EA032192B1 - Биспецифическое антитело к vegf/ang-2, нуклеиновая кислота, кодирующая это антитело, вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин, способ получения биспецифического антитела и содержащая его фармацевтическая композиция - Google Patents

Abstract

В изобретении описано биспецифическое антитело к человеческому сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF/VEGF-A) и к человеческому ангиопоэтину-2 (ANG-2) человеческого подкласса IgG1 с мутациями I253A, H310A и H435A, нуклеиновая кислота, кодирующая это антитело, экспрессионный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин - продуцент биспецифического антитела, способ его получения, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело которая предназначена для лечения сосудистых заболеваний глаз.

Description

Изобретение относится к биспецифическому антителу к человеческому сосудистому эндотелиальному фактору роста (УЕСР/УЕСР-А) и к человеческому ангиопоэтину-2 (ΆΝ6-2), способу его получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела.

Предпосылки создания изобретения

Ангиогенез участвует в патогенезе различных нарушений, включая солидные опухоли, внутриглазные неоваскулярные синдромы, такие как пролиферативные ретинопатии или возрастная дегенерация желтого пятна (ЛМИ), ревматоидный артрит и псориаз (Ро1ктап и др., 1. ΒίοΙ. Сйет. 267, 1992, с. 1093110934; К1адзЬгип М. и др., Аппи. Кеу. Рйузю1. 53, 1991, с. 217-239 и Сагпег А., Уа8еи1ат Фзеазез, в: Ра11юЬю1оду о£ оси1аг Фзеазе, А. бупапйс арргоасй, под ред. Сагпег А. и Ι<1ίπΐ\\ΌΓΐ1ι С. К., 2-ое изд., изд-во Магсе1 Иеккет, Уотк, 1994, с. 1625-1710).

Ранибизумаб (товарный знак Ьисепйз®) представляет собой фрагмент моноклонального антитела, выведенный из того же самого родительского мышиного антитела, что и бевацизумаб (авастин). Однако его подвергали процедуре созревания аффинности для достижения более сильного связывания с УЕСР-А (\νϋ 98/45331). Известно, что блокада УЕСР-А может быть связана с некоторыми симптомами системной токсичности, по этой причине ранибизумаб лишен Рс-области для уменьшения времени полужизни в сыворотке и, следовательно, системной токсичности. Он представляет собой антиангиогенный агент, который разрешен для лечения возрастной дегенерации желтого пятна влажного типа (АКМИ), обычной формы связанной с возрастом потери зрения.

Анализы ангиогенеза в роговице продемонстрировали, что АNС-1 и АNС-2 оказывают сходные воздействия, обладая синергетической активностью при совместном действии с УЕСР, в отношении ускорения роста новых кровеносных сосудов (Азайата Т. и др., Сйс. Кез. 83, 1998, с. 233-240). Возможность того, имел место зависящий от дозы эндотелиальный ответ, вытекала из данных о том, что ш νίΙΐΌ АNС-2 в высокой концентрации может также обладать проангиогенным действием (К1т I. и др., Опсодепе 19, 2000, с. 4549-52). В высокой концентрации АNС-2 действует в качестве фактора выживания при апоптозе эндотелиальных клеток в процессе истощения в сыворотке факторов апоптоза в результате активации Т1е2 посредством пути Р1-3-киназы и Лк1 (К1т I. и др., Опсодепе 19, 2000, с. 4549-4552).

В νθ 2010/040508 А9 и νθ 2011/117329 описаны биспецифические антитела к УЕСР/АNС-2. В νθ 2008/132568 описаны слитые белки, связывающиеся с факторами роста. В νθ 2009/136352 описаны антиангиогенные соединения. В νθ 2009/080253 и νθ 2011/117330 описаны биспецифические двухвалентные форматы антител. В νθ 2010/069532 описаны антитела к Апд2.

Сосудистые глазные заболевания, такие как возрастная дегенерация желтого пятна (АРМИ) и диабетическая ретинопатия (ИК), являются результатом аномальной хороидальной или ретинальной неоваскуляризации соответственно. Они являются основными причинами потери зрения у жителей промышленно развитых стран. Поскольку сетчатка состоит из хорошо оформленных слоев нейронных, глиальных и сосудистых элементов, относительно небольшие нарушения, такие, которые имеют место при пролиферации сосудов или отеке, могут приводить к значительному снижению зрительной функции. Наследственные дегенерации сетчатки, такие как пигментный ретинит (КР), ассоциированы также с сосудистыми нарушениями, такими как сужение артериол и сосудистая атрофия. Они поражают 1 из 3500 индивидуумов и характеризуются прогрессирующей ночной слепотой, уменьшением поля зрения, атрофией зрительного нерва, ослаблением артериол и снижением центрального зрения, часто прогрессирующим вплоть до полной слепоты.

Ишемические ретинопатии характеризуются снижением или дисфункцией сосудистой сети сетчатки, что приводит к снижению потока крови и гипоксии. Сетчатка реагирует на гипоксию генерированием сигналов роста новых кровеносных сосудов, однако эти новые сосуды, как правило, являются ломкими и неупорядоченными. Так, рост этих аномальных новых сосудов может создавать угрозу зрению, поскольку они могут истекать, кровоточить или приводить к рубцеванию, что, в конце концов, может заканчиваться отслоением сетчатки. Современные пути лечения ишемических ретинопатией направлены на остановку роста патологических сосудов, но они не воздействуют на лежащую в их основе ишемию, которая запускает их рост. Кроме того, стандартное лечение диабетической ретинопатии, ишемической ретинопатии, которая поражает миллионы людей, включает разрушение части сетчатки лазером с целью прекращения роста новых сосудов и сохранения центрального зрения. Известно применение стратегий для блокады функции сосудистого эндотелиального фактора роста (УЕСР), основного активатора роста сосудов. Кратковременная анти-УЕСР терапия может улучшать зрение, но она не направлена на лежащую в основе заболевания ишемию и фактически может обострять это состояние, поскольку ингибирует роста всех сосудов, включая оказывающие благоприятное действие коллатерали. Существует также серьезная проблема, связанная с системной экспозицией этих лекарственных средств в организме престарелых и/или страдающих диабетом пациентов, для которых может требоваться рост новых сосудов при ишемии головного мозга, сердца или конечностей.

Как правило, при глазных болезнях часто применяют введение в стекловидное тело более мелких фрагментов антител типа РаЬ ог РаЬ(2), поскольку они имеют короткое время полужизни в сыворотке и низкий риск системной токсичности. Однако указанные более мелкие фрагменты, как правило, обладают также и более коротким временем полужизни в стекловидном теле (например, из-за более быстрой диф

- 1 032192 фузии в сыворотку) и, как правило, их необходимо чаще дозировать.

У К1т и др., Мо1еси1аг Υίδίοη. 15, 2009, с. 2803-2812 описаны полноразмерные антитела, которые вводят вводимые внутрь стекловидного тела (интравитреально) в глаз, для которых установлено, что Ι§0, связывающиеся с ЕсКп, элиминировались в кровь у мышей дикого типа, в то время как 1дУ, не связывающиеся с ЕсКп, не элиминировались в кровеносную систему. Кроме того, Ι§0, связывающиеся с ЕсКп, не элиминировались в кровеносную систему у мышей с выключенным ЕсКп.

Таким образом, в данной области существует необходимость в создании улучшенных средств для лечения и предупреждения различных сосудистых глазных заболеваний, таких как ишемические ретинопатии.

Краткое изложение сущности изобретения

Одним из объектов изобретения является биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим УЕОЕ, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим ΆΝΟ-2, в котором

I) указанный первый антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с УЕОЕ, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи СОК3Н-участок, имеющий 8ЕО ΙΌ N0: 1, СОК2Н-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 2, и СОК1Н-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 3, и в вариабельном домене легкой цепи СПК3Ь-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 4, СПК2Ь-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 5, и СЭЕ1 Ь-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 6; и

II) указанный второй антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с ΑNС-2. содержит в вариабельном домене тяжелой цепи СОК3Н-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 9, СОК2Н-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 10, и СОК1Н-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 11, и в вариабельном домене легкой цепи СОКЗЬ-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 12, СПК2Ь-участок, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 13, и СПК1Ьучасток, имеющий 8Е0 ΙΌ N0: 14, причем указанное биспецифическое антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого подкласса 1дС1 (происходящую из человеческого антитела) и содержащую мутации Ι253Α, Н310А и Н435А (нумерация согласно ЕИ-индексу Кэбота).

В предпочтительном варианте указанный первый антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с УЕОЕ, этого антитела содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи УН аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7 и в качестве вариабельного домена легкой цепи УЪ аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8, а указанный второй антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с ΑNС-2. содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи УН аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 15 и в качестве вариабельного домена легкой цепи УЪ аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 16.

При этом константная область тяжелой цепи ^ОПподкласса указанного биспецифического антитела в более предпочтительном варианте содержит также мутации Ь234А, Ь235А и Р329О (нумерация согласно ЕИ-индексу Кэбота).

Кроме того, биспецифическое антитело, включающее первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывает человеческий УЕОЕ, и второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывает человеческий ΑNС-2. в наиболее предпочтительном варианте включает аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 25, 8Е0 ΙΌ N0: 26, 8Е0 ΙΌ N0: 27 и 8Е0 ΙΌ N0: 28, или же аминокислотные последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 21, 8Е0 ΙΌ N0: 22, 8Е0 ΙΌ N0: 23 и 8Е0 ΙΌ N0: 24.

Вторым объектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в лечении сосудистых заболеваний глаз.

В предпочтительном варианте эта фармацевтическая композиция предназначена для интравитреального введения.

Третьим объектом данного изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая указанное биспецифическое антитело.

Четвертым объектом является экспрессионный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, который обладает способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, а пятым объектом - прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор.

И наконец, последними объектами служит способ получения биспецифического антитела, включающий стадии, на которых

а) трансформируют клетку-хозяина векторами, содержащими молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют указанное антитело;

б) культивируют клетку-хозяина в условиях, обеспечивающих синтез указанной молекулы антитела; и

в) выделяют указанную молекулу антитела из указанной культуры, а также биспецифическое антитело, полученное с помощью данного способа.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схема, иллюстрирующая концепцию и преимущества антител к УЕСΕ-ΑNС-2 (<УЕОЕ

- 2 032192

ΆΝΟ-2>) 1дС1- или 1дС4-типа с мутациями ААА (мутации Ι253Α, Н310А и Н435А - нумерация согласно Ευ-индексу Кэбота);

на фиг. 2 - результаты измерений вязкости в лабораторных условиях на основе ЭБ8 (динамическое рассеяние света). Представлены данные о полученной путем экстраполяции вязкости при 150 мг/мл в 200мМ аргинине/сукцинате, рН 5,5 (сравнение антител <νΕΟΕ-ΑΝΟ-2>, предлагаемых в изобретении, УЕСЕаид2-0016 (с ААА-мутациями) с референс-антителом νΕΟΕαη§2-0015 (без ААА-мутаций));

на фиг. 3 - полученные с помощью ЭБ8 данные об агрегации в зависимости от температуры (включающие полученные с помощью ЭБ8 данные о температуре начала агрегации) в 20мМ НЬ. 140мМ №С1. рН 6,05 (сравнение антител <VΕСΕ-ΑNС-2>, предлагаемых в изобретении, νΕΟΕαη§2-0016 (с АААмутациями) с референс-антителом νΕ0Εαη§2-0015 (без ААА-мутаций);

на фиг. 4 - данные о хранении в течение 7 дней при 40°С в концентрации 100 мг/мл (снижение основного пика и повышение пика, соответствующего высокомолекулярным (НМА) видам (сравнение антител <VΕСΕ-ΑNС-2>, предлагаемых в изобретении, νΕΟΕαη§2-0016 (с ААА-мутациями), для которых характерна более низкая агрегация, с референс-антителом \Е6Еапд2-0015 (без ААА-мутаций);

на фиг. 5А - данные об аффинности к ЕсКп в стабильном состоянии νΕΟΕαη§2-0015 (без АААмутаций): наложение В1асоге-сенсограмм, полученных при различных концентрациях, демонстрирует зависящее от концентрации связывание УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутаций) с ЕсКп;

на фиг. 5Б - данные об аффинности к ЕсКп в стабильном состоянии антитела, представленного на фиг. 5А: УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутаций): кривая зависимости связывания от концентрации 'УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутаций), описывающая связывание с ЕсКп;

на фиг. 5В - данные о аффинности к ЕсКп в стабильном состоянии 'УЕСЕапд2-0016 (с АААмутациями): наложение В1асоге-сенсограмм, полученных при различных концентрациях, демонстрирует отсутствие связывание с ЕсКп при всех концентрациях;

на фиг. 5Г - данные о аффинности к ЕсКп в стабильном состоянии УЕСЕапд2-0016 (с АААмутациями): кривая зависимости связывания от концентрации УЕСЕапд2-0016 (с ААА-тациями, демонстрирует отсутствие связывания с ЕсКп;

на фиг. 5Д - данные о аффинности к ЕсКп в стабильном состоянии УЕСЕапд2-0016 (с АААмутациями): кривая зависимости связывания от концентрации УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутациями), демонстрирует отсутствие связывания с ЕсКп (диапазон ответа от -0,6 до 0,2 Ки/диапазоны концентраций от 0 до 0,35М);

на фиг. 6 - результаты количественной оцени взаимодействия Ес гамма К111а с VΕСΕаηд2-0015 без ААА-мутаций и УЕСЕапд2-0016 с ААА-мутациями (оба в виде антител 1дС1-подкласса с мутациями Р329С БАБА; в качестве контроля применяли антитело к Όί§ 1дС1-покласса и антитело, основой которого являлся 1дС4);

на фиг. 7А - схема, иллюстрирующая принцип применяемого для изучения ФК ЕЫ8А-анализа, предназначенного для определения концентраций биспецифических антител <УЕСЕ/Апд2> в сыворотке и лизатах всего глаза;

на фиг. 7Б - концентрация в сыворотке после внутривенного введения: сравнение соединений νΕΟЕапд2-0015 без ААА-мутаций и УЕСЕапд2-0016 с ААА-мутациями;

на фиг. 7В - концентрация в сыворотке после интравитреального введения: сравнение соединений УЕСЕапд2-0015 с ААА-мутациями и VΕСΕаηд2-0016 без ААА-мутаций;

на фиг. 7Г - концентрация в глазных лизатах УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутациями) в правом и левом глазу (после интравитреального введения только в правый глаз в сравнении с внутривенным введением): после интравитреального введения значительные концентрации удалось обнаружить только в правом глазу. После внутривенного введения в лизатах глаз не удалось обнаружить никаких концентраций из-за небольшого времени полужизни в сыворотке УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутацией);

на фиг. 7Д -концентрация глазных в лизатах УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутации) правого и левого глаза (после интравитреального введения только в правый глаз в сравнении с внутривенным введением): в правом глазу (и в некоторой степени в левом глазу) после интравитреального введения удалось обнаружить концентрации ^ВОЕнп^^^. Это свидетельствует о диффузии из правого глаза в сыворотку и из нее в левый глаз, что можно объяснить длительным временем полужизни VΕСΕаηд2-0015 (без АААмутации). После внутривенного введения удалось также обнаружить значительные концентрации в лизатах обоих глаз в результате диффузии в глаза сохраняющего стабильность в сыворотке УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутации).

Подробное описание изобретения

Итак, биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, является двухвалентным.

Указанное биспецифическое двухвалентное антитело отличается тем, что содержит:

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого полноразмерного антитела, которое специфически связывается с УЕСЕ;

б) модифицированную тяжелую цепь и модифицированную легкую цепь второго полноразмерного антитела, которое специфически связывается с ΑNС-2, в котором константные домены СЬ и СН1 заменены друг на друга.

- 3 032192

Такой формат биспецифического двухвалентного антитела в качестве биспецифического антитела, специфически связывающегося с человеческим сосудистым эндотелиальным фактором роста (УЕСТ) и человеческим ангиопоэтином-2 (ΆΝΟ-2), описан в νΟ 2009/080253 (включая модифицированные с помощью технологии кпоЬ5-1Шо-1ю1с5 (обеспечение взаимодействия по типу выступы-во впадины) СН3-домены). Антитела, основой которых является указанный формат биспецифического двухвалентного антитела, обозначают как СтоккМаЬ.

Биспецифическое двухвалентное антитело может содержать:

а) в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО Ш ΝΟ: 25 и в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО Ш ΝΟ: 27, и

б) в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ: 26 и в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ: 28.

Биспецифическое двухвалентное антитело может также содержать:

а) в качестве тяжелой цепи первого полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ: 21 и в качестве легкой цепи первого полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ: 23, и

б) в качестве модифицированной тяжелой цепи второго полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ: 22 и в качестве модифицированной легкой цепи второго полноразмерного антитела аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ΝΟ: 24.

Итак, биспецифическое двухвалентное антитело может содержать первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим УЕСТ, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим ΑΝΟ-2, и характеризоваться аминокислотными последовательностями ЗЕО ГО ΝΟ: 25, ЗЕО ГО ΝΟ: 26, ЗЕО ГО ΝΟ: 27 и ЗЕО ГО ΝΟ: 28 или же с аминокислотными последовательностями ЗЕО ГО ΝΟ: 21, ЗЕО ГО ΝΟ: 22, ЗЕО ГО ΝΟ: 23 и ЗЕО ГО ΝΟ: 24.

Биспецифическое антитело, может содержать:

а) тяжелую цепь и легкую цепь первого полноразмерного антитела, которое специфически связывается с УЕСТ;

б) тяжелую цепь и легкую цепь второго полноразмерного антитела, которое специфически связывается с ΑΝΟ-2, в котором Ν-конец тяжелой цепи соединен с С-концом легкой цепи через пептидный линкер.

Указанный формат биспецифического двухвалентного антитела в качестве биспецифического антитела, специфически связывающегося с человеческим сосудистым эндотелиальным фактором роста (УЕСТ) и человеческим ангиопоэтином-2 (ΑΝΟ-2). описан в νΟ 2011/117330, включая модифицированные с помощью технологии кпоЬ5-т1о-1ю1с5 СН3-домены. Антитела, основой которых является указанный формат биспецифического двухвалентного антитела, обозначают как БАб^^аЬ.

Вариабельный домен тяжелой цепи антитела (УН) и вариабельный домен легкой цепи антитела (УЪ) тяжелой и легкой цепи второго полноразмерного антитела можно стабилизировать дисульфидом путем интродукции дисульфидной связи между следующими положениями: положение 44 в вариабельном домене тяжелой цепи и положение 100 в вариабельном домене легкой цепи (нумерация во всех случаях согласно ЕИ-индексу Кэбота (КаЬа! Е.А. и др., Зсс.|испсс5 о£ Рто1ет8 о£ 1ттипо1ощса1 1п1еге81, 5-ое изд., РиЬйс Неа11й ЗеМсе, №Июпа1 1п81йи1е8 о£ Неа11й, ВеЛекба, МБ, 1991). Указанной дополнительной стабилизации дисульфидом достигают путем интродукции дисульфидной связи между вариабельными доменами УН и УЪ тяжелой и легкой цепи второго полноразмерного антитела. Методики интродукции не встречающихся в естественных условиях дисульфидных мостиков для стабилизации описаны, например, в νΟ 94/029350, у Ра)адора1 У. и др., Рто1. Епдш. 10, 1997, с. 1453-1459; КоЬауакЫ и др., №.1с1еаг Мебюше & Вю1оду 25, 1998, с. 387-393 или Зс1ишб1 М. и др., Бпсодепе 18, 1999, с. 1711-1721.

СН3-домены биспецифического двухвалентного антитела можно изменять с помощью технологии кпоЬ-ш1о-йо1е8, которая описана подробно с помощью нескольких примеров, например, в νΟ 96/027011, у Ктбд^ау 1.В. и др., Рто1ет Епд 9, 1996, с. 617-621 и Метсйап! А.М. и др., №11 Вю1ес1шо1 16, 1998, с. 677-681. При осуществлении этого метода поверхности взаимодействия двух СН3-доменов изменяют с целью повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, содержащих два указанных СН3домена. Каждый из двух СН3-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой выступ, а другой представлять собой впадину. Интродукция дисульфидного мостика стабилизирует гетеродимеры (Метсйап! А.М. и др., №Щ.1ге Вю1ес11 16, 1998, с. 677-681; А1\се11 З. и др., 1. Мо1. Вю1. 270, 1997, с. 26-35) и повышает выход.

Биспецифические антитела могут содержать СН3-домен одной тяжелой цепи и СН3-домен другой тяжелой цепи каждый вступает в контакт на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела, где указанную поверхность изменяют так, чтобы способствовать образованию биспецифического антитела, где изменение отличается тем, что

а) изменяют СН3-домен одной тяжелой цепи, так, что в исходной поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая контактирует с исходной поверхностью раздела СН3-домена другой тяже

- 4 032192 лой цепи в биспецифическим антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотной остаток, имеющий больший объем боковой цепи, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела СНЗдомена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость в поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи, и

б) изменяют СНЗ-домен другой тяжелой цепи, так, что в исходной поверхности раздела второго СНЗ-домена, которая контактирует с исходной поверхностью раздела первого СНЗ-домена в биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, создавая тем самым полость в поверхности раздела второго СНЗ-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СНЗ-домена.

Таким образом, антитело может характеризоваться тем, что СНЗ-домен первой тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте а), и СНЗ-домен второй тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в подпункте б), каждый вступает в контакт на поверхности раздела, которая имеет изменение в исходной поверхности раздела между СНЗ-доменами антитела, где

I) в СНЗ-домене одной тяжелой цепи аминокислотный остаток заменяют на аминокислотной остаток, имеющий больший объем боковой цепи, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела СНЗ-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость в поверхности раздела СНЗдомена другой тяжелой цепи, и где

II) в СНЗ-домене второй тяжелой цепи аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, создавая тем самым полость в поверхности раздела второго СНЗ-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СНЗдомена.

Предпочтительно аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковой цепи, выбирают из группы, состоящей из аргинина (К), фенилаланина (Р), тирозина (Υ), триптофана (XV).

Предпочтительно аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, выбирают из группы, состоящей из аланина (А), серина (8), треонина (Т), валина (V).

Оба СНЗ-домена можно дополнительно изменять путем интродукции аминокислоты цистеина (С) в соответствующие положения каждого СНЗ-домена, так, чтобы мог образовываться дисульфидный мостик между обоими СНЗ-доменами.

Биспецифическое антитело может отличаться наличием одного или нескольких следующих свойств (для определения которых применяют анализы, описанные в примере 6) а именно:

более низкой концентрацией в сыворотке по сравнению с соответствующим биспецифическим антителом без мутаций, указанных в подпункте III) (через 96 ч после введения в стекловидное тело у мышей, которые имеют дефицит мышиного РсКи, но являются гемизиготными трансгенными по человеческому РсКи);

сходной (фактор 0,8-1,2) концентрацией в лизатах всего правого глаза по сравнению с соответствующим биспецифическим антителом без мутаций, указанных в подпункте III) (у мышей, которые имеют дефицит мышиного РсКи, но являются гемизиготными трансгенными по человеческому РсКи, через 96 ч после введения в стекловидное тело правого глаза).

Биспецифическое двухвалентное антитело может содержать первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим νΕΟΡ, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим ΑΝ6-2, причем

I) указанный первый антигенсвязывающий центр может содержать в качестве вариабельного домена тяжелой цепи (νΉ) 8ЕО Ю N0: 7, а в качестве вариабельного домена легкой цепи (νΤ) 8Ε0 Ю N0: 8; и

II) указанный второй антигенсвязывающий центр может содержать в качестве вариабельного домена тяжелой цепи (9Н) 8Ε0 Ю N0: 15, а в качестве вариабельного домена легкой цепи (9Ъ) 8Ε0 Ю N0: 16, и

III) биспецифическое антитело может содержать константную область тяжелой цепи подкласса Ц61 или ЦОЗ (выведенную из человеческого антитела) и содержащую мутации Б25ЗА, Б2З5А и РЗ296 (нумерация согласно ЕИ-индексу Кэбота), и характеризоваться наличием одного или нескольких следующих свойств (для определения которых применяют анализы, описанные в примере 6) более низкой концентрацией в сыворотке по сравнению с соответствующим биспецифическим антителом без мутаций, указанных в подпункте III) (через 96 ч после интравитреального введения мышам, которые имеют дефицит мышиного РсКи, но являются гемизиготными трансгенными по человеческому РсКи);

сходной (отличаются в 0,8-1,2 раза) концентрацией в лизатах всего правого глаза по сравнению с соответствующим биспецифическим антителом без мутаций, указанных в подпункте III) (у мышей, которые имеют дефицит мышиного РсКи, но являются гемизиготными трансгенными по человеческому РсКи, через 96 ч после интравитреального введения в правый глаз).

Биспецифическое двухвалентное антитело может содержать первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим νΕ^. и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим ΑN6-2, отличающиеся тем, что

I) указанный первый антигенсвязывающий центр может содержать в качестве вариабельного доме

- 5 032192 на тяжелой цепи (УН) 8ЕО ГО N0: 7 с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, а в качестве вариабельного домена легкой цепи (УЬ) 8Е0 ГО N0: 8 с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами; и

II) указанный второй антигенсвязывающий центр может содержать в качестве вариабельного домена тяжелой цепи (УН) 8Е0 ГО N0: 15 с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, а в качестве вариабельного домена легкой цепи (УЬ) 8Е0 ГО N0: 16 с 1, 2 или 3 аминокислотными заменами, и

III) биспецифическое антитело может содержать константную область тяжелой цепи подкласса 1дС1 или !дС4 (выведенную из человеческого антитела) и содержащую мутации Ь253Л, Ь235Л и Р329С (нумерация согласно ЕИ-индексу Кэбота), и может характеризоваться наличием одного или нескольких следующих свойств (для определения которых применяют анализы, описанные в примере 6) более низкой концентрацией в сыворотке по сравнению с соответствующим биспецифическим антителом без мутаций, указанных в подпункте III) (через 96 ч после интравитреального введения мышам, которые имеют дефицит мышиного ЕеИп. но являются гемизиготными трансгенными по человеческому ЕсИп);

сходной (отличаются в 0,8-1,2 раза) концентрацией в лизатах всего правого глаза по сравнению с соответствующим биспецифическим антителом без мутаций, указанных в подпункте III) (у мышей, которые имеют дефицит мышиного ЕсИп, но являются гемизиготными трансгенными по человеческому ЕсИп, через 96 ч после интравитреального введения в правый глаз).

В контексте настоящего описания понятие антитело относится к связывающему белку, который содержит антигенсвязывающие центры (сайты). Понятия связывающий сайт или антигенсвязывающий центр в контексте настоящего описания означает область(и) молекулы антитела, в которой(ыми) фактически связывается лиганд. Антигенсвязывающий центр содержит вариабельные домены тяжелой цепи антитела (УН) и вариабельные домены легкой цепи антитела (УЬ) (пара УН/УЬ).

Понятие специфичность антитела относится к избирательному распознаванию антителом конкретного эпитопа антигена. Встречающиеся в естественных условиях антитела являются, например, моноспецифическими.

Согласно изобретению биспецифические антитела представляют собой антитела, которые имеют две различные антигенсвязывающие специфичности. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, являются специфическими в отношении двух различных антигенов, УЕСЕ в качестве первого антигена и АУС-2 в качестве второго антигена.

В контексте настоящего описания понятие моноспецифическое антитело означает антитело, которое имеет один или несколько связывающих сайтов, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

В контексте настоящего описания понятие валентный означает присутствие конкретного количества связывающих сайтов в молекуле антитела. Так, понятия двухвалентный, четырехвалентный и шестивалентный означает присутствие двух связывающих сайтов, четырех связывающих сайтов и шести связывающих сайтов соответственно в молекуле антитела. Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, являются двухвалентными.

В контексте настоящего описания понятие УЕСЕ относится к человеческому сосудистому эндотелиальному фактору роста (УЕСЕ/УЕСЕ-А), т.е. состоящему из 165 аминокислот фактору роста человеческих эндотелиальных клеток сосудов (аминокислоты 27-191 последовательности-предшественника человеческого УЕСЕ165: 8Е0 ГО N0: 17; аминокислоты 1-26 обозначают сигнальный пептид), и к родственным изоформам 121, 189 и 206 фактора роста эндотелиальных клеток сосудов, которые описаны у Ьеипд Ό.Α. и др., 8с1епсе 246, 1989, с. 1306-1309; Ноиск и др., Мо1. Епбоспп. 5, 1991, с. 1806-1814; Кеск Р.1. и др., 8с1епсе 246, 1989, с. 1309-1312 и Соппо11у Р.Т. и др., 1. Вю1. Сйет. 264, 1989, с. 20017-20024; а также к встречающимся в естественных условиях аллельным и процессированным формам указанных факторов роста. УЕСЕ участвует в регуляции нормального и аномального ангиогенеза и неоваскуляризации, ассоциированной с опухолями и внутриглазными болезнями (Ееггага N. и др., Епбосг. Кеу. 18, 1997, с. 4-25; Вегктап И.А. и др., 1. С1т. Шуек!. 91, 1993, с. 153-159; Вго\уп Ь.Е. и др., Нитап Ра11ю1. 26, 1995, с. 86-91; Вго\уп Ь.Е. и др., Сапсег Иек. 53, 1993, с. 4727-4735; МаИегп 1. и др., Вгй. 1. Сапсег. 73, 1996, с. 931934 и Руогак Н.Е. и др., Ат. 1. Ра11ю1. 146, 1995, с. 1029-1039). УЕСЕ представляет собой гомодимерный гликопротеин, который был выделен из нескольких источников и включает несколько изоформ. Для УЕСЕ характерна высокая специфическая митогенная активность в отношении эндотелиальных клеток.

В контексте настоящего описания понятие АЛС-2 относится к человеческому ангиопоэтину-2 (АЛС-2) (который сокращенного обозначают как АNСРΤ2 или АNС2) (8Е0 ГО N0: 18), который описан, например, у МаЬопр1егге Р.С. и др., Заеисе 277,1997, с. 55-60 и Сйеиид А.Н. и др., Сеиотюк 48, 1998, с. 389-391. Ангиопоэтины-1 (8Е0 ГО N0: 19) и -2 описаны в качестве лигандов Т1е, семейства тирозинкиназ, которые избирательно экспрессируются в сосудистом эндотелии (Уапсорои1ок С.Р. и др., №1Шге 407, 2000, 242-248). В настоящее время известно четыре определенных представителя семейства ангиопоэтинов. Ангиопоэтин-3 и -4 (Апд-3 и Апд-4) могут представлять собой отличающиеся широким разнообразием копии одного и того же генного локуса у мышей и человека (К1т I. и др., ЕЕВ8 Ье1, 443, 1999, с. 353-356; К1т I. и др., 1. Вю1 СНет 274, 1999, с. 26523-26528). АNС-1 и АNС-2 впервые идентифицированы в экспериментах, проведенных на культурах ткани, в качестве агониста и антагониста соответственно (см. касательно АNС-1: Раугк 8. и др., Се11 87, 1996, с. 1161-1169; и касательно АNС-2: Магкопргегге Р.С.

- 6 032192 и др., 8с1епсе 277, 1997, с. 55-60). Все известные ангиопоэтины связываются, прежде всего, с Т1е2 (8Е6 ΙΌ N0: 20), а аффинность связывания обоих Апд-1 и -2 с Т1е2 составляет 3нМ (Кй) (Ма18опр1етге Р.С. и др., 8с1епсе 277, 1997, с. 55-60).

Антигенсвязывающие центры биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, содержат шесть гипервариабельных участков (СОЯ), которые обусловливают различные уровни аффинности связывающего антиген центра. Присутствует три СОЯ в вариабельном домене тяжелой цепи (СОЯН1, СЭРН2 и СОЯН3) и три СОЯ в вариабельном домене легкой цепи (СОЯЫ, СПЯЬ2 и СОЯЬЗ). Протяженность СОЯ и каркасных участков (РЯ) определяют путем сравнения с компилированной базой данных аминокислотных последовательностей, в которых эти области определены на основе вариабельности между последовательностями.

Антитела могут содержать константные области иммуноглобулинов, полученные из человеческих иммуноглобулинов одного или нескольких классов, где указанные классы иммуноглобулинов включают классы 1д6, 1дМ, 1дА, Ι§Ό и 1дЕ и в случае 1д6 и 1дА их подклассы, прежде всего 1д61 и 1д64.

В контексте настоящего описании понятия моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела относятся к препарату молекул антител с одинаковым аминокислотным составом.

Понятие химерное антитело относится к антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, из одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области, выведенную из другого источника или вида, как правило, полученному с помощью методов рекомбинантной ДНК. Предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Другими предпочтительными формами химерных антител являются антитела, константная область которых модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для создания свойств, прежде всего касающихся СЦ-связывания и/или связывания Рсрецептора (РсЯ). Указанные химерные антитела обозначают также как антитела переключенного класса. Химерные антитела являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих ДНК-сегменты, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулина, и ДНК-сегменты, которые кодируют константные области иммуноглобулина. Методы создания химерных антител включают общепринятые методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Мотлкоп 8.Ь. и др., Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 81, 1984, с. 6851-6855; И8 5202238 и И8 5204244.

Понятие гуманизированное антитело относится к антителам, в которых каркасный участок или гиперварибельные участки (определяющие комплементарность участки (СОЯ)) модифицированы так, что содержат СОЯ иммуноглобулина другой специфичности относительно родительского иммуноглобулина. Мышиный СОЯ можно трансплантировать в каркасный участок человеческого антитела для получения гуманизированного антитела (см., например, Я1есйтапп Ь. и др., №1иге 332, 1988, с. 323-327 и №иЬетдет М.8. и др., МШие 314, 1985, с. 268-270). Наиболее предпочтительные СОЯ соответствуют участкам, которые представлены последовательностями, распознающими антигены, указанным выше для химерных антител. Другими формами гуманизированных антител являются антитела, константная область которых дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с исходным антителом для создания свойств, прежде всего касающихся С1д-связывания и/или связывания Рс-рецептора (РсЯ).

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие человеческое антитело относится к антителам, которые имеют вариабельные и константные области, выведенные из последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (уап Эук М.А. и уап йе Атке1 1.6., Сигг. Ορίη. СНет. Вю1. 5, 2001, с. 368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые могут после иммунизации продуцировать весь спектр человеческих антител или отобранные человеческие антитела в отсутствии эндогенного производства иммуноглобулинов. Перенос массива генов иммуноглобулинов человеческой зародышей линии в таких несущих мутант зародышевой линии мышей может приводить к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (см., например, 1акоЬоуЙ8 А. и др., Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 90, 1993, с. 2551-2555; 1акоЬоуЙ8 А. и др., №Шге 362, 1993, с. 255-258; Вгиеддетапп М. и др., Уеат 1ттипо1. 7, 1993, с. 33-40). Человеческие антитела можно получать также в фаговых дисплейных библиотеках (НоодепЬоот Н.Я. и Аш1ег 6., 1. Мо1. Вю1. 227, 1992, с. 381-388; Маткк Ι.Ό. и др., 1. Мо1. Вю1. 222, 1991, с. 581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно применять также методики, разработанные Со1е А. с соавторами и Воегпег Р. с соавторами (Со1е А. и др., Мопос1опа1 АпйЬоШек апй Сапсег Тйетару, изд-во ЬГк А.Ь., 1985, с. 77 и Воегпег Р. и др., 1. 1ттипо1. 147, 1991, с. 86-95). Как уже указывалось для химерных и гуманизированных антител в контексте настоящего описания понятие человеческое антитело относится также к антителам, константная область которых модифицирована для создания свойств, прежде всего касающихся С1с.|-связывания и/или связывания Рс-рецептора (РсЯ), например, путем переключения класса, т.е. изменения или мутации Рс-областей (например, с 1д61 на 1д64 и/или мутация 1д61/1д64).

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие рекомбинантное антитело включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены методами рекомбинации, например, антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как N80- или СНО-клетка или

- 7 032192 из животного (например, мыши), трансгенного по генам человеческого иммуноглобулина, или антитела, экспрессированные с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектирована клетка-хозяин. Указанные рекомбинантные антитела имеют вариабельные и константные области в преобразованной форме. Рекомбинантные антитела подвергались соматической гипермутации ίη νίνο. Так, аминокислотные последовательности УН- и УЪ-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые хотя выведены и родственны последовательностям УН и УЪ человеческой зародышевой линии, могут не существовать в естественных условиях в популяции антител человеческой зародышевой линии ίη νίνο.

В контексте настоящего описания вариабельный домен (вариабельный домен легкой цепи (УЬ), вариабельный домен тяжелой цепи (УН)) обозначает каждую из пары из легких и тяжелых цепей, которые непосредственно участвуют в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных человеческих легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (ТВ), последовательности которых обладают выраженным консерватизмом, соединенные тремя гипервариабельными участками (или определяющими комплементарность участками, СОК). Каркасные участки адаптированы к β-складчатой конформации, а СОВ могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. СОВ в каждой цепи сохраняют свою трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с СОВ из другой цепи антигенсвязывающий центр. СОВЗ-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют наиболее важную роль в специфичности/аффинности связывания антител.

В контексте настоящего описания понятия гипервариабельный участок илио антигенсвязывающая область антитела относится к аминокислотным остаткам, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из определяющих комплементарность участков или СОВ. Каркасные участки или ГВ-участки представляют собой области вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельных участков. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат в направлении от Ν- к С-концу домены ТВ1, СЭР1. ТВ2, СЭВ2. РВЗ, СЭВЗ и ТВ4. СОВ на каждой цепи разделены указанными аминокислотами каркасного участка. СЭВЗ тяжелой цепи представляет собой область, которая вносит основной вклад в связывание антигена. СОВ- и ТВучастки определяют согласно стандартному определению КаЬа1 Е.А. и др., 8сс.|испес5 οί Ргсйепъ οί 1ттипо1ощса1 [Щсгск!, 5-ое изд., изд-во РиЬйс НсаНН 8егуюе, Ναΐίοηαΐ ЕъШШех οί НеаИЪ, ВеШекба, ΜΌ, 1991.

В контексте настоящего описания понятие связывание или специфическое связывание относится к связыванию антитела с эпитопом антигена (либо человеческого УЕСТ, либо человеческого ΑΝΟ-2), установленному в анализе ίη νίίτο, предпочтительно анализе на основе поверхностного плазмонного резонанса (ΒΙΑ^γο, фирма 6Е-Неа1Шсаге Упсалла, Швеция), с очищенным антигеном дикого типа. Аффинность связывания оценивают в понятиях ка (константа скорости ассоциации антитела/антигена в комплекс), к_с (константа диссоциации) и К_с (к_с/ка). Связывание или специфическое связывание может характеризоваться аффинностью связывания (К_с), составляющей 10^-8 моль/л или менее.

Понятие эпитоп относится к любой полипептидной детерминанте, обладающей способностью специфически связываться с антителом. Эпитопная детерминанта химически включает активные расположенные на поверхности группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи аминокислот, фофорил или сульфонил, и может иметь специфические характеристики трехмерной структуры и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается с антителом.

Считается, что антитело специфически связывается с антигеном, когда оно избирательно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.

Понятие полноразмерное антитело относится к антителу, состоящему из двух тяжелых цепей полноразмерного антитела и двух легких цепей полноразмерного антитела. Тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, содержащий в направлении от Ν-конца к С-концу тяжелой цепи антитела вариабельный домен (УН), домен 1 константной области тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирную область антитела (НВ), домен 2 константной области тяжелой цепи антитела (СН2) и домен 3 константной области тяжелой цепи антитела (СНЗ), что сокращенно обозначают как УН-СН1НВ-СН2-СН3; и необязательно домен 4 константной области тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса 1дЕ. Предпочтительно тяжелая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, содержащий в направлении от Ν-конца к С-концу УН, СН1, НВ, СН2 и СНЗ. Легкая цепь полноразмерного антитела представляет собой полипептид, содержащий в направлении от Ν-конца к Сконцу легкой цепи антитела вариабельный домен легкой цепи антитела (УЪ) и константный домен легкой цепи антитела (СЬ), что сокращенно обозначают как УЪ-СЬ. Константный домен легкой цепи антитела (СЬ) может быть κ- (каппа) или λ-(лямбда) типа. Две цепи полноразмерного антитела связаны друг с другом через межполипептидные дисульфидные связи между СЬ-доменом и СН1-доменом и между шарнирными областями тяжелых цепей полноразмерного антитела. Примерами типичных полноразмерных антител являются встречающиеся в естественных условиях антитела типа 1дС (например, 1дС1 и 1дС2), 1дМ, 1дА, Ι§ϋ и 1дЕ. Полноразмерные антитела могут иметь происхождение из одного вида, на

- 8 032192 пример, человека, или они могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела. Полноразмерные антитела содержат два антигенсвязывающих центра, каждый образованный парой УН и УБ, которые оба специфически связываются с одним и тем же антигеном. Под С-концом тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела понимают последнюю аминокислоту на С-конце указанной тяжелой или легкой цепи. Под Ν-концом тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела понимают последнюю аминокислоту на Ν-конце указанной тяжелой или легкой цепи.

В контексте изобретения под пептидным линкером понимают пептид, содержащий аминокислотные последовательности, который предпочтительно имеет синтетическое происхождение. Указанные пептиды применяют для соединения С-конца легкой цепи с Ν-концом тяжелой цепи второго полноразмерного антитела (которое специфически связывается со вторым антигеном) через пептидный линкер. Пептидный линкер в тяжелой и легкой цепи второго полноразмерного антитела представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого состоит по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 32-50 аминокислот. Пептидный линкер может представлять собой пептид, аминокислотная последовательность которого состоит из 32-40 аминокислот. Указанный пептидный линкер также может представлять собой (Сх§)и, где С = глицин, 8 =серин, (х=3, п=8, 9 или 10 и т= 0, 1, 2 или 3) или (х=4 и п=6, 7 или 8 и т=0, 1, 2 или 3), предпочтительно х= 4, п=6 или 7, и т=0, 1, 2 или 3, более предпочтительно х=4, п=7 и т=2 или (С₄8)₆С₂.

В контексте настоящего описания понятие константная область означает сумму доменов антитела, отличных от вариабельной области. Константная область не участвует непосредственно в связывании антигена, но обеспечивает различные эффекторные функции. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела подразделяют на классы: 1дЛ, 1дЭ, 1дЕ, 1дС и 1дМ, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы, такие как 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4, 1дА1 и 1дА2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулина, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно. Константные области легкой цепи антитела, которые могут присутствовать во всех пяти классах антител, обозначают как каппа (κ) и лямбда (λ).

В контексте настоящего описания понятия константная область, выведенная из человеческого источника или человеческая константная область означают константную область тяжелой цепи человеческого антитела подкласса 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 и/или константную область легкой каппа- или лямбда-цепи. Указанные константные области хорошо известны в данной области и описаны, например, у КаЬа! Е.А. и др., 8сс.|испсс5 οί Рго1еш8 οί 1ттипо1од1са1 1п1сгс51. 5-ое изд., изд-во, РиЬйс Неа11й 8егу1ее, №10опа1 1п8Й1и1е8 οί Неа11й, ВеШекба, ΜΌ, 1991 (см, например, также 1оЬи8оп С. и Аи Т.Т., №.1с1е1с Ас1б§ Кек. 28, 2000, с. 214-218; КаЬа! Е.А. и др., Ргос. №И. Асаб. 8а. И8А 72, 1975, с. 2785-2788). В контексте настоящего описания для нумерации положений и мутаций применяют систему нумерации ЕЙ (ЕИиндекс) согласно КаЬа! Е.А. и др., 8ес.|иепсе5 οί Рто1етк οί 1ттипо1од1са1 1п1ете81, 5-ое изд., изд-во РиЬйс Неа1111 8етуюе, №10опа1 1и81йи1е8 οί Неа11й, ВеШекба, ΜΌ, 1991 и обозначают как нумерация в соответствии с ЕИ-индексом Кэбота.

Биспецифические антитела могут иметь константную область человеческого подкласса 1дС1 (выведенную из человеческого подкласса 1§С1). или константную область человеческого подкласса 1дС4 (выведенную из человеческого подкласса 1§С4).

Биспецифическое антитело может представлять собой человеческое антитело подкласса 1дС1 с мутациями Б234А (Беи235А1а), Б235А (Беи234А1а) и Р329С (Рго329С1у). Указанное антитело обладает пониженной способностью связываться с РсК (прежде всего оно больше не может связываться с РсК гамма I, РсК гамма II и РсК гамма III). Это, прежде всего, ценно для снижения потенциальных побочных действий типа, например, тромбоза (Меуег Т. и др., 1. ТБготЬ. Наеток!. 7, 2009, с. 171-181). Биспецифическое антитело может представлять собой человеческое антитело подкласса ^04 с мутациями 8228Р (8ег228Рго), Б235Е (Беи23561и) и Р329С (Рго32961у). Указанное антитело обладает пониженной описанной выше способностью связываться с РсК. Хотя уже описанная ранее мутация Рго329А1а удаляет только две трети взаимодействия при оценке с использованием Рс гамма КШа-сэндвича, Рго329С1у в антителах полностью нарушает связывание Рс-области с Рс гамма КНР Это является особенно ценным, поскольку связывание с Рс гамма КШ участвует в АЭСС (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность), которая приводит к гибели клеток, что может быть полезным при лечении раковых заболеваний, но может вызывать серьезные побочные действия при лечении с использованием антител других сосудистых или иммунологических заболеваний. Поэтому антитела [дС1-подкласса с мутациями Б234А, Б235А и Р329С и к^-подкласса с мутациями 8228Р, Б235Е и Р329С являются наиболее ценными, поскольку они оба больше не могут связываться с РсК гамма I, РсК гамма II и РсК гамма III.

В контексте настоящего описания понятие с ААА-мутациями относится к мутациям Г253А (Пе253А1а), Н310А (Н1к310А1а) и Н435А (Н1к435А1а) в константной области тяжелой цепи ^01 или ^04, где нумерация соответствует ЕИ-индексу Кэбота.

В контексте настоящего описания понятие с Р329С БАБА-мутациями относится к мутациям Б234А (Беи235А1а), Б235А (Беи234А1а) и Р329С (Рго32961у) в константной области тяжелой цепи ^01подкласса, где нумерация соответствует ЕИ-индексу Кэбота. В контексте настоящего описания понятие

- 9 032192 с 8РЬЕ-мутациями относится к мутациям 8228Р (8ег228Рго) и Ь235Е (Ееи235О1и) в константной области тяжелой цепи 1дО4-подкласса, где нумерация соответствует ЕИ-индексу Кэбота. В контексте настоящего описания понятие с 8РЬЕ и Р239О-мутациями относится к мутациям 8228Р (8ет228Рто), Ь235Е (Ееи235О1и) и Р329О (Рго329С1у) в константной области тяжелой цепи 1дО4-подкласса, где нумерация соответствует ЕИ-индексу Кэбота.

Антитело можно получать с помощью методов рекомбинации. Методы рекомбинантного получения широко известны в данной области и заключаются в том, что экспрессируют белок в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением антитела и, как правило, очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии антител в вышеуказанных клетках-хозяевах нуклеиновую кислоту, кодирующую соответствующие модифицированные легкие и тяжелые цепи, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в пригодных прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах типа СНО-клеток, ΝδΘ-клеток, 8Р2/0-клеток, НЕК293клеток, СО8-клеток, РЕВ.Сб-клеток, дрожжей или клеток Е.соИ, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса). Общие методы рекомбинантного получения антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в обзорных статьях Макпбек 8.С., Рто1ет Ехрг. РипГ. 17,

1999, с.183-202; Ое155е 8. и др., Рто1еш Ехрг. РипГ. 8, 1996, с. 271-282; КаиГтап К.Д., Мо1. Вю1есЪпо1. 1б,

2000, с. 151-160; \\егпег КО., Отид Век. 48, 1998, с. 870-880.

Итак, способ получения биспецифического антитела может заключаться в том, что осуществляют стадии, на которых

а) трансформируют клетку-хозяина векторами, содержащими молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют указанное антитело;

б) культивируют клетку-хозяина в условиях, обеспечивающих синтез указанной молекулы антитела; и

в) выделяют указанную молекулу антитела из указанной культуры. Стадия выделения, указанная в подпункте в), может включать применение специфического захватывающего реагента для константной области легкой цепи (который, например, является специфическим для константной области легкой каппа- или лямбда-цепи, в зависимости от того, легкая каппа- или лямбда цепь применяется в биспецифическом антителе, предлагаемом в изобретении). Причем указанный специфически захватывающий легкую цепь реагент применяют в режиме связывания-и-элюции). Примерами указанных специфических для константной области легкой цепи захватывающих реагентов являются, например, Карра8е1ес1™ и ЬатЬбаЕаЬ8е1ес1™ фирмы ОЕ Неа11йсаге/ВАС, основой которых является очень жесткий матрикс на основе агарозы, который обеспечивает высокие скорости потока и низкое обратное давление при крупномасштабном анализе. Их особенностью является лиганд, который связывается с константной областью легкой каппа- или лямбда-цепи соответственно (т. е. фрагменты, лишенные константной области легкой цепи не связываются; фиг. 1). Таким образом, оба реагента обладают способностью связываться с другими молекулами-мишенями, которые содержат константную область легкой цепи, например, 1дО, 1дА и 1дМ. Лиганды присоединяют к матриксу через плечо длинного гидрофильного спейсера, что делает их легко доступными для связывания с молекулой-мишенью. Они находятся на одноцепочечном фрагменте антитела, который подвергают скринингу в отношении каппа- или лямбда-цепи человеческого 1д.

Биспецифические антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых процедур очистки иммуноглобулинов, таких, например, как хроматография на белок А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, кодирующие моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур. Клетки гибридомы могут служить в качестве источника таких ДНК и РНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как НЕК293-клетки, СНО-клетки или клетки миеломы, которые в противном случае не могут продуцировать белок иммуноглобулина, с получением в результате синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.

Варианты (или мутанты) аминокислотной последовательности биспецифического антитела получают путем интродукции соответствующих нуклеотидных замен в ДНК антитела или путем синтеза нуклеотидов. Однако указанные модификации можно осуществлять только в очень ограниченном диапазоне. Например, модификации не должны изменять указанные выше характеристики антитела, такие как 1дО-подкласс и связывание антигена, но могут повышать выход рекомбинантного производства, стабильность белка или облегчать очистку.

В контексте настоящего описания понятие клетка-хозяин означает любой тип клеточной системы, который можно создавать для получения антител. В качестве клеток-хозяев можно применять НЕК293клетки и СНО-клетки.

В контексте настоящего описания понятия клетка, клеточная линия и клеточная культура используются взаимозаменяемо, и они все включают потомство указанных клеток. Так, понятия трансформанты и трансформированные клетки включают первично трансформированную клетку и выведенные из нее культуры безотносительно к количеству пересевов. Следует понимать также, что потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за произвольных или преднамеренных му

- 10 032192 таций. Под объем изобретения подпадает вариант потомства, который обладает такой же функцией или биологической активностью, которая обнаружена в результате скрининга или отобрана у исходной трансформированной клетки.

Экспрессия в ΝδΟ-клетках описана, например, у Вагпез Ь.М. и др., Су1о1есйпо1оду 32, 2000, с. 109123; Вагпез Ь.М. и др., Вю1есй. Вюепд. 73, 2001, с. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Иигосйег Υ. и др., №с1. Ас1бз. Кез. 30, 2002, Е9. Клонирование вариабельных доменов описано у Ог1апб1 К. и др., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 86, 1989, с. 3833-3837; Сайег Р. и др., Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 89, 1992, с. 4285-4289 и у Шгбегйанд Ь. и др., 1. 1ттипо1. Ме1йобз 204, 1997, с. 77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (НЕК293) описана у 8сй1аедег Е.-Ь и Сйпз1епзеп К., Су1о1есйпо1оду 30, 1999, с. 71-83 и у 8сй1аедег Е.-Ь, 1. 1ттипо1. Ме!йобз 194, 1996, с. 191-199.

Контролирующие последовательности, которые можно применять для прокариот, включают, например, промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.

Нуклеиновая кислота является функционально связанной, когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой нуклеиновой кислотой. Например, ДНК предпоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируется в виде предбелка, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательности, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчать трансляцию. Как правило, функционально связанные означает, что последовательности ДНК, подлежащие связыванию, являются смежными, а в случае секреторного лидера, смежными и находиться в рамке считывания. Однако не является обязательным, чтобы энхансеры были смежными. Связывание осуществляют путем лигирования в приемлемых сайтах рестрикции. Если указанные сайты не существуют, то согласно принятой практике используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры.

Очистку антител осуществляют для того, чтобы элиминировать клеточные компоненты или другие загрязнители, например, другие клеточные нуклеиновые кислоты или белки, с использованием стандартных методик, включая обработку щелочью/ДСН, СзС1-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Сштеп! Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. АизиЬе1 Р. и др., изд-во Сгеепе РиЬНзЫпд апб νίΚγ 1п1егзс1епсе. №\ν Υο^к, 1987). Для очистки белков детально разработаны и нашли широкое применение различные методы, такие как аффинная хроматография с использованием белков микроорганизмов (например, аффинная хроматография на белке А или белке С), ионообменная хроматография (например, катионообменная (карбоксиметильные смолы), анионообменная (аминоэтильные смолы) и хроматография на основе обмена смешанного типа), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими лигандами 8Н), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматической адсорбции (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами или м-аминофенилборной кислотой), металл-хелатная аффинная хроматография (например, с Νί(ΙΙ)- и Си(11)-аффинный материалом), гель-фильтрация и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Ууауа1акзйт1 М.А., Арр1. Вюсйет. Вю1есй. 75, 1998, с. 93-102).

Биспецифические двухвалентные антитела оказывают благоприятное воздействие на больных людей, которые нуждаются в УЕСР- и АNС-2-направленной терапии.

Двухвалентные биспецифические антитела к человеческому УЕСР и человеческому АNС-2 могут иметь ценный профиль эффективности/безопасности и могут оказывать благоприятное действие на пациента, который нуждается в анти-УЕСР- и анти-АNС-2-терапии.

В контексте настоящего описания понятие фармацевтический носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, придающие изотоничность и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель можно применять для введения подлежащему лечению индивидууму местным путем. Например, антитело или содержащую его композицию можно вводить индивидууму путем внутриглазного применения, например, путем внутриглазной инъекции, такой как интравитреальная инъекция. Это можно осуществлять с помощью стандартных процедур, известных в данной области (см., например, К1йег и др., 1. С1т. 1пуез1. 116, 2006, с. 3266-76; Киззе1ак1з-Сагпе1го и др., №игора!йо1. Арр1. №шоЬю1. 25, 1999, с. 196-206 и νην и др., Агсй. №иго1. 33, 1976, с. 183-185).

Эту композицию можно вводить с помощью различных методов, известных в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или форму введения можно варьировать в зависимости от требуемых результатов. Для введения соединения, с помощью определенных путей введения может оказаться необходимым наносить на соединение покрытие из материала, препятствующего его инактивации, или осуществлять введение соединения совместно с таким материалом. Например, соединение можно вводить индивидууму в соответствующем носителе, например, в липосомах или в разбавителе. К фармацевтически приемлемым разбавителям относятся физиологический раствор и водные забуферивающие растворы. К фармацевтически приемлемым носителям относятся стерильные водные

- 11 032192 растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Применение таких сред и агентов для обладающих фармацевтической активностью субстанций известно в данной области.

Можно применять целый ряд возможных путей введения, включая (но, не ограничиваясь только ими) внутриглазное применение или местное нанесение. Применение может быть внутриглазным и включает (но, не ограничиваясь ими) подконъюнктивальную инъекцию, внутричерепную инъекцию, инъекцию в переднюю камеру через темпоральный лимб, интрастромальную инъекцию, инъекцию в роговицу, инъекцию сетчатку, инъекцию в водянистую влагу глаза, инъекцию в субтеновое пространство глаза или введение с помощью устройства с замедленным высвобождением, интравитреальную инъекцию (например, инъекцию в переднюю, срединную или заднюю область стекловидного тела). Причем применение может быть местным и включает (но, не ограничиваясь только ими) нанесение глазных капель на роговицу.

Биспецифическое антитело или фармацевтическую композицию можно применять путем интравитреального введения, например, путем инъекции в стекловидное тело. Это можно осуществлять с помощью стандартных процедур, известных в данной области (см., например, Клйег и др., 1. С11и. !иус51. 116, 2006, с. З266-76; Ви88е1ак18-Сагие1го и др., №игораШо1. Арр1. №игоЫо1. 25, 1999, с. 196-206 и νιογ и др., Агсй. №иго1. ЗЗ, 1976, с. 18З-185).

Причем терапевтические наборы могут содержать одну или несколько доз биспецифического антитела в фармацевтической композиции, указанной в настоящем описании, приемлемое устройство для инъекции в стекловидное тело фармацевтической композиции и инструкцию, детализирующую показания для применения индивидуумам и протоколы осуществления инъекции. Композиции, как правило, вводят индивидууму, который нуждается в лечении, путем инъекции в стекловидное тело. Это можно осуществлять с помощью стандартных процедур, известных в данной области (см., например, КШег и др., 1. С11и. Шуей. 116, 2006, с. З266-З276; Ви88е1ак18-Сагиепо и др., №игораШо1. Арр1. №игоЫо1. 25, 1999, с. 196-206 и νην и др., Агсй. №иго1. ЗЗ, 1976, с. 18З-185).

Композиции могут содержать также адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Отсутствие микроорганизмов можно обеспечивать как с помощью процедур стерилизации (см. выше), так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких, например, как парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота и т.п. Целесообразно включать в композиции агенты для придания изотоничности, такие как сахара, хлорид натрия и т. п. Кроме того, можно пролонгировать абсорбцию инъекционной фармацевтической формы путем включения веществ, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Вне зависимости от выбранного пути введения соединения можно применять в пригодной гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, приготавливают в виде фармацевтически приемлемых форм лекарственного средства с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области.

Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях можно варьировать для получения количества действующего вещества, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, но которое не является токсичным для пациента. Выбранный уровень доз должен зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, путь введения, продолжительность введения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, которые используют в сочетании с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, состояние, общее состояние здоровья и предшествующая история болезни пациента, подлежащего лечению, и другие подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

Композиция должна быть стерильной и текучей в той степени, чтобы ее можно было вводить с помощью шприца. Помимо воды предпочтительным носителем является изотонический забуференный физиологический раствор.

Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию агенты для придания изотоничности, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит или сорбит, и хлорид натрия.

Композиция может представлять собой офтальмическую композицию в форме депо, содержащую действующее вещество для субконъюнктивального введения. Офтальмическая композиция в форме депо содержит микрочастицы практически чистого действующего вещества, например, биспецифического антитела. Микрочастицы, содержащие биспецифическое антитело могут быть погружены в биосовместимый фармацевтически приемлемый полимер или липидный капсулирующий агент. Композиции в форме депо можно адаптировать для высвобождения всего или практически всего действующего вещества в течение удлиненного периода времени. Полимерный или липидный матрикс, если он присутству- 12 032192 ет, может быть адаптирован к расщеплению, достаточному для того, чтобы транспортироваться от места введения после высвобождения всего или практического всего действующего вещества. Композиция в форме депо может представлять собой жидкую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый полимер и растворенное или диспергированное действующее вещество. После инъекции полимер образует депо в месте инъекции, например, путем образования геля или осаждения.

Итак, описанное биспецифическое антитело и указанная фармацевтическая композиция предназначены для лечения сосудистых глазных заболеваний.

Понятия сосудистое глазное заболевание и сосудистое заболевание глаз в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо, и они включают (но, не ограничиваясь только ими) синдромы внутриглазной неоваскуляризации, такие как диабетическая ретинопатия, диабетический отек желтого пятна, ретролентальная фиброплазия, неоваскулярная глаукома, окклюзии вен сетчатки, окклюзии центральной вены сетчатки, дегенерация желтого пятна, возрастная дегенерация желтого пятна, пигментный ретинит, ретинальная ангиоматозная пролиферация, телеангиэктазия желтого пятна, ишемическая ретинопатия, неоваскуляризация радужной оболочки, внутриглазная неоваскуляризация, неоваскуляризация роговицы, неоваскуляризация сетчатки, хороидальная неоваскуляризация и дегенерация сетчатки (Сагпег А., Уа§си1аг бЦеакек, в: Ра11юЬю1оду о£ оси1аг бщеаке, А. бупапис арргоасЬ, под ред. Сагпег А. и Ι<1ίπΐ\\ΌΓΐ1ι С.К., 2-ое изд., изд-во Магсе1 Беккет, №\ν Уотк, 1994, с. 1625-1710). В контексте настоящего описания сосудистое глазное заболевание включает любые патологические состояния, отличающиеся измененной или нерегулируемой пролиферацией и инвазией новых кровеносных сосудов в структуры тканей глаза, таких как сетчатка или роговица. Сосудистое глазное заболевание выбирают из группы, включающей: влажную возрастную дегенерацию желтого пятна (влажная форма АМБ), сухую возрастную дегенерацию желтого пятна (сухая форма АМБ), диабетический отек желтого пятна (БМЕ), цистоидный отек желтого пятна (СМЕ), непролиферативную диабетическую ретинопатию (ИРБИ), пролиферативную диабетическую ретинопатию (РБК), цистоидный отек желтого пятна, васкулит (например, окклюзия центральной вены сетчатки) папиллоэдему (отек диска зрительного нерва), ретинит, конъюнктивит, увеит, хороидит, мультифокальный хороидит, гитоплазмоз глаза, блефарит, сухой глаз (болезнь Шегрена) и другие офтальмические заболевания, при которых глазное заболевание или нарушение ассоциировано с неоваскуляризацией глаза, просачиванием из сосудов и/или отеком сетчатки. Таким образом, биспецифические антитела можно применять для предупреждения и лечения влажной формы АМБ, сухой формы АМБ, СМЕ, БМЕ, №БК, РБК, блефарита, сухого глаза и увеита, предпочтительно также влажной формы АМБ, сухой формы АМБ, блефарита и сухого глаза, предпочтительно также СМЕ, БМЕ, БРБК и РБК, предпочтительно также блефарита и сухого глаза, в частности влажной формы АМБ и сухой формы АМБ, а также наиболее предпочтительно важной формы АМБ. Глазное заболевание можно выбрать из группы, включающей влажную возрастную дегенерацию желтого пятна (влажная форма АМБ), отек сетчатки, окклюзии вен сетчатки, ретролентальную фиброплазию и диабетическую ретинопатию.

Другие болезни, ассоциированные с неоваскуляризацией роговицы, включают (но, не ограничиваясь только ими) эпидемический кератоконъюнктивит, дефицит витамина А, переношение положенного времени контактных линз, атопический кератит, верхний лимбический кератит, птеригий, сухой кератит, болезнь Шегрена, розовые угри, филектенулоз, сифилис, инфекции, вызываемые микобактериями, липидные дегенерации, химические ожоги, бактериальные язвы, грибковые язвы, инфекции, вызываемые вирусом герпеса простого, инфекции, вызываемые вирусом опоясывающего лишая, протозойные инфекции, саркому Капоши, язву Мурена, краевую дегенерацию Терриена, краевой кератолизис, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, полиартрит, травму, саркоидоз Вегенера, склерит, болезнь Стивена-Джонсона, перифигоидную радиальную кератотомию и отторжение трансплантата роговицы.

Заболевания, ассоциированные с ретинальной/хороидальной неоваскуляризацией, включают (но, не ограничиваясь только ими) диабетическую ретинопатию, дегенерацию желтого пятна, серповидноклеточную анемию, саркоид, сифилис, псевдоксантому эластическую, болезнь Педжета, окклюзию вен, окклюзию артерий, обструктивное заболевание сонной артерии, хронический увеит/витрит, инфекции, вызываемые микобактериями, болезнь Лайма, системную красную волчанку, ретролентальную фиброплазию, пигментный ретинит, отек сетчатки (включая отек желтого пятна), болезнь Изла, болезнь Бехчета, инфекции, вызывающие ретинит или хороидит, синдром предполагаемого глазного гистоплазмоза, болезнь Беста, миопию, ямки диска зрительного нерва, болезнь Штаргардта, туберкулез сосудистой оболочки глазного яблока (туберкулезный увеит), хроническое отслоение сетчатки, синдром гипервязкости, токсоплазмоз, осложнения, связанные с травмой и воздействием лазера. Другие болезни включают (но, не ограничиваясь только ими) болезни, ассоциированные с покраснением (неоваскуляризация угла), и болезни, вызываемые аномальной пролиферацией фиброваскулярной или фиброзной ткани, включая все формы пролиферативной витриоретинопатии.

Ретролентальная фиброплазия (КБР) представляет собой заболевание глаза, которое поражает преждевременно родившихся детей. Вероятно, оно вызывается дезорганизованным ростом кровеносных сосудов сетчатки, что может приводить к рубцеванию и отслоению сетчатки. КБР может быть слабой и может спонтанно устраняться, но может в серьезных случаях приводить к слепоте. В целом, все недоношенные дети имеют риск ИБР, а очень низкий вес при рождении является дополнительным фактором

- 13 032192 риска. Как токсичность кислорода, так и относительно гипоксия могут принимать участие в развитии И0Р.

Дегенерация желтого пятна представляет собой медицинское состояние, встречающееся главным образом у престарелых людей, при котором центр внутренней выстилки глаза, известный как желтое пятно (макула) сетчатки, истончается, атрофируется и в некоторых случаях кровоточит. Это может приводить к снижению центрального зрения, что влечет за собой отсутствие возможности видеть мелкие детали, читать или различать лица. Согласно Американской академии офтальмологии в Соединенных Штатах это является причиной потери центрального зрения (слепоты) у людей возрастом старше 50 лет. Хотя некоторые дистрофии желтого пятна, которые поражают более молодых индивидуумов, иногда обозначают как дегенерация желтого пятна, понятие, как правило, относится к возрастной дегенерации желтого пятна (АМЭ или АКМЭ).

Возрастная дегенерация желтого пятна начинается с характерных отложений желтого цвета, называемых друзами, в макуле (центральная область сетчатки, которая обеспечивает детализированное центральное зрение, называемая ямкой), между пигментным эпителием сетчатки и низлежащей собственно сосудистой оболочкой глаза. Большинство людей с указанными ранними изменениями (которые называют возрастной макулопатией) имеют хорошее зрение. У людей с друзами может развиваться запущенная форма АМЭ.

Риск значительно возрастает, когда друзы становятся крупными и многочисленными и связанными с нарушением в слое пигментированных клеток под желтым пятном. Крупные и мягкие друзы связаны с повышенными отложениями холестерина и могут реагировать на лечение снижающими холестерин средствами или Рео-процедуру.

Запущенная форма АМЭ, ответственная за глубокую (полную) потерю зрения, имеет две формы: сухую и влажную. Затрагивающая центральную ямку географическая атрофия, сухая форма запущенной АМЭ, является результатом атрофии слоя пигментного эпителия сетчатки, расположенного под сетчаткой, что приводит к потере зрения в результате потери фоторецепторов (палочек и колбочек) в центральной области глаза. Хотя для этого состояния отсутствует лечение, Национальным институтом глаза и другими организациями продемонстрировано, что витаминные добавки с высокими дозами антиоксидантов, лютеином и зеаксантином замедляют развитие сухой формы дегенерации желтого пятна у некоторых пациентов, улучшая визуальную активность.

Ретинит пигментный (ИР) представляет собой группу генетических состояний глаза. При прогрессировании симптомов ИР, как правило, ночная слепота предшествует туннельному зрению в течение ряда лет или даже десятилетий. Многие люди с ИР не становятся формально слепыми до 40 или 50 лет и сохраняют некоторое зрение в течение всей жизни. У других в результате ИР развивается полная слепота, в некоторых случаях даже уже в детстве. Развитие ИР в каждом случае является различным. ИР является типом наследственной дистрофии сетчатки, т.е. относится к группе наследственных нарушений, при которых аномалии фоторецепторов (палочки и колбочки) или ретинального пигментного эпителия (ИРЕ) сетчатки приводит к прогрессирующей потере зрения. Пораженные индивидуумы сначала страдают нарушенной адаптацией к темноте или никталопией (куриная (ночная) слепота), затем снижением периферического поля зрения (так называемым туннельным зрением) и иногда позднее в процессе развития болезни снижением центрального зрения.

Макулярный отек (отек желтого пятна) имеет место, когда жидкость и белковые отложения собираются на макуле или под макулой глаза, центральной областью желтого цвета сетчатки, вызывая утолщение и набухание. Набухание может искажать центральное зрение человека, поскольку желтое пятно находится вблизи центра сетчатки на задней стенке глазного яблока. Эта область содержит плотно упакованные колбочки, что обеспечивает острое, ясное центральное зрение, позволяющее человеку видеть форму, цвет и детали, которые находятся непосредственно на линии взгляда. Цистоидный макулярный отек является типом макулярного отека, который включает образование цист.

Комбинированные терапии: Биспецифическое антитело или фармацевтическую композицию, можно применять индивидуально (без дополнительного терапевтического средства) для лечения одного или несколько глазных заболеваний, указанных в настоящем описании.

Биспецифическое антитело или фармацевтическую композицию можно применять в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами или методами для лечения одного или несколько глазных заболеваний, указанных в настоящем описании.

А значит, биспецифическое антитело или фармацевтическую композицию можно приготовить в сочетании с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами и применять для лечения одного или несколько глазных заболеваний, указанных в настоящем описании.

Комбинированные терапии, представленные в настоящем описании, предусматривают введение биспецифического антитела или фармацевтической композиции последовательно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами для лечения одного или несколько глазных заболеваний, указанных в настоящем описании.

Дополнительные терапевтические средства включают (но, не ограничиваясь только ими) триптофанил-тРНК-синтетазу (ТгрКБ), Еуе001 (пэгилированный анти-УЕСЕ аптамер), скваламин, ИЕТААЯЕ™

- 14 032192 (анекортава ацетат в виде депо-суспензии; фирма А1соп, 1пс.), пролекарство комбретастатина А4 (СА4Р), МΑСυСΕN™, Μ^ΕΡ^ΕΝ™ (мифепристон-ги486), субтенон, триамцинолона ацетонид, интравитреальный кристаллический триамцинолона ацетонид, приномастат (АС3340-синтетический ингибитор матричных металлопротеиназ, фирма РПхег), флуцинолона ацетонид (включая внутриглазной имплантат флуцинолона, фирма ВаизсЬ & БотЬ/Соп!го1 Оейуегу Зуз1етз), ингибиторы УЕСЕК (фирма Зидеп), VΕСΕ-Τ^ар (фирма Кедепегоп/Ауепйз), ингибиторы тирозинкиназного рецептора УЕСЕ, такие как 4-(4бром-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ΖΌ6474), 4-(4-фтор-2метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3 -пирролидин-1 -илпропокси)хиназолин (ΑΖ^2171), ваталаниб (РТК787) и ЗШ 1248 (сунитиниб), линомид и ингибиторы функции интегрина бета-3, и ангиостатин.

Другие фармацевтические терапии, которые можно применять в сочетании с биспецифическим антителом или фармацевтической композицией включают (но, не ограничиваясь только ими), νίδυΌΥΝΕ™, применяемый вместе с нетермическим лазером, РКС 412, эндовион (фирма №игоЗеагсЬ А/З), нейротрофические факторы, включая в качестве примера глиальный нейротрофический фактор и цилиарный нейротрофический фактор, диатазем, дорзоламид, фототроп (РЬо1ойор), 9-цис-ретиналь, глазные лекарственные средства (включая эхо-терапию (Ес1ю ТЬегару), включая фосфолина йодид или эхотиофат, или ингибиторы угольной ангидразы, ΑΕ-941 (фирма ΑΕΐета БаЬога1опез, 1пс.), З1та-027 (фирма З1гпа ТЬегареийсз, 1пс.), пегаптаниб (фирма №Хз1аг РЬагтасеийса1з/С11еаб Заепсез), нейротрофины (включая только в качестве примера, ΝΤ-4/5, фирма Сепеп!есЬ), Сапб5 (фирма Асийу РЬагтасеийса1з), ΙΝ8-37217 (фирма 1пзрйе РЬагтасеийса1з), антагонисты интегрина (включая препараты фирм Лег1п1 АС и АЬЬоН БаЬога1опез), ΕΟ-3306 (фирма Агк ТЬегареийсз Б1б.), ΒΌΜ-Ε (фирма ВюО1ет Ыб.), талидомид (применяемый, например, фирмой Εηί^еΜеб, 1пс.), кардиотрофин-1 (фирма Сепеп!есЬ), 2метоксиэстрадиол (фирма А11егдап/Оси1ех), ОБ-8234 (фирма Тогау 1пби81г1ез), ЭТС-200 (фирма №иго1есЬ), тетратиомолибдат (Мичиганский Университет (Бшуегзбу ок МюЫдап)), ΕΥΝ-002 (фирма Бупкеиз Вю1есЬ), соединение из микроводорослей (фирма АдиазеагсЬ/А1Ьапу, Мега РЬагтасеийса1з), Ό9120 (фирма СеШеск Сгоир рю), АТХ-З10 (Натата1зи РЬокшсз), ТСЕ-бета 2 (фирма Сепхуте/СеИпх), ингибиторы тирозинкиназ (фирмы А11егдап, 8υСΕN, РПхег), ΝΧ-278-Ь (фирма №Хз1аг РЬагтасеийса1з/С11еаб Заепсез), Ор1-24 (фирма ОРТ1З Егапсе ЗА), нейропротекторы ганглиев клеток сетчатки (фирма СодегИ №игозаепсез), Ν-нитропиразольные производные (фирма Техаз А&М Бшуегзбу Зуз!ет), КР102 (фирма Кгепбзку РЬагтасеийса1з), циклоспорин А, ограниченную транслокацию сетчатки, фотодинамическую терапию (РОТ) (включая (только в качестве примера) рецепторнаправленную РОТ, фирма Впз1о1-Муегз ЗдшЬЬ, Со.; порфимер натрия для инъекции совместно с РОТ; вертепорфин, фирма ОБТ 1пс.; ростапорфин, применяемый совместно с РОТ, фирма Мпауеп! Мебюа1 Тес11по1ощез; талапорфин натрия применяемый совместно с РОТ, фирма №рроп Ре!го1еит; мотексафин лютеция, фирма РЬагтасусНсз, 1пс.), антисмысловые олигонуклеотиды (включая только в качестве примера, продукты, протестированные фирмой №уада1| РЬагта ЗА и 1313-13650, фирма 1з1з РЬагтасеийса1з), лазерную фотокоагуляцию, обработку друз лазером, хирургию макулярных разрывов сетчатки, хирургическую транслокацию макулы, имплантируемые миниатюрные телескопы, ангиографию РЫ-движения (известную также как микролазерная терапия или ангиография фидерных сосудов), бомбардировку протонным пучком, микростимулирующую терапию, хирургию по поводу отслоения сетчатки и операцию на стекловидном теле, операцию вдавливания сферы, операцию в субмакулярной области, транспупиллярную термотерапию, терапию фотосистемы I, применение РНК-интерференции (РНК1), экстракорпоральный реоферез (известный также как мембранная дифференциальная фильтрация и реотерапия), имплантацию микрочипов, терапию стволовыми клетками, генную заместительную терапию, генную терапию на основе рибозимов (включая генную терапию с использованием элемента ответа на гипоксию, фирмы ОхБогб Вютебюа; Бепйрак, Сепейх; генная терапия Ρ^ΕΕ, фирма Сеп Уес), трансплантацию фоторецепторных/ретинальных клеток (включая трансплантируемые эпителиальные клетки сетчатки, фирма О1аспп, 1пс.; трансплантат клеток сетчатки, фирма Се11 Сепезуз, 1пс.) и акупунктуру.

Любое антиангиогенное средство можно применять в сочетании с биспецифическим антителом или фармацевтической композиций, включая (но, не ограничиваясь только ими) указанные у Сагтейе! и ба1п, №11иге 407, 2000, с. 249-257. Антиангиогенное средства могут представлять собой другой антагонист УЕСЕ или антагонист рецептора УЕСЕ, такой как варианты УЕСЕ, фрагменты растворимого рецептора УЕСЕ, аптамеры, обладающие способностью блокировать УЕСЕ или УЕСЕК, нейтрализующие антитела к УЕСЕК, низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VΕСΕК и любые их комбинации, и они включают анти-VΕСΕ аптамеры (например, пегаптаниб), растворимые рекомбинантные рецепторы-ловушки (например, УЕСЕ Тгар). Антиангиогенное средство может также включать кортикостероиды, ангиостатические стероиды, анекортава ацетат, ангиостатин, эндостатин, малые интерферирующие РНК, снижающие экспрессию УЕСЕК или лиганда УЕСЕ, средства пост-УЕСЕК-блокады на основе ингибиторов тирозинкиназ, ингибиторы ММР, 1СЕВР3, блокаторы ЗОЕ-1, ΡΕ^Ε, гамма-секретазу, дельта-подобный лиганд 4, антагонисты интегрина, блокатор Н1Е-1-альфа, блокатор протеинкиназы СК2 и ингибитор хоминга стволовой клетки (т.е. клетки-предшественника эндотелиальных клеток) к области неоваскуляризации с использованием эндотелиального кадхерина (СО-144) и антител к стромальному фактору (ЗОЕ)I. Можно применять также низкомолекулярные ингибиторы КТК, мишенью которых являются УЕСЕ

- 15 032192 рецепторы, включая РТК787. Можно применять также агенты, обладающие активностью в отношении неоваскуляризации, которые не обязательно представляют собой анти-VΕСΡ-соединения. и они включают противовоспалительные лекарственные средства, ингибиторы т-Тог, рапамицин, эверолимус, темсиролимус, циклоспон, анти-'Т№-агенты, агенты, мишенью которых является комплемент, и нестероидные противовоспалительные средства. Можно применять также агенты, обладающие нейрозащитным действием, и которые могут потенциально снижать развитие сухой формы дегенерации желтого пятна, например, класс лекарственных средств, называемых нейростероидами. Они включают такие лекарственные средства, как дегидроэпиандростерон (ИНЕА) (товарные знаки: Ргайега® и Р1бе1ш®), дегидроэпиандростерона сульфат и прегненолона сульфат. Любое предназначенное для лечения АМИ (возрастная дегенерация желтого пятна) терапевтическое средство можно применять в сочетании с биспецифическим антителом или фармацевтической композицией, предлагаемым/предлагаемой в изобретении, включая (но, не ограничиваясь только ими) вертепорфин в сочетании с РОТ, пегаптаниб натрия, цинк или антиоксидант(ы), индивидуально или в любой комбинации.

Понятия индивидуум и пациент применяют взаимозаменяемо, и они относятся к млекопитающим, таким как больные люди и приматы кроме человека, а также к экспериментальным животным, таким как кролики, крысы и мыши, а также другие животные. Животные включают всех позвоночных животных, например, млекопитающих и животных, не относящихся к млекопитающим, таким как собаки, кошки, овцы, свиньи, кролики, куры и т. д. Предпочтительными индивидуумами для воплощения на практике терапевтических способов являются люди. Индивидуумы, которые нуждаются в лечении, включают пациентов, которые уже страдают глазным заболеванием или нарушением, а также предрасположенных к развитию нарушения.

В контексте настоящего описания понятия клетка, клеточная линия и клеточная культура используются взаимозаменяемо, и они все включают потомство. Так, понятия трансформанты и трансформированные клетки включают первично трансформированную клетку и выведенные из нее культуры безотносительно к количеству пересевов. Следует понимать также, что потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за произвольных или преднамеренных мутаций. Под объем изобретения подпадает вариант потомства, который обладает такой же функцией или биологической активностью, которая обнаружена в результате скрининга у исходной трансформированной клетки. В тех случаях, когда следует применять другие обозначения, это должно быть очевидно из контекста.

В контексте настоящего описания понятие трансформация относится к процессу переноса векторов/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Если в качестве клеток-хозяев применяют клетки, оболочки которых не представляют собой труднопреодолимые барьеры, то трансфекцию осуществляют, например, методом, основанным на осаждении фосфатом кальция, описанным у СгаНат и Vаи бег ЕЬ, ^го1о§у 52, 197З, с. 546-567. Однако можно применять также и другие методы интродукции ДНК в клетки, такие как инъекция в ядра или слияние протопластов. Если используют прокариотические клетки или клетки, имеющие значительные клеточные оболочки, то в качестве метода трансфекции можно применять обработку кальцием с использованием хлорида кальция, описанную у СоНеи 8.К и др., РNΑ8 69, 1972, с. 2110-2114.

В контексте настоящего описания понятие экспрессия относится к процессу, посредством которого осуществляется транскрипция нуклеиновой кислоты в мРНК, и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК (которую называют также транскриптом) впоследствии транслируется с образованием пептидов, полипептидов или белков. Транскрипты и кодируемые полипептиды в целом называют генным продуктом. Если полинуклеотид выводят из геномной ДНК, то экспрессия в эукариотической клетке может включать сплайсинг мРНК.

Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в частности самореплицирующуюся молекулу, которая переносит встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и/или между клетками-хозяевами. Понятие включает векторы, функция которых состоит, прежде всего, во встраивании ДНК или РНК в клетку (например, хромосомная интеграция), репликационные векторы, функция которых состоит прежде всего в репликации ДНК или РНК, и в экспрессионные векторы, функция которых состоит прежде всего в транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Под понятие подпадают также векторы, которые обладают несколькими указанными функциями.

Экспрессионный вектор представляет собой полинуклеотид, который при интродукции в соответствующую клетку-хозяина может транскрибироваться и транслироваться в полипептид. Понятие экспрессионная система относится, как правило, к приемлемой клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, функцией которой может быть выход требуемого продукта экспрессии.

Следующие примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, полный объем которого представлен в приведенной ниже формуле изобретения. Очевидно, что в изложенных процедурах могут быть сделаны модификации без отклонения от сущности изобретения.

- 16 032192

Описание перечня последовательностей (аминокислотные последовательности)

8ЕО Ш N0:	1	СОКЗН тяжелой цепи, <УЕСР> ранибизумаб
8Е0 Ш N0:	2	СОК2Н тяжелой цепи, <УЕСР> ранибизумаб
8Е0 Ш N0:	3	СОК1Н тяжелой цепи, <УЕСР> ранибизумаб
ЗЕО Ш ΝΟ:	4	СОКЗЬ легкой цепи, <УЕОЕ> ранибизумаб
8Е0 Ш N0:	5	СОК2Ь легкой цепи, <УЕСР> ранибизумаб
8Е0 Ш N0:	6	СОК1Ь легкой цепи, <УЕСР> ранибизумаб
8Е0 Ш N0:	7	вариабельный домен тяжелой цепи УН, <УЕСР> ранибизумаб
8Е0 Ш N0:	8	вариабельный домен легкой цепи УЬ, <УЕСР> ранибизумаб
8Е0 Ш N0:	9	СОКЗН тяжелой цепи, <ΑΝΟ-2> вариант Αη§2ί ЬСЮ
8Е0 Ш N0:	10	СОК2Н тяжелой цепи, <ΑΝΟ-2> вариант Аиц21 ЬСЮ 1
8Е0 Ш N0:	11	СОК1Н тяжелой цепи, <ΑΝΟ-2> вариант Αη§2ί ЬСЮ

8Е0 Ш N0:	12	СОКЗЬ легкой цепи, <ΑΝΘ-2> вариант Αη§2ί ЬСЮ
8Е0 Ш N0:	13	СОК2Ь легкой цепи, <ΑΝΘ-2> вариант Аиц21 ЬСЮ,
8Е0 Ш N0:	14	СОК1Ь легкой цепи, <ΑΝΘ-2> вариант Аиц21 ЬСЮ
8Е0 Ш N0:	15	вариабельный домен тяжелой цепи УН, <ΑΝ0-2> вариант Αη§2ί ЬСЮ
8Е0 Ш N0:	16	вариабельный домен легкой цепи УЬ, <ΑΝ0-2> вариантΑη§2ί ЬСЮ
8Е0 Ш N0:	17	человеческий сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕСЕ); последовательность-предшественник человеческого УЕСЕ165
8Е0 Ш N0:	18	человеческий ангиопоэтин-2 (ΑΝ0-2)
8Е0 Ш N0:	19	человеческий ангиопоэтин-1 (ΑΝ0-1)
8Е0 Ш N0:	20	человеческий Ые-2-рецептор
8Е0 Ш N0	21	тяжелая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС1 с ААА-мутациями (УЕСРаиц2-0012)
8Е0 Ш N0	22	тяжелая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС1 с ААА-мутациями (УЕСРаиц2-0012)
8Е0 Ш N0	23	легкая цепь 1 <УЕ6Е-АКГС-2> СгоккМАЬ 1дС1 с ААА-мутациями (УЕСРаид2-0012)
8Е0 Ш N0	24	легкая цепь 2 <УЕ6Е-АКГС-2> СгоккМАЬ 1дС1 с ААА-мутациями (УЕСР-Аид2-0012)
8Е0 Ш N0:	25	тяжелая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС1 с ААА-мутациями и Р329С ЬАЬА-мутациями (УЕСРаид2-0016)
8Е0 Ш N0:	26	тяжелая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1§С1 с ААА-мутациями и Р329С ЬАЬА-мутациями (УЕСРаид2-0016)
8Е0 Ш N0:	27	легкая цепь 1 <УЕ6Р-АКГС-2> СгоккМАЬ 1дС1 с ААА-мутациями и Р329С ЬАЬА-мутациями (УЕСРаиц2-0016)
8Е0 Ш N0:	28	легкая цепь 2 <УЕ6Р-АКГС-2> СгоккМАЬ 1дС1 с ААА-мутациями и Р329С ЬАЬА-мутациями (УЕСРаиц2-0016)
8Е0 Ш N0:	29	тяжелая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями
8Е0 Ш N0:	30	тяжелая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями
8Е0 Ш N0:	31	легкая цепь 1 <УЕ6Р-АКГС-2> СгоккМАЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями
8Е0 Ш N0:	32	легкая цепь 2 <УЕ6Р-АКГС-2> СгоккМАЬ 1§64 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями
8Е0 Ш N0:	33	тяжелая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> ОАксРаЬ 1§С1 с ААА-мутациями
8Е0 Ш N0:	34	тяжелая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> ОАксРаЬ 1дС1 с ААА-мутациями
8Е0 Ш N0:	35	легкая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> ОАксРаЬ 1цС1 с ААА-мутациями
8Е0 Ш N0:	36	тяжелая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> ОАксРаЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями
8Е0 Ш N0:	37	тяжелая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> ОАксРаЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями
8Е0 Ш N0:	38	легкая цепь 1 <УЕ6Р-АКГС-2> ОАксРаЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями
8Е0 Ш N0:	39	тяжелая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС1 дикого типа (без ААА-мутаций) (УЕСРаид2-0201)
8Е0 Ш N0:	40	тяжелая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС1 дикого типа (без ААА-мутаций) (УЕСРаид2-0201)
8Е0 Ш N0:	41	легкая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС1 дикого типа (без ААА-мутаций) (УЕСРаид2-0201)
8Е0 Ш N0:	42	легкая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1дС1 дикого типа (без ААА-мутаций) (УЕСРаид2-0201)
8Е0 Ш N0:	43	тяжелая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоккМАЬ 1§С1 только с Р329С ЬАЬА-мутациями (без ААА-мутаций) (УЕСРаид2-0015)

8Е0 Ш N0:	44	тяжелая цепь 2 <νΕ6Ρ-ΑΝ6-2> СгоззМАЬ 1§01 только с Р329С ЬАЬА-мутациями (без ААА-мутаций) (УЕСРаид2-0015)
8Е0 Ш ΝΟ:	45	легкая цепь 1 <νΕ6Ρ-ΑΝΟ-2> СгоккМАЬ 1дС1 только с Р329С ЬАЬА-мутациями (без ААА-мутаций) (УЕСРаиц2-0015)
8Е0 Ш N0:	46	легкая цепь 2 <νΕ6Ρ-ΑΝ6-2> СгокзМАЬ 1§С1 только с Р3296 ЬАЬА-мутациями (без ААА-мутаций) (УЕ6Рапд2-0015)
8Е0 Ш ΝΟ:	47	константная область легкой каппа-цепи
8Е0 Ш ΝΟ:	48	константная область легкой лямбда-цепи
8Е0 Ш ΝΟ:	49	константная область тяжелой цепи, выведенная из человеческого 1дС1
8Е0 Ш N0:	50	константная область тяжелой цепи, выведенная из человеческого 1дС4

- 17 032192

Экспериментальные процедуры

Таблица 1. Биспецифические антитела и соответствующие им последовательности

Описание	Сокращенное обозначение	Последовательности
<νΕ6Ε-ΑΝ6-2> СгойкМАЬ 1§61 с ААА-мутациями	УЕ6Еаид2-0012	8Е0 Ш ΝΟ: 21, 8Е0 Ш ΝΟ: 22, 8Е0 Ш ΝΟ: 23, 8Е0 Ш N0: 24
<νΕ6Ε-ΑΝ6-2> СгоййМАЬ 1§61 дикого типа (без ААА-мутаций)	УЕОЕаи§2-0201-	8Е0 Ш N0: 39, 8Е0 Ш N0: 40, 8Е0 Ш N0: 41, 8Е0 Ш N0: 42
<νΕ6Ε-ΑΝ6-2> СгоййМАЬ 1§61 с ААА-мутациями и Р329С ЬАЕАмутациями	УЕСЕаид2-0016	8Е0 Ш N0: 25, 8Е0 Ш N0: 26, 8Е0 Ш N0: 27, 8Е0 Ш N0: 28
<νΕ6Ε-ΑΝ6-2> СгоййМАЬ 1§61 только с Р329С ЬАЬА-мутациями (без ААА-мутаций)	УЕСЕаид2-0015	8Е0 Ш N0: 43, 8Е0 Ш N0: 44, 8Е0 Ш N0: 45, 8Е0 Ш N0: 46
<νΕ6Ε-ΑΝ6-2> СгоййМАЬ 1д64 с ААА-мутациями и с 8РЬЕ-мутациями	--	8Е0 Ш N0: 29, 8Е0 Ш N0: 30, 8Е0 Ш N0: 31, 8Е0 Ш N0: 32
<νΕ6Γ-ΑΝ6-2> ОАксРаЬ 1§61 с АААмутациями	-	8Е0 Ш N0: 33, 8Е0 Ш N0: 34, 8Е0 Ш N0: 35
<νΕ6Ε-ΑΝ6-2> ОАксЕаЬ 1§64 с АААмутациями и с 8РЬЕ-мутациями	-	8Е0 Ш N0: 36, 8Е0 Ш N0: 37, 8Е0 Ш N0: 38

Следует иметь в виду, что в контексте настоящего описания понятие с ААА-мутациями относится к мутациям Г253А (Пе253А1а), Н310А (Н1з310А1а) и Н435А (Н1з435А1а) в константной области тяжелой цепи ΙβΟί или 1дО4 (нумерация согласно Еи-индексу Кэбота), понятие с Р329О ЬАЕА-мутациями в контексте настоящего описания относится к мутациям Ь234А (Ьеи235А1а), Ь235А (Ьеи234А1а) и Р329О (Рго329О1у) в константной области тяжелой цепи Ι§Ο1-подкласса (нумерация согласно Еи-индексу Кэбота), а понятие с ЗРБЕ-мутациями в контексте настоящего описания относится к мутациям 8228Р (8ег228Рго) и Б235Е (Беи235О1и) в константной области тяжелой цепи ^ОД-подкласса (нумерация согласно Еи-индексу Кэбота).

Примеры

Материалы и общие методы

Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у КаЬа! Е.А. и др., 8ециепсез о£ Рго1етз о£ 1ттнпо1оц1са1 ΙηΙ^ϊΌδΐ, 5-ое изд., изд-во РиЬЕс Неа11Е 8егу1се, Жиопа1 ЫзЕ^ез о£ НеаШъ ВеШезба, МИ, 1991. Аминокислоты цепей антитела пронумерованы и обозначены согласно ЕИ-нумерации (Ебе1тап О.М. и др., Ргос. ЖЕ. Асаб. 8с£ и8А 63, 1969, с. 78-85; КаЬа! Е.А. и др., 8ециепсез о£ Рго1етз о£ 1ттнпо1оц1са1 1п1егез1, 5-ое изд., изд-во РиЬЕс НеаЙЕ 8егу1се, Жиопа1 ЫзЕ^ез о£ Неа11й, Ве1йезба, ΜΏ, 1991.

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК применяли стандартные методы, описанные у 8атЬгоок б. и др., Мо1еси1аг С1оптц: А 1аЬога1огу тапиа1; изд-во Со1б 8ргтд НагЬог БаЬогабогу Ргезз, Со1б 8ргтд НагЬог, Ж\\ Уогк, 1989. Все применяемые в молекулярной биологии реагенты применяли согласно инструкциям производителей.

Синтез генов

Требуемые сегменты генов заказывали в соответствии с представленными спецификациями на фирме Оепеаг! (Регенсбург, Германия).

Определение последовательности ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования двух цепей, которое осуществляли на фирме Меб1Оепот1х ОтЬН (Мартинсрид, Германия) или 8ершзегуе ОтЬН (Фатерштеттен, Германия).

Анализ последовательностей ДНК и белков и оценка данных о последовательностях

Для создания, картирования, анализа, аннотации и иллюстрации последовательностей применяли пакет программ фирмы ОСО (ОепеЕсз Сотри1ег Огоир, Мэдисон, шт. Висконсин), версия 10.2 и усовершенствованный набор программ 1пГота\'з Уес1ог N11, версия 8.0.

Экспрессионные векторы

Для экспрессии описанных антител применяли варианты экспрессионных плазмид для кратковременной экспрессии в клетках (например, в НЕК293-Е-клетках), основанных либо на кДНК-организации с интроном А промотора СМУ или без него, либо на геномной организации с промотором СМУ. Помимо кассеты экспрессии антитела векторы включали:

сайт инициации репликации, который обеспечивает репликацию этой плазмиды в Е. соЕ, ген β-лактамазы, который придает устойчивость Е. соЕ к ампициллину, и ген дигидрофолатредуктазы из Миз тизси1из в качестве селектируемого маркера в эукариотических клетках.

Транскрипционная единица гена антитела состояла из следующих элементов:

- 18 032192 уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 5'-конце, немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса, расположенная за ней последовательность интрона А в случае организации на основе кДНК,

5'-нетранслируемая область гена человеческого антитела, сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, цепь человеческого антитела (дикого типа или с заменой доменов) либо с организацией на основе кДНК, либо с геномной организацией с экзон-интронной организацией иммуноглобулина,

З'-нетранслируемая область с последовательностью сигнала полиаденилирования и уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на З'-конце.

Слитые гены, содержащие цепи антитела, описанные ниже, создавали с помощью ПЦР и/или синтеза генов и собирали с помощью известных методов и технологий рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций получали большие количества плазмид путем получения плазмид из трансформированных культур Е. той (фирма Nис1еοЬοηά АХ, фирма Масйегеу№де1).

Методики культивирования клеток

Применяли стандартные методики культивирования клеток, описанные в Синей РюЮ^Ь ίη Се11 Вюкду, под ред. Βοηίίηάηο 1.8., Ωηδδο М., Наййгй ί.Β., ^^рр^ηсοи-8с11\νа^ιζ. ί. и Уатайа К.М, изд-во ίοΐιη ^11еу & δοηκ, 1пс, 2000.

Биспецифические антитела экспрессировали путем кратковременной котрансфекции соответствующими плазмидами экспрессии клеток НЕК29-Т, выращенных в суспензии, согласно описанному ниже методу.

Пример 1. Экспрессия и очистка.

Кратковременные трансфекции в НЕК29З-Т-системе.

Биспецифические антитела создавали путем кратковременной трансфекции с помощью соответствующих плазмид (например, кодирующих тяжелую цепь и модифицированную тяжелую цепь, а также соответствующую легкую цепь и модифицированную легкую цепь), используя НЕК29З-Т-систему (фирма ΙηνΟτο^η), согласно инструкции производителя. В целом, метод состоял в следующем: клетки НЕК29З-Т (фирма Ιηνίίτο^οη), растущие в суспензии либо во встряхиваемой колбе, либо в ферментере с перемешивающим устройством в бессывороточной среде для экспрессии Тгее81у1е™ 29З (фирма ΙηνίΐΓοдеи), трансфектировали смесью из четырех экспрессионных плазмид и 293ίесί^η™ или фектина (фирма ΙηνίΙΐΌβοη). В 2-литровую встряхиваемую колбу (фирма Οοτηιηβ) НЕК29З-Т-клетки высевали с плотностью 1,0* 10⁶ клеток/мл в 600 мл и инкубировали при 120 об/мин, 8% СО₂. Через день клетки трансфектировали при клеточной плотности примерно 1,5*10 клеток/мл, используя примерно 42 мл смеси, содержащей А) 20 мл среды Орй-МЕМ (фирма ΙηνίΙΐΌβοη) с 600 мкг общей плазмидной ДНК (1 мкг/мл), кодирующей тяжелую или модифицированную тяжелую цепь соответственно, и соответствующую легкую цепь в эквимолярном соотношении, и Б) 20 мл Орй-МЕМ + 1,2 мл 293ίесί^η™ или фектина (2 мкл/мл). В зависимости от поглощения глюкозы в процессе ферментации добавляли раствор глюкозы. Супернатант, содержащий секретированное антитело, собирали через 5-10 дней и антитела либо очищали непосредственно из супернатанта или супернатант замораживали и помещали на хранение.

Очистка.

Биспецифические антитела очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии, используя МаЬ8е1ес18иге-8ер11аго5е (для не ААА-мутантов) (фирма СЕ НеаЙЪсаге, Швеция) или карра8е1есйагарозу (для ААА-мутантов) (фирма СЕ Неаййсаге, Швеция), хроматографии гидрофобных взаимодействий с использованием бутил-сефарозы (фирма СЕ Неаййсаге, Швеция), и гельфильтрации на смоле супердекс 200 (фирма СЕ НеаЙЪсаге, Швеция).

В целом, метод состоял в следующем: полученные после стерилизации фильтрацией супернатанты клеточных культур захватывали с помощью смолы МаЬ8е1ес1 8иВе, уравновешенной ЗФР-буфером (10мМ №₂НРО₄, 1мМ КН₂РО₄, 1З7 мМ №1С1 и 2,7 мМ КС1, рН 7,4), промывали буфером для уравновешивания и элюировали 25мМ цитратом натрия, рН З,0. ААА-мутанты захватывали с помощью смолы карра8е1ес1, уравновешенной 25 мМ Трис, 50мМ №С1, рН 7,2, отмывали буфером для уравновешивания и элюировали 25 мМ цитратом натрия, рН 2,9. Элюированные белковые фракции объединяли и нейтрализовали 2М Трис, рН 9,0. Пулы антител подготавливали для хроматографии гидрофобных взаимодействий, добавляя 1,6М раствор сульфата аммония до конечной концентрации 0,8М сульфат аммония и значение рН доводили до 5,0 с помощью уксусной кислоты. После уравновешивания бутил-сефарозной смолы З5 мМ ацетатом натрия, 0,8М сульфата аммония, рН 5,0 антитела наносили на смолу, промывали буфером для уравновешивания и элюировали линейным градиентом до З5 мМ ацетата натрия, рН 5,0. Фракции, содержащие биспецифическое антитело, объединяли и дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации, используя колонку, заполненную смолой супердекс 200 26/60 СЬ (фирма СЕ НеаИйсаге, Швеция), уравновешенную 20 мМ гистидином, 140мМ №С1, рН 6,0. Фракции, содержащие биспецифическое антитело, объединяли, концентрировали до требуемой концентрации, используя уст

- 19 032192 ройства для ультрафильтрации У1уакрш (фирма 8айогшк 81еФт Вю1есй 8.А., Франция), и хранили при 80°С.

Таблица 2. Выходы биспецифических антител <УЕСЕ-АNС-2>

	УЕ6Рап§2-0015 (без ААА-мутации)	УЕ6Рап§2-0016 (с АААмутацией)
титр супернатанта	64 мкг/мл, (2 л соответствует 128 мг)	п.а. (масштаб 2 л)
белок А (МаЬ8е1ес18иге)	118 мг (~ 70% мономера)	п.а.

Карра8е1ес1	п.а.	117 мг (~ 83% мономера)
бутил-сефароза	60 мг	57 мг
8ЕС (гель-фильтрация)	35 мг (>95% мономера)	38 мг (>95% мономера)

Чистоту и целостность антитела анализировали после стадии очистки с помощью капиллярного электрофореза в присутствии ДСН (КЭ-ДСН), используя технологию микропотоков йаЪсЫр (фирма Са11рег ЕИ’е 8с1епсе, США). 5 мкл белкового раствора подготавливали для КЭ-ДСН-анализа, используя набор НТ Рго1еш Ехргекк Иеадеп! согласно инструкциям производителя, и анализировали с помощью системы йаЪСЫр 0X4, используя чип НТ Рго1еш Ехргекк. Данные анализировали с помощью программы йаЪСЫр СХ.

Таблица 3. Удаление типичных побочных продуктов с помощью различных последовательных стадий очистки по данным КЭ-ДСН

Стадия очистки		УЕОРаи§2-0015			УЕОЕаи§2-0016
	% площади пика *	анализ: КЭ-ДСН (СаНрег ЦаЬсЫр ОХП)
	МАт	% Ат	(НС)2	Уг Ат	(ЬС)2	БС	МАт	% Ат	(НС)2	Уг Ат	(БС) 2	БС
МаЬ 8е1ес4 Зиге	55,7	19	10,6	9,8	3,5	0,9
Карра 8е1ес4	-	63	13,4	3,5	6,1	5,8	7,4
бутил-сефароза	81,4	1,9	2,3	8,2	3,6	1,8	76,2	1,3	0,7	8,3	7,7	5,8
Супердекс 200 8ЕС	92,4	1,8	2,6	1,4	0,5	0,5	99	1Д	п.а.	п.а.	п.а.	п.а.

Содержание агрегатов в образцах антител анализировали с помощью высокоэффективной 8ЕС на аналитической колонке для гель-фильтрации, заполненной супердексом 200 (фирма СЕ Неаййсаге, Швеция), применяя 2>ЗФР (20мМ \а₂11Р0.|, 2 мМ КН₂Р0₄, 274 мМ \аС1 и 5,4 мМ КС1, рН 7,4) в качестве подвижного буфера, при 25°С. 25 мкг белка инъецировали в колонку со скоростью потока 0,75 мл/мин и подвергали изократическому элюированию в течение 50 мин.

Аналогично этому получали и очищали биспецифические антитела <УЕСЕ-АNС-2> УЕСЕапд20012 и УЕСЕапд2-0201, достигая следующих выходов:

	УЕСгГапд2-0012 (с ААА-мутацией )	УЕСгРап§2-0201 (без ААА-мутации)
титр/количество	-	36 мкг/мл/72 мг
масштаб	2,1 л	2 л
белок А (МаЪ8е1ес18иге)	-	66 мг (содержание мономеров ~95%)

карра8е1ес!	43 мг (содержание мономеров ~ 65%)	-
бутил-сефароза	-	45 мг
8ЕС	14 мг	21 мг (содержание мономеров > 98%)
выход на гидроксилапатите	8,5 мг (содержание мономеров > 98%)
общий выход (извлечение)	8,5 мг (20%)	21 мг (30%)

Биспецифические антитела<УЕСЕ-АNС-2>, такие как <УЕСЕ-АNС-2> СгоккМАЪ 1цС4 с АААмутациями и с 8РЙЕ-мутациями (8Ер ГО N0: 29, 8 ЕС) ГО N0: 30, 8ЕС) ГО N0: 31, 8ЕС) ГО N0: 32), <УЕСтЕ-АЕЮ-2> 0АксЕаЪ ^1 с ААА-мутациями (8Ер ГО N0: 33, 8ЕС) ГО N0: 34, 8ЕС) ГО N0: 35) и <УЕСЕ-АКС-2> 0АксЕаЪ Ιε('ι4 с ААА-мутациями и с 8РЕЕ-мутациями (8ЕР ГО N0: 36, 8ЕС) ГО N0: 37, 8ЕС) 10 N0: 38), также можно получать и очищать аналогичными методами.

Пример 2. Аналитический анализ и возможность обнаружения.

Основанное на 1)Е8 измерение вязкости в лабораторных условиях.

Измерение вязкости осуществляли в целом согласно известному методу (Не Е. и др., Апа1у11са1 Вюсйетщйу 399, 2009, с. 141-143). В целом, метод состоял в следующем: образцы концентрировали до получения различных концентрации белка в 200 мМ сукцинате аргинина, рН 5,5 перед добавлением гранул из полистирольного латекса (диаметром 300 нм) и полисорбата 20 (0,02 об.%). Образцы переносили в

- 20 032192 оптический 384-луночный планшет посредством центрифугирования через 0,4-микрометровую фильтровальную пластину и покрывали парафиновым маслом. Кажущийся диаметр гранул латекса определяли путем динамического рассеяния света при 25 °С. Вязкость раствора можно рассчитывать по формуле η 1(0(111/111,0) (η: вязкость; η0: вязкость воды; ΐϊϊ: кажущийся гидродинамический радиус гранул латекса; 111,0: гидродинамический диаметр гранул латекса в воде.

Для того чтобы можно было осуществлять сравнение различных образцов при одной и той же концентрации, данные о вязкости в зависимости от концентрации аппроксимировали с помощью уравнения Муни (уравнение 1) (Моопеу, Со11оМ Зс1, 1951; Мопкоз, Вюсйет. Вюрйуз. Ас1а, 1997) и осуществляли интерполяцию данных с помощью следующего уравнения:

уравнение 1 (З: параметр гидродинамического взаимодействия белка; К: коэффициент самосжатия; Φ: объем фракции растворенного белка).

Результаты представлены на фиг. 2: установлено, что УЕСТапд2-0016 с ААА-мутациями в Тсобласти обладает более низкой вязкостью при всех температурах, при которых осуществляли измерения, по сравнению с УЕСТапд2-0015 без ААА-мутаций в Тс-области.

Температура начала агрегации по данным 1)1,З.

Образцы приготавливали в концентрации 1 мг/мл в 20 мМ гистидине/хлориде гистидина, 140 мМ №С1, рН 6,0, переносили в оптический 384-луночный планшет посредством центрифугирования через 0,4-микрометровую фильтровальную пластину и покрывали парафиновым маслом. Гидродинамический радиус и в этом случае измеряли с помощью динамического рассеяния света, при этом образцы нагревали со скоростью 0,05°С/мин с 25 до 80°С. Температуру начала агрегации определяли как температуру, при которой гидродинамический радиус начинал возрастать. Результаты представлены на фиг. 3. На фиг. 3 представлены данные об агрегации УЕСТапд2-0015 без ААА-мутаций в сравнении с УЕСТапд2-0016 с ААА-мутациями в Тс-области. Установлено, что для УЕСТапд2-0016 температура начала агрегации составляла 61°С, в то время как у УЕСТапд2-0015 без ААА-мутаций температура начала агрегации составляла 60°С.

ОЬЗ-анализ в зависимости от времени.

Образцы приготавливали в концентрации 1 мг/мл в 20 мМ гистидине/хлориде гистидина, 140 мМ №С1, рН 6,0, переносили в оптический 384-луночный планшет посредством центрифугирования через 0,4-микрометровую фильтровальную пластину и покрывали парафиновым маслом. Гидродинамический радиус и в этом случае измеряли с помощью динамического рассеяния света, при этом образцы выдерживали при постоянной температуре 50°С вплоть до 145 ч. В этом эксперименте тенденция к агрегации нативного неуложенного белка при повышенной температуре может приводить к увеличению среднего диаметра частиц с течением времени. Указанный метод на основе 1)ЕЗ является очень чувствительным в отношении агрегатов, поскольку их образование приводит к сверхпропорциональному изменению интенсивности рассеяния света. Даже после выдерживания в течение 145 ч при 50°С (температура, близкая к температуре начала агрегации) средний диаметр частиц как УЕСТапд2-0015, так и УЕСТапд2-0016 увеличивался менее чем на 0,5 нм.

Хранение в течение 7 дней при 40°С в концентрации 100 мг/мл (повышение уровня НМА).

Образцы концентрировали до конечной концентрации 100 мг/мл в 200 мМ сукцинате аргинина, рН 5,5, стерилизовали фильтрацией и хранили в покое при 40°С в течение 7 дней. До и после хранения определяли содержание высоко- и низкомолекулярных видов (НМV и ΙΑ1\ν соответственно) с помощью гель-фильтрации. Различие в содержании I Ι\1\ν и ЬМА между образцами после хранения и образцами, в которых измерение осуществляли сразу после приготовления, обозначали как повышение 11\1\\' и повышение 1А1\\' соответственно. Результаты, представленные в табл. 4 и на фиг. 4, продемонстрировали, что для УЕСТапд2-0015 (без ААА-мутации) характерно более выраженное снижение основного пика и более выраженное повышение 11М\\' по сравнению с УЕСТ Апд2-0016 (с ААА-мутацией). При создании изобретения неожиданно было установлено, что для УЕСТ Апд2-0016 (с ААА-мутацией) характерна меньшая тенденция к агрегации по сравнению с УЕСТапд2-0015 (без ААА-мутации).

Таблица 4. Изменение основного пика и пиков, соответствующих НМА и ЕМА, после хранения в течение 7д при 40°С

	Изменение площади (%)(40°С-(-80°С))
	Основной пик	ΗΜ\ν	ЕМУУ
УЕОЕапд2-0015 (-ААА-мутации)	-3,56	2,89	0,67
УЕ6Еап§2-0016 (+ААА-мутации)	-1,74	1,49	0,25

Функциональный анализ биспецифических антител к УЕСТ и Аид2 осуществляли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ЗРК), используя устройство В1Асоге® Т100 или Т200 (фирма СЕ Неа11йсаге), при 25°С. Система В1Асоге® хорошо подходит для изучения молекулярных взаимодействий. ЗРК-технология основана на измерении коэффициента преломления вблизи поверхности покрытого золотом биосенсорного чипа. Изменения коэффициента преломления свидетельствуют об изменениях мас

- 21 032192 сы на поверхности, вызываемых взаимодействием иммобилизованного лиганда с анализируемым веществом, инъецируемым в растворе. Масса возрастает, если молекулы связываются с иммобилизованными лигандами на поверхности, и наоборот масса снижается в случае диссоциации анализируемого вещества от иммобилизованного лиганда (отражая диссоциацию комплекса). 8РК позволяет осуществлять непрерывный мониторинг в реальном времени связывания лиганда/анализируемого вещества и таким образом определять константу скорости ассоциации (ка), константу скорости диссоциации (кб) и константу равновесия (КИ).

Пример 3. Связывание с УЕСР, Апд2, Рс гамма К и РсКп.

Оценка кинетики аффинности к изоформам УЕСР, включая оценку видовой перекрестной реактивности.

Примерно 12000 резонансных единиц (КИ) системы для захвата (10 мкг/мл козьего античеловеческого Р(аЬ)'₂; код заказа: 28958325; фирма СЕ НеаИйсаге Вю-8с1епсез АВ, Швеция) сшивали с СМ5чипом (фирма СЕ НеаНйсаге, ВК-1005-30) при рН 5,0, применяя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой СЕ НеаИйсаге. Буфер для системы и образца представлял собой ЗФР-Т (10мМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20), рН 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер. Биспецифическое антитело захватывали путем инъекции 50нМ раствора в течение 30 с при скорости потока 5 мкл/мин. Ассоциацию измеряли путем инъекции человеческого йУЕСР121, мышиного тУЕСР120 или крысиного гУЕСР164 в различных концентрациях в растворе в течение 300 с при скорости потока 30 мкл/мин, начиная с концентрации 300нМ, применяя разведения 1:3. Осуществляли мониторинг фазы диссоциации в течение периода времени вплоть до 1200 с и запускали путем замены раствора образца на подвижный буфер. Поверхность регенерировали путем 60-секундной отмывки с помощью раствора глицина, рН 2, при скорости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, покрытой козьим античеловеческим Р(аЬ')₂. Вычитали также данные, полученные при осуществлении контрольных пустых инъекций (двойной контроль). Для расчета кажущейся величины К_с и других кинетических параметров применяли модель 1:1 Лэнгмюра. Результаты представлены в табл. 5.

Аффинность к Апд2 в растворе, включая оценку видовой перекрестной реактивности.

Оценка аффинности в растворе позволяет измерять аффинность взаимодействия путем определения концентрации свободных взаимодействующих партнеров в уравновешенной смеси. Анализ аффинности в растворе включает смешение биспецифического антитела<УЕСР-АNС-2>, сохраняя его постоянную концентрацию, с лигандом (т. е. Апд2) в различных концентрациях. Максимальное возможное количество резонансных единиц (например, 17000 резонансных единиц (КИ)) антитела иммобилизовали на поверхности СМ5-чипа (фирма СЕ НеаИйсаге, ВК-1005-30) при рН 5,0, используя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой СЕ НеаНйсаге. Буфер для системы и образца представлял собой НВ8-Р, рН 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер. Для получения калибровочной кривой Апд2 в возрастающих концентрациях инъецировали в проточную ячейку устройства В1Асоге, содержащую иммобилизованное биспецифическое антитело к УЕСР-АNС-2. Количество связанного Апд2 оценивали в резонансных единицах (КИ) и строили график зависимости от концентрации. Растворы каждого лиганда (11 концентраций в диапазоне от 0 до 200нм биспецифического антитела к УЕСР-АNС-2) инкубировали с 10нМ Апд2 и давали достигать равновесия при комнатной температуре. Концентрации свободного Апд2 определяли с использованием калибровочной кривой, созданной до и после измерения ответа в растворах с известными количествами Апд2. 4-параметрическую подгонку осуществляли с помощью ХЬЙ4 (программа фирмы ШВ8) с моделью 201, откладывая концентрацию свободного АNС-2 на у-оси и концентрацию ингибирующего антитела на х-оси. Аффинность рассчитывали, определяя точку изгиба этой кривой. Поверхность регенерировали путем однократной отмывки в течение 30 с 0,85%ным раствором Н₃РО₄ при скорости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, покрытой пустым контролем. Результаты представлены в табл. 6.

Аффинность к РсКп в стабильном состоянии.

Для сравнения биспецифических антител друг с другом определяли аффинность к РсКп в стабильном состоянии. Человеческий РсКп разводили в буфере для сочетания (10 мкг/мл №-ацетата, рН 5,0) и иммобилизовывали на С1-чипе (фирма СЕ Неаййсаге, ВК-1005-35), используя процедуру направленной иммобилизации, применяя устройство В1Асоге, до достижения конечного ответа 200 КИ. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и дважды примировали, используя подвижный буфер. Буфер для системы и образца представлял собой ЗФР-Т (10мМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20) рН 6,0. Для исследования каждого антитела применяли различные концентрации 1дС, составляющие 62,5, 125, 250 и 500 нМ. Скорость потока составляла 30 мкл/мин и различные образцы инъецировали последовательно на поверхность чипа, при этом в качестве периода ассоциации был выбран промежуток времени, составляющий 180 с. Поверхность регенерировали путем инъекции ЗФР-Т, рН 8 в течение 60 с при ско

- 22 032192 рости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от пустой поверхности. Вычитали также результаты, полученные при инъекциях буфера (т.е. применяли двойной контроль). Для расчета аффинности в стабильном состоянии применяли метод, входящий в программу В1а-Еуа1иайоп. В целом, метод состоял в следующем: строили график зависимости величины ВИ (ВИ тах) от анализируемых концентраций, получая кривую дозовой зависимости. На основе 2-параметрической подгонки рассчитывали верхнюю асимптоту, что позволяло определять величину ВИ, составляющую половину от максимальной, и таким образом определять аффинность. Результаты представлены на фиг. 5 и в табл. 7. Аналогичным образом определял аффинность к ЕсВп обезьян циномолгус (супо), мышей и кроликов.

Оценка связывания Ес гамма ВШа.

Для измерения аффинности к Ес гамма В111а применяли прямой анализ связывания. Систему для захвата (1 мкг/мл пента-Н15; фирма Ошадеп) (примерно 3000 резонансных единиц (ВИ)) сшивали с СМ5-чипом (фирма СЕ НеаИЕсаге, ВВ-1005-30) при рН 5,0, используя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой СЕ НеаИВсаге. Буфер для системы и образца представлял собой НВ8-Р, рН 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер. Ес гамма ВШа-Н15-рецептор захватывали путем инъекции 100нМ раствора в течение б0 с при скорости потока 5 мкл/мин. Связывание оценивали путем инъекции 100нМ биспецифического антитела или моноспецифических контрольных антител (анти-Э1д для антитела 1дС1-подкласса и 1дС4-подкласса) в течение 180 с при скорости потока 30 мкл/мин. Поверхность регенерировали путем отмывки в течение 120 с раствором глицина, рН 2,5 при скорости потока 30 мкл/мин. Поскольку связывание Ес гамма В111а отличается от модели связывания 1:1 Лэнгмюра, в этом анализе определяли только наличие связывания/отсутствие связывания. Аналогичным образом можно определять связывание Ес гамма В1а и Ес гамма В11а. Из результатов, представленных на фиг. 6, следует, что после интродукции мутаций Р329С ЬАЬА не удалось обнаружить связывание с Ес гамма В111а.

Оценка независимого связывания УЕСЕ и Апд2 с биспецифическими антителами<VЕСЕ-АNС-2>.

Примерно 3500 резонансных единиц (ВИ) системы для захвата (10 мкг/мл козьего античеловеческого 1дС; фирма СЕ НеаИЕсаге В1о-8с1епсек АВ, Швеция) сшивали с СМ4-чипом (фирма СЕ НеаИЕсаге ВВ-1005-34) при рН 5,0, используя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой СЕ НеаИЕсаге. Буфер для системы и образца представлял собой ЗФР-Т (10мМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20) рН 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С. Перед захватом проточную ячейку дважды примировали, используя подвижный буфер.

Биспецифическое антитело захватывали путем инъекции 10нМ раствора в течение 60 с со скоростью 5 мкл/мин. Независимое связывание каждого лиганда с биспецифическим антителом анализировали, определяя способность активного связывания для каждого лиганда, которые добавляли либо последовательно, либо одновременно (скорость 30 мкл/мин), согласно описанным ниже вариантам:

1. Инъекция человеческого УЕСЕ в концентрации 200 нМ в течение 180 с (демонстрирует индивидуальное связывание антигена).

2. Инъекция человеческого Апд2 в концентрации 100 нМ в течение 180 с (демонстрирует индивидуальное связывание антигена).

3. Инъекция человеческого УЕСЕ в концентрации 200 нМ в течение 180 с с последующей дополнительной инъекцией человеческого Апд2 в концентрации 100 нМ в течение 180 с (демонстрирует связывание Апд2 в присутствии УЕСЕ).

4. Инъекция человеческого Апд2 в концентрации 100 нМ в течение 180 с с последующей дополнительной инъекцией человеческого УЕСЕ в концентрации 200 нМ (демонстрирует связывание УЕСЕ в присутствии Апд2).

5. Совместная инъекция человеческого УЕСЕ в концентрации 200 нМ и человеческого Апд2 в концентрации 100нМ в течение 180 с (демонстрирует одновременное связывание УЕСЕ и Апд2).

Поверхность регенерировали в помощью отмывки в течение 60 с 3 мМ раствором МдС1₂ при скорости потока 30 мкл/мин. Все различия в коэффициентах преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного от поверхности, сенсибилизированной античеловеческим 1дС.

Считается, что биспецифическое антитело обладает способностью связываться с обоими антигенами независимо друг от друга, если образующийся конечный сигнал, полученный при применении подходов 3, 4 и 5, равен или близок к сумме индивидуальных конечных сигналов, полученных при применении подходов 1 и 2. Результаты, представленные в табл. 9, демонстрируют, что оба антитела УЕСЕапд2-0016, УЕСЕапд2-0012 обладали способностью независимо друг от друга связываться с УЕСЕ и АNС2.

Оценка одновременного связывания УЕСЕ и Апд2 с биспецифическими антителами<VЕСЕ-АNС2>.

Во-первых, сшивали примерно 1600 резонансных единиц (ВИ) УЕСЕ (20 мкг/мл) с СМ4-чипом (фирма СЕ НеаИВсаге, ВВ-1005-34) при рН 5,0, используя набор для аминного сочетания, поставляемый фирмой СЕ НеаИЕсаге. Буфер для системы и образца представлял собой ЗФР-Т (10мМ забуференный

- 23 032192 фосфатом физиологический раствор, включающий 0,05% Твин 20), рН 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на 25°С, а температуру блока для образца устанавливали на 12°С и примировали дважды, используя подвижный буфер. Во-вторых, 50нМ раствор биспецифического антитела инъецировали в течение 180 с со скоростью 30 мкл/мин. В-третьих, йАпд-2 инъецировали в течение 180 с со скоростью 30 мкл/мин. Ответ в виде связывания йАпд-2 зависел от количества биспецифического антитела, связанного с УЕОР, и он свидетельствовал об одновременном связывании. Поверхность регенерировали путем отмывки в течение 60 с с помощью 0,85%-ного раствора Н₃РО₄ при скорости потока 30 мкл/мин. О наличии одновременного связывания свидетельствует дополнительный специфический сигнал связывания ИАпд2 относительно предшествующего сигнала связывания УЕОР с биспецифическими антителами<УЕОР-АNО-2>. Для обоих биспецифических антител УЕОРап§2-0015 и УЕОРап§2-0016 удалось обнаружить одновременное связывание УЕОР и Апд2 с биспецифическими антителами<УЕОРАNО-2> (данные не представлены).

Таблица 5. Результаты: кинетики аффинности к изоформам УЕОР из различных видов

	УЕСЕап§2-0015 кажущаяся аффинность	УЕСЕапд2-0016 кажущаяся аффинность	УЕСгЕап§2-0012 кажущаяся аффинность	УЕСЕапд2-0201 кажущаяся аффинность
человеческий УЕ6Е 121	<1пМ (по ЕЙасогеспецификации)	<1пМ (по Ейасотеспецификации)	<1пМ (по Ейасогеспецификации)	<1пМ (по ЕЙасогеспецификации)
мышиный УЕ6Е 120	нет связывания	нет связывания	нет связывания	нет связывания
крысиный УЕОР 164	13нМ	14нМ	24нМ	35нМ

Таблица 6: Результаты: аффинность к Апд2 в растворе

	УЕСГапд2-0015, КТ) [нМ]	УЕСГапд2-0016, КТ) [нМ]	УЕСГапд2-0012, КТ) [нМ]	УЕСГап§2—0201, КТ) [нМ]
человеческий Ап§2	8	20	20	ТЬс! (подлежит определению)
су по Ап§2	5	13	10	ТЬб
мышиный Апц2	8	13	8	ТЬб
кроличий Апц2	4	11	8	ТЬб

Таблица 7: Результаты: аффинность к РсКп биспецифических антител <УЕОР-АNО-2>

УЕСГап§2-0015 [аффинность]

УЕСГап§2-0016 [аффинность]

УЕСГап§2-0012 [аффинность]

УЕ6Гап§2—0201 [аффинность]

человеческий ЕсКп	0,8мкМ	нет связывания	нет связывания	0,8мкМ
су по ЕсКп	0,9мкМ	нет связывания	нет связывания	1,0мкМ
МЫШИНЫЙ ЕсКп	0,2мкМ	нет связывания	нет связывания	0,2мкМ

Таблица 8. Результаты: связывание с Рс гамма КЫПа

	УЕСРаи§2-0015	УЕСРаи§2-0016	УЕСРаи§2-0012	УЕСРапд2 -0201
РсуК1а	нет связывания	нет связывания	связывание	связывание
РсуКПа	нет связывания	нет связывания	нет связывания	связывание
РсуКШа	нет связывания	нет связывания	нет связывания	связывание

Таблица 9. Результаты: независимое связывание УЕОР и Апд2 с биспецифическими антителами <УЕОР-А^-2>

	1) Ап§2 [Кишах]	2) УЕ6Е [КЕГтах]	3) сначала УЕСТ, затем Апд2 [КЕГтах]	4) сначала Апд2, затем УЕСТ [КЕГтах]	5) Совместная инъекция Апд2+УЕСЕ [КИтах]
УЕ6Еапд2- 0016	174	50	211	211	211
УЕ6Еапд2- 0012	143	43	178	177	178

Пример 4. Масс-спектрометрия.

В данном разделе описана характеризация биспецифических антител <УЕОР-АNО-2> в отношении правильной сборки. Предполагаемые первичные структуры подтверждали с помощью массспектрометрии с ионизацией электроспреем (Е8РМС) дегликозилированных и интактных или расщепленных с помощью Ме8 (расщепляющий ^О фермент из 8. руодепез) биспецифических антител <УЕОРАNО-2>. Расщепление с помощью Ше8 осуществляли с использованием 100 мкг очищенного антитела,

- 24 032192 которое инкубировали с 2 мкг Ме8-протеазы (фирма КосНе) в буфере, содержащем 100 ммолей/л №Н₂Р0₄Ма2НР0₄, рН 7,1, при З7°С в течение 5 ч. Затем антитела дегликозилировали с помощью N гликозидазы Р, нейраминидазы и 0-гликозидазы (фирма КосНе) в буфере, содержащем 100 ммолей/л №Н₂Р0₄Ма2НР0₄, рН 7,1, при З7°С в течение вплоть до 16 ч, используя белок в концентрации 1 мг/мл, и затем осуществляли обессоливание с помощью ЖХВР на колонке сефадекс С25 (фирма СЕ Неа11Нсаге). Общую массу определяли с помощью Е8БМС, применяя МС-систему таХ18 40 иНК-рТОР (фирма Вгикег ОаПотк), снабженную источником ТгА'егза №иоМа1е (фирма АДуюи).

Массы, установленные для расщепленных к1е8, дегликозилированных (табл. 10) или интактных дегликозилированных (табл. 11) молекул, соответствовали предсказанным массам, которые выводили на основе аминокислотных последовательностей биспецифических антител <VΕ0Ρ-ΑN0-2>, состоящих из двух различных легких цепей ЬС_Аи8г и ЬС _луц_енти_с (р_анибиз_умаб) и двух различных тяжелых цепей НС_Аи§2 и ^НС луцентис.

Таблица 10. Массы дегликозилированных и расщепленных с помощью к1е8 биспецифических антител <VΕ0Ρ/ΑN02>, таких как VΕСΡаиβ2-0201 (без ААА-мутации) и VΕСΡаиβ2-0012 (с ААА-мутацией)

Образец	Е(аЬ’)2 биспецифического антитела <ΥΕΟΡ-ΑΝ6-2>	Дегликозилированная Ес биспецифического антитела <УЕОРΑΝΟ-2>
Предсказанная средняя масса [Да]	Обнаруженная средняя масса [Да]	Предсказанная средняя масса [Да]	Обнаруженная средняя масса [Да]
УЕ6Раид2- 0201	99360,8	99360,7	47439,2	47430,1
УЕ6Раид2- 0012	99360,8	99361,1	47087,7	47082,0

Таблица 11. Массы дегликозилированных биспецифических антител <VΕ0Ρ/ΑN02>. таких как \^/'ЕС1Ра11д2-0016 (с ААА-мутацией) и VΕСΡаиβ2-0015 (без ААА-мутации)

	Дегликозилированное биспецифического антитела <УЕСгР-АЫС-2>
	Предсказанная средняя масса [Да]	Обнаруженная средняя масса [Да]
УЕСРаид2-0016	146156,9	146161,2
УЕ6Раид2-0015	146505,3	146509,4

Пример 5. Хроматография для оценки связывания Рс-Ки.

Сочетание со стрептавидин-сефарозой.

Добавляли 1 г стрептавидин-сефарозы (фирма СЕ Неа11Нсаге) к биотинилированному и подвергнутому диализу рецептору и инкубировали в течение 2 ч при встряхивании. Дериватизированной рецептором сефарозой заполняли 1-миллилитровую ХК-колонку (фирма СЕ Неа11Нсаге).

Хроматография с применением аффинной РсКи-колонки.

Условия:

размеры колонки: 50 мм х 5 мм, высота слоя: 5 см, загрузка: 50 мкг образца, буфер для уравновешивания: 20мМ МЕ8 с 150мМ №С1, регулирующий значение рН до 5,5, буфер для элюции: 20мМ Трис/НС1 с 150мМ №С1, регулирующий значение рН до 8,8, элюция: 7,5 С\ (объем колонки) буфера для уравновешивания в от З0 С\ до 100% буфера для элюции, 10 С\ буфера для элюции.

Колоночная хроматография на основе аффинности к НиРсКи.

В приведенной ниже таблице представлены данные о временах удерживания биспецифических антител <VΕСΡ-ΑNС-2> на колонках для аффинной хроматографии, содержащих человеческий РсКи. Данные получали с использованием указанных выше условий. В приведенной ниже таблице представлены данные о временах удерживания биспецифических антител <VΕСΡ-ΑNС-2> на человеческом РсКи.

Таблица 12. Результаты: времена удерживания биспецифических антител<VΕСΡ-ΑNС-2>

Антитело	Время удерживания [мин]
УЕ(ЭРАп§2-0015 (без ААА-мутации)	78,5
УЕОРАид2-0201 (без ААА-мутации )	78,9
УЕСРАид2-0012 (с ААА-мутацией )	2,7 («пустой» пик)
УЕСтРАи§2-0016 (с ААА-мутацией )	2,7 («пустой» пик)

Пример 6. Фармакокинетические (ФК) свойства.

ФК данные в отношении Рс-Ки, полученные на мышах, трансгенных по человеческому РсКи.

Фаза прижизненных исследований.

Опыт проводили на самках мышей С57В1./6.1 (фон); мышей с дефицитом РсКи, но гемизиготных трансгенных по человеческому РсКи (НиРсКи, линия 276 -Дд).

- 25 032192

Часть 1.

Всем мышам инъецировали однократно интравитреально в правый глаз 2 мкл/животное соответствующего раствора (т.е. 21 мкг соединения /животное (УЕСРАпд2-0015 (без ААА-мутации) или 23,6 мкг соединения /животное (УЕСРАпд2-0016 (с ААА-мутацией).

Мышей подразделяли на 2 группы по 6 животных в каждой. Получали образцы крови у животных группы 1 через 2, 24 и 96 ч, а у животных группы 2 через 7, 48 и 168 ч после дозирования.

Осуществляли инъекцию в стекловидное тело правого глаза мышей с помощью включающей микрошприц системы №поР11 для нанолитровых инъекций фирмы Vο^1б Ргешзюп 1пз1гцтеп1з, 1пс., Берлин, Германия. Мышей анестезировали с помощью 2,5% изофлурана и для визуализации глаза мышей применяли микроскоп Ье1са М2РЬ 3 с 40-кратным увеличением и источником кольцевого света Ье1са КЬ 2500 ЬСИ. Затем 2 мкл соединения инъецировали с помощью иглы 35-размера.

Кровь собирали из ретробульбарного венозного сплетения контралатерального глаза каждого животного для определения уровней соединения в сыворотке.

Образцы сыворотки объемом по меньшей мере 50 мкл получали из крови после выдерживания в течение 1 ч при КТ путем центрифугирования (9300*д) при 4°С в течение 3 мин. Образцы сыворотки замораживали непосредственно после центрифугирования и хранили в замороженном состоянии при -80°С до анализа. Обработанные глаза животных из группы 1 выделяли через 96 ч после обработки, у животных из группы 2 - через 168 ч после обработки. Образцы хранили в замороженном состоянии при -80°С до анализа.

Часть 2.

Всем мышам инъецировали однократно внутривенно через хвостовую вену по 200 мкл/животное соответствующего раствора (т.е. 21 мкг соединения/животное (УЕСРАпд2-0015 (без ААА-мутации) или 23,6 мкг соединения/животное (УЕСРАпд2-0016 (с ААА-мутацией).

Мышей подразделяли на 2 группы по 5 животных в каждой. Получали образцы крови у животных группы 1 через 1, 24 и 96 ч, а у животных группы 2 через 7, 48 и 168 ч после дозирования. Кровь собирали из ретробульбарного венозного сплетения каждого животного для определения уровней соединения в сыворотке.

Образцы сыворотки объемом по меньшей мере 50 мкл получали из крови после выдерживания в течение 1 ч при КТ путем центрифугирования (9300*д) при 4°С в течение 3 мин. Образцы сыворотки замораживали непосредственно после центрифугирования и хранили в замороженном состоянии при -80°С до анализа.

Получение лизатов всего глаза (мышей).

Лизаты глаз получали путем физико-химического расщепления всего глаза лабораторных животных. Для механического разрушения каждый глаз переносили в микропробирку с коническим дном объемом 1,5 мл. После замораживания-оттаивания глаза промывали однократно промывочным буфером (фирма В1о-Каб, набор для лизиса клеток Вю-Р1ех, каталожный № 171-304011). На следующей стадии добавляли 500 мкл свежеприготовленного буфера для лизиса клеток и глаза измельчали с помощью 1,5миллилитрового пестика для измельчения тканей (фирма К1тЬ1е Сйазе, 1,5-миллилитровый пестик, артикул № 749521-1500). Затем смесь 5 раз подвергали замораживанию и оттаиванию и вновь измельчали. Для отделения лизата от оставшейся ткани образцы центрифугировали в течение 4 мин при 4500*д. После центрифугирования супернатант собирали и хранили при -20°С для дополнительного анализа с помощью количественного ЕЫ8А.

Анализ.

Концентрации антител <УЕСР/АNС2> в сыворотке и лизатах глаз мышей определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А).

Для количественной оценки антител <УЕСР/АNС2> в образцах сыворотки и лизатах глаз мышей осуществляли стандартный твердофазный серийный сэндвич-иммуноанализ с применением биотинилированного и дигокигенированного моноклональных антител в качестве иммобилизованного (захватывающего) и идентифицирующего антител. Подтверждением сохранения биспецифичности анализируемого соединения должно являться то, что биотинилированное захватывающее антитело распознает анти-УЕСР-связывающий сайт, в то время как дигоксигенированное идентифицирующее антитело связывается с анти-Апд2-связывающим сайтом анализируемого соединения. Связанный иммунный комплекс, включающий захватывающее антитело, анализируемое соединение и идентифицирующее антитело, на твердой фазе сенсибилизированного стрептавидином титрационного микропланшета (8А-МТР) затем выявляли с помощью сшитого с пероксидазой из хрена антитела к дигоксигенину. После отмывки несвязанного материала из 8А-МТР и добавления АВТ8-субстрата полученный сигнал пропорционален количеству анализируемого соединения, связанного с твердой фазой 8А-МТР. Затем осуществляли количественную оценку путем превращения измеренных сигналов образцов в концентрации, определенные относительно калибраторов, анализируемых параллельно.

На первой стадии 8А-МТР сенсибилизировали, используя 100 мкл/лунку раствора биотинилированного захватывающего антитела (МАт<1б<УЕСР>>М-2.45.51-1дС-В1(ИП8)) в концентрации 1 мкг/мл в течение 1 ч при 500 об/мин на МТР-шейкере. Тем временем подготавливали калибраторы, ОС-образцы

- 26 032192 (образцы для контроля качества) и образцы. Калибраторы и ОС-образцы разводили до 2% сывороточной основой; образцы разводили до тех пор, пока сигналы не попадали в линейную область калибраторов.

После сенсибилизации 8А-МТР захватывающим антителом планшет промывали трижды промывочным буфером, используя З00 мкл/лунку. Затем с помощью пипетки вносили по 100 мкл/лунку калибраторов, ОС-образцов и образцов в 8А-МТР и вновь инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин. При этом анализируемое соединение связывалось с помощью его анти-УЕСТ-связывающего сайта через захватывающее антитело с твердой фазой 8А-МТР. После инкубации и удаления несвязанного анализируемого соединения путем промывки планшета в 8А-МТР добавляли по 100 мкл/лунку первого идентифицирующего антитела (МАт<Iά-<Αηд2>>Μ-2.6.81-IдС-^^д(XО8и)) в концентрации 250 нг/мл. И в этом случае планшет инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин на шейкере. После промывки в лунки 8АМТР добавляли по 100 мкл/лунку второго идентифцирующего антитела (ПАт<дигоксигенин>8-ЕаЬ-РОЭ (поли)) в концентрации 50 мед./мл и планшет вновь инкубировали в течение 1 ч при 500 об/мин. После конечной стадии промывки для удаления идентифицирующего антитела добавляли по 100 мкл/лунку субстрата (АВТ8). Конъюгат антитело-фермент катализировал цветную реакцию АВТ8®-субстрата. Затем сигнал измеряли с помощью ридера для ЕЫ8А при длине волны 405 нм (длина референс-волны: 490 нм ([405/490]нм)).

Оценка фармакокинетики.

Фармакокинетические параметры рассчитывали с помощью некомпартментального анализа, используя программу для оценки фармакокинетических параметров ^ίηΝοη1ίη™ (фирма РЬагъцМ), версия 5.2.1.

Результаты: А) Концентрации в сыворотке.

Результаты определения концентраций в сыворотке представлены в табл. 1З-16 и на фиг. 7Б-7В.

Таблица 1З. УЕСΕΑηд2-0015 (без ААА-мутации): сравнение концентраций в сыворотке после интравитреального и внутривенного введения

	Концентрация в сыворотке после интравитреального введения	Концентрация в сыворотке после внутривенного введения
Время	Средняя конц. [мкг/мл]	Средняя конц. [мкг/мл]
1 ч		17,7
2 ч	9,8
7 ч	10,4	12,1
24 ч	6,4	8,3
48 ч	6,5	6,9
96 ч	3,4	4,1
168 ч	2,9	2,7

Таблица 14. УЕСΕΑηд2-0016 (с ААА-мутацией): сравнение концентраций в сыворотке после интравитреального и внутривенного введения

	Концентрация в сыворотке после интравитреального введения	Концентрация в сыворотке после внутривенного введения
Время	Средняя конц. [мкг/мл]	Средняя конц. [мкг/мл]
1 ч		18,4
2 ч	7,0
7 ч	8,7	10,0
24 ч	2,2	3,3
48 ч	1,0	1,0
96 ч	0,1	0,1
168 ч	0,0	0,0

Таблица 15. УЕСΕаηд2-0015 (без ААА-мутации) и УЕСΕаηд2-0016 (с ААА-мутацией): сравнение концентраций в сыворотке после интравитреального введения)

	УЕСтЕап£2-0015 (без ААА-мутации)	УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутацией)
Время	Средняя конц. [мкг/мл]	Средняя конц. [мкг/мл]
2 ч	9,8	7,0
7 ч	10,4	8,7
24 ч	6,4	2,2
48 ч	6,5	1,0
96 ч	3,4	0,1
168 ч	2,9	0,0

- 27 032192

Таблица 16. УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутации) и УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутацией): сравнение концентраций в сыворотке после внутривенного)

	УЕСЕапц2-0015 (без ААА-мутации)	УЕСЕапц2-0016 (с ААА-мутацией)
Время	Средняя конц. [мкг/мл]	Средняя конц. [мкг/мл]
1 ч	17,7	18,4
7 ч	12,1	10,0
24 ч	8,3	3,3
48 ч	6,9	1,0

	УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутации)	УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутацией)
Время	Средняя конц. [мкг/мл]	Средняя конц. [мкг/мл]
96 ч	4,1	0,1
168 ч	2,7	0,0

Результаты: Б) Концентрации в глазных лизатах левых и правых глаз.

Результаты определения концентраций в глазных лизатах представлены в табл. 17-18 и на фиг. 7Г7Д.

Таблица 17а. Концентрации УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутации) в глазных лизатах после интравитреального введения в правый глаз

Средние величины конц. для п=6 мышей
Время	Средняя конц. [нг/мл]
96 ч	левый глаз	8,7
правый глаз	46,1
168 ч	левый глаз	4,3
правый глаз	12,9

Таблица 17б. Концентрации УЕСЕапд2-0015 (без ААА-мутации) в глазных лизатах после внутривенного введения

Средние величины конц. для п=5 мышей
Время	Средняя конц. [нг/мл]
96 ч	левый глаз	4,2
правый глаз	7,5
168 ч	левый глаз	3,4
правый глаз	6,1

Таблица 18а: Концентрации УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутациями) в глазных лизатах после интравитреального введения в правый глаз

Средние величины конц. Для п=5 мышей
Время	Средняя конц. [нг/мл]
96 ч	левый глаз	0,3
правый глаз	34,5
168 ч	левый глаз	0,1
правый глаз	9,0

Таблица 18б. Концентрации УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутациями) в глазных лизатах после внутривенного введения

Средние величины конц. Для п=5 мышей
Время	Средняя конц. [нг/мл]
96 ч	левый глаз	0,0
правый глаз	ОД
168 ч	левый глаз	0,0
правый глаз	ОД

Обобщение результатов.

После интравитреального введения биспецифического антитела <УЕСΓ/АNС2>, предлагаемого в изобретении, такого как УЕСЕапд2-0016 (с ААА-мутацией), в глазных лизатах обнаружены его концентрации (через 96 и 168 ч), близкие к концентрациями биспецифического антитела <УЕСΓ/АNС2> без ААА-мутации, такого как УЕСЕапд2-0015.

- 28 032192

Кроме того, после интравитреального введения биспецифического антитела <УЕСТ/ΑNС2>, предлагаемого в изобретении, такого как УЕСТапд2-0016 (с ААА-мутацией), обнаружены также более быстрый клиренс и более короткое время полужизни в сыворотке по сравнению с биспецифическим антителом <VЕСΕ/ΑNС2> без ААА-мутации, таким как УЕСТапд2-0015.

Пример 7. Анализ ангиогенеза в микрокармане роговицы мышей.

Для оценки антиангиогенного действия биспецифического антитела <УЕСЕ/ΑNС2> с соответствующими последовательностями анти-УЕСТ УН и УЪ ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 7 и 8 и анти-ΑNС2 УН и УЪ ЗЕО ГО ΝΟ: 15 и 16 в отношении индуцируемого УЕСТ ангиогенеза ш у1уо, при создании изобретения осуществляли анализ ангиогенеза в роговице мышей. При осуществлении этого анализа насыщенный УЕСТ Nу1аί1о-диск имплантировали в карман из бессосудистой роговицы на фиксированном расстоянии от сосудов лимба. В ответ на создание градиента УЕСТ в роговице сразу начинался рост сосудов. Опыт проводили на самках мышей линии Ва1Ь/с возрастом 8-10 недель, которых покупали у фирмы СЬаг1е§ Клуег, Сульцфельд, Германия. Протокол модифицировали согласно методу, описанному у Кодегз М.З. и др., №1. РгоЮс. 2, 2007, с. 2545-2550. В целом, метод состоял в следующем: у анестизированных мышей создавали под микроскопом микрокарманы глубиной примерно 500 мкм на расстоянии примерно 1 мм от лимба до верхней части роговицы, используя хирургическое лезвие и острые пинцеты. Имплантировали диск (Ну1аЯо®, фирма Ра11 СогрогаЪоп, шт. Мичиган) диаметром 0,6 мм и поверхность области имплантации выравнивали. Диски инкубировали в соответствующем факторе роста или наполнителе в течение по меньшей мере 30 мин. Через 3, 5 и 7 дней (или в другом варианте только после 3, 5 или 7 дней) глаза фотографировали и оценивали сосудистый ответ. Результаты анализа выражали количественно, рассчитывая процент области новых сосудов относительно общей площади роговицы.

Диски пропитывали 300 нг УЕСТ или ЗФР в качестве контроля и имплантировали на 7 дней. Выросты сосудов из лимба в диск оценивали в день 3, 5 и/или 7. За 1 день до имплантации диска внутривенно вводили антитело в дозе 10 мг/кг (благодаря тому, что при внутривенном применении стабильное в сыворотке антитело УЕСТапд2-0015 (без ААА-мутации), которое отличалось от УЕСТапд2-0016 только ААА-мутацией и имело такие же анти-УЕСТ и анти-ΑNС2 УН- и УЪ-области, опосредующие эффективность, его применяли в качестве заместителя указанного антитела) для тестирования антиангиогенного действия в отношении индуцированного УЕСТ ангиогенеза ш у1уо. Животных в контрольной группе обрабатывали наполнителем. Применяемый объем составлял 10 мл/кг.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110>

Роше Гликарт АГ <120>

ЩАЯ

БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО К УЕОЕ/АЫО-2, НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА, КОДИРУЮЭТО АНТИТЕЛО, ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ НУКЛЕИНОВУЮ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ

БИСПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИТЕЛА И КОМПОЗИЦИЯ

КИСЛОТУ, КЛЕТКА-ХОЗЯИН,

СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО <130>

31094 МО <150>

<151>

ЕР12176299.1

2012-07-13 <160>

<170>

РабепЫп, версия

3.5 <210>

<211>

<212>

<213>

РНТ

Искусственная <220>

<223>

СБК.3Н тяжелой цепи, <УЕОЕ>ранибизумаб <400>

Туг Рго Туг Туг Туг О1у ТЕг Вег Н1з Тгр Туг РЕе Азр

5 10

Уа1

- 29 032192 <210> 2 <211> 17 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> СЬК2Н тяжелой цепи, <УЕВР>ранибизумаб <400>2

Тгр 11е Азп ТЪг Туг ТЪг О1у О1и Рго ТЪг Туг А1а А1а Азр РЪе Ьуз

5 1015

Агд <210>3 <211>5 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> СЬК1Н тяжелой цепи, <УЕВР>ранибизумаб <400>3

Н1з Туг О1у Меб Азп <210>4 <211>9 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> СЬКЗЬ легкой цепи, <УЕВР>ранибизумаб <400>4

О1п О1п Туг Вег ТЪг Уа1 Рго Тгр ТЪг <210>5 <211>7 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> СЬК2Ь легкой цепи, <УЕВР>ранибизумаб <400> 5

РЪе ТЪг Вег Вег Ьеи Н1з Вег

5 <210> 6 <211> 11

- 30 032192 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> СЬК1Ь легкой цепи, <УЕСЕ>ранибизумаб <400>6

Бег А1а Бег О1п Азр 11е Бег Азп Туг Ьеи Азп

510 <210>7 <211>123 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи УН, <УЕСЕ>ранибизумаб <400> 7

О1и Уа1 1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1и

Бег

О1у

О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

О1у

Туг

Азр

РЬе

ТЬг

Н1з

Туг

20

25

30

О1у

Меб

Азп

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЬг

Туг

ТЬг

О1у

О1и

Рго

ТЬг

Туг

А1а

А1а

Азр

РЬе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РЬе

ТЬг

РЬе

Бег

Ьеи

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Бег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Туг

Рго

Туг

Туг

Туг

О1у

ТЬг

Бег

Н1з

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<210> 8 <211> 107 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> вариабельный домен легкой цепи УЬ, <УЕСЕ>ранибизумаб <400> 8

- 31 032192

Азр 1

11е

О1п

Ьеи

ТЪг 5

О1п

5ег

Рго

5ег

5ег 10

Ьеи

5ег

А1а

5ег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТЪг

11е

ТЪг

Суз

5ег

А1а

5ег

О1п

Азр

11е

5ег

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

РЪе

ТЪг

5ег

5ег

Ьеи

Н1з

5ег

О1у

Уа1

Рго

5ег

Агд

РЪе

5ег

О1у

50

55

60

5ег

О1у

5ег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

5ег

5ег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЪе

А1а

ТЪг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

5ег

ТЪг

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

<210>	9
<211>	20
<212>	РКТ
<213>	Искусственная
<220>
<223>	СЬКЗН тяжелой цепи,	<АЫС-2> вариант Апд21_ЬС10
<400>	9
5ег Рго	> Азп Рго Туг Туг Туг	Азр 5ег 5ег О1у Туг Туг Туг	Рго О1у
1	5	10	15

А1а РЪе Азр 11е

<210>	10
<211>	17
<212>	РКТ
<213>	Искусственная
<220>
<223>	СЬК2Н тяжелой цепи, <АЫС-2> вариант Апд21_ЬС10
<400>	10

Тгр 11е Азп Рго Азп 5ег О1у О1у ТЪг Азп Туг А1а О1п Ьуз РЪе О1п

5 10 15

О1у

- З2 032192

<210> <211> <212> <213>

11 5 РКТ Искусственная

<220> <223>	СЬК1Н тяжелой цепи, <АЫО-2> вариант Апд21_ЬС10
<400>	11

О1у Туг Туг Меб Н1з

1	5
<210> <211> <212> <213>	12 11 РКТ Искусственная

<220> <223>	СЬК3Ь легкой цепи, <АЫО-2> вариант Апд21_ЬС10
<400>	12

О1п Уа1 Тгр Азр Вег Вег Вег Азр Н1з Тгр Уа1

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	13 7 РКТ Искусственная

<220> <223>	СЬК2Ь легкой цепи, <АЫО-2> вариант Апд21_ЬС10
<400>	13

Азр Азр Вег Азр Агд Рго Вег

1	5
<210> <211> <212> <213>	14 11 РКТ Искусственная

<220> <223>	СЬК1Ь легкой цепи, <АЫО-2> вариант Апд21_ЬС10
<400>	14

О1у О1у Азп Азп 11е О1у Вег Ьуз Вег Уа1 Н1з

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	15 129 РКТ Искусственная

<220>

- 33 032192 <223> вариабельный домен тяжелой цепи УН, <ΑΝΟ-2> вариант Апд21_ЬС10 <400> 15

О1п 1

Уа1

О1п Ьеи

Уа1 5

О1п

Бег О1у А1а О1и 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

О1у 15

А1а

Бег

Уа1

Ьуз

Уа1

Бег

Суз

Ьуз

А1а

Бег

О1у

Туг

ТЪг

РЪе

ТЪг

О1у

Туг

20

25

30

Туг

Меб

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Меб

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Бег

О1у

О1у

ТЪг

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РЪе

50

55

60

О1п

О1у

Агд

Уа1

ТЪг

Меб

ТЪг

Агд

Азр

ТЪг

Бег

11е

Бег

ТЪг

А1а

Туг

65

70

75

80

Меб

О1и

Ьеи

Бег

Агд

Ьеи

Агд

Бег

Азр

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Бег

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

Азр

Бег

Бег

О1у

Туг

Туг

Туг

100

105

110

Рго

О1у

А1а

РЪе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Меб

Уа1

ТЪг

Уа1

Бег

115

120

125

Бег <210> 16 <211> 110 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> вариабельный домен легкой цепи УЬ, <ΑΝΟ-2> вариант Апд21_ЬС10 <400> 16

Бег 1

Туг

Уа1

Ьеи ТЪг О1п 5

Рго

Рго

Бег

Уа1 10

Бег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЪг

А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

О1у

О1у

Азп

Азп

11е

О1у

Бег

Ьуз

Бег

Уа1

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

Азр

Азр

Бег

Азр

Агд

Рго

Бег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

- 34 032192

Азп 65

Вег

О1у

Азп

ТЪг

А1а 70

ТЪг Ьеи

ТЪг

11е

Вег 75

Агд Уа1

О1и

А1а

О1у 80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Уа1

Тгр

Азр

Вег

Вег

Вег

Азр

Н1з

85

90

95

Тгр

Уа1

РЪе

О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

110

<210>

17

<211>

191

<212>

РКТ

<213>

Ното

зар1епз

<400>

17

Меб

Азп

РЪе

Ьеи

Ьеи

Вег

Тгр

Уа1

Н1з

Тгр

Вег

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

Туг

Ьеи

Н1з

Н1з

А1а

Ьуз

Тгр

Вег

О1п

А1а

А1а

Рго

Меб

А1а

О1и

О1у

20

25

30

О1у

О1у

О1п

Азп

Н1з

Н1з

О1и

Уа1

Уа1

Ьуз

РЪе

Меб

Азр

Уа1

Туг

О1п

35

40

45

Агд

Вег

Туг

Суз

Н1з

Рго

11е

О1и

ТЪг

Ьеи

Уа1

Азр

11е

РЪе

О1п

О1и

50

55

60

Туг

Рго

Азр

О1и

11е

О1и

Туг

11е

РЪе

Ьуз

Рго

Вег

Суз

Уа1

Рго

Ьеи

65

70

75

80

Меб

Агд

Суз

О1у

О1у

Суз

Суз

Азп

Азр

О1и

О1у

Ьеи

О1и

Суз

Уа1

Рго

85

90

95

ТЪг

О1и

О1и

Вег

Азп

11е

ТЪг

Меб

О1п

11е

Меб

Агд

11е

Ьуз

Рго

Н1з

100

105

110

О1п

О1у

О1п

Н1з

11е

О1у

О1и

Меб

Вег

РЪе

Ьеи

О1п

Н1з

Азп

Ьуз

Суз

115

120

125

О1и

Суз

Агд

Рго

Ьуз

Ьуз

Азр

Агд

А1а

Агд

О1п

О1и

Азп

Рго

Суз

О1у

130

135

140

Рго

Суз

Вег

О1и

Агд

Агд

Ьуз

Н1з

Ьеи

РЪе

Уа1

О1п

Азр

Рго

О1п

ТЪг

145

150

155

160

Суз

Ьуз

Суз

Вег

Суз

Ьуз

Азп

ТЪг

Азр

Вег

Агд

Суз

Ьуз

А1а

Агд

О1п

- 35 032192

165

175

Рго Агд Агд

190

170

Ьеи О1и Ьеи Азп О1и Агд ТЪг Суз Агд Суз Азр Ьуз

180185 <210> 18 <211>496 <212> РНТ <213> Ното зарБепз <400>18

Меб 1

Тгр

О1п

11е

Уа1 5

РЪе

РЪе

ТЪг

Ьеи

Бег 10

Суз

Азр

Ьеи

Уа1

Ьеи 15

А1а

А1а

А1а

Туг

Азп

Азп

РЪе

Агд

Ьуз

Бег

Меб

Азр

Бег

11е

О1у

Ьуз

Ьуз

20

25

30

О1п

Туг

О1п

Уа1

О1п

Н1з

О1у

Бег

Суз

Бег

Туг

ТЪг

РЪе

Ьеи

Ьеи

Рго

35

40

45

О1и

Меб

Азр

Азп

Суз

Агд

Бег

Бег

Бег

Бег

Рго

Туг

Уа1

Бег

Азп

А1а

50

55

60

Уа1

О1п

Агд

Азр

А1а

Рго

Ьеи

О1и

Туг

Азр

Азр

Бег

Уа1

О1п

Агд

Ьеи

65

70

75

80

О1п

Уа1

Ьеи

О1и

Азп

11е

Меб

О1и

Азп

Азп

ТЪг

О1п

Тгр

Ьеи

Меб

Ьуз

85

90

95

Ьеи

О1и

Азп

Туг

11е

О1п

Азр

Азп

Меб

Ьуз

Ьуз

О1и

Меб

Уа1

О1и

11е

100

105

110

О1п

О1п

Азп

А1а

Уа1

О1п

Азп

О1п

ТЪг

А1а

Уа1

Меб

11е

О1и

11е

О1у

115

120

125

ТЪг

Азп

Ьеи

Ьеи

Азп

О1п

ТЪг

А1а

О1и

О1п

ТЪг

Агд

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Азр

130

135

140

Уа1

О1и

А1а

О1п

Уа1

Ьеи

Азп

О1п

ТЪг

ТЪг

Агд

Ьеи

О1и

Ьеи

О1п

Ьеи

145

150

155

160

Ьеи

О1и

Н1з

Бег

Ьеи

Бег

ТЪг

Азп

Ьуз

Ьеи

О1и

Ьуз

О1п

11е

Ьеи

Азр

165

170

175

О1п

ТЪг

Бег

О1и

11е

Азп

Ьуз

Ьеи

О1п

Азр

Ьуз

Азп

Бег

РЪе

Ьеи

О1и

180

185

190

Ьуз

Ьуз

Уа1

Ьеи

А1а

Меб

О1и

Азр

Ьуз

Н1з

11е

11е

О1п

Ьеи

О1п

Бег

- 36 032192

195

200

205

11е

Ьуз 210

О1и

О1и

Ьуз

Азр

О1п 215

Ьеи

О1п Уа1

Ьеи

Уа1 220

Бег

Ьуз

О1п

Азп

Бег

11е

11е

О1и

О1и

Ьеи

О1и

Ьуз

Ьуз

11е

Уа1

ТЬг

А1а

ТЬг

Уа1

Азп

225

230

235

240

Азп

Бег

Уа1

Ьеи

О1п

Ьуз

О1п

О1п

Н1з

Азр

Ьеи

МеЕ

О1и

ТЬг

Уа1

Азп

245

250

255

Азп

Ьеи

Ьеи

ТЬг

МеЕ

МеЕ

Бег

ТЬг

Бег

Азп

Бег

А1а

Ьуз

Азр

Рго

ТЬг

260

265

270

Уа1

А1а

Ьуз

О1и

О1и

О1п

11е

Бег

Рке

Агд

Азр

Суз

А1а

О1и

Уа1

Рке

275

280

285

Ьуз

Бег

О1у

Н1з

ТЬг

ТЬг

Азп

О1у

11е

Туг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Рке

Рго

Азп

290

295

300

Бег

ТЬг

О1и

О1и

11е

Ьуз

А1а

Туг

Суз

Азр

МеЕ

О1и

А1а

О1у

О1у

О1у

305

310

315

320

О1у

Тгр

ТЬг

11е

11е

О1п

Агд

Агд

О1и

Азр

О1у

Бег

Уа1

Азр

Рке

О1п

325

330

335

Агд

ТЬг

Тгр

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Уа1

О1у

Рке

О1у

Азп

Рго

Бег

О1у

О1и

340

345

350

Туг

Тгр

Ьеи

О1у

Азп

О1и

Рке

Уа1

Бег

О1п

Ьеи

ТЬг

Азп

О1п

О1п

Агд

355

360

365

Туг

Уа1

Ьеи

Ьуз

11е

Н1з

Ьеи

Ьуз

Азр

Тгр

О1и

О1у

Азп

О1и

А1а

Туг

370

375

380

Бег

Ьеи

Туг

О1и

Н1з

Рке

Туг

Ьеи

Бег

Бег

О1и

О1и

Ьеи

Азп

Туг

Агд

385

390

395

400

11е

Н1з

Ьеи

Ьуз

О1у

Ьеи

ТЬг

О1у

ТЬг

А1а

О1у

Ьуз

11е

Бег

Бег

11е

405

410

415

Бег

О1п

Рго

О1у

Азп

Азр

Рке

Бег

ТЬг

Ьуз

Азр

О1у

Азр

Азп

Азр

Ьуз

420

425

430

Суз

11е

Суз

Ьуз

Суз

Бег

О1п

МеЕ

Ьеи

ТЬг

О1у

О1у

Тгр

Тгр

Рке

Азр

435

440

445

- 37 032192

А1а

Суз 450

О1у

Рго

Бег Азп

Ьеи 455

Азп О1у

Меб

Туг

Туг 460

Рго

О1п

Агд

О1п

Азп

ТНг

Азп

Ьуз

РНе

Азп

О1у

11е

Ьуз

Тгр

Туг

Туг

Тгр

Ьуз

О1у

Бег

465

470

475

480

О1у

Туг

Бег

Ьеи

Ьуз

А1а

ТНг

ТНг

Меб

Меб

11е

Агд

Рго

А1а

Азр

РНе

485

490

495

<210>

19

<211>

498

<212>

РКТ

<213>

Ното

заръепз

<400>

19

Меб

ТНг

Уа1

РНе

Ьеи

Бег

РНе

А1а

РНе

Ьеи

А1а

А1а

11е

Ьеи

ТНг

Н1з

1

5

10

15

11е

О1у

Суз

Бег

Азп

О1п

Агд

Агд

Бег

Рго

О1и

Азп

Бег

О1у

Агд

Агд

20

25

30

Туг

Азп

Агд

11е

О1п

Н1з

О1у

О1п

Суз

А1а

Туг

ТНг

РНе

11е

Ьеи

Рго

35

40

45

О1и

Н1з

Азр

О1у

Азп

Суз

Агд

О1и

Бег

ТНг

ТНг

Азр

О1п

Туг

Азп

ТНг

50

55

60

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Агд

Азр

А1а

Рго

Н1з

Уа1

О1и

Рго

Азр

РНе

Бег

Бег

65

70

75

80

О1п

Ьуз

Ьеи

О1п

Н1з

Ьеи

О1и

Н1з

Уа1

Меб

О1и

Азп

Туг

ТНг

О1п

Тгр

85

90

95

Ьеи

О1п

Ьуз

Ьеи

О1и

Азп

Туг

11е

Уа1

О1и

Азп

Меб

Ьуз

Бег

О1и

Меб

100

105

110

А1а

О1п

11е

О1п

О1п

Азп

А1а

Уа1

О1п

Азп

Н1з

ТНг

А1а

ТНг

Меб

Ьеи

115

120

125

О1и

11е

О1у

ТНг

Бег

Ьеи

Ьеи

Бег

О1п

ТНг

А1а

О1и

О1п

ТНг

Агд

Ьуз

130

135

140

Ьеи

ТНг

Азр

Уа1

О1и

ТНг

О1п

Уа1

Ьеи

Азп

О1п

ТНг

Бег

Агд

Ьеи

О1и

145

150

155

160

11е

О1п

Ьеи

Ьеи

О1и

Азп

Бег

Ьеи

Бег

ТНг

Туг

Ьуз

Ьеи

О1и

Ьуз

О1п

165

170

175

- 38 032192

Ьеи Ьеи О1п О1п

ТЕг Азп

О1и

11е

Ьеи 185

Ьуз

11е

Н1з

О1и

Ьуз 190

Азп

Вег

180

Ьеи

Ьеи

О1и

Н1з

Ьуз

11е

Ьеи

О1и

Меб

О1и

О1у

Ьуз

Н1з

Ьуз

О1и

О1и

195

200

205

Ьеи

Азр

ТЕг

Ьеи

Ьуз

О1и

О1и

Ьуз

О1и

Азп

Ьеи

О1п

О1у

Ьеи

Уа1

ТЕг

210

215

220

Агд

О1п

ТЕг

Туг

11е

11е

О1п

О1и

Ьеи

О1и

Ьуз

О1п

Ьеи

Азп

Агд

А1а

225

230

235

240

ТЕг

ТЕг

Азп

Азп

Вег

Уа1

Ьеи

О1п

Ьуз

О1п

О1п

Ьеи

О1и

Ьеи

Меб

Азр

245

250

255

ТЕг

Уа1

Н1з

Азп

Ьеи

Уа1

Азп

Ьеи

Суз

ТЕг

Ьуз

О1и

О1у

Уа1

Ьеи

Ьеи

260

265

270

Ьуз

О1у

О1у

Ьуз

Агд

О1и

О1и

О1и

Ьуз

Рго

РЕе

Агд

Азр

Суз

А1а

Азр

275

280

285

Уа1

Туг

О1п

А1а

О1у

РЕе

Азп

Ьуз

Вег

О1у

11е

Туг

ТЕг

11е

Туг

11е

290

295

300

Азп

Азп

Меб

Рго

О1и

Рго

Ьуз

Ьуз

Уа1

РЕе

Суз

Азп

Меб

Азр

Уа1

Азп

305

310

315

320

О1у

О1у

О1у

Тгр

ТЕг

Уа1

11е

О1п

Н1з

Агд

О1и

Азр

О1у

Вег

Ьеи

Азр

325

330

335

РЕе

О1п

Агд

О1у

Тгр

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Меб

О1у

РЕе

О1у

Азп

Рго

Вег

340

345

350

О1у

О1и

Туг

Тгр

Ьеи

О1у

Азп

О1и

РЕе

11е

РЕе

А1а

11е

ТЕг

Вег

О1п

355

360

365

Агд

О1п

Туг

Меб

Ьеи

Агд

11е

О1и

Ьеи

Меб

Азр

Тгр

О1и

О1у

Азп

Агд

370

375

380

А1а

Туг

Вег

О1п

Туг

Азр

Агд

РЕе

Н1з

11е

О1у

Азп

О1и

Ьуз

О1п

Азп

385

390

395

400

Туг

Агд

Ьеи

Туг

Ьеи

Ьуз

О1у

Н1з

ТЕг

О1у

ТЕг

А1а

О1у

Ьуз

О1п

Вег

405

410

415

Вег

Ьеи

11е

Ьеи

Н1з

О1у

А1а

Азр

РЕе

Вег

ТЕг

Ьуз

Азр

А1а

Азр

Азп

420

425

430

- 39 032192

Азр

Азп

Суз 435

МеЕ

Суз

Ьуз

Суз

А1а 440

Ьеи

МеЕ

Ьеи

ТЪг

О1у 445

О1у

Тгр

Тгр

РЪе

Азр

А1а

Суз

О1у

Рго

5ег

Азп

Ьеи

Азп

О1у

МеЕ

РЪе

Туг

ТЪг

А1а

450

455

460

О1у

О1п

Азп

Н1з

О1у

Ьуз

Ьеи

Азп

О1у

11е

Ьуз

Тгр

Н1з

Туг

РЪе

Ьуз

465

470

475

480

О1у

Рго

5ег

Туг

5ег

Ьеи

Агд

5ег

ТЪг

ТЪг

МеЕ

МеЕ

11е

Агд

Рго

Ьеи

485

490

495

Азр

РЪе

<210> :

20

<211>

1124

<212>

РРТ

<213> ]

Ното

зар1епз

<400>

20

МеЕ

Азр

5ег

Ьеи

А1а

5ег

Ьеи

Уа1

Ьеи

Суз

О1у

Уа1

5ег

Ьеи

Ьеи

Ьеи

1

5

10

15

5ег

О1у

ТЪг

Уа1

О1и

О1у

А1а

МеЕ

Азр

Ьеи

11е

Ьеи

11е

Азп

5ег

Ьеи

20

25

30

Рго

Ьеи

Уа1

5ег

Азр

А1а

О1и

ТЪг

5ег

Ьеи

ТЪг

Суз

11е

А1а

5ег

О1у

35

40

45

Тгр

Агд

Рго

Н1з

О1и

Рго

11е

ТЪг

11е

О1у

Агд

Азр

РЪе

О1и

А1а

Ьеи

50

55

60

МеЕ

Азп

О1п

Н1з

О1п

Азр

Рго

Ьеи

О1и

Уа1

ТЪг

О1п

Азр

Уа1

ТЪг

Агд

65

70

75

80

О1и

Тгр

А1а

Ьуз

Ьуз

Уа1

Уа1

Тгр

Ьуз

Агд

О1и

Ьуз

А1а

5ег

Ьуз

11е

85

90

95

Азп

О1у

А1а

Туг

РЪе

Суз

О1и

О1у

Агд

Уа1

Агд

О1у

О1и

А1а

11е

Агд

100

105

110

11е

Агд

ТЪг

МеЕ

Ьуз

МеЕ

Агд

О1п

О1п

А1а

5ег

РЪе

Ьеи

Рго

А1а

ТЪг

115

120

125

Ьеи

ТЪг

МеЕ

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз

О1у

Азр

Азп

Уа1

Азп

11е

5ег

РЪе

Ьуз

130

135

140

- 40 032192

Ьуз 145

Уа1

Ьеи

11е

Ьуз

О1и О1и 150

Азр

А1а

Уа1

11е 155

Туг

Ьуз

Азп

О1у

5ег 160

РЪе

11е

Н1з

5ег

Уа1

Рго

Агд

Н1з

О1и

Уа1

Рго

Азр

11е

Ьеи

О1и

Уа1

165

170

175

Н1з

Ьеи

Рго

Н1з

А1а

О1п

Рго

О1п

Азр

А1а

О1у

Уа1

Туг

5ег

А1а

Агд

180

185

190

Туг

11е

О1у

О1у

Азп

Ьеи

РЪе

ТЪг

5ег

А1а

РЪе

ТЪг

Агд

Ьеи

11е

Уа1

195

200

205

Агд

Агд

Суз

О1и

А1а

О1п

Ьуз

Тгр

О1у

Рго

О1и

Суз

Азп

Н1з

Ьеи

Суз

210

215

220

ТЪг

А1а

Суз

МеЬ

Азп

Азп

О1у

Уа1

Суз

Н1з

О1и

Азр

ТЪг

О1у

О1и

Суз

225

230

235

240

11е

Суз

Рго

Рго

О1у

РЪе

МеЬ

О1у

Агд

ТЪг

Суз

О1и

Ьуз

А1а

Суз

О1и

245

250

255

Ьеи

Н1з

ТЪг

РЪе

О1у

Агд

ТЪг

Суз

Ьуз

О1и

Агд

Суз

5ег

О1у

О1п

О1и

260

265

270

О1у

Суз

Ьуз

5ег

Туг

Уа1

РЪе

Суз

Ьеи

Рго

Азр

Рго

Туг

О1у

Суз

5ег

275

280

285

Суз

А1а

ТЪг

О1у

Тгр

Ьуз

О1у

Ьеи

О1п

Суз

Азп

О1и

А1а

Суз

Н1з

Рго

290

295

300

О1у

РЪе

Туг

О1у

Рго

Азр

Суз

Ьуз

Ьеи

Агд

Суз

5ег

Суз

Азп

Азп

О1у

305

310

315

320

О1и

МеЬ

Суз

Азр

Агд

РЪе

О1п

О1у

Суз

Ьеи

Суз

5ег

Рго

О1у

Тгр

О1п

325

330

335

О1у

Ьеи

О1п

Суз

О1и

Агд

О1и

О1у

11е

Рго

Агд

МеЬ

ТЪг

Рго

Ьуз

11е

340

345

350

Уа1

Азр

Ьеи

Рго

Азр

Н1з

11е

О1и

Уа1

Азп

5ег

О1у

Ьуз

РЪе

Азп

Рго

355

360

365

11е

Суз

Ьуз

А1а

5ег

О1у

Тгр

Рго

Ьеи

Рго

ТЪг

Азп

О1и

О1и

МеЬ

ТЪг

370

375

380

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Азр

О1у

ТЪг

Уа1

Ьеи

Н1з

Рго

Ьуз

Азр

РЪе

Азп

Н1з

385 390 395 400

- 41 032192

ТЪг

Азр

Н1з

РЪе

5ег 405

Уа1

А1а

11е

РЪе

ТЪг 410

11е

Н1з

Агд

11е

Ьеи 415

Рго

Рго

Азр

5ег

О1у

Уа1

Тгр

Уа1

Суз

5ег

Уа1

Азп

ТЪг

Уа1

А1а

О1у

МеЕ

420

425

430

Уа1

О1и

Ьуз

Рго

РЪе

Азп

11е

5ег

Уа1

Ьуз

Уа1

Ьеи

Рго

Ьуз

Рго

Ьеи

435

440

445

Азп

А1а

Рго

Азп

Уа1

11е

Азр

ТЪг

О1у

Н1з

Азп

РЪе

А1а

Уа1

11е

Азп

450

455

460

11е

5ег

5ег

О1и

Рго

Туг

РЪе

О1у

Азр

О1у

Рго

11е

Ьуз

5ег

Ьуз

Ьуз

465

470

475

480

Ьеи

Ьеи

Туг

Ьуз

Рго

Уа1

Азп

Н1з

Туг

О1и

А1а

Тгр

О1п

Н1з

11е

О1п

485

490

495

Уа1

ТЪг

Азп

О1и

11е

Уа1

ТЪг

Ьеи

Азп

Туг

Ьеи

О1и

Рго

Агд

ТЪг

О1и

500

505

510

Туг

О1и

Ьеи

Суз

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1

Агд

Агд

О1у

О1и

О1у

О1у

О1и

О1у

515

520

525

Н1з

Рго

О1у

Рго

Уа1

Агд

Агд

РЪе

ТЪг

ТЪг

А1а

5ег

11е

О1у

Ьеи

Рго

530

535

540

Рго

Рго

Агд

О1у

Ьеи

Азп

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьуз

5ег

О1п

ТЪг

ТЪг

Ьеи

Азп

545

550

555

560

Ьеи

ТЪг

Тгр

О1п

Рго

11е

РЪе

Рго

5ег

5ег

О1и

Азр

Азр

РЪе

Туг

Уа1

565

570

575

О1и

Уа1

О1и

Агд

Агд

5ег

Уа1

О1п

Ьуз

5ег

Азр

О1п

О1п

Азп

11е

Ьуз

580

585

590

Уа1

Рго

О1у

Азп

Ьеи

ТЪг

5ег

Уа1

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

Ьеи

Н1з

Рго

Агд

595

600

605

О1и

О1п

Туг

Уа1

Уа1

Агд

А1а

Агд

Уа1

Азп

ТЪг

Ьуз

А1а

О1п

О1у

О1и

610

615

620

Тгр

5ег

О1и

Азр

Ьеи

ТЪг

А1а

Тгр

ТЪг

Ьеи

5ег

Азр

11е

Ьеи

Рго

Рго

625

630

635

640

О1п

Рго

О1и

Азп

11е

Ьуз

11е

5ег

Азп

11е

ТЪг

Н1з

5ег

5ег

А1а

Уа1

- 42 032192

645

650

655

11е

Вег

Тгр

ТЪг 660

11е

Ьеи

Азр

О1у

Туг 665

Вег

11е

Вег

Вег

11е 670

ТЪг

11е

Агд

Туг

Ьуз

Уа1

О1п

О1у

Ьуз

Азп

О1и

Азр

О1п

Н1з

Уа1

Азр

Уа1

Ьуз

675

680

685

11е

Ьуз

Азп

А1а

ТЪг

11е

ТЪг

О1п

Туг

О1п

Ьеи

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Рго

690

695

700

О1и

ТЪг

А1а

Туг

О1п

Уа1

Азр

11е

РЪе

А1а

О1и

Азп

Азп

11е

О1у

Вег

705

710

715

720

Вег

Азп

Рго

А1а

РЪе

Вег

Н1з

О1и

Ьеи

Уа1

ТЪг

Ьеи

Рго

О1и

Вег

О1п

725

730

735

А1а

Рго

А1а

Азр

Ьеи

О1у

О1у

О1у

Ьуз

Меб

Ьеи

Ьеи

11е

А1а

11е

Ьеи

740

745

750

О1у

Вег

А1а

О1у

Меб

ТЪг

Суз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

Ьеи

А1а

РЪе

Ьеи

11е

755

760

765

11е

Ьеи

О1п

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азп

Уа1

О1п

Агд

Агд

Меб

А1а

О1п

А1а

770

775

780

РЪе

О1п

Азп

Уа1

Агд

О1и

О1и

Рго

А1а

Уа1

О1п

РЪе

Азп

Вег

О1у

ТЪг

785

790

795

800

Ьеи

А1а

Ьеи

Азп

Агд

Ьуз

Уа1

Ьуз

Азп

Азп

Рго

Азр

Рго

ТЪг

11е

Туг

805

810

815

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Тгр

Азп

Азр

11е

Ьуз

РЪе

О1п

Азр

Уа1

11е

О1у

О1и

820

825

830

О1у

Азп

РЪе

О1у

О1п

Уа1

Ьеи

Ьуз

А1а

Агд

11е

Ьуз

Ьуз

Азр

О1у

Ьеи

835

840

845

Агд

Меб

Азр

А1а

А1а

11е

Ьуз

Агд

Меб

Ьуз

О1и

Туг

А1а

Вег

Ьуз

Азр

850

855

860

Азр

Н1з

Агд

Азр

РЪе

А1а

О1у

О1и

Ьеи

О1и

Уа1

Ьеи

Суз

Ьуз

Ьеи

О1у

865

870

875

880

Н1з

Н1з

Рго

Азп

11е

11е

Азп

Ьеи

Ьеи

О1у

А1а

Суз

О1и

Н1з

Агд

О1у

885

890

895

- 43 032192

Туг

Ьеи

Туг

Ьеи 900

А1а

11е

О1и

Туг

А1а 905

Рго

Н1з

О1у Азп

Ьеи 910

Ьеи

Азр

РЬе

Ьеи

Агд

Ьуз

5ег

Агд

Уа1

Ьеи

О1и

ТЬг

Азр

Рго

А1а

РЬе

А1а

11е

915

920

925

А1а

Азп

5ег

ТЬг

А1а

5ег

ТЬг

Ьеи

5ег

5ег

О1п

О1п

Ьеи

Ьеи

Н1з

РЬе

930

935

940

А1а

А1а

Азр

Уа1

А1а

Агд

О1у

МеЬ

Азр

Туг

Ьеи

5ег

О1п

Ьуз

О1п

РЬе

945

950

955

960

11е

Н1з

Агд

Азр

Ьеи

А1а

А1а

Агд

Азп

11е

Ьеи

Уа1

О1у

О1и

Азп

Туг

965

970

975

Уа1

А1а

Ьуз

11е

А1а

Азр

РЬе

О1у

Ьеи

5ег

Агд

О1у

О1п

О1и

Уа1

Туг

980

985

990

Уа1 Ьуз

Ьуз ТЬг МеЬ О1у Агд

995

Ьеи

1000

Рго Уа1 Агд Тгр МеЬ А1а 11е О1и

1005

5ег

Ьеи 1010

Азп

Туг

5ег

Уа1

Туг 1015

ТЬг

ТЬг

Азп

5ег

Азр 1020

Уа1

Тгр

5ег

Туг

О1у

Уа1

Ьеи

Ьеи

Тгр

О1и

11е

Уа1

5ег

Ьеи

О1у

О1у

ТЬг

Рго

1025

1030

1035

Туг

Суз

О1у

МеЬ

ТЬг

Суз

А1а

О1и

Ьеи

Туг

О1и

Ьуз

Ьеи

Рго

О1п

1040

1045

1050

О1у

Туг

Агд

Ьеи

О1и

Ьуз

Рго

Ьеи

Азп

Суз

Азр

Азр

О1и

Уа1

Туг

1055

1060

1065

Азр

Ьеи

МеЬ

Агд

О1п

Суз

Тгр

Агд

О1и

Ьуз

Рго

Туг

О1и

Агд

Рго

1070

1075

1080

5ег

РЬе

А1а

О1п

11е

Ьеи

Уа1

5ег

Ьеи

Азп

Агд

МеЬ

Ьеи

О1и

О1и

1085

1090

1095

Агд

Ьуз

ТЬг

Туг

Уа1

Азп

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Туг

О1и

Ьуз

РЬе

ТЬг

Туг

1100

1105

1110

А1а

О1у

11е

Азр

Суз

5ег

А1а

О1и

О1и

А1а

А1а

1115

1120

<210>	21
<211>	453
<212>	РРТ

- 44 032192 <213> Искусственная <220>

<223> тяжелая цепь 1 <МЕЕР-АЫЕ-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями (УЕСРапд2-0012) <400> 21

О1и Уа1 1

О1п Ьеи

Уа1 5

О1и

Бег

О1у

О1у О1у 10

Ьеи Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

О1у

Туг

Азр

РЪе

ТЪг

Н1з

Туг

20

25

30

О1у

Меб

Азп

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЪг

Туг

ТЪг

О1у

О1и

Рго

ТЪг

Туг

А1а

А1а

Азр

РЪе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РЪе

ТЪг

РЪе

Бег

Ьеи

Азр

ТЪг

Бег

Ьуз

Бег

ТЪг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Туг

Рго

Туг

Туг

Туг

О1у

ТЪг

Бег

Н1з

Тгр

Туг

РЪе

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

Бег

Бег

А1а

Бег

ТЪг

Ьуз

О1у

115

120

125

Рго

Бег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Бег

Бег

Ьуз

Бег

ТЪг

Бег

О1у

О1у

130

135

140

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЪе

Рго

О1и

Рго

Уа1

145

150

155

160

ТЪг

Уа1

Бег

Тгр

Азп

Бег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

Бег

О1у

Уа1

Н1з

ТЪг

РЪе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Бег

Бег

О1у

Ьеи

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТЪг

Уа1

Рго

Бег

Бег

Бег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Бег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

О1и

Рго

Ьуз

210

215

220

- 45 032192

Бег 225

Суз

Азр

Ьуз

ТНг

Н1з 230

ТНг

Суз

Рго

Рго

Суз 235

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи 240

Ьеи

О1у

О1у

Рго

Бег

Уа1

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

245

250

255

Ьеи

Меб

А1а

Бег

Агд

ТНг

Рго

О1и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

260

265

270

Бег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

275

280

285

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Бег

290

295

300

ТНг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

305

310

315

320

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

325

330

335

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТНг

11е

Бег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

340

345

350

О1п

Уа1

Туг

ТНг

Ьеи

Рго

Рго

Суз

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТНг

Ьуз

Азп

О1п

355

360

365

Уа1

Бег

Ьеи

Тгр

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РНе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

370

375

380

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Бег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

ТНг

385

390

395

400

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Бег

Азр

О1у

Бег

РНе

РНе

Ьеи

Туг

Бег

Ьуз

Ьеи

405

410

415

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РНе

Бег

Суз

Бег

420

425

430

Уа1

Меб

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

А1а

Туг

ТНг

О1п

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

435

440

445

Ьеи

Бег

Рго

О1у

Ьуз

<210> 22 <211> 463

450

- 46 032192 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 2 <νΕΟΡ-ΑΝΟ-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями (УЕСРапд2-0012) <400> 22

О1п Уа1 1

О1п

Ьеи να1 5

О1п

Еег

О1у

А1а

О1и 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

О1у 15

А1а

Еег

να1

Ьуз

να1

Еег

Суз

Ьуз

А1а

Еег

О1у

Туг

ТИг

РИе

ТИг

О1у

Туг

20

25

30

Туг

МеЕ

Н1з

Тгр

να1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

МеЕ

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Еег

О1у

О1у

ТИг

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РИе

50

55

60

О1п

О1у

Агд

να1

ТИг

МеЕ

ТИг

Агд

Азр

ТИг

Еег

11е

Еег

ТИг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЕ

О1и

Ьеи

Еег

Агд

Ьеи

Агд

Еег

Азр

Азр

ТИг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Еег

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

Азр

Еег

Еег

О1у

Туг

Туг

Туг

100

105

110

Рго

О1у

А1а

РИе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТИг

МеЕ

Уа1

ТИг

Уа1

Еег

115

120

125

Еег

А1а

Еег

να1

А1а

А1а

Рго

Еег

να1

РИе

11е

РИе

Рго

Рго

Еег

Азр

130

135

140

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Еег

О1у

ТИг

А1а

Еег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

145

150

155

160

РИе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

Ьуз

να1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

165

170

175

О1п

Еег

О1у

Азп

Еег

О1п

О1и

Еег

να1

ТИг

О1и

О1п

Азр

Еег

Ьуз

Азр

180

185

190

Еег

ТИг

Туг

Еег

Ьеи

Еег

Еег

ТИг

Ьеи

ТИг

Ьеи

Еег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

195

200

205

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

να1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТИг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Еег

210 215 220

- 47 032192

Вег 225

Рго

Уа1

ТЕг

Ьуз

Вег 230

РЕе

Азп

Агд

О1у

О1и 235

Суз

Азр

Ьуз

ТЕг

Н1з 240

ТЕг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

Рго

Вег

Уа1

245

250

255

РЕе

Ьеи

РЕе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЕг

Ьеи

Меб

А1а

Вег

Агд

ТЕг

260

265

270

Рго

О1и

Уа1

ТЕг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Вег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

275

280

285

Уа1

Ьуз

РЕе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

290

295

300

ТЕг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Вег

ТЕг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Вег

305

310

315

320

Уа1

Ьеи

ТЕг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

325

330

335

Суз

Ьуз

Уа1

Вег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТЕг

11е

340

345

350

Вег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Суз

ТЕг

Ьеи

Рго

355

360

365

Рго

Вег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТЕг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Вег

Ьеи

Вег

Суз

А1а

370

375

380

Уа1

Ьуз

О1у

РЕе

Туг

Рго

Вег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Вег

Азп

385

390

395

400

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЕг

ТЕг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Вег

405

410

415

Азр

О1у

Вег

РЕе

РЕе

Ьеи

Уа1

Вег

Ьуз

Ьеи

ТЕг

Уа1

Азр

Ьуз

Вег

Агд

420

425

430

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЕе

Вег

Суз

Вег

Уа1

Меб

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

435

440

445

Н1з

Азп

А1а

Туг

ТЕг

О1п

Ьуз

Вег

Ьеи

Вег

Ьеи

Вег

Рго

О1у

Ьуз

450

455

460

<210> 23

- 48 032192 <211> 214 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 1 <УЕСЕ-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями (УЕСЕапд2-0012) <400> 23

Азр 1

11е

О1п

Ьеи

ТЪг 5

О1п

Еег

Рго

Еег

Еег 10

Ьеи

Еег

А1а

Еег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТЪг

11е

ТЪг

Суз

Еег

А1а

Еег

О1п

Азр

11е

Еег

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

РЪе

ТЪг

Еег

Еег

Ьеи

Н1з

Еег

О1у

Уа1

Рго

Еег

Агд

РЪе

Еег

О1у

50

55

60

Еег

О1у

Еег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Еег

Еег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЪе

А1а

ТЪг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

Еег

ТЪг

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

Агд

ТЪг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Еег

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Рго

Рго

Еег

Азр

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Еег

О1у

115

120

125

ТЪг

А1а

Еег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЪе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Еег

О1у

Азп

Еег

О1п

145

150

155

160

О1и

Еег

Уа1

ТЪг

О1и

О1п

Азр

Еег

Ьуз

Азр

Еег

ТЪг

Туг

Еег

Ьеи

Еег

165

170

175

Еег

ТЪг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

Еег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЪг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Еег

Еег

Рго

Уа1

ТЪг

Ьуз

Еег

195

200

205

РЪе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

- 49 032192

210 <210> 24 <211> 213 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 2 <УЕСР-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями (УЕСР-Апд2-0012) <400> 24

Бег 1

Туг

Уа1

Ьеи

ТЪг 5

О1п

Рго

Рго

Бег

Уа1 10

Бег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЪг

А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

О1у

О1у

Азп

Азп

11е

О1у

Бег

Ьуз

Бег

Уа1

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

Азр

Азр

Бег

Азр

Агд

Рго

Бег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

50

55

60

Азп

Бег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1у

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Уа1

Тгр

Азр

Бег

Бег

Бег

Азр

Н1з

85

90

95

Тгр

Уа1

РЪе

О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

Бег

Бег

А1а

Бег

100

105

110

ТЪг

Ьуз

О1у

Рго

Бег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Бег

Бег

Ьуз

Бег

ТЪг

115

120

125

Бег

О1у

О1у

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЪе

Рго

130

135

140

О1и

Рго

Уа1

ТЪг

Уа1

Бег

Тгр

Азп

Бег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

Бег

О1у

Уа1

145

150

155

160

Н1з

ТЪг

РЪе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Бег

Бег

О1у

Ьеи

Туг

Бег

Ьеи

Бег

165

170

175

Бег

Уа1

Уа1

ТЪг

Уа1

Рго

Бег

Бег

Бег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

Туг

11е

180

185

190

Суз

Азп

Уа1

Азп

Нгз

Ьуз

Рго

Бег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

- 50 032192

195

200

205

О1и Рго Ьуз Еег Суз

210 <210> 25 <211> 453 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 1 <УЕСЕ-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями и Р329С ЬАЬА-мутациями (УЕСЕапд2-0016) <400> 25

О1и 1

Уа1

О1п

Ьеи Уа1 5

О1и

Еег

О1у

О1у О1у 10

Ьеи

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Еег

Ьеи

Агд

Ьеи

Еег

Суз

А1а

А1а

Еег

О1у

Туг

Азр

РЬе

ТЬг

Н1з

Туг

20

25

30

О1у

Мей

Азп

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЬг

Туг

ТЬг

О1у

О1и

Рго

ТЬг

Туг

А1а

А1а

Азр

РЬе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РЬе

ТЬг

РЬе

Еег

Ьеи

Азр

ТЬг

Еег

Ьуз

Еег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Мей

Азп

Еег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Туг

Рго

Туг

Туг

Туг

О1у

ТЬг

Еег

Н1з

Тгр

Туг

РЬе

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Еег

Еег

А1а

Еег

ТЬг

Ьуз

О1у

115

120

125

Рго

Еег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Еег

Еег

Ьуз

Еег

ТЬг

Еег

О1у

О1у

130

135

140

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

О1и

Рго

Уа1

145

150

155

160

ТЬг

Уа1

Еег

Тгр

Азп

Еег

О1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Еег

О1у

Уа1

Н1з

ТЬг

РЬе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Еег

Еег

О1у

Ьеи

Туг

Еег

Ьеи

Еег

Еег

Уа1

Уа1

- 51 032192

180

185

190

ТЪг

Уа1

Рго

Бег

Бег

Бег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Бег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

О1и

Рго

Ьуз

210

215

220

Бег

Суз

Азр

Ьуз

ТЪг

Н1з

ТЪг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

225

230

235

240

А1а

О1у

О1у

Рго

Бег

Уа1

РЪе

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

245

250

255

Ьеи

Меб

А1а

Бег

Агд

ТЪг

Рго

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

260

265

270

Бег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

275

280

285

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Бег

290

295

300

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

305

310

315

320

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

О1у

А1а

325

330

335

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТЪг

11е

Бег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

340

345

350

О1п

Уа1

Туг

ТЪг

Ьеи

Рго

Рго

Суз

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТЪг

Ьуз

Азп

О1п

355

360

365

Уа1

Бег

Ьеи

Тгр

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

370

375

380

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Бег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЪг

ТЪг

385

390

395

400

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Бег

Азр

О1у

Бег

РЪе

РЪе

Ьеи

Туг

Бег

Ьуз

Ьеи

405

410

415

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЪе

Бег

Суз

Бег

420

425

430

- 52 032192

Уа1 Меб Н1з О1и А1а Ьеи Н1з Азп А1а Туг ТЪг О1п Ьуз Вег Ьеи Вег

435 440 445

Ьеи Вег Рго О1у Ьуз

450 <210> 26 <211> 463 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 2 <УЕОР-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями и Р329О ЬАЬА-мутациями (УЕСРапд2-0016) <400> 26

О1п 1

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1п Вег

О1у А1а

О1и Уа1 10

Ьуз

Ьуз

Рго

О1у 15

А1а

Вег

Уа1

Ьуз

Уа1

Вег

Суз

Ьуз

А1а

Вег

О1у

Туг

ТЪг

РЪе

ТЪг

О1у

Туг

20

25

30

Туг

Меб

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Меб

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Вег

О1у

О1у

ТЪг

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РЪе

50

55

60

О1п

О1у

Агд

Уа1

ТЪг

Меб

ТЪг

Агд

Азр

ТЪг

Вег

11е

Вег

ТЪг

А1а

Туг

65

70

75

80

Меб

О1и

Ьеи

Вег

Агд

Ьеи

Агд

Вег

Азр

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Вег

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

Азр

Вег

Вег

О1у

Туг

Туг

Туг

100

105

110

Рго

О1у

А1а

РЪе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Меб

Уа1

ТЪг

Уа1

Вег

115

120

125

Вег

А1а

Вег

Уа1

А1а

А1а

Рго

Вег

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Рго

Рго

Вег

Азр

130

135

140

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Вег

О1у

ТЪг

А1а

Вег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

145

150

155

160

РЪе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

165

170

175

- 53 032192

О1п

Бег

О1у Азп 180

Бег О1п

О1и

Бег

Уа1 185

ТНг

О1и

О1п

Азр

Бег 190

Ьуз

Азр

Бег

ТНг

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

Бег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

195

200

205

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТНг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Бег

210

215

220

Бег

Рго

Уа1

ТНг

Ьуз

Бег

РНе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

Азр

Ьуз

ТНг

Н1з

225

230

235

240

ТНг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

А1а

О1у

О1у

Рго

Бег

Уа1

245

250

255

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

Меб

А1а

Бег

Агд

ТНг

260

265

270

Рго

О1и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Бег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

275

280

285

Уа1

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

290

295

300

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Бег

ТНг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

305

310

315

320

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

325

330

335

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТНг

11е

340

345

350

Бег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Суз

ТНг

Ьеи

Рго

355

360

365

Рго

Бег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТНг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Бег

Ьеи

Бег

Суз

А1а

370

375

380

Уа1

Ьуз

О1у

РНе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Бег

Азп

385

390

395

400

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТНг

ТНг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Бег

405

410

415

Азр

О1у

Бег

РНе

РНе

Ьеи

Уа1

Бег

Ьуз

Ьеи

ТНг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

420

425

430

- 54 032192

Тгр О1п О1п О1у Азп Уа1

435

РЪе Еег Суз

440

Еег Уа1

МеЕ Н1з О1и А1а Ьеи

445

Н1з Азп А1а Туг ТЪг О1п Ьуз

450 455

Еег Ьеи Еег Ьеи Еег Рго О1у Ьуз 460 <210> 27 <211> 214 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 1 <УЕОЕ-АИО-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями и Р329С ЬАЬА-мутациями (УЕСЕапд2-0016) <400> 27

Азр 1

11е

О1п

Ьеи

ТЪг 5

О1п

Еег

Рго

Еег

Еег 10

Ьеи

Еег

А1а

Еег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТЪг

11е

ТЪг

Суз

Еег

А1а

Еег

О1п

Азр

11е

Еег

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

РЪе

ТЪг

Еег

Еег

Ьеи

Н1з

Еег

О1у

Уа1

Рго

Еег

Агд

РЪе

Еег

О1у

50

55

60

Еег

О1у

Еег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Еег

Еег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЪе

А1а

ТЪг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

Еег

ТЪг

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

Агд

ТЪг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Еег

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Рго

Рго

Еег

Азр

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Еег

О1у

115

120

125

ТЪг

А1а

Еег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЪе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Еег

О1у

Азп

Еег

О1п

145

150

155

160

О1и

Еег

Уа1

ТЪг

О1и

О1п

Азр

Еег

Ьуз

Азр

Еег

ТЪг

Туг

Еег

Ьеи

Еег

165

170

175

- 55 032192

Вег

ТЕг

Ьеи

ТЕг 180

Ьеи

Вег

Ьуз

А1а

Азр 185

Туг

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз 190

Уа1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЕг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Вег

Вег

Рго

Уа1

ТЕг

Ьуз

Вег

195

200

205

РЕе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

210

<210> <211> <212> <213>

28 213 РРТ Искусственная

<220>

<223> Легкая цепь 2 <УЕОР-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО1 с ААА-мутациями и Р329О ЬАЬА-мутациями (УЕСРапд2-0016) <400> 28

Вег 1

Туг Уа1

Ьеи

ТЕг 5

О1п

Рго

Рго

Вег

Уа1 10

Вег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЕг

А1а

Агд

11е

ТЕг

Суз

О1у

О1у

Азп

Азп

11е

О1у

Вег

Ьуз

Вег

Уа1

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

Азр

Азр

Вег

Азр

Агд

Рго

Вег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЕе

Вег

О1у

Вег

50

55

60

Азп

Вег

О1у

Азп

ТЕг

А1а

ТЕг

Ьеи

ТЕг

11е

Вег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1у

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Уа1

Тгр

Азр

Вег

Вег

Вег

Азр

Н1з

85

90

95

Тгр

Уа1

РЕе

О1у

О1у

О1у

ТЕг

Ьуз

Ьеи

ТЕг

Уа1

Ьеи

Вег

Вег

А1а

Вег

100

105

110

ТЕг

Ьуз

О1у

Рго

Вег

Уа1

РЕе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Вег

Вег

Ьуз

Вег

ТЕг

115

120

125

Вег

О1у

О1у

ТЕг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЕе

Рго

130

135

140

О1и

Рго

Уа1

ТЕг

Уа1

Вег

Тгр

Азп

Вег

О1у

А1а

Ьеи

ТЕг

Вег

О1у

Уа1

145

150

155

160

- 56 032192

Н1з

ТЪг

РЪе

Рго

А1а 165

Уа1

Ьеи

О1п

5ег

5ег 170

О1у

Ьеи

Туг

5ег

Ьеи 175

5ег

5ег

Уа1

Уа1

ТЪг

Уа1

Рго

5ег

5ег

5ег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

Туг

11е

180

185

190

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

5ег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

195

200

205

О1и

Рго

Ьуз

5ег

Суз

210

<210>	29
<211>	450
<212>	РКТ
<213>	Искусственная
<220> <223>	Тяжелая цепь 1 <УЕСЕ-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с 5РЬЕ-мутациями
<400>	29

О1и Уа1 1

О1п Ьеи

Уа1 5

О1и

5ег

О1у О1у О1у 10

Ьеи

Уа1

О1п Рго

О1у 15

О1у

5ег

Ьеи

Агд

Ьеи

5ег

Суз

А1а

А1а

5ег

О1у

Туг

Азр

РЪе

ТЪг

Н1з

Туг

20

25

30

О1у

МеЕ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЪг

Туг

ТЪг

О1у

О1и

Рго

ТЪг

Туг

А1а

А1а

Азр

РЪе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РЪе

ТЪг

РЪе

5ег

Ьеи

Азр

ТЪг

5ег

Ьуз

5ег

ТЪг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЕ

Азп

5ег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Туг

Рго

Туг

Туг

Туг

О1у

ТЪг

5ег

Н1з

Тгр

Туг

РЪе

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

5ег

А1а

5ег

ТЪг

Ьуз

О1у

115

120

125

Рго

5ег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

5ег

Агд

5ег

ТЪг

5ег

О1и

5ег

130

135

140

- 57 032192

ТЪг 145

А1а

А1а

Ьеи

О1у Суз 150

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг 155

РЪе

Рго

О1и

Рго

Уа1 160

ТЪг

Уа1

Бег

Тгр

Азп

Бег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

Бег

О1у

Уа1

Н1з

ТЪг

РЪе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Бег

Бег

О1у

Ьеи

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТЪг

Уа1

Рго

Бег

Бег

Бег

Ьеи

О1у

ТЪг

Ьуз

ТЪг

Туг

ТЪг

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азр

Н1з

Ьуз

Рго

Бег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

О1и

Бег

Ьуз

210

215

220

Туг

О1у

Рго

Рго

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

РЪе

О1и

О1у

О1у

225

230

235

240

Рго

Бег

Уа1

РЪе

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

Ьеи

Меб

А1а

245

250

255

Бег

Агд

ТЪг

Рго

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Бег

О1п

О1и

260

265

270

Азр

Рго

О1и

Уа1

О1п

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

275

280

285

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

РЪе

Азп

Бег

ТЪг

Туг

Агд

290

295

300

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

305

310

315

320

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

О1у

Ьеи

Рго

Бег

Бег

11е

О1и

325

330

335

Ьуз

ТЪг

11е

Бег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Суз

340

345

350

ТЪг

Ьеи

Рго

Рго

Бег

О1п

О1и

О1и

Меб

ТЪг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Бег

Ьеи

355

360

365

Бег

Суз

А1а

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

370

375

380

О1и

Бег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЪг

ТЪг

Рго

Рго

Уа1

385 390 395 400

- 58 032192

Ьеи

Азр

Еег

Азр

О1у 405

Еег

РЪе

РЪе

Ьеи

Уа1 410

Еег

Агд

Ьеи

ТЪг

Уа1 415

Азр

Ьуз

Еег

Агд

Тгр

О1п

О1и

О1у

Азп

Уа1

РЪе

Еег

Суз

Еег

Уа1

МеЬ

Н1з

420

425

430

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

А1а

Туг

ТЪг

О1п

Ьуз

Еег

Ьеи

Еег

Ьеи

Еег

Ьеи

435

440

445

О1у Ьуз

450 <210> 30 <211> 460 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 2 <УЕОЕ-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО4 с ААА-мутациями и с ЕРЬЕ-мутациями <400> 30

О1п Уа1 1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1п

Еег

О1у

А1а

О1и 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

О1у 15

А1а

Еег

Уа1

Ьуз

Уа1

Еег

Суз

Ьуз

А1а

Еег

О1у

Туг

ТЪг

РЪе

ТЪг

О1у

Туг

20

25

30

Туг

МеЬ

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

МеЬ

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Еег

О1у

О1у

ТЪг

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РЪе

50

55

60

О1п

О1у

Агд

Уа1

ТЪг

МеЬ

ТЪг

Агд

Азр

ТЪг

Еег

11е

Еег

ТЪг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЬ

О1и

Ьеи

Еег

Агд

Ьеи

Агд

Еег

Азр

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Еег

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

Азр

Еег

Еег

О1у

Туг

Туг

Туг

100

105

110

Рго

О1у

А1а

РЪе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

МеЬ

Уа1

ТЪг

Уа1

Еег

115

120

125

Еег

А1а

Еег

Уа1

А1а

А1а

Рго

Еег

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Рго

Рго

Еег

Азр

130 135 140

- 59 032192

О1и С1п 145

Ьеи

Ьуз

Бег

О1у 150

ТЬг

А1а

Бег

Уа1

Уа1 155

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп 160

Рке

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

165

170

175

О1п

Бег

О1у

Азп

Бег

О1п

О1и

Бег

Уа1

ТЬг

О1и

О1п

Азр

Бег

Ьуз

Азр

180

185

190

Бег

ТЬг

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Бег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

195

200

205

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЬг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Бег

210

215

220

Бег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Бег

Рке

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

225

230

235

240

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Рке

О1и

О1у

О1у

Рго

Бег

Уа1

Рке

Ьеи

Рке

245

250

255

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЕ

А1а

Бег

Агд

ТЬг

Рго

О1и

Уа1

260

265

270

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Бег

О1п

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

О1п

Рке

275

280

285

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

290

295

300

Агд

О1и

О1и

О1п

Рке

Азп

Бег

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

ТЬг

305

310

315

320

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

325

330

335

Бег

Азп

Ьуз

О1у

Ьеи

Рго

Бег

Бег

11е

О1и

Ьуз

ТЬг

11е

Бег

Ьуз

А1а

340

345

350

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Рго

Суз

О1п

355

360

365

О1и

О1и

МеЕ

ТЬг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Бег

Ьеи

Тгр

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

370

375

380

Рке

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Бег

Азп

О1у

О1п

Рго

- 60 032192

385 390 395 400

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз 405

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго Уа1 410

Ьеи

Азр

Еег

Азр

О1у 415

Еег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Еег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Еег

Агд

Тгр

О1п

О1и

420

425

430

О1у

Азп

Уа1

РЬе

Еег

Суз

Еег

Уа1

Мей

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

А1а

435

440

445

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Еег

Ьеи

Еег

Ьеи

Еег

Ьеи

О1у

Ьуз

450

455

460

<210>	31
<211>	214
<212>	РРТ
<213>	Искусственная
<220> <223>	Легкая цепь 1 <УЕСЕ-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с ЕРЬЕ-мутациями
<400>	31

Азр 1

11е

О1п

Ьеи

ТЬг 5

О1п

Еег

Рго

Еег

Еег 10

Ьеи

Еег

А1а

Еег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Еег

А1а

Еег

О1п

Азр

11е

Еег

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

РЬе

ТЬг

Еег

Еег

Ьеи

Н1з

Еег

О1у

Уа1

Рго

Еег

Агд

РЬе

Еег

О1у

50

55

60

Еег

О1у

Еег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Еег

Еег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

Еег

ТЬг

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

ТЬг

РЬе

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Еег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Еег

Азр

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Еег

О1у

115

120

125

ТЬг

А1а

Еег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

- 61 032192

130 135140

Ьуз 145

Уа1

О1п Тгр

Ьуз

Уа1 150

Азр

Азп

А1а

Ьеи О1п 155

Вег

О1у

Азп

Вег

О1п 160

О1и

Вег

Уа1

ТЪг

О1и

О1п

Азр

Вег

Ьуз

Азр

Вег

ТЪг

Туг

Вег

Ьеи

Вег

165

170

175

Вег

ТЪг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

Вег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЪг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Вег

Вег

Рго

Уа1

ТЪг

Ьуз

Вег

195

200

205

РЪе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

210 <210>32 <211>213 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 2 <УЕОР-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО4 с ААА-мутациями и с ВРЬЕ-мутациями <400> 32

Вег 1

Туг

Уа1

Ьеи

ТЪг 5

О1п

Рго

Рго

Вег

Уа1 10

Вег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЪг

А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

О1у

О1у

Азп

Азп

11е

О1у

Вег

Ьуз

Вег

Уа1

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

Азр

Азр

Вег

Азр

Агд

Рго

Вег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Вег

О1у

Вег

50

55

60

Азп

Вег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Вег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1у

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Уа1

Тгр

Азр

Вег

Вег

Вег

Азр

Н1з

85

90

95

Тгр

Уа1

РЪе

О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

Вег

Вег

А1а

Вег

100

105

110

ТЪг

Ьуз

О1у

Рго

Вег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Вег

Агд

Вег

ТЪг

- 62 032192

115

120

125

Бег

О1и

Бег

ТНг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

130

135

140

О1и

Рго

Уа1

ТНг

Уа1

Бег

Тгр

Азп

Бег

О1у

А1а

Ьеи

ТНг

Бег

О1у

Уа1

145

150

155

160

Н1з

ТНг

РНе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Бег

Бег

О1у

Ьеи

Туг

Бег

Ьеи

Бег

165

170

175

Бег

Уа1

Уа1

ТНг

Уа1

Рго

Бег

Бег

Бег

Ьеи

О1у

ТНг

Ьуз

ТНг

Туг

ТНг

180

185

190

Суз

Азп

Уа1

Азр

Н1з

Ьуз

Рго

Бег

Азп

ТНг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

195

200

205

О1и

Бег

Ьуз

Туг

О1у

210 <210> 33 <211> 453 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 1 <УЕОЕ-АЫО-2> ОАзсЕаЬ 1дО1 с ААА-мутациями <400> 33

О1и 1

Уа1

О1п Ьеи

Уа1 5

О1и

Бег

О1у О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

О1у

Туг

Азр

РНе

ТНг

Н1з

Туг

20

25

30

О1у

Меб

Азп

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТНг

Туг

ТНг

О1у

О1и

Рго

ТНг

Туг

А1а

А1а

Азр

РНе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РНе

ТНг

РНе

Бег

Ьеи

Азр

ТНг

Бег

Ьуз

Бег

ТНг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Туг

Рго

Туг

Туг

Туг

О1у

ТНг

Бег

Н1з

Тгр

Туг

РНе

Азр

Уа1

100

105

110

- 63 032192

Тгр

О1у

О1п 115

О1у

ТЕг

Ьеи Уа1

ТЕг 120

Уа1

Вег

Вег

А1а

Вег 125

ТЕг

Ьуз

О1у

Рго

Вег

Уа1

РЕе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Вег

Вег

Ьуз

Вег

ТЕг

Вег

О1у

О1у

130

135

140

ТЕг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЕе

Рго

О1и

Рго

Уа1

145

150

155

160

ТЕг

Уа1

Вег

Тгр

Азп

Вег

О1у

А1а

Ьеи

ТЕг

Вег

О1у

Уа1

Н1з

ТЕг

РЕе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Вег

Вег

О1у

Ьеи

Туг

Вег

Ьеи

Вег

Вег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТЕг

Уа1

Рго

Вег

Вег

Вег

Ьеи

О1у

ТЕг

О1п

ТЕг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Вег

Азп

ТЕг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

О1и

Рго

Ьуз

210

215

220

Вег

Суз

Азр

Ьуз

ТЕг

Н1з

ТЕг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи

О1у

О1у

Рго

Вег

Уа1

РЕе

Ьеи

РЕе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЕг

245

250

255

Ьеи

Меб

А1а

Вег

Агд

ТЕг

Рго

О1и

Уа1

ТЕг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

260

265

270

Вег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЕе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

275

280

285

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЕг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Вег

290

295

300

ТЕг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Вег

Уа1

Ьеи

ТЕг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

305

310

315

320

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Вег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

325

330

335

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТЕг

11е

Вег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

340

345

350

О1п

Уа1

Суз

ТЕг

Ьеи

Рго

Рго

Вег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТЕг

Ьуз

Азп

О1п

- 64 032192

355

360

365

Уа1

Бег

Ьеи

Бег

Суз

А1а

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

370

375

380

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Бег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЪг

ТЪг

385

390

395

400

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Бег

Азр

О1у

Бег

РЪе

РЪе

Ьеи

Уа1

Бег

Ьуз

Ьеи

405

410

415

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЪе

Бег

Суз

Бег

420

425

430

Уа1

Меб

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

А1а

Туг

ТЪг

О1п

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

435

440

445

Ьеи

Бег

Рго

О1у

Ьуз

450 <210> 34 <211> 705 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 2 <МЕСР-АЫС-2> ОАзсРаЬ 1дО1 с ААА-мутациями <400> 34

Бег 1

Туг

Уа1

Ьеи

ТЪг 5

О1п Рго

Рго

Бег

Уа1 10

Бег Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЪг

А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

О1у

О1у

Азп

Азп

11е

О1у

Бег

Ьуз

Бег

Уа1

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

Азр

Азр

Бег

Азр

Агд

Рго

Бег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

50

55

60

Азп

Бег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1у

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Уа1

Тгр

Азр

Бег

Бег

Бег

Азр

Н1з

85

90

95

Тгр

Уа1

РЪе

О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

Рго

Ьуз

100

105

110

- 65 032192

А1а

А1а

Рго 115

Бег

Уа1

ТЪг

Ьеи

РЪе 120

Рго

Рго

Бег

Бег О1и 125

О1и Ьеи

О1п

А1а

Азп

Ьуз

А1а

ТЪг

Ьеи

Уа1

Суз

Ьеи

11е

Бег

Азр

РЪе

Туг

Рго

О1у

130

135

140

А1а

Уа1

ТЪг

Уа1

А1а

Тгр

Ьуз

А1а

Азр

Бег

Бег

Рго

Уа1

Ьуз

А1а

О1у

145

150

155

160

Уа1

О1и

ТЪг

ТЪг

ТЪг

Рго

Бег

Ьуз

О1п

Бег

Азп

Азп

Ьуз

Туг

А1а

А1а

165

170

175

Бег

Бег

Туг

Ьеи

Бег

Ьеи

ТЪг

Рго

О1и

О1п

Тгр

Ьуз

Бег

Н1з

Агд

Бег

180

185

190

Туг

Бег

Суз

О1п

Уа1

ТЪг

Н1з

О1и

О1у

Бег

ТЪг

Уа1

О1и

Ьуз

ТЪг

Уа1

195

200

205

А1а

Рго

ТЪг

О1и

Суз

Бег

О1у

О1у

О1у

О1у

Бег

О1у

О1у

О1у

О1у

Бег

210

215

220

О1у

О1у

О1у

О1у

Бег

О1у

О1у

О1у

О1у

Бег

О1у

О1у

О1у

О1у

Бег

О1у

225

230

235

240

О1у

О1у

О1у

Бег

О1у

О1у

О1п

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1

О1и

Бег

О1у

А1а

О1и

245

250

255

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

О1у

А1а

Бег

Уа1

Ьуз

Уа1

Бег

Суз

Ьуз

А1а

Бег

О1у

260

265

270

Туг

ТЪг

РЪе

ТЪг

О1у

Туг

Туг

Меб

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

275

280

285

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Меб

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Бег

О1у

О1у

ТЪг

290

295

300

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РЪе

О1п

О1у

Агд

Уа1

ТЪг

Меб

ТЪг

Агд

Азр

ТЪг

305

310

315

320

Бег

11е

Бег

ТЪг

А1а

Туг

Меб

О1и

Ьеи

Бег

Агд

Ьеи

Агд

Бег

Азр

Азр

325

330

335

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Бег

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

Азр

340

345

350

Бег

Бег

О1у

Туг

Туг

Туг

Рго

О1у

А1а

РЪе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

- 66 032192

355

360

365

ТЪг

МеЕ 370

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

5ег 375

А1а

5ег

ТЪг

Ьуз

О1у 380

Рго

5ег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

5ег

5ег

Ьуз

5ег

ТЪг

5ег

О1у

О1у

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

385

390

395

400

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЪе

Рго

О1и

Рго

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

Тгр

405

410

415

Азп

5ег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

5ег

О1у

Уа1

Н1з

ТЪг

РЪе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

420

425

430

О1п

5ег

5ег

О1у

Ьеи

Туг

5ег

Ьеи

5ег

5ег

Уа1

Уа1

ТЪг

Уа1

Рго

5ег

435

440

445

5ег

5ег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

450

455

460

5ег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

О1и

Рго

Ьуз

5ег

Суз

Азр

Ьуз

465

470

475

480

ТЪг

Н1з

ТЪг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

Рго

485

490

495

5ег

Уа1

РЪе

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

Ьеи

МеЕ

А1а

5ег

500

505

510

Агд

ТЪг

Рго

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

5ег

Н1з

О1и

Азр

515

520

525

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

530

535

540

А1а

Ьуз

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

5ег

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

545

550

555

560

Уа1

5ег

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

565

570

575

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

5ег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

580

585

590

ТЪг

11е

5ег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЪг

595

600

605

- 67 032192

Ьеи

Рго 610

Рго

Суз

Агд

Азр

О1и 615

Ьеи

ТИг

Ьуз

Азп

О1п 620

Уа1

Еег

Ьеи

Тгр

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РИе

Туг

Рго

Еег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

625

630

635

640

Еег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТИг

ТИг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

645

650

655

Азр

Еег

Азр

О1у

Еег

РИе

РИе

Ьеи

Туг

Еег

Ьуз

Ьеи

ТИг

Уа1

Азр

Ьуз

660

665

670

Еег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РИе

Еег

Суз

Еег

Уа1

МеЕ

Н1з

О1и

675

680

685

А1а

Ьеи

Нгз

Азп

А1а

Туг

ТИг

О1п

Ьуз

Еег

Ьеи

Еег

Ьеи

Еег

Рго

О1у

690

695

700

Ьуз

705 <210> 35 <211> 214 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 1 <УЕСЕ-А№-2> ОАзсЕаЬ 1дО1 с ААА-мутациями <400> 35

Азр 1

11е

О1п

Ьеи

ТИг 5

О1п

Еег

Рго

Еег

Еег 10

Ьеи

Еег

А1а

Еег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТИг

11е

ТИг

Суз

Еег

А1а

Еег

О1п

Азр

11е

Еег

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

РИе

ТИг

Еег

Еег

Ьеи

Н1з

Еег

О1у

Уа1

Рго

Еег

Агд

РИе

Еег

О1у

50

55

60

Еег

О1у

Еег

О1у

ТИг

Азр

РИе

ТИг

Ьеи

ТИг

11е

Еег

Еег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РИе

А1а

ТИг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

Еег

ТИг

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

ТИг

РИе

О1у

О1п

О1у

ТИг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

Агд

ТИг

Уа1

А1а

А1а

- 68 032192

100

105

110

Рго

Еег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

Рго

Еег

Азр

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Еег

О1у

115

120

125

ТЬг

А1а

Еег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Еег

О1у

Азп

Еег

О1п

145

150

155

160

О1и

Еег

Уа1

ТЬг

О1и

О1п

Азр

Еег

Ьуз

Азр

Еег

ТЬг

Туг

Еег

Ьеи

Еег

165

170

175

Еег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Еег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЬг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Еег

Еег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Еег

195

200

205

РЬе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

210

<210>	36
<211>	450
<212>	РРТ
<213>	Искусственная
<220> <223>	Тяжелая цепь 1 <УЕСЕ-АЫС-2> ОАзсЕаЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с ЕРЬЕ-мутациями
<400>	36

О1и Уа1 1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1и

Еег О1у

О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Еег

Ьеи

Агд

Ьеи

Еег

Суз

А1а

А1а

Еег

О1у

Туг

Азр

РЬе

ТЬг

Н1з

Туг

20

25

30

О1у

Мей

Азп

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЬг

Туг

ТЬг

О1у

О1и

Рго

ТЬг

Туг

А1а

А1а

Азр

РЬе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РЬе

ТЬг

РЬе

Еег

Ьеи

Азр

ТЬг

Еег

Ьуз

Еег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Мей

Азп

Еег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

- 69 032192

А1а

Ьуз

Туг

Рго 100

Туг

Туг

Туг

О1у

ТЪг 105

Вег

Н1з

Тгр

Туг

РЪе 110

Азр

Уа1

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

Вег

Вег

А1а

Вег

ТЪг

Ьуз

О1у

115

120

125

Рго

Вег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Вег

Агд

Вег

ТЪг

Вег

О1и

Вег

130

135

140

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЪе

Рго

О1и

Рго

Уа1

145

150

155

160

ТЪг

Уа1

Вег

Тгр

Азп

Вег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

Вег

О1у

Уа1

Н1з

ТЪг

РЪе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Вег

Вег

О1у

Ьеи

Туг

Вег

Ьеи

Вег

Вег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТЪг

Уа1

Рго

Вег

Вег

Вег

Ьеи

О1у

ТЪг

Ьуз

ТЪг

Туг

ТЪг

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азр

Н1з

Ьуз

Рго

Вег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

О1и

Вег

Ьуз

210

215

220

Туг

О1у

Рго

Рго

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

РЪе

О1и

О1у

О1у

225

230

235

240

Рго

Вег

Уа1

РЪе

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

Ьеи

Меб

А1а

245

250

255

Вег

Агд

ТЪг

Рго

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

Вег

О1п

О1и

260

265

270

Азр

Рго

О1и

Уа1

О1п

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

275

280

285

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

РЪе

Азп

Вег

ТЪг

Туг

Агд

290

295

300

Уа1

Уа1

Вег

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

305

310

315

320

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Вег

Азп

Ьуз

О1у

Ьеи

Рго

Вег

Вег

11е

О1и

325

330

335

- 70 032192

Ьуз

ТЪг

11е

Бег 340

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п 345

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п 350

Уа1

Суз

ТЪг

Ьеи

Рго

Рго

Бег

О1п

О1и

О1и

Меб

ТЪг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Бег

Ьеи

355

360

365

Бег

Суз

А1а

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

370

375

380

О1и

Бег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЪг

ТЪг

Рго

Рго

Уа1

385

390

395

400

Ьеи

Азр

Бег

Азр

О1у

Бег

РЪе

РЪе

Ьеи

Уа1

Бег

Агд

Ьеи

ТЪг

Уа1

Азр

405

410

415

Ьуз

Бег

Агд

Тгр

О1п

О1и

О1у

Азп

Уа1

РЪе

Бег

Суз

Бег

Уа1

Меб

Н1з

420

425

430

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

А1а

Туг

ТЪг

О1п

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

435

440

445

О1у Ьуз

450 <210> 37 <211> 702 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 2 <МЕЬР-АЫЬ-2> ОАзсРаЬ 1дС4 с ААА-мутациями и с БРЬЕ-мутациями <400> 37

Бег 1

Туг

Уа1

Ьеи

ТЪг 5

О1п

Рго

Рго

Бег

Уа1 10

Бег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЪг

А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

О1у

О1у

Азп

Азп

11е

О1у

Бег

Ьуз

Бег

Уа1

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

Азр

Азр

Бег

Азр

Агд

Рго

Бег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

50

55

60

Азп

Бег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1у

65

70

75

80

- 71 032192

Азр

О1и

А1а Азр

Туг Туг 85

Суз

О1п

Уа1

Тгр 90

Азр

Вег

Вег

Вег

Азр 95

Н1з

Тгр

Уа1

РЕе

О1у

О1у

О1у

ТЕг

Ьуз

Ьеи

ТЕг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

Рго

Ьуз

100

105

110

А1а

А1а

Рго

Вег

Уа1

ТЕг

Ьеи

РЕе

Рго

Рго

Вег

Вег

О1и

О1и

Ьеи

О1п

115

120

125

А1а

Азп

Ьуз

А1а

ТЕг

Ьеи

Уа1

Суз

Ьеи

11е

Вег

Азр

РЕе

Туг

Рго

О1у

130

135

140

А1а

Уа1

ТЕг

Уа1

А1а

Тгр

Ьуз

А1а

Азр

Вег

Вег

Рго

Уа1

Ьуз

А1а

О1у

145

150

155

160

Уа1

О1и

ТЕг

ТЕг

ТЕг

Рго

Вег

Ьуз

О1п

Вег

Азп

Азп

Ьуз

Туг

А1а

А1а

165

170

175

Вег

Вег

Туг

Ьеи

Вег

Ьеи

ТЕг

Рго

О1и

О1п

Тгр

Ьуз

Вег

Н1з

Агд

Вег

180

185

190

Туг

Вег

Суз

О1п

Уа1

ТЕг

Н1з

О1и

О1у

Вег

ТЕг

Уа1

О1и

Ьуз

ТЕг

Уа1

195

200

205

А1а

Рго

ТЕг

О1и

Суз

Вег

О1у

О1у

О1у

О1у

Вег

О1у

О1у

О1у

О1у

Вег

210

215

220

О1у

О1у

О1у

О1у

Вег

О1у

О1у

О1у

О1у

Вег

О1у

О1у

О1у

О1у

Вег

О1у

225

230

235

240

О1у

О1у

О1у

Вег

О1у

О1у

О1п

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1

О1и

Вег

О1у

А1а

О1и

245

250

255

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

О1у

А1а

Вег

Уа1

Ьуз

Уа1

Вег

Суз

Ьуз

А1а

Вег

О1у

260

265

270

Туг

ТЕг

РЕе

ТЕг

О1у

Туг

Туг

Меб

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

275

280

285

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Меб

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Вег

О1у

О1у

ТЕг

290

295

300

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РЕе

О1п

О1у

Агд

Уа1

ТЕг

Меб

ТЕг

Агд

Азр

ТЕг

305

310

315

320

Вег

11е

Вег

ТЕг

А1а

Туг

Меб

О1и

Ьеи

Вег

Агд

Ьеи

Агд

Вег

Азр

Азр

325

330

335

- 72 032192

ТЪг

А1а

Уа1

Туг 340

Туг

Суз

А1а

Агд

5ег 345

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг 350

Туг

Азр

5ег

5ег

О1у

Туг

Туг

Туг

Рго

О1у

А1а

РЪе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

355

360

365

ТЪг

МеЕ

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

5ег

А1а

5ег

ТЪг

Ьуз

О1у

Рго

5ег

Уа1

РЪе

370

375

380

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

5ег

Агд

5ег

ТЪг

5ег

О1и

5ег

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

385

390

395

400

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЪе

Рго

О1и

Рго

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

Тгр

405

410

415

Азп

5ег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

5ег

О1у

Уа1

Н1з

ТЪг

РЪе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

420

425

430

О1п

5ег

5ег

О1у

Ьеи

Туг

5ег

Ьеи

5ег

5ег

Уа1

Уа1

ТЪг

Уа1

Рго

5ег

435

440

445

5ег

5ег

Ьеи

О1у

ТЪг

Ьуз

ТЪг

Туг

ТЪг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Н1з

Ьуз

Рго

450

455

460

5ег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Агд

Уа1

О1и

5ег

Ьуз

Туг

О1у

Рго

Рго

465

470

475

480

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

РЪе

О1и

О1у

О1у

Рго

5ег

Уа1

РЪе

485

490

495

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

Ьеи

МеЕ

А1а

5ег

Агд

ТЪг

Рго

500

505

510

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

5ег

О1п

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

515

520

525

О1п

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг

530

535

540

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

РЪе

Азп

5ег

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

5ег

Уа1

545

550

555

560

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

А1а

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

565

570

575

Ьуз

Уа1

5ег

Азп

Ьуз

О1у

Ьеи

Рго

5ег

5ег

11е

О1и

Ьуз

ТЪг

11е

5ег

580

585

590

- 73 032192

Ьуз

А1а

Ьуз 595

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и 600

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЬг 605

Ьеи

Рго

Рго

Суз

О1п

О1и

О1и

Мей

ТЬг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Еег

Ьеи

Тгр

Суз

Ьеи

Уа1

610

615

620

Ьуз

О1у

РЬе

Туг

Рго

Еег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Еег

Азп

О1у

625

630

635

640

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЬг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Еег

Азр

645

650

655

О1у

Еег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

Еег

Агд

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Ьуз

Еег

Агд

Тгр

660

665

670

О1п

О1и

О1у

Азп

Уа1

РЬе

Еег

Суз

Еег

Уа1

Мей

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

675

680

685

Азп

А1а

Туг

ТЬг

О1п

Ьуз

Еег

Ьеи

Еег

Ьеи

Еег

Ьеи

О1у

Ьуз

690

695

700

<210> 38 <211> 214 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 1 <УЕСЕ-АЫС-2> ОАзсЕаЬ 1дС4 с ААА мутациями и с ЕРЬЕ-мутациями <400> 38

Азр 1

11е

О1п

Ьеи

ТЬг 5

О1п

Еег

Рго

Еег

Еег 10

Ьеи

Еег

А1а

Еег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Еег

А1а

Еег

О1п

Азр

11е

Еег

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

РЬе

ТЬг

Еег

Еег

Ьеи

Н1з

Еег

О1у

Уа1

Рго

Еег

Агд

РЬе

Еег

О1у

50

55

60

Еег

О1у

Еег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Еег

Еег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

Еег

ТЬг

Уа1

Рго

Тгр

90 95

- 74 032192

ТЪг

РЪе

О1у О1п 100

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и 105

11е

Ьуз

Агд

ТЪг

Уа1 110

А1а

А1а

Рго

Вег

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Рго

Рго

Вег

Азр

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Вег

О1у

115

120

125

ТЪг

А1а

Вег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЪе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Вег

О1у

Азп

Вег

О1п

145

150

155

160

О1и

Вег

Уа1

ТЪг

О1и

О1п

Азр

Вег

Ьуз

Азр

Вег

ТЪг

Туг

Вег

Ьеи

Вег

165

170

175

Вег

ТЪг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

Вег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЪг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Вег

Вег

Рго

Уа1

ТЪг

Ьуз

Вег

195

200

205

РЪе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

210 <210> 39 <211> 453 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 1 <УЕОР-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО1 дикого типа без ААА-мутаций) (УЕСРапд2-0201) <400> 39

О1и Уа1 1

О1п

Ьеи Уа1 5

О1и

Вег О1у О1у О1у 10

Ьеи Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Вег

Ьеи

Агд

Ьеи

Вег

Суз

А1а

А1а

Вег

О1у

Туг

Азр

РЪе

ТЪг

Н1з

Туг

20

25

30

О1у

Меб

Азп

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЪг

Туг

ТЪг

О1у

О1и

Рго

ТЪг

Туг

А1а

А1а

Азр

РЪе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РЪе

ТЪг

РЪе

Вег

Ьеи

Азр

ТЪг

Вег

Ьуз

Вег

ТЪг

А1а

Туг

70 75 80

- 75 032192

Ьеи

О1п Меб

Азп

Бег 85

Ьеи Агд А1а

О1и

Азр 90

ТНг

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Ьуз

Туг

Рго

Туг

Туг

Туг

О1у

ТНг

Бег

Н1з

Тгр

Туг

РНе

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТНг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Бег

Бег

А1а

Бег

ТНг

Ьуз

О1у

115

120

125

Рго

Бег

Уа1

РНе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Бег

Бег

Ьуз

Бег

ТНг

Бег

О1у

О1у

130

135

140

ТНг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РНе

Рго

О1и

Рго

Уа1

145

150

155

160

ТНг

Уа1

Бег

Тгр

Азп

Бег

О1у

А1а

Ьеи

ТНг

Бег

О1у

Уа1

Н1з

ТНг

РНе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Бег

Бег

О1у

Ьеи

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТНг

Уа1

Рго

Бег

Бег

Бег

Ьеи

О1у

ТНг

О1п

ТНг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Бег

Азп

ТНг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

О1и

Рго

Ьуз

210

215

220

Бег

Суз

Азр

Ьуз

ТНг

Н1з

ТНг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

225

230

235

240

Ьеи

О1у

О1у

Рго

Бег

Уа1

РНе

Ьеи

РНе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТНг

245

250

255

Ьеи

Меб

11е

Бег

Агд

ТНг

Рго

О1и

Уа1

ТНг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

260

265

270

Бег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РНе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

275

280

285

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТНг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Бег

290

295

300

ТНг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

Н1з

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

305

310

315

320

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

- 76 032192

325

330

335

Рго

11е

О1и

Ьуз 340

ТЪг

11е

Еег

Ьуз

А1а 345

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд 350

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЪг

Ьеи

Рго

Рго

Суз

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТЪг

Ьуз

Азп

О1п

355

360

365

Уа1

Еег

Ьеи

Тгр

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

Еег

Азр

11е

А1а

370

375

380

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Еег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЪг

ТЪг

385

390

395

400

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Еег

Азр

О1у

Еег

РЪе

РЪе

Ьеи

Туг

Еег

Ьуз

Ьеи

405

410

415

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз

Еег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЪе

Еег

Суз

Еег

420

425

430

Уа1

Меб

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Нгз

Азп

Нгз

Туг

ТЪг

О1п

Ьуз

Еег

Ьеи

Еег

435

440

445

Ьеи Еег Рго О1у Ьуз

450 <210> 40 <211> 463 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Тяжелая цепь 2 <УЕОЕ-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО1 дикого типа (без ААА-мутаций) (УЕСЕапд2-0201) <400> 40

О1п Уа1 1

О1п

Ьеи Уа1 5

О1п

Еег О1у

А1а О1и Уа1 10

Ьуз

Ьуз

Рго

О1у 15

А1а

Еег

Уа1

Ьуз

Уа1

Еег

Суз

Ьуз

А1а

Еег

О1у

Туг

ТЪг

РЪе

ТЪг

О1у

Туг

20

25

30

Туг

Меб

Н1з

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

О1п

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Меб

35

40

45

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

Еег

О1у

О1у

ТЪг

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РЪе

50

55

60

О1п

О1у

Агд

Уа1

ТЪг

Меб

ТЪг

Агд

Азр

ТЪг

Еег

11е

Еег

ТЪг

А1а

Туг

- 77 032192

МеЕ

О1и

Ьеи

5ег Агд 85

Ьеи Агд

5ег

Азр

Азр 90

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агд

5ег

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

Азр

5ег

5ег

О1у

Туг

Туг

Туг

100

105

110

Рго

О1у

А1а

РЪе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

МеЕ

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

115

120

125

5ег

А1а

5ег

Уа1

А1а

А1а

Рго

5ег

Уа1

РЪе

11е

РЪе

Рго

Рго

5ег

Азр

130

135

140

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

5ег

О1у

ТЪг

А1а

5ег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

145

150

155

160

РЪе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

165

170

175

О1п

5ег

О1у

Азп

5ег

О1п

О1и

5ег

Уа1

ТЪг

О1и

О1п

Азр

5ег

Ьуз

Азр

180

185

190

5ег

ТЪг

Туг

5ег

Ьеи

5ег

5ег

ТЪг

Ьеи

ТЪг

Ьеи

5ег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

195

200

205

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЪг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

5ег

210

215

220

5ег

Рго

Уа1

ТЪг

Ьуз

5ег

РЪе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

Азр

Ьуз

ТЪг

Н1з

225

230

235

240

ТЪг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

Рго

5ег

Уа1

245

250

255

РЪе

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

Ьеи

МеЕ

11е

5ег

Агд

ТЪг

260

265

270

Рго

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

5ег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

275

280

285

Уа1

Ьуз

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

290

295

300

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

5ег

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

5ег

305

310

315

320

- 78 032192

Уа1

Ьеи

ТИг

Уа1

Ьеи 325

Н1з

О1п

Азр

Тгр

Ьеи 330

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг 335

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТИг

11е

340

345

350

Бег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Суз

ТИг

Ьеи

Рго

355

360

365

Рго

Бег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТИг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Бег

Ьеи

Бег

Суз

А1а

370

375

380

Уа1

Ьуз

О1у

РИе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Бег

Азп

385

390

395

400

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТИг

ТИг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Бег

405

410

415

Азр

О1у

Бег

РИе

РИе

Ьеи

Уа1

Бег

Ьуз

Ьеи

ТИг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

420

425

430

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РИе

Бег

Суз

Бег

Уа1

МеЕ

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

435

440

445

Нгз

Азп

Нгз

Туг

ТИг

О1п

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Бег

Рго

О1у

Ьуз

450

455

460

<210> <211> <212> <213>

41 214 РРТ Искусственная

<220>

<223> Легкая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дО1 дикого типа (без ААА-мутаций) (УЕСРапд2-0201) <400> 41

Азр 1

11е

О1п Ьеи

ТИг 5

О1п

Бег

Рго

Бег

Бег 10

Ьеи

Бег

А1а

Бег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТИг

11е

ТИг

Суз

Бег

А1а

Бег

О1п

Азр

11е

Бег

Азп

Туг

20

25

30

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Уа1

Ьеи

11е

35

40

45

Туг

РИе

ТИг

Бег

Бег

Ьеи

Н1з

Бег

О1у

Уа1

Рго

Бег

Агд

РИе

Бег

О1у

50

55

60

- 79 032192

Вег 65

О1у

Вег

О1у

ТЕг

Азр 70

РЕе

ТЕг

Ьеи

ТЕг

11е 75

Вег

Вег

Ьеи

О1п

Рго 80

О1и

Азр

РЕе

А1а

ТЕг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

Вег

ТЕг

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

ТЕг

РЕе

О1у

О1п

О1у

ТЕг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

Агд

ТЕг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Вег

Уа1

РЕе

11е

РЕе

Рго

Рго

Вег

Азр

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Вег

О1у

115

120

125

ТЕг

А1а

Вег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РЕе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Вег

О1у

Азп

Вег

О1п

145

150

155

160

О1и

Вег

Уа1

ТЕг

О1и

О1п

Азр

Вег

Ьуз

Азр

Вег

ТЕг

Туг

Вег

Ьеи

Вег

165

170

175

Вег

ТЕг

Ьеи

ТЕг

Ьеи

Вег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЕг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Вег

Вег

Рго

Уа1

ТЕг

Ьуз

Вег

195

200

205

РЕе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

210 <210> 42 <211> 213 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 2 <УЕОР-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО1 дикого типа (без ААА-мутаций) (УЕбРапд2-0201) <400> 42

Вег 1

Туг Уа1

Ьеи

ТЕг О1п 5

Рго

Рго

Вег Уа1 10

Вег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЕг

А1а

Агд

11е

ТЕг

Суз

О1у

О1у

Азп

Азп

11е

О1у

Вег

Ьуз

Вег

Уа1

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

- 80 032192

Азр

Азр 50

Еег

Азр

Агд

Рго

Еег 55

О1у

11е

Рго

О1и

Агд 60

РЬе

Еег

О1у

Еег

Азп

Еег

О1у

Азп

ТЬг

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Еег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1у

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Уа1

Тгр

Азр

Еег

Еег

Еег

Азр

Н1з

85

90

95

Тгр

Уа1

РЬе

О1у

О1у

О1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Еег

Еег

А1а

Еег

100

105

110

ТЬг

Ьуз

О1у

Рго

Еег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Еег

Еег

Ьуз

Еег

ТЬг

115

120

125

Еег

О1у

О1у

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

130

135

140

О1и

Рго

Уа1

ТЬг

Уа1

Еег

Тгр

Азп

Еег

О1у

А1а

Ьеи

ТЬг

Еег

О1у

Уа1

145

150

155

160

Н1з

ТЬг

РЬе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Еег

Еег

О1у

Ьеи

Туг

Еег

Ьеи

Еег

165

170

175

Еег

Уа1

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Еег

Еег

Еег

Ьеи

О1у

ТЬг

О1п

ТЬг

Туг

11е

180

185

190

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Еег

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

195

200

205

О1и

Рго

Ьуз

Еег

Суз

210

<210> <211> <212> <213>	43 453 РРТ Искусственная
<220> <223>	Тяжелая цепь 1 <УЕСЕ-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дО1 только с Р329С ЬАЬА-
	мутациями (без ААА-мутаций) (УЕСЕапд2-0015)
<400>	43

О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Еег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго

5 10

О1у О1у

Еег Ьеи Агд Ьеи

Еег Суз А1а А1а Еег

О1у Туг Азр РЬе ТЬг Н1з

Туг

- 81 032192

О1у

Меб

Азп Тгр Уа1 35

Агд

О1п А1а 40

Рго

О1у Ьуз

О1у

Ьеи 45

О1и

Тгр

Уа1

О1у

Тгр

11е

Азп

ТЪг

Туг

ТЪг

О1у

О1и

Рго

ТЪг

Туг

А1а

А1а

Азр

РЪе

50

55

60

Ьуз

Агд

Агд

РЪе

ТЪг

РЪе

Бег

Ьеи

Азр

ТЪг

Бег

Ьуз

Бег

ТЪг

А1а

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Ьуз

Туг

Рго

Туг

Туг

Туг

О1у

ТЪг

Бег

Н1з

Тгр

Туг

РЪе

Азр

Уа1

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

Бег

Бег

А1а

Бег

ТЪг

Ьуз

О1у

115

120

125

Рго

Бег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Бег

Бег

Ьуз

Бег

ТЪг

Бег

О1у

О1у

130

135

140

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЪе

Рго

О1и

Рго

Уа1

145

150

155

160

ТЪг

Уа1

Бег

Тгр

Азп

Бег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

Бег

О1у

Уа1

Н1з

ТЪг

РЪе

165

170

175

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Бег

Бег

О1у

Ьеи

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Бег

Уа1

Уа1

180

185

190

ТЪг

Уа1

Рго

Бег

Бег

Бег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

195

200

205

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Бег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

О1и

Рго

Ьуз

210

215

220

Бег

Суз

Азр

Ьуз

ТЪг

Н1з

ТЪг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

225

230

235

240

А1а

О1у

О1у

Рго

Бег

Уа1

РЪе

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

245

250

255

Ьеи

Меб

11е

Бег

Агд

ТЪг

Рго

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

260

265

270

Бег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

275

280

285

- 82 032192

О1и Уа1 290

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг 295

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и О1п 300

Туг

Азп

Вег

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Вег

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

Н1з

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

305

310

315

320

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

Вег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

О1у

А1а

325

330

335

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТЪг

11е

Вег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

340

345

350

О1п

Уа1

Туг

ТЪг

Ьеи

Рго

Рго

Суз

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТЪг

Ьуз

Азп

О1п

355

360

365

Уа1

Вег

Ьеи

Тгр

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

Вег

Азр

11е

А1а

370

375

380

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Вег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЪг

ТЪг

385

390

395

400

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Вег

Азр

О1у

Вег

РЪе

РЪе

Ьеи

Туг

Вег

Ьуз

Ьеи

405

410

415

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз

Вег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЪе

Вег

Суз

Вег

420

425

430

Уа1

Меб

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЪг

О1п

Ьуз

Вег

Ьеи

Вег

435

440

445

Ьеи

Вег

Рго

О1у

Ьуз

450

<210> <211> <212> <213>	44 463 РКТ Искусственная
<220> <223>	Тяжелая цепь 2 <УЕОР-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО1 только с Р329О ЬАЬА-
	мутациями (без ААА-мутаций) (УЕСРапд2-0015)
<400>	44

О1п Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1п Вег О1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго О1у А1а

5 10 15

Вег Уа1 Ьуз Уа1

Вег Суз Ьуз А1а Вег

О1у Туг ТЪг РЪе

ТЪг О1у Туг

- 83 032192

Туг

МеЕ

Н1з 35

Тгр

Уа1

Агд О1п

А1а 40

Рго

О1у

О1п

О1у Ьеи 45

О1и

Тгр

МеЕ

О1у

Тгр

11е

Азп

Рго

Азп

5ег

О1у

О1у

ТИг

Азп

Туг

А1а

О1п

Ьуз

РИе

50

55

60

О1п

О1у

Агд

Уа1

ТИг

МеЕ

ТИг

Агд

Азр

ТИг

5ег

11е

5ег

ТИг

А1а

Туг

65

70

75

80

МеЕ

О1и

Ьеи

5ег

Агд

Ьеи

Агд

5ег

Азр

Азр

ТИг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

5ег

Рго

Азп

Рго

Туг

Туг

Туг

Азр

5ег

5ег

О1у

Туг

Туг

Туг

100

105

110

Рго

О1у

А1а

РИе

Азр

11е

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТИг

МеЕ

Уа1

ТИг

Уа1

5ег

115

120

125

5ег

А1а

5ег

Уа1

А1а

А1а

Рго

5ег

Уа1

РИе

11е

РИе

Рго

Рго

5ег

Азр

130

135

140

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

5ег

О1у

ТИг

А1а

5ег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

145

150

155

160

РИе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

165

170

175

О1п

5ег

О1у

Азп

5ег

О1п

О1и

5ег

Уа1

ТИг

О1и

О1п

Азр

5ег

Ьуз

Азр

180

185

190

5ег

ТИг

Туг

5ег

Ьеи

5ег

5ег

ТИг

Ьеи

ТИг

Ьеи

5ег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

195

200

205

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТИг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

5ег

210

215

220

5ег

Рго

Уа1

ТИг

Ьуз

5ег

РИе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

Азр

Ьуз

ТИг

Н1з

225

230

235

240

ТИг

Суз

Рго

Рго

Суз

Рго

А1а

Рго

О1и

А1а

А1а

О1у

О1у

Рго

5ег

Уа1

245

250

255

РИе

Ьеи

РИе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТИг

Ьеи

МеЕ

11е

5ег

Агд

ТИг

260

265

270

Рго

О1и

Уа1

ТИг

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

5ег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

275

280

285

- 84 032192

Уа1

Ьуз 290

РЪе

Азп

Тгр

Туг Уа1 295

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1 300

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

Туг

Азп

Бег

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Бег

305

310

315

320

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

Н1з

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

325

330

335

Суз

Ьуз

Уа1

Бег

Азп

Ьуз

А1а

Ьеи

О1у

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТЪг

11е

340

345

350

Бег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Суз

ТЪг

Ьеи

Рго

355

360

365

Рго

Бег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

ТЪг

Ьуз

Азп

О1п

Уа1

Бег

Ьеи

Бег

Суз

А1а

370

375

380

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

Бег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Бег

Азп

385

390

395

400

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЪг

ТЪг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Бег

405

410

415

Азр

О1у

Бег

РЪе

РЪе

Ьеи

Уа1

Бег

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз

Бег

Агд

420

425

430

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

Уа1

РЪе

Бег

Суз

Бег

Уа1

Меб

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

435

440

445

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЪг

О1п

Ьуз

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Бег

Рго

О1у

Ьуз

450

455

460

<210> 45 <211> 214 <212> РРТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 1 <УЕСР-АЫС-2> СгоззМАЬ 1дО1 только с Р329С ЬАЬАмутациями (без ААА-мутаций) (УЕСРапд2-0015) <400>45

Азр 11е О1п Ьеи ТЪг О1п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 О1у

5 1015

Азр Агд Уа1

ТЪг 11е ТЪг Суз Бег А1а

2025

Бег О1п Азр 11е

Бег Азп Туг

- 85 032192

Ьеи Азп

Тгр 35

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго 40

О1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз 45

Уа1

Ьеи

11е

Туг

РНе

ТНг

Бег

Бег

Ьеи

Н1з

Бег

О1у

Уа1

Рго

Бег

Агд

РНе

Бег

О1у

50

55

60

Бег

О1у

Бег

О1у

ТНг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

ТНг

11е

Бег

Бег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РНе

А1а

ТНг

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

Бег

ТНг

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

ТНг

РНе

О1у

О1п

О1у

ТНг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

Агд

ТНг

Уа1

А1а

А1а

100

105

110

Рго

Бег

Уа1

РНе

11е

РНе

Рго

Рго

Бег

Азр

О1и

О1п

Ьеи

Ьуз

Бег

О1у

115

120

125

ТНг

А1а

Бег

Уа1

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Азп

РНе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

130

135

140

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Бег

О1у

Азп

Бег

О1п

145

150

155

160

О1и

Бег

Уа1

ТНг

О1и

О1п

Азр

Бег

Ьуз

Азр

Бег

ТНг

Туг

Бег

Ьеи

Бег

165

170

175

Бег

ТНг

Ьеи

ТНг

Ьеи

Бег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

180

185

190

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТНг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Бег

Бег

Рго

Уа1

ТНг

Ьуз

Бег

195

200

205

РНе Азп Агд О1у О1и Суз

210 <210> 46 <211> 213 <212> РКТ <213> Искусственная <220>

<223> Легкая цепь 2 <УЕОЕ-АЫО-2> СгоззМАЬ 1дО1 только с Р329О ЬАЬАмутациями (без ААА-мутаций) (УЕСЕапд2-0015) <400> 46

Бег Туг Уа1 Ьеи ТНг О1п Рго Рго Бег Уа1 Бег Уа1 А1а Рго О1у О1п

5 10 15

- 86 032192

ТЪг

А1а

Агд

11е 20

ТЪг

Суз

О1у О1у

Азп 25

Азп

11е

О1у

Вег

Ьуз 30

Вег

Уа1

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

Туг

35

40

45

Азр

Азр

Вег

Азр

Агд

Рго

Вег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Вег

О1у

Вег

50

55

60

Азп

Вег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Вег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1у

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Уа1

Тгр

Азр

Вег

Вег

Вег

Азр

Н1з

85

90

95

Тгр

Уа1

РЪе

О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

Вег

Вег

А1а

Вег

100

105

110

ТЪг

Ьуз

О1у

Рго

Вег

Уа1

РЪе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Вег

Вег

Ьуз

Вег

ТЪг

115

120

125

Вег

О1у

О1у

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЪе

Рго

130

135

140

О1и

Рго

Уа1

ТЪг

Уа1

Вег

Тгр

Азп

Вег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

Вег

О1у

Уа1

145

150

155

160

Н1з

ТЪг

РЪе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Вег

Вег

О1у

Ьеи

Туг

Вег

Ьеи

Вег

165

170

175

Вег

Уа1

Уа1

ТЪг

Уа1

Рго

Вег

Вег

Вег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

Туг

11е

180

185

190

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

Вег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьуз

Уа1

195

200

205

О1и

Рго

Ьуз

Вег

Суз

210

<210>	47
<211>	107
<212>	РКТ
<213>	Ното	зарчепз
<400>	47
Агд ТЪг Уа1	А1а А1а Рго Вег Уа1	РЪе 11е	РЪе Рго Рго Вег Азр О1и
1		5	10	15

- 87 032192

О1п Ьеи

Ьуз

Еег 20

О1у

ТЬг А1а

Еег

Уа1 25

Уа1

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп 30

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

О1и

А1а

Ьуз

Уа1

О1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

Азп

А1а

Ьеи

О1п

35

40

45

Еег

О1у

Азп

Еег

О1п

О1и

Еег

Уа1

ТЬг

О1и

О1п

Азр

Еег

Ьуз

Азр

Еег

50

55

60

ТЬг

Туг

Еег

Ьеи

Еег

Еег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Еег

Ьуз

А1а

Азр

Туг

О1и

65

70

75

80

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

О1и

Уа1

ТЬг

Н1з

О1п

О1у

Ьеи

Еег

Еег

85

90

95

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Еег

РЬе

Азп

Агд

О1у

О1и

Суз

100

105

<210>

48

<211>

105

<212>

РРТ

<213>

Ьото

зар1епз

<400>

48

О1п

Рго

Ьуз

А1а

А1а

Рго

Еег

Уа1

ТЬг

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Еег

Еег

О1и

1

5

10

15

О1и

Ьеи

О1п

А1а

Азп

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

Уа1

Суз

Ьеи

11е

Еег

Азр

РЬе

20

25

30

Туг

Рго

О1у

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

А1а

Тгр

Ьуз

А1а

Азр

Еег

Еег

Рго

Уа1

35

40

45

Ьуз

А1а

О1у

Уа1

О1и

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Рго

Еег

Ьуз

О1п

Еег

Азп

Азп

Ьуз

50

55

60

Туг

А1а

А1а

Еег

Еег

Туг

Ьеи

Еег

Ьеи

ТЬг

Рго

О1и

О1п

Тгр

Ьуз

Еег

65

70

75

80

Н1з

Агд

Еег

Туг

Еег

Суз

О1п

Уа1

ТЬг

Н1з

О1и

О1у

Еег

ТЬг

Уа1

О1и

85

90

95

Ьуз

ТЬг

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

О1и

Суз

Еег

100

105

<210> 49 <211> 330

- 88 032192 <212> РКТ <213> Ното зарчепз <400> 49

А1а 1

5ег

ТЪг

Ьуз

О1у 5

Рго

5ег

Уа1

РЪе

Рго 10

Ьеи

А1а

Рго

5ег

5ег 15

Ьуз

5ег

ТЪг

5ег

О1у

О1у

ТЪг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

20

25

30

РЪе

Рго

О1и

Рго

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

Тгр

Азп

5ег

О1у

А1а

Ьеи

ТЪг

5ег

35

40

45

О1у

Уа1

Н1з

ТЪг

РЪе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

5ег

5ег

О1у

Ьеи

Туг

5ег

50

55

60

Ьеи

5ег

5ег

Уа1

Уа1

ТЪг

Уа1

Рго

5ег

5ег

5ег

Ьеи

О1у

ТЪг

О1п

ТЪг

65

70

75

80

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н1з

Ьуз

Рго

5ег

Азп

ТЪг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

85

90

95

Ьуз

Уа1

О1и

Рго

Ьуз

5ег

Суз

Азр

Ьуз

ТЪг

Н1з

ТЪг

Суз

Рго

Рго

Суз

100

105

110

Рго

А1а

Рго

О1и

Ьеи

Ьеи

О1у

О1у

Рго

5ег

Уа1

РЪе

Ьеи

РЪе

Рго

Рго

115

120

125

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЪг

Ьеи

МеЕ

11е

5ег

Агд

ТЪг

Рго

О1и

Уа1

ТЪг

Суз

130

135

140

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

5ег

Н1з

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

Ьуз

РЪе

Азп

Тгр

145

150

155

160

Туг

Уа1

Азр

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

165

170

175

О1и

О1п

Туг

Азп

5ег

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

5ег

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

180

185

190

Н1з

О1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

5ег

Азп

195

200

205

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

11е

О1и

Ьуз

ТЪг

11е

5ег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

210

215

220

О1п

Рго

Агд

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЪг

Ьеи

Рго

Рго

5ег

Агд

Азр

О1и

225

230

235

240

- 89 032192

Ьеи

ТЕг

Ьуз

Азп

О1п 245

Уа1

Вег

Ьеи

ТЕг

Суз 250

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЕе 255

Туг

Рго

Вег

Азр

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Вег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

260

265

270

Азп

Туг

Ьуз

ТЕг

ТЕг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Вег

Азр

О1у

Вег

РЕе

РЕе

275

280

285

Ьеи

Туг

Вег

Ьуз

Ьеи

ТЕг

Уа1

Азр

Ьуз

Вег

Агд

Тгр

О1п

О1п

О1у

Азп

290

295

300

Уа1

РЕе

Вег

Суз

Вег

Уа1

Меб

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЕг

305

310

315

320

О1п

Ьуз

Вег

Ьеи

Вег

Ьеи

Вег

Рго

О1у

Ьуз

325

330

<210>

50

<211>

327

<212>

РРТ

<213>

Ното

зар1епз

<400>

50

А1а

Вег

ТЕг

Ьуз

О1у

Рго

Вег

Уа1

РЕе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Вег

Агд

1

5

10

15

Вег

ТЕг

Вег

О1и

Вег

ТЕг

А1а

А1а

Ьеи

О1у

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

20

25

30

РЕе

Рго

О1и

Рго

Уа1

ТЕг

Уа1

Вег

Тгр

Азп

Вег

О1у

А1а

Ьеи

ТЕг

Вег

35

40

45

О1у

Уа1

Н1з

ТЕг

РЕе

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

О1п

Вег

Вег

О1у

Ьеи

Туг

Вег

50

55

60

Ьеи

Вег

Вег

Уа1

Уа1

ТЕг

Уа1

Рго

Вег

Вег

Вег

Ьеи

О1у

ТЕг

Ьуз

ТЕг

65

70

75

80

Туг

ТЕг

Суз

Азп

Уа1

Азр

Н1з

Ьуз

Рго

Вег

Азп

ТЕг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

85

90

95

Агд

Уа1

О1и

Вег

Ьуз

Туг

О1у

Рго

Рго

Суз

Рго

Вег

Суз

Рго

А1а

Рго

100

105

110

О1и

РЕе

Ьеи

О1у

О1у

Рго

Вег

Уа1

РЕе

Ьеи

РЕе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

115 120 125

- 90 032192

Азр

ТЪг 130

Ьеи

МеЕ

11е

5ег

Агд 135

ТЪг

Рго

О1и

Уа1

ТЪг 140

Суз

Уа1

Уа1

Уа1

Азр

Уа1

5ег

О1п

О1и

Азр

Рго

О1и

Уа1

О1п

РЪе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

145

150

155

160

О1у

Уа1

О1и

Уа1

Н1з

Азп

А1а

Ьуз

ТЪг

Ьуз

Рго

Агд

О1и

О1и

О1п

РЪе

165

170

175

Азп

5ег

ТЪг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

5ег

Уа1

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

Н1з

О1п

Азр

180

185

190

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуз

О1и

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

Уа1

5ег

Азп

Ьуз

О1у

Ьеи

195

200

205

Рго

5ег

5ег

11е

О1и

Ьуз

ТЪг

11е

5ег

Ьуз

А1а

Ьуз

О1у

О1п

Рго

Агд

210

215

220

О1и

Рго

О1п

Уа1

Туг

ТЪг

Ьеи

Рго

Рго

5ег

О1п

О1и

О1и

МеЕ

ТЪг

Ьуз

225

230

235

240

Азп

О1п

Уа1

5ег

Ьеи

ТЪг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЪе

Туг

Рго

5ег

Азр

245

250

255

11е

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

5ег

Азп

О1у

О1п

Рго

О1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

260

265

270

ТЪг

ТЪг

Рго

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

5ег

Азр

О1у

5ег

РЪе

РЪе

Ьеи

Туг

5ег

275

280

285

Агд

Ьеи

ТЪг

Уа1

Азр

Ьуз

5ег

Агд

Тгр

О1п

О1и

О1у

Азп

Уа1

РЪе

5ег

290

295

300

Суз

5ег

Уа1

МеЕ

Н1з

О1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Н1з

Туг

ТЪг

О1п

Ьуз

5ег

305

310

315

320

Ьеи

5ег

Ьеи

5ег

Ьеи

О1у

Ьуз

325

- 91 032192

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим УЕОЕ, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим ΆΝΟ-2, в котором:

   I) указанный первый антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с УЕОЕ, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи СИК3Н-участок, имеющий 8Ер ΙΌ ΝΟ: I, СИК2Н-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 2, и СИК1Н-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 3, и в вариабельном домене легкой цепи СИКЗЕ-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 4, СИК2Т-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 5, и СИК1Т-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 6; и

   II) указанный второй антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с ΆΝΟ-2, содержит в вариабельном домене тяжелой цепи СИКЗИ-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 9, СИК2Н-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 10, и СИК1Н-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 11, и в вариабельном домене легкой цепи СОКЗЬ-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 12, СИК2Т-участок, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 13, и СИК1Еучасток, имеющий 8Ер ГО ΝΟ: 14, и в котором

   III) биспецифическое антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого подкласса ^01 (происходящую из человеческого антитела) и содержащую мутации Ш53А, Н310А и Н435А (нумерация согласно ЕИ-индексу Кэбота).
2. 2. Биспецифическое антитело по п.1, в котором:

   I) указанный первый антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с УЕОЕ, содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи УН аминокислотную последовательность 8Ер ГО ΝΟ: 7 и в качестве вариабельного домена легкой цепи УЬ аминокислотную последовательность 8Ер ГО ΝΟ: 8 и

   II) указанный второй антигенсвязывающий центр, специфически связывающийся с ΑΝΟ-2, содержит в качестве вариабельного домена тяжелой цепи УН аминокислотную последовательность 8Ер ГО ΝΟ: 15 и в качестве вариабельного домена легкой цепи УЬ аминокислотную последовательность 8Ер ГО ΝΟ: 16.
3. 3. Биспецифическое антитело по п.1, в котором константная область тяжелой цепи ^01 -подкласса содержит также мутации Б234А, Б235А и Р329О (нумерация согласно ЕИ-индексу Кэбота).
4. 4. Биспецифическое антитело по п.1, включающее аминокислотные последовательности 8Ер ГО ΝΟ: 25, 8Ер ГО ΝΟ: 26, 8Ер ГО ΝΟ: 27 и 8Ер ГО ΝΟ: 28.
5. 5. Биспецифическое антитело по п.1, включающее аминокислотные последовательности 8Ер ГО ΝΟ: 21, 8Ер ГО ΝΟ: 22, 8Ер ГО ΝΟ: 23 и 8Ер ГО ΝΟ: 24.
6. 6. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-5 и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения сосудистых заболеваний глаз.
7. 7. Фармацевтическая композиция по п.6 для интравитреального введения.
8. 8. Нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело по любому из пп.1-5.
9. 9. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.8, который обладает способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине.
10. 10. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по п.9.
11. 11. Способ получения биспецифического антитела по любому из пп.1-5, включающий стадии, на которых:

    а) трансформируют клетку-хозяин вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанное антитело;

    б) культивируют указанную клетку-хозяин в условиях, обеспечивающих синтез указанной молеку лы антитела; и

    в) выделяют указанную молекулу антитела из указанной культуры.
12. 12. Биспецифическое антитело, полученное с помощью способа по п.11.

    Интравитреальная инъекция - у-, продолжительное время полужизни К в стекловидном теле ΈΓ крово стекло сосудистая сетьс

    СВ

    1|Й|ё||ййВ сосудистая сеть