CN116478948A - 一种生成高唾液酸化蛋白药物的细胞工程方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生成高唾液酸化蛋白药物的细胞工程方法，涉及生物技术领域。所述方法用到的融合蛋白为β‑半乳糖苷α‑2,6‑唾液酸转移酶1的催化结构域与β‑1,4‑半乳糖基转移酶融合得到的融合蛋白。通过将该融合蛋白与目标蛋白在宿主细胞中进行共表达，能够有效提高目标蛋白的唾液酸修饰程度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种生成高唾液酸化蛋白药物的细胞工程方法。
背景技术
IgG抗体药物的可结晶片段(Fc片段)的N297位存在一个保守的N糖基化位点，其连接的N糖的糖链组成和结构对IgG抗体的功能具有重要影响。研究发现静脉注射免疫球蛋白(IVIG)抗炎作用的发挥依赖于IgG抗体Fc片段上N297位糖链末端修饰的唾液酸，且唾液酸以α-2,6连接到糖链的倒数第二个半乳糖上。然而，从人体血液中提纯得到的IVIG其唾液酸化水平普遍较低。因此，生产具有高唾液酸修饰水平的IgG抗体对其抗炎作用的研究和炎症疾病的治疗都具有重要意义。由于使用普通工程细胞(如：CHO细胞)生产的IgG的糖链唾液酸修饰水平很低，因此，通过对工程细胞糖基化相关基因进行改造，提高IgG糖链的唾液酸化修饰水平，对生产具有抗炎活性的IgG抗体药物具有重要意义。
N糖基化是蛋白质重要的翻译后修饰，起始于细胞内质网，完成于高尔基体中，由一系列的糖基转移酶逐个添加不同的糖单元组装而成。未经改造的工程细胞所生产的IgG抗体，在N297位修饰的糖链主要是不含半乳糖的双天线复合糖型(G0F型，图1)，需要通过β-1,4-半乳糖基转移酶(B4GALT1)和β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)两步催化，才能组装成为具有抗炎活性的唾液酸修饰糖型(G2FS1/G2FS2型,图1)。然而，可能由于N297糖基化位点在IgG抗体结构中空间受限，工程细胞内源表达的B4GALT1和ST6GAL1对该位点的糖链催化效率低。
相关技术中，生产高唾液酸IgG抗体的方法分为体外酶催化和细胞糖工程两类。体外酶催化方法包括：1.通过采用重组表达的糖基转移酶B4GALT1、ST6GAL1和合成制备的糖基供体底物与IgG抗体共孵育反应，在IgG抗体的N297位糖链上依次添加半乳糖和唾液酸；2.先通过内切糖苷酶(endoglycosidases，EndoS)去除掉IgG抗体上的N-聚糖，然后使用具有转糖酶活性的EndoS突变体将有机合成的带有唾液酸修饰的完整糖链整体添加到IgG抗体的N297位。体外酶催化反应虽然效率高，但由于需要额外制备糖基转移酶、糖苷酶和糖基供体等底物，而且需要额外的纯化步骤，其生产成本相应较高，难以实现工业化生产。细胞糖工程方法通过瞬时转染、稳定转染或者定点敲入特定基因的方式在宿主细胞中对糖链中唾液酸的生物合成途径进行改造，从而提高工程细胞生产高唾液酸修饰IgG的能力。包括：过表达编码唾液酸糖基供体转运蛋白(CMP-sialic acid transporter)的基因；同时过表达编码糖基转移酶B4GALT1和ST6GAL1的两个基因。但上述方案生产的IgG抗体的唾液酸修饰程度均较低，仅能得到IgG抗体药物的部分单唾液酸修饰(G2FS1型)和极少量的双唾液酸修饰(G2FS2型)。
因此，如何通过经济有效的方法获得高度唾液酸修饰的IgG抗体或蛋白药物具有重要的社会价值。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种融合蛋白，通过与目标蛋白在细胞中共表达，能够有效提高目标蛋白的唾液酸修饰程度。
本发明还提供一种编码上述融合蛋白的核酸分子。
本发明还提供一种重组载体。
本发明还提供一种重组生物细胞。
本发明还提供一种产品。
本发明还提供一种提高蛋白的唾液酸修饰程度的方法。
本发明还提供由上述提高蛋白的唾液酸修饰程度的方法制备得到的蛋白。
本发明还提供上述融合蛋白/核酸分子/重组载体/产品/方法在制备含唾液酸化糖型的蛋白中的应用。
根据本发明的第一方面实施例的一种融合蛋白，所述融合蛋白为β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域与β-1,4-半乳糖基转移酶融合得到的融合蛋白。
根据本发明的一些实施例，所述β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域为A1)至A4)任一项，
A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第429～764位所示的蛋白质；
A2)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第492～764位所示的蛋白质；
A3)将A1)或A2)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1活性的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质。
根据本发明的一些实施例，所述β-1,4-半乳糖基转移酶为B1)或B2)或B3)，
B1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第1～393位所示的蛋白质；
B2)将B1)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β-1,4-半乳糖基转移酶活性的融合蛋白；
B3)在B1)或B2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质。
根据本发明的一些实施例，所述β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域与所述β-1,4-半乳糖基转移酶通过非剪切性连接肽连接。
根据本发明的一些实施例，所述非剪切性连接肽为非剪切性柔性连接肽。本领域技术人员可以依据目标蛋白或多肽对连接肽进行选择。例如，所述非剪切性柔性连接肽可以为SEQ ID NO.1第409～428位所示氨基酸序列，也可以为GGGSGGSG、(GGGGS)6、(GGGGS)5、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、GGGG、GSGGSG、GSGGSGGGSGGSGGG、GGGGSGGG、GSGGSGGG或GGGGSGGGSGG。
根据本发明的一些实施例，所述蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白和/或SUMO标签蛋白。可以理解的是，本发明的融合蛋白可以包含一个或多个蛋白标签；多个蛋白标签可以包含多个相同蛋白标签的组合，也可以为多个不同蛋白标签的组合。
根据本发明的第二方面实施例的一种编码上述融合蛋白的核酸分子。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子中，用于编码所述β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域的核苷酸序列如C1)至C4)任一项所示，
C1)SEQ ID NO.2第1285～2292位核苷酸序列；
C2)SEQ ID NO.2第1474～2292位核苷酸序列；
C3)与C1)或C2)所示的核苷酸序列具有90％以上同一性，且编码的蛋白质具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1活性的核苷酸序列；
C4)与C1)或C2)或C3)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例，用于编码所述β-1,4-半乳糖基转移酶的核苷酸序列如D1)至D3)任一项所示，
D1)SEQ ID NO.2第1～1179位核苷酸序列；
D2)与D1)所示的核苷酸序列具有90％以上同一性，且编码的蛋白质具有β-1,4-半乳糖基转移酶活性的核苷酸序列；
D3)与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。
根据本发明的第三方面实施例的一种重组载体，所述重组载体含有E1)或E2)，
E1)本发明第二方面实施例中所述的核酸分子；
E2)含有本发明第二方面实施例中所述的核酸分子的表达盒。
根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述融合蛋白的DNA。该DNA不但可包括启动所述融合蛋白基因转录的启动子，还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
根据本发明的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述载体具体可以为哺乳细胞表达质粒。
根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述突融合蛋白的核酸分子得到的重组载体。
根据本发明的第四方面实施例的含有本发明第一方面实施例中所述的融合蛋白或本发明第二方面实施例中所述的核酸分子或本发明第三方面实施例中所述的重组载体的重组生物细胞。
根据本发明的一些实施例，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述哺乳动物细胞可以为CHO细胞，HEK293细胞或其他哺乳动物细胞。所述重组生物细胞不包含生殖材料。
根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞具体可以为向CHO细胞中导入重组载体得到的重组CHO细胞。
根据本发明的第五方面实施例的一种产品，所述产品含有F1)至F4)中的至少一种，
F1)本发明第一方面实施例中所述的融合蛋白；
F2)本发明第二方面实施例中所述的核酸分子；
F3)本发明第三方面实施例中所述的重组载体；
F4)本发明第四方面实施例中所述的重组生物细胞。
根据本发明的第六方面实施例的一种提高蛋白的唾液酸修饰程度的方法，包括以下步骤：使目标蛋白与本发明第一方面实施例中所述的融合蛋白在宿主细胞中共表达。
根据本发明的一些实施例，所述方法具体可以为：
1)将本发明第二方面实施例中所述的核酸分子整合至宿主细胞的基因组，使所述宿主细胞表达所述融合蛋白，得到重组宿主细胞；
2)将能够表达目标蛋白的重组表达载体转染至所述重组宿主细胞，并诱导所述重组宿主细胞表达所述目标蛋白。
具体地，还可以包括验证表达得到的所述目标蛋白的唾液酸糖型含量。用于验证的方法包括但不限于超高效液相色谱(UPLC)。
根据本发明的一些实施例，所述目标蛋白可以为抗体以及其他蛋白药物，包括但不限于IgG。
根据本发明的一些实施例，“将本发明第二方面实施例中所述的核酸分子整合至宿主细胞的基因组”通过将a1或a2导入所述宿主细胞实现；
a1：含有本发明第二方面实施例中所述的核酸分子的核酸分子A；所述核酸分子A在本发明第二方面实施例中所述的核酸分子的上游具有上游同源臂，且在本发明第二方面实施例中所述的核酸分子的下游具有下游同源臂，所述上游同源臂和所述下游同源臂用于将本发明第二方面实施例中所述的核酸分子整合至所述宿主细胞；
a2：含有a1中所述核酸分子A的重组载体A。
根据本发明的一些实施例，所述步骤1)具体可以包括：将a2中所述重组载体A与含有gRNA、Cas9蛋白编码基因的重组载体B共同导入所述宿主细胞。
根据本发明的第七方面实施例的上述方法制备得到的蛋白。
根据本发明的第八方面实施例的G1)至G6)中任一种在制备含唾液酸化糖型的蛋白中的应用，
G1)本发明第一方面实施例中所述的融合蛋白；
G2)本发明第二方面实施例中所述的核酸分子；
G3)本发明第三方面实施例中所述的重组载体；
G4)本发明第四方面实施例中所述的重组生物细胞；
G5)本发明第五方面实施例中所述的产品；
G6)本发明第六方面实施例中所述的方法。
本发明至少具有如下有益效果：
未经改造的工程细胞在生产IgG抗体过程中，在N297位修饰的糖链需要通过B4GALT1和ST6GAL1两步催化才能产生唾液酸修饰糖型。这两种糖基转移酶虽然都定位于细胞高尔基体，但其具体分布并不完全一致，导致其连续催化糖链延长、生成高唾液酸糖型的效率不如体外反应效率高。本发明通过将β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)的催化结构域与全长β-1,4-半乳糖基转移酶(B4GALT1)连接成为融合蛋白，改变ST6GAL1催化结构域在细胞高尔基体中的定位，使其与B4GALT1形成共定位，从而更有效地对B4GALT1的反应产物(半乳糖修饰的糖链)进行催化，提高唾液酸糖型的生产效率。本发明的融合蛋白在N糖基化修饰的蛋白类药物的唾液酸化改造中具有很好的应用前景。
本发明的提高蛋白的唾液酸修饰程度的方法通过构建表达所述融合蛋白的工程细胞株，使用该工程细胞株生产的抗体的糖链主要为唾液酸修饰的糖型(占比可达87.87％，其中双唾液酸修饰的糖型占比可达18.87％)。本发明的方法能够提高糖基转移酶B4GALT1和ST6GAL1在工程细胞株中对糖链的反应效率，从而进一步提高工程细胞株生产高唾液酸修饰IgG抗体的能力。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1是IgG抗体上常见的几种N糖糖型结构示意图；
图2是本发明实施例1的B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白的结构示意图；
图3是本发明实施例1的质粒pROSA26-B4GALT1-ST6GAL1的图谱；
图4是本发明实施例1的质粒HP180的图谱
图5是本发明对比例1的质粒pROSA26-ST6GAL1-P2A-B4GALT1的图谱；
图6是本发明检测例1的B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株的PCR验证结果；
图7是本发明检测例1的B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株的Western blot验证结果；
图8是本发明检测例2的质粒pCGS3-Fc的图谱；
图9是本发明检测例2的野生型CHO细胞、B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株所生产的抗体Fc片段的N糖糖型的色谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在下述实施例中，所用细胞株为CHO细胞。可以根据实际需要，合理的替换为本领域其他工程细胞株。
实施例1
经过文献调研发现定位于高尔基体的ST6GAL1蛋白结构包括一段短的胞质区(第1-11位氨基酸)、高尔基膜锚定区(第12-26位氨基酸)、位于高尔基内腔的茎区(STEM，第27-133位氨基酸)和催化结构区(第134-406位氨基酸)。
本实施例提供一种B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白。通过一段柔性连接子(linker)将ST6GAL1的第71～406位氨基酸与全长的B4GALT1(包含胞质尾区、膜锚定区、茎区和催化结构域)连接构成B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白。B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白的结构示意图如图2所示。
B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
MRFLRPVLGGSAAMPGATLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLSGRDLSRLPQLVGVSSTLRSGTIGATANKQPPGARPPPPVGVSSKPRPGPDSSPGTAFDPGLKSNWTSVLVPPTTALLTLPACPEESPLLVGPMVIDFNIAVDLELLAKKNPEIKMGGRYSPKDCISPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTMFNRAKLLNIGFQEALKDHDYNCFVFSDVDLIPMDDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLAINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRIVHKGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMRFDGLNSLTYQVLNVERYPLYTKITVDIGTPRGGGGSEQKLISEEDLKLSGSETPGTSESATPESGSPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHCYPYDVPDYA*(SEQ ID NO.1)；
其中，第1～393位氨基酸对应B4GALT1，第394～398位氨基酸对应B4GALT1和MYC标签间的柔性连接子，第399～408位氨基酸对应MYC标签，第409～428位氨基酸对应MYC标签和ST6GAL1茎区间的柔性连接子，第429～491位氨基酸对应ST6GAL1的茎区，第492～764位氨基酸对应ST6GAL1的催化结构区，第765～773位氨基酸对应HA标签。
ATGAGATTCTTACGGCCTGTGCTGGGCGGCAGCGCCGCCATGCCTGGCGCCACCCTGCAGAGAGCCTGCAGACTGCTGGTGGCCGTGTGCGCCCTGCACCTGGGCGTGACCCTGGTGTACTACCTGAGCGGCCGGGACCTGAGCAGACTGCCTCAGCTGGTAGGTGTGAGTTCTACCCTAAGAAGCGGCACCATCGGCGCCACCGCCAACAAGCAGCCTCCTGGCGCTAGGCCTCCTCCTCCTGTGGGCGTGAGTAGTAAGCCTAGACCTGGCCCTGACAGCAGCCCTGGCACCGCCTTCGACCCTGGCCTGAAGAGCAACTGGACAAGCGTGCTGGTGCCTCCTACCACCGCCCTGCTGACCCTGCCTGCCTGCCCTGAGGAGAGCCCTCTGCTGGTGGGCCCTATGGTGATCGACTTCAACATCGCCGTGGACCTGGAGCTGCTGGCCAAGAAGAACCCTGAGATCAAGATGGGCGGCAGATACAGCCCTAAGGACTGCATCAGCCCTCACAAGGTGGCCATCATCATCCCTTTCAGAAACAGACAAGAGCACCTGAAGTACTGGCTGTACTACCTGCACCCTGTGCTGCAGAGACAGCAGCTGGACTACGGCATCTACGTGATCAACCAAGCCGGCGACACCATGTTCAACAGAGCCAAGCTGCTGAACATCGGCTTCCAAGAGGCCCTGAAGGACCACGACTACAACTGCTTCGTGTTCAGCGACGTGGACCTGATCCCTATGGACGACCACAACGCCTACAGATGCTTCTCTCAGCCTAGACACATCAGCGTGGCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGCCTGCCTTACGTGCAGTACTTCGGCGGCGTGAGCGCCCTGAGCAAGCAGCAGTTCCTGGCCATCAACGGCTTCCCTAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGCGAGGACGACGACATCTTCAACAGAATCGTGCACAAGGGCATGAGCATCAGCAGACCTAACGCCGTGGTGGGCAGATGCAGAATGATCAGACACAGCAGAGACAAGAAGAACGAGCCTAACCCTCAGAGATTCGACAGAATCGCCCACACCAAGGAGACGATGAGGTTCGACGGACTGAACAGCCTGACCTACCAAGTGCTGAACGTGGAGAGATACCCTCTGTACACCAAGATCACCGTGGACATCGGCACCCCTAGAGGCGGCGGCGGCAGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGAAGCTTAGCGGATCTGAAACTCCTGGGACTTCCGAGTCTGCTACACCTGAATCTGGATCCCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGATCTGGAAGAATTACCTAAGCATGAACAAGTACAAAGTGTCCTACAAGGGGCCAGGACCAGGCATCAAGTTCAGTGCAGAGGCCCTGCGCTGCCACCTCCGGGACCATGTGAATGTATCCATGGTAGAGGTCACAGATTTTCCCTTCAATACCTCTGAATGGGAGGGTTATCTGCCCAAGGAGAGCATTAGGACCAAGGCTGGGCCTTGGGGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAGCGGGATCTCTGAAGTCCTCCCAACTAGGCAGAGAAATCGATGATCATGACGCAGTCCTGAGGTTTAATGGGGCACCCACAGCCAACTTCCAACAAGATGTGGGCACAAAAACTACCATTCGCCTGATGAACTCTCAGTTGGTTACCACAGAGAAGCGCTTCCTCAAAGACAGTTTGTACAATGAAGGAATCCTAATTGTATGGGACCCATCTGTATACCACTCAGATATCCCAAAGTGGTACCAGAATCCGGATTATAATTTCTTTAACAACTACAAGACTTATCGTAAGCTGCACCCCAATCAGCCCTTTTACATCCTCAAGCCCCAGATGCCTTGGGAGCTATGGGACATTCTTCAAGAAATCTCCCCAGAAGAGATTCAGCCAAACCCCCCATCCTCTGGGATGCTTGGTATCATCATCATGATGACGCTGTGTGACCAGGTGGATATTTATGAGTTCCTCCCATCCAAGCGCAAGACTGACGTGTGCTACTACTACCAGAAGTTCTTCGATAGTGCCTGCACGATGGGTGCCTACCACCCGCTGCTCTATGAGAAGAATTTGGTGAAGCATCTCAACCAGGGCACAGATGAGGACATCTACCTGCTTGGAAAAGCCACACTGCCTGGCTTCCGGACCATTCACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGA(SEQ ID NO.2)；
其中，第1～1179位核苷酸用于编码B4GALT1，第1180～1194位核苷酸用于编码B4GALT1和MYC标签间的柔性连接子，第1195～1224位核苷酸用于编码MYC标签，第1225～1284位核苷酸用于编码MYC标签和ST6GAL1茎区间的柔性连接子，第1285～1473位核苷酸用于编码ST6GAL1的茎区，第1474～2292位核苷酸用于编码ST6GAL1的催化结构区，第2293～2319位核苷酸用于编码HA标签。
获得表达B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白的细胞的方法如下：
(1)人工合成如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
(2)将步骤(1)合成得到的核苷酸序列经过酶切、酶连、菌落扩增、挑菌、测序克隆到载体质粒上，得到B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白表达质粒(记为：pROSA26-B4GALT1-ST6GAL1)。
质粒pROSA26-B4GALT1-ST6GAL1的图谱如图3所示。质粒pROSA26-B4GALT1-ST6GAL1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
GATGCCGCATAGTTACTCGAGTCAAGCGTGAGCATAAAACTCGGGTCAATAAGGGAGCCGCAGTGGAG TAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTACTCGGCTGGGGGAGGGGAGTGCCGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTG CCTCCTGTCTTCTAAAGACCGCCCCGGGACTGGAAGGATCCCTTCCCCCTTTCCCCTCGTGATCTGCAAGTCGAGG CTTTCTGGGAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTGAGGGCTAACCTGGTGCGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGG AATTGAACTGGTGTAAAATTGGAAGGGTGAGAATTCCCACGGATTTTCGTTTGTGTCGGGAGGTGATTGTAATAGG GGCAAAGGAGGGAAATGGGAGACTAGGTGCTCGCCTGGGGTTTTGTGCAGCAAAACTACAGGTTATTATTAATAAG CCTTGGAGTATTTTTCATCGAGTTGGATTAAGGTCATGCTCACgtttGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCATGAGATTCTTACGGCCTGTGCTGGGCGGCAGCGCCGCCATGCCTGGCGCCACCCTGCAGAGAGCCTGCAGACTGCTGGTGGCCGTGTGCGCCCTGCACCTGGGCGTGACCCTGGTGTACTACCTGAGCGGCCGGGACCTGAGCAGACTGCCTCAGCTGGTAGGTGTGAGTTCTACCCTAAGAAGCGGCACCATCGGCGCCACCGCCAACAAGCAGCCTCCTGGCGCTAGGCCTCCTCCTCCTGTGGGCGTGAGTAGTAAGCCTAGACCTGGCCCTGACAGCAGCCCTGGCACCGCCTTCGACCCTGGCCTGAAGAGCAACTGGACAAGCGTGCTGGTGCCTCCTACCACCGCCCTGCTGACCCTGCCTGCCTGCCCTGAGGAGAGCCCTCTGCTGGTGGGCCCTATGGTGATCGACTTCAACATCGCCGTGGACCTGGAGCTGCTGGCCAAGAAGAACCCTGAGATCAAGATGGGCGGCAGATACAGCCCTAAGGACTGCATCAGCCCTCACAAGGTGGCCATCATCATCCCTTTCAGAAACAGACAAGAGCACCTGAAGTACTGGCTGTACTACCTGCACCCTGTGCTGCAGAGACAGCAGCTGGACTACGGCATCTACGTGATCAACCAAGCCGGCGACACCATGTTCAACAGAGCCAAGCTGCTGAACATCGGCTTCCAAGAGGCCCTGAAGGACCACGACTACAACTGCTTCGTGTTCAGCGACGTGGACCTGATCCCTATGGACGACCACAACGCCTACAGATGCTTCTCTCAGCCTAGACACATCAGCGTGGCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGCCTGCCTTACGTGCAGTACTTCGGCGGCGTGAGCGCCCTGAGCAAGCAGCAGTTCCTGGCCATCAACGGCTTCCCTAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGCGAGGACGACGACATCTTCAACAGAATCGTGCACAAGGGCATGAGCATCAGCAGACCTAACGCCGTGGTGGGCAGATGCAGAATGATCAGACACAGCAGAGACAAGAAGAACGAGCCTAACCCTCAGAGATTCGACAGAATCGCCCACACCAAGGAGACGATGAGGTTCGACGGACTGAACAGCCTGACCTACCAAGTGCTGAACGTGGAGAGATACCCTCTGTACACCAAGATCACCGTGGACATCGGCACCCCTAGAGGCGGCGGCGGCAGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGAAGCTTAGCGGATCTGAAACTCCTGGGACTTCCGAGTCTGCTACACCTGAATCTGGATCCCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGATCTGGAAGAATTACCTAAGCATGAACAAGTACAAAGTGTCCTACAAGGGGCCAGGACCAGGCATCAAGTTCAGTGCAGAGGCCCTGCGCTGCCACCTCCGGGACCATGTGAATGTATCCATGGTAGAGGTCACAGATTTTCCCTTCAATACCTCTGAATGGGAGGGTTATCTGCCCAAGGAGAGCATTAGGACCAAGGCTGGGCCTTGGGGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAGCGGGATCTCTGAAGTCCTCCCAACTAGGCAGAGAAATCGATGATCATGACGCAGTCCTGAGGTTTAATGGGGCACCCACAGCCAACTTCCAACAAGATGTGGGCACAAAAACTACCATTCGCCTGATGAACTCTCAGTTGGTTACCACAGAGAAGCGCTTCCTCAAAGACAGTTTGTACAATGAAGGAATCCTAATTGTATGGGACCCATCTGTATACCACTCAGATATCCCAAAGTGGTACCAGAATCCGGATTATAATTTCTTTAACAACTACAAGACTTATCGTAAGCTGCACCCCAATCAGCCCTTTTACATCCTCAAGCCCCAGATGCCTTGGGAGCTATGGGACATTCTTCAAGAAATCTCCCCAGAAGAGATTCAGCCAAACCCCCCATCCTCTGGGATGCTTGGTATCATCATCATGATGACGCTGTGTGACCAGGTGGATATTTATGAGTTCCTCCCATCCAAGCGCAAGACTGACGTGTGCTACTACTACCAGAAGTTCTTCGATAGTGCCTGCACGATGGGTGCCTACCACCCGCTGCTCTATGAGAAGAATTTGGTGAAGCATCTCAACCAGGGCACAGATGAGGACATCTACCTGCTTGGAAAAGCCACACTGCCTGGCTTCCGGACCATTCACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGATGACTCGAGGGAGGAGACTACAAGGACGACGATGACAAGTCGGCCGCTGGAGGATAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCaaacGATCCTTGCTATATCATGAAATTATAGTGTCGCAAGTTAGAATACATAAACAGAATTTTAGTGTTTTCTACAGGGCCCTGCACTTCACTCTTTCCCTCCTGCTCCCTCTGCAGCCCTACCAAAAGATATTTTAGCACTCTCATTTGAGTCCCCTTTTCATTTGTTAGTACTGGCTCACCCAATCCCTAGACAGAGCACTGGCATTCTTCCCCTCATGATCTTAGAAGCCTGATGAGTCATGAAACCAGACAGATTAGTTACACCACAAATTGAGGCTGTAGCTGGGGCCTTACCCTGCAGTTCTTTTATGCCTCCTTAGTACATTTTGTTGACTGTTTGCCTTGATTTTCATTTTCTATCCCCTTCGGGAGCTCTGCTGCAATACCGAGTTTTATGCTCACGCTTGAGCTAGCATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCT(SEQ ID No.3)。
其中，下划线标记部分的核苷酸序列为B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白表达盒编码基因的上游同源臂，加粗标记部分的核苷酸序列为B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白表达盒编码基因的下游同源臂。
(3)利用CRISPR-Cas9技术将B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白表达基因定点敲入到工程CHO细胞基因组的ROSA26位点。具体操作如下：
构建CRISPR Cas9系统质粒：
人工合成靶向ROSA26位点的gRNA序列(gRNA序列参考自文献：Gaidukov Leonid,et al.A multi-landing pad DNA integration platform for mammalian cellengineering.[J].Nucleic Acids Res 46,4072-4086,2018.)。将合成的gRNA经过退火、酶连、菌落扩增、挑菌、测序等步骤构建到载体质粒HP180(质粒图谱如图4所示)，得到靶向ROSA26位点的CRISPR-Cas9系统质粒。
按照FectoPRO转染试剂盒(Polyplus，货号116-001)操作说明书，将CRISPR Cas9系统质粒、质粒pROSA26-B4GALT1-ST6GAL1共转染CHO细胞。
转染48h后，观察细胞转染情况(转染成功则细胞表达EGFP蛋白，细胞发出绿色荧光)，提供流式分选发绿色荧光的阳性单克隆细胞。
单克隆培养：收取阳性单克隆细胞，放置细胞培养箱中培养1～2周。
(4)待步骤(3)获得的阳性单克隆细胞长至占满细胞孔板底部约80％时，通过PCR和蛋白印迹(Western Blot)验证细胞株是否在特定位点含有目的基因以及目的基因是否表达。将筛选获得的B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白基因成功整合进入工程CHO细胞基因组ROSA26位点的代表性单克隆细胞株记为B4-ST6细胞株。
对比例1
本对比例提供一种B4GALT1/ST6GAL1共表达蛋白。通过P2A将全长的B4GALT1(包含胞质尾区、膜锚定区、茎区序列和催化结构域)和全长的ST6GAL1(包含胞质尾区、膜锚定区、茎区序列和催化结构域，)连接构成B4GALT1/ST6GAL1共表达蛋白。
P2A用于编码P2A肽。P2A肽是一种“自我剪切”肽，在转录后翻译时会通过“自我断裂”将B4GALT1和ST6GAL1两个蛋白分离。
获得表达对比例1的B4GALT1/ST6GAL1共表达蛋白的细胞(记为：ST6/B4细胞株)的方法与实施例1的区别仅在于：与CRISPR Cas9系统质粒共转染CHO细胞的表达质粒不同，该表达质粒为质粒pROSA26-ST6GAL1-P2A-B4GALT1。
其中，质粒pROSA26-ST6GAL1-P2A-B4GALT1的制备方法如下：
人工合成编码B4GALT1-ST6GAL1共表达蛋白的核苷酸序列。将合成得到的核苷酸序列经过酶切、酶连、菌落扩增、挑菌、测序克隆到载体质粒上，得到B4GALT1/ST6GAL1共表达质粒(记为：pROSA26-ST6GAL1-P2A-B4GALT1)。
质粒pROSA26-ST6GAL1-P2A-B4GALT1的图谱如图5所示。质粒pROSA26-ST6GAL1-P2A-B4GALT1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
GATGCCGCATAGTTACTCGAGTCAAGCGTGAGCATAAAACTCGGGTCAATAAGGGAGCCGCAGTGGAG TAGGCGGGGAGAAGGCCGCACCCTACTCGGCTGGGGGAGGGGAGTGCCGCAATACCTTTCTGGGAGTTCTCTGCTG CCTCCTGTCTTCTAAAGACCGCCCCGGGACTGGAAGGATCCCTTCCCCCTTTCCCCTCGTGATCTGCAAGTCGAGG CTTTCTGGGAGATGGGCGGGAGTCTTCTGGGCAGGCTTGAGGGCTAACCTGGTGCGTGGGCGTTGTCCTGCAGGGG AATTGAACTGGTGTAAAATTGGAAGGGTGAGAATTCCCACGGATTTTCGTTTGTGTCGGGAGGTGATTGTAATAGG GGCAAAGGAGGGAAATGGGAGACTAGGTGCTCGCCTGGGGTTTTGTGCAGCAAAACTACAGGTTATTATTAATAAG CCTTGGAGTATTTTTCATCGAGTTGGATTAAGGTCATGCTCACgtTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAGAAAAAGTTCAGCTGCTGCGTCCTGGTCTTTCTTCTGTTTGCAGTCATCTGTGTGTGGAAGGAAAAGAAGAAAGGGAGTTACTATGATTCCTTTAAATTGCAAACCAAGGAATTCCAGGTGTTAAAGAGTCTGGGGAAATTGGCCATGGGGTCTGATTCCCAGTCTGTATCCTCAAGCAGCACCCAGGACCCCCACAGGGGCCGCCAGACCCTCGGCAGTCTCAGAGGCCTAGCCAAGGCCAAACCAGAGGCCTCCTTCCAGGTGTGGAACAAGGACAGCTCTTCCAAAAACCTTATCCCTAGGCTGCAAAAGATCTGGAAGAATTACCTAAGCATGAACAAGTACAAAGTGTCCTACAAGGGGCCAGGACCAGGCATCAAGTTCAGTGCAGAGGCCCTGCGCTGCCACCTCCGGGACCATGTGAATGTATCCATGGTAGAGGTCACAGATTTTCCCTTCAATACCTCTGAATGGGAGGGTTATCTGCCCAAGGAGAGCATTAGGACCAAGGCTGGGCCTTGGGGCAGGTGTGCTGTTGTGTCGTCAGCGGGATCTCTGAAGTCCTCCCAACTAGGCAGAGAAATCGATGATCATGACGCAGTCCTGAGGTTTAATGGGGCACCCACAGCCAACTTCCAACAAGATGTGGGCACAAAAACTACCATTCGCCTGATGAACTCTCAGTTGGTTACCACAGAGAAGCGCTTCCTCAAAGACAGTTTGTACAATGAAGGAATCCTAATTGTATGGGACCCATCTGTATACCACTCAGATATCCCAAAGTGGTACCAGAATCCGGATTATAATTTCTTTAACAACTACAAGACTTATCGTAAGCTGCACCCCAATCAGCCCTTTTACATCCTCAAGCCCCAGATGCCTTGGGAGCTATGGGACATTCTTCAAGAAATCTCCCCAGAAGAGATTCAGCCAAACCCCCCATCCTCTGGGATGCTTGGTATCATCATCATGATGACGCTGTGTGACCAGGTGGATATTTATGAGTTCCTCCCATCCAAGCGCAAGACTGACGTGTGCTACTACTACCAGAAGTTCTTCGATAGTGCCTGCACGATGGGTGCCTACCACCCGCTGCTCTATGAGAAGAATTTGGTGAAGCATCTCAACCAGGGCACAGATGAGGACATCTACCTGCTTGGAAAAGCCACACTGCCTGGCTTCCGGACCATTCACTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCGGATCCGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGAGATTCTTACGGCCTGTGCTGGGCGGCAGCGCCGCCATGCCTGGCGCCACCCTGCAGAGAGCCTGCAGACTGCTGGTGGCCGTGTGCGCCCTGCACCTGGGCGTGACCCTGGTGTACTACCTGAGCGGCCGGGACCTGAGCAGACTGCCTCAGCTGGTAGGTGTGAGTTCTACCCTAAGAAGCGGCACCATCGGCGCCACCGCCAACAAGCAGCCTCCTGGCGCTAGGCCTCCTCCTCCTGTGGGCGTGAGTAGTAAGCCTAGACCTGGCCCTGACAGCAGCCCTGGCACCGCCTTCGACCCTGGCCTGAAGAGCAACTGGACAAGCGTGCTGGTGCCTCCTACCACCGCCCTGCTGACCCTGCCTGCCTGCCCTGAGGAGAGCCCTCTGCTGGTGGGCCCTATGGTGATCGACTTCAACATCGCCGTGGACCTGGAGCTGCTGGCCAAGAAGAACCCTGAGATCAAGATGGGCGGCAGATACAGCCCTAAGGACTGCATCAGCCCTCACAAGGTGGCCATCATCATCCCTTTCAGAAACAGACAAGAGCACCTGAAGTACTGGCTGTACTACCTGCACCCTGTGCTGCAGAGACAGCAGCTGGACTACGGCATCTACGTGATCAACCAAGCCGGCGACACCATGTTCAACAGAGCCAAGCTGCTGAACATCGGCTTCCAAGAGGCCCTGAAGGACCACGACTACAACTGCTTCGTGTTCAGCGACGTGGACCTGATCCCTATGGACGACCACAACGCCTACAGATGCTTCTCTCAGCCTAGACACATCAGCGTGGCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGCCTGCCTTACGTGCAGTACTTCGGCGGCGTGAGCGCCCTGAGCAAGCAGCAGTTCCTGGCCATCAACGGCTTCCCTAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGCGAGGACGACGACATCTTCAACAGAATCGTGCACAAGGGCATGAGCATCAGCAGACCTAACGCCGTGGTGGGCAGATGCAGAATGATCAGACACAGCAGAGACAAGAAGAACGAGCCTAACCCTCAGAGATTCGACAGAATCGCCCACACCAAGGAGACGATGAGGTTCGACGGACTGAACAGCCTGACCTACCAAGTGCTGAACGTGGAGAGATACCCTCTGTACACCAAGATCACCGTGGACATCGGCACCCCTAGAGGCGGCGGCGGCAGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGTGATGACTCGAGGAGGGCCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCaaacGATCCTTGCTATATCATGAAATTATAGTGTCGCAAGTTAGAATACATAAACAGAATTTTAGTGTTTTCTACAGGGCCCTGCACTTCACTCTTTCCCTCCTGCTCCCTCTGCAGCCCTACCAAAAGATATTTTAGCACTCTCATTTGAGTCCCCTTTTCATTTGTTAGTACTGGCTCACCCAATCCCTAGACAGAGCACTGGCATTCTTCCCCTCATGATCTTAGAAGCCTGATGAGTCATGAAACCAGACAGATTAGTTACACCACAAATTGAGGCTGTAGCTGGGGCCTTACCCTGCAGTTCTTTTATGCCTCCTTAGTACATTTTGTTGACTGTTTGCCTTGATTTTCATTTTCTATCCCCTTCGGGAGCTCTGCTGCAATACCGAGTTTTATGCTCACGCTTGAGCTAGCATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCT(SEQ ID No.4)。
其中，下划线标记部分的核苷酸序列为B4GALT1/ST6GAL1共表达蛋白的表达盒编码基因的上游同源臂，加粗标记部分的核苷酸序列为B4GALT1/ST6GAL1共表达蛋白的表达盒编码基因的下游同源臂。
检测例
1、通过PCR和蛋白印迹(Western Blot)验证B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株是否分别为成功整合B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白基因和ST6GAL1-P2A-B4GALT1共表达基因的细胞株。
(1)通过PCR验证发现，对B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株的基因组进行扩增，都能够产生包含B4GALT1-ST6GAL1表达基因或ST6GAL1-P2A-B4GALT1共表达基因序列的PCR条带(约840bp)。这表明B4GALT1-ST6GAL1表达基因和ST6GAL1-P2A-B4GALT1共表达基因分别成功整合进入CHO细胞基因组的ROSA26位点。结果如图6所示。
(2)通过Western Blot验证发现，与野生型CHO细胞相比，B4-ST6细胞株在目标分子量位置正确表达了B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白，ST6/B4细胞株在目标分子量位置正确表达了ST6GAL1和B4GALT1蛋白。其中带有MYC标签的B4GALT1和带有HA标签的ST6GAL1催化结构域分别被anti-Myc和anti-HA抗体识别。结果如图7所示。
综上可知，B4GALT1-ST6GAL1融合基因和ST6GAL1-P2A-B4GALT1共表达基因分别成功整合进入B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株基因组的ROSA26位点，并成功表达目标蛋白。
2、B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株生产抗体Fc片段的糖型表征
实验方法如下：
(1)使用转染试剂将含编码IgG抗体Fc片段的表达质粒(名称为pCGS3-Fc)分别转染进入野生型CHO细胞、B4-ST6细胞株和ST6/B4细胞株，以实现Fc片段的表达和生产。
其中，IgG抗体Fc片段蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。IgG抗体Fc片段表达质粒pCGS3-Fc的图谱如图8所示。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO.5)
(2)使用蛋白A+G亲和层析树脂进行抗体Fc片段的纯化。
(3)使用PNGaseF糖苷酶对纯化后的Fc片段进行酶切释放N糖糖链，纯化获得N糖糖链后，使用普鲁卡因胺对糖链进行标记，进一步纯化获得标记普鲁卡因胺的N糖后，运用UPLC进行N糖糖型的表征。
结果如图9所示。
糖型含量的计算公式为：某个糖型所占含量＝该糖型在色谱图中的峰面积/(G0F+G1F+G2F+G2FS1+G2FS2)的总峰面积。
野生型CHO细胞所生产的抗体Fc片段N糖基化修饰糖型主要为G0F(54.01％)、G1F(39.98％)和G2F(6.01％)。ST6/B4细胞株所生产的抗体Fc片段N糖基化修饰糖型主要为G0F(3.47％)、G1F(16.27％)、G2F(16.76％)、G2FS1(59.14％)和G2FS2(4.35％)。而B4-ST6细胞株所生产的抗体Fc片段的N糖糖型主要为G0F(1.53％)、G1F(7.99％)、G2F(2.61％)、G2FS1(69.00％)和G2FS2(18.87％)。
ST6/B4细胞株所生产的抗体Fc片段的N糖中唾液酸修饰的糖型(G2FS1+G2FS2)占比为63.49％；而B4-ST6细胞株生产的抗体Fc片段的N糖中唾液酸修饰的糖型(G2FS1+G2FS2)所占比例为87.87％，其中双唾液酸修饰的糖型高达18.87％。这表明实施例1构建的稳定表达B4GALT1-ST6GAL1融合蛋白的细胞糖工程方法能够有效提高工程细胞株生产的抗体双唾液酸修饰的糖型。
实施例1中选取了ST6GAL1蛋白氨基酸序列的第71～406位氨基酸，包含全部的催化结构区(第134～406位)和部分茎区序列(第71-133位)。但本发明的融合蛋白中，ST6GAL1的序列不限于ST6GAL1蛋白氨基酸序列的第71～406位氨基酸，茎区序列不会对其ST6GAL1催化活性产生影响。融合蛋白中的ST6GAL1序列只需要含有ST6GAL1蛋白的催化结构域，即可用于实现提高抗体唾液酸修饰的糖型的目的。
上面结合实施例对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域与β-1,4-半乳糖基转移酶融合得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域为A1)至A4)任一项，
A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第429～764位所示的蛋白质；
A2)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第492～764位所示的蛋白质；
A3)将A1)或A2)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1活性的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质；
优选地，所述β-1,4-半乳糖基转移酶为B1)或B2)或B3)，
B1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1第1～393位所示的蛋白质；
B2)将B1)中所述氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且同时具有β-1,4-半乳糖基转移酶活性的融合蛋白；
B3)在B1)或B2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的蛋白质；
优选地，所述β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域与所述β-1,4-半乳糖基转移酶通过非剪切性连接肽连接。
3.一种编码如权利要求1或2所述融合蛋白的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子中，用于编码所述β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的催化结构域的核苷酸序列如C1)至C4)任一项所示，
C1)SEQ ID NO.2第1285～2292位核苷酸序列；
C2)SEQ ID NO.2第1474～2292位核苷酸序列；
C3)与C1)或C2)所示的核苷酸序列具有90％以上同一性，且编码的蛋白质具有β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1活性的核苷酸序列；
C4)与C1)或C2)或C3)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
优选地，用于编码所述β-1,4-半乳糖基转移酶的核苷酸序列如D1)至D3)任一项所示，
D1)SEQ ID NO.2第1～1179位核苷酸序列；
D2)与D1)所示的核苷酸序列具有90％以上同一性，且编码的蛋白质具有β-1,4-半乳糖基转移酶活性的核苷酸序列；
D3)与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有E1)或E2)，
E1)权利要求3或4所述的核酸分子；
E2)含有权利要求3或4所述的核酸分子的表达盒。
6.含有表达权利要求1或2所述的融合蛋白或权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体的重组生物细胞。
7.一种产品，其特征在于，所述产品含有F1)至F4)中的至少一种，
F1)权利要求1或2所述的融合蛋白；
F2)权利要求3或4所述的核酸分子；
F3)权利要求5所述的重组载体；
F4)权利要求6所述的重组生物细胞。
8.一种提高蛋白的唾液酸修饰程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：使目标蛋白与权利要求1或2所述的融合蛋白在宿主细胞中共表达。
9.由权利要求8所述的方法制备得到的蛋白。
10.G1)至G6)中任一种在制备含唾液酸化糖型的蛋白中的应用，
G1)权利要求1或2所述的融合蛋白；
G2)权利要求3或4所述的核酸分子；
G3)权利要求5所述的重组载体；
G4)权利要求6所述的重组生物细胞；
G5)权利要求7所述的产品；
G6)权利要求8所述的方法。
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