CN115803010A - 浓缩的蛋白质组合物、它们的制备及其用途 - Google Patents

浓缩的蛋白质组合物、它们的制备及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115803010A
CN115803010A CN202180048641.2A CN202180048641A CN115803010A CN 115803010 A CN115803010 A CN 115803010A CN 202180048641 A CN202180048641 A CN 202180048641A CN 115803010 A CN115803010 A CN 115803010A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpc
suspension
protein
composition
range
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180048641.2A
Other languages
English (en)
Inventor
N·达赫马尼
S·V·法切蒂
Z·马林
S·P·帕特尔
G·沙赫特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN115803010A publication Critical patent/CN115803010A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Abstract

本发明涉及一种产生包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物的方法，所述方法包括使蛋白质与络合剂在缓冲溶液中接触的步骤，其中所述络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素，并且其中所述蛋白质和所述络合剂在包含于所述缓冲溶液中时具有相反的净电荷；在所述缓冲溶液中使所述蛋白质与所述络合剂之间形成RPC；以及获得包含所述RPC的悬浮液。本文还提供了组合物，包括药物组合物/制剂，所述药物组合物/制剂包含本发明的可逆蛋白质络合物(RPC)，特别是通过本文提供的方法获得的可逆蛋白质络合物。

Description

浓缩的蛋白质组合物、它们的制备及其用途
背景技术
在过去的几十年中，生物制剂在FDA药物批准方面逐渐超过小分子。事实上，虽然新生物实体(NBE)在1993年至1999年占获得批准的新分子实体(NME)总数的10％，但从2000年至2009年，它们提高至17％，并且从2010年至2019年提高至24％(Mullard,NatureReviews Drug Discovery,2020,ISSN 1474-1784)。这一趋势归因于生物制剂以其生物来源而具有高于化学合成的小分子的耐受性，并且它们具有更高的选择性，特别是最近几代抗体，使它们能够以非常高的特异性靶向疾病区域，从而提高安全性和有效性(Buvailo,https://www.biopharmatrend.com/post/67-will-small-molecules-sustain-pharmaceutical-race-with-biologics/；July 11,2018)。
生物制剂主要作为用于肠胃外施用的溶液商业化。它们在含有某些赋形剂的水性介质中配制，这些赋形剂是确保蛋白质稳定性、防止氧化和确保等渗性所必需的。生物制剂药物产品最常储存于5±3℃，导致维持冷链的供应链复杂且昂贵，降低了药物可及性；在发展中国家尤其如此。在某些情况下，可将蛋白质溶液冻干，以便提高药物产品的稳定性和保质期，并且与冷链相比，更易于运输和储存。在这种情况下，使用额外的赋形剂诸如冷冻保护剂以在冷冻干燥循环期间保护蛋白质，并且使用其他赋形剂以促进冻干制剂在施用于患者之前复溶。
在过去的几十年中，这些生物制剂的标准剂型已经得到了广泛的研究，并且科学界见证了与目前现有制剂相关的许多局限性的出现。第一个局限性是生物溶液中的颗粒形成，这是当今制药行业面临的主要问题之一，因为这些颗粒被卫生当局视为具有免疫原性，因此可能导致产品撤回，这对制药行业来说意味着相当大的成本。最近，人们已经做出许多努力来了解颗粒形成背后的机制，结果显示其来源与表面活性剂相关；主要是由于聚山梨酯降解和泊洛沙姆与初级包装中存在的硅油的相互作用。表面活性剂是在生物制剂中广泛使用的赋形剂之一，并且对于防止由于药物产品加工、运输和储存过程中所经历的应激而导致的蛋白质聚集至关重要(Gervasi等人,Eur J Pharm Biopharm,2018,131,8-24)。因此，制药行业的目标是寻找替代赋形剂，或从根本上开发新型不含表面活性剂的生物制剂。
当前生物制剂遇到的另一个局限性是由于与高浓度蛋白质制剂相关联的高粘度而导致的浓度限制。与此同时，最近生物制剂开发在施用途径方面的一个明显趋势是，从静脉输注转向皮下施用，以改善患者依从性，因为他们可以自主注射药物。为支持这一点，制剂需要高度浓缩(>100mg/mL)，以便经由单次注射递送治疗剂量。但是，此类高度浓缩的制剂(>100mg/mL)与过高的粘度相关联，使其经由注射施用杂化。因此，开发高浓度生物制剂可能对改善患者依从性非常有益。
过去，可逆蛋白质-聚离子络合概念已被用于开发高度浓缩的生物制剂并且应对上述制剂挑战。可逆蛋白质络合物(RPC)也称为疏水性离子对(HIP)、蛋白质-聚电解质络合物(PPC)或聚离子络合物(PIC)，已经在文献中得到广泛报道，并且由Morawetz和Hughes于1952年作为纯化方法首次提出，从那以后其用途已发展到其他应用，包括用于生物制剂的药物递送系统(Mimura等人,J Chem Phys,2019,150(6),064903；Morawetz和Hughes,TheJournal of Physical Chemistry,1952,56(1),64-49)。
这一概念依赖于在特定理化条件(例如，pH、离子强度、摩尔-电荷比)下混合带相反电荷的分子，使得经由静电相互作用形成复合物。由于电荷被中和和掩蔽，复合物不再可溶，并且沉淀物呈白色颗粒。重要的是，该络合可通过减少静电相互作用逆转，静电相互作用对周围pH和离子强度敏感。事实上，提高离子强度导致带相反电荷的分子之间的静电屏蔽(或屏蔽)，而改变pH结果会减少分子上的电荷分布，引起静电相互作用的减少以及随后两个分子的解离(Chamieh等人,In J Pharm,2019,559,228-234；Matsuda等人,J PharmSci,2018,107(10),2713-2719)。
这一概念已经用生物分子(包括酶、激素、肽和蛋白质)以及带相反电荷的聚合物针对蛋白质纯化进行了评估，其中将酶溶于有机溶剂中不会失去活性，并且还可以作为一种药物递送策略来增强生物利用度(Mimura等人,J Chem Phys,2019,150(6),064903；Chamieh等人,In J Pharm,2019,559,228-234；Matsuda等人,J Pharm Sci,2018,107(10),2713-2719；Ristroph和Prud’homme,Nanoscale Advances,2019,1(11),4207-4237)。事实上，大多数生物分子都是亲水的。利用RPC概念使这些生物分子具有疏水性并且提高其在已经建立的药物递送系统(包括胶束、脂质体和自乳化药物递送系统(SEDDS))中的掺入效率(Chamieh等人,In J Pharm,2019,559,228-234)。RPC已被证明能够改善蛋白质对理化应激(包括热、搅拌和氧化)的稳定性(Matsuda等人,J Pharm Sci,2018,107(10),2713-2719)。
据报道，为最大程度提高络合效率，应将缓冲液的pH调节为低于或高于蛋白质的等电点(pI)两个pH单位，以最大程度改善蛋白质上的电荷分布。虽然蛋白质在碱性pH下通常不稳定，因此有利于带正电荷的蛋白质的弱酸性pH更合适，并且带相反电荷的聚合物应带负电荷以形成复合物(Mimura等人,J Chem Phys,2019,150(6),064903；Matsuda等人,JPharm Sci,2018,107(10),2713-2719)。
还已经提到，除两种聚离子之间的静电相互作用以外，疏水性相互作用也参与稳定复合物。因此，选择络合剂(CA)时要考虑的另一个重要参数是疏水性。事实上，抗衡离子的疏水性结构域(诸如烷基尾或芳族基团)将用排除水的疏水性结构域覆盖蛋白质的表面区域(Mimura等人,J Chem Phys,2019,150(6),064903；Ristroph和Prud’homme,NanoscaleAdvances,2019,1(11),4207-4237)。
虽然在各种条件下使用各种络合剂能够有效地实现蛋白质的络合，但随后的蛋白质络合物的解离仍然具有挑战性。特别是，蛋白质的(部分)降解或不可逆络合物的形成会对解离效率产生负面影响。尤其是经皮下施用于患者时，含有蛋白质络合物的组合物在生理条件下不能有效解离，可能在耐受性和免疫原性风险方面造成严重威胁。
因此，本领域需要包含以下蛋白质络合物的高度浓缩的组合物，这些蛋白质络合物在生理条件下有效地解离成天然、功能性治疗性蛋白质。
因此，本发明的一个目的是提供产生包含在生理条件下有效解离的可逆蛋白质络合物的组合物的方法。
本发明的另一个目的是提供包含在生理条件下有效解离的可逆蛋白质络合物的组合物。
本发明的另一个目的是提供包含可逆蛋白质络合物的药物制剂，其用作药物，特别是其中可逆蛋白质络合物包含治疗性蛋白质并且/或者其中药物制剂经皮下施用。
发明内容
该技术问题通过本文所提供并且特征体现于权利要求中的实施例得到解决。即，本发明特别涉及以下项：
1.一种用于产生包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使蛋白质与络合剂在缓冲溶液中接触，
其中所述络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素，并且
其中所述蛋白质和所述络合剂在包含于所述缓冲溶液中时具有相反的净电荷；
b)在所述缓冲溶液中使所述蛋白质与所述络合剂之间形成RPC；以及
c)获得包含在步骤(b)中形成的所述RPC的悬浮液。
2.根据项1所述的方法，其中络合剂为硫酸葡聚糖，特别是分子量为40kDa的硫酸葡聚糖。
3.根据项1或2所述的方法，其中将缓冲溶液的pH调节为低于蛋白质的等电点。
4.根据项1至3中任一项所述的方法，其中将缓冲溶液的pH调节为低于蛋白质的等电点2至5个pH单位，特别是低于蛋白质的等电点3个pH单位。
5.根据项1或2所述的方法，其中将缓冲溶液具有在1至6范围内的pH，特别是其中缓冲溶液具有在3至6范围内的pH，特别是缓冲溶液具有在4.5至5.5范围内的pH。
6.根据项1至5中任一项所述的方法，其中缓冲溶液具有在20mM至50mM范围内的离子强度，特别是其中缓冲溶液具有在20mM至30mM范围内的离子强度。
7.根据项1至6中任一项所述的方法，其中缓冲溶液包含作为缓冲剂的组氨酸或柠檬酸盐。
8.根据项1至7中任一项所述的方法，其中包含蛋白质和络合剂的缓冲溶液通过混合包含蛋白质的第一溶液与包含络合剂的第二溶液获得。
9.根据项8所述的方法，其中包含蛋白质的第一溶液和/或包含络合剂的第二溶液包含缓冲剂。
10.根据项1至9中任一项所述的方法，其中蛋白质与络合剂以1:0.2至1:2范围内的摩尔-电荷比接触，特别是其中蛋白质与络合剂以1:0.2至1:1范围内的摩尔-电荷比接触。
11.根据项1至10中任一项所述的方法，其中蛋白质与络合剂在缓冲溶液中以在1mg/mL至40mg/mL范围内、特别是在1mg/mL至5mg/mL范围内的蛋白质浓度接触。
12.根据项1至11中任一项所述的方法，其中蛋白质为抗体、生长因子、激素、细胞因子、酶或前述任一者的片段和/或融合蛋白。
13.根据项12所述的方法，其中抗体为抗体，特别是其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体-药物缀合物或抗体片段。
14.根据项1至13中任一项所述的方法，其中络合剂在包含于缓冲溶液中时具有净负电荷。
15.根据项1至14中任一项所述的方法，其中络合剂包含疏水性部分。
16.根据项1至15中任一项所述的方法，其中包含RPC的组合物包含至少一种赋形剂。
17.根据项16所述的方法，其中所述至少一种赋形剂在RPC的形成之前和/或之后加入组合物中。
18.根据项17或18所述的方法，其中所述至少一种赋形剂为稳定剂和/或表面活性剂。
19.根据项1至18中任一项所述的方法，其中方法包括以下进一步的步骤：交换包含RPC的悬浮液的液体级分。
20.根据项19所述的方法，其中包含RPC的悬浮液的液体级分通过离心包含RPC的悬浮液并且将沉降的RPC重悬于缓冲溶液或水中来交换。
21.根据项19所述的方法，其中包含RPC的悬浮液的液体级分通过相对于缓冲溶液或水透析包含RPC的悬浮液来交换。
22.根据项1至21中任一项所述的方法，其中方法包括以下进一步的步骤：富集悬浮液中的RPC以获得富集的RPC悬浮液。
23.根据项22所述的方法，其中富集悬浮液中的RPC包含以下步骤：
a)离心包含所述RPC的所述悬浮液，以获得包含富集的RPC悬浮液的上清液和沉淀物；以及
b)从所述沉淀物中去除所述上清液，以获得富集的RPC悬浮液。
24.根据项22或23所述的方法，其中富集的RPC悬浮液的液体级分在富集步骤期间至少部分地被替换为非水性溶剂。
25.根据项24所述的方法，其中非水性溶剂为三醋精、二甘醇单乙醚或油酸乙酯。
26.根据项1至25中任一项所述的方法，其中该方法包括以下进一步的步骤：冻干包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液以获得冻干物。
27.根据项26所述的方法，其中在冻干步骤之前，将至少一种冷冻保护剂加入包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中。
28.根据项27所述的方法，其中所述至少一种冷冻保护剂选自由以下项组成的组：糖、氨基酸、甲胺、易溶盐、多元醇、丙二醇、聚乙二醇和普郎尼克类。
29.根据项26至28中任一项所述的方法，其中在冻干步骤之前，将包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的蛋白质浓度调节至10mg/mL至100mg/mL，特别是调节至40mg/mL至80mg/mL。
30.根据项1至25中任一项所述的方法，其中该方法包括以下进一步的步骤：喷雾干燥包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液以获得喷雾干燥的粉末。
31.根据项30所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前，将包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的蛋白质浓度调节至1mg/mL至10mg/mL，特别是调节至1mg/mL至5mg/mL。
32.根据项30或31所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分。
33.根据项32所述的方法，其中交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分降低悬浮液中的至少一种缓冲剂、络合剂和/或赋形剂的浓度。
34.根据项33所述的方法，其中在交换悬浮液的液体级分之后，包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液基本上不含缓冲剂。
35.根据项33或34所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换悬浮液的液体级分，以获得在1:0.2与1:1之间、特别是在1:0.4与1:0.8之间的蛋白质与络合剂之间的摩尔-电荷比。
36.根据项30至35中任一项所述的方法，其中喷雾干燥在115℃的入口温度和/或48℃的出口温度进行。
37.根据项30至36中任一项所述的方法，其中喷雾干燥在17mL/min的进料速率下进行。
38.根据项30至37中任一项所述的方法，其中该方法包括以下进一步的步骤：将喷雾干燥的粉末重悬于非水性溶剂(NAS)中以获得RPC-NAS悬浮液。
39.根据项38所述的方法，其中非水性溶剂为选自由以下项组成的组的至少一者：二甘醇单乙醚、油酸乙酯、三醋精、异山梨醇二甲醚和四氢呋喃聚乙二醇醚。
40.根据项39所述的方法，其中将喷雾干燥的粉末重悬，以获得蛋白质浓度在50mg/mL至300mg/mL范围内、特别是在100mg/mL至250mg/mL范围内的RPC-NAS悬浮液。
41.一种包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物，其中组合物通过根据项1至40中任一项所述的方法获得。
42.一种包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物，其中所述RPC包含蛋白质和络合剂，并且
其中所述络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素。
43.根据项42所述的组合物，其中络合剂为硫酸葡聚糖，特别是分子量为40kDa的硫酸葡聚糖。
44.根据项42或43所述的组合物，其中蛋白质在包含于RPC中时具有净正电荷。
45.根据项44所述的组合物，其中蛋白质为抗体、生长因子、激素、细胞因子、酶或前述任一者的片段和/或融合蛋白。
46.根据项45所述的组合物，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体-药物缀合物或抗体片段。
47.根据项42至46中任一项所述的组合物，其中络合剂在包含于RPC中时具有负电荷。
48.根据项42至47中任一项所述的组合物，其中络合剂包含疏水性部分。
49.根据项42至48中任一项所述的组合物，其中组合物包含至少一种赋形剂。
50.根据项49所述的组合物，其中所述至少一种赋形剂为稳定剂和/或表面活性剂。
51.根据项42至50中任一项所述的组合物，其中蛋白质在包含于RPC中时与未络合的蛋白质相比具有更高的解链温度。
52.根据项42至51中任一项所述的组合物，其中包含蛋白质和络合剂的RPC在生理pH和离子强度下解离。
53.根据项42至51中任一项所述的组合物，其中包含蛋白质和络合剂的RPC在10mM至100mM PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中当稀释至蛋白质浓度为0.1mg/mL至10mg/mL时解离。
54.根据项42至53中任一项所述的组合物，其中组合物为悬浮液。
55.根据项54所述的组合物，其中悬浮液用根据项1至25中任一项所述的方法获得。
56.根据项54或55所述的组合物，其中悬浮液中的蛋白质浓度在50mg/mL至250mg/mL的范围内，特别是其中悬浮液中的蛋白质浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内。
57.根据项54至56中任一项所述的组合物，其中悬浮液包含未络合的络合剂。
58.根据项54至57中任一项所述的组合物，其中包含于悬浮液中的RPC具有在5μm至20μm范围内的平均粒径，特别是其中包含于悬浮液中的RPC具有在6μm至12μm范围内的平均粒径。
59.根据项54至57中任一项所述的组合物，其中包含于悬浮液中的RPC具有在100nm至4000nm范围内的平均粒径，特别是其中包含于悬浮液中的RPC具有在150nm至2000nm范围内的平均粒径。
60.根据项54至57中任一项所述的组合物，其中包含于悬浮液中的RPC具有在0.1μm至20μm范围内的平均粒径，特别是其中包含于悬浮液中的RPC具有在0.1μm至12μm范围内的平均粒径。
61.根据项54至60中任一项所述的组合物，其中悬浮液能够通过26G针头注射。
62.根据项54至61中任一项所述的组合物，其中悬浮液在4℃和/或25℃至少4周是稳定的。
63.根据项54至62中任一项所述的组合物，其中悬浮液具有在2cP至20cP范围内、特别是在3cP至15cP范围内的粘度，粘度在20℃下测量。
64.根据项54至63中任一项所述的组合物，其中悬浮液的pH低于蛋白质的等电点。
65.根据项54至64中任一项所述的组合物，其中悬浮液的pH低于蛋白质的等电点1至3个pH单位，特别是其中悬浮液的pH低于蛋白质的等电点2个pH单位。
66.根据项54至64中任一项所述的组合物，其中悬浮液的pH在1至6的范围内，特别是其中悬浮液的pH在4.5至5.5的范围内。
67.根据项54至66中任一项所述的组合物，其中悬浮液包含缓冲剂。
68.根据项67所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
69.根据项54至68中任一项所述的组合物，其中悬浮液具有在20mM至50mM范围内的离子强度，特别是其中悬浮液具有在20mM至30mM范围内的离子强度。
70.根据项54至66中任一项所述的组合物，其中悬浮液基本上不含缓冲剂。
71.根据项54至70中任一项所述的组合物，其中悬浮液进一步包含非水性溶剂。
72.根据项71所述的组合物，其中非水性溶剂为二甘醇单乙醚、三醋精或油酸乙酯。
73.根据项42至53中任一项所述的组合物，其中组合物为冻干物。
74.根据项73所述的组合物，其中冻干物用根据项26至29中任一项所述的方法获得。
75.根据项73或74所述的组合物，其中冻干物包含缓冲剂。
76.根据项75所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
77.根据项73至76中任一项所述的组合物，其中冻干物包含至少一种冷冻保护剂。
78.根据项77所述的组合物，其中所述至少一种冷冻保护剂选自由以下项组成的组：糖、氨基酸、甲胺、易溶盐、多元醇、丙二醇、聚乙二醇和普郎尼克类。
79.根据项73至78中任一项所述的组合物，其中冻干物在40℃至少4周是稳定的。
80.根据项73至79中任一项所述的组合物，其中冻干物在液体中复溶至蛋白质浓度在50mg/mL至250mg/mL的范围内，特别是其中冻干物在液体中复溶至蛋白质浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内。
81.根据项80所述的组合物，其中液体为PBS。
82.根据项80或81所述的组合物，其中重悬的冻干物具有在2cP至20cP范围内、特别是在10cP至20cP范围内的粘度。
83.根据项42至53中任一项所述的组合物，其中组合物为喷雾干燥的粉末。
84.根据项83所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末的蛋白质含量按重量计为至少40％(w/w)、按重量计为至少50％(w/w)、按重量计为至少60％(w/w)。
85.根据项83或84所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末用根据项30至37中任一项所述的方法获得。
86.根据项83至85中任一项所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末包含缓冲剂。
87.根据项86所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
88.根据项83至85中任一项所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末基本上不含缓冲剂。
89.根据项83至88中任一项所述的组合物，其中包含于喷雾干燥的粉末中的RPC具有在5μm至50μm范围内、特别是在10μm至40μm范围内、特别是在20μm至35μm范围内的平均粒径。
90.根据项83至89中任一项所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末重悬于液体中至悬浮液中的蛋白质浓度在50mg/mL至300mg/mL的范围内，特别是其中喷雾干燥的粉末重悬于液体中至悬浮液中的蛋白质浓度在100mg/mL至250mg/mL的范围内。
91.根据项90所述的组合物，其中液体为非水性溶剂。
92.根据项91所述的组合物，其中非水性溶剂为选自由以下项组成的组的至少一者：二甘醇单乙醚、油酸乙酯、三醋精、异山梨醇二甲酯和四氢呋喃聚乙二醇醚，优选地二甘醇单乙醚、油酸乙酯或三醋精。
93.根据项90至92中任一项所述的组合物，其中复溶的喷雾干燥的粉末具有在10cP至100cP范围内、特别是在20cP至80cP范围内的粘度。
94.一种药物制剂，其包含根据项41至93中任一项所述的组合物。
95.根据项94所述的药物制剂，其中药物制剂包含根据项54至72中任一项所述的悬浮液、根据项80至82中任一项所述的复溶的冻干物或根据项90至93中任一项所述的重悬的喷雾干燥的粉末。
96.根据项94或95所述的药物制剂，其用作药物。
97.根据项94至96中任一项所述的药物制剂，其用于治疗自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性或动脉粥样硬化。
98.根据项97使用的药物制剂，其中药物制剂通过如下施用：经皮下、肌内、透皮、眼部(诸如结膜下、前房内、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上腔)，至脑部(诸如腰椎内、鞘内或脑室内)，经关节内或通过吸入。
99.根据项94或95所述的药物制剂用于治疗选自由以下项组成的组的疾病的用途：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化。
100.根据项94或95所述的药物制剂用于制备药物的用途，该药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化。
101.一种治疗患有选自由以下项组成的组的疾病的受试者的方法：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化，该方法包含以下步骤：(a)产生根据项94或95所述的药物制剂；以及(b)向有此需要的受试者施用该药物制剂。
102.根据项101所述的方法，其中药物组合物经皮下、肌内或透皮施用，特别是其中药物组合物经皮下施用。
103.一种经皮下、肌内或透皮施用药物制剂的方法，该方法包含以下步骤：(a)产生根据项94或95所述的药物制剂；以及(b)通过皮下、肌内或透皮递送向受试者施用药物制剂。
因此，在一个方面，本发明涉及一种用于产生包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物的方法，该方法包含以下步骤：(a)使蛋白质与络合剂在缓冲溶液中接触，其中络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素，并且其中蛋白质和络合剂在包含于缓冲溶液中时具有相反的净电荷，优选地使得蛋白质与络合剂的摩尔-电荷比为约1:1或高于1:1；(b)在缓冲溶液中使蛋白质与络合剂之间形成RPC；以及(c)获得包含在步骤(b)中形成的RPC的悬浮液。
即，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：络合剂硫酸葡聚糖和硫酸软骨素可用于产生包含在生理条件下有效溶解可逆蛋白质络合物(RPC)的蛋白质组合物。进一步，出乎意料地发现，包含本发明的RPC的制剂即使在高蛋白质浓度下也具有特别低的粘度，并且因此适于皮下施用。
本发明人已经证明，硫酸葡聚糖和硫酸软骨素两者均用于以接近100％的效率络合蛋白质(图9)。令人惊讶的是，包含这些络合剂的RPC在模拟人体内的生理条件的PBS(pH7.4,137mM NaCl)中以接近100％的效率溶解。因此，包含本发明的RPC的制剂可以施用于患者，优选地经皮下施用，其中里它们原位溶解以使得蛋白质可供患者吸收。
产生本发明的可逆蛋白质络合物所需的第一步是使蛋白质与络合剂在缓冲溶液中接触。即，可以将蛋白质和络合剂在缓冲溶液中混合，使得在蛋白质与络合剂之间形成可逆蛋白质复合物。不受理论的约束，可逆蛋白质复合物的形成至少部分地由缓冲溶液中带相反电荷的蛋白质与络合剂之间的静电相互作用驱动。应当理解，单个蛋白质分子通常与多个络合剂分子经历复合物的形成。
即，在本发明内，络合剂和蛋白质在包含于缓冲溶液中时具有相反的电荷。因此，在某些实施例中，当包含于缓冲溶液中时，络合剂可以带正电荷，并且蛋白质可以带负电荷。但是，优选的是，蛋白质在包含于缓冲溶液中时带正电荷，并且络合剂在包含于缓冲溶液中时带负电荷。
应当理解，蛋白质和络合剂两者均可在接触步骤之前溶于缓冲溶液中。使带相反电荷的蛋白质与络合剂在缓冲溶液中接触导致可逆蛋白质络合物形成沉淀，从而使缓冲溶液转变为包含可逆蛋白质络合物的悬浮液。
如本文所用的“组合物”是指包含本发明的可逆蛋白质络合物和至少一种另外对化合物的混合物。即，本发明的组合物优选地包含可逆蛋白质络合物，这些可逆蛋白质络合物包含络合剂硫酸葡聚糖和/或硫酸软骨素。组合物可具有任何形式。但是，在某些实施例中，组合物为悬浮液。在其他实施例中，组合物为粉末，特别是冻干粉末、或喷雾干燥的粉末、或复溶的或重悬的粉末。
在某些实施例中，本发明的组合物为悬浮液。如本文所用的术语“悬浮液”是指具有连续液相和呈颗粒形式的不连续固相的分散体，诸如RPC，其具有5μm至300μm的数均直径。但是，重要的是应当理解，术语“悬浮液”还可以涵盖包含较小颗粒的分散体，例如具有在纳米范围内的数均直径的RPC。
如本文所用的术语“络合物”是指两个或更多个分子的缔合，其通常通过非共价键合来缔合，例如，第一分子的带正电荷的基团与第二分子的带负电荷的基团之间的缔合。进一步，第一分子与第二分子之间的疏水相互作用可以促进复合物的形成。在本发明内，第一分子优选地为蛋白质，并且第二分子优选地为络合剂。
如果两个分子(即，蛋白质和络合剂)之间的缔合可在不显著修饰蛋白质的情况下逆转，则称复合物为可逆的。即，如果蛋白质复合物可以解离并且蛋白质在该复合物解离后保持其原始大小、结构和/或功能，则称该蛋白质复合物为可逆的。
优选地，如果复合物的形成和复合物的解离都可以高效地实现，则将蛋白质复合物确定为可逆蛋白质复合物。
如本文所用的术语“络合效率”是指在特定条件(即，特定pH和/或离子强度)下形成包含蛋白质和络合剂的复合物的效率。络合效率定义为样品中的蛋白质与络合剂接触后经历复合物形成的百分比。特别是，如果在与络合剂接触的步骤后，样品中至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的蛋白质经历了复合物形成，则称复合物以高络合效率形成。
如本文所用的术语“解离效率”是指包含蛋白质和络合剂的复合物在特定条件(即，特定pH和/或离子强度)下解离的效率。解离效率定义为样品中的蛋白质络合物在特定条件下溶解以使得蛋白质从络合物中释放并且返回溶液中的百分比。特别是，如果样品中的至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的络合物在该样品中的特定条件下解离成可溶性蛋白质，则称络合物以高解离效率解离。
因此，如果蛋白质复合物以高络合效率形成并且以高解离效率溶解，则将该蛋白质复合物定义为“可逆蛋白质复合物”。
进一步，如果蛋白质在蛋白质复合物解离后保持其原始大小、结构和/或功能，则将该蛋白质复合物定义为“可逆蛋白质复合物”。特别是，如果样品中的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的蛋白质在其已在解离步骤中从蛋白质复合物中释放后保持其原始大小结构和/或功能，则将该蛋白质复合物确定为可逆蛋白质复合物。
优选地，如果蛋白质复合物在10mM至100mM PBS(pH 7.4)中解离后，样品中的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的蛋白质保持其原始大小结构和/或功能，则将该蛋白质复合物确定为可逆蛋白质复合物。
更优选地，如果蛋白质复合物在生理条件下解离后，样品中的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的蛋白质保持其原始大小结构和/或功能，则将该蛋白质复合物确定为可逆蛋白质复合物。
技术人员知道用于确定络合效率和解离效率的方法。例如，用于确定络合效率的方法和用于确定解离效率的方法分别公开于实例1.2.3和实例1.2.4中。此外，技术人员知道用于确定蛋白质在蛋白质复合物解离后是否保持其原始大小、结构和/或功能的方法。
蛋白质大小的变化主要是由于蛋白质的降解，其通常导致蛋白质大小减小，或两个或更多个蛋白质分子的聚集，其通常导致蛋白质大小增加。例如，蛋白质的大小可以在复合物形成之前和复合物解离之后通过本领域已知的任何方法诸如体积排阻色谱(SEC)或离子交换色谱(IEC)来确定(参见实例1.2.8)。
即，在某些实施例中，如果在样品中的RPC解离后，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的蛋白质呈单体形式并且未降解，优选地当通过体积排阻色谱(SEC)测量时，则称蛋白质为稳定的。
替代性地，如果当通过离子交换色谱(IEC)分析并且在RPC形成之前和RPC解离之后进行比较时，蛋白质的主峰百分比差异不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，则称蛋白质是稳定的。
蛋白质的结构可以在复合物形成之前和复合物解离之后通过本领域已知的任何方法确定诸如X射线晶体学、NMR或圆二色性来确定。
蛋白质的功能可以在复合物形成之前和复合物解离之后确定。例如，抗原结合分子诸如抗体的功能可以在结合研究中确定。本领域已知的用于确定蛋白质与靶标结合的常用方法为等温滴定量热法或表面等离子体共振法。优选地，抗原结合分子在复合物解离后可具有与复合物形成前基本上相同的结合特性。即，如果抗原结合分子与抗原的结合亲和力在复合物形成之前和复合物解离之后测量时差异小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％，则称抗原结合分子具有基本上相同的结合特性。
如本发明的方法的上下文中使用的术语“使接触”是技术人员所理解的。该术语涉及使本发明的两种化合物(即，蛋白质和络合剂)彼此物理接触。优选地使蛋白质与络合剂在缓冲溶液中物理接触。即，蛋白质和络合剂两者均溶于缓冲溶液中，使得它们能够通过扩散以实现物理接触。缓冲溶液中化合物的接触可以通过振摇、混合、涡旋等来促进。
如本文所用的术语“静电相互作用”是指在两种带相反电荷的物质(即，带正电荷的物质和带负电荷的物质)之间形成的相互作用。此类相互作用通常涉及离子键。
大多数蛋白质同时含有酸性官能团和碱性官能团。因此，如果蛋白质的净电荷在给定条件下为负，则称蛋白质带负电荷。因此，如果蛋白质的净电荷在给定条件下为正，则称蛋白质带正电荷。多肽在给定pH下的净电荷可基于Henderson-Hasselbalch方程(Hasselbalch,K.A.,1917 Biochemische Zeitschrift 78:112-144)和多肽的可电离的氨基酸侧链以及N末端和C末端的已知pKa值来计算。
如本文所用的术语“缓冲溶液”是指组合物，其中该组合物包含弱酸及其共轭碱(通常作为共轭碱盐)、弱碱及其共轭酸或它们的混合物。本领域技术人员将容易地认识到可用于本发明的方法和/或制剂的各种缓冲溶液。典型的缓冲溶液包括但不限于药用弱酸、弱碱或它们的混合物。
短语“弱酸”是在水溶液中不完全电离的化学酸；即，如果酸由通式HA表示，则在水溶液中形成A-，但仍然存在大量未解离的HA。弱酸的酸解离常数(Ka)在1.8×10-16与55.5之间变化。
短语“弱碱”是在水溶液中不完全电离的化学碱；即，如果碱由通式B表示，则在水溶液形成BH+，但仍然存在大量未质子化的B。所得共轭弱酸BH+的酸解离常数(Ka)在1.8×l0-16与55.5之间变化。
短语“共轭酸”是一对通过获得或失去质子而相互转化的两种化合物(HX+,X)中的酸成员HX+。
短语“共轭碱”是一对通过获得或失去质子而相互转化的两种化合物(HX,X-)中的碱成员X-。
短语“共轭碱盐”是包含共轭碱X-和带正电荷的抗衡离子的离子盐。
在本发明内，络合剂可以是聚合物，优选带电荷的聚合物。即，本发明优选地基于在蛋白质与聚合物之间形成可逆蛋白质络合物，其中聚合物在包含于缓冲溶液中时具有与蛋白质的净电荷相反的电荷。
特别是，在本发明内已经证明，与用单体络合剂诸如十二烷基硫酸钠(SDS)或牛磺胆酸钠(ST)形成的络合物相比，聚合物络合剂引起可逆蛋白质络合物在生理条件下更有效地溶解(见图9)。特别是，已经证明，在复合物解离后，单体络合剂诸如SDS或ST导致蛋白质发生显著降解(见表8)。
在某些实施例中，络合剂为硫酸葡聚糖。本发明人已经证明，硫酸葡聚糖可用于形成在生理条件下有效解离的可逆蛋白质络合物。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为硫酸葡聚糖。
如本文所用的术语“硫酸葡聚糖”是指葡聚糖的聚阴离子衍生物，其分子量范围为7,000至500,000道尔顿。葡聚糖是葡萄糖的聚合物，其中葡萄糖残基通过α-1,6键合连接。因此，在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为具有在7,000至500,000道尔顿范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖。
平均分子量为40kDa的葡聚糖硫酸盐被证明特别适于形成在生理条件下有效解离的可逆蛋白质络合物。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为具有在10kDa至200kDa范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖。在一个更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为具有在20kDa至100kDa范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖。在一个甚至更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为具有在20kDa至80kDa范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖。在一个甚至更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为具有在30kDa至50kDa范围内的平均分子量的硫酸葡聚糖。在一个最优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为具有40kDa的平均分子量的硫酸葡聚糖。
在其他实施例中，络合剂为硫酸软骨素。硫酸软骨素是由交替糖链(N-乙酰半乳糖胺和葡糖醛酸)组成的硫酸化糖胺聚糖(GAG)。在本发明内，术语“硫酸软骨素”涵盖硫酸软骨素A(软骨素-4-硫酸盐)、硫酸软骨素C(软骨素-6-硫酸盐)、硫酸软骨素D(软骨素-2,6-硫酸盐)和硫酸软骨素E(软骨素-4,6-硫酸盐)。在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为硫酸软骨素A。在其他实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为硫酸软骨素C。在另外的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为硫酸软骨素D。在另外的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为硫酸软骨素E。在另外的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂为由以下项组成的组中的至少一者：硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D和硫酸软骨素E。
术语“带电荷聚合物”是指由以线性或非线性方式连接的重复结构单元的主链组成的任何化合物，其中一些重复单元含有带正电荷或带负电荷的化学基团。重复结构单元本质上可以是多糖、烃、有机的或无机的。重复单元的范围可以为n＝2至n＝数百万。
如本文所用的术语“带正电荷的聚合物”是指含有携带、能够携带或能够被修饰以携带正电荷的化学基团(诸如铵、烷基铵、二烷基铵、三烷基铵和季铵)的聚合物。
如本文所用的术语“带负电荷的聚合物”是指含有携带、能够携带或能够被修饰以携带负电荷的化学基团(诸如磷酸及其他含磷的酸、硫酸及其他含硫的酸、硝酸盐及其他含氮的酸、甲酸及其他羧酸的衍生物)的聚合物。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中将缓冲溶液的pH调节至低于蛋白质的等电点。
可逆蛋白质络合物的形成主要由带相反电荷的蛋白质与形成络合物的络合剂之间的静电相互作用驱动。分子在溶液中的电荷取决于溶液的pH等。在本发明内，优选的是蛋白质和络合剂包含于缓冲溶液中，其中将缓冲溶液的pH调节为使得蛋白质和络合剂带相反的电荷。
当包含于溶液中时，蛋白质可以包含带正电荷和带负电荷的氨基酸残基。如果蛋白质在特定条件下包含的负电荷多于正电荷，则称该蛋白质在所述条件下具有净负电荷。如果蛋白质在特定条件下包含的正电荷多于负电荷，则称该蛋白质在所述条件下具有净正电荷。
如本文所用的术语“等电点”意指大分子诸如蛋白质的总净电荷为零的pH值。在蛋白质中，可能具有许多带电荷基团，并且在等电点处，所有这些电荷的总和为零。在高于等电点的pH下，多肽的总净电荷将为负，而在低于等电点的pH时，多肽的总净电荷将为正。
技术人员知道用于确定蛋白质的等电点的方法。最常见地，蛋白质的等电点基于蛋白质的氨基酸序列来计算。可在线获得许多可以计算蛋白质的等电点的工具，诸如“ExPASy Compute pI/Mw”；参见Protein Identification and Analysis Tools on theExPASy Server；Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；(In)John M.Walker(ed):The Proteomics ProtocolsHandbook,Humana Press(2005),pp.571-607。
形成可逆蛋白质复合物的蛋白质可具有净正电荷或净负电荷。但是，优选的是，蛋白质在包含于缓冲溶液中时具有净正电荷。即，优选的是，缓冲溶液的pH低于蛋白质的等电点。
通常观察到暴露于强酸性pH可能导致蛋白质发生不可逆的变性。因此，优选的是，将缓冲溶液的pH调节为低于蛋白质的等电点2至5个pH单位。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中将缓冲溶液的pH调节为低于蛋白质的等电点2至5个pH单位。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中将缓冲溶液的pH调节为低于蛋白质的等电点约3个pH单位。
将缓冲溶液的pH调节至仅略低于蛋白质的等电点的pH，确保蛋白质在缓冲溶液中时带正电荷，并且同时减小蛋白质变性的风险。
替代性地，可以将缓冲溶液的pH调节为固定值。本发明的方法优选地用于产生包含治疗性蛋白质(即抗体)的可逆蛋白质络合物。大多数抗体具有在6.5至9范围内的等电点。因此，大多数抗体在包含于具有酸性pH值的缓冲溶液中时将具有净正电荷。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液具有在1至6范围内的pH。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液具有在3至6范围内的pH。在一个更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液具有在4.5至5.5范围内的pH。
本发明人已经证明，复合物形成要求缓冲溶液具有至少5mM、优选至少20mM的离子强度(图13)。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液具有在5mM至50mM、优选20mM至50mM范围内的离子强度。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液具有在20mM至30mM范围内的离子强度。
术语“离子强度”在本文中用作溶液中所有离子的浓度的以下函数：
Figure BDA0004041476750000201
其中ci是离子i的摩尔浓度(M,mol/L)，zi是该离子的电荷数，并且取溶液中所有离子的总和。
缓冲溶液可包含任何可以使可逆蛋白质复合物有效形成的缓冲剂。本领域已知的许多缓冲剂可以将溶液的pH值维持在选定的pH值附近。可用于本发明的方法的缓冲剂包括但不限于甲酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苹果酸盐、吡啶、哌嗪、二甲胂酸盐、琥珀酸盐、MES、马来酸盐、组氨酸、Bis-Tris、磷酸盐、乙醇胺、ADA和碳酸盐。
应当理解，缓冲剂的选择取决于要络合的蛋白质。在某些实施例中，将缓冲溶液的pH调节为低于要络合的蛋白质的等电点。技术人员知道用于确定蛋白质的等电点以及选择可以维持缓冲溶液中的pH维持低于所述蛋白质的等电点的缓冲剂的方法。因此，在某些实施例中，本发明涉及本发明的方法，其中缓冲溶液包含可以维持缓冲溶液的pH维持低于蛋白质的等电点的缓冲剂。在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液包含可以维持缓冲溶液的pH低于蛋白质的等电点1至3个pH单位的缓冲剂。在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液包含可以维持缓冲溶液的pH低于蛋白质的等电点2个pH单位的缓冲剂。
本发明人已经证明，当形成包含不同类型的抗体的可逆蛋白质络合物时，组氨酸特别适合作为缓冲剂。组氨酸中咪唑侧链的共轭酸(质子化形式)的pKa为约6.0。组氨酸缓冲液在5.5至7.4的pH范围内最有效。因此，当形成等电点在6与9之间的抗体的可逆蛋白质络合物时，组氨酸特别适合作为缓冲剂。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液包含作为缓冲剂的组氨酸。
进一步，已经证明，当形成包含不同类型的抗体的可逆蛋白质络合物时，柠檬酸盐特别适合作为缓冲剂。柠檬酸盐是一种弱三羧酸，具有三个不同的pKa值(3.1、4.7和6.4)。柠檬酸盐缓冲液在2.5至7的pH范围内最有效。因此，当形成等电点在3与6之间的抗体的可逆蛋白质络合物时，柠檬酸盐特别适合作为缓冲剂，但它可以可用于络合具有更高等电点的蛋白质。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中缓冲溶液包含作为缓冲剂的柠檬酸盐。
如本文所用的术语“缓冲剂”是指用于在加入另一种酸性或碱性化合物后将溶液的pH维持在选定的pH值附近的弱酸或弱碱。此类试剂的功能是防止当酸或碱加入溶液中时pH发生变化。此类试剂可以是酸、碱或它们的组合。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中包含蛋白质和络合剂的缓冲溶液通过混合包含蛋白质的第一溶液与包含络合剂的第二溶液获得。
在本发明内，优选的是，通过将包含蛋白质的第一溶液与包含络合剂的第二溶液混合以使蛋白质与络合剂接触。技术人员知道用于制备包含蛋白质或络合剂的溶液以及混合这些溶液的方法。
替代性地，可通过(i)在缓冲溶液中提供蛋白质或络合剂以及(ii)将RPC的剩余组分以固体形式加入缓冲溶液中，以使蛋白质与络合剂接触。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中包含蛋白质的第一溶液和/或包含络合剂的第二溶液包含缓冲剂。
包含蛋白质的溶液和/或包含络合剂的溶液两者均可包含缓冲剂。即，在某些实施例中，该方法涉及使包含蛋白质和缓冲剂的第一溶液与包含络合剂和缓冲剂的第二溶液接触的步骤。第一溶液中的缓冲剂和第二溶液中的缓冲剂可以是相同的缓冲剂，也可以是不同的缓冲剂。在某些实施例中，第一溶液和第二溶液两者均包含作为缓冲剂的组氨酸。在其他实施例中，第一溶液和第二溶液两者均包含作为缓冲剂的柠檬酸盐。
替代性地，可通过将包含缓冲剂的溶液与固体混合，以使蛋白质与络合剂接触。例如，可通过将固体形式的络合剂加入溶液中以使包含蛋白质和缓冲剂的溶液与络合剂接触，使得络合剂溶于溶液中并且与蛋白质形成可逆蛋白质复合物。相应地，可通过将固体形式的蛋白质加入溶液中以使包含络合剂和缓冲剂的溶液与蛋白质接触，使得蛋白质溶于溶液中并且与络合剂形成可逆蛋白质复合物。
在某些实施例中，将络合剂逐渐加入蛋白质溶液中。优选地，将包含络合剂的溶液逐渐加入蛋白质溶液中。更优选地，将包含络合剂的缓冲溶液逐渐加入缓冲蛋白质溶液中。缓冲溶液可包含本文所公开的缓冲剂中的任一者。
复合物形成由带相反电荷的蛋白质与络合剂之间的静电相互作用驱动。在本发明内，将使蛋白质与络合剂在缓冲溶液中以特定的摩尔-电荷比接触。在某些实施例中，蛋白质在包含于缓冲溶液中时具有净正电荷。在这些情况下，蛋白质与络合剂之间的摩尔-电荷比定义为缓冲溶液中包含的所有蛋白质的正电荷总数与缓冲溶液中包含的所有络合剂的负电荷总数之间的比率。因此，在1:1的摩尔电荷比下，缓冲溶液中包含的蛋白质的正电荷在理论上将被缓冲溶液中包含的络合剂的负电荷完全中和。
在本发明内，出人意料地发现，蛋白质与络合剂之间的摩尔电荷比为1:1或甚至高于1:1(蛋白质过量)时足以获得几乎完全的络合物形成，从而减少在产生本发明的RPC时对络合剂的需求(表7)。例如，已经证明，络合剂硫酸葡聚糖的摩尔-电荷比为1:0.6时足以实现蛋白质的完全络合。对于络合剂硫酸软骨素，甚至摩尔-电荷比为1:0.2时即足以实现蛋白质的完全络合。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中蛋白质与络合剂以1:0.1至1:6范围内的摩尔-电荷比接触，特别是其中蛋白质与络合剂以1:0.2至1:1范围内的摩尔-电荷比接触。
应当理解，实现蛋白质的完全络合所需的摩尔-电荷比根据络合剂而变化。
因此，在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中蛋白质与络合剂硫酸葡聚糖以1:0.2至1:2范围内的摩尔-电荷比接触，优选地，其中蛋白质与络合剂硫酸葡聚糖以1:0.5至1:2范围内的摩尔-电荷比接触，更优选地，其中蛋白质与络合剂硫酸葡聚糖以1:0.5至1:1范围内的摩尔-电荷比接触，最优选地，其中蛋白质与络合剂硫酸葡聚糖以1:0.6范围内的摩尔-电荷比接触。
在其他实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中蛋白质与络合剂硫酸软骨素以1:0.2至1:2范围内的摩尔-电荷比接触，优选地，其中蛋白质与络合剂硫酸软骨素以1:0.2至1:1范围内的摩尔-电荷比接触。
本发明已进一步证明，络合效率取决于缓冲溶液中的蛋白质浓度。特别是，已经证明，可在1mg/mL至40mg/mL范围内的蛋白质浓度下实现络合物形成(图10)。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中蛋白质与络合剂在缓冲溶液中以1mg/mL至40mg/mL范围内的蛋白质浓度接触。
本发明人已经证明，在高于5mg/mL的蛋白质浓度下形成的络合物具有更大的粒径，其可能降低络合物的可注射性(图11)。进一步，在高于5mg/mL的蛋白质浓度下形成的络合物的解离效率不及在较低蛋白质浓度下形成的蛋白质络合物的解离效率(图10)。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中蛋白质与络合剂在缓冲溶液中以1mg/mL至5mg/mL范围内的蛋白质浓度接触。
本发明的方法不限于特定类型的蛋白质。即，本发明的方法可用于产生包含任何类型的蛋白质的可逆蛋白质络合物。由于技术人员知道基于其氨基酸序列确定任何蛋白质的等电点的方法，因此技术人员能够选择适合于与硫酸葡聚糖或硫酸软骨素形成可逆蛋白质络合物的缓冲液条件。
优选地，本发明的方法用于产生包含治疗性蛋白质的可逆蛋白质络合物。即，本发明的方法可以产生适于经皮下、肌内或透皮施用的具有高蛋白质浓度的药物组合物。
如本文所用的术语“治疗性蛋白质”是指已知任何可用于预防、治疗或改善疾病或病症的肽或蛋白质，例如，抗体、生长因子、细胞表面受体、细胞因子、激素、毒素或前述任一者的片段和/或融合蛋白。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中蛋白质为抗体、生长因子、激素、细胞因子、酶或前述任一者的片段和/或融合蛋白。
本发明涉及可逆蛋白质络合物的产生。但是，应当指出，本发明还涵盖包含肽的可逆络合物的产生。因此，术语“蛋白质”在本文中与术语“肽”或“多肽”可互换使用。
如本文所用的术语“肽”或“多肽”是指由肽键连接的单个非支链氨基酸残基构成的化合物。此类化合物中氨基酸残基的数量差异很大。
如本文所用的术语“蛋白质”可以与术语“肽”或“多肽”作为同义词使用，或者可以另外指两个或更多个肽的复合物，所述两个或更多个肽可通过肽键以外的键连接，例如，构成蛋白质的此类肽可通过二硫键连接。术语“蛋白质”还可以包括具有一个或多个相同的氨基酸序列但具有不同的一种或多种翻译后修饰(诸如磷酸化、酰化、糖基化等，特别是当这些蛋白质在真核宿主中表达时可以添加)的肽或肽家族。
本文定义内涵盖的蛋白质的实例包括哺乳动物蛋白质，诸如生长激素，包括人类生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；凝血因子诸如VIIIC因子、IX因子、组织因子和维勒布兰德氏(von Willebrands)因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，诸如尿激酶或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA，例如
Figure BDA0004041476750000251
Figure BDA0004041476750000252
)；蛙皮素(Bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(调节正常表达和分泌的T细胞活化)；人类巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白诸如人类血清白蛋白；缪勒管(Muellerian)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；DNA酶；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整合素；蛋白A或蛋白D；类风湿因子；神经营养因子诸如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子诸如NGF-β；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子(DAF)；病毒抗原，诸如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；寻址蛋白；调节蛋白；免疫粘附素；抗体；以及以上列出的多肽中任一者的生物活性片段或变体。
如本文所用的术语“生长因子”是指能够实现细胞分化的多肽分子。根据本文的教导内容设想使用的生长因子的实例包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、人内皮细胞生长因子(ECGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、骨形态发生蛋白(BMP)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和/或血小板源性生长因子(PDGF)。
如本文所用的术语“激素”是指通常由一个器官形成的刺激另一个器官的功能的物质。多肽激素包括但不限于胰岛素、生长激素、肠抑胃肽和胆囊收缩素。
如本文所用的术语“细胞因子”是指任何影响其他细胞功能以及调节免疫或炎症反应中细胞之间的相互作用的分泌多肽。细胞因子包括但不限于单核因子、淋巴因子和趋化因子，无论它们由哪些细胞产生。例如，单核因子通常被称为由单核细胞产生和分泌，但是，许多其他细胞(诸如自然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、脑星形胶质细胞、骨髓基质细胞、表皮角质形成细胞和B淋巴细胞)产生单核因子。淋巴因子通常被称为由淋巴细胞产生。细胞因子的实例包括但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子β(TNFβ)。
如本文所用的术语“酶”是指主要由蛋白质组成并且催化化学反应的大分子化合物。
优选地，本发明的方法用于产生包含抗体的可逆蛋白质络合物。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中蛋白质为抗体或其片段。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体-药物缀合物或抗体片段。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且特别涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或衍生自其他物种的抗体。抗体是由免疫系统产生的能够识别并结合特定抗原的蛋白质。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immuno Biology,5thEd.,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有多个结合位点，也称为表位，被多个抗体上的CDR(互补决定区)识别。与不同表位特异性结合的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有多于一种的相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合目标靶标的抗原或其一部分的抗原结合位点的分子，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫性抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任何物种。但是，在一个实施例中，免疫球蛋白是人、鼠或兔来源的。
抗体可以是完整抗体。如本文所用，术语“完整抗体”是包含VL和VH结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其是指可归因于抗体的Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及下调细胞表面受体，诸如B细胞受体和BCR。
如本文所用的术语“Fc区”意指免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
如本文所用，术语“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
如本文所用，术语“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体；微型抗体(Olafsen等人(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体、CDR(互补决定区)和上述中任一者(其免疫特异性地结合癌症细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的表位结合片段、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。
在某些实施例中，抗体可以是单克隆抗体。本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，例如，除了可能存在的少量天然存在的突变，该抗体群包含的单个抗体是相同的。单克隆抗体对单个抗原位点具有高特异性。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除特异性以外，单克隆抗体的优势还在于它们可以在不受其他抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本文所述主题使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人(1975)Nature,256:495描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如：US 4816567、US 5807715)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson等人(1991)Nature,352:624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到。
在某些实施例中，抗体可以是天然抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端至C端，每条重链均具有可变区(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
在某些实施例中，抗体是经工程化改造的抗体。“经工程化改造的抗体”可以是通过基因工程引入、缺失或取代一个或多个氨基酸残基的任何抗体。术语“经工程化改造的抗体”进一步涵盖“经糖工程化改造的抗体”。“经糖工程化改造的抗体”是其中连接聚糖的组成已经过修饰的抗体。聚糖的修饰可以不受限制地通过化学或酶方法来实现。进一步，转基因宿主细胞是本领域已知的，可用于合成经糖工程化改造的抗体。
在某些实施例中，抗体为人抗体。“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可(US 4816567；以及Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文中的目标嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链及/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链及/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
在其他实施例中，抗体为多克隆抗体。如本文所用的术语“多克隆抗体”是指识别并且结合同一抗原上的不同表位的抗体的异质混合物。多克隆抗体可以从粗血清制剂中获得，也可以使用例如抗原亲和层析法、蛋白A/蛋白G亲和层析法等进行纯化。
在某些实施例中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。如本文所用的术语“多特异性抗体”是指包含具有多表位特异性(即，能够结合一个分子上的两个或更多个不同表位，或能够结合两个或更多个不同分子上的表位)的抗原结合结构域的抗体。
在一些实施例中，多特异性抗体是对至少两个不同的抗原结合位点具有结合特异性的单克隆抗体(例如双特异性抗体)。在一些实施例中，多特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合一个相同分子内的两个表位(分子内结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合同一蛋白质分子上的两个不同表位。在某些实施例中，多特异性抗体结合的两个不同表位是通常不被一种单特异性抗体(诸如常规抗体或一个免疫球蛋白单可变结构域)在同一时间结合的表位。在一些实施例中，多特异性抗体的第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以结合位于两个不同分子内的表位(分子间结合)。例如，多特异性抗体的第一抗原结合结构域可以结合一个蛋白质分子上的一个表位，而多特异性抗体的第二抗原结合域可以结合不同蛋白质分子上的另一表位，从而使这两个分子交联。
在一些实施例中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元与第一表位结合，第二VH/VL单元与第二表位结合，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。这样的多特异性抗体包括但不限于全长抗体，具有两个或多个VL和VH结构域的抗体，和抗体片段(诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体抗体、双特异性双体抗体和三抗体，已共价或非共价连接的抗体片段)。进一步包含重链可变区的至少一部分和/或轻链可变区的至少一部分的VH/VL单元也可以称为“臂(arm)”、“半体(hemimer)”或“半抗体(half antibody)”。在一些实施例中，半体包括重链可变区的足够部分，以实现与第二半体形成分子内二硫键。在一些实施例中，半体包括杵突变(knob mutation)或臼突变(hole mutation)，例如，以实现与包含互补臼突变或杵突变的第二半体或半抗体的异二聚化。
在某些实施例中，本文提供的多特异性抗体可以是双特异性抗体。如本文所用，术语“双特异性抗体”是包含抗原结合结构域的多特异性抗体，其能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特异性抗体在本文中也可以被称为具有“双重特异性”或为“双重特异性的”。示例性的双特异性抗体可以结合蛋白质和任何其他抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可以结合相同蛋白质分子的两个不同表位。在某些实施例中，双特异性抗体可以结合两个不同蛋白质分子上的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达蛋白质的细胞。
双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。在某些实施例中，双特异性抗体片段为Dutafab，如Beckmann等人(DutaFabs are engineered therapeutic Fabfragments that can bind two targets simultaneously；Nature Communications；2021；vol.2:708)所公开的。在某些实施例中，Dutafab可以特异性结合至人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血管生成素-2(Ang-2)。在某些实施例中，Dutafab可以特异性结合至人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板源性生长因子(PDGF)。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的改造的抗体，包括“章鱼抗体”或“双可变结构域免疫球蛋白”(DVD)(参见例如，US 2006/0025576A1和Wu等人NatureBiotechnology(2007))。本文的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包括与靶标以及其他不同抗原结合的抗原结合位点(参见例如，US 2008/0069820)。
本发明的抗体可以是裸抗体、融合抗体或包含于抗体-药物缀合物中。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。
如本文所用的术语“免疫缀合物”或“抗体药物缀合物”是指抗体或其抗原结合片段与另一种试剂(诸如化疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等)的键合。该键合可以是共价键，也可以是非共价相互作用，诸如通过静电力实现。可采用本领域已知的多种接头来形成免疫缀合物。此外，免疫缀合物可以以融合蛋白的形式提供，该融合蛋白可以由编码免疫缀合物的多核苷酸表达。
如本文所用的术语“抗体融合蛋白”意指具有氨基酸序列的多肽分子，该氨基酸序列包括抗原结合蛋白的一部分的氨基酸序列。例如，抗原结合蛋白的部分可以是整个抗体或其片段。特别是，抗体融合蛋白可以包含抗体或其片段的第一氨基酸序列以及另一多肽或蛋白质的第二氨基酸序列。第二氨基酸序列可以例如为细胞因子的氨基酸序列。抗体融合蛋白可通过连接两个或更多个多核苷酸来创建，这些多核苷酸最初编码单独的蛋白质(包括肽和多肽)。融合基因的翻译产生具有源自每个原始蛋白质的功能特性的单个蛋白质。
在某些实施例中，蛋白质为抗体。本发明涵盖的抗体的示例性分子靶标包括：CD蛋白质，诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受体家族的成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mol、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；蛋白C等。
可以利用的示例性抗体包括但不限于：hRl(抗IGF-1R，美国专利申请序列号12/722,645，提交于3/12/10)、hPAM4(抗粘蛋白，美国专利号7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利号7,251,164)、hA19(抗CD19，美国专利号7,109,304)、WMMU31(抗AFP，美国专利号7,300,655)、hLLl(抗CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利号7,074,403)、hMu-9(抗CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗HLA-DR，美国专利号7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利号6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、hRS7(抗EGP-1，美国专利号7,238,785)、hMN-3(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、Abl24和Abl 25(抗CXCR4，美国专利号7,138,496)。
使用的替代抗体包括但不限于：阿昔单抗(abciximab)(抗糖蛋白Ilb/IIIa)、阿仑单抗(alemtuzumab)(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(cetuximab)(抗EGFR)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(抗CD33)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗CD20)、帕尼单抗(panitumumab)(抗EGFR)、利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)、托西莫单抗(tositumomab)(抗CD20)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗ErbB2)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗CA-125)、阿德木单抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿替珠单抗(atlizumab)(抗IL-6受体)、贝那利珠单抗(benralizumab)(抗CD125)、CC49(抗TAG-72)、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA，美国专利申请11/983,372，沉积为ATCC PTA-4405和PTA-4406)、D2/B(抗PSMA，WO 2009/130575)、tocilizumab(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(basiliximab)(抗CD25)、达利珠单抗(daclizumab)(抗CD25)、依法利珠单抗(efalizumab)(抗CDl l a)、GA101(抗CD20；GlycartRoche)、莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)(抗CD3受体)、那他珠单抗(natalizumab)(抗a4整联蛋白)、奥马珠单抗(omalizumab)(抗IgE)；抗TNF抗体，诸如CDP571(Ofei等人,2011,Diabetes 45:881-85)、MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B、M303(ThermoScientific,Rockford,IL)、英夫利昔单抗(infliximab)(Centocor,Malvern,PA)、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab pegol)(UCB,Brussels,Belgium)、抗CD40L(UCB,Brussels,Belgium)、阿达木单抗(adalimumab)(Abbott,Abbott Park,IL)、Benlysta(Human Genome Sciences)；用于治疗阿尔茨海默病的抗体，诸如Alz 50(Ksiezak-Reding等人,1987,J Biol Chem 263:7943-47)、更汀芦单抗、苏兰珠单抗(solanezumab)和英夫利昔单抗(infliximab)；抗纤维蛋白抗体，如59D8、T2Gl s、MH1；抗HIV抗体，诸如P4/D10(美国专利申请序列号11/745,692)、Ab 75、Ab 76、Ab 77(Paulik等人,1999,Biochem Pharmacol58:1781-90)；以及抗病原体的抗体，诸如CR6261(抗流行性感冒)、艾韦单抗(exbivirumab)(抗乙型肝炎)、泛维珠单抗(felvizumab)(抗呼吸道合胞病毒)、福拉韦单抗(foravirumab)(抗狂犬病病毒)、莫维组单抗(motavizumab)(抗呼吸道合胞病毒)、帕利珠单抗(palivizumab)(抗呼吸道合胞病毒)、帕巴库单抗(panobacumab)(抗假单胞菌)、雷韦单抗(rafivirumab)(抗狂犬病病毒)、瑞加韦单抗(regavirumab)(抗巨细胞病毒)、司韦单抗(sevirumab)(抗巨细胞病毒)、替维鲁单抗(tivirumab)(抗乙型肝炎)和乌珠单抗(urtoxazumab)(抗大肠杆菌)。
在某些实施例中，抗体可以是双特异性抗VEGF/抗血管生成素-2(Ang-2)抗体、抗α突触核蛋白(aSyn)抗体、双特异性抗FAP/抗OX40抗体、双特异性抗VEGF/抗PDGF抗体(Dutafab)、贝伐单抗、帕妥珠单抗或更汀芦单抗。
即，在某个实施例中，抗体可以是双特异性抗VEGF/抗血管生成素-2(Ang-2)抗体。在某个实施例中，双特异性抗VEGF/抗血管生成素-2(Ang-2)抗体可以是Faricimab，如WO2014/009465中以“VEGFang2-0016”所公开。在某个实施例中，双特异性抗VEGF/抗血管生成素-2(Ang-2)抗体可以是a Dutafab。
在某个实施例中，抗体可以是抗α突触核蛋白(aSyn)抗体。在某个实施例中，抗体可以是双特异性抗FAP/抗OX40抗体。在某个实施例中，抗体可以是Dutafab。在某个实施例中，Dutafab可以是双特异性抗VEGF/抗PDGF Dutafab。在某个实施例中，抗体可以是贝伐单抗。在某个实施例中，抗体可以是帕妥珠单抗。在某个实施例中，抗体可以是更汀芦单抗。
在另一个实施例中，抗体为人抗体或人源化抗体。在一个方面，抗体选自以下：阿仑单抗(alemtuzumab)
Figure BDA0004041476750000341
阿特珠单抗(atezolizumab)
Figure BDA0004041476750000342
贝伐单抗(bevacizumab)
Figure BDA0004041476750000343
西妥昔单抗(cetuximab)
Figure BDA0004041476750000344
帕尼单抗(panitumumab)
Figure BDA0004041476750000345
帕妥珠单抗(pertuzumab)
Figure BDA0004041476750000346
2C4)、曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA0004041476750000347
托西莫单抗(tositumomab)
Figure BDA0004041476750000348
阿昔单抗(abciximab)
Figure BDA0004041476750000349
阿达木单抗(adalimumab)
Figure BDA00040414767500003410
阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、托珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)
Figure BDA00040414767500003411
巴维妥昔单抗(bavituximab)、贝利木单抗(belimumab)
Figure BDA00040414767500003412
briankinumab、卡那单抗(canakinumab)
Figure BDA00040414767500003413
西利珠单抗(cedelizumab)、培戈-赛妥珠单抗(certolizumabpegol)
Figure BDA00040414767500003414
cidfusituzumab、cidtuzumab、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克瑞组单抗(crenezumab)、达利珠单抗(daclizumab)
Figure BDA0004041476750000351
达洛珠单抗(dalotuzumab)、地诺单抗(denosumab)
Figure BDA0004041476750000352
依库珠单抗(eculizumab)
Figure BDA0004041476750000353
依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、艾米希组单抗(emicizumab)
Figure BDA0004041476750000354
泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、戈利木单抗(golimumab)
Figure BDA0004041476750000355
伊匹单抗(ipilimumab)、伊马曲单抗(imgatuzumab)、英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BDA0004041476750000356
拉贝妥珠单抗(labetuzumab)、来瑞组单抗(lebrikizumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、培戈-鲁利珠单抗(lulizumab pegol)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、纳武单抗(mogamulizumab)、莫维组单抗(motavizumab)、motovizumab、muronomab、那他珠单抗(natalizumab)
Figure BDA0004041476750000357
耐昔妥珠单抗(necitumumab)
Figure BDA0004041476750000358
尼妥珠单抗(nimotuzumab)
Figure BDA0004041476750000359
nolovizumab、numavizumab、奥洛组单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)
Figure BDA00040414767500003510
奥那妥组单抗(onartuzumab)(也称为MetMAb)、帕利珠单抗(palivizumab)
Figure BDA00040414767500003511
帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、帕博利珠单抗(pembrolizumab)
Figure BDA00040414767500003512
培克珠单抗(pexelizumab)、普立昔单抗(priliximab)、ralivizumab、兰尼单抗(ranibizumab)
Figure BDA00040414767500003513
reslivizumab、瑞替珠单抗(reslizumab)、resyvizumab、罗妥木单抗(robatumumab)、隆利组单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、西鲁库单抗(sarilumab)、苏金单抗(secukinumab)、瑟瑞妥单抗(seribantumab)、西法木单抗(sifalimumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)
Figure BDA00040414767500003514
西利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他度组单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、替非组单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)
Figure BDA00040414767500003515
托利珠单抗(toralizumab)、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)
Figure BDA00040414767500003516
维多珠单抗(vedolizumab)
Figure BDA0004041476750000361
维西珠单抗(visilizumab)、扎木单抗(zanolimumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中络合剂在包含于缓冲溶液中时具有净负电荷。
在本发明内，优选的是，将缓冲溶液的pH调节为低于蛋白质的等电点。同时，优选的是，络合剂在包含于缓冲溶液中时具有负电荷。络合剂硫酸葡聚糖和硫酸软骨素包含硫酸酯基团，当络合剂包含于缓冲溶液中时，该硫酸酯基团可具有负电荷。特别是，当将缓冲溶液的pH调节至高于硫酸葡聚糖和/或硫酸软骨素的硫酸酯基团的pKa值得pH值时，硫酸酯基团将带负电荷。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中将缓冲溶液的pH调节为低于蛋白质的等电点并且高于缓冲剂的pKa值，特别是其中缓冲剂为硫酸葡聚糖和/或硫酸软骨素。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中包含RPC的组合物包含至少一种赋形剂。
本发明人已经证明，缓冲溶液中赋形剂的存在不会显著干扰可逆蛋白质络合物的形成或这些络合物的溶解。例如，已经证明，常用赋形剂蔗糖、聚山梨酯20和泊洛沙姆188单独或组合不会干扰可逆蛋白质复合物的形成和溶解(图14和15)。因此，可以在形成RPC之前将一种或多种赋形剂加入缓冲溶液中，使得在一种或多种赋形剂的存在下形成RPC。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在形成RPC之前将至少一种赋形剂加入组合物中。
替代性地，可以在形成RPC之后将一种或多种赋形剂加入悬浮液中。即，RPC可以在不存在任何赋形剂的条件下形成，并且随后将赋形剂加入悬浮液中。因此，在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在形成RPC之后将至少一种赋形剂加入组合物中。
在另外的实施例中，可以在RPC形成之前和之后将一种或多种赋形剂加入组合物中。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中所述至少一种赋形剂为稳定剂和/或表面活性剂。
如本文所用的术语“稳定剂”表示药用赋形剂，其保护蛋白质和/或组合物免于在生产、储存和应用期间发生化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于如下文所定义的糖、氨基酸、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇、木糖醇、葡聚糖、甘油、阿糖醇、丙二醇、聚乙二醇)、环糊精(例如，羟丙基-β-环糊精、磺基丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精)、聚乙二醇(例如，PEG3000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 6000)、白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA))、盐(例如，氯化钠、氯化镁、氯化钙)、螯合剂(例如EDTA)。选择相同或不同的组的多于一种稳定剂可存在于组合物中。
如本文所用的术语“糖”包括单糖和寡糖。单糖是不能被酸水解的单体碳水化合物，包括简单糖及其衍生物(例如氨基糖)。糖通常以其D构型使用。单糖的实例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脱氧核糖、神经氨酸。寡糖是由多于一个单体糖单元组成的碳水化合物，这些单体糖单元通过支链或直链糖苷键连接。寡糖内的单体糖单位可以相同或不同。根据单体糖单元的数量不同，寡糖为二糖、三糖、四糖、五糖等。与多糖相比，单糖和寡糖溶于水。寡糖的实例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖和棉子糖。优选的糖为蔗糖和海藻糖(即，α,α-D-海藻糖)，最优选地为蔗糖。
如本文所用的术语“氨基酸”表示具有位于羧基基团的α-位的氨基部分的药学上可接受的有机分子。氨基酸的实例包括但不限于精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸。在各种情况下采用的氨基酸优选为L型氨基酸。碱性氨基酸诸如精氨酸、组氨酸或赖氨酸，优选以其无机盐的形式(有利地以盐酸盐形式，即作为氨基酸盐酸盐)使用。
稳定剂中的一个亚组为冻干保护剂。术语“冻干保护剂”表示一种药用赋形剂，其用于保护不稳定的活性成分(例如蛋白质)在冻干过程以及随后的储存和重构过程中免受不稳定条件的影响。冻干保护剂包括但不限于由糖、多元醇(诸如糖醇)和氨基酸组成的组。优选的冻干保护剂可选自由以下项组成的组：糖，诸如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神经氨酸；氨基糖，诸如葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺(“葡甲胺”)；多元醇，诸如甘露醇和山梨醇；以及氨基酸，诸如精氨酸和甘氨酸；或它们的混合物。
稳定剂中的一个亚组为抗氧化剂。术语“抗氧化剂”表示一种药用赋形剂，其用于防止活性药物成分发生氧化。抗氧化剂包括但不限于抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸、柠檬酸、EDTA。
根据本发明所述的组合物还可包含一种或多种张度剂。术语“张度剂”表示用于调节组合物的张度的药用赋形剂。组合物可以是低渗、等渗或高渗的。等渗性通常与溶液的渗透压相关，其通常相对于人血清的渗透压(约250mOsmol/kg至350mOsmol/kg)而言。根据本发明所述的组合物可以是低渗、等渗或高渗的，但优选为等渗的。等渗组合物为液体或由固体形式(例如由冻干形式)复溶得到的液体，并且表示与之相比的某种其他溶液诸如生理盐溶液和血清具有相同张度的溶液。合适的张度剂包括但不限于氯化钠、氯化钾、甘油以及选自氨基酸或糖类的组中的任意组分(特别是葡萄糖)。
在稳定剂和张度剂中，一组化合物可同时发挥两种作用，即它们同时用作稳定剂和张度剂。该化合物的实例可参见由糖类、氨基酸、多元醇、环糊精、聚乙二醇和盐组成的组。可同时用作稳定剂和张度剂的糖的一个实例为蔗糖。
组合物还可包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌程序并且通过加入各种抗菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)以确保无微生物存在。防腐剂包括但不限于乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵。
如本文所用的术语“表面活性剂”表示药用表面活性试剂。优选地，使用非离子型表面活性剂。药用表面活性剂的实例包括但不限于聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)和十二烷基硫酸钠(SDS)。优选的聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯为聚山梨酯20(聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，以商品名Tween 20TM销售)和聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯，以商品名Tween 80TM销售)。优选的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物是以商品名
Figure BDA0004041476750000391
F68或泊洛沙姆188TM销售的那些。优选的聚氧乙烯烷基醚是以商品名BrijTM销售的那些。优选的烷基苯基聚氧乙烯醚以商品名Triton X销售，最优选对叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(以商品名Triton X-100TM销售)。
应当理解，上面列出的稳定剂和表面活性剂可以以足以获得预期效果的浓度加入到本发明的组合物中。技术人员知道这些浓度，或者替代性地能够通过常规实验确定这些浓度。
本发明的组合物中的优选稳定剂为蔗糖。蔗糖由于其蛋白质稳定特性而常用作药物组合物中的稳定剂。在某些实施例中，在形成RPC之前，将蔗糖加入组合物中。即，在蛋白质与络合剂在所述缓冲溶液中接触之前，将蔗糖加入缓冲溶液中。在某些实施例中，蔗糖以在50mM至500mM范围内、优选在100mM至250mM范围内的浓度存在于缓冲溶液中。
在其他实施例中，可以在形成RPC之后将蔗糖加入组合物中。即，在某些实施例中，可以在喷雾干燥或冻干步骤之前将蔗糖加入悬浮液中。在某些实施例中，蔗糖可以以在0.5mg/mL至10mg/mL范围内、在0.5mg/mL至5mg/mL范围内或在1mg/mL至3mg/mL范围内的浓度加入根据本发明所述的悬浮液中。
本发明的组合物中的优选增溶剂为泊洛沙姆188和聚山梨酯20。泊洛沙姆188和聚山梨酯20常用作药物组合物中的增溶剂。在某些实施例中，在形成RPC之前，将泊洛沙姆188和/或聚山梨酯20加入组合物中。即，可以在蛋白质与络合剂在所述缓冲溶液中接触之前将泊洛沙姆188和/或聚山梨酯20加入缓冲溶液中。在某些实施例中，泊洛沙姆188和/或聚山梨酯20以在0.01％(w/v)至1％(w/v)范围内、在0.01％(w/v)至0.5％(w/v)范围内、在0.01％(w/v)至0.1％(w/v)范围内或在0.02％(w/v)至0.06％(w/v)范围内的浓度存在于缓冲溶液中。
在其他实施例中，可以在RPC形成之后将泊洛沙姆188和/或聚山梨酯20加入组合物(特别是本发明的任意悬浮液)中。即，在某些实施例中，可以在喷雾干燥步骤之前将泊洛沙姆188和/或聚山梨酯20加入包含RPC的组合物或富集的RPC悬浮液中。在某些实施例中，泊洛沙姆188和/或聚山梨酯20可以以在0.1mg/mL至2mg/mL范围内、在0.1mg/mL至1mg/mL范围内或在0.5mg/mL至1mg/mL范围内的浓度加入根据本发明所述的悬浮液中。
在某些实施例中，包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液不含稳定剂和/或增溶剂。即，在某些实施例中，包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液包含一种或多种稳定剂，但不含增溶剂。在其他实施例中，包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液包含一种或多种增溶剂，但不含稳定剂。在另外的实施例中，包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液不含增溶剂和稳定剂。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中该方法包括以下进一步的步骤：交换包含RPC的悬浮液的液体级分。
即，可以将包含RPC的悬浮液的液体级分替换为另一种液体。技术人员知道用于交换悬浮液的液体级分的方法。
例如，可通过离心来交换包含RPC的悬浮液的液体级分。即，可以以适当的速度离心包含RPC的悬浮液以促进RPC的沉降。随后，可以将沉降的RPC重悬于另一种液体中。离心和重悬步骤可重复1次、2次、3次、4次、5次或更多次。优选地，将沉降的RPC重悬于缓冲溶液或水中。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中包含RPC的悬浮液的液体级分通过离心包含RPC的悬浮液并且将沉降的RPC重悬于缓冲溶液或水中来交换。
替代性地，可通过透析来交换包含RPC的悬浮液的液体级分。透析可以但不限于在透析小柱或在透析管中进行。技术人员能够选择基于RPC中包含的蛋白质的大小来选择透析小柱或透析管的合适的截留分子量，使得RPC保留在透析小柱或透析管中。优选地，透析小柱或透析管可具有在10kDa至10,000kDa范围内的截留分子量。RPC的透析可相对于任何液体、优选相对于缓冲溶液或水进行。透析步骤可重复1次、2次、3次、4次或5次。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中包含RPC的悬浮液的液体级分通过相对于缓冲溶液或水透析包含RPC的悬浮液来交换。
在某些实施例中，将包含RPC的悬浮液液体级分与缓冲溶液交换。在某些实施例中，缓冲溶液可以与在RPC形成之前蛋白质和/或络合剂已溶于其中的缓冲溶液具有相似或相同的组成。即，在某些实施例中，可以将包含RPC的悬浮液的液体级分与新鲜缓冲溶液交换。新鲜缓冲溶液是其中不包含蛋白质、络合剂和/或RPC的缓冲溶液。在某些实施例中，新鲜缓冲溶液可以是本文所公开的缓冲溶液中的任一者。在某些实施例中，可以将包含RPC的悬浮液的液体级分与20mM组氨酸缓冲剂(pH 5)交换。
在某些实施例中，将包含RPC的悬浮液的液体级分与水交换。本发明人出人意料地发现，相对于超纯水透析RPC产生了直径在纳米范围内的非常小的颗粒。此类小RPC对于通过注射器向患者施用特别有吸引力。即，在一个优选实施例中，相对于超纯水对RPC进行渗析。
术语“水”是指具有化学式H2O的化合物。在本发明的意义上，水不含或基本上不含溶质。优选地，在本发明的方法中使用的水为蒸馏水和/或去离子水。
在某些实施例中，在本发明的方法中使用的水为超纯水。如本文所用的术语“超纯水”意指已尽可能多地去除杂质并且比电阻为16MΩ·cm或更高的水。在某些实施例中，术语“超纯水”意指具有至少17MΩ·cm的比电阻的水。在某些实施例中，术语“超纯水”意指具有至少18MΩ·cm的比电阻的水。术语“超纯水”涵盖超纯级水(MilliQ水)。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中该方法包括以下进一步的步骤：富集悬浮液中的RPC，以获得富集的RPC悬浮液。
本发明的方法可包含以下进一步的步骤：富集悬浮液中的RPC。即，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中富集悬浮液中的RPC包含以下步骤：(a)离心包含RPC的悬浮液，以获得包含富集的RPC悬浮液的上清液和沉淀物；以及(b)从沉淀物中除去上清液，以获得富集的RPC悬浮液。
悬浮液中的RPC可通过本领域已知的任何方法来富集。优选地，悬浮液中的RPC通过离心来富集。悬浮液中的RPC比悬浮液的可溶性组分具有更高的密度。因此，悬浮液的离心将导致RPC向离心容器底部迁移。因此，彻底离心将导致在容器底部形成包含RPC的沉淀物或沉淀以及基本上不含RPC的上清液。如果在离心步骤之后，上清液中包含样品中的小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的RPC，则称该上清液“基本上不含”RPC。技术人员知道，上清液中RPC的浓度取决于离心步骤的持续时间和速度。
为富集悬浮液中的RPC，可以在离心步骤后部分或完全除去上清液。即，在某些实施例中，将上清液部分从离心容器中部分除去，并且随后将沉淀物重悬于剩余上清液中以获得富集的悬浮液。在其他实施例中，可以从离心容器中完全除去上清液，并且可以将沉淀物重悬于加入离心容器中的液体中。在某些实施例中，该液体具有比在第一步中除去的上清液更低的体积。沉淀物重悬于其中的液体可以与在其中形成RPC的缓冲溶液相同，也可以与在其中形成RPC的缓冲溶液不同。
如本文所用的术语“离心”是指在设备的区室内旋转，该区室绕轴旋转以实现分离材料的目的。如本文所用的术语“沉淀物”是指能够与悬浮液的流体部分物理分离的任何固体或半固体材料。如本文所用的术语“上清液”描述了悬浮液中在颗粒(例如RPC)沉降到容器底部之后的流体部分。
除离心之外，还可以使用其他方法获得富集的包含RPC的悬浮液。例如，在某些实施例中，富集的悬浮液可通过使悬浮液中的RPC通过重力沉降并且倾析上清液来获得。在其他实施例中，富集的包含RPC的悬浮液可通过过滤和/或透析包含RPC的悬浮液来获得。
技术人员知道离心以获得富集的RPC悬浮液的方法。进一步，技术人员知道，富集的RPC悬浮液中RPC的浓度至少取决于离心速度、离心时间和RPC重悬于其中的液体体积。因此，技术人员能够调整离心方法，使得可获得具有所需的蛋白质浓度的富集的RPC悬浮液。
在本发明内，可富集悬浮液中的RPC以获得高于50mg/mL的蛋白质浓度。优选地，可富集悬浮液中的RPC以获得在50mg/mL与300mg/mL之间的蛋白质浓度。更优选地，可富集悬浮液中的RPC以获得在50mg/mL与250mg/mL之间的蛋白质浓度。最优选地，可富集悬浮液中的RPC以获得在100mg/mL与250mg/mL之间的蛋白质浓度。
必须注意，富集步骤可以在交换包含RPC的悬浮液的液体级分之前或之后执行。即，在某些实施例中，可首先交换包含RPC的悬浮液的液体级分，并且随后富集所获得的悬浮液中的RPC。例如，可在第一步将包含RPC的悬浮液的液体级分相对于超纯水进行渗析，然后可在第二步通过离心将所得悬浮液中的RPC富集至所需的浓度。
在某些实施例中，可首先将悬浮液中的RPC富集至所需的浓度，然后在第二步将富集的悬浮液的液体级分通过离心和重悬或通过透析来交换。
在某些实施例中，可以在交换包含RPC的悬浮液的液体级分的同时富集RPC。即，RPC可通过离心来沉降，随后重悬于较小体积的新鲜缓冲溶液或超纯水中。任选地，可以在最终重悬于较小的体积中时，将RPC洗涤一次或多次。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中富集的RPC悬浮液的液体级分在富集步骤期间至少部分地被替换为非水性溶剂。
在离心步骤之后，可以从离心容器中部分或全部移除上清液并且替换为非水性溶剂。即，在某些实施例中，可以在离心步骤之后全部移除上清液，并且可以将包含RPC的沉淀物重悬于非水性溶剂中。在其他实施例中，可以在离心步骤之后部分地移除上清液，并且可以将沉淀物重悬于剩余上清液与非水性溶剂的混合物中。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中非水性溶剂为表4中的任一者，但优选地为三醋精、二甘醇单乙醚或油酸乙酯。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中该方法包括以下进一步的步骤：冻干包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液以获得冻干物。
在额外的步骤中，可以将包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液冻干。本发明人已经证明，冻干RPC可复溶，使得它们在5℃、25℃或40℃储存至少4周后有效解离(表12)。此外，冻干RPC至少4周是稳定的，而不显著地形成蛋白质聚集体或发生蛋白质降解(表13)。因此，从包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液获得的冻干物适于以更长时间储存治疗性蛋白质，而无需完整冷链。
如本文所用的术语“冻干”是指“冷冻干燥”过程，其包含使水从冷冻状态转化为气态而不经过液态。冷冻干燥过程去除含水材料中的水分，同时材料保持冷冻状态。冻干的基本过程包含以下步骤：冷冻、初级干燥(升华)和二级干燥(脱附)。首先，将溶解和/或悬浮物质在低温(例如，-60℃)下冷冻。缓慢冷冻产生更大的晶体，使升华物质逸出。一些产物形成玻璃状材料，并且在冷冻过程中可能需要退火。退火是指首先降低温度，再提高温度，然后再次降低温度，将成分锁定于原位，然后使晶体生长。冷冻时间可在1小时至24小时的范围内，具体取决于应用。在步骤2(初级干燥)中，然后经由真空提取水或稀释剂，从而产生多孔的干燥的“饼状物”。升华在真空下发生，产物温度低于其临界温度。这通常是耗时最长的过程。在初级干燥循环结束时，产物将具有3％至5％的水分含量。采用最终干燥步骤(二级干燥)来去除残留的未冷冻的水分子。该过程通过加热产物来完成。二级干燥可导致水分含量为约0.5％。术语“冻干物”是指冻干步骤的冻干产物。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在冻干步骤之前，将至少一种冷冻保护剂加入包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中。
为保护RPC中包含的蛋白质在冻干步骤中免受损害，可以在冻干步骤之前向悬浮液中加入冷冻保护剂。
本文中使用的术语“冷冻保护剂”与术语“冻干保护剂”类似，用于描述保护冻干材料的分子。已知作为冻干保护剂的分子通常是多羟基化合物，诸如糖(单糖、二糖和多糖)、多元醇及其衍生物。海藻糖和蔗糖是天然的冻干保护剂。如本文所用的术语“冻干保护剂”包括在干燥过程中为生物活性化合物提供稳定性的试剂，例如，通过提供无定形玻璃态介质和通过氢键与蛋白质结合以取代在干燥过程中去除的水分子来实现。这有助于维持蛋白质的构象，最大程度减少干燥循环期间的蛋白质降解，并且改善产物的长期稳定性。冻干保护剂的非限制性实例包括：糖，诸如蔗糖或海藻糖；氨基酸，诸如谷氨酸一钠、非结晶甘氨酸或组氨酸；甲胺，诸如甜菜碱；易溶盐，诸如硫酸镁；多元醇，诸如三元或更高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、赤藓糖醇、甘油(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；普郎尼克类；以及它们的组合。加入制剂中的冻干保护剂的量通常是在干燥蛋白质制剂时不会导致不可接受的蛋白质降解/聚集量的量。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中至少一种冷冻保护剂选自由以下项组成的组：糖、氨基酸、甲胺、易溶盐、多元醇、丙二醇、聚乙二醇和普郎尼克类。在某些实施例中，冷冻保护剂为糖，特别是蔗糖。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在冻干步骤之前，将包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的蛋白质浓度调节至10mg/mL至100mg/mL，特别是调节至40mg/mL至80mg/mL。
冻干步骤可以用任何悬浮液执行。本发明人已经证明，冻干蛋白质浓度为60mg/mL的富集的RPC悬浮液不会显著降低RPC的稳定性和/或解离效率。因此，优选的是，冻干步骤用其中蛋白质浓度调节至10mg/mL至100mg/mL的包含RPC的悬浮液执行。更优选地，将包含RPC的悬浮液中的蛋白质浓度调节至40mg/mL至80mg/mL。最优选地，将包含RPC的悬浮液中的蛋白质浓度调节至60mg/mL。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中该方法包括以下进一步的步骤：喷雾干燥包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液以获得喷雾干燥的粉末。
除冻干之外，可以将包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液喷雾干燥以获得固体组合物，在这种情况下为喷雾干燥的粉末。
如本文所用的术语“喷雾干燥”是指使用喷雾干燥器由溶液或悬浮液产生包含微米级颗粒的干粉的方法。喷雾干燥在原则上是一种溶剂萃取过程。将待获得的产物的成分溶解/分散在液体中，然后例如使用蠕动泵进料至喷雾干燥器的雾化器中。可用于液体雾化的合适的雾化器包括喷嘴或旋转圆盘。对于喷嘴，由于压缩气体的作用而发生雾化，而在使用旋转圆盘的情况下，由于圆盘的快速旋转而发生雾化。在这两种情况下，雾化均导致液体破碎成小液滴进入干燥室中，其中从气溶胶液滴中提取并且排出溶剂，例如通过排放管排放到溶剂阱中。
可通过喷雾干燥产生1pm至500pm的液滴尺寸。当溶剂(水或有机溶剂)干燥时，含纳米颗粒的液滴干燥成微米级颗粒，形成粉末状颗粒。
许多可商购获得的喷雾干燥仪可用于制备本发明的组合物，例如，合适的机器由Buchi和Niro制造。合适的喷雾干燥仪的实例包括来自Buchi的实验室规模的喷雾干燥仪，诸如小型喷雾干燥仪290或MOBILE MINORTM，或来自Niro的制药级喷雾干燥机
Figure BDA0004041476750000461
，或来自Procept NV的4M8-TriX。
在典型的喷雾干燥机中，待干燥的悬浮液从搅拌的储液罐泵送至雾化室，其中它从喷嘴作为细小的液滴喷射到加热的气流中，例如，入口温度在50℃至250℃的范围内(如果存在产物发生不希望的氧化的风险，可使用氮气代替空气)。加热空气的温度必须足以蒸发液体并且将微粒干燥成自由流动的粉末，但不应过高以致产物降解。微粒可以收集在旋风分离器或过滤器或旋风分离器与过滤器的组合中。
在喷雾干燥步骤之前，可以将包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液调节至特定的蛋白质浓度。即，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前，将包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的蛋白质浓度调节至1mg/mL至10mg/mL，特别是调节至1mg/mL至5mg/mL。
本发明人已经证明，悬浮液中的蛋白质浓度对喷雾干燥颗粒的尺寸具有影响。当重悬于液体中时，具有较小尺寸的颗粒可以促进喷雾干燥粉末的可注射性。因此，在某些实施例中，优选的是，包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的蛋白质浓度低于10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL或1mg/mL。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分。
即，可以在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液相。悬浮液的液相的交换可通过但不限于透析来实现。
如本文所用的术语“透析”是指溶解的溶质在选择性渗透膜上相对于浓度梯度扩散以实现平衡。当小溶质穿过膜时，较大的溶质和颗粒诸如RPC被捕集在一侧。通过更换膜外侧的渗析液缓冲剂，可连续去除较小的溶质以纯化所捕集的较大的分子。
可使用几轮透析进行缓冲剂交换。一般来说，当缓冲剂多次(例如2次或3次)替换时，透析将是最有效的，然后优选地在搅拌板上于室温放置过夜。标准透析方案为16小时至24小时。许多因素影响透析速率，包括：扩散系数、pH、温度、时间、物质的浓度、样品体积、透析液(缓冲液)体积、透析液更换次数、膜表面积、膜厚、分子电荷和透析液搅拌(搅拌)。几种类型的透析膜可通过商购获得并且是本领域所熟知的。例示性地非限制性实例为聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、纤维素酯(CE)膜和再生纤维素(C)膜。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分降低悬浮液中的至少一种缓冲剂、络合剂、稳定剂和/或增溶剂的浓度。
在某些实施例中，希望喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量尽可能高。因此，可能希望在喷雾干燥步骤之前减少悬浮液中的非蛋白质组分。
本发明在实例2.2中已经证明，可以在不存在缓冲剂的情况下获得喷雾干燥的粉末，其中蛋白质的完整性不受显著影响。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在交换悬浮液的液体级分之后，包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液基本上不含缓冲剂。在某些实施例中，RPC可以在喷雾干燥步骤之前相对于超纯水渗析。
应当理解，由于透析期间的稀释效应，不可能从悬浮液的液体级分中完全去除缓冲剂。因此，如果在喷雾干燥步骤之前，悬浮液中的缓冲剂的浓度低于5mM、低于4mM、低于3mM、低于2mM、低于1mM、低于0.5mM、低于0.1mM或低于0.01mM，则称悬浮液基本上不含缓冲剂。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中交换包含RPC的悬浮液的液体级分或富集的RPC悬浮液使包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中的缓冲剂的浓度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、至少95％或至少99％。
进一步，在实例2.2中已经证明，可通过在喷雾干燥步骤之前降低悬浮液中的络合剂、表面活性剂和/或稳定剂的浓度来提高喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量，而不影响蛋白质的稳定性。
即，在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分，以使包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中的络合剂的浓度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分，以使包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中的络合剂的浓度降低20％至50％，更优选地降低30％至40％，最优选地降低33％。
在另外的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分，以使包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中的稳定剂的浓度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分，以使包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中的稳定剂的浓度降低30％至70％，更优选地降低40％至60％，最优选地降低50％。
在另外的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分，以使包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中的增溶剂的浓度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液的液体级分，以使包含RPC的悬浮液或富集的RPC悬浮液中的稳定剂的浓度降低30％至70％，更优选地降低40％至60％，最优选地降低50％。
因此，减少悬浮液中的络合剂将导致蛋白质与络合剂之间的摩尔-电荷比减小。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换悬浮液的液体级分，以获得在1:0.2与1:1之间、特别是在1:0.4与1:0.8之间的蛋白质与络合剂之间的摩尔-电荷比。
在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换悬浮液的液体级分，以获得在1:0.2至1:1之间、更优选地在1:0.2至1:0.6之间、甚至更优选地在1:0.2至1:0.4之间、最优选地约1:0.2的蛋白质与络合剂硫酸软骨素之间的摩尔-电荷比。
在另一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前交换悬浮液的液体级分，以获得在1:0.2至1:1之间、更优选地在1:0.4至1:0.8之间、甚至更优选地在1:0.5至1:0.7之间、最优选地约1:0.6的蛋白质与络合剂硫酸葡聚糖之间的摩尔-电荷比。
喷雾干燥的粉末可以在不导致RPC中包含的蛋白质聚集或破坏的任何条件下获得。技术人员能够通过常规实验优化喷雾干燥条件以防止蛋白质破坏和/或聚集，并且知道在喷雾干燥步骤之后确定RPC中的蛋白质稳定性的方法(参见实例1.2.8和2.2)。
本发明人在实例2.2中已经证明，在115℃的入口温度、48℃的出口温度和17mL/min的流速下喷雾干燥引起包含RPC的喷雾干燥粉末的形成，其中RPC中包含的蛋白质是稳定的。
因此，喷雾干燥可以在50℃至250℃、优选100℃至200℃、更优选100℃至150℃、甚至更优选100℃至130℃范围内、最优选115℃的入口温度进行。
进一步，喷雾干燥可以在40℃至150℃、优选40℃至100℃、更优选40℃至80℃、甚至更优选40℃至60℃范围内、最优选48℃的出口温度进行。
进一步，喷雾干燥可以在1mL/min至35mL/min、优选5mL/min至30mL/min、更优选10mL/min至25mL/min、甚至更优选15mL/min至20mL/min范围内、最优选17mL/min的流速下进行。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中喷雾干燥在90℃至250℃范围内的入口温度、40℃至150℃范围内的出口温度和/或1mL/min至35mL/min范围内的流速下进行。
在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中喷雾干燥在100℃至200℃范围内的入口温度、40℃至100℃范围内的出口温度和/或5mL/min至30mL/min范围内的流速下进行。
在一个更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中喷雾干燥在100℃至150℃范围内的入口温度、40℃至80℃范围内的出口温度和/或10mL/min至25mL/min范围内的流速下进行。
在一个甚至更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中喷雾干燥在100℃至130℃范围内的入口温度、40℃至60℃范围内的出口温度和/或15mL/min至20mL/min范围内的流速下进行。
在一个最优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中喷雾干燥在115℃的入口温度、48℃的出口温度和/或17mL/min的流速下进行。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中喷雾干燥在115℃的入口温度和/或48℃的出口温度进行。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中喷雾干燥在17mL/min的进料速率下进行。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，，其中该方法包括以下进一步的步骤：将喷雾干燥的粉末重悬于非水性溶剂(NAS)中以获得RPC-NAS悬浮液。
即，可以将包含RPC的喷雾干燥的粉末重悬于非水性溶剂(NAS)中以获得RPC-NAS悬浮液。发明人在实例2.3中已经证明，包含RPC的喷雾干燥粉末可重悬于非水性溶剂中，以获得具有高蛋白质浓度的悬浮液。特别是，已经证明，与通过将喷雾干燥的RPC重悬于水性溶剂中获得的悬浮液相比，RPC-NAS悬浮液的粘度明显更低。
术语“RPC-NAS悬浮液”是指包含固体颗粒(在这种情况下为RPC)与液相的异质混合物。液相包含至少一种非水性溶剂或由其组成。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中非水性溶剂为选自由以下项组成的组中的至少一者：二甘醇单乙醚、油酸乙酯、三醋精、异山梨醇二甲醚和四氢呋喃聚乙二醇醚。
喷雾干燥的RPC重悬于其中的非水性溶剂可以是本领域已知的任何非水性溶剂，其使蛋白质保持在稳定和非聚集形式，并且不干扰RPC在生理条件下的后续解离。进一步，优选的是，NAS为欧盟/或美国药典中包含的NAS。
二甘醇单乙醚(CAS号111-90-0；C2H5OCH2CH2OCH2CH2OH)，也称为
Figure BDA0004041476750000511
，是一种在化妆品和非处方外用产品中具有悠久的使用历史的液体。
Figure BDA0004041476750000512
已被应用于几种商业制剂中，并且在许多研究中用作制剂的主要成分。
油酸乙酯(CAS号111-62-6，CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7COOC2H5)是由油酸和乙醇缩合形成的脂肪酸酯。油酸乙酯用作包含亲脂性物质诸如类固醇的药物制剂的溶剂。它还用作润滑剂和增塑剂。
甘油三酯1,2,3-三乙酰氧基丙烷(CAS号102-76-1，C9H14O6)通常称为三醋精、三乙酸甘油酯或1,2,3-三乙酰基甘油。它是甘油与乙酰化剂诸如乙酸和乙酸酐的三酯。它是一种人造化合物，通常用作食品添加剂，例如作为调味剂中的溶剂，并且具有保湿功能，E编号为E1518并且澳大利亚批准代码为A1518。它用作药物产品中的赋形剂，在其中用作保湿剂、增塑剂和溶剂。
异山梨醇二甲醚(CAS号5306-85-4；C8H14O4)是一种可持续的溶剂，广泛用于各种化妆品和药物制剂中。
四氢呋喃聚乙二醇醚(CAS号：31692-85-0)也称为四甘醇或四氢糠醇聚乙二醇醚，是一种非水性溶剂，经常用作静脉注射或肌内注射用肠胃外产品中的溶剂。
本发明人在实例2.3中已经证明，Transcutol、油酸乙酯和三醋精特别适于产生RPC-NAS悬浮液，因为它们引起高蛋白质稳定性以及低水平的蛋白质聚集。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中非水性溶剂为选自由以下项组成的组中的至少一者：二甘醇单乙醚、油酸乙酯和三醋精。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的方法，其中将喷雾干燥的粉末重悬，以获得蛋白质浓度在50mg/mL至300mg/mL、优选100mg/mL至250mg/mL范围内的RPC-NAS悬浮液。
技术人员知道用于产生具有特定蛋白质浓度的RPC-NAS悬浮液的方法。特别是，可通过将限定量的喷雾干燥的RPC重悬于限定量的非水性溶剂中来产生具有特定蛋白质浓度的RPC-NAS悬浮液。
在另一方面，本发明涉及包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物，其中该组合物通过根据本发明所述的方法获得。
即，本发明涉及一种已通过上文以任意组合所述的方法中的任一者所获得的包含RPC的组合物。特别是，本发明涉及一种包含RPC的组合物，其中RPC包含络合剂硫酸葡聚糖和/或硫酸软骨素。
因此，在另一方面，本发明涉及一种包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物，其中RPC包含蛋白质和络合剂，并且其中络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中络合剂为硫酸葡聚糖，特别是分子量为40kDa的硫酸葡聚糖。
即，络合剂可以是上文已公开的络合剂中的任一者。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中蛋白质为抗体、生长因子、激素、细胞因子、酶或前述任一者的片段和/或融合蛋白。
进一步，RPC中包含的蛋白质可以是上文已公开的蛋白质中的任一者。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体-药物缀合物或抗体片段。
本发明的组合物中包含的蛋白质优选地为基本上纯的并且预期是基本上均质的(即，不含污染蛋白质)。“基本上纯的”意指本发明的组合物中的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的蛋白质具有相同的氨基酸序列。相应地，优选的是，本发明的组合物中的RPC中包含的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的蛋白质具有相同的氨基酸序列。即，本发明的组合物可包含多于一种类型的蛋白质。
组合物中的RPC主要通过静电相互作用得到稳定。因此，优选的是，在带正电荷的蛋白质与一种或多种带负电荷的络合剂之间形成RPC。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中蛋白质在包含于RPC中时具有净正电荷。在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中络合剂在包含于RPC中时具有负电荷。
本发明的组合物可包含一种或多种赋形剂，特别是稳定剂和/或表面活性剂。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中组合物包含至少一种赋形剂。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中至少一种赋形剂为稳定剂和/或表面活性剂。赋形剂、稳定剂和增溶剂的实例在上文给出。
本发明人已经证明，当蛋白质包含于RPC中时，蛋白质的热稳定性更高。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中蛋白质在包含于RPC中时与未络合的蛋白质相比具有更高的解链温度。
蛋白质的解链温度，也称为变性中点，定义为折叠和展开状态在平衡时同等填充的温度(Tm)(假设双态蛋白质折叠)。Tm可使用热漂移测定法来确定。实例1.9中更详细地描述了用于确定蛋白质的Tm的不同的热漂移测定法，即微量差示扫描荧光法(nanoDSF)和差示扫描量热法(DSC)。
如果蛋白质并非与络合剂的络合物的一部分，特别是并非与络合剂硫酸软骨素和/或硫酸葡聚糖的络合物的一部分，则称其处于非络合态。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含蛋白质和络合剂的RPC在生理pH和离子强度下解离。
本发明人出人意料地发现，包含作为络合剂的硫酸葡聚糖和/或硫酸软骨素的RPC在生理pH和离子强度下解离。因此，可以将包含本发明的RPC的液体制剂施用于受试者，使得它们在施用部位解离，因此导致在所述受试者中释放未络合的蛋白质。
如本文所用的术语“生理pH”是指哺乳动物身体的组织和器官细胞中的正常pH。例如，人体的生理pH通常为约7.4，但哺乳动物体内的正常生理pH可以是约7.0至约7.8的任何pH。
如本文所用的术语“生理离子强度”指哺乳动物身体的组织和器官细胞中的正常pH。例如，人体的生理离子强度通常为约0.15mol/L。
因此，如果样品中的至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的络合物在生理pH和离子强度下解离成可溶性蛋白质，则称蛋白质络合物在生理pH和离子强度下解离。
在本发明内，使用pH为7.4并且离子强度为0.137mol/L的磷酸盐缓冲盐水(PBS)模拟生理条件。本发明人已经证明，包含不同蛋白质的RPC在PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中以至少96％的解离效率解离(参见实例3.1)。因此，本发明的可逆蛋白质络合物在生理条件下解离是合理的，因此可以以适当的制剂和经由适当的施用途径(例如，皮下施用)直接应用于受试者。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含蛋白质和络合剂的RPC在10mM至100mM PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中解离。
本发明人已经证明，将包含RPC的悬浮液用10mM或100mM PBS(pH 7.4，137mM至1370mM NaCl)稀释至蛋白质浓度为1mg/mL引起RPC的解离。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含蛋白质和络合剂的RPC在10mM PBS(pH7.4,137mM NaCl)中稀释至蛋白质浓度在0.1mg/mL至10mg/mL范围内、优选在0.1mg/mL至5mg/mL范围内、更优选在0.1mg/mL至2mg/mL范围内、最优选1mg/mL时发生解离。
在一个替代实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含蛋白质和络合剂的RPC在100mM PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中稀释至蛋白质浓度在0.1mg/mL至10mg/mL范围内、优选在0.1mg/mL至5mg/mL范围内、更优选在0.1mg/mL至2mg/mL范围内、最优选1mg/mL时发生解离。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中组合物为悬浮液。
即，在某些实施例中，本发明的RPC可配制为悬浮液。在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液用根据本发明所述的方法获得。
悬浮液可具有任何蛋白质浓度。但是，优选的是本发明的悬浮液适于经皮下施用于受试者，其在理想情况下要求悬浮液中的蛋白质浓度为至少100mg/mL。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液中的蛋白质浓度在50mg/mL至250mg/mL的范围内。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液中的蛋白质浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内。
本文公开了用于获得具有要求保护的蛋白质浓度的悬浮液的方法以及用于确定悬浮液中的蛋白质浓度的方法。本文描述了用于确定悬浮液中的蛋白质浓度的方法。例如，悬浮液中的蛋白质浓度可通过用10mM PBS(pH 7.4,137mM NaCl)制备悬浮液的连续稀释液并且通过本领域已知的任何方法(诸如紫外-可见分光光度法(NanoDrop)或Bradford测定法)来测量稀释液中的蛋白质浓度来确定。具有所需的蛋白质浓度的悬浮液可通过富集或稀释悬浮液来获得，如本文所公开。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液包含未络合的络合剂。
即，在某些实施例中，本发明的悬浮液可包含过量的络合剂，优选地，其中未络合的络合剂溶于悬浮液的液体级分中。在某些实施例中，未络合的络合剂是RPC中包含的同一络合剂。在某些实施例中，络合剂以在0.1mM至100mM范围内、优选在0.1mM至10mM范围内、更优选在0.1mM至1mM范围内、最优选在0.2mM至0.6mM范围内的浓度包含于悬浮液的液体级分中。
优选地，络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素。即，在某些实施例中，悬浮液的液体级分包含浓度在0.1mM至100mM范围内、优选在0.1mM至10mM范围内、更优选在0.1mM至1mM范围内、最优选在0.2mM至0.6mM范围内的硫酸葡聚糖。在其他实施例中，悬浮液的液体级分包含浓度在0.1mM至100mM范围内、优选在0.1mM至10mM范围内、更优选在0.1mM至1mM范围内、最优选在0.2mM至0.6mM范围内的硫酸软骨素。
可在通过络合至悬浮液形成RPC后或当交换悬浮液的液体级分时将额外的络合剂加入悬浮液中。
本发明的悬浮液中的RPC可具有任何粒径。但是，认为包含较小RPC的悬浮液与包含较大RPC的悬浮液相比具有更高的可注射性。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含于悬浮液中的RPC具有在5μm至20μm范围内的平均粒径。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含于悬浮液中的RPC具有在6μm至12μm范围内的平均粒径。
本发明人已经出人意料地发现，相对于超纯水透析RPC产生特别小的RPC(参见例如图20)。即，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含于悬浮液中的RPC具有在100nm至4000nm范围内的平均粒径，特别是其中包含于悬浮液中的RPC具有在150nm至2000nm范围内的平均粒径。
在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中包含于悬浮液中的RPC具有在0.1μm至20μm范围内的平均粒径，特别是其中包含于悬浮液中的RPC具有在0.1μm至12μm范围内的平均粒径。
如本文所用的术语“平均粒径”通常是指组合物中颗粒的统计平均粒径(直径)。基本上呈球形的颗粒的直径可以称为物理或流体动力学直径。非球形颗粒的直径可以优先指流体动力学直径。如本文所用，非球形颗粒的直径可以指颗粒表面上两点之间的最大直线距离。平均粒径可使用本领域已知的方法诸如动态光散射、激光衍射分析(参见实例1.2.5)或扫描电子显微镜(SEM)来测量。
优选的是，通过注射将包含RPC的悬浮液直接施用于受试者。即，本发明的悬浮液优选地可通过本领域常用的针头来注射。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液通过26G针头来注射。
如本文所用的术语“26G针头”是指26号针头。如本文所用的术语“规格(gauge)”旨在提供用于注射器针头的常用数值规格系统的内径和外径的参考。有利地，本发明的组合物可通过具有至少26号规格的小规格针头来注射。26G针头具有的外径为0.4636mm。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液在4℃和/或25℃至少4周是稳定的。
在本发明内，如果RPC中包含的蛋白质在RPC解离后保持其原始大小、结构和/或功能，则称包含RPC的悬浮液是稳定的。
本发明人已经证明，悬浮液在4℃和/或25℃保持稳定至少4周(参见实例5.2)。例如，在悬浮液在4℃或25℃储存至少4周后，仅观察到低水平的蛋白质降解和/或聚集(表13)。
在一个优选的实施例中，如果在悬浮液中的RPC解离后，悬浮液中至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的蛋白质呈单体形式(优选地当通过体积排阻色谱(SEC)测量时)，则称悬浮液是稳定的。
替代性地，如果当通过离子交换色谱(IEC)进行分析并且比较RPC形成之前和RPC解离之后时，蛋白质的主峰百分比差异不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，则称悬浮液是稳定的。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液具有在2厘泊至20厘泊(cP)范围内、特别是在3cP至15cP范围内的粘度(在20℃测量时)。
在本发明内，优选的是，悬浮液具有低粘度以利于悬浮液的可注射性。本发明人已经证明，蛋白质浓度高达120mg/mL的悬浮液具有小于20cP的粘度，因此可通过26G针头注射。
1厘泊换算为SI单位时等于1毫帕-秒(mPa·s)(1cP＝10-2P＝10-3Pa·s)。厘泊适当地缩写为cP。水在25℃时的粘度为0.0089泊，或在20℃时为1厘泊。流体的粘度可以用流变仪测量，如实例1.2.7中所述。
为确保悬浮液中RPC的完整性，优选的是，悬浮液具有低于蛋白质的等电点并且高于络合剂的pKa的pH。
因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液的pH低于蛋白质的等电点。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液的pH低于蛋白质的等电点2至5个pH单位，特别是其中悬浮液的pH低于蛋白质的等电点3个pH单位。
即，在某些实施例中，将悬浮液的pH调节为低于RPC中包含的蛋白质的等电点。pH低于蛋白质的等电点产生带正电荷的蛋白质，并且因此阻止了悬浮液中RPC的解离。
在某些实施例中，蛋白质为抗体。抗体具有在6至9范围内的等电点。为维持抗体带正电荷，优选的是悬浮液具有在1至6范围内、优选4.5至5.5范围内的pH。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液的pH在1至6的范围内，特别是其中悬浮液的pH在4.5至5.5的范围内。
在某些实施例中，悬浮液包含缓冲剂。悬浮液可包含任何可以维持悬浮液中的RPC而不影响RPC或其中包含的蛋白质的稳定性的缓冲剂。可用于本发明的组合物中的缓冲剂包括但不限于甲酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苹果酸盐、吡啶、哌嗪、二甲胂酸盐、琥珀酸盐、MES、马来酸盐、组氨酸、Bis-Tris、磷酸盐、乙醇胺、ADA和碳酸盐。
已经证明，包含缓冲剂组氨酸的悬浮液能够长时间保持稳定并且具有低粘度，其允许通过26G针头注射该悬浮液。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液包含缓冲剂。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液具有在20mM至50mM范围内的离子强度，特别是其中悬浮液具有在20mM至30mM范围内的离子强度。
在某些实施例中，悬浮液包含作为缓冲剂的20mM至50mM的组氨酸或柠檬酸盐。优选地，悬浮液包含作为缓冲剂的20mM至30mM的组氨酸或柠檬酸盐。
在其他实施例中，悬浮液不含缓冲剂。本发明人已经证明，可制备仅包含RPC、络合剂和超纯(MilliQ)水的RPC悬浮液。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液基本上不含缓冲剂。
如果在喷雾干燥步骤之前，悬浮液中的缓冲剂的浓度低于5mM、低于4mM、低于3mM、低于2mM、低于1mM、低于0.5mM、低于0.1mM或低于0.01mM，则称该悬浮液基本上不含缓冲剂。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液的液体级分由超纯(MilliQ)水组成。超纯(MilliQ)水当暴露于空气时具有约5.5的pH。因此，其中液体级分由超纯(MilliQ)水组成的悬浮液优选地包含以下RPC，该RPC包含具有6或更高的等电点的蛋白质。
技术人员知道用于从包含RPC的悬浮液中去除缓冲剂的方法。例如，可相对于不含缓冲剂的液体对包含RPC的悬浮液进行渗析。可重复透析步骤，直至悬浮液基本上不含缓冲剂。如果悬浮液中的缓冲剂的浓度低于1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM、0.01mM，则称该悬浮液基本上不含缓冲剂。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中悬浮液进一步包含非水性溶剂。
在某些实施例中，悬浮液的液体级分可以为水性溶剂与非水性溶剂的混合物。即，水性溶剂与非水性溶剂之间的比率可以为90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90。
悬浮液可包含任何可以维持悬浮液中的RPC而不其包括RPC或其中包含的蛋白质的稳定性的非水性溶剂。在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中非水性溶剂为表4中的任一者，但优选地为三醋精、二甘醇单乙醚或油酸乙酯。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中组合物为冻干物。
即，在某些实施例中，本发明涉及包含本发明的RPC的冻干物。在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中冻干物用根据本发明所述的方法获得。
如本文中与根据本发明所述的组合物结合使用的术语“冻干物”表示通过本领域本身已知的冷冻干燥方法生产的制剂。溶剂(例如水)在真空下通过冷冻后升华，并且残留水在高温下脱附而被移除。在制药领域，冻干物通常具有约0.1％(w/w)至5％(w/w)的残留水分，并且以粉末或物理稳定的饼状物存在。冻干物的特征在于在添加重构介质后迅速溶解。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中冻干物包含缓冲剂。
即，冻干物可包含缓冲剂。优选地，冻干物通过冷冻干燥本发明的悬浮液获得。因此，在一个优选的实施例中，冻干物与本发明的悬浮液包含相同的缓冲剂。更优选地，缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
在某些实施例中，冻干物可不含或基本上不含缓冲剂。特别是，在冻干步骤之前，可以将包含RPC的悬浮液相对于水进行渗析。
冷冻干燥悬浮液可能带来对RPC中包含的蛋白质的破坏。为防止冻干期间破坏蛋白质，可以在冷冻干燥步骤之前将冷冻保护剂加入悬浮液中。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中冻干物包含至少一种冷冻保护剂。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中至少一种冷冻保护剂选自由以下项组成的组：糖、氨基酸、甲胺、易溶盐、多元醇、丙二醇、聚乙二醇和普郎尼克类。
本发明人已经证明，本发明的冻干物在高温下长时间是稳定的。例如，本发明的冻干物已在40℃储存4周。令本发明人惊讶的是，结果表明，在40℃储存4周后，本发明的冻干物中包含的RPC可有效溶解，并且冻干物中包含的蛋白质可完全回收(表12)。进一步，本发明人发现，将冻干物在40℃储存4周后，该冻干物中包含的蛋白质保持稳定。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中冻干物在40℃可保持稳定至少4周。在一个替代实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中冻干物在5℃和/或25℃至少4周是稳定的。
在本发明内，如果RPC中包含的蛋白质在RPC解离后保持其原始大小、结构和/或功能，则称包含RPC的冻干物是稳定的。
因此，在一个优选的实施例中，如果在冻干物复溶并且复溶的冻干物中的RPC解离后，冻干物中至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的蛋白质呈单体形式(优选地当通过体积排阻色谱(SEC)测量时)，则称该冻干物是稳定的。当分析蛋白质是否呈单体形式时，RPC优选地在PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中复溶和解离。
替代性地，如果当通过离子交换色谱(IEC)进行分析并且比较RPC形成之前和RPC解离之后时(优选地当冻干物在PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中复溶和解离时)，蛋白质的主峰百分比差异不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，则称该冻干物是稳定的。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中冻干物在液体中复溶至蛋白质浓度在50mg/mL至250mg/mL的范围内，特别是其中冻干物在液体中复溶至蛋白质浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内。
本发明的冻干物可以在施用于受试者之前在液体中复溶。因此，在某些实施例中，本发明的组合物可以为包含本发明的RPC的复溶的冻干物。
如本文所用的术语“复溶”，除非另有说明，是指将冻干物与液体混合以形成液体产物的过程。一旦在液体中复溶，冻干物的成分可通过溶解、分散、悬浮、胶体悬浮、乳化或以其他方式混合中的一种或多种的任意组合存在于液体产物的介质中。因此，所得复溶的液体产物的特征可以在于溶液、分散体、悬浮液、胶体悬浮液、乳液或均相混合物的任意组合。即使冻干物的少量部分(例如，少于10％)在所得液体产物中保持未复溶，也可以说复溶的组合物“经复溶”。
本发明的冻干物可以以任何体积复溶。优选地，本发明的冻干物可在液体中复溶，使得在复溶的冻干物中获得在50mg/mL至250mg/mL范围内的蛋白质浓度。甚至更优选地，本发明的冻干物复溶于液体中，使得在复溶的冻干物中获得在100mg/mL至200mg/mL范围内的蛋白质浓度。
本文公开了用于获得具有要求保护的蛋白质浓度的复溶的冻干物的方法以及用于确定复溶的冻干物中的蛋白质浓度的方法。本文描述了用于确定复溶的冻干物中的蛋白质浓度的方法。例如，复溶的冻干物中的蛋白质浓度可通过用10mM PBS(pH 7.4,137mMNaCl)制备重悬的冻干物的连续稀释液并且通过本领域已知的任何方法(诸如紫外-可见分光光度法(NanoDrop)或Bradford测定法)来测量稀释液中的蛋白质浓度来确定。具有所需的蛋白质浓度的复溶的冻干物可通过将冻干物复溶于特定体积的液体中获得。
优选地，本发明的冻干物在PBS、更优选PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中复溶。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中液体为PBS。
本发明人已经发现，本发明的冻干物可在PBS中复溶，以获得蛋白质浓度为至少130mg/mL的复溶的冻干物(表12)。此外，将冻干物复溶于PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中可能引起冻干物中包含的RPC解离。因此，在某些实施例中，复溶的冻干物为溶液，优选包含PBS的溶液，更优选包含PBS并且蛋白质浓度在50mg/mL至250mg/mL范围内的溶液，最优选包含PBS并且蛋白质浓度在100mg/mL至200mg/mL范围内的溶液。
复溶的冻干物可具有在2cP至20cP、3cP至20cP、4cP至20cP、5cP至20cP、6cP至20cP、7cP至20cP、8cP至20cP、9cP至20cP、或10cP至20cP范围内的粘度。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中重悬的冻干物具有在2cP至20cP范围内、特别是在10cP至20cP范围内的粘度。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中组合物为喷雾干燥的粉末。
即，在某些实施例中，本发明的RPC可配制为喷雾干燥的粉末。在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末用根据本发明所述的方法获得。
本发明人已经出人意料地发现，喷雾干燥本发明的悬浮液可产生蛋白质含量超过40％的喷雾干燥的粉末(参见表3)。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末的蛋白质含量按重量计为至少40％(w/w)、按重量计为至少50％(w/w)、按重量计为至少60％(w/w)。
技术人员知道用于确定喷雾干燥的粉末的蛋白质含量的方法。例如，可将喷雾干燥的粉末在PBS中复溶，以溶解喷雾干燥的粉末中所包含的RPC，并且复溶的蛋白质的浓度可通过本领域已知的任何方法诸如Nanodrop、Bradford测定法等来确定。技术人员能够基于复溶的喷雾干燥的粉末中的蛋白质浓度来计算喷雾干燥的粉末的蛋白质含量。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末包含缓冲剂。
即，喷雾干燥的粉末可包含缓冲剂。优选地，喷雾干燥的粉末通过本发明的喷雾干燥悬浮液获得。因此，在一个优选的实施例中，喷雾干燥的粉末与本发明的悬浮液包含相同的缓冲剂。更优选地，缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
已经证明，在喷雾干燥步骤之前悬浮液中缓冲剂的浓度对喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量具有影响(表3)。即，在喷雾干燥步骤之前悬浮液中缓冲剂的浓度越高，所得喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量越低。为提高喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量，可以在喷雾干燥步骤之前降低悬浮液中缓冲剂的浓度。例如，可以在喷雾干燥步骤之前将悬浮液中缓冲剂的浓度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。即，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末基本上不含缓冲剂。
本发明人已经证明，喷雾干燥不含缓冲剂组氨酸的悬浮液产生蛋白质含量为至少60％的喷雾干燥的粉末(参见表3)。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末已经由包含少于20mM、少于15mM、少于10mM、少于5mM、少于1mM或0mM的缓冲剂的悬浮液获得，特别是其中缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
类似地，本发明人已经证明，在喷雾干燥步骤之前降低悬浮液中络合剂和/或赋形剂的浓度会提高喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量，而不影响喷雾干燥的粉末中的蛋白质的稳定性。
即，在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末已经由包含少于100mg/mL、少于90mg/mL、少于80mg/mL、少于70mg/mL或少于60mg/mL的络合剂的悬浮液获得，特别是其中络合剂为硫酸葡聚糖。
在其他实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末已经由包含少于2.5mg/mL、少于2mg/mL、少于1.75mg/mL、少于1.5mg/mL或少于1mg/mL的稳定剂的悬浮液获得，特别是其中稳定剂为蔗糖。
在其他实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末已经由包含少于0.5mg/mL、少于0.4mg/mL、少于0.3mg/mL或少于0.25mg/mL的增溶剂的悬浮液获得，特别是其中增溶剂为聚山梨酯20。
在一个更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末已经由包含在0mM与20mM之间的组氨酸、在0.5mg/mL与1mg/mL之间的硫酸葡聚糖、在0.5mg/mL与2.5mg/mL之间的蔗糖、在0.1mg/mL与0.5mg/mL之间的聚山梨酯20以及在1mg/mL与10mg/mL之间的RPC的悬浮液获得。
在一个甚至更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末已经由包含在0mM与10mM之间的组氨酸、在0.5mg/mL与0.7mg/mL之间的硫酸葡聚糖、在0.5mg/mL与1.5mg/mL之间的蔗糖、在0.1mg/mL与0.3mg/mL之间的聚山梨酯20以及在1mg/mL与5mg/mL之间的RPC的悬浮液获得。
喷雾干燥的粉末中的颗粒可具有任何尺寸。但是，优选地是喷雾干燥的粉末中的颗粒具有小粒径以便于注射这些颗粒。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末中包含的RPC具有在5μm至50μm范围内的平均粒径。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末中包含的RPC具有在10μm至40μm范围内的平均粒径。在更优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末中包含的RPC具有在20μm至35μm范围内的平均粒径。
在一个替代实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末中包含的RPC具有在10μm至25μm范围内的平均粒径。
在本发明内，如果RPC中包含的蛋白质在RPC重悬和/或解离后保持其原始大小、结构和/或功能，则称包含RPC的喷雾干燥的粉末是稳定的。
因此，在一个优选的实施例中，如果在RPC重悬和/或解离后，喷雾干燥的粉末中至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的蛋白质呈单体形式(优选地当通过体积排阻色谱(SEC)测量时)，则称喷雾干燥的粉末是稳定的。为分析蛋白质是否呈单体形式，RPC优选地溶于PBS(pH 7.4,137mMNaCl)中。
替代性地，如果当通过离子交换色谱(IEC)进行分析并且比较RPC形成之前和RPC重悬和/或解离之后时(优选地当RPC溶于PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中时)，蛋白质的主峰百分比差异不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，则称喷雾干燥的粉末是稳定的。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末在液体中复溶。
本发明的喷雾干燥的粉末可以在施用于受试者之前重悬于液体中。因此，在某些实施例中，本发明的组合物可以是重悬的包含RPC的喷雾干燥的粉末。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中喷雾干燥的粉末重悬于液体中至蛋白质浓度在50mg/mL至300mg/mL的范围内，特别是其中喷雾干燥的粉末在液体中复溶至蛋白质浓度在100mg/mL至250mg/mL的范围内。
本发明的喷雾干燥的粉末可以以任意体积重悬。优选地，本发明的喷雾干燥的粉末重悬于液体中，使得在重悬的喷雾干燥的粉末中获得在50mg/mL至300mg/mL范围内的蛋白质浓度。甚至更优选地，本发明的喷雾干燥的粉末重悬于液体中，使得在重悬的喷雾干燥的粉末中获得在100mg/mL至250mg/mL范围内的蛋白质浓度。
喷雾干燥的粉末可以重悬于任何液体中。但是，优选的是，喷雾干燥的粉末重悬于非水性溶剂中，使得获得RPC-NAS悬浮液。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中液体为非水性溶剂。
在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中非水性溶剂为选自表4的溶剂、由以下项组成的组中的至少一者：二甘醇单乙醚、油酸乙酯、三醋精、异山梨醇二甲酯和四氢呋喃聚乙二醇醚，优选三醋精、二甘醇单乙醚或油酸乙酯。
本发明人已经证明，将RPC重悬于非水性溶剂Transcutol、油酸乙酯或三醋精中对RPC中包含的蛋白质的稳定性无显著影响。因此，在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中非水性溶剂为选自表4的溶剂或由以下项组成的组中的至少一者：二甘醇单乙醚、油酸乙酯、三醋精、异山梨醇二甲酯和四氢呋喃聚乙二醇醚，优选三醋精、二甘醇单乙醚或油酸乙酯。
在本发明内，如果喷雾干燥的粉末中包含的蛋白质在RPC重悬后保持其原始大小、结构和/或功能，则液体适于重悬本发明的喷雾干燥的粉末。
因此，在一个优选的实施例中，如果在RPC解离后，重悬的喷雾干燥的粉末中至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的蛋白质呈单体形式(优选地当通过体积排阻色谱(SEC)测量时)，则称液体适于重悬本发明的喷雾干燥的粉末。为分析蛋白质是否呈单体形式，RPC优选地溶于PBS(pH7.4,137mM NaCl)中。
替代性地，如果当通过离子交换色谱(IEC)进行分析并且比较RPC形成之前和RPC在液体中重悬和解离之后时(优选地当RPC溶于PBS(pH 7.4,137mM NaCl)中时)，蛋白质的主峰百分比差异不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％，则称所述液体适于重悬本发明的喷雾干燥的粉末。
进一步，已经证明，将RPC重悬于非水性溶剂中时，与在水性溶剂中包含相同浓度的RPC的悬浮液相比，具有更低的粘度(参见表4)。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中复溶的喷雾干燥的粉末具有在10cP至300cP、优选20cP至80cP、优选20cP至50cP范围内的粘度。在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中复溶的喷雾干燥的粉末具有在50cP至300cP范围内的粘度。在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中复溶的喷雾干燥的粉末具有在80cP至280cP范围内的粘度。在另一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的组合物，其中复溶的喷雾干燥的粉末具有在100cP至250cP范围内的粘度。
在另一方面，本发明涉及一种药物制剂，该药物制剂包含根据本发明所述的组合物。
在某些实施例中，组合物本身为药物制剂。特别是，包含RPC的悬浮液、富集的RPC悬浮液、复溶的冻干物或RPC-NAS悬浮液可用作药物制剂。
在其他实施例中，药物制剂可通过将固体组合物转变为液体形式来获得。即，在某些实施例中，药物制剂可通过将本发明的冻干物复溶于合适的液体、优选复溶于PBS(pH7.4,137mM NaCl)中来获得。在其他实施例中，药物制剂可通过将本发明的喷雾干燥的粉末重悬于合适的液体、优选非水性溶剂中来获得。
如本文所用的术语“药物制剂”是指包含本发明的可逆蛋白质复合物以及至少一种药用赋形剂的剂型。本文所用的术语“药用”意指适于正常的药物应用，即在患者中不引起不良事件。如本文所用的术语“赋形剂”或“药用赋形剂”意指与活性药物成分的物理和化学特性相容并且不干扰活性药物成分的生物活性的有效性的无毒材料，其通常是安全无毒的，既不是生物学上不可接受的也不是其他层面上不可接受的，并且是兽医以及人类药物用途可接受的。如本说明书中所用的“赋形剂”或“药用赋形剂”包括一种和一种以上的此类赋形剂。
在某些实施例中，药物制剂为可以经由注射施用于受试者的液体。优选地，药物制剂可以经皮下、肌内或透皮施用。在某些实施例中，药物制剂可以经眼部施用。
在另一方面，本发明涉及用作药物的根据本发明所述的药物制剂。
即，本发明的药物制剂，特别是悬浮液、复溶的冻干物或重悬的喷雾干燥的粉末，可以用作药物。因此，在一个优选的实施例中，本发明的药物制剂包含本发明的RPC的悬浮液、本发明的RPC悬浮液、本发明的复溶的冻干物或本发明的RPC-NAS悬浮液。
如本文所用的术语“药物”意指适于向有此需要的患者施用药物活性化合物(即治疗性蛋白质)的药物制剂。
在一个优选的实施例中，根据本发明所述的药物制剂用作治疗选自由以下项组成的组的疾病的药物：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及用于治疗以下疾病的根据本发明所述的药物组合物：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性或动脉粥样硬化。
在某些实施例中，根据本发明所述的药物制剂用于治疗癌症。如本文所用的术语“癌症”是指其中异常细胞不受控制地分裂并且可能侵袭附近组织的疾病，包括但不限于：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、膀胱癌、骨肉瘤(bone sarcoma)、乳腺癌、宫颈癌、破坏性绒毛膜腺癌、绒毛膜癌、胃癌、霍奇金氏淋巴瘤、葡萄胎、肺癌、恶性间皮瘤、蕈样肉芽肿病(一种皮肤T细胞淋巴瘤)、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤(osteosarcoma)、卵巢癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、头颈部鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、移行细胞膀胱癌、肾母细胞瘤等。
本发明的药物制剂中的药物活性成分为蛋白质。优选地，根据本发明所述使用的药物制剂包含抗体。即，根据本发明所述使用的药物制剂中的RPC可包含抗体和络合剂，特别是络合剂硫酸葡聚糖或硫酸软骨素。技术人员能够鉴别本领域已知的可用于治疗特定疾病的抗体。
但是，在某些实施例中，抗体可以与本文所公开的靶分子中的任一者结合，这些靶分子为例如：CD蛋白质，诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；HER受体家族的成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；蛋白C等。
本发明的药物制剂中可以包含的示例性抗体包括但不限于：hRl(抗IGF-1R，美国专利申请序列号12/722,645，提交于3/12/10)、hPAM4(抗粘蛋白，美国专利号7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利号7,251,164)、hA19(抗CD19，美国专利号7,109,304)、WMMU31(抗AFP，美国专利号7,300,655)、hLLl(抗CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利号7,074,403)、hMu-9(抗CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗HLA-DR，美国专利号7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利号6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、hRS7(抗EGP-1，美国专利号7,238,785)、hMN-3(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、Abl24和Abl 25(抗CXCR4，美国专利号7,138,496)。
本发明的药物制剂中可以包含的替代抗体包括但不限于：阿昔单抗(abciximab)(抗糖蛋白Ilb/IIIa)、阿仑单抗(alemtuzumab)(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(cetuximab)(抗EGFR)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(抗CD33)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(抗CD20)、帕尼单抗(panitumumab)(抗EGFR)、利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)、托西莫单抗(tositumomab)(抗CD20)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗ErbB2)、阿巴伏单抗(abagovomab)(抗CA-125)、阿德木单抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿替珠单抗(atlizumab)(抗IL-6受体)、贝那利珠单抗(benralizumab)(抗CD125)、CC49(抗TAG-72)、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA，美国专利申请11/983,372，沉积为ATCC PTA-4405和PTA-4406)、D2/B(抗PSMA，WO 2009/130575)、tocilizumab(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(basiliximab)(抗CD25)、达利珠单抗(daclizumab)(抗CD25)、依法利珠单抗(efalizumab)(抗CDl la)、GA101(抗CD20；Glycart Roche)、莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)(抗CD3受体)、那他珠单抗(natalizumab)(抗a4整联蛋白)、奥马珠单抗(omalizumab)(抗IgE)；抗TNF抗体，诸如CDP571(Ofei等人,2011,Diabetes 45:881 -85)、MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B、M303(Thermo Scientific,Rockford,IL)、英夫利昔单抗(infliximab)(Centocor,Malvern,PA)、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab pegol)(UCB,Brussels,Belgium)、抗CD40L(UCB,Brussels,Belgium)、阿达木单抗(adalimumab)(Abbott,Abbott Park,IL)、Benlysta(Human Genome Sciences)；用于治疗阿尔茨海默病的抗体，诸如Alz 50(Ksiezak-Reding等人,1987,J Biol Chem 263:7943-47)、更汀芦单抗、苏兰珠单抗(solanezumab)和英夫利昔单抗(infliximab)；抗纤维蛋白抗体，如59D8、T2Gl s、MH1；抗HIV抗体，诸如P4/D10(美国专利申请序列号11/745,692)、Ab 75、Ab 76、Ab 77(Paulik等人,1999,Biochem Pharmacol 58:1781-90)；以及抗病原体的抗体，诸如CR6261(抗流行性感冒)、艾韦单抗(exbivirumab)(抗乙型肝炎)、泛维珠单抗(felvizumab)(抗呼吸道合胞病毒)、福拉韦单抗(foravirumab)(抗狂犬病病毒)、莫维组单抗(motavizumab)(抗呼吸道合胞病毒)、帕利珠单抗(palivizumab)(抗呼吸道合胞病毒)、帕巴库单抗(panobacumab)(抗假单胞菌)、雷韦单抗(rafivirumab)(抗狂犬病病毒)、瑞加韦单抗(regavirumab)(抗巨细胞病毒)、司韦单抗(sevirumab)(抗巨细胞病毒)、替维鲁单抗(tivirumab)(抗乙型肝炎)和乌珠单抗(urtoxazumab)(抗大肠杆菌)。
在某些实施例中，抗体可以是双特异性抗VEGF/抗血管生成素-2(Ang-2)抗体、抗α突触核蛋白(aSyn)抗体、双特异性抗FAP/抗OX40抗体、双特异性抗VEGF/抗PDGF抗体(Dutafab)、贝伐单抗、帕妥珠单抗或更汀芦单抗。
优选地，本发明的药物制剂可用于经皮下、肌内或透皮应用于受试者。因此，在一个特定实施例中，本发明涉及根据本发明所述使用的药物制剂，其中药物制剂经皮下、肌内或透皮施用。在一个优选的实施例中，本发明涉及根据本发明所述使用的药物制剂，其中药物制剂经皮下施用。
经皮下、肌内和透皮施用本发明的药物制剂具有的优势在于，该药物制剂可以由受试者自行施用。进一步，根据本发明所述的药物制剂可用于向难以或不可能进行静脉内应用的受试者施用。
在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述使用的药物制剂，其中药物制剂为本发明的富集的RPC悬浮液，并且其中该富集的RPC悬浮液经皮下、肌内、透皮、眼部(诸如结膜下、前房内、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上腔)施用，施用至脑部(诸如腰椎内、鞘内或脑室内)，经关节内或通过吸入施用。
在其他实施例中，本发明涉及根据本发明所述使用的药物制剂，其中药物制剂为本发明的复溶的冻干物，并且其中复溶的冻干物经皮下、肌内或透皮施用。
在另外的实施例中，本发明涉及根据本发明所述使用的药物制剂，其中药物制剂为本发明的重悬的喷雾干燥的粉末，并且其中该重悬的喷雾干燥的粉末经皮下、肌内、透皮、眼部(诸如结膜下、前房内、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上腔)施用，施用至脑部(诸如腰椎内、鞘内或脑室内)，经关节内或通过吸入施用。
在某些实施例中，本发明涉及用于治疗眼科疾病的根据本发明所述的药物制剂。在某些实施例中，眼科疾病可以是眼部血管疾病。
用于治疗眼部血管疾病的药物制剂中的RPC可包含抗体或抗体片段。在某些实施例中，抗体或抗体片段可特异性结合至人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)。在某些实施例中，抗体或抗体片段可特异性结合至人血管生成素-2(Ang-2)。在某些实施例中，抗体或抗体片段可特异性结合至VEGF/VEGF-A和Ang-2。
即，在某些实施例中，药物制剂的RPC中包含的抗体或抗体片段可以是双特异性抗体或双特异性抗体片段。在某些实施例中，双特异性抗体可特异性结合至VEGF/VEGF-A和Ang-2。在某些实施例中，双特异性抗VEGF/抗血管生成素-2(Ang-2)抗体可以是Faricimab，如WO2014/009465中以“VEGFang2-0016”所公开。
在某些实施例中，双特异性抗体片段可以是Dutafab。在某些实施例中，Dutafab可以与VEGF/VEGF-A和/或Ang-2特异性结合。
术语“眼部血管疾病”包括但不限于眼内新生血管性综合征诸如糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、早产儿视网膜病变、新生血管性青光眼、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、视网膜血管瘤样增生、黄斑毛细血管扩张、缺血性视网膜病变、虹膜新生血管、眼内新生血管、角膜新生血管、视网膜新生血管、脉络膜新生血管和视网膜变性。(Garner,A.，Vascular diseases，In:Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach,Garner,A.和Klintworth,G.K.(编撰),第2版,Marcel Dekker,New York(1994),第1625-1710页)。如本文所用，眼血管病症是指特征在于新血管的改变或不受调节的增殖和侵袭到眼组织诸如视网膜或角膜结构中的任何病理性病状。在一个实施例中，眼部血管疾病选自由以下项组成的组：湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、干性年龄相关性黄斑变性(干性AMD)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、囊样黄斑水肿(CME)、非增生型糖尿病视网膜病变(NPDR)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR)、囊样黄斑水肿、血管炎(例如视网膜中央静脉阻塞)、视神经乳头水肿、视网膜炎、结膜炎、葡萄膜炎、脉络膜炎、多灶性脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症(
Figure BDA0004041476750000721
氏病)以及其他眼科疾病，其中眼部疾病或病症与眼新生血管、血管渗漏和/或视网膜水肿相关。因此，根据本发明的药物制剂可用于预防和治疗湿性AMD、干性AMD、CME、DME、NPDR、PDR、睑缘炎、干眼症和葡萄膜炎，另外优选湿性AMD、干性AMD、睑缘炎和干眼症，另外优选CME、DME、NPDR和PDR，另外优选睑缘炎和干眼症，特别是湿性AMD和干性AMD，并且另外特别是湿性AMD。在一些实施例中，眼血管疾病选自由以下项组成的组：湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、黄斑水肿、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变。与角膜新生血管相关联的其他疾病包括但不限于：流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、角膜接触镜过度磨损、特应性角膜炎、上缘性角膜炎、翼状干燥性角膜炎、干燥综合征(sjogrens)、酒糟鼻、小水疱病(phlyctenulosis)、梅毒、分枝杆菌感染、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角膜溃疡、特里昂边缘性角膜变性(Terrien's marginal degeneration)、边缘性角质层分离、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性动脉炎、创伤、韦格纳结节病(Wegeners sarcoidosis)、巩膜炎、史蒂芬约翰逊综合征(Steven's Johnson disease)、类天疱疮放射状角膜切开术和角膜移植排斥。与视网膜/脉络膜新生血管相关联的疾病包括但不限于：糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、镰形细胞贫血症、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、佩吉特氏病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、色素性视网膜炎、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、伊尔斯病(Eales disease)、白塞氏病(Bechets disease)、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假定眼组织胞浆菌病、贝斯特氏病(Bests disease)、近视、视窝(optic pits)、斯塔加特氏病(Stargarts disease)，睫状体扁平部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综合征、弓形体病、创伤和激光后并发症。其他疾病包括但不限于与红变(角部新生血管)相关联的疾病，以及由纤维血管或纤维组织异常增生引起的疾病(包括各种形式的增生性玻璃体视网膜病变)。
在某些实施例中，本发明的药物制剂用于治疗AMD，特别是湿性AMD。在某些实施例中，本发明的药物制剂用于治疗糖尿病性黄斑水肿。在某些实施例中，用于治疗AMD和/或糖尿病性黄斑水肿的药物制剂中包含的RPC包含特异性结合至VEGF/VEGF-A和/或Ang-2的抗体或抗体片段。在某些实施例中，用于治疗AMD和/或糖尿病性黄斑水肿的药物制剂中包含的RPC包含特异性结合至VEGF/VEGF-A和Ang-2的双特异性抗体。在某些实施例中，所述双特异性抗体为Faricimab。在某些实施例中，用于治疗AMD和/或糖尿病性黄斑水肿的药物制剂中包含的RPC包含特异性结合至VEGF/VEGF-A和Ang-2的Dutafab。
早产儿视网膜病变(ROP)是一种影响早产婴儿的眼病。据认为该疾病由视网膜血管生长紊乱引起，可能导致瘢痕形成和视网膜脱离。ROP可能是轻度的，并且可能自发消退，但是在严重情况下可能导致失明。因此，所有早产儿都存在发生ROP的危险，并且极低的出生体重是一个附加的风险因素。氧中毒和相对缺氧均可能导致ROP的发展。黄斑变性是一种医学疾病，主要见于老年人群，其表现为眼内层中心(称为视网膜的黄斑区域)变薄、萎缩，并且在某些情况下出血。该疾病可能导致丧失中央视觉，从而导致无法看到细节、无法阅读或无法识别面部。根据美国眼科学会，该疾病是目前美国50岁以上人群中央视觉丧失(失明)的主要原因。尽管某些影响年轻人的黄斑营养不良有时被称为黄斑变性，但是该术语通常是指年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD)。年龄相关性黄斑变性始于黄斑(视网膜的中心区域，其提供详细的中央视觉，称为中央凹)中的特征性黄色沉积物，称为视网膜色素上皮和下面的脉络膜之间的玻璃膜疣。大多数产生这些早期变化的人(称为年龄相关性黄斑病)具有良好的视力。患有玻璃膜疣的人可能继续发展为晚期AMD。当玻璃疣较大且数量众多并且与黄斑下的色素细胞层紊乱相关联时，风险相当高。大而软的玻璃膜疣与胆固醇沉积物升高相关，并且可能对降胆固醇药物或Rheo手术有反应。
导致严重视力丧失的晚期AMD有两种形式：干性和湿性。中央地图样萎缩是干性形式的晚期AMD，由视网膜下方的视网膜色素上皮层萎缩引起，通过眼睛中央部分的光感受器(视杆和视锥细胞)的丧失导致视力丧失。虽然没有针对这种情况的治疗方法，但国家眼科研究所和其他机构已经证明，含有高剂量抗氧化剂、叶黄素和玉米黄质的维生素补充剂可以减缓干性黄斑变性的进展，并在某些患者中提高视力。
色素性视网膜炎(RP)是一组遗传性眼病。在RP症状的发展过程中，夜盲症通常比隧道视觉先出现数年或甚至数十年。许多患有RP的人直到40多岁或50多岁才成为法定盲人，并且终生保留一定的视力。其他人则可能因为RP而完全失明，并且在某些病例中早在幼儿期就已完全失明。RP的进展因病例而异。RP是一种遗传性视网膜营养不良，属于一组遗传性疾病，其中视网膜的感光器(视杆细胞和视锥细胞)或视网膜色素上皮(RPE)异常导致进行性视力丧失。受影响的个体首先经历暗适应不良或夜盲症(夜盲)，然后发生周围视野减小(称为隧道视觉)，并且有时在病程晚期丧失中央视觉。
当液体和蛋白质沉积物积聚在眼黄斑(即视网膜的黄色中央区域)上方或下方时，导致其增厚和肿胀时，发生黄斑水肿。由于黄斑位于眼球后部视网膜中央附近，因此肿胀可能使人的中央视觉扭曲。该区域容纳紧密排列的视锥，提供明显、清晰的中央视觉，使人们能够看到实现范围内的形状、颜色和细节。囊性黄斑水肿是一种包括囊肿形成的黄斑水肿。
在某些实施例中，根据本发明所述的药物制剂单独施用(无需另外的治疗剂)，用于治疗本文所述的一种或多种眼部血管疾病。
在其他实施例中，本发明的药物制剂可以与一种或多种另外的治疗剂或方法组合施用，用于治疗本文所述的一种或多种眼部血管疾病。
另外的治疗剂可包括但不限于：色胺酰基-tRNA合成酶(TrpRS)、Eye00l(抗VEGF聚乙二醇化适体)、角鲨胺、RETAANE(TM)(用于长效混悬剂的醋酸阿奈可他；Alcon,Inc.)、康普立停A4前药(CA4P)、MACUGEN(TM)、MIFEPREX(TM)(美服培酮-ru486)、结膜下曲安奈德、玻璃体内结晶曲安奈德、普马司他(Prinomastat)(AG3340-合成基质金属蛋白酶抑制剂，Pfizer)、醋酸氟轻松(包括氟轻松眼内植入物，Bausch&Lomb/Control DeliverySystems)、VEGFR抑制剂(Sugen)、VEGF-Trap(Regeneron/Aventis)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(诸如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、SU1 1248(司马沙尼(sunitinib))、三羧氨基喹啉以及整联蛋白v.β3功能和血管抑素抑制剂。
可以与根据本发明所述的药物制剂组合使用的其他药物疗法包括但不限于：与非热激光结合使用的VISUDYNE(TM)；PKC 412；Endovion(NeuroSearch A/S)；神经营养因子(包括例如神经胶质衍生的神经营养因子和睫状神经营养因子)；地尔硫卓；多佐胺；Phototrop；9-顺-视网膜；眼药(包括Echo Therapy)，包括磷化碘或乙膦硫胆碱或碳酸酐酶抑制剂)；AE-941(AEterna Laboratories,Inc.)；Sirna-027(Sima Therapeutics,Inc.)；哌加他尼(pegaptanib)(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)；神经营养蛋白(仅作为示例，包括NT-4/5，Genentech)；Cand5(Acuity Pharmaceuticals)；INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)；整联蛋白拮抗剂(包括来自Jerini AG和AbbottLaboratories的那些)；EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)；BDM-E(BioDiem Ltd.)；沙利度胺(例如，由EntreMed,Inc.使用)；心肌营养蛋白-1(Genentech)；2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)；NTC-200(Neurotech)；四硫代钼酸盐(密歇根大学)；LYN-002(Lynkeus Biotech)；微藻类化合物(Aquasearch/Albany,MeraPharmaceuticals)；D-9120(Celltech Group plc)；ATX-S10(Hamamatsu Photonics)；TGF-β2(Genzyme/Celtrix)；酪氨酸激酶抑制剂(Allergan,SUGEN,Pfizer)；NX-278-L(NeXstarPharmaceuticals/Gilead Sciences)；Opt-24(OPTIS France SA)；视网膜细胞神经节神经保护剂(Cogent Neurosciences)；N-硝基吡唑衍生物(德克萨斯A&M大学系统)；KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)；环孢菌素A；受限视网膜易位(Limited retinaltranslocation)光动力疗法(仅作为示例，包括靶向受体的PDT，Bristol-Myers Squibb,Co.；带有PDT的注射用卟吩姆钠；维替泊芬，QLT Inc；带有PDT的罗培泊芬，MiraventMedical Technologies；带有PDT的他拉泊芬钠，Nippon Petroleum；莫特沙芬镥，Pharmacyclics，Inc.)；反义寡核苷酸(包括，例如，由Novagali Pharma SA测试的产品以及Ionis Pharmaceuticals的ISIS-13650)；激光光凝；玻璃疣激光；黄斑裂孔手术；黄斑移位手术；植入式微型望远镜；PHi运动血管造影术(也称为微激光疗法和饲养血管治疗)；质子束疗法；微刺激疗法；视网膜脱落和玻璃体手术；巩膜扣；黄斑手术；经瞳孔热疗法；光系统I疗法；使用RNA干扰(RNAi)；体外血液分离(也称为膜差分过滤和流变疗法)；微芯片植入；干细胞疗法；基因替代疗法；核酶基因疗法(包括用于缺氧应答元件的基因疗法，OxfordBiomedica；Lentipak，Genetix；PDEF基因疗法，GenVec)；光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin,Inc.；视网膜细胞移植物，Cell Genesys,Inc.)；以及针灸。
任何抗血管生成剂均可与根据本发明所述的药物制剂组合使用，包括但不限于以下文献中列出的那些：Carmeliet和Jain,2000,Nature 407:249-257。在某些实施例中，抗血管生成剂可以是VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，诸如VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制剂及其任意组合，并且包括抗VEGF适体(例如哌加他尼)、可溶性重组诱饵受体(例如VEGF Trap)。在某些实施例中，抗血管生成剂可包括皮质类固醇、血管抑制类固醇、醋酸阿奈可他(anecortave acetate)、血管抑素、内皮抑素、降低表达的VEGFR或VEGF配体的表达的小干扰RNA、后VEGFR阻断与酪氨酸激酶抑制剂、MMP抑制剂、IGFBP3、SDF-1阻断剂、PEDF、γ-分泌酶、δ样配体4、整联蛋白拮抗剂、HIF-1α阻断剂、蛋白激酶CK2阻断剂，以及使用血管内皮钙粘蛋白(CD-144)和基质源性因子(SDF)-I抗体抑制干细胞(即内皮祖细胞)归巢到新生血管位点。也可以使用靶向VEGF受体的小分子RTK抑制剂(包括PTK787)。也可以使用不一定是抗VEGF化合物的抗新生血管活性药物，包括抗炎药、m-Tor抑制剂、雷帕霉素、依维莫司、temsirolismus、环孢霉素、抗TNF剂、抗补体剂和非甾体类抗炎剂。也可以使用具有神经保护作用并且可以潜在地减少干性黄斑变性进展的药剂，诸如称为“神经类固醇”的药物。这些药物包括诸如脱氢表雄酮(DHEA)(商标名称：Prastera(R)和Fidelin(R))、硫酸脱氢表雄酮和孕烯醇酮硫酸盐。任何AMD(年龄相关性黄斑变性)治疗剂均可与根据本发明所述的药物制剂组合使用，包括但不限于维替泊芬与PDT组合、哌加他尼钠、锌或抗氧化剂，这些治疗剂单独或以任意组合施用。
在其中根据本发明所述的药物制剂用于治疗眼科疾病诸如但不限于眼部血管疾病的实施例中，优选的是，根据本发明所述的药物制剂经眼内或玻璃体内施用。
如本文所用的术语“眼内”是指眼球内的任何位置。如本文所用的术语“玻璃体内”是指眼睛后部的凝胶内部。即，用于治疗眼科疾病的药物制剂可以经视网膜下、囊内、脉络膜上、前房内、睑内施用，施用到眼球筋膜囊下、结膜下区域、尽端、眼球后间隙或球周间隙。
如本文所用的术语“视网膜下”是指视网膜与脉络膜之间的区域。如本文所用的术语“囊内”是指晶状体囊内。如本文所用的术语“脉络膜上”是指脉络膜与巩膜之间的区域。如本文所用的术语“眼球筋膜囊下”是指眶隔后方、巩膜外、眼球筋膜下方的区域。如本文所用的术语“结膜下”是指结膜与巩膜之间的区域。如本文所用的术语“前房内”是指“进入眼房中”，即，进入眼前房或后房中。如本文所用的术语“睑内”是指进入眼睑中。如本文所用的术语“尽端(cul-de-sac)”是指眼睑与眼球之间的间隙。如本文所用的术语“眼球后”是指眼眶后面。如本文所用的术语“球周”是指眼眶内或眼睛附近。
在另一方面，本发明涉及根据本发明所述的药物制剂用于治疗选自由以下项组成的组的疾病的用途：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化。
在另一方面，本发明涉及根据本发明所述的药物制剂在药物制备中的用途，该药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化。
在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的药物制剂用于治疗眼科疾病的药物制剂的用途。在某些实施例中，本发明涉及根据本发明所述的药物制剂在药物制备中的用途，该药物用于治疗眼科疾病。眼病可以是本文所公开的眼科疾病中的任一者。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗选自由以下项组成的组的疾病的方法：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化，该方法包含以下步骤：(a)根据本发明所述的方法产生药物制剂；以及(b)向有此需要的受试者施用该药物制剂。
在一个优选的实施例中，本发明涉及一种治疗患有选自由以下项组成的疾病的受试者的方法：自身免疫病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变性和动脉粥样硬化，该方法包含以下步骤：(a)根据本文所述的方法产生药物制剂；以及(b)向有此需要的受试者施用该药物制剂，其中该药物组合物经皮下、肌内或透皮施用，特别是其中该药物组合物经皮下施用。
在另一个实施例中，本发明涉及一种治疗眼科疾病、特别是眼部血管疾病的方法，该方法包含以下步骤：(a)根据本文所述的方法产生药物制剂；以及(b)向有此需要的受试者施用该药物制剂。在某些实施例中，在治疗眼科疾病的方法中使用的药物制剂可包含特异性结合至VEGF/VEGF-A和Ang-2的抗体或抗体片段。在某些实施例中，在治疗眼科疾病的方法中使用的药物制剂可以经眼内或玻璃体内施用。
在另一个实施例中，本发明涉及一种经皮下、肌内或透皮施用药物制剂的方法，该方法包含以下步骤：(a)根据本文所述的方法产生药物制剂；以及(b)经皮下、肌内或透皮向有此需要的受试者施用该药物制剂。
在另一个实施例中，本发明涉及一种经眼部向受试者施用药物制剂的方法，该方法包含以下步骤：(a)根据本文所述的方法产生药物制剂；以及(b)经眼部(诸如经结膜下、前房内、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上腔)向有此需要的受试者施用该药物制剂。
在另一个实施例中，本发明涉及一种将药物制剂施用至受试者的脑部的方法，该方法包含以下步骤：(a)根据本文所述的方法产生药物制剂；以及(b)将该药物制剂施用至受试者的脑部(诸如腰椎内、鞘内或脑室内)。
在另一个实施例中，本发明涉及一种经关节内向受试者施用药物制剂的方法，该方法包含以下步骤：(a)根据本文所述的方法产生药物制剂；以及(b)经关节内向受试者施用该药物制剂。
如本文所用的指代向受试者递送本发明的药物制剂的术语“施用”不限于任何特定途径，而是指医学界认为适当的任何途径。例如，本发明设想的递送或施用的途径包括但不限于经皮下、肌内、透皮、眼部(诸如结膜下、前房内、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上腔)施用，施用至脑部(诸如腰椎内、鞘内或脑室内)，经关节内或通过吸入施用。在本发明的某些实施例中，经皮下施用。
如本文所用的术语“皮下”是指皮肤下方(例如，在真皮下方的结缔组织中和肌肉组织的面上)。
如本文所用的术语“肌内”是指肌内途径(IM途径)。在IM施用途径中，注射到位于皮下层下方的横纹肌纤维中。
如本文所用的术语“透皮”意指穿入和/或穿过皮肤或粘膜以局部或全身递送活性剂的途径。
在本发明内，优选的是，根据本发明所述的药物制剂以治疗有效量施用于受试者。
如本文所用的术语“治疗有效量”意指当施用于患有或易患疾病、病症和/或病状的个体时足以治疗该疾病、病症和/或病状的量。本领域普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上并不要求在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是当施用或递送给有此类治疗需求的大量受试者时提供特定期望的药理学应答的量。特别是应当理解，特定受试者实际上可能对“治疗有效量”是“难治性的”。应当理解，在包含不同蛋白质的药物制剂之间，治疗有效量可能是不同的。但是，技术人员知道用于确定获得期望的治疗效果所需的组合物的量的方法。
在某些实施例中，根据本发明所述的药物制剂作为蛋白质浓度为至少50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL或200mg/mL的液体组合物经皮下、肌内、透皮、眼部(诸如结膜下、前房内、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上腔)向受试者施用，施用至脑部(诸如腰椎内、鞘内或脑室内)或经关节内施用。作为单一剂量施用的药物制剂的体积可以在0.1mL至10mL、0.1mL至9mL、0.1mL至8mL、0.1mL至7mL、0.1mL至6mL、0.1mL至5mL、0.1mL至4mL、0.1mL至3mL、0.1mL至2mL、0.1mL至1mL、1mL至3mL或1mL至2mL的范围内。
如本文所用的术语“受试者”或“患者”是指根据本发明所述的药物制剂可以向其递送或施用的任何动物。例如，受试者可以是人、犬、猫、牛、猪、马、老鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠等。在本发明的许多实施例中，受试者是人。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、延迟发作、降低严重程度和/或降低特定疾病、病症和/或病状的一个或多个症状或特征的生物活性剂的任何施用。此类治疗可以针对未表现出相关疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者。替代性地或另外地，此类治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定的迹象的受试者。
虽然本发明的方面在附图、表格和前述描述中得到详细说明和描述，但此类附图、表格和描述应被视为说明性的或示例性的而不是限制性的。另外，权利要求中的附图标记不应被解释为限制范围。
还应当理解，普通技术人员可以在权利要求的范围和精神内做出改变和修改。特别是，本发明涵盖具有来自上文所述的不同实施例的特征的任何组合的进一步实施例。在此上下文中还应当注意，本发明涵盖在附图中单独示出的所有进一步特征，尽管它们可能没有在前面或下面的描述中予以描述。此外，附图和描述中描述的实施例的单一替代方案及其特征的单一替代方案可以根据本发明的方面从主题中排除。
每当在权利要求中使用“包含”一词时，不应将其解释为排除其他要素或步骤。还应当理解，与属性或值结合使用的术语“基本上”、“大体上”、“约”、“大约”等可以在本公开的上下文中以精确的方式限定属性或值。因此，在提及相应的属性或值时，也可以省略术语“基本上”、“大体上”、“约”、“大约”等。术语“基本上”、“大体上”、“约”、“大约”与值一起使用时可意指该值±10％，优选±5％。
本文引用了许多文档，包括专利申请书、制造商手册和科学出版物。所述文件的公开内容，被认为与本发明的专利性无关，而是以全文引用的方式并入本文。更具体而言，所有参考文件的引用程度如同将每个单独的文件具体且单独地以引用方式并入本文。
附图简要说明
图1：在组氨酸缓冲液(20mM,pH 5.0)中以1:1摩尔-电荷比混合VEGF-Ang2和硫酸葡聚糖溶液后获得的RPC悬浮液的外观。
图2：络合前(裸蛋白质)以及络合(RPC)和解离后的蛋白质解链温度。
图3：DSC热图，示出a.络合形式的VA2的解链温度(Tm＝144.2℃)，和b.RPC制剂中存在的葡聚糖硫酸钠盐的解链温度(Tm＝171.9℃)。
图4：200mg/mL RPC悬浮液的外观，示出制剂的糊状外观：a.刮铲保持面朝上；b.刮铲面朝下。
图5：喷雾干燥的VA2 RPC的外观。
图6：在组氨酸缓冲液和在超纯水(MilliQ水)中的悬浮液喷雾干燥后的VA2 RPC颗粒的SEM图像。
图7：悬浮于NAS溶剂中的VA2 RPC喷雾干燥的粉末。EO，油酸乙酯；IDME，异山梨醇二甲醚。
图8：不同蛋白质形式与硫酸葡聚糖(DS)以1:1摩尔-电荷比络合和解离的百分比。
图9：RPC的络合和解离百分比，使用VEGF-Ang2作为蛋白质模型并且使用不同的络合剂。*在pH 4.0下进行络合。**用PBS 100mM进行解离。
图10：在不同蛋白质浓度下，VA2与DS的络合和解离的百分比。
图11：与DS以不同的蛋白质浓度络合后获得的RPC粒径。
图12：在具有不同pH的组氨酸缓冲液20mM中VA2与DS的络合百分比；及其在PBS中的相应的解离百分比。
图13：在具有不同离子强度的组氨酸缓冲液pH 5.0中VA2与DS的络合百分比；及其在PBS中的相应的解离百分比。
图14：在不同添加剂存在下，VA2与DS的络合和解离百分比。图15：VA2 RPC的外观：a.在组氨酸缓冲液(对照)中；b.在不同添加剂(蔗糖、聚山梨酯20、泊洛沙姆188或其混合物)存在下；c.在超纯水(MilliQ水)中(未络合)。
图16：在不同温度下储存4周后，RPC制剂(F1至F4)和VA2对照DP溶液的外观。注意到在25℃或40℃储存4周后，RPC悬浮液中形成硬饼状物、凝胶外观和收缩。A.前视图；B.底视图。
图17：VA2 RPC 60mg/mL在5℃储存4周的外观：a.冻干前；b和c.冻干后(b.前视图；C.底视图)；d.冻干饼状物复溶于PBS(120mg/mL)中后。
图18：在不同温度下储存4周后，RPC制剂的外观。Ctrl–对照(在组氨酸缓冲液中，未经缓冲液交换)，C–离心(在MilliQ中，通过离心交换缓冲液)，D–透析(在MilliQ中，通过透析交换缓冲液)，A–前视图，B–涡旋前的底视图，C–涡旋后的底视图。
图19：样品外观的比较–对照样品中形成了“硬饼状物”(左图)，而渗析后的样品中的颗粒保持分散状态(右图)。
图20：已通过离心(A)或透析(B)将缓冲液交换为超纯水的RPC的粒径比较。第一个结果通过激光衍射测量技术获得(A)，而第二个结果通过动态光散射获得(B)。
实例
本发明的方面另外通过以下例示性非限制性实例进行描述，这些实例提供了对本发明的实施例及其许多优势的更好的理解。包括以下实例以证明本发明的优选实施例。本领域技术人员应当理解，以下实例中所公开的技术代表本发明中使用的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选方式。但是，本领域的技术人员应当理解，根据本公开，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施例进行许多改变并且仍获得相同或相似的结果。
实例1：可逆蛋白质复合物(RPC)制剂的开发
1.1材料
治疗性蛋白质包括单克隆抗体(mAb)、双特异性crossmab、细胞因子融合单克隆抗体和DutaFab，由F.霍夫曼-罗氏公司(F.Hoffmann-La Roche AG)(瑞士巴塞尔)提供。组氨酸-HCl和L-组氨酸碱获自Ajinomoto(日本大阪)，柠檬酸和柠檬酸三钠获自Merck(德国达姆施塔特)，聚山梨酯20获自Croda(英国东约克郡)，泊洛沙姆188获自BASF(德国路德维希港)，并且蔗糖获自Pfanstiehl(瑞士楚格)。葡聚糖硫酸钠盐(DS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、硫酸软骨素(CS)、水合牛磺胆酸钠(ST)、三醋精、二甘醇单乙醚
Figure BDA0004041476750000831
异山梨醇二甲醚、四甘醇(四氢呋喃聚乙二醇醚)、油酸乙酯、PBS片剂和PVDF过滤器购自Sigma-Aldrich(瑞士布克斯)。Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO 10K)获自Thermo Scientific。MilliQ水(电阻率>18MΩcm)使用Merck Millipore MilliQ水纯化系统(德国达姆施塔特)进行制备。使用的所有溶剂均为分析级。
1.2方法
1.2.1蛋白质溶液和络合剂溶液的制备
组氨酸缓冲液(20mM,pH 5.3-5.8)(主要含有蔗糖、表面活性剂和/或氯化钠)中的不同蛋白质溶液在络合之前经过渗析，以用组氨酸缓冲液(20mM,pH 5.0)交换缓冲液。透析在室温运行2h，然后在5℃±3℃下过夜运行。将透析后的蛋白质用组氨酸缓冲液(20mM,pH5.0)进一步稀释至5mg/mL。
用组氨酸缓冲液(20mM,pH 5.0)制备50mg/mL的络合剂溶液(葡聚糖硫酸钠盐、十二烷基硫酸钠、硫酸软骨素、水合牛磺胆酸钠)。
1.2.2蛋白质含量
通过使用分光光度计(NanoDrop Onec,ThermoFisher Scientific)测量280nm处的紫外吸光度来确定蛋白质浓度。为确定蛋白质浓度，首先使用PBS10mM解离RPC悬浮液，然后将4μL置于仪器基座上进行定量。
1.2.3可逆蛋白质络合物的形成
根据蛋白质的氨基酸序列计算蛋白质电荷，然后确定每摩尔各种蛋白质的相应电荷。还确定各络合剂的摩尔-电荷。通过将蛋白质溶液(5mg/mL)与络合剂溶液(50mg/mL)以1:1的摩尔-电荷比混合来制备可逆蛋白质络合物，旨在实现100％的电荷中和。络合剂对蛋白质电荷的完全中和导致蛋白质沉淀并且形成白色蛋白质-颗粒物悬浮液。
将1mL RPC悬浮液样品离心(10 000rpm,5min)并且使用紫外光谱法(nanoDropOnec,Thermo Scientific)对上清液中剩余的蛋白质的量进行定量后，根据以下公式确定络合百分比：
Figure BDA0004041476750000841
1.2.4可逆蛋白质络合物的解离
在通过将RPC悬浮液用PBS(10mM,pH 7.4)稀释至最终蛋白质浓度为1mg/mL而导致pH升高后，可逆蛋白质络合物解离。蛋白质在pH 7.4下不带电，蛋白质与络合剂之间的电荷相互作用减少，引起络合物解离。
利用UV确定解离后的蛋白质浓度，并且根据以下公式计算解离百分比：
Figure BDA0004041476750000851
1.2.5粒径
RPC粒径分布使用激光衍射分析仪(Partica LA-960,HORIBA)进行测量。将RPC悬浮液上样至含有超纯水(MilliQ水)的仪器的样品浴槽中，其浓度使透射率可以达到70％至95％，然后在循环模式下进行测量。报告平均粒径值。喷雾干燥的RPC粉末的粒径分布也使用SEM进行评估。
1.2.6ζ电位
使用Malvern Zetasizer Nano ZS评估颗粒表面电荷。在组氨酸缓冲液和超纯水(MilliQ水)介质两者中评估RPC的颗粒表面电荷。由于络合仅发生于特定条件下，因此首先在组氨酸缓冲液中进行络合，然后相对于超纯水(MilliQ水)进行透析以去除缓冲离子。将两种介质中的RPC悬浮液用其相应的介质稀释至0.1mg/mL，然后将样品(约0.8mL)加载到ζ电位池中进行分析。
1.2.7粘度
使用配备锥板几何构造的流变仪(Physica MCR 301,Anton Paar)进行粘度测量。通过将80μL样品置于板的中心来确定RPC制剂的粘度。所用的方法由3个步骤组成：第一步将样品在120s内平衡至20℃；然后第二步，施加1000s-1的剪切速率10s；最后一步施加1000s-1剪切速率5s。
1.2.8蛋白质稳定性
在络合前以及络合和解离之后评估蛋白质稳定性。使用体积排阻色谱(SEC)监测蛋白质纯度，并且使用离子交换色谱(IEC)监测蛋白质电荷。
1.2.9蛋白质解链温度
使用nanoDSF测量液体形式(悬浮液)的可逆蛋白质络合物的解链温度，并且利用DSC测量固体形式(喷雾干燥的粉末)的可逆蛋白质络合物的解链温度。
1.2.9.1利用nanoDSF测量解链温度
测量络合前裸蛋白的蛋白质解链温度，并且测量络合后RPC悬浮液以及RPC在PBS10mM中解离后的蛋白质解链温度。将30μL各溶液(约1.2mg/mL)置于384孔微孔板中，转移至48毛细管阵列(约10μL)中，然后引入仪器(Prometheus,nanoTemper)中。该方法包括以0.5℃/min的加热速率应用25℃至95℃的温度梯度。将激发功率设置为28％，记录蛋白质荧光强度(比率350/330nm)，并且记录解链温度(转变中点Tm，50％未折叠的蛋白质)。
1.2.9.2利用DSC测量解链温度
在络合和喷雾干燥后，使用DSC(Q2000,TA instruments)测量RPC粉末的蛋白质解链温度。将样品置于仪器中(约50mg)，然后该方法由以下步骤组成：在25℃平衡；然后以5℃/min的速率降至-5℃，并且等温保持5min；然后以2℃/min的速率升至250℃，并且等温保持5min；最后以5℃/min的速率降至25℃。
1.3结果
将蛋白质(VEGF-Ang2)溶液与络合剂(硫酸葡聚糖)溶液在组氨酸缓冲液(20mM pH5.5)中以1:1摩尔-电荷比混合，引起蛋白质颗粒的白色悬浮液的形成(图1)。
利用激光衍射法测得的RPC悬浮液的平均粒径为10.8±0.8μm。当制剂静置时，观察到颗粒沉降，但是，颗粒在简单搅拌后很容易重悬。
组氨酸缓冲液中RPC颗粒的表面电荷为-13.9±0.6mV；使用透析与超纯水(MilliQ水)进行缓冲液交换(洗涤)后，表面电荷为-43.6±0.5mV。
在络合前与络合并且在PBS中解离后，利用SEC评估的蛋白质稳定性结果无显著差异，单体百分比分别为95.2％和95.3％。使用IEC观察到相同的结果，在络合前与络合并且在PBS中解离后，主峰百分比分别为67.2％和66.7％。
确定对照裸形式(未络合)、络合后的悬浮液形式以及RPC在PBS中解离后的蛋白质解链温度(Tm)。结果表明，裸对照蛋白质的Tm(67.5℃)与RPC络合和解离后的Tm(68.4℃)无显著差异，确认了利用SEC和IEC观察到的结果，得出以下结论：络合-解离过程不影响蛋白质的稳定性(图2)。有趣的是，络合蛋白质(RPC)未表现出明确的拐点，表明络合形式的蛋白质的Tm偏移至高于95℃(nanoDSF温度范围的上限)的温度，表明与裸蛋白相比具有更高的稳定性。
进一步利用DSC确定络合形式的蛋白质的确切Tm(图3)。结果表明，当蛋白质与DS络合时，蛋白质Tm从67.5℃偏移至144.2℃，表明RPC形式的蛋白质具有更高的稳定性。
实例2：可逆蛋白质复合物制剂的后处理步骤
利用RPC概念开发高浓度蛋白质制剂。评估了两种方法；第一种方法包括将组氨酸缓冲液中的RPC悬浮液浓缩到60mg/mL至200mg/mL范围内的一系列浓度。第二种方法包括将喷雾干燥的RPC颗粒重悬于非水性溶剂中。
2.1浓缩
利用离心(Eppendorf离心机5810R)浓缩RPC悬浮液。将RPC悬浮液(5mg/mL)灌装到含有磁力搅拌棒的Falcon管(50mL)中，然后离心(3900rpm,15min,5℃)以进行浓缩。弃去上清液(100％络合)，然后将残余物均质化并且汇集到一个Falcon管中。通过在990μL PBS(10mM,pH 7.4)中解离10μL悬浮液来确定中间浓度。通过进一步离心或用组氨酸缓冲液稀释，将浓度调节至120mg/mL。
为获得更高的浓度(高达200mg/mL)，使用高速离心机(Beckman Coulter OptimaL-90K制备型超速离心机)进行浓缩。将RPC悬浮液置于含有磁力搅拌棒的高速离心管(Beckman Coulter,70mL)中，然后在5℃以10 000rpm离心10min。除去上清液，然后将贮库(depot)通过涡旋均质化，取10μL在990μL PBS中解离，以评估中间浓度。继续离心，直至达到200mg/mL的最终目标浓度。
将RPC悬浮液浓缩至高达200mg/mL，产生非常致密的白色悬浮液，其具有糊状外观(图4)。但是，该制剂可通过26G针头进行注射。180mg/mL和160mg/mL的RPC悬浮液具有相似的糊状外观，而RPC悬浮液在约120mg/mL时变得更接近液态，并且90mg/mL和60mg/mL的RPC悬浮液为液体。
不同浓缩的悬浮液的粘度测量显示出剪切稀化效应(施加恒定剪切速率时粘度降低)。与牛顿溶液相比，此功能使制剂的可注射性更容易。然而，所用的粘度测量方法是针对液体溶液开发的，不适用于糊状RPC制剂。
2.2喷雾干燥
使用Büchi小型喷雾干燥仪B-290进行喷雾干燥。将入口温度设置为115℃(出口温度约48℃)，并且将氮气抽吸设置为100％。将进料速率(蠕动泵)设置为17mL/min。RPC制剂保持搅拌，以免喷雾干燥过程中颗粒发生沉降。
VA2 RPC制剂在5mg/mL(F1至F3)下的喷雾干燥产生细小的白色粉末(图5)。
为优化喷雾干燥的RPC粉末中的蛋白质含量以及在RPC悬浮液喷雾干燥过程后蛋白质的稳定性，对不同的制剂组合物(F1至F3)进行评估(表1)。如实例1中所述制备RPC制剂，然后将相应量的蔗糖和聚山梨酯20加入F1中。由于本发明人的目标是在最终粉末中获得最高的蛋白质含量，因此本发明人使用尽可能少的赋形剂来限制它们对最终粉末含量的贡献，同时仍然确保喷雾干燥过程中的蛋白质稳定性。鉴于组氨酸缓冲液的组分对RPC粉末的最终固体含量影响很大，因此在络合后使用透析将组氨酸缓冲液与超纯水(MilliQ水)交换(F2和F3)。然后将相应量的蔗糖和聚山梨酯20加入F3中。
表1：待喷雾干燥的5mg/mL的RPC溶液的组成。
Figure BDA0004041476750000881
喷雾干燥后，在PBS中解离特定量后，利用UV确定RPC粉末中的蛋白质含量，并且使用以下公式来计算：
Figure BDA0004041476750000891
利用SEC和IEC评估蛋白质稳定性，利用DSC确定粉末形式的RPC中的蛋白质解链温度，并且在溶解于PBS中后利用nanoDSF确定蛋白质解链温度。
在喷雾干燥后获得的F1和F3颗粒的扫描电子显微镜(SEM)分析显示，用超纯水(MilliQ水)洗涤的VA2 RPC中存在松散的圆形且分散的颗粒(F3，图6)，而组氨酸缓冲液中VA2 RPC中的颗粒团聚程度更高，形成簇和熔融状颗粒(F1，图6)。这种颗粒形状的差异是由于所用的不同介质还是由于喷雾干燥过程本身，有待进一步研究。
喷雾干燥前后组氨酸缓冲液相对于超纯水(MilliQ水)中的VA2 RPC颗粒分析显示，喷雾干燥后的粒径从约8μm增加至约30μm(表2)，可能是由于加入的赋形剂(蔗糖和PS20)吸附到RPC颗粒上以及喷雾干燥过程中可能形成簇。
表2：喷雾干燥前后组氨酸缓冲液相对于超纯水(MilliQ水)中的VA2 RPC粒径。
Figure BDA0004041476750000892
正如预期的那样，喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量在制剂(F1至F3)中根据缓冲盐和加入的赋形剂的量而变化(表3)。
表3：VA2 RPC喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量和稳定性。
Figure BDA0004041476750000893
Figure BDA0004041476750000901
F1中的蛋白质含量为43.1％，组氨酸缓冲盐对喷雾干燥的粉末中的固体含量的贡献较高。在F2中去除赋形剂并且用MQ水洗掉组氨酸缓冲液，使蛋白质含量提高至70.2％。在F3中将蛋白质:DS摩尔-电荷比降低至1:0.6，然后洗掉组氨酸缓冲盐并且减少加入的赋形剂的量，导致最终蛋白质含量为63.0％。
利用SEC和IEC评估喷雾干燥过程中的蛋白质稳定性。在所有制剂中，在化学稳定性(IEC)方面未观察到显著变化。但是，利用SEC观察到高分子量物质(HMWS)增加，尤其是在F2中，可能是由于在喷雾干燥过程中不存在组氨酸缓冲液和赋形剂来保护RPC。事实上，在F3中，加入一半赋形剂能够减少HMW物质。因此，F3似乎是一种良好的折衷方案，可优化最终喷雾干燥的粉末中的蛋白质含量，并且确保喷雾干燥过程中的蛋白质稳定性。
2.3喷雾干燥的RPC的重悬
对一系列非极性溶剂作为重悬介质进行测试，这些溶剂包括油酸乙酯、三醋精、Transcutol(二甘醇单乙醚)、四氢呋喃聚乙二醇醚和异山梨醇二甲醚。将RPC喷雾干燥的粉末掺入相应体积的溶剂中，达到100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL和250mg/mL，然后均质化。
在用PBS稀释后，评估浓缩或重悬于非水介质中后的RPC解离。在PBS中解离后，使用DSC和nanoDSF评估喷雾干燥的RPC粉末的解链温度。利用SEC和IEC评估浓缩或重悬于非水介质中后的蛋白质稳定性。如实例1中所述，对高浓度制剂的粒径和粘度进行评估。
VA2 RPC喷雾干燥的粉末悬浮于NAS中产生白色悬浮液(图7)。
将110mg RPC喷雾干燥的粉末溶于0.25mL PBS中后，最终体积为0.29mL。固体含量的贡献为0.04mL(总体积的约14％)。在制备具有不同浓度的VA2 RPC-NAS悬浮液时，考虑到这一体积(例如，将喷雾干燥的粉末溶于0.26mL NAS中，以使总体积达到0.3mL)。NAS中VA2的目标浓度和实际浓度列于表4中。
表4：NAS中的目标蛋白质浓度和实际蛋白质浓度、其相应的粘度和稳定性(SEC和IEC)。
Figure BDA0004041476750000911
VA2 RPC SD粉末在PBS 10mM中以213mg/mL的浓度解离产生非常粘稠的溶液(275cP，表4)。VA2 RPC SD粉末悬浮于NAS中与PBS相比，产生较低的粘度，在193mg/mL至223mg/mL的浓度范围内，粘度范围为20cP至70cP(表4)。用NAS进行短时间孵育后的蛋白质稳定性评估表明，四氢呋喃聚乙二醇醚和IDME内的HMWS增加。在三醋精、Transcutol和EO内也观察到蛋白质聚集，但程度较低(表4)。来自IEC的结果也表明，与四氢呋喃聚乙二醇醚和IDME相比，在三醋精、Transcutol和EO内具有更高的稳定性。尽管粘度降低，但由于溶液的粒径大，因此无法通过26G针头进行注射。
实例3：概念的普遍性
3.1使用不同蛋白质的概念的普遍性
使用不同蛋白质形式(mAb、双特异CrossmAb、细胞因子融合mAb、DutaFab)并且以硫酸葡聚糖作为络合剂，在1:1摩尔-电荷比下评估RPC的可行性。
本发明人使用分子量为40kDa的硫酸葡聚糖作为络合剂。据报道，DS平均每个单体具有两个负电荷，相当于每摩尔聚合物具有240个负电荷。根据氨基酸序列计算各蛋白质的正电荷数，并且汇总于表5中。因此，对应于各蛋白质与DS之间的摩尔-电荷比为1:1的蛋白质:DS络合重量比汇总于表5中。
表5：利用对应于摩尔-电荷比为1:1的蛋白质与络合剂硫酸葡聚糖(DS)之间的重量比制备可逆蛋白质络合物。
Figure BDA0004041476750000921
研究表明，使用对应于不同蛋白质形式(mAbs、双特异CrossmAb、融合mAb、DutaFab)所测试的不同蛋白质能够形成RPC，其络合百分比在96.1±1.4％至99.5±0.3％的范围内(图8)。就不同的蛋白质形式而言，该概念的可逆性也得到确认，PBS 10mM中的解离百分比在96.5±1.6％至105.4±0.8％的范围内。络合和解离在室温下均瞬间完成。因此，RPC概念适用于各种生物制剂。
蛋白质与DS络合并且随后在PBS 10mM中解离后，不影响蛋白质的稳定性。SEC和IEC结果显示，在络合和解离前后使用所测试的不同蛋白质获得的单体和主峰的百分比之间无显著差异(表6)。
表6：在络合之前和络合-解离之后，利用SEC获得的不同蛋白质的单体百分比以及利用IEC获得的不同蛋白质的主峰百分比。*分析方法不可用。
Figure BDA0004041476750000931
3.2使用不同络合剂的概念的普遍性
还使用不同的络合剂(CA)(包括硫酸葡聚糖(DS)、硫酸软骨素(CS)、SDS和牛磺胆酸钠(ST))并且以双特异性CrossmAb(VEGF-Ang2)作为蛋白质模型，对RPC的可行性进行了评估。用组氨酸缓冲液(20mM,pH 5.0)制备5mg/mL的蛋白质溶液并且制备50mg/mL的络合剂溶液，并且在不同的蛋白质:CA摩尔-电荷比下进行络合。
优化的蛋白质(VEGF-Ang2)与络合剂的摩尔-电荷比以及对应的体积比汇总于表7中。通常，对于VEGF-Ang2和DS，本发明人先前在1:1的摩尔-电荷比评估了100％的络合和解离。比率优化表明，即使在1:0.6的比率下也能够达到相同的络合-解离效率，该比率对应于蛋白质完全络合所需要加入的最少DS。这表明，基于蛋白质序列的理论电荷计算方法高估DS可用于络合的正电荷数，因此提供100％电荷中和所需的DS的实际量低于计算量。重要的是要注意，本发明人考虑的是分布在蛋白质上的正电荷总数，而不是蛋白质净电荷，因为蛋白质净电荷将低估电荷添加的正电荷数。
表7：用于制备可逆蛋白质络合物(RPC)的VEGF-Ang2与不同络合剂(CA)之间的优化的摩尔-电荷比和重量比。
Figure BDA0004041476750000941
当将DS、SDS和CS加入蛋白质溶液中时，在pH 5.0(约100％)下发生络合。当使用ST时，仅在将缓冲溶液的pH调节至4.0后发生络合；此外，需要3小时孵育时间才能达到100％络合(图9)。
用DS或CS形成的RPC的解离是即时和完全的。使用SDS和ST形成的RPC需要更长时间才能解离；使用具有更高离子强度(100mM)的PBS加快了解离过程(对于SDS和ST，分别是96.1％和89.4％，图5)。
SEC分析显示，当使用DS和CS时，蛋白质在络合和解离后具有良好的稳定性。但是，ST以及甚至更多的SDS导致蛋白质明显降解。这些结果也通过IEC得到确认(表8)。
表8：在络合前和使用不同的络合剂进行络合-解离后，利用SEC获得的双特异性mAb的单体百分比以及利用IEC得到的主峰百分比。
Figure BDA0004041476750000942
实例4：概念的稳健性
利用一系列蛋白质浓度、缓冲液类型、pH和离子强度评估RPC形成的稳健性，以确定RPC形成的最佳条件。
4.1蛋白质浓度的影响
使用组氨酸缓冲液中浓度范围为1mg/mL至100mg/mL的蛋白质评估RPC形成。用组氨酸缓冲液(20mM,pH 5.0)将VEGF-Ang2渗析后的储备液(130mg/mL)稀释至100mg/mL、50mg/mL、40mg/mL、30mg/mL、25mg/mL、20mg/mL、5mg/mL和1mg/mL。将相应体积的DS(50mg/mL)以1:1的摩尔电荷比(重量比为1:0.167)加入1mL每种浓度的蛋白质溶液中。在离心后评估络合百分比，并且在PBS 10mM中评估解离百分比。
在不同蛋白质浓度下，确定VA2与DS的络合和解离的百分比(图10)。结果表明，在1mg/mL至至少100mg/mL(评估的最高浓度)的任何蛋白质浓度下均发生络合。尽管在1mg/mL至40mg/mL范围内的蛋白质浓度下络合百分比在96.7±2.4％至99.5±0.0％的范围内；但由于与高蛋白质浓度相关联的高粘度阻碍络合剂扩散到溶液中并且到达每个蛋白质分子以实现均匀的蛋白质络合，因此在高于40mg/mL的浓度下的络合受到限制。
在蛋白质浓度为1mg/mL至40mg/mL时形成的络合物的解离百分比在98.1±2.3％至82.3±5.4％的范围内，在较高浓度下，解离百分比较低。因此，将实现完全络合和解离的最佳蛋白质浓度范围定义为1mg/mL至5mg/mL(图10)。
还发现用于络合的初始蛋白质浓度对最终RPC粒径分布有影响(表9和图11)。
表9：与DS以不同的蛋白质浓度络合后的RPC粒径。
Figure BDA0004041476750000951
4.2缓冲液强度和pH对络合的影响
在5mg/mL的蛋白质浓度以及与DS的1:1摩尔-电荷比下，使用具有在5mM至50mM范围内的离子强度和1至7范围内的pH的组氨酸缓冲液评估RPC形成；并且用柠檬酸盐缓冲液(10mM至20mM，pH 5.0)进行评估。还使用超纯水(MilliQ水)作为介质评估RPC形成。将蛋白质储备液相对于超纯水(MilliQ水)渗析，然后用超纯水(MilliQ水)中稀释至5mg/mL。通过将蛋白质溶液与DS(50mg/mL，在超纯水(MilliQ水)中)溶液以1:1的摩尔-电荷比混合来制备络合物。在离心后评估络合百分比，并且在PBS 10mM中评估解离百分比。
使用在1至7范围内的不同pH下的组氨酸缓冲液20mM评估络合百分比(图12)。确定它们在PBS中的相应的解离百分比。
当pH为1至5.5时，络合百分比在98.6±1.0％至99.2±0.9％的范围内；当pH为6时，络合百分比为93.5±0.2％；当pH为7时，络合百分比为1.3±0.4％。相应的络合百分比在98.1±4.6％至109.2±3.8％的范围内(图12)。因此，用于络合的最佳缓冲液pH范围为4.5至5.5，以便确保完全络合和蛋白质稳定性(强酸性pH可能导致蛋白质降解)。
另一方面，在5mM至50mM范围内的不同离子强度下，在组氨酸缓冲液pH 5中评估络合百分比(图13)。确定它们在PBS中的相应的解离百分比。
当离子强度在20mM至50mM的范围内时，络合百分比在98.6±1.0％至99.9±0.1％的范围内；当离子强度为10mM时，络合百分比为82.2±0.2％；当离子强度为5mM时，络合百分比为66.3±0.3％。相应的络合百分比在98.9±1.4％至109.9±0.9％的范围内(图13)。尽管使用组氨酸缓冲液50mM的RPC制剂表现出颗粒沉淀，然后形成凝胶状贮库。因此，用于络合的最佳缓冲离子强度在20mM至30mM的范围内，以便确保完全络合和制剂稳定性。
发明人在本研究中主要使用组氨酸缓冲液，尽管使用其他缓冲液也发生络合，包括使用柠檬酸盐缓冲液20mM pH 5时，络合百分比为97.2±2.0％并且解离百分比为108.0±1.1％。
4.3缓冲液强度、pH和体积对解离的影响
使用不同介质评估复合物解离，这些介质包括PBS 10mM(pH 7.4,NaCl 137mM)、磷酸盐缓冲液10mM(pH 7.4)以及含有盐水的组氨酸缓冲液20mM(pH 5.0,NaCl 137mM)。将RPC悬浮液用相应的介质稀释至1mg/mL，涡旋，然后通过目视检查样品来评估解离情况；当溶液澄清时，利用UV测量蛋白质含量以确定解离百分比。
在不同的RPC:PBS稀释比(1:4、1:2、1:1.5和1:1)下，通过将100μL、100μL、200μL、250μL RPC与400μL、300μL、300μL、250μL PBS 10mM混合，评估RPC 5mg/mL瞬时完全解离所需的PBS(10mM pH 7.4)体积。确定最终溶液的解离百分比和pH。
测试不同的缓冲液离子强度和pH以解离RPC颗粒。RPC颗粒在PBS内立即完全解离，产生澄清溶液。用磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.4)稀释RPC，由于RPC颗粒不完全解离(约50％解离)而产生混浊的溶液；NaCl的加入使RPC颗粒能够完全解离。RPC在含有盐水的组氨酸缓冲液(20mM,pH 5.0)中的解离百分比甚至更低(约17％)，其中NaCl的加入也使RPC颗粒能够完全解离。因此，用于实现完全RPC解离的最佳缓冲液是PBS(10mM,pH 7.4)(在一些情况下也可以使用100mM来加快解离过程)。就PBS体积而言，RPC颗粒完全解离需要至少2:1的PBS:RPC比率，导致制剂中的pH增加至至少6.5才可完全解离。
4.4赋形剂的影响
通过将蔗糖和/或表面活性剂加入制剂缓冲液中来评估蛋白质制剂中使用的通用赋形剂对RPC形成的影响。在与DS(1:1摩尔-电荷比)络合之前，向用组氨酸缓冲液(20mM,pH5.0)稀释至5mg/mL的蛋白质溶液中加入蔗糖、聚山梨酯20和/或泊洛沙姆188(制剂F1至F6，表10)，然后确定相应的络合和解离百分比。
表10：加入组氨酸缓冲液中的RPC制剂中的另外的赋形剂。
Figure BDA0004041476750000971
添加剂(蔗糖、聚山梨酯20和/或泊洛沙姆188)的百分比不影响RPC形成。络合百分比在99.2％至99.6％的范围内。添加剂也不影响PBS中的RPC解离，解离百分比在92.3％至97.5％的范围内(图14，图15)。
在代替组氨酸缓冲液的超纯水(MilliQ水)中，VA2与DS无法络合。缓冲液是RPC形成所必需的(图15)。
实例5：短期稳定性研究
实施一项短期研究，评估RPC制剂中的蛋白质(120mg/mL)在不同温度下以及存在或不存在添加剂(蔗糖、泊洛沙姆188、聚山梨酯20)的情况下的稳定性。RPC制剂(F1至F4)在组氨酸缓冲液中配制，并且将其与制剂F5(其中利用透析将组氨酸缓冲液与超纯水(MilliQ水)交换)进行比较。
RPC悬浮液在60mg/mL(F6)下成功冻干，并且产生均匀的饼状物，其在PBS中易于复溶(和解离)至最终浓度为120mg/mL，产生透明溶液(图17)。
为评估冷冻干燥和RPC悬浮液复溶的可行性，将F6浓缩至60mg/mL，将2mL灌装到6mL小瓶中，然后将样品置于冻干机中进行冷冻干燥。F6应复溶于0.85mL PBS中，得到最终浓度分别为120mg/mL、240mM和0.05％的VA2、蔗糖和PS 20。
对RPC制剂与标准蛋白质溶液(F7；药物产品液体溶液120mg/mL)中的蛋白质稳定性进行比较。
将0.5mL制剂F1至F5和F7灌装到2mL玻璃小瓶中，然后与冻干样品一起在稳定室(5℃、25℃和40℃)中储存四周。不同制剂的组成列于表11中。
在不同时间点，在外观、蛋白质含量(UV)、物理和化学稳定性(SEC,IEC)以及粘度方面监测制剂的稳定性。
表11：制备用于稳定性研究的不同制剂的组成。
Figure BDA0004041476750000981
Figure BDA0004041476750000991
浓缩至120mg/mL的RPC制剂(F1至F4)在初始时间为液体悬浮液，并且在不同制剂在5℃储存储存4周后未观察到变化。但是，在25℃或40℃储存4周后，观察到一些外观变化，包括形成硬饼状物，其中在一些制剂中形成具有或不具有凝胶外观的收缩沉淀(图16)。这些硬饼状物是不可逆的，需要磁力搅拌器和涡流来重悬RPC颗粒和复溶悬浮液。另一个有趣的观察结果发生于在PBS中解离期间。在5℃和25℃储存4周后，RPC颗粒完全解离；但是，储存于40℃的制剂中RPC颗粒的解离使得用PBS稀释时部分形成混浊的溶液。
有趣的是，当F5在25℃和40℃储存4周后，未观察到存在于F1至F4制剂中的硬饼状物。
5.1解离后的蛋白质含量回收率
在PBS中解离后，在不同RPC悬浮液(F1至F5)中测得的蛋白质浓度显示，在5℃和25℃储存4周后，蛋白质含量的回收率为92.7％至107.0％。但是，在40℃储存4周后，由于RPC颗粒的解离不完全，蛋白质含量的回收率在8.7％至16.8％的范围内(表12)。
在5℃、25℃和40℃储存4周后，将RPC冻干物(F6)复溶于PBS后，回收的总蛋白质含量的回收率在101.1％±1.6％至105.0％±0.4％的范围内(表12)。冻干RPC悬浮液可以解决RPC悬浮液在40℃下储存后观察到的不完全解离的问题。
在所有温度下储存期间，F7中的蛋白质含量均保持稳定(表12)。
表12：VA2 RPC制剂(F1至F5)和VA2对照溶液(F6)的初始蛋白质浓度以及在不同温度下储存4周后的蛋白质含量回收率。
Figure BDA0004041476750000992
Figure BDA0004041476750001001
5.2蛋白质稳定性
对储存4周后RPC制剂(F1至F4)中的蛋白质进行SEC和IEC分析，结果表明，在PBS中解离后，在5℃下具有良好的稳定性。在25℃储存4周后，利用SEC观察到单体损失1.9％至2.5％，并且利用IEC观察到主峰损失5.1％至5.7％。在40℃储存4周后，利用SEC观察到单体损失22.0％至28.8％，并且利用IEC观察到主峰损失41.6％至45.7％(表13)。
SEC分析清晰地表明，VA2 RPC悬浮液在超纯水(MilliQ水)(F5)中不稳定，因为在25℃和40℃储存4周后分别观察到单体损失8.7％和55.4％。
在冷冻干燥过程(F6)前后未观察到显著差异，利用SEC分析获得的单体百分比分别为96.5％和96.8％。对RPC冻干物中单体百分比的跟踪显示，在5℃和25℃储存至少4周后，单体保持稳定；在40℃下观察到单体损失1.5％。类似地，在冷冻干燥过程前后利用IEC分析未观察到显著差异，主峰百分比分别为66.1％和66.3％。对RPC冻干物中主峰百分比的跟踪显示，在5℃储存4周后，主峰保持稳定，在25℃下损失1.7％，并且在40℃下损失5.4％。
在所有温度下储存4周后，对照制剂(F7)中通过SEC测得的单体的蛋白质百分比保持稳定；在5℃储存4周后，通过IEC测得的主峰百分比表现出良好的稳定性，25℃和40℃下的主峰损失分别为2.4％和22.9％。
5.3粘度
粘度测量结果表明，组氨酸缓冲液中的RPC悬浮液(F1至F4)的粘度无显著差异；不同赋形剂似乎对最终的RPC粘度无显著影响。总体而言，与对照药物产品溶液(F7)相比(粘度为20cP)，RPC悬浮液中VA2制剂的粘度较低(10cP至12cP)。用超纯水(MilliQ水)交换组氨酸缓冲液后，粘度明显下降(F5)，从10cP降至4cP。在冻干的RPC悬浮液在PBS中复溶后(F6)，粘度与RPC悬浮液相比略有增加(16cP)，但是仍然低于对照(F7)(表13)。
表13：VA2 RPC和对照制剂(120mg/mL)的初始粘度，以及在不同温度下储存4周后，利用SEC得到的平均单体百分比和利用IEC得到的主峰百分比。
Figure BDA0004041476750001011
*未进行分析。**在PBS中复溶后。
实例6：RPC的透析
在前面的实例中，当某些RPC样品储存于25℃和40℃时观察到“硬饼状物”的形成。这种现象影响样品的外观(样品可能看起来“收缩”)，即使施加搅拌，颗粒也无法再完全重悬。将初始样品缓冲液(20mM组氨酸缓冲液pH 5)与相同但新鲜的缓冲液或超纯水交换，可在相同的储存条件下改善样品性能。通过离心进行缓冲液交换，其中蛋白质-聚合物络合物(RPC颗粒)发生沉降，除去上清液，然后将沉淀物中的络合物重悬于新鲜缓冲液或超纯水中。对样品的分析表明，当利用尺寸排阻色谱进行分析时，新鲜组氨酸缓冲液和超纯水中RPC络合物的粒径相当(即，在μm范围内)，而超纯水中解离的蛋白质的物理稳定性较低。
后续实验的目的是探索缓冲液交换的替代方法(例如透析)，并且进一步研究并且确认以这种方式处理的样品的外观的改善。
方法
用20mM组氨酸缓冲液(pH 5)制备浓度为5mg/mL的VEGF-Ang 2(VA2)蛋白质储备液。为形成蛋白质-聚合物络合物，在磁力搅拌器上恒定混合下，将50mg/mL络合聚合物(葡聚糖硫酸钠盐)在20mM组氨酸缓冲液(pH 5)中的溶液逐渐加入蛋白质中。
始终评估所制备的样品的络合百分比，发现其络合百分比>98％。
下一步，将络合溶液分成体积相等的3份：一份相对于超纯水进行渗析；另一份相对于新鲜组氨酸缓冲液进行渗析；最后一份用作对照，不经进一步操作。使用MWCO为10kDa至100kDa的透析盒或管进行透析。
透析后，回收样品，并且通过离心将蛋白质浓度调节至120mg/mL。收集含有蛋白质-聚合物络合物的沉淀物并且弃去上清液。
将获得的样品灌装到2mL玻璃小瓶中，加塞，卷压，并且储存于不同条件(即，5℃、25℃、30℃或40℃)下。
在预定义的时间点，表征蛋白质-聚合物络合物在10mM磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中解离之前的外观并且通过激光衍射或动态光散射技术(取决于预期粒径)测量其粒径。解离后，分别利用体积排阻色谱和离子交换色谱确定蛋白质的大小和电荷异构体。
结果
当渗析的样品(相对于超纯水或新鲜组氨酸缓冲液渗析)在任何储存条件下储存1个月后，未观察到“硬饼状物”形成。对于相对于超纯水渗析的样品，悬浮液看起来更接近液态，并且沉降的颗粒量更少，而相对于组氨酸缓冲液渗析的样品则更接近“糊状”并且更致密。通过搅拌可以完全重悬。相比之下，在储存于25℃和40℃的对照样品中检测到“硬饼状物”的形成(图18和图19)。
令人惊讶的是，对于相对于超纯水渗析的样品，测得的粒径明显低于组氨酸缓冲液中的样品(对照或相对于新鲜缓冲液渗析)。这是粒径首次处于nm范围内，而后者(如先前所测量和报告的)在μm范围内(图20)。此外，当通过离心将缓冲液交换为超纯水时，RPC的粒径也在μm范围内，这可能意味着通过透析进行缓冲液交换可以更好地“冲洗”颗粒并且实现更有效的缓冲液交换。
在储存于40℃的样品中仍然观察到络合物的不完全解离，意味着络合蛋白质无法完全回收(表14)。
与对照相比，相对于超纯水渗析的样品的稳定性较低(表14)。
表14：对于RPC悬浮液对照以及相对于超纯水(MilliQ)渗析的RPC悬浮液，利用SEC获得的单体百分比和利用IEC获得的主峰百分比。
Figure BDA0004041476750001031
*未进行分析

Claims (103)

1.一种用于产生包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使蛋白质与络合剂在缓冲溶液中接触，
其中所述络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素，并且
其中所述蛋白质和所述络合剂在包含于所述缓冲溶液中时具有相反的净电荷；
b)在所述缓冲溶液中使所述蛋白质与所述络合剂之间形成RPC；以及
c)获得包含在步骤(b)中形成的所述RPC的悬浮液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述络合剂为硫酸葡聚糖，特别是分子量为40kDa的硫酸葡聚糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述缓冲溶液的pH调节至低于所述蛋白质的等电点。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中将所述缓冲溶液的pH调节至低于所述蛋白质的等电点2至5个pH单位，特别是低于所述蛋白质的等电点3个pH单位。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述缓冲溶液具有在1至6的范围内的pH，特别是其中所述缓冲溶液具有在3至6的范围内的pH，特别是其中所述缓冲溶液具有在4.5至5.5的范围内的pH。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述缓冲溶液具有在20mM至50mM的范围内的离子强度，特别是其中所述缓冲溶液具有在20mM至30mM的范围内的离子强度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述缓冲溶液包含作为缓冲剂的组氨酸或柠檬酸盐。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中包含所述蛋白质和所述络合剂的所述缓冲溶液通过混合包含所述蛋白质的第一溶液与包含所述络合剂的第二溶液获得。
9.根据权利要求8所述的方法，其中包含所述蛋白质的所述第一溶液和/或包含所述络合剂的所述第二溶液包含缓冲剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述蛋白质与所述络合剂以1:0.2至1:2的范围内的摩尔-电荷比接触，特别是其中所述蛋白质与所述络合剂以1:0.2至1:1的范围内的摩尔-电荷比接触。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述蛋白质与所述络合剂在所述缓冲溶液中以在1mg/mL至40mg/mL、特别是1mg/mL至5mg/mL的范围内的蛋白质浓度接触。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为抗体、生长因子、激素、细胞因子、酶或前述任一者的片段和/或融合蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体为抗体，特别是其中所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体-药物缀合物或抗体片段。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述络合剂在包含于所述缓冲溶液中时具有负净电荷。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述络合剂包含疏水部分。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中包含所述RPC的所述组合物包含至少一种赋形剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种赋形剂在所述RPC的所述形成之前和/或之后添加至所述组合物。
18.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述至少一种赋形剂为稳定剂和/或表面活性剂。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下进一步的步骤：交换包含所述RPC的所述悬浮液的液体级分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中包含所述RPC的所述悬浮液的所述液体级分通过离心包含所述RPC的所述悬浮液并且将沉降的RPC重悬于缓冲溶液或水中来交换。
21.根据权利要求19所述的方法，其中包含所述RPC的所述悬浮液的所述液体级分通过相对于缓冲溶液或水透析包含所述RPC的所述悬浮液来交换。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下进一步的步骤：富集所述悬浮液中的所述RPC以获得富集的RPC悬浮液。
23.根据权利要求22所述的方法，其中富集所述悬浮液中的所述RPC包括以下步骤：
a)离心包含所述RPC的所述悬浮液，以获得包含富集的RPC悬浮液的上清液和沉淀物；以及
b)从所述沉淀物中去除所述上清液，以获得富集的RPC悬浮液。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述富集的RPC悬浮液的液体级分在富集步骤期间至少部分地被替换为非水溶剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述非水溶剂为三乙酸甘油酯、二乙二醇单乙醚或油酸乙酯。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下进一步的步骤：冻干包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液以获得冻干物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在冻干步骤之前，将至少一种冷冻保护剂添加至包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述至少一种冷冻保护剂选自由以下项组成的组：糖、氨基酸、甲胺、易溶盐、多元醇、丙二醇、聚乙二醇和普郎尼克类。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中在所述冻干步骤之前，将包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液的蛋白质浓度调节至10mg/mL至100mg/mL，特别是调节至40mg/mL至80mg/mL。
30.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下进一步的步骤：喷雾干燥包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液以获得喷雾干燥的粉末。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在喷雾干燥步骤之前，将包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液的蛋白质浓度调节至1mg/mL至10mg/mL，特别是调节至1mg/mL至5mg/mL。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中在所述喷雾干燥步骤之前交换包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液的所述液体级分。
33.根据权利要求32所述的方法，其中交换包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液的所述液体级分降低所述悬浮液中的至少一种缓冲剂、络合剂和/或赋形剂的浓度。
34.根据权利要求33所述的方法，其中在交换所述悬浮液的所述液体级分之后，包含所述RPC的所述悬浮液或所述富集的RPC悬浮液基本上不含缓冲剂。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中在所述喷雾干燥步骤之前交换所述悬浮液的所述液体级分，以获得在1:0.2至1:1之间、特别是在1:0.4至1:0.8之间的所述蛋白质与所述络合剂之间的摩尔-电荷比。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中喷雾干燥在115℃的入口温度和/或48℃的出口温度进行。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其中喷雾干燥以17mL/min的进料速率进行。
38.根据权利要求30至37中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下进一步的步骤：将所述喷雾干燥的粉末重悬于非水溶剂(NAS)中以获得RPC-NAS悬浮液。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述非水溶剂为选自由以下项组成的组的至少一者：二乙二醇单乙醚、油酸乙酯、三乙酸甘油酯、异山梨醇二甲醚和四氢呋喃聚乙二醇醚。
40.根据权利要求39所述的方法，其中将所述喷雾干燥的粉末重悬，以获得蛋白质浓度在50mg/mL至300mg/mL的范围内、特别是在100mg/mL至250mg/mL的范围内的RPC-NAS悬浮液。
41.一种包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物，其中所述组合物通过根据权利要求1至40中任一项所述的方法获得。
42.一种包含可逆蛋白质络合物(RPC)的组合物，其中所述RPC包含蛋白质和络合剂，并且
其中所述络合剂为硫酸葡聚糖或硫酸软骨素。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述络合剂为硫酸葡聚糖，特别是分子量为40kDa的硫酸葡聚糖。
44.根据权利要求42或43所述的组合物，其中所述蛋白质在包含于所述RPC中时具有正净电荷。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述蛋白质为抗体、生长因子、激素、细胞因子、酶或前述任一者的片段和/或融合蛋白。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、抗体-药物缀合物或抗体片段。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的组合物，其中所述络合剂在包含于所述RPC中时具有负电荷。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的组合物，其中所述络合剂包含疏水部分。
49.根据权利要求42至48中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种赋形剂。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述至少一种赋形剂为稳定剂和/或表面活性剂。
51.根据权利要求42至50中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质在包含于所述RPC中时与未络合的蛋白质相比具有更高的解链温度。
52.根据权利要求42至51中任一项所述的组合物，其中包含所述蛋白质和所述络合剂的所述RPC在生理pH和离子强度下解离。
53.根据权利要求42至51中任一项所述的组合物，其中包含所述蛋白质和所述络合剂的所述RPC在10mM至100mM PBS(pH 7.4，137mM NaCl)中当稀释至蛋白质浓度为0.1mg/mL至10mg/mL时解离。
54.根据权利要求42至53中任一项所述的组合物，其中所述组合物为悬浮液。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述悬浮液用根据权利要求1至25中任一项所述的方法获得。
56.根据权利要求54或55所述的组合物，其中所述悬浮液中的蛋白质浓度在50mg/mL至250mg/mL的范围内，特别是其中所述悬浮液中的蛋白质浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液包含未络合的络合剂。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的组合物，其中包含于所述悬浮液中的所述RPC具有在5μm至20μm的范围内的平均粒径，特别是其中包含于所述悬浮液中的所述RPC具有在6μm至12μm的范围内的平均粒径。
59.根据权利要求54至57中任一项所述的组合物，其中包含于所述悬浮液中的所述RPC具有在100nm至4000nm的范围内的平均粒径，特别是其中包含于所述悬浮液中的所述RPC具有在150nm至2000nm的范围内的平均粒径。
60.根据权利要求54至57中任一项所述的组合物，其中包含于所述悬浮液中的所述RPC具有在0.1μm至20μm的范围内的平均粒径，特别是其中包含于所述悬浮液中的所述RPC具有在0.1μm至12μm的范围内的平均粒径。
61.根据权利要求54至60中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液能够通过26G针注射。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液在4℃和/或25℃至少4周是稳定的。
63.根据权利要求54至62中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液当在20℃测量时，具有在2cP至20cP的范围内、特别是在3cP至15cP的范围内的粘度。
64.根据权利要求54至63中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液的pH低于所述蛋白质的等电点。
65.根据权利要求54至64中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液的pH低于所述蛋白质的等电点1至3个pH单位，特别是其中所述悬浮液的pH低于所述蛋白质的等电点2个pH单位。
66.根据权利要求54至64中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液的pH在1至6的范围内，特别是其中所述悬浮液的pH在4.5至5.5的范围内。
67.根据权利要求54至66中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液包含缓冲剂。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中所述缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
69.根据权利要求54至68中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液具有在20mM至50mM的范围内的离子强度，特别是其中所述悬浮液具有在20mM至30mM的范围内的离子强度。
70.根据权利要求54至66中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液基本上不含缓冲剂。
71.根据权利要求54至70中任一项所述的组合物，其中所述悬浮液进一步包含非水溶剂。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中所述非水溶剂为二乙二醇单乙醚、三乙酸甘油酯或油酸乙酯。
73.根据权利要求42至53中任一项所述的组合物，其中所述组合物为冻干物。
74.根据权利要求73所述的组合物，其中所述冻干物用根据权利要求26至29中任一项所述的方法获得。
75.根据权利要求73或74所述的组合物，其中所述冻干物包含缓冲剂。
76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
77.根据权利要求73至76中任一项所述的组合物，其中所述冻干物包含至少一种冷冻保护剂。
78.根据权利要求77所述的组合物，其中所述至少一种冷冻保护剂选自由以下项组成的组：糖、氨基酸、甲胺、易溶盐、多元醇、丙二醇、聚乙二醇和普郎尼克类。
79.根据权利要求73至78中任一项所述的组合物，其中所述冻干物在40℃至少4周是稳定的。
80.根据权利要求73至79中任一项所述的组合物，其中所述冻干物在液体中复溶至蛋白质浓度在50mg/mL至250mg/mL的范围内，特别是其中所述冻干物在液体中复溶至蛋白质浓度在100mg/mL至200mg/mL的范围内。
81.根据权利要求80所述的组合物，其中所述液体为PBS。
82.根据权利要求80或81所述的组合物，其中重悬的冻干物具有在2cP至20cP的范围内、特别是在10cP至20cP的范围内的粘度。
83.根据权利要求42至53中任一项所述的组合物，其中所述组合物为喷雾干燥的粉末。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述喷雾干燥的粉末的蛋白质含量为按重量计至少40％(w/w)、按重量计至少50％(w/w)、按重量计至少60％(w/w)。
85.根据权利要求83或84所述的组合物，其中所述喷雾干燥的粉末用根据权利要求30至37中任一项所述的方法获得。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的组合物，其中所述喷雾干燥的粉末包含缓冲剂。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中所述缓冲剂为组氨酸或柠檬酸盐。
88.根据权利要求83至85中任一项所述的组合物，其中所述喷雾干燥的粉末基本上不含缓冲剂。
89.根据权利要求83至88中任一项所述的组合物，其中包含于所述喷雾干燥的粉末中的所述RPC具有在5μm至50μm的范围内、特别是在10μm至40μm的范围内、特别是在20μm至35μm的范围内的平均粒径。
90.根据权利要求83至89中任一项所述的组合物，其中所述喷雾干燥的粉末重悬于液体中至所述悬浮液中的蛋白质浓度在50mg/mL至300mg/mL的范围内，特别是其中所述喷雾干燥的粉末重悬于液体中至所述悬浮液中的蛋白质浓度在100mg/mL至250mg/mL的范围内。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述液体为非水溶剂。
92.根据权利要求91所述的组合物，其中所述非水溶剂为选自由以下项组成的组的至少一者：二乙二醇单乙醚、油酸乙酯、三乙酸甘油酯、异山梨醇二甲酯和四氢呋喃聚乙二醇醚，优选二乙二醇单乙醚、油酸乙酯或三乙酸甘油酯。
93.根据权利要求90至92中任一项所述的组合物，其中复溶的喷雾干燥的粉末具有在10cP至100cP的范围内、特别是在20cP至80cP的范围内的粘度。
94.一种药物制剂，其包含根据权利要求41至93中任一项所述的组合物。
95.根据权利要求94所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含根据权利要求54至72中任一项的悬浮液、根据权利要求80至82中任一项的复溶的冻干物或根据权利要求90至93中任一项的重悬的喷雾干燥的粉末。
96.根据权利要求94或95所述的药物制剂，其用作药物。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的药物制剂，其用于治疗自身免疫性疾病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变或动脉粥样硬化。
98.根据权利要求97所述使用的药物制剂，其中所述药物制剂通过如下施用：经皮下，肌内，透皮，眼部诸如结膜下、前房内、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上腔，至脑部诸如腰椎内、鞘内或脑室内，经关节内或通过吸入。
99.根据权利要求94或95所述的药物制剂用于治疗选自由以下项组成的组的疾病的用途：自身免疫性疾病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变和动脉粥样硬化。
100.根据权利要求94或95所述的药物制剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗选自由以下项组成的组的疾病：自身免疫性疾病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变和动脉粥样硬化。
101.一种治疗患有选自由以下项组成的组的疾病的受试者的方法：自身免疫性疾病、免疫失调疾病、癌、肉瘤、胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、阿尔茨海默病、1型或2型糖尿病、淀粉样变和动脉粥样硬化，所述方法包括以下步骤：(a)产生根据权利要求94或95所述的药物制剂；以及(b)向有此需要的受试者施用所述药物制剂。
102.根据权利要求101所述的方法，其中药物组合物经皮下、肌内或透皮施用，特别是其中所述药物组合物经皮下施用。
103.一种皮下、肌内或透皮施用药物制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)产生根据权利要求94或95所述的药物制剂；以及(b)通过皮下、肌内或透皮递送向受试者施用所述药物制剂。
CN202180048641.2A 2020-07-09 2021-07-09 浓缩的蛋白质组合物、它们的制备及其用途 Pending CN115803010A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20184997 2020-07-09
EP20184997.3 2020-07-09
PCT/EP2021/069090 WO2022008699A1 (en) 2020-07-09 2021-07-09 Concentrated compositions of proteins, their preparation and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115803010A true CN115803010A (zh) 2023-03-14

Family

ID=71575033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180048641.2A Pending CN115803010A (zh) 2020-07-09 2021-07-09 浓缩的蛋白质组合物、它们的制备及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230181471A1 (zh)
EP (1) EP4178530A1 (zh)
JP (1) JP2023533173A (zh)
CN (1) CN115803010A (zh)
WO (1) WO2022008699A1 (zh)

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5874540A (en) 1994-10-05 1999-02-23 Immunomedics, Inc. CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies
DE60042785D1 (de) 1999-06-09 2009-10-01 Immunomedics Inc Immuntherapie von autoimmunerkrankungen durch die verwendung von b-zell spezifischen antikörpern
ATE248587T1 (de) * 1999-06-14 2003-09-15 Baxter Int Mikrosphären mit verzögerter wirkstoffabgabe
LT2857516T (lt) 2000-04-11 2017-09-11 Genentech, Inc. Multivalentiniai antikūnai ir jų panaudojimas
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
NZ513418A (en) 2001-08-07 2004-04-30 Univ Massey Vaccine comprising proteins from mycobacterium paratuberculosis
CA2478047C (en) 2002-03-01 2014-01-21 Immunomedics, Inc. Rs7 antibodies
ATE477276T1 (de) 2002-03-01 2010-08-15 Immunomedics Inc Internalisierung von anti cd74 monoklonalen antikörpern und deren verwendungen
AU2003230320A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-11 Peptron Co., Ltd Sustained release formulation of protein and preparation method thereof
CA2489467C (en) 2002-06-14 2015-02-24 Immunomedics, Inc. Humanized monoclonal antibody hpam4
AU2003248982B2 (en) 2002-08-01 2009-12-10 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US7541440B2 (en) 2002-09-30 2009-06-02 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-granulocyte antibodies and methods of use
WO2005012493A2 (en) 2003-07-31 2005-02-10 Immunomedics, Inc. Anti-cd19 antibodies
US20070116768A1 (en) * 2003-12-09 2007-05-24 Michael Chorny Sustained release preparations composed of biocompatible complex microparticles
US7251164B2 (en) 2004-11-10 2007-07-31 Innovative Silicon S.A. Circuitry for and method of improving statistical distribution of integrated circuits
JP5214252B2 (ja) 2005-03-03 2013-06-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド ヒト化ｌ２４３抗体
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
ITTO20080313A1 (it) 2008-04-22 2009-10-23 Marco Colombatti Anticorpo monoclonale isolato o suo frammento legante l'antigene specifico di membrana della prostata, suoi coniugati e suoi usi
KR101388785B1 (ko) * 2011-07-25 2014-04-23 가톨릭대학교 산학협력단 단백질 또는 펩티드 약물과 황산기 함유 다당류로 이루어진 안정적이고 지속적인 약물전달을 위한 약물복합체
MA37794B1 (fr) 2012-07-13 2017-07-31 Roche Glycart Ag Anticorps bispécifiques anti-vegf/anti-ang-2 et leur utilisation dans le cadre du traitement de pathologies vasculaires oculaires

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022008699A1 (en) 2022-01-13
EP4178530A1 (en) 2023-05-17
JP2023533173A (ja) 2023-08-02
US20230181471A1 (en) 2023-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210290525A1 (en) Formulations of antibody
CN105555311B (zh) 稳定的抗体组合物
JP6680827B2 (ja) リポソーム製剤
TWI738632B (zh) 穩定的含有高濃度抗vegf抗體之蛋白質溶液調配物
US11459376B2 (en) Compositions and methods for the delivery of therapeutic biologics for treatment of disease
US11717488B2 (en) Particle formation and morphology
TWI734233B (zh) 抗體調配物
JP7089121B2 (ja) 高濃度の抗ｖｅｇｆ抗体を含有するタンパク質溶液製剤
CN115803010A (zh) 浓缩的蛋白质组合物、它们的制备及其用途
RU2817350C2 (ru) Липосомальные препараты

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40081142

Country of ref document: HK

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination