TWI734233B - 抗體調配物 - Google Patents

抗體調配物 Download PDF

Info

Publication number
TWI734233B
TWI734233B TW108138766A TW108138766A TWI734233B TW I734233 B TWI734233 B TW I734233B TW 108138766 A TW108138766 A TW 108138766A TW 108138766 A TW108138766 A TW 108138766A TW I734233 B TWI734233 B TW I734233B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
formulation
seq
pharmaceutical formulation
vegf
antibody
Prior art date
Application number
TW108138766A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202033180A (zh
Inventor
克里斯汀 烏斯
羅伯特 穆勒
克勞蒂亞 穆勒
馬汀 巫葛
克理斯俊 富雷闕
皮歐特爾 詹 蘇茲塞尼
Original Assignee
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 filed Critical 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Publication of TW202033180A publication Critical patent/TW202033180A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI734233B publication Critical patent/TWI734233B/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M5/00—Devices for bringing media into the body in a subcutaneous, intra-vascular or intramuscular way; Accessories therefor, e.g. filling or cleaning devices, arm-rests
    • A61M5/178—Syringes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

本發明係關於一種雙特異性抗VEGF/ANG2抗體的醫藥調配物及該調配物之製備方法及用途。

Description

抗體調配物
本發明係關於一種針對血管形成素-2 (ANG-2)及人類血管內皮生長因子(VEGF、VEGF-A)之雙特異性抗體(雙特異性抗VEGF/ANG2抗體)之液體醫藥調配物及該調配物之製備方法及用途。
針對血管形成素-2 (ANG-2)及人類血管內皮生長因子(VEGF、VEGF-A)之雙特異性抗體(雙特異性抗VEGF/ANG2抗體)具有治療性意義，尤其作為用於治療及預防治療血管疾病(包括眼部血管疾病)之藥劑。雙特異性抗VEGF/ANG2抗體例如描述於WO2010040508、WO2011/117329或WO2014/009465中。此等抗體抑制Vegf結合至VEGF受體且同時抑制ANG-2結合至Tie2。
作為蛋白質醫藥群之一部分之抗體分子極易受物理及化學降解影響。化學降解包括涉及經由鍵生成或裂解之蛋白質修飾產生新化學個體之任何製程。已知多種化學反應影響蛋白質。此等反應可涉及水解，包括肽鍵之裂解以及脫醯胺、異構化、氧化及分解。物理降解係指高序結構之變化且包括變性、吸附至表面、聚集及沈澱。蛋白質穩定性受蛋白質自身之特徵(例如胺基酸序列、糖基化型態)及外部影響(諸如溫度、溶劑pH、賦形劑、界面或剪切速率)而影響。因此，限定最佳調配條件係重要的，以防止蛋白質在製造、儲存及投與期間發生降解反應。(Manning, M. C.等人 (1989), 「Stability of protein pharmaceuticals」, Pharm Res 6(11), 903-918；Zheng, J. Y., Janis, L. J. (2005), 「Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298」, Int. J. Pharmaceutics 308, 46-51)。當調配物應包括高濃度之抗體時，尤其難以獲得治療性抗體之穩定液體調配物。
因此，本發明之目標為提供具有儘可能少的賦形劑之雙特異性VEGF/ANG2抗體之液體、尤其高濃度調配物，其實現所需給藥且允許經由細針將雙特異性抗體便利地玻璃體內投與患者。
本發明係關於一種雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之液體醫藥調配物、該調配物之製備方法及用途。特定言之，本發明之醫藥調配物用於玻璃體內投與以治療如AMD及DME之眼科疾病。
在一個態樣中，本發明涉及一種液體醫藥調配物，其包含： - 20至150 mg/ml雙特異性抗VEGF/ANG2抗體，其包含人類IgG1子類之恆定重鏈區 - 15至35 mM氯化鈉 - 15至25 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液 pH為5.5±0.5；其中 該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中 i) 特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 1之CDR3H區、SEQ ID NO: 2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區；且 ii) 特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 9之CDR3H區、SEQ ID NO: 10之CDR2H區及SEQ ID NO: 11之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 12之CDR3L區、SEQ ID NO: 13之CDR2L區及SEQ ID NO: 14之CDR1L區， 且其中 iii) 該雙特異性抗體包含人類IgG1子類之恆定重鏈區，該恆定重鏈區包含突變I253A、H310A及H435A及突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)。
在一個實施例中，雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在一個實施例中，雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為法利昔單抗(faricimab)。
在一個實施例中，調配物進一步包含 - 1至20 mM之至少一種穩定劑。
在一個實施例中，調配物進一步包含 - 7.0 mM±2.0 mM甲硫胺酸。
在一個實施例中，調配物進一步包含 - 0.01-0.07% (w/v)界面活性劑。
在一個實施例中，調配物進一步包含 - 0.04% (w/v)±0.02% (w/v)聚山梨醇酯20。
在一個實施例中，調配物進一步包含 - 50-250 mM張力劑。
在一個實施例中，調配物進一步包含 - 160 mM±24 mM蔗糖。
在一個實施例中，調配物基本上不含可見粒子。
在一個實施例中，調配物為穩定調配物。
在一個實施例中，調配物之滲透壓為300±100 mOsm/kg。
在一個實施例中，調配物用於玻璃體內投與。
在一個態樣中，調配物用於治療眼部血管疾病。
在一個實施例中，眼部血管疾病係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、黃斑變性、濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)、早產兒視網膜病(ROP)、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、視網膜血管瘤增生、黃斑毛細管擴張、缺血性視網膜病、虹膜新生血管、眼內新生血管、角膜新生血管、視網膜新生血管、脈絡膜新生血管及視網膜變性，特定言之選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)。
本發明之一個態樣為一種用於製備本發明之醫藥調配物的方法。
本發明之一個態樣為包含本發明之醫藥調配物之小瓶。
本發明之一個態樣為包含本發明之醫藥調配物之預裝藥品之注射器。
本發明之一個態樣為本發明之液體醫藥調配物之凍乾形式。
本發明提供一種雙特異性抗VEGF/ANG2抗體(具有IgG1恆定區)之液體醫藥調配物，其具有適用於眼科使用及玻璃體內應用之寶貴特性：調配物具有低黏度及低濁度(甚至在例如約120 mg/l之高濃度下)，該調配物係穩定的且等張的。此尤其藉由組合20至150 mg/ml (尤其100至140 mg/ml)包含如本文所描述之人類IgG1子類之恆定重鏈區的雙特異性抗VEGF/ANG2抗體、15至35 mM氯化鈉及15至25 mM pH為5.5±0.5之組胺酸緩衝液來達成。
本發明係關於一種包含雙特異性抗VEGF/ANG2之液體醫藥調配物，該雙特異性抗VEGF/ANG2包含人類IgG1子類之恆定重鏈區。
術語「醫藥調配物」係指呈此形式以允許活性成分之生物活性明確有效的製劑，且其不含對調配物所投與之個體具有毒性的額外組分。
如本文中結合本發明之調配物所使用之術語「液體」表示調配物，其在大氣壓下至少在約2℃至約35℃之間的溫度(在一個實施例中，在約2℃至約25℃之間)下為液體。
包含於醫藥調配物中之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之濃度在約20 mg/ml至約150 mg/ml範圍內，特定言之，濃度為120 mg/ml±18 mg/ml，更特定言之，濃度為120 mg/ml±12 mg/ml。在另一實施例中，濃度可為30 mg/ml±4.5 mg/ml。
如本文所用，「抗體」係指包含抗原結合部位之結合蛋白。如本文所用之術語「結合部位」或「抗原結合部位」表示配位體實際上結合之抗體分子之一或多個區域。術語「抗原結合部位」包含抗體重鏈可變域(VH)及抗體輕鏈可變域(VL) (VH/VL對)。
抗體特異性係指抗體對抗原之特定抗原決定基的選擇性識別。舉例而言，天然抗體係單特異性的。
根據本發明之「雙特異性抗體」為具有兩種不同抗原結合特異性之抗體。本發明之抗體對兩種不同抗原具有特異性，VEGF作為第一抗原且ANG-2作為第二抗原。
如本文所用之術語「單特異性」抗體表示具有一或多個結合部位之抗體，該一或多個結合部位中之每一者結合至相同抗原之相同抗原決定基。
如本申請案中所用之術語「價」表示抗體分子中存在之結合部位的指定數目。同樣，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗體分子中存在兩個結合部位、四個結合部位及六個結合部位。根據本發明之雙特異性抗體較佳為「二價」。
如本文所用之術語「結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管形成素-2 (ANG-2)之雙特異性抗體」、「雙特異性抗VEGF/ANG2抗體」及「雙特異性＜VEGF/ANG2＞抗體」可互換，且係指具有至少兩個不同抗原結合部位，第一個結合至VEGF且第二個結合至ANG2之抗體。
雙特異性抗VEGF/ANG2抗體例如描述於WO2010/040508、WO2011/117329、WO2012/131078、WO2015/083978、WO2017/197199及WO2014/009465中。WO2014/009465描述尤其經設計用於治療眼部血管疾病之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體。WO2014/009465 (其全文併入本文中)之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體尤其適用於如本文所描述之眼部血管疾病之治療及治療時程。特定言之，如WO2014/009465中所描述之抗VEGF/ANG2抗體VEGFang2-0016亦描述為法利昔單抗(在World Health Organization (2017).「International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN). Proposed INN: List 118」 WHO Drug Information. 31 (4)中)為本發明之較佳雙特異性抗VEGF/ANG2抗體。
在一個實施例中，結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管形成素-2 (ANG-2)之雙特異性抗體為雙特異性抗VEGF/ANG2抗體，其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中 i) 特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 1之CDR3H區、SEQ ID NO: 2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區；且 ii) 特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 9之CDR3H區、SEQ ID NO: 10之CDR2H區及SEQ ID NO: 11之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 12之CDR3L區、SEQ ID NO: 13之CDR2L區及SEQ ID NO: 14之CDR1L區， 且其中 iii) 該雙特異性抗體包含人類IgG1子類之恆定重鏈區，該恆定重鏈區包含突變I253A、H310A及H435A及突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)。
在一個實施例中，此雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價。
在一個實施例中，此雙特異性二價抗VEGF/ANG2抗體之特徵在於 i) 特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位包含作為重鏈可變域VH之SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，且包含作為輕鏈可變域VL之SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，且 ii) 特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位包含作為重鏈可變域VH之SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，且包含作為輕鏈可變域VL之SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
在本發明之一個態樣中，根據本發明之此雙特異性二價抗體之特徵在於包含 a) 特異性結合至VEGF之第一全長抗體之重鏈及輕鏈； b) 特異性結合至ANG-2之第二全長抗體之經修飾之重鏈及經修飾之輕鏈，其中恆定域CL及CH1彼此替換。
特異性結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管形成素-2 (ANG-2)之雙特異性抗體之此雙特異性二價抗體類型描述於WO 2009/080253 (包括經臼包杵(Knobs-into-Hole)修飾之CH3域)中。將基於此雙特異性二價抗體類型之抗體命名為CrossMAb。
在一個實施例中，此雙特異性二價抗VEGF/ANG2抗體之特徵在於包含 a)SEQ ID NO: 17之胺基酸序列作為第一全長抗體之重鏈，及SEQ ID NO: 18之胺基酸序列作為第一全長抗體之輕鏈，及 b)SEQ ID NO: 19之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾之重鏈，及SEQ ID NO: 20之胺基酸序列作為第二全長抗體之經修飾之輕鏈。
在一個實施例中，此雙特異性二價抗VEGF/ANG2抗體之特徵在於包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
因此，本發明之一個實施例為包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位的雙特異性二價抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在一個實施例中，根據本發明之雙特異性二價抗體之CH3域藉由「臼包杵」技術改變，該技術藉由幾個實例詳細描述於例如WO 96/027011, Ridgway J.B.,等人, Protein Eng 9 (1996) 617-621；及Merchant, A.M.,等人, Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681中。在此方法中，改變兩個CH3域之相互作用表面以增加含有此等兩個CH3域之兩條重鏈的雜二聚。(兩條重鏈之)兩個CH3域中之每一者可為「杵」，而另一者為「臼」。二硫橋鍵之引入使雜二聚體穩定(Merchant, A.M,等人, Nature Biotech 16 (1998) 677-681；Atwell, S.,等人J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)且提高產量。
在本發明之一較佳態樣中，根據本發明之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之特徵在於 一條重鏈之CH3域與另一條重鏈之CH3域各自在包含抗體CH3域之間的原始界面之界面處相遇， 其中改變該界面以促進形成雙特異性抗體，其中改變之特徵在於： a) 改變一條重鏈之CH3域， 使得原始界面內之一條重鏈之CH3域與雙特異性抗體內之原始界面之另一條重鏈之CH3域相遇，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在一條重鏈之CH3域之界面內產生突起，該突起可定位於另一條重鏈之CH3域之界面內之空腔中 及 b) 改變另一條重鏈之CH3域， 使得原始界面內之第二CH3域與雙特異性抗體內之原始界面之第一CH3域相遇 胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第二CH3域之界面內產生空腔，在該空腔內可定位第一CH3域之界面內的突起。
因此，本文所描述使用之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之特徵較佳在於 a)之全長抗體之重鏈之CH3域及b)之全長抗體之重鏈之CH3域各自在界面處相遇，該界面包含抗體CH3域之間的原始界面中的改變； 其中i)在一條重鏈之CH3域中 胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在一條重鏈之CH3域之界面內產生突起，該突起可定位於另一條重鏈之CH3域之界面內的空腔中 且其中 ii) 在另一條重鏈之CH3域中 胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，由此在第二CH3域之界面內產生空腔，在該空腔內可定位第一CH3域之界面內的突起。
較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)組成之群。
較佳地，具有較小側鏈體積之該胺基酸殘基選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)組成之群。
在本發明之一個態樣中，兩個CH3域均藉由將作為胺基酸之半胱胺酸(C)引入各CH3域之相應位置以使得可在兩個CH3域之間形成二硫橋鍵而進一步改變。
在一個實施例中，雙特異性抗體在「杵鏈」之CH3域中包含T366W突變，且在「臼鏈」之CH3域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦可例如藉由將S354C突變引入至一個CH3域中且將Y349C突變引入至另一CH3域中使用CH3域之間之額外鏈間二硫橋鍵(Merchant, A.M,等人, Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。
在另一較佳實施例中，雙特異性抗體在兩個CH3域中之一者中包含S354C及T366W突變且在兩個CH3域中之另一者中包含Y349C、T366S、L368A、Y407V突變在另一較佳實施例中，雙特異性抗體在兩個CH3域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3域中之另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變(一個CH3域中之額外Y349C或S354C突變及另一CH3域中之額外S354C或Y349C突變，形成鏈間二硫橋鍵) (始終根據Kabat之EU索引編號(Kabat, E.A., 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。
涵蓋用於增強雜二聚之CH3修飾的其他技術作為本發明之替代方案且描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954及WO 2013/096291中。
在一個實施例中，替代地使用EP 1 870 459A1中所描述之雜二聚方法。此方法基於在兩條重鏈之間的CH3/CH3域界面中的特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸的取代/突變。該多特異性抗體之一個較佳實施例為多特異性抗體之一條重鏈之CH3域中之胺基酸R409D及K370E突變及另一重鏈之CH3域中之胺基酸D399K及E357K突變(根據Kabat之EU索引編號)。
在另一實施例中，該多特異性抗體包含「杵鏈」之CH3域中的胺基酸T366W突變及「臼鏈」之CH3域中的胺基酸T366S、L368A及Y407V突變；且另外包含「杵鏈」之CH3域中的胺基酸R409D及K370E突變及「臼鏈」之CH3域中的胺基酸D399K及E357K突變。
在一個實施例中，替代地使用WO2013/157953中所描述之雜二聚方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3域包含胺基酸T366K突變，且另一條重鏈之CH3域包含胺基酸L351D突變。在另一實施例中，一條重鏈之CH3域進一步包含胺基酸L351K突變。在另一實施例中，另一重鏈之CH3域進一步包含選自Y349E、Y349D及L368E (在一個實施例中L368E)之胺基酸突變。
在一個實施例中，替代地使用WO2012/058768中所描述之雜二聚方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3域包含胺基酸L351Y及Y407A突變，且另一條重鏈之CH3域包含胺基酸T366A及K409F突變。在另一實施例中，另一條重鏈之CH3域在位置T411、D399、S400、F405、N390或K392處進一步包含胺基酸突變。在一個實施例中，該胺基酸突變選自由以下組成之群 a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E及T411W， b) D399R、D399W、D399Y及D399K， c) S400E、S400D、S400R及S400K， d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V及F405W， e) N390R、N390K及N390D， f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F及K392E。
在另一實施例中，一條重鏈之CH3域包含胺基酸L351Y及Y407A突變，且另一條重鏈之CH3域包含胺基酸T366V及K409F突變。在另一實施例中，一條重鏈之CH3域包含胺基酸Y407A突變，且另一重鏈之CH3域包含胺基酸T366A及K409F突變。在另一實施例中，另一重鏈之CH3域進一步包含胺基酸K392E、T411E、D399R及S400R突變。
在一個實施例中，替代地使用WO2011/143545中所描述之雜二聚方法。在一個實施例中，在選自由368及409組成之群之位置將根據WO2011/143545之胺基酸修飾引入重鏈之CH3域中。
在一個實施例中，替代地使用WO2011/090762中所描述之雜二聚方法，其亦使用上述臼包杵技術。在一個實施例中，一條重鏈之CH3域包含胺基酸T366K突變，且另一條重鏈之CH3域包含胺基酸Y407A突變。在一個實施例中，一條重鏈之CH3域包含胺基酸T366K突變，且另一條重鏈之CH3域包含胺基酸Y407T突變。
在一個實施例中，多特異性抗體具有IgG2同型，且替代地使用WO2010/129304中所描述之雜二聚方法。
在一個實施例中，替代地使用WO2009/089004中所描述之雜二聚方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3域包含用帶負電胺基酸之K392或N392之胺基酸取代(在一個實施例中為麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)；在另一實施例中為K392D或N392D突變)，且另一重鏈之CH3域包含用帶正電胺基酸之D399、E356、D356或E357之胺基酸取代(在一個實施例中為離胺酸(K)或精胺酸(R)，在另一實施例中為D399K、E356K、D356K或E357K取代；且在甚至再一實施例中為D399K或E356K突變)。在另一實施例中，一條重鏈之CH3域進一步包含用帶負電胺基酸之K409或R409之胺基酸取代(在一個實施例中為麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)；在另一實施例中為K409D或R409D突變)。在另一實施例中，一條重鏈之CH3域進一步或可替代地包含用帶負電胺基酸之K439及/或K370之胺基酸取代(在一個實施例中為麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))。
在一個實施例中，替代地使用WO2007/147901中所描述之雜二聚方法。在一個實施例中，一條重鏈之CH3域包含胺基酸K253E、D282K及K322D突變，且另一條重鏈之CH3域包含胺基酸D239K、E240K及K292D突變。
在一個實施例中，替代地使用WO2007/110205中所描述之雜二聚方法。
在一個較佳實施例中，此雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價。
在一個實施例中，結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管形成素-2 (ANG-2)之雙特異性二價抗體為雙特異性抗VEGF/ANG2抗體，其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中 i) 特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 1之CDR3H區、SEQ ID NO: 2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區；且 ii) 特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 9之CDR3H區、SEQ ID NO: 10之CDR2H區及SEQ ID NO: 11之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 12之CDR3L區、SEQ ID NO: 13之CDR2L區及SEQ ID NO: 14之CDR1L區， 且其中 iii) 該雙特異性抗體包含人類IgG1子類之恆定重鏈區，該恆定重鏈區包含突變I253A、H310A及H435A及突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)；且其中 iv) 在恆定重鏈區中，T366W突變包含於一個CH3域中，且T366S、L368A、Y407V突變包含於另一CH3域中(根據Kabat之EU索引編號)。
在一個實施例中，結合至人類血管內皮生長因子(VEGF)及人類血管形成素-2 (ANG-2)之雙特異性二價抗體為雙特異性抗VEGF/ANG2抗體，其包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中 i) 特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 1之CDR3H區、SEQ ID NO: 2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區；且 ii) 特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 9之CDR3H區、SEQ ID NO: 10之CDR2H區及SEQ ID NO: 11之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 12之CDR3L區、SEQ ID NO: 13之CDR2L區及SEQ ID NO: 14之CDR1L區， 且其中 iii) 該雙特異性抗體包含人類IgG1子類之恆定重鏈區，該恆定重鏈區包含突變I253A、H310A及H435A及突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)；且其中 iv) 在恆定重鏈區中，S354C及T366W突變包含於一個CH3域中，且Y349C、T366S、L368A及Y407V突變包含於另一CH3域中(根據Kabat之EU索引編號)。
在一個實施例中，此雙特異性二價抗VEGF/ANG2之特徵在於包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
因此，本發明之一個實施例為包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位的雙特異性二價抗體，其特徵在於包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在一較佳實施例中，此雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為法利昔單抗。
如本文所用之術語「VEGF」係指人類血管內皮生長因子(VEGF/VEGF-A)，165個胺基酸之人類血管內皮細胞生長因子(人類VEGF165之前驅體序列之胺基酸27-191：SEQ ID NO: 25；胺基酸1-26表示訊息肽)，及相關之121、189及206個血管內皮細胞生長因子同功異型物，如藉由Leung, D.W.,等人, Science 246 (1989) 1306-9；Houck等人, Mol. Endocrin. 5 ( 1991) 1806 -1814；Keck, P.J.,等人, Science 246 (1989) 1309-12及Connolly, D.T.,等人, J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24所描述；以及天然存在之對偶基因及經處理形式之彼等生長因子。VEGF涉及與腫瘤及眼內病症相關之正常及異常血管新生及新生血管之調節(Ferrara, N.,等人, Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25；Berkman, R.A.,等人., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159；Brown, L.F.,等人, Human Pathol. 26 (1995) 86-91；Brown, L.F.,等人, Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735；Mattern, J.,等人, Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934；及Dvorak, H.F.,等人, Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039)。VEGF為已與幾種來源分離之均二聚糖蛋白且包括幾種同功異型物。VEGF展示對內皮細胞之高度特異性細胞分裂活性。VEGF拮抗劑/抑制劑抑制VEGF結合至其受體VEGFR。已知VEGF拮抗劑/抑制劑包括如WO2014/009465中所描述之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體。
如本文所用之術語「ANG-2」係指人類血管形成素-2 (ANG-2) (或者縮寫為ANGPT2或ANG2) (SEQ ID NO: 24)，其描述於例如Maisonpierre, P.C.,等人, Science 277 (1997) 55-60及Cheung, A.H.,等人, Genomics 48 (1998) 389-91中。發現血管形成素-1及血管形成素-2為選擇性表現於血管內皮內之酪胺酸激酶家族Tie之配位體(Yancopoulos, G.D.等人, Nature 407 (2000) 242-48)。現存在血管形成素家族之四個確定成員。血管形成素-3及-4 (Ang-3及Ang-4)可表示小鼠及人類中相同基因座的廣泛差異的對應物(Kim, I.,等人, FEBS Let, 443 (1999) 353-56；Kim, I.,等人, J Biol Chem 274 (1999) 26523-28)。在組織培養實驗中分別將ANG-1及ANG-2最初鑑別為促效劑及拮抗劑(參見ANG-1: Davis, S.,等人, Cell 87 (1996) 1161-69；及ANG-2: Maisonpierre, P.C.,等人, Science 277 (1997) 55-60)。所有已知血管形成素主要結合至其受體TIE2，且Ang-1及Ang-2兩者均結合至親和力為3 nM (Kd)之TIE2 (Maisonpierre, P.C.,等人, Science 277 (1997) 55-60)。ANG2拮抗劑/抑制劑抑制ANG2結合至其受體TIE2。已知ANG2拮抗劑/抑制劑包括如WO2014/009465中所描述之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體。
本發明之雙特異性抗體之抗原結合部位含有六個互補決定區(complementarity determining region；CDR)，其對抗原之結合部位之親和力有不同程度的貢獻。存在三個重鏈可變域CDR (CDRH1、CDRH2及CDRH3)及三個輕鏈可變域CDR (CDRL1、CDRL2及CDRL3)。CDR及構架區(framework region；FR)之範圍藉由與胺基酸序列之經編譯資料庫比較來確定，其中彼等區域已根據序列之間的變化而定義。
本發明之抗體包含源自人類起源之免疫球蛋白類別IgG1的免疫球蛋白恆定區。
如本文所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指單一胺基酸組合物之抗體分子之製劑。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一個來源或種類之可變區(亦即結合區)及源自不同來源或種類之恆定區之至少一部分的抗體，其通常藉由重組DNA技術製備。包含鼠類可變區及人類恆定區之嵌合抗體係尤其有利的。本發明所涵蓋之「嵌合抗體」之其他形式為其中恆定區已經修飾或相對於原始抗體已發生變化以產生根據本發明之所要特性(尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面)的彼等形式。該等嵌合抗體亦稱為「類別轉換抗體」。嵌合抗體係包含編碼免疫球蛋白可變區之DNA區段及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA區段的免疫球蛋白基因之表現產物。用於產生嵌合抗體之方法涉及此項技術中熟知的習知重組DNA及基因轉染技術。參見例如Morrison, S.L., 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；美國專利第5,202,238號及第5,204,244號。
術語「人類化抗體」係指其中構架或「互補決定區」(CDR)已經修飾以包含與母免疫球蛋白之CDR相比具有不同特異性之免疫球蛋白之CDR的抗體。在一較佳實施例中，將鼠類CDR移植至人類抗體之構架區中以製備「人類化抗體」。參見例如Riechmann, L., 等人, Nature 332 (1988) 323-327；及Neuberger, M.S., 等人, Nature 314 (1985) 268-270。尤其較佳CDR對應於表示識別上文針對嵌合抗體所提及之抗原之序列的CDR。本發明所涵蓋之「人類化抗體」之其他形式為其中恆定區已經另外修飾或相對於原始抗體之恆定區已發生變化以產生根據本發明之特性(尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面)的彼等形式。
如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。人類抗體在目前先進技術(van Dijk, M.A.及van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)中為熟知的。人類抗體亦可在轉殖基因動物(例如小鼠)中製備，該等動物一旦免疫，能夠在無內源性免疫球蛋白產生下產生完整譜系或一系列人類抗體。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該生殖系突變小鼠中將使得人類抗體在抗原攻擊時產生(參見例如Jakobovits, A.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555；Jakobovits, A.,等人, Nature 362 (1993) 255-258；Brueggemann, M.,等人, Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可在噬菌體呈現文庫中產生(Hoogenboom, H.R.,及Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388；Marks, J.D.,等人, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole., 等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77頁 (1985)及Boerner, P., 等人, J. Immunol. 147 (1991) 86-95)。如針對根據本發明之嵌合及人類化抗體已經提及，如本文所用之術語「人類抗體」亦包含在恆定區中經修飾以產生根據本發明之特性的此類抗體，尤其關於C1q結合及/或FcR結合，其例如藉由「類別轉換」，亦即Fc部分之變化或突變(例如自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4突變)。
如本文中所使用，術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組手段所製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如自諸如NS0或CHO細胞之宿主細胞或自對人類免疫球蛋白基因轉殖基因動物(例如，小鼠)分離的抗體或使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現的抗體。此類重組人類抗體具有呈變化形式之可變區及恆定區。根據本發明之重組人類抗體已經受活體內體細胞超突變。因此，重組抗體VH及VL區之胺基酸序列係源自人類生殖系VH及VL序列且與其相關的序列，但可能並非天然存在於活體內之人類抗體生殖系譜系。
如本文所用之「可變區」(輕鏈(VL )之可變區、重鏈(VH )之可變區)或「可變域」表示與抗體結合至抗原直接有關的該對輕鏈及重鏈域中之每一者。可變輕鏈域及可變重鏈域具有相同通式結構，且各域包含序列廣泛保守的，藉由三個「高變區」(或互補決定區(CDR))連接之四個構架(FR)區。構架區採用β-片層組態且CDR可形成連接β-片層結構之環路。各鏈中之CDR藉由構架區保持在其三維結構中且與來自其他鏈之CDR一起形成抗原結合部位。抗體之重鏈及輕鏈CDR3區在根據本發明之抗體之結合特異性/親和力中起尤其重要的作用。術語「抗體之抗原結合部分」在用於本文中時係指抗體之胺基酸殘基，其負責抗原結合。抗體之抗原結合部分包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「構架」或「FR」區為不同於如本文所定義之高變區殘基之可變域區。因此，抗體之輕鏈可變域及重鏈可變域包含：自N端至C端之域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。尤其，重鏈之CDR3係對抗原結合貢獻最多且定義抗體特性的區。CDR及FR區係根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究所(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)之標準定義及/或來自「高變環路」之殘基來確定。
術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合抗體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面群，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及或荷質比特徵。抗原決定基為藉由抗體所結合之抗原之區域。
術語「全長抗體」表示由兩條「全長抗體重鏈」及兩條「全長抗體輕鏈」組成之抗體。「全長抗體重鏈」為在N端至C端方向上由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定重鏈域1 (CH1)、抗體鉸鏈區(HR)、抗體重鏈恆定域2 (CH2)及抗體重鏈恆定域3 (CH3)組成的多肽(縮寫為VH-CH1-HR-CH2-CH3)；及在子類IgE之抗體存在的情況下視情況選用抗體重鏈恆定域4 (CH4)。較佳地，「全長抗體重鏈」為在N端至C端方向上由VH、CH1、HR、CH2及CH3組成的多肽。「全長抗體輕鏈」為在N端至C端方向上由抗體輕鏈可變域(VL)及抗體輕鏈恆定域(CL)組成的多肽(縮寫為VL-CL)。抗體輕鏈恆定域(CL)可為κ或λ。兩條全長抗體鏈經由CL域與CH1域之間及全長抗體重鏈之鉸鏈區之間的多肽間雙硫鍵連接在一起。典型全長抗體之實例為天然抗體，如IgG (例如IgG1及IgG2)、IgM、IgA、IgD及IgE。根據本發明之全長抗體可來自單一種類，例如人類，或其可為嵌合或人類化抗體。根據本發明之全長抗體包含兩個各自藉由VH與VL對形成之抗原結合部位，其均特異性結合至相同抗原。該全長抗體之重鏈或輕鏈之C端表示該重鏈或輕鏈的C端處之最後一個胺基酸。該全長抗體之重鏈或輕鏈的N端表示該重鏈或輕鏈的N端處之最後一個胺基酸。
如本申請案中所用之術語「恆定區」或「恆定域」表示除可變區外之抗體之域之總和。恆定區不直接參與結合抗原，但展現各種效應功能。視其重鏈之恆定區之胺基酸序列而定，抗體分為如下類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類，諸如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgAl及IgA2。對應於不同類別之抗體的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。可見於所有五個抗體類別中之輕鏈恆定區稱為κ及λ。
如本申請案中所用之術語「源自人類之恆定區」表示子類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體之恆定重鏈區及/或恆定輕鏈κ或λ區。此類恆定區為目前先進技術中所熟知且例如藉由Kabat, E. A.所描述(參見例如Johnson, G.及Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218；Kabat, E. A.,等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785- 2788)。
如本文所用，術語恆定重鏈域(或區)定義含有恆定重鏈區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈之C端區。
該術語包括恆定重鏈域之天然序列及變異恆定重鏈域。變異恆定重鏈域包括例如在恆定域中之突變，其用於促進如上文所描述之用於臼包杵技術的雜二聚。亦可包括其他突變，例如L234A (Leu235Ala)、L235A (Leu234Ala)及P329G (Pro329Gly)，因為具有此等突變之恆定域具有經減少之FcR結合(尤其其展示不再與FcRγI、FcRγII及FcRγIII結合)。此尤其適用於減少潛在副作用，例如血栓症(Meyer, T.,等人, J. Thromb. Haemost. 7 (2009) 171-81)。另外例如，突變I253A、H310A及H435A (根據Kabat之EU索引編號)亦可包括於恆定域中，因為具有此等突變之恆定域具有經降低之FcRn一或兩個突變)或經消除之FcRn結合(全部3個突變)。
在一個態樣中，人類IgG重鏈恆定區自丙胺酸118 (A118) (根據Kabat之EU索引編號)延伸至重鏈之羧基端。然而，藉由宿主細胞所產生之抗體可能經歷來自重鏈C端之一或多個(特定言之，一或兩個)胺基酸之轉譯後裂解。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之分裂變異體。此可為重鏈之最末兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat之EU索引編號)的情況。因此，恆定重鏈域之C端離胺酸(Lys447)或甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)可能存在或可能不存在。若未另外指示，則包括恆定重鏈域之重鏈之胺基酸序列在本文中用C端甘胺醯-離胺酸二肽表示。
「穩定」調配物為其中蛋白質(例如抗體)基本上保持其物理及化學穩定性且因此在儲存時，保持其生物活性的調配物；例如其中醫藥調配物中之雙特異性抗體之高分子量含量(HMW)在25℃下8週後低於10% (在一個實施例中低於5%，在一個實施例中低於2.5%)。在一個實施例中，醫藥調配物中之雙特異性抗體之高分子量含量(HMW)在25℃下52週後低於10% (在一個實施例中低於5%)。
在一個實施例中，「穩定液體醫藥調配物」為在冷藏溫度(2-8℃)下至少12個月，尤其2年，且更尤其3年未觀察到顯著變化之液體調配物。穩定性準則如下：如藉由尺寸排阻層析法(SEC-HPLC)所量測經降解之抗體單體不超過10%、尤其5%。此外，藉由目視分析，溶液無色或澄清至略微乳白色。調配物之蛋白質濃度變化不超過+/-10%。形成不超過10%，尤其5%之聚集。藉由此項技術中已知之方法量測穩定性，諸如UV光譜法、尺寸排阻層析法(SEC-HPLC)、離子交換層析法(IE-HPLC)、比濁法及目視檢查。
濁度 ( 以 FTU (= 福爾馬肼濁度單位 ) 為單位 ) 可在濁度計上(例如，在根據Ph. Eur. 2.2.1之Hach 2100 AN濁度計上)測定醫藥調配物之濁度(液體之透明度及乳白度)。將樣品體積為大約2 mL的樣品溶液轉移至11 mm內徑玻璃光析管中。將玻璃光析管置放於濁度計中且相對於參考懸浮液1 FTU、3 FTU、10 FTU、20 FTU及100 FTU之校準曲線量測濁度。
黏度(以mPa為單位)  醫藥調配物之調配物樣品之黏度可在流變儀(例如在1000 s- 1 剪切速率及20℃之溫度下，具有25 mm-0.5°錐度之Anton Paar Physica MCR 301旋轉流變儀)上測定。
可見粒子 在各別檢測機(例如，藉助於2倍放大鏡之Seidenader檢測機V90-T)上目視檢查小瓶樣品。調整照明光源L1、L2及L3至設定5。在旋轉移動期間檢查小瓶樣品是否存在粒子。對於根據USP-NF ＜790＞ (其基本上不含可見粒子)之要求的玻璃體內注射，形成可見粒子係不可接受的。USP-NF ＜790＞規定，當檢測非經腸藥物且觀察到不超過指定數目之單元含有可見微粒時，達到「基本上不含」標準。更特定言之，對於經受100%檢測之非經腸藥物，當批料符合0.65%或更低之可接受之品質水準(AQL)時，符合「基本上不含」標準。且若評估已出貨至客戶之產品變得有必要(例如，由於抱怨或管制問題)，則公司可抽樣且檢測20個單元。若樣品中未觀測到粒子，則認為批料「基本上不含」可見微粒。
蛋白質濃度(以mg/ml為單位)。  藉由在來自Perkin Elmer之UV/Vis光度計λ 35上之紫外(UV)光吸收來量測調配物樣品之蛋白質濃度。將調配物樣品用pH 5.5之20 mM L-組胺酸-乙酸鹽緩衝溶液稀釋至約0.5 mg/mL之蛋白質濃度且填充至厚度為1 cm之量測光析管中。量測光析槽之UV吸收係在280及320 nm之波長下量測。
根據以下方程式，自280 (A280)及320 nm (A320)處所量測之UV光吸收、1.70 mL/(mg×cm)之消光係數(E)、1 cm之厚度(d)及對應於實際稀釋之稀釋因子(DF)來計算蛋白質濃度：
Figure 02_image001
pH  藉由具有玻璃電極之電位計測定調配物樣品之pH。
離子強度  根據方程式1計算調配物之無因次離子強度I：方程式 1
Figure 02_image003
在此表達式中，z為離子I (對於陰離子呈陽性且對於陰離子呈陰性)之電荷數目，bi 為其重量莫耳濃度。bθ 對應於1 mol/kg，且需要使I無因次(Physical Chemistry, P. Atkins, J. de Paula, Oxford Press 第九版, 第194頁)。
使用亨德森-哈塞爾巴爾赫方程式(Henderson-Hasselbalch equation)計算帶電緩衝液種類之重量莫耳濃度(Methods in Enzymology- Guide to Protein Purification, 第 182卷, M.P. Deutscher, Academic Press, Inc., 1990, 第24頁及以後各頁)。
滲透壓  根據冰點下降原理，在來自Gonotec之Osmomat 030 3P滲透計上量測調配物樣品之滲透壓。
界面活性劑  本發明之醫藥調配物包含界面活性劑，以減少抗體聚集及粒子形成。如本文所用之術語「界面活性劑」表示醫藥學上可接受之賦形劑，其用於保護蛋白質調配物免受如攪拌及剪切之機械應力。醫藥學上可接受之界面活性劑之實例包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烷基醚(例如以商標BrijTM 出售之彼等)及聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆(Poloxamer)、普洛尼克(Pluronic))。
較佳地，界面活性劑為聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯或泊洛沙姆。聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯之實例為聚山梨醇酯20(以商標Tween 20TM 出售)及聚山梨醇酯80(以商標Tween 80TM 出售)。聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸較佳為聚山梨醇酯20。
上文所提及之界面活性劑一般以0.01% (w/v)或更高，例如0.01至約0.09% (w/v)之濃度使用。本發明之醫藥組合物中之界面活性劑尤其在約0.02%至約0.06% (w/v)範圍內，更尤其在約0.03%至約0.05% (w/v)範圍內，甚至更尤其以約0.04% (w/v)之濃度使用。
如本文所使用之術語「泊洛沙姆」包括由聚氧丙烯之中央疏水鏈側接聚氧乙烯之兩個親水鏈構成之聚氧乙烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物，稱為泊洛沙姆188，其由BASF (Parsippany, N. J.)以商標名PLURONIC® F68出售。可用於本發明之調配物中之其他泊洛沙姆包括泊洛沙姆403 (以PLURONIC® P123出售)、泊洛沙姆407 (以PLURONIC® P127出售)、泊洛沙姆402 (以PLURONIC® P122出售)、泊洛沙姆181 (以PLURONIC® L61出售)、泊洛沙姆401 (以PLURONIC® L121出售)、泊洛沙姆185 (以PLURONIC® P65出售)、及泊洛沙姆338 (以PLURONIC® F108出售)。
緩衝液  如本文所用之術語「緩衝液」表示醫藥學上可接受之賦形劑，其可穩定醫藥製劑之pH。適合的緩衝液為此項技術中所熟知且可在文獻中找到。用於玻璃體內投與之典型醫藥學上可接受之緩衝液包含但不限於組胺酸緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、丁二酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液或其混合物。在此情形下，特別有利之緩衝液包含L-組胺酸(「組胺酸緩衝液」)或L-組胺酸及L-組胺酸鹽酸鹽之混合物，其中pH值可用此項技術中已知之酸或鹼調節。特別有利之緩衝液包含L-組胺酸(「組胺酸緩衝液」)，尤其用乙酸(例如30%)或鹽酸鹽調節pH之L-組胺酸。以上提及之緩衝液通常以約2 mM至約200 mM或約5 mM至約100 mM之濃度，尤其以約10 mM至約30 mM或約15 mM至約20 mM且更尤其約20 mM之濃度使用。不受所使用緩衝液影響，pH可用此項技術中已知之酸或鹼(例如乙酸、鹽酸、磷酸、硫酸及檸檬酸、氫氧化鈉及氫氧化鉀，尤其用乙酸)調節至4.5至7.0，及尤其5.0至6.0範圍內的值，且最特定言之是調節至pH 5.5±0.2。特別有利之緩衝液為濃度為15至25 mM (在一個實施例中，20 mM±3 mM，特定言之20 mM±2 mM)之組胺酸(L-組胺酸)乙酸鹽緩衝液，pH為5.5±0.5 (在一個實施例中，pH為5.5±0.3；特定言之，pH為5.5±0.2)
穩定劑  術語「穩定劑」表示醫藥可接受之賦形劑，其在製造、儲存及應用期間保護活性醫藥成分及/或調配物免受化學及/或物理降解。蛋白質醫藥之化學及物理降解路徑由Cleland等人(1993), Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4):307-77, Wang (1999) Int J Pharm 185(2):129-88, Wang (2000) Int J Pharm 203(1-2):1-60及Chi等人(2003) Pharm Res 20(9):1325-36綜述。穩定劑包括但不限於糖、胺基酸、多元醇、環糊精(例如羥丙基-β-環糊精、磺基丁基乙基-β-環糊精、β-環糊精)、聚乙二醇(例如PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000、PEG 6000)、白蛋白、人類血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、鹽(例如氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣)、螯合劑(例如如下文所定義之EDTA)。尤其使用於本發明之穩定劑係選自由糖、多元醇及胺基酸組成之群。更特定言之，穩定劑選自由蔗糖、海藻糖、山梨糖醇及甲硫胺酸組成之群。
更佳地，穩定劑為甲硫胺酸。甲硫胺酸首次在本文所描述調配物中用於眼部應用。臨床前安全測試顯示，當例如以玻璃體內投與時，甲硫胺酸展示用於眼部疾病之良好安全概況。
穩定劑可以約2 mM至約600 mM之濃度存在於調配物中，特定言之，若穩定劑為甲硫胺酸，則濃度為約2 mM至約15 mM或5 mM至12 mM；更尤其濃度為約5 mM至9 mM或約7 mM。
在一個較佳實施例中，穩定劑為甲硫胺酸時濃度為7.0 mM±2.0 mM甲硫胺酸(在一個實施例中7.0 mM±1.0 mM甲硫胺酸；在一個實施例中7.0 mM±0.7 mM甲硫胺酸)。甲硫胺酸作為穩定劑尤其適用，因為其可額外作為過氧化氫之清除劑起作用，該過氧化氫用於注射溶液或經封裝之預裝藥品之注射器滅菌。
在一些實施例中，本發明之液體醫藥調配物包含抗氧化劑作為第二穩定劑。「抗氧化劑」為醫藥學上可接受之賦形劑，其防止活性醫藥成分氧化。抗氧化劑包括但不限於螯合劑(諸如EDTA)、檸檬酸、抗壞血酸、丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、亞硫酸鈉、對胺基苯甲酸、麩胱甘肽、沒食子酸丙酯、半胱胺酸、甲硫胺酸、乙醇、苄醇及正乙醯半胱胺酸。抗氧化劑可以約0.01 mM至約100 mM之濃度，尤其以約5 mM至約50 mM之濃度，且尤其以約5 mM至約25 mM之濃度使用。特定言之，選擇甲硫胺酸作為第二穩定劑，尤其濃度為約5 mM至約25 mM，更尤其濃度為約10 mM。
如本文所用之術語「糖」表示單醣或寡醣。單醣為無法被酸水解之單體碳水化合物，包括簡單糖及其衍生物，例如胺基糖。單醣之實例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、去氧核糖、神經胺糖酸。寡醣為由多於一個經由一或多個分支狀或鏈狀糖苷鍵連接之單體醣單元組成之碳水化合物。寡醣內之單體醣單元可相同或不同。視單體醣單元之數目而定，寡醣為二醣、三醣、四醣、五醣等醣。與多醣相反，單醣及寡醣為水溶性的。寡醣之實例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖及棉子糖。特定言之，糖選自蔗糖及海藻糖，特定言之蔗糖。
如本文所用之術語「胺基酸」表示具有位於羧基之α-位置之胺基部分的醫藥學上可接受之有機分子。胺基酸之實例包括精胺酸、甘胺酸、鳥胺酸、離胺酸、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、異白胺酸、白胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、脯胺酸，特定言之甲硫胺酸。
如本文所用之術語「多元醇」表示具有超過一個羥基的醫藥學上可接受之醇。適合之多元醇包含但不限於甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、聚葡萄糖、丙三醇、阿拉伯糖醇、丙二醇、聚乙二醇及其組合。多元醇可以約10 mM至約500 mM之濃度，尤其以約10至約250 mM之濃度，且更尤其以約200至約250 mM之濃度使用。
術語「穩定劑」亦包括凍乾保護劑。術語「凍乾保護劑」表示醫藥可接受之賦形劑，其在凍乾製程、隨後的儲存及復原期間保護不穩定活性成分(例如蛋白質)免受不穩定狀況影響。凍乾保護劑包含但不限於由糖類、多元醇(諸如糖醇)及胺基酸組成之群。特定言之，凍乾保護劑可選自由以下組成之群：糖(諸如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖)、神經胺酸、胺基糖(諸如葡糖胺、半乳胺糖、N-甲基葡糖胺(「葡甲胺」))、多元醇(諸如甘露糖醇及山梨糖醇)及胺基酸(諸如甲硫胺酸或甘胺酸)。凍乾保護劑可以約10 mM至約600 mM之濃度，尤其以約10至約250 mM之濃度，且更尤其以約100至約250 mM之濃度使用。
張力劑  醫藥調配物亦可含有張力劑。如本文所使用之術語「張力劑」表示用於調節調配物張力的醫藥學上可接受之張力劑。調配物可為低張、等張或高張的。等張性一般係關於溶液之滲透壓，通常係關於人類血清之滲透壓。根據本發明之調配物可為低張、等張或高張的，醫藥調配物較佳為等張的。等張調配物為液體或自固體形式，例如自凍乾形式復原之液體，且表示具有與其所比較之一些其他溶液(諸如生理鹽溶液及血清)類似的張力的溶液。適合的張力劑包含但不限於氯化鈉、氯化鉀、甘油及來自胺基酸、糖(尤其蔗糖)之群的任何組分。在本發明之一個實施例中，張力劑較佳為蔗糖。張力劑一般以約5 mM至約1000 mM，特定言之約30 mM至約500 mM，更特定言之約120 mM至約200 mM之濃度使用。對於本發明之等張調配物之張力劑一般以約50 mM至約250 mM，特定言之約120 mM至約200 mM之濃度使用。更特定言之，對於等張調配物之張力劑以130 mM至190 mM之濃度，且在蔗糖用作張力劑之情況下，甚至更尤其以約160 mM±24 mM之濃度使用。張力劑及其濃度經選擇以使等張調配物能夠具有300±100 mOsm/kg之目標滲透壓(尤其具有300±50 mOsm/kg之目標滲透壓)。
在穩定劑及張力劑內，存在一群可以兩種方式起作用之化合物，亦即其可同時為穩定劑及張力劑。其實例可在糖、胺基酸、多元醇、環糊精、聚乙二醇及鹽之群中找到。可同時為穩定劑及張力劑之糖的實例為海藻糖。
降黏劑 醫藥調配物亦可含有降黏劑。如本文中所使用之術語「降黏劑」表示用於降低調配物之黏度的醫藥學上可接受之離子強度改良劑，其對於高濃度調配物及在治療眼部疾病中預期經由細針(實現相對快速應用而無需高壓注射)在眼睛中玻璃體內投與之調配物係重要的。典型降黏劑之實例為例如氯化鈣或氯化鈉。
佐劑  醫藥調配物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。預防微生物之存在可藉由滅菌程序及藉由包括各種抗細菌及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物)來確保。防腐劑一般以約0.001至約2% (w/v)之濃度使用。防腐劑包含但不限於乙醇、苯甲醇、苯酚、間甲酚、對氯間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、氯化苯甲烴銨。
用途  根據本發明之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之醫藥調配物可用於預防或治療眼部血管疾病。出於此目的，提供雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之醫藥調配物，其作為液體等張調配物用於玻璃體內投與，其黏度為20 mPas或更低(較佳為15 mPas或更低)、濁度為30 FTU或更低(較佳為25 FTU或更低)、滲透壓為300±50 mOsm/kg，基本上不含可見粒子。出於此目的，雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之液體等張醫藥調配物可以玻璃小瓶形式或以預裝藥品之注射器形式提供，特定言之呈預裝藥品之玻璃注射器形式。
對於此類調配物，應避免玻璃體內投與眼睛賦形劑(例如精胺酸)，因為已描述精胺酸作為組織纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)之載劑對於視網膜及視網膜色素上皮之毒性(參見例如Benner J D, Morse LS, Toth CA等人Arch Ophthalmol 19911091731-1736.1736；Johnson MW, Olsen KR. Hernandez E.等人, Arch Ophthalmool 1990108259-263.263, Irvine W D, Johnson MW, Heinandez E.等人,. Arch Ophthalmol 1991109718-722.722, Johnson MW, Olsen KR. Heinandez E., Retina 199111250-258.258)。因此，本發明之液體醫藥調配物基本上不含精胺酸或不包含精胺酸。低黏度亦為必需的，以便實現商業規模生產製程(藉由超過濾法提高濃度)及確保簡單且方便的玻璃體內注射(在50 mm/min之注射速度下，注射(滑動)力小於20 N，尤其小於15N)。據證實，黏度小於15 mPas之本發明之液體醫藥調配物能夠在注射力小於5 N之情況下經由30G注射針注射，注射時間為5 s。出於此目的，雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之醫藥調配物呈黏度為15 mPas或更低、濁度為25 FTU或更低、滲透壓為300±50 mOsm/kg、基本上不含可見粒子之液體等張調配物。為避免任何可見粒子，本發明之液體醫藥調配物基本上不含氯化鈣或不包含氯化鈣。
術語「眼部血管疾病」及「血管性眼病」可在本文中互換使用，且包括但不限於眼內新生血管性症候群，諸如糖尿病性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、早產兒視網膜病、新生血管性青光眼、視網膜靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、黃斑變性、老年性之黃斑變性、色素性視網膜炎、視網膜血管瘤增生、黃斑毛細管擴張、缺血性視網膜病、虹膜新生血管、眼內新生血管、角膜新生血管、視網膜新生血管、脈絡膜新生血管及視網膜變性。(Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A.及Klintworth, G.K., (編), 第二版, Marcel Dekker, New York (1994), 第1625頁至1710頁)。如本文所用，眼部血管病症係指特徵為新血管改變或不受調控增生及侵入諸如視網膜或角膜之眼部組織結構之任何病理性狀。在一個實施例中眼部血管疾病係選自由以下組成之群：濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD) (亦稱作新生血管性老年性之黃斑變性(nAMD))、糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性視網膜病(DR)、非增生性糖尿病性視網膜病(NPDR)、增生性糖尿病視網膜病(PDR)、囊樣黃斑水腫(CME)、脈管炎(例如視網膜中央靜脈阻塞)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎、葡萄膜炎、脈絡膜炎、多處脈絡膜炎、眼部組織漿菌病、瞼炎、乾眼(休格倫氏病(Sjögren's disease))及其他眼科疾病，其中眼睛疾病或病症係與眼部新生血管、血管滲漏及/或視網膜水腫，特定言之濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD) (亦稱作新生血管性老年性之黃斑變性(nAMD))、糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病視網膜病(DR)、非增生性糖尿病性視網膜病(NPDR)、增生性糖尿病視網膜病(PDR)、囊樣黃斑水腫(CME)、脈管炎(例如視網膜中央靜脈阻塞)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)相關聯。因此，供使用之抗VEGF/ANG2雙特異性抗體及本文所描述之方法適用於預防及治療濕性AMD (亦稱為新生血管性老年性之黃斑變性(nAMD))、DME、DR、NPDR、PDR，亦較佳濕性AMD、DME及RVO，亦較佳濕性AMD。在一些實施例中，眼部血管疾病係選自由以下組成之群：濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、糖尿病性視網膜病(DR)及早產兒視網膜病(ROP)。
與角膜新生血管相關之其他疾病包括但不限於流行性角膜結膜炎、維生素A缺乏症、隱型眼鏡超戴症、異位性角膜炎、上緣角膜炎、翼狀胬肉乾性角膜炎、休格倫氏病(sjogrens)、痤瘡、泡性角膜炎(phylectenulosis)、梅毒、分枝桿菌(Mycobacteria)感染、脂質變性、化學燒傷、細菌潰瘍、真菌潰瘍、單純疱疹感染、帶狀疱疹感染、原蟲感染、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、莫倫氏潰瘍(Mooren ulcer)、特利恩式角膜邊緣變性(Terrien's marginal degeneration)、邊緣角質層分離、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、創傷、華格納氏類肉瘤病(Wegeners sarcoidosis)、鞏膜炎、史蒂文約翰遜氏病(Steven's Johnson disease)、放射狀角膜切開術及角膜移植物排斥。
與視網膜/脈絡膜新生血管相關之疾病包括但不限於糖尿病性視網膜病、黃斑變性、鐮狀細胞貧血、類肉瘤、梅毒、彈性假黃瘤、派傑氏病(Pagets disease)、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、萊姆氏病(Lyme's disease)、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病、色素性視網膜炎、視網膜水腫(包括黃斑水腫)、伊爾斯氏病(Eales disease)、白塞氏病(Bechets disease)、引起視網膜炎或脈絡膜炎之感染、眼假組織漿菌病、貝斯特氏病(Bests disease)、近視、斯特格氏病(Stargardts disease)、睫狀體扁平部炎(pars planitis)、慢性視網膜剝離、黏性過大綜合征(hyperviscosity syndromes)、弓蟲病、創傷及雷射後併發症。其他疾病包括但不限於與虹膜紅變相關之疾病(眼角新生血管)及藉由纖維小管或纖維組織之異常增生引起之疾病，包括增生性玻璃體視網膜病之所有形式。
早產兒視網膜病(ROP)為影響早產嬰兒之眼睛疾病。認為其係由視網膜血管之雜亂生長引起，可能導致疤痕及視網膜剝離。ROP可為輕度的，且可自發地消散，但在嚴重情況下會引起失明。因此，所有早產嬰兒均有發生ROP之風險，且極低的出生重量為額外風險因素。氧中毒及相對缺氧均可促使形成ROP。
黃斑變性為主要發現於老年人中之醫學病狀，其中稱為視網膜之黃斑區域的眼睛之內層中央經受變薄、萎縮且在一些情況下出血。此會導致中央視覺喪失，此引起無法看見精細細節、無法閱讀或無法辨識面部。根據美國眼科學會(the American Academy of Ophthalmology)，其為當今美國五十歲以上人群之中央視覺喪失(失明)之主要原因。儘管影響較年輕個體之一些黃斑營養不良有時稱為黃斑變性，但該術語一般係指老年性之黃斑變性(AMD或ARMD)。
如本文所用，「老年性之黃斑變性(AMD)」係指在稱為黃斑之小的視網膜中央部分惡化時的嚴重眼睛病狀。濕性形式之AMD (濕性AMD(wAMD)，亦稱為新生血管性AMD (nAMD))為晚期AMD形式，其特徵在於異常血管自黃斑下方之脈絡膜生長。此稱為脈絡膜新生血管。此等血管滲漏血液及流體至視網膜中，引起視覺扭曲，該等視覺扭曲使直線呈波狀，以及盲點及中心視覺喪失。此等異常血管最終結疤，導致中央視覺永久性喪失。AMD之症狀包括視覺中央黑暗、模糊區域；及色覺減弱或改變。可在常規眼睛檢查中偵測到AMD。黃斑變性之最常見早期跡象中之一者為在視網膜下存在隱結微小黃色沈積物或色素凝集。
色素性視網膜炎(RP)為遺傳性眼睛病狀之群。在RP症狀進展中，夜盲症一般先於管狀視覺數年或甚至數十年。許多患有RP的人直至40歲或50歲才變得法定的失明並且在其一生保留一些視力。其他人因RP完全失明，在一些情況下，早在兒童期。RP之進展在各情況下不同。RP為一類遺傳性視網膜營養不良，其為一組遺傳病症，其中視網膜之感光體(桿狀體及錐體)或視網膜色素上皮(RPE)之異常導致進行性視覺喪失。受影響個體首先經歷缺陷性暗適應或夜盲症(nyctalopia/night blindness)，隨後周圍視野減少(稱為管狀視覺)，且有時在疾病過程後期喪失中央視覺。
當流體及蛋白質沈積物聚集在眼睛之黃斑上或下方(視網膜之黃色中央區域)時，出現黃斑水腫，使其變厚及腫脹。當黃斑在眼球背面處的視網膜中央附近時，腫脹可能使人之中央視覺扭曲。此區域容納有緊密堆積的視錐，其提供清晰、清楚的中央視覺以使得人能夠直接看見視線中之形式、顏色及細節。囊樣黃斑水腫為包括囊腫形成之黃斑水腫之類型。
如本文所用，「糖尿病性黃斑水腫」(DME)係指影響患有糖尿病(1或2型)之人之嚴重眼睛病狀。當視網膜中之血管滲漏至黃斑中且流體及蛋白質沈積物聚集於眼睛之黃斑上或下方(視網膜之黃色中央區域)且使其變厚及腫脹(水腫)時，出現黃斑水腫。當黃斑在眼球背面處的視網膜中央附近時，腫脹可能使人之中央視覺扭曲。DME之主要症狀包括但不限於視覺模糊、漂浮物、對比度喪失、複視及視覺最終喪失。DME之病理學特徵在於血液-視網膜障壁分解，通常防止水在視網膜中移動，因此使流體積聚在視網膜組織中且存在視網膜變厚。當前在眼睛檢查期間診斷DME，該眼睛檢查由視力測試(其測定人在標準化圖表上可讀到的最小字母)、檢查疾病之跡象之擴眼檢查、成像測試(諸如光同調斷層掃描(optical coherence tomography；OCT)或螢光素血管攝影術(fluorescein angiography；FA)及壓力量測儀(量測眼睛內部壓力之儀器)))組成。亦進行以下研究以確定治療：光同調斷層掃描(OCT)、螢光素血管攝影術及色彩立體眼底攝影術(color stereo fundus photography)。DME可廣泛表徵為兩個主要類別-局部性及彌漫性。局部性DME之特徵在於在具有足夠黃斑血流量之黃斑中之特定的分離區及明顯的滲漏。彌漫性DME由黃斑周圍之整個毛細管床之滲漏產生，其由眼睛之內部血液-視網膜障壁分解而產生。除了局部性及彌漫性以外，亦基於臨床檢查結果將DME分類成臨床上顯著黃斑水腫(CSME)、非CSME及具有中央參與之CSME (CSME-CI)，其涉及中央窩。本發明包括治療以上提及之類別之DME的方法。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病係選自由以下組成之群：濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性視網膜病(DR)、非增生性糖尿病性視網膜病(NPDR)、增生性糖尿病性視網膜病(PDR)、脈管炎(例如視網膜靜脈阻塞(RVO)及視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)。
在一個實施例中，眼部血管疾病係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、黃斑變性、濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)、早產兒視網膜病(ROP)、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、視網膜血管瘤增生、黃斑毛細管擴張、缺血性視網膜病、虹膜新生血管、眼內新生血管、角膜新生血管、視網膜新生血管、脈絡膜新生血管及視網膜變性，特定言之選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為糖尿病性視網膜病(DR)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為糖尿病性黃斑水腫(DME)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為視網膜靜脈阻塞(RVO)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為早產兒視網膜病(ROP)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為黃斑變性。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為老年性之黃斑變性(AMD)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為濕性老年性之黃斑變性(wAMD)。
在本發明之一個實施例中，眼部血管疾病為脈絡膜新生血管。
投與  根據本發明之液體醫藥調配物可藉由玻璃體內(IVT)手段投與，諸如醫藥技術中已知之彼等手段(例如適當的注射器)。對於玻璃體內注射，注射體積通常為50至100 µL。玻璃體內注射藉由使用30G (25G至30G)之拋棄式注射器及注射針或具有適當注射針之預裝藥品之注射器進行。液體調配物可藉由使用孔徑為5 µm之過濾針自含有調配物之小瓶中取出。玻璃體內注射技術描述於例如D.Yorston, Community Eye Health. 2014; 27(87): 47中。
出於此目的，雙特異性抗VEGF/ANG2抗體之醫藥調配物作為液體等張調配物，其黏度為15 mPas或更低、濁度為25 FTU或更低、滲透壓為300±50 mOsm/kg、基本上不含可見粒子。
待用於活體內投與之調配物必須為無菌的。此容易藉由無菌過濾膜過濾及無菌製造規範實現。
用於製備調配物之方法  根據本發明之調配物可藉由此項技術中已知之方法或製程製備，例如超過濾-透析過濾、透析、添加及混合、凍乾、復原及其組合。根據本發明之調配物的製備實例可見於下文中。
在本發明之一個實施例中，醫藥調配物可藉由以下製造方法或製程製備，該等方法或製程包含以下步驟： 1.   利用介於5與80 kD之間(30至50 kD)(30 kD)的截留分子量(molecular weight cut-off)之半透膜，藉由超過濾法或透析過濾法相對透析過濾緩衝液進行緩衝液交換，該透析過濾緩衝液含有組胺酸-乙酸鹽緩衝液或組胺酸-乙酸鹽緩衝液及氯化鈉，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉及甲硫胺酸，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉、甲硫胺酸及蔗糖。典型地，透析過濾緩衝液與本體溶液之間的比率為5至20(5至10)。 2.   替代1的方式，利用介於5與80 kD之間(30至50 kD) (30kD)的MWCO之透析膜，使用透析緩衝液藉由透析法進行緩衝液交換，該透析緩衝液含有組胺酸-乙酸鹽緩衝液或組胺酸-乙酸鹽緩衝液及氯化鈉，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉及甲硫胺酸，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉、甲硫胺酸及蔗糖。典型地，透析緩衝液與本體溶液之間的比率為5至20 (5至10)。 3.   利用介於5與80 kD之間的截留分子量(molecular weight cut-off；MWCO) (30至50 kD) (30 kD)之透析過濾膜，將經緩衝液交換之本體溶液藉由透析過濾法濃縮至蛋白質濃度超過120 mg/mL (120至160 mg/mL) (120至200 mg/mL)。 4.   醫藥調配物之最終組成藉由添加各別賦形劑之儲備溶液或藉由適當調節緩衝液來調節。藉由混合使溶液均質化。
此外，製造方法或製程可包括以下步驟 5.   最終調配溶液可在低於-20℃ (低於-40℃)之溫度下冷凍儲存。 6.   在填充於最終主容器之前，解凍溶液。 7.   藉由攪拌，將若干容器或批量之醫藥調配物混合且均質化。 8.   均質化醫藥調配物經由孔徑為至少0.2或0.22 µm之若干(至少兩個)滅菌級過濾器來過濾。 9.   在無菌條件下，將滅菌過濾溶液填充至滅菌小瓶或可預裝藥品之注射器中且用彈性塞(分別為柱塞及管套)封閉。 10.  檢測所填充之主容器之缺陷及可見粒子。 11.  預裝藥品之注射器與各別裝置組件組裝，封裝至滅菌障壁系統中且在外表面滅菌。 12.  將小瓶及滅菌注射器封裝於最終二次封裝中。
根據本發明之醫藥調配物亦可為凍乾形式或自凍乾形式復原之液體形式。「凍乾形式」係藉由此項技術中已知之凍乾方法製造。凍乾物通常具有約0.1至5% (w/w)之殘餘水分含量，且以粉末或物理穩定的餅狀物形式存在。可在添加復原介質之後藉由快速溶解自凍乾物獲得「經復原之形式」。適合的復原介質包含但不限於注射用水(water for injection；WFI)、抑菌注射用水(bacteriostatic water for injection；BWFI)、氯化鈉溶液(例如0.9% (w/v) NaCl)及葡萄糖溶液(例如5% (w/v)葡萄糖)。
抗體之生產  藉由重組手段生產尤其適用於本發明之抗VEGF/ANG2抗體。用於重組生產之方法在目前先進技術中廣泛已知且包含在原核及真核細胞中之蛋白質表現，隨後分離抗體且通常純化至醫藥學上可接受之純度。對於在宿主細胞中表現如前述之抗體，藉由標準方法將編碼各別經修飾之輕鏈及重鏈之核酸插入表現載體中。表現在適合的原核或真核宿主細胞(如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌(E. coli)細胞)中進行及自細胞(溶解後之上清液或細胞)回收抗體(來自)。用於抗體之重組生產的一般方法在目前先進技術中熟知且描述於，例如，以下之綜述文章中：Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202；Geisse, S.,等人, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol 16 (2000) 151-160；Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880。用於製備適用於本發明之抗體的方法包含以下步驟：a)用包含編碼該抗體之核酸分子的載體轉化宿主細胞；b)在允許合成該抗體分子之條件下培養該宿主細胞；及c)自該培養物回收該抗體分子。
藉由習知免疫球蛋白純化程序(諸如蛋白A瓊脂糖、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和性層析法)將抗體自培養基適當分離。編碼單株抗體之DNA及RNA易於使用習知程序分離及定序。融合瘤細胞可充當此類DNA及RNA之來源。一旦分離，DNA可插入至表現載體中，該等表現載體隨後轉染至不另外產生免疫球蛋白蛋白質的宿主細胞中，諸如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞，以在宿主細胞中獲得重組單株抗體之合成。
雙特異性抗體之胺基酸序列變異體(或突變體)係藉由將適當核苷酸變化引入至抗體DNA中或藉由核苷酸合成來製備。然而，僅可在極有限之範圍內進行此類修飾。舉例而言，該等修飾不改變上文所提及之抗體特徵，諸如IgG同型及抗原結合，但可提高重組生產之產量、蛋白質穩定性或促進純化。
如用於本申請案中之術語「宿主細胞」表示任何種類之細胞系統，其可經工程改造以產生包含於本發明之調配物中之抗體。在一個實施例中，將HEK293細胞及CHO細胞用作宿主細胞。
如本文所用，「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」之表達可互換使用且所有此類名稱均包括後代。因此，詞語「轉型體」及「轉型細胞」包括主要個體細胞及源自其之培養物，與轉移數目無關。亦應理解，由於有意或無意突變，所有後代可能不會具有精確相同的DNA含量。包括具有與最初轉化細胞中所篩檢出的相同功能或生物活性的變異體後代。
在NS0細胞中之表現藉由例如，Barnes, L.M.等人，Cytotechnology 32 (2000) 109-123；Barnes, L.M.等人，Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270描述。短暫表現藉由例如，Durocher, Y.等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9描述。可變域之選殖藉由Orlandi, R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；Norderhaug, L.等人，J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87描述。較佳短暫表現系統(HEK 293)藉由Schlaeger, E.-J及Christensen, K.在Cytotechnology 30 (1999) 71-83中及藉由Schlaeger, E.-J.在J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199中描述。
適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合部位。已知真核細胞利用啟動子、強化子及聚腺苷酸化訊號。
在核酸與另一核酸序列處於功能關係時，其為「可操作地連接」的。舉例而言，若前序列或分泌性前導子之DNA作為參與多肽分泌之前蛋白表現，則其可操作地連接至多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其可操作地連接至該序列；或若核糖體結合部位經定位以便促進轉譯，則其可操作地連接至編碼序列。一般而言，「可操作地連接」意謂經連接之DNA序列為連續的，且在分泌性前導子之情況下，其為連續的且在閱讀框架內。然而，強化子不必為連續的。藉由在方便的限制部位處結紮來實現連接。若此類部位不存在，則根據習知慣例使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
進行抗體純化以藉由標準技術消除細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質，該等標準技術包括鹼性/SDS處理、CsCl帶、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知的其他技術。參見Ausubel, F., 等人編, Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing及Wiley Interscience, New York (1987)。已良好確立不同方法且廣泛用於蛋白質純化，諸如使用微生物蛋白質(例如蛋白質A或蛋白質G親和性層析法)之親和性層析法、離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式交換)、喜硫吸附(例如使用β-巰基乙醇及其他SH配位體)、疏水性相互作用或芳族吸附層析法(例如，使用苯基-瓊脂糖、氮雜-親砂樹脂或間胺基苯基硼酸)、金屬螯合劑親和性層析法(例如，使用Ni(II)親和及Cu (II)親和材料)，尺寸排阻層析法及電泳方法(諸如凝膠電泳法、毛細電泳法)(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。
本申請案中所揭示之胺基酸序列：
SEQ ID NO: 說明
1 ＜VEGF＞之重鏈可變域CDR3
2 ＜VEGF＞之重鏈可變域CDR2
3 ＜VEGF＞之重鏈可變域CDR1
4 ＜VEGF＞之輕鏈可變域CDR3
5 ＜VEGF＞之輕鏈可變域CDR2
6 ＜VEGF＞之輕鏈可變域CDR1
7 ＜ANG-2＞之重鏈可變域CDR3
8 ＜ANG-2＞之重鏈可變域CDR2
9 ＜ANG-2＞之重鏈可變域CDR1
10 ＜ANG-2＞之輕鏈可變域CDR3
11 ＜ANG-2＞之輕鏈可變域CDR2
12 ＜ANG-2＞之輕鏈可變域CDR1
13 ＜VEGF＞之重鏈可變域(VH)
14 ＜VEGF＞之輕鏈可變域(VL)
15 ＜ANG-2＞之重鏈可變域(VH)
16 ＜ANG-2＞之輕鏈可變域(VL)
17 雙特異性抗VEGF/ANG2抗體：CrossMAb VEGFang2-0016-＜VEGF＞輕鏈
18 雙特異性抗VEGF/ANG2抗體：CrossMAb VEGFang2-0016-＜ANG2＞輕鏈
19 雙特異性抗VEGF/ANG2抗體：CrossMAb VEGFang2-0016-＜VEGF＞重鏈
20 雙特異性抗VEGF/ANG2抗體：CrossMAb VEGFang2-0016-＜ANG2＞重鏈
21 例示性κ恆定輕鏈區
22 例示性λ恆定輕鏈區
23 人類IgG1子類之例示性恆定重鏈區
24 具有前導子及His標籤之人類血管形成素-2 (ANG-2)
25 人類血管內皮生長因子(VEGF)
在下文中，列舉本發明之實施例：  1. 一種液體醫藥調配物，其包含： - 20至150 mg/ml雙特異性抗VEGF/ANG2抗體，其包含人類IgG1子類之恆定重鏈區(在一個實施例中，30 mg/ml±4.5 mg/ml或120 mg/ml±18 mg/ml)， - 15至35 mM氯化鈉(在一個實施例中25 mM±5 mM；在一個實施例中25 mM±3.75 mM氯化鈉；特定言之，25 mM±2.5 mM氯化鈉)， - 15至25 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液(在一個實施例中，20 mM±3 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液；在一個實施例中，20 mM±2 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液)， pH為5.5±0.5(在一個實施例中，pH為5.5±0.3；特定言之，pH為5.5±0.2)； 其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中 i) 特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 1之CDR3H區、SEQ ID NO: 2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區；且 ii) 特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO: 9之CDR3H區、SEQ ID NO: 10之CDR2H區及SEQ ID NO: 11之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO: 12之CDR3L區、SEQ ID NO: 13之CDR2L區及SEQ ID NO: 14之CDR1L區， 且其中 iii) 該雙特異性抗體包含人類IgG1子類之恆定重鏈區，該恆定重鏈區包含突變I253A、H310A及H435A及突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat之EU索引編號)。 2. 如實施例1之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中 i) 特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位包含作為重鏈可變域VH之SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，且包含作為輕鏈可變域VL之SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，且 ii) 特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位包含作為重鏈可變域VH之SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，且包含作為輕鏈可變域VL之SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。 3. 如實施例2之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中 其中 iv) 在恆定重鏈區中，S354C及T366W突變包含於一個CH3域中，且Y349C、T366S、L368A及Y407V突變包含於另一CH3域中(根據Kabat之EU索引編號)。 4. 如實施例1至3中任一項之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。 5. 如實施例1至3中任一項之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為法利昔單抗。 6. 如實施例1之醫藥調配物，其中該調配物包含 - 120 mg/ml±18 mg/ml雙特異性抗VEGF/ANG2抗體(特定言之，120 mg/ml±12 mg/ml雙特異性抗VEGF/ANG2抗體)。 7. 如實施例1至7中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與。 8. 如實施例1至6中任一項之醫藥調配物，其中該調配物基本上不含可見粒子。 9. 如實施例1至8中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含 - 1至20 mM之至少一種穩定劑(在一個實施例中，選自糖、多元醇及胺基酸)。 10. 如實施例1至8中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含 - 7.0 mM±2.0 mM甲硫胺酸(在一個實施例中，7.0 mM±1.0 mM甲硫胺酸；在一個實施例中，7.0 mM±0.7 mM甲硫胺酸)。 11. 如實施例1至10中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含 - 0.01至0.07%界面活性劑(在一個實施例中，選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或泊洛沙姆)。 12. 如實施例1至10中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含 - 0.04% (w/v)±0.02(w/v)聚山梨醇酯20 (在一個實施例中，0.03% (w/v)至0.07% (w/v))；在一個實施例中，0.04% (w/v)±0.01(w/v)；在一個實施例中，約0.04% (w/v)) 13. 如實施例1至12中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含 - 50至250 mM張力劑(在一個實施例中，選自張力劑選自蔗糖、海藻糖及山梨糖醇之張力劑)。 14. 如實施例1至12中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含 - 160 mM±24 mM蔗糖(在一個實施例中，160 mM±16 mM；在一個實施例中，約160 mM)。 15. 如實施例1至14中任一項之醫藥調配物，其中該調配物具有20 mPas或更低之黏度(在一個實施例中，17 mPas或更低；在一個實施例中，16 mPas或更低，在一個實施例中，約15 mPas或更低；在一個實施例中，15 mPas或更低)。 16. 如實施例1至15中任一項之醫藥調配物，其中該調配物具有30 FTU或更低之濁度(在一個實施例中27 FTU或更低；在一個實施例中26 FTU或更低；在一個實施例中約25 FTU或更低；在一個實施例中25 FTU或更低)。 17. 如實施例1至16中任一項之醫藥調配物，其中該調配物具有20與50之間的離子強度(在一個實施例中，離子強度在30與50之間(在一個實施例中，離子強度在30與45之間；在一個實施例中，離子強度為30±10))。 18. 如實施例1至17中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與，其中該調配物基本上不含氯化鈣(或不包含氯化鈣)。 19. 如實施例1至17中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與，其中該調配物基本上不含精胺酸(或不包含精胺酸)。 20. 如實施例1至17中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與，其中該調配物基本上不含精胺酸及氯化鈣(或不包含精胺酸及氯化鈣)。 21. 如實施例1至5及7至20中任一項之醫藥調配物，其中該調配物包含以下組分或(至少)由以下組分組成 - 20至150 mg/ml雙特異性抗VEGF/ANG2抗體(在一個實施例中，30 mg/ml±4.5 mg/ml或120 mg/ml±18 mg/ml，特定言之，120 mg/ml±12 mg/ml)； - 15至35 mM氯化鈉(在一個實施例中25 mM±5 mM；在一個實施例中25 mM±3.75 mM氯化鈉；特定言之，25 mM±2.5 mM氯化鈉)， - 15至25 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液(在一個實施例中20 mM±3 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液；在一個實施例中20 mM±2 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液)； - 7.0 mM±2.0 mM甲硫胺酸(在一個實施例中7.0 mM±1.0 mM甲硫胺酸；在一個實施例中7.0 mM±0.7 mM甲硫胺酸) - 0.03% (w/v)至0.07% (w/v)聚山梨醇酯20 (在一個實施例中，0.04% (w/v)±0.02 (w/v))；在一個實施例中，0.04% (w/v)±0.01(w/v)；在一個實施例中，約0.04% (w/v))； - 160 mM±24 mM蔗糖(在一個實施例中，160 mM±16 mM；在一個實施例中，約160 mM)； -水(用於(眼科)注射)； pH為5.5±0.5(在一個實施例中，pH為5.5±0.3；特定言之，pH為5.5±0.2)； 22. 如實施例1至21中任一項之醫藥調配物，其中調配物為穩定調配物。 23. 如實施例1至21中任一項之醫藥調配物，其中在25℃下8週後或在25℃下52週後，該醫藥調配物中之雙特異性抗體之高分子量種類(HMW)含量低於10% (在一個實施例中低於5%)。 24. 如實施例1至21中任一項之醫藥調配物，其中在2-8℃下2年後(或在2-8℃下3年後)，該醫藥調配物中之雙特異性抗體之主峰超過50%且該醫藥調配物中之雙特異性抗體之高分子量種類(HMW)含量低於10%(在2-8℃下2年後(或在2-8℃3年後)，該醫藥調配物中之雙特異性抗體之主峰超過55%且該醫藥調配物中之雙特異性抗體之高分子量種類(HMW)含量低於7%)。 25. 如實施例1至24中任一項之醫藥調配物，其中該調配物之滲透壓為300±100 mOsm/kg (在一個實施例中，300±50 mOsm/kg)。 26. 如實施例1至25中任一項之醫藥調配物，其用於治療眼部血管疾病。 27. 如實施例26之醫藥調配物，其中該眼部血管疾病係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、黃斑變性、濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)、早產兒視網膜病(ROP)、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、視網膜血管瘤增生、黃斑毛細管擴張、缺血性視網膜病、虹膜新生血管、眼內新生血管、角膜新生血管、視網膜新生血管、脈絡膜新生血管及視網膜變性，特定言之選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)。 28. 如實施例26之醫藥調配物，其中該眼部血管疾病為糖尿病性視網膜病。 29. 如實施例26之醫藥調配物，其中該眼部血管疾病為糖尿病性黃斑水腫(DME)。 30. 如實施例26之醫藥調配物，其中該眼部血管疾病為視網膜靜脈阻塞(RVO)。 31. 如實施例26之醫藥調配物，其中該視網膜靜脈阻塞為視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)。 32. 如實施例26之醫藥調配物，其中該眼部血管疾病為黃斑變性。 33. 如實施例26之醫藥調配物，其中該黃斑變性為老年性之黃斑變性(AMD)。 34. 如實施例26之醫藥調配物，其中該黃斑變性為濕性老年性之黃斑變性(wAMD) (亦稱作新生血管性老年性之黃斑變性(nAMD)。 35. 如實施例26之醫藥調配物，其中該眼部血管疾病為脈絡膜新生血管。 36. 一種用於製備如實施例1至25中任一項之醫藥調配物的方法， 該方法包含以下步驟 -a)藉由超過濾法及透析過濾法相對透析過濾緩衝液或b)藉由透析法使用透析緩衝液針對雙特異性抗體本體溶液進行緩衝液交換，該等緩衝液含有組胺酸-乙酸鹽緩衝液或組胺酸-乙酸鹽緩衝液及氯化鈉，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉及甲硫胺酸，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉、甲硫胺酸及蔗糖 - 藉由超過濾法濃縮該經緩衝液交換之本體溶液 - 藉由添加各別賦形劑之儲備溶液或藉由適當調節緩衝液來調節醫藥調配物之最終組成，且藉由混合將液體醫藥調配物均質化。 37. 一種包含如實施例1至25中任一項之醫藥調配物之小瓶。 38. 一種包含如實施例1至25中任一項之醫藥調配物之經預裝藥品注射器。 39. 一種如實施例1至25中任一項之液體醫藥調配物之凍乾形式。
實例  如下研發根據本發明之用於玻璃體內(IVT)投與之液體藥品醫藥調配物。
實例1：材料及方法  提供如WO2014/009465中所描述製備及純化之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)用於最初在pH 5.5下之20 mM組胺酸-HCl緩衝液中濃度為約130至140 mg/mL進行進一步實驗。
在表1及表2中給出在調配物製備期間所使用之材料(包括供應商)及其初級封裝之概述表 1 用於調配物之化學物質
化學物質 供應商
L-組胺酸游離鹼 Ajinomoto
L-組胺酸-HCl單水合物 Ajinomoto
鈉-乙酸鹽-三水合物 Merck
冰醋酸 Wacker Chemie
氯化鈉 Merck
二水合氯化鈣(CaCl2 ) Applichem
蔗糖 FPS
甲硫胺酸 Ajinomoto
聚山梨醇酯20 Croda
泊洛沙姆 BASF
表 2 初級封裝
名稱 供應商
6 ml小瓶，無色，20 mm Schott
鐵氟龍化血清塞(teflonized serum-stoppers) D777-1，20 mm Daikyo
具有PP蓋之鋁蓋，20 mm Helvoet (Datwyler)
2 ml小瓶，無色，13 mm Schott
鐵氟龍化血清塞D777-1，13 mm Daikyo
具有PP蓋之鋁蓋，13 mm Helvoet (Datwyler)
1.0 mL預裝藥品之注射器(PFS) Gerresheimer Buende
1.0 mL PFS柱塞 West
0.5 mL預裝藥品之注射器(PFS) Nuova Ompi
0.5 mL PFS柱塞 West
容器封閉系統  藉助於橡皮塞(D 777-1，13 mm)及帶翻蓋之鋁密封之無色2-mL或6-mL玻璃小瓶(1型玻璃)。 具有藉助於Gerresheimer Buende TELC針蓋(tip cap)及West 4023/50柱塞閉合之呂埃錐(luer cone)之無色1.0-mL可預裝藥品之注射器(1型玻璃)。 具有藉助於Vetter OVS針蓋及West 4023/50柱塞閉合之呂埃錐之無色0.5-mL可預裝藥品之注射器(1型玻璃)。Vetter OVS針蓋由West 4023/50彈性體組成。
尺寸排阻層析法(SE-HPLC)  尺寸排阻層析法(SEC)用於偵測調配物中之可溶性高分子量種類(聚集物)及低分子量水解產物(LMW)。用TSK-Gel G3000SWXL, 7.8 × 300 mm, 5 μm (Tosoh Bioscience, 目錄號08541)或BioSuite 250, 7.8 × 300 mm或5 μm (Waters, 目錄號186002165)進行該方法。藉由使用pH 7.0之0.2 M磷酸鉀、0.25 M KCl作為移動相之等度溶離曲線分離完整單體、聚集體及片段，且在280 nm之波長下偵測。
離子交換層析法(IE-HPLC))  進行離子交換層析法(IEC)以偵測化學降解產物，改變調配物中測試抗體之淨電荷。用YMC BioPro SP-F, 100 × 4.6 mm, 5 µm管柱(YMC，目錄號SF00S05-1046WP)進行該方法。在0.8 ml/min之流動速率下，將pH 6.8之20 mM BES (N,N-雙[2-羥乙基]-2-胺基乙烷磺酸)作為溶離劑A及pH 6.8之20 mM BES, 488 mM NaCl作為溶離劑B。在注射至管柱上之前，用溶離劑A將樣品稀釋至3 mg/mL。 梯度程序：
時間(min) 移動相A% 移動相B%
0 98 2
5 98 2
35 85 15
35.1 0 100
40 0 100
40.1 98 2
50 98 2
濁度(以FTU(=福爾馬肼濁度單位)為單位)  在根據Ph. Eur. 2.2.1之Hach 2100 AN濁度計上測定調配物樣品之濁度(液體之透明度及乳白度)。將樣品體積為大約2 mL的樣品溶液轉移至11 mm內徑玻璃光析管中。將玻璃光析管置放於濁度計中且相對於參考懸浮液1 FTU、3 FTU、10 FTU、20 FTU及100 FTU之校準曲線量測濁度。
黏度(以mPa為單位)  在1000 s- 1 之剪切速率及20℃之溫度下，在具有25 mm-0.5°錐度之Anton Paar Physica MCR 301旋轉流變儀上用量測調配物樣品之黏度。
可見粒子 在藉助於2倍放大鏡之Seidenader檢測機V90-T上目視檢查小瓶樣品。調整照明光源L1、L2及L3至設定5。在旋轉移動期間檢查小瓶樣品是否存在粒子。
蛋白質濃度(以mg/ml為單位)。  藉由在來自Perkin Elmer之UV/Vis光度計λ 35上之紫外(UV)光吸收來量測調配物樣品之蛋白質濃度。將調配物樣品用pH 5.5之20 mM L-組胺酸-乙酸鹽緩衝溶液稀釋至約0.5 mg/mL之蛋白質濃度且填充至厚度為1 cm之量測光析管中。量測光析槽之UV吸收係在280及320 nm之波長下量測。
根據以下方程式，自280 (A280)及320 nm (A320)處所量測之UV光吸收、1.70 mL/(mg×cm)之消光係數(E)、1 cm之厚度(d)及對應於實際稀釋之稀釋因子(DF)來計算蛋白質濃度：
Figure 02_image005
滲透壓  根據冰點下降原理，在來自Gonotec之Osmomat 030 3P滲透計上量測調配物樣品之滲透壓。
pH  藉由具有玻璃電極之電位計測定調配物樣品之pH。
實例2：pH/緩衝液篩檢I  設置  pH/緩衝液篩檢之範疇為選擇用於抗VEGF/ANG2抗體之市售調配物之最佳pH及緩衝液且選擇具有低黏度、降低之濁度及良好穩定性行為之調配物，從而導致可溶聚集體及帶電變異體之較少形成。
pH/緩衝液篩檢之第一部分包括三種緩衝液系統：L-組胺酸/L-組胺酸-HCl (His/His-HCl)、L-組胺酸-乙酸鹽(His/乙酸鹽)及乙酸鈉(Na/乙酸鹽)，pH範圍介於5.3與6.5之間，緩衝液強度範圍介於7與300 mM之間且離子強度範圍介於5與86之間。活性調配物之設置展示於表3中。表 3 調配物編碼： pH / 緩衝液篩檢部分 I
調配物編碼 緩衝液 系統 pH 緩衝液濃度(mM) 離子強度 蛋白質(mg/ml) 填充體積(ml) 劑型
F1 His/His-HCl 5.3 7 5 120 2.7 6mL小瓶
F2 5.9 75 45.5 120 2.7 6mL小瓶
F3 6.5 300 86 120 2.7 6mL小瓶
F4 His/乙酸鹽 5.3 102 86 120 2.7 6mL小瓶
F5 5.9 10 5 120 2.7 6mL小瓶
F6 6.5 180 45.5 120 2.7 6mL小瓶
F7 Na/乙酸鹽 5.3 58 45.5 120 2.7 6mL小瓶
F8 5.9 91 86 120 2.7 6mL小瓶
F9 6.2 6 5 120 2.7 6mL小瓶
F10 His/His-HCl 5.3 100 86 120 2.7 6mL小瓶
F11 5.9 10 5 120 2.7 6mL小瓶
F12 6.5 165 45.5 120 2.7 6mL小瓶
F13 His/乙酸鹽 5.3 53 45.5 120 2.7 6mL小瓶
F14 5.9 150 86 120 2.7 6mL小瓶
F15 6.5 20 5 120 2.7 6mL小瓶
F16 Na/乙酸鹽 5.3 7 5 120 2.7 6mL小瓶
F17 5.9 49 45.5 120 2.7 6mL小瓶
F18 6.2 89 86 120 2.7 6mL小瓶
F19 His/His-HCl 5.9 75 45.5 120 2.7 6mL小瓶
F20 5.9 75 45.5 120 2.7 6mL小瓶
材料及方法  表1及表2給出在調配物製備期間所使用之材料及其初級封裝之概述
使用具有10 kD截留分子量之Slide-A-Lyzer G2 (Thermo Scientific)，藉由相對如表3中所列之緩衝液系統以透析法針對藥物物質進行緩衝液交換。藉此，將42 mL藥物物質填充至透析裝置中並與5 L透析緩衝液進行三次緩衝液交換。
視情況，若透析之後蛋白質濃度低於120 mg/mL，則藉由使用Amicon Ultra 15、Ultracel 10K(Millipore)裝置(20℃，4000 rpm)離心來濃縮藥物物質。
然後，將經透析且視情況經濃縮之藥物物質用對應透析緩衝液稀釋至120 mg/mL之目標蛋白質濃度，產生最終藥品溶液。
各藥品溶液經由0.22 µm Sterivex GV(Millipore)過濾器過濾且填充至具有2.7 mL填充體積之乾淨且滅菌的6 mL小瓶中。將小瓶塞住且旋緊。
分析方法 濁度及黏度之分析測試方法描述於實例1中。
結果  圖1比較來自pH/緩衝液篩檢I之調配物的濁度及黏度結果。
一般而言，具有高離子強度(例如4、14、10、3、8及18)之調配物展示高濁度(超過30 FTU)及低黏度(大約10 mPas)。相反，具有低離子強度之調配物具有高黏度(大約25至40 mPas)及低濁度(低於10 FTU)。出人意料地，具有緩衝液系統組胺酸-乙酸鹽(13、6、4、14)之調配物可鑑別為具有大約10 mPas之低黏度及小於25 FTU之濁度。
結論  量測來自pH/緩衝液篩檢I之調配物的黏度及濁度。出人意料地，組胺酸-乙酸鹽緩衝液系統與具有45.5或更高之離子強度之調配物展示低黏度及降低之濁度值。
實例3：pH/緩衝液篩檢II  設置  pH/緩衝液篩檢之範疇為選擇用於抗VEGF/ANG2抗體CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)抗VEGF/ANG2抗體之調配物之最佳pH及緩衝液且選擇具有低黏度、降低之濁度及良好穩定性行為之調配物，從而導致可溶聚集體及帶電變異體之較少形成。
pH/緩衝液篩檢之第二部分係基於pH/緩衝液篩檢I之結果設計且包括pH範圍在5.5與6.0之間，緩衝液強度範圍在14與59 mM之間的緩衝液系統L-組胺酸-乙酸鹽(His/乙酸鹽)。藉由增加緩衝液強度或藉由添加氯化鈉(NaCl)或氯化鈣(CaCl2 )來修改調配物之離子強度，產生離子強度範圍在10與50之間。活性調配物之設置展示於表4中。表 4 調配物編碼： ph / 緩衝液篩檢部分 II
調配物編碼 (= - 樣品編號 ) 緩衝液 系統 緩衝液 濃度 (mM) pH 鹽 鹽濃度 (mM) 離子強度 蛋白質 (mg/ml) 填充體積 (ml) 劑型
GRM0069-01 = 01 His-乙酸鹽 14 5.5 - - 10 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-02 = 02 His-乙酸鹽 39 5.5 - - 30 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-03 = 03 His-乙酸鹽 14 5.5 NaCl 20 30 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-04 = 04 His-乙酸鹽 14 5.5 CaCl2 6.7 30 120 2.7 6-mL小瓶
GRM069-05 = 05 His-乙酸鹽 14 5.5 NaCl 40 50 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-06 = 06 His-乙酸鹽 14 5.5 CaCl2 13.3 50 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-07 = 07 His-乙酸鹽 20 6.0 - - 10 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-08 = 08 His-乙酸鹽 59 6.0 - - 30 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-09 = 09 His-乙酸鹽 20 6.0 NaCl 20 30 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-10 = 10 His-乙酸鹽 20 6.0 CaCl2 6.7 30 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-11 = 11 His-乙酸鹽 20 6.0 NaCl 40 50 120 2.7 6-mL小瓶
GRM0069-12 = 12 His-乙酸鹽 20 6.0 CaCl2 13.3 50 120 2.7 6-mL小瓶
材料及方法  表1及表2給出在調配物製備期間所使用之材料及其初級封裝之概述
使用具有30 kD截留分子量半滲透膜之Labscale TTF(Millipore)，藉由相對如表4中所列之緩衝液以超過濾-透析過濾針對藥物物質進行緩衝液交換。藉此，將120 mL藥物物質填充至Labscale系統中並相對1050 mL透析過濾緩衝液進行緩衝液交換。
在緩衝液交換後，在Labscale系統中將藥物物質濃縮至大約150 mg/mL之蛋白質濃度。
隨後，將經濃縮之藥物物質用各別緩衝液及鹽溶液之儲備溶液稀釋至120 mg/mL之目標蛋白質濃度，產生如表4之最終藥品溶液。
各藥品溶液經由0.22 µm Sterivex GV(Millipore)過濾器過濾且填充至具有2.7 mL填充體積之乾淨且滅菌的6 mL小瓶中。將小瓶塞住且旋緊。
分析方法 濁度、黏度及SE-HPLC之分析測試方法描述於實例1中。
穩定性程式  調配物在2-8℃及25℃下保持穩定性8週。在穩定性研究開始時及儲存8週後抽取樣品且分析。
結果  圖2比較pH/緩衝液篩檢之第二部分之濁度及黏度結果。一般而言，相比於5.5之pH，濁度隨著離子強度之增加及6.0之pH而增加。此外，氯化鈉之存在亦導致較高濁度。相比於pH為6，5.5之pH亦降低黏度。此外，至少30之離子強度有助於將黏度降低至大約15 mPas之水準。當比較不同鹽對黏度之影響時，氯化鈣或更高緩衝液強度比氯化鈉更有效降低黏度。
考慮到兩個目標：降低濁度及黏度，離子強度為至少30且pH為5.5之調配物展示約20 FTU之降低的濁度水準及約15 mPas之黏度。
圖3比較開始(=0)時pH/緩衝液篩檢II調配物之聚集體含量(HMWS)與在5℃及25℃下8週後的含量。一般而言，HMW含量隨離子強度增加而增加。比較不同鹽之效果，高緩衝液強度或氯化鈉之存在導致與氯化鈉之存在相比聚集體之增加較少。5.5之較低pH對減少聚集體形成具有較小影響。
結論  pH為5.5且離子強度為30之調配物提供了降低濁度、低黏度及降低聚集體形成之最佳結果。離子強度可用較高緩衝液強度來調節，或添加氯化鈉及氯化鈣之鹽。一般而言，較高緩衝液強度或氯化鈣之存在展示較佳濁度及黏度行為。
實例4：界面活性劑篩檢  設置  界面活性劑篩檢之範疇為選擇用於調配抗VEGF/ANG2抗體CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)之最佳界面活性劑類型及界面活性劑濃度。
基於pH/緩衝液篩檢I及II之結果，120 mg/mL VEGF/Ang-2抗體、pH 5.5之20 mM L-組胺酸-乙酸鹽緩衝液、25 mM氯化鈉及180 mM蔗糖之調配物基質實現具有300±50 mOsm/kg之目標滲透壓之等張調配物。
在Vegf-Ang2抗體上在0.01與0.07%之間之不同界面活性劑濃度下，界面活性劑篩檢測試界面活性劑聚山梨醇酯20及泊洛沙姆188之穩定效果。另外，測試無界面活性劑之調配物。
表5概述界面活性劑篩檢之測試調配物。表 5 界面活性劑篩檢之調配物編碼
調配物編碼 (= - 樣品編號 ) 調配物基質 離子強度 目標滲透壓 (mOsm/kg) 界面活性劑 界面活性劑 濃度 (%) 填充體積 (ml) 劑型
GRM0071-01 120 mg/mL Vegf-Ang2抗體 20 mM His-乙酸鹽pH 5.5, 25 mM NaCl 180 mM蔗糖 40 311 - 0 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-02 聚山梨醇酯20 0.01 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-03 聚山梨醇酯20 0.03 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-04 聚山梨醇酯20 0.05 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-05 聚山梨醇酯20 0.07 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-06 泊洛沙姆 0.01 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-07 泊洛沙姆 0.03 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-08 泊洛沙姆 0.05 2.7 6-mL小瓶
GRM0071-09 泊洛沙姆 0.07 2.7 6-mL小瓶
材料及方法  表1及表2給出在調配物製備期間所使用之材料及其初級封裝之概述
使用具有30kD截留分子量半滲透膜之Labscale TTF(Millipore)，藉由相對20 mM組胺酸-乙酸鹽pH 5.3透析過濾緩衝液以超過濾-透析過濾針對藥物物質進行緩衝液交換。藉此，將250 mL藥物物質填充至Labscale系統中並相對1700 mL透析過濾緩衝液進行緩衝液交換。
在緩衝液交換之後，在Labscale系統中將藥物物質濃縮至大約170 mg/mL之蛋白質濃度及大約5.5之pH。
隨後，將經濃縮之藥物物質用各別緩衝液及鹽溶液之儲備溶液稀釋至120 mg/mL之目標蛋白質濃度，產生如表5之最終藥品溶液。
各藥品溶液經由0.22 µm Sterivex GV(Millipore)過濾器過濾且填充至具有2.7 mL填充體積之乾淨且滅菌的6 mL小瓶中。將小瓶塞住且旋緊。
分析方法  蛋白質濃度、pH值、滲透壓、濁度、黏度、可見粒子及SE-HPLC之分析測試方法描述於實例1中。
穩定性程式  在界面活性劑篩檢期間，施加在2-8℃下之1週水平振盪(200 rpm)、在25℃下之1週水平振盪(200 rpm)及5次凍/融(-40℃/5℃)循環之機械應力測試條件。
結果  表6概述界面活性劑篩檢樣品之初始結果。所有調配物之蛋白質濃度為大約120 mg/mL且pH為5.5±0.1。所量測之滲透壓在335與350 mOsm/kg之間，且由此略微高於311 mOsm/kg之目標。所選具有20 mM組胺酸-乙酸鹽緩衝液(pH 5.5)加25 mM氯化鈉及180 mM蔗糖之120 mg/mL Vegf-Ang2之調配物基質產生約15 mPas之低黏度及20 FTU之降低之濁度。
在5℃及25℃及凍融應力(五次凍融循環)下，將界面活性劑篩檢調配物暴露於振盪應力且分析可見粒子及可溶性聚集體(HMWS)。
表7概述在初始時及在物理應力之後的可見粒子結果。所有調配物樣品在初始時不含粒子。在暴露於不同物理應力之後，無界面活性劑之調配物GRM0071-01始終展示許多粒子。添加至少0.01%聚山梨醇酯20防止在暴露於三種物理應力方法期間形成可見粒子。
出人意料地，在暴露於5℃下振盪1週後添加泊洛沙姆並不能防止可見粒子之形成，然而其能夠保護蛋白質免受25℃之振盪及凍融應力的影響。
圖4展示初始樣品及受力樣品之可溶性聚集體含量(HMWS)。無界面活性劑之調配物GRM0071-01(1)對振盪應力敏感且在5℃及25℃下振盪1週後展示聚集體含量增加高達10%。因為聚集體含量自3%增加至3.8%，0.01%聚山梨醇酯20之存在不足以完全防止在25℃下振盪1週後可溶性聚集體增加。出人意料地，需要等於0.03%或高於0.03%之含量的聚山梨醇酯20以防止可溶性聚集體在25℃下振盪1週後之增加。表 6 關於製造後界面活性劑篩檢樣品之蛋白質濃度、 pH 、滲透壓、濁度及黏度結果之概述
調配物編碼 (= - 樣品編號 ) 蛋白質濃度(mg/mL) pH 滲透壓(mOsm/kg) 濁度(FTU) 黏度(mPas)
GRM0071-01 121 5.6 341 22.9 15
GRM0071-02 118 5.6 344 20.4 14
GRM0071-03 121 5.6 337 20 14
GRM0071-04 124 5.5 341 20.1 14
GRM0071-05 121 5.5 341 20.3 14
GRM0071-06 121 5.5 347 20.5 14
GRM0071-07 120 5.6 340 20.1 15
GRM0071-08 121 5.5 350 21 15
GRM0071-09 122 5.5 346 20.8 15
表 7 初始及經物理應力之界面活性劑篩檢樣品之可見粒子結果之概述
調配物編碼 (= - 樣品編號 ) 界面活性劑 初始 在5 ℃下振盪 1 週後 在25 ℃下振盪 1 週後 5 次凍融循環後
GRM0071-01 無 不含粒子 有許多粒子 有許多粒子 有許多粒子
GRM0071-02 0.01%聚山梨醇酯20 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0071-03 0.03%聚山梨醇酯20 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0071-04 0.05%聚山梨醇酯20 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0071-05 0.07%聚山梨醇酯20 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0071-06 0.01%泊洛沙姆 不含粒子 有許多粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0071-07 0.03%泊洛沙姆 不含粒子 有許多粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0071-08 0.05%泊洛沙姆 不含粒子 有許多粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0071-09 0.07%泊洛沙姆 不含粒子 有許多粒子 不含粒子 不含粒子
結論  需要添加至少0.03%聚山梨醇酯20以使抗VEGF/ANG2抗體在120 mg/mL之濃度下完全穩定以抵抗振盪及凍融應力。
界面活性劑泊洛沙姆不能保護濃度為120 mg/mL之雙特異性抗VEGF/ANG2抗體在5℃下免於振盪應力之影響。
具有20 mM組胺酸-乙酸鹽緩衝液(pH 5.5)、25 mM氯化鈉及180 mM蔗糖之調配物基質為120 mg/mL抗VEGF/ANG2抗體調配物提供可接受之濁度(大約20 FTU)及黏度結果(大約15 mPas)。
實例5：賦形劑篩檢I  設置  賦形劑篩檢之範疇為選擇用於抗VEGF/ANG2抗體CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)之市售調配物之最終組成。
基於先前pH/緩衝液篩檢I及II及界面活性劑篩檢之結果，選擇由120 mg/mL Vegf-Ang2抗體、20 mM組胺酸乙酸鹽緩衝液系統、160 mM蔗糖及0.04%聚山梨醇酯20組成之調配物基質。在調配物基質中，測試pH (5.5對5.8)、鹽(25 mM氯化鈉對8 mM氯化鈣)及甲硫胺酸(0對7 mM)之效果。基於來自緩衝液及鹽濃度之貢獻將離子強度調節至40。
表8概述賦形劑篩檢I之調配物。表 8 賦形劑篩檢部分 I 之調配物編碼
調配物編碼(= - 樣品編號) 蛋白質濃度 pH/ 緩衝液 鹽 甲硫胺酸(mM) 蔗糖 聚山梨醇酯20 填充體積 劑型
GRM0073-01 120 mg/mL 20 mM組胺酸-乙酸鹽pH 5.5 25 mM NaCl 0 160 mM 0.04% 2.7 mL 6-mL小瓶
GRM0073-02 7
GRM0073-03 8 mM CaCl2 0
GRM0073-04 7
GRM0073-05 20 mM組胺酸-乙酸鹽pH 5.8 25 mM NaCl 0
GRM0073-06 7
GRM0073-07 8 mM CaCl2 0
GRM0073-08 7
材料及方法  表1及表2給出在調配物製備期間所使用之材料及其初級封裝之概述
使用具有30 kD截留分子量半滲透膜之Labscale TTF(Millipore)，藉由相對20 mM組胺酸-乙酸鹽pH 5.3透析過濾緩衝液或20 mM組胺酸-乙酸鹽pH 5.6，以超過濾-透析過濾針對藥物物質進行緩衝液交換。藉此，將410 mL藥物物質填充至Labscale系統中並相對3000 mL透析過濾緩衝液進行緩衝液交換。
在緩衝液交換之後，在Labscale系統中將藥物物質濃縮至大約165 mg/mL之蛋白質濃度及大約5.5或5.8之pH。
隨後，將經濃縮之藥物物質用各別緩衝液及鹽溶液之儲備溶液稀釋至120 mg/mL之目標蛋白質濃度，產生如表8之最終藥品溶液。
各藥品溶液經由0.22 µm Sterivex GV(Millipore)過濾器過濾且填充至具有2.7 mL填充體積之乾淨且滅菌的6 mL小瓶中。將小瓶塞住且旋緊。
分析方法  蛋白質濃度、pH值、滲透壓、濁度、黏度、可見粒子、SE-HPLC及IE-HPLC之分析測試方法描述於實例1中。
穩定性程式  調配物在2-8℃下保持穩定性長達20週且在25℃下長達13週。此外，使樣品在2-8℃下暴露於1週水平振盪(200 rpm)，在25℃下暴露於1週水平振盪(200 rpm)及5次凍/融(-40℃/5℃) 循環。
結果  表9概述賦形劑篩檢I之初始結果。所有調配物具有在125 mg/mL與130 mg/mL之間的蛋白質濃度。具有5.5之目標pH之調配物GRM0073-01至-04的pH值經量測為約5.6，而具有5.8之目標pH之調配物GRM0073-05至-08的pH值經量測為約5.9。含有25 mM氯化鈉之調配物(GRM0073-01、-02、-05及-06)的滲透壓相比於具有8 mM氯化鈣之調配物(GRM0073-03、-04、-07及-08) (該等調配物具有在273與288 mOsm/kg之間的滲透壓結果)具有更高的滲透壓結果(在313與322 mOsm/kg之間)。
表10概述在初始時、在物理應力之後及在5℃及25℃下儲存13週後的可見粒子結果。在製造之後及在暴露於物理應力(在5℃或25℃下振盪1週，或五次凍融循環)之後，所有調配物不含粒子。出人意料地，含有8 mM氯化鈣之所有調配物在5℃及25℃下儲存13週後展示可見粒子，而含有25 mM氯化鈉之所有調配物不含粒子。
圖5比較含有25 mM氯化鈉之調配物的濁度及黏度結果。藉此，pH為5.5之調配物展示更低的濁度(21 FTU對25 FTU)及更低的黏度(17 mPas對21 mPas)。
圖6及7分別展示在5℃下儲存20週、在25℃下儲存13週期間可溶性聚集體(HMWS)之增加。pH為5.8之調配物相較於pH 5.5之調配物展示可溶性聚集體略微較少之增加。出人意料地，添加甲硫胺酸可減少可溶性聚集體之形成且可補償較低pH對聚集之影響。
圖8及圖9分別比較在5℃下儲存20週後及在25℃下儲存13週後，藉由IEC所量測之帶電變異體之變化。在5℃下儲存13週後，所有調配物展示大約1%之主峰面積之略微下降。此伴隨著酸性變異體之大致0.2%之增加及鹼性峰面積之大約1%之增加。不存在由不同pH或甲硫胺酸之存在引起之明顯差異。儘管在25℃下儲存13週後，主峰下降大得多(大約18%)，，但基於pH及甲硫胺酸不存在明顯差異。在25℃下儲存期間主峰之降低主要由酸性變異體之增加引起。表 9 在製造之後賦形劑篩檢 I 樣品之蛋白質濃度、 pH 及滲透壓結果之概述
調配物編碼 (= - 樣品編號 ) 蛋白質濃度(mg/mL) pH 滲透壓(mOsm/kg)
GRM0073-01 126 5.6 315
GRM0073-02 125 5.6 322
GRM0073-03 126 5.6 275
GRM0073-04 127 5.6 288
GRM0073-05 126 5.9 313
GRM0073-06 128 5.9 314
GRM0073-07 129 5.9 273
GRM0073-08 128 5.9 281
表 10 初始及受力賦形劑篩檢 I 樣品之可見粒子結果之概述
調配物編碼 (= - 樣品編號) 鹽 初始 在5 ℃下振盪 1 週後 在25 ℃下振盪 1 週後 5 次凍融循環後 在5 ℃下振盪 13 週後 在25 ℃下振盪 13 週後
GRM0073-01 25 mM NaCl 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0073-02 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0073-03 8 mM CaCl2 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 有許多粒子 有許多粒子
GRM0073-04 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 有許多粒子 有許多粒子
GRM0073-05 25 mM NaCl 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0073-06 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0073-07 8 mM CaCl2 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 有許多粒子 有許多粒子
GRM0073-08 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 有許多粒子 有許多粒子
結論  儘管與具有氯化鈉之調配物(參考實例2及3)相比，氯化鈣之存在導致較低黏度及濁度水準，但其出人意料地亦引起可見粒子之形成。對於根據USP-NF ＜790＞ (其基本上不含可見粒子)之要求的玻璃體內注射，形成可見粒子係不可接受的。因此，與使用氯化鈣相比，添加氯化鈉作為用於降低黏度之離子強度改良劑為較佳的。
此外，與pH 5.8之調配物相比，pH 5.5之調配物展示更低濁度及更低黏度。然而，相比於pH 5.5之調配物，pH 5.8之調配物展示略微較少之可溶性聚集體之形成，但此效果可藉由添加7 mM甲硫胺酸補償。因此，在pH 5.5下添加甲硫胺酸允許減少可溶性聚集體形成，同時仍實現更低黏度及濁度水準。
pH之差異(pH 5.5對5.8)或存在或不存在甲硫胺酸對帶電變異體之形成無影響。
總之，具有25 mM氯化鈉而非8 mM氯化鈣及20 mM組胺酸-乙酸鹽緩衝液(pH 5.5)，及7 mM甲硫胺酸及160 mM蔗糖及0.04%聚山梨醇酯20之調配物允許具有低濁度及黏度及經改良之穩定性行為的無粒子調配物。
實例6：賦形劑篩檢 II 設置  在賦形劑篩檢之第二部分中，穩定性行為之特徵進一步在於預裝藥品之注射器及30 mg/mL之蛋白質濃度。
賦形劑篩檢I產生由120 mg/mL抗VEGF/ANG2抗體CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)、20 mM組胺酸-乙酸鹽(pH 5.5)、25 mM氯化鈉、160 mM蔗糖、7 mM甲硫胺酸及0.04%聚山梨醇酯20組成之最佳化調配物，將該最佳化調配物填充於玻璃小瓶中(對應於調配物GRM0073-02)。
此調配物亦填充於預裝藥品之注射器(GRM0076-02)中。此外，以30 mg/mL之蛋白質濃度測試此調配物基質之穩定性行為，將該調配物基質填充在預裝藥品之注射器(GRM0077-02)或玻璃瓶(GRM0077-06)中。
為了比較，以30 mg/mL (GRM0077-09)及120 mg/ml (GRM0076-05)測試填充於玻璃小瓶中之參考調配物之穩定性。
表11概述賦形劑篩檢II之調配物。表 11 賦形劑篩檢部分 II 之調配物編碼
調配物編碼 (= 樣品編號 ) 蛋白質濃度 pH/ 緩衝液 鹽 甲硫胺酸 蔗糖 聚 山梨醇酯 20 填充體積 劑型
GRM0076-02 120 mg/mL 20 mM組胺酸-乙酸鹽 pH 5.5 25 mM NaCl 7 mM 160 mM 0.04% 1 mL 1 mL PFS
GRM0077-02 30 mg/mL
GRM0077-06 2.7 6 mL小瓶
GRM0077-09 30 mg/mL 20 mM組胺酸-乙酸鹽 pH 6.0 100 mM NaCl 0 mM 60 mM
GRM0076-05 120 mg/mL
材料及方法  表1及表2給出在調配物製備期間所使用之材料及其初級封裝之概述
藉由使用具有30 kD截留分子量半滲透膜之Labscale TTF(Millipore)之超過濾-透析過濾對藥物物質進行緩衝液交換。
為了於pH 5.5之20 mM組胺酸-乙酸鹽緩衝液中製備抗VEGF/ANG2抗體CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)，將大約340 mL藥物物質填充至Labscale系統中並相對2400 mL之20 mM組胺酸-乙酸鹽pH 5.2透析過濾緩衝液進行緩衝液交換。
使用大約200 mL藥物物質於pH 6.0之20 mM組胺酸-HCl緩衝液中製備抗VEGF/ANG2抗體CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)。將此填充至Labscale系統中並相對1400 mL之20 mM組胺酸-HCl pH 5.85透析過濾緩衝液進行緩衝液交換。
緩衝液交換後，在Labscale系統中將藥物物質濃縮至大約165 mg/mL之蛋白質濃度及大約5.5或6.0之pH。
隨後，將經濃縮之藥物物質用各別緩衝液及鹽溶液之儲備溶液稀釋至30或120 mg/mL之目標蛋白質濃度，產生如表8之最終藥品溶液。
各藥品溶液經由0.22 µm Sterivex GV (Millipore)過濾器過濾且填充至填充體積為2.7 mL之乾淨且滅菌的6 mL小瓶中或填充體積為1 mL之乾淨滅菌的1 mL預裝藥品之注射器中。將小瓶塞住且旋緊，而注射器用柱塞封閉。
分析方法  蛋白質濃度、pH值、滲透壓、濁度、黏度、可見粒子及SE-HPLC之分析測試方法描述於實例1中。
穩定性程式  調配物在2-8℃及24℃下保持穩定性13週。此外，使樣品在2-8℃下暴露於1週水平振盪(200 rpm)，在25℃下暴露於1週水平振盪(200 rpm)及5次凍/融(-40℃/5℃) 循環。
結果  表12概述賦形劑篩檢II之初始結果。GRM0076-02 (PFS中之最佳化調配物)及GRM0076-05 (參考調配物)兩者均匹配目標蛋白質濃度為120 mg/mL，其中量測值分別為119或123 mg/mL。在30 mg/mL之目標蛋白質濃度下製備GRM0077-02 (PFS中之最佳化調配物)、GRM0077-06 (小瓶中之最佳化調配物)及GRM0076-05(參考調配物)。實際蛋白質濃度在30與31 mg/mL之間的範圍內。
所有調配物之pH接近於目標pH且最大偏差僅為0.1 pH單位。
在1 20 mg/mL下之調配物之滲透壓略高且在310與320 mOsm/kg之間，而30 mg/mL調配物在278與394 mOsm/kg之間。
表13概述在初始時、在物理應力之後及在5℃及25℃下儲存13週後的可見粒子結果。在製造之後及在暴露於物理應力(在5℃或25℃下振盪1週，或五次凍融循環)之後，所有調配物不含粒子。出人意料地，參考調配物在5及25℃下儲存13週後顯示許多粒子。所有其他調配物不含粒子。
圖10比較在120 mg/mL之蛋白質濃度下最佳化及參考調配物之濁度及黏度結果。最佳化調配物展示大約23 FTU之明顯更低的濁度，而臨床服務調配物具有超過45 FTU之濁度。有趣的是，兩種調配物之黏度均低於14 mPas。
圖11展示30 mg/ml調配物之濁度及黏度。此處，調配物GRM0072-02與GRM0077-09之間的濁度差異較小，但最佳化調配物仍展示更低的濁度。與120 mg/mL調配物相比，兩種30 mg/mL調配物之黏度極低且低於2 mPas。
圖12及圖13展示在5℃及25℃下儲存13週後HMW種類之增加。最佳化調配物展示在120 mg/mL及30 mg/mL兩者處之HMW種類之增加比參考調配物少。在25℃下儲存13週後，穩定效果最明顯，其中在最佳化調配物GRM0076-02中HMW僅增加至2.4%，而調配物GRM0076-05展示增加達至2.9%。對於30 mg/mL調配物，亦觀測到相同趨勢，發現最佳化調配物增加至1.0%且對於參考形式增加至1.3%。
圖14比較在5℃及25℃下儲存13週後，藉由IEC所量測之帶電變異體之變化。在5℃下儲存13週後，所有調配物展示大約1%之主峰面積之略微下降。此伴隨鹼性峰面積之相應增加，而酸性峰面積保持恆定。儘管在25℃下儲存13週後，主峰之下降要大得多(大約10%)，但調配物之間不存在明顯差異。在25℃下儲存期間主峰之減少主要藉由酸性變異體之增加(約8%)及鹼性變異體之略微增加(1-2%)引起。與最佳化調配物(約2%增加)相比，在25℃下13週後參考調配物(在pH 6.0下調配)之鹼性變異體之增加略低(約1%)。較低蛋白質濃度及主容器對帶電變異體無影響。表 12 在製造之後賦形劑篩檢 II 樣品的蛋白質濃度、 pH 及滲透壓結果之概述
調配物編碼 調配物及劑型 蛋白質濃度 (mg/mL) pH 滲透壓 (mOsm/kg)
GRM0076-02 120 mg/mL於PFS中 119 5.6 318
GRM0077-02 30 mg/mL於PFS中 30 5.5 278
GRM0077-06 30 mg/mL於小瓶中 30 5.5 278
GRM0077-09 30 mg/mL於小瓶中，參考調配物 31 6.0 294
GRM0076-05 120 mg/mL於小瓶中，參考調配物 123 6.1 312
表 13 初始及受力賦形劑篩檢 II 樣品之可見粒子結果之概述
調配物編碼 調配物及劑型 初始 在5 ℃下振盪 1 週後 在25 ℃下振盪 1 週後 5 次凍 / 融循環後 在5 ℃下振盪 13 週後 在25 ℃下振盪 13 週後
GRM0076-02 120 mg/mL於PFS中 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0077-02 30 mg/mL於PFS中 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0077-06 30 mg/mL於小瓶中 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
GRM0077-09 30 mg/mL於小瓶中，參考調配物 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 有許多粒子 有許多粒子
GRM0076-05 120 mg/mL於小瓶中，參考調配物 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子 不含粒子
結論  賦形劑篩檢II之結果證實最佳化調配物優於參考調配物。在120 mg/mL下之最佳化調配物之濁度自大於45 FTU降至小於25 FTU，同時維持黏度至小於15 mPas。低黏度為必需的以便實現商業規模生產製程(藉由超過濾之高濃度)及確保簡單且方便的玻璃體內注射(注射力小於20 N，特定言之小於15 N)。經證實黏度小於15 mPas之最佳化調配物能夠在注射力小於5 N之情況下經由30G注射針注射，注射時間為5 s。
此外，在5及25℃下儲存13週後，30 mg/mL之最佳化調配物保持不含粒子，而參考調配物顯示可見粒子。此外，最佳化調配物中HMW種類之增加更低。
在30及120 mg/mL之蛋白質濃度下且在小瓶以及預裝藥品之注射器中觀測到最佳化調配物的經改良之穩定性行為。
總之，含有組胺酸-乙酸鹽緩衝液(pH 5.5)、25 mM氯化鈉、7 mM甲硫胺酸、160 mM蔗糖及0.04%聚山梨醇酯20之蛋白質濃度在30與120 mg/mL之間的最佳化調配物允許具有低濁度及黏度及在小瓶及預填注射器中之經改良之穩定性行為的不含粒子之調配物。
實例 7 ： 甲硫胺酸用於眼部適應症之安全性 ( 用於玻璃體內施加之調配物中 ) 對 L - 甲硫胺酸之非臨床毒性研究之概述 在石蟹獼猴中進行毒性研究，其中甲硫胺酸(10 mM)為媒劑及經調配之測試物品CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗)之組分。在此研究中，總共12隻動物(6隻雄性/6雌性)，每隻眼睛用50 μL玻璃體內處理兩次，間隔14天。左眼用媒劑(含有10 mM甲硫胺酸)處理且右眼用亦含有10 mM甲硫胺酸之經調配之測試物品CrossMAb VEGFang2-0016(法利昔單抗)處理在此研究中，石蟹獼猴中未發現甲硫胺酸之眼部效果。
進行三次研究(在石蟹獼猴中及在紐西蘭白兔中)，其中甲硫胺酸(5-25 mM)為媒劑之組分，玻璃體內投與(亦每隻眼睛50 μL)多達六次、間隔14天。在此等研究中，在用含甲硫胺酸之媒劑處理之動物中之任一者中未觀測到甲硫胺酸之眼部效果。
非臨床毒性研究之概述提供於表14中。表 14 含有甲硫胺酸之非臨床毒性研究之概述 ( 玻璃體內給藥 )
種類 － 石蟹獼猴 NZW兔 石蟹獼猴 NZW兔
N (m/f) － 6M/6F 3M 5M/5F 5M/5F
投與 － 左眼媒劑，右眼經調配之法利昔單抗 雙眼媒劑(對照組) 雙眼媒劑(對照組) 雙眼媒劑(對照組)
給藥次數(間隔14天) － 2 1 6 4
   CrossMAb VEGFang2-0016之調配物(法利昔單抗) － － － －
測試物品 CrossMAb VEGFang2-0016 (法利昔單抗) 法利昔單抗 － － －
媒劑/對照物品組合物 7 mM甲硫胺酸 10 mM甲硫胺酸 25 mM甲硫胺酸 5 mM甲硫胺酸 5 mM甲硫胺酸
－ － 5 mM NAT 1 mM NAT 1 mM NAT
20 mM組胺酸-乙酸鹽緩衝液pH 5.5 20 mM組胺酸/組胺酸-HCl 20 mM組胺酸HCl 20 mM組胺酸HCl 20 mM組胺酸HCl
160 mM蔗糖 50 mM蔗糖 240 mM蔗糖 240 mM蔗糖 240 mM蔗糖
0.04%聚山梨醇酯20 0.04% (w/v)聚山梨醇酯20 0.02%聚山梨醇酯20 0.02%聚山梨醇酯20 0.02%聚山梨醇酯20
25 mM氯化鈉 100 mM氯化鈉 － － －
縮寫：NAT = N-乙醯色胺酸；NZW = 紐西蘭白
實例 8 ： 穩定性 將藥品批料(於20 mM L-組胺酸-乙酸鹽pH 5.5、160 mM蔗糖、25 mM氯化鈉、7 mM L-甲硫胺酸、0.04%聚山梨醇酯20中之120 mg/mL Vegf/Ang2抗體(法利昔單抗))經由0.22 µm滅菌過濾器過濾且填充至具有0.24 mL之填充體積之乾淨且滅菌的2 mL玻璃小瓶中。
在製造後，pH為5.6、滲透壓為320 mOsm/kg且蛋白質濃度為120 mg/mL。
表15呈現在5℃下儲存期間之藥品批料GLI0219-01之穩定性資料。表16展示在25℃下儲存期間之穩定性。表 15 在 5 ℃ 下儲存期間 Vegf - Ang2 抗體 ( 法利昔單抗 ) 藥品批料之穩定性資料
時間 ( 週數 ) 可見粒子 濁度 (NTU) 藉由 SEC 之 HMW ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 酸性峰 ( 面積 %) 鹼性峰 ( 面積 %)
0 幾乎不含粒子 24 0.8 72.8 18.9 8.3
4 0粒子/10小瓶 22 1.2 72.2 18.9 8.9
13 0粒子/10小瓶 23 1.7 71.6 19.5 8.9
26 0粒子/10小瓶 22 2.2 71.0 19.5 9.5
39 0粒子/10小瓶 24 2.4 70.6 19.8 9.6
52 0粒子/10小瓶 23 2.8 69.5 20.2 10.3
65 0粒子/10小瓶 24 3.1 68.8 20.7 10.5
78 0粒子/10小瓶 24 3.3 68.3 20.8 11.0
表 16 ： 在 25 ℃ 下儲存期間 Vegf - Ang2 抗體 ( 法利昔單抗 ) 藥品批料之穩定性資料
時間 ( 週數 ) 可見粒子 濁度 (NTU) 藉由 SEC 之 HMW ( 面積 %) 主峰 ( 面積 %) 酸性峰 ( 面積 %) 鹼性峰 ( 面積 %)
0 幾乎不含粒子 24 1.0 72.8 18.9 8.3
4 0粒子/10小瓶 23 2.0 68.1 21.4 10.5
13 0粒子/10小瓶 23 2.6 59.7 28.6 11.7
26 0粒子/10小瓶 23 3.0 50.0 37.2 12.8
52 0粒子/10小瓶 24 3.5 37.7 49.9 12.4
縮寫
縮寫 說明
His/Ace 組胺酸-乙酸鹽緩衝液
His-HCl 組胺酸-鹽酸鹽緩衝液
SE-HPLC 尺寸排阻高效液相層析法
IE-HPLC 離子交換高效液相層析法
FTU 福爾馬肼濁度單位
HMW 高分子量種類
mPas 毫帕斯卡秒
LMW 低分子量種類
mg/mL 毫克/毫升
圖 1 來自pH/緩衝液篩檢部分I之調配物的濁度(圖1A)及黏度(圖1B)結果。圖1比較來自pH/緩衝液篩檢I之調配物的濁度及黏度結果(在條形圖下方：第一行：調配物樣品之編號；第二行：pH值；第三行：緩衝液系統；第四行：離子強度)。圖 2 來自pH/緩衝液篩檢部分II之調配物的濁度(圖2A)及黏度(圖2B)結果(在條形圖下方：第一行：調配物樣品編號；第二行：pH值；第三行：無降黏劑-、NaCl或CaCl2 ；第四行：離子強度)。圖 3 來自在開始時及在5℃及25℃下儲存8週後之pH/緩衝液篩檢部分II之調配物的較高分子量種類(HMW)(在條形圖下方：第一行：調配物樣品編號；第二行：pH值；第三行：無降黏劑-、NaCl或CaCl2 ；第四行：離子強度)。圖 4 在初始時及在物理應力之後的高分子量種類(HMW)之含量(在條形圖下方：第一行：物理應力類型；第二行：界面活性劑%；第三行：調配物樣品編號)。圖 5 來自賦形劑篩檢I之調配物的濁度(圖5A)及黏度(圖5B)(在條形圖下方：第一行：pH值，其中NaCl作為降黏劑，不存在(-)或存在(+)甲硫胺酸作為穩定劑；第二行：調配物樣品編號)。圖 6 在初始時及在5℃下之儲存期間的高分子量種類(HMW)之含量(在條形圖下方：第一行：pH值，其中NaCl作為降黏劑，不存在(-)或存在(+)甲硫胺酸作為穩定劑；第二行：調配物樣品編號)。圖 7 在初始時及在25℃下之儲存期間高分子量種類(HMW)之含量(在條形圖下方：第一行：pH值，其中NaCl作為降黏劑，不存在(-)或存在(+)甲硫胺酸作為穩定劑；第二行：調配物樣品編號)。圖 8 在初始時及在5℃下之儲存期間帶電種類之含量(主峰(圖8A)、酸性峰(圖8B)及鹼性峰(圖8C))(在條形圖下方：第一行：pH值，其中NaCl作為降黏劑，不存在(-)或存在(+)甲硫胺酸作為穩定劑；第二行：調配物樣品編號)。圖 9 在初始時及在25℃下之儲存期間帶電種類之含量(主峰(圖9A)、酸性峰(圖9B)及鹼性峰(圖9C))(在條形圖下方：第一行：pH值，其中NaCl作為降黏劑；不存在(-)或存在(+)甲硫胺酸作為穩定劑；第二行：調配物樣品編號)。圖 10 來自賦形劑篩檢II之具有蛋白質濃度為120 mg/mL之最佳化及參考調配物之濁度(圖10A)及黏度(圖10B)。圖 11 來自賦形劑篩檢II之具有蛋白質濃度為30 mg/mL之最佳化及參考調配物之濁度(圖11A)及黏度(圖11B)。圖 12 具有120 mg/mL之蛋白質濃度的最佳化及參考調配物在初始時(左條)及在5℃ (中條)下及25℃ (右條)下儲存13週後的高分子量種類(HMW)之含量。圖 13 具有30 mg/mL之蛋白質濃度的最佳化及參考調配物在初始時(左條)及在5℃ (中條)下及25℃ (右條)下儲存13週後的高分子量種類(HMW)之含量。圖 14 最佳化及參考調配物在初始時(左條)及在5℃ (中條)下及25℃ (右條)下儲存13週後的帶電種類之含量(主峰(圖14A)、酸性峰(圖14B)及鹼性峰(圖14C))。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022

Claims (31)

  1. 一種液體醫藥調配物，其包含：120mg/ml±18mg/ml雙特異性抗VEGF/ANG2抗體，該抗體包含人類IgG1子類之恆定重鏈區，15至35mM氯化鈉，15至25mM組胺酸乙酸鹽緩衝液，pH為5.5±0.5；其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：1之CDR3H區、SEQ ID NO：2之CDR2H區及SEQ ID NO：3之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：4之CDR3L區、SEQ ID NO：5之CDR2L區及SEQ ID NO：6之CDR1L區；且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位在重鏈可變域中包含SEQ ID NO：9之CDR3H區、SEQ ID NO：10之CDR2H區及SEQ ID NO：11之CDR1H區，且在輕鏈可變域中包含SEQ ID NO：12之CDR3L區、SEQ ID NO：13之CDR2L區及SEQ ID NO：14之CDR1L區，且其中iii)該雙特異性抗體包含人類IgG1子類之恆定重鏈區，該恆定重鏈區包含突變I253A、H310A及H435A及突變L234A、L235A及P329G(根據Kabat之EU索引編號)。
  2. 如請求項1之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中i)特異性結合至VEGF之該第一抗原結合部位包含作為重鏈可變域VH之SEQ ID NO：7之胺基酸序列，且包含作為輕鏈可變域VL之SEQ ID NO：8之胺基酸序列，且ii)特異性結合至ANG-2之該第二抗原結合部位包含作為重鏈可變域VH之SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且包含作為輕鏈可變域VL之SEQ ID NO：16之胺基酸序列。
  3. 如請求項2之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含特異性結合至人類VEGF之第一抗原結合部位及特異性結合至人類ANG-2之第二抗原結合部位，其中iv)在該恆定重鏈區中，S354C及T366W突變包含於一個CH3域中，且Y349C、T366S、L368A及Y407V突變包含於另一CH3域中(根據Kabat之EU索引編號)。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為二價且包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該雙特異性抗VEGF/ANG2抗體為法利昔單抗(faricimab)。
  6. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與。
  7. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物基本上不含可見粒子。
  8. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含1至20mM之至少一種穩定劑。
  9. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含7.0mM±2.0mM甲硫胺酸。
  10. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含0.01-0.07%(w/v)界面活性劑。
  11. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含0.03%至0.07%(w/v)聚山梨醇酯20。
  12. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含50-250mM張力劑。
  13. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物進一步包含160mM±24mM蔗糖。
  14. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物具有20mPas或更低之黏度。
  15. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物具有30FTU或更低之濁度。
  16. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物具有介於20與50之間的離子強度。
  17. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與，其中該調配物基本上不含氯化鈣。
  18. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與，其中該調配物基本上不含精胺酸。
  19. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其用於玻璃體內投與，其中該調配物基本上不含精胺酸及氯化鈣。
  20. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物包含以下組分或由以下組分組成： 120mg/ml±18mg/ml雙特異性抗VEGF/ANG2抗體；15至35mM氯化鈉；15至25mM組胺酸乙酸鹽緩衝液；7.0mM±2.0mM甲硫胺酸；0.03%(w/v)至0.07(w/v)聚山梨醇酯20；160mM±24mM蔗糖；水；pH為5.5±0.5。
  21. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中調配物為穩定調配物。
  22. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中在25℃下8週後或在25℃下52週後，該醫藥調配物中雙特異性抗體之高分子量種類(HMW)含量低於10%。
  23. 如請求項1至3中任一項之醫藥調配物，其中該調配物之滲透壓為300±100mOsm/kg。
  24. 一種如請求項1至23中任一項之醫藥調配物的用途，其用於製造治療眼部血管疾病之藥劑。
  25. 如請求項24之用途，其中該等眼部血管疾病係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻 塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、黃斑變性、早產兒視網膜病(ROP)、新生血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、視網膜血管瘤增生、黃斑毛細管擴張、缺血性視網膜病、虹膜新生血管、眼內新生血管及視網膜變性。
  26. 如請求項25之用途，其中該黃斑變性為濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)；且該眼內新生血管為角膜新生血管、視網膜新生血管或脈絡膜新生血管。
  27. 如請求項26之用途，其中該等眼部血管疾病係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病(DR)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)及濕性老年性之黃斑變性(濕性AMD)。
  28. 一種用於製備如請求項1至23中任一項之醫藥調配物之方法，該方法包含以下步驟a)藉由超過濾法及透析過濾法相對透析過濾緩衝液或b)藉由透析法使用透析緩衝液針對雙特異性抗體本體溶液進行緩衝液交換，該等緩衝液含有組胺酸-乙酸鹽緩衝液或組胺酸-乙酸鹽緩衝液及氯化鈉，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉及甲硫胺酸，或組胺酸-乙酸鹽緩衝液、氯化鈉、甲硫胺酸及蔗糖藉由超過濾法濃縮該經緩衝液交換之本體溶液藉由添加各別賦形劑之儲備溶液或藉由適當調節緩衝液來調節醫藥 調配物之最終組成，且藉由混合將液體醫藥調配物進行均質化。
  29. 一種包含如請求項1至23中任一項之醫藥調配物之小瓶。
  30. 一種包含如請求項1至23中任一項之醫藥調配物之經預裝藥品注射器。
  31. 一種如請求項1至23中任一項之液體醫藥調配物之凍乾調配物。
TW108138766A 2018-10-29 2019-10-28 抗體調配物 TWI734233B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18203104 2018-10-29
EP18203104.7 2018-10-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202033180A TW202033180A (zh) 2020-09-16
TWI734233B true TWI734233B (zh) 2021-07-21

Family

ID=64082948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108138766A TWI734233B (zh) 2018-10-29 2019-10-28 抗體調配物

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20210324062A1 (zh)
EP (1) EP3873519A1 (zh)
JP (1) JP6920393B2 (zh)
KR (2) KR102467349B1 (zh)
CN (1) CN112930194A (zh)
AU (2) AU2019370601B2 (zh)
BR (1) BR112021007946A2 (zh)
CA (1) CA3114728C (zh)
CL (1) CL2021001037A1 (zh)
CR (1) CR20210200A (zh)
IL (1) IL281717A (zh)
MA (1) MA54052A (zh)
MX (1) MX2021004774A (zh)
MY (1) MY195550A (zh)
PE (1) PE20211865A1 (zh)
SG (1) SG11202103064YA (zh)
TW (1) TWI734233B (zh)
WO (1) WO2020089051A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3129901A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Eli Lilly And Company Therapeutic antibody formulation
CN116323663A (zh) 2020-09-04 2023-06-23 豪夫迈·罗氏有限公司 与vegf-a和ang2结合的抗体及其使用方法
WO2022057888A1 (zh) * 2020-09-17 2022-03-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合vegf和ang-2的双特异性抗原结合分子
CN115569191A (zh) * 2021-07-05 2023-01-06 山东新时代药业有限公司 一种重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体冻干制剂
CN115581765A (zh) * 2021-07-05 2023-01-10 山东新时代药业有限公司 一种重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体注射液
WO2024085606A1 (ko) * 2022-10-20 2024-04-25 (주)니오테스바이오 인간 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체 및 그 응용

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015107015A1 (en) * 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with improved protein a-binding

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
DK3050963T3 (da) 2005-03-31 2019-12-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid ved regulering af arrangement
CA2646965C (en) 2006-03-24 2016-06-21 Jonathan H. Davis Engineered heterodimeric protein domains
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
PL2519543T3 (pl) 2009-12-29 2016-12-30 Białka wiążące heterodimery i ich zastosowania
TW201138821A (en) * 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
US9562109B2 (en) 2010-11-05 2017-02-07 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
RS60499B1 (sr) 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
AU2013249985B2 (en) 2012-04-20 2017-11-23 Merus N.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
KR101774121B1 (ko) 2012-07-13 2017-09-01 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-vegf/항-ang-2 항체 및 안 혈관 질환의 치료에 있어서 이의 용도
KR20150063728A (ko) 2013-12-02 2015-06-10 삼성전자주식회사 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체
TWI761959B (zh) * 2014-11-07 2022-04-21 瑞士商諾華公司 治療眼部疾病之方法
EP3240571A4 (en) * 2014-12-31 2018-06-13 NovelMed Therapeutics, Inc. Formulation of aglycosylated therapeutic antibodies
KR101808234B1 (ko) * 2015-06-23 2017-12-12 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 안정한 액상 제제
AU2016356047B2 (en) * 2015-11-18 2021-10-21 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a VEGF antagonist
EP3407868A1 (en) * 2016-01-26 2018-12-05 Formycon AG Liquid formulation of a vegf antagonist
CN109310756B (zh) 2016-05-13 2022-06-28 奥美药业有限公司 新型血管生成素2，vegf双特异性拮抗剂
WO2018122053A1 (en) * 2016-12-29 2018-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-angiopoietin-2 antibody formulation
CN112739323A (zh) * 2018-05-10 2021-04-30 瑞泽恩制药公司 含有高浓度vegf受体融合蛋白的制剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015107015A1 (en) * 2014-01-15 2015-07-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with improved protein a-binding

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Regula JT, et al. "Targeting key angiogenic pathways with a bispecific CrossMab optimized for neovascular eye diseases" EMBO Molecular Medicine (Online) 2016;8(11):1265-1288 *

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202103064YA (en) 2021-05-28
JP6920393B2 (ja) 2021-08-18
CA3114728A1 (en) 2020-05-07
EP3873519A1 (en) 2021-09-08
TW202033180A (zh) 2020-09-16
KR102590359B1 (ko) 2023-10-16
MA54052A (fr) 2022-02-09
WO2020089051A1 (en) 2020-05-07
CA3114728C (en) 2024-05-14
KR20220136446A (ko) 2022-10-07
MX2021004774A (es) 2021-08-24
AU2019370601A1 (en) 2021-05-27
JP2020097567A (ja) 2020-06-25
CR20210200A (es) 2021-05-25
IL281717A (en) 2021-05-31
BR112021007946A2 (pt) 2021-08-03
AU2019370601B2 (en) 2024-05-23
PE20211865A1 (es) 2021-09-21
MY195550A (en) 2023-01-31
CL2021001037A1 (es) 2021-09-24
AU2024203126A1 (en) 2024-05-30
KR102467349B1 (ko) 2022-11-16
US20210324062A1 (en) 2021-10-21
CN112930194A (zh) 2021-06-08
KR20210069677A (ko) 2021-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI734233B (zh) 抗體調配物
US20240058263A1 (en) Formulations of antibody
KR102588846B1 (ko) 고농도의 항-vegf 항체를 포함하는 안정한 단백질 용액 제제
KR102272568B1 (ko) 안정화 항체 조성물
CN110559435B (zh) 包含离子性液体的液体蛋白质制剂
KR20180100439A (ko) 이중특이적 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물
JP2010512356A (ja) 非経口ａベータ抗体製剤
JP7475335B2 (ja) Ｃｓｆ－１ｒ抗体製剤
KR20070107079A (ko) 안정화된 액체 폴리펩타이드 제형
TW201945031A (zh) 低ph藥物製劑
TWI761869B (zh) 包含抗cd47/pd-l1雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途
CN113453719A (zh) 包含抗cd47抗体的制剂及其制备方法和用途
US20240182554A1 (en) Protein solution formulation containing high concentration of an anti-vegf antibody
WO2018223958A1 (zh) 一种含c-Met抗体药物偶联物的药物组合物及其用途
CN107205925B (zh) 液体药物组合物
RU2806628C2 (ru) Состав, содержащий антитело
CN116510006A (zh) 抗trbv9抗体的药物组合物及其用途