KR20180100439A - 이중특이적 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물, 사이클로덱스트린 및 완충제를 포함하는 신규하고 안정한 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

이중특이적 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물
재조합 DNA 기술의 출현은 지난 30년 동안 다수의 단백질 약제물의 발달을 가능하게 하였다. 단백질-기반 약제물은 현재 (전)임상 개발에서 그리고 시판 제품으로서 가장 빠르게 성장하는 치료제의 카테고리이다. 작은 화학적 약물에 비해서, 단백질 약제물은 비교적 낮은 농도에서 높은 특이성 및 활성도를 가지며, 전형적으로 고 영향 질병, 예컨대 다양한 암, 자가 면역 질환 및 대사 장애의 치료를 제공한다(Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jul;32(7):372-80, Wang, Int J Pharm. 1999 Aug 20;185(2):129-88).
상업적인 규모의 정제 공정의 발달로 인해서, 재조합 단백질은 현재 처음 제조될 때 고순도로 수득될 수 있다. 그러나, 단백질은 단지 약하게 안정하고, 화학적 및 물리적으로 매우 분해되기 쉽다. 화학적 분해는 공유 결합, 예컨대 탈아미드화, 산화, 새로운 다이설파이드 브릿지의 절단 또는 형성, 가수분해, 이성질체화 또는 탈글리코실화를 포함하는 변형을 지칭한다. 물리적 분해는 단백질 풀림, 표면에 대한 바람직하지 않은 흡착 및 응집을 포함한다. 이러한 물리적 안정성 및 화학적 안정성의 취급이 단백질 약제물의 개발에서 가장 도전적인 과제 중 하나이다(Chi et al., Pharm Res, Vol. 20, No. 9, Sept 2003, pp. 1325-1336, Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jul;32(7):372-80).
단백질 응집은 단백질의 물리적 불안정성의 주요 사건을 나타내고, 용매와 소수성 단백질 잔기 간의 열역학적으로 선호되지 않는 상호작용을 최소화하는 내재하는 경향성으로 인해서 일어난다. 그것은 재접힘, 정제, 멸균화, 운송 및 저장 공정 동안 일상적으로 일어나기 때문에 특히 문제가 된다. 응집은 단백질 네이티브 상태가 열역학적으로 매우 선호되는 용액 조건(예를 들어, 중성 pH 및 37℃) 및 스트레스의 부재 하에서도 일어날 수 있다(Chi et al., Pharm Res, Vol. 20, No. 9, Sept 2003, pp. 1325-1336, Roberts, Trends Biotechnol. 2014 Jul;32(7):372-80, Wang, Int J Pharm. 1999 Aug 20;185(2):129-88, Mahler J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34.).
단백질 응집은 그것이 치료 단백질의 생물학적 활성도를 손상시킬 수 있기 때문에 문제가 된다. 더욱이, 단백질의 응집은 약물 제품의 바람직하지 않은 미학으로 이어지고, 최종 생성물로부터 응집물을 제거하는 데 필요한 정교한 정제 단계로 인해서 생성물 수율을 감소시킨다. 또한, 보다 최근에는, 응집된 단백질(심지어는 인간화 또는 완전 인간 단백질)의 존재는, 환자가 활성 단백질 단량체에 대한 면역 반응을 발달시킬 것이라는 위험을 상당히 증가시켜서, 중화 항체 및 약물 내성 또는 다른 부정적인 부작용을 초래할 수 있다는 우려 및 증거가 증가하고 있다(Mahler J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34).
다양한 기전에 의해서 단백질 응집을 최소화하기 위해서 몇몇 노력이 문헌에 보고되어 있다. 단백질은 이의 1차 구조를 변형하고, 이에 의해서 내부 소수성을 증가시키고 외부 소수성을 감소시킴으로써 안정화되어 응집물 형성 및 다른 화학적 변화로부터 보호될 수 있다. 그러나, 단백질의 유전자 조작은 손상된 기능 및/또는 증가된 면역원성을 초래할 수 있다. 또 다른 접근법은 다양한 기전, 예컨대 온도, 압력, pH 및 염을 사용함으로써 기능적인 네이티브 단량체를 회복시키기 위해서 응집물의 해리("비응집(disaggregation)"이라 지칭됨)에 초점을 맞춘다. 현재, 단백질 응집물은 주로 하류 가공의 폴리싱 단계에서 불순물로서 제거된다. 그러나, 높은 수준의 고분자량(HMW)의 경우에, 상당한 양의 HMW를 제거하는 것은 실질적인 수율 손실을 초래할뿐만 아니라 강력한 하류 가공의 설계를 어렵게 만든다(Chi et al., Pharm Res, Vol. 20, No. 9, Sept 2003, pp. 1325-1336).
생물학적 응용 및 생명공학적 응용에서 단백질 안정성 및 활성도를 보존하는 것은 심각한 도전이다. 치료 단백질의 향상된 안정성을 제공하고, 제형, 충전, 수송, 저장 및 투여 동안 응집 및 변성을 감소시켜, 기능 손실 및 부정적인 면역원성 반응을 예방하는 최적화된 약제학적 조성물이 관련 기술 분야에 요구된다. 본 발명의 목적은 이러한 요구를 충족시키는 것이다.
단백질 불안정성, 및 특히 단백질 응집은 생명공학 산업에서 증가하는 도전 과제이며, 여기서 응집은 재접힘, 정제, 멸균, 수송 및 저장 공정 동안을 비롯하여, 치료 단백질의 수명 전체에서 일어난다. 따라서 본 발명의 목적은 제1 결합 도메인을 통해서 표적 세포 표면 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인을 통해서 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물; β-사이클로덱스트린; 및 완충제를 포함하는 안정한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
β-사이클로덱스트린, 메틸-β-사이클로덱스트린, 하이드록시에틸-β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 에틸-β-사이클로덱스트린, 부틸-β-사이클로덱스트린, 석신일-(2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(2,3,6-트라이-O-메틸)-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(2,3,6-트라이-O-벤조일)-β-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 포스페이트 나트륨염, β-사이클로덱스트린 설페이트 나트륨염, 트라이아세틸-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(6-O-설포)-β-사이클로덱스트린 헵타나트륨염, 카복시메틸-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 6-O-p-톨루엔설폰일-β-사이클로덱스트린으로 이루어진 군, 및 특히 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린으로부터 선택된 β-사이클로덱스트린이 존재할 수 있다. 그것은 0.1% 내지 20%(w/v), 바람직하게는 0.5% 내지 2%(w/v), 보다 바람직하게는 0.8% 내지 1.5%(w/v)의 범위의 농도로 존재할 수 있다.
이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 0.1 내지 5㎎/㎖, 바람직하게는 0.2 내지 2.5㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.25 내지 1.0㎎/㎖의 농도 범위로 존재할 수 있다. 이의 제1 결합 도메인은 CD33에 결합할 수 있다. 특히, 이중특이적 단일 쇄 작제물의 제1 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 99, 109, 119, 128, 137, 146, 155, 164 및 173로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이중특이적 단일 쇄 작제물의 제2 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 9, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 179 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
완충제는 인산칼륨, 아세트산/아세트산나트륨, 시트르산/시트르산나트륨, 석신산/석신산나트륨, 타타르산/타타르산나트륨, 히스티딘/히스티딘 HCl, 글라이신, 트리스(Tris), 글루타메이트, 아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터, 특히 인산칼륨, 시트르산/시트르산나트륨, 석신산, 히스티딘, 글루타메이트, 아세테이트 및 이들의 조합물로부터 선택될 수 있다.
약제학적 조성물의 pH는 4 내지 7.5 범위일 수 있다.
수크로스, 트레할로스, 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 라이신, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 폴록사머 188, 플루로닉 및 이들의 조합물을 비롯한, 1종 이상의 부형제가 본 명세서에 제공된 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다.
조성물은 1종 이상의 보존제, 특별하게는 벤질 알코올, 클로로부탄올, 페놀, 메타-크레졸, 메틸파라벤, 페녹시에탄올, 프로필파라벤 싸이오머로잘(thiomerosal)을 포함할 수 있다. 이들 보존제의 사용에 대한 구조 및 전형적인 농도는 문헌[Meyer et al. J Pharm Sci. 96(12), 3155]의 표 1에 기술되어 있다.
또한 본 명세서에는 서열번호 100 또는 110의 아미노산 서열을 갖고, 약 0.5㎎/㎖의 농도로 존재하는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물, 추가로 약 1%(w/v)의 농도의 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염인 사이클로덱스트린, 및 추가로 약 10mM의 농도의 인산칼륨인 완충제를 포함하는, 보존제가 존재하지 않는 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 제형은 약 6.0의 pH에서 약 8%(w/v)의 농도의 수크로스 및 약 0.01%(w/v)의 농도의 폴리솔베이트 80을 추가로 포함한다.
도 1: 폴리솔베이트 20, 80 또는 HP-β-CD를 함유하는 AMG 330(서열번호 100) 제제에서 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의한 고분자량 종 및 배좌이성질체(conformer)의 정량분석을 나타낸 도면.
도 2: 스트레스 인자: 스트레스 없음 (A), 포밍(foaming) (B) 및 10회 동결/해동 사이클 (C)의 기능에서, AMG 330 제제 중의 비-단량체 종(배좌이성질체, 이량체, 응집물 포함)의 양에 대한 폴리솔베이트(PS) 20, 80 및 HP-β-CD의 효과를 나타낸 도면. 종의 정량 분석은 크기 배제 초고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해서 달성하였다. 단백질 농도는 동일한 검정(A280 검출)에 의해서 다루어졌다.
도 3: 0.9%(V/V)의 벤질 알코올의 존재 하에서 AMG 103의 응집 경향에 대한 HP-β-CD 및 SBE-β-CD의 농도 의존적 효과(350㎚에서 광학 밀도에 의해서 측정; 광학 밀도는 10㎜의 경로길이를 지칭함)를 나타낸 도면.
도 4: 0.9%(V/V)의 벤질 알코올의 존재 하에서 37℃에서 24시간 동안의 인큐베이션 전 (A) 및 후 (B)의 AMG 103의 고유 형광 방출 강도 측정치를 나타낸 도면.
도 5: AMG 103(서열번호 174) 제제의 350㎚에서 광학 밀도에 대한 HP-β-CD (A) 및 SBE-β-CD (B)의 농도 증가의 효과를 기술하는 실험 설계 연구(2-수준 4-인자 완전 요인배치법)으로부터 유래된 예측 모델을 나타낸 도면.
도 6: 5㎎/㎖ CD33_2-hALB(서열번호 175)를 함유하는 상이한 제형에서 크기 배제 크로마토그래피에 의한 고분자량 종(HMWS)의 평가를 나타낸 도면.
도 7: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해서 결정된 3종의 상이한 MSLN-hALB(서열번호 176) 제형(K60RTrT (A), K60SBESuT (B), 및 K60RMSuT (C))에 대한 25℃ 및 37℃에서의 고분자량 종 형성률을 나타낸 도면.
도 8: 약한 양이온 교환 초고성능 액체 크로마토그래피(WCX-UPLC)에 의해서 결정된 3종의 상이한 MSLN-hALB 제형에 대한 25℃ 및 37℃에서의 산성 전하 변이체의 형성을 나타낸 도면.
도 9. 12% PEG-3350의 존재 하에서 40C에서 AMG 330 용해도를 나타낸 도면. SBE-β-CD(캡티솔(Captisol)) 및 알지네이트(프로타날(Protanal)) 둘 모두는 더 높은 농도에서 사용되는 경우 응집된 AMG 330 및 단량체 AMG 330의 안정성을 증가시킨다. 그러나, SBE-β-CD는 단량체를 우선적으로 가용화한다. 좌측 상의 대조군(1X PBS)은 SBE-β-CD 없이 인큐베이션된 것이었고, 반면에 우측 상의 대조군(1X PBS)은 PEG 및 SBE-β-CD 없이 인큐베이션된 것이었다.
도 10: AMG 330 중의 % 단량체 및 % 응집물에 대한 SBE-β-CD 및 알지네이트의 상이한 농도의 효과를 나타낸 도 9에 나타낸 것과 동일한 실험으로부터의 데이터를 나타낸 도면. 약 0.1 내지 1%에서의 SBE-β-CD는 응집물을 훼손시키면서 단량체 함량을 증가시키기에 효과적이다(녹색 화살표로 나타냄). 이에 반해서, 알지네이트 데이터는 응집물 증가의 반대 경향성을 나타낸다(적색 화살표로 나타냄). SBE-β-CD는 또한 이러한 경우에서 과농축의 부정적인 영향을 감소시키는 것을 나타낸다.
도 11: 완충제 교환 및 초미세여과/원심분리에 의한 단백질 농축 후 AMG 330의 평균 SEC 상대 피크 면적을 나타낸 도면.
도 12. A: SEC 주피크 + HMW에 의해서 계산된, 과농축에 의해서 달성된 최대 AMG 330 농도의 요약을 나타낸 도면. SBE-β-CD 제형(별표로 나타냄)은 더 높은 농도에 도달하였고, 더 높은 % 단량체를 유지하였다. B: 도 12A에 나타낸 것과 동일한 실험으로부터의 데이터를 나타낸 도면(여기서AMG 330은 글라이신 및 수크로스의 부재 또는 존재 하에서 SBE-β-CD의 농도 증가의 존재 하에서 최대 7 내지 8㎎/㎖로 농축되었음(별표 참고)). 좌측 상의 대조군은 SBE-β-CD 없이 농축되었다. 우측 상의 대조군은 0.4㎎/㎖의 이의 시작 농도를 초과하게 농축되지 않았다. '2% 글라이신, 1% 수크로스"라고 표지된 추가적인 샘플은 SBE-β-CD 사용의 이점을 입증하기 위해서 SBE-β-CD 없이 농축되었다. C: 4℃에서 5일 인큐베이션 후 AMG 330 CEX 상대 피크 면적(2회 반복검증의 평균치)을 나타낸 도면. 모든 샘플은 20mM 시트레이트, 0.01% PS-80, pH 6.0을 함유한다. D: SEC 분석 후 AMG 330 상대 주 피크 면적을 나타낸 도면. 모든 샘플은 또한 20mM 시트레이트, 0.01% PS-80, pH 6.0을 포함한다.
도 13: SEC 주피크 + HMW로부터 계산된 AMG 330 농도를 나타낸 도면.
도 14: 완충제 교환 및 농축 후 SEC로부터의 AMG 330 상대 피크 면적을 나타낸 도면.
도 15: 다양한 사이클로덱스트린과 함께 인큐베이션시킨 후 AMG 330 SEC 총 피크 면적(주 피크 + HMW) 피크를 나타낸 도면.
도 16: 1㎎/㎖에서 13개의 상이한 제형 중에, -20, -30 및 -700℃에서 최대 6주 동안 저장된 AMG 330을 나타낸 도면.
도 17: a: 0.5%에서 SBE-β-CD는 그 자신 상에 우아한 리오(lyo) 케이크를 제공하기에 완전히 충분하지 않을 수 있지만, 이것은 보다 일반적인 벌킹제(bulking agent), 예컨대 글라이신 및 만니톨과 상용성임을 나타낸 도면. 이들 리오 케이크 모두는 SBE-β-CD의 존재 하에서 응집 또는 미립화(particulation)가 적거나 거의 없이 양호하게 재구성 및 생산되었다. b: α-사이클로덱스트란(화살표로 표시된 분홍색 크로마토그램)이 아닌 SBE-β-CD(화살표로 표시된 청색 크로마토그램)의 사용이 재구성 후 % 응집물을 감소시킴을 나타낸 도면. 임의의 사이클로덱스트린이 없는 대조군 제형(두꺼운 흑색선)은 또한 α-사이클로덱스트란보다 낮지만, 응집물의 상승된 수준을 나타낸다. 이들 결과는 SBE-β-CD 사용의 이점을 입증한다. c: 상이한 제형의 분석용 SEC를 나타낸 도면(pre 및 post는 동결건조 전 및 구성 후를 나타냄). d: 동결건조 후 상이한 제형에 대한 MFI 분석을 나타낸 도면.
도 18. 과농축에 의해서 달성된 최대 Fapα BiTE(등록상표)(서열번호 177) 농도의 요약을 나타낸 도면. SBE-β-CD 제형(별표로 나타냄)은 α-사이클로덱스트란에 비해서 더 높은 단백질 농도에 도달하였고, 더 높은 % 단량체를 유지하였다. α-사이클로덱스트란 제형은 침전으로 인해서 이의 가용성 단백질 대부분을 손실하였다.
도 19. CD33-scFc BiTE 항체 작제물 제형의 기능에서 크기 배제 초고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해서 결정된 고분자량 종(HMWS)의 백분율 함량에 대한 개요를 나타낸 도면.
도 20. FLT3-scFc BiTE 항체 작제물 제형의 기능에서 크기 배제 초고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해서 결정된 고분자량 종(HMWS)의 백분율 함량에 대한 개요를 나타낸 도면.
도 21. BCMA-scFc BiTE 항체 작제물 제형의 기능에서 크기 배제 초고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해서 결정된 고분자량 종(HMWS)의 백분율 함량에 대한 개요를 나타낸 도면.
현재 치료용 생명공학 제품의 고품질 및 내인성 인간 단백질에 대한 재조합 인간 단백질 및 항체의 유사성에도 불구하고, 단백질 불안정성은 중요한 문제이다. 단백질 응집의 품질 관련된 결과, 예컨대 약물 제품의 단백질 활성도 및 바람직하지 않은 미학의 가능한 손실에 더하여, 가용성 단백질 응집물은 상당한 세포독성 효과를 갖고, 중요하게는 단백질 제품에 대한 면역 반응의 발달에 대한 잠재적인 위험 인자이다.
단백질 응집은 발효, 재접힘, 정제, 충전, 수송, 저장 또는 투여를 비롯한 단백질의 수명 전체의 다양한 지점에서 그 동안 일어날 수 있고, 다양한 환경 인자에 강하게 의존한다. 치료 단백질의 안정성을 증가시키고, 응집을 감소시키는 중요한 요구가 관련 기술 분야에 존재하고; 최적화된 약제학적 제형은 이렇게 하는 것을 도울 수 있다. 본 발명자들은 다양한 환경 스트레스 인자에 노출되는 경우 이중특이적 항체 작제물(구체적으로, 이중-특이적 T-세포 인게이저, BiTE(등록상표))의 응집에 대한 상이한 사이클로덱스트린의 효과를 조사하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 항체 작제물이 사이클로덱스트린, 특히 β-사이클로덱스트린의 존재 하에서 상당히 안정화될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 a) 제1 결합 도메인을 통해서 표적 세포 표면 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인을 통해서 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물, b) β-사이클로덱스트린, 및 c) 완충제를 포함하는 안정한 약제학적 조성물을 제공한다.
안정성
본 발명 내에서, 용어 "안정성" 또는 "안정화"는 구체적으로 제형, 충전, 수송, 저장 및 투여 동안 약제학적 조성물 전체의 안정성, 특히 활성 성분(즉, 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물) 자체의 안정성에 관한 것이다. 용어 "안정성" 또는 "안정한"은 본 발명의 약제학적 조성물 및 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 문맥에서 특별하게는 단백질 응집물(HMWS)의 감소 또는 예방을 지칭한다. 구체적으로, 용어 "안정성"은 또한 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물에 포함되는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 콜로이드 안정성에 관한 것이다. "콜로이드 안정성"은 연장된 시간 기간(수 일 내지 수 년) 동안 액체 중에 분산되어 유지되는 콜로이드 입자(예컨대, 단백질)의 안정성이다.
용어 "(단백질) 응집물"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 일반적으로 목적하는 정의된 종(예를 들어, 단량체) 대신에 더 높은 분자량의 단백질 종, 예컨대 "올리고머" 또는 "다량체"를 포함한다. 이 용어는 본 명세서에서 용어 "고분자량 종" 및 "HMWS"와 상호 교환 가능하게 사용된다. 단백질 응집물은 일반적으로 크기(작은 조립체(이량체)에서 큰 조립체(눈에 보이지 않거나(subvisible) 심지어는 눈에 보이는 입자)까지의 범위 및 직경이 나노미터에서 마이크로미터 범위까지의 범위), 모폴로지(대략 구체에서 피브릴형까지), 단백질 구조(네이티브 대 비네이티브/변성됨), 분자간 결합의 유형(공유 대 비공유), 가역성 및 용해성이 상이할 수 있다. 가용성 응집물은 대략 1 내지 100㎚의 크기 범위를 포함하고, 단백질 미립자는 눈에 보이지 않거나 (약 0.1 내지 100.m) 눈에 보이는(100 .m 초과) 범위를 포함한다. 상기에 언급된 유형의 단백질 응집물 모두는 일반적으로 이 용어에 의해서 포함된다. 용어 "(단백질) 응집물"은 따라서 2종 이상의 단백질 단량체의 모든 부류의 물리적으로-회합 또는 화학적으로 연결된 비네이티브 종을 지칭한다.
따라서 용어 "단백질 응집" 또는 "비네이티브 응집"은 단백질 분자가 단량체라 지칭된 개별 단백질을 갖과 함께, 2종 이상의 단백질로 구성된 복합체로 조립되는 공정(들)을 나타낸다. 온도, 기계적 스트레스, 예컨대 진탕 및 교반, 펌핑, 동결 및/또는 해동 및 제형화을 비롯한, 매우 다양한 조건에 의해서 유도될 수 있는 단백질 응집으로 이어지는 다수의 경로가 존재한다.
온도
온도 증가는 화학 반응, 예컨대 단백질의 산화 및 탈아미드화를 가속화하는데, 이것은 그 다음 응집을 촉진시킬 수 있다. 더 높은 온도는 또한 4차, 3차 및 2차 구조 수준에 대한 단백질의 입체배좌에 직접적으로 영향을 주고, 응집을 촉진시킬 수 있는 온도-유도된 풀림으로 이어질 수 있다.
동결 및 해동
단백질 변성 및 응집은 복잡한 물리적 및 화학적 변화, 예컨대 새로운 얼음/용액 계면의 생성, 용기 표면에 대한 흡착, 단백질 및 용질의 저온농축(cryoconcentration) 및 완충제 구성성분의 결정화로 인한 pH 변화로 인해서 동결/해동 동안 일어날 수 있다.
단백질 농축
단백질 농도의 증가는 또한 단백질 응집물의 형성을 향상시킬 수 있다. 높은 단백질 농도에서, 거대분자 과밀이 일어나는데, 이 용어는 그 용질 중에서 각각의 거대분자 종의 거동에 대한 거대분자 용질에 의한 높은 총 부피 점유의 효과를 기술하는 데 사용된다. 이러한 배제된 부피 이론에 따라서, 자가-조립 및 이에 따른 잠재적인 응집이 선호될 수 있다.
보존제
항미생물성 보존제, 예컨대 벤질 알코올 및 페놀은 종종 이의 저장 수명 동안 멸균성을 보장하기 위해서 단백질 액체 제형에서 요구되며, 또한 다회용량 제형 및 특정 약물 전달 시스템, 예를 들어 주사 펜, 미니펌프 및 국소 도포에서 요구된다. 다수의 보존제가 단백질 응집을 유도하는 것으로 보고되어 있지만, 근본적인 기전은 잘 이해되지 않는다. 보존제는 응집되기 쉬운 풀린 단백질 상태에 결합하여 이를 채운다고 제안되어 있다.
이롭게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 스트레스, 특히 열 스트레스, 저장, 표면-유도된 스트레스(예컨대, 동결/해동 사이클, 포밍), 농축(초미세여과 및 투석에 의함)에 적용되는 경우에도 또는 유기 화합물, 예컨대 항미생물성 보존제와 혼합되는 경우에도 안정하다고, 즉, 단백질 응집물이 존재하지 않거나 또는 실질적으로 존재하지 않고 유지된다고 예상된다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 첨부된 실시예에서 평가된 SBE-β-CD 또는 HP β-CD를 포함하는 조성물과 비교할 때 유사하거나 또는 심지어는 개선된 특징을 가질 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 분산된 단량체 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 균질한 용액이다.
통상의 기술자는 약제학적 조성물이 효과적으로 활성 성분의 안정화를 제공하지만(즉, 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 단백질 응집물의 형성을 감소시키거나 저해함), 그러나 약제학적 조성물의 전체 유용성을 실질적으로 손상시키지 않으면서, 일부 응집물 또는 배좌이성질체가 가끔 형성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이러한 문맥에서, 응집물이 "실질적으로 존재하지 않는"은 예를 들어, 첨부된 실시예에서 평가된 바와 같이, 특별하게는 또한 환경 스트레스에 적용되는 경우에도 응집물의 양이 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%(w/v) 미만으로 유지되는 것을 의미한다.
가용성 및 불용성 단백질 응집물의 존재를 결정하는 방법은 특히 문헌[Mahler et al., J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34]에 의해서 검토되어 있다. 가용성 단백질 응집물의 형성은 첨부된 실시예에 기술된 바와 같이 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해서 평가될 수 있다. SEC는 단백질 응집물의 검출 및 정량분석을 위한 가장 널리 사용되는 분석 방법 중 하나이다. SEC 분석은 응집물의 크기 분석 및 이의 정량분석 둘 모두를 가능하게 한다. SEQ-UPLC는 약 5 내지 1000kDa의 분자량 범위에서 이의 형상 및 크기(수력학적 반경)를 기준으로 거대분자의 선택적이고 신속한 분리를 가능하게 한다.
단백질 용액은 유광(opalescence) 또는 탁도(turbidity)라 지칭되는 광학 특성을 나타낸다. 용액의 광학 특성은 광을 산란 및 흡수하는 존재하는 입자의 함수이다. 단백질은 자연 콜로이드이고, 수성 제형의 탁도는 단백질 농도, 비용해된 입자의 존재, 입자 크기 및 부피 단위당 입자수에 좌우된다. 탁도는 340 내지 360㎚ 범위의 광학 밀도로서 UV-Vis 분광학에 의해서 측정될 수 있고, 가용성 및 불용성 응집물 둘 모두를 검출하는 데 사용될 수 있다.
더욱이, 시각적인 수단에 의한 샘플의 조사는 여전히 단백질 응집물을 평가하는 중요한 양상이다. 가시적인 응집물의 존재 또는 부재에 대한 시각적인 평가는 바람직하게는 도이처 아르즈나이미텔 코덱스(Deutscher Arzneimittel Codex) (DAC) 시험 5에 따라서 수행된다.
본 명세서 다른 부분에 언급된 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물은 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 증가된 콜로이드 안정성을 선호하고-주로 그 내에 포함한 β-사이클로덱스트린의 작용에 의해서인 것 같음-, 이에 따라서 감소된 액체-액체 상 분리(LLPS) 또는 심지어는 이의 부재를 나타내는 것으로 예상된다. LLPS는 균질한 단백질 용액이 온도 감소로 인해서 단백질-부족 상(통상적으로 상부 층) 및 단백질-풍부 상(통상적으로 하부 층)으로 분리되는 열역학적 유래의 사건이다. LLPS는 전형적으로 단순하게 두 상을 혼합하고, 용액의 온도를 상승시킴으로써 완전히 가역적이다. LLPS의 발생은 짧은 범위의 매력적인 단백질-단백질 상호작용으로 인한 것이었다(그것은 단백질-단백질 인력의 강도의 척도가 됨). 본 발명에 따른 β-사이클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물은 β-사이클로덱스트린을 포함하지 않는 약제학적 조성물과 비교할 때, LLPS 단백질-부족 상 중에 더 높은 농도의 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물을 포함하는 것으로 발견되었다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 대조군과 비교하는 경우 결국 감소된 LLPS 또는 LLPS 부재를 나타내고, 따라서 본 발명의 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 증가된 콜로이드 안정성을 촉진시킨다고 예상된다. LLPS가 유도될 수 있고, 상이한 상의 단백질 함량은 첨부된 실시예에 기술된 바와 같이 조사될 수 있다.
특히 열 및/또는 화학적 변성으로 인한 환경 스트레스는 또한 입체배좌 변화로 이어질 수 있는데, 이것을 결국 응집을 선호할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물이 또한 방향족 아미노산의 고유 형광 방출 강도를 측정함으로써 평가되는 바와 같이 입체배좌 변화와 관련하여 안정화된다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 바람직하게는 배좌이성질체(즉, 비네이티브, 비정상적으로 접힌 단백질 종)의 형성을 감소시키거나 또는 저해한다.
항체 작제물
상기에 설명된 바와 같이, 본 발명의 안정한 약제학적 조성물은 제1 결합 도메인을 통해서 표적 세포 표면 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인을 통해서 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물을 포함한다.
용어 "항체 작제물"은 일반적으로 구조 및/또는 기능이 항체의, 예를 들어 전장 또는 전체 면역글로불린 분자의 구조 및/또는 기능에 기반하는 분자를 지칭한다. 따라서 항체 작제물은 그의 특이적 표적 또는 항원에 결합할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 항체 작제물은 표적 결합을 허용하는 항체의 최소 구조 요건을 포함한다. 이러한 최소 구조 요건은 예를 들어, 적어도 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3)의 존재에 의해서 정의된다. 본 발명에 따른 작제물이 기반으로 하는 항체는 예를 들어 단클론성, 재조합, 키메라, 탈면역화, 인간화 및 인간 항체를 포함한다.
생명공학적 또는 단백질 조작 방법 또는 과정에 의해 생성된 카멜리드 항체 및 다른 면역글로불린 항체를 포함하는 전장 또는 전체 항체는 "항체 작제물"의 정의 내에 있다. 이들 전장 항체는 예를 들어, 단클론성, 재조합, 키메라, 탈면역화, 인간화 및 인간 항체일 수 있다. 또한 "항체 작제물"의 정의 내에는 전장 항체의 단편, 예컨대 VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 또는 "r　IgG" ("하프(half) 항체")가 있다. 항체 작제물은 또한 항체 변이체가라고도 지칭되는 항체의 변형된 단편, 예컨대 scFv, 다이-scFv 또는 바이(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-지퍼, scFab, Fab2, Fab3, 다이아바디, 단일 쇄 다이아바디, 텐덤 다이아바디(Tandab's), 텐덤 다이-scFv, 텐덤 트라이-scFv, 하기와 같은 구조에 의해서 예시되는 "미니바디": (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2 또는 (scFv-CH3-scFv)2, 멀티바디, 예컨대 트라이아바디 또는 테트라바디, 및 단일 도메인 항체, 예컨대 나노바디 또는 다른 V 영역 또는 도메인의 항원 또는 에피토프에 독립적으로 특이적으로 결합하는 단지 하나의 가변 도메인을 포함하는 단일 가변 도메인 항체(이것은 VHH, VNAR VH 또는 VL일 수 있음)일 수 있다. 또한 용어 "항체 작제물"은 VH, VL, VHH 및 VNAR을 포함하는 군으로부터 개개로 선택되는 (적어도) 2개의 단일 도메인 단클론성 항체, 및 링커로 구성된 단일 도메인 항체 작제물을 포함한다. 링커는 바람직하게는 펩타이드 링커의 형태이다. 유사하게, "scFv-단일 도메인 mAb"는 상기에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 단일 도메인 및 상기에 기술된 바와 같은 하나의 scFv 분자로 구성된 단클론성 항체 작제물이다. 또한, 링커는 바람직하게는 펩타이드 링커의 형태이다.
더 나아가, 용어 "항체 작제물"의 정의는 일반적으로 1가, 2가 및 다가/다중가 작제물을 포함하고, 따라서, 단지 하나의 항원 구조에 특이적으로 결합하는 단일 특이적 작제물뿐만 아니라 별개의 결합 도메인을 통해 하나 초과의 항원 구조, 예를 들어, 2, 3개 이상에 특이적으로 결합하는 이중특이적 및 다특이적/다중특이적 작제물을 포함한다. 게다가, 용어 "항체 작제물"의 정의는 단지 하나의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 분자뿐만 아니라 하나 초과의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 분자를 포함하며, 이 쇄는 동일하거나(동종이량체, 동종삼량체 또는 동종 올리고머) 또는 상이할 수 있다(이종이량체, 이종삼량체 또는 이종올리고머). 본 발명의 문맥에서, 제1 결합 도메인을 통해서 표적 세포 표면 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인을 통해서 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물이 특별하게 예상된다.
결합 도메인
용어 "결합 도메인"은 본 발명과 관련하여 각각 표적 분자(항원) 상에서 주어진 표적 에피토프 또는 주어진 표적 부위에 (특이적으로) 결합하고/상호작용하고/인식하는 도메인을 특성규명한다. 결합 도메인은 바람직하게는 폴리펩타이드 형태이다. 이러한 폴리펩타이드는 단백질 부분 및 비단백질 부분(예를 들어, 화학적 링커 또는 화학적 가교제, 예컨대 글루타르알데하이드)을 포함할 수 있다. 단백질(보통 30개 미만의 아미노산을 갖는 이의 단편, 바람직하게는 생물학적으로 활성인 단편 및 펩타이드)은 공유 펩타이드 결합을 통해 서로 결합되는 2개 이상의 아미노산을 포함한다(아미노산 쇄를 초래). 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 통상적으로 30개 초과의 아미노산으로 이루어진 분자의 군을 기재한다. 폴리펩타이드는 다량체, 예컨대 이량체, 삼량체 및 더 고차의 올리고머(즉 하나 초과의 폴리펩타이드 분자로 이루어짐)를 추가로 형성할 수 있다. 이러한 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩타이드 분자는 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있다. 이러한 다량체의 대응하는 더 고차의 구조는 결과적으로 동종- 또는 이종이량체, 동종 또는 이종삼량체 등으로 지칭된다. 이종다량체에 대한 예는 천연 유래 형태에서 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드로 이루어진 항체 분자이다. 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 또한 자연적으로 변형된 펩타이드/폴리펩타이드/단백질을 지칭하되, 변형은, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 번역후 변형에 의해 달성된다. "펩타이드", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 본 명세서에서 지칭될 때, 또한 화학적으로 변형, 예컨대 페길화(pegylated)될 수 있다. 이러한 변형은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 본 명세서에서 이하에 기재되어 있다.
제1 결합 도메인의 구조 및 기능, 및 바람직하게는 또한 제2 결합 도메인의 구조 및/또는 기능은, 예를 들어 전장 또는 전체 면역글로불린 분자의 구조 및/또는 기능에 기반한다. 제1 결합 도메인은 3개의 경쇄 CDR(즉, 가변 경(VL) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 3개의 중쇄 CDR(즉, 가변 중(VH) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3)의 존재를 특징으로 한다. 제2 결합 도메인은 바람직하게는 또한 표적 결합을 허용하는 항체의 최소 구조적 요건을 포함한다. 더 바람직하게는, 제2 결합 도메인은 적어도 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있지만; 그러나, 이는 둘 다 포함하지는 않는다. Fd 단편은, 예를 들어, 2개의 VH 영역을 가지고, 종종 무손상 항원-결합 도메인의 일부 항원-결합 기능을 보유한다. (변형된) 항원-결합 항체 단편의 예는 (1) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편; (2) F(ab')2 단편(힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편); (3) 2개의 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (4) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편, (5) VH 도메인을 갖는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546); (6) 단리된 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR), 및 (7) 단쇄 Fv(scFv)를 포함한다(예를 들어, scFV-라이브러리로부터 유래됨).
가변 영역
용어 "가변"은 그들의 서열에서 가변성을 나타내고, 특정 항체의 특이성 및 결합 친화도를 결정함에 있어서 수반되는 항체 또는 면역글로불린 도메인의 일부(즉, "가변 도메인(들)")를 지칭한다. 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 쌍은 함께 단일 항원 결합 부위를 형성한다. VH에 대해 가장 근위인 CH 도메인은 CH1로서 표기된다. 각각의 경(L) 쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 연결되는 반면, 2개의 H　쇄는 H　쇄 아이소타입에 의존하는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 결합된다.
가변성은 항체의 가변 도메인 전체적으로 균일하게 분포되지 않으며; 이는 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 하위 도메인에서 농축된다. 이들 하위 도메인은 "초가변 영역" 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불린다. CDR은 항체와 항원의 특이적인 상호작용에 책임이 있는 잔기의 대부분을 함유하고, 따라서 항체 분자의 기능적 활성에 기여하고; 이들은 항원 특이성의 주요 결정기이다.
정확한 정의의 CDR 경계 및 길이는 상이한 분류 및 넘버링 시스템의 대상이다. 따라서 CDR은 카바트(Kabat), 코티아(Chothia), 접촉 또는 본 명세서에 기재된 넘버링 시스템을 포함하는 임의의 다른 경계 정의에 의해 지칭될 수 있다. 경계를 달리함에도 불구하고, 각각의 이들 시스템은 가변 서열 내에서 소위 "초가변 영역"을 구성하는 것과 일부 중복된 정도를 가진다. 따라서 이들 시스템에 따른 CDR 정의는 인접한 프레임워크 영역에 대해 길이 및 경계 면적이 다를 수 있다. 예를 들어 카바트(교차종 서열 가변성에 기반한 접근법), 코티아(항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근법) 및/또는 매캘럼(MacCallum)(Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. MoI. Biol, 1987, 196: 901-917; MacCallum et al., J. MoI. Biol, 1996, 262: 732) 참조. 항원 결합 부위를 특성규명하기 위한 또 다른 표준은 옥스포드 몰레큘러 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 AbM 정의이다. 예를 들어, 문헌[Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)] 참조. 2개의 잔기 식별 기법이 중복 영역을 정하지만, 동일한 영역은 아닌 정도로, 그들은 혼성체 CDR을 정하도록 조합될 수 있다. 그러나, 소위 카바트 시스템에 따른 넘버링이 바람직하다.
전형적으로, CDR은 정규 구조로서 분류될 수 있는 루프 구조를 형성한다. 용어 "정규 구조"는 항원 결합(CDR) 루프에 의해 채택되는 주요 쇄 입체배좌를 지칭한다. 비슷한 구조적 연구로부터, 6개의 항원 결합 루프 중 5개는 이용 가능한 입체배좌의 제한된 레퍼토리만을 가지는 것으로 발견되었다. 각각의 정규 구조는 폴리펩타이드 골격의 비틀림 각도에 의해 특성규명될 수 있다. 따라서, 항체 사이의 대응하는 루프는 대부분의 루프에서 높은 아미노산 서열 가변성에도 불구하고 매우 유사한 3차원 구조를 가질 수 있다(Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800). 더 나아가, 채택된 루프 구조와 그것을 둘러싸는 아미노산 서열 사이에 관계가 있다. 특정 정규 분류의 입체배좌는 루프의 길이 및 루프 내에서뿐만 아니라 보존된 프레임워크 내에서(즉, 루프 외부의) 중요한 위치에 존재하는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. 따라서 특정 정규 분류에 대한 배치는 이들 중요한 아미노산 잔기의 존재에 기반하여 이루어질 수 있다.
용어 "정규 구조"는 또한, 예를 들어, 카바트에 의해 목록으로 만들어져 있는 항체의 선형 서열에 관한 고찰을 포함할 수도 있다(문헌[Kabat et al.(상기 참고)]). 카바트 넘버링 계획(시스템)은 일치되는 방식으로 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 다양하게 채택된 표준이고, 본 명세서의 다른 곳에 또한 언급된 바와 같은 본 발명에 적용된 바람직한 계획이다. 추가적인 구조적 고려는 또한 항체의 정규 구조를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 카바트 넘버링에 의해 완전히 반영되지 않는 상기 차이는 코티아 등의 넘버링 시스템에 의해 기재되고/되거나 다른 기법, 예컨대 결정학 및 2 또는 3-차원 컴퓨터 모델링에 의해 나타낼 수 있다. 따라서, 주어진 항체 서열은, 특히, (예를 들어, 라이브러리 내 다양한 정규 구조를 포함하기 위한 필요에 기반하여) 적절한 분류 서열의 식별을 허용하는 정규 분류에 놓일 수 있다. 항체 아미노산 서열의 카바트 넘버링 및 코티아 등(상기 참고)에 의해 기술된 바와 같은 구조적 고찰 및 항체 구조의 정규적 측면을 이해하기 위한 이들의 암시가 문헌에 기술된다. 면역글로불린의 상이한 분류의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 항체 구조의 검토를 위해, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988]을 참조하기 바란다.
경쇄의 CDR3 및 특히 중쇄의 CDR3은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내의 항원 결합에서 가장 중요한 결정기를 구성할 수 있다. 일부 항체 작제물에서, 중쇄 CDR3은 항원과 항체 사이의 주된 면적을 구성하는 것으로 나타난다. CDR3만이 변형된 시험관내 선택 계획은 항체의 결합 특성을 변화시키기 위해 또는 어떤 잔기가 항원 결합에 기여하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, CDR3은 전형적으로 항체-결합 부위 내에서 분자 다양성의 가장 큰 공급원이다. 예를 들어, H3은 2개의 아미노산 잔기 또는 26개 초과의 아미노산만큼 짧을 수 있다.
프레임워크 및 불변 영역
가변 도메인의 더 보존된(즉, 비초가변) 부분은 "프레임워크" 영역(FRM)으로 불리며, 3차원 공간에서 6개의 CDR에 대한 스캐폴드를 제공하여 항원 결합 표면을 형성한다. 천연 유래 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 β-시트 구조의 부분을 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 β-시트 입체배치를 주로 채택하는 4개의 FRM 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 FRM에 의해 근위에서 그리고 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 보유되고, 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al.(상기 참조)] 참조). 불변 도메인은 항원 결합에 직접 연루되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어, 항체-의존적, 세포-매개 세포독성 및 상보체 활성화를 나타낸다.
결합 특이성
이중특이적 항체 작제물
상기에 설명된 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 항체 작제물은 특별하게는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물이라고 예상된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "이중특이적"은 "적어도 이중특이적"인 항체 작제물을 지칭하며, 즉, 이는 적어도 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하되, 제1 결합 도메인은 하나의 항원 또는 표적에 결합하고, 제2 결합 도메인은 다른 항원 또는 표적에 결합한다. 따라서, 이 용어에 포함되는 항체 작제물은 적어도 2개의 상이한 항원 또는 표적에 대해 특이성을 포함한다. 따라서 용어 "이중특이적 항체 작제물"은 또한 다중 특이적 항체 작제물, 예컨대 삼중특이적 항체 작제물을 포함하며, 후자는 3개의 결합 도메인, 또는 3개 초과의(예를 들어, 4개, 5개...) 특이성을 갖는 작제물을 포함하는 것이다. 항체 작제물이 (적어도) 이중특이적인 것을 고려하여, 그들은 자연적으로 발생되지 않고, 그들은 자연적으로 생기는 생성물과 현저하게 상이하다. "이중특이적" 항체 작제물은 상이한 특이성을 갖는 적어도 2개의 별개의 결합 부위를 갖는 인공 혼성체 항체 또는 면역글로불린이다. 이중특이적 항체는 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 2종의 상이한 정제된 단클론성 항체(mAbs) 또는 항체 단편의 화학적 접합에 의해서 또는 특히 이중특이적 IgG 분자를 생산하는 쿼드로마 세포주를 초래하는 2종의 하이브리도마를 융합시킴으로써, 생산될 수 있다(검토를 위해서 문헌[Kontermann and Brinkmann, Drug Discov Today. 2015 Jul;20(7):838-47] 참조).
표적
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 안정한 약제학적 조성물은 제1 결합 도메인을 통해서 표적 세포 표면 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인을 통해서 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물을 포함한다.
용어 "(특이적으로) 결합한다", (특이적으로) 인식한다", "(특이적으로) 지향된다", "(특이적으로) 반응한다"은 본 발명에 따라 결합 도메인이 표적 단백질 또는 항원 상에 위치된 에피토프 중 하나 이상의, 바람직하게는 적어도 2 이상, 더 바람직하게는 적어도 3 및 가장 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산과 상호작용하거나 또는 특이적으로 상호작용하는 것을 의미한다.
용어 "에피토프"는 결합 도메인, 예컨대 항체 또는 면역글로불린 또는 항체 또는 면역글로불린의 유도체 또는 단편이 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. "에피토프"는 항원성이며, 따라서 용어 에피토프는 때때로 본 명세서에서 "항원 구조" 또는 "항원 결정소"로서 지칭된다. 따라서, 결합 도메인은 "항원 상호작용 부위"이다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특정 인식"을 나타내는 것으로 이해된다. "에피토프"는 단백질(입체배좌적 에피토프)의 3차 접힘에 의해 접합된 연속적 아미노산 또는 비연속적 아미노산(선형 에피토프)에 의해 형성될 수 있다. 선형 에피토프는 독특한 서열에서 전형적으로 적어도 3 또는 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 6 또는 적어도 7, 예를 들어, 약 8 내지 약 10개의 아미노산을 포함한다. 입체배좌적 에피토프는 전형적으로 선형 에피토프에 비해 증가된 수의 아미노산을 포함한다. 에피토프 형성을 결정하는 방법은 x-선 결정학, 2차원 핵자기 공명(2D-NMR) 분광학 및 부위 지정 스핀 표지법 및 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance: EPR) 분광학을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
결합 도메인과 에피토프 또는 에피토프 클러스터 사이의 상호작용은 결합 도메인이 특정 단백질 또는 항원 상의 에피토프 또는 에피토프 클러스터에 대해 인식 가능한 친화도를 나타내고, 일반적으로 비-표적 단백질 또는 항원과의 상당한 반응성을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다. "인식 가능한 친화도"는 약 10-6　M (KD) 또는 더 강한 친화도로 결합을 포함한다. 바람직하게는, 결합은 결합 친화도가 약 10-12 내지 10-8M, 10-12 내지 10-9M, 10-12 내지 10-10M, 10-11 내지 10-8M, 바람직하게는 약 10-11 내지 10-9M인 경우 특이적이라고 간주된다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 도메인은 이의 표적 단백질 또는 항원 이외의 단백질 또는 항원에 본질적으로 또는 실질적으로 결합하지 않는다(즉, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 이의 각각의 표적 단백질 이외의 단백질에 결합할 수 없다).
용어 "본질적으로/실질적으로 결합하지 않는" 또는 "결합할 수 없는"은 본 발명의 결합 도메인이 이의 표적 단백질 또는 항원 이외의 단백질 또는 항원에 결합하지 않고, 즉, 이의 표적 단백질 또는 항원 이외의 단백질 또는 항원과 30% 초과, 바람직하게는 20% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 특히 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 이하의 반응성을 나타내지 않으며, 이에 의해 이의 각각의 표적 단백질 또는 항원에 대한 결합은 각각 100%가 되는 것으로 설정된다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 표적 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제1 결합 도메인 및 T 세포 표면 항원 CD3에 결합할 수 있는 제2 결합 도메인은 포함한다고 예상된다. 항체 작제물, 결합 도메인, 특히 제2 결합 도메인(이것은 T　세포의 표면 상의 인간 CD3에 결합함)은 특히 하기 포맷을 갖는다고 예상된다: VH　영역 및 VL　영역의 쌍은 단일 쇄 항체(scFv)의 포맷으로 존재한다. VH 및 VL 영역은 VH-VL 또는 VL-VH의 순서로 배열된다. VH-영역은 링커 서열에 대해 N 말단으로 위치되고, VL-영역은 링커 서열의 C-말단으로 위치되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 항체 작제물의 제2 결합 도메인은 T 세포 표면 항원 CD3에 결합할 수 있다. T 세포 또는 T 림프구는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하는 림프구 유형(백혈구의 유형 그 자체)이다. 각각 별개의 기능을 갖는 T 세포의 몇몇 서브세트가 있다. T　세포는 세포 표면 상에서 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대 B 세포 및 NK 세포와 구별될 수 있다. TCR은 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 인식 항원을 초래하며, 두 상이한 단백질 쇄로 구성된다. T 세포의 95%에서, TCR은 알파(α) 및 베타(β) 쇄로 이루어진다. TCR이 항원 펩타이드 및 MHC(펩타이드/ MHC 복합체)와 맞물릴 때, T 림프구는 관련된 효소, 공동 수용체, 전문화된 어댑터 분자 및 활성화 또는 방출된 전사 인자에 의해 매개된 일련의 생화학적 사건을 통해 활성화된다.
CD3 수용체 복합체는 단백질 복합체이며, 4개의 쇄로 구성된다. 포유동물에서, 복합체는 CD3γ(감마) 쇄, CD3δ(델타) 쇄 및 2개의 CD3ε(엡실론) 쇄를 함유한다. 이들 쇄는 T 세포 수용체(TCR) 및 소위 ζ(제타) 쇄와 회합되어 T 세포 수용체 CD3 복합체를 형성하고, T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. CD3γ(감마), CD3δ(델타) 및 CD3ε(엡실론) 쇄는 단일 세포외 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3 분자의 세포내 꼬리는 TCR의 신호전달 능력에 필수적인 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프 또는 축약하면 ITAM로서 알려진 단일 보존 모티프를 함유한다. CD3　엡실론 분자는 인간에서 염색체 11 상에 존재하는 CD3E 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 제2 결합 도메인은 표적 세포 표면 항원에 결합할 수 있다. 상기 표적 세포 표면 항원은 일반적으로 제2 결합 도메인에 의해서 인식되고, 이것에 결합할 수 있는 임의의 항원일 수 있다. 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 CD3 및 표적 세포 표면 항원 둘 모두에 대한 결합에 의해서 T 세포와 표적 세포 사이에 링크를 형성한다고 예상된다. 따라서 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 T 세포를 표적 세포에 모집하고, 바람직하게는 전세포사멸(pro-apoptotic) 단백질, 예컨대 퍼포린 및 그랜자임을 생성시켜, 표적 세포를 유발함으로써 T 세포가 표적 세포에 대한 세포독성 활성을 발휘하도록 한다고 생각된다. 따라서 표적 세포는 전형적으로 T 세포 매개된 세포독성, 및 이에 따른 세포용해에 대한 표적으로서 의도된 세포일 것이다. 예를 들어, 표적 세포는 종양 세포, 예컨대, 악성 아세포일 수 있다. 따라서 표적 세포 표면 항원은 CD33, CD19, FAP알파, MSLN, FLT3 또는 BCMA로부터 선택될 수 있다. CD33은 특별하게는 본 발명의 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 제1 결합 도메인에 대한 표적으로서 예상된다.
본 발명의 바람직한 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 첨부된 실시예에 평가된 바와 같이 AMG 103(CD19를 인식하는 제1 결합 도메인을 포함함), AMG 330(CD33을 인식하는 제1 결합 도메인을 포함함), CD33 특이적 HLE BiTE, FLT3 특이적 HLE BiTE 및 BCMA 특이적 HLE BiTE를 포함한다.
구체적으로, 이중특이적 단일 쇄 작제물의 제1 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 99, 109, 119, 128, 137, 146, 155, 164, 173, 183, 185 및 187로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 이중특이적 단일 쇄 작제물의 제2 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 9, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 179 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
따라서 본 발명의 바람직한 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 서열번호 100, 서열번호 110, 서열번호 174, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 180, 서열번호 182, 서열번호 184, 서열번호 186, 서열번호 188로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호로 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하거나 이것으로 이루어진 작제물을 포함한다
펩타이드 링커
본 발명의 항체 작제물의 적어도 2개의 결합 도메인 및 가변 도메인은 펩타이드 링커(스페이서 펩타이드)를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다. 용어 "펩타이드 링커"는 본 발명에 따르면 본 발명의 항체 작제물의 하나의 아미노산 서열(가변 및/또는 결합) 도메인 및 다른(가변 및/또는 결합) 도메인이 서로 연결되는 아미노산 서열을 정의한다. 이러한 펩타이드 링커의 필수 기술적 특징은 상기 펩타이드 링커가 임의의 중합 활성을 포함하지 않는다는 것이다. 적합한 펩타이드 링커 중에 미국 특허 제4,751,180호 및 제4,935,233호 또는 국제 특허 제WO　88/09344호에 기재된 것이다.
링커가 사용되는 경우에, 이 링커는 바람직하게는 각각의 제1 도메인 및 제2 도메인이 서로 독립적으로 그들의 차별적인 결합 특이성을 보유할 수 있다는 것을 보장하는데 충분한 길이 및 서열을 가진다. 본 발명의 항체 작제물 내 적어도 2개의 결합 도메인(또는 2개의 가변 도메인)을 연결하는 펩타이드 링커에 대해, 단지 소수의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 이하, 예컨대 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개의 아미노산 잔기의 아미노산 잔기만을 포함하는 상기 펩타이드 링커가 바람직하다. 5개 미만의 아미노산을 갖는 예상된 펩타이드 링커는 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산(들)을 포함하고, Gly-풍부일 수 있고, 즉 단일 아미노산 Gly로 이루어질 수 있다. 다른 유용한 펩타이드 링커는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호 178), 즉, Gly4Ser, 또는 이의 중합체, 즉 (Gly4Ser)x를 특징으로 하고, 식 중 x는 1 이상의 정수이다. 바람직하게는, 어떠한 2차 구조도 촉진시키지 않는 펩타이드 링커가 바람직하다. 융합되고 조작적으로 연결된 이중특이적 단쇄 작제물을 제조하고 포유류 세포 또는 박테리아에서 그들을 발현시키는 방법은 관련 기술 분야에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed.,. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012]).
유도체
용어 "항체 작제물"은 또한 유도체를 포함한다. 용어 "유도체"는 일반적으로 추가적인 작용기를 도입하도록 공유 변형된 항체 작제물을 지칭한다. 항체 작제물의 공유 변형은 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 분자의 특정 아미노산 잔기를 반응시킴으로써 번역 후에 도입될 수 있다. 항체 작제물의 유도체화를 사용하여 치료제 또는 진단제, 표지, 분자의 혈청 반감기를 연장시키는 기, 또는 비자연 아미노산의 삽입부를 부착할 수 있다. 일반적으로 적용되는 화학적 변형은 하기를 포함한다:
시스테인일 잔기는 α-할로아세테이트(및 대응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아마이드와 가장 통상적으로 반응되어, 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테인일 잔기는 또한 브로모트라이플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-나이트로-2-피리딜 다이설파이드, 메틸 2-피리딜 다이설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-나이트로페놀 또는 클로로-7-나이트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 이 작용제가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문에 pH 5.5 내지 7.0에서 다이에틸파이로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화된다. 파라-브로모펜아실 브로마이드가 또한 유용하며, 반응은 바람직하게는 pH　6.0에서 0.1M 카코딜산나트륨 중에서 수행된다. 라이신일 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응된다. 이들 제제에 의한 작용제는 라이신일 잔기의 하전을 반전시키는 효과를 가진다. 알파-아미노 함유 잔기에 대한 다른 적합한 시약은 이미도에스터, 예컨대 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트라이나이트로벤젠설폰산; O-메틸아이소유레아; 2,4-펜탄다이온; 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매화된 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄다이온, 1,2-사이클로헥산다이온, 및 닌하이드린 중의 하나 또는 몇몇 통상적인 시약과의 반응에 의해 변형된다. 알기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa 때문에 알칼리성 조건에서 수행되는 것이 필요하다. 더 나아가, 이들 시약은 라이신의 기뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노기와 반응될 수 있다.
티로실 잔기의 특정 변형은 스펙트럼 표지를 방향족 다이아조늄 화합물 또는 테트라나이트로메탄과의 반응에 의해 티로실 잔기 내로 도입함에 있어서 특정 관심을 가지고 이루어질 수 있다. 가장 통상적으로는, N-아세틸이미다졸 및 테트라나이트로메탄은 각각 O-아세틸 타이로실 종 및 3-나이트로 유도체를 형성하기 위해 사용된다. 타이로실 잔기는 방사면역측정법에서 사용하기 위한 표지 단백질을 제조하기 위해 125I 또는 131I를 이용하여 요오드화되며, 상기에 기술된 클로라민 T 방법이 적합하다.
카복실 측기(아스파틸 또는 글루타밀)는 카보다이이미드(R'―N=C=N--R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형되며, 여기서 R 및 R'은 선택적으로 상이한 알킬기, 예컨대 1-사이클로헥실-3-(2-몰폴린일-4-에틸) 카보다이이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-다이메틸펜틸) 카보다이이미드이다. 더 나아가, 아스파틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라긴일 및 글루타민일 잔기로 전환된다.
2작용성 작용제로의 유도체화는 다양한 방법에서 사용하기 위한 수불용성 지지체 기질 또는 표면에 본 발명의 항체 작제물을 가교하는 데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교제는, 예를 들어, 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스터, 예를 들어, 4-아지도살리실산에 의한 에스터, 다이숙신이미딜 에스터, 예컨대 3,3'-다이싸이오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 및 2작용성 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함하는 동종2작용성 이미도에스터를 포함한다. 유도체화제, 예컨대 메틸-3-[(p-아지도페닐)다이싸이오]프로?오이미데이트는 광의 존재 하에 가교를 형성할 수 있는 광활성 가능한 중간체를 수득한다. 대안적으로, 반응성 수불용성 매트릭스, 예컨대 사이아노겐 브로마이드-활성화된 탄수화물 및 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기재된 바와 같은 반응성 기질이 단백질 고정을 위해 사용된다.
글루타민일 및 아스파라긴일 잔기는 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 빈번하게 탈아미드화된다. 대안적으로, 이들 잔기는 약산성 조건 하에 탈아마이드화된다. 이들 잔기의 형태 중 하나는 본 발명의 범주 내에 속한다.
다른 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 알기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실기의 아마이드화를 포함한다.
글리코실화 및 탈글리코실화
본 발명의 범주 내에 포함된 항체 작제물의 공유 변형의 다른 유형은 단백질의 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 글리코실화 패턴은 단백질의 서열(예를 들어, 이하에 논의되는 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생성되는 숙주 세포 또는 유기체에 의존할 수 있다. 특정 발현 시스템은 이하에 논의된다.
폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이-펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있지만, 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 부착을 지칭한다.
항체 작제물에 대한 글리코실화 부위의 첨가는, 그것이 (N-연결 글리코실화 부위에 대해) 상기에 기술된 트라이펩타이드 서열 중 하나 이상을 함유하도록, 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 수행된다. 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대해) 출발 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 용이성을 위해서, 항체 작제물의 아미노산 서열은 DNA 수준의 변화를 통해, 특히 목적으로 하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 사전 선택된 염기에서 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 바람직하게 변경된다.
항체 작제물 상에서 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 다른 수단은 단백질에 대한 글리코사이드의 화학적 또는 효소적 결합에 의한다. 이들 절차는 그들이 N- 및 O-연결된 글리코실화에 대한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포 내 단백질의 생성을 필요로 하지 않다는 점에서 유리하다. 사용된 결합 방식에 따라서, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 유리 설프하이드릴기, 예컨대 시스테인의 설프하이드릴기, (d) 유리 하이드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 하이드록실기, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아마이드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 국제 특허 제WO　87/05330호, 및 문헌[Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306]에 기재되어 있다.
출발 항체 작제물 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 화합물 트라이플루오로메탄설폰산, 또는 동등한 화합물에 대한 단백질의 노출을 필요로 한다. 이 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 초래하는 한편, 폴리펩타이드 무손상을 남긴다. 화학적 탈글리코실화는 문헌[Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131]에 의해 기재된다. 폴리펩타이드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350]에 의해 기재된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 잠재적 글리코실화 부위에서의 글리코실화는 문헌[Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105]에 기재된 바와 같은 화합물 튜니카마이신의 사용에 의해 방지될 수 있다. 튜니카마이신은 단백질-N-글리코사이드 결합의 형성을 차단한다.
비-단백질성 중합체
항체 작제물의 다른 변형이 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 항체 작제물의 공유 변형의 다른 유형은 다양한 폴리올, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(페길화), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜, 또는 탄수화물의 공중합체, 예컨대 하이드록시에틸 전분(예를 들어, HESylation(등록상표)) 또는 폴리시알산(예를 들어, PolyXen(등록상표) 테크놀로지)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 비단백질성 중합체에 항체 작제물을 연결하는 것을 포함한다. 추가로, 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 치환은 항체 작제물 내의 다양한 위치에서, 예를 들어, PEG와 같은 중합체의 첨가를 용이하게 하기 위해 이루어질 수 있다.
표지
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 작제물의 공유 변형은 하나 이상의 표지의 첨가를 포함한다. 표지기는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위한 다양한 길이의 스페이서 아암을 통해 항체 작제물에 결합될 수 있다. 표지 단백질의 다양한 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다. 용어 "표지" 또는 "표지기"는 임의의 검출 가능한 표지를 지칭한다. 일반적으로, 표지는 그들이 검출되는 분석에 따라 다양한 분류에 속하며 - 다음의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
a) 방사성 또는 중동위원소, 예컨대 방사성동위원소 또는 방사성핵종일 수 있는 동위원소 표지(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)
b) 자기 표지(예를 들어, 자기 입자)
c) 산화환원 활성 모이어티
d) 광학 염료(발색단, 인광체 및 형광체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 예컨대 형광기(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 화학발광기 및 "소분자" 형광 또는 단백질성 형광 중 하나일 수 있는 형광단
e) 효소기(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제)
f) 바이오틴일화된 기
g) 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프는 2차 리포터(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등)에 의해 인식된다.
"형광 표지"는 그의 고유 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적합한 형광 표지는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린(Malacite green), 스틸벤, 루시퍼 옐로(Lucifer Yellow), 캐스케이드 블루제이(Cascade BlueJ), 텍사스 레드(Texas Red), 이아에단스(IAEDANS), 에단스(EDANS), 보디피 FL(BODIPY FL), LC 레드 640, Cy 5, Cy 5.5, LC 레드 705, 오리건 그린(Oregon green), 알렉사-플루오르(Alexa-Fluor) 염료(알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로 및 R-피코에리트린(PE)(몰레큘러 프로브(Molecular Probes), 미국 오리건주 유겐 소재), FITC, 로다민 및 텍사스 레드(Texas Red)(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 락포드 소재), Cy5, Cy5.5, Cy7(아머샴 라이프 사이언스(Amersham Life Science), 미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 형광단을 포함하는 적합한 광학 염료는 리차드 피. 하우글랜드(Richard P. Haugland)에 의한 문헌[Molecular Probes Handbook]에 기재되어 있다.
적합한 단백질성 형광 표지는 또한 GFP의 레닐라(Renilla), 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus), 또는 에쿼리아(Aequorea) 종을 포함하는, 녹색 형광 단백질(Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP(Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), 블루 형광 단백질(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 향상된 황색 형광 단백질(EYFP, 클론테크 래버러토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.)), 루시퍼라제(Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β 갈락토시다제(Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) 및 레닐라(Renilla)(국제 특허 제92/15673호, 제WO95/07463호, 제WO98/14605호, 제WO98/26277호, 제WO99/49019호, 미국 특허 제5,292,658호; 제5,418,155호; 제5,683,888호; 제5,741,668호; 제5,777,079호; 제5,804,387호; 제5,874,304호; 제5,876,995호; 제5,925,558호)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
류신 지퍼 도메인은 그들이 발견된 단백질의 올리고머화를 촉진시키는 펩타이드이다. 류신 지퍼는 본래 몇몇 DNA-결합 단백질에서 식별되었고(Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지된 류신 지퍼 중에 천연 유래 펩타이드 및 이량체화 또는 삼량체화되는 그의 유도체가 있다. 가용성 올리고머 단백질을 생성하는데 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 출원 제WO　94/10308호에 기재되어 있고, 폐 계면활성제 단백질 D(SPD)로부터 유래된 류신 지퍼는 문헌[Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191]에 기재되어 있다. 이종성 단백질이 융합된 안정한 삼량체화를 허용하는 변형된 류신 지퍼의 사용은 문헌[Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78]에 기재되어 있다. 일 접근법에서, CDH19 항체 단편을 포함하는 재조합 융합 단백질 또는 류신 지퍼 펩타이드에 융합된 유도체는 적합한 숙주 세포에서 발현되고, 형성되는 가용성 올리고머 CDH19 항체 단편 또는 유도체는 배양 상청액으로부터 회수된다.
항체 작제물은 또한, 예를 들어 분자의 단리를 돕거나 또는 분자의 적합화된 약동학적 프로파일에 관한 추가적인 펩타이드 또는 도메인을 포함할 수 있다. 항체 작제물의 단리를 돕는 도메인은 단리 방법, 예컨대 단리 칼럼에서 포획될 수 있는 펩타이드 모티브 또는 2차적으로 도입된 모이어티로부터 선택될 수 있다. 이러한 추가적인 도메인의 비제한적 실시형태는 Myc-태그, HAT-태그, HA-태그, TAP-태그, GST-태그, 키틴 결합 도메인 (CBD-태그), 말토스 결합 단백질(MBP-태그), 플래그-태그, 스트렙-태그 및 이들의 변이체(예를 들어, 스트렙II-태그) 및 His-태그로서 알려진 펩타이드 모티브를 포함한다. His-태그 도메인은 바람직하게는 6개의 His 잔기(헥사-히스티딘)의 분자의 아미노산 서열에서 연속 His 잔기의 반복부로서 일반적으로 공지된다. 항체 작제물의 혈청 반감기(즉, 투여된 약물의 50%가 생물학적 과정, 예를 들어 대사, 배설 등을 통해서 제거되는 시간)를 연장시키는 데 유용한 도메인 또는 펩타이드는 인간 신체에서 바람직한 약동학적 프로파일을 갖는 다른 단백질, 예컨대 혈청 알부민(예를 들어, AB156 펩타이드) 또는 면역글로불린의 불변 영역(Fc 도메인 또는 이의 변이체)에 결합할 수 있는 것을 포함한다.
이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 본 발명의 약제학적 조성물 중에 최대 약 5㎎/㎖, 즉, 약 4.0㎎/㎖, 3.0㎎/㎖, 2.0㎎/㎖, 1.0㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 0.25㎎/㎖ 또는 0.1㎎/㎖의 농도로 존재한다고 예상된다. 바람직하게는, 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 약제학적 조성물 중에 0.1 내지 5㎎/㎖, 바람직하게는 0.2 내지 2.5㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.25 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 존재한다.
사이클로덱스트린
이중특이적 단일 쇄 항체 작제물 및 완충제 이외에, 본 발명의 약제학적 조성물은 β-사이클로덱스트린을 추가로 포함한다. 일반적으로, 용어 "사이클로덱스트린" 또는 "CD"는 적어도 6개 이상의 1→4 연결 α-D-글루코피라노사이드 단위로 구성된 환식 올리고당을 지칭한다. 사이클로덱스트린의 단일 구조는 에터기 내부 및 1차 하이드록실기를 특징으로 하는 극성 외부를 갖는 소수성 공극을 특징으로 한다. 6-원의 (α-사이클로덱스트린), 7-원의 (β-사이클로덱스트린) 및 8-원의 (γ-사이클로덱스트린) 사이클로덱스트린을 비롯한, 다수의 사이클로덱스트린이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 7 α-D-글루코피라노사이드 단위를 포함하는 β-사이클로덱스트린이 본 발명의 약제학적 조성물의 특별하게 바람직한 구성성분인데, 그 이유는 이것은 다양한 스트레스 조건 하에서 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물을 효과적으로 안정화시킬 수 있는 것으로 보이기 때문이다.
용어 "사이클로덱스트린"(및 특히 "β-사이클로덱스트린")은 또한 화학적으로 변형된 (β-)사이클로덱스트린 유도체를 포함한다. 일반적으로, 임의의 화학적 변형은 그것이 첨부된 실시예에서 입증된 바와 같은 약제학적 조성물의 이로운 특성을 감소시키거나 없애지 않는 한, 특히 약제학적 조성물이 그의 안정성을 보유하는 한 가능하다. 화학적으로 변형된 사이클로덱스트린 어원은 전형적으로 글루코스 잔기의 2-, 3- 및 6-하이드록실기에서 다른 작용기의 도입 또는 에터화로부터 기인한다. 따라서, 이 용어는 하이드록실기의 하나 이상의 치환을 포함하는 사이클로덱스트린, 예를 들어, 알킬화 및 하이드록시알킬화 사이클로덱스트린을 포함한다.
본 발명의 목적을 위해서, 용어 "사이클로덱스트린"은 또한 이의 약제학적으로 허용 가능한 염(들)을 포함한다. 구 "약제학적으로 허용 가능한 염(들)"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 투여에 효과적이고 안전한 사이클로덱스트린의 염을 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 음이온, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유래된 것과 함께 형성된 것, 및 양이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 함께 형성된 것을 포함한다. 물론, 약제물에서 사용되는 임의의 반대이온이 안전한 것으로 간주되어야 하고, 약제학적으로 승인된 반대이온의 몇몇 목록이 존재하고, 이것은 공급원에 따라서 다르다. 승인된 염 형성제는 예를 들어, 문헌[the Handbook of Pharmaceutical Salts (Stahl PH, Wermuth CG, editors. 2002. Handbook of pharmaceutical salts: Properties, selection and use. Weinheim/Zurich: Wiley-VCH/VHCA.)]에서 찾아볼 수 있다.
따라서 본 발명의 약제학적 조성물은 β-사이클로덱스트린, 특별하게는 β-사이클로덱스트린, 메틸-β-사이클로덱스트린, 하이드록시에틸-β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 에틸-β-사이클로덱스트린, 부틸-β-사이클로덱스트린 석신일-(2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(2,3,6-트라이-O-메틸)-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(2,3,6-트라이-O-벤조일)-β-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 포스페이트 나트륨염, β-사이클로덱스트린 설페이트 나트륨염, 트라이아세틸-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(6-O-설포)-β-사이클로덱스트린 헵타나트륨염, 카복시메틸-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 및 6-O-p-톨루엔설폰일-β-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것으로 예상된다. 특히, β-사이클로덱스트린은 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린("SBE-β-CD") 나트륨염, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린("HP-β-CD")일 수 있다.
β-사이클로덱스트린은 약제학적 조성물 중에 0.1% 내지 20%(w/v), 바람직하게는 0.5% 내지 2%(w/v), 보다 바람직하게는 0.8% 내지 1.5%(w/v)의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 특히 화학적으로 비변형된 β-사이클로덱스트린의 농도는 약 1.8%(w/v) 이하, 예컨대 약 1.6%(w/v), 약 1.5%(w/v), 약 1.4%(w/v), 약 1.3%(w/v), 약 1.2%(w/v), 약 1.1%(w/v), 약 1.0%(w/v), 약 0.9%(w/v), 약 0.8%(w/v) 이하, 약 0.1%(w/v)까지인 것으로 예상된다.
완충제
본 발명의 약제학적 조성물은 인산칼륨, 아세트산/아세트산나트륨, 시트르산/시트르산나트륨, 석신산/석신산나트륨, 타타르산/타타르산나트륨, 히스티딘/히스티딘 HCl, 글라이신, 트리스, 글루타메이트, 아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터, 특히 인산칼륨, 시트르산/시트르산나트륨, 석신산, 히스티딘, 글루타메이트, 아세테이트 및 이들의 조합물로부터 선택될 수 있는 완충제를 추가로 포함한다.
적합한 완충제 농도는 약 200mM 이하, 예컨대 약 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5mM의 농도를 포함한다. 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 안정성을 제공하기 위해서 완충제 농도를 쉽게 조정할 수 있을 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물 중의 완충제 농도는 구체적으로 약 5 내지 약 200mM, 바람직하게는 약 5 내지 약 100mM, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 50mM 범위라고 예상된다.
pH
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 4 내지 약 7.5 범위의 pH , 즉 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 또는 7.5의 pH를 가질 수 있다. 바람직하게는, pH는 약 5 내지 약 7.5, 보다 바람직하게는 약 5.5 내지 약 7.5 범위이다.
약제학적 조성물
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여에 적합한 조성물에 관한 것이다. 용어 "대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자"는 본 발명의 약제학적 조성물의 투여가 바람직한 임의의 대상체, 특별하게는 포유동물 대상체를 지칭하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 포유동물 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함하고, 인간이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 안정하고, 약제학적으로 허용 가능하고, 즉, 약제학적 조성물이 투여되는 대상체에서 어떠한 바람직하지 않은 국소 또는 전신 효과를 유발하지 않으면서 목적하는 치료 효과를 이끌어낼 수 있다. 본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 조성물은 특히 멸균될 수 있고/있거나 약제학적으로 불활성일 수 있다. 구체적으로, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 동물 및 보다 특별하게는 인간에서 사용하기 위해서 규제 기관에 의해서 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 의해서 승인된 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 치료 유효량의 하나 또는 복수의 본 명세서에 기술된 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물(들), β-사이클로덱스트린 및 완충제를 포함한다. "치료 유효량"이라는 것은 목적하는 치료 효과를 이끌어내는 상기 작제물의 양이다. 치료 효능 및 독성, 예를 들어 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50(집단의 50%에서 치명적인 용량)은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해서 결정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 간의 용량비는 치료 지수이고, 그것은 비, ED50/LD50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 치료 약제학적 조성물이 일반적으로 바람직하다.
부형제
이미 기술된 β-사이클로덱스트린 및 완충제 이외에, 약제학적 조성물은 부형제가 본 명세서에 기술된 그의 이로운 특성, 특히 그의 안정성을 을 감소시키거나 없애지 않는 한 1종 이상의 추가 부형제를 임의로 포함할 수 있다.
부형제는 매우 다양한 목적, 예컨대 제형의 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성을 조절하는 것, 예컨대 점성도의 조절 및 또는 유효성을 추가로 개선시키고, 그리고 또는 이러한 제형을 추가로 안정화시키기 위한 본 발명의 방법 및, 예를 들어 제조, 운송, 저장, 예비-사용 제제, 투여 동안 및 이후에 생기는 스트레스에 기인하는 분해 및 파괴에 대한 과정에 대해 사용될 수 있다. 용어 "부형제"는 일반적으로 충전제, 결합제, 붕괴제, 코팅, 흡수제, 항접착제, 활택제(glidant), 보존제, 항산화제, 향료, 착색제, 감미료, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이팅제, 점도 부여제, 표면 활성제, 희석제, 보습제, 담체, 희석제, 보존제, 유화제, 안정제 및 등장 개질제를 포함한다.
허용 가능한 부형제는 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능하고, 즉, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 대해서 비독성이다.
예시적인 부형제는 제한 없이 하기를 포함한다:
Figure pct00001
하전된 아미노산, 바람직하게는 라이신, 라이신 아세테이트, 아르기닌, 글루타메이트 및/또는 히스티딘을 비롯한, 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 트레오닌, 프롤린, 2-페닐알라닌,
Figure pct00002
항미생물제, 예컨대 항균제 및 항진균제를 비롯한 보존제;
Figure pct00003
항산화제, 예컨대 아스코르브산, 메싸이오닌, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨;
Figure pct00004
생리 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로는 약 5 내지 약 8 또는 9의 pH 범위로 조성물을 유지시키는 데 사용되는 완충제, 완충 시스템 및 완충 제제; 완충제의 예는 보레이트, 바이카보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산, 석시네이트, 포스페이트, 히스티딘 및 아세테이트; 예를 들어, 약 pH 7.0 내지 8.5의 트리스 완충제, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충제임;
Figure pct00005
비-수성 용매, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유 예컨대 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트;
Figure pct00006
물, 알코올/수용액을 포함하는 수성 담체, 에멀션 또는 식염수 및 완충 매질을 포함하는 현탁액;
Figure pct00007
생분해성 중합체, 예컨대 폴리에스터;
Figure pct00008
벌킹제, 예컨대 만니톨 또는 글라이신;
Figure pct00009
킬레이팅제, 예컨대 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA);
Figure pct00010
등장 및 흡수 지연제;
Figure pct00011
착화제, 예컨대 카페인 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린;
Figure pct00012
충전제;
Figure pct00013
단당류; 이당류; 및 다른 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 탄수화물은 비-환원 당, 바람직하게는 트레할로스, 수크로스, 옥타설페이트, 솔비톨, 또는 자일리톨일 수 있음;
Figure pct00014
(저분자량) 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질성 담체, 예컨대 인간 또는 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린, 바람직하게는 인간 기원의 것;
Figure pct00015
착색제 및 향미제;
Figure pct00016
황 함유 환원제, 예컨대 글루타싸이온, 싸이옥산, 싸이오글리콜산나트륨, 싸이오글리세롤, [알파]-모노싸이오글리세롤 및 싸이오황산나트륨
Figure pct00017
희석제;
Figure pct00018
유화제;
Figure pct00019
친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈)
Figure pct00020
염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨;
Figure pct00021
보존제, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 불활성 기체 등; 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소;
Figure pct00022
금속 복합체, 예컨대 Zn-단백질 복합체;
Figure pct00023
용매 및 공용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜);
Figure pct00024
폴리올, 트레할로스, 수크로스, 옥타설페이트, 만니톨, 솔비톨 또는 자일리톨 스타키오스, 만노스, 솔보스, 자일로스, 리보스, 마이오이니시토스, 갈락토스, 락티톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜을 비롯한 당 및 당 알코올; 및 다가 당 알코올;
Figure pct00025
현탁제;
Figure pct00026
계면활성제 또는 습윤제, 예컨대 플루로닉(pluronic), PEG, 소르비탄 에스터, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메트아민, 레시틴, 콜레스테롤, 타일록사팔(tyloxapal); 계면활성제는 바람직하게는 1.2KD 초과의 분자량을 갖는 세제 및/또는 바람직하게는 3KD 초과의 분자량을 갖는 폴리에터일 수 있음; 바람직한 세제의 비제한적인 예는 트윈(Tween) 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 및 트윈 85임; 바람직한 폴리에터에 대한 비제한적인 예는 PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 및 PEG 5000임;
Figure pct00027
안정성 향상제, 예컨대 수크로스 또는 솔비톨;
Figure pct00028
등장성 향상제, 예컨대 알칼리토금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 솔비톨;
Figure pct00029
염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 또는 고정유를 포함하는 비경구 전달 비히클;
Figure pct00030
유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제를 포함하는 정맥내 전달 비히클(예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것).
약제학적 조성물의 상이한 부형제(예를 들어 상기 열거한 것)는 상이한 효과를 가질 수 있고, 예를 들어, 아미노산은 완충제, 안정제 및/또는 항산화제로서 작용할 수 있으며; 만니톨은 벌킹제 및/또는 등장성 향상제로서 작용할 수 있고; 염화나트륨은 전달 비히클 및/또는 등장성 향상제 등으로서 작용할 수 있다는 것은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 분명하다.
폴리올은 물리적 및 화학적 분해 과정으로부터 단백질을 보호하기 위해 액체와 동결건조 제형 둘 다에서 유용한 안정화제이고, 제형의 등장성을 조정하기에 또한 유용하다. 폴리올은 당, 예를 들어, 만니톨, 수크로스 및 솔비톨 및 다가 알코올, 예를 들어, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜, 및 본 명세서의 논의의 목적을 위해, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 관련된 물질을 포함한다. 동결건조 제형 내 케이크의 구조적 안정성을 보장하기 위해 통상적으로 만니톨이 사용된다. 이는 케이크에 대한 구조적 안정성을 보장한다. 이는 일반적으로 동결건조보호제, 예를 들어, 수크로스와 함께 사용된다. 솔비톨 및 수크로스는 등장성을 조절하기 위한 작용제 그리고 수송 동안 동결-해동 스트레스에 대한 보호를 위한 안정제로서 또는 제조 공정 동안 벌크의 제조를 위해서 일반적으로 사용된다. PEG는 단백질을 안정화시키는 데 그리고 동결보호제로서 유용하다.
계면활성제는 일상적으로 표면 흡수를 방지하거나, 최소화하거나 또는 감소시키기 위해 사용된다. 단백질 분자는 표면 상에서 흡수 및 변성되기 쉬우며, 그 결과 공기-액체, 고체-액체 및 액체-액체 계면에서 응집되기 쉬울 수 있다. 이들은 일반적으로 단백질 농도와 반비례하는 규모로 작용한다. 이들 해로운 상호작용은 일반적으로 단백질 농도와 반비례하는 규모이고, 전형적으로 생성물의 운송 및 처리 동안 생성된 것과 같은 물리적 교반에 의해 악화된다. 일반적으로 사용되는 계면활성제는 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 솔비탄 폴리에톡실레이트의 다른 지방산 에스터 및 폴록사머 188을 포함한다. 계면활성제는 또한 단백질 입체배좌적 안정성을 제어하기 위해 통상적으로 사용된다. 이와 관련하여 계면활성제의 사용은 단백질-특이적인데, 임의의 주어진 계면활성제가 전형적으로 일부 단백질을 안정화하고, 다른 것을 탈안정화하기 때문이다.
폴리솔베이트는 산화적 분해가 되기 쉬우며, 종종 공급되는 바와 같이, 단백질 잔기 측쇄, 특히 메싸이오닌의 산화를 야기하는 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 결과적으로, 폴리솔베이트는 조심해서 사용되어야 하며, 사용할 때, 그들의 더 낮은 유효 농도에서 사용되어야 한다.
항산화제는 주변 산소 및 온도의 적절한 수준을 유지시킴으로써 그리고 광에 대한 노출을 회피함으로써 약제학적 제형에서 단백질의 해로운 산화를 - 어느 정도까지 - 예방할 수 있다. 항산화제 부형제는 단백질의 산화 분해를 예방하기 위해서도 사용될 수 있다. 이와 관련하여 유용한 항산화제 중에 환원제, 산소/자유 라디칼 스캐빈저 및 킬레이팅제가 있다. 치료 단백질 제형에서 사용하기 위한 항산화제는 바람직하게는 수용성이고, 산물의 저장 수명 전체에서 이의 활성을 유지한다. EDTA가 유용한 예이다.
금속 이온은 단백질 공동인자로서 작용할 수 있고, 단백질 배위 복합체의 형성을 가능하게 할 수 있다. 금속 이온은 또한 단백질을 분해하는 일부 과정을 저해할 수 있다. 그러나, 금속 이온은 또한 단백질을 분해하는 물리적 및 화학적 과정을 촉매한다. 마그네슘 이온(10 내지 120mM)은 아스파트산의 아이소아스파트산으로의 이성질체화를 저해하기 위해 사용될 수 있다. Ca+2 이온은(100 mM까지) 인간 데옥시리보뉴클레아제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 그러나, Mg+2, Mn+2 및 Zn+2는 rhDNase를 탈안정화시킬 수 있다. 유사하게, Ca+2 및 Sr+2는 인자 VIII을 안정화시킬 수 있고, 이는 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2에 의해 탈안정화될 수 있으며, 그의 응집은 Al+3 이온에 의해 증가될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 저해하고, 약물 제품의 저장 수명 또는 사용 기간 내내 제품 멸균을 보장하는 주요 기능을 갖고, 특히 다회-용량 제형을 위해서 필요하다. 일반적으로 사용되는 보존제는 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 보존제는 소분자 비경구 제품과 함께 사용된 오랜 역사가 있지만, 보존제를 포함하는 단백질 제형의 개발은 도전적일 수 있다. 보존제는 거의 항상 단백질에 대해 탈안정화 효과(응집)를 가지고, 이는 용량 단백질 제형에서 그들의 사용을 제한함에 있어서 주요 인자가 되었다. 지금까지, 대부분의 단백질 약물은 일회용으로만 제형화되었다. 그러나, 다회 용량 제형이 가능할 때, 그들은 환자의 편리함 및 증가된 시장성을 가능하게 하는 부가된 이점을 가진다. 보존된 제형의 개발이 더 편리하고, 다회용 주사 펜 제시의 상업화를 야기하는 경우의 인간 성장 호르몬(hGH)은 좋은 예이다.
예상할 수 있는 바와 같이, 보존제를 함유하는 액체 제형의 개발은 동결건조제형보다 더 도전적이다. 동결건조된 제품은 보존제 없이 동결건조될 수 있고, 사용 시 희석제를 함유하는 보존제에 의해 제구성될 수 있다. 이는 보존제가 단백질과 접촉하는 시간을 단축시키고, 관련된 안정성 위험을 최소화한다. 액체 제형에 의해, 보존제 유효성 및 안정성은 전체 생성물 보관 수명(약 18 내지 24개월)에 걸쳐 유지되어야 한다. 언급하는 중요한 점은 보존제 유효성이 활성 약물 및 모든 부형제 성분을 함유하는 최종 제형에서 입증되어야 한다는 것이다.
예를 들어, 약제학적 제형의 이온 강도 및/또는 등장성을 조정하고/하거나 항체 작제물 또는 다른 성분의 용해도 및/또는 물리적 안정성을 추가로 개선시키기 위해 본 발명의 특정 실시형태에 따라 염이 사용될 수 있다. 널리 공지된 바와 같이, 이온은 단백질 표면 상에서 하전된 잔기에 결합에 의해 그리고 단백질에서 하전 및 극성 기를 차폐시킴으로써 그리고 그들의 정전 상호작용, 끌어당기고 반발하는 상호작용을 감소시킴으로써 단백질의 천연 상태를 안정화시킬 수 있다. 이온은 또한, 특히, 단백질의 변성 펩타이드 결합(--CONH)에 대한 결합에 의해 단백질의 변성 상태를 안정화시킬 수 있다. 더 나아가, 단백질 내 하전 및 극성기와의 이온성 상호작용은 또한 분자간 정전 상호작용을 감소시킬 수 있고, 이에 의해 단백질 응집 및 불용성을 방지하거나 또는 감소시킬 수 있다. 이온 종은 단백질에 대한 그들의 효과와 차이가 있다. 본 발명에 따라 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있는 단백질에 대한 이온 및 그들의 효과의 다수의 범주적 순위가 개발되었다. 일 예는 용액 중의 단백질의 입체배좌적 안정성에 대한 그들의 효과에 의해 이온성 및 극성 비이온성 용질을 랭킹하는 호프마이스터 계열(Hofmeister series)이다. 용질 안정화는 "코스모트로픽(kosmotropic)"으로서 지칭된다. 용질의 탈안정화는 "카오트로픽(chaotropic)"으로서 지칭된다. 코스모트로프는 용액로부터 단백질을 침전시키기 위해("염석") 일반적으로 고농도(예를 들어, 1몰 초과의 황산암모늄)에서 사용된다. 카오트로프는 통상적으로 단백질을 변성시키고/시키거나 가용화("염용")하기 위해 사용된다. "염용" 및 "염석"에 대한 이온의 상대적 유효성은 호프마이스터 계열에서 그들의 위치를 정한다.
유리 아미노산은 벌킹제, 안정제 및 항산화제뿐만 아니라 다른 표준 용도로서 약제학적 조성물에서 사용될 수 있다. 제형 내 단백질을 안정화시키기 위해 라이신, 프롤린, 세린 및 알라닌이 사용될 수 있다. 글리신은 정확한 케이크 구조 및 특성을 보장하기 위해 동결건조에서 유용하다. 알기닌은 액체와 동결건조 제형 둘 다에서 단백질 응집을 저해하는 데 유용할 수 있다. 메싸이오닌은 항산화제로서 유용하다.
약제학적 조성물을 제형화하기에 특별하게 유용한 부형제는 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 라이신, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머 188, 플루로닉 및 이들의 조합물을 포함한다. 상기 부형제는, 조성물이 본 명세서에 예시된 바와 같은 바람직한 특성을 나타내고, 특히 함유된 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 안정화를 촉진시키는 한, 약제학적 조성물 중에 상이한 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 수크로스는 약제학적 조성물 중에 2%(w/v) 내지 12%(w/v)의 농도로, 즉 12%(w/v), 11%(w/v), 10%(w/v), 9%(w/v), 8%(w/v), 7%(w/v), 6%(w/v), 5%(w/v), 4%(w/v), 3%(w/v) 또는 2%(w/v)의 농도로 존재할 수 있다. 바람직한 수크로스 농도는 4%(w/v) 내지 10%(w/v), 보다 바람직하게는 6%(w/v) 내지 10%(w/v) 범위이다. 폴리솔베이트 80은 약제학적 조성물 중에 0.001%(w/v) 내지 0.5%(w/v)의 농도로, 즉 0.5%(w/v), 0.2%(w/v), 0.1%(w/v), 0.08%(w/v), 0.05%(w/v), 0.02%(w/v), 0.01%(w/v), 0.008%(w/v), 0.005%(w/v), 0.002%(w/v) 또는 0.001%(w/v)의 농도로 존재할 수 있다. 바람직한 폴리솔베이트 80 농도는 0.002%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 바람직하게는 0.005%(w/v) 내지 0.02%(w/v) 범위이다.
본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 특히 1종 이상의 보존제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물의 제형화에 유용한 보존제는 항미생물제(예를 들어, 항균제 또는 항진균제), 항산화제, 킬레이팅제, 불활성 기체 등; 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소를 포함한다. 항미생물성 보존제는 미생물 증식을 감소시킴으로써 약의 저장 수명을 연장시키는 데 사용되는 물질이다. 본 발명의 약제학적 조성물을 제형화하기에 특별하게 유용한 보존제는 벤질 알코올, 클로로부탄올, 페놀, 메타-크레졸, 메틸파라벤, 페녹시에탄올, 프로필파라벤 싸이오머로잘을 포함한다. 이들 보존제의 사용에 대한 구조 및 전형적인 농도는 문헌[Meyer et al. J Pharm Sci. 96(12), 3155]의 표 1에 기술되어 있다.
상기 언급된 보존제는 약제학적 조성물 중에 상이한 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 벤질 알코올은 0.2 내지 1.1%(v/v) 범위의 농도로, 클로로부탄올은 0.3 내지 0.5%(v/v) 범위의 농도로, 페놀은 0.07 내지 0.5%(v/v) 범위의 농도로, 메타-크레졸은 0.17 내지 0 내지 32%(v/v) 범위의 농도로 또는 싸이오머로잘은 0.003 내지 0.01%(v/v) 범위의 농도로 존재할 수 있다. 메틸파라벤에 대한 바람직한 농도는 0.05 내지 0.5%(v/v) 범위이고, 페녹시에탄올의 경우에는 0.1 내지 3%(v/v) 범위이고, 프로필파라벤의 경우에는 0.05 내지 0.5%(v/v) 범위이다.
그러나, 약제학적 조성물은 임의의 보존제를 포함하지 않는다고 또한 예상된다. 특히, 본 발명은 특히 약 0.5㎎/㎖의 농도의 서열번호 100 및 110에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물, 약 1%(w/v)의 농도의 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 및 약 10mM의 농도의 인산칼륨 및 추가로 약 6.0의 pH에서 약 8%(w/v)의 농도의 수크로스 및 약 0.01%(w/v)의 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는, 보존제가 존재하지 않는 약제학적 조성물을 제공한다.
형태
본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 고체, 액체, 동결물, 기체 또는 동결건조된 형태로 제형화될 수 있고, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 젤, 분말, 정제, 용액, 에어로졸, 과립, 환제, 현탁물, 에멀션, 캡슐, 시럽, 액체, 엘렉시르, 추출물, 팅크제(tincture) 또는 유체 추출물의 형태일 수 있다.
일반적으로, 즉, 의도된 투여 경로, 전달 포맷 및 바람직한 투여량에 따라서 다양한 저장형 및/또는 투여형이 본 발명의 약제학적 조성물에 대해서 예상된다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Oslo, A., Ed., (2012) 참고). 통상의 기술자는 특정 투여형의 이러한 선택이 예를 들어 본 발명의 항체 작제물의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 클리어런스 속도에 영향을 줄 수 있다는 것을 인식할 것이다.
예를 들어, 약제학적 조성물 내 주요 비히클 또는 담체는 자연에서 수성 또는 비수성일 수 있다. 적합한 비히클 또는 담체는 비경구 투여를 위해 조성물 중에서 통상적인 다른 물질로 가능하게 보충될 가능성이 있는 주사용수, 생리적 식염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 추가적인 예시적 비히클이다.
비경구 투여가 상정될 때, 본 발명의 치료적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 비히클에서 목적으로 하는 항체 작제물을 포함하는 무 발열원, 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 특히 비경구 주사용의 적합한 비히클은 항체 작제물이 적절하게 보존된 멸균, 등장 용액으로서 제형화되는 멸균 증류수이다. 제제는 목적하는 분자와 작용제, 예컨대 주사 가능한 미소구체, 생-침식성(bio-erodible) 입자, 중합체 화합물(예컨대, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀의 제형을 포함할 수 있고, 이는 데포 주사(depot injection)를 통해서 전달될 수 있는 생성물의 제어된 방출 또는 지속적인 방출을 제공할 수 있다. 순환 시 지속되는 기간을 촉진시키는 효과를 갖는 히알루론산이 또한 사용될 수 있다. 목적으로 하는 항체 작제물을 도입하기 위해 이식 가능한 약물 전달 장치가 사용될 수 있다.
지속형 또는 제어형 전달/방출 제형이 또한 본 명세서에서 예상된다. 다양한 다른 지속 또는 제어 전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생분해성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하기 위한 기법이 또한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 마이크로입자의 제어 방출을 설명하는 국제 특허 출원 PCT/US93/00829 참조하기 바란다. 지속 방출 제제는 성형된 입자의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐로 반투과성 중합체를 포함할 수 있다. 지속 방출 기질은 폴리에스터, 하이드로겔, 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 공개 제058481호에서 개시되는 바와 같음), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., 1981, 상기 참조) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산(유럽 특허 출원 공개 제133,988호)을 포함할 수 있다. 지속 방출 조성물은 또한 관련 기술 분야에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[ Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692]; 유럽 특허 출원 공개 제EP 036,676호; 제EP 088,046호 및 제EP 143,949호 참조). 항체 작제물은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐(예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에서 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀전, 나노입자 및 나노캡슐)에서, 또는 마크로에멀전에서 포집될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Oslo, A., Ed., (2012)]에 개시되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균 제제로서 제공된다. 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조될 때, 이 방법을 이용하는 멸균은 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조 형태로 또는 용액 중에 저장될 수 있다. 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근법 포트를 갖는 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백(bag) 또는 피하 주사기 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 바이알에 놓인다.
본 명세서에 개시된 항체 작제물은 또한 면역-리포좀으로서 제형화될 수 있다. "리포좀"은 포유류에 대한 약물의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소수포이다. 리포좀의 구성성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게 이중증 형성에서 통상적으로 배열된다. 항체 작제물을 함유하는 리포좀은 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 W0　97/38731에 기재된 것과 같은 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 제5,013, 556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀을 정의진 기공 크기의 필터를 통해 압출하여 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 본 발명의 항체 작제물의 Fab' 단편은 다이설파이드 교환반응을 통해 문헌[Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 화학치료제는 임의로 리포좀내에 함유된다(문헌[Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)] 참조).
추가 활성제
본 발명의 조성물은 본 명세서에 정의된 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물에 추가로 조성물의 의도된 용도에 따라 추가적인 생물학적 활성제를 포함할 수 있다는 것이 생각된다. 이러한 작용제는 특히 종양 및/또는 악성 세포에 자용하는 약물일 수 있지만, 위장관계 상에서 작용하는 작용제, 면역반응을 저해하는 약물(예를 들어, 코르티코스테로이드), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계 상에서 작용하는 약물 및/또는 관련 기술 분야에 공지된 사이토카인과 같은 작용제를 비롯한, 다른 활성제가 약제학적 조성물의 의도된 용도에 따라서 예상된다. 또한 본 발명의 약제학적 조성물은 공동 요법에서, 즉, 다른 항암 의약과 병용하여 적용된다고 예상된다.
저장
일단 약제학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀전, 고체, 결정으로서 또는 탈수 또는 동결건조된 분말로서 멸균 바이알에 저장될 수 있다. 이러한 제형은 바로 사용 가능한 형태로 또는 투여 전에 재구성되는(예를 들어, 동결건조된) 형태로 저장될 수 있다. 예를 들어 동결건조된 조성물, 예를 들어, 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection: BWFI), 생리 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 또는 동결건조 전에 단백질이 있었던 동일한 제형에서 재구성될 수 있다.
투여 경로
본 발명의 일반적으로 약제학적 조성물은 임의의 적합한 투여 경로에 의한 전달을 위해서 제형화될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 투여 경로는 국소 경로(예컨대, 경피, 흡입, 비강, 눈, 귀/이, 질, 점막); 장관 경로(예컨대, 정맥내, 동맥내, 골내, 근육내, 대뇌내, 뇌실내, 경막외, 척수강내, 피하, 복강내, 양막외, 관절내, 심장내, 진피내, 병변내, 자궁내, 방광내, 유리체내, 경피, 비강내, 점막경유, 활액내, 강내)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은, 예를 들어 볼루스 주사와 같은 주사에 의해 또는 연속 주입과 같은 주입에 의해 특히 비경구 투여, 예를 들어, 피하 또는 정맥내 전달에 대해 유용하다. 약제학적 조성물은 의학 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 약제학적 조성물을 투여하기 위한 의학적 장치의 예는 미국 특허 제4,475,196호; 제4,439,196호; 제4,447,224호; 제4,447, 233호; 제4,486,194호; 제4,487,603호; 제4,596,556호; 제4,790,824호; 제4,941,880호; 제5,064,413호; 제5,312,335호; 제5,312,335호; 제5,383,851호; 및 제5,399,163호에 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 중단되지 않고 투여될 수 있다. 비제한적 예로서, 중단되지 않은 또는 실질적으로 중단되지 않은, 즉, 연속 투여는 환자의 신체 내로의 항체 작제물의 유입을 측정하기 위해 환자에 의해 착용되는 소형 펌프 시스템에 의해 실현될 수 있다. 약제학적 조성물은 상기 펌프 시스템을 이용함으로써 투여될 수 있다. 이러한 펌프 시스템은 일반적으로 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 주입될 치료제를 함유하는 카트리지의 주기적 교환에 통상적으로 의존한다. 이러한 펌프 시스템에서 카트리지를 교환할 때, 환자 신체 내로 치료제의 다른 중단되지 않은 흐름의 일시적 중단이 계속해서 일어날 수 있다. 이러한 경우에, 카트리지 대체 전의 투여 단계 및 카트리지 대체 후의 단계는 본 발명의 약제학적 수단의 의미 내에서 여전히 고려될 것이며, 본 발명의 방법은 이러한 치료제의 한 번의 "중단되지 않은 투여"를 함께 구성한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 연속적 또는 중단되지 않은 투여는 저장소 밖으로 유체를 떨쳐버리기 위한 유체 구동 기계 및 구동 기계를 작동시키기 위한 작동 기계를 포함하는 유체 전달 장치 또는 소형 펌프 시스템에 의해 정맥내 또는 피하일 수 있다. 피하 투여를 위한 펌프 시스템은 환자의 피부를 관통하기 위한 그리고 환자의 신체 내로 적합한 조성물을 전달하기 위한 바늘 또는 캐뉼라를 포함할 수 있다. 상기 펌프 시스템은 정맥, 동맥 또는 혈관과 독립적으로 환자의 피부에 직접 고정 또는 부착될 수 있고, 이에 의해 펌프 시스템과 환자의 피부 사이에 직접적인 접촉을 허용한다. 펌프 시스템은 24시간 내지 며칠까지 동안 환자의 피부에 부착될 수 있다. 펌프 시스템은 작은 용적을 위한 저장소에 의해 작은 크기를 가질 수 있다. 비제한적 예로서, 투여될 적합한 약제학적 조성물에 대한 저장소의 용적은 0.1 내지 50㎖일 수 있다.
연속적 투여는 또한 피부 상에서의 패치 착용에 의해 경피로 달성될 수 있고, 간격은 대체된다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이 목적에 적합한 약물 전달을 위한 패치 시스템을 인식한다. 경피 투여는 특히 중단되지 않은 투여를 잘 받아들이는데, 제1 고갈 패치의 교환이, 예를 들어 제1 고갈 패치에 바로 인접한 그리고 제1 고갈 패치의 제거 직전에 피부 표면 상에서의 새로운, 제2 패치와 동시에 유리하게 수행될 수 있기 때문이다. 유동 중단 또는 파워셀 고장의 문제는 생기지 않는다.
통상의 기술자는 본 발명의 약제학적 조성물이 그것이 안정하고 바람직하게는 첨부된 실시예에서 평가된 β-사이클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물과 동일한 이로운 특성을 나타내는 한 일반적으로 상기에 기술된 부형제, 또는 추가적인 활성제 중 임의의 것을 포함할 수 있거나, 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 통상의 기술자는 안정하고, 바람직하게는 포함된 이중특이적 단일 쇄 항체 단편의 응집물 및/또는 배좌이성질체가 실질적으로 존재하지 않는 약제학적 조성물을 제공하도록 다양한 구성성분을 쉽게 조정 할 수 있을 것이다.
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본 명세서에 사용되는 바와 같은 단수 형태는 달리 문맥에서 명확하게 표시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 이러한 상이한 시약 중 하나 이상을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재된 방법에 대해 변형 또는 대체되는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 대해 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 표시되지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 해당 시리즈에서의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체적 실시형태에 대한 다수의 동등물을 인식하거나 또는 단지 일상적인 실험을 이용하여 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 어디에서나 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결되는 요소의 모든 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 내, 바람직하게는 10% 내, 보다 바람직하게는 ±5% 내를 의미한다. 그러나 그것은 또한 명수(concrete number)를 포함하고, 예를 들어, 약 20은 20을 포함한다.
용어 "미만" 또는 "초과"는 명수를 포함한다. 예를 들어, 20 미만은 그 이하를 의미한다. 유사하게, 초과 또는 보다 큰은 각각 이상 또는 크거나 같음을 의미한다.
본 명세서 및 다음의 청구범위 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 변형, 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수의 그룹의 포함을 나타내는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지는 않는다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "포함하는"은 본 명세서에서 용어 "갖는"과 함께 사용될 때 때때로 용어 "함유하는" 또는 "포함하는(including)"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "이루어진"은 청구범위 요소에서 구체화되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본 명세서에서 사용될 때, "본질적으로 이루어진"은 청구범위의 기본적인 그리고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 제외하지 않는다.
본 명세서의 각각의 예에서, 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등으로 제한되지 않고, 이와 같이 달라질 수 있다고 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하려는 목적을 위해서이고, 청구범위에만 정의된 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
상기이든 하기이든 간에, 본 명세서의 내용 전체에서 인용된 모든 간행물 및 특허(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조 시방서, 지시서 등 포함)는 본 명세서에 이들의 전문이 참고로 포함된다. 본 명세서에서 본 발명은 선행 발명으로 인해서 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것으로 이해되어서는 안된다. 참고로 포함된 문헌이 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 정도까지, 본 명세서는 임의의 이러한 문헌을 대체할 것이다.
본 발명 및 이의 이점의 더 양호한 이해가 단지 예시적인 목적을 위해서 제공된, 하기 실시예로부터 수득될 것이다. 실시예는 어떤 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: AMG330 및 HP-β-CD를 포함하는 제형에 대한 온도-유도된 스트레스의 효과
수산화인회석 크로마토그래피로부터 유래된 AMG 330 단백질 풀(서열번호 100)을 100mM 트리스 베이스, 50mM 인산수소이나트륨, 4%(w/v) 트레할로스 이수화물(pH 5.2)로 구성된 제형 베이스 완충제 중에서 투석하였다. 투석의 종말점을 오스몰농도 측정에 의해서 검증하였다. 투석된 벌크를 초미세여과 및 원심분리에 의해서 0.96㎎/㎖의 농도로 농축시키고, 0.2㎛ PVDF 필터에 의해서 멸균 여과하였다. 미리 제형화된 벌크를 3개의 동등한 크기의 부피 분획으로 분할하였다. 이들을 각각 5M 수산화나트륨을 사용하여 pH 5.2, 5.6 및 6.0으로 조정하고, 0.2㎛ PVDF 필터로 다시 여과하였다. pH 조정 후 미리 제형화된 벌크를 1%(w/v) 폴리솔베이트 20, 1%(w/v) 폴리솔베이트 80 또는 4%(w/v) HP-β-CD 중 어느 하나를 함유하는 스톡 용액의 필요한 부피로 스파이킹(spiking)하였다. 최종 제형 중의 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80 및 HP-β-CD의 농도를 도 1에 나타낸다. 각각의 제형의 농도를 상기에 기술된 바와 같이 구성된 베이스 완충제를 사용하여 0.4㎎/㎖로 조정하였다. 모든 부형제는 약물 등급(compendial grade)으로 적용되었다. 최종 제형을 폴리프로필렌 반응 튜브 내에 150㎕로 충전시키고, 30℃에서 72시간 동안 제어 캐비넷에서 인큐베이션시켰다. 배좌이성질체 및 고분자량 종(HMWS)의 함량을 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UPLC)로 결정하였다. SE-UPLC를 어퀴티 H-클래스 UPLC 시스템(Aquity H-Class UPLC system)(워터스(Waters)) 상에서 어퀴티 UPLC BEH200 SEC 150㎜ 칼럼(워터스)을 사용하여 수행하였다. 칼럼 온도를 25℃로 설정하였다. 0.4㎖/분의 유량을 사용하여 등용매 방법(isocratic method)을 적용함으로써 크기 변이체의 분리를 달성하였다. 이동상은 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl(pH 6.8)로 구성되었다. 실시 시간은 총 6.0분이다. 샘플을 8℃에서 분석 시까지 오토샘플러 내에 유지시켰다. 주입 부피는 7.5㎕였다. 캐리 오버(carry over)를 회피하기 위해서 40% ACN으로의 중간 주입을 각각의 샘플 이후에 수행하였다. 검출은 형광을 기반으로 하였다(Ex 280㎚, Em 325㎚). 피크 적분을 엠파워(Empower)(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 단량체 및 크기 변이체의 상대 AUC를 기록하였다. 열 스트레스(30℃) 동안 비-단량체 단백질 종(배좌이성질체 및 고분자량 종 포함함)의 형성은 HP-β-CD의 존재 하에서 저해될 수 있다는 것을 발견할 수 ㅇ있었다(도 1). 이에 반해서, 폴리솔베이트 20 또는 80을 함유하는 제형은 시간에 따라서 비-단량체 종의 형성을 나타내었다.
실시예 2: AMG330 및 HP-β-CD를 포함하는 제형에 대한 표면-유도된 스트레스의 효과
HP-β-CD가 표면 유도된 스트레스 조건에 대해서 AMG 330을 안정화시키는지의 여부를 평가하기 위해서 추가 실험을 수행하였다. 35mM 트리스 하이드로클로라이드, 17.5mM 인산나트륨 하이드로겐포스페이트, 100mM L-아르기닌 하이드로클로라이드 및 1.4%(w/v) 트레할로스 이수화물, pH 6.0 중에 제형화된 AMG 330 약물 물질에 폴리솔베이트 20, 80 또는 HP-β-CD를 도 2(x축)에 도시된 상이한 농도로 보충하였다. 모든 부형제는 약물 등급으로 적용되었다. 제형을 미리 세척되고 미리 멸균된 유형 I 유리 바이알 내에서 1.0㎖로 충전시켰다. 바이알을 멸균화된 부틸 고무 마개로 닫고, 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 제형을 (1) 10회의 연속 동결/해동 사이클 및 (2) 포밍에 의해서 스트레스 받게 하였다. 동결 및 해동은 엡실론(Epsilon) 2-6D 파일럿 규모 동결 건조기(크리스트(Christ), 독일 소재)에서 수행하였다. 동결 및 건조를 위한 표적 온도를 각각 -50℃ 및 20℃로 설정하였다. 0.3K/분의 동결 및 해동 속도를 사용하였다. 각각의 온도 다음에 1시간의 등온 고원이 이어졌다. 21G 주사 바늘을 사용하여 질소를 각각의 용액 중에 1시간에 걸쳐서 80㎖/분으로 주입함으로써 포밍을 달성하였다. 멸균 필터가 구비된 제2 주사 바늘을 사용하여 바이알을 배기시켰다. -70℃에서 저장된 샘플을 스트레스가 없는 대조군으로서 사용하였다. SE-UPLC 및 아르즈나이미텔 코덱스(DAC) 시험 5에 따른 육안 검사에 의해서 샘플을 분석하였다. SE-UPLC를 실시예 1 하에 기술된 바와 같이 수행하였다. 단백질 농도의 평가를 위해서 280㎚에서의 흡수를 통해서 검출을 추가로 수행하였다.
스트레스가 없는 대조군에서, 배좌이성질체, 이량체 및 응집물을 포함하는 비-단량체 종은, HP-β-CD를 갖는 제형과 비교하는 경우 폴리솔베이트 20 또는 80을 함유하는 제형 중에서 더 풍부하다는 것이 명백하였다. 포밍 및 동결/해동에 의해서 스트레스 받는 경우, 비-단량체 종이 폴리솔베이트를 함유하는 제형 중에서 증가하였다(도 2). HP-β-CD의 사용은 비-단량체 종의 형성을 감소시켰다. 임의의 계면활성제의 부재 하에서, 80% 초과의 단백질 손실이 관찰된 반면, 폴리솔베이트 및 HP-β-CD의 사용은 정량적인 단백질 회수를 초래하였다. 계면활성제 무함유 제형에 반해서, HP-β-CD 함유 제형은 가시적인 크기 범위의 단백질 응집물이 실질적으로 존재하지 않았다(표 1).
Figure pct00031
실시예 3: AMG103 및 HP-β-CD 또는 SBE-β-CD를 포함하는 제형에 대한 벤질 알코올의 효과
벤질 알코올의 존재 하에서 BiTE(등록상표) 항체 작제물의 안정성에 대한 HP-β-CD 및 SBE-β-CD의 영향을 0.6㎎/㎖ AMG 103(블리나투모맙)을 함유하는 제형 중에서 조사하였다. 따라서 AMG 103을 20mM 히스티딘, 2%(w/v) 트레할로스 이수화물, 0.9%(w/v) 염화나트륨(pH 7.0) 중에서 제형화하였다. 이 제형에 상이한 농도의 HP-β-CD(0.5 및 1.0%w/V) 또는 SBE-β-CD(0.5, 1.0 및 2.0%w/V) 중 어느 하나를 보충하였다. 사이클로덱스트린 무함유 제형을 대조군으로서 제공하였다. 모든 제형 중의 AMG 103 농도를 0.6㎎/㎖로 조정하였다. 모든 부형제는 약물 등급으로 적용되었다. 모든 제형을 0.9%(V/V) 벤질 알코올로 스파이킹하고, 폴리프로필렌 반응 튜브 내에서 0.5㎖로 충전시켰다. 인큐베이션을 37℃에서 24시간 동안 수행하였다. 샘플을 UV 흡수에 의해서 분석하여 단백질 응집에 대한 측정치로서 350㎚에서의 광학 밀도를 결정하였고, 잠재적인 입체배좌 변화를 검출하기 위해서 고유 형광 방출 강도 측정에 의해서 분석하였다. 투명한 절반 면적 96웰 플레이트(코닝)를 사용하여 인피니트(Infinite) M1000 플레이트 리더(테칸(Tecan)) 상에서 UV 흡수를 수행하였다. 각각의 웰을 샘플 용액 100㎕로 충전시켰다. 샘플 측정을 3회 반복하여 수행하였다. UV 흡수를 350㎚에서 기록하였다. 고유 형광 방출 강도를 바닥으로부터 동일한 플레이트에서 분석하였다. 여기는 278㎚에서 실현되었다. 1㎚ 증분을 사용하여 300 내지 500㎚에서 방출 강도를 기록하였다. 여기 및 방출 슬릿을 각각 10 및 5㎚로 설정하였다. UV 및 형광 측정 둘 모두 동안 플레이트를 온도 제어하였다(25℃).
350㎚에서의 광학 밀도(OD)는 HP-β-CD 또는 SBE-β-CD의 존재 하에서의 AMG 103의 감소된 응집 경향성을 나타내었다. 그 효과는 사이클로덱스트린 농도 증가에 따라서 두드러졌다(도 3). 벤질 알코올의 존재 하에서의 AMG 103의 응집은 고유 형광에 의해서 입증된 국지 환경 트립토판 잔기의 변화로 번역된다. 이러한 변화는 상이한 β-CD의 농도 증가에 따라서 최소화되었다(도 4).
실시예 4: 상이한 농도의 AMG103 및 β-CD를 포함하는 제형에 대한 벤질 알코올의 효과
AMG 103(블리나투모맙)의 응집 경향에 대한 HP-β-CD 및 SBE-β-CD의 농도 증가의 효과를 2-수준 4-인자 완전 요인배치법 실험 설계에 의해서 다루었다. AMG 103을 실시예 2 하에서 기술된 바와 같이 제형화하였다. 그러나, 이의 농도를 0.2 내지 0.6㎎/㎖로 변화시켰다(표 2).
Figure pct00032
모든 샘플을 투명한 절반 면적 96웰 플레이트(코닝)에서 37℃에서 96시간 동안 직접 인큐베이션시켰다. 플레이트를 접착제 포일로 덮어서 증발 손실을 방지하였다. 다시 350㎚에서의 광학 밀도를 AMG 103의 응집에 대한 척도로서 취하였다(실시예 3 참고). 스태티스티카(Statistica)(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 분산 분석법(ANOVA)을 통해서 분석 데이터를 평가하였다. 측정된 값의 정상 분포를 원시 잔차에 대해서 예상된 정상 값을 플롯팅함으로써 그래프로 검증하였다. 예측 모델(도 5)을 분석 데이터의 회귀를 기반으로 스태티스티카(등록상표)에 의해서 생성하였다. 이에 의해서, 인자들 간의 선형 상호작용뿐만 아니라 순수한 인자 효과가 고려되었다. AMG 103 및 벤질 알코올의 주어진 농도에서, HP-β-CD 또는 SBE-β-CD 중 어느 하나의 함량 증가에 따라서 AMG 103의 응집이 감소될 수 있었다(도 5).
실시예 5: 이중특이적 항체 작제물 및 β-CD를 포함하는 제형에 대한 저장-유도된 스트레스의 효과
20mM 인산칼륨, 150mM L-아르기닌 하이드로클로라이드 및 6%(w/v) 트레할로스 이수화물 중의 대략 1㎎/㎖ CD33_2-hALB(pH 6.0)를 함유하는 미리 제형화된 약물 물질을 각각 20mM 시트르산, 6%(w/v) 수크로스(pH 5.0) 및 20mM 인산칼륨, 6%(w/v) 수크로스(pH 6.0) 중에서 투석하였다. 투석 종말점을 오스몰농도 측정을 통해서 결정하였다. 슬라이드 에이 라이저(Slide A Lyzer)(등록상표) 장치를 사용하여 투석을 수행하였다. 투석 후 시트레이트 완충된 물질을 비바스핀(VivaSpin)(등록상표) 유닛을 사용하여 7㎎/㎖를 초과하게 직접 농축시켰다. 원심분리를 대략 2000g에서 5분 동안 2 내지 8℃에서 수행하였다. 인산칼륨 완충된 물질을 유사하게 처리하였다. 그러나, 물질을 원심분리 단계 이전에 2개의 동등한 크기의 부피 분획으로 분할하였다. 하나의 분획을 pH 7.0으로 조정하였다. 제2 분획으 pH를 pH 6.0에서 유지시켰다. 0.2㎛ PVDF 필터를 통한 멸균 여과 후, 폴리솔베이트 80 및 적용 가능한 경우 SBE-β-CD의 스톡 용액을 첨가함으로써 농축물을 최종적으로 제형화하였다. CD33_2-hALB 표적 농도는 5.0㎎/㎖였다. 최종적으로 제형화된 벌크를 미리 세척되고 미리 멸균된 유형 I 유리 바이알 내에 충전시켰다. 바이알을 멸균화된 부틸 고무 마개로 닫고, 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 충전 부피는 총 1.0㎖였다. 제형에 대한 개요를 표 3에 제공한다. 바이알을 37℃에서 온도 제어된 캐비넷에서 6일 동안 저장하였다. 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 SE-UPLC에 의해서 고분자량 종을 정량분석하였다. 단백질의 주입된 양은 총 3㎍이었다.
Figure pct00033
SBE-β-CD를 함유하는 제형(F2, F4, F6)은 사이클로덱스트린 무함유 제제와 비교하는 경우 인큐베이션 후 더 적은 양의 고분자량 종(HMWS)을 나타내었다. 이러한 효과는 pH 5에서 보다 pH 6 및 7에서 더 두드러졌다(도 6).
실시예 6: 이중특이적 항체 작제물 및 β-CD를 포함하는 제형에 대한 초미세여과 및 투석여과의 효과
정제된 MSLN-hALB(즉, 서열번호 176)를 초미세여과(UF)에 의해서 단계식으로 농축시켰다. 먼저 재생 셀룰로스 막 및 0.11㎡의 표면이 구비된 카세트를 사용하여 7배 농축을 수행하였다. 50㎠의 표면을 갖는 더 작은 막을 사용하여 추가 7배 농축을 수행하였다. 두 막 모두는 10kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 가졌다. 초미세여과 단계 및 투석여과 단계의 경우 막관통 압력을 1.4bar로 제한하였다. 농축된 풀을 2개의 부분으로 분할하였다. 제1 부분을 20mM 인산칼륨, 150mM L-아르기닌 하이드로클로라이드, 6%(w/v) 트레할로스 이수화물로 구성된 완충제(pH 6.0) 중에서 투석여과하였다. 제2 부분을 20mM 인산칼륨, 2%(w/v) 수크로스로 구성된 완충제(pH 6.0) 중에서 투석여과하였다. 농축된 스톡 용액을 투석여과된 물질에 첨가함으로써 표 4에 열거된 최종 제형을 조정하였다. 모든 부형제는 약물 등급으로 적용되었다. 표적 MSLN-hALB 농도는 1.0㎎/㎖였다.
Figure pct00034
최종적으로 MSLN-hALB 약물을 0.2㎛ PVDF 필터를 통해서 멸균 여과하고, 미리 세척되고 미리 멸균된 유형 I 유리 바이알 내에 충전시켰다. 바이알을 멸균화된 부틸 고무 마개로 닫고, 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 충전 부피는 총 1.0㎖였다. 바이알을 최대 2주 동안 각각 25℃ 및 37℃에서 온도 제어된 캐비넷에 저장하였다. 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 SE-UPLC에 의해서 고분자량 종을 정량분석하였다. 단백질의 주입된 양은 총 3㎍이었다. 약한 양이온 교환 초고성능 액체 크로마토그래피(WCX-UPLC)를 사용하여 산성 전하 변이체를 결정하였다. 프로테인-팩 하이 레스(Protein-Pak Hi Res) CM 7㎛ 4.6 x 100㎜ 칼럼을 사용하여 UPLC H 클래스 어퀴티(워터스) 상에서 WCX-UPLC를 수행하였다. 칼럼 온도를 30℃로 설정하였다. 크로마토그래피 분리를 달성하기 위해서 하기 구배(표 5)를 적용하였다:
Figure pct00035
용리액 A는 20mM 인산나트륨(pH 6.5)으로 구성되었다. 용리액 B는 20mM 인산나트륨, 250mM 염화나트륨(pH　6.5)으로 구성되었다. 단백질의 주입된 양은 총 3㎍이었다. 유량은 0.65㎖/분이었다. 주입 전에, 샘플을 오토샘플러에서 8℃에서 유지시켰다. 단백질 검출은 고유 형광 강도의 측정에 따랐다. 여기는 280㎚에서 수행되었고, 방출은 330㎚에서 취했다. 곡선 하 상대 면적(AUC)을 기준으로 산성 전하 변이체를 정량분석하였다. 적분을 엠파워(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
최저 고분자량 종(HMWS) 형성률이 SBE-β-CD를 갖는 제형에서 관찰되었다(도 7B). 산성 전하 변이체의 최저 분율에 의해서 나타난 바와 같이 화학적 안정성 또한 SBE-β-CD 함유 제형에 대해서 가장 두드러졌다(도 8).
실시예 7: SBE-β-CD 및 알지네이트를 갖는 AMG 330의 LLPS
LLPS: 액체-액체 상 분리(LLPS)는 콜로이드 입자들(예를 들어, 단백질들) 간의 순 인력(net attraction)에 의해서 유발되고, 따라서 이러한 인력의 강도의 척도이다. 단백질들 간에 인력이 존재하는 경우, 온도가 충분히 낮다면 LLPS는 함께 존재하는 단백질-풍부 상 및 단백질-부족 상으로 일어난다. LLPS에서, 함께 존재하는 상은 정확하게 열역학적으로 평형이고, 완전히 가역적이고, 함께 존재하는 상의 농도는 초기 단백질 농도가 아닌 온도에만 좌우된다. LLPS는 PEG의 첨가에 의해서 유도될 수 있다. 단백질들 간에 더 강한 인력이 존재하는 경우, LLPS가 일어나는 데 필요한 PEG 농도가 더 낮고, 이것은 결국 이들 단백질이 쉽게 응집할 것이라는 것을 나타낸다. 주어진 온도 및 PEG 농도에서, 단백질의 콜로이드 안정성을 증가시키는 부형제는 단백질-부족 상 중에서 더 높은 단백질 농도를 초래한다. 이러한 단백질 농도의 증가는 부형제가 없는 대조군에 대해서 크로마토그래피로 측정될 수 있다. 제형 개발 시에 LLPS를 관찰하고, 단백질 분자들 간의 인력을 평가하는 것이 바람직하다.
본 실험의 목적은 LLPS를 사용하여 AMG 330의 콜로이드 안정성에 대한 SBE-β-CD 및 알지네이트의 효과를 평가하는 것이다.
Figure pct00036
Figure pct00037
상이한 용액/샘플 조성 및 제제를 상기 표 6 및 표 7에 언급된 바와 같이 제조하였다. 샘플을 제조하였고(최종 AMG 330 농도 0.12㎎/㎖), 40℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 20초 동안 마이크로 원심분리하였고(에펜도르프 센트리퓨즈(Eppendorf Centrifuge) 5418, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 80uL의 상청액을 제거하고, 애질런트(Agilent) 크로마토그래피 시스템(애질런트 1200, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에서 분석용 CEX(프로팩(ProPac) WCX-10 칼럼, 내경 2㎜)에 의해서 분석하였다.
분석용 CEX: 30분의 구배 시간(총 실시 시간:45분/주입)을 사용하고, 500mM 염화나트륨의 최대 농도를 사용하고 0.2㎖/분의 유량에서, 20mM 시트르산, 0.005% 나트륨 아자이드, pH 6.0으로 평형시키고, 20mM 시트르산, 1M 염화나트륨, 0.005% 나트륨 아자이드 pH 6.0으로 용리시키는 CEX 칼럼에 70㎕의 샘플을 주입하였다. 오토샘플러 온도를 실시 동안 40C에서 유지시켰다. 크로마토그램으로부터, 샘플의 피크 면적을 계산하였다(도 9 및 10).
실시예 8: 4종의 상이한 제형(SBE-β-CD 포함)의 존재 하에서 초미세여과 원심분리에 의한 AMG 330의 완충제 교환 및 단백질 농도
Figure pct00038
Figure pct00039
초기 단백질 농도는 0.4㎎/㎖였다. 2㎖의 0.4㎎/㎖ AMG 330을 아미코눌트라(Amiconultra) 15㎖ 원심분리 필터, MWCO 10,000에 넣었다. 10㎖의 적절한 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 단백질과 약하게 혼합하고, 3시간 동안 2000rpm에서 4℃에서 원심분리하였다(알레그라 6R 센트리퓨즈(Allegra 6R Centrifuge), 베크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 캘리포니아주 브레아 소재). 이어서 농축물(retentate)을 약하게 혼합하고 1.5시간 동안 2500rpm에서 25℃에서 원심분리하였다. 200 내지 250㎕의 농축물 부피 이후에, 10㎖의 적절한 완충제를 각각에 첨가하고, 농축물과 약하게 혼합하고, 30분 동안 2500rpm에서 25℃에서 200 내지 250㎕의 최종 부피로 원심분리하였다. 4종의 상이한 제형 중의 최종 단백질 농도는 2.9 내지 3.7㎎/㎖ 범위였다.
분석용 SEC: 0.5㎖/분의 유량으로(총 실시 시간: 35분/주입) 100mM 인산나트륨, 250mM 염화나트륨, pH 6.8의 러닝(running) 완충제를 사용하여 애질런트 크로마토그래피 시스템(애질런트 1200, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에서 분석용 SEC(TSKgel G3000SWXL, 내경 7.8㎜, 미국 펜실베니아주 소재)에 의해서 샘플을 분석하였다. 오토샘플러 온도를 실시 동안 4℃에서 유지시켰다.
SBE-β-CD의 존재는 초미세여과에 의한 단백질 농축 동안 HMW의 형성에 대해서 AMG 330에 상당한 보호를 제공하는 것으로 보이며, SBE-β-CD를 함유하는 제형에서 가장 낮은 상대적인 양의 응집물을 갖는다. 아르기닌, 글루타메이트, 수크로스, 만니톨 및 PS-80을 함유하는 제형은 트리스, 포스페이트, 아르기닌, 트레할로스 및 PEG 4000을 함유하는 제형 다음에 가장 많은 양의 HMW를 가졌다(도 11). CEX 분석은 유사한 효과를 나타내었다(데이터 나타내지 않음).
실시예 9: SBE-β-CD를 포함하는 AMG 330의 소규모 제형 연구(LLPS, FT, UFC)
본 실험의 목적은 14종의 상이한 제형에서 다양한 스트레스 후 AMG 330의 안정성을 평가하는 것이다. 구체적으로, LLPS, 20회의 동결/해동(F/T) 사이클 및 초미세여과/원심분리(UFC)에 의한 농축 이후에 AMG 330을 평가하였다. 실시예 8에 나타난 바와 같이, SBE-β-CD는 AMG 330 응집에 대해서 보호를 제공하며, 이것이 본 실험에서 추가로 평가된다. UFC의 경우(도 12A, B), 5종의 제형 만을 조사하였다. LLPS 및 F/T 연구의 경우(도 12C, D), 14종의 제형을 조사하였다. LLPS 샘플을 분석용 CEX에 의해서 분석한 반면, UFC 및 F/T 샘플을 분석용 SEC 및 CEX 둘 모두에 의해서 분석하였다.
물질 및 방법:
Figure pct00040
초미세여과/원심분리(UFC):
Figure pct00041
각각의 샘플의 경우, 4㎖의 0.4㎎/㎖ AMG 330을 MWCO 10,000의 아미코눌트라 15㎖ 원심분리 필터 튜브에 넣었다. 8㎖의 적절한 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 단백질과 약하게 혼합하고, 농축물이 200 내지 250uL일 때까지 2000rpm(4000 rcf)에서 20℃에서 원심분리하였다(알레그라 6R 센트리퓨즈, 베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아 소재). 이 과정을 총 3회의 농축 단계 동안 2회 더 반복하였다. 이어서 농축물을 피펫터로 약하게 혼합하고, 필터 튜브로부터 제거하고, 에펜도르프 튜브에 넣고, 2분의 최대 속도에서 마이크로-원심분리하였다(에펜도르프 센트리퓨즈 5418, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재). 그 후, 단백질 농도를 상청액에 대해서 측정하고, 20㎕를 주입함으로써 분석용 SEC에 의해서 분석하였다(실시예 8에서와 동일한 상세사항). 각각의 샘플을 2회 반복물로 제조하였다.
LLPS:
샘플을 하기 표에 개괄된 바와 같이 준비하고, 5일 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 모든 샘플의 최종 부피는 240㎕였다. 인큐베이션 후, 샘플을 20초 동안 마이크로 원심분리하고(에펜도르프 센트리퓨즈 5418, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 이어서 200㎕ 상청액을 분석용 CEX(오토샘플러 온도를 25℃에서 유지시킨 것을 제외하고 실시예 7에서의 상세사항과 동일함)을 위해서 제거하였다.
Figure pct00042
SBE-β-CD의 농도 증가는 비교적 낮은 수준의 응집물을 유지하면서 증가된 단량체 회수를 초래하였다. SBE-β-CD는 수크로스, 만니톨 및 수크로스와 조합되는 경우, 특히 글라이신 및 수크로스와 조합되는 경우 훨씬 더 양호하게 기능하였다. 이것은 특히 놀라운 것인데, 그 이유는 글라이신 단독은 매우 불량하게 기능하고, 그것은 수크로스와 조합되어도 그다지 더 양호하게 기능하지 않았기 때문이다.
동결/해동(F/T):
Figure pct00043
샘플을 상기 표와 같이 제조하였다. 20회 F/T 사이클을 수행하였는데, 샘플을 각각의 동결 동안 적어도 1시간 동안 -70℃ 또는 -30℃에서 저장하고, 해동 동안 1시간 이하 동안 실온에 저장하였다. 각각의 샘플의 최종 부피는 240㎕였다. 0회 사이클 및 20회 사이클 후 분취물을 분석용 SEC(실시예 8과 동일함) 분석을 위해서 제거하였다.
SBE-β-CD의 존재는 다른 제형에 비해서 F/T 동안 응집 감소 및 상대 단량체 농도의 증가에 대해서 이익을 제공하는 것으로 보인다. SBE-β-CD가 다른 부형제, 특별하게는 글라이신 및 수크로스와 조합되어 사용된 제형 또한 잘 기능하였다.
실시예 10: SBE-β-CD 및 2-하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린의 효과 비교
SBE-β-CD는 이전 UFC 실험에서 단백질 농축 동안 응집에 대해서 AMG 330에 상당한 보호를 제공한다고 밝혀졌다. 본 실험에서, UFC에 의한 단백질 농축 동안 AMG 330에 대한 효과를 SBE-β-CD 또는 또 다른 사이클로덱스트린, 2-하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린(2-HP-β-CD) 중 어느 하나의 존재 하에서와 비교한다.
물질 및 방법:
20㎖의 0.4㎎/㎖ AMG 330을 MWCO 10,000의 아미코눌트라 15㎖ 원심분리 필터 튜브에서 약 10㎖로 농축시켰다. 튜브의 농축물을 합하고, 이어서 단백질의 농도를 SoloVPE(2.319㎖/(㎎*㎝)의 흡광 계수 사용)에 의해서 측정하고, 0.83㎎/㎖인 것을 발견하였다. 이어서, 이 단백질을 사용하여 UFC 샘플을 제조하였다.
모든 샘플은 10mM 인산칼륨, 8% 수크로스, 0.01% 폴리솔베이트-80(pH 6.0)을 함유하였다.
5개의 제형 조건을 시험하였다: 1) 완충제 만을 갖는 대조군, 2) 1% SBE-β-CD 첨가, 3) 2% SBE-β-CD 첨가, 4) 1% 2-HP-β-CD 첨가, 및 5) 2% 2-HP-β-CD 첨가. 50㎖의 각각의 5개의 완충제 용액을 제조하였다. 각각의 제형의 2회 반복 샘플을 시험하였다.
각각의 샘플의 경우, 0.875㎖의 AMG 330을 MWCO 10,000의 아미코눌트라 4㎖ 원심분리 필터 튜브에 넣었다. 3.125㎖의 적절한 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 단백질과 약하게 혼합하고, 농축물 부피가 약 100uL일 때까지 25C에서 4000rcf에서 튜브를 원심분리하였다(알레그라 6R 센트리퓨즈, 베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아 소재). 4㎖의 추가적인 완충제를 첨가하고, 샘플을 다시 약 100uL로 농축시켰다. 이어서 농축물을 피펫터로 약하게 혼합하고, 45uL를 필터 튜브로부터 제거하고, 에펜도르프 튜브에 넣고, 2분의 최대 속도에서 마이크로-원심분리하였다(에펜도르프 센트리퓨즈 5418, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재). 상청액을 분석용 SEC에 의해서 분석하였다(실시예 8에서와 동일함). 농축되지 않은 AMG 330(0.4㎎/㎖)을 또한 비교 목적을 위해서 분석하였다.
본 실험에서, AMG 330을 1 및 2% SBE-β-CD 또는 2-HP-β-CD의 존재 하에서 약 10㎎/㎖까지 농축시켰다. SBE-β-CD 함유 제형을 별표로 표시한다. 좌측 상의 대조군(0.4㎎/㎖로서 표지됨)은 0.4㎎/㎖의 이의 시작 농도를 초과하게 농축되지 않았다. 좌측으로부터 두 번째 것(도 4A 및 도 4B에서 대조군으로서 표지됨)은 어떠한 사이클로덱스트린도 없이 농축된 샘플이다. SBE-β-CD와 2-HP-β-CD 제형 간의 비교는 SBE-β-CD 사용의 이점을 입증한다. 도 13은 도달되는 최고 농도를 나타내고; 도 14는 % 응집물 및 % 단량체에 대한 이들 농축된 용액의 조성을 나타낸다.
실시예 11: 가용성의 비-응집된 형태로 AMG 330을 유지시키는 이들의 능력에 대한 4종의 상이한 사이클로덱스트린의 비교
SBE-β-CD는 이전 실험에서 AMG 330 중에서 응집 감소를 나타내었다. 본 실험의 목적은 SBE-β-CD와 비교하여 다른 사이클로덱스트린을 평가하는 것이다. 4℃ 및 25℃에서 4종의 상이한 사이클로덱스트린과 함께 1 내지 4일 인큐베이션시킨 후 AMG 330 중의 응집 수준을 측정하였다.
물질 및 방법:
모든 샘플은 또한 약 2㎎/㎖ AMG 330, 20mM 시트레이트, 및 0.01% 폴리솔베이트-80(pH 6.0)을 함유하였다. 샘플을 제조하고, 에펜도르프 튜브에 저장하였다(표 14). 튜브를 플라스틱 내에 랩핑하여, 인큐베이션 동안 광으로부터 보호하였다. 4℃ 및 25℃에서 1일 및 4일 인큐베이션 후 분취물을 취하였다(써모피셔 사이언티픽(Thermofisher Scientific), (미국 뉴햄프셔주 뉴잉톤 소재) 하케(Haake) A28). 분취물을 간단히 마이크로 원심분리하고(에펜도르프 센트리퓨즈 5418, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 상청액을 분석용 SEC에 의해서 분석하였다.
Figure pct00044
Figure pct00045
SBE-β-CD를 비롯한 4종의 상이한 사이클로덱스트린을 가용성의 비-응집된 형태로 AMG 330을 유지시키는 능력에 대해서 시험하였다. 약 2㎎/㎖에서의 단백질을 4일 동안 4℃ 및 25℃에서 추가로 농축하지 않고 인큐베이션시켰다. 모든 샘플은 또한 20mM 시트레이트, 및 0.01% 폴리솔베이트-80(pH 6.0)을 함유하였다.
4℃에서 4일 마지막에, 0.5% SBE-β-CD 제형은 SEC에 의해서 더 큰 총 피크 면적을 가졌는데, 이는 더 높은 가용성 단백질 농도를 나타낸다. 다른 제형은 다양한 정도로 침전 및 응집되었다. 이러한 결과는, SBE-β-CD가 α-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필 β-사이클로덱스트린(25℃에서만 약간 양호한 것으로 보임)과 비교할 때 두 온도(4℃ 및 25℃) 모두에서 AMG 330의 보다 효과적인 안정제 및 가용화제였음을 입증한다(도 15).
실시예 12: 1㎎/㎖에서 13개의 상이한 제형 중에, ~20, ~30 및 -70℃에서 최대 6주 동안 저장된 AMG 330.
본 실험의 목적은 AMG 330에 대한 안정하게 동결 및 동결 건조된 제형을 개발하는 것이며, SBE-β-CD 및 트리톤 X-100을 제형 부형제로서 평가하였다. 폴리카보네이트 카보이(carboy)를 사용하여 약물 물질(DS) 동결 저장을 모의실험하였다.
물질 및 방법:
AMG 330의 경우 0.4㎎/㎖의 출발 농도를 사용하여, 약 23psi로 설정된 델타 압력을 갖는 2개의 타당한 μ 규모 TFF 시스템을 사용하여 UF/DF 완충제 교환(표 16에 열거된 완충제)을 수행하였다. 4개의 밀리포어 펠리콘 3 울트라셀 (Millipore Pellicon 3 Ultracel) 10kD 0.11m2 카세트 및 2개의 타당한 튜빙 조립체를 사용하였다. 교환 후, 물질을 1.2㎎/㎖로 과농축시키고, 멸균 날젠 용기에 수집하였다.
Figure pct00046
제형 완충제, PEG 및 계면활성제 스톡을 새로 제조하고, 첨가하여 최종 제형화된 물질을 생성하였다. 샘플을 본 실험을 위해서 30㎖ PC 카보이(날젠) 중에 15㎖ 부피로 충전시켰다. 모든 샘플을 충전 전에 스터리벡스 필터 유닛(sterivex filter unit)(0.22㎛)을 사용하여 멸균 후드에서 여과하였다. PC 카보이 내의 최종 단백질 농도는 1㎎/㎖이다.
정적 실험을 위해서, 샘플을 t = 0주 및 t= 6주에서 분석용 SEC(실시예 8에서와 같음)에 의해서 측정하였다.
결과:
SBE-β-CD를 다양한 온도에서 인큐베이션된 AMG 330 제형 중에 포함시켰다. 저장 6주 후 결과는, 모든 SBE-β-CD 함유 제형은 PEG-4000의 사용을 기반으로 한 제형 및 SBE-β-CD가 없는 제형과 달리 안정하였음을 나타내었다.
SBE-β-CD와 PEG 기재 제형 간의 비교는 SBE-β-CD 사용의 이점을 입증한다. PEG 기재 제형은 -20℃에서 저장 후에 상당히 응집 및 미립자화되었다(도 16).
실시예 13: AMG 330을 위한 동결건조된 제형을 위한 부형제로서의 2종의 사이클로덱스트란(SBE-β-CD 및 α-사이클로덱스트린)의 평가
본 실험은 BiTE(등록상표) 분자를 위해서 동결건조된 제형을 개발할 수 있는 플랫폼을 결정하기 위해서 수행되었다. AMG 330 BiTE(등록상표)를 모델 단백질로서 사용하였다. 2종의 사이클로덱스트린(SBE-β-CD 및 α-사이클로덱스트란)을 제형 부형제로서 평가하였다.
물질 및 방법:
AMG 330 약물 물질 농도는 0.4㎎/㎖이다. AMG 330을 밀리포어 센트리프렙스(30KNMWL, 15㎖)를 사용하여 각각의 완충제(표 17에 열거됨) 내에서 완충제 교환시켰다:
1. 30㎖의 AMG 330 DS를 제형당 2개(2 x 15㎖)의 센트리프렙 샘플 용기에 분취함
2. 4.4㎖의 상응하는 제형 완충제를 각각의 센트리프렙 여과액 수집기에 첨가함(DS의 과농축을 예방하기 위함)
3. 1500 x g에서 20분 동안 25℃에서 원심분리함(알레그라 6R 센트리퓨즈, 베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아 소재)(평형까지 원심분리함); 약 5㎖의 단백질이 각각의 샘플 용기에 남아있고, 1.2㎎/㎖ 표적으로 3-배 농축함
4. 각각의 여과액 수집기에서 여과액을 경사처리하고, 4.4㎖의 새로운 제형 완충제로 대체하고; 10㎖의 새로운 제형 완충제를 각각의 샘플 용기에 넣음
5. 단계 3에 따라서 원심분리함
6. 단계 4 내지 5를 4회 더 반복함(총 5회의 완충제 교환; 약 243-배의 총 희석)
7. 4℃에서 완충제-교환된 물질 O/N을 저장함
Figure pct00047
제형 완충제 및 계면활성제 스톡을 첨가하여 최종 제형화된 물질을 생성하였다. 샘플을 제형당 총 4개의 바이알로 5cc 유리 바이알(스코트 유형(Schott Type) 1A)에 2㎖의 부피로 충전시켰다. 모든 샘플을 충전 전에 스터리벡스 필터 유닛(0.22㎛)을 사용하여 멸균 후드에서 여과하였다. 충전 후 바이알을 동결건조를 위해서 고무 마개로 느슨하게 닫았다(도 17a).
제형당 3개의 바이알을 변형된 보존성 동결건조 사이클(-17℃ 어닐링 온도, 66시간 총 사이클 시간)을 사용하여 동결건조시켰다. 제형당 남아있는 1개의 바이알을 t=0(동결건조전) 분석을 위해서 남겨두었다. 재구성 전, 리오 케이크를 구조적 온전성 및 고상함에 대해서 시각적으로 조사하였다. 동결건조된 샘플을 1.96㎖의 밀리-Q 수로 재구성하고, 추가 분석을 위해서 완전히 용해될 때까지 빙빙 돌렸다. 동결건조 전 샘플 및 구성 후 샘플을 분석용 SEC 및 마이크로 유동 영상화(micro flow imaging: MFI)에 의해서 분석하였다.
SEC 결과는, SBE-β-CD 함유 제형이 α-사이클로덱스트란을 갖거나 사이클로덱스트란을 전혀 갖지 않는 제형에 비해서 동결건조 전 및 동결건조 후에 더 낮은 수준의 HMW 종을 생성하였음을 보여주었다. 다른 제형 부형제(수크로스, 글라이신, 만니톨)는 HMW 종의 수준에 유의하게 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다(도 17b, c).
MFI는, 동결건조 후에 대부분의 제형에 대해서 눈에 보이지 않는 입자(주로 1 내지 2㎛ 범위)의 적당한 증가를 보여었다. α-사이클로덱스트란 제형 중 하나, C60AcL에 대해서 극적인 증가가 관찰되었다. 2종의 SBE-β-CD(캡티솔) 함유 제형, C60CpT 및 C60CpMSuT는 동결건조 후 눈에 보이지 않는 입자를 가장 적게 함유하였다(도 17d).
실시예 14: SBE-β-CD 및 α-사이클로덱스트란을 포함하는 Fap 알파 BiTE (등록상표) 의 소규모 제형 연구(UFC, LLPS 및 F/T).
본 실험의 목적은 다양한 제형에서 다양한 스트레스 후 FAP 알파 BiTE(등록상표)의 안정성을 평가하는 것이다. 구체적으로, LLPS, 20회의 동결/해동(F/T) 사이클 및 초미세여과/원심분리(UFC)에 의한 농축 이후에 FAP 알파 BiTE(등록상표)(서열번호 177)를 평가하였다. 유사한 제형을 갖는 이전 연구로부터의 결과는 SBE-β-CD가 AMG 330 BiTE(등록상표) 안정성에 대해서 이로운 긍정적인 효과를 갖는다는 것을 나타내었고, 본 연구에서는 FAP BiTE(등록상표)에 대한 SBE-β-CD의 효과를 조사하였다.
물질 및 방법:
30㎖의 완충제를 시험된 각각의 제형을 위해서 제조하였다.
Figure pct00048
각각의 샘플을 위해서, 375㎕의 2.65㎎/㎖ FAP 알파 BiTE(등록상표)(10mM 인산칼륨, 161mM 아르기닌(pH 7.6) + 4% 트레할로스 중에 제형화됨)를 MWCO 10,000의 아미코눌트라 4㎖ 원심분리 필터 튜브에 넣었다. 3.5㎖의 적절한 완충제를 각각의 튜브에 첨가하고, 단백질과 약하게 혼합하고, 농축물 부피가 약 50uL일 때까지 25C에서 4000rcf에서 튜브를 원심분리하였다(알레그라 6R 센트리퓨즈, 베크만 쿨터, 미국 캘리포니아주 브레아 소재). 완충제 첨가 및 원심분리 단계를 3회의 농축 단계 동안 2회 더 반복하였다. 이어서 농축물을 피펫터로 약하게 혼합하고, 필터 튜브로부터 제거하고, 에펜도르프 튜브에 넣고, 2분의 최대 속도에서 마이크로-원심분리하였다(에펜도르프 센트리퓨즈 5418, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재). 이어서 상청액을 SEC에 의해서 분석하였다. 각각의 샘플을 2회 반복물로 제조하였다. 농축되지 않은 FAP 알파 BiTE(등록상표)(2.65㎎/㎖)을 또한 비교 목적을 위해서 분석하였다.
SBE-β-CD의 존재는, 단백질 농축 동안 HMW 종의 형성을 억제함으로써 상대적인 SEC 주피크를 증가시키는 것으로 보였다. α-사이클로덱스트란의 존재는 매우 낮은 단백질 회수 및 HMW 종의 높은 상대적인 수준을 초래하였다.
Fap 알파 LLPS 결과: Fap α BiTE(등록상표) 및 SBE-β-CD를 사용한 LLPS 결과는 AMG 330을 사용한 LLPS 결과와 대등하다. α-사이클로덱스트란은 이 분자의 콜로이드 안정성에 어떠한 긍정적이거나 부정적인 효과를 나타내지 않았다(도 18).
실시예 15: CD33-scFc BiTE 항체 작제물에 대한 제형 연구
CD33-scFc BiTE 항체 작제물을 단백질 A 및 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용하여 정제하였다. CEX 용리물을 pH 4.2에서 10kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 막을 함유하는 투석 카세트를 사용하여 10mM L-글루탐산 완충제 중에서 투석시켰다. 투석을 2 내지 8℃에서 수행하였다. 투석된 풀 물질의 농도는 총 2.3㎎/㎖였다. 물질을 10kDa의 MWCO를 갖는 막을 함유하는 농축기 튜브를 사용하여 초미세여과 원심분리(UFC)를 통해서 추가로 농축시켰다. 농축된 물질을 0.22㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통해서 여과하였다. 여과 후 농도는 총 2.7㎎/㎖였다. 물질을 농축된 스톡 용액을 스파이킹함으로써 표 19에 열거된 제형 중에 완전히 제형화하였다. 최종 단백질 농도는 총 1.0㎎/㎖였다.
Figure pct00049
제형을 2R 유형 I 유리 바이알에 1.0㎖로 충전시키고, 이것을 부틸 고무 마개 및 알루미늄 플립 오프 시일(aluminum flip off seal)로 닫았다. 바이알을 -20 및 -70℃에서 저장하였다. 샘플을 지정된 시간 지점에서 열었다. 샘플링 바이알을 주변 온도에서 해동시키고, 고분자량 종의 함량 백분율을 정량분석하기 위해서 크기 배제 초고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)를 통해서 분석하였다. SE-UPLC를 어퀴티 H-클래스 UPLC 시스템(워터스) 상에서 어퀴티 UPLC BEH200 SEC 150㎜ 칼럼(워터스)을 사용하여 수행하였다. 칼럼 온도를 25℃로 설정하였다. 0.4㎖/분의 유량을 사용하여 등용매 방법(isocratic method)을 적용함으로써 크기 변이체의 분리를 달성하였다. 이동상은 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl(pH 6.8)로 구성되었다. 실시 시간은 총 6.0분이다. 샘플을 8℃에서 분석 시까지 오토샘플러 내에 유지시켰다. 총 3㎍ 양의 단백질을 주입하였다. 캐리 오버를 회피하기 위해서 40% ACN으로의 중간 주입을 각각의 샘플 이후에 수행하였다. 검출은 형광을 기반으로 하였다(여기 280㎚, 방출 325㎚). 피크 적분을 엠파워(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. HMWS의 곡선 하 상대 면적을 기록하였다(도 18).
-70℃ 이하에서의 제형화된 CD33-scFc BiTE 항체 작제물의 저장은 HMWS의 형성을 저해하였다. 그러나, HMWS는 HPBCD를 함유하지 않는 제형의 경우 -20℃에서 저장 동안 상당히 증가하였다. 이에 반해서, 이 단백질은 이의 농도(6 또는 12%)와 관계없이 HPBCD의 존재 하에서 -20℃에서 HMWS의 형성이 예방되었다. 만니톨의 존재는 HMWS의 증가가 나타내는 바와 같이 -20℃에서 안정성에 해로웠다.
실시예 16: FLT3-scFc BiTE 항체 작제물에 대한 제형 연구
2종의 상이한 FLT3-scFc BiTE 항체 작제물(FL1-scFc 및 FL2-scFc)을 단백질 A 및 CEX 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. CEX 후 모든 작제물을 pH 4.2에서 10mM L-글루탐산, 4%(w/v) 수크로스로 구성된 완충제 중에서 투석여과하였다. 사용된 막의 MWCO는 10kDa이었다. 투석여과된 풀(단백질 농도 1.7㎎/㎖)을 7.6㎎/㎖의 농도가 달성될 때까지 초미세여과(10kDa의 MWCO)를 통해서 농축시켰다. 이어서, 물질을 0.2㎛ 필터를 통해서 여과하고, 부형제 스톡 용액으로의 스파이킹을 통해서 완전히 제형화하였다. 제형의 개요를 표 20에 제공한다.
Figure pct00050
제형을 2R 유형 I 유리 바이알에 1.3㎖로 충전시키고, 이것을 부틸 고무 마개 및 알루미늄 플립 오프 시일로 닫았다. 바이알을 -20℃에서 저장하였다. 샘플을 지정된 시간 지점에서 열었다. 샘플링 바이알을 주변 온도에서 해동시키고, 고분자량 종의 함량 백분율을 정량분석하기 위해서 크기 배제 초고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)를 통해서 분석하였다. SE-UPLC를 어퀴티 H-클래스 UPLC 시스템(워터스) 상에서 어퀴티 UPLC BEH200 SEC 150㎜ 칼럼(워터스)을 사용하여 수행하였다. 칼럼 온도를 25℃로 설정하였다. 0.4㎖/분의 유량을 사용하여 등용매 방법(isocratic method)을 적용함으로써 크기 변이체의 분리를 달성하였다. 이동상은 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl(pH 6.8)로 구성되었다. 실시 시간은 총 6.0분이다. 샘플을 8℃에서 분석 시까지 오토샘플러 내에 유지시켰다. 총 3㎍ 양의 단백질을 주입하였다. 캐리 오버를 회피하기 위해서 40% ACN으로의 중간 주입을 각각의 샘플 이후에 수행하였다. 검출은 형광을 기반으로 하였다(여기 280㎚, 방출 325㎚). 피크 적분을 엠파워(등록상표) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. HMWS의 곡선 하 상대 면적을 기록하였다(도 19).
실시예 17: BCMA-scFc BiTE 항체 작제물에 대한 제형 연구
2개의 BCMA-scFc BiTE 항체 작제물(BC1-scFc 및 BC2-scFc)을 실시예 16에 기술된 바와 같이 정제, 제형화, 저장 및 분석하였다. 제형의 개요를 표 21에 제공한다.
Figure pct00051
도 20은 두 항체 작제물 모두의 경우 제형의 기능에서 HMWS 백분율 함량을 나타낸다. HMWS의 백분율 함량은 각각 4주 후 HPBCD 무함유 제형에서 1.6%(BC1-scFc) 및 1.9%(BC-scFc) 증가하였다. 이에 반해서, HMWS 형성은 6% HPBCD 함유 제형에서 저해되었다.
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN RESEARCH (MUNICH) GMBH AMGEN INC. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING BISPECIFIC ANTIBODY CONSTRUCTS <130> IPA180767-DE <140> PCT/EP2017/051486 <141> 2017-01-25 <150> US 62/286,552 <151> 2016-01-25 <160> 188 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Ile Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Ser <210> 6 <211> 14 <212> PRT 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Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr 485 490 495 Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 500 505 510 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 515 520 525 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 530 535 540 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 545 550 555 560 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 565 570 575 Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr 580 585 590 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 595 600 605 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 610 615 620 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 625 630 635 640 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 645 650 655 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 660 665 670 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 675 680 685 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 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Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 500 505 510 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 515 520 525 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 530 535 540 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 545 550 555 560 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu 565 570 575 Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 580 585 590 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 595 600 605 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 610 615 620 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 625 630 635 640 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 645 650 655 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 660 665 670 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 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Pro Pro Ser Arg Glu Glu 885 890 895 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 900 905 910 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 915 920 925 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 930 935 940 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 945 950 955 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 965 970 975 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 980 985 <210> 187 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 187 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His 20 25 30 Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Pro Gly Tyr His Ala Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 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Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Pro Gly Tyr His Ala Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Arg Asp Thr Asp Val Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Thr 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 260 265 270 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 275 280 285 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 290 295 300 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr 305 310 315 320 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 325 330 335 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 340 345 350 Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 385 390 395 400 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly 405 410 415 Ala Val Thr Ser Gly Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly 420 425 430 Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly 435 440 445 Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 450 455 460 Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val 465 470 475 480 Leu Trp Tyr Ser Asn Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 485 490 495 Val Leu Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 500 505 510 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 515 520 525 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 530 535 540 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 545 550 555 560 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu 565 570 575 Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 580 585 590 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 595 600 605 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 610 615 620 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 625 630 635 640 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 645 650 655 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 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870 875 880 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 885 890 895 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 900 905 910 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 915 920 925 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 930 935 940 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 945 950 955 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 965 970 975 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 980 985

Claims (14)

  1. 약제학적 조성물로서, 제1 결합 도메인을 통해서 표적 세포 표면 항원에 결합하고, 제2 결합 도메인을 통해서 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물, β-사이클로덱스트린 및 완충제를 포함하되, 상기 조성물은 안정한, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 β-사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린, 메틸-β-사이클로덱스트린, 하이드록시에틸-β-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 에틸-β-사이클로덱스트린, 부틸-β-사이클로덱스트린, 석신일-(2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(2,3,6-트라이-O-메틸)β-사이클로덱스트린, 헵타키스(2,3,6-트라이-O-벤조일)-β-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 포스페이트 나트륨염, β-사이클로덱스트린 설페이트 나트륨염, 트라이아세틸-β-사이클로덱스트린, 헵타키스(6-O-설포)-β-사이클로덱스트린 헵타나트륨염, 카복시메틸-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 6-O-p-톨루엔설폰일-β-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 β-사이클로덱스트린은 0.1% 내지 20%(w/v), 바람직하게는 0.5% 내지 2%(w/v), 보다 바람직하게는 0.8% 내지 1.5%(w/v) 범위의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β-사이클로덱스트린은 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물은 0.1 내지 5㎎/㎖, 바람직하게는 0.2 내지 2.5㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.25 내지 1.0㎎/㎖의 범위의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제는 인산칼륨, 아세트산/아세트산나트륨, 시트르산/시트르산나트륨, 석신산/석신산나트륨, 타타르산/타타르산나트륨, 히스티딘/히스티딘 HCl, 글라이신, 트리스(Tris), 글루타메이트, 아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 완충제는 인산칼륨, 시트르산/시트르산나트륨, 석신산, 히스티딘, 글루타메이트, 아세테이트 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 pH는 4 내지 7.5 범위인, 약제학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 솔비톨, 아르기닌, 라이신, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 폴록사머(poloxamer) 188, 플루로닉(pluronic) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부형제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 보존제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 1종 이상의 보존제는 벤질 알코올, 클로로부탄올, 페놀, 메타-크레졸, 메틸파라벤, 페녹시에탄올, 프로필파라벤 및 싸이오머로잘로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 상기 제1 결합 도메인은 CD19, CD33, MSLN, FLT3 또는 BCMA에 결합하는, 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 이중특이적 단일 쇄 작제물의 상기 제1 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 99, 109, 119, 128, 137, 146, 155, 164, 173, 183, 185 및 187로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 이중특이적 단일 쇄 작제물의 상기 제2 결합 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 9, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 179 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제형은 보존제가 존재하지 않고, 상기 이중특이적 단일 쇄 항체 작제물의 상기 아미노산 서열은 서열번호 100 또는 110이고, 상기 작제물은 약 0.5㎎/㎖의 농도로 존재하고, 상기 사이클로덱스트린은 약 1%(w/v)의 농도의 설포부틸에터-β-사이클로덱스트린 나트륨염이고, 상기 완충제는 약 10mM의 농도의 인산칼륨이고, 상기 제형은 약 6.0의 pH에서 약 8%(w/v)의 농도의 수크로스 및 약 0.01%(w/v)의 농도의 폴리솔베이트 80을 더 포함하는, 약제학적 조성물.
KR1020187023934A 2016-01-25 2017-01-25 이중특이적 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물 KR20180100439A (ko)

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