JP6790057B2 - 改変されたn−およびo−グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する細胞ならびにその方法および使用 - Google Patents
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Description
− エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列を含み、内因性UDP−ガラクトース4−エピメラーゼ(GalE)の発現および/または活性が欠損し、かつ糖タンパク質をコードする第2の外因性核酸配列を含む真核細胞を、エンドグルコサミニダーゼ酵素および糖タンパク質を発現するのに適した条件で提供するステップと、
− 糖タンパク質がエンドグルコサミニダーゼと細胞内でまたは細胞外で接触された後、糖タンパク質を回収するステップと
を含む方法が提供される。
本発明は、特定の実施形態に関しておよびある図面に関連して説明されるが、本発明は、それに限定されず、請求項によってのみ限定される。請求項におけるいかなる参照記号も、範囲を限定するとして解釈されないものとする。記載される図面は概要に過ぎず、非限定的である。図面において、要素のいくつかのサイズは誇張され得、説明の目的のために一定の縮尺で描かれていないことがあり得る。用語「含む」が本発明の説明および請求項において使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。単数名詞を指すとき、不定冠詞または定冠詞、たとえば「1つの(a)」または「1つの(an)」、「その」が使用される場合、これは、特に何らかが他に明記されない限り、その名詞の複数形を含む。
− 内因性UDP−ガラクトース4−エピメラーゼ(GalE)の発現および/または活性が欠損し、かつエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列および糖タンパク質をコードする第2の外因性核酸配列を含む真核細胞を、エンドグルコサミニダーゼ酵素および糖タンパク質を発現するのに適した条件で提供するステップと、
− 糖タンパク質がエンドグルコサミニダーゼと細胞内でまたは細胞外で接触された後、糖タンパク質を回収するステップと
を含む方法が提供される。
これは、国際公開第2010/015722号パンフレットおよびMeuris et al.(Nat Biotechnol.2014 32(5):485−9)において記載されるように行った。手短かに言えば、インビトロにおける脱グリコシルを回避するために、本発明者らは、HEK293S細胞株においてインビボ脱N−グリコシル化を実行する。糸状菌トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)からクローニングされたためにendoTと示されるendoH型エンドグリコシダーゼをコードする菌類遺伝子(Genbank受入番号CS423050)の同定およびクローニング(PhD thesis Ingeborg Stals,Ghent University,2004)により、それが可能になる。研究は、グルコサミントランスフェラーゼIネガティブHEK細胞株において実行する(Reeves,Callewaert et al.,PNAS.99(2002):13419−13424)。この細胞株は、Man5GlcNAc2N−グリカンをほぼ排他的に産生し、これは、endoH型エンドグリコシダーゼによってキトビオース結合で加水分解される。
HEK293S細胞株のトランスゴルジ/TGNへのendoT酵素のターゲティングは、ゴルジ保持グリコシルトランスフェラーゼのトランスゴルジターゲティングシグナルを融合することによって実現する。ゴルジに内在するほとんどのグリコシルトランスフェラーゼは、程度の差はあれ、細長い支えとなっている領域(stalk region)においてタンパク分解性のスプライシングを受ける(Jaskiewicz,J.Biol.Chem.271(42)(1996),26395−26403)。ヒトβ−ガラクトシド−α−2,6−シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalI)またはヒトガングリオシド−GM2−シンターゼ(GalNAcT)のN−末端を完全長endoT酵素のN−末端に融合する。β−ガラクトシド−α−2,6−シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalI)は、より特徴付けられており、そのN−末端は、トランスゴルジ中に保持されるが、それはいくつかの切断部位を含有し、場合によりタンパク分解性の処理を受ける(Kitazume−Kawaguchi et al.,Glycobiology 9(12)(1999),1397−1406)。
哺乳動物細胞におけるendoT構築物の一過性のトランスフェクション
pCAGGS−hST−endoT、pCAGGS−hST−endoT−myc、pCAGGS−hGalNAcT−endoT、およびpCAGGS−hGalNAcT−endoT−mycを、国際公開第2010/015722号パンフレットおよびMeuris et al.(Nat Biotechnol.2014 32(5):485−9)において記載されるように産生した。これらのプラスミドおよびさらに空のpCAGGSプラスミドは、Hek293S−Flt3細胞株を一過性にトランスフェクトするために使用した。ネガティブコントロールとして、細胞はまた、DNAなしでトランスフェクトした。細胞がトランスフェクションの日に少なくとも85%〜90%コンフルエントとなるように、細胞は、トランスフェクションの2日前に6つのウェルプレート中に1ウェル当たり200.000細胞で接種した。トランスフェクションの6時間前に培地の半分を無血清培地と交換し、トランスフェクションの3時間前にすべての培地(3mL)を2mLの無血清培地と交換した。DNAリポプレックスは、500μL無血清培地中で10μLのリポフェクタミン2000と4μgのプラスミドDNAとを組み合わせ、室温で20分間インキュベートすることによって調製した。インキュベーション後、リポプレックスを細胞に追加し、一晩インキュベートした。翌朝、30%血清を含有する1mLの培地をそれぞれのウェルに追加し、総血清濃度を10%にした。
BSA(ウシ胎仔血清由来)を含有する培地サンプルは、ニッケルイオンを添加したキレートセファロース6Bビーズを使用してクリーンアップした。
サンプル調製後、30μLの各サンプルを10% SDS−PAGEゲル上に添加し、流した。ゲルは、ニトロセルロース膜に半乾燥ブロットし、1/1000に希釈した一次ペンタhis抗体および1/5000に希釈した二次抗マウスIgG1によりhisタグ付きFlt3タンパク質の検出を実行した。
同じ培地サンプルを、(タンパク分解性切断)endoT融合タンパク質の分泌を判断するためにも使用した。β−メルカプトエタノールを有する10μLの3×Laemlliバッファーを20μLのもとのサンプルに追加し、これらを10% SDS−PAGEゲル上で流した。ニトロセルロース膜へのブロッティング後、検出は、1/3000に希釈した抗myc一次抗体および1/5000に希釈した抗マウス二次抗体を使用して実行した。
Hek293S−Flt3は、Man5GlcNAc2 N−グリカンをほぼ排他的に産生する親の細胞株Hek293S−RicRからS.Savvides教授のグループによって生成された。それは、ヒトFlt3受容体のhisタグ付き細胞外ドメインについての安定したトランスフェクタント株であり、このタンパク質は、分泌経路を通過する。
使用するトランスフェクションプロトコールにより、約30〜40%の効率で細胞をトランスフェクトすることが可能になる(FACSによって判断、結果は示さず)。毎日の顕微鏡観察は、endoT融合タンパク質のいずれかまたは空のpCAGGSプラスミドをトランスフェクトした後の有意な細胞死も、ネガティブコントロールウェル(DNAなしでのトランスフェクション)よりも遅い増殖も示さなかった。
サンプル中に大量のウシ血清アルブミン(BSA)(約66kDaまで流れる)が存在し、分泌された非脱グリコシル化Flt3受容体が約70kDaまで流れるという事実のために、Flt3の免疫検出、とりわけ70kDaよりもわずかに小さい分子量のBSAエリアに流れる、このタンパク質の脱グリコシル化形態の検出は、過剰なBSAによる非特異的な(aspecific)染色および実際のFlt3シグナルの遮断によって不明瞭になる。そのため、ニッケル添加キレートセファロースビーズによるクリーンアップステップを使用して、ある程度サンプルからFlt3を精製することは好都合である。Flt3分子がhisタグ付きであるため、このステップは、サンプル中のFlt3分子を選択的に濃縮し、検出が可能になる。
分泌されたFlt3細胞外ドメインは、9つの推定上のN−グリコシル化部位を含有する(Rosnet et al.,1993)。今日に至るまで、これらの部位の7つは、N−グリカンにより修飾されることが確認された(個人的な情報交換、K.Verstraete)。endoT融合タンパク質による少なくともいくつかのグリカンの除去により、ウエスタンブロット上でのバンドシフトが引き起こされることが予想され、これは実際にそうなる(示さず)。トランスフェクションおよび誘発の2日後、pCAGGS−hST−endoTおよびpCAGGS−hST−endoT−mycトランスフェクト細胞によって産生されたFlt3の処理を観察することができる。3日後、もはや完全ではないグリコシル化Flt3をendoTトランスフェクト細胞によって産生されたサンプルのいずれにおいても観察することができる。mycタグ付きendoT融合タンパク質によりトランスフェクトされた細胞から生じるFlt3バンドが、非mycタグ付きendoT融合タンパク質トランスフェクト細胞由来のものと同じ挙動を示すという事実は、両方の場合にc−mycタグが融合タンパク質の機能に深刻に干渉しないという事実を示す。
両方のendoT融合タンパク質構築物は、c−mycタグによりC−末端にもタグを付けた。これにより、endoT融合タンパク質のゴルジ内腔ドメインのタンパク分解性の処理および続く分泌の判断を可能にし、これは、次いでウエスタンブロットによって上清において検出されるはずである。これは、ヒトGM2シンターゼのターゲティングドメインにN−末端で融合されたendoT(pCAGGS−hGalNAcT−endoT−myc)について、実際にそうなる(示さず)。アミノ酸22および23間のカテプシンD様スプライス部位(GL−LYAST)での処理により、約39,1kDa(非グリコシル化mycタグ付き形態)の分泌断片がもたらされるであろう。分泌断片はほぼこの大きさである。クーマシー染色SDS−PAGEゲルは、pCAGGS−hGalNAcT−endoTおよびpCAGGS−hGalNAcT−endoT−mycトランスフェクト細胞由来の上清サンプルを添加したレーンにおいて、小さいが明確に定められたバンドを示し、MWにわずかな差異があるが、これはmyc−タグ(1,2kDa)の存在または非存在に起因するものである(示さず)。
戦略
本発明者らの目標は、ムチン型O−グリコシル化を完全に欠く細胞株を生成することである。GlycoDelete技術とこの細胞株とを組み合わせることは、したがって、O−グリカンおよびN−グリカンの両方の不均一性が著しく低下した「GlycoDoubleDelete」細胞株をもたらすであろう。これらの細胞株は、それらのN−グリカンが正確なフォールディングを媒介するのを必要とするが、完全に成熟したN−グリカンまたはO−グリカンが機能することを必要としない糖タンパク質を産生するのに有用であろう。たとえば、結晶学において、グリカンの不均一性は結晶形成を妨げ得る。加えて、グリカンは、生物製剤の効能、活性、および安定性に影響を及ぼすことが知られているが、グリカンの不均一性はバッチごとに異なり得、医薬タンパク質の特性が同様に異なり得ることを意味する。
GalE遺伝子のエクソン2、3、および4を標的にする3つのガイドを、MIT(CRISPR.MIT.EDU)から入手可能なオンラインツールにより設計した。それらの配列は表1からわかる。これらのガイドによって標的にされるGalE遺伝子の遺伝子座を図2に示す。次いで、ガイドを、Ran et al(Ran,F.A.et al.Genome engineering using the CRISPR−Cas9 system.Nat.Protoc.8,2281−2308(2013))の指示に従ってFeng Zhangの研究所のPX458ベクター中にクローニングした。ガイドのためのクローニング部位とは別に、このベクターは、GFP遺伝子の発現がCas9発現に共役しているCas9−GFP発現カセットも有する。その発現が同じプロモーターから駆動されるため、GFPを発現する細胞は、Cas9タンパク質も発現しなければならない。2つのコード配列は、結果として生じるmRNAにおいてCDSのあるストレッチをリボソームにスキップさせ、同じmRNAから2つの別々のポリペプチド鎖を生成する、ウイルス起源のDNAエレメントである2A配列によって分離される。
遺伝子型スクリーニングの開発およびクローン選択への適用
ガイド1および3の両方がインビボゲノム編集の実現に成功したことを示したため、本発明者らは、ガイド1および3により再度HEK293s細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞を96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり1つの細胞にFACSソートした。34のクローンを増殖させ、安定した単一細胞株由来のコロニーにし、増やした。それぞれのクローンについて、本発明者らは、ゲノムDNA抽出のために2*105細胞を回収し、100μl QuickExtractバッファー中で溶解した。この方法はDNA精製ステップを必要としないため、この方法により、他の細胞溶解物と混合したゲノムDNAの粗製抽出物がもたらされた。多量の混入物は、サンプル中のゲノムDNA濃度を測定するのを困難にする。異なるPCR反応に同様の量のゲノムDNAを追加するために、本発明者らは、毎回、同量のバッファー中に同量の細胞を溶解し、10μlの総PCR容量当たり1μlのその粗ゲノムDNAミックスを使用した。本発明者らは、本発明者らの標準的な高忠実度のポリメラーゼが粗ゲノムDNA抽出物中に存在する副産物から損害を受けることが多く、加えて、これにより標的領域の増幅が不良となるかまたは標的領域が増幅されないことも見出した。そのため、ポリメラーゼとしてKapa HiFiを使用することが不可欠であり、これは、非常に広範に変動するゲノムDNA品質を取り扱うことができると思われた。過去、このPCR産物は、PCR産物を直接シークエンシングすると、DNA純度が低いためにリードの品質が悪くなったため、TOPOベクター中にクローニングされた。しかしながら、磁気ビートによるPCRアンプリコンの精製により、高純度のDNAサンプルがもたらされ、これは、ネステッドプライマーを使用することによる直接的なサンガーシークエンシングを可能にした。これは、中間のクローニングステップの必要を除き、結果的に分析時間を何日も減少させた。サンガーシークエンシングは、21のクローンにおいて編集を明らかにし、13個はなお野生型であった。
O−グリコシル化タンパク質に対するこのKOの効果をチェックするために、本発明者らは、ヒトGM−CSF(hGM−CSF)発現プラスミドにより様々なクローンをトランスフェクトした。hGM−CSFは、4つ以下の様々な構造のO−グリカンおよび2つ以下のN−グリカンを有し得ることが知られる小さいサイトカインである。その不均一のO−グリコシル化は、SDS−PAGEゲル上でスミアを引き起こす。これは、図6、GDレーンおよびHEK293sレーンにおいて示される。本発明者らのクローンにおいて産生されたhGM−CSFサンプルにおいてそのような広範囲なスミアが存在しないことは、ムチン型O−グリコシル化が欠けていることを示すと思われる。実際に、ウエスタンブロットによる分析は、3つのN−グリコフォームに相当する3本の別々のバンドのみを区別することができ、明らかなスミアがないことを示す。低分子量から高分子量にかけて、バンドは、N−グリカンで装飾されていないhGM−CSF、1つのN−グリカンで装飾されたhGM−CSF、および2つのN−グリカンで装飾されたhGM−CSFに相当する。N−グリカンは、UDP−GalおよびUDP−GalNAcの欠如により、さらなる成熟も妨げられるため、3つの残りのグリコフォームは、図6において示されるようにSDS−PAGEゲル上で別々のバンドに分離する。結果的に、本発明者らは、選択したクローンのいずれも機能的なGalE酵素をなお発現するものはないと結論付ける。
HEK293sGlycoDoubleDelete細胞株を生成するために、HEK293sGlycoDelete細胞に、HEK293sGalE−/−細胞の生成と同じCRISPR/Cas9構築物をトランスフェクトした。単一の細胞をトランスフェクションの72時間後にソートした。18のクローンから始めて増殖させ、24ウェルプレートまで増やした。本発明者らはhGM−CSF発現プラスミドによりそれらをトランスフェクトし、上記に記載される方法と同じ方法においてウエスタンブロットでグリコプロファイルについてチェックした。図からわかるように、それらのクローンのほとんどで発現されたhGM−CSFは、分子量が激しく低下したことを示し、機能喪失型のGalE突然変異を示した。本発明者らは、GalE機能性およびendoT処理におけるクローンの差異に依存して3つの異なる型のhGM−CSF処理を区別することができた。最初の型(図7においてNで標識)において、O−グリコシル化によるスミアはなお明らかであり、結果的に、細胞はなお少なくとも1つの機能的なGalE遺伝子コピーを有した。第2のhGM−CSFサンプル型(図7においてBと標識)は、GalEノックアウトに成功したが、endoT活性が低下したまたはそれを欠く(ただし、endoTは親細胞において活性であった)細胞に起源を有する。結果的に、これらの細胞は、著しく低い分子量のhGM−CSFを産生するが、1つおよび2つのN−グリコシル化部位を有するN−グリコフォームはなお検出可能である。最後に、図7においてAと標識される、残存しているグリカン不均一性がほぼ観察されない第3の型のhGM−CSF処理が本発明者らにより観察される。本発明者らは、さらに、これらの細胞をHEK293sGlycoDoubleDeleteと呼ぶ。
両方の新たな細胞株をさらに特徴付けるために、選択したHEK293sGalE−/−およびHEK293sGlycoDoubleDeleteクローン細胞株において産生されたhGM−CSFを精製した。これらのhGM−CSFサンプルのトリプシンペプチドは、GalE KOがO−グリコシル化の停止をもたらすことを確認するために、MALDI−TOF質量分析計で分析した。
HEK293sGlycoDelete細胞は、N−グリコシル化における不均一性に対処する。しかしながら、タンパク質グリコシル化は、主として2つの型になる:O結合型およびN結合型炭水化物。完全に均質の糖タンパク質を産生することを目的とする場合、O−グリコシル化は、GlycoDelete産生タンパク質において残る不均一性の最も重要な原因である。UDP−GlcNAcをUDP−GalNAcにエピマー化するGalE遺伝子をノックアウトすることにより、本発明者らは、HEK293s細胞からUDP−GalNAcを取り除き、結果的にタンパク質上でのあらゆるムチン型O−グリコシル化を妨げた。ガラクトースまたはGalNAc装飾残基が検出されなかったため、代替のサルベージ経路は活性でないと思われ、または必要な前駆物質を集めることができなかった。hGM−CSF発現中に使用される培地(FreeStyle 293発現培地)中のガラクトースおよびGalNAc濃度は明らかではなく、したがって、本発明者らは、サルベージされたクレオチド糖がないことを、培地中にそれらが存在していないか、または細胞においてサルベージ経路が不活性であるかもしくは破壊されていることによるものとすることはできない。HEK293sGlycoDelete細胞とGalE KO戦略とを組み合わせることにより、本発明者らは、HEK293sGlycoDoubleDelete細胞を生成した。これらの細胞は、不可欠で複雑なPTMを有するが、これらのPTMによって引き起こされる固有の不均一性がないタンパク質を発現することができる。HEK293sGalE−/−およびHEK293sGlycoDoubleDelete細胞の両方において予測されるグリコフォームは、質量分析法によって確認することができた。
前に述べた発見について明らかに示すために、His6タグ付きヒトEPOを接着性HEK293s、HEK293sGlycoDelete、HEK293sGale−/−、およびHEK293sGlycoDoubleDelete細胞において安定して発現させた。
概念実証として、FcテイルとヒトTNF受容体2との間の融合物からなり、複数のO−グリコシル化およびN−グリコシル化部位を含有するエタネルセプト(エンブレル)をHEK293s、HEK293sGlycoDelete、HEK293sGale−/−、およびHEK293sGlycoDoubleDelete細胞において発現させた。すべての細胞株をDMEM/F12培地+10% FCS中で6ウェルプレートに接種した。接種の24時間後に培地を吸引し、3ml無血清FreeStyle 293培地と交換し、細胞を偽トランスフェクトしたまたはエタネルセプト(エンブレル)をコードする発現ベクターによりトランスフェクトした(FuGENE HD;メーカーの指示に従った)。上清をトランスフェクションの5日後に収集した。上清サンプルは、SDS−PAGEおよびウエスタンブロット分析を介して分析し(図17)、エタネルセプトがHEK293s(レーン1)、HEK293sGalE−/−(レーン2)、HEK293sGlycoDelete(レーン3)、およびHEK293sGlycoDoubleDelete(レーン4)細胞において安定して発現したことが示された。分子量の明らかなシフトを観察することができ、これは、HEK293sGlycoDelete細胞およびHEK293sGlycoDoubleDelete細胞におけるN−グリカンの低下、ならびにHEK293sGalE−/−およびHEK293sGlycoDoubleDelete細胞においてO−グリカンがないことに対応する。
別の例として、RSV−Gを様々な細胞株において発現させた。詳細には、HEK239s、HEK239sGalE−/−、HEK239sGlycoDelete、およびHEK239GlycoDoubleDelete細胞をDMEM/F12培地+10% FCS中で6ウェルプレートに接種した。接種の24時間後に培地を吸引し、3ml無血清FreeStyle 293培地と交換し、細胞を偽トランスフェクトしたまたはRSV−Gをコードする発現ベクターによりトランスフェクトした(FuGENE HD;メーカーの指示に従った)。上清をトランスフェクションの3日後に収集した。
ガイド構築およびクローニング
GalE遺伝子をUCSC human genome browser(build nr.GRCh37/hg19)からダウンロードし、http://CRISPR.MIT.EDUで入手可能なツールを使用してガイドについてスクリーニングした。本発明者らは、ウェブサイトのアルゴリズムに従って最適なオフターゲットスコアを有する3つのガイドを選択した。ガイドをコードするオリゴおよびそのリバース相補体(complement)は、本発明者らのクローニング戦略、5’リン酸化と適合性の、IDTに発注したエンドを用いて伸長させた。最終的なガイド配列の配列を表5に表す。次に、3つのガイドを、Ran et al10において記載されるようにPX458ベクター(Addgeneを通して入手可能)中にクローニングした。手短かに言えば、オリゴは、それぞれのオリゴの100μM希釈液の1μlを8μlデュプレキシング(duplexing)バッファー(100mM酢酸カリウム、30mM HEPES、pH7.5)に追加することによってアニールした。このミックスを98℃まで加熱し、5℃/分で25℃まで少しずつ冷却した。アニールしたオリゴの1/200希釈液の2μlを100ngのPC458ベクター、2μl Tangoバッファー(Fermentas、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA)、1μlのDTT(10mM)、1μlのATP(10mM)、1μl BbSI FastDigest制限酵素(Fermentas)、1μl T7リガーゼ(Fermentas)、およびmilliQに追加し、20μlの総容積にした。このミックスを37℃で5分〜25℃で5分を6回繰り返すことにより、制限およびライゲ−ションをインキュベートした。次に、2μlの産物を化学的にコンピテントなMC1061大腸菌(E.coli)細胞に形質転換した。細胞は、PX485ベクターを含有する細胞を選択するためにカルベニシリン抗生物質を含有するLB培地において一晩37℃で増殖させた。
すべてのHEK細胞株からのゲノムDNA(gDNA)の単離のために、2*105細胞を、メーカーの指示に従って100μlのQuickExtract DNA Extraction Solution(Epicentre、Madison、WI、USA)中に溶解した。QuickExtractゲノムDNA抽出は、DNA精製ステップを含まない。そのため、抽出物は、多量の残存している細胞溶解産物を含有し、サンプル中のゲノムDNA濃度を測定するのを困難にする。そのため、本発明者らは、常に、等量のQuickExtract DNA抽出溶液において、ゲノムDNAを調製するための等量の細胞から始め、この部において記載されるgDNAに対するすべてのPCRについて、本発明者らは、10μlの全PCR容量当たり1μlのこの溶解物を使用した。
標的(GalE遺伝子)の関心領域は、GoTaq Green(Promega、Madison、WI、USA)、表6に表すGalEフォワードおよびリバースプライマー、ならびにQuickExtractにより単離したgDNA鋳型を使用して、55℃のアニーリング温度および2分間の伸長時間で増幅させた。アンプリコンは、メーカーの指示に従って磁気ビーズ(PCR Clean Up、CleanNA、Alphen aan den Rijn、Netherlands)を使用して精製した。
HEK293sおよびHEK293sGlycoDelete細胞は、10%ウシ胎仔血清(FCS)を補足したDMEM/F12(Life Technologies、Paisley、UK)において、37℃および5% CO2で加湿インキュベーター中において維持した。
hGM−CSFは、以前に記載されるように1、質量スペクトル分析のために産生、精製および調製した。手短かに言えば、細胞をhGM−CSF発現プラスミドによりトランスフェクトした。トランスフェクション後の1日目に培地をFreestyle 293 Expression培地(Life technologies、Paisley、UK)に交換し、上清をトランスフェクションの5日後に回収した。培地は、Aekta Pure(GE healthcare UK Ltd、Buckinghamshire、UK)のNi2+イオン(GE healthcare UK Ltd、Buckinghamshire、UK)を添加したHis−Trap HPカラムに直接添加し、その後、superdex 75 size exclusion column(GE healthcare UK Ltd、Buckinghamshire、UK)でポリッシングステップを続け、バッファーをPBSに変えた。精製後のタンパク質濃度は、Pierce BCA Protein Assay Kit(Life technologies、Paisley、UK)によって決定した。
MALDI−TOF分析のために、2,5ugのhGM−CSFサンプルをSDS−PAGEゲル上で分離し、20〜70kDaの領域をゲルから切り取り、ゲル内トリプシン消化を実行した。ペプチド抽出およびクリーンアップは、C18 ZipTips(Merck Millipore、Billerica、MA、USA)を使用して実行し、5ulの総容積でサンプルを溶出した。次に、2ulのそれぞれのペプチドミックスをCHCA(α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸)マトリックスにおいてMALDI標的プレート上にスポットした。MALDI−TOF分析は、最適な分解のためにリフレクトロンを作動させ、陽イオンモードで実行した。
PBS中の5μgのhGM−CSFを別々のチューブに等分した。酵素なしでまたは500ユニットPNGaseF(手製)を追加して、サンプルを37℃で24時間インキュベートした。消化後、0,1% TFAを追加し、サンプルを、メーカーの指示に従ってC4 ZipTips(Merck Millipore、Billerica、MA、USA)を使用して脱塩した。最終的な溶出は、3μlの50%アセトニトリル、49,5% milliQ、および0,5% TFA中で行い、これをMALDIプレート上に直接スポットした。1μlの10mg/mlアルファ−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸マトリックスをそれぞれのスポットに追加した。サンプルは、リニアモードでApplied Biosystems 4800プロテオミクス分析機器で分析した。
6ウェルプレートにおいて、1*106細胞は、Fugene HD(Promega、Madison、WI、USA)トランスフェクション試薬を使用することにより、ガイドを含有する8,8μgのPX458ベクターによりトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、本発明者らは、トランスフェクト細胞からGFP発現クローンをFACsソートした。本発明者らは、ソートした細胞をプールし、それらをおよそ1*10^6細胞まで増やした。細胞は、培地を上下にピペッティングすることによって回収した。ゲノムDNAは、メーカーの指示に従ってQuickExtractキット(Epicentre、Madison、WI、USA)により調製した。
単一細胞由来のクローンを24ウェルプレートにおいて増やし、これからゲノムDNAを、前に詳述されるようにQuickExtractを使用して調製した。関心領域をKapa HiFiポリメラーゼおよび表9に表すプライマーによってPCR増幅した。
Illuminaシークエンシングは、特異的なアダプターを使用する。しかしながら、これらのアダプターは非常に長く、したがって、本発明者らは、最初により小さい中間アダプターを用いて関心領域を増幅し、次いで、本発明者らは、Illuminaシークエンシングアダプターを用いて第2の反応においてこれを伸長させた。したがって、最初に、CRISPR/Cas9ガイドによって標的にされる領域をQuickExtractにより単離したgDNAから増幅し、同時に、最初のPCR反応において中間アダプター(表10の最初の4つのプライマーの太字)を用いて伸長させた。この反応において、Kapa HiFiポリメラーゼをメーカーの指示に従って使用し、アニーリング温度はそれぞれガイド3およびガイド1のプライマーについて70℃および72℃とし、伸長時間は30秒間とした。アンプリコンは、磁気ビーズ(CleanNA、Alphen aan den Rijn、Netherlands)を使用して精製した。100ngの精製増幅産物(amplificate)を、一方にP5アダプターおよびIlluminaシークエンシングフォワードアダプターを、他方にP7アダプター、Illuminaシークエンシングリバースアダプター、およびTruseqバーコード付着させるために再度増幅させた(表10)。異なるTruseqバーコード(表10、「P7 Truseq13〜28」と命名したプライマー)をすべてのクローンに提供することにより、本発明者らは、シークエンシングの実行後、いずれの配列がいずれのクローンに属したかを追跡することができた。再度、Kapa HiFiポリメラーゼをメーカーの指示に従って使用し、アニーリング温度は70℃および伸長時間は30秒間とした。しかしながら、増幅バイアスを回避するために15サイクルのみを実行した。サンプルは、磁気ビーズ(CleanNA、Alphen aan den Rijn、Netherlands)を使用して精製し、濃度はnanodropで測定した。本発明者らは、等モル量でサンプルをプールし、10nMまで混合物を希釈した。このサンプルは、1%の総DNA濃度で他のサンプルと共にプールした。このミックスは、次いで、シングルエンドシークエンシングを使用してIllumina NextSeqで分析した。
タンパク質サンプルは、前に記載されるように、12% Tricin SDS−PAGEゲル上で分離し、調製した(DeAngelis,M.M.,Wang,D.G.&Hawkins,T.L.Solid−phase reversible immobilization for the isolation of PCR products.Nucleic Acids Res.23,4742−4743(1995))。サンプルは、メーカーの指示に従ってTE70X半乾燥転写ユニット(Hoefer、Holliston、MA、USA)を使用してニトロセルロース膜(Schleicher&Schuell、 Munchen、Germany)に転写した。次に、ブロットは、1時間、0,05%(wt/vol)Tween20および3%(wt/vol)粉乳を含有するPBSによりブロックした。hGM−CSFを視覚化するために、DyLight 800共役6×Hisタグ抗体(カタログ番号200−345−382、Rockland、Limerick、PA、USA)を1/15000希釈液中で追加し、1時間インキュベートした。PBS+0,05% tween20による3回の洗浄ステップ後、ブロットは、odysseyスキャナを使用して視覚化した(LI−COR biosciences、Lincoln、NE、USA)。
Claims (8)
- ゴルジ移行シグナルに作動可能に連結されているエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする外因性核酸配列を含み、かつ内因性UDP−ガラクトース4−エピメラーゼ(GalE)の発現および/または活性が欠損した真核細胞。
- 糖タンパク質をコードする第2の外因性核酸配列をさらに含む、請求項1に記載の真核細胞。
- 内因性エンドグルコサミニダーゼ酵素を発現しない、請求項1または2に記載の真核細胞。
- 哺乳動物細胞、特にHek293細胞またはCHO細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の真核細胞。
- 前記エンドグルコサミニダーゼは、マンノシル−糖タンパク質エンド−ベータ−N−アセチルグルコサミニダーゼ(E.C.3.2.1.96)、特にEndo Tである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の真核細胞。
- 前記糖タンパク質は、前記細胞によって分泌される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の真核細胞。
- 真核細胞においてO−グリコシル化をさらに欠く単一GlcNAc修飾タンパク質を産生するための方法であって、
− ゴルジ移行シグナルに作動可能に連結されているエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第1の外因性核酸配列を含み、内因性UDP−ガラクトース4−エピメラーゼ(GalE)の発現および/または活性が欠損し、かつ糖タンパク質をコードする第2の外因性核酸配列を含む真核細胞を、前記エンドグルコサミニダーゼ酵素および前記糖タンパク質を発現するのに適した条件で提供するステップと、
− 前記糖タンパク質が前記エンドグルコサミニダーゼと細胞内で接触された後、前記糖タンパク質を回収するステップと
を含む方法。 - 前記糖タンパク質が前記エンドグルコサミニダーゼによって細胞内で処理された後、前記糖タンパク質をグリコシルトランスフェラーゼによって処理させるステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
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