JP6796184B2 - 二重特異性抗ｖｅｇｆ／抗ａｎｇ−２抗体及び眼血管疾患の処置におけるそれらの使用 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体（二重特異性抗体を含む）の粘度の低下のための方法に、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−Ａ）に対する及びヒトアンギオポエチン２（ＡＮＧ−２）に対する二重特異性抗体、それらの産生のための方法、前記抗体を含む医薬的組成物、及びその使用に関する。

発明の背景
血管形成は、固形腫瘍、眼内新生血管症候群（例えば増殖性網膜症又は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、関節リウマチ、及び乾癬など）を含む種々の障害の病因に関与する（Folkman, J., et al., J. Biol.Chem.267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu.Rev.Physiol.53 (1991) 217-239; and Garner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp.1625-1710）。

ラニビズマブ（商品名ルーセンティス（登録商標））は、ベバシズマブ（アバスチン）と同じ親マウス抗体由来のモノクローナル抗体フラグメントである。しかし、それは、親和性成熟されており、ＶＥＧＦ−Ａへのより強い結合を提供する（WO 98/45331）。これは、ＶＥＧＦ−Ａ遮断が、一部の全身毒性に関連しうるが、従って、ラニビズマブは、Ｆｃ部分が欠落しており、血中半減期及び、結果的に、全身毒性を低下することが公知である。それは加齢性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）の「湿潤」型を処置するために承認されている抗血管形成薬剤、加齢に関連する失明の一般的な形態である。

角膜血管形成アッセイは、ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２の両方が、同様の効果を有することを示し、ＶＥＧＦと相乗的に作用し、新たな血管の成長を促した。Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40.用量依存性の内皮応答があったという可能性が、インビトロで、高濃度で、ＡＮＧ−２が、また、血管形成促進でありうるとの観察により出された（Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52）。高濃度で、ＡＮＧ−２は、ＰＩ−３キナーゼ及びＡｋｔ経路を介して、Ｔｉｅ２の活性化を通じて血清欠乏アポトーシスの間に内皮細胞のためのアポトーシス生存因子として作用する（Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52）。

WO 2010/040508 A9及びWO 2011/117329は、抗ＶＥＧＦ／抗ＡＮＧ−２抗体二重特異性に関する。WO2008/132568は、成長因子に結合する融合タンパク質に関する。WO2009/136352は、抗血管形成化合物に関する。WO 2009/080253及びWO 2011/117330は、二重特異性の二価抗体フォーマットに関する。WO2010/069532は、Ａｎｇ２抗体に関する。

眼血管疾患（例えば加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）及び糖尿病性網膜症（ＤＲ）など）は、それぞれ異常脈絡膜又は網膜血管新生に起因する。それらは先進国における視力喪失の主な原因である。網膜は、ニューロン、グリア、及び血管要素の明確に定義された層からなるので、そのような血管増殖又は浮腫に見られるような比較的小さな乱れが、視覚機能の著しい損失をもたらしうる。遺伝性網膜変性（例えば網膜色素変性症（ＲＰ）など）が、また、血管異常（例えば細動脈狭窄及び血管萎縮など）と関連付けられる。それらは、３５００人中１人という多くに影響し、しばしば、完全な失明に進行する、進行性夜盲、視野欠損、視神経萎縮、細動脈減弱、及び視力の中心喪失により特徴付けられる。

虚血性網膜症は、血流の低下及び低酸素をもたらす網膜血管系の喪失又は機能不全により特徴付けられる。網膜は、新たな血管を成長させるためシグナルを生成することにより、低酸素状態に応答するが、しかし、これらの新たな血管は、通常、脆弱で無秩序である。それは、視力への脅威の大半を作る、これらの異常な新たな血管の成長である。なぜなら、それらは、漏出し、出血する、又は網膜剥離に終わりうる瘢痕化に導くからである。虚血性網膜症のための現在の治療は病的な血管の成長を停止しようとするが、それらの成長を駆動する、基礎となる虚血に対処しない。さらに、何百万人に影響を与える、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症のための標準的な処置は、新たな血管の成長を停止し、中心視野を保存する試みにおいて、レーザーを用いた、網膜の一部の破壊を含む。戦略は、血管成長の主なプロモーターである血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の機能を遮断するために用いられてきた。短期的には、抗ＶＥＧＦ治療は、視力を向上させることができるが、しかし、それは、基礎となる虚血には対処しておらず、実際には、この状態を悪化させうる。なぜなら、それは、有益な側副血管を含むすべての血管の成長を阻害するからである。新たな血管成長が、虚血性脳、心臓、又は四肢において要求されうる高齢者及び／又は糖尿病患者において、これらの薬物の全身曝露の深刻な懸念もある。

典型的には、眼疾患のために、硝子体内適用を介して、Ｆａｂ又はＦａｂ（２）のようなより小さな抗体フラグメントが使用されることが多い。なぜなら、それらは、低い血清半減期を有し、全身毒性のリスクが低いからである。しかし、このより小さなフラグメントは、また、典型的には、より低い硝子体内半減期（例、原因血清中でのより速い拡散に起因する）を有し、典型的には、よりしばしば投与しなければならない。

Kim et al, Molecular Vision, 15 (2009) 2803-2812は、眼の硝子体内に投与された完全長抗体に関し、ＦｃＲｎ結合を伴うＩｇＧは、野生型マウスにおいて、血液中に排除されたのに対し、ＦｃＲｎ結合を伴わないＩｇＹは、血液系中に排除されなかった。さらに、ＦｃＲｎ結合を伴うＩｇＧは、ＦｃＲｎノックダウンマウスにおいて、血液系中に排除されなかった。

当技術分野において、種々の眼血管疾患（例えば虚血性網膜症など）を処置及び予防するためのより良い手段についての必要性がある。

発明の概要
本発明の一局面は、抗体の粘度の低下のための方法であって、ここで、抗体は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含み、ここで、方法は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を伴う、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラスの抗体定常重鎖領域の改変を含む。

本発明の一実施態様において、前記方法は、抗体が、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であることを特徴とし、ここで
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及び、ここで
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含む。

本発明の一実施態様において、そのような方法は、上に記載する前記の二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含み、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）をさらに含む、ヒトＩｇＧ１サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含むことを特徴とする。

本発明の一実施態様は、そのような方法により得られた抗体である。

本発明の一実施態様は、抗体の粘度の低下のための変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の使用であって、ここで、抗体は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含む。

本発明の一実施態様において、前記方法は、抗体が、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であることを特徴とし、
ここで
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及び、ここで
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含む。

本発明の一実施態様において、前記の特定の使用は、二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含み、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）をさらに含む、ヒトＩｇＧ１サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含むことを特徴とする。

本発明は、さらに、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体に向けられ、
ここで
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及び、ここで
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含む。

一実施態様において、前記の二重特異性抗体は、以下を特徴とする：
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号７のアミノ酸配列を、及び、軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ならびに
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号１５のアミノ酸配列を、及び、軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。

一実施態様において、前記の二重特異性抗体は、ｉｉｉ）の下の定常重鎖領域が、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする。一実施態様において、ＩｇＧ１サブタイプの前記の二重特異性抗体は、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。

一実施態様において、前記の二重特異性抗体は、ｉｉｉ）の下の定常重鎖領域が、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする。一実施態様において、ＩｇＧ４サブタイプの前記の二重特異性抗体は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。一実施態様において、ＩｇＧ４サブタイプの前記の二重特異性抗体は、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。

本発明のさらなる局面は、前記の二重特異性抗体を含む医薬的組成物、眼血管疾患の処置における使用のための前記の医薬的組成物、眼血管疾患の処置のための医薬の製造のための前記の二重特異性抗体の使用、前記の二重特異性抗体を、そのような処置を必要とする患者へ投与することによる、眼血管疾患に苦しむ患者の処置の方法である。一実施態様において、二重特異性抗体又は前記二重特異性抗体を含む医薬的組成物は、硝子体内適用を介して投与される。

本発明のさらなる局面は、本発明に従った二重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子である。

本発明は、さらに、原核又は真核宿主細胞において前記核酸を発現することが可能である、本発明に従った前記核酸を含む発現ベクター、ならびに、本発明の二重特異性抗体の組換え産生のための、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明は、さらに、本発明に従ったベクターを含む原核又は真核宿主細胞を含む。

本発明は、さらに、本発明に従った二重特異性抗体の産生のための方法を含み、本発明に従った核酸を、原核又は真核宿主細胞中で発現させ、前記の二重特異性抗体を、前記細胞又は細胞培養上清から回収することにより特徴付けられる。一実施態様は、本発明に従った二重特異性抗体の調製のための方法であって、以下の工程を含む：
ａ）宿主細胞を、前記抗体をコードする核酸分子を含むベクターを用いて形質転換すること；
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を許す条件下で培養すること；及び
ｃ）前記抗体分子を、前記培養から回収すること。

本発明は、さらに、二重特異性抗体の産生のための、そのような方法により得られた抗体を含む。

したがって、本発明の一実施態様は、配列番号２１の、配列番号２２の、配列番号２３の、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体である。

したがって、本発明の一実施態様は、配列番号２５の、配列番号２６の、配列番号２７の、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体である。

本発明に従った抗体は、眼血管疾患に苦しむ患者のための利益を起こす、Ｆｃ部分／定常領域におけるそれらの特異的な改変に起因する、高度に価値のある特性を有する。それらは、硝子体内環境中での高い安定性及び眼からの遅い拡散を示し（定常重鎖領域を伴わない、より小さな抗体フラグメントと比較して）、そこでは、実際の疾患が、位置付けられ、処置される（そのため、処置スケジュールを、潜在的に、非ＩｇＧ様抗体（例、Ｆａｂ及び（Ｆａｂ）２フラグメント）などと比較し、改善することができる）。驚くべきことに、非改変ＩｇＧ抗体と比較し、定常領域中の変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａを伴う抗体（それ以上のＦｃＲｎ結合を伴わない）の硝子体内適用後の眼中での半減期が、同様であったのに対し（わずかにだけ低下した）（表１７ａ及び１８ａならびに図７Ｄ及び７Ｅ）、眼から血液血清中への拡散は同様であった（表１５及び図７Ｂ）。これは、高度に価値がある。なぜなら、眼からＶＥＧＦ及びＡｎｇ２（例、抗ＡＮＧ２／ＡＮＧ２抗体複合体又は抗ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ抗体複合体としての血清中への輸送を介して）を排除することが、ＡＮＧ２及び／又はＶＥＧＦに関連する眼血管疾患の処置のために望まれるためである。本発明に従った抗体は、他方で、非改変ＩｇＧ抗体と比較した場合、血清から非常に迅速に取り除かれる（それは、全身曝露から生じる潜在的な副作用を低下させるために、高度に望まれる）。

驚くべきことに、それらは、また、より低い粘度を示し（図２を参照のこと）（定常領域中に変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａを伴わないバージョンと比較して）、従って、眼疾患の処置の間での細い針を通した硝子体内適用のために特に有用である（そのような適用のために、典型的には、細い針が使用され、高粘度によって、適切な適用がかなり困難になる）。より低い粘度によって、また、より高い濃度の製剤を許す。

また、驚くべきことに、本発明に従った抗体は、保存の間に、より低い凝集傾向を示し（図４）（Ｆｃ部分中に変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａを伴わないバージョンと比較して）、それは、眼における硝子体内適用のために決定的である（眼中での凝集が、そのような処置の間に、合併症に導きうるからである）。本発明に従った二重特異性抗体は、血管疾患の阻害において良い効力を示す。

特定の実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は、定常領域中のそれらの特定の改変（例、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）のため、血栓及び／又は不要な細胞死（例えば、ＡＤＣＣに起因する）などの副作用のリスクを低下させる非結合Ｆｃｇａｍｍａ受容体などの価値のある特性を示す。

ＡＡＡ変異（変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ−ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を伴う＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体の概念及び利点の模式図。 小規模ＤＬＳベースの粘度測定。２００mMアルギニン／スクシネート（ｐＨ５．５）中の１５０mg/mLでの外挿された粘度（本発明のＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）に従った＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞抗体と参照ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（そのようなＡＡＡ変異を伴わない）との比較）。 ２０mM Ｈｉｓ、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０ ５中の温度に依存したＤＬＳ凝集（ＤＬＳ凝集開始温度を含む）（本発明のＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）に従った＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞抗体と参照ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（そのようなＡＡＡ変異を伴わない）との比較）。 ４０℃で１００mg/mLでの７日間保存（主な高分子量／ＨＭＷ増加の減少）（より低い凝集を示した、本発明のＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）に従った＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞抗体と参照ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（そのようなＡＡＡ変異を伴わない）との比較）。 ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）のＦｃＲｎの定常状態の親和性：異なる濃度でのBIAcoreセンサーグラムのオーバーレイは、ＦｃＲｎへのＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）の結合に依存した濃度を示す。 Ａ：ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）のＦｃＲｎの定常状態の親和性：ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）の濃度依存性結合応答曲線は、ＦｃＲｎへの結合を示す。 ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）のＦｃＲｎの定常状態の親和性：異なる濃度でのBIAcoreセンサーグラムのオーバーレイは、全ての濃度でＦｃＲｎへの結合を示す。 ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）のＦｃＲｎの定常状態の親和性：ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）の濃度依存性結合応答曲線は、ＦｃＲｎへの結合を示さない。 ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）のＦｃＲｎの定常状態の親和性：ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）の濃度依存性結合応答曲線は、ＦｃＲｎへの結合を示さない（応答は−０．６から０．２ＲＵの範囲である／濃度スケールは０から０．３５Ｍの範囲である）。 ＡＡＡ変異を伴わないＶＥＧＦａｎｇ２−００１５のＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ相互作用及びＡＡＡ変異を伴うＶＥＧＦａｎｇ２−００１６の測定（両方が、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異を伴うＩｇＧ１サブクラスである；コントロールとして、ＩｇＧ１サブクラスの抗Ｄｉｇ及びＩｇＧ４ベースの抗体を使用した）。 血清及び全眼ライセート中の＜ＶＥＧＦ／Ａｎｇ２＞二重特異性抗体の濃度の決定のための模式的なＰｋ−ＥＬＩＳＡアッセイの原理。 静脈内適用後の血清中濃度：化合物の比較−ＡＡＡ変異を伴わないＶＥＧＦａｎｇ２−００１５及びＡＡＡ変異を伴うＶＥＧＦａｎｇ２−００１６。 硝子体内適用後の血清中濃度：化合物の比較−ＡＡＡ変異を伴わないＶＥＧＦａｎｇ２−００１５及びＡＡＡ変異を伴うＶＥＧＦａｎｇ２−００１６。 右眼及び左眼におけるＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）の眼ライセート濃度（静脈内適用と比較し、右眼中だけへの硝子体内適用後）：有意な濃度が、硝子体内適用後、右眼中だけで検出することができた。静脈内適用後、眼ライセート中の無濃度が、ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）の低い血清中半減期に起因して、検出することができた。 右眼及び左眼におけるＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）の眼ライセート濃度（静脈内適用と比較した、右眼中だけへの硝子体内適用後）：硝子体内適用後の右眼において（及び、ある程度まで、左眼において）、ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５の濃度を検出することができた。これは、右眼から血清中への、及びそこから左眼中への拡散を示し、それは、ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）の長い半減期により説明することができる。静脈内適用後、また、両方の眼の眼ライセート中の有意な濃度が、血清中で安定なＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）の眼中への拡散に起因して検出することができた。

発明の詳細な説明
本発明の一実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は二価である。

本発明の一局面において、本発明に従った、そのような二重特異性の二価抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の完全長抗体の改変重鎖及び改変軽鎖、ここで、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いにより交換される。

ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に特異的に結合する二重特異性抗体のための、この二重特異性の二価抗体フォーマットは、WO2009/080253において記載されている（ノブ−インツ−ホール改変ＣＨ３ドメインを含む）。この二重特異性の二価抗体フォーマットに基づく抗体を、ＣｒｏｓｓＭａｂと名付けた。

一実施態様において、そのような二重特異性の二価抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）第１の完全長抗体の重鎖として、配列番号２５のアミノ酸配列、及び、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号２７のアミノ酸配列、ならびに
ｂ）第２の完全長抗体の改変重鎖として、配列番号２６のアミノ酸配列、及び、第２の完全長抗体の改変軽鎖として、配列番号２８のアミノ酸配列。

一実施態様において、そのような二重特異性の二価抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）第１の完全長抗体の重鎖として、配列番号２１のアミノ酸配列、及び、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号２３のアミノ酸配列、ならびに
ｂ）第２の完全長抗体の改変重鎖として、配列番号２２のアミノ酸配列、及び、第２の完全長抗体の改変軽鎖として、配列番号２４のアミノ酸配列。

一実施態様において、そのような二重特異性の二価抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）第１の完全長抗体の重鎖として、配列番号２９のアミノ酸配列、及び、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号３１のアミノ酸配列、ならびに
ｂ）第２の完全長抗体の改変重鎖として、配列番号３０のアミノ酸配列、及び、第２の完全長抗体の改変軽鎖として、配列番号３２のアミノ酸配列。

したがって、本発明の一実施態様は、配列番号２５の、配列番号２６の、配列番号２７の、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体である。

したがって、本発明の一実施態様は、配列番号２１の、配列番号２２の、配列番号２３の、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体である。

したがって、本発明の一実施態様は、配列番号２９の、配列番号３０の、配列番号３１の、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体である。

本発明の別の局面において、本発明に従った二重特異性抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の完全長抗体の重鎖及び軽鎖；
ｂ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の完全長抗体の重鎖及び軽鎖、ここで、重鎖のＮ末端が、軽鎖のＣ末端に、ペプチドリンカーを介して接続される。

ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒトアンジオポエチン２（ＡＮＧ−２）に特異的に結合するこの二重特異性抗体のための、この二重特異性の二価抗体フォーマットは、WO2011/117330において記載されている（ノブ−インツ−ホール改変ＣＨ３ドメインを含む）。この二重特異性の二価抗体フォーマットに基づく抗体を、ＯＡｓｃＦａｂと名付けた。

一実施態様において、そのような二重特異性の二価抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）第１の完全長抗体の重鎖として、配列番号３３のアミノ酸配列、及び、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号３５のアミノ酸配列、ならびに
ｂ）ペプチドリンカーを介して、第２の完全長抗体の軽鎖に接続された第２の完全長抗体の重鎖として、配列番号３４のアミノ酸配列。

一実施態様において、そのような二重特異性の二価抗体は、以下を含むことを特徴とする：
ａ）第１の完全長抗体の重鎖として、配列番号３６のアミノ酸配列、及び、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号３８のアミノ酸配列、ならびに
ｂ）ペプチドリンカーを介して、第２の完全長抗体の軽鎖に接続された第２の完全長抗体の重鎖として、配列番号３７のアミノ酸配列。

一実施態様において、第２の完全長抗体の重鎖及び軽鎖の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、以下の位置の間でのジスルフィド結合の導入により安定化されたジスルフィドである：重鎖可変ドメイン位置４４から軽鎖可変ドメイン位置１００（ナンバリングは、常に、ＫａｂａｔのＥＵインデックス（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従う）。そのようなさらなるジスルフィド安定化は、第２完全長抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬの間でのジスルフィド結合の導入により達成される。安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入するための技術が、例えば、WO 94/029350、Rajagopal, V., et al, Prot.Engin.10 (1997) 1453-59;Kobayashi et al., Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393；又はSchmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721において記載されている。

したがって、本発明の一実施態様は、配列番号３３の、配列番号３４の、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体である。

したがって、本発明の一実施態様は、配列番号３６の、配列番号３７の、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体である。

一実施態様において、本発明に従った二重特異性の二価抗体のＣＨ３ドメインは、「ノブ−インツ−ホール」技術により変えられ、それは、例えば、WO 96/027011、Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681において、いくつかの例を用いて詳細に記載されている。この方法において、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を変えて、これら２つのＣＨ３ドメインを含む両方の重鎖のヘテロ二量体を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインの各々は、「ノブ」でありうるが、他は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入によって、ヘテロ二量体を安定化させ（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681;Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35）、収量を増加させる。

本発明の好ましい局面において、本発明に従った全ての二重特異性抗体が、１つの重鎖のＣＨ３ドメイン及び他の重鎖のＣＨ３ドメインが、各々、抗体のＣＨ３ドメインの間の本来の界面を含む界面で会合し；ここで、前記界面を変え、二重特異性抗体の形成を促し、ここで、変化は、以下を特徴とする：
ａ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインを変え、
二重特異性抗体内の他の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面に会合する、１つの重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面内で、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて交換され、それにより、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞中に配置可能である１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に隆起を生成するようにし、
及び
ｂ）他の重鎖のＣＨ３ドメインを変え、
二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの本来の界面に会合する、第２のＣＨ３ドメインの本来の界面内で、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて交換され、それにより、第１のＣＨ３ドメインの界面内の隆起が配置可能である、第２のＣＨ３ドメインの界面内に空洞を生成するようにする。

このように、本発明に従った抗体は、好ましくは、以下を特徴とする：
ａ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメイン及びｂ）の完全長抗体の重鎖のＣＨ３ドメインが、各々、抗体ＣＨ３ドメインの間の本来の界面において変化を含む界面で会合し、
ここで、ｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて交換され、それにより、他の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空洞中に配置可能である１つの重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に隆起を生成し、
及び、ここで
ｉｉ）他の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、
アミノ酸残基が、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基を用いて交換され、それにより、第１のＣＨ３ドメインの界面内の隆起が配置可能である、第２のＣＨ３ドメインの界面内に空洞を生成する。

好ましくは、より大きな側鎖容積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。

好ましくは、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群より選択される。

本発明の一局面において、両方のＣＨ３ドメインは、さらに、両方のＣＨ３ドメインの間にジスルフィド架橋を形成できるようにする、各々のＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入により変えられる。

一実施態様において、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおいてＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋を、例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン中にＹ３４９Ｃ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン中にＥ３５６Ｃ変異又はＳ３５４Ｃ変異を導入することにより、使用することもできる（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681）。

別の実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他においてＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。別の好ましい実施態様において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおいてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他においてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含む（鎖間ジスルフィド架橋を形成する、１つのＣＨ３ドメインにおける追加のＹ３４９Ｃ変異及び他のＣＨ３ドメインにおける追加のＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ変異）（ナンバリングは、常に、ＫａｂａｔのＥＵインデックス（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従う）。しかし、また、EP 1 870 459 A1に記載される通りの他のノブ−イン−ホール技術を、代わりに又は追加で使用することができる。このように、二重特異性抗体についての別の例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異である（ナンバリングは、常に、ＫａｂａｔのＥＵインデックス（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）に従う）。

別の実施態様において、二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を、ならびに、追加で、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異を含む。

別の実施態様において、二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異を含み、又は、前記の三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異及び２つのＣＨ３ドメインの他におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異ならびに、追加で、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ変異を含む。

一実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は、以下の特性（実施例６において記載される通りのアッセイにおいて決定される）の１つ又は複数を有することを特徴とする：
− ｉｉｉ）の下に記載する変異を伴わない、対応する二重特異性抗体と比較し、より低い血清中濃度を示し（マウスにおける硝子体内適用後９６時間、それらは、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、しかし、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックである）；
− ｉｉｉ）の下に記載する変異を伴わない、対応する二重特異性抗体と比較し、全右眼ライセートにおける同様の（倍数０．８〜１．２）濃度（マウスにおいて、それらは、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、しかし、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックであり、右眼における硝子体内適用後９６時間）。

一実施態様において、二重特異性の二価抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含むことを特徴とし、以下を特徴とする：
ｉ）前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として、配列番号７、及び、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として、配列番号８を含み；及び
ｉｉ）前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として、配列番号１５、及び、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として、配列番号１６を含み；及び
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含み、
及び、以下の特性（実施例６において記載される通りのアッセイにおいて決定される）の１つ又は複数を有する：
− ｉｉｉ）の下に記載する変異を伴わない、対応する二重特異性抗体と比較し、より低い血清中濃度を示し（マウスにおける硝子体内適用後９６時間、それらは、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、しかし、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックである）；
− ｉｉｉ）の下に記載する変異を伴わない、対応する二重特異性抗体と比較し、全右眼ライセートにおける同様の（倍数０．８〜１．２）濃度を示す（マウスにおいて、それらは、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、しかし、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックであり、右眼における硝子体内適用後９６時間）。

一実施態様において、二重特異性抗体は、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含むことを特徴とし、以下を特徴とする：
ｉ）前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として、１、２、又は３つのアミノ酸置換を伴う配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として、１、２、又は３つのアミノ酸置換を伴う配列番号８を含み；及び
ｉｉ）前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として、１、２、又は３つのアミノ酸置換を伴う配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として、１、２、又は３つのアミノ酸置換を伴う配列番号を含み；及び
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含むＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含み、
及び、以下の特性（実施例６において記載される通りのアッセイにおいて決定される）の１つ又は複数を有する：
− ｉｉｉ）の下に記載する変異を伴わない、対応する二重特異性抗体と比較し、より低い血清中濃度を示し（マウスにおける硝子体内適用後９６時間、それらは、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、しかし、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックである）；
− ｉｉｉ）の下に記載する変異を伴わない、対応する二重特異性抗体と比較し、全右眼ライセートにおける同様の（倍数０．８〜１．２）濃度を示す（マウスにおいて、それらは、マウスＦｃＲｎ欠損であるが、しかし、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合トランスジェニックであり、右眼における硝子体内適用後９６時間）。

本明細書において使用する通り、「抗体」は、抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、本明細書において使用する通り、リガンドが実際に結合する抗体分子の領域を表示する。用語「抗原結合部位」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ／ＶＬの対）を含む。

抗体特異性は、抗原の特定のエピトープについての抗体の選択的な認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。

本発明に従った「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、２つの異なる抗原（第１抗原としてのＶＥＧＦ及び第２抗原としてのＡＮＧ−２）について特異的である。

用語「単一特異性」抗体は、本明細書において使用する通り、その各々が、同じ抗原の同じエピトープに結合する、１つ又は複数の結合部位を有する抗体を表示する。

用語「価」は、本願内で使用する通り、抗体分子中の結合部位の指定された数の存在を表示する。そのようなものとして、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、それぞれ、抗体分子中の２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を表示する。本発明に従った二重特異性抗体は、好ましくは、「二価」である。

用語「ＶＥＧＦ」は、本明細書において使用する通り、ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ−Ａ）、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子（ヒトＶＥＧＦ１６５の前駆体配列のアミノ酸２７−１９１：配列番号１７；アミノ酸１−２６は、シグナルペプチドを表す）、及び関連する１２１、１８９、及び２０６血管内皮細胞成長因子アイソフォーム（Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9;Houck et al., Mol. Endocrin. 5 ( 1991) 1806 -1814;Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12、及びConnolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24により記載される通り）；それらの成長因子の天然アリル及びプロセシング形態と一緒に、指す。ＶＥＧＦは、腫瘍及び眼内障害に関連付けられる正常及び異常な血管形成及び血管新生の調節において含まれる（Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A.,et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159;Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91;Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735;Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer.73 (1996) 931-934；及びDvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039）。ＶＥＧＦは、いくつかの供給源から単離され、いくつかのアイソフォームを含む、ホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞について高度に特異的な分裂促進活性を示す。

用語「ＡＮＧ−２」は、本明細書において使用する通り、ヒトアンギオポエチン２（ＡＮＧ−２）（あるいは、ＡＮＧＰＴ２又はＡＮＧ２を用いて省略される）（配列番号１８）であり、それらは、例えば、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60及びCheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91において記載されている通りである。アンジオポエチン１（配列番号１９）及び２は、Ｔｉｅｓ（血管内皮細胞内で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリー）についてのリガンドとして発見された（Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48）。アンジオポエチンファミリーの４つの決定的なメンバーがある。アンジオポエチン３及び４（Ａｎｇ−３及びＡｎｇ−４）は、マウス及びヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐した対応物を表しうる（Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56;Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28）。ＡＮＧ−１及びＡＮＧ−２は、本来は、それぞれアゴニスト及びアンタゴニストとして組織培養実験において同定された（ＡＮＧ−１については、Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69；及びＡＮＧ−２については、Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60を参照のこと）。公知のアンジオポエチンの全てが、主に、Ｔｉｅ２（配列番号２０）に結合し、Ａｎｇ−１及び−２の両方が、３ｎＭ（Ｋｄ）の親和性を伴い、Ｔｉｅ２へ結合する（Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60）。

本発明の二重特異性抗体の抗原結合部位は、変動する程度において、抗原についての結合部位の親和性に寄与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の範囲は、アミノ酸配列のコンパイルされたデータベースとの比較により決定され、ここで、それらの領域は、配列の間の可変性に従って定義されてきた。

本発明の抗体は、１つ又は複数の免疫グロブリンクラスのヒト起源から由来する免疫グロブリン定常領域を含み、ここで、そのような免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラス、ならびに、ＩｇＧ及びＩｇＡの場合において、それらのサブクラス、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ４を含む。

用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において使用する通り、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

用語「キメラ抗体」は、１つの供給源又は種からの可変領域、即ち、結合領域及び異なる供給源又は種から由来する定常領域の少なくとも部分を含む抗体を指し、通常、組換えＤＮＡ技術により調製される。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が、好ましい。本発明により包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、定常領域が、本来の抗体のものから、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、改変又は変化され、本発明に従った特性を生成する形態である。そのようなキメラ抗体は、また、「クラススイッチ抗体」として言及される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に基づくヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；US 5,202,238及びUS 5,204,244を参照のこと。

用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変され、親免疫グロブリンのものと比較した場合、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含む抗体を指す。好ましい実施態様において、マウスＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワーク領域中に移植し、「ヒト化抗体」を調製した。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327；及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について前述した抗原を認識する配列を表すＣＤＲに対応する。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が、追加で、本来の抗体のものから、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、改変又は変化され、本発明に従った特性を生成する形態である。

用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用する通り、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、最先端技術において周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。例えば、免疫化時に、内因性の免疫グロブリン産生の非存在において完全レパートリーを産生すること、又はヒト抗体の選択が可能であるトランスジェニック動物（例、マウス）において、ヒト抗体を産生することが現在可能である。そのような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原攻撃時にヒト抗体の産生をもたらす（例、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555;Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258;Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照のこと）。ヒト抗体は、また、ファージディスプレイライブラリーにおいて産生することができる（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol.227 (1992) 381-388;Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）。

Cole et al.及びBoerner et al.の技術が、また、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Cole A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)）。本発明に従ったキメラ抗体及びヒト化抗体について既に言及されている通り、用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用する通り、定常領域において改変され、本発明に従った特性、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば、「クラススイッチ」、即ち、Ｆｃ部分の変化又は変異（例、ＩｇＧ１からＩｇＧ４及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）により生成するそのような抗体も含む。

用語「組換え抗体」は、本明細書において使用する通り、組換え手段により調製、発現、作製、又は単離された全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞（例えばＮＳ０細胞又はＣＨＯ細胞など）から又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例、マウス）から単離された抗体、あるいは宿主細胞中へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体などを含むことを意図する。そのような組換え抗体は、可変領域及び定常領域を再配置形態において有する。本発明に従った組換え抗体を、インビボ体細胞超変異に供した。このように、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＨ及びＶＬ配列から由来する及びそれに関連し、インビボでのヒト抗体生殖系レパートリー内に自然に存在しないであろう配列である。

「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変ドメイン）は、本明細書において使用する通り、抗体を抗原へ結合させる際に直接的に含まれる軽鎖及び重鎖の対の各々を表示する。可変ヒト軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般的な構造を有し、各々のドメインが、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は、広く保存されており、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている。フレームワーク領域は、βシートコンホメーションを取り、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各々の鎖中のＣＤＲは、それらの三次元構造において、フレームワーク領域により保持され、他の鎖からのＣＤＲと一緒に、抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に従った抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、従って、本発明のさらなる目的を提供する。

用語「超可変領域」又は「抗体の抗原結合部分」は、本明細書において使用する場合、抗原結合について関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義する超可変領域以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖は、ＮからＣ末端で、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各々の鎖上のＣＤＲは、フレームワークアミノ酸により分離される。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準的な定義に従って決定する。

本明細書において使用する通り、用語「結合する」又は「特異的に結合する」は、インビトロアッセイにおいて、好ましくは、精製された野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡコア、ＧＥ−ヘルスケア、スウェーデン、ウプサラ）において、抗原（ヒトＶＥＧＦ又はヒトＡＮＧ−２のいずれか）のエピトープへの抗体の結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数）、ｋ_Ｄ（解離定数）、及びＫ_Ｄ（kD/ka）により定義される。一実施態様において、「結合する」又は「特異的に結合する」は、１０^−８mol/l又はそれ以下、一実施態様において、１０^−９M〜１０^−１３mol/lの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を意味する。

用語「エピトープ」は、抗体への特異的な結合が可能である任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施態様において、エピトープ決定因子は、分子の化学的に活性な表面基（例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなど）を含み、特定の実施態様において、特定の三次元構造特徴、及び／又は特定の荷電特徴を有しうる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。

特定の実施態様において、抗体は、それが、優先的に、タンパク質及び／又は巨大分子の複合体混合物中のその標的抗原を認識する場合、抗原に特異的に結合すると言う。

用語「完全長抗体」は、２つの「完全長抗体重鎖」及び２つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を表示する。「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）（ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３として省略される）；ならびに、場合により、サブクラスＩｇＥの抗体の場合において、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）からなるポリペプチドである。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体重鎖可変ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドである（ＶＬ−ＣＬと省略される）。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）でありうる。２つの完全長抗体鎖を、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間の及び完全長抗体重鎖のヒンジ領域の間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して、一緒に連結される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのような天然抗体である。本発明に従った完全長抗体は、単一種（例、ヒト）からでありうる、又は、それらは、キメラ化もしくはヒト化抗体でありうる。本発明に従った完全長抗体は、ＶＨ及びＶＬの対により各々形成された２つの抗原結合部位を含み、その両方が、具体的には、同じ抗原に結合する。前記完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＣ末端での最後のアミノ酸を表示する。前記完全長抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＮ末端での最後のアミノ酸を表示する。

用語「ペプチドリンカー」は、本発明内で使用する通り、アミノ酸配列を伴うペプチドを表示し、それは、好ましくは、合成由来である。本発明に従ったこれらのペプチドを使用し、軽鎖のＣ末端を、第２の完全長抗体（第２抗原に特異的に結合する）の重鎖のＮ末端に、ペプチドリンカーを介して接続する。第２の完全長抗体の重鎖及び軽鎖内のペプチドリンカーは、少なくとも３０アミノ酸の長さを伴う、好ましくは、３２〜５０アミノ酸の長さを伴うアミノ酸配列を伴うペプチドである。１つにおいて、ペプチドリンカーは、３２〜４０アミノ酸の長さを伴うアミノ酸配列を伴うペプチドである。一実施態様において、前記リンカーは、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン（ｘ＝３、ｎ＝８、９、又は１０及びｍ＝０、１、２、又は３）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７、又は８及びｍ＝０、１、２、又は３）を伴う、好ましくは、ｘ＝４、ｎ＝６、又は７及びｍ＝０、１、２、又は３を伴う、より好ましくは、ｘ＝４、ｎ＝７、及びｍ＝２を伴う（ＧｘＳ）ｎである。一実施態様において、前記リンカーは（Ｇ_４Ｓ）_６Ｇ_２である。

用語「定常領域」は、本願内で使用する通り、可変領域以外の抗体のドメインの和を表示する。定常領域は、抗原の結合において直接的に含まれないが、しかし、種々のエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体を、クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭにおいて分け、これらのいくつかを、さらに、サブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２など）中に分けてもよい。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域を、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ぶ。全ての５つの抗体クラスにおいて見出すことができる軽鎖定常領域を、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ぶ。

用語「ヒト起源から由来する定常領域」又は「ヒト定常領域」は、本願において使用する通り、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域を表示する。そのような定常領域は、最先端技術において周知であり、例えば、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)（また、例えば、Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788を参照のこと）により記載される。位置及び変異のナンバリングについての適用内で、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に従ったＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックス）を使用し、「ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング」として言及する。

一実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス（ヒトＩｇＧ１サブクラスから由来）の定常領域を有する。

一実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒトＩｇＧ１サブクラスから由来）の定常領域を有する。

一実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は、変異Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）を伴うヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。そのような抗体は、低下したＦｃＲ結合を有する（特に、それらは、もはや、ＦｃＲｇａｍｍａＩ、ＦｃＲｇａｍｍａＩＩ、及びＦｃＲｇａｍｍａＩＩＩへの結合を示さない）。これは特に、例えば血栓症のような潜在的副作用の減少に有用である（Meyer, T., et al., J. Thromb.Haemost.7 (2009) 171-81）。一実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体は、変異Ｓ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）、Ｌ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）、及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）を伴うヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。そのような抗体は、上に示す通り、低下したＦｃＲ結合を示す。記載したＰｒｏ３２９Ａｌａ変異は、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａサンドイッチ相互作用の３分の２だけを既に除去しており、本発明に従った抗体中のＰｒｏ３２９Ｇｌｙは、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩへのＦｃ部分の結合を完全に与える。これは、特に有用である。なぜなら、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩへの結合が、細胞死に導くＡＤＣＣ（抗体依存性の細胞毒性）において含まれ、それは、癌疾患の処置において有用でありうるが、しかし、それは、他の血管疾患又は免疫学的疾患の抗体ベースの処置において深刻な副作用を起こしうる。そのため、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇを伴うＩｇＧ１サブクラス及び変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを伴うＩｇＧ４サブクラスの本発明に従った抗体が、特に有用である。なぜなら、それらは、両方が、ＦｃＲｇａｍｍａＩ、ＦｃＲｇａｍｍａＩＩ、及びＦｃＲｇａｍｍａＩＩＩへのより多くの結合を示さないからである。

用語「変異ＡＡＡを伴う」は、本明細書において使用する通り、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常重鎖領域における変異Ｉ２５３Ａ（Ｉｌｅ２５３Ａｌａ）、Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）、Ｈ４３５Ａ（Ｈｉｓ４３５Ａｌａ）を指し、ここで、ナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。

用語「変異Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを伴う」は、本明細書において使用する通り、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域における変異Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）を指し、ここで、ナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。用語「変異ＳＰＬＥを伴う」は、本明細書において使用する通り、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域におけるＳ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）及びＬ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）を指し、ここで、ナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。用語「変異ＳＰＬＥ及びＰ２３９Ｇを伴う」は、本明細書において使用する通り、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域におけるＳ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）、Ｌ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）、及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）を指し、ここで、ナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。

本発明に従った免疫グロブリンは、組換え手段により産生される。このように、本発明の一局面は、本発明に従った抗体をコードする核酸である。さらなる局面は、本発明に従った抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換えの産生のための方法が、最先端技術において広く公知であり、原核細胞及び真核細胞中でのタンパク質発現を含み、続く抗体の単離及び通常は医薬的に許容可能な純度までの精製を伴う。宿主細胞中での上記の抗体の発現のために、それぞれの改変された軽鎖及び重鎖をコードする核酸を、標準方法により発現ベクター中に挿入する。発現は、適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞（ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又はE. coli細胞など）において実施され、抗体を細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収する。抗体の組換え産生のための一般的方法が、最先端技術において周知であり、例えば、Makrides, S. C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説文献において記載されている。

したがって、本発明の一実施態様は、本発明に従った二重特異性抗体の調製のための方法であって、以下の工程を含む：
ａ）宿主細胞を、前記抗体をコードする核酸分子を含むベクターを用いて形質転換すること；
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を許す条件下で培養すること；及び
ｃ）前記抗体分子を、前記培養から回収すること。

一実施態様において、ｃの下での回収工程は、軽鎖定常ドメイン特異的な捕捉試薬（それは、例えば、本発明に従った二重特異性抗体中のカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖が使用されるかに依存して、カッパ定常軽鎖又はラムダ定常軽鎖について特異的）の使用を含む。一実施態様において、この軽鎖特異的捕捉試薬を、結合及び溶出モードにおいて使用する。そのような軽鎖定常ドメイン特異的な捕捉試薬の例は、例えば、GE Healthcare／BACからのKappaSelect（商標）及びLambdaFabSelect（商標）であり、それらは、高い流速及び低い背圧を大規模で許す高度に強固なアガロースビーズマトリクスに基づく。それらは、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖の定常領域にそれぞれ結合するリガンドを特徴とする（即ち、軽鎖の定常領域を欠くフラグメントは、結合しない；図１）。両方が、従って、軽鎖の定常領域を含む他の標的分子（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ）に結合することが可能である。リガンドは、マトリクスに、長い親水性スペーサーを介して付着され、それを、標的分子への結合のために簡単に利用可能にする。それらは、ヒトＩｇカッパ又はラムダのいずれかについてスクリーニングされる単鎖抗体フラグメントに基づく。

本発明の二重特異性抗体は、従来の免疫グロブリン精製手段（例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなど）により培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たしうる。一度、単離されると、ＤＮＡを、発現ベクター中に挿入し、それは、次に、本来なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えばＨＥＫ ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、又はミエローマ細胞など）中にトランスフェクトし、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成を得うる。

二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアント（又は変異体）を、抗体ＤＮＡ中へ適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又はヌクレオチド合成により調製する。そのような改変は、しかし、非常に限られた範囲においてだけ、実施することができる。例えば、改変は、上に言及する抗体特徴（例えばＩｇＧサブクラス及び抗原結合など）を変えないが、しかし、組換え産生の収量、タンパク質安定性を改善し、又は精製を促進しうる。

本願において使用する用語「宿主細胞」は、本発明に従った抗体を生成するために操作することができる任意の種類の細胞系を表示する。一実施態様において、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用する。本明細書において使用する通り、表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」は、互換的に使用され、全てのそのような名称は後代を含む。このように、用語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、トランスファーの数にかかわらず、初代被験細胞及びそれに由来する培養物を含む。全ての子孫が、故意又は偶然の突然変異のため、ＤＮＡ含量において正確に同一ではないかもしれないことも理解される。本来の形質転換細胞についてスクリーニングされたのと同じ機能及び生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。

ＮＳ０細胞における発現が、例えば、Barnes, L. M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L. M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res.30 (2002) E9により記載されている。可変ドメインのクローニングが、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837;Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ ２９３）が、Schlaeger, E. -J., and Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83及びSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により報告されている。

原核生物のために適したコントロール配列は、例えば、プロモーター、場合により、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。

核酸は、それが、別の核酸配列と機能的な関係におかれた場合、「動作可能に連結されている」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに動作可能に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コード配列に動作可能に連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に動作可能に連結されている。一般的に、「動作可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が、近接している、分泌リーダーの場合において、近接し、リーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接する必要はない。連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の実行に従って使用する。

細胞成分又は他の混入物（例、他の細胞性核酸又はタンパク質）を、標準的な技術（アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動を含む）、及び当技術分野において公知の他により排除するために、抗体の精製を実施する。Ausubel, F., et al., ed.Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。

異なる方法が、タンパク質精製のために、十分に確立され、広範に使用されている。例えば、微生物タンパク質を用いた親和性クロマトグラフィー（例、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（例、ベータ−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを伴う）、疎水的相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例、フェニル基−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を伴う）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例、Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料を伴う）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動方法（例えばゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動など）など（Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。

本発明に従った二重特異性の二価抗体は、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ−２標的治療を必要とするヒト患者について利益を示す。

本発明に従ったヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ−２に対する二価の二重特異性は、効力／安全性プロファイルを有しうる、そして抗ＶＥＧＦ及び抗ＡＮＧ−２治療を必要とする患者のために利益を提供しうる。

本発明の一局面は、本発明に従った抗体を含む医薬的組成物である。本発明の別の局面は、医薬的組成物の製造のための本発明に従った抗体の使用である。本発明のさらなる局面は、本発明に従った抗体を含む医薬的組成物の製造のための方法である。別の局面において、本発明は、医薬的担体を用いて一緒に製剤化された、組成物、例、本発明に従った抗体を含む医薬的組成物を提供する。

本明細書において使用する通り、「医薬的担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性のある同様のものを含む。好ましくは、担体は、局所経路を介して被験者に投与する投与のために適している。例えば、抗体又はその組成物を、眼内適用により、例えば、眼内注射（例えば硝子体内注射など）により、被験者に投与することができる。これは、当技術分野において公知の標準的な手順に従って実施することができる。例えば、Ritter et al., J. Clin.Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206；及びWray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5を参照のこと。

本発明の組成物は、当技術分野において公知の種々の方法により投与することができる。当業者により理解されるであろう通り、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に依存して変動しうる。本発明の化合物を、特定の投与の経路により投与するために、その活性化を防止するための材料を用いて、化合物をコーティングする、又は化合物を同時投与することが必要でありうる。例えば、化合物は、適切な担体（例えば、リポソーム）、又は希釈剤中で、被験者に投与してもよい。医薬的に許容可能な希釈剤は、生理食塩水及び水性緩衝溶液を含む。医薬的担体は、滅菌注射可能溶液又は分散剤の即時調製のための滅菌水溶液又は分散剤及び滅菌粉末を含む。医薬的に活性な物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野において公知である。

送達の多くの可能なモードを使用することができ、非限定的に、眼内適用又は局所適用を含む。一実施態様において、適用は、眼内であり、非限定的に、結膜下注射、前房内注射、側頭部角膜縁を介した前房中への注射、基質内注射、角膜内注射、網膜下注射、眼房水注射、テノン嚢下注射又は持続送達装置、硝子体内注射（例、前、中、又は後硝子体内注射）を含む。一実施態様において、適用は局所的であり、非限定的に、角膜への点眼を含む。

一実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物は、硝子体内適用を介して、例えば、硝子体内注射を介して投与される。これは、当技術分野において公知の標準的な手順に従って実施することができる。例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206；及びWray et al., Arch.Neurol.33 (1976) 183-5を参照のこと。

一部の実施態様において、本発明の治療的キットは、本明細書において記載する医薬的組成物中に存在する二重特異性抗体の１又は複数の用量、医薬的組成物の硝子体内注射のための適した装置、ならびに適した被験者を詳述する指示書及び注射を行うためのプロトコールを含みうる。これらの実施態様において、組成物は、典型的には、処置を必要とする被験者に、硝子体内注射を介して投与される。これは、当技術分野において公知の標準的な手順に従って実施することができる。例えば、Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol.25 (1999) 196-206；及びWray et al., Arch.Neurol.33 (1976) 183-5を参照のこと。

組成物は、また、アジュバント（例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤など）を含んでもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順（上記）により、ならびに、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、及び同様のものなど）の包含により、確実にされうる。また、等張剤（例えば糖、塩化ナトリウム、及び同様のものなど）を組成物中に含むことが望ましいであろう。また、注射可能な医薬的形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど）の包含によりもたらされうる。

選択された投与の経路にかかわらず、本発明の化合物（それは、適した水和形態において使用してもよい）、及び／又は本発明の医薬的組成物は、当業者に公知の従来の方法により、医薬的に許容可能な投与形態中に製剤化される。

本発明の医薬的組成物における活性成分の実際の投与量レベルを、変動させてもよく、患者への毒性を伴わず、特定の患者、組成物、及び投与様式についての所望の治療的応答を達成するために効果的である活性成分の量を得るようにする。選択される投与量レベルは、種々の薬物動態学的因子（用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、用いられている特定の化合物の排出速度、治療の持続期間、他の薬物、用いられる特定の組成物との組み合わせにおいて使用される化合物及び／又は材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の因子を含む）に依存しうる。

組成物は、滅菌で、組成物がシリンジにより送達可能である範囲まで液体でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは、等張緩衝生理食塩水である。

適した流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、分散の場合においては、要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）、及び塩化ナトリウムなどを組成物中に含むことが好ましいであろう。

組成物は、結膜下投与のための活性薬剤を含む眼科用デポー製剤を含むことができる。眼科用デポー製剤は、本質的に純粋な活性薬剤、例えば、本発明に従った二重特異性抗体の微粒子を含む。本発明に従った二重特異性抗体を含む微粒子は、生体適合性の医薬的に許容可能なポリマー又は脂質封入薬剤中に埋め込むことができる。デポー製剤を、延長期間にわたり、実質的に全ての活性物質の全てを放出するように適応してもよい。ポリマー又は脂質マトリクスは、存在する場合、全て又は実質的に全ての活性薬剤の放出後に、十分に分解され、投与部位から輸送されるように適応してもよい。デポー製剤は、医薬的に許容可能なポリマー及び溶解又は分散した活性薬剤を含む、液体製剤でありうる。注射時、ポリマーは、例えば、ゲル化又は沈殿により、注射部位でデポーを形成する。

本発明の別の局面は、眼血管疾患の処置における使用のための、本発明に従った二重特異性抗体である。

本発明の一実施態様は、眼血管疾患の処置における使用のための、本発明に従った二重特異性抗体である。

本発明の別の局面は、眼血管疾患の処置における使用のための、前記医薬的組成物である。

本発明の別の局面は、眼血管疾患の処置のための医薬の製造のための本発明に従った抗体の使用である。

本発明の別の局面は、そのような処置を必要とする患者に、本発明に従った抗体を投与することによる、眼血管疾患に苦しむ患者の処置の方法である。

用語「眼血管疾患」及び「血管眼疾患」を、本明細書において互換的に使用し、非限定的に、眼内新生血管症候群、例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、未熟児網膜症、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、網膜血管腫増殖症、黄斑毛細血管拡張症、虚血性網膜症、虹彩血管新生、眼内血管新生、角膜血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、及び網膜変性などを含む。（Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G.K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp.1625-1710）本明細書において使用する通り、眼血管障害は、眼組織（例えば網膜又は角膜など）の構造中への新たな血管の変化した又は調節されない増殖及び侵入により特徴付けられる任意の病理学的状態を指す。一実施態様において、眼血管疾患は、以下からなる群より選択される：滲出型加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、乾燥型加齢黄斑変性症（乾燥型ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、血管炎（例、網膜中心静脈閉塞症）、乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、多巣性脈絡膜炎、眼ヒストプラスマ、眼瞼炎、ドライアイ（シェーグレン病）、及び他の眼疾患、ここで、眼疾患又は障害は、眼血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫と関連付けられる。そのため、本発明に従った二重特異性抗体は、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、ＰＤＲ、眼瞼炎、ドライアイ、及びブドウ膜炎、また、好ましくは、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、眼瞼炎、及びドライアイ、また、好ましくは、ＣＭＥ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、及びＰＤＲ、また、好ましくは、眼瞼炎、及びドライアイ、特に、滲出型ＡＭＤ及び乾燥型ＡＭＤ、また、特に、滲出型ＡＭＤの防止及び処置において有用である。一部の実施態様において、眼疾患は、滲出型加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、未熟児網膜症、及び糖尿病性網膜症からなる群より選択される。

角膜血管新生に関連付けられる他の疾患は、非限定的に、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部角角膜炎、翼状片角膜炎乾性角、シェーグレン、酒さ性ざ瘡、フィレクテヌローシス、梅毒、マイコバクテリア感染、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切開、及び角膜移植拒絶を含む。

網膜／脈絡膜新生血管形成に関連する疾患は、非限定的に、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜色素変性、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を起こす感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経ピット、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷、及びレーザー後合併症を含む。他の疾患は、非限定的に、ルベオーシス（角の新生血管形成）に関連付けられる疾患及び線維血管組織又は繊維組織の異常増殖（増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む）により起こされる疾患を含む。

未熟児の網膜症（ＲＯＰ）は、早期に生まれた乳児に影響する、眼の疾患である。それは、瘢痕及び網膜剥離をもたらしうる、網膜血管の無秩序な成長により起こされると考えられる。ＲＯＰは、軽度であり、自然発生的に消散しうるが、深刻な場合において失明に導きうる。そのようなものとして、全ての早産乳児には、ＲＯＰについてのリスクがあり、非常に低い出生体重は、追加のリスク因子である。酸素毒性及び相対低酸素症の両方が、ＲＯＰの発生に寄与しうる。

黄斑変性症は、高齢者において主に見出される医学的状態であり、ここで、眼の内部裏打ちの中心（網膜の黄斑領域として公知である）が、菲薄化、萎縮、及び、一部の場合において、出血を被る。これは、中心視野の喪失を招きうるが、それは、細かい詳細を見る、読む、又は顔を認識することの不能を伴う。米国眼科学会に従い、それは、５０歳を上回る人々での、今日の米国での中心視野喪失（失明）の主要な原因である。若年者に影響する一部の黄斑ジストロフィーは、時々、黄斑変性症と呼ばれているが、この用語は、一般的に、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ又はＡＲＭＤ）を指す。

加齢黄斑変性は、網膜色素上皮とその下の脈絡膜の間のドルーゼンと呼ばれる黄斑（詳細な中心視野を提供する網膜の中央領域で、中心窩と呼ばれる）に特徴的な黄色沈着を伴い始まる。これらの初期の変化（加齢性黄斑変性症とも呼ばれる）を伴う大半の人々が、良い視力を有する。ドルーゼンを伴う人々は、進み、進行性ＡＭＤを発生しうる。このリスクは、ドルーゼが大きく、多数であり、黄斑下の色素性細胞層における乱れに関連付けられる場合、相当により高い。大きく、柔らかいドルーゼンは、上昇したコレステロール沈着に関連しており、コレステロール低下薬剤又はＲｈｅｏ手順に応答しうる。

進行性ＡＭＤは、深刻な失明に関与し、２つの形態を有する：乾燥型及び滲出型。中央の地理的な萎縮は、進行性ＡＭＤの乾燥形態であり、網膜下の網膜色素上皮層への萎縮から生じ、それは、眼の中央部分において光受容体（桿体及び錐体）の喪失を通じて視力喪失を起こす。処置は、この状態について利用可能ではなく、高用量の酸化防止剤、ルテイン、及びゼアキサンチンを伴うビタミンサプリメントが、国立眼研究所及び他により、乾燥黄斑変性の進行を遅らせ、一部の患者において、視力を改善することが実証されている。

網膜色素変性症（ＲＰ）は、遺伝的な眼状態の群である。ＲＰについての症状の進行において、夜盲は、一般的に、トンネル視を数年又は数十年だけ先行する。ＲＰを伴う多くの人が、彼らの４０代又は５０代までに、合法的に盲目にならず、一部の視力を、全ての彼らの人生で保持する。他は、一部の場合において、小児期という早期に、ＲＰから完全な盲目に行く。ＲＰの進行は、各々の場合において異なる。ＲＰは、遺伝性網膜ジストロフィーの型であり、遺伝性障害の群であり、ここで、網膜の光受容体（桿体及び錐体）又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の異常が、進行性の視力喪失に導く。罹患した個人は、最初に、欠陥のある暗順応又は夜盲症（夜盲）を経験し、周辺視野の低下（トンネル視として公知である）及び、時々、疾患の経過における後期に、中心視野の喪失が続く。

液体及びタンパク質の堆積物が眼の黄斑の上下に集まる際、黄斑浮腫（網膜の黄色中央領域）が生じ、それを厚くし、膨潤させる。腫脹が、ヒトの中心視野を歪めうる。なぜなら、黄斑は、眼球の後ろで、網膜の中心近くにあるからである。この領域は、ヒトが、直接的に視線中にある形態、色、及び詳細を見ることを可能にする、シャープで明確な中心視野を提供する緊密に詰められた錐体を保持する。嚢胞様黄斑浮腫は、嚢胞形成を含む黄斑浮腫の型である。

組み合わせ治療：特定の実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物を、本明細書において記載する１つ又は複数の眼血管疾患の処置のために、単独で（追加の治療的薬剤を伴わない）投与する。

他の実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物を、本明細書において記載する１つ又は複数の眼血管疾患の処置のために、１つ又は複数の追加の治療的薬剤又は方法との組み合わせにおいて投与する。

他の実施態様において、本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物を、１つ又は複数の追加の治療的薬剤との組み合わせにおいて製剤化し、本明細書において記載する１つ又は複数の眼血管疾患の処置のために投与する。

特定の実施態様において、本明細書において提供する組み合わせ処置は、投与を含み、本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物を、本明細書において記載する１つ又は複数の眼血管疾患の処置のために、１つ又は複数の追加の治療的薬剤と順次投与する。

追加の治療的薬剤は、非限定的に、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｒｐＲＳ）、EyeOOl（抗ＶＥＧＦペグ化アプタマー）、スクアラミン、RETAANE（商標）（デポー懸濁液用の酢酸アネコルタブ；Alcon, Inc.）、コンブレタスタチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）、MACUGEN（商標）、MIFEPREX（商標）（ミフェプリストン−ｒｕ４８６）、サブテノントリアムシノロンアセトニド、硝子体内結晶トリアムシノロンアセトニド、プリノマスタット（ＡＧ３３４０合成マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、Pfizer）、フルオシノロンアセトニド（フルオシノン眼内インプラントを含む、Bausch & Lomb/Control Delivery Systems）、ＶＥＧＦＲ阻害剤（SUGEN）、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Regeneron/Aventis）、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（ｌ−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、及びＳＵ１１２４８（スニチニブ）、リノマイド、ならびにインテグリンｖ．ベータ．３機能及びアンギオスタチンの阻害剤を含む。

本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物との組み合わせにおいて使用することができ、投与される他の医薬的治療は、非限定的に、非熱レーザーを用いたVISUDYNE（商標）、ＰＫＣ４１２、Endovion（NeuroSearch A/S）、神経栄養因子（例として、グリア由来の神経栄養因子及び毛様体神経栄養因子を含む）、ジアタゼム、ドルゾラミド、フォトトロプ、９−シス−レチナール、目薬（エコー治療を含む）（ヨウ化ホスホリン又はエコチオフェート又は炭酸脱水酵素阻害剤を含む）、ＡＥ−９４１（AEterna Laboratories, Inc.）、Sirna-027（Sima Therapeutics, Inc.）、ペガプタニブ（NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences）、ニューロトロフィン（例として、ＮＴ−４／５、Genentechを含む）、Cand5（Acuity Pharmaceuticals）、ＩＮＳ−３７２１７（Inspire Pharmaceuticals）、インテグリンアンタゴニスト（Jerini AG及びAbbott Laboratoriesからのものを含む）、ＥＧ−３３０６（Ark Therapeutics Ltd.）、ＢＤＭ−Ｅ（BioDiem Ltd.）、サリドマイド（例えば、EntreMed, Inc.により使用される通り）、カルジオトロフィン１（Genentech）、２メトキシエストラジオール（Allergan/Oculex）、ＤＬ−８２３４（Toray Industries）、ＮＴＣ−２００（Neurotech）、テトラチオモリブデン（ミシガン大学）、ＬＹＮ−００２（Lynkeus Biotech）、微細藻類化合物（Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals）、Ｄ−９１２０（Celltech Group pic）、ＡＴＸ−Ｓ１０（Hamamatsu Photonics）、ＴＧＦ−β２（Genzyme/Celtrix）、チロシンキナーゼ阻害剤（Allergan, SUGEN, Pfizer）、ＮＸ−２７８−Ｌ（NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences）、ＯＰＴ−２４（OPTIS France SA）、網膜細胞神経節神経保護剤（Cogent Neurosciences）、Ｎニトロピラゾール誘導体（Texas A&M University System）、ＫＰ−１０２（Krenitsky Pharmaceuticals）、シクロスポリンＡ、Ｔｉｍｉｔｅｄ網膜転座、光線力学治療（例として、受容体を標的とするＰＤＴ、Bristol-Myers Squibb, Co.；ＰＤＴを用いた注射用のルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン、QLT Inc.；ＰＤＴを伴うロスタポルフィン、Miravent Medical Technologies；ＰＤＴを伴うタラポルフィンナトリウム、Nippon Petroleum；モテキサフィンルテチウム、Pharmacyclics, Inc.）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Novagali Pharma SAによりテストされた産物及びＩＳＩＳ−１３６５０、Isis Pharmaceuticalsを含む）、レーザー光凝固、ドルーゼンレーザー加工、黄斑円孔手術、黄斑転座手術、移植可能ミニチュアテレスコープ、ファイモーション血管造影（また、マイクロレーザー治療及びフィーダーベッセル処置として公知である）、陽子線治療、微小刺激治療、網膜剥離及び硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱治療、光化学系Ｉ治療、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレシス（また、膜差濾過及びＲｈｅｏｔｈｅｒａｐｙとして公知である）、マイクロチップ移植、幹細胞治療、遺伝子交換治療、リボザイム遺伝子治療（低酸素応答エレメント用の遺伝子治療を含む、Oxford Biomedica；Lentipak、GENETIX；ＰＤＥＦ遺伝子治療、GenVec）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞、Diacrin, Inc.；網膜細胞移植、Cell Genesys, Inc.を含む）、及び鍼を含む。

任意の抗血管形成薬剤を、本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物（非限定的に、Carmeliet and Jain, 2000, Nature 407: 249-257により列挙されるものを含む）との組み合わせにおいて使用することができる。特定の実施態様において、抗血管形成薬剤は、別のＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えばＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦ受容体フラグメント、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを遮断することが可能であるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子量阻害剤、及びそれらの任意の組み合わせなどであり、これらは、抗ＶＥＧＦアプタマー（例、ペガプタニブ）、可溶性組換えデコイ受容体（例、ＶＥＧＦトラップ）を含む。特定の実施態様において、抗血管形成薬剤は、コルチコステロイド、血管形成抑制ステロイド、酢酸アネコルタブ、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦＲ又はＶＥＧＦリガンドの発現を減少させる低分子干渉ＲＮＡ、チロシンキナーゼ阻害剤を用いたＶＥＧＦＲ後の遮断、ＭＭＰ阻害剤、ＩＧＦＢＰ３、ＳＤＦ−１遮断薬、ＰＥＤＦ、ガンマ−セクレターゼ、デルタ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、ＨＩＦ−１アルファ遮断、プロテインキナーゼＣＫ２遮断、及び血管内皮カドヘリン（ＣＤ−１４４）及び間質由来因子（ＳＤＦ）−Ｉ抗体を使用した血管新生部位への幹細胞（即ち、内皮前駆細胞）ホーミングの阻害を含む。ＶＥＧＦ受容体（ＰＴＫ７８７を含む）を標的とする小分子ＲＴＫ阻害剤を使用することもできる。必ずしも抗ＶＥＧＦ化合物ではない血管新生に対して活性を有する薬剤も使用することができ、抗炎症薬物、ｍ−Ｔｏｒ阻害剤、ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、シクロスポリン、抗ＴＮＦ薬剤、抗補体薬剤、及び非ステロイド性抗炎症薬剤を含むことができる。神経保護的であり、乾燥型黄斑変性の進行を潜在的に低下させることができる薬剤も使用することができる（例えば「神経ステロイド」と呼ばれる薬物のクラスなど）。これらは、薬物、例えばデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（ブランド名：Prastera（登録商標）及びFidelin（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロン硫酸、及びプレグネノロン硫酸などを含む。任意のＡＭＤ（加齢性黄斑変性症）治療用薬剤は、本発明に従った二重特異性抗体又は医薬的組成物との組み合わせにおいて使用することができ、非限定的に、ＰＤＴとの組み合わせにおけるベルテポルフィン、ペガプタニブナトリウム、亜鉛、又は酸化防止剤（単独で又は任意の組み合わせにおいて）を含む。

用語「被験者」及び「患者」は、互換的に使用され、哺乳動物（例えばヒト患者及び非ヒト霊長類など）、ならびに実験動物（例えばウサギ、ラット、及びマウスなど）、ならびに他の動物などを指す。動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、ニワトリなどを含む。本発明の治療的方法を実行するための好ましい被験者は、ヒトである。処置が必要な被験者は、眼血管疾患又は障害に既に苦しんでいる患者ならびに障害を発生しやすい患者を含む。

本明細書において使用する通り、表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」は互換的に使用され、全てのそのような名称はその子孫を含む。このように、用語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、トランスファーの数に関わらず、初代被験細胞及びそれから由来する培養物を含む。全ての子孫が、故意又は偶然の変異に起因し、ＤＮＡ含量において正確に同一ではないかもしれないことも理解される。本来の形質転換細胞についてスクリーニングされたのと同じ機能及び生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。別個の名称が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。

用語「形質転換」は、本明細書において使用される通り、宿主細胞中へのベクター／核酸のトランスファーのプロセスを指す。手強い細胞壁障壁を伴わない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、Graham, F.L., van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 546-467により記載される通りのリン酸カルシウム沈殿法により行う。しかし、細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法（例えば、核注射による又はプロトプラスト融合による、など）も使用することができる。原核細胞又は実質的な細胞壁構成を含む細胞を使用する場合、例えば、トランスフェクションの方法は、Cohen, S.N., et al., PNAS. 69 (1972) 2110-2114により記載される通りの塩化カルシウムを使用したカルシウム処理である。

本明細書において使用する通り、「発現」は、核酸がｍＲＮＡ中に転写されるプロセス及び／又は転写されたｍＲＮＡ（また、転写物として言及される）が、その後、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質中に翻訳されているプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的に、遺伝子産物として言及される。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡから由来する場合、真核細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。

「ベクター」は、特に自己複製する核酸分子であり、それは、挿入された核酸分子を、宿主細胞中及び／又はその間に移す。この用語は、細胞中へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入（例、染色体組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、ならびに、ＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また、記載する通りの機能の複数を提供するベクターが含まれる。

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞中に導入された場合、ポリペプチドに転写及び翻訳されうるポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるように機能することができる、発現ベクターで構成される適した宿主細胞を指す。

以下の実施例、配列表、及び図面を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲において記載される。記載する手順は、本発明の精神から逸脱することを伴わず、改変を作ることができることが理解される。

配列リストの記載（アミノ酸配列）

以下において、本発明の実施態様を列挙する：
１．ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ここで
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及び、ここで
ｉｉｉ）二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含む。

２．実施態様１に従った二重特異性抗体であって、ここで
ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号７のアミノ酸配列を、及び、軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ならびに
ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号１５のアミノ酸配列を、及び、軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。

３．実施態様１〜２のいずれか１つに従った二重特異性抗体であって、ここで、ｉｉｉ）の下の定常重鎖領域が、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。

４．実施態様３に従った二重特異性抗体であって、ここで、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。

５．実施態様１〜２のいずれか１つに従った二重特異性抗体であって、ここで、ｉｉｉ）の下の定常重鎖領域が、ヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。

６．実施態様５に従った二重特異性抗体であって、ここで、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。

７．実施態様５に従った二重特異性抗体であって、ここで、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。

８．実施態様１〜７のいずれか１つに従った抗体を含む医薬的組成物。

９．眼血管疾患の処置における使用のための、実施態様１〜７のいずれか１つに従った二重特異性抗体。

１０．眼血管疾患の処置のための医薬の製造のための、実施態様１〜７のいずれか１つに従った二重特異性抗体の使用。

１１．抗体が、硝子体内適用を介して投与される、実施態様９又は１０のいずれか１つに従った二重特異性抗体。

１２．そのような処置を必要とする患者に、実施態様１〜７のいずれか１つに従った抗体を投与することによる、眼血管疾患に苦しむ患者の処置の方法。

１３．実施態様１〜７のいずれか１つに従った二重特異性抗体をコードする核酸。

１４．原核又は真核宿主細胞において前記核酸を発現することが可能である、実施例１３に従った前記核酸を含む発現ベクター。

１５．実施態様１４に従ったベクターを含む原核又は真核宿主細胞。

１６．実施態様１〜７に従った二重特異性抗体の調製のための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）宿主細胞を、前記抗体をコードする核酸分子を含むベクターを用いて形質転換すること；
ｂ）宿主細胞を、前記抗体分子の合成を許す条件下で培養すること；及び
ｃ）前記抗体分子を、前記培養から回収すること。

１７．実施態様１６の方法により得られた二重特異性抗体。

１８．配列番号２５の、配列番号２６の、配列番号２７の、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体。

１９．配列番号２１の、配列番号２２の、配列番号２３の、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体。

２０．配列番号２９の、配列番号３０の、配列番号３１の、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む、二重特異性の二価抗体。

実験手順

用語「変異ＡＡＡを伴う」は、本明細書において使用する通り、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常重鎖領域中の変異Ｉ２５３Ａ（Ｉｌｅ２５３Ａｌａ）、Ｈ３１０Ａ（Ｈｉｓ３１０Ａｌａ）、及びＨ４３５Ａ（Ｈｉｓ４３５Ａｌａ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を指し、用語「変異Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡを伴う」は、本明細書において使用する通り、ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域中の変異Ｌ２３４Ａ（Ｌｅｕ２３５Ａｌａ）、Ｌ２３５Ａ（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ）、及びＰ３２９Ｇ（Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を指し、用語「変異ＳＰＬＥを伴う」は、本明細書において使用する通り、ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域中のＳ２２８Ｐ（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）及びＬ２３５Ｅ（Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を指す。

実施例
材料及び方法
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報が、以下において与えられる：Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗体鎖のアミノ酸に、ＥＵナンバリングに従って番号を付けて指す（Edelman, G. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。

組換えＤＮＡ技術
標準的方法を使用し、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載される通りに操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の指示に従って使用した。

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、Geneart（レーゲンスブルク、ドイツ）での所与の仕様に従って順序付けた。

ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、MediGenomix GmbH（マルティンスリート、ドイツ）又はSequiserve GmbH（ファーターシュテッテン、ドイツ）で実施した二本鎖配列決定により決定した。

ＤＮＡ及びタンパク質配列分析ならびに配列データ管理
ＧＣＧの（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びInfomaxのVector NT1 Advance suite version 8.0を、配列の作成、マッピング、分析、注釈、及び図示のために使用した。

発現ベクター
記載する抗体の発現のために、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターを伴う又は伴わないｃＤＮＡ組織化又はＣＭＶプロモーターを伴うゲノム組織化のいずれかに基づく一過性発現（例、ＨＥＫ２９３−Ｆにおける）細胞のための発現プラスミドの変異体を適用した。

抗体発現カセットの他に、ベクターは、以下を含んだ：
− 大腸菌においてこのプラスミドの複製を許す複製の起点、
− 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子、及び
− 真核細胞における選択可能なマーカーとしての、ハツカネズミからのジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、
− 抗体遺伝子の転写単位は、以下のエレメントで構成された：
− ５’末端での固有の制限部位、
− ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサー及びプロモーター、
− ｃＤＮＡ組織化の場合において、イントロンＡ配列が続く、
− ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
− 免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 免疫グロブリンエクソン−イントロン組織化を伴うｃＤＮＡとしての又はゲノム組織化としてのヒト抗体鎖（野生型又はドメイン交換を伴う）、
− ポリアデニル化シグナル配列を伴う３’非翻訳領域、及び
− ３’末端での固有の制限部位。

下に記載する通りの抗体鎖を含む融合遺伝子を、ＰＣＲ及び／又は遺伝子合成により生成し、公知の組換え方法及び一致した核酸セグメントの接続により（例、それぞれのベクターにおいて固有の制限部位を使用し）、組み立てた。サブクローン化した核酸配列をＤＮＡ配列決定により検証した。一過性トランスフェクションのために、より多量のプラスミドを、形質転換された大腸菌培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）からのプラスミド調製により調製した。

細胞培養
標準的な細胞培養技術を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.において記載される通りに使用した。

二重特異性抗体は、下に記載する通り、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９−Ｆ細胞中でのそれぞれの発現プラスミドの一過性同時トランスフェクションにより発現させた。

実施例１
タンパク質の発現及び精製
ＨＥＫ２９３−Ｆシステムにおける一過性トランスフェクション
二重特異性抗体を、それぞれのプラスミド（例、重鎖及び改変重鎖、ならびに対応する軽鎖及び改変軽鎖をコードする）を用いた一過性トランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３−Ｆシステム（Invitrogen）を製造者の指示に従って使用して精製した。簡単には、振盪フラスコ中又は撹拌発酵槽中のいずれかで、無血清FreeStyle（商標）２９３発現培地（Invitrogen）中で、懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Invitrogen社）を、４つの発現プラスミド及び２９３フェクチン（商標）又はフェクチン（Invitrogen）の混合物を用いてトランスフェクトした。２L振盪フラスコ（Corning）について、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、６００ml中の１．０Ｅ＊６個細胞/mLの密度で播種し、１２０rpm、８%ＣＯ_２でインキュベートした。翌日、細胞を、Ａ）重鎖又は改変重鎖、及び等モル比での対応する軽鎖をそれぞれコードする６００μgの全プラスミドＤＮＡ（１μg/mL）を伴う２０mlのOpti-MEM（Invitrogen）ならびにＢ）２０mlのOpti-MEM ＋ １．２mLの２９３フェクチン又はフェクチン（２μl/mL）の約４２mL混合物を用いて、約１．５Ｅ＊６個細胞/mLの細胞密度でトランスフェクトした。グルコース消費量に従い、グルコース溶液を、発酵の過程の間に加えた。分泌された抗体を含む上清を、５−１０日後に採取し、抗体を上清から直接的に精製した、又は上清を凍結及び保存した。

精製
二重特異性抗体を、細胞培養上清から、MabSelectSure-Sepharose（商標）（ｎｏｎ＿ＡＡＡ変異体用）（GE Healthcare、スウェーデン）又はkappaSelect-Agarose（ＡＡＡ変異体用）（GE Healthcare、スウェーデン）を使用した親和性クロマトグラフィー、ブチルセファロース（GE Healthcare、スウェーデン）を使用した疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びSuperdex 200サイズ排除（GE Healthcare、スウェーデン）クロマトグラフィーにより精製した。

簡単には、滅菌濾過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０mM Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１mM ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７mM ＮａＣｌ、及び２．７mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて平衡化したMabSelect SuRe樹脂上に捕捉し、平衡緩衝液を用いて洗浄し、２５mMクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ３．０で溶出した。ＡＡＡ変異体を、２５mMトリス、５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を用いて平衡化したkappaSelect樹脂上に捕捉し、平衡緩衝液を用いて洗浄し、２５mMクエン酸ナトリウムｐＨ２．９を用いて溶出した。溶出したタンパク質画分をプールし、２M Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０を用いて中和した。抗体プールは、０．８M硫酸アンモニウムの最終濃度まで１．６M硫酸アンモニウム溶液を加えることにより、疎水性相互作用クロマトグラフィー用に調製し、ｐＨを、酢酸を使用し、ｐＨ５．０に調整した。３５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．８M硫酸アンモニウム、ｐＨ５．０を用いたブチルセファロース樹脂の平衡化後、抗体を樹脂に適用し、平衡緩衝液を用いて洗浄し、３５mM酢酸ナトリウムｐＨ５．０までの直線勾配を用いて溶出した。画分を含む二重特異性抗体をプールし、２０mMヒスチジン、１４０mMＮａＣｌ、ｐＨ６．０を用いて平衡化したSuperdex20026/60 GL（GE Healthcare、スウェーデン）カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより、さらに精製した。画分を含む二重特異性抗体を、プールし、Vivaspin限外濾過装置（Sartorius Stedim Biotech S.A.、フランス）を使用して必要な濃度まで濃縮し、−８０℃で保存した。

純度及び抗体の完全性を、マイクロ流体Labchip技術（Caliper Life Science, USA）を使用し、ＣＥ−ＳＤＳによる各々の精製工程後に分析した。５μlのタンパク質溶液を、製造者の指示に従い、HT Protein Express Reagent Kitを使用し、ＣＥ−ＳＤＳ分析のために調製し、HT Protein Express Chipを使用したLabChip GXIIシステム上で分析した。データを、LabChip GX Softwareを使用して分析した。

抗体サンプルの凝集体含量を、２×ＰＢＳ（２０mM Ｎａ_２ＨＰＯ ４、２mM ＫＨ_２ＰＯ_４、２７４mM ＮａＣｌ、及び５．４mM ＫＣｌ、ｐＨ７．４）泳動緩衝液中のSuperdex200分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare、スウェーデン）を使用し、２５℃で、高性能ＳＥＣにより分析した。２５μgタンパク質を、０．７５ml/分の流速でカラム上に注射し、５０分間にわたり均一濃度で溶出した。

同様に、＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体ＶＥＧＦａｎｇ２−００１２及びＶＥＧＦａｎｇ２−０２０１を調製し、以下の収量を伴い精製した：

また、＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体、ＡＡＡ変異を伴う及びＳＰＬＥ変異を伴う＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞ＣｒｏｓｓＭＡｂ ＩｇＧ４（配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２）、ＡＡＡ変異を伴う＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞ＯＡｓｃＦａｂ ＩｇＧ１（配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５）、ならびにＡＡＡ変異を伴う及びＳＰＬＥ変異を伴う＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞ＯＡｓｃＦａｂ ＩｇＧ４（配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８）を、同様に調製し、精製することができる。

実施例２
分析＆現像性
小規模ＤＬＳベース粘度測定
粘度測定は、本質的に、（He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-3）において記載される通りに実施した。簡単には、サンプルを、ポリスチレンラテックスビーズ（３００nm直径）及びポリソルベート２０（０．０２%ｖ／ｖ）を加える前に、２００mMコハク酸アルギニン、ｐＨ５．５中の種々のタンパク質濃度に濃縮する。サンプルを、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離により、光学的３８４ウェルプレート中に移し、パラフィンオイルを用いて覆った。ラテックスビーズの見かけ上の直径を、２５℃での動的光散乱により決定する。溶液の粘度を、η＝η０（ｒｈ／ｒｈ、０）（η：粘度；η０：水の粘度；ｒｈ：ラテックスビーズの見掛け上の流体力学的半径；ｒｈ、０：水中でのラテックスビーズの流体力学半径）として算出することができる。

同じ濃度での種々のサンプルの比較を許すために、粘度−濃度データを、ムーニー等式（式１）（Mooney, Colloid Sci, 1951; Monkos, Biochem.Biophys.Acta 1997）を用いて適合し、それに従って、データを補間した。

（Ｓ：タンパク質の流体力学的相互作用パラメータ；Ｋ：自己込み合い因子；Φ：溶解したタンパク質の体積分率）

結果を図２において示す：Ｆｃ部分においてＡＡＡ変異を伴うＶＥＧＦａｎｇ２−００１６は、全ての測定された温度で、Ｆｃ部分においてＡＡＡ変異を伴わないＶＥＧＦａｎｇ２−００１５と比較し、より低い粘度を示す。

ＤＬＳ凝集開始温度
サンプルは、２０mMヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中で、濃度１mg/mLで調製し、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離により光学的３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルを用いて覆った。流体力学半径を、動的光散乱により繰り返し測定し、サンプルを、０．０５℃／分の速度で、２５℃から８０℃まで加熱する。凝集開始温度は、流体力学的半径が増加し始める温度として定義する。結果を図３に示す。図３において、Ｆｃ部分におけるＡＡＡ変異を伴わないＶＥＧＦａｎｇ２−００１５対ＡＡＡ変異を伴うＶＥＧＦａｎｇ２−００１６の凝集を示す。ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６は、６１℃の凝集開始温度を示したのに対し、ＡＡＡ変異を伴わないＶＥＧＦａｎｇ２−００１５は、６０℃の開始温度を示した。

ＤＬＳ時間経過
サンプルを、２０mMヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に、１mg/mLの濃度で調製し、０．４μmフィルタープレートを通した遠心分離により光学的３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルを用いて覆った。流体力学半径を、動的光散乱により繰り返し測定し、サンプルを、１４５時間まで５０℃の一定温度で保つ。この実験において、上昇温度での天然、アンフォールドタンパク質の凝集傾向は、経時的に、平均粒径の増加に導きうる。このＤＬＳベースの方法は、凝集物について非常に鋭敏である。なぜなら、これらは、過剰比例的に散乱光強度に寄与するためである。５０℃（凝集開始温度に近い温度、上を参照のこと）で１４５時間後でさえ、わずか０．５nm未満の平均粒径の増加が、ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５及びＶＥＧＦａｎｇ２−００１６の両方について見出された。

１００mg/mLで４０℃での７日間保存（ＨＭＷ増加）
サンプルを、２００mMアルギニンコハク酸、ｐＨ５．５中で、１００mg/mLの最終濃度まで濃縮し、滅菌濾過し、静止状態で７日間にわたり４０℃で保存した。保存前後、高及び低分子量種（それぞれＨＭＷ及びＬＭＷ）の含量を、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定する。保存したサンプルと調製直後に測定したサンプルとの間のＨＭＷ及びＬＭＷ含量における差を、それぞれ「ＨＭＷ増加」及び「ＬＭＷ増加」として報告する。結果を表４及び図４において示し、それらは、ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）が、ＶＥＧＦ Ａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）と比較し、主ピークのより高い低下及びより高いＨＭＷ増加を示すことを示している。驚くべきことに、ＶＥＧＦ Ａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）は、ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）と比較し、より低い凝集傾向を示した。

抗ＶＥＧＦ及び抗Ａｎｇ２二重特異性抗体の機能的分析は、BIAcore（登録商標）Ｔ１００又はＴ２００機器（GE Healthcare）を２５℃で使用し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。BIAcore（登録商標）システムが、分子相互作用の試験のために十分に確立されている。ＳＰＲ技術は、金コーティングバイオセンサーチップの表面近くでの屈折率の測定に基づく。屈折率における変化は、固定化リガンドと、溶液中に注射された分析物との相互作用により起こる表面上での質量変化を示す。質量は、分子が、表面上に固定化されたリガンドに結合する場合、増加し、逆に、質量は、固定化リガンドからの分析物の解離（複雑な解離を反映する）の場合において、減少する。ＳＰＲは、リガンド／分析物の結合の継続的リアルタイムモニタリング、及び、このように、会合速度定数（ｋａ）の、解離速度定数（ｋｄ）、及び平衡定数（ＫＤ）の決定を許す。

実施例３
ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＦｃｇａｍｍａＲ、及びＦｃＲｎへの結合
種交差反応性の評価を含む、動力学的親和性ＶＥＧＦアイソフォーム
捕捉システム（１０μg/mlヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２；オーダーコード：２８９５８３２５；GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）の約１２０００共鳴単位（ＲＵ）を、GE Healthcareにより供給されたアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０で、ＣＭ５チップ（GE Healthcare ＢＲ−１００５−３０）上に共役させた。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５% Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、泳動緩衝液を用いて２回刺激した。二重特異性抗体を、５μｌ／分の流量で３０秒間にわたり、５０nM溶液を注射することにより捕捉した。会合を、１：３希釈液中で３００nMを用いて開始し、３０μl/分の流量で３００秒間にわたる、溶液中の種々の濃度におけるヒトｈＶＥＧＦ１２１、マウスｍＶＥＧＦ１２０、又はラットｒＶＥＧＦ１６４の注射により測定した。解離相を、１２００秒間までモニターし、サンプル溶液から泳動緩衝液への切り替えにより誘発した。表面を、３０μｌ／分の流速でグリシンｐＨ２．１溶液を用いた６０秒間の洗浄により再生した。バルク屈折率の差を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）表面から得られた応答を減算することにより補正した。ブランク注射も減算する（＝二重参照）。見掛けのＫ_Ｄ及び他の動力学的パラメータの算出のために、ラングミュア１：１モデルを使用した。結果を表５において示す。

種交差反応性の評価を含むＡｎｇ２溶液親和性
溶液親和性では、平衡混合物中の遊離の相互作用パートナーの濃度を決定することにより、相互作用の親和性を測定する。溶液の親和性アッセイは、＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体の混合を含み、種々の濃度のでのリガンド（＝Ａｎｇ２）を用いて、一定の濃度に保った。抗体の最大の可能な共鳴単位（例、１７０００共鳴単位（ＲＵ））を、GE Healthcareにより供給されたアミンカップリングキットを使用し、ｐＨ５．０で、ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）表面上に固定化した。サンプル及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ−Ｐ ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、泳動緩衝液を用いて２回刺激した。検量線を生成するために、増加濃度のＡｎｇ２を、固定化ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体を含むBIAcoreフローセル中に注射した。結合したＡｎｇ２の量を、共鳴単位（ＲＵ）として決定し、濃度に対してプロットした。各々のリガンドの溶液（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体についての０から２００nMまでの１１の濃度）を、１０nMのＡｎｇ２を用いてインキュベートし、室温で平衡に達することを許した。遊離のＡｎｇ２を、公知の量のＡｎｇ２を用いて溶液の応答を測定する前後に生成した検量線から決定した。４パラメータ適合を、遊離Ａｎｇ２濃度をｙ軸として及び阻害のための抗体の使用濃度をｘ軸として使用したモデル２０１を使用し、XLfit4（IDBS Software）を用いて設定した。親和性は、この曲線の変曲点を決定することにより算出した。表面を、３０μl/分の流速で０．８５% Ｈ_３ＰＯ_４溶液を用いた１回の３０秒間の洗浄により再生した。バルク屈折率の差を、得られた応答を、ブランク共役表面から減算することにより補正した。結果を表６に示す。

ＦｃＲｎの定常状態の親和性
ＦｃＲｎ測定のために、定常状態の親和性を使用し、互いに対する二重特異性抗体を比較した。ヒトＦｃＲｎを、共役緩衝液（１０μg/ml、酢酸Ｎａ ｐＨ５．０）中に希釈し、２００ＲＵの最終応答へのＢＩＡコアウィザードを使用し、標的固定化手順により、Ｃ１−Ｃｈｉｐ（GE Healthcare BR-1005-35）上に固定化した。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、泳動緩衝液を用いて２回刺激した。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５% Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ６．０であった。各々の抗体について異なるＩｇＧ濃度を評価するために、濃度６２．５nM、１２５nM及び２５０nM、５００nMを調製した。流速を３０μl/分に設定し、異なるサンプルを、チップ表面上に連続的に注射し、１８０秒の会合時間を選んだ。表面を、３０μl/分の流速で６０秒間にわたり注射されたＰＢＳ−Ｔ ｐＨ８により再生した。バルク屈折率の差を、得られた応答を、ブランク表面から減算することにより補正した。緩衝液注射も減算する（＝二重参照）。定常状態の親和性を算出するために、Ｂｉａ評価ソフトウェアからの方法を使用した。簡単には、ＲＵ値（ＲＵ ｍａｘ）を、分析された濃度に対してプロットし、用量反応曲線をもたらした。２パラメトリック適合に基づき、上部漸近線を算出し、半最大ＲＵ値、故に、親和性の決定を許す。結果を図５及び表７において示す。同様に、カニクイザル、マウス、及びウサギＦｃＲｎへの親和性を決定することができる。

ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ測定
ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ測定のために、直接的な結合アッセイを使用した。捕捉システム（１μg/ml Penta-His；Quiagen）の約３０００共鳴単位（ＲＵ）を、GE Healthcareにより供給されたアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０で、ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-30）上に共役させた。サンプル及びシステム緩衝液は、ＨＢＳ−Ｐ＋ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、泳動緩衝液を用いて２回刺激した。ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ−Ｈｉｓ−受容体を、５μl/分の流量で６０秒間にわたり、１００nM溶液を注射することにより捕捉した。結合を、１００nMの二重特異性抗体又は単一特異性コントロール抗体（ＩｇＧ１サブクラスについての抗Ｄｉｇ及びＩｇＧ４サブクラス抗体）の１８０秒にわたる３０μl/の流量での注射により測定した。表面を、３０μl/分の流速でグリシンｐＨ２．１溶液を用いた１２０秒間の洗浄により再生した。ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ結合は、ラングミュア１：１モデルと異なるため、結合／無結合だけを、アッセイを用いて決定した。同様の様式において、ＦｃｇａｍｍａＲＩａ及びＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ結合を決定することができる。結果を図６において示し、そこでは、変異Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡの導入により、ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａへのそれ以上の結合を検出することはできなかった、ということになる。

＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体への非依存的なＶＥＧＦ及びＡｎｇ２結合の評価
捕捉システム（１０μg/mlヤギ抗ヒトＩｇＧ；GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）の約３５００共鳴単位（ＲＵ）を、GE Healthcareにより供給されたアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０で、ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-34）上に共役させた。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５% Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルの温度を２５℃に、サンプルブロックの温度を１２℃に設定した。捕捉前に、フローセルを、泳動緩衝液を用いて２回刺激した。

二重特異性抗体を、５μl/分の流量で６０秒間にわたり１０nM溶液を注射することにより捕捉した。二重特異性抗体への各々のリガンドの非依存的な結合を、順次又は同時に加えた（３０μl/分の流量）、各々のリガンドについての活性な結合能力を決定することにより分析した：
１． １８０秒間にわたる２００nMの濃度を伴うヒトＶＥＧＦの注射（抗原の単一結合を同定する）。
２． １８０秒間にわたる１００nMの濃度を伴うヒトＡｎｇ２の注射（抗原の単一結合を同定する）。
３． １８０秒間にわたる２００nMの濃度を伴うヒトＶＥＧＦの注射、それに続く、１８０秒間にわたる１００nMの濃度を伴うヒトＡｎｇ２の追加注射（ＶＥＧＦの存在におけるＡｎｇ２の結合を同定する）。
４． １８０秒間にわたる１００nMの濃度を伴うヒトＡｎｇ２の注射、それに続く、２００nMの濃度を伴うヒトＶＥＧＦの追加注射（Ａｎｇ２の存在におけるＶＥＧＦの結合を同定する）。
５． １８０秒間にわたる２００nMの濃度を伴うヒトＶＥＧＦの及び１００nMの濃度を伴うヒトＡｎｇ２の同時注射（ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２の結合を同時に同定する）。

表面を、３０μl/分の流速で３ｍ ＭｇＣｌ_２溶液を用いた６０秒間の洗浄により再生した。バルク屈折率の差を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ表面から得られた応答を減算することにより補正した。

二重特異性抗体は、アプローチ３、４、及び５の結果として得られた最終シグナルが、アプローチ１及び２の個々の最終シグナルの和と等しい又はそれと同様である場合、相互に非依存的に両方の抗原に結合することができる。結果を表９において示し、そこでは、両方の抗体ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６、ＶＥＧＦａｎｇ２−００１２が、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に相互に非依存的に結合することができることが示されている。

＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二特異性抗体への同時のＶＥＧＦ及びＡｎｇ２結合の評価
第１に、ＶＥＧＦ（２０μg/ml）の約１６００共鳴単位（ＲＵ）を、GE Healthcareにより供給されたアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０で、ＣＭ５チップ（GE Healthcare BR-1005-34）上に共役させた。サンプル及びシステム緩衝液は、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５% Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０mMリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルを２５℃に、サンプルブロックを１２℃に設定し、泳動緩衝液を用いて２回刺激した。第２に、二重特異性抗体の５０ｎＭ溶液を、３０μl/分の流量で１８０秒間にわたり注射した。第３に、ｈＡｎｇ−２を、３０μＬ／分の流量で１８０秒間にわたり注射した。ｈＡｎｇ−２の結合応答は、ＶＥＧＦに結合した二重特異性抗体の量から依存し、同時結合を示す。表面を、３０μl/分の流速で０．８５% Ｈ_３ＰＯ_４溶液を用いた６０秒間の洗浄により再生した。同時結合が、以前のＶＥＧＦ結合＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異的抗体へのｈＡｎｇ２の追加の特異的な結合シグナルにより示される。二重特異性抗体ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５及びＶＥＧＦａｎｇ２−００１６の両方について、＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体への同時ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２結合を検出することができた（データは示さず）。

実施例４
質量分析法
このセクションでは、正確な組み立てに重点を置き、＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体の特徴付けを記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化された、インタクトな又はＩｄｅＳ消化された（Ｓ．ピオゲネスのＩｇＧ分解酵素）＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により確認した。ＩｄｅＳ消化を、５時間にわたり３７℃で１００mmol/LのＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ２ＨＰＯ_４、ｐＨ ７．１中の２μgのＩｄｅＳプロテアーゼ（Roche）を用いてインキュベートした１００μgの精製抗体を用いて実施した。その後、抗体を、１mg/mLのタンパク質濃度で、１６時間まで３７℃で１００mmol/LのＮａＨ２ ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．１中のＮグリコシダーゼＦ、ノイラミニダーゼ、及びＯグリコシダーゼ（Roche）を用いて脱グリコシル化し、その後、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）上でのＨＰＬＣを介して脱塩した。全質量を、TriVersa NanoMateソース（Advion）を備えたmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）上で、ＥＳＩ−ＭＳを介して決定した。

ＩｄｅＳ消化し、脱グリコシル化した（表１０）、又は無傷の脱グリコシル化した（表１１）分子について得られた質量は、２つの異なる軽鎖ＬＣ_Ａｎｇ２及びＬＣ_{Ｌｕｃｅｎｔｉｓ}、ならびに２つの異なる重鎖ＨＣ_Ａｎｇ２及びＨＣ_{Ｌｕｃｅｎｔｉｓ}からなる＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体についてのアミノ酸配列から推定される予測質量に対応する。

実施例５
Ｆｃ−Ｒｎクロマトグラフィー
ストレプトアビジンセファロースへの共役：
１グラムのストレプトアビジンセファロース（GE Healthcare）を、ビオチン化し、透析した受容体に加え、振盪を伴い、２時間にわたりインキュベートした。受容体誘導化セファロースを、１mlのＸＫカラム（GE Healthcare）中に充填した。

ＦｃＲｎ親和性カラムを使用したクロマトグラフィー：
条件：
カラム寸法：５０mm×５mm
床の高さ：５cm
負荷：５０μgサンプル
平衡緩衝液：２０mM ＭＥＳ、１５０mM ＮａＣｌを伴い、ｐＨ５．５に調整
溶出緩衝液：１５０mM ＮａＣｌ、２０mMトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．８に調整
溶出：７．５ＣＶ平衡化緩衝液、３０ＣＶ中１００%溶出緩衝液へ、１０ ＣＶ溶出緩衝液

Ｈｕ ＦｃＲｎ親和性カラムクロマトグラフィー
以下の表において、ヒトＦｃＲｎを含む親和性カラム上での＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体の保持時間を与える。データを、上の条件を使用して得た。以下の表において、ヒトＦｃＲｎ上での＜ＶＥＧＦ−ＡＮＧ−２＞二重特異性抗体の保持時間を与える。

実施例６
薬物動態（ＰＫ）特性
ヒトＦｃＲｎについてトランスジェニックなＦｃ−Ｒｎマウスを用いたＰＫデータ
生活相において
試験は、雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（バックグラウンド）；マウスＦｃＲｎ欠損、ヒトＦｃＲｎについてヘミ接合性トランスジェニック（ｈｕＦｃＲｎ、系統２７６−／ＴＧ）を含んだ。

パート１
全てのマウスに、２μＬ／動物の適切な溶液（即ち、２１μg化合物／動物（ＶＥＧＦＡｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）又は２３．６μg化合物／動物（ＶＥＧＦＡｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う））を用いて、右眼中に１回、硝子体内注射した。

マウスを、各々６匹を伴う２群に割り付けた。血液サンプルを、投与後、２、２４、及び９６時間目に群１から、ならびに、７、４８、及び１６８時間目に群２から採取する。

マウス右眼の硝子体中への注射は、World Precision Instruments, Inc.（ドイツ、ベルリン）からのナノリットル注射用のNanoFil Microsyringeシステムを使用することにより実施した。マウスを、２．５%イソフルランを用いて麻酔し、マウス眼の視覚化のために、Leica KL2500 LCDライトニングを用いた、４０倍倍率及びリングライトを伴うＬｅｉｃａ ＭＺＦＬ３顕微鏡を使用した。その後、２μLの化合物を、３５ゲージ針を使用して注射した。

血液を、血清中の化合物レベルの測定のために、各々の動物から反対側の眼の球後静脈叢を介して収集した。

少なくとも５０μlの血清サンプルを、室温での１時間後、４℃で３分間にわたる遠心分離（９３００ｘｇ）により、血液から得た。血清サンプルを、遠心分離の直後に凍結し、分析まで−８０℃で凍結保存した。群１の動物の処置眼を、処置後９６時間目に、群２の動物では、処置後１６８時間目に単離した。サンプルを、分析まで−８０℃で凍結保存した。

パート２
全てのマウスに、２００μL/動物の適切な溶液（即ち、２１μg化合物／動物（ＶＥＧＦＡｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）又は２３．６μg化合物／動物（ＶＥＧＦＡｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う））を用いて、尾静脈を介して１回静脈内注射した。

マウスを、各々５匹を伴う２群に割り付けた。血液サンプルを、投与後、１、２４、及び９６時間目に群１から、ならびに、７、４８、及び１６８時間目に群２から採取する。血液を、血清中の化合物レベルの測定のために、各々の動物から球後静脈叢を介して収集した。

少なくとも５０μlの血清サンプルを、室温での１時間後、４℃で３分間にわたる遠心分離（９３００ｘｇ）により、血液から得た。血清サンプルを、遠心分離の直後に凍結し、分析まで、−８０℃で凍結保存した。

眼全体ライセート（マウス）の調製
眼ライセートを、実験動物からの眼全体の物理化学的分解により得た。機械的破壊のために、各々の眼を、円錐底を伴う１．５ｍＬマイクロバイアル中に移した。凍結解凍後、眼を、１mLの細胞洗浄緩衝液（Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７１−３０４０１１）を用いて１回洗浄した。以下の工程において、５００μLの新しく調製した細胞溶解緩衝液を加え、眼を、１．５ｍＬ組織破砕乳棒（Kimble Chase、１．５mL乳棒、Ａｒｔ．Ｎｏ．７４９５２１−１５００）を使用して破砕した。混合物を、次に、５回凍結解凍し、再度粉砕した。残りの組織からライセートを分離するために、サンプルを、４５００×ｇで４分間にわたり遠心分離した。遠心分離後、上清を収集し、定量化ＥＬＩＳＡにおけるさらなる分析まで、−２０℃で保存した。

分析
マウス血清及び眼ライセート中の＜ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２＞抗体の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。

マウス血清サンプル及び眼ライセート中の＜ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２＞抗体の定量化のために、捕捉抗体及び検出抗体として使用したビオチン化及びジゴキシゲニン化モノクローナル抗体を用いた標準的な固相シリアルサンドイッチイムノアッセイを実施した。分析物の二重特異性の完全性を検証するために、ビオチン化捕獲抗体が、抗ＶＥＧＦ結合部位を認識するのに対し、ジゴキシゲニン化検出抗体は、分析物の抗Ａｎｇ２結合部位に結合しうる。ストレプトアビジンコーティングしたマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）の固相上での捕捉抗体、分析物、及び検出抗体の結合免疫複合体を、次に、抗ジゴキシゲニン抗体に共役させた西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて検出する。ＳＡ−ＭＴＰからの非結合物質を洗浄及びＡＢＴＳ基質の添加後、得られたシグナルは、ＳＡ−ＭＴＰの固相上に結合した分析物の量に比例している。定量化を、次に、サンプルの測定シグナルを、並列で分析したキャリブレータを参照した濃度に変換することにより行う。

第１工程において、ＳＡ−ＭＴＰを、１００μL/ウェルの濃度１μg/mLビオチン化捕捉抗体溶液（ｍＡｂ＜Ｉｄ＜ＶＥＧＦ＞＞Ｍ−２．４５．５１−ＩｇＧ−Ｂｉ（ＤＤＳ））を用いて、ＭＴＰシェイカー上で１時間、５００rpmでコーティングした。合間に、キャリブレータ、ＱＣ−サンプル、及びサンプルを調製した。キャリブレータ及びＱＣ−サンプルは、２%血清マトリクスに希釈する；サンプルを、シグナルがキャリブレータの直線範囲内になるまで希釈した。

捕捉抗体を用いてＳＡ−ＭＴＰをコーティングした後、プレートを、洗浄緩衝液及び３００μL/ウェルを用いて３回洗浄した。その後、１００μl/ウェルのキャリブレータ、ＱＣ−サンプル、及びサンプルを、ＳＡ−ＭＴＰ上でピペッティングし、１時間にわたり５００rpmで再びインキュベートした。分析物を、今回、その抗ＶＥＧＦ結合部位を用いて、捕捉抗体を介して、ＳＡ−ＭＴＰの固相に結合した。インキュベーション及びプレートを洗浄することによる非結合分析物の除去後、１００μL/ウェルの第１検出抗体（ｍＡｂ＜Ｉｄ−＜Ａｎｇ２＞＞Ｍ−２．６．８１−ＩｇＧ−Ｄｉｇ（ＸＯＳｕ））（濃度２５０ng/mLを伴う）をＳＡ−ＭＴＰに加えた。再び、プレートを、シェイカー上で５００rpmで１時間にわたりインキュベートした。洗浄後、１００μL/ウェルの第２検出抗体（ｐＡｂ＜ジゴキシゲニン＞Ｓ−Ｆａｂ−ＰＯＤ（ポリ））（濃度５０mU/mLで）を、ＳＡ−ＭＴＰのウェルに加え、プレートを、再び、１時間にわたり、５００rpmでインキュベートした。過剰の検出抗体を除去するための最終洗浄工程後、１００μL/ウェル基質（ＡＢＴＳ）を加える。抗体−酵素コンジュゲートは、ＡＢＴＳ（登録商標）基質の色反応を触媒する。シグナルを、次に、ＥＬＩＳＡリーダーにより、４０５nm波長（参照波長：４９０nm（［４０５／４９０］nm））で測定した。

薬物動態学的評価
薬物動態学的パラメータを、薬物動態学的評価プログラムWinNonlin（商標）（Pharsight）、バージョン５．２．１を使用し、非コンパートメント分析により算出した。

結果：Ａ）血清中濃度
血清中濃度についての結果を、表１３〜１６及び図７Ｂ〜７Ｃにおいて示す。

結果：Ｂ）左眼及び右眼の眼ライセート中の濃度
眼ライセート中の濃度についての結果を、表１７〜１８及び図７Ｄ〜７Ｅにおいて示す。

結果の要約：
硝子体内適用後、本発明に従った二重特異性＜ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）は、ＡＡＡ変異を伴わない二重特異性＜ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５と比較し、眼ライセート中で同様の濃度（９６及び１６８時間後）を示す。

また、硝子体内適用後、本発明に従った二重特異性＜ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６（ＡＡＡ変異を伴う）は、ＡＡＡ変異を伴わない二重特異性＜ＶＥＧＦ／ＡＮＧ２＞抗体ＶＥＧＦａｎｇ２−００１５と比較し、血清中でのより速いクリアランス及びより短い半減期を示す。

実施例７
マウス角膜マイクロポケット血管形成アッセイ
インビボでのＶＥＧＦ誘導性血管形成に対する、配列番号７及び８のそれぞれの抗ＶＥＧＦ ＶＨ及びＶＬならびに配列番号１５及び１６の抗ＡＮＧ２ ＶＨ及びＶＬを伴う二重特異性抗体の抗血管形成効果をテストするために、本発明者らは、マウス角膜血管形成アッセイを実施する。このアッセイにおいて、ＶＥＧＦを浸したNylafloディスクを、角膜縁血管への固定された距離で、無血管角膜のポケット中に移植した。血管は、直ちに、発生中のＶＥＧＦ勾配に向けて、角膜中に成長する。８〜１０週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Charles River（ドイツ、ズルツフェルト）から購入した。プロトコールは、Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550により記載された方法に従って改変する。簡単には、約５００μmの幅を伴うマイクロポケットを、麻酔したマウスにおいて、外科用ブレード及び鋭いピンセットを使用し、角膜縁から角膜の上部までの約１mmで、顕微鏡下で調製する。直径０．６mmを伴うディスク（Nylaflo（登録商標、Pall Corporation、ミシガン）を移植し、移植領域の表面を平滑化した。ディスクを、対応する成長因子又は賦形剤中で、少なくとも３０分間にわたりインキュベートする。３、５、及び７日間後（又は、あるいは、３、５、又は７日間後だけ）、眼を撮影し、血管応答を測定する。アッセイを、角膜の全面積当たりの新たな血管の面積のパーセンテージを算出することにより定量化する。

ディスクは、３００ngのＶＥＧＦを用いて、又はコントロールとしてＰＢＳを用いて負荷し、７日間にわたり移植する。角膜縁からディスクまでの血管の伸長を、３、５、及び／又は７日目に経時的にモニターする。ディスク移植に先立つ１日目、抗体を、１０mg/kgの用量で（静脈内適用に起因し、血清で安定なＶＥＧＦａｎｇ２−００１５（ＡＡＡ変異を伴わない）（ＶＥＧＦａｎｇ２−００１６から、ＡＡＡ変異だけ異なり、効力を媒介するための同じ抗ＶＥＧＦ及び抗ＡＮＧ２ ＶＨ及びＶＬを有する）を、サロゲートとして使用する）、インビボでのＶＥＧＦ誘導性血管形成に対する抗血管形成効果をテストするために、静脈内投与する。コントロール群における動物は、賦形剤を受ける。適用容積は１０ml/kgである。

Claims (9)

1. ヒトＶＥＧＦに特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、
   ここで
   ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号３のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号６のＣＤＲ１Ｌ領域を含み；及び
   ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインにおいて、配列番号９のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１０のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１１のＣＤＲ１Ｈ領域、ならびに、軽鎖可変ドメインにおいて、配列番号１２のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１３のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号１４のＣＤＲ１Ｌ領域を含み、及び、ここで
   ｉｉｉ）二重特異性抗体が、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４サブクラス（ヒト起源から由来する）の定常重鎖領域を含む、
   を含む、網膜静脈閉塞症の処置のための医薬。
2. ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する前記の第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号７のアミノ酸配列を、及び、軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ならびに
   ｉｉ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する前記の第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインＶＨとして、配列番号１５のアミノ酸配列を、及び、軽鎖可変ドメインＶＬとして、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
   請求項１記載の医薬。
3. ｉｉｉ）の下の定常重鎖領域が、ＩｇＧ１サブクラスのものであり、かつ、
   ＩｇＧ１サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、
   請求項１〜２のいずれか一項記載の医薬。
4. ｉｉｉ）の下の定常重鎖領域が、ＩｇＧ４サブクラスのものであり、かつ、
   ＩｇＧ４サブクラスの定常重鎖領域が、さらに、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む、
   請求項１〜２のいずれか一項記載の医薬。
5. 医薬が硝子体内適用を介して投与される、請求項１〜４のいずれか一項記載の医薬。
6. ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の完全長抗体の重鎖及び軽鎖；ここで、第１の全長抗体の重鎖として、配列番号２５のアミノ酸配列が含まれ、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号２７のアミノ酸配列が含まれる；及び
   ｂ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の完全長抗体の改変重鎖及び改変軽鎖、ここで、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いにより交換されており、第２の全長抗体の改変重鎖として、配列番号２６のアミノ酸配列が含まれ、第２の完全長抗体の改変軽鎖として、配列番号２８のアミノ酸配列が含まれる；
   を含むことを特徴とする、二重特異性二価抗体、
   を含む、網膜静脈閉塞症の処置のための医薬。
7. ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の完全長抗体の重鎖及び軽鎖；ここで、第１の全長抗体の重鎖として、配列番号２１のアミノ酸配列が含まれ、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号２３のアミノ酸配列が含まれる；及び
   ｂ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の完全長抗体の改変重鎖及び改変軽鎖、ここで、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いにより交換されており、第２の全長抗体の改変重鎖として、配列番号２２のアミノ酸配列が含まれ、第２の完全長抗体の改変軽鎖として、配列番号２４のアミノ酸配列が含まれる；
   を含むことを特徴とする、二重特異性二価抗体、
   を含む、網膜静脈閉塞症の処置のための医薬。
8. ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する第１の完全長抗体の重鎖及び軽鎖；ここで、第１の全長抗体の重鎖として、配列番号２９のアミノ酸配列が含まれ、第１の完全長抗体の軽鎖として、配列番号３１のアミノ酸配列が含まれる；及び
   ｂ）ＡＮＧ−２に特異的に結合する第２の完全長抗体の改変重鎖及び改変軽鎖、ここで、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いにより交換されており、第２の全長抗体の改変重鎖として、配列番号３０のアミノ酸配列が含まれ、第２の完全長抗体の改変軽鎖として、配列番号３２のアミノ酸配列が含まれる；
   を含むことを特徴とする、二重特異性二価抗体、
   を含む、網膜静脈閉塞症の処置のための医薬。
9. 医薬が硝子体内適用を介して投与される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬。