。ＡｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰの配
列（配列番号５４）は、Ｐｒｅｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ１１１（１９９２）、２
２９〜３３に開示されている。

【００１４】本明細書において用いる場合、用語「ＥＧＦＰ」は、２つのアミノ酸置換を有
するＧＦＰの変異改変体をいう：Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔ（Ｈｅｉｍら、Ｎａｔ
ｕｒｅ３７３（１９９５），６６３〜６６４）。用語「ヒト化」は、ヒト細胞
におけるタンパク質の発現についてコドンを最適化するようにＧＦＰ核酸配列に
作製された変化をいう（Ｙａｎｇら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａ
ｒｃｈ２４（１９９６）、４５９２〜４５９３）。

【００１５】本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術（当業
者の範囲内）が使用され得る。このような技術は、文献中で十分に説明される。
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌ
ｅｓｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１
９８２）；「ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈ」第Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；「Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８
４）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．Ｈ
ａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５））；「Ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ
．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔ
ｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚ
ｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，（１９８
６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照のこと。

【００１６】「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンで
ある。ここでは、付着したセグメントの複製をもたらすように、別のＤＮＡセグ
メントが付着され得る。

【００１７】「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかでの、デオ
キシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマ
ー形成をいう。この用語は、この分子の一次構造および二次構造のみをいい、そ
して任意の特定の３次形態に限定しない。従って、この用語は、とりわけ、直線
状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染
色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。

【００１８】ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に配置された場合、インビ
ボで転写されポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は
、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コ
ドンにより決定される。コード配列としては以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、
哺乳動物）ＤＮＡ由来ゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列。ポリアデニル
化シグナルおよび転写終止配列は、コード配列の３’側に位置付けされ得る。

【００１９】本明細書において用いる場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、反対側の
核酸鎖の残基の間の水素結合により安定化された逆平行の二重鎖を形成する２つ
の核酸鎖の会合のプロセスをいう。

【００２０】用語「オリゴヌクレオチド」は、短い（１００塩基長未満）の核酸分子をいう
。

【００２１】本明細書において用いる場合、「ＤＮＡ調節配列」は、プロモーター、エンハ
ンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのような転写制御配列お
よび翻訳制御配列である。これは、宿主細胞中のコード配列の発現を提供し、そ
して／または発現を調節する。

【００２２】「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そして下
流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を
規定する目的のために、このプロモーター配列を、転写開始部位によりその３’
末端で結合し、上記の検出可能バックグラウンドレベルで転写を開始するのに必
要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸長する。
プロモーター配列内に、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因
であるタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは、しばし
ば（ただし常にではない）「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含
む。種々のプロモーター（誘導プロモーターを含む）が、本発明の種々のベクタ
ーを駆動するために用いられ得る。

【００２３】本明細書において用いる場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限
酵素」は、それぞれが特異的ヌクレオチド配列でまたはその近位で二本鎖ＤＮＡ
を切断する細菌酵素をいう。

【００２４】細胞は、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡが細胞の内側に導入された場合、この
ようなＤＮＡにより「形質転換」または「トランスフェクト」されている。形質
転換するＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、または組み込まれな
くても（共有結合）よい。原核生物細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞において
、例えば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームのエレメント上に
維持され得る。真核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転
換ＤＮＡが染色体に組み込まれており、それにより形質転換ＤＮＡが染色体複製
を通じて娘細胞に遺伝される細胞である。この安定性は、この真核生物細胞が形
質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する能力
により実証される。「クローン」は、単一の細胞または有糸分裂による共通の祖
先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代についてインビトロ
で安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。

【００２５】ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、事実上、より大きい分子との会合が見出され
ていない、より大きいＤＮＡ分子内の、同定可能なＤＮＡセグメントである。従
って、この異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、この遺伝子は、供給源
の生物体のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡと、通常隣接す
る。別の実施例では、異種ＤＮＡは、２つの異なる供給源由来の遺伝子の部分が
（融合タンパク質産物を産生するように）一緒にされている構築物中にコード配
列を含む。対立遺伝子改変体または天然に存在する変異事象は、本明細書におい
て規定されるようなＤＮＡの異種領域を生じない。

【００２６】本明細書において用いる場合、用語「レポーター遺伝子」は、異種プロモータ
ーまたはエンハンサーエレメントに結合したコード配列（そしてその産物は、そ
の構築物が組織または細胞中に導入される場合、容易にそして定量的にアッセイ
され得る）をいう。

【００２７】本明細書において記載されるアミノ酸は、「Ｌ」異性体形態であることが好ま
しい。このアミノ酸配列は、１文字コードで与えられる（Ａ：アラニン；Ｃ：シ
ステイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ
：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；
Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アル
ギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：トレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファン；Ｙ：
チロシン；Ｘ：任意の残基）。ＮＨ₂は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する
遊離のアミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する
遊離のカルボキシ基をいう。標準的ポリペプチド命名法に従って、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２４３（１９６９）、３５５２〜５９を用いる。

【００２８】本発明は、ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３８、ｄ
ｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２およびｄｍＦ
Ｐ５９２からなる群より選択される単離かつ精製された蛍光タンパク質に関する
。

【００２９】本発明の１つの実施形態において、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を
同定する方法が提供される。この方法は、サンプル中の核酸配列の存在について
のスクリーニングの工程であって、ここで、この核酸配列は、配列番号３、５、
８、１１、１２および１４からなる群より選択される配列を有するペプチドをコ
ードする工程、を包含する。核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を同定する。

【００３０】本発明の別の実施形態において、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同
定する方法が提供される。この方法は、サンプル中の核酸配列の存在についての
スクリーニングの工程であって、ここで、この核酸配列は、配列番号４、６、７
、９、１０、１３、１５および１６からなる群より選択されるプライマーにハイ
ブリダイズする工程、を包含する。核酸配列の存在は、蛍光タンパク質をコード
するＤＮＡ配列を同定する。

【００３１】本発明のなお別の実施形態において、細胞中の蛍光タンパク質を分析する方法
が提供される。この方法は、細胞中の配列番号５５〜６３からなる群より選択さ
れるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程
；およびこのタンパク質由来の蛍光シグナルを測定する工程、を包含する。この
方法は、さらにシグナルに従って細胞をソートする工程を包含する。好ましくは
、この細胞は蛍光発色セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉ
ｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ：蛍光標示式細胞ソーティング）により
ソートされる。なお好ましくは、この核酸配列は、蛍光タンパク質に融合される
（ここで目的のタンパク質は蛍光タンパク質とは別である）、目的のタンパク質
をコードする目的の遺伝子を含む。検出された蛍光シグナルは、目的の遺伝子、
およびさらに細胞中の目的のタンパク質の存在を示す。蛍光タンパク質の細胞内
位置を同定することにより、目的のタンパク質の細胞内位置がまた同定される。

【００３２】以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的のために与えられ、
そしていかなる様式でも本発明を限定することは意図されない。

【００３３】（実施例１）（生物学的材料）新規な蛍光タンパク質を、Ａｎｔｈｏｚｏａのいくつかの属から同定した。こ
れらの属は、いかなる生物発光も示さないが、通常の白色光または紫外光の下で
観察した場合に、蛍光色を有する。６つの種を選択した（表１を参照のこと）。

【００３４】

【表１】（実施例２）（ｃＤＮＡの調製）全ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎ
ｓｋｉＰ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２（１９８７）、１５６〜１
５９）のプロトコルに従って、目的の種から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳＭ
ＡＲＴＰＣＲｃＤＮＡ合成キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を提供されたプロト
コルに従って使用して、１〜３μｇの全ＲＮＡから開始して合成したが、唯一、
このキット中に提供された「ｃＤＮＡ合成プライマー」をプライマーＴＮ３（５
’−ＣＧＣＡＧＴＣＧＡＣＣＧ（Ｔ）₁₃、配列番号１）（表２）で置き換える変
更を行った。次いで、増幅されたｃＤＮＡサンプルを、提供されたプロトコルに
記載されたように調製したが、ただし、ＰＣＲに使用した２つのプライマーがＴ
Ｓプライマー（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ、配列
番号２）（表２）およびＴＮ３プライマー（表２）であった（ともに、０．１μ
Ｍの濃度）ことが異なる。２０〜２５回のＰＣＲサイクルを実施して、ｃＤＮＡ
サンプルを増幅した。この増幅されたｃＤＮＡを水で２０倍希釈し、そしてこの
希釈物のうちの１μｌを、続く手順にて使用した。

【００３５】（表２）ｃＤＮＡ合成およびＲＡＣＥにて使用したオリゴ

【００３６】

【表２】（実施例３）（オリゴの設計）新規な蛍光タンパク質のｃＤＮＡのフラグメントを単離するために、縮重プラ
イマーを使用するＰＣＲを実施した。縮重プライマーは、蛍光タンパク質のファ
ミリー中で最も変化しないと予測された領域におけるｍＲＮＡの配列と一致する
ように設計した。このような４つのストレッチを選択し（表３）、そして縮重プ
ライマーの変異体を設計した。このようなプライマーはすべて、ｍＲＮＡの３’
末端に関した。すべてのオリゴを、使用前にゲル精製した。表２は、ｃＤＮＡ合
成およびＲＡＣＥにおいて使用したオリゴを示す。

【００３７】（表３）（重要なアミノ酸ストレッチおよび蛍光タンパク質の単離のために使用した対
応縮重プライマー）

【００３８】

【表３】（実施例４）（ｎＦＰの３’−ｃＤＮＡフラグメントの単離）３’−ＲＡＣＥの改変型ストラテジーを使用して、標的フラグメントを単離し
た（図１を参照のこと）。このＲＡＣＥストラテジーは、連続する２つのＰＣＲ
工程を含んだ。第１のＰＣＲ工程は、第１の縮重プライマー（表４）およびｃＤ
ＮＡ合成のために使用されたＴＮ３プライマーと同一の３’部分を有する、Ｔ７
−ＴＮ３プライマー（配列番号１７）（Ｔ７−ＴＮ３の配列については、表２）
を含んだ。このＰＣＲ工程において長い方であるＴ７−ＴＮ３プライマーを置き
換えた理由は、短い方であるＴＮ３プライマーを使用した場合、特にＴ７−ＴＮ
３プライマーを低濃度（０．１μＭ）にて使用した場合に、生じるバックグラウ
ンド増幅が効果的に抑制されたことである（Ｆｒｏｈｍａｎら（１９９８）ＰＮ
ＡＳＵＳＡ、８５、８９９８〜９００２）。第２のＰＣＲ工程は、ＴＮ３プラ
イマー（配列番号１、表２）および第２の縮重プライマー（表４）を含んだ。

【００３９】（表４）（ｎＦＰｃＤＮＡの３’フラグメントの特異的増幅を生じる、第１および第
２のＰＣＲのための縮重プライマーの組み合わせ）

【００４０】

【表４】第１のＰＣＲ反応を、以下のように実施した：増幅されたｃＤＮＡサンプルの
２０倍希釈物１μｌを反応混合物に添加した。この反応混合物は、提供された緩
衝液を含む１× ＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭｄＮＴＰ、０．３μＭの第１の縮
重プライマー（表４）および０．１μＭのＴ７−ＴＮ３（配列番号１７）プライ
マーを、総量２０μｌにて含んでいた。サイクルのプロフィールは、以下の（Ｈ
ｙｂａｉｄＯｍｎｉＧｅｎｅＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロ
ールモード）であった：９５℃で１０秒、５５℃で１分、７２℃で４０秒を１サ
イクル；９５℃で１０秒、６２℃で３０秒、７２℃で４０秒を２４サイクル。次
いで、この反応物を水で２０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを第２
のＰＣＲ反応物に添加した。この第２のＰＣＲ反応物は、製造業者により提供さ
れた緩衝液を含む１× ＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑＰｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅＭｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭｄＮＴＰ、０．３μＭの第
２の縮重プライマー（表４）および０．１μＭのＴＮ３プライマーを含んでいた
。サイクルのプロフィールは、以下の（ＨｙｂａｉｄＯｍｎｉＧｅｎｅＴｈ
ｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０
秒、５５℃（ＧＥＧ／ＧＮＧまたはＰＶＭに関して）または５２℃（ＮＦＰに関
して）で１分、７２℃で４０秒を１サイクル；９５℃で１０秒、６２℃（ＧＥＧ
／ＧＮＧまたはＰＶＭに関して）または５８℃（ＮＦＰに関して）で３０秒、７
２℃で４０秒を１３サイクル。ＰＣＲの産物を、製造業者のプロトコルに従って
、ＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングし
た。

【００４１】縮重プライマーの異なる組み合わせを、各種由来のＤＮＡに対する第１および
第２のＰＣＲ反応において試し続けて、特異的増幅を生じるプライマーの組み合
わせを見出した。この特定の増幅とは、予期されるサイズの顕著なバンド（ＮＧ
ＨおよびＧＥＧ／ＧＮＧについて約６５０〜８００ｂｐ、そしてＮＦＰおよびＰ
ＶＭについて約３５０〜５００ｂｐ（時に、少数の弱いバンドを伴う））が、２
つのＰＣＲ反応後にアガロースゲル上で検出されたことを意味する。Ａｎｔｈｏ
ｚｏａ綱の異なる種についてのプライマーの選り抜きの組み合わせを、表４に列
挙する。プライマーの他のいくつかの組み合わせもまた、正確なサイズのフラグ
メントの増幅を生じたが、これらのフラグメントの配列は、同定された他の蛍光
タンパク質またはＡｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａＧＦＰに対して、相同
性を示さなかった。

【００４２】（実施例５）（全長ｃＤＮＡのコピーの取得）得られた新規な蛍光タンパク質ｃＤＮＡの３’フラグメントを配列決定する際
に、２つの５’指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー
をｃＤＮＡについて合成し（表５）、次いでこのｃＤＮＡの５’末端を、連続す
る２つのＰＣＲを使用して増幅した。その次のＰＣＲ反応において、「ステップ
アウトＰＣＲ」という新規なアプローチを使用して、バックグラウンドの増幅を
抑制した。このステップアウト反応混合物は、製造業者により提供された緩衝液
を用いる１× ＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭｄＮＴＰ、０．２μＭの第１の遺伝
子特異的プライマー（表５を参照のこと）、０．０２μＭのＴ７−ＴＳプライマ
ー（配列番号１８）、０．１μＭのＴ７プライマー（配列番号１９）および増幅
されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを、総容量２０μｌにて含んでい
た。サイクルのプロフィールは、以下の（ＨｙｂａｉｄＯｍｎｉＧｅｎｅＴ
ｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１
０秒、６０℃で３０秒、７２℃で４０秒を２３〜２７サイクル。増幅の産物を水
で５０倍希釈し、そしてこの希釈物のうちの１μｌを、第２の（入れ子）ＰＣＲ
に添加した。この反応は、提供された緩衝液を含む１× Ａｄｖａｎｔａｇｅ
ＫｌｅｎＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００
μＭｄＮＴＰ、０．２μＭの第２の遺伝子特異的プライマーおよび０．１μＭ
のＴＳプライマー（配列番号２）を、総容量２０μｌにて含んでいた。サイクル
のプロフィールは、以下の（ＨｙｂａｉｄＯｍｎｉＧｅｎｅＴｈｅｒｍｏｃ
ｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０℃
で３０秒、７２℃で４０秒を１２サイクル。次いで増幅の産物を、製造業者のプ
ロトコルに従って、ｐＡｔｌａｓベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中にクローニン
グした。

【００４３】（表５）（５’−ＲＡＣＥに使用した遺伝子特異的プライマー）

【００４４】

【表５】（実施例６）（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｎＦＰの発現）新規な蛍光タンパク質発現のためのＤＮＡ構築物を調製するために、以下の２
つのプライマーを各ＤＮＡについて合成した：そのｃＤＮＡの３’−ＵＴＲに位
置するアニーリング部位を有する５’指向性「下流」プライマー、および翻訳開
始部位（最初のＡＴＧコドンを含まない）の部位に対応する３’指向性「上流」
プライマー（表６）。両方のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼについての
部位をコードする５’−ヒール（ｈｅｅｌ）を有した；さらに、この上流プライ
マーは、そのＰＣＲ産物をｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中に、このベク
ターにコードされる６×ＨｉｓタグとｎＦＰのリーディングフレームの融合が生
じるような様式でクローニングすることを可能にするように設計した。ＰＣＲを
以下のように実施した：増幅されたｃＤＮＡサンプルの２０倍希釈物１μｌを反
応混合物に添加した。この反応混合物は、製造業者により提供された緩衝液を含
む１× ＡｄｖａｎｔａｇｅＫｌｅｎＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＭｉｘ
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００μＭｄＮＴＰ、０．２μＭの上流プライマーお
よび０．２μＭの下流プライマーを、最終容量２０μｌにて含んでいた。サイク
ルのプロフィールは、以下の（ＨｙｂａｉｄＯｍｎｉＧｅｎｅＴｈｅｒｍｏ
ｃｙｃｌｅｒ、チューブコントロールモード）であった：９５℃で１０秒、６０
℃で３０秒、７２℃で４０秒を２３〜２７サイクル。この増幅工程の産物を、フ
ェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製し、次いで標準的
プロトコルに従ってこのプライマーの配列に対応する制限エンドヌクレアーゼを
使用して、ｐＱＥ３０ベクター中にクローニングした。

【００４５】すべてのプライマーを、ＸＬ−１ｂｌｕｅＥ．ｃｏｌｉ中にて増幅し、そ
してプラスミドＤＮＡミニプレップキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）によって精製し
た。この組換えクローンを、コロニーの色によって選択し、そして３ｍｌのＬＢ
培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充）中にて３７℃で一晩増殖させた
。この一晩培養物１００μｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新鮮な
ＬＢ培地２００ｍｌに移し、そして３７℃、２００ｒｐｍにて、ＯＤ₆₀₀０．６
〜０．７まで増殖させた。次いで、１ｍＭＩＰＴＧをこの培養物に添加し、そ
してインキュベーションを、３７℃でさらに１６時間進行させた。この細胞を収
集し、そして組換えタンパク質（Ｎ末端に６×Ｈｉｓタグを組み込んでいる）を
、製造業者のプロトコルに従って、ＴＡＬＯＮ^TM金属アフィニティー樹脂（ＣＬ
ＯＮＴＥＣＨ）を使用して精製した。

【００４６】（表６）（発現構築物へとクローニングするためにｎＦＰの全長コード領域を得るため
に使用したプライマー）

【００４７】

【表６】（実施例７）（新規な蛍光タンパク質およびこのタンパク質をコードするｃＤＮＡ）蛍光タンパク質をコードする７つの全長ｃＤＮＡを得（配列番号４５〜５１）
、そして７つの新規な蛍光タンパク質を産生した（配列番号５３〜５９）。これ
らの単離された新規な蛍光タンパク質のスペクトル特性を表７に示し、そしてこ
れらの新規なタンパク質についての発光スペクトルおよび励起スペクトルを、表
３〜１１に示す。

【００４８】（表７）（単離したＮＦＰのスペクトル特性）

【００４９】

【表７】＊相対量子収率は、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａＧＦＰの量子収率と比較して決定し
た。＊＊相対輝度は、励起係数に量子収率を掛けて、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａＧＦＰ
についての量子収率で割ったものである。

【００５０】蛍光タンパク質の多重整列を図２Ａに示す。番号付けは、Ａｅｑｕｏｒｅａ
ｖｉｃｔｏｒｉａのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ、配列番号５４）に基づく
。これらの新規な蛍光タンパク質のアミノ酸配列に、配列番号５５〜６３と名付
ける。Ｚｏａｎｔｈｕｓ由来の２つのタンパク質およびＤｉｓｃｏｓｏｍａ由来
の４つのタンパク質を、互いの間で比較する：このシリーズの第１のタンパク質
中の対応残基と同一である残基を、ダッシュによって示す。導入されたギャップ
を、点によって示す。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａＧＦＰの配列において、βシート
を形成するストレッチに下線を付す：側鎖がこのβ−ｃａｎの内側を形成する残
基に影を付ける。図２Ｂは、ｃＦＰ４８４のＮ末端部分を示す、この部分は、他
のタンパク質との相同性を有さない。推定シグナルペプチドに下線を付す。

【００５１】以下の参考文献を、本明細書中に引用した。１．Ｏｒｍｏら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：１３９２〜１３９５。２．Ｙａｎｇ，Ｆ．ら（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ１４：１２
４６〜１２５１。３．Ｃｏｒｍａｃｋら（１９９６）Ｇｅｎｅ１７３、３３〜３８。４．Ｈａａｓら（１９９６）ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙ６．３１５〜３
２４。５．Ｙａｎｇら（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ
２４、４５９２〜４５９３。６．Ｇｈｏｄａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１８２３〜
１１８２６。７．ＰｒａｓｈｅｒＤ．Ｃ．ら（１９９２）Ｇｅｎｅ１１１：２２９〜３３
。８．Ｋａｉｎら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９（４）６５０〜
５５。９．ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉＰ．ら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１６２、１５６〜１５９。１０．Ｆｒｏｈｍａｎら（１９９８）ＰＮＡＳＵＳＡ、８５、８９９８〜９０
０２。

【００５２】本明細書中で言及されるいずれの特許または刊行物も、本発明が属する分野の
当業者レベルの指標である。これらの特許および刊行物は、各個々の刊行物が参
考として援用されると詳細かつ個別に示されたのと同じ程度に、参考として本明
細書中で援用される。

【００５３】本発明が、言及された対象を実行しそして目的および利益を得るため、ならび
に本発明に固有の対象を実行しそして目的および利益を得るために、十分に適合
されることを、当業者は容易に理解する。これらの実施例は、本明細書中に記載
の方法、手順、処理、分子、および特定の化合物とともに、好ましい実施形態の
現在の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲に対する限定としては意図
されない。特許請求の範囲の範囲によって規定されるような本発明の意図内に包
含される、本発明における変化および他の使用は当業者が思い付く。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、標的フラグメントを単離するために使用される３’−ＲＡＣＥの改変
されたストラテジーを示す。使用されたオリゴヌクレオチドの配列を表２に示す
。Ｄｐ１およびＤｐ２は、第１および第２のＰＣＲにおいてそれぞれ使用された
縮重プライマーである（縮重プライマーの配列については、表３および表４を参
照のこと）。

【図２】図２Ａは、新規な蛍光タンパク質の多重アラインメントを示す。番号付けは、
Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に基づ
く。Ｚｏａｎｔｈｕｓ由来の２つのタンパク質およびＤｉｓｃｏｓｏｍａ由来の
４つのタンパク質を、互いの間で比較する：シリーズの第１のタンパク質中の残
基と一致する残基と同一の残基を、ダッシュで表す。導入したギャップをドット
で表す。Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａＧＦＰの配列において、βシートを形成するス
トレッチに下線を付す；側鎖がβ−ｃａｎの内部を形成する残基に影を付ける（
Ｙａｎｇら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，１２４６−１２５１
（１９９６）に従う）。図２Ｂは、ｃＦＰ４８４のＮ末端部分を示し、これは、
他のタンパク質とは相同性を有さない。推定シグナルペプチドに下線を付す。

【図３】図３は、Ａｎｅｍｏｎｉａｍａｊａｎｏ、ａｍＦＰ４８６由来の新規な蛍光
タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。

【図４】図４は、Ｃｌａｖｕｌａｒｉａ、ｃＦＰ４８４由来の新規な蛍光タンパク質の
励起および発光スペクトルを示す。

【図５】図５は、Ｚｏａｎｔｈｕｓ、ｚＦＰ５０６由来の新規な蛍光タンパク質の励起
および発光スペクトルを示す。

【図６】図６は、Ｚｏａｎｔｈｕｓ、ｚＦＰ５３８由来の新規な蛍光タンパク質の励起
および発光スペクトルを示す。

【図７】図７は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｔｒｉａｔａ、ｄｓＦＰ４８３由来の新規な
蛍光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。

【図８】図８は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｒＦＰ５８３由来の新規な蛍光タンパク質の
励起および発光スペクトルを示す。

【図９】図９は、Ａｎｅｍｏｎｉａｓｕｌｃａｔａ、ａｓＦＰ６００由来の新規な蛍
光タンパク質の励起および発光スペクトルを示す。

【図１０】図１０は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｇＦＰ５１２由来の新規な蛍光タンパク質
の励起および発光スペクトルを示す。

【図１１】図１１は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ、ｄｍＦＰ５９２由来の新規な蛍光タンパク質
の励起および発光スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (72)発明者フラドコフ，アルカディフェドロビッチロシア国 113570，モスクワ， 35／２ −14，ウーリッツァドニエプロペトロフスカヤ (72)発明者ラバス，マーリイアレクサンドロビッチロシア国 117465，モスクワ， 35− 416，ウーリッツァゲネララチュレネバ (72)発明者マッツ，ミハイルウラディミロビッチロシア国 117465，モスクワ， 712− 28，ウーリッツァテプリイスタンＦターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA20 DA06 GA11 GA19 GA27 HA03 4B064 AG01 CA02 CA19 CC01 CC06 CC12 CC24 CE12 DA13 4B065 AA01X AA26X AA58X AA72X AA87X AA90Y AB01 AC14 BA01 BA24 BB01 BC03 BC09 BC26 BD14 CA24 CA46 CA52 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA50 EA50 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然の環境以外において存在する非生物発光性Ａｎｔｈｏｚ
ｏａ蛍光タンパク質。
【請求項２】Ａｎｅｍｏｎｉａｍａｊａｎｏ、Ｃｌａｖｕｌａｒｉａ
ｓｐ．、Ｚｏａｎｔｈｕｓｓｐ．、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ．「ｒｅｄ」、
Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｔｒｉａｔａ、Ａｎｅｍｏｎｉａｓｕｌｃａｔａ、Ｄ
ｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ．「ｍａｇｅｎｔａ」、およびＤｉｓｃｏｓｏｍａｓ
ｐ．「ｇｒｅｅｎ」からなる群より選択される非生物発光性Ａｎｔｈｏｚｏａ種
によって産生される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】ａｍＦＰ４８６、ｃＦＰ４８４、ｚＦＰ５０６、ｚＦＰ５３
８、ｄｓＦＰ４８３、ｄｒＦＰ５８３、ａｓＦＰ６００、ｄｇＦＰ５１２、およ
びｄｍＦＰ５９２からなる群より選択される、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８
；配列番号５９；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２；および配列番号
６３からなる群より選択される配列を有する、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】単離されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタン
パク質。
【請求項６】天然の環境以外において存在する核酸であって、ここで該核
酸は請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質、またはそのフラグメント
をコードするヌクレオチド配列を有する、核酸。
【請求項７】請求項６に記載の核酸のフラグメント。
【請求項８】ベクターおよび請求項６または７に記載の核酸を含む、構築
物。
【請求項９】請求項６または７に記載の核酸で形質転換した細胞、または
その後代。
【請求項１０】請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質を産生す
る方法であって、該方法は以下の工程：該タンパク質を産生するために請求項９に記載の細胞を増殖させる工程、を包含する、方法。
【請求項１１】蛍光タンパク質をコードする核酸を利用する適用であって
、ここで改善点として：請求項６または７に記載の核酸を利用する工程、を包含する、適用。