KR101535262B1

KR101535262B1 - 인간 고아 ｇ-단백질 결합 수용체 단백질의 효능제 및 저해제 탐색을 위한 ｈｔｓ 시스템

Info

Publication number: KR101535262B1
Application number: KR1020120086501A
Authority: KR
Inventors: 정경숙; 원미선; 안지원; 강창모; 김보경; 송경빈; 이희구
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2015-07-08
Also published as: KR20140020077A

Abstract

본 발명은 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1(human seven transmembrane protein 1)의 효능제(angonist) 또는 저해제(antagonist)의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 이용하여 hSTM1의 효능제 또는 저해제를 스크리닝하는 방법, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 이용하여 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법, hSTM1 단백질 및 Gnai3(guanidine nucleotide binding prtein, alpha inhibiting activity polypeptide 3) 단백질을 발현하는 효모에 효능제 또는 저해제 후보물질, 또는 효능제 또는 저해제 후보물질과 PTX(pertussis toxin)를 모두 처리하고 상기 후보물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하여 hSTM1의 효능제 또는 저해제를 스크리닝하는 방법, 상기 hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝 키트 및 상기 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된, Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모 형질전환체에 관한 것이다.

Description

인간 고아 Ｇ-단백질 결합 수용체 단백질의 효능제 및 저해제 탐색을 위한 ＨＴＳ 시스템{High Throughput Screening System for Identification of Agonist and Antagonist of Human Orphan G-Protein coupled receptor}

GPCRs(G-protein coupled receptors) 중에서 리간드가 확인된 수용체는 "공지된" 수용체라 지칭되는 반면, 내생 리간드가 확인되지 않은 수용체는 "고아 (Orphan)" 수용체라 지칭된다. 현재 공지된 GPCRs을 이용한 의약품이 100대 의약품의 30%를 차지하고 있고 매출 상위를 차지하는 약물 또한 GPCR 약물이 많다. 따라서 GPCR의 타겟 우수성은 아주 특별하다 할 수 있으나, 현재 약물개발에 성공한 GPCRs는 단 46개에 불과한 실정이다. 이러한 점에서 고아 GPCRs는 이후 제약 산업에서 중요한 위치를 차지할 것으로 생각되고 있다. 비록 사람에게는 다수의 수용체 종류가 존재하지만, 단연 가장 풍부하고 병태에 관련된 것은 GPCR이 대표적이다. 사람 게놈 내에는 약 1,000개의 GPCRs이 있다고 추산되고 있으며, 일반적으로, 리간드가 수용체와 결합할 때(수용체 활성화), 세포 내 구조가 변화하여 세포 내 부위와 세포 내 "G-단백질" 간의 커플링이 가능하게 된다. 또한, GPCR은 하나 이상의 G 단백질과 상호작용할 수 있다. 지금까지 알려진 G-단백질은 G_q, G_s, G_o/i, 및 G_12/13등이 있다. 상기 G-단백질과 커플링된 활성화된 GPCR은 신호전달 과정을 거쳐 궁극적으로 세포 기능의 활성화 또는 세포 기능 억제라는 결과를 가져온다. 수용체의 C-말단과 세포 내 도메인(cytoplasmic domain)-3 가 G-단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다.

생체 내에서 GPCRs은 세포막에서 두 가지 다른 구조 즉, "비활성화" 상태 및 "활성화" 상태 사이의 평형 상태로 존재한다. 비활성화 상태의 수용체는 세포 내의 신호전달 경로에 연계된 생물학적 반응을 나타낼 수 없다. 활성화 상태로 수용체의 구조가 변화하면 G-단백질을 통하여 세포 내의 신호전달 경로에 연계되어 생물학적 반응을 나타낼 수 있다. 또한, 수용체는 내생 리간드, 또는 약물과 같은 화합물에 의해 활성화 상태로 안정화될 수 있다.

인류가 정복해야할 중요한 질병 중 하나인 암은 세포 분열상의 결함으로 인하여 휴지기 상태에 있어야 할 세포가 이상 증식하여 그 주변의 세포를 파괴하는 특성을 갖는다. 이러한 암은 세포의 성장 및 분화를 조절하는 신호전달체계에 관여하는 여러 인자들의 유전적 변이로 발생한다고 알려져 있다. 진핵세포는 외부에서 세포성장에 대한 신호를 받으면 신호전달체계를 통하여 세포주기에 따라 증식하게 된다. 이때, 정상세포는 G1기에서 외부로부터 성장 자극 신호가 있으면 S기로 진입하여 G2기를 거쳐 세포분열을 일으켜 증식하고, 외부 신호가 없으면 세포주기의 진행이 중단되어 G1기에서 멈추어진 G0기(휴지기)에서 존재한다. 반면, 암세포는 외부 신호와 상관없이 휴지기에 있어야 할 세포들이 세포주기를 따라 DNA 합성과 세포분열을 계속하면서 증식한다. 이와 같이 휴지기와 세포분열주기를 결정하기 위해서는 각 기의 세포주기 인자들이 세포 내에 존재하여 정확하게 세포주기가 수행되도록 하여야 하며 외부 신호를 받아들이는 수용체가 존재하여야 한다. 따라서 휴지기와 세포분열주기의 경계를 결정하는 수용체 및 세포주기 인자들의 기능이 왜곡되면 세포가 비정상적으로 성장하게 되어 암세포로 형질 전환되게 된다. 지금까지 비정상적인 암세포로의 전환에는 다양한 암 유전자(oncogene)가 관여한다고 알려져 있으며 Ras 단백질도 그 중 하나이다. 또한 휴지기로의 진행에는 G-단백질을 비롯한 다양한 세포주기 조절 인자가 관계한다고 알려져 있다. 이러한 인자는 모든 진핵세포에 공동으로 존재하고 있고, 이들은 각 세포 간에 상호 교환될 수 있는 특징을 가지므로 사람의 유전자를 모델생명체에 발현시켜 그 유전자를 조절하여 활성화시키거나 저해하는 약물을 밝힘으로써, 암의 발생, 암세포로의 형질전환 및 암세포의 성장 기전과 관련된 새로운 항암제를 개발할 수 있다. 이때 모델생물체를 이용함은 사람의 세포에서 약물을 스크리닝하기 전, 다량의 약물을 1차로 스크리닝하는 방법에 있어 아주 경제적이며 유용하다.

사람의 고아 수용체 유전자 hSTM1은 암 유전자로서 항암 표적으로 유용하므로(대한민국 등록특허 제10-1137019호), 그 효능제 및 저해제를 규명하는 것은 암 치료 및 GPCR의 기능 연구에 있어 매우 중요하다. 이에 본 발명자들은 상기 hSTM1의 효능제 및 저해제 탐색을 위한 스크리닝 시스템을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, hstm1 유전자를 모델 생물체인 분열효모에 발현시키면 밝혀지지 않은 경로를 통하여 세포의 성장이 저해되고 이러한 현상이 ras1 돌연변이 효모에서 더욱 뚜렷하게 나타나는 것을 확인하여 인간 고아 수용체 유전자인 hstm1을 상기 효모에 도입시킨 hSTM1의 효능제 및 저해제 탐색을 위한 스크리닝 시스템을 개발하였다. 본 발명의 hSTM1의 효능제 및 저해제 탐색을 위한 스크리닝 시스템은 효모의 표현형만으로 효능제 또는 저해제를 탐색할 수 있으므로, 그 탐색이 간편하며, G-단백질인 인간의 Gnai3를 동시에 발현하면 표현형이 더욱더 확실해질 뿐만 아니라, PTX(pertussis toxin)를 이용하여 위양성(false positive) 약물을 제거할 수 있는 장점을 가짐을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 이용한 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 이용한 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모를 이용한 인간 고아 G 단백질 결합 수용체인 hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 포함하는, hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된, Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 이용한 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 바람직하게는, (a) hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 후보물질을 처리한 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장을 비교하여, 상기 후보물질을 처리했을 때 대조군과 비교하여 성장 수준이 낮으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, 성장 수준이 높으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 (c) 단계는 추가로 상기 조절 후보물질이 hSTM1을 발현하지 않는 효모 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않는 것을 확인하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "G 단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)"는 세포막에 존재하는 단백질 중 가장 큰 슈퍼 패밀리(superfamily) 수용체 군으로 세포 바깥으로부터 오는 신호를 G 단백질을 통해 세포 안으로 전달시켜주는 역할을 하는 수용체 단백질을 의미하며, GPCR 외에도 7TM(seven transmembrane domain receptor) 또는 GPLR(G-protein linked receptor) 등과 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 GPCR은 다양한 리간드의 표적 단백질로서, 크게 후각 및 미각 자극에 반응하는 감각 수용체 그룹(olfactory/gustatory GPCR)과 신경전달물질(neurotransmitter) 또는 호르몬 등 각종 신호전달물질에 반응하는 수용체 그룹 (transmitter GPCR)로 분류될 수 있다. 상기 GPCR에 대한 서열은 미국 국립보건원 (NCBI)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, "고아 G 단백질 결합 수용체(orphan GPCR, oGPCR)"는 상기 수용체 그룹에 속하는 GPCR 중 그 리간드가 밝혀지지 않은 GPCR을 의미한다. 상기 고아 GPCR의 리간드를 규명하는 것은 디오르파니제이션(Deorphanization)이라 하며, GPCR을 타겟으로 하는 신약 개발에 있어 중요한 부분으로 여겨지고 있다.

본 발명에서 용어, "hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질"은 인간 고아 G 단백질 결합 수용체 중 하나로서, 위암, 대장암 또는 간암 세포주에서 과발현되어 있으며, 상기 단백질 코딩하는 유전자는 인간 염색체 중 1번 염색체 1p36.13 위치에 존재한다. 상기 hSTM1 단백질은 hSTM1 수용체 단백질과 혼용될 수 있다. 상기 hSTM1에 대한 3개의 전사 변형체(transcriptional variant)가 존재하며, 두 개의 아형(isoform)이 존재한다. hSTM1 아형 1은 두 개의 얼터너티브 스플라이싱 변형체 1 또는 2(alternative splicing variants) (서열번호 3 또는 4)로부터 만들어질 수 있으며, hSTM2 아형 2는 얼터너티프 스플라이싱 변형체 3(서열번호 5)로부터 만들어질 수 있으며, N-말단의 65개의 아미노산이 결손된 단백질을 코딩한다. 상기 hSTM1 단백질은 본 발명자들에 의하여 그 기능이 최초로 동정되었던 단백질로서, hSTM1 단백질이 과발현되는 경우 암의 진행 또는 전이를 촉진될 수 있다 (대한민국 등록특허 제10-1137019호). 따라서 hSTM1 단백질을 조절하는 물질을 규명하는 것은 항암제 또는 hSTM1 단백질과 같은 고아 GPCR 연구에 유용하다. 상기 hSTM1 단백질에 대한 정보는 미국 국립보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스를 통하여 얻을 수 있으며, 그 예로 NP_060235 또는 NP_001035215이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 hSTM1 단백질은 그 종류가 특별히 제한되지는 않으나, 서열번호 1로 기재된 hSTM1 아형 1 또는 서열번호 2로 기재된 hSTM1 아형 2의 아미노산 서열로 정의되는 hSTM1 단백질을 의미할 수 있다. 상기 hSTM1 단백질은 서열번호 1 또는 2로 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 GPCR로서 기능하는 단백질이라면 모두 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 상기 hSTM1 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어, "hSTM1 단백질을 발현하는 효모"는 상기 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 도입한 효모로서, 효모에는 존재하지 않는 hSTM1 단백질을 발현하는 효모 형질전환체를 의미한다. 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 hSTM1 단백질을 발현하지 않는 효모에 비하여 그 성장이 저해되는 특성을 지닌다. 따라서, hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 hSTM1의 활성을 조절하는 물질(효능제 또는 저해제)을 처리하였을 때, 조절하는 물질을 처리하지 않은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 비하여 그 성장이 저해 또는 증가될 것이므로, 이러한 현상을 이용하여 hSTM1의 활성을 조절하는 물질을 스크리닝하거나 조절 활성을 확인할 수 있다. 상기 효모를 이용하는 경우 고가의 장비 및 시약을 사용하지 않고도 효모의 표현형만을 이용하여 hSTM1의 활성을 조절하는 물질을 규명할 수 있으므로, 간단하면서도 적은 비용이 소모된다는 이점을 지닌다. 또한, 상기 효모는 hSTM1 단백질을 발현시킬 수 있는 효모라면 그 종류는 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 분열효모(fission yeast, schizosaccharomyces pombe) 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으며, 바람직하게는 분열효모이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 벡터는 효모에 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터라면 제한없이 포함하며, 그 예로 분열효모용 게이트웨이 발현벡터인 pDES3X일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 벡터는 벡터를 포함하는 형질전환체를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터인 pDES3X를 사용하였다(실시예 1).

본 발명에서 용어, "도입"은 형질주입(transfection) 또는 형질도입(transduction)으로 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 상기 도입은 효모, 특히 분열효모에 외래 DNA를 유입시킬 수 있는 방법이라면 제한없이 포함한다. 상기 형질주입은 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질주입 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 바람직하게는 Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모는 본 발명에서 Ras1 돌연변이 효모와 혼용될 수 있다. hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된, Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모의 경우, hSTM1 단백질을 발현하는 야생형 효모에 비하여 세포성장 억제가 더욱 잘 일어나므로, hSTM1의 활성을 조절하는 물질 (효능제 또는 저해제)의 규명에 있어 그 표현형의 구별이 보다 용이한 장점을 지닌다. 특히, hSTM1 단백질을 발현하는, Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모에 hSTM1 단백질의 억제제를 처리하는 경우, 세포성장 회복을 관찰하는 것이 보다 용이하므로 hSTM1 단백질의 억제제의 규명에 특히 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "Ras1 단백질"이란 효모에 존재하는 Ras 단백질로서, 성분화(sexual differentiation) 및 세포 모양(cell morphology) 조절에 관여하는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Ras1 단백질은 바람직하게는 분열효모에 내재적으로 존재하는 Ras1 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Ras1 단백질에 대한 정보는 미국 국립보건원 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 NP_593579.1(Gene ID:2542285)인 Ras1 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "Ras1 단백질의 활성이 야생형보다 감소"는 Ras1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부가 치환(substitution), 삽입(addition), 수식(modification) 또는 제거(deletion)됨으로써 나타나는 야생형 Ras1 단백질에 비하여 감소된 활성을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 Ras1 단백질의 활성이 야생형보다 감소된 효모는 hSTM1 단백질을 발현시켰을 때, 야생형 효모에 비하여 hSTM1 단백질에 의한 효모의 성장 감소가 더 뚜렷하게 나타나는 효모를 의미하며, 그 예로 Ras1 단백질을 코딩하는 유전자가 결손된 효모이나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 Ras1 단백질을 코딩하는 유전자가 결손된 효모를 사용하여, hSTM1 단백질을 발현시켰으며, 이때 hSTM1 단백질을 발현하는 야생형 효모인 ED664에 비하여 뚜렷한 성장 저해를 나타내었다(도 2).

상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 Gnai3(guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 3) 단백질을 추가로 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 Gnai3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 도입하여 hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 모두 발현하는 효모를 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "Gnai3(guanine nucleotide binding protein(G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 3) 단백질"은 hSTM1 수용체 단백질과 결합하는 G 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Gnai3 단백질은 본 발명자에 의해 규명된 hSTM1 수용체 단백질과 결합하는 단백질로서, Gαi 서브유닛(subunit)으로, I형 G 단백질에 속한다. 상기 Gnai3 단백질은 hSTM1 단백질에 의한 신호전달을 매개하는 G 단백질이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로 초파리 유래의 Gi-alpha65A, 제브라피쉬(zebrafish) 유래의 Gnai3, 마우스 유래의 Gnai3 또는 인간 유래의 Gnai3 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 인간 유래의 G 단백질인 Gnai3 일 수 있다. 상기 Gnai3 단백질에 대한 정보는 미국 국립보건원 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 NP_006487.1인 인간 유래의 Gnai3 단백질(NC_000001.10; NT_032977.9; NM_006496.2)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 Gnai3 단백질은 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 Gnai3 단백질을 의미할 수 있다. 상기 Gnai3 단백질은 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 hSTM1에 의한 신호전달을 매개하는 생물학적 활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 Gnai3와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 Gnai3 단백질은 hSTM1 수용체 단백질과 결합하여 hSTM1에 의해 매개되는 세포 신호 전달에 관여하므로, Gnai3 단백질 및 hSTM1 단백질을 모두 발현하는 효모는 hSTM1 단백질만을 발현하는 효모에 비하여 세포 성장이 더욱 심화되는 성질을 나타낼 수 있다. 따라서, Gnai3 단백질을 추가로 발현하는, hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 hSTM1 단백질만을 발현하는 효모에 비하여 hSTM1 단백질의 효능제 또는 저해제의 스크리닝 또는 활성 확인에 있어 더욱 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 hSTM1 단백질의 저해제 스크리닝에 유용하다.

본 발명에서 용어, "hSTM1 단백질의 조절 물질"은 hSTM1 단백질에 자극을 주어 hSTM1 단백질의 기능을 조절하는 물질을 의미한다. 상기 hSTM1 단백질의 조절 물질은 hSTM1 단백질에 자극을 주어 그 기능을 조절하는 물질이라면 특별히 그 종류가 제한되지는 않으며, 그 예로 화합물, 단백질 또는 핵산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 hSTM1 단백질의 조절 물질은 hSTM1 단백질에 결합하여 hSTM1 단백질의 활성에 영향을 줄 수 있으며, 내재적 리간드(endogenous ligand)가 결합하는 부위뿐만 아니라 hSTM1 단백질의 다른 위치에도 결합하여 활성을 조절할 수 있다. 상기 hSTM1 단백질의 조절 물질은 효능제(Agonist) 또는 저해제(Antagonist)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 화합물 라이브러리(Chemical library)를 이용하여 hSTM1 단백질의 조절물질을 고속 대량 스크리닝(HTS)하였다.

본 발명에서 용어, "효능제(Agonist)"는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 유도, 증진 또는 증강시킬 수 있는 분자를 의미한다. 상기 효능제는 활성제와 혼용될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 효능제는 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장을 저해시킬 수 있는 분자라면 제한없이 포함하며, 바람직하게는 hSTM1 단백질에 결합하여 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장 저해를 가져오는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 효능제는 hSTM1 단백질에 결합하여 hSTM1 단백질의 생물학적 활성을 증진시키므로, hSTM1 단백질 또는 hSTM1 단백질과 Gnai3 단백질을 모두 발현하는 야생형 또는 Ras1 돌연변이 효모에 처리하는 경우, 효능제를 처리하지 않은 효모과 그 성장 정도를 비교하였을 때 성장이 더욱 저해되므로, 이와 같은 효모의 표현형을 이용하여 효능제를 스크리닝하거나 효능제 활성을 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 방선균에서 추출한 W1689가 효능제로서 작용함을 확인하였다(실시예 8).

본 발명에서 용어, "저해제(Antagonist)"는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 수용체의 리간드와 함께 사용하는 경우 수용체의 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 저해제는 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장을 높일 수 있는 분자라면 제한없이 포함하며, 바람직하게는 hSTM1 단백질에 결합하여 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장을 높이는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 저해제는 암 단백질(oncogene)인 hSTM1의 활성을 저해시키는 역할을 수행하므로, hSTM1의 저해제는 항암제로서 사용될 수 있다. 상기 저해제는 hSTM1 단백질에 결합하여 hSTM1 단백질의 생물학적 활성을 감소시키므로, hSTM1 단백질, 또는 hSTM1 단백질과 Gnai3 단백질을 모두 발현하는 야생형 또는 Ras1 돌연변이 효모에 처리하는 경우, 저해제를 처리하지 않은 효모에 비하여 세포 성장이 더 잘 일어나게 된다. 따라서, 이와 같은 효모의 표현형을 이용하여 저해제를 스크리닝하거나 저해제의 활성을 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 방선균에서 추출한 W1598이 저해제로서 작용함을 확인하였다(실시예 8).

상기 스크리닝 방법의 (c) 단계는 상기 후보물질이 hSTM1을 발현하지 않는 효모 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않는 것을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 hSTM1의 조절물질은 hSTM1 단백질의 생물학적 활성만을 특이적으로 조절하는 물질이므로, hSTM1 단백질을 발현하지 않는 효모 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않는다. 따라서, 상기 후보 물질을 효능제 또는 저해제로 판단하기 전에 상기 후보 물질을 처리한 hSTM1 단백질을 발현하지 않는 효모 균주의 성장을 확인하여, hSTM1 단백질을 발현하지 않는 효모 균주의 성장에는 영향을 주지 않는 것을 확인함으로써 상기 후보 물질이 효능제 또는 저해제로 특이적으로 작용하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 상기 스크리닝 방법은 바람직하게는 (a) hSTM1 단백질을 발현하는 효모 및 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 GPCR인 hSTM1의 조절 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 후보물질을 처리한 상기 효모의 성장 수준을 비교하여, 상기 후보물질을 처리하였을 때 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 대조군에 비하여 감소하고 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모 균주의 성장에는 영향을 주지 않으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 증가하며 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 hSTM1 단백질, GPCR, 인간 고아 GPCR, 효능제 및 저해제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "C-말단이 결손된 hSTM1 단백질"은 G 단백질과 결합하는 hSTM1 단백질의 부위가 결손된 hSTM1 단백질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질은 G 단백질과 결합하는 hSTM1 단백질의 부위가 결손된 hSTM1 단백질이라면 제한없이 포함하며, 그 예로 Gnai3 단백질과 결합하는 C-말단 부위가 결손된 hSTM1 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질은 G 단백질과 결합하는 부위가 결손되어 있으므로 세포 내부로 신호를 전달하는 활성이 감소하여, hSTM1 단백질에 대한 효능제 또는 저해제를 처리한다 하여도 효능제 또는 저해제에 의한 신호를 효모 세포 내로 효과적으로 전달시킬 수 없다. 따라서, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모 외에 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 추가적으로 사용하는 경우 hSTM1 단백질의 효능제 또는 저해제를 스크리닝하는 본 발명의 정확도를 높일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 효능제 후보 약물을 처리하였을 때 효모의 성장이 저해되었으나, C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 처리하였을 때에는 효모의 성장에 큰 영향을 주지 않음을 확인하여 상기 효능제 후보 약물이 hSTM1 단백질 하위 신호 전달이 아닌 hSTM1 단백질에 작용하여 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 6).

본 발명의 일 실시예에서는 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 효모에 형질주입하여, hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 제작하였다. 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 hSTM1 단백질을 발현하지 않는 효모에 비하여 그 성장 속도가 현저히 저해되는 결과를 나타내었으며, ras1 유전자가 결손된 효모(△ras1)에서는 hSTM1 단백질에 의한 성장 저해 현상이 더욱 심화되는 결과를 나타내었다(도 2 a 및 b). 상기와 같은 현상을 이용하여 hSTM1 단백질에 의한 효모의 성장 억제를 더욱 심화시키는 효능제 후보 약물 및 hSTM1 단백질에 의한 효모의 성장 억제를 회복시키는 저해제 후보 약물을 각각 스크리닝하였고, 이러한 약물이 hSTM1 단백질을 발현하지 않는 효모에서는 성장에 영향을 미치지 않음을 확인하여 hSTM1 단백질에 특이적인 효능제 또는 저해제로 작용함을 확인하였다(도 5 및 6). 특히, hSTM1 단백질의 저해제의 경우 hSTM1 단백질을 발현하는 Ras1 돌연변이 효모에서 효모 성장 회복 현상이 더욱 뚜렷하게 나타나는 결과를 보였다(도 6 b). 또한, hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 모두 발현하는 효모를 제작하였고, 이 경우 hSTM1 단백질만을 발현하는 효모에 비하여 그 성장속도가 더욱 저해되는 결과를 보여 상기 효모를 hSTM1 단백질의 효능제 또는 저해제를 스크리닝하거나 그 활성을 확인하는 데 있어 유용하게 사용할 수 있음을 뒷받침하였다(도 7). 또한, 방선균 유래의 천연물 W1689를 효능제로, W1598을 저해제로 각각 스크리닝하였고, 이들을 농도 의존적으로 hSTM1 단백질을 발현하는 ras1 돌연변이 효모 균주에 처리하여 세포 성장을 확인하였다(도 9).

또 다른 양태로서, 본 발명은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 이용한 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법을 제공한다.

상기 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법은 바람직하게는 (a) hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절물질을 처리하는 단계; (b) 상기 조절물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 조절물질을 처리하지 않은 대조군과 조절물질을 처리한 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장을 비교하여, 상기 조절물질을 처리했을 때 대조군과 비교하여 성장 수준이 낮으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, 성장 수준이 높으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조절물질의 활성을 확인하는 방법에서 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 ras1 돌연변이 효모이거나 Gnai3 단백질을 추가로 발현하는 효모일 수 있다.

상기 hSTM1 단백질, hSTM1 단백질을 발현하는 효모, 인간 고아 GPCR, hSTM1의 조절물질, 효능제 및 저해제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법은 상기 스크리닝하는 방법과 마찬가지로, hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 hSTM1의 조절물질, 즉 hSTM1의 효능제 또는 저해제를 처리하여 효능제 또는 저해제로서 작용하는지 여부를 확인하는데 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 상기 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법은 바람직하게는 (a) hSTM1 단백질을 발현하는 효모 및 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 GPCR인 hSTM1의 조절물질을 처리하는 단계; (b) 상기 조절물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 조절물질을 처리하지 않은 대조군과 조절물질을 처리한 상기 효모의 성장 수준을 비교하여, 상기 조절물질을 처리하였을 때 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 대조군에 비하여 감소하고 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모 균주의 성장에는 영향을 주지 않으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 증가하며 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 hSTM1, GPCR, 고아 GPCR, 조절물질, 효능제, 저해제, C-말단이 결손된 hSTM1 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 추가로 이용함으로써, hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 이용하여 효능제 또는 저해제의 효능을 확인하는 상기 방법의 정확도를 높일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모를 이용한 인간 고아 G 단백질 결합 수용체인 hSTM1의 효능제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 hSTM1의 효능제의 스크리닝 방법은 바람직하게는, (a) hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 효능제 후보물질, 또는 효능제 후보물질과 PTX(pertussis toxin)를 모두 처리하는 단계; (b) 상기 효능제 후보물질, 또는 효능제 후보물질 및 PTX가 모두 처리된 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 PTX 및 효능제 후보물질을 모두 처리한 군의 성장 수준이 효능제 후보물질만 처리한 군과 비교하여 높으면 hSTM1의 효능제로 판단하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 hSTM1 단백질, Gnai3 단백질, 인간 고아 GPCR, hSTM1 및 효능제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "PTX(pertussis toxin)"는 백일해균(Bordelella pertussis)에 의해 생성되는 독소로서, 단백질에 기반한 AB₅-타입 외독소(exotoxin)를 의미한다. 상기 PTX는 인간 I형 G 단백질을 억제하는 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 구체적으로 이형삼합체인 G 단백질(Heterotrimeric G protein)의 α1 서브유닛을 ADP-라이보실화(ribosylation)하여, G 단백질과 GPCR 간의 상호작용을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다. 다만, 상기 PTX는 인간 I 형 G 단백질, 즉 본 발명에서는 Gnai3를 억제하는 기능을 수행할 수 있으나, 효모의 G 단백질은 억제시키지 않는다. 따라서, PTX가 hSTM1 단백질에 의한 신호전달을 매개하는 Gnai3 만을 특이적으로 억제하는 성질을 이용하여, 효능제 후보 물질이 hSTM1 단백질을 통하여 효과를 발휘하는 것인지 Gnai3 하위 신호전달체계를 통하여 효과를 발휘하는 것인지를 구별할 수 있다. 즉, 위양성(false-positive)을 나타내는 약물을 제거하는데 유용하게 이용될 수 있다. 따라서, hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모에 hSTM1의 효능제 후보물질, 또는 효능제 후보물질과 PTX(pertussis toxin)를 모두 처리하였을 때, hSTM1의 효능제 후보물질을 처리한 군이 hSTM1의 효능제 후보물질을 처리하지 않은 군에 비하여 세포 성장이 억제되는 현상이 나타나고, 이러한 현상이 효능제 후보물질과 PTX(pertussis toxin)를 모두 처리하였을 때 나타나지 않는다면, 상기 효능제 후보물질은 hSTM1의 효능제라고 판단할 수 있다. 이와 같은 상기 스크리닝 방법은 효모의 표현형을 통하여 hSTM1의 효능제를 고속으로 스크리닝할 수 있는 방법이며, 또한 위양성이 제거된 약물을 스크리닝할 수 있는 방법으로서 hSTM1의 효능제 탐색에 있어 매우 유용하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모를 이용한 인간 고아 G 단백질 결합 수용체인 hSTM1의 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.

바람직하게는 (a) hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 저해제 후보물질, 또는 저해제 후보물질과 PTX(pertussis toxin)를 모두 처리하는 단계; (b) 상기 저해제 후보물질, 또는 저해제 후보물질 및 PTX가 모두 처리된 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 PTX 및 저해제 후보물질을 모두 처리한 군의 성장 수준이 저해제 후보물질만 처리한 군과 비교하여 낮으면 hSTM1의 저해제로 판단하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 hSTM1 단백질, Gnai3 단백질, GPCR, 고아 GPCR 및 저해제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

hSTM1 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모를 이용한 상기 hSTM1 단백질의 스크리닝 방법은 PTX 처리에 의해 세포 자체의 성장에 영향을 받는 인간 세포와 달리 분열 효모의 경우에는 그 자체의 성장에 영향이 적기 때문에 PTX를 이용한 위양성의 구별이 가능하다. hSTM1 단백질의 저해제의 경우 효모의 세포 성장이 대조군에 비하여 증가하게 되나, PTX를 처리하게 되면 효모의 과성장이 일어나지 않게 되므로, 이를 통하여 상기 저해제가 hSTM1 단백질과 Gnai3 단백질을 통하여 과성장을 가져옴을 알 수 있다. 또한, 보통의 경우, 세포 성장을 촉진시키는 약물은 효모의 미토겐(mitogen)인 경우가 많으나, 상기 미토겐의 경우 대개 Gnai3와 무관한 신호전달 경로에 의하므로 PTX를 추가로 처리한다 하여도 효모의 과성장을 억제시키지 못하므로, 저해제와 미토겐의 구별이 가능하게 된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모를 포함하는, hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝용 키트를 제공한다.

상기 hSTM1 단백질, hSTM1 단백질을 발현하는 효모, 효능제 및 저해제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 Ras1 단백질의 활성이 야생형 효모에 비하여 감소된 효모이거나 Gnai3 단백질을 추가로 발현하는 효모일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트는 상기 효모 외에 GPCR 단백질의 조절 물질 스크리닝에 사용되는 당업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응 조건은 종래 당업계에서 통상적으로 알려져 있는 것들을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 일이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 hSTM1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된, Ras1 단백질의 활성이 야생형 효모에 비하여 감소된 효모 형질전환체를 제공한다.

상기 hSTM1 단백질, 벡터, 도입 및 Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 효모 형질전환체는 Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소되어 hSTM1 단백질에 의한 세포 성장 저해가 야생형 효모에 비하여 더욱 뚜렷하게 나타나므로, hSTM1 단백질의 효능제 또는 저해제의 스크리닝, 활성 확인 및 스크리닝용 키트의 제작에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 표현형을 이용하여 hSTM1 단백질의 효능제 또는 저해제를 탐색할 수 있으므로, 고가의 시약이 적게 사용되므로 경제적일 뿐만 아니라, 표현형 분석을 통하여 고속으로 탐색이 가능하다. 특히, 본 발명의 시스템은 Gnai3 및 PTX를 이용하는 경우 효율적으로 위양성이 제거된 hSTM1 단백질의 효능제를 탐색할 수 있는 이점을 지닌다.

도 1은, 효모발현 데스티네이션 벡터(Destination vector)와 인간 고아 GPCR hstm1 유전자 및 C-말단 결손 hstm1 유전자(hstm1 △C)를 가지는 엔트리 벡터(Entry vector) 제조 방법 및; 이들을 이용한 최종산물인 인간 고아 GPCR hSTM1 또는 C-말단 결손 hSTM1을 발현하는 효모벡터 제조방법을 나타낸 도이다.
도 2 a는, 인간 고아 GPCR hSTM1 및 C-말단 결손 hSTM1을 발현하는 효모균주의 세포성장을 그래프로 나타낸 도로서, 인간 고아 GPCR hSTM1을 발현하는 균주는 세포성장 저해를 보였다. 도 2 b는 인간 고아 GPCR hSTM1 및 C-말단 결손 hSTM1을 발현하는 ras1 돌연변이 균주의 세포성장을 그래프로 나타낸 도이다. 인간 고아 GPCR hSTM1 및 C-말단 결손 hSTM1을 발현하는 균주는 모두 세포성장을 저해하는 결과를 보였으며, 인간 고아 GPCR hSTM1 및 C-말단 결손 hSTM1을 발현하는 정상 균주에 비해 더 큰 세포성장 저해를 보였다. 도 2 c는 도 2 a 및 b의 실험을 고체 배지를 이용하여 수행한 것으로, 상기 도 2 a 및 b와 동일한 결과를 보여주고 있다.
도 3은, 고속 대량 스크리닝(HTS)을 위해서 96 웰 플레이트를 이용하여 약물 스크리닝에 적절한 세포의 농도를 다양한 희석배율을 통하여 조사한 도이다. 도 3 a는 상기 실험 계획을 그림으로 나타낸 것이며, 도 3 b는 실제 실험을 통하여 HTS에 사용할 세포의 수를 일정한 희석을 통하여 결정한 것을 나타낸 도이다.
도 4는, 정상 균주인 ED665에 hSTM1 또는 C-말단 결손 hSTM1을 발현하는 균주, 및 ras1 돌연변이 균주(△ras1)에 hSTM1을 발현하는 3개의 균주를 비교하여 약물을 스크리닝하는 HTS 시스템의 순서도(flow chart)를 보여준다.
도 5는, HTS 스크리닝을 통하여 나온 결과의 예를 보여주는 도이다. 효능제 후보물질(실선)과 저해제 후보물질(점선)의 예를 보여주고 있다.
도 6은, 상기 도 5에서 선택된 약물을 다시 한번 동일한 시스템을 이용하여 한 플레이트 안에서 검정한 결과를 나타내는 것이다. 도 6 a는 활성후보물질, b는 저해제 후보물질, c는 세포독성물질을 각각 나타낸다.
도 7은, 효모발현 데스티네이션 벡터(Destination vector) 및 hSTM1 결합 단백질인 Gnai3를 가지는 엔트리 벡터(Entry vector)의 제조 방법 및; 이들을 이용한 최종산물인 GTP 결합단백질 Gnai3를 발현하는 효모벡터 제조방법을 나타낸 것이다.
도 8은, hSTM1과 그의 결합 단백질인 Gnai3를 이용한 상기와 다른 스크리닝 시스템을 보여준다. 이는 hSTM1 발현에 의한 효과를 더욱 증폭시킨다. 또한 이 시스템은 도 6 실험을 통하여 얻어진 약물 중에서 위양성(False Positive)을 선별하는 용도로 사용할 수 있다. 도 8 a는 도 7에서 만든 Gnai3를 발현하는 벡터를 삽입하여 hSTM1과 동시에 발현시켜 hSTM1의 효능을 더욱 증폭시켜 실험하였고, 위양성(False Positive)을 선별하기 위하여 Gnai3 저해 약물인 Pertussis Toxin(PTX) 을 처리하여 Gnai3의 기능을 저해한 다음, 약물의 효능을 검정하여 위양성(False Positive)을 선별할 수 있도록 시스템을 만들었다. 도 8 b는 hSTM1과 Gnai3를 동시에 발현하여 약물을 스크리닝한 예를 보여준다. 도 8 c는 도 6, 7, 또는 도 8 b를 통하여 얻어진 약물이 hSTM1과 G-단백질을 저해 혹은 활성시킴으로 인하여 얻어진 약물인지 여부를 PTX를 처리하여 조사한 그림이다.
도 9는, 도 8을 통해서 얻어진 후보물질의 농도를 다양하게 하여 활성을 가지는 약물을 재탐색하고 약물의 활성농도를 조사한 결과를 나타낸 것이다. 방선균 분획 중 W1689번은 효능제 후보물질이며, W1598번은 저해제 후보물질에 해당된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: h stm1 및 Gnai3 유전자 클로닝

인간의 뇌 mRNA로부터 제작한 cDNA 라이브러리로부터 인간의 G 단백질 결합 수용체 유전자 hstm1 및 C-말단이 결손된 hstm1을 PCR (Polymerase chain reaction) 을 통하여 증폭하였다. hstm1 유전자의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었으며, C-말단이 결손된 hstm1(hstm1 △C) 유전자의 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 2에 나타내었다.

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
hstm1-N term	5'-accggatccatggaccaggcgctgtccctgtg-3'	서열번호 7
hstm1-C term	5'-cttgatatctcagctggggaggaggggctca-3'	서열번호 8

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
hstm1-N term	5'-accggatccatggaccaggcgctgtccctgtg-3'	서열번호 7
hstm1-△C term	5'-cttgatatctcaccacaagccagggcaggtgg-3'	서열번호 9

상기 증폭은 94℃ 10분, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 1 싸이클 반응시키고, 94℃ 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분에서 30 싸이클 반응시킨 다음, 94℃ 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 10분에서 1 싸이클의 조건에서 수행되었다.

그 다음, 증폭된 PCR 절편을 제한효소 BamHI 및 EcoRV를 이용하여 절단한 다음, attL1 및 attL2 위치 특이적인 재조합 사이트(site-specfici recombinat site)를 갖는 엔트리 벡터인 pENTR3C 벡터(Invitrogen사, Catalog no. 11817-012)에 클로닝하여, pENTR3C-hstm1 및 pENTR3C-hstm1C을 각각 만들었다. 태그 단백질을 포함하지 않으며, LEU2 영양마커를 포함하고, attR1-CmR-ccdB-attR2 카세트를 포함하는 분열효모용 게이트웨이 발현벡터인 pDEST3X에 hstm1 또는 C-말단 결손 hstm1을 삽입하였다. 상기 과정은 엔트리 벡터인 pENTR3C-hstm1 또는 pENTR3C-hstm1C와 데스티네이션 벡터인 pDES3X 및 LR 클로나아제(LR Clonase, Invitrogen 사)를 섞어 LR 반응을 진행시켜, pDES3X-hstm1 혹은 pDES3X-hstm1C을 제작하였으며, 상기 과정을 도 1에 나타내었다. 상기 벡터들은 nmt1 프로모터를 가지므로, 티아민 존재하에서 hstm1 또는 hstm1△C을 발현하지 않는다.

실시예 2: 분열효모 형질전환 및 세포성장 확인

정상 분열효모인 ED665 및 ras1 돌연변이 균주를 각각 배양한 후, pDES3X, pDES3X-hstm1 및 pDES3X-hstm1C를 형질전환하였다. 그 다음, 단독 콜로니를 선택한 다음, hSTM1 또는 hSTM1△C가 발현되지 않도록 최저 배지에 티아민을 넣고 접종한 다음 배양하였다. 그 다음, 각각을 동일한 O.D₆₀₀이 되도록 희석하고 60 시간 동안 배양하면서 O.D₆₀₀에서 흡광도를 조사하여 세포성장을 관찰하였다.

그 결과, 정상 균주인 ED665에 pDES3X-hstm1을 도입한 균주는 대조군인 pDES3X와 c-말단이 결손된 pDES3X-hstm1C를 가지는 균주와 비교해 볼 때 느린 세포 성장을 나타내었다(도 2 a). ras1 돌연변이 균주에 pDES3X-hstm1을 도입한 균주는 정상 균주인 ED665에 pDES3X-hstm1을 도입한 균주에 비하여 더 강한 세포성장 억제능을 보였고, c-말단이 결손된 pDES3X-hstm1C를 가지는 균주도 대조군인 pDES3X를 가지는 균주와 비교하여 세포 성장 정도가 낮았다(도 2 b). 상기 균주를 티아민을 더 첨가시킨 영양배지, 티아민이 약간 들어있는 영양배지, 티아민을 첨가시킨 최저배지 및 티아민이 포함되지 않은 최소배지에 순차적으로 희석하여 고체 배지에 스팟팅(spotting)한 결과, 액체 배지에서의 현상과 동일한 세포성장 저해가 hSTM1의 발현과 상관하여 일어남을 알 수 있었다(도 2 c).

따라서, 분열효모 균주에서 사람의 수용체 유전자인 hstm1을 발현시킬 경우 분열효모 균주의 세포성장이 저해되고, ras1 돌연변이 균주에 hSTM1을 발현시킬 경우 정상 분열효모 균주에 hSTM1을 발현시키는 경우보다 세포성장 억제가 더 잘 일어나므로, 이 현상을 이용하여 효모의 표현형을 통하여 사람의 수용체 단백질인 hSTM1의 기능을 억제하거나 향상시키는 약물을 스크리닝할 수 있을 것을 유추할 수 있었다.

실시예 3: 약물 스크리닝 조건 탐색

약물 스크리닝에 사용할 적절한 세포수와 배양 시간과 같은 조건을 탐색하기 위하여, 도 3 a의 그림에서 보는 바와 같이 2 X 10⁷개의세포가 들어있는 세포배양액 100㎕를 바닥이 U-모양인 96-웰에 넣고 4배씩 순차적으로 희석하였다. 유전자가 발현되지 않는 티아민 포함 배지와 유전자를 발현하는 티아민이 빠진 배지에 세포를 희석하여 넣고 24, 48 및 72시간 동안 배양한 후, 가장 적절한 세포의 수와 배양시간을 조사하였다. 그 결과, 하나의 웰에 8 x 10⁴개 세포를 넣고 48시간 동안 배양을 하는 것이 가장 적절하다는 것을 알 수 있었다. 약물 스크리닝에서 hSTM1의 세포 성장 억제능을 더 활성화시키는 약물의 경우(유전자 기능 활성화제, Agonist), 적절한 세포성장을 보이는 hSTM1을 가지는 정상 효모의 성장 억제를 보는 것이 가장 적절했다(도 3 b). 반면, hSTM1의 세포 성장 억제능을 저해하여 세포성장을 정상으로 돌리는 경우(유전자 기능 저해제, antagonist), ras1 돌연변이 균주를 이용하여 억제된 세포성장이 다시 돌아오는 것을 관찰하는 것이 적절한 것으로 판단되었다(도 3 b).

실시예 4: 고속 대량 약물 스크리닝(High throughput screening, HTS)의 시범 실시

상기 실시예 3에서 탐색한 조건에 맞추어, HTS 약물 스크리닝을 시범 실시하였다. 도 4에 나타낸 순서도(flow chart)에서 보는 바와 같이, 티아민이 포함된 최소배지에서 각 균주를 흡광도 600(OD₆₀₀)에서 1~2 되게 배양하고, 티아민이 빠진 최소배지에 흡광도 600에서 0.1이 되도록 희석한 후, 흡광도 600에서 0.8~0.9이 되도록 다시 배양하였다. 그 다음, 일괄적으로 티아민이 빠진 최소배지를 이용하여 흡광도 600에서 0.08이 되도록 희석하였다. 이 배양액을 각 웰에 50㎕씩 분주하고(8 x 10⁴ 개 세포), 최소배지 50㎕에 실사용 농도의 2배가 되도록 약물을 희석하여 만든 후 섞어주고, 30℃ 배양기에 넣어 배양하였다. 96-웰의 1번과 12번 라인에는 대조군으로 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 넣었다. 48 시간 배양한 다음, 96-웰 용 원심분리기를 이용하여 세포를 모으고 이미지를 스캔하여 약물의 효능을 정성적으로 분석하였다. 또한 96-웰 용 세포흡광도 측정기를 이용하여 세포의 흡광도를 분석하여 실제 세포성장의 차이를 정량적으로 분석하였다. 벡터를 가지는 균주의 세포성장에는 큰 영향을 주지 않고 hSTM1을 가지는 균주만 영향을 받는 약물을 선정하였다. 이러한 과정을 통하여, 도 5의 예에서 보는 바와 같이 활성후보약물(실선 박스) 및 저해제 후보물질(점선 박스)을 분리할 수 있었다.

실시예 5: 고속 대량 약물 스크리닝(High throughput screening, HTS)에 의해 선별된 약물의 검증

전장(full-length)의 hstm1 유전자와 C-말단이 결손된 hstm1 유전자를 가지는 정상 균주 및 ras1 돌연변이주를 이용하여 상기 실시예 4를 통하여 확보한 약물의 활성을 다시 조사하였다. 상기 실시예 4에서와 같은 방법으로 균주를 배양하고 후보 약물들을 상기 6개의 균주(벡터, hSTM1 또는 hSTM1△C를 발현하는 정상균주, 벡터, hSTM1 및 hSTM1△C를 발현하는 ras1 돌연변이주)에 처리하였다. 도 6 a는 효능제 후보물질을 처리한 결과의 예로서, hSTM1을 활성화시키는 약물 활성에 의해 hSTM1을 발현하는 정상 균주 및 ras1 돌연변이주 모두에서 세포사멸이 더 증가함을 보였고, 도 6 b는 저해제 후보물질을 처리한 결과의 예로서, 상기 약물활성에 의해 정상 균주 및 ras1 돌연변이주 모두에서 hSTM1의 발현에 의해 저해되었던 세포 성장이 다시 회복됨을 보여준 것을 나타낸 것으로, ras1 돌연변이주에서 그 결과가 더 뚜렷하였다. 그 밖에 위양성인 약물과 도 6 c처럼 모든 균주의 세포성장을 저해하는 세포독성 약물 또한 확인할 수 있었다.

실시예 6: 사람의 수용체 유전자 h stm1과 세포내에서 결합하는 G-단백질 Gnai3의 효모벡터로의 클로닝 및 Gnai3의 효과 검증

사람의 Gnai3는 Gnai2와 함께 hSTM1 단백질과 세포 내에서 결합하여 세포 밖 신호를 세포 내부로 전달하는데 관여하는 것으로 알려져 있다 (한국등록특허 제10-1137019호). 구체적으로는 사람의 Gnai3 유전자를 하기 표 3에 나타낸 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 절편을 pENTR3C에 넣어 pENTR3C-Gnai3를 만들고, 3x HA 태그 및 Ura4 선택 마커를 가지는 pDES173N와 LR 클로나아제를 섞어 LR 반응을 시켜, 결과적으로 Gnai3를 발현하는 효모발현 벡터 pDES173N-Gnai3를 만들었고 이러한 과정을 도 7에 나타내었다.

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
Gnai3-N term	5'-ccggatccatgggctgcacgttgagcgccg-3'	서열번호 10
Gnai3-C term	5'-aagatatctcaataaagtccacattccttta-3'	서열번호 11

효모 균주에 pDES3X-hstm1 및 pDES173N-Gnai3를 동시에 도입한 균주(hSTM1 과 Gnai3를 모두 발현함)와 콘트롤 벡터인 pDES3X와 pDES173N을 동시에 가지는 균주(hSTM1 과 Gnai3을 발현하지 않음) 또는 pDES3X-hstm1 및 pDES173N을 가지는 균주(hSTM1을 발현함)의 세포 성장을 서로 비교하였다. 상기 실시예 4와 같은 조건으로 세포를 배양하고 동일한 세포수와 배양시간을 두어 실험을 실시하였다. 그 결과 hSTM1 및 Gnai3를 모두 발현하는 균주는 hSTM1 하나만 발현한 균주와 비교하여 더 강한 세포성장 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 8 a).

실시예 7: 사람의 수용체 유전자 h stm1 과 세포 내에서 결합하는 G-단백질인 Gnai3를 저해하는 PTX ( Pertussis Toxin )의 효과 검증

사람의 I-형의 G-단백질은 PTX(pertussis toxin)에 의해 그 기능이 저해되나, 효모에 내재되어 있는 I-형의 G-단백질은 사람의 G-단백질과 달리 PTX에 의해 그 기능이 저해되지 않는다. 따라서, PTX를 hSTM1의 활성을 조절하는 약물과 같이 처리하면 인위적으로 도입한 사람의 I-형의 G-단백질인 Gnai3만 저해 받을 것이므로, 이를 선별한 약물의 위양성 (false positive) 제거에 이용하였다.

상기의 HTS 시스템을 통하여 발굴된 약물은 수용체 유전자와 G-단백질을 통하여 효능을 발휘할 수도 있지만, 세포로 들어가서 G-단백질의 하위 신호전달 체계내의 단백질에 영향을 주어 그 효능을 발휘할 수도 있으므로 G-단백질을 통해 효능을 발휘하는 약물만을 선택적으로 선별하기 위하여 PTX를 사용할 수 있는지 확인하였다.

그 결과, 도 8 b에서 보는 바와 같이, 세포성장 억제능을 보이는 약물과 PTX를 동시에 처리하였을 때, 약물에 의한 세포성장 억제능이 PTX에 의해 완벽히 저해되는 경우 그 약물은 수용체와 G-단백질의 결합을 조절하여서 약물의 효능이 발휘됨을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 PTX를 이용하면 수용체를 거치지 않는 위양성으로 간주되는 약물을 제거할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 8: 선별된 양성 약물의 다양한 농도에서의 활성 검증

상기 HTS 시스템을 이용하여 수용체 유전자의 효능제로 선별된 약물을 다양한 농도로 희석하여, 도 9에서 보는 바와 같이 상기의 균주에 처리한 후 그 효능을 조사하였다. 방선균에서 추출한 W1689를 처리하였을 때, 벡터만 들어간 균주에서는 6.25 내지 100㎍/㎖의 농도에서 조금 세포성장이 증가하였다가 그 이후 조금씩 감소하였으나, hstm1을 도입한 균주에서는 25㎍/㎖에서 급격하게 세포성장이 저해되는 결과를 나타내었다. 또한, 액체 배지에서 배양된 균주를 고체 배지에 스폿팅하여 그 결과를 도식화하였다 (도 9 a).

상기 결과는 W1689가 hSTM1에 의한 세포성장 저해를 더욱 촉진하는 것을 나타내는 것으로, hSTM1의 효능제 즉, 아고니스트의 역할을 하는 것을 나타내는 것이다. 또한, W1598을 처리한 경우, W1689와 반대로 벡터만 들어간 균주에서는 세포성장에 아무런 변화가 일어나지 않았으나 hSTM1이 들어간 균주에서 세포성장 증가가 유의적으로 나타남을 보여주고 있다. 약물 농도 6.25 내지 200㎍/㎖까지 광범위 하게 DMSO를 처리한 샘플에 비해 지속적인 세포성장을 나타내었다. 또한, 액체 배지에서 배양된 균주를 고체 배지에 스폿팅하여 그 결과를 도식화 하였다(도 9 b). 그 결과, hSTM1을 과발현시킨 균주의 경우, W1598의 농도가 증가함에 따라 세포 성장 촉진을 나타내므로, hSTM1을 통하여 세포성장 촉진이 일어난다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 hSTM1에 의한 세포성장 저해를 역으로 저해하는 것이므로 W1598가 hSTM1의 저해제로서 기능함을 나타내는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> High Throughput Screening System for Identification of Agonist and Antagonist of Human Orphan G-Protein coupled receptor <130> PA120507KR <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(291) <223> hstm1 isoform 1 <400> 1 Met Val Trp Lys Lys Leu Gly Ser Arg Asn Phe Ser Ser Cys Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ile Gln Trp Ile Trp Asp Val Leu Gly Glu Cys Ala Gln Asp 20 25 30 Gly Trp Asp Glu Ala Ser Val Gly Leu Gly Leu Ile Ser Ile Leu Cys 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Thr Phe Pro Gln Phe Ile Lys Ala Tyr Lys Thr Gly 50 55 60 Asn Met Asp Gln Ala Leu Ser Leu Trp Phe Leu Leu Gly Trp Ile Gly 65 70 75 80 Gly Asp Ser Cys Asn Leu Ile Gly Ser Phe Leu Ala Asp Gln Leu Pro 85 90 95 Leu Gln Thr Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Val Leu Ala Asp Leu Val Met 100 105 110 Leu Thr Leu Tyr Phe Tyr Tyr Lys Phe Arg Thr Arg Pro Ser Leu Leu 115 120 125 Ser Ala Pro Ile Asn Ser Val Leu Leu Phe Leu Met Gly Met Ala Cys 130 135 140 Ala Thr Pro Leu Leu Ser Ala Ala Gly Pro Val Ala Ala Pro Arg Glu 145 150 155 160 Ala Phe Arg Gly Arg Ala Leu Leu Ser Val Glu Ser Gly Ser Lys Pro 165 170 175 Phe Thr Arg Gln Glu Val Ile Gly Phe Val Ile Gly Ser Ile Ser Ser 180 185 190 Val Leu Tyr Leu Leu Ser Arg Leu Pro Gln Ile Arg Thr Asn Phe Leu 195 200 205 Arg Lys Ser Thr Gln Gly Ile Ser Tyr Ser Leu Phe Ala Leu Val Met 210 215 220 Leu Gly Asn Thr Leu Tyr Gly Leu Ser Val Leu Leu Lys Asn Pro Glu 225 230 235 240 Glu Gly Gln Ser Glu Gly Ser Tyr Leu Leu His His Leu Pro Trp Leu 245 250 255 Val Gly Ser Leu Gly Val Leu Leu Leu Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gln 260 265 270 Phe Leu Val Tyr Arg Arg Ser Thr Ala Ala Ser Glu Leu Glu Pro Leu 275 280 285 Leu Pro Ser 290 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(226) <223> hstm1 isoform 2 <400> 2 Met Asp Gln Ala Leu Ser Leu Trp Phe Leu Leu Gly Trp Ile Gly Gly 1 5 10 15 Asp Ser Cys Asn Leu Ile Gly Ser Phe Leu Ala Asp Gln Leu Pro Leu 20 25 30 Gln Thr Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Val Leu Ala Asp Leu Val Met Leu 35 40 45 Thr Leu Tyr Phe Tyr Tyr Lys Phe Arg Thr Arg Pro Ser Leu Leu Ser 50 55 60 Ala Pro Ile Asn Ser Val Leu Leu Phe Leu Met Gly Met Ala Cys Ala 65 70 75 80 Thr Pro Leu Leu Ser Ala Ala Gly Pro Val Ala Ala Pro Arg Glu Ala 85 90 95 Phe Arg Gly Arg Ala Leu Leu Ser Val Glu Ser Gly Ser Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Arg Gln Glu Val Ile Gly Phe Val Ile Gly Ser Ile Ser Ser Val 115 120 125 Leu Tyr Leu Leu Ser Arg Leu Pro Gln Ile Arg Thr Asn Phe Leu Arg 130 135 140 Lys Ser Thr Gln Gly Ile Ser Tyr Ser Leu Phe Ala Leu Val Met Leu 145 150 155 160 Gly Asn Thr Leu Tyr Gly Leu Ser Val Leu Leu Lys Asn Pro Glu Glu 165 170 175 Gly Gln Ser Glu Gly Ser Tyr Leu Leu His His Leu Pro Trp Leu Val 180 185 190 Gly Ser Leu Gly Val Leu Leu Leu Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gln Phe 195 200 205 Leu Val Tyr Arg Arg Ser Thr Ala Ala Ser Glu Leu Glu Pro Leu Leu 210 215 220 Pro Ser 225 <210> 3 <211> 2254 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(2254) <223> hstm1 isoform 1 (variant 1) <400> 3 agcgcgcggc gtgggggcgg ggcctgcggt tcccgcgggg gcggtggcgc gcggtcagct 60 gacccggcgg gccttgaccc agaagctggg ccctggcggc ggatctggac gtggtgagcc 120 ggaccggggg caggtggcaa acttcacggc tgggggtcgg ggctcctggg cttccctgcc 180 acatccttcc agccctctcc tccggccgct ggactgtccc ggctcctgcg ccctccttgt 240 ggcgcgatat cgtgggacga ggctccgggc cgggactggg tggccctcgg gaatccgcag 300 ccagtggccc cccacctcaa aggcgaccag cgcggcctct cgagctggcc tggccaggag 360 ttgccctgcc ccggccgacc ggccccttgg catctgatgg cttcgttttt cccgggccgg 420 ccgggcgagg ggccctcgcg gcgctggccc cagcagctgt cctatcatta tccctccaaa 480 caggcggccc gcgccgggct gagtcaccag gagggagctg tggccgagga cgccgaggcc 540 tggagtgggt ggtagccccg agctgggacg ctcctccctc cacaatctcc ccaggtctgc 600 agggaccgag ggcctacact gcctcctccc acgccgtgct taggaaccct tgctggcctc 660 agaacaccag cgccctccct ccggtgcagc cctgcctggc cgggggcccc tcctccacag 720 ccatggtctg gaagaaactg ggctcccgca acttctccag ctgccccagt ggctccatcc 780 agtggatatg ggatgtgttg ggtgaatgtg cccaggacgg ctgggacgag gccagcgtgg 840 gcctgggctt gatctccatt ctctgctttg ctgcatctac cttcccccag ttcatcaaag 900 cctacaagac gggcaacatg gaccaggcgc tgtccctgtg gttcctcctg ggctggattg 960 gcggagactc ctgcaacctc atcggctcct tccttgctga ccagctgccc ctgcagacct 1020 acacggctgt gtattatgtc ttggcagacc tggtgatgct gacgctgtac ttttactaca 1080 agttcaggac gcgcccctct ctgttgtctg cccccatcaa ctccgtgctg ttgttcctca 1140 tggggatggc gtgcgccaca ccgctgctga gtgctgctgg gcccgtggct gcccctaggg 1200 aagccttccg ggggcgggcg ctcctgtccg tggagtcggg cagcaagccc ttcacccggc 1260 aggaagtcat tggcttcgtc atcggctcca tctccagcgt gttgtacctg ctttcccggc 1320 tgcctcagat ccgcaccaac ttcctccgga agtccaccca ggggatctcc tactctctgt 1380 tcgcgctggt gatgctgggg aacacgctgt atgggctgag cgtgctgctc aaaaaccccg 1440 aggagggcca gagcgagggc agctacctgc tgcaccacct gccctggctt gtgggcagcc 1500 tgggcgtgct gctgctcgac accatcatct ccatccagtt cctggtgtac aggcgcagca 1560 ccgccgcctc ggagcttgag cccctcctcc ccagctgacc agaaccaggc tgagcgcagg 1620 aggacaggca ccaccggatg ccacaccagg caggaggagg tgtggacagt gatggtacgg 1680 cggccctgca tcagcctgcg ggtggcctct ggatcctccg tggaccgaac cgtcccccca 1740 ggaacacacc ttcaggtaga ccccgaagcc tcaaggccgg ggctggagcg gagaccccag 1800 ggcctctcag gagacagtga ggctgcccct cctaccacct acctcattct gcctactcac 1860 cccaggggcc acagccacag cctgctggac tcaggactgt cctgtcaact ccagacaact 1920 gaataaacag gccgggtaca gtggctcgca cctgtaatcc tagcactttg ggaggccgaa 1980 gcgggtggac cacttgacgt ccgtagttcg agaccagcct ggccaacatg gtgaaacccc 2040 atctctacta aaaatacaaa aattagccag gtgtggtggc acacatctgt agtcccagct 2100 acttgggagg ctgaggcagg agaactgttt gaacctggga gacagaggtt gcggtgaacc 2160 gagatcgtgc cactgtactc cagcctgggt gacagagtga gactccgtct caaaaaaata 2220 aaaaagataa ccgaggaaac ggtacctccc catg 2254 <210> 4 <211> 1884 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(1884) <223> hstm1 isoform 1 (variant 2) <400> 4 agcgcgcggc gtgggggcgg ggcctgcggt tcccgcgggg gcggtggcgc gcggtcagct 60 gacccggcgg gccttgaccc agaagctggg ccctggcggc ggatctggac gtggcggccc 120 gcgccgggct gagtcaccag gagggagctg tggccgagga cgccgaggcc tggagtgggt 180 ggtagccccg agctgggacg ctcctccctc cacaatctcc ccaggtctgc agggaccgag 240 ggcctacact gcctcctccc acgccgtgct taggaaccct tgctggcctc agaacaccag 300 cgccctccct ccggtgcagc cctgcctggc cgggggcccc tcctccacag ccatggtctg 360 gaagaaactg ggctcccgca acttctccag ctgccccagt ggctccatcc agtggatatg 420 ggatgtgttg ggtgaatgtg cccaggacgg ctgggacgag gccagcgtgg gcctgggctt 480 gatctccatt ctctgctttg ctgcatctac cttcccccag ttcatcaaag cctacaagac 540 gggcaacatg gaccaggcgc tgtccctgtg gttcctcctg ggctggattg gcggagactc 600 ctgcaacctc atcggctcct tccttgctga ccagctgccc ctgcagacct acacggctgt 660 gtattatgtc ttggcagacc tggtgatgct gacgctgtac ttttactaca agttcaggac 720 gcgcccctct ctgttgtctg cccccatcaa ctccgtgctg ttgttcctca tggggatggc 780 gtgcgccaca ccgctgctga gtgctgctgg gcccgtggct gcccctaggg aagccttccg 840 ggggcgggcg ctcctgtccg tggagtcggg cagcaagccc ttcacccggc aggaagtcat 900 tggcttcgtc atcggctcca tctccagcgt gttgtacctg ctttcccggc tgcctcagat 960 ccgcaccaac ttcctccgga agtccaccca ggggatctcc 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caaaaaaata aaaaagataa 1860 ccgaggaaac ggtacctccc catg 1884 <210> 5 <211> 1642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(1642) <223> hstm1 isoform 2 (variant 3) <400> 5 agcgcgcggc gtgggggcgg ggcctgcggt tcccgcgggg gcggtggcgc gcggtcagct 60 gacccggcgg gccttgaccc agaagctggg ccctggcggc ggatctggac gtggcggccc 120 gcgccgggct gagtcaccag gagggagctg tggccgagga cgccgaggcc tggagtgggt 180 ggtagccccg agctgggacg ctcctccctc cacaatctcc ccaggtctgc agggaccgag 240 ggcctacact gcctcctccc acgccgtgct taggccagtt catcaaagcc tacaagacgg 300 gcaacatgga ccaggcgctg tccctgtggt tcctcctggg ctggattggc ggagactcct 360 gcaacctcat cggctccttc cttgctgacc agctgcccct gcagacctac acggctgtgt 420 attatgtctt ggcagacctg gtgatgctga cgctgtactt ttactacaag ttcaggacgc 480 gcccctctct gttgtctgcc cccatcaact ccgtgctgtt gttcctcatg gggatggcgt 540 gcgccacacc gctgctgagt gctgctgggc ccgtggctgc ccctagggaa gccttccggg 600 ggcgggcgct cctgtccgtg gagtcgggca gcaagccctt cacccggcag gaagtcattg 660 gcttcgtcat cggctccatc tccagcgtgt tgtacctgct ttcccggctg cctcagatcc 720 gcaccaactt cctccggaag tccacccagg ggatctccta ctctctgttc gcgctggtga 780 tgctggggaa cacgctgtat gggctgagcg tgctgctcaa aaaccccgag gagggccaga 840 gcgagggcag ctacctgctg caccacctgc cctggcttgt gggcagcctg ggcgtgctgc 900 tgctcgacac catcatctcc atccagttcc tggtgtacag gcgcagcacc gccgcctcgg 960 agcttgagcc cctcctcccc agctgaccag aaccaggctg agcgcaggag gacaggcacc 1020 accggatgcc acaccaggca ggaggaggtg tggacagtga tggtacggcg gccctgcatc 1080 agcctgcggg tggcctctgg atcctccgtg gaccgaaccg tccccccagg aacacacctt 1140 caggtagacc ccgaagcctc aaggccgggg ctggagcgga gaccccaggg cctctcagga 1200 gacagtgagg ctgcccctcc taccacctac ctcattctgc ctactcaccc caggggccac 1260 agccacagcc tgctggactc aggactgtcc tgtcaactcc agacaactga ataaacaggc 1320 cgggtacagt ggctcgcacc tgtaatccta gcactttggg aggccgaagc gggtggacca 1380 cttgacgtcc gtagttcgag accagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa 1440 aatacaaaaa ttagccaggt gtggtggcac acatctgtag tcccagctac ttgggaggct 1500 gaggcaggag aactgtttga acctgggaga cagaggttgc ggtgaaccga gatcgtgcca 1560 ctgtactcca gcctgggtga cagagtgaga ctccgtctca aaaaaataaa aaagataacc 1620 gaggaaacgg tacctcccca tg 1642 <210> 6 <211> 354 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(354) <223> Human Gnai3 <400> 6 Met Gly Cys Thr Leu Ser Ala Glu Asp Lys Ala Ala Val Glu Arg Ser 1 5 10 15 Lys Met Ile Asp Arg Asn Leu Arg Glu Asp Gly Glu Lys Ala Ala Lys 20 25 30 Glu Val Lys Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr 35 40 45 Ile Val Lys Gln Met Lys Ile Ile His Glu Asp Gly Tyr Ser Glu Asp 50 55 60 Glu Cys Lys Gln Tyr Lys Val Val Val Tyr Ser Asn Thr Ile Gln Ser 65 70 75 80 Ile Ile Ala Ile Ile Arg Ala Met Gly Arg Leu Lys Ile Asp Phe Gly 85 90 95 Glu Ala Ala Arg Ala Asp Asp Ala Arg Gln Leu Phe Val Leu Ala Gly 100 105 110 Ser Ala Glu Glu Gly Val Met Thr Pro Glu Leu Ala Gly Val Ile Lys 115 120 125 Arg Leu Trp Arg Asp Gly Gly Val Gln Ala Cys Phe Ser Arg Ser Arg 130 135 140 Glu Tyr Gln Leu Asn Asp Ser Ala Ser Tyr Tyr Leu Asn Asp Leu Asp 145 150 155 160 Arg Ile Ser Gln Ser Asn Tyr Ile Pro Thr Gln Gln Asp Val Leu Arg 165 170 175 Thr Arg Val Lys Thr Thr Gly Ile Val Glu Thr His Phe Thr Phe Lys 180 185 190 Asp Leu Tyr Phe Lys Met Phe Asp Val Gly Gly Gln Arg Ser Glu Arg 195 200 205 Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Gly Val Thr Ala Ile Ile Phe Cys 210 215 220 Val Ala Leu Ser Asp Tyr Asp Leu Val Leu Ala Glu Asp Glu Glu Met 225 230 235 240 Asn Arg Met His Glu Ser Met Lys Leu Phe Asp Ser Ile Cys Asn Asn 245 250 255 Lys Trp Phe Thr Glu Thr Ser Ile Ile Leu Phe Leu Asn Lys Lys Asp 260 265 270 Leu Phe Glu Glu Lys Ile Lys Arg Ser Pro Leu Thr Ile Cys Tyr Pro 275 280 285 Glu Tyr Thr Gly Ser Asn Thr Tyr Glu Glu Ala Ala Ala Tyr Ile Gln 290 295 300 Cys Gln Phe Glu Asp Leu Asn Arg Arg Lys Asp Thr Lys Glu Ile Tyr 305 310 315 320 Thr His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Lys Asn Val Gln Phe Val Phe 325 330 335 Asp Ala Val Thr Asp Val Ile Ile Lys Asn Asn Leu Lys Glu Cys Gly 340 345 350 Leu Tyr <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hstm1-N term <400> 7 accggatcca tggaccaggc gctgtccctg tg 32 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hstm1-C term <400> 8 cttgatatct cagctgggga ggaggggctc a 31 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for hstm1-delta C term <400> 9 cttgatatct caccacaagc cagggcaggt gg 32 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Gnai3-N term <400> 10 ccggatccat gggctgcacg ttgagcgccg 30 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Gnai3-C term <400> 11 aagatatctc aataaagtcc acattccttt a 31

Claims

(a) hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및
(c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 후보물질을 처리한 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장을 비교하여, 상기 후보물질을 처리했을 때 대조군과 비교하여 성장 수준이 낮으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, 성장 수준이 높으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함하는, 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 Ras1(GTPase Ras1) 단백질의 활성이 야생형 효모에 비해 감소된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 추가로 Gnai3(guanine nucleotide binding protein, alpha inhibiting activity polypeptide 3) 단백질을 발현하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 추가로 상기 후보물질이 hSTM1을 발현하지 않는 효모 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않는 것을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 저해제는 항암제인 것인 방법.
(a) hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질을 발현하는 효모 및 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및
(c) 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 후보물질을 처리한 상기 효모의 성장 수준을 비교하여, 상기 후보물질을 처리하였을 때 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 대조군에 비하여 감소하고 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모 균주의 성장에는 영향을 주지 않으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 증가하며 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함하는, 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝 방법.
(a) hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 조절물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 조절물질을 처리하지 않은 대조군과 조절물질을 처리한 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장을 비교하여, 상기 조절물질을 처리했을 때 대조군과 비교하여 성장 수준이 낮으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, 성장 수준이 높으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함하는, 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 Ras1 단백질의 활성이 야생형 효모에 비해 감소된 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 추가로 Gnai3 단백질을 발현하는 것인 방법.
(a) hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질을 발현하는 효모 및 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 조절물질을 처리한 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및
(c) 조절물질을 처리하지 않은 대조군과 조절물질을 처리한 상기 효모의 성장 수준을 비교하여, 상기 조절물질을 처리하였을 때 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 대조군에 비하여 감소하고 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모 균주의 성장에는 영향을 주지 않으면 hSTM1의 효능제(Agonist)로, hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 성장이 증가하며 C-말단이 결손된 hSTM1 단백질을 발현하는 효모의 균주의 세포 성장에는 영향을 주지 않으면 저해제(Antagonist)로 판단하는 단계를 포함하는, 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 조절물질의 활성을 확인하는 방법.
(a) hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 효능제 후보물질, 또는 효능제 후보물질과 PTX(pertussis toxin)를 모두 처리하는 단계;
(b) 상기 효능제 후보물질, 또는 효능제 후보물질 및 PTX가 모두 처리된 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 PTX 및 효능제 후보물질을 모두 처리한 군의 성장 수준이 효능제 후보물질만 처리한 군과 비교하여 높으면 hSTM1의 효능제로 판단하는 단계를 포함하는, 인간 고아 G 단백질 결합 수용체인 hSTM1의 효능제의 스크리닝 방법.
(a) hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질 및 Gnai3 단백질을 발현하는 효모에 인간 고아 G 단백질 결합 수용체(GPCR)인 hSTM1의 저해제 후보물질, 또는 저해제 후보물질과 PTX(pertussis toxin)를 모두 처리하는 단계;
(b) 상기 저해제 후보물질, 또는 저해제 후보물질 및 PTX가 모두 처리된 효모의 성장 수준을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 PTX 및 저해제 후보물질을 모두 처리한 군의 성장 수준이 저해제 후보물질만 처리한 군과 비교하여 낮으면 hSTM1의 저해제로 판단하는 단계를 포함하는, 인간 고아 G 단백질 결합 수용체인 hSTM1의 저해제의 스크리닝 방법.
hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질을 발현하는 효모를 포함하는, hSTM1의 효능제 또는 저해제의 스크리닝용 키트.
제13항에 있어서, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 Ras1 단백질의 활성이 야생형 효모에 비해 감소된 것인 키트.
제13항에 있어서, 상기 hSTM1 단백질을 발현하는 효모는 추가로 Gnai3 단백질을 발현하는 것인 키트.
hSTM1(human seven transmembrane protein 1) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된, Ras1 단백질의 활성이 야생형에 비하여 감소된 효모 형질전환체.