CN117701606A - mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用 - Google Patents
mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117701606A CN117701606A CN202311590029.5A CN202311590029A CN117701606A CN 117701606 A CN117701606 A CN 117701606A CN 202311590029 A CN202311590029 A CN 202311590029A CN 117701606 A CN117701606 A CN 117701606A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mapple
- vector
- double
- pcag
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 106
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 95
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 45
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 33
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 20
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 20
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 claims description 17
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 17
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 64
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 9
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 9
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 4
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000269457 Xenopus tropicalis Species 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 101150073877 egg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用。本发明首先筛选出无荧光泄露的mApple蛋白的N端截短型突变体C‑mApple‑2和C‑mApple‑3，同时，构建了相应的C端截短型突变体N‑mApple‑2和N‑mApple‑3，并进一步构建了新型嵌合基因GA2.0和AG2.0，创造性地构建了无荧光泄露、具有更高精确性和可靠性的双标记嵌合分析系统MADM2.0。该系统的荧光标记具有更高的准确性和可靠性，不但能在哺乳动物细胞中有效工作，而且可用于研究热带爪蛙发育过程和疾病发生机制，为发育生物学和再生生物学研究提供了一种重要的细胞命运示踪及单细胞表型分析工具，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用。
背景技术
热带爪蛙(Xenopus tropicalis)是爪蛙属中唯一具有二倍体遗传背景的两栖类模式动物，具有易饲养，卵直径大，愈合能力强，体外受精，产卵量大，早期胚胎透明等特点，已逐渐发展成为发育生物学、再生医学和遗传学等研究领域的理想模式生物，可应用于发育与再生机制的探究、人类疾病模型研究和疾病靶向药物治疗的筛选。
双标记嵌合分析(Mosaic analysis with double markers,MADM)系统是基于Cre诱导的Translocation过程能同时实现特定细胞荧光标记、基因敲除及谱系示踪的分子遗传工具。MADM系统的基本原理是将两个相互嵌合的标记基因(荧光蛋白)分别定位到同源染色体上的相同位点，其中一个嵌合基因包含绿色荧光蛋白(GFP)的N端和红色荧光蛋白(RFP)的C端(中间由含有LoxP位点的内含子相连接)，而另一个嵌合基因包含RFP的N端和GFP的C端(中间由含有LoxP位点的内含子相连接)。在没有Cre的情况下，不表达功能性的GFP或RFP；但在特定时期、特定细胞中表达Cre时，Cre能诱导带有两种不同荧光蛋白N端的DNA链与另一条带有相同荧光蛋白C端的DNA链在细胞有丝分裂G2期发生染色体易位重组，使得两个子代细胞分别表达有任一种有功能性的荧光蛋白(称为：X-segregation)，或者其中一个子代细胞表达两种荧光蛋白而另一种子代细胞不带任何功能性荧光蛋白(称为：Z-segregation)。另外，重组也可能发生在细胞周期的G1期或者G0期，在这种情况下，细胞同时表达两种荧光蛋白。
在同源染色体上的相同位点敲入该双荧光标记嵌合分析系统，可以通过染色体间重组在体内有效地诱导所有组织中的有丝分裂和有丝分裂后细胞的单荧光或双荧光标记，该方法可以实现在体内体细胞克隆或分离的单细胞中同时标记细胞和基因敲除。当突变位点选定为其中一个标记中时，在进行有丝分裂后，能够通过直接观察不同标记，实现单细胞分辨率的荧光标记突变细胞和另一种荧光标记的同级野生型细胞的表型分析。当使用野生型(即该位点的插入不导致原本的基因表达发生改变)双标记嵌合分析系统时，可以实现动态追踪两个同源细胞(GFP+和RFP+)，通过谱系示踪可以实现对发育过程细胞命运的深入了解。通过双荧光谱系追踪与单细胞水平的表型分析相结合，揭示发育过程和疾病机制的更复杂的细节，对组织器官发育、再生及修复的研究具有重要意义。因此，双荧光标记嵌合分析一旦广泛应用于这些领域，将带来突破性的发现。
任何有机荧光团在长时间照射下都会发生不可逆的光漂白，提高荧光蛋白的亮度可以减少筛选荧光标记位点时所需的时间。新型红色荧光蛋白mApple被证实其在斑马鱼胚胎中比其他RFP更加明亮，因此构建含有mApple荧光蛋白的嵌合分析系统可以实现体外和体内高效的红色荧光标记。最近已有科研团队利用mApple作为红色荧光标记，EGFP作为绿色荧光标记，构建了适用于斑马鱼模式动物的双荧光标记嵌合分析系统(zMADM)，并利用双荧光标记系统在双谱系追踪与单细胞水平的表型分析的优势，成功获得斑马鱼视顶盖神经元柱细胞的不对等分裂的证据，进一步证实了zMADM系统在水生动物器官发育机制研究领域的独特优势(zMADM(zebrafish mosaic analysis with double markers for single-cell gene knockout and dual-lineage tracing,2022,119(9):e2122529119)。
为了进一步探索zMADM系统是否能在热带爪蛙模型中有效工作，发明人首先克隆了上述研究中zMADM系统的嵌合基因片段(N-EGFP::C-mApple,GA；N-mApple::C-EGFP,AG)，并将其连接到pCAG-EGFP载体(由pBS-T2A-EGFP-bGHpA载体(见本实验室已发表文章：29897811)经本实验室改造所得)中CAG启动子下游的BamHI与EcoRI酶切位点之间，替换原有EGFP片段，进而构建pCAG-GA，以及pCAG-AG表达载体。然而，将上述载体转染293T细胞进行功能验证时，我们发现转染pCAG-GA和pCAG-Cre载体(Addgene,#13775，经本实验室改造)的细胞没有绿色荧光表达，但有红色荧光表达(GFP-/RFP+)；转染pCAG-AG和pCAG-Cre载体的细胞没有任何荧光表达(GFP-/RFP-)；pCAG-GA、pCAG-AG和pCAG-Cre三个载体共同转染的293T细胞中既有绿色荧光又有红色荧光表达(GFP+/RFP+)，而且表达红色荧光的细胞数量远高于表达绿色荧光的细胞数量。上述结果表明：pCAG-GA表达载体转染细胞后发生红色荧光泄露，这将严重影响利用上述zMADM系统进行细胞命运示踪及进行单细胞水平表型分析的精确性与可靠性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有基于mApple作为红色荧光标记蛋白的zMADM系统存在荧光泄露问题的缺点与不足，提供一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统。
本发明的另一方面是提供两组mApple蛋白N端截短型突变体。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，命名为MADM2.0，包括Cre重组酶载体，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体，其中：
所述的双标记是指绿色荧光蛋白EGFP和红色荧光蛋白mApple，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；
所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白EGFP的N端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mApple的C端61位～711位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mApple的N端1位～60位碱基与绿色荧光蛋白EGFP的C端275位～720位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到；
或者，所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白EGFP的N端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mApple的C端73位～711位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mApple的N端1位～72位碱基与绿色荧光蛋白EGFP的C端275位～720位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到。
进一步地，所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
进一步地，所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体通过如下方法制备得到：
S1、分别以质粒序列数据库Addgene中编号为#182155的pTol2-eab2-AG载体中的AG嵌合基因片段的DNA序列为模板，以质粒序列数据库Addgene中编号为#182156的pTol2-eab2-GA载体中的GA嵌合基因片段的DNA序列为模板，进行基因合成，并连接到pCAG-EGFP载体的BamHI与EcoRI酶切位点之间，构建pCAG-GA表达载体和pCAG-AG表达载体；
S2、以红色荧光蛋白mApple的N端截短型突变体C-mApple-2或C-mApple-3的DNA序列为模板，进行基因合成，并替换pCAG-GA表达载体的C-mApple，构建双标记嵌合片段1载体，命名为pCAG-GA2.0表达载体；以缺失的片段为模板(C-mApple-2为57bp，C-mApple-3为69bp)，进行基因合成，并插入pCAG-AG表达载体N-mApple下游，构建双标记嵌合片段2载体，命名为pCAG-AG2.0表达载体。
进一步地，所述的Cre重组酶载体选自pCAG-Cre载体或改造后的pCAG-Cre载体。
更进一步地，所述的改造后的pCAG-Cre载体通过如下方法制备得到：以质粒序列数据库Addgene中编号为#13775的pCAG-Cre载体中的Cre基因片段的DNA序列为模板，进行基因合成，并连接到pCAG-EGFP载体的BamHI与EcoRI酶切位点之间，构建pCAG-Cre表达载体。
mApple蛋白N端截短型突变体，与原zMADM系统的嵌合基因中mApple蛋白N端C-mApple的氨基酸序列SEQ ID NO:8相比，所述mApple蛋白N端截短型突变体中存在以下突变中的至少一种：
1)缺失N端19个氨基酸序列(即C-mApple-2，氨基酸序列如SEQ ID NO:8的第20位～235位氨基酸所示)；
2)缺失N端23个氨基酸序列(即C-mApple-3，氨基酸序列如SEQ ID NO:8的第24位～235位氨基酸所示)。
核酸分子，为编码上述mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子。
进一步地，编码1)中mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO:9的第58位～708位碱基所示；编码2)中mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9的第70位～708位碱基所示。
生物材料，为含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
相互嵌合基因组，包含上述双标记嵌合片段1和双标记嵌合片段2。
上述双标记嵌合分析系统、mApple蛋白N端截短型突变体、核酸分子、生物材料或相互嵌合基因组在双标记嵌合分析中的应用。
上述双标记嵌合分析系统在双谱系追踪和/或单细胞水平表型分析中的应用。
进一步地，所述的应用为在热带爪蛙早期胚胎水平表型分析中的应用。
进一步地，所述的应用的操作为：
S11、以质粒序列数据库Addgene中编号为#61391的pCS2-Cre载体为模板，在体外转录Cre的mRNA，纯化得到CremRNA；
S12、将CremRNA，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体制备成注射混合液，注射到热带爪蛙受精卵的动物极，注射后的受精卵放置于胚胎培养液中孵育，利用荧光体式显微镜筛选出表达荧光的F0胚胎。
本发明的技术思路：为了使zMADM系统更精确可靠地应用于发育和疾病机制研究领域，发明人对pCAG-GA表达载体中的GA嵌合基因片段进行编码框、结构域和序列分析，发现其中GA片段中的内含子中有多个剪接相似位点，以及C-mApple片段相对于完整的mApple基因序列只删除了起始密码子ATG三个碱基序列，mApple的发色团及其β罐保护结构完整，而且C-mApple片段的前70个碱基序列中包含多个ATG起始密码子序列，其中含有Kozak相似序列。因此发明人对产生荧光泄露的细胞进行RNA提取后进行反转录以及扩增N-EGFP::C-mApple片段并测序，验证内含子剪接的精确性。接着，发明人通过截短mApple片段N端参与形成β罐一端的“帽子”结构的6个氨基酸合成C-mApple-1，并将其连接到含CAG但无Kozak序列的表达载体框架上进行功能验证。最后，发明人构建了缺失C-mApple片段5’端不同位点的ATG的多个截短体的表达载体并进行功能验证，探究pCAG-GA表达载体发生红色荧光泄露的原因。实验结果表明，pCAG-GA表达载体中GA之间的内含子剪接正确，且mApple在缺失Kozak序列、N端ATG和参与形成β罐一端的“帽子”结构的6个氨基酸后仍能产生红色荧光。通过C-mApple截短体验证发现，发生荧光泄露的原因可能是C-mApple片段的N端的Kozak类似序列使其后面的ATG在翻译过程中被识别为起始密码子，从而使C-mApple表达出N端缺少部分氨基酸但仍然能够表达红色荧光的蛋白突变体，进而造成红色荧光泄露。
进一步地，本发明利用缺失突变技术、内含子剪接原理和嵌合基因移码突变原理，创新性地构建了两种新型无荧光泄露的相互嵌合基因GA2.0和AG2.0，并证实该系统可在哺乳动物细胞及热带爪蛙模型中实现更加精确的细胞命运示踪及单细胞水平的表型分析研究。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明创造性地制备了红色荧光蛋白mApple的两套突变体(N-mApple突变体：N-mApple-2和N-mApple-3；C-mApple突变体：C-mApple-2和C-mApple-3)，并利用该突变体构建了一个更加精确、无荧光泄露的具有双谱系追踪与单细胞水平表型分析能力的MADM系统(MADM2.0)。根据内含子剪接原理以及真核生物翻译相关序列的分析，在保留双荧光嵌合基因载体剪接移码突变的基础上，对原始zMADM系统的两个嵌合基因进行重构，解决了原始zMADM系统红色荧光泄露的问题，不仅保留了其在双谱系追踪和单细胞水平表型分析的示踪优势，同时提高了其作为揭示发育过程和疾病机制更复杂的细节的一种有效工具的准确性和可靠性，并且证实了新制备的MADM2.0系统可应用于热带爪蛙模型研究，对利用热带爪蛙模型开展发育生物学和再生生物学的研究具有重要意义。
附图说明
图1为pCAG-EGFP、pCAG-Cre、pCAG-GA和pCAG-AG载体图谱。
图2为293T细胞转染载体48h验证结果(均共转pCAG-Cre载体)图：转染pCAG-GA载体、转染pCAG-AG载体、转染双载体。
图3为红色荧光293T细胞GA片段反转录测序结果图。
图4为pCAG-mApple-origin、pCAG-mApple-1、pCAG-mApple-2、pCAG-mApple-3载体图谱。
图5为293T细胞转染pCAG-mApple-1表达载体48h后荧光结果图。
图6为293T细胞转染载体48h验证结果图：单转pCAG-mApple-origin、pCAG-mApple-1、pCAG-mApple-2、pCAG-mApple-3表达载体。
图7为pCAG-GA2.0载体图谱和pCAG-AG2.0载体图谱。
图8为293T细胞转染载体48h验证结果(均共转pCAG-Cre载体)图：转染pCAG-GA2.0载体、转染pCAG-AG2.0载体、转染双载体。
图9为热带爪蛙早期胚胎验证结果(均共注射Cre mRNA)图：注射pCAG-GA2.0载体、注射pCAG-AG2.0载体、注射双载体。
具体实施方式
本发明首先利用缺失突变技术构建mApple蛋白的4种N端截短型突变体(C-mApple-origin，C-mApple-1，C-mApple-2，C-mApple-3)，并将其克隆到pCAG-EGFP载体中CAG启动子下游的BamHI与EcoRI酶切位点之间，将构成的4个载体转染细胞进行功能验证后，对产生荧光泄露和无荧光泄露的序列进行分析，筛选出无荧光泄露的突变体C-mApple-2和C-mApple-3(优先选择C-mApple-3作为C-mApple突变体)。再利用缺失突变技术、内含子剪接原理和嵌合基因移码突变原理对嵌合基因GA(N-EGFP::C-mApple)进行改造，构建出无荧光泄露的GA2.0嵌合基因(N-EGFP::C-mApple-3)及其表达载体。同时，根据C-mApple-2和C-mApple-3的序列特征，构建了相应的mApple蛋白的C端截短型突变体N-mApple-2和N-mApple-3(优先选择N-mApple-3作为N-mApple突变体)，并进一步构建了新型嵌合基因AG2.0(N-mApple-3::C-EGFP)。本发明利用上述GA2.0和AG2.0嵌合基因，创造性地构建了无荧光泄露、具有更高精确性和可靠性的双标记嵌合分析系统(MADM2.0)。该系统可以在Cre重组酶介导下进行易位重组并表达红色和绿色荧光。进一步，本发明利用所制备的嵌合基因GA2.0和AG2.0的表达载体pCAG-GA2.0和pCAG-AG2.0，与CremRNA一起进行热带爪蛙胚胎注射，在早期胚胎中可观察到绿色和红色荧光标记，但在单个表达载体(pCAG-GA2.0或pCAG-AG2.0)与CremRNA共同注射的早期胚胎中未观察到荧光表达，即无荧光泄露。利用本发明所获得的mApple蛋白突变体进一步构建的MADM2.0系统，其荧光标记具有更高的准确性和可靠性，不但能在哺乳动物细胞中有效工作，而且可用于研究热带爪蛙发育过程和疾病发生机制，为发育生物学和再生生物学的研究提供了一种重要的细胞命运示踪及单细胞表型分析工具，具有重要的应用价值。包括：
(1)以原始zMADM系统中C-mApple的DNA序列为模板，利用缺失突变技术分别克隆编码原始C-mApple片段(C-mApple-origin)、缺失5'端18个碱基序列的C-mApple突变体(C-mApple-1，含有C-mApple片段5’端的所有ATG)、缺失5’端57个碱基序列的C-mApple突变体(C-mApple-2，缺失C-mApple片段5’端前两个ATG)、缺失5’端69个碱基序列的C-mApple突变体(C-mApple-3，缺失C-mApple片段5’端前三个ATG)的截短体DNA序列；
(2)将上述原始C-mApple及新构建的3种截短体的DNA片段分别克隆到pCAG-EGFP载体CAG启动子下游的BamHI与EcoRI酶切位点之间，替换原有EGFP片段，分别构建pCAG-mApple-origin、pCAG-mApple-1、pCAG-mApple-2、pCAG-mApple-3表达载体；
(3)将构建的四种截短体载体进行测序(天一辉远)，将测序正确的载体用于接下来的细胞验证实验；
(4)将四种截短体载体分别转染293T细胞，48h后用倒置荧光显微镜观察发光情况：C-mApple-origin和C-mApple-1转染组均能观察到明显红色荧光；C-mApple-2和C-mApple-3转染组均无荧光表达现象；
(5)根据步骤(4)所得结果，结合对C-mApple的序列分析，我们推测荧光泄露原因如下：真核生物的翻译起始主要以扫描的形式，通过小亚基起始复合物实现mRNA起始密码子的识别，该识别过程中，AUG前第三个碱基的A或G，以及AUG后的G，可十倍地影响翻译效率。原始C-mApple序列5’端第一个ATG(25-27位)上游第三个碱基(22位)为A，28位为G，极大地提高了其在翻译过程中被识别为起始密码子的可能性，从而使原始zMADM系统中嵌合基因GA(N-EGFP::C-mApple)所设计的移码突变失效，翻译出N端缺失少数氨基酸但仍然能够表达红荧光的相对完整的mApple蛋白，从而造成荧光泄露。
因此，上述结果和分析进一步说明本发明所创造的mApple蛋白的突变体C-mApple-2和C-mApple-3均可作为双标记嵌合分析系统中嵌合基因GA(N-EGFP::C-mApple)的C-mApple片段；而C-mApple-2和C-mApple-3所对应的N-mApple(N-mApple-2和N-mApple-3)均可作为双标记嵌合分析系统中嵌合基因AG(N-mApple::C-EGFP)的N-mApple片段。为了使zMADM系统更准确地应用于发育和疾病机制研究领域，发明人根据以下设计思路对原始zMADM系统进行创造性改造：
我们在保留双荧光嵌合基因载体经过剪接后下游编码区发生移码突变的基础上，利用本发明所创造的mApple的C-mApple突变体(C-mApple-2或C-mApple-3)及其相应的N-mApple突变体(N-mApple-2或N-mApple-3)对原始zMADM系统中的两个嵌合基因片段(GA和AG)进行重构，能够确保其作为嵌合基因标记工具进行使用时的准确性和可靠性。进一步，本发明优先选用所创造的突变体C-mApple-3对原始zMADM系统进行升级改造(MADM2.0)。
①根据内含子5'端剪接位点共有序列AG|GU，3'端剪接位点共有序列AG|G，将原始GA嵌合基因中C-mApple序列上游69bp的DNA片段删除(苏州泓迅生物)，使C-mApple的5'端第一个碱基为G，合成的C-mApple突变体为C-mApple-3，新构建的嵌合基因表达载体命名为pCAG-GA2.0；
②将①中删除的69bpDNA片段插入到原始AG嵌合基因中N-mApple片段下游(苏州泓迅生物)，使N-mApple的3'端最后两个碱基为AG，合成的N-mApple突变体为N-mApple-3，新构建的嵌合基因表达载体命名为pCAG-AG2.0；
(6)将步骤(5)所得pCAG-GA2.0和pCAG-AG2.0载体单独或一起转染293T细胞进行功能验证(均同时转染pCAG-Cre表达载体)，48h后用倒置荧光显微镜观察发光情况，结果发现：仅转染pCAG-GA2.0载体或pCAG-AG2.0载体的293T细胞中未观察到任何荧光；共同转染了两个2.0版本载体的293T细胞中同时观察到绿色荧光和红色荧光。
(7)将构建成功的pCAG-GA2.0和/或pCAG-AG2.0表达载体与体外转录的CremRNA(利用mMessagemMachine SP6 Kit(Ambion,Austin,TX,USA)在体外转录pCS2-Cre中Cre的mRNA，同时利用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Germantown,MD,USA)进行纯化)共同注射到热带爪蛙受精卵1细胞期的动物极，胚胎注射48h后用荧光体式显微镜观察胚胎，可观察到注射了双载体的胚胎中出现了双荧光表达，而注射了单载体的胚胎中未观察到任何荧光表达。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中涉及的载体：
pCAG-EGFP载体是载体pBS-T2A-EGFP-bGHpA(已在文献“Mao C Z,Zheng L,Zhou YM,et al.CRISPR/Cas9-mediated efficient and precise targeted integration ofdonor DNA harboring double cleavage sites in Xenopus tropicalis[J].The FASEBJournal,2018,32(12):fj.201800093.DOI:10.1096/fj.201800093.”中公开)经T2A片段替换为CAG片段(KU341333.1，442to 1240)改造所得；
pCAG-Cre载体是载体pCAG-EGFP经EGFP片段替换为Cre片段(Addgene,#13775)改造所得。
实施例1：pCAG-GA与pCAG-AG的构建和细胞验证
将pTol2-eab2-AG载体(Addgene,#182155)中的AG嵌合基因片段以及pTol2-eab2-GA载体中(Addgene,#182156)的GA嵌合基因片段的DNA序列为模板，进行基因合成，并连接到pCAG-EGFP载体(本实验室构建)的BamHI与EcoRI酶切位点之间(苏州泓迅生物)，替换原有的EGFP片段，构建pCAG-GA和pCAG-AG表达载体(图1)。
利用构建好的pCAG-GA和/或pCAG-AG载体与pCAG-Cre载体(本实验室构建)共同转染293T细胞进行功能验证(将细胞种至24孔板，待细胞密度达到70-80％时，进行转染，每孔转染500ng/质粒)，48小时后在倒置荧光显微镜下观察荧光(图2)。
上述GA嵌合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；上述AG嵌合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
实施例2：GA片段内含子剪接准确性的验证
1.将pCAG-GA表达载体转染293T细胞(将细胞种至24孔板，待细胞密度达到70-80％时，进行转染，每孔转染500ng/质粒)，48h后通过流式细胞分选仪分选出含有红色荧光的293T细胞，将分选得到的293T细胞进行RNA提取后进行反转录，得到该细胞的cDNA。
2.以该cDNA为模板，在N-EGFP中设计正向引物和C-mApple中设计反向引物进行PCR扩增荧光嵌合片段基因序列。所述PCR引物的序列如下所示：
N-EGFP-Fw：5’-TGCCACCTACGGCAAGCTGA-3’
C-mApple-Re：5’-GGGAGGAGTCCTGGTTAACG-3’。
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将扩增得到的DNA片段纯化后进行TOPO连接并转化DH5α大肠杆菌后涂平板，挑选阳性单克隆菌落进行DNA测序(天一辉远)后进行图谱比对(图3)。
上述内含子正确剪接得到的GA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
实施例3：mApple片段N端部分碱基缺失的功能验证/突变体C-mApple-1的制备及其表达载体构建
1.以pCAG-GA的DNA序列为模板，设计特异性PCR引物(C-mApple-1-Fw/C-mApple-Re)扩增缺失5’端18个碱基序列的C-mApple突变体的DNA序列(C-mApple-1)(其中，原始C-mApple(C-mApple-origin)氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)。所述PCR引物的序列如下所示：
C-mApple-1-Fw：5’-cgGGATCCAATAACATGGCCATCATCAAGGAG-3’
C-mApple-Re：5’-cgGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’
上述正向引物C-mApple-1-Fw序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是BamHI酶切位点序列；上述反向引物C-mApple-Re序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是EcoRI酶切位点序列。
2.将扩增的PCR产物用BamHI与EcoRI双酶切，回收带有粘性末端的DNA片段，并连接到pCAG-EGFP载体的BamHI与EcoRI酶切位点之间，进而构建pCAG-mApple-1重组载体(图4)。
3.将构建好的pCAG-mApple-1表达载体进行测序(天一辉远)，将测序正确的载体转染293T细胞，48h后用倒置荧光显微镜观察荧光(图5)。
实施例4：突变体C-mApple-origin的制备及其表达载体构建
1.以pCAG-GA的DNA序列为模板，设计特异性PCR引物(mApple-origin-Fw/C-mApple-Re)扩增编码C-mApple蛋白的DNA序列(C-mApple-origin)。所述PCR引物的序列如下所示：
C-mApple-origin-Fw：5’-cgGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGAATA-3’
C-mApple-Re：5’-cgGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。
上述正向引物C-mApple-origin-Fw序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是BamHI酶切位点序列；上述反向引物C-mApple-Re序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是EcoRI酶切位点序列。
2.将扩增的PCR产物用BamHI与EcoRI双酶切，回收带有粘性末端的DNA片段，并连接到pCAG-EGFP载体(本实验室构建)的BamHI与EcoRI酶切位点之间，进而构建pCAG-mApple-origin重组载体(图4)。
3.将重组载体转化大肠杆菌DH5α，涂平板，挑选阳性单克隆菌落进行DNA测序验证。
实施例5：突变体C-mApple-2的制备及其表达载体构建
1.以pCAG-GA的DNA序列为模板，设计特异性PCR引物(C-mApple-2-Fw/C-mApple-Re)扩增缺失5’端57个碱基序列的C-mApple突变体的DNA序列(C-mApple-2)。所述PCR引物的序列如下所示：
C-mApple-2-Fw：5’-cgGGATCCGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAAC-3’
C-mApple-Re：5’-cgGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。
上述正向引物C-mApple-2-Fw序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是BamHI酶切位点序列；上述反向引物C-mApple-Re序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是EcoRI酶切位点序列。
2.将扩增的PCR产物用BamHI与EcoRI双酶切，回收带有粘性末端的DNA片段，并连接到pCAG-EGFP载体(本实验室构建)的BamHI与EcoRI酶切位点之间，进而构建pCAG-mApple-2重组载体(图4)。
3.将重组载体转化大肠杆菌DH5α，涂平板，挑选阳性单克隆菌落进行DNA测序验证。
实施例6：突变体C-mApple-3的制备及其表达载体构建
1.以pCAG-GA的DNA序列为模板，设计特异性PCR引物(C-mApple-3-Fw/C-mApple-Re)扩增缺失5’端69个碱基序列的C-mApple突变体的DNA序列(C-mApple-3)。所述PCR引物的序列如下所示：
C-mApple-3-Fw：5’-cgGGATCCGGCTCCGTGAACGGCCACGAGT-3’
C-mApple-Re：5’-cgGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。
上述正向引物C-mApple-3-Fw序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是BamHI酶切位点序列；上述反向引物C-mApple-Re序列中，5’端cg是酶切位点保护碱基，下划线字母是EcoRI酶切位点序列。
2.将扩增的PCR产物用BamHI与EcoRI双酶切，回收带有粘性末端的DNA片段，并连接到pCAG-EGFP载体(本实验室构建)的BamHI与EcoRI酶切位点之间，进而构建pCAG-mApple-3重组载体(图4)。
3.将重组载体转化大肠杆菌DH5α，涂平板，挑选阳性单克隆菌落进行DNA测序验证。
实施例7：pCAG-mApple-origin、pCAG-mApple-1、pCAG-mApple-2、pCAG-mApple-3表达载体的细胞验证
用构建好的pCAG-mApple-origin、pCAG-mApple-1(由实施例3获得)、pCAG-mApple-2、pCAG-mApple-3表达载体分别转染293T细胞进行验证(将细胞种至24孔板，待细胞密度达到70-80％时进行转染，每孔转染500ng/质粒)，48小时后在倒置荧光显微镜下观察荧光(图6)。
实施例8：pCAG-GA2.0与pCAG-AG2.0载体的构建和细胞功能验证
根据内含子5'端剪接位点共有序列AG|GU，3'端剪接位点共有序列AG|G，为确保C-mApple的5'端第一个碱基为G，以实施例6所筛选到的C-mApple突变体(C-mApple-3)所对应的编码DNA序列为基础，合成C-mApple-3片段(苏州泓迅生物)并替换pCAG-GA载体中的C-mApple片段(命名为C-mApple-3)，进而构建pCAG-GA2.0表达载体(图5)。
将C-mApple-3缺失的C-mApple片段N端的69bp(加上起始密码子，即ATGGTGAGCAAGGGCGA GGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAG)插入到pCAG-AG的N-mApple下游(苏州泓迅生物)，使新合成的N-mApple的3'端最后两个碱基为AG(命名为N-mAppl e-3)，新构建的载体命名为pCAG-AG2.0(图7)。
此外，还可以实施例5所筛选到的C-mApple突变体(C-mApple-2)所对应的编码DNA序列为基础，合成C-mApple-2片段并替换pCAG-GA载体中的C-mApple片段(命名为C-mApple-2)，进而构建pCAG-GA2.0'表达载体。将C-mApple-2缺失的C-mApple片段N端的57bp(加上起始密码子，即ATGGTGAGC AAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAG)插入到pCAG-AG的N-mApple下游，使新合成的N-mApple的3'端最后两个碱基为AG(命名为N-mApple-2)，新构建的载体命名为pCAG-AG2.0'。
利用构建好的pCAG-GA2.0和/或pCAG-AG2.0载体与pCAG-Cre载体(本实验室构建)共同转染293T细胞进行功能验证(将细胞种至24孔板，待细胞密度达到70-80％时，进行转染，每孔转染500ng/质粒)，48小时后在倒置荧光显微镜下观察荧光(图8)。
实施例9：MADM2.0系统在热带爪蛙模型中的应用
将实施例8构建成功的pCAG-GA2.0和/或pCAG-AG2.0表达载体与体外转录的CremRNA(以pCS2-Cre载体(Addgene，#61391)为模板，利用mMessagemMachine SP6 Kit(Ambion,Austin,TX,USA)在体外转录Cre的mRNA，并利用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Germantown,MD,USA)进行纯化)，注射混合液(25ng/μL质粒和30ng/μL mRNA)2nL到热带爪蛙受精卵(1细胞期)的动物极，注射后的受精卵放置于0.1×MBS胚胎培养液(由5×MBS(配置方法：称取NaCl 25.9g、Hepes 11.9g、NaHCO3 1.0g、KCl 0.4g、MgSO4 0.5g、Ca(NO3)20.8g、CaCl2 0.2g，加入800mL去离子水并混匀，pH调至7.4，容量瓶定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存备用)稀释而成)中，并在21℃的培养箱中孵育过夜，于第二天早上将培养箱温度调至25℃继续孵育胚胎发育至48h，利用荧光体式显微镜筛选出表达荧光的F0胚胎。结果表明，共注射pCAG-GA2.0和pCAG-AG2.0表达载体(同时注射Cre mRNA)的胚胎中筛选到了能表达双荧光的F0代早期胚胎，只注射单个表达载体(同时注射Cre mRNA)的胚胎未观察到任何荧光现象(图9)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：命名为MADM2.0，包括Cre重组酶载体，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体，其中：
所述的双标记是指绿色荧光蛋白EGFP和红色荧光蛋白mApple，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；
所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白EGFP的N端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mApple的C端61位～711位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mApple的N端1位～60位碱基与绿色荧光蛋白EGFP的C端275位～720位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到；
或者，所述的双标记嵌合片段1由绿色荧光蛋白EGFP的N端1位～274位碱基与红色荧光蛋白mApple的C端73位～711位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到；所述的双标记嵌合片段2由红色荧光蛋白mApple的N端1位～72位碱基与绿色荧光蛋白EGFP的C端275位～720位碱基通过含有LoxP位点的内含子相连接得到。
2.根据权利要求1所述的无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：
所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1或2所述的无荧光泄露的双标记嵌合分析系统，其特征在于：
所述的双标记嵌合片段1载体、双标记嵌合片段2载体通过如下方法制备得到：
S1、分别以质粒序列数据库Addgene中编号为#182155的pTol2-eab2-AG载体中的AG嵌合基因片段的DNA序列为模板，以质粒序列数据库Addgene中编号为#182156的pTol2-eab2-GA载体中的GA嵌合基因片段的DNA序列为模板，进行基因合成，并连接到pCAG-EGFP载体的BamHI与EcoRI酶切位点之间，替换原有的EGFP片段，构建pCAG-GA表达载体和pCAG-AG表达载体；
S2、以红色荧光蛋白mApple的N端截短型突变体的DNA序列为模板，进行基因合成，并替换pCAG-GA表达载体的C-mApple，构建双标记嵌合片段1载体，命名为pCAG-GA2.0表达载体；以缺失的片段为模板，进行基因合成，并插入pCAG-AG表达载体N-mApple下游，构建双标记嵌合片段2载体，命名为pCAG-AG2.0表达载体；
所述的Cre重组酶载体选自pCAG-Cre载体或改造后的pCAG-Cre载体；所述的改造后的pCAG-Cre载体通过如下方法制备得到：以质粒序列数据库Addgene中编号为#13775的pCAG-Cre载体中的Cre基因片段的DNA序列为模板，进行基因合成，并连接到pCAG-EGFP载体的BamHI与EcoRI酶切位点之间，替换原有的EGFP片段，构建pCAG-Cre表达载体。
4.mApple蛋白N端截短型突变体，其特征在于：与SEQ ID NO:8相比，所述mApple蛋白N端截短型突变体中存在以下突变中的至少一种：
1)缺失N端19个氨基酸序列；
2)缺失N端23个氨基酸序列。
5.核酸分子，其特征在于：为编码权利要求4中所述的mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子；其中，编码1)中mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:9的第58位到第708位碱基所示；编码2)中mApple蛋白N端截短型突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9的第70位到第708位碱基所示。
6.生物材料，其特征在于：为含有权利要求5中所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
7.相互嵌合基因组，其特征在于：包含权利要求1中所述的双标记嵌合片段1和双标记嵌合片段2。
8.权利要求1-3任一项中所述的双标记嵌合分析系统、权利要求4中所述的mApple蛋白N端截短型突变体、权利要求5中所述的核酸分子、权利要求6中所述的生物材料或权利要求7中所述的相互嵌合基因组在双标记嵌合分析中的应用。
9.权利要求1-3任一项中所述的双标记嵌合分析系统在双谱系追踪和/或单细胞水平表型分析中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的应用为在热带爪蛙早期胚胎水平表型分析中的应用，包括如下步骤：
S11、以质粒序列数据库Addgene中编号为#61391的pCS2-Cre载体为模板，在体外转录Cre的mRNA，纯化得到CremRNA；
S12、将CremRNA，双标记嵌合片段1载体和双标记嵌合片段2载体制备成注射混合液，注射到到热带爪蛙受精卵的动物极，注射后的受精卵放置于胚胎培养液中孵育，利用荧光体式显微镜筛选出表达荧光的F0胚胎。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311590029.5A CN117701606A (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311590029.5A CN117701606A (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117701606A true CN117701606A (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=90143296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311590029.5A Pending CN117701606A (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117701606A (zh) |
-
2023
- 2023-11-27 CN CN202311590029.5A patent/CN117701606A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Trichas et al. | Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice | |
| Ogino et al. | Highly efficient transgenesis in Xenopus tropicalis using I-SceI meganuclease | |
| CN106893739A (zh) | 用于靶向基因操作的新方法和系统 | |
| CN107880132A (zh) | 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法 | |
| US7771714B2 (en) | Medium comprising chicken leukemia inhibitory factor (LIF) | |
| JP2005245435A (ja) | 新規蛍光遺伝子断片および魚 | |
| CN109153990A (zh) | 用于基因编辑的组合物和方法 | |
| CN104846011A (zh) | 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法 | |
| CN102653756B (zh) | 一种定向改造动物基因组特定基因的方法及其应用 | |
| US20090113565A1 (en) | Methods for Detecting Fluorescent Proteins and Animals Having Fluorescent Proteins | |
| CN107406843A (zh) | 用于实时监测哺乳动物合成染色体的构建和生物工程化的组合物和方法 | |
| CN107893073A (zh) | 一种筛选谷氨酰胺合成酶缺陷型hek293细胞株的方法 | |
| CN106086031A (zh) | 猪肌抑素基因编辑位点及其应用 | |
| CN102453716A (zh) | 猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用 | |
| CA3081687A1 (en) | Dna plasmids for the fast generation of homologous recombination vectors for cell line development | |
| Annilo | Studies on mammalian ribosomal protein S7 | |
| EP1098987B1 (en) | Method for transformation of animal cells | |
| CN112899238A (zh) | 基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用 | |
| CN111100877B (zh) | 肥厚型心肌病小鼠模型的制备方法及其应用 | |
| CN117701606A (zh) | mApple蛋白突变体及其在双标记嵌合分析中的应用 | |
| WO2020074915A1 (en) | Genetically modified sterile avians and method for the reconstitution thereof | |
| WO2013056664A1 (zh) | 家蚕丝素重链基因突变序列及突变的方法和应用 | |
| CN114957433B (zh) | 一种热带爪蛙Fosl1蛋白突变体及其应用 | |
| CN105695509B (zh) | 一种获得高纯度心肌细胞的方法 | |
| TWI316958B (zh) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |