CN103492577B - 用于动物细胞的表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于动物细胞且具有增强的基因表达能力的表达载体。更具体而言，本发明涉及用于动物细胞的表达载体，其包括作为基因表达增强因子的MAR因子和SAR因子，所述元件位于启动子的5'端或转录终止因子的3'端或者位于启动子的5'端和转录终止因子的3'端上。根据本发明的用于动物细胞的表达载体与传统的用于动物细胞的表达载体相比，呈现显著增加的基因表达能力，因此，可以显著增加外源基因的蛋白表达。特别地，根据本发明的用于动物细胞的表达载体即使没有MTX增强也可以确保获得高表达细胞系，因此非常有用。

Description

用于动物细胞的表达载体
技术领域
本发明涉及用于动物细胞的具有增强的基因表达效率的表达载体。
背景技术
为了获得过表达的靶蛋白，以将获得的靶蛋白用于医学和工业等，使用了多种表达系统，例如，微生物表达系统、植物表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、动物细胞表达系统等等。其中，微生物表达系统是最容易使用的系统，并已发展为适用于多种应用且商业化的表达系统。
然而，微生物表达系统存在多个限制因素。主要的限制因素是，由于微生物的蛋白表达和修饰机理（糖基化、磷酸化、酰胺化）与动物细胞不同，即使在微生物表达系统中表达相同的基因，所表达的蛋白的结构或特性与原始蛋白也不完全相同。因此，在利用微生物表达系统制备重组蛋白质时，由于几乎没有产生合成后修饰，也不产生所制备的蛋白的失活或显著功能差异，但频繁表达修饰的蛋白质或结构上有部分差异的蛋白质。此外，使用微生物表达系统的重组蛋白质制备过程存在困难，因为由于微生物污染、微生物内毒素污染等，需要进行二次污染物的消除过程。
另一方面，虽然动物细胞表达系统是最合适的动物蛋白表达系统，与微生物表达系统相比，动物细胞表达系统由于重组蛋白的表达效率低且动物细胞的操作过程难导致其生产成本高，这使得动物细胞表达不容易工业化。目前使用的工业化的动物细胞系有CHO（Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢）细胞、BHK（Baby Hamster Kidney，幼仓鼠肾）细胞、骨髓瘤（myeloma）细胞等。可以通过在这些动物细胞系中转染包括相应基因的表达载体来表达目标外源蛋白。
在包括糖基化的各种蛋白质修饰机制保留在动物细胞中且蛋白质被分泌到培养基中的情况下，可以容易地进行蛋白质的获得和纯化过程。在培养过程中，大多数动物细胞必然需要如血清蛋白等复合添加物，但由于CHO细胞可以在不添加血清和蛋白的培养基中培养，CHO细胞可以作为最合适的宿主细胞用于重组蛋白表达。此外，由于已经进行了大量关于CHO细胞的研究，CHO细胞具有优势，因此其特性是众所周知的：生长速度快且可以进行用于大规模培养的悬浮培养（suspension culture）。
通常，当使转基因表达于动物细胞时，同时转染（transfection）转基因和具有标记（marker）的载体，在选择性培养基中培养并筛选转染的细胞。然而，在大多数情况下，其表达频率显著的低。其中一个原因是，不同于微生物系统，在动物细胞中，这些转基因应整合到宿主细胞染色体中。而且，即使筛选出转基因稳定地整合到宿主细胞染色体中的稳定转染子（stable transfectants），仍难以预测其表达量。原因是，基因在每个细胞中的整合位点是不同的，并且根据整合位点，其表达模式也不同。因此，转基因的数量和整合到动物细胞中的转基因的表达量二者之间没有明确的相关性(Grindley等人,1987,TrendsGenet.3,16-22;Kucherlapati等人,1984,Crit.Rev.Biochem.16,349-381;Palmiter等人,1986,Annu.Rev.Genet.20,465-499)。在大多数情况下，动物细胞中的基因表达被整合位点周围的DNA碱基所抑制，因此，即使是在稳定整合的转基因（stably integrated transgenes）的情况下，表达也是以显著低的水平表达(Eissenberg等人,1991,Trends Genet.7,335-340;Palmiter等人,1986,Annu.Rev.Genet.20,465-499)。
已经报道了各种系统中用于保护转基因表达免受上述的基因位点特异性影响的可用的DNA因子。对于上述DNA因子，可以使用绝缘子（insulator）因子、核基质附着区（nuclear matrix attachment region，以下，称为“MAR”）、核骨架附着区（scaffold attachmentregion，下文中，简称为“SAR”）等。虽然其作用机制尚未阐明，但当转基因（transgene）构建体中包括DNA因子时，其能诱导基因表达而与整合位点无关，并且基因的拷贝数决定表达量(McKnight,R.A.等人,1992,Proc.Natl.Acad.US.89,6943-6947)。KALOS等人将人载脂蛋白（apolipoprotein）B基因的MAR元件与最小启动子转基因构建体（minimal promoter transgene construct）相结合并在动物细胞中诱导基因表达，使转录物的表达增加约200倍(Kalos等人,1995,Mol.Cell.Biol.15,198-207)。相似地，据报道，鸡溶菌酶（chicken lysozyme）A基因的MAR元件，人干扰素β（interferonβ）的SAR元件等赋予了在脊椎动物中的转基因表达，而与在宿主细胞染色体上的整合位点无关(Eissenberg等人,1991,Trends Genet.7,335-340;Klehr等人,1991,Biochemistry30,1264-1270)。然而，还尚未见到利用如上所述的具体的β球蛋白MAR元件、具体的MAR/SAR元件或者具体的干扰素βSAR元件的组合来尝试大幅提高细胞系中蛋白产量或者确保工业利润的报道。
本背景技术中所公开的信息仅仅是为了改善对本发明背景的理解。因此，本发明不包括本领域所属技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于动物细胞的表达载体，其包括至少一个拷贝的MAR元件和SAR元件，所述元件位于启动子的5'端和/或转录终止位点的3'端，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。
本发明的另一个目的是提供转染了用于动物细胞的表达载体的重组动物细胞。
本发明的再一个目的是提供使用了用于动物细胞的表达载体的靶蛋白制备方法。
根据本发明的一个方面，提供了用于动物细胞的表达载体，其包括至少一个拷贝的MAR元件或SAR元件，所述元件位于启动子的5'端和/或转录终止位点的3'端，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。
根据本发明的另一个方面，提供了用于动物细胞的表达载体，其包括选自由位于启动子的5'端和/或转录终止位点的3'端的至少一个拷贝的β球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件以及干扰素βSAR元件所组成的组中的基因表达增强因子，所有所述基因表达增强因子在表达载体内均有效地相互连接。
根据本发明的另一个方面，提供了用于动物细胞的表达载体，其包括MAR元件以及SAR元件，所述元件是基因表达增强因子，位于启动子的5'端和/或转录终止位点的3'端，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。
根据本发明的另一个方面，提供了用于动物细胞的表达载体，其包括β球蛋白MAR元件以及CSP-B SAR元件，所述元件是基因表达增强因子，位于启动子（此处，启动子是鼠EF1α启动子突变体）的5'端和/或转录终止位点的3'端，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。
根据本发明的另一个方面，提供转化了用于动物细胞的表达载体的重组微生物。
根据本发明的另一个方面，提供转染了用于动物细胞的表达载体的重组动物细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了靶蛋白的生产方法，其特征在于培养重组动物细胞来表达靶蛋白，然后回收表达的靶蛋白。
根据本发明的另一个方面，提供了具有SEQ ID NO.34所示碱基序列的小鼠EF1α启动子突变体。
以下具体实施方式和所附的权利要求使本发明的其它特征和实施方式变得明显。
附图说明
图1示意性显示了包括在每一个载体中的多种MAR元件和SAR元件的组合的结构图。
图2是pC(F)mEGM(R)表达载体的图谱。
图3是pM(R)mEGC(F)表达载体的图谱。
图4是pM(R)M(R)mEG表达载体的图谱。
图5显示了在转染pI(F)SG、pI(R)SG、pSGI(F)、pSGI(R)、pC(F)SG、pC(R)SG、pSGC(F)、pSGC(R)、pM(R)SG、pM(F)SG、pSGM(F)以及pSGM(R)载体到贴壁培养的宿主细胞系之后，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测量人血管内皮生长因子（VEGF）的表达率所获得的结果。
图6显示了在转染pI(F)SG、pI(R)SG、pSGI(F)、pSGI(R)、pC(F)SG、pC(R)SG、pSGC(F)、pSGC(R)、pM(R)SG、pM(F)SG、pSGM(F)以及pSGM(R)载体到悬浮培养宿主细胞系之后，利用ELISA法测量VEGF的表达率所获得的结果。
图7显示了使用关于pI(F)SGM(F)、pI(R)SGM(R)、pI(R)SGI(F)、pI(R)SGI(R)、pI(R)SGC(F)、pI(R)SGC(R)、pC(F)SGM(F)、pC(F)SGM(R)、pC(F)SGI(F)、pC(F)SGI(R)、pC(F)SGC(F)、pC(F)SGC(R)、pC(F)C(F)SG、pM(R)SGC(F)、pM(R)SGC(R)、pM(R)SGI(F)、pM(R)SGI(R)、pM(R)SGM(R)以及pM(R)M(R)SG载体的ELISA法测量的VEGF表达率的结果。
图8显示了使用关于pC(F)SGM(R)、pM(R)SGC(F)以及pM(R)M(R)SG的ELISA法测量的VEGF表达率的结果。
图9显示了用mEF1α启动子突变体替换图8所示的载体的SV40启动子之后，通过使用ELISA法测量VEGF表达率获得的结果。此处，pmEF1α启动子*是指mEF1α启动子突变体。
图10显示了用重组抗体蛋白替换图9所示的载体的靶蛋白之后，通过测量重组抗体蛋白表达率获得的结果。此处，pmEF1α启动子*是指mEF1α启动子突变体。
图11显示了通过测量pM(R)SG、pMhEG、pMcEG、pMmEG以及pMmEG(TA)的重组抗体蛋白的表达率获得的结果。
具体实施方式
除非另有定义，本说明书中所用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的技术人员所理解的含义相同的含义。通常，本说明书中所使用的命名法是本领域众所周知的且在本领域中普遍使用。
本发明涉及用于动物细胞的表达载体，其具有增强的基因表达效率，具体地，涉及用于动物细胞的包括MAR元件以及SAR元件的表达载体，所述元件是基因表达增强因子，位于启动子的5'端和/或转录终止位点的3'端，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。
为了在表达外源基因时显著增加基因的表达量，本发明人发明了保护外源基因表达免受宿主细胞染色体的位点特异性抑制效果影响并在CHO（Chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢）细胞、BHK（baby hamster kidney，幼仓鼠肾）细胞或者已知的动物细胞等中增加外源基因表达的因子。
详细而言，使用核基质附着区（nuclear matrix attachment region，以下称为“MAR”）和核骨架附着区（scaffold attachment region，以下称为“SAR”）构建载体，使至少一个或两个拷贝的MAR元件或SAR元件位于启动子的5'端或者转录终止位点的3'端，且对表达载体的能力进行比较和分析。
首先，为了得到MAR元件或SAR元件的序列，从相应的细胞中分离相应的基因组DNA，然后利用相应的基因组DNA的聚合酶链式反应（PCR）法以及亚克隆方法将其克隆入大肠杆菌载体，从而得到多种MAR元件和SAR元件。优选地，MAR元件和SAR元件可以选自由人β球蛋白MAR(Yu,J.,Bock,J.H.,Slightom,J.L.and Villeponteau,B.,Gene139(2),139-145(1994),gene bank#:L22754)、人CSP-B基因侧翼（flanking）SAR(Hanson,R.D.and Ley,T.J.,Genbank#:M62716)以及人干扰素β基因侧翼SAR(Mielke,C.,Kohwi,Y.,Kohwi-Shigematsu,T.and Bode,J.,Biochemistry29,7475-7485(1990),Genbank#:M83137)所组成的组。
在本发明中，用于动物细胞的表达载体可以是包括至少一个拷贝的基因表达增强因子的用于动物细胞的表达载体，所述基因表达增强因子选自由位于每一个启动子的5'端和转录终止位点的3'端的β球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件以及干扰素βSAR元件所组成的组，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。
此外，用于动物细胞的表达载体可以是包括至少一个拷贝的基因表达增强因子的用于动物细胞的表达载体，所述基因表达增强因子选自由位于启动子的5'端或者转录终止位点的3'端的β球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件以及干扰素βSAR元件所组成的组，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接。
特别地，用于动物细胞的表达载体包括至少两个拷贝的基因表达增强因子。就是说，用于动物细胞的表达载体包括位于启动子的5'端或者转录终止位点的3'端的至少两个拷贝的基因表达增强因子。或者，可以通过包括位于启动子的5'端或者转录终止位点的3'端的至少一个拷贝的基因表达增强因子来分别诱导外源基因表达的增加。
此外，更优选的是，用于动物细胞的表达载体包括MAR元件和SAR元件两者，所述元件是基因表达增强因子，位于启动子的5'端、转录终止位点的3'端或者启动子的5'端和转录终止位点的3'端两者处。
在本发明中，术语“启动子”是指编码区的上游（upstream）非编码区的DNA序列，其包括聚合酶结合位点并具有将位于启动子下游的基因转录成mRNA的转录起始活性。更具体地，“启动子”包括位于距转录起始位点（+1）上游20至30个碱基并使RNA聚合酶从正确的位置或类似TATA盒的区域起始转录的TATA盒，但并不限定于这些区域的上游和下游。除这些区域之外，启动子可以包括募集除RNA聚合酶之外的用于调节表达的蛋白所需要的区域。在本发明中，启动子可以是SV40启动子或者源自CMV的启动子并且包括EF-1α启动子。此外，这些启动子的突变体也可以包括在其中。如本文所用，术语“突变体”是指为了增加基因表达通过添加，删除或取代启动子序列的一部分而得到的突变体。
此外，启动子被有效地连接，以便诱导作为外源基因的靶基因的表达。此处，术语“有效地连接”（operably linked）是指将DNA表达调节序列和编码靶蛋白的DNA序列以有功能的方式相互连接，以便行使通常的功能。与重组载体的有效的连接可以通过使用本领域公知的基因重组技术来进行，在位点特异性地断裂和连接DNA时，可以使用本领域公知的酶等。
在本发明中，靶基因是编码待表达外源产物的基因，是编码全部种类的能作为重组蛋白表达的蛋白的基因。上述蛋白的代表例有胰岛素、细胞因子（白介素、肿瘤坏死因子、干扰素、集落刺激因子、趋化因子等）、促红细胞生成素等。靶基因包括“多克隆位点”，其是包括此处介绍的用于整合到载体中的限制性内切酶的识别或剪切位点的DNA序列。
在本发明中，基因表达增强因子可以是β球蛋白基质附着区（MAR）元件、CSP-B SAR元件或者干扰素-βSAR元件，其中术语“MAR（matrix attachment region，基质附着区）”是指临时附着具有转录活性的DNA环结构域至被称为核基质（nuclear matrix）的蛋白质网络上的DNA序列(Pienta等人,(1991)Crit.Rev.Eukaryotic Gene Expres.1:355-385)。本领域知晓许多MAR序列的实例。
在本发明中，转录终止位点的实例可以包括在相关技术中已知的任何转录终止位点。优选地，转录终止位点可以是胃泌素的转录终止位点，且多聚腺苷酸（polyA）可连接其上。例如，可以包括人生长激素多聚腺苷酸化（polyA）信号、牛生长激素多聚腺苷酸化（polyA）信号或者SV40病毒多聚腺苷酸化（polyA）信号。
本发明人选择并构建了人胃泌素（gastrin）基因终止子（terminator），其中，为了通过增加mRNA的稳定性而提高表达载体的效率，将准确已知的对转录终止必要的polyA信号、剪切位点和终止位点应用于本发明的表达载体的构建的胃泌素基因终止子上。胃泌素基因由603bp的片段组成，其中包括的poly-A信号、剪切位点和终止子位于HindIII限制性内切酶图谱（map）上，其中poly-A信号和剪切位点彼此间隔15bp，且终止子和poly-A信号间隔约220bp。转录终止于位于如上所述的位置的胃泌素的转录终止位点，并且在剪切位点产生mRNA的剪切以及多聚腺苷酸化（poly-A）。
在本发明中，用于动物细胞的表达载体可以是包括位于启动子的5'末端或转录终止位点的3'端的一个拷贝的β-球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件或干扰素βSAR元件的载体。
在本发明中，基因表达增强因子的组合可以是如图1所示的配置。图1示意性地显示了在用于动物细胞的表达载体中的基因表达增强因子的结合序列、启动子、poly(A)和终止子。此处，启动子是SV40启动子、mEF1α启动子或者是mEF1α启动子突变体，并且MAR/SAR是β球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件或干扰素βSAR元件。
在本发明中，用于动物细胞的表达载体可以是一种载体，其包括位于启动子的5'端和/或转录终止位点的3'端的MAR元件和SAR元件。此时，MAR元件和SAR元件可以是彼此相邻或者通过编码或非编码序列而彼此分离。
作为本发明的一个具体实施例，用于动物细胞的表达载体可以是一种载体，其包括位于启动子的5'端的一个拷贝的β球蛋白MAR元件和位于转录终止位点的3'端的一个拷贝的CSP-B SAR元件。
作为本发明的一个具体实施例，用于动物细胞的表达载体可以是一种载体，其包括位于启动子的5'端的一个拷贝的β球蛋白MAR元件和位于转录终止位点的3'端的一个拷贝的干扰素βSAR元件。
作为本发明的一个具体实施例，用于动物细胞的表达载体可以是一种载体，其包括位于启动子的5'端的一个拷贝的CSP-B SAR元件和位于转录终止位点的3'端的一个拷贝的β球蛋白MAR元件。
作为本发明的一个具体实施例，用于动物细胞的表达载体可以是一种载体，其包括位于启动子的5'端的一个拷贝的干扰素βSAR元件和位于转录终止位点的3'端的一个拷贝的β球蛋白MAR元件。
在本发明中，当包括两个拷贝的β球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件或干扰素βSAR元件时，优选可以将两个拷贝的MAR或SAR元件连续放置以便彼此相邻或通过相对短的间隔区彼此分隔。
在本发明中，载体可以包括基因表达增强因子，其包括正向或反向的β球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件和干扰素βSAR元件。此处，每一个基因表达增强因子的取向可以根据这些因子的特定组合而不同。
在本发明的实施例中，确认当使用mEF1α启动子突变体且具有SEQ ID NO.34的序列时，，所有具有MAR和SAR元件的载体与具有SV40启动子的载体相比，抗体生产率增加5倍或以上，特别是，pC(F)mEGM(R)的产率增加10倍或以上。由于用mEF1α启动子代替SV40启动子且使用0nM的MTX浓度之后所测量的产率与使用SV40启动子且经MTX增强之后所获得的产率相比提高约2倍，上述结果表明高表达细胞株可以不经MTX增强而获得。因此，本发明的特征在于使用mEF1α启动子突变体。在另一方面，本发明涉及具有SEQ ID NO.34的序列的小鼠EF1α启动子突变体。
在另一方面，本发明涉及转化了用于动物细胞的表达载体的重组细胞或动物细胞。
此处，动物细胞可以是CHO细胞、Hela细胞、BHK细胞、NIH/3T3细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、CHO-K1细胞、HEK293细胞等，其是通常已知的动物细胞系。此外，动物细胞可以是SP2/0细胞、NSO细胞、PER.C6细胞等。
另一方面，本发明涉及使用了用于动物细胞的表达载体的靶蛋白的制备方法，其特征在于通过培养重组动物细胞来表达靶蛋白并且回收靶蛋白。
在本发明中，制备方法可以包括：（a）将靶基因整合入用于动物细胞的表达载体，使表达受启动子调节;（b）将整合了靶基因的用于动物细胞的表达载体转染动物细胞；以及（c）培养转染的重组动物细胞以表达靶蛋白并回收靶蛋白。
在下文中，本发明将通过实施例详细描述。但是，这些实施例仅仅是为了阐释本发明，并且本领域技术人员会知晓这些实施例并不视为限制本发明的范围。
实施例1：MAR和SAR元件的克隆
用DNA分离试剂盒从Hep G-2细胞系中分离基因组DNA（genomic DNA）后，利用PCR法获得MAR/SAR的DNA（Wizard基因组DNA纯化试剂盒，Promega，美国）。
用200ng分离的基因组DNA作模板（template），并添加25pmole的每种引物、dNTP（0.5mM）以及ExTaq DNA聚合酶（Takara Shuzo Co.，日本），从而进行聚合酶链式反应（PCR）。用于每个MAR/SAR元件的引物序列以及通过PCR获得的DNA片段大小在表1中显示。用GeneAmp PCR系统9600（Perkin-Elmer Corp.，美国）以及下述表2所示的PCR条件进行聚合酶链式反应。
[表1]
[表2]
步骤 条件 循环
1 94℃,2min 1
2 94℃,40sec;65℃,40sec;72℃,40sec 2-31
3 72℃,10min 32
将获得的人β球蛋白MAR、CSP-B SAR以及干扰素-βSAR的PCR产物亚克隆到pT7blue（R）（Novagene，美国）或pCR2.1（Invitrogen，美国）载体中。将人β球蛋白MAR亚克隆到pT7blue（R）载体中并且将CSP-B SAR和干扰素-βSAR亚克隆到pCR2.1载体中。
实施例2：用于动物细胞的表达载体的构建
2-1：pSV-β-gal/版本I和版本II载体的构建
为了有效地克隆被亚克隆于pT7blue（R）载体和pCR2.1载体中的MAR和SAR元件，在pSV-β-gal载体的启动子之前，构建重组体pSV-β-gal版本I（version I）和版本II（version II）载体。
首先，在构建了包括Spe I-Sma I-Apa I-EcoR I限制性酶切位点的引物（SEQ ID NO.7）以及在3'端包括Hind III的引物（SEQ ID NO.8）并对pSV-β-gal载体（Promega Co.，美国）的SV40启动子进行PCR之后，将443bp的包括SV40启动子的经Spe I-Hind III-处理的片段分离、纯化并从琼脂糖凝胶（agarose gel）使用gene clean III试剂盒（BIO101Co.）回收。之后，将此片段整合并连接到用Spe I/Hind III处理过的线性化的pBluescript SK（+）（Stratagene Co.，美国）上，其所用的是相同的限制性内切酶，从而构建了pBluescript/SV40I启动子载体。然后，用限制性内切酶Sca I和Hind III处理所构建的pBluescript/SV40I启动子载体，并对这样的包括SV40启动子的片段进行纯化、分离并用如上所述的方法从琼脂糖凝胶中回收。之后，将该片段整合并连接到用相同的限制性内切酶处理的线性化的pSV-β-gal载体上，从而完成版本I载体（pSV-β-gal/versionI）。
SEQ ID NO.7:用于构建pSV-beta-gal/ver1载体的正义引物
5'-GCACTAGTCC CGGGCCCATG ATTACGAATT CGCGCAGCACCAT-3'
SEQ ID NO.8:用于构建pSV-beta-gal/ver1载体的反义引物
5'-GCAAGCTTTT TGCAAAAGCC TAGGCCTCC-3'
为了构建重组体pSV-β-gal版本II载体，经EcoR I和Hind III处理pSV-β-gal载体之后，将420bp的包括SV40启动子的经EcoR I/Hind III处理的片段纯化、分离并从琼脂糖凝胶中用上述方法回收。之后，将此片段整合并连接到用EcoR I和Hind III处理过的线性化的pBluescript SK（+）载体上，其所用的是相同的限制性内切酶，从而构建了pBluescript/SV40II启动子载体。然后，用限制性内切酶Sca I和Hind III处理所构建的pBluescript/SV40II启动子载体，并对包括SV40启动子的片段进行分离、纯化并用上述的方法从琼脂糖凝胶中回收。之后，将该片段整合并连接到用相同的限制性内切酶处理的线性化的pSV-β-gal载体上，从而完成版本II载体（pSV-β-gal/version II）。
2-2：包括MAR/SAR元件和β-gal基因的载体的构建
在实施例1中构建的pT7blue/β球蛋白MAR载体用限制性内切酶Spe I和Sma I处理，将包括β球蛋白MAR元件的3kb大小的DNA片段分离、纯化并从琼脂糖凝胶中回收。之后，将此片段整合并连接到用Spe I和Sma I处理过的线性化的重组体pSV-β-gal版本I载体上，其所用的是相同的限制性内切酶，从而完成β球蛋白MAR元件（pMS-β-gal）的克隆。为了确定所整合的β球蛋白MAR元件的方向，用存在于β球蛋白MAR元件以及重组体pSV-β-gal版本I中的限制性内切酶Hind III进行处理，从而确定β球蛋白MAR元件的方向是反向的。
按上述方法从pCR2.1/干扰素βSAR和pCR2.1/CSP-B SAR中将SAR元件分离并克隆到pSV/I或者pSV/II中。用ApaI/SpeI将干扰素βSAR亚克隆到pSV-β-gal/版本I中，从而构建了pSV-β-gal/干扰素βSAR(F)(pIS-β-gal)。用引物和作为模板的包括限制性内切酶位点Spe I和Sma I的pCR2.1/CSP-B SAR（SEQ ID NO.9和10）进行PCR，将用限制性内切酶Spe I/Sma I处理的CSP-B SAR分离并亚克隆到经相同的限制性内切酶处理的pSV-β-gal/版本II中，从而构建了pSV-β-gal/CSP-B SAR(pCS-β-gal)。
SEQ ID NO.9:CSP-B SAR正义链
5'-TTT ACT AGT GGA TCC CAT TCT CCT TGA-3'
SEQ ID NO.10:CSP-B SAR反义链
5'-TCC CCC GGG GAA TTC AAA CAA CTC AAT AGC-3'(30mer)
2-3：胃泌素基因的转录终止位点的获得和pSG-β-gal载体的构建
用引物(SEQ ID NO.11)合成胃泌素基因的转录终止位点（GTF）的正义链（sense strand）并且用引物(SEQ ID NO.12)合成其反义链（antisense strand）之后，将两条链退火（annealing）。经BamH I和Pst I处理的退火的反应产物整合并连接到预先经相同的限制性内切酶处理的线性化的pSV-β-gal载体中(Promega Co.，美国)，从而完成pSG-β-gal载体。
SEQ ID NO.11:胃泌素终止位点的正义序列
5'-AGCGGATCCA GGATAATATA TGGTAGGGTT CATAGCCAGA GTAACCTTTTTTTTTAATTT TTATTTTATT TTATTTTGAG CTGCAG-3'
SEQ ID NO.12:用于pSG载体中的胃泌素终止位点的反义序列
5'-CTGCAGCTCA AAATAAAATA AAATAAAAAT TAAAAAAAAA GGTTACTCTGGCTATGAACCCTACCATATA TTATCCTGGA TCCGCT-3'
2-4：pM(R)SG载体的构建
用聚合酶链式反应（PCR）法构建同时用于β球蛋白MAR(反向)以及SPA-GTF的载体。为了构建pM(R)SG载体，用实施例2-2的pMS-β-gal和实施例2-3的pSG-β-gal作为模板进行聚合酶链式反应，之后反应产物经特定的限制性内切酶处理并连接，从而完成pM(R)SG载体。
①用于β球蛋白MAR元件的聚合酶链式反应（PCR）
用作为模板的pMS-β-gal、正义引物ML1(SEQ ID NO.13)和反义引物MR1(SEQ ID NO.14)进行PCR。所获得的反应产物经限制性内切酶Sac II和Cla I处理使其切开，之后整合并连接到预先经相同的限制性内切酶处理的线性化的pMS-β-gal载体中，完成第一个亚克隆步骤，从而构建了作为中间载体产物的pMS-β-gal/sc载体。
SEQ ID NO.13:用于扩增在pMS载体中的人β球蛋白MAR元件的ML1引物
5'-TCCCCGCGGC CCGGGCCTCC TGAGTAGCTG GGGACT-3'
SEQ ID NO.14:用于扩增在pMS载体中的人β球蛋白MAR元件的MR1引物
5'-TTGGGGCCCA TCGATTTTTC CTCTTTAGGT TCTC-3'
②包括多克隆位点和转录终止位点的聚合酶链式反应(PCR)
用正义引物TL1(SEQ ID NO.15)和反义引物TR1(SEQ ID NO.16)进行用于pSG-β-gal载体中胃泌素基因的转录终止位点的PCR。将PCR产物亚克隆到pGEM-T easy载体中(Promega Co.，美国)，其是一种构建的TA克隆载体，可以使PCR产物不经限制性内切酶处理而直接构建到载体上，从而构建了pGEM-T/MCSp(A)载体，该载体是用于构建载体的中间产物。
SEQ ID NO.15:pSG载体中胃泌素终止位点的TL1引物
5'-GAAGATCTGT TAACTCGAGA ACTTGTTTAT TGCAGCTTA3'
SEQ ID NO.16:pSG载体中胃泌素终止位点的TR1引物
5'-GTGCCAGCTT GCATGCCTGC-3'
③用于SV40启动子和多克隆位点的聚合酶链式反应(PCR)
用正义引物PL1(SEQ ID NO.17)和反义引物PR1(SEQ ID NO.18)进行用于SV40启动子和多克隆位点的PCR。反应产物经限制性内切酶Apa I和Bgl II处理，然后连接到预先经相同的限制性内切酶处理的线性化的pGEM-T/MCSp(A)载体上，从而构建了作为中间产物的pGEM-T/SVMCSp(A)载体。
SEQ ID NO.17:用于融合SV40病毒启动子和多克隆位点的PL1引物
5'-CCGGGCCCAT CGATAAGCTT GATCCCGCGC AGCACCATGG CCTGAA-3'
SEQ ID NO.18:用于融合SV40病毒启动子和多克隆位点的PR1引物
5'-GAAGATCTGC GGCCGCTAGC AAGCTTTTTG CAAAAGCCTA-3'
④pMS载体和pMSG载体的构建
用限制性内切酶Cla I和BamH I处理实施例③中所构建的pGEM-T/SVMCSp(A)载体，将由SV40启动子、多克隆位点和SV40转录终止位点所组成的DNA片段分离并纯化。之后，纯化的DNA片段整合到在实施例①中所构建的预先经相同的限制性内切酶处理的线性化的pMS-β-gal/sc载体中，从而完成pMS载体。为了构建pM(R)SG载体，用限制性内切酶BamH I和Sca I处理上述构建的pSG-β-gal载体并分离、纯化具有胃泌素基因的GTF序列的950bp的DNA片段之后，纯化的DNA片段整合并连接到预先经相同的限制性内切酶处理的线性化的pMS载体中，从而完成pM(R)SG载体。
2-5:pSG载体的构建
为了在转录终止位点的3’端整合MAR/SAR元件，构建了pSG载体。用Sma I和Cla I处理pM(R)SG表达载体以从中去除MAR之后，用Klenow处理产物使其产生平末端并自我连接，从而构建pSG载体。
2-6：pMSG和pSGM载体的构建
用Sac II和Cla I处理pM(R)SG表达载体以从其分离MAR(R)之后，为了获得MAR(F)(MAR为正向)，构建了引物(SEQ ID NO.19和20)，以使Sac II/Cla I位点包括其中，并进行PCR。PCR产物从琼脂糖凝胶中分离并整合到经相同限制性内切酶处理的pM(R)SG载体中，从而构建了pM(F)SG载体。
SEQ ID NO.19:5'-TTTTCCGCGGTTTTCCTCTTTAG-3'
SEQ ID NO.20:5'-TTTTATCGATCCTCCTGAGTAG-3'
同时，pSGM载体，其是用于动物细胞的包括位于转录终止位点3’端的β球蛋白MAR元件的表达载体，通过下述方法构建。
为了构建pSGM载体，构建了包括位于MAR两端的限制性内切酶位点Nar I的引物(SEQ ID NO.21和22)，并用pM(R)SG做模板进行PCR。PCR产物经限制性内切酶Nar I处理并整合到经相同的限制性内切酶处理的pSG载体中，从而构建了pSGM(R)和pSGM(F)载体。
SEQ ID NO.21:β-球蛋白MAR正义Nar I
5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3'(31mer)
SEQ ID NO.22:β-球蛋白MAR反义Nar I
5'-AAA AGG CGC CTT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3'(31mer)
2-7：pISG和pSGI载体的构建
pISG载体是用于动物细胞的包括位于启动子5’端的干扰素βSAR元件的表达载体，且pSGI载体是用于动物细胞的包括位于转录终止位点3’端的干扰素βSAR元件的表达载体，其通过如下方法构建。
从pSV-β-gal/干扰素βSAR(F)(pI(F)S-β-gal)载体中移除β-gal基因，并整合多克隆位点（MCS）、SV40转录终止位点以及胃泌素的GTF，从而构建了pI(F)SG载体。
移除包括pI(F)S-β-gal载体的β-gal基因位点的Hind III/Pst I片段，从经相同的限制性内切酶处理的pM(R)SG中分离Hind III/Pst I片段并整合，从而构建了pI(F)SG载体。
pI(F)SG载体经限制性内切酶EcoR I处理，将干扰素βSAR元件从琼脂糖凝胶中分离并再次整合到经相同的限制性内切酶处理的pI(F)SG载体中以构建pI(R)SG。之后，pI(R)SG载体通过限制性内切酶图谱确认。为了构建pSGI载体，将包括限制性内切酶Nar I位点的连接片段（linker）（SEQ ID NO.23）整合到pGEM-T easy载体中，并且用限制性内切酶EcoR I处理SAR元件，以从pISG载体上分离DNA片段。然后，将分离的DNA片段整合到修饰的T载体中。再一次，用限制性内切酶Nar I将产物酶切并整合到经相同的限制性内切酶处理的pSG载体中，从而构建了pSGI(F)和pSG(R)载体。
SEQ ID NO.23:连接片段
5'-GGC CGG CGC CGA ATT CGG CGC C-3'
2-8：pCSG和pSGC载体的构建
pCSG载体是用于动物细胞的包括位于启动子5’端的CSP-B SAR元件的表达载体，且pSGC载体是用于动物细胞的包括位于转录终止位点3’端的CSP-B SAR元件的表达载体，其通过如下方法构建。
用作为模板的pSV-β-gal/CSP-B SAR(F)(pCS-β-gal)和包括限制性内切酶位点Cla I和Sma I的引物(SEQ ID NO.24和10)进行PCR，之后用限制性内切酶Cla I和Sma I进行处理，从而获得CSP-B SAR的DNA片段。用限制性内切酶Cla I和Sma I处理pM(R)SG载体以移除MAR，之后整合到经相同的限制性内切酶处理的CSP-B SAR，从而构建了pC(R)SG载体。
SEQ ID NO.24:CSP-B SAR正义Cla I
5'-AAA AAT CGA TAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3'(30mer)
SEQ ID NO.10:CSP-B SAR反义Sma I
5'-TCC CCC GGG GAA TTC AAA CAA CTC AAT AGC-3'(30mer)
将从pC(R)SG载体用限制性内切酶Sac II处理获得的CSP-B SAR元件整合到经相同的限制性内切酶处理的pSG载体上，从而构建了pC(F)SG载体。
为了构建pSGC载体，构建包括位于CSP-B SAR两端的限制性内切酶位点Nar I的引物（SEQ ID NO.25和26），并用pC(F)SG做模板进行PCR。PCR产物经限制性内切酶Nar I处理并整合到经相同的限制性内切酶处理的pSG载体中，从而构建了pSGC(F)和pSGC(R)载体。
SEQ ID NO.25:CSP-B SAR正义Nar I
5'-AAA AGG CGC CGA ATT CAA ACA ACT CAA TAG C-3'(31mer)
SEQ ID NO.26:CSP-B SAR反义Nar I
5'-AAA AGG CGC CAT GAC CAT GAT TAC GCC AAG-3'(30mer)
2-9：pMMSG、pMSGM、pMSGC和pMSGI载体的构建
pMMSG载体是用于动物细胞的包括位于启动子5’端的两个拷贝的β球蛋白MAR元件的表达载体，且pMSGM载体是用于动物细胞的包括位于启动子5’端和转录终止位点3’端的β球蛋白MAR元件的表达载体，其分别通过如下方法构建。
用作为模板的pM(R)SG载体和包括在MAR两端的限制性内切酶位点Nar I和Cla I的引物(SEQ ID NO.21和27)进行PCR。之后，PCR产物经限制性内切酶Nar I和Cla I处理后整合到经限制性内切酶Cla I处理的pM(R)SG载体，从而构建了pM(R)M(R)SG载体。
SEQ ID NO.21:β-球蛋白MAR正义Nar I
5'-AAA AGG CGC CCC TCC TGA GTA GCT GGG ACT A-3'(31mer)
SEQ ID NO.27:β-球蛋白MAR Cla I
5'-AAA ATC GAT TT CTT CCT CTT TAG GTT CTC C-3'(31mer)
为了构建pM(R)SGM、pM(R)SGC以及pM(R)SGI载体，用限制性内切酶Nar I处理pSGM(F)、pSGC(F)以及pSGI(F)载体，以分别分离出β球蛋白MAR、CSP-B SAR元件或干扰素βSAR元件，并将它们整合到经相同的限制性内切酶处理的pM(R)SG载体中，从而构建了pM(R)SGM(R)、pM(R)SGC(F)、pM(R)SGC(R)、pM(R)SGI(F)和pM(R)SGI(R)载体。
2-10：pI(R)SGI、pI(R)SGC和pI(R)SGM载体的构建
用于动物细胞的表达载体，其包括位于启动子5’端的一个拷贝的干扰素βSAR元件以及位于转录终止位点3’端的一个拷贝的β球蛋白MAR元件、CSP-B SAR元件和干扰素βSAR元件，通过如下方法构建。
为了构建pI(R)SGI、pI(R)SGC和pI(R)SGM载体，分别从pSGI(F)、pSGC(F)和pSGM(F)载体用限制性内切酶Nar I分离MAR/SAR元件。将分离并纯化的MAR/SAR元件整合到经限制性内切酶Nar I处理的pI(R)SG载体中，从而构建了pI(R)SGI(R)、pI(R)SGI(F)、pI(R)SGC(R)、pI(R)SGC(F)、pI(R)SGM(R)和pI(R)SGM(F)载体。
2-11：pCCSG、pCSGI、pCSGC和pCSGM载体的构建
pCCSG载体是用于动物细胞的包括位于启动子5’端的两个拷贝的CSP-B SAR元件的表达载体，其通过如下方法构建。
包括CSP-B SAR元件的pC(F)SG载体经限制性内切酶Hind III处理以使其分离，然后进行自我连接。再一次，用限制性内切酶Nhe I和Spe I处理产物以分离并纯化出CSP-B SAR元件，然后将其整合到经限制性内切酶Spe I处理的pC(F)SG载体中，从而构建了pC(F)C(F)SG载体。
为了构建pC(F)SGI、pC(F)SGC和pC(F)SGM载体，分别从pSGI(F)、pSGC(F)和pSGM(F)载体用限制性内切酶Nar I分离MAR/SAR元件。将分离并纯化的MAR/SAR元件整合到经限制性内切酶Nar I处理的pC(F)SG载体中，从而构建了pC(F)SGI(R)、pC(F)SGI(F)、pC(F)SGC(R)、pC(F)SGC(F)、pC(F)SGM(R)和pC(F)SGM(F)载体。
2-12：包括小鼠EF1α启动子及其突变体的表达载体的构建
利用DNA分离试剂盒（DNeasy Blood&Tissue Kit，QIAGEN）从获自小鼠卵黄囊组织的基因组DNA中分离小鼠EF1α启动子。
将200ng的基因组DNA、10pmol的每种引物(SEQ ID NO.28和29)以及水加入到Maxime PCR Premix(i-pfu)(Intron biotechnology)中，使形成20μl的总体积以进行聚合酶链式反应(PCR)。反应条件如下。在热循环仪中连续执行下述反应，于94℃持续5分钟，再执行94℃持续30秒、56℃持续1分钟和72℃持续3分钟的循环25次，最后在72℃持续反应5分钟，之后用分离试剂盒(GeneAllR ExpinTM PCR SV，Geneall)进行分离并纯化。
SEQ ID NO.28:mEF1α-F
5'-TTT TAT CGA TAG CGG AGT AAG GAA GAG TAG-3
SEQ ID NO.29:mEF1α-R
5’-TTT TGC TAG CAG CGG TGG TTT TCA CAA CAC-3’
用Cla I和Nhe I从pM(R)SG表达载体中将SV40启动子去除之后，再整合经相同的限制性内切酶处理的小鼠EF1α启动子，从而构建了pMmEG表达载体。
为了用腺嘌呤代替位于TATATAA，即小鼠EF1α启动子的TATA盒序列，的第五个位点的胸腺嘧啶，构建了PCR引物，该引物包括如下所述的一个取代的序列，从而产生了单碱基对突变（Jaeger E.，1997）。
在管1中混合引物1和引物3(SEQ ID NO.30和32)，在管2中混合引物2和引物4(SEQ ID NO.31和33)，分别用pMmEG表达载体作为模板来进行第一步PCR，将两管中所获得的每个产物均纯化，将纯化的产物相互混合。之后，用作为模板的混合的PCR产物以及引物1和4在同样条件下进行第二步PCR。用Kpn I和Spe I处理PCR产物，之后，用分离试剂盒获得小鼠EF1α启动子突变体（mEF1α(TA)）。用Kpn I和Spe I处理pMmEG表达载体以去除小鼠EF1α启动子，再整合经相同的限制性内切酶处理的小鼠EF1α启动子突变体（mEF1α(TA)，SEQ ID NO.34），从而构建了pMmEG(TA)载体。
SEQ ID NO.30:mEF-tata-1
5’-TCC CAG GGA CCG TCG CTA AAT TCT CAT AAC-3’
SEQ ID NO.31:mEF-tata-2
5’-GAA CGG TAT AAA AGT GCG GCA GTC GCC TTG-3’
SEQ ID NO.32:mEF-tata-3
5’-CAA GGC GAC TGC CGC ACT TTT ATA CCG TTC-3’
SEQ ID NO.33:mEF-tata-4
5’-GCT CCG CTC AAA ACT CAA GGG GAC AAA TTC-3’
2-13:pmEG表达载体的构建
用限制性内切酶Sac I处理pC(R)SG载体以去除CSP-B SAR并自我连接之后，用限制性内切酶Cla I和Nhe I处理产物，从而构建了pG。用限制性内切酶Cla I和Nhe I处理pMmEG(TA)载体以分离小鼠EF1α突变体，再将其整合到经相同的限制性内切酶处理的pG中，从而构建了pmEG载体。
2-14：pC(F)mEGM(R)/pM(R)mEGC(F)/pM(R)M(R)mEG表达载体的构建
小鼠EF1α启动子突变体整合到包括两个拷贝的MAR/SAR并具有高表达效率的表达载体，从而构建了如下所述的表达载体。
用限制性内切酶Cla I和Nhe I处理pMmEG(TA)表达载体以分离小鼠EF1α启动子突变体，用同样的限制性内切酶处理pC(F)SGM(R)、pM(R)SGC(F)和pM(R)M(R)SG表达载体以去除SV40启动子后，整合所分离的小鼠EF1α启动子突变体，从而构建了图2的pC(F)mEGM(R)表达载体、图3的pM(R)mEGC(F)表达载体和图4的pM(R)M(R)mEG表达载体。
此时，构建的pC(F)mEGM(R)载体(SEQ ID NO.35)的信息如下。
[表3]
实施例3：转染细胞系的建立
3-1：使用贴壁宿主细胞系的转染
DHFR基因缺陷型CHO DG44细胞系（Dr.Chasin，Columbia Unversity）培养于含10％胎牛血清（fetal bovine serum）的MEM（最小必需培养基，Gibco BRL）培养基中。2×105的细胞接种到包括2mL培养基的6孔培养板中并于37℃在5％CO2的培养箱中培养过夜直至进行转染。
通过脂质体介导的方法进行转染。包括pSP72载体中的DHFR基因的pDCH1P载体，该载体是一个商业化的载体，以100:1的摩尔比与每个测试载体共转染。取2ug的每种载体与GeneJuice（MERCK，德国，一种脂肪表面活性剂）和无血清MEM-培养基相混合，以使它们于室温相互反应45分钟，然后将其和培养基一起加入到洗涤过的细胞中。之后，将转染的细胞培养6小时并去除培养基。为了筛选转染细胞系，在无核苷的MEM培养基中培养细胞。2周后收获初步适应的细胞，再用10nM和100nM的MTX使细胞不断适应，从而分别获得稳定的细胞系。
3-2:使用悬浮培养的宿主细胞系的转染
将适应了悬浮培养的CHO DG44宿主细胞系在商业化的无血清培养基中传代培养。转染的前一天进行传代培养，将pDCH1P载体和每个测试载体用电穿孔（Electroporation）进行转染。为了选择所转染的细胞系，在无核苷的商业化的无血清培养基中培养细胞。2周后收获初步适应的细胞，再用10nM和100nM的MTX使细胞不断适应，从而分别获得稳定的细胞系（stable cell line）。
实施例4：实验例：用于确认表达能力的实验
4-1：用于表达重组VEGF蛋白的表达载体的构建
在获得亚克隆于pT7blue和pCR2.1载体的重组蛋白基因之后，用限制性内切酶将其酶切。实施例2中所构建的每个载体用与重组蛋白基因上所使用的内切酶相同的限制性内切酶酶切并整合到每个载体中，从而构建表达载体。
为了验证实施例2中所构建的载体在基因表达方面的效果，用正义引物（SEQ ID NO.36）和反义引物(SEQ ID NO.37)对VEGF（human Vascular Endothelial Growth Factor，人血管内皮生长因子）的基因进行PCR扩增。用限制性内切酶Nhe I和Xho I处理PCR产物以获得VEGF基因后，实施例中所构建的载体用相同的限制性内切酶酶切，并将所获得的VEGF基因整合到这些载体中，从而构建了表达载体。
SEQ ID NO.36:vegf-5
5'-CTA GCTAGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG-3'
SEQ ID NO.37:vegf-3
5'-GAAGATCTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3'
4-2：用于表达重组抗体蛋白的表达载体的构建
为了验证实施例中所构建的载体在基因表达方面的效果，构建了用于表达重组抗CD20抗体基因的表达载体。
用限制性内切酶Bgl II和Xho I处理重组抗体的重链（heavy chain）基因，用限制性内切酶NheⅠ和XhoⅠ处理轻链（light chain）之后，分别地，将所处理的基因整合到实施例中经相同限制性内切酶处理的载体中，从而构建了表达载体。
4-3：转染的贴壁细胞系的建立
将这些表达载体引入到CHO DG44宿主细胞系中。2×105的细胞接种于6孔板中并在5％CO2培养箱中于37℃培养24小时后，这些表达载体（2μg）和DHFR小基因以100:1的比例混合，并通过脂质体介导的转染将它们一起引入CHO细胞中，如脂质体和阳离子脂质体（Dosper）等。引入6小时后，将培养基改为生长培养基，再将细胞持续培养48小时。
在选择培养基（含10％热灭活的透析过的FBS且不含核苷的MEM-α培养基）中培养转染的细胞系，选择培养基中以0nM、10nM和100nM的浓度渐进地增加MTX（Ethotrexate，氨甲喋呤）浓度。以2×105细胞/孔（2mL）在每个MTX浓度接种转染的细胞系并培养4天，之后，将培养液收获，然后用ELISA试剂盒（R&D Systems，DY293）分析吸光度。
图5中显示了通过使用关于pI(F)SG、pI(R)SG、pSGI(F)、pSGI(R)、pC(F)SG、pC(R)SG、pSGC(F)、pSGC(R)、pM(R)SG、pM(F)SG、pSGM(F)以及pSGM(R)载体的吸光度测量的VEGF表达率。
4-4：转染的悬浮培养的细胞系的建立和VEGF产率的测量
将这些表达载体引入到适应了悬浮培养的CHO DG44宿主细胞系中。以5×105细胞/mL的浓度将细胞加入到烧瓶中并于37℃下在5％CO2培养箱中振荡温育24小时后，将VEGF表达载体和pDCH1P载体以100:1的摩尔比相互混合并通过电穿孔将其一起引入到CHO细胞中。转染约3天后，将培养基换为选择培养基，然后再培养2-3周。
将转染的细胞系培养于添加了MTX（Ethotrexate，氨甲喋呤）的培养基中，并将适应了每个MTX梯度的细胞以2×105细胞/孔（2mL）接种于6孔板并培养4天。之后，将培养液收获，并用ELISA试剂盒（R&D Systems，DY293）分析吸光度。
首先，通过使用关于pI(F)SG、pI(R)SG、pSGI(F)、pSGI(R)、pC(F)SG、pC(R)SG、pSGC(F)、pSGC(R)、pM(R)SG、pM(F)SG、pSGM(F)以及pSGM(R)载体的吸光度测量了VEGF表达率（图6），将所得到的结果与图5所示的实施例4-3的结果相比较。从结果来看，至少选出了两个拷贝的MAR/SAR组合。进行了一个组合，当在转录终止位点的下游选取正向和反向时，在启动子和MAR和SAR元件的上游选取I（R）、C（F）和M（R）。
其次，通过使用所选组合，利用关于pI(R)SGM(F)、pI(R)SGM(R)、pI(R)SGI(F)、pI(R)SGI(R)、pI(R)SGC(F)、pI(R)SGC(R)、pC(F)SGM(F)、pC(F)SGM(R)、pC(F)SGI(F)、pC(F)SGI(R)、pC(F)SGC(F)、pC(F)SGC(R)、pC(F)C(F)SG、pM(R)SGC(F)、pM(R)SGC(R)、pM(R)SGI(F)、pM(R)SGI(R)、pM(R)SGM(R)以及pM(R)M(R)SG载体的吸光度测量了VEGF表达率。如图7所示，pC(F)SGM(R)、pM(R)SGC(F)和pM(R)M(R)SG载体与其他载体相比具有显著高的产率。这就是说，确认在将MAR元件和SAR元件组合在一块的情况下可以使靶蛋白高表达。具体而言，pC(F)SGM(R)与具有两个MAR元件的pM(R)M(R)SG载体相比具有显著的高表达率。这表明MAR元件和SAR元件的组合比包括两个MAR元件的组合更有效，并且通过使用此种组合，蛋白可以在工业利润水平下生产。
再次，利用关于三个所选的载体(pC(F)SGM(R)、pM(R)SGC(F)和pM(R)M(R)SG))的ELISA法测量了VEGF表达率（图8）。此外，通过使用关于实施例2-14中图2的pC(F)mEGM(R)(SEQ ID NO.35)表达载体，该表达载体中用mEF1α启动子突变体代替了SV40启动子，实施例2-14中图3的pM(R)mEGC(F)表达载体以及具有实施例2-14中图4的酶切图的pM(R)M(R)mEG表达载体的吸光度测量了VEGF表达率（图9）。结果如图8和9所示，用mEF1α启动子突变体代替SV40启动子之后，在这三种载体的情况下，VEGF的产率增加5倍或更多。特别地，在pC(F)mEGM(R)载体的情况下，产率增加20倍或更多。
上述实验结果表明，通过应用mEF1α启动子突变体到MAR元件和SAR元件的组合可获得显著的协同效应。
4-5：重组抗体蛋白产率的测定
同时，利用实施例4-2中关于三种载体的方法构建了用于重组抗体蛋白的表达载体，并用实施例4-4中的方法转染用于抗体生产的细胞系并在选择性培养基上培养2-3周。以2×105个细胞/孔（2mL）将转染的细胞系接种于6孔板中并培养6天，然后收获培养液，然后用ELISA试剂盒（PanGen Biotech.，PGK1002）分析抗体的表达率。
结果如图10所示，在使用mEF1α启动子突变体的情况下，与使用SV40启动子的情况相比，所有三种载体中抗体产率增加3倍或更多。特别是，pC(F)mEGM(R)载体的产率增加10倍或更多。
由于用mEF1α启动子突变体代替SV40启动子且适应了0nM的MTX浓度之后所测量的产率与使用SV40启动子的情况并经MTX增强之后所分析的产率相比高约2倍，上述结果表明，可以不用通过MTX增强而获得高表达的细胞系。也就是说，与相关技术相比，确认通过组合根据本发明的mEF1α启动子突变体和MAR元件和SAR元件的组合，在工业利润水平上提高了产率。
同时，在生产重组抗体时，在用小鼠EF1α启动子突变体以及MAR元件和SAR元件的组合的情况下，与用小鼠EF1α启动子突变体以及两个拷贝的MAR元件的组合相比，产率显著提高了。此实验结果表明，应用小鼠EF1α启动子突变体到MAR元件和SAR元件的组合获得了协同效应。
4-6：小鼠EF1α启动子突变体的效果的确定
为了测试在实施例2-12中所构建的小鼠EF1α启动子突变体的效果，构建了整合了人EF1α启动子的pMhEG以及整合了CHO（Chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢）EF1α启动子的pMcEG，并与实施例2-12中的小鼠EF1α启动子及其突变体相比较。
首先，按如下方法构建pMhEG载体。用SEQ ID NO.38和39的引物对pEF/myc/cyto(Invitrogen)载体的人EF1α启动子位点进行PCR。
SEQ ID NO.38:5'-TCG ATC GAA TTC AAG TT CGT GAG G-3'
SEQ ID NO.39:5'-GCT AGC GTG TTC ACG ACA CCT GAA ATG-3'
接着，用限制性内切酶Cla I和Nhe I处理PCR产物，然后分离并从1%的琼脂糖凝胶中纯化。之后，纯化的PCR产物整合到经相同的限制性内切酶处理的pM(R)SG载体中，从而构建了pMhEG载体。
此外，按如下方法构建pMcEG载体。传代培养的CHO DG44细胞（1×106）放入离心管并以3,000rpm离心1分钟获得细胞，并用DNeasy Blood&Tissue试剂盒(QIAGEN)制备CHO基因组DNA。之后，用SEQ ID NO.40和41的引物进行PCR，从而获得CHO EF1α启动子(Genbank登录号为AY188393)。
SEQ ID NO.40:chEF1A-F
5'-TAT CGA TAG TGG AGT CAG GAA GGG TAG-3'
SEQ ID NO.41:chEF1A-R
5'-TGC TAG CAG CGG TGG TTT TCA CAA CAC-3'
用限制性内切酶ClaI和NheI处理PCR产物，然后分离并从1%琼脂糖凝胶中纯化。然后，纯化的PCR产物整合到经相同的限制性内切酶处理的pM(R)SG载体中，从而构建了pMcEG载体。
此后，用实施例2-4中的pM(R)SG和实施例2-12中的pMmEG和pMmEG（TA）制备重组抗体，并用与上述实施例4-5中同样的方法来获得pMhEG和pMcEG载体。
结果如图11所示，确认在用小鼠EF1α启动子的情况下，产率高于用人EF1α启动子或CHO EF1α启动子的情况，并且在用SEQ ID No.34的鼠EF1α启动子突变体的情况下，与用SV40启动子或小鼠EF1α启动子等的情况相比，产率显著提高。

Claims (15)

1.一种用于动物细胞的表达载体，其包括位于启动子的5'端和/或转录终止位点的3'端的一个或两个拷贝的反向的MAR元件和正向的SAR元件，所有所述元件在表达载体内均有效地相互连接，所述启动子是小鼠EF1α启动子突变体且所述启动子的序列如SEQ ID NO.34所示。
2.如权利要求1所述的用于动物细胞的表达载体，MAR元件和SAR元件彼此相邻或者被编码或非编码序列彼此分隔。
3.如权利要求1所述的用于动物细胞的表达载体，所述MAR元件是β球蛋白MAR元件。
4.如权利要求3所述的用于动物细胞的表达载体，所述β球蛋白MAR元件的序列是Genbank登录号为L22754的序列。
5.如权利要求1所述的用于动物细胞的表达载体，所述SAR元件是CSP-B SAR元件或者干扰素βSAR元件。
6.如权利要求5所述的用于动物细胞的表达载体，所述CSP-B SAR元件的序列是Genbank登录号为M62716的序列。
7.如权利要求5所述的用于动物细胞的表达载体，所述干扰素βSAR元件的序列是Genbank登录号为M83137的序列。
8.如权利要求1所述的用于动物细胞的表达载体，多腺苷酸化信号连接于转录终止位点的5’端。
9.如权利要求1所述的用于动物细胞的表达载体，其中将其表达受启动子调节的靶基因整合到表达载体中。
10.如权利要求1所述的用于动物细胞的表达载体，所述载体是序列如SEQ ID NO.35所示的pC(F)mEGM(R)。
11.一种用权利要求1-10任一项所述的用于动物细胞的表达载体转化的重组微生物。
12.一种用权利要求1-10任一项所述的用于动物细胞的表达载体转染的重组动物细胞，其中动物细胞选自包括CHO细胞、Hela细胞、BHK细胞、NIH/3T3细胞、COS-1细胞、COS-7细胞和HEK293细胞的组。
13.如权利要求12所述的重组动物细胞，所述动物细胞是CHO细胞。
14.一种靶蛋白的制备方法，所述方法包括：培养如权利要求12所述的重组动物细胞以表达靶蛋白；并回收所述靶蛋白。
15.一种序列如SEQ ID NO.34所示的小鼠EF1α启动子突变体。
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