EA009123B1

EA009123B1 - Парентеральные композиции пептидов для лечения системной красной волчанки

Info

Publication number: EA009123B1
Application number: EA200501131A
Authority: EA
Inventors: Шарон Кохен-Веред; Эсмира Нафтали; Вера Вайнштейн; Адриан Гилберт; Эти Клингер
Original assignee: Тева Фармасьютикал Индастриз, Лтд.
Priority date: 2003-01-14
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2007-10-26
Also published as: EA200501131A1; NO20053773L; EP1594434A4; WO2004064787A2; CA2513320A1; CA2513320C; JP2011173888A; JP2006517540A; CN1774259A; IL169574A0; CO5640143A2; AU2004206842A1; EP1594434B1; JP4817068B2; CN1774259B; NO20053773D0; CR7938A; WO2004064787A3; DK1594434T3; IS7972A

Abstract

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей водный носитель; от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли а) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большое 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (i) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Id-антитела, или (ii) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ у мышей, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), или b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8-17, или с) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие любую последовательность из а) и b) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (a) (i), (a) (ii) и (b) (i) - (b) (x), или d) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичных последовательности, включенных в (a)(i), (a)(ii) и (b)(i)-(b)(x); и усилитель растворимости, в которой и пептид, и усилитель растворимости растворены в водном носителе; и при этом композиция имеет рН от 4 до 9, и к способу ослабления симптомов СКВ у человека посредством введения эффективного количества композиции.

Description

Данная заявка содержит притязания на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 60/439918, поданной 14 января 2003г., полное содержание которой, таким образом, включено в виде ссылки.

В данной заявке ссылки на различные публикации даны посредством полного цитирования. Описания указанных публикаций в полном объеме включены при этом в данную заявку в виде ссылки, чтобы более полно описать состояние уровня техники, которое известно специалистам на дату изобретения, описанного и заявленного в данном описании.

Уровень техники

Системная красная волчанка (СКВ) или волчанка является ослабляющим здоровье аутоиммунным заболеванием, характеризующимся наличием множества аутоантител, включая антитела к днДНК, к ядерным антигенам и к рибонуклеопротеинам. СКВ поражает примерно 1 из 2000 человек (в США 1 из 700 женщин). Заболевание, главным образом, поражает молодых женщин при соотношении женщин к мужчинам, составляющем примерно 9:1.

Системная красная волчанка может поражать почти любой орган или систему организма. Системная красная волчанка может включать периоды, когда выражено немного симптомов, если они вообще выражены (ремиссия), и другие периоды, когда заболевание становится более активным (вспышка). Наиболее часто, когда люди упоминают волчанку, они относят ее к системной форме заболевания.

Кортикостероиды являются главной опорой при лечении системных аутоиммунных заболеваний. Угрожающие жизни, приводящие к тяжелой инвалидности проявления СКВ лечат высокими дозами глюкокортикоидов (1-2 мг/кг/сутки). Нежелательные эффекты хронического введения глюкокортикоидов включают множество заметных неблагоприятных эффектов, таких как кушингоидный габитус, ожирение центрального действия, гипертония, инфекция, ломкость капилляров, гирсутизм, усиленный остеопороз, катаракты, сахарный диабет, миопатия и психоз. Кроме токсичности кортикостероидов соблюдение пациентами схемы дозирования также представляет собой серьезную проблему.

Для борьбы с активным заболеванием также используют цитотоксические агенты, снижающие частоту вспышек заболевания и уменьшающие потребность в стероидах. Нежелательные побочные эффекты последних включают угнетение костного мозга, повышенную частоту инфекций оппортунистическими организмами, необратимую недостаточность функции яичников, алопецию и повышенный риск злокачественных новообразований.

СКВ является воспалительным заболеванием, для которого до настоящего времени не существует определенного способа лечения или средства. Заболевание приводит к острым и хроническим осложнениям. Единственными способами лечения являются паллиативные способы, предназначенные для снятия острых симптомов и предотвращения хронических осложнений, часто с сильными побочными эффектами. Поэтому существует неудовлетворенная потребность в данной области, и врачи, и пациенты были бы рады новым способам лечения, которые потенциально могли бы устранить или уменьшить нежелательные проявления болезни.

Несмотря на всестороннее исследование механизмов, лежащих в основе индукции СКВ, информация об этиологии заболевания очень ограничена. До недавнего времени исследования СКВ проводились с использованием лимфоцитов периферической крови (РВЬ) пациентов на разных клинических стадиях и при использовании разных протоколов лечения. Альтернативно, в качестве модели СКВ исследовали линии мышей, у которых развивается спонтанное СКВ-подобное заболевание. Данный вид анализа приводит к неполным и запутанным интерпретациям роли различных иммунологических и неиммунологических факторов либо в индукции, либо в поддержании заболевания, главным образом, вследствие гетерогенности пациентов, с одной стороны, и невозможности контролировать фазу индукции заболевания в линиях мышей с СКВ, с другой стороны.

Несколько лет назад разработана модель СКВ на животных. В указанной модели, основанной на концепции идиотипической сети, формировался широкий спектр связанных с волчанкой аутоантител и клинические проявления (Μβηάίονίε, 8. е! а1. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 85: 2260 (1988)). Индукцию осуществляли иммунизацией линий мышей, у которых не развивается какое-либо спонтанное аутоиммунное заболевание, с помощью человеческого моноклонального антитела против ДНК (мАт), которое несет общий идиотип, названный 16/6 1б (81юепГе1б. Υ. е! а1., 1. Ехр. Меб. 158: 718 (1983)).

Человеческое мАт 16/6 является анти-ДНК-антителом исходного изотипа 1дМ и в культуре переключаемого на 1дС1. мАт получали от пациента, и они несут общий идиотип, 16/6 1б (81юепГе1б е! а1., 1983; Мепб^ю е! а1., 1988). Клетки гибридомы, секретирующие указанное мАт, обычно выращивают в культуре и антитело выделяют из надосадков культур, используя аффинную колонку с белком О, связанным с сефарозой. Человеческое анти-ДНК-мАт 16/6 (1дО1/к) описано в 81оепГе1б, Υ. е! а1., 1. Ο1ίη. 1пте51. 70: 205-208 (1982) и в Аа1зтап, А. е! а1., Ιη!. 1ттипо1. 7: 689-696 (1995).

После иммунизации мыши продуцировали антитела, специфичные по отношению к 16/6 1б, антитела, которые несут 16/6 1б, и антитела, направленные против разных ядерных антигенов (днДНК, онДНК, 8т, рибонуклеопротеидну (РНП), Во, Ьа и др.). Серологические данные были связаны с лейкопенией, повышенной скоростью оседания эритроцитов, протеинурией, избытком иммунных комплексов в почках и склерозом клубочков (Мепб^ю е! а1., 1988), которые являются типичными проявлениями СКВ. Кроме

- 1 009123 того, было показано, что экспериментальное заболевание может быть индуцировано мышиным анти-16/6 1б-мАт (Мепб1оу1с, 8. е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 19: 729 (1989)) и мышиным анти-анти-16/6 И (16/6 1б+)-мАт (№а18шаи, А. е! а1., 1п!егпаб. 1ттипо1. 5: 1293 (1993); №аЕтап, А. апб Мохез, Е. Еиг. 1. 1ттипо1. 23: 1566, (1993)). Индукция заболевания регулируется генетически и, таким образом, зависит от линии (Мепб1оу1с, 8. е! а1., 1шшипо1оду 69: 228 (1990)). Указанная уникальная модель индукции экспериментальной СКВ обеспечивает подходящие средства для ясного анализа различных стадий и связанных иммунных параметров, вовлеченных в индукцию и развитие СКВ.

СКВ является системным аутоиммунным заболеванием, характеризующимся образованием аутоантител против собственных антигенов, таких как ДНК, 8т, Ко, Ьа, РНП, кардиолипин и гистоны. Этиология СКВ неизвестна, и понимание механизма, посредством которого возникают указанные аутоантитела, дало бы возможность в этом разобраться. Обнаружено, что моноклональные аутоантитела, которые способны вызывать появление антител, которые несут 16/6 И или взаимодействуют с ним, являются патогенными и, таким образом, способны индуцировать экспериментальную СКВ (Риеке, Н. е! а1., 1п!егпа!1. 1ттипо1. 2: 225 (1990); 811тоедег. Ζ.Μ. е! а1., 1. С1ш. 1шшипо1. 13: 127 (1993)). Секвенированы вариабельные (V) области девяти аутоантител, которые связываются либо с ДНК, либо с экстрактом ядер (ΝΕ) НеЬа, выделенные из организма мышей С3Н.8У с экспериментальной СКВ (№ащтап апб Мохез, 1993). Анализировали моноклональные антитела с разной специфичностью, чтобы попытаться определить связи между разными аутоантителами. Обнаружено, что три мАт связываются с ДНК, и было показано, что они имеют признаки последовательности, характерные для патогенных анти-ДНК-антител. Показано, что в одном из указанных мАт, названном 2С4С2, используется ген ν-области тяжелой (Н) цепи (У_Н), идентичный ν_Η анти-ДНК-мАт, выделенного из других склонных к развитию волчанки мышей, а именно (ΝΖΒχΝΖ№)Ρ1. Ген ν-области легкой (Ь) цепи (У_ъ) мАт 2С4С2 на 98% гомологичен V другого антиДНК-мАт, также выделенного от мышей (ΝΖΒχΝΖ№)Ρ1. Два других анти-ДНК-мАт, названных 5012-4 и 5012-6, имеют 93% общих последовательностей ν_Η с последовательностями мАт 2С4С2. Шесть мАт связывают белки ΝΕ НеЬа. Девять мАт используют всего пять генов ν_Η и четыре гена VI, зародышевой линии, свидетельствуя, что аутоантитела, индуцированные у мышей с экспериментальной СКВ, не происходят из одного клона В-клеток. Три из девяти У_Н и VI, оказались идентичными по последовательности генам зародышевой линии, тогда как по меньшей мере три других имели соматические мутации. Последнее подтверждает, что указанные аутоантитела возникают у мышей как при использовании существующих (непримированных) В-клеток, так и посредством запускаемого антигеном процесса. Кроме того, очевидно, что в случае аутоантител, обнаруженных у мышей с экспериментальной СКВ, используются генетические элементы, сходные с элементами, используемыми в мАт, которые выделяли из линий мышей, у которых волчанка развивается спонтанно.

Т-клетки играют важную роль в индукции и развитии экспериментальной СКВ. Так, было показано, что Т-клеточные линии и клоны, специфичные к 16/6 И, индуцируют экспериментальную СКВ у сингенных реципиентов подобно 16/6-антителу. Поэтому после инокуляции активированных клеток линий у мышей развивались как серологические признаки, так и повреждение почек, которое типично для СКВ (Еиске, Н. е! а1., 1тшипо1оду 73: 421 (1991)). Кроме того, 16/6 И-специфичная линия Т-клеток, происходящих от мышей С3Н.8У, индуцировала СКВ у мышей С57ВЬ/6, которые, как было показано, резистентны к индукции заболевания после инъекций либо 16/6 16-, либо анти-16/6 И-мАт (Мепб1оу1с е! а1., 1990).

При попытке идентифицировать патогенную область 16/6 И были получены (РаЬ')₂-фрагменты 16/6 И-мАт, и обнаружено, что они сохраняют специфичность и патогенную способность целой молекулы 16/6 И (ΚΗζ, Р.Г, е! а1., 1шшип. Ье!. 41: 79 (1994)).

мАт 5012, которое было выделено из организма мышей с экспериментальной СКВ и которое, как было показано, связывается с ДНК и несет 16/6 И, способно индуцировать экспериментальную СКВ у мышей (УаЕшап, А. е! а1., 1п!егпаб. 1шшипо1. 5: 1293 (1993)). Т-клетки, которые специфично реагируют на мАт пролиферацией, вероятно, реагируют на пептиды, представляющие последовательности из их областей, определяющих комплементарность (СИК). Весьма вероятно, что Т-клетки узнают ν-области указанных выше антител, так как они не реагируют с другими антителами, которые несут такую же константную область, но имеют другие специфичности. В пределах вариабельной области наиболее вероятно узнаваемыми областями являются СИК, так как они представляют собой области, которые наиболее различаются среди разных антител. СИК-области последовательностей УН девяти патогенных мышиных мАт, указанных выше, которые индуцируют СКВ у мышей, заключены в прямоугольники на фиг. 1 в работе \Уз151пзп апб Мохез, 1993, на которой представлены полные нуклеотидные и рассчитанные аминокислотные последовательности УН девяти мАт.

В экспериментальных моделях СКВ - мыши Ва1Ь/с и склонные к СКВ мыши, т.е. мыши (ΝΖΒχΝΖ№)Ρ1 - лечение либо пептидами, основанными на шСИК, либо соединением 1 значимо снижало связанные с СКВ показатели, особенно отложения иммунных комплексов (1СИ) в почке, протеинурию и лейкопению. Лечение не оказывало влияния на 16/6 И-специфичный гуморальный ответ (УаЕшащ А., е! а1. Моби1а!юп о£ шитпе 5У51ет1с 1ири5 егу!йеша!о8И8 \νί11ι рерббез Ьазеб оп сошр1ешеп!агйу бе1егтттд гещопз о£ рабюдешс αιιΙί-ΟΝΛ топос1опа1 апйЬоИез. Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8с1. И.8.А. (1997), 94(4): 620; Еба!,

- 2 009123

Е., е! а1. РгеуеШюп οί кук!етк 1ирик егу1Ьета!окик-11ке Фкеаке ίη (ΝΖΒχΝΖ\)Ε1 т1се Ьу 1гса11пд \νίΐΗ ί.’ΌΡ1- апй СЭРЗ- Ьакей рерЬйек οί раНодешс аи!оап!1Ьойу. ί. С1ш. 1ттипо1. (2000), 20: 268; Ейа!, Е., е! а1. ТЬе тесЬашкт Ьу \\'1ис11 а рерПйе Ьакей оп сотр1етеп!агйу йе1егттшд гедюп-1 οί раНодешс πηΐι-ΩΝΆ апйЬойу ате1юга!ек ехрептеп!а1 8ЬЕ (2001), Ргос. №11. Асай. δα. И.8.Л. 98: 1148).

СОРТ человека, соединение 1, показанное на фиг. 1, является синтетическим пептидом из 19 аминокислот, основанным на определяющей комплементарность области 1 (СЭР1) анти-днДНК-мАт человека, названного 16/6 1й (Уа1ктап, А., е! а1. Мойи1аЬоп οί типпе кук!етю 1ирик егу1Ьета!окик ννίΐΠ рерПйез Ьакей оп сотр1етеп!агйу йе!егт1шпд гедюпк οί ра!Ьодешс παί-ΩΝΑ топос1опа1 апЬЬоФек. Ргос. №!1. Асай. 8οΐ. И.8.А. (1997), 94 (4): 4620-4625).

Указанные пептиды, подобно многим пептидам, не очень хорошо растворимы. Поэтому в данной заявке предлагаются композиции, которые улучшают растворимость пептидов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей водный носитель;

от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли

a) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (ί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СЭЯ) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 1й-антитела, или (ίί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СЭЯ) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, или

b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность (ί) ТСУУХ₁Х₂Х₃Х₄Х₅р8РЕК8ЕЕУ1С (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 11), где Х₁ означает МеЕ А1а или Уа1; Х₂ означает С1п, Акр, С1и или Агд; Х₃ означает Тгр или А1а; Х₄ означает Уа1 или 8ет и Х₅ означает Ьук, С1и или А1а;

(ίί) ЕЮТЗТбСХ^Х^^юХпХ^КАКАТ (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 12), где Х₆ и Х₇, каждый означает ТЬг, Уа1 или А1а; Х₈ означает Туг или РЬе; Х₉ означает Акп или Акр; Х₁₀означает С1п или С1и; Х₁₁ означает Ьук или С1и и Х₁₂ означает РЬе или Туг;

(ш) УУСАЯХвХмХ^Хп^АХпХ^УСрСЗ (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 13), где Х₁₃ означает РЬе, ТЬг или С1у; Х₁₄ означает Ьеи, А1а или 8ет; Х₁₅ означает Тгр или А1а; Х₁₆ означает С1и или Ьук; Х₁₇ означает Ме! или А1а и Х₁₈ означает Акр, Ьук или 8ет;

(ίν) СУХХ Х;₎Х₂1Х₂₂Х₂₃Х₂48НОХ₂₅Х26ЬЕУ1О (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 14), где Х₁₉ означает Ме! или А1а; Х₂₀ означает Акп, Акр или Агд; Х₂₁ означает Тгр или А1а; Х₂₂ означает Уа1 или 8ет; Х₂₃ означает Ьук или С1и; Х₂₄ означает С1п или А1а; Х₂₅ означает Ьук или С1и и Х₂₆ означает 8ет или А1а;

(ν) УУСАЯХ^Х^Х^УСХэдХ^Х^СрТЕ (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 15), где Х₂₇ означает 8ет или РЬе; Х₂₈ означает С1у или А1а; Х₂₉ означает Агд, А1а или С1и; Х₃₀ означает Акп или Акр; Х₃₁ означает Туг или РЬе и Х₃₂ означает Тгр, Н1к или А1а;

(νί) ХззУУУ8У1Хз4рХз5РХз6Хз7ОХз8ЕУ1О (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 16), где Х₃₃ означает С1у или ТЬг С1у; Х₃₄ означает Агд или Ьук; Х₃₅ означает Рго или 8ет; Х₃₆ означает С1у или С1и; Х₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈ означает С1и, Ьеи или 8ет;

(νίί) УУСАЯХЛ.ЕХ^ .Х .\₄;Х_4;ХА)\П¥Х₄₅С1Х₄₆1)С (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 17), где Х₃₉ означает С1у или РЬе; Х₄₀ означает Агд или А1а; Х₄₁ означает С1у или А1а; Х₄₂ означает С1у или А1а; Х₄₃ означает Тгр или А1а; Х₄₄ означает Акп или А1а; Х₄₅ означает Туг или Тгр; Х₄₆ означает Ме! или С1п;

(νίίί) Е8СУУУ8 (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 8);

(ίχ) Е!ХН868ТКУКТ8ЕК8 (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 9); или (χ) С1ЕЕЯС1С1\\'Х1)У1)УУУС1\11)У (8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 10), или

c) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие любую последовательность из а) и Ь) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (а)(1), (а)(и) и (Ь)(1)-(Ь)(х), или

й) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (а)(1), (а)(и) и (Ь)(1)(Ь)(х); и усилитель растворимости, выбранный из группы, состоящей из диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, №метил-2-пирролидинона, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и замещенного β-циклодекстрина, в которой и пептид, и усилитель растворимости растворены в водном носителе; и при этом композиция имеет рН от 4 до 9.

Настоящее изобретение также относится к способу ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающему в себя введение человеку любой из фармацевтических компози

- 3 009123 ций согласно изобретению в количестве. эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. СЭК1 человека (соединение 1) в виде ацетатной соли - показаны молекулярная и структурная формулы ЙСЭК1. аминокислотная последовательность и физические параметры.

Фиг. 2. Секреция 1Ь-2 из клеток. взятых от мышей. обработанных раствором соединения 1 и каптизолом. после того. как затем клетки были активированы раствором соединения 1 в РВ8.

- соединение 1 (К8) 50 мкг/мышь.

- соединение 1 (К8) 200 мкг/мышь.

- ΌΡ 50 мкг/мышь.

- ΌΡ 200 мкг/мышь.

- 12% каптизол в ампулах.

Фиг. 3. Секреция ΙΕΝ-γ из клеток. взятых от мышей. обработанных раствором соединения 1. после того. как клетки были затем активированы раствором соединения 1 в ЕМ-1 (2.5х10⁶ клеток/лунку).

- плацебо.

-А-Δ-Δ-X- соединение

- соединение

50 мкг/мышь (лечебная доза).

100 мкг/мышь (лечебная доза).

200 мкг/мышь (лечебная доза).

- соединение

Фиг. 4. Секреция ΙΕΝ-γ из клеток. взятых от мышей. обработанных раствором соединения 1. после того. как клетки были затем активированы раствором соединения 1 в ЕМ-1 (5х 10⁶ клеток/лунку).

- плацебо.

-Δ-X_ * _

- соединение 1 25 мкг/мышь.

50 мкг/мышь.

100 мкг/мышь.

200 мкг/мышь.

- соединение

Фиг. 5. Анти-днДНК-антитела у мышей (ΝΖΒχΝΖν)Ε1 после 10 инъекций соединения 1 в каптизоле |ОЭ=оптическая плотность; соединение 1 (С) = соединение 1. растворенное в каптизоле].

- плацебо.

- соединение 1 50 мкг/мышь.

- соединение 1 25 мкг/мышь.

-0-оФиг. 6. Срезы почек от мышей (ΝΖΒχΝΖ\ν)Ε1. показывающие интенсивность отложений иммунных комплексов. Срезы в верхнем ряду получены от мыши. обработанной каптизолом. срезы среднего ряда от мыши. обработанной 50 мкг/мышь соединения 1. и срезы нижнего ряда от мыши. обработанной 25 мкг/мышь соединения 1.

Увеличение - левые: х100. правые: х400. ФИТЦ-иммуногистология.

Фиг. 7. Титры антител в сыворотках пациентов с СКВ и контрольных сыворотках здоровых людей при тестировании их сывороток в отношении способности связываться с пептидами 1а. 11а и 111а. или мАт 5С12. или контрольным пептидом.

Фиг. 8. Концентрация человеческих анти-ДНК 16/6 И-мАт. требуемая для оптимальной стимуляции РВЬ пациентов с СКВ и здоровых людей в контроле. РВЬ стимулировали различными концентрациями (0.1-40 мкг/лунку) 16/6 И-мАт. Концентрацию. дающую самый высокий индекс стимуляции. определяли как оптимальную для запуска пролиферативного ответа.

Фиг. 9. Пролиферация РВЬ от одного пациента с СКВ. стимулированных митогеном фитогемагглютинином (ФГА). в отсутствие или в присутствии ЙСЭК1 или ЙСЭК3.

Фиг. 10. Пролиферация РВЬ от одного пациента с СКВ. стимулированных человеческим мАт 16/6 I. в отсутствие или в присутствии пептидов 1ιί.ΌΡ1 или ЙСЭК3 человека или пептида тСЭКЗ мыши.

Фиг. 11. Пролиферация РВЬ от одного пациента с СКВ. стимулированных человеческим мАт 16/6 I. в отсутствие или в присутствии пептидов ЙСЭК1 или НСЭКЗ человека или мышиных пептидов с обратной последовательностью гсутСОК1 и гсхтСЭКЗ.

Фиг. 12. Ингибирование секреции 1Ь-2 в РВЬ пациентов с СКВ. запускаемой мАт 16/6 И человека. в отсутствие или в присутствии ЙСЭК1 или ЙСЭКЗ.

Фиг. 13. Повышающая регуляция секреции ΤΟΕ-β в РВЬ одного типичного пациента с СКВ. стимулированной человеческим мАт 16/6 И. в отсутствие или в присутствии ЙСЭК1 или ЙСЭК3.

Фиг. 14. Типичный гель. показывающий активность ММР-2 и ММР-9 в сыворотках пациентов с СКВ и здоровых людей в контроле. Сыворотки (5 мкл) 40 пациентов с СКВ и 25 здоровых людей в качестве контролей анализировали в отношении активности ММР-2 или ММР-9 зимографией в геле. На фи

- 4 009123 гуре показаны типичные результаты с образцами сыворотки из двух групп.

Фиг. 15. График, показывающий количественный анализ активностей ММР-2 и ММР-9 в сыворотках пациентов с СКВ (темные колонки) и здоровых людей в качестве контролей (белые колонки). 36 образцов сыворотки пациентов с СКВ и 15 образцов сыворотки здоровых людей в качестве контролей тестировали в отношении активности ММР-2 или ММР-9, используя специальные наборы для анализа активности. Результаты выражены в виде средней ± к.е.т. *Р=0,0302.

Фиг. 16А-В. Графики, показывающие уровни активности ММР-9 и индексы активности заболевания (8ΕΕΌΑΙ) у пациентов с СКВ. 35 образцов сыворотки от 8 пациентов с СКВ мужского пола (фиг. 16 А) и 27 женского пола (фиг. 16В) тестировали в отношении активности ММР-9 с помощью специального набора для анализа активности. Представлено распределение активности ММР-9 в соответствии с 8ΕΕΌΑΙ пациентов. Пунктирной линией указана активность ММР-9 у здоровых людей в контроле.

Фиг. 17А-В. Графики, показывающие характер активности ММР-2 (белые кружки) и ММР-9 (черные кружки) в сыворотках двух пациентов с СКВ, собранных в течение 4-6 лет заболевания. Сыворотки тестировали в отношении активностей ММР-2 или ММР-9 с помощью специальных наборов для анализа активности. Анализы осуществляли в двух повторах.

Подробное описание

a) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (ί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОЕ) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Ιά-антитела, или (ίί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СЭЕ) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, или

b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность (ι) Τ6ΥΥ.\·.\;.\_;.\₄.\,Ο8ΡΕΚ81.Ε\\Ί(.ι (8ЕС ΙΌ N0: 11), где \₁ означает Ме1, А1а или Уа1; \₂ означает С1и, Акр, С1и или Агд; \₃ означает Тгр или А1а; \₄ означает Уа1 или 8ет и \₅ означает Ьук, С1и или А1а;

(ίί) Е!\Р8ТСС\..\ \₈\.\ \ \ КАКАТ (НЕС) ΙΌ N0: 12), где Х₆ и Х₇, каждый означает ТНг, Уа1 или А1а; \₈ означает Туг или РНе; \₉ означает Аки или Акр; \₁₀означает С1и или С1и; Х₁₁ означает Ьук или С1и и \₁₂ означает РНе или Туг;

(ΐΐΐ) ΥΥСΑЕX1зX14X15X16РΥΑX17X18Υ\С^68 (НЕС) ΙΌ N0: 13), где Х13 означает РНе, ТНг или С1у; \₁₄ означает Ьеи, А1а или 8ет; \₁₅ означает Тгр или А1а; \₁₆ означает С1и или Ьук; \₁₇ означает Ме! или А1а и Х₁₈ означает Акр, Ьук или 8ет;

(ίν) ΟΥ^ν ΙΟ.ν,.νΥΙΑ\ΊΓ> (НЕС) ΙΌ N0: 14), где \₁₉ означает Ме! или А1а; \₂₀ означает Акп, Акр или Агд; \₂₁ означает Тгр или А1а; \₂₂ означает Уа1 или 8ет; \₂₃ означает Ьук или С1и; \₂₄ означает С1п или А1а; \₂₅ означает Ьук или С1и и Х₂₆ означает 8ет или А1а;

(ν) ΥΥСΑЕX₂₇X₂₈X₂₉ΥСX₃₀X₃₁X₃₂С^Т^ (НЕС) ΙΌ N0: 15), где Х₂₇ означает 8ет или РНе; \₂₈ означает С1у или А1а; \₂₉ означает Агд, А1а или С1и; \₃₀ означает Акп или Акр; \₃₁ означает Туг или РНе и \₃₂ означает Тгр, Н1к или А1а;

(νί) X₃₃ΥΥ\8\IX₃4^X₃5РX₃6Xз7СX₃8Ε\Ю (НЕС) ΙΌ N0: 16), где Х₃₃ означает С1у или ТНг С1у; \₃₄ означает Агд или Ьук; \₃₅ означает Рго или 8ет; \₃₆ означает С1у или С1и; \₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈ означает С1и, Ьеи или 8ет;

(νίί) ΥΥСΑЕX₃₉^^X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄^V^ΥX₄₅СX₄₆^V (НЕС) ΙΌ N0: 17), где Х₃₉ означает С1у или РНе; \₄₀ означает Агд или А1а; Х₄₁ означает С1у или А1а; \₄₂ означает С1у или А1а; \₄₃ означает Тгр или А1а; \₄₄ означает Акп или А1а; \₄₅ означает Туг или Тгр; Х₄₆ означает Ме! или С1п;

(νίίί) Γ86ΥΥ\8 (НЕС) ΙΌ N0: 8);

(ίχ) ЕГПН8С8ТХУКТ8ЕК8 (НЕС) ΙΌ N0: 9); или (χ) С^^ЕСС\N^V^ΥΥΥСМ^V (НЕС) ΙΌ N0: 10), или

6) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (а)(1), (а)(и) и (Ь)(1)(Ь)(х); и усилитель растворимости, выбранный из группы, состоящей из диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, №метил-2-пирролидинона, 1-этенил-2-пирролидинона,

- 5 009123 сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и замещенного β-циклодекстрина, в которой и пептид, и усилитель растворимости растворены в водном носителе; и при этом композиция имеет рН от 4 до 9.

В одном варианте по меньшей мере 0,5 мг/мл композиции составляет фармацевтически приемлемая соль пептида.

В другом варианте пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из

ΝΗ₂-ΤΗγ С1у Туг Туг Ме! С1и Тгр Уа1 Ьук С1и 8ег Рго С1и Ьук 8ег Ьеи С1и-Тгр 11е С1у-СООН (8ЕО ГО N0: 1);

ΝΗ₂-Ο1π 11е Аки Рго 8ег Тйг С1у С1у Тйг Тйг Туг Аки С1и Ьук Рйе Ьук А1а Ьук А1а Тйг-СООН (8Е0 ГО N0: 2);

ΝΗ₂-Τυγ Туг Сук А1а Агд Рйе Ьеи Тгр С1и Рго Туг А1а Ме! Акр Туг Тгр С1у С1и С1у 8ег-СООН (8Е0 ГО ^: 3);

ΝΗ₂-61υ Туг Акп Ме! Акп Тгр Уа1 Ьук С1и 8ег Н1к С1у Ьук 8ег Ьеи С1и Тгр 11е С1у-СООН (8Е0 ГО ^: 4);

ΝΗ₂-Τυγ Туг Сук А1а Агд 8ег С1у Агд Туг С1у Акп Туг Тгр С1у С1п Тйг Ьеи-СООН (8Е0 ГО N0: 5); ΝΗ₂-61υ Туг Туг Тгр 8ег Тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у Ьук С1у С1и С1и Тгр 11е С1у-СООН (8Е0 ГО N0: 6);

ΝΗ₂-Τυγ Туг Сук А1а Агд С1у Ьеи Ьеи Агд С1у С1у Тгр Акп Акр Уа1 Акр Туг Туг С1у Ме! Акр Уа1СООН (81Т) ГО ^: 7);

ΝΗ.-РКе 8ег 61у Туг Туг Тгр 8ег-СООН (8ЕО ГО 8);

ΝΗ₂-Ο1π 11е Акп Н1к 8ег С1у 8ег Тйг Акп Туг Ьук Тйг 8ег Ьеи Ьук 8ег-СООН (8Е0 ГО N0: 9); и

ΝΗ₂-Ο1γ Ьеи Ьеи Агд С1у С1у Тгр Акп Акр Уа1 Акр Туг Туг Туг С1у Ме! Акр Уа1-СООН (8Е0 ГО №: 10).

В одном варианте пептид содержит следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность

ХззУУ^8^1Хз4рХз5РХзбХз7ОХз8Е^1О (8ЕО ГО ^: 16), где Х₃₃ означает С1у или Тйг С1у; Х₃₄ означает Агд или Ьук; Х₃₅ означает Рго или 8ег; Х₃₆ означает С1у или С1и; Х₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈ означает С1и, Ьеи или 8ег.

В другом варианте любой из описанных выше фармацевтических композиций усилителем растворимости является замещенный β-циклодекстрин.

В одном варианте замещенным β-циклодекстрином является β-циклодекстрин, замещенный гидроксипропилом, сульфобутиловым эфиром или сульфопропиловым эфиром.

В другом варианте замещенным β-циклодекстрином является β-циклодекстрин, замещенный сульфобутиловым эфиром.

В следующем варианте любой из описанных выше композиций концентрация пептида в растворе составляет по меньшей мере 1,0 мг/мл.

В следующем варианте концентрация пептида в растворе составляет по меньшей мере 2,5 мг/мл.

В одном варианте концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 2,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 2,5 до 5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 5 до 7 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 7 до 8,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 8,5 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 9 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 10 до 15 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 15 до 20 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 1,0 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 2,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 15 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,1 до 0,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,1 до 0,2 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,2 до 0,3 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,3 до 0,4 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,4 до 0,5 мг/мл.

В следующем варианте композиция имеет рН от 6,5 до 8,5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 7,5 до 8,5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 4 до 5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 5 до 6.

В следующем варианте композиция имеет рН от 6 до 7.

В следующем варианте композиция имеет рН от 7 до 8.

В следующем варианте композиция имеет рН от 8 до 9.

- 6 009123

В другом варианте любой из описанных выше фармацевтических композиций фармацевтически приемлемой солью является ацетатная соль.

В следующем варианте фармацевтически приемлемой солью является ацетатная соль, а замещенным β-циклодекстрином является гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрин.

В другом варианте композиция, кроме того, содержит фармацевтически приемлемый буфер в количестве и типа, подходящего для получения рН фармацевтической композиции в диапазоне 4-9. Буфером может быть ацетатный буфер, нитратный буфер или карбонат натрия.

Настоящее изобретение также относится к способу ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающему введение человеку любой из указанных выше фармацевтических композиций в количестве, эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

Настоящее изобретение также относится к указанным выше фармацевтическим композициям для применения при лечении СКВ у человека.

Настоящее изобретение также относится к способу производства любой из указанных выше фармацевтических композиций, включающему следующие стадии:

a) приготовление раствора диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, Ы-метил-2-пирролидинона, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана или замещенного β-циклодекстрина в водном носителе с предварительно определенной концентрацией;

b) добавление предварительно определенного количества фармацевтически приемлемой соли

1) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (ί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (ΟΌΡ) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Ιά-антитела, или (ίί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОВ) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей,

2) пептида, содержащего аминокислоты, имеющие последовательность (1) ТС¥У.\-.\₂.\_;.\₄.\,С)81ТК81.Е\\'1С (8ΕΕ) ΙΌ N0: 11), где \₁ означает МеЕ А1а или Уа1; \₂ означает 61п, Азр, 61и или Агд; \₃ означает Тгр или А1а; \₄ означает Уа1 или 8ег и \₅ означает Ьуз, 61и или А1а;

(ίί) ΕINР8Т66X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂ΚАΚАТ (8ΕΟ ΙΌ N0: 12), где Х₆ и Х₇, каждый означает ТЬг, Уа1 или А1а; \₈ означает Туг или РЬе; Х₉ означает Азп или Азр; \₁₀означает 61п или 61и; Х₁₁ означает Ьуз или 61и и \₁₂ означает РЬе или Туг;

(ίίί) ΥΥСАВX1зX14X15X16РΥАX17X18Υ\С^68 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 13), где Х₁₃ означает РЬе, ТЬг или 61у; \₁₄ означает Ьеи, А1а или 8ет; \₁₅ означает Тгр или А1а; \₁₆ означает 61и или Ьуз; \₁₇ означает Ме1 или А1а и \₁₈ означает Азр, Ьуз или 8ет;

(ίν) ΥίΥΥ'.\ .\₃ .\.\'.\₃₃.\₃:811Υί.\..\₃·.ΕΕΑ\'Ι/₄ (8ΕΟ ΙΌ N0: 14), где \₁₉ означает Ме1 или А1а; \₂₀ означает Азп, Азр или Агд; \₂₁ означает Тгр или А1а; \₂₂ означает Уа1 или 8ет; Х₂₃ означает Ьуз или 61и; \₂₄ означает 61п или А1а; \₂₅ означает Ьуз или 61и и Х₂₆ означает 8ет или А1а;

(ν) У¥САВ\₃ \₃₈\ УС\_; \_;·\_;зС('УП. (81Т) ΙΌ N0: 15), где Х₂₇ означает 8ег или РЬе; \₂₈ означает 61у или А1а; \₂₉ означает Агд, А1а или 61и; \₃₀ означает Азп или Азр; \₃₁ означает Туг или РЬе и Х₃₂ означает Тгр, Н1з или А1а;

(νΐ) XззΥΥ\8\IXз4^Xз5РXз6Xз7СXз₈Ε\Ю (81Т) ΙΌ N0: 16), где \₃₃ означает 61у или ТЬг 61у; \₃₄ означает Агд или Ьуз; Х₃₅ означает Рго или 8ег; \₃₆ означает 61у или 61и; \₃7 означает Ьуз или Азр и Х₃₈ означает 61и, Ьеи или 8ег;

(νίί) ¥УСАВ\_;Т1.\₄ .\ ₂\₄·.\_4;.\₄Ό\ΌΥ.\₄,(.ι.\₃.Ι)ν (8ΕΕ) ΙΌ N0: 17), где Х₃₉ означает 61у или РЬе; \₄₀ означает Агд или А1а; \₄₁ означает 61у или А1а; \₄₂ означает 61у или А1а; \₄₃ означает Тгр или А1а; \₄₄ означает Азп или А1а; \₄₅ означает Туг или Тгр; \₄₆ означает Ме1 или 61п;

(νίίί) Ε8(.ιΥΥ\Υ8 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 8);

(ίχ) ΕΙΥ118С8Т\УКТ81.К8 (8ΕΕ) ΙΌ N0: 9); или (χ) (₄1.1.Β(₄(₄\\'\Ι)\ΌΥΥΥ(₄\1Ι)¥ (8ΕΕ) ΙΌ N0: 10), или

3) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие любую последовательность из а) и Ь) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (а)(1), (а)(и) и (Ь)(1)-(Ь)(х), или

4) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (а)(1), (а)(и) и (Ь)(1)(Ь)(х); и

c) доведение рН раствора со стадии Ь) вплоть до растворения пептида в растворе; и

ά) при необходимости доведение рН раствора со стадии с) до рН 4-9, таким образом получая фар

- 7 009123 мацевтическую композицию.

В одном варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей по меньшей мере 0,1 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей по меньшей мере 0,5 мг/мл.

В следующем варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 5, 10 или 15 мг/мл.

В одном варианте способа полученная в результате конечная концентрация замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции составляет от 70 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 80 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 90 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 100 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 110 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 120 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 130 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 140 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 150 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции от 160 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного β-циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного β-циклодекстрина в фармацевтической композиции, составляющей 120 мг/мл.

В следующем варианте стадия Ь), кроме того, включает перемешивание раствора в течение 1 ч.

В другом варианте на стадии с) рН корректируют, используя 1,0н. НС1 или ЫаОН.

В следующем варианте способ, кроме того, включает фильтрование раствора со стадии б) через фильтр из ацетата целлюлозы.

В следующем варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл;

стадия Ь), кроме того, включает перемешивание раствора в течение 1 ч; и на стадии с) рН корректируют, используя 1,0н. НС1 или ЫаОН, и способ, кроме того, включает фильтрование раствора со стадии б) через фильтр из ацетата целлюлозы.

Настоящее изобретение также относится к композиции, полученной любым из указанных выше способов.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, содержащей от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли

а) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом ами

- 8 009123 нокислот, имеющих последовательность, соответствующую (ί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СЭВ) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Ιά-антитела, или (ίί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОЯ) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, или

b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность (ί) Τ6ΥΥ.\·.\;.\_;.ν.\,Ο8ΡΕΚ81.Ε\\Ί(.ι (БЕС ΙΌ N0: 11), где Х1 означает МеЕ А1а или Уа1; Х₂ означает С1и, Акр, С1и или Агд; Х₃ означает Тгр или А1а; Х₄ означает Уа1 или Бег и Х₅ означает Ьук, С1и или А1а;

(ίί) ΕΙΝΡ8ΤΟΟΧ₆Χ·₇Х₈Х₉Х₁₀Х₁₁Х₁₂КАКАТ (БЕС ΙΌ N0: 12), где Х₆ и Х₇, каждый означает ТЬг, Уа1 или А1а; Х₈ означает Туг или РЬе; Х₉ означает Акп или Акр; Х₁₀означает С1п или С1и; Х_п означает Ьук или С1и и Х₁₂ означает РЬе или Туг;

(ίίί) У¥САКХ₁₃Х₁₄Х₁₅Х₁₆Р¥АХ₁₇Х₁₈¥А6РСБ (БЕС ΙΌ N0: 13), где Х₁₃ означает РЬе, ТЬг или С1у; Х₁₄ означает Ьеи, А1а или Бег; Х₁₅ означает Тгр или А1а; Х₁₆ означает С1и или Ьук; Х₁₇ означает Ме! или А1а и Х₁₈ означает Акр, Ьук или Бег;

(ίν) 6¥НХ19Х2оХ21Х22Х2зХ24БНСХ25Х26ЬЕАЮ (БЕС ΙΌ N0: 14), где Х₁₉ означает Ме! или А1а; Х₂₀ означает Акп, Акр или Агд; Х₂₁ означает Тгр или А1а; Х₂₂ означает Уа1 или Бег; Х₂₃ означает Ьук или С1и; Х₂₄ означает С1п или А1а; Х₂₅ означает Ьук или С1и и Х₂₆ означает Бег или А1а;

(ν) ¥ТСАКХ₂₇Х₂₈Х₂₉¥СХ₃₀Х₃₁Х₃₂СрТЬ (БЕС ΙΌ N0: 15), где Х₂₇ означает Бег или РЬе; Х₂₈ означает С1у или А1а; Х₂₉ означает Агд, А1а или С1и; Х₃₀ означает Акп или Акр; Х₃₁ означает Туг или РЬе и Х₃₂ означает Тгр, Н1к или А1а;

(νί) Хзз¥У\8\Хз4рХз5РХз6Хз7ОХз8Е\Ю (БЕС ΙΌ N0: 16), где Х₃₃ означает С1у или ТЬг С1у; Х₃₄ означает Агд или Ьук; Х₃₅ означает Рго или Бег; Х₃₆ означает С1у или С1и; Х₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈ означает С1и, Ьеи или Бег;

(νίί) ¥ТСАКХ₃₉ЕЬХ₄₀Х₄₁Х₄₂Х₄₃Х₄₄ОУО¥Х₄₅СХ_4&ОУ (БЕС ΙΌ N0: 17), где Х₃₉ означает С1у или РЬе; Х₄₀ означает Агд или А1а; Х₄₁ означает С1у или А1а; Х₄₂ означает С1у или А1а; Х₄₃ означает Тгр или А1а; Х₄₄ означает Акп или А1а; Х₄₅ означает Туг или Тгр; Х₄₆ означает Ме! или С1п;

(νίίί) ЕБСУУАБ (БЕС ΙΌ N0: 8);

(ίχ) ЕЕННБСБТХУКТБЬКБ (БЕС ΙΌ N0: 9); или (χ) (.ιΕΕΒ(.ι(.ι\\'\Ι)\ΌΥΥΥ(.ι\1Ι)Υ (БЕС ΙΌ N0: 10), или

6) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (а)(1), (а)(и) и (Ь)(1)(Ь)(х); и усилитель растворимости, выбранный из группы, состоящей из диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, №метил-2-пирролидинона, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и замещенного β-циклодекстрина.

В одном варианте лиофилизованной фармацевтической композиции по меньшей мере 0,5 мг/мл композиции составляет фармацевтически приемлемая соль пептида.

Настоящее изобретение также относится к способу лиофилизации любой из указанных выше фармацевтических композиций, включающему следующие стадии:

a) снижение температуры фармацевтической композиции до -40°С;

b) поддержание температуры при -40°С в течение предварительно определенного периода времени;

c) повышение температуры раствора до 20°С;

б) поддержание температуры при 20°С в течение предварительно определенного периода времени и

е) снижение давления и поддержание температуры при 20°С в течение предварительно определенного периода времени, таким образом лиофилизируя фармацевтическую композицию.

В одном варианте стадию а) осуществляют в течение 2 ч.

В другом варианте стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют в течение 13 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют при давлении 110 мкбар.

В другом варианте стадию б) осуществляют в течение 13 ч.

В другом варианте стадию б) осуществляют при давлении 110 мкбар.

В другом варианте на стадии е) давление понижают до 10 мкбар.

В другом варианте стадию е) осуществляют в течение 5 ч.

В другом варианте стадию а) осуществляют в течение 2 ч;

- 9 009123 стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч;

стадию с) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар;

стадию 6) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 5 ч и давление понижают до 10 мкбар.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, полученной любым из указанных выше способов.

Настоящее изобретение также относится к способу лиофилизации любой из указанных выше фармацевтических композиций, включающему в себя следующие стадии:

a) снижение температуры фармацевтической композиции до -45°С;

b) поддержание температуры при -45°С в течение предварительно определенного периода времени;

c) повышение температуры раствора до -20°С;

б) повышение температуры раствора до 25°С и

е) поддержание температуры при 25°С в течение предварительно определенного периода времени, таким образом лиофилизируя фармацевтическую композицию.

В одном варианте стадию а) осуществляют в течение 6 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют в течение 19 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию б) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию е) осуществляют в течение 8 ч.

В другом варианте стадию е) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию а) осуществляют в течение 6 ч;

стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч;

стадию с) осуществляют в течение 19 ч и при давлении 150 мкбар;

стадию б) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 150 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 8 ч и при давлении 150 мкбар.

Настоящее изобретение также относится к указанной выше лиофилизованной фармацевтической композиции, в которой содержание воды в композиции составляет менее 5%.

В одном варианте содержание воды в композиции составляет менее 4%.

В другом варианте содержание воды в композиции составляет менее 3,5%.

Настоящее изобретение также относится к упакованной фармацевтической композиции, состоящей из упаковочного материала и предварительно определенного количества любой из указанных выше лиофилизованных фармацевтических композиций.

В другом варианте пептид имеет формулу ΝΗ₂-Ο1ν Туг Туг Тгр 8ег Тгр 11е Агд С1и Рго Рго С1у Ьух С1у С1и С1и Тгр 11е 61у-С00Н (8Еф ГО ΝΟ: 6).

Синтетические пептиды согласно данному изобретению основаны на СБЯ моноклональных патогенных аутоантител, выделенных от мышей с экспериментальной СКВ. Такие моноклональные антитела получают из надосадков гибридом, полученных слиянием, например, клеток селезенки мышей С3Н.8А, иммунизированных анти-16/6 1б-мАт, с клетками плазмоцитомы Х63.653 (Аа1хшап апб Мохех, 1993).

Примерами таких пептидов являются пептиды формул 1а-Уа, приведенных в данном описании, основанные, соответственно, на областях СБИТ, СБЯ2 и СБЯ3 тяжелой цепи мАт 5С12 и областях СБЯ1 и СБЯ3 тяжелой цепи мАт 2С4С2 (Ааыпап апб Мохех, 1993), и их аналоги.

Подразумевается, что пептиды согласно настоящему изобретению включают аналоги пептидов 1аУа, включая аналоги, содержащие замену, делецию и добавление, которые приведены в данном описании. Аналоги с заменами имеют замены аминокислот в разных положениях, при этом указанные замены производят на основе объема, гидрофобного-гидрофильного характера и заряда аминокислот.

Аминокислоты можно разделить в соответствии с объемом, гидрофобным-гидрофильным характером и зарядом. Что касается объема, то специалистам в данной области понятно, что аминокислотами с наибольшим занимаемым объемом являются Тгр, Туг, Рйе, Агд, Ьух, 11е, Ьеи, Ме! и Н1х, тогда как аминокислотами с наименьшими объемами являются С1у, А1а, 8ег, Ахр, Тйг и Рго, остальные занимают промежуточное положение между ними.

Что касается гидрофобного-гидрофильного характера, то хорошо известно, что аминокислоты С1у, А1а, Рйе, Уа1, Ьеи, 11е, Рго, Ме! и Тгр являются гидрофобными в то время, как все остальные аминокислоты являются гидрофильными. Среди гидрофильных аминокислот 8ег, Тйг, С1п и Туг не имеют заряда, тогда как Агд, Бух, Н1х и Ахп имеют положительный заряд, а Ахр и С1и имеют отрицательные заряды.

При отборе пептидов для тестирования в отношении их возможности ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на СКВ-индуцирующие ауто

- 10 009123 антитела, важно, чтобы замены были выбраны из таких замен, которые в совокупности существенно не изменяют объем, гидрофобный-гидрофильный характер и заряд соответствующей части не подвергнутого заменам исходного пептида. Таким образом, гидрофобный остаток может быть заменен гидрофильным остатком или наоборот при условии, что общий эффект существенно не изменит объем, гиброфобный-гидрофильный характер и заряд соответствующего не подвергнутого заменам исходного пептида.

Следует понимать, что другие модификации пептидов также входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, подразумевается, что пептид согласно настоящему изобретению включает его химическое производное, которое сохраняет по меньшей мере часть функции пептида, которая дает возможность использовать его для предотвращения или ингибирования пролиферативных ответов Т-клеток и аутоиммунного заболевания.

Химическое производное пептида согласно настоящему изобретению содержит дополнительные химические остатки, обычно не являющиеся частью пептида. В объем данного изобретения включены ковалентные модификации пептида. Такие модификации могут быть введены в молекулу в результате взаимодействия являющихся мишенью аминокислотных остатков пептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Большое количества таких химических производных и способов их получения хорошо известны в данной области.

Также в объем изобретения включены соли пептидов согласно изобретению. В используемом в данном описании смысле термин соли относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотноаддитивным солям аминогрупп пептидной молекулы. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа и цинка и т.п., и соли с органическими основаниями, такие как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. К кислотно-аддитивным солям относятся, например, соли с неорганическими кислотами, такими, например, как хлористо-водородная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими, например, как уксусная кислота или щавелевая кислота. Такие химические производные и соли предпочтительно используют для модификации фармацевтических свойств пептида, когда речь идет о стабильности, растворимости и т.д.

Синтетические пептиды и их аналоги согласно изобретению могут быть выбраны из группы, состоящей из пептидов, имеющих последовательности Ι-У, приведенные в данном описании, где:

(ί) пептид с последовательностью I имеет формулу (8ЕЦ ГО N0: 11)

Т 6 Υ Υ Х₁ Х₂ Х₃ Х₄ Х₅ Ω 8 Р Е К 8 Ь Е № I 6 [I] где Х₁ означает Мс1. А1а или Уа1; Х₂ означает 61п, Акр, 61и или Агд; Х₃ означает Тгр или А1а; Х₄ означает Уа1 или 8ег и Х₅ означает Ьук, 61и или А1а.

В одном варианте пептид с последовательностью I имеет формулу (1а) (8ЕЦ ГО N0: 1)

Т 6 Υ Υ М О № V К О 8 Р Е К 8 Ь Е № I 6 Да) (й) пептид с последовательностью II имеет формулу (8ЕЦ ГО N0: 12)

Е I N Р 8 Т 6 6 Х₆ Х₇ Х₈ Х₉ Хю Х₁₁ Х₁₂ К А К А Т [II] где каждый из Х₆ и Х₇ является ТНг, Уа1 или А1а; Х₈ является Туг или РНе; Х₉ является Акп или Акр; Хю является 61п или 61и; Х₁₁ является Ьук или 61и и Х₁₂ является РНе или Туг.

В одном варианте пептид с последовательностью II имеет формулу (Па) (8ЕЦ ГО N0: 2)

Е I N Р 8 Т 6 6 Т Т Υ N О К Г К А К А Т (Па) (ΐϊϊ) пептид с последовательностью III имеет формулу (8ЕЦ ГО N0: 13)

Υ Υ С А В Х13 Х14 Х15 Х16 Р Υ А Х_п Хю Υ № 6 О 6 8 [III] где Х₁₃ означает РНе, Тйт или 61у; Х₁₄ означает Ьеи, А1а или 8ег; Х₁₅ означает Тгр или А1а; Х₁₆ означает 61и или Ьук; Х₁₇ означает Ме! или А1а и Х₁₈ означает Акр, Ьук или 8ег.

В одном варианте пептид с последовательностью III имеет формулу (Ша) (8ЕЦ ГО N0: 3)

Υ Υ С А В Г Ь № Е Р Υ А М Ό Υ № 6 О 6 8 (Ша) (ίν) пептид с последовательностью IV имеет формулу (8ЕЦ ГО N0: 14)

Υ N Х₁₉ Х₂₀ Х₂₁ Х₂₂ Х₂₃ Х₂₄ 8 Н 6 Х₂₅ Х₂₆ Ь Е № I 6 [IV] где Х₁₉ означает Ме! или А1а; Х₂₀ означает Акп, Акр или Агд; Х₂₁ означает Тгр или А1а; Х₂₂ означает Уа1 или 8ег; Х₂₃ означает Ьук или 61и; Х₂₄ означает 61п или А1а; Х₂₅ означает Ьук или 61и и Х₂₆ означает 8ег или А1а.

В одном варианте пептид с последовательностью IV имеет формулу (Ша) (8ЕЦ ГО N0: 4)

Υ N М N № V К О 8 Н 6 К 8 Ь Е № I 6 (Ша) (ν) пептид с последовательностью V имеет формулу (8ЕЦ ГО N0: 15)

Υ Υ С А В Х27 Х28 Х29 Υ 6 Х30 Х31 Х32 6 О Т Ь [V] где Х₂₇ означает 8ег или РНе; Х₂₈ означает 61у или А1а; Х₂₉ означает Агд, А1а или 61и; Х₃₀ означает Акп или Акр; Х₃₁ означает Туг или РНе и Х₃₂ означает Тгр, Н1к или А1а.

В одном варианте пептид с последовательностью V имеет формулу ^а) (8ЕЦ ГО N0: 5)

Υ Υ С А В 8 6 В Υ 6 N Υ № 6 О Т Ь ^а)

Пептиды 1а-Ша основаны, соответственно, на областях СБВ1, СБВ2 и СБВ3 Сн-цепи мАт 5612, а

- 11 009123 пептиды 1Уа и Уа основаны, соответственно, на областях СЦК.1 и СЦК.3 У_н-цепи мАт 2С4С2 (Уащтаи апб Μοζβκ, 1993).

После получения пептида согласно настоящему изобретению его способность ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на СКВ-индуцирующие аутоантитела, легко может быть определена специалистами в данной области без того, чтобы прибегнуть к большему, чем это необходимо, экспериментированию, используя такие тесты, которые приведены в данном описании. Одним из тестов, который может быть легко проведен, является тест в отношении способности пептидов с заменами ингибировать ίη νίίτο пролиферативные ответы некоторых Т-клеточных линий и клонов, специфичных по отношению к СКВ-индуцирующим аутоантителам. Т-клеточные линии и клоны могут, например, представлять собой Т-клеточные линии и клоны, специфичные по отношению к 16/6 1б-мАт (Епске е1 а1., 1991), созданные из клеток лимфатических узлов иммунизированных мышей ранее описанным способом (Ахе1гоб, О. апб Μοζеκ, Е. 1ттипоЬ1о1оду 172: 99 (1986)). На клетки воздействуют стимулирующим антителом, презентированным на облученных сингенных клетках селезенки, в присутствии обогащенной среды, каждые 2 недели. Линии Т-клеток клонируют стандартным способом лимитирующего разведения. Пролиферативные ответы указанных Т-клеточных линий и клонов тестируют, например, способом, описанным в разделе Материалы и способы в данном описании.

Другим тестом, который может быть проведен для того, чтобы выбрать пептиды, обладающие требуемой активностью, является тест в отношении способности пептидов с заменами ингибировать способность Т-клеточных линий и клонов обеспечивать помощь специфичным по отношению к пептидам Вклеткам в присутствии исходного пептида. Пептиды с заменами также можно тестировать в отношении их способности связываться непосредственно, после биотинилирования с продуктами ММС класса II на антигенпрезентирующих клетках соответствующих линий. С этой целью осуществляют Ν-концевое биотинилирование соответствующих пептидов при 0°С с избытком биотин-Ы-гидроксисукцинимида в водном растворе (Μοζеκ, Е. е1 а1., ЕМВО 1. 8: 4049 (1989)). Прилипающие клетки селезенки мышей или прилипающие клетки лимфоцитов периферической крови (РВЬ) человека (1х10⁶/образец) инкубируют с биотинилированными пептидами в РВ8. содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (РВ8/БСА) при 37°С в течение 20 ч с последующей инкубацией с фикоэритринстрептавидином в течение 30 мин при 4°С. После каждой инкубации клетки дважды промывают указанным выше раствором. Затем клетки анализируют проточной цитометрией, используя ЕАСЗсап. В каждом анализе исследуют, минимум, 5000 клеток (что касается указанных выше способов, см., например, Μοζеκ е1 а1., 1989; 21ктап е1 а1., 1991).

Следующим тестом, который может быть проведен, является тест в отношении способности пептидов ингибировать секрецию цитокина линией Т-клеток или Т-лимфоцитами мышей, которые являются высокоотвечающими на СКВ-индуцирующие аутоантитела. Цитокины регистрируют следующим образом: активность 1Ь-1 оценивают либо в ЕЬ18А, используя пару антител: для захвата и регистрирующее антитело (как описано ниже для 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-10), или используя анализ ЬВКМ-33(1А5) (Соп1оп, Р.1. 1. 1ттипе. 134: 1280 (1983)), в котором клетки 1А5 стимулируют в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) либо надосадками, либо рекомбинантным 1Ь-1 в разных концентрациях для секреции 1Ь-2. После инкубации в течение ночи надосадки клеток 1А5 переносят к 1Ь-2-зависимой линии цитотоксических Тлимфоцитов (СТЬЕ). Стимуляцию линии СТЬЕ посредством 1Ь-2 измеряют через 24 ч по включению ³[Н]-тимидина. 1Ь-2 непосредственно регистрируют, используя 1Ь-2-зависимую линию СТЬЕ или посредством ЕЬ18А. Уровни 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-10, ΙΝΕ-γ и ΤΝΡ-α в надосадках определяют в ЕЬ18А, используя антитела к различным цитокинам (Рйатшдеп/8ап Ц1едо/Са./и8А) согласно инструкциям производителя.

В случае пептидов, которые являются позитивными при тестировании в одном или нескольких указанных тестах ίη νίΙΐΌ. будут основания предполагать наличие активности ίη νί\Ό. Однако тесты ίη νί\Ό также можно проводить, не прибегая к большему, чем это необходимо, экспериментированию. Так, например, можно инъецировать взрослым мышам выбранный для исследования пептид либо в день -3, либо в 0 день. Затем мышей иммунизируют индуцирующим заболевание аутоантителом или пептидом. Спустя 10 дней тестируют клетки лимфатических узлов мышей в отношении их способности пролиферировать в ответ на иммуноген, чтобы выявить ингибирующую способность выбранного для исследования пептида.

Другой такой тест на животных ίη νί\Ό заключается в измерении терапевтической активности непосредственно в мышиной модели ίη νί\Ό в отношении возникновения СКВ, как описано выше. Пептиды можно инъецировать мышам, у которых экспериментальная СКВ индуцируется различными путями, в разных дозах и в разных временных режимах. Чтобы определить фармакокинетические параметры пептидов, включая объем распределения, захват антигенпрезентирующими клетками и клиренс, можно использовать биотинилированные производные пептидов. Концентрацию растворимой фракции пептидов в различных жидкостях организма можно определить посредством ЕЬ18А, используя покрытые авидином планшеты и специфичные антитела против пептидов. Связанные с клетками пептиды можно анализировать посредством ЕАС8, используя конъюгированный с флуорохромом авидин или стрептавидин. Кроме того, обработанных мышей можно периодически тестировать для того, чтобы определить влияние пептидов на ответы в виде аутоантител и на проявления заболевания, вызванного у мышей СКВ-индуцирую

- 12 009123 щим антителом.

Другой способ ίη νίνο заключается в толеризации новорожденных мышей выбранным для исследования пептидом с последующей иммунизацией мышей патогенным аутоантителом, таким как 16/6 Ι6+. или таким же пептидом и наблюдении за проявлениями заболевания. такими как серологические показатели. связанные с лейкопенией. повышенной скоростью оседания эритроцитов. протеинурией. обилием иммунных комплексов в почках и склерозом клубочков. Таким образом. можно видеть. что. кроме предпочтительных вариантов. которые. как было показано. применимы в примерах. приведенных в данном описании. специалисты в данной области смогут определить дополнительные пептиды. которые также будут применимы. следуя руководствам. приведенным в данном описании. без чрезмерного экспериментирования.

Также можно осуществить относительно простой тест ίη νίίτο. чтобы проанализировать предполагаемую терапевтическую эффективность любого данного пептида с заменами у любого данного пациента с СКВ. Чтобы оценить достижение конечной цели создания пептидов. которые будут связываться с высокой аффинностью с соответствующими молекулами МНС класса II. но не будут приводить к дальнейшей активации Т-клеток и поэтому будут оказывать терапевтическое действие на пациентов с СКВ. можно анализировать пептиды после их биотинилирования в отношении их способности связываться непосредственно с продуктами НЬА класса II на антигенпрезентирующих клетках в лимфоцитах периферической крови пациентов с СКВ. В таких анализах можно использовать здоровых контрольных доноров и контрольные пептиды. чтобы подтвердить их специфичность.

В одном варианте терапевтическим агентом согласно изобретению является пептид. выбранный из группы пептидов формул ЬУ. приведенных в данном описании. включая пептиды И-Уа и их аналоги с заменами и/или делециями.

В другом варианте терапевтическим агентом согласно настоящему изобретению является форма одного полиэпитопного пептида. Так. в предпочтительном варианте двойные пептиды. состоящие из двух разных пептидов. выбранных из группы пептидов формул ЬУ. приведенных в данном описании. ковалентно связывают друг с другом. например коротким участком из остатков аланина или предполагаемым сайтом для протеолиза катепсином. См.. например. патент США 5126249 и европейский патент 495049 в отношении таких сайтов. Это будет индуцировать сайт-специфичный протеолиз предпочтительной формы на два требуемых аналога. Альтернативно. из определенного количества одинаковых или разных пептидов согласно изобретению можно образовать пептидный полимер. например. полимеризацией пептидов с использованием подходящего полимеризующего агента. такого как 0.1% глутаральдегид (Аиб1Ьег1 е! а1. (1981). Ыа1иге 289: 593). Полимер предпочтительно будет содержать от 5 до 20 остатков пептидов. Такие полимеры пептидов также можно образовать перекрестным сшиванием пептидов или прикреплением множества пептидов на макромолекулярных носителях. Подходящими макромолекулярными носителями являются. например. белки. такие как столбнячный токсоид. и линейные и разветвленные сополимеры аминокислот. такие как линейный сополимер Ь-аланина. Ь-глутаминовой кислоты и Ьлизина и разветвленный сополимер Ь-тирозина. Ь-глутаминовой кислоты. Ь-аланина и Ь-лизина (Т.С)-АЬ-. или многоцепочечный поли-ЭЬ-аланин (М. Зе1а е! а1. 1955. I. Ат. СНет. Зое. 77: 6175). Конъюгаты получают. например. сначала связывая пептид с водорастворимым карбодиимидом. таким как гидрохлорид 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимида. и затем осуществляя конъюгацию с макромолекулярным носителем. как описано Ми11ег. С.М. е! а1. (1982) Ргос. №111. Асаб. Зс1. ИЗА 79: 569. Содержание связанного пептида в каждом конъюгате определяют анализом аминокислот по сравнению с составом отдельного носителя.

Согласно одному варианту настоящего изобретения один или несколько активных пептидов могут быть связаны с подходящим макромолекулярным носителем или могут быть полимеризованы в присутствии глутаральдегида.

Пептиды. их полимеры или их конъюгаты с подходящими макромолекулярными носителями будут вводиться пациентам в форме. которая обеспечивает их биодоступность. делая их подходящими для лечения. В том случае. если обнаружено. что более одного пептида обладают значительной ингибирующей активностью. то указанные пептиды будут вводиться пациентам в виде препарата. содержащего смесь данных пептидов.

Изобретение. кроме того. относится к фармацевтическим композициям. содержащим по меньшей мере один синтетический пептид согласно изобретению. его конъюгат с подходящим макромолекулярным носителем или его полимер необязательно с фармацевтически приемлемым носителем.

В объем изобретения включен любой подходящий путь введения. включая пероральный. внутривенный. подкожный. внутрисуставной. внутримышечный. ингаляционный. интраназальный. интратекальный. внутрибрюшинный. интрадермальный. трансдермальный или другие известные пути. включая энтеральный путь.

Пределы доз для введения композиций согласно настоящему изобретению должны быть достаточно большими. чтобы получить эффект. при котором. например. иммунный ответ на СКВ-индуцирующие аутоантитела. который измеряется по пролиферации Т-клеток ίη νίίτο. был существенно предотвращен или ингибирован. и в дальнейшем заболевание значимо подвергалось лечению.

- 13 009123

Дозы не должны быть настолько большими, чтобы вызвать неблагоприятные побочные эффекты, такие как нежелательные перекрестные реакции, генерализованная иммуносупрессия, анафилактические реакции и т.п.

Эффективные дозы пептидов согласно данному изобретению для применения при лечении СКВ находятся в диапазоне от 1 мкг/кг до 1 мг/кг массы тела. Вводимая доза будет зависеть от возраста, пола, состояния здоровья и массы реципиента, вида сопутствующего лечения, если таковое имеется, частоты лечения и природы требуемого эффекта.

Синтетические пептиды согласно изобретению, в частности пептиды с последовательностями Ι-У, приведенными в данном описании, нацелены на ингибирование или подавление специфичных ответов на антигены у пациентов с СКВ, не влияя на все другие иммунные ответы. Такой подход имеет огромнейшее значение, так как большинство диагностируемых пациентов являются молодыми женщинами, которых необходимо лечить в течение многих лет, а в настоящее время принятое лечение СКВ заключается во введении иммуносупрессирующих агентов, таких как кортикостероиды, и/или цитотоксических лекарственных средств, и те и другие являются неспецифичными и имеют множество неблагоприятных побочных эффектов.

Препараты согласно настоящему изобретению могут быть введены парентерально, местно или ректально. Конечно, они могут быть введены в форме, подходящей для каждого пути введения. Например, их можно вводить посредством инъекции, ингаляции, мази, суппозитория и т.д., введение может быть путем инъекции, инфузии или ингаляции; местное - посредством примочки или мази; и ректальное - посредством суппозиториев.

Фразы парентеральное введение и введенный парентерально в используемом в данном описании смысле означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, интрадермальную, внутрибрюшинную, через трахею, подкожную, под кутикулу, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.

Фразы системное введение и введенный системно, периферическое введение и введенный периферически в используемом в данном описании смысле означают введение соединения, лекарственного средства или другого вещества, отличное от прямого введения в центральную нервную систему так, что оно поступает в систему пациента и таким образом подвергается метаболизму и другим подобным процессам, например подкожное введение.

Подробности способов общего приготовления композиций и информацию о дополнительных эксципиентах можно найти в Кеттд1оп: Тйе 8с1еисе апб Ргаебее оГ Рйагшасу, 20111 Ε6ίΐίοη.

Синтетические пептиды могут быть получены, как описано в международной публикации РСТ № νθ 02/067848 или в международной публикации РСТ № νθ 96/30057.

Данное изобретение будет более понятным на основании подробного описания экспериментов, которое следует далее. Однако специалист в данной области без труда поймет, что обсуждаемые конкретные способы и результаты являются только иллюстративными для изобретения, которое более полно описано в формуле изобретения, которая следует далее.

Подробное описание экспериментов

Синтез пептидов Ι-У и тестирование, показывающее эффективность синтезированных пептидов для лечения СКВ в моделях на животных, описаны в международной публикации РСТ № νθ 96/30057. Дополнительное тестирование на животных описано в международной публикации РСТ № νθ 02/067848.

Пример 1. Разработка композиции для соединения 1.

Пептиды согласно настоящей заявке описаны в международной патентной публикации νθ 02/067848, опубликованной 6 сентября 2002г., и могут быть получены способами, хорошо известными в данной области (см., например, Рерббек: ЗупШеДк, 81гисШге апб АррНсабопк, еб. Ьу В. СиНе. Асабетк Ргекк, 1995; РерОбе 8уп1Ьек1к Рго1осо1к, еб. Ьу М. РеппшдФп апб В. Оипп, Нишапа Ргекк, 1994; 8сйпокег, М. е! а1. 1п кйи пеШгаПхаОоп ш Вос-сйетэкДу коЬб рйаке купйеДк. Вар1б, Н1дй у1е1б аккешЬ1у оГ б1ГПси11 кециепсек. ΙπΙ. 1. Рер1. Рго1еш Век. (1992) 40: 180-193).

Соединение 1 является синтетическим полипептидом, состоящим из 19 аминокислот. Его получают в виде ацетатной соли. Определена растворимость пептида в воде, составляющая менее 0,5 мг/мл. На фиг. 1 показано соединение 1 в виде ацетатной соли.

Чтобы разработать композицию с концентрацией пептида, превышающей 2 мг/мл, предпочтительно до 10 мг/мл, проводили эксперименты с несколькими усилителями растворимости. Предварительные эксперименты показали, что концентрации 2 мг/мл нелегко достигнуть. Чтобы разработать композицию для подкожной инъекции, также желательно, чтобы значение рН было в пределах от 4 до 9 и чтобы раствор был изоосмотическим.

На основании всестороннего обзора литературы было принято несколько основных подходов, чтобы получить композицию с максимальной растворимостью. Рассматривались следующие факторы:

установление рН и буферы;

растворители;

- 14 009123 сорастворители;

солюбилизирующие агенты.

Способы

Соединение 1 растворяли в выбранном растворе усилителя растворимости либо отдельно, либо в комбинации с другими эксципиентами и растворы перемешивали по меньшей мере в течение часа. При необходимости корректировали рН. Растворы исследовали визуально, чтобы оценить растворимость, и отправляли для аналитического определения. В случае нескольких выбранных композиций также тестировали биологическую активность.

Результаты

В табл. 1 представлен тип усилителей растворимости, используемых для разработки композиции. В табл. 2 и 3 суммированы эксперименты, которые осуществляли с разными усилителями растворимости. В табл. 2 суммирован исходный скрининг, осуществляемый с концентрациями пептида в диапазоне от 5 до 10 мг/мл. Эксперимент, который проводили с более высокой концентрацией пептида, затем повторяли с более низкими дозами (см. табл. 3).

Исходные тесты показали, что соединение 1 лучше растворимо в пределах требуемых уровней рН, как кислых, так и основных, но менее стабильно в диапазоне основных значений рН. Соответственно, тестировали несколько буферов и агентов для корректировки рН, включая ацетатный буфер, цитратный буфер и карбонат натрия. Ни один из исходно тестированных буферов не достигал требуемого уровня растворимости пептида. Только выше рН 9,2 и ниже рН 3,0 наблюдались уровни растворимости 2 мг/мл. Однако на начальной стадии были выбраны композиции с ацетатным буфером и цитратным буфером (с маннитом в качестве агента тоничности) для начальных токсикологических исследований. Указанные композиции тестировали в отношении биологической активности, и было доказано, что они активны.

Тестировали неводные растворители (см. табл. 1), такие как этанол, глицерин, пропиленгликоль, кремофор и их комбинации, но они не увеличивали растворимость соединения 1. Раствор 30% ИМА (диметилацетамида) давал растворимость в требуемых пределах (5-9 мг/мл), но не подходил для фармацевтической композиции из-за своего профиля токсичности. Улучшенную растворимость также наблюдали при использовании 30% (мас./мас.) ПЭГ 400 (5-9 мг/мл). Указанную последнюю композицию выбрали для токсикологических исследований, но показано, что она является неактивной в биологическом анализе и может быть причиной некоторых неблагоприятных эффектов при исследовании токсичности на мышах. Таким образом, было решено больше не заниматься данной композицией. Учитывая предварительные эксперименты, неводные растворители не использовали в данных композициях.

Тестировали несколько аминокислот (см. табл. 1), включая Ь-аргинин, Ь-глутаминовую кислоту, Ьглицин и Ь-лизин, чтобы повысить растворимость белка. Растворимость пептида в Ь-аргинине была на требуемом уровне, но конечное значение рН было выше 9. Попытка снизить рН или использовать НС1соль аргинина приводила к выпадению пептида в осадок. Также тестировали сывороточный альбумин человека, и он повышал растворимость пептида при низких концентрациях пептида (1 мг/мл) (см. табл. 3). Однако вследствие его потенциальной иммуногенности и низкой растворимости пептида его не использовали в дальнейших экспериментах.

Наполнители (см. табл. 1), включая маннит, сорбит и декстран, тестировали отдельно и в комбинации с другими эксципиентами, но они не повышали растворимость пептида в растворе.

Сорастворители (см. табл. 1), включая полисорбат 20 и полисорбат 80, тестировали отдельно и в комбинации с другими эксципиентами. Хотя более низкие концентрации полисорбатов (вплоть до 6%) не увеличивали растворимость пептида, более высокие концентрации (до 10% - см. табл. 2) повышали растворимость пептида до 2 мг/мл. Однако считали, что такие высокие концентрации полисорбатов являются неподходящими для фармацевтических композиций.

Также тестировали два типа циклодекстринов, которые оба одобрены для применения в продаваемых парентеральных продуктах: гидроксипропил-в-циклодекстрин и сульфобутиловый эфир-в-циклодекстрин (каптизол). Оба заметно увеличивали растворимость пептида (концентрации на уровне 10 мг/мл для гидроксипропил-в-циклодекстрина и 2,5 для каптизола). Тестировали биологическую активность двух композиций циклодекстрина и обнаружили, что они равны по активности пептиду, взятому отдельно.

Сар118о1® (каптизол) является коммерчески доступным полианионным производным β-циклодекстрина, в котором соль сульфоната натрия отделена от гидрофобной полости спейсерной группой простого бутилового эфира или простого сульфобутилового эфира (8ВЕ). Каптизол является торговой маркой препарата, гептазамещенного простым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина (8ΒΕ7-β-ΠΌ) СуИех 1пс. (\\л\лу.еарЦ5о1.сот). Структура каптизола позволяет молекулам лекарственного средства войти в гидрофобную полость, таким образом изолируя молекулу лекарственного средства от водного растворителя. Так как наружная поверхность каптизола является гидрофильной, то растворимость готовой молекулы лекарственного средства при этом повышается. Применение циклодекстринов для повышения растворимости молекул лекарственных средств описано в патентах США №№ 5134127 и 5376645, полное содержание которых включено, таким образом, в виде ссылки.

Согласно литературным данным каптизол СуИех 1пс. является безопасным при парентеральном

- 15 009123 введении и не проявляет нефротоксичности. связанной с бета-циклодекстрином. По сравнению с бетациклодекстрином каптизол проявляет сравнимые или более высокие свойства комплексообразования и более высокую растворимость в воде выше 90 г/100 мл - 50-кратное повышение.

Заключение

Обнаружено. что несколько усилителей растворимости подходят для требуемого диапазона растворимости: ΌΜΆ. ПЭГ-400. диметилацетамид. полиэтиленгликоль. полиоксилированное касторовое масло. Ν-метил-З-пирролидинон. 1-этенил-2-пирролидинон. полисорбат 20. полисорбат 80. гидроксипропил-βциклодекстрин и сульфобутиловый эфир-р-циклодекстрин (каптизол). Подтверждено. что из указанных усилителей растворимости оба циклодекстрина являются лучшими в отношении растворимости. биологической активности и стабильности. Соответственно. было решено выбрать каптизол в качестве усилителя растворимости для применения в композициях согласно примеру 5 и исследовать обе композиции на основе циклодекстрина далее. Конечная композиция для клинических исследований согласно примеру 5 состоит из 120 мг/мл каптизола в воде с требуемым количеством пептида (0.5. 1.0 или 2.5 мг/мл). и НС1. и ΝαΟΗ для корректировки рН.

Таблица 1

Усилители растворимости. используемые для разработки композиции соединения 1

Классификация усилителей растворимости	Усилители растворимости
Растворители	Кремофор ЕЬ, СМС, этанол, ЭМА, глицерин, пропиленгликоль, ПЭГ 400, монотиоглицерин
Сорастворители	Полисорбат 20, полисорбат 80
Солюбилизаторы	Аргинин, Η3Ά, глицин, креатинин, глутаминовая кислота, лизин (ацетатная соль и свободное основание), каптизол, гидроксипропил-β-циклодекстрин
Наполнители	Маннит, сорбит, декстроза, лактоза, декстран
Агенты для корректировки рН	Цитратный буфер, ацетатный буфер, карбонат натрия

Таблица 2

Список сорастворителей и стабилизаторов. оцениваемых в композициях пептидного соединения 1

Усилитель растворимости*	Используемый %	Стандартное количество на основании литературы, %	Количество добавляемого пептида (мг/мл)	Анализ, %	рН композиции	Примечания
Альбумин (Н8А), Декстроза	1,5 1,5	0,4-5,0	5		6,0 доведено до 4,1	Нерастворимо
Альбумин (Н8А), Полисорбат 80, Глицин	1,0 0,6 2,0	0,4-5,0 0,8-4,0 0,2-2,1	5		5,8 доведено до 4,1	Нерастворимо
Аргинин	1,5	0,8-1,6	15	93	9,8	Прозрачный раствор
АргининНС1	2,0	0,8-1,6	5	-	3,5	Нерастворимо
Аргинин Лактоза	1,5 1,5	0,8-1,6	15	93	9,8	При снижении рН ниже 8,5 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Каптизол	10,0 20,0	до 30,0	10	86 89	4,9 доведено до 4,4	Мутный раствор
СМС (карбоксиметил целлюлоза) в ацетатном буфере	0,2 0,05 М		5	90	5,0	Для токсикологических исследований

- 16 009123

Креатанин	0,8	до 0,6	5	-	6,1 доведено до 4,1	Нерастворимо
Кремофор ЕЬ Этанол Диметилацетамид	15,0 10,0 6,0	-10,0 0,6-32,9 0,012-6,0	5		4,0	Очень мутный
Декстран	от 4,0 до 15,0	3,0-30,0	5	-	3,9	Нерастворимо
Диметилацетамид (ЭМА)	6,0-20,0	0,012-6,0	5	-	4,6	Нерастворимо
Диметилацетамид (ОМА)	25,0	0,012-6,0	5	87	5,1	Прозрачный раствор
Диметилацетамид (ЭМА)	30,0	0,012-6,0	10	93	5,1	Прозрачный раствор
Этанол	10,0	0,6-32,9	5	-	-	Нерастворимо
Глутаминовая кислота	2,0		5		3,7	При повышении рН выше 4 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Глицерин	1,5	1,6-32,5	5	37	4,5	Нерастворимо
Глицерин	30,0	1,6-32,5	5	-	3,7	Нерастворимо
Глицерин, Полисорбат 80	10,0 0,6	1,6-32,5 0,8-4	5	12	6,5 доведено до 4,5	Нерастворимо
Глицин	0,4	0,2-2,1	5	-	4,6	Нерастворимо
Гидроксипропил-βциклодекстрин	20,0	до 30,0	10	99	4,6	Прозрачный раствор
Лизин, ацетатная соль	2,0		5	-	3,8	Нерастворимо
Лизин,свободное основание	2,0		5		9,2	При снижении рН ниже 8 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Маннит в цитратном буфере	4,0 0,035 М	2,0-10,0	5	38	3,4	Для токсикологических исследований
Маннит в ацетатном буфере	4,0 0,05 М	2,0-10,0	5	32	4,3	Для токсикологических исследований
Маннит, Глицин	20,0 0,4	2,0-10,0 0,2-2,1	5	14	6,4 доведено до 4,5	Нерастворимо
Маннит, Полисорбат 20	20,0 0,6	2,0-10,0	5	22	6,5 доведено до 4,5	Нерастворимо
Монотиоглицерин	1,0	0,1-10,0	5	-	4,5	Мутный раствор
ПЭГ 400	30,0	до 30,0	5	88	4,2	Слегка опалесцирующий
ПЭГ 400	30,0	до 30,0	10	89	4,2	Мутный раствор
ПЭГ 400 с ϋΜΑ	30,0 6,0	до 30,0 0,012-0,6	5	94	4,2	Прозрачный раствор
ПЭГ 400	10,0	6,0-18,0	5	58	4,2	Нерастворимо
ПЭГ 400 ЭМА	10,0 10,0	до 30,0 0,012-0,6	5	-	4,3	Нерастворимо
ПЭГ 400 Пропиленгликоль РСг	10,0 10,0	до 30,0 10,0	5	-	4,1	Нерастворимо
ПЭГ 400 Пропиленгликоль	18,0 50,0	до 30,0 10,0	5	100	4,2	Прозрачный раствор
Полисорбат 80	1,6	0,8-4,0	5	24	7,2 доведено до 4,5	Нерастворимо
Полисорбат 80	6,0	0,8-4,0	5	-	3,9	Нерастворимо
Полисорбат 80 Креатанин	6,0 0,6	0,8-4,0 до 0,6	5	-	4,0	Нерастворимо
Пропиленгликоль РС ЭМА	10,0 10,0	10,0 0,012-0,6	5	-	4,2	Нерастворимо
Пропиленгликоль РС	10,0,30,0	10,0	5	-	4,2	Нерастворимо
Карбонат натрия	1,5		5		11,4	При снижении рН ниже 8,5 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Сорбит	5,0	10,0-25,0	5	-	6,9 доведено до 4,5	Мутный раствор

- 17 009123

Таблица 3

Композиции соединения 1 при низких концентрациях пептида

Усилитель растворимости*	Используемый %	Стандартное количество на основании литературы, %	Количество добавляемого пептида (мг/мл)	Анализ, %	рН композиции	Примечания
Альбумин (Н8А)	5,0	0,4-5,0	1,0 2,5	90	6,9 доведено до 4,5	Прозрачный раствор Мутный раствор
Аргинин	1,5	0,8-1,6	1,0	24	10,6 доведено до 8,5	При снижении рН ниже 8,5 пептид выпадал в осадок и раствор превращался в гель
Каптизол	12,0	до 30,0	1,0 2,5	106 100	5,3 от 6,5 до 8,5	Прозрачный раствор
Декстран	20,0	3,0-30,0	1,0	6,9	4,8 доведено до 4,0	Мутный раствор
Глицерин	30,0	1,6-32,5	1,0	-	4,8 доведено до 4,0	Мутный раствор
Маннит	4,0	0,8-4,0	1,0	64	4,7 доведено до 4,0	Мутный раствор
Полисорбат 20	10,0		1,0 2,5	95 88	5,8 доведено до 4,8	Прозрачный раствор Прозрачный с небольшим количеством осадка
Полисорбат 20 Маннит	10,0 2,0	2,0-10,0	2,5	115	5,1 доведено до 4,3	Прозрачный раствор
Полисорбат 80	4,0 6,0-10,0	0,8-4,0	1,0 2,5	91 89	5,5 доведено до 5,0	Прозрачный раствор Слегка мутный раствор
Полисорбат 80 Маннит	4,0 2,0	0,8-4,0 2,0-10,0	2,5	88	5,1 доведено до 4,4	Слегка мутный раствор
Пропиленгликоль РО	10,0	10,0	1,0	78	5,0 доведен до 4,4	Мутный раствор
Сорбит	20,0	10,0-25	1,0	52	4,5	Мутный раствор

Пример 2. Протокол приготовления раствора соединения 1 в каптизоле.

Стандартные способы растворения, такие как смешивание сухого соединения 1 и сухого каптизола в воде или добавление соединения 1 к приготовленному раствору каптизола и воды, не приводили к полному растворению в требуемых концентрациях. Тестировали несколько разных концентраций как соединения 1, так и каптизола при разных уровнях рН. Однако следующий способ приготовления раствора соединения 1 в каптизоле приводил к полному растворению в требуемых концентрациях.

Вещества

Каптизол, соединение 1 и вода.

Способ

1. Взвешивают соответствующее количество каптизола, чтобы получить конечную концентрацию 120 мг/мл.

2. Добавляют 80% конечного количества воды и перемешивают в течение 10 мин с использованием магнитной мешалки.

3. Взвешивают соединение 1, чтобы получить конечную концентрацию 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл.

4. Добавляют пептид к раствору каптизола. Перемешивают в течение 1 ч.

5. Повышают рН, чтобы получить прозрачный раствор (в композиции 2,0 мг/мл может быть необходимо повысить рН немного выше 9). рН необходимо корректировать, используя 1,0н. НС1 и 1,0н. ЫаОН. Перемешивают в течение 10 мин.

6. При необходимости корректируют рН до диапазона от 7,5 до 8,5 (используя либо НС1, либо ЫаОН, 1,0н.).

7. Добавляют воду до конечного объема.

8. Фильтруют раствор через фильтр из ацетата целлюлозы с порами 0,2 мкм.

9. Регистрируют конечное значение рН.

10. Делят на аликвоты и хранят при подходящей температуре.

Пример 3. Лиофилизация раствора соединения 1 и каптизола.

Данный способ лиофилизации отличается от других способов лиофилизации тем, что процентное содержание сухого остатка в композиции выше (12%), тогда как лиофилизованные продукты обычно содержат от 5 до 10% сухого остатка.

Оборудование

В качестве лиофильной сушилки использовали лиофилизатор Еб^агбз Ьуойех 0.6. Осуществляли ΐρ/ОО

- 18 009123 оборудования и проверяли в отношении соответствия посредством проверки качества до разработки способа. Готовили растворы соединения 1 и каптизола с концентрациями соединения 1 0,5, 1,0 и 2,5 мг/мл. Загружаемый объем доводили до 1 мл (1,05 г).

Основные стадии способа

1. Замораживание.

2. Выдерживание (при низкой температуре).

3. Сушка в вакууме в две стадии:

3.1. первичная сушка - нагревание стеллажа для сушки до верхней поддерживаемой температуры, контроль температуры стеллажа на верхнем поддерживаемом уровне,

3.2. вторичная сушка - снижение давления до минимального значения при верхней поддерживаемой температуре стеллажа.

Партии 1-3

Замораживание - замораживание проводили от комнатной температуры до -40°С в течение 2 ч. Стеллажи поддерживали при -40°С в течение 3 ч.

Сушка - сушку осуществляли при давлении 110 мкбар. Температуру стеллажа увеличивали до 20°С в течение 13 ч и поддерживали при данной температуре еще в течение 13 ч.

Общее время процесса составляло 31 ч.

Результаты

Результаты по содержанию воды:

партия 1: 3,8%, партия 2: 4,0% и партия 3: 4,9%.

Партии 4 и 5 Так как результаты по содержанию воды при использовании способов, приводящих к получению партий 1, 2 и 3, были выше, чем требуемое значение, было решено добавить стадию вторичной сушки при той же самой температуре и при низком давлении.

Сушка - сушку осуществляли при давлении 110 мкбар. Температуру стеллажа увеличивали до 20°С в течение 13 ч и поддерживали при данной температуре еще в течение 13 ч (партия 4) или 8 ч (партия 5). Давление понижали до 10 мкбар дополнительно в течение 5 ч.

Общее время процесса составляло 36 ч.

Результаты

Результаты по содержанию воды:

партия 4: плацебо - 3,0%, мг/мл - 3,9%, партия 5: плацебо - 4,1%.

Заключение

Как показано, разработан удовлетворительный способ лиофилизации соединения 1 с каптизолом. Вследствие высокого процентного содержания сухого остатка и поэтому конденсированной лиофилизуемой массы разработанный способ является более длительным, чем имеющиеся современные циклы лиофилизации пептидов, и имеет дополнительную стадию вторичной сушки.

В табл. 4 суммирован разработанный способ.

Таблица 4

Стадия	Соединение 1 (пептид) с каптизолом
Загрузка	5°С
Замораживание	2 часа до -40°С
Выдерживание при низкой температуре	3 часа до -40°С
Первичная сушка: Нагревание до 20°С Выдерживание при 20°С	13 часов давление 110 мкбар 13 часов давление 110 мкбар
Вторичная сушка: Выдерживание при 20°С	5 часов давление 10 мкбар
Хранение при	-20°С
Время процесса	36 часов

Пример 4. Исследование биологической активности т у1уо лиофилизованного раствора соединения (ИР, 1 мг/флакон, 12% каптизол).

Биологическую активность проверяли по ингибированию секреции П.-2 из специфичных по отно

- 19 009123 шению к стандартному образцу (КЗ) соединения 1 Т-клеток после подкожной (п/к) обработки лиофилизованным раствором соединения. т.е. лекарственным продуктом (ΌΡ) при двух концентрациях. Результаты обработки сравнивают с результатами обработки мышей соединением 1 (КЗ) в фосфатно-солевом буфере (РВЗ). Результаты показаны в таблице ниже и на фиг. 2.

План эксперимента

1. Иммунизация (соединение 1 КЗ. эмульгированное с СРА. во все четыре подушечки лап) 0 день

2. Обработка (п/к в заднюю часть шеи. в 200 мкл раствора) 0 день

3. Активация ΐη νΐΐΓο 10 день

a) соединением 1 КЗ в концентрациях 0; 0.5; 1; 2.5; 5; 10; 25; 50 и 100 мкг/мл;

b) пептидом с обратным порядком аминокислот относительно соединения 1 (негативный контроль);

c) Соп А (позитивный контроль).

4. Инкубация культуры в течение 20 ч при 37°С в инкубаторе во влажной атмосфере с 5% СО₂.

5. Измерение П.-2 с помощью Е1ЛЗА.

Таблица 5

Таблица экспериментальных групп

Группа	Иммунизация	Обработка
А	50 мкг соединения 1 КЗ	50 мкг соединения 1 КЗ в РВЗ
В	200 мкг соединения 1 КЗ в РВЗ
С	50 мкг ΩΡ (партия 2)
ϋ	200 мкг ϋΡ (партия 2)
Г	Плацебо (12% каптизол)

Таблица 6 Секреция II .-2 у мышей. обработанных соединением 1 (ΌΡ) после активации ΐη νΐΐΓο соединением 1 КЗ. пг/мл

Обработаны

	Группа	Р	А	В	С	ϋ
Активатор	Концентра ция активатора (мкг/мл)	12% каптизол в ампулах	Соедине ние 1 К8 50, мкг/мышь	% ингиби рования	Соедине ние 1 К8 200, мкг/мышь	% ингиби рования	ϋΡ 50, мкг/мышь	% ингиби рования	ϋΡ 200, мкг/мышь	% ингиби рования
Соп А	2,5	5,825	6,215		5,403		3,537		4,069
Соединение 1 К8	0	НПКО	НПКО		НПКО		НПКО		НПКО
Соединение 1 К.8	0,5	11	9		19		8		НПКО
Соединение 1 К8	1	10	НПКО		НПКО		НПКО		НПКО
Соединение 1 К.8	2,5	15	8	51	НПКО	НП	6	61	6	62
Соединение 1 К8	5	20	9	55	8	60	10	48	7	63
Соединение 1 К8	10	25	16	38	11	58	13	48	8	67
Соединение 1 К8	25	29	15	48	11	63	16	45	13	56
Соединение 1 К8	50	40	21	47	15	62	20	50	12	69
Соединение 1 К8	100	42	25	41	18	58	24	43	15	64
	Среднее ингибирование (%) (в диапазоне 5-100 мкг/мл)	45,6	60,4	46,8	63,7

НПКО = Ниже предела количественного определения.

Строки 1-4 не включали в кривую.

НП = Не применимо.

Пример 5. Оценка оптимальной дозы для обработки.

В дальнейшем описании использовали следующие сокращения.

СРА Полный адъювант Фрейнда

Οοι А Конканавалин А

ΌΡ Лекарственный продукт

БЗ Лекарственное вещество

ЕМ-1 Обогащенная среда БССМ-1

ЕМ-3 Обогащенная среда КРМЕ1640 + фетальная сыворотка теленка

РСЗ Фетальная сыворотка теленка

ΉΝ-γ Интерферон-гамма

ΕΝ Лимфатический узел

- 20 009123

РВЗ	Фосфатно-солевой буфер
КЗ	Стандартный образец
п/к	Подкожное
ТВ	Трипановый синий
ΤΟΡ-β	Трансформирующий фактор роста-бета
^ΡΙ	Вода для инъекции

Введение

Группу из 20 мышей иммунизировали 50 мкг/мышь соединения 1 КЗ. Иммунизированных мышей распределяли на пять групп обработки, которые указаны далее: плацебо, 25, 50, 100 и 200 мкг/мышь соединения 1 1)Р (подкожное введение). Через 10 дней после иммунизации и обработки извлекали ΓΝ и готовили суспензию отдельных клеток. Затем измеряли секрецию ш νίΐΐΌ ΙΡΝ-γ и ΤΟΡ-β культивируемыми клетками в ответ на активацию несколькими концентрациями соединения 1 КЗ.

План эксперимента

1. Иммунизация 0 день

2. Обработка соединением 1 ОР 0 день

3. Активация ш νίΐΐΌ клеток ΓΝ от обработанных мышей 10 день

4. Сбор культуральной среды (для определения ΙΡΝ-γ) 12 день

5. Сбор культуральной среды (для определения ΙΟΡ-β) 13 день

6. ЕЫЗА в отношении ΙΡΝ-γ

7. ЕЫЗА в отношении ΤΟΡ-β

Таблица 7

Экспериментальные группы

Экспериментальная группа	Обработка	Активация ΐη νΐίΓο
Режим	Мышей/группу	Клеток/лунку	Концентрация соединения 1 КЗ
А 1	Контроль, 1 по/	Л	2,5x10⁶
	1 Л* /0 каптизол		5х10⁶
А2	25	4	2,5x10⁶
мкг/мышь	5х10⁶	Соединение 1 КЗ
АЗ	50	4	2,5x10⁶
мкг/мышь	5х10⁶	0-100 мкг/мл
А4	100	4	2,5x10⁶
мкг/мышь	5х10⁶
А5	200	4	2,5x10⁶
мкг/мышь	5х10⁶

Материалы и реагенты

Животные.

Мыши: 20 самок мышей ВАЬВ/с, поставляемых центром разведения животных Наг1ап, Кейоуо!. Возраст во время иммунизации (неделя+дни): 10.

Средняя масса мышей, включенных в эксперимент: 19,01 г.

Вещества.

Общие реагенты: 70% этанол получали из 96% этанола разбавлением очищенной Н₂О.

Приготовление растворов соединения 1 для иммунизации

Эмульсию СРА-соединение 1 КЗ (500 мкг/мл, 50 мкг/мышь) готовили следующим образом.

1. 1,874 мг соединения 1 растворяли в 1,87 мл ^ΡΙ, получая раствор 1 мг/мл.

2. Раствор проверяли с помощью рН-индикаторной полоски и обнаружили, что он имеет рН 5.

3. 1,5 мл раствора эмульгировали с 1,5 мл СΡА, получая конечную концентрацию 500 мкг/мл.

Приготовление растворов для обработки

Обработку проводили п/к-инъекцией 200 мкл раствора.

Приготовление 12% раствора каптизола

1,2 г каптизола растворяли в 10 мл ^ΡΙ, получая 12% раствор каптизола.

Последовательность операций при проведении эксперимента Взвешивание мышей.

Мышей взвешивали перед иммунизацией. Средняя масса мышей: 19,01±0,97 г.

- 21 009123

Иммунизация.

Иммунизацию проводили инъекцией 100 мкл эмульсии для иммунизации (50 мкл в каждую подушечку задних лап).

Обработка.

После стадии иммунизации мышей обрабатывали п/к-инъекцией по 200 мкл из указанных растворов для обработки, содержащих соединение 1 ΌΡ или 12% каптизол, в заднюю часть шеи.

Культивирование ш νίίτο.

Мышей забивали смещением шейных позвонков. ΓΝ извлекали из задних конечностей и переносили в стерильную чашку Петри, содержащую примерно 5 мл ΚΡΜΙ. Клетки выделяли осторожным продавливанием ткани через стальную сетку с ячейками 200 мкм. Клетки собирали и центрифугировали при 300 д в течение 10 мин при комнатной температуре.

Суспензии отдельных клеток готовили из объединенных ΓΝ из каждой экспериментальной группы.

Суспензии 2,5 и 5,0 млн клеток/мл/лунку культивировали с соединением 1 К8 (0-100 мкг/мл) в ЕМ-1.

Секрецию ΙΓΝ-γ и ΤΟΓ-β в качестве показателя клеточного ответа определяли посредством ЕЫ8Л культуральной среды (48 ч для ΙΓΝ-γ и 72 ч для ΤΟΓ-β).

Таблица 8 Экспериментальные группы ш νίίτο

Экспериментальная группа	Обработка	Активация ΐη νΐίΓΟ
Режим	Клеток/группу	Концентрация активирующего вещества
А1-2,5	Контроль, 12% каптизол	2,5x10⁶	Соединение 1 К.8 0; 3,125; 6,25; 12,5; 50 и 100 мкг/мл Соп А 2,5 мкг/мл
А1-5	5х10⁶
А2-2,5	ϋΡ 25 мкг/мышь	2,5x10⁶
А2-5	5x10⁶
АЗ-2,5	ϋΡ 50 мкг/мышь	2,5x10⁶
АЗ-5	5х10⁶
А4-2,5	ЭР 100 мкг/мышь	2,5x10⁶
А4-5	5х10⁶
А5-2,5	ЭР 200 мкг/мышь	2,5x10⁶
А5-5	5х10⁶

Приготовление суспензий клеток

Таблица 9

Результаты подсчета клеток и приготовление клеточных суспензий (10х10⁶/мл)

Группа	Объем (мл)	Коэффициент разбавления	Живые клетки	Мертвые клетки	% живых клеток	% мертвых клеток	Среднее количество живых клеток	Общее количество живых клеток (χ 10⁶)	ЕМ-1, необходимое для добавления (мл) для суспензии 10x10⁶ клеток/мл
А1	10	16	115	-	100	--	112	179,2	17,9
109	--	100	-
А2	10	16	50	4	92,6	7,4	47,5	76	7,6
45	2	95,7	4,3
АЗ	10	16	80	4	95,2	4,8	80,5	128,8	12,8
81	5	94,2	5,8
А4	10	16	87	--	100	--	89	142	14,2
91	--	100	-

120	2	98,4	1,6
105	2	98,1	1,9

- 22 009123

Приготовление суспензии клеток (5х10⁶/мл)

Суспензию 10х 10⁶ клеток/мл разбавляли 1:2 добавлением 5 мл ЕМ-1 к 5 мл клеточной суспензии. Инкубация культур клеток ΕΝ в 48-луночных планшетах

Готовили 3 планшета для культуры ткани. В каждый планшет добавляли следующее.

Контроль фона (клетки. инкубированные с культуральной средой)

0.5 мл суспензии клеток

0.5 мл культуральной среды (ЕМ-1)

Позитивный контроль системы (клетки. стимулированные Соп А)

0.5 мл суспензии клеток

0.5 мл Соп А 5 мкг/мл в ЕМ-1 (конечная концентрация 2.5 мкг/лунку)

Клетки. инкубированные с активирующими растворами соединения 1 (образцы)

0.5 мл суспензии клеток

0.5 мл соединения 1 К8 6.25-200 мкг/мл (конечная концентрация 3.125-100 мкг/мл/лунку) Инкубация культур клеток ΕΝ в 96-луночных планшетах

После приготовления 48-луночных планшетов готовили 96-луночные планшеты. используя 100 мкл из суспензии клеток и 100 мкл из активирующих растворов.

Планшеты для культивирования инкубировали при 37°С в инкубаторе с увлажнением и 5% СО₂ в течение 48 или 72 ч.

Сбор надосадков

Культивируемые планшеты центрифугировали при 300 д в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадки (850 мкл из каждой лунки) переносили либо в зеркальные планшеты. либо в пробирки. Затем надосадок делили на аликвоты для работы (две аликвоты по 200 и одна аликвота объемом 450 мкл). чтобы избежать повторного замораживания/оттаивания образцов. Каждую пробирку помечали соответствующей подробной информацией.

1. Код эксперимента и время после инкубации.

2. Номер группы и образца.

3. Активатор и концентрация.

4. Дата сбора надосадка.

Надосадки хранили при -20°С вплоть до использования в ЕС-18А.

Результаты

Таблица 10

Сводная информация о группах

Экспериментальные группы:

Иммунизация

Эксперимен тальные группы

Обработка ^Д°^3а Подгруппа иммунизации ⁷

Режим

Активация ΐη νΐίΓΟ

А1

А2

12% каптизол Контроль, плацебо

Соединение 1 мкг/мышь мкг/мышь

АЗ

Соединение 1 мкг/мышь

Соединение 1 К.8

3,125-100 мкг/мл

А4

А5

Соединение 1

100 мкг/мышь

Соединение 1

200 мкг/мышь

- 23 009123

Конечные концентрации цитокина

Таблица 11-А

Конечная концентрация цитокина, пг/мл (2,5 млн клеток/лунку)

Концентрация соединения 1	Плацебо	50 мкг/мышь	100 мкг/мышь	200 мкг/мышь
3,125 мкг/мл	321,3	54,1	64,5	103,9
6,25 мкг/мл	238,6	81,8	116,1	126,1
12,5 мкг/мл	397,1	123,1	180,9	129,0
25 мкг/мл	655,5	215,1	262,8	240,3
50 мкг/мл	573,9	292,5	518,3	378,1
100 мкг,мл	926,0	531,8	582,7	524,1
Соп А	322,6	356,2	337,4	нпко

Таблица 11-В

Конечная концентрация цитокина, пг/мл (5 млн клеток/лунку)

Концентрация соединения 1	Плацебо	25 мкг/мышь	50 мкг/мышь	100 мкг/мышь	200 мкг/мышь
3,125 мкг/мл	522,3	НПКО	76,2	90,8	204,4
6,25 мкг/мл	634,8	НПКО	109,2	157,8	244,1
12,5 мкг/мл	962,8	41,9	179,5	257,1	466,1
25 мкг/мл	967,4	70,0	277,9	421,7	660,5
50 мкг/мл	1338,8	104,2	373,4	739,7	922,5
100 мкг,мл	2010,2	185,2	547,0	995,5	1006,2
Соп А	6839,8	2995,3	4837,0	10126,8	7722,8

Результаты также представлены на фиг. 3, 4.

Результаты наблюдения

Секреция ΙΓΝ-γ.

1. В группе плацебо показана линейная дозовая зависимость при активации соединением 1 ίη νίΐΐΌ. Данный график сходен с графиком, полученным для модели ех νίνΌ при такой же дозе иммунизации (50 мкг/мышь) и культуральной среде (ЕМ-1).

2. Дозовая зависимость при активации соединением 1 ίη νίΐΐΌ имела место во всех тестированных группах.

3. Значимое ингибирование секреции ΙΓΝ-γ наблюдали при всех дозах, используемых для обработки (среднее 95% ингибирование при дозе обработки 25 мкг/мышь). Может быть выявлена обратная корреляция между дозой, которая служит для обработки, и % ингибирования, в основном, при использовании 5х10^б клеток/лунку. При использовании 2,5х10^б клеток/лунку обработка животных 50 мкг/мышь давала большее ингибирование, чем 100 или 200 мкг. Точка 25 мкг пропущена (недостаток клеток).

4. Большее ингибирование наблюдали при использовании 5х10⁶ клеток/лунку вместо 2,5 х10⁶ клеток/лунку.

5. На линейном диапазоне кривой 8Ό ингибирования в % было низким.

6. Техническая проблема, связанная с Соп А, выражена при использовании 2,5 х10⁶ клеток/лунку. Секреция ΤΟΕ-β.

1. В группе плацебо не наблюдали дозовой зависимости при активации ίη νίΐΐΌ соединением 1. Секретируемый уровень ТОЕ-β был ниже предела определения в ЕБ18А во всех других группах обработки.

Пример 6. Оптимизации цикла сублимационной сушки в случае соединения 1 и каптизола для инъекции (0, 0,5, 1,0 и 2,5 мг/флакон).

Цель

Целью данного исследования была оптимизация цикла сублимационной сушки соединения 1 с каптизолом для инъекции, чтобы улучшить форму лиофилизуемой массы и избежать смятия и растрескивания. Соответственно, было решено улучшить и оптимизировать цикл лиофилизации. Данный цикл перенесен в промышленные лиофилизаторы для производства партий для испытаний фазы I.

- 24 009123

Оптимизация способа

Готовили партии пептида с концентрациями 0,5, 1,0, 2,5 мг/мл и плацебо и осуществляли несколько циклов сублимационной сушки. В качестве сублимационной сушилки использовали лиофилизатор Ебэдагбз Ьуойех 0.6.

Тестировали растворимость, содержание воды и внешний вид лиофилизованного материала.

Согласно полученным результатам выбран новый цикл лиофилизации соединения 1. Вследствие высокого процентного содержания сухого остатка (12%) и поэтому конденсированной лиофилизуемой массы новый способ является более длительным, чем цикл лиофилизации в примере 3, и имеет дополнительную стадию первичной сушки. В табл. 12 суммированы различия между способами.

Таблица 12

Стадия	Цикл лиофилизации для соединения 1 и каптизола из примера 3	Новый цикл лиофилизации для соединения 1 и каптизола
Загрузка	5°С	5°С
Замораживание	2 часа до -40°С	6 часов до -45°С
Выдерживание при низкой температуре	3 часа до -40°С	3 часа до -45°С
Первичная сушка: Стадия I Стадия II Выдерживание при 20°С (25°С)	до 20°С 13 часов давление 110 мкбар 13 часов давление 110 мкбар	до -20°С 19 часов давление 150 мкбар до 25°С 13 часов давление 150 мкбар 8 часов давление 150 мкбар
Вторичная сушка: Выдерживание при 20°С	5 часов давление 10 мкбар	-
Хранение при	5°С	5°С
Время процесса	36 часов	49 часов

Пример 7. Действие соединения 1 (введенного в каптизоле) на симптомы волчанки у склонных к СКВ самок мышей (ΝΖΒχΝΖ№)Ε1.

Пациентов, принимающих участие в клинических испытаниях, будут лечить соединением 1, используя в качестве эксципиента каптизол (натриевую соль сульфобутиловый эфир-бета-циклодекстрина). По этой причине важно определить, будет ли обработка мышей (ΝΖΒχΝΖ№)Ε1 композицией соединения 1, вводимого в каптизоле, оказывать такое же лечебное действие на симптомы волчанки, которое наблюдается при обработке мышей такой же линии соединением 1 в РВ8.

С этой целью самок мышей (ΝΖΒχΝΖ№)Ε1 (примерно 8-месячного возраста) делили на 3 группы, которые обрабатывали подкожно 1 раз в неделю в течение 10 недель либо отдельно каптизолом (п=8), либо 25 или 50 мкг/мышь соединения 1 в каптизоле (п=9 и 10, соответственно). Указанные дозы были выбраны потому, что предшествующие исследования показали, что дозы в данном диапазоне более эффективны в ослаблении симптомов СКВ, чем более высокие тестированные дозы (100 и 200 мкг/мышь). Одну и ту же партию лекарственного вещества использовали в данном исследовании и в первом клиническом испытании фазы I соединения 1.

У мышей проводили наблюдения в отношении анти-днДНК-антител и протеинурии. После забивания мышей определяли интенсивность 1СЭ в почках.

Как можно видеть на фиг. 5, не наблюдалось значимых различий между группами по уровням днДНК-специфичных антител после 10 инъекционных обработок.

В табл. 13 также показано, что целебное действие обработки соединением 1 может наблюдаться, начиная с 5-й инъекции, и поддерживается до 10-й инъекции. Средние уровни протеинурии в контрольной группе, обработанной каптизолом, были, соответственно, выше, чем в группах, обработанных соединением 1. В табл. 13 также показано, что наблюдалось уменьшение интенсивности 1СЭ в почках в обеих группах, обработанных разными дозами соединения 1. Имела место общая тенденция, свидетельствующая, что более низкая доза (25 мкг/мышь) была более эффективна, чем более высокая доза (50 мкг/мышь) в снижении клинических симптомов СКВ у данных мышей.

- 25 009123

Таблица 13

Клинические симптомы СКВ у мышей (У2ВхУ2Ш)Г1, обработанных 25 или 50 мкг/мышь соединения 1 (в каптизоле)

Группа исследования	Среднее Количес 5	значение пре гво недель пс 7	теинурии ± 8 еле начала о( 8	ЕМ (г/л) >работки 10	1СО^а (среднее ± 8ЕМ)
Каптизол	1,81±1,22 (п=8)	5,74±3,13 (п=8)	4,5±2,92 (п=7)^ь	4,46±2,93 (п=7)^ь	2,29±0,28 (п=7)
Соединение 1 (50 мкг/мышь)	0,75±0,3 (п=10)	0,81±0,3 (п=10)	1,09±0,4 (п=10)	1,29±0,3 (п=10)	1,90±0,23 (п=10)
Соединение 1 (25 мкг/мышь)	0,16±0,05 (п=9)	1,26±1,09 (п=9)	0,5±0,31 (п-9)	0,56±0,3 (п=9)	1,22^с±0,32 (п=9)

^а Κ',Ό = отложения иммунных комплексов. Шкала интенсивности ШЭ: 0 = нет; 1 = умеренное; 2 = тяжелое; 3 = тяжелое/очень интенсивное.

^ь Гибель одного животного с высоким уровнем протеинурии привела к более низкому среднему значению в группе.

^с р<0,05 (по сравнению с контрольными мышами, обработанными каптизолом; Манн-Уитни).

На фиг. 6 показаны типичные срезы одной почки из каждой группы обработки. Срезы верхнего ряда получены от мыши, обработанной каптизолом, срезы среднего ряда от мыши, обработанной 50 мкг/мышь соединения 1, и срезы нижнего ряда получены от мыши, обработанной 25 мкг/мышь соединения 1. Можно видеть, что интенсивность отложений иммунных комплексов, наблюдаемая в срезах почек мышей, обработанных соединением 1 (растворенным в каптизоле) при обоих уровнях доз, была намного ниже, чем интенсивность, наблюдаемая в контрольной группе.

Пример 8. Клиническое исследование фазы I.

Проводимое в нескольких центрах, рандомизированное, двойное слепое, с плацебо-контролем, с использованием однократной дозы, с четырьмя вариантами исследование фазы I, чтобы оценить переносимость и безопасность подкожной инъекции соединения 1 в каптизоле у субъектов с СКВ.

Это было первое клиническое исследование с использованием соединения 1 в каптизоле на людях во Франции. Основной целью исследования была оценка переносимости и безопасности соединения 1 в каптизоле, вводимого в виде однократной п/к-инъекции субъектам с СКВ. Второй целью исследования была оценка иммунологических ответов после однократной п/к-дозы соединения 1 в каптизоле у указанных субъектов.

В исследовании принимали участие тридцать шесть (36) субъектов. Для включения пациентов с СКВ в исследование должно выполняться по меньшей мере четыре критерия, используемых для диагностики волчанки согласно Американской коллегии ревматологии. Пациенты также должны иметь стабильное, легкое/умеренное заболевание и оценку в баллах, меньше или равную 10, согласно индексу активности заболевания СКВ 8^Е^АI.

Каждый пациент получал однократную п/к-инъекцию перерастворенного соединения 1 для инъекции или соответствующего плацебо (каптизол) в соответствии со следующим распределением по группам:

группа А: плацебо (каптизол), группа В: 0,5 мг соединения 1 в каптизоле, группа С: 1 мг соединения 1 в каптизоле, группа Э: 2,5 мг соединения 1 в каптизоле.

Проводили стандартную группу тестов на безопасность, включая сбор крови и мочи для лабораторных тестов, во время отбора, в день введения дозы, через 24 ч после введения дозы и на 2, 4 и 8 неделе после введения дозы. Перед введением дозы и при последующих намеченных посещениях брали образцы крови для иммунологических тестов, имеющих отношение к СКВ, тестов на антитела против соединения 1 и анализа пролиферации РВЕ. Выполняли следующие иммунологические тесты:

Кумбса (прямой и непрямой),

С3, С4 и СН50, общий !д6, !дМ и !дА,

АNА, анти-днДНК (анализ Фарра), анти-онДНК, анти-ЕNА (включая анти-Еа, анти-Во, анти-РНП, анти-8т), антитела против кардиолипина, ¥ОВЕ, антитела ГТА, ревматоидный фактор.

- 26 009123

Безопасность и переносимость соединения 1 в каптизоле в популяции субъектов оценивали на основе следующих критериев:

наличие нежелательных явлений (АЕ), включая вспышку СКВ, основные жизненные показатели,

ЭКГ в 12 отведениях, изменения при физическом обследовании, стандартные клинические лабораторные тесты, оценка критерия 8ΕΕΌΑΙ, результаты иммунологических тестов.

Подробное описание фазы 1а клинического исследования

Основные исполнители исследования и соответствующие места исследования.

Шесть (6) исследовательских центров во Франции: проф. 1еап Сйаг1ек Р1е11е (Норйа1 Ьа РШе 8а1ре1пеге, Рапк), проф. Ойуег Меуег (Норйа1 В1сйа1, Рапк), проф. 1еап Веуих (Норйа1 Непп Мопбог, Сге1ей), проф. Бою Сш11еуш (Норйа1 Аукеппе, ВоЫдпу), проф. Елс Насйи11а (Норйа1 С1аибе Ниле/, ЬШе Себех), проф. Хау1ег МалеИе (Норйа1 В1се1ге, Кгеш1ш Вюе1ге).

Соединение 1 (в каптизоле), плацебо, вода для инъекций - ампулы, доза и способ введения.

Соединение 1 в каптизоле (120 мг/флакон) из флаконов инъецировали подкожно в виде однократной дозы субъекту в следующих дозах: 0,5 мг соединения 1/флакон в каптизоле, 1 мг соединения 1/флакон в каптизоле и 2,5 мг соединения 1/флакон в каптизоле.

Плацебо для соединения 1.

120 мг каптизола/флакон (идентичный по внешнему виду с флаконами соединения 1 в каптизоле). Методика.

В нескольких центрах проводили рандомизированное, двойное слепое, с плацебо-контролем, с четырьмя вариантами исследование, используя однократную подкожную инъекцию соединения 1 или плацебо. Отбор пациентов с СКВ осуществляли до 21 дня перед исходными процедурами. Каждого выбранного для исследования субъекта случайно распределяли в одну из 4 групп лечения: подкожная инъекция 0,5, 1 или 2,5 мг соединения 1 или соответствующего плацебо. Всех субъектов принимали в клинике в день, предшествующий введению дозы. Каждый субъект получал однократную дозу одного из перечисленных выше средств лечения. Субъектов отпускали из клиники через 24 ч после введения дозы. В дальнейшем проводили наблюдение за субъектами на 2, 4 и 8 неделе после введения дозы. Брали образцы крови (сыворотки и цельной крови) для лабораторных тестов на безопасность при отборе, в день введения дозы (перед дозой), во 2 день (после дозы), на 2, 4 и 8 неделе (последнее посещение). Образцы крови для иммунологических тестов брали при отборе, в день введения дозы (перед дозой) и на 4 и 8 неделе. Пролиферацию лимфоцитов периферической крови (РВЬ) оценивали в день введения дозы (перед дозой) и на 2, 4 и 8 неделе.

Количество субъектов (общее и для каждого режима лечения).

Тридцать шесть (36) субъектов случайно распределяли в данном исследовании следующим образом: 9 субъектов в группу лечения 0,5 мг, 9 субъектов в группу лечения 1 мг, 10 субъектов в группу лечения 2,5 мг и 8 субъектов в группу лечения плацебо.

Диагностика и основные критерии для включения в исследование.

Выбираемые для данного исследования субъекты были пациентами с СКВ, которые удовлетворяли по меньшей мере четырем диагностическим критериям Американской коллегии ревматологии (АСВ). Их состояние болезни должно быть стабильным, от слабого до умеренного с оценкой в баллах, равной или меньшей 10, согласно индексу активности заболевания СКВ, обновленному в 2000г. (8ЬЕИА1 2К).

Из участия исключали пациентов с СКВ, которые сообщали об астме нестабильного или тяжелого течения, инсульте, остром инфаркте миокарда, нестабильной ангине, кровоизлиянии в головной мозг и эмболии легких в течение 6 месяцев перед отбором для исследования. Пациенты с СКВ, которые имели какие-либо клинически значимые или нестабильные медицинские или хирургические показания, сахарный диабет, заболевание печени (цирроз, активный гепатит, портальная гипертензия и/или асциты), клинически значимую гипертонию, в истории болезни какую-либо злокачественную опухоль, диализ или хроническое обструктивное заболевание легких (СОРИ), также исключались из участия в исследовании.

Также из участия в исследовании исключали пациентов с СКВ, которые подвергались плазмаферезу или которых лечили в течение 3 месяцев перед отбором одним из лекарственных средств, перечисленных ниже: преднизон 30 мг/сутки или больше (или эквивалентная доза другого кортикостероида), внутривенные кортикостероиды, внутривенный иммуноглобулин С (1дС), пероральные антикоагулянты и любые цитотоксические средства (например, азатиоприн, хлорамбуцил, циклофосфамид, микофенолят мофетила, метотрексат, такролимус).

Кроме того, из исследования исключали пациентов с СКВ, приступивших к лечению кортикостероидами (более ±10 мг/сутки преднизона или эквивалентная доза другого кортикостероида) и/или противомалярийными средствами в течение последних 3 месяцев перед отбором.

Хотя предпринимали попытку сохранить исходно начатое лечение СКВ на протяжении всего курса исследования, однако, исследователи могли изменить лечение участника в любое время в ходе исследо

- 27 009123 вания, чтобы поддержать и оптимизировать здоровье пациента.

Критерии для оценки

Безопасность.

Оценивали следующие параметры безопасности при отборе, во время госпитализации и при повторных посещениях, включая последнее посещение: основные жизненные показатели (систолическое давление крови, диастолическое давление крови, пульс, насыщение кислородом, температура и масса), ЭКГ в 12 отведениях, изменение при физическом обследовании и стандартные клинические лабораторные тесты на безопасность. Нежелательные явления регистрировали в день введения дозы и при каждом посещении в дальнейшем.

Иммунология.

Имеющие отношение к СКВ иммунологические тесты проводили при отборе, во время госпитализации и при последующих посещениях, включая последнее посещение.

За связанными с лекарственным средством иммунологическими ответами следили, используя анализ пролиферации РВЬ и анализ антител против соединения 1, в день введения дозы и при последующих посещениях, включая последний визит.

Активность заболевания.

Оценку активности заболевания с использованием подсчета индекса активности заболевания СКВ, обновленного в 2000г. (8ЬЕБА1 2К), проводили при отборе, во время госпитализации и при последующих посещениях, включая последний визит.

Статистические способы.

Использовали компьютерную программу 8А8®, версия 9.0, чтобы проанализировать и представить данные, собранные во время данного исследования. Не проводили расчетов эффективности и не проводили формальной проверки гипотезы в данном исследовании фазы 1а.

Нежелательные явления.

Возникновение и частоту нежелательных явлений представляли по классам, соответствующим органам и системам, и с помощью предпочтительной терминологии согласно словарю МебБЯА, версия 5.0. Данные сгруппированы по группам обработки.

Клинические лабораторные данные.

Описательные статистические данные, касающиеся лабораторных показателей, включая количество определений, среднее значение, стандартное отклонение, минимальное и максимальное значения, определяли при отборе, в 1 день (перед дозой), 2 день, на 2, 4 и 8 неделе, и они представлены по группам лечения. Изменения от исходного уровня в каждой временной точке/при посещении также представлены для каждого посещения в соответствии с назначением лечения. Процент аномальных результатов (низких или высоких в соответствующих случаях) представлен на основе параметра в соответствии с группой лечения и посещением/временной точкой. Проводили анализ сдвига от исходного уровня к 24 ч после введения дозы и от исходного уровня к последнему посещению.

Основные жизненные показатели.

Описательные статистические данные, касающиеся основных жизненных показателей, включая количество определений, среднее значение, стандартное отклонение, медианное, минимальное и максимальное значения, определяли при отборе, в 1 день (перед и после введения дозы и в каждой временной точке), 2 день, на 2, 4 и 8 неделе, и они сгруппированы в соответствии с назначенным лечением. Изменения от исходного уровня в каждой временной точке/при посещении также представлены для посещения в соответствии с назначением лечения.

Масса.

Описательные статистические данные, касающиеся массы (кг) исходного уровня, в конце исследования и изменение от исходного уровня представлены по группам лечения.

ЭКГ.

Представлены описательные статистические данные, касающиеся параметров ЭКГ исходного уровня, в конце исследования и изменения от исходного уровня. Представлен анализ сдвига в виде таблиц сдвига от исходного уровня к окончанию исследования между нормальными/аномальными или имеющимися/отсутствующими параметрами ЭКГ. Потенциально клинически значимые (РС8) измерения ЦТс (по Базетту) идентифицировали согласно предварительно определенным критериям. Представлены таблицы анализа сдвига между РС8 и не-РС8 абсолютными значениями ЦТс (по Базетту) и таблица частоты РС8-изменения в ЦТс (по Базетту) от исходного уровня к любому посещению.

Физическое обследование.

Результаты физического обследования анализировали по частоте встречаемости субъектов с аномальными или нормальными данными для каждой системы организма на исходном уровне и при последнем визите. Также применяли анализ сдвига от нормальных к аномальным значениям и наоборот. В том случае, когда не происходило изменения относительно исходного уровня, использовали определение другое.

Иммунологические тесты, связанные с соединением 1.

В случае иммунологических параметров рассчитывали описательные статистические данные, включая количество определения, среднее значение, стандартное отклонение, медианное, минимальное и

- 28 009123 максимальное значения, и они представлены по группам лечения и посещениям. Изменение от исходного уровня к каждому последующему визиту также представлено по группам лечения. В соответствующих случаях количество и процент субъектов с негативными/позитивными результатами представлены по группам лечения и посещениям.

БЬЕОА! 2К.

Представлены описательные статистические данные, включая среднее значение, стандартное отклонение, медианное, минимальное и максимальное значения Б^Ε^АI 2К.

Результаты фазы Та клинического исследования

Распределение субъектов и характеристики СКВ.

Тридцать шесть (36) исследуемых субъектов начинали и закончили данное исследование по протоколу. Большинство субъектов (34) во всех группах лечения были женского пола (94,4%) и европеоидной расы (30, 83,3%). Средний возраст во всех группах лечения составлял 35,6 лет (диапазон средних значений от 32 до 39 лет). Большинство субъектов (91,7%) имели диагностические критерии согласно Американской коллегии ревматологии (АСЯ) от 4 до 6 и среднюю для группы оценку Б^Ε^АI 2К в пределах от 2,1 до 4,1.

Результаты по безопасности.

Не было заметного различия между исследуемыми группами лечения лекарственным средством и группой, принимавшей плацебо, по частоте встречаемости АЕ. Наиболее распространенными АЕ во всех группах были головная боль, классифицируемая как слабая или умеренная по природе, и реакция в месте инъекции, классифицируемая как слабая по природе. Не наблюдали зависимого от дозы ответа. В ходе исследования не встречались серьезные нежелательные явления (БАЕ) или АЕ, классифицируемые как тяжелые.

Не наблюдали клинически значимого эффекта, который можно приписать исследуемому лекарственному средству, в отношении показателей гематологии, биохимии или анализа мочи.

Не наблюдали клинически значимого эффекта, который можно приписать исследуемому лекарственному средству, в отношении параметров основных жизненных показателей (систолического кровяного давления, диастолического кровяного давления, пульса, насыщения кислородом).

Не наблюдали клинически значимого эффекта, который можно приписать исследуемому лекарственному средству, в отношении температуры и массы.

Не наблюдали клинически значимых различий между группами, которых лечили соединением 1 и плацебо, в отношении измерений ЭКГ по категориям и параметров ЭКГ в цифровой форме. Не было зарегистрировано абсолютного значения РСБ-ОТс и изменения ОТс относительно исходного уровня >60 мс. Сходное количество субъектов в группах, которых лечили соединением 1 и плацебо, имели изменение ОТ'сВ относительно исходного уровня от 30 до 60 мс.

Не отмечено клинически значимого действия соединения 1 при физическом обследовании. Иммунологические результаты.

Оценка образцов сыворотки всех субъектов показала, что однократное подкожное введение соединения 1 при уровне доз 0,5, 1 и 2,5 мг/пациенту не индуцировало образование антител, специфичных по отношению к соединению 1. У 7 субъектов имел место ответ на соединение 1 выше предела отсечения. Указанные повышенные уровни антител уже имелись перед введением дозы. Не наблюдали повышения уровней антител в последующий период (2 месяца) исследования. Сыворотки указанных субъектов анализировали в отношении изотипа реагирующих антител. Ответ у 2 субъектов был связан с изотипом ^М, и с изотипом - у 2 других. Ни у одного из семи не было специфичных антител ^Е.

Анализ лимфоцитов периферической крови (РВЬ) показал, что 50% субъектов (18) были классифицированы как отвечающие ^Ι>2) со сходным распределением во всех группах лечения. Т-клеточный ответ был относительно низким, и невозможно было выявить связи между лечебной дозой соединения 1 или концентрацией, используемой в анализе, и статусом респондера/нереспондера, принимая во внимание, что вводили только однократную п/к-дозу исследуемого лекарственного средства. Также не наблюдалось признаков повышенной частоты встречаемости статуса респондера с течением времени. Анализ столбнячного токсоида (ТТХ), который служит в качестве контроля безопасности, показывает, что ответ на ТТХ сохранялся в течение периода исследования во всех группах лечения, свидетельствуя о том, что соединение 1 в каптизоле не изменяет иммунологический ответ на повторно введенный антиген ТТХ.

Полученные иммунологические данные являются результатом введения только однократной дозы исследуемого лекарственного соединения 1.

Результаты определения активности заболевания.

Не отмечено клинически значимого влияния соединения 1 на индекс Б^Ε^АI (изменение >3, <12 пунктов) во время исследования, за исключением одного субъекта в группе лечения дозой 0,5 мг, у которого регистрировали изменение индекса Б^Ε^АI от 2 до 10 пунктов между исходным уровнем и 4 неделей на основе анализа мочи, показывающего пиурию. Исследователем не подтверждены указанные данные анализа мочи как вспышка волчанки по определению в протоколе, и было решено не изменять лечение.

Заключение

Данное исследование фазы Та показало, что однократная подкожная инъецированная доза соедине

- 29 009123 ния 1. равная 0.5. 1 или 2.5 мг в 120 мг каптизола. была безопасной и хорошо переносимой. и дало возможность для продолжения исследования с многократными дозами в фазе 1Ь.

Пример 9. Клиническое исследование фазы 1Ь.

Проводимое в нескольких центрах. двухнациональное. рандомизированное. двойное слепое. с четырьмя вариантами. с плацебо-контролем. с использованием многократных доз исследование фазы I. чтобы оценить переносимость и безопасность подкожной инъекции соединения 1 в каптизоле у субъектов с СКВ.

Данное исследование осуществляется для того. чтобы оценить безопасность и переносимость многократного п/к-введения соединения 1 субъектам с СКВ. Второй целью исследования является оценка иммунологических ответов после многократного п/к-введения соединения 1 в каптизоле у субъектов с СКВ.

Соединение 1 вводят в дозах 0.5. 1 или 2.5 мг в каптизоле. Проходящий клиническое испытание продукт вводят через день (исключая выходные дни). всего 12 п/к-инъекций. т.е. 3 дозы в неделю в течение 4 недель. Наблюдение за субъектами проводят при запланированных визитах по графику на 2. 4. 8 и 12 неделе после начала введения доз. Безопасность и переносимость оценивают. используя тесты. сходные с тестами. описанными выше для фазы 1а клинического исследования.

Результаты

Исследование фазы 1Ь показывает. что многократные подкожно инъецированные дозы соединения 1. равные 0.5. 1 или 2.5 мг в 120 мг каптизола. являются безопасными и хорошо переносимыми.

Пример 10. Выявление антител против пептидов 1а. 11а и Ша и анти-16/6 Ιά-антител в сыворотках пациентов с СКВ и здоровых людей в качестве контроля.

У людей с СКВ (32 пациента) брали кровь и их сыворотки тестировали в ЕЫ8А в отношении их способности связывать пептиды 1а. 11а и Ша. контрольный пептид р195-212 (миастеногенный пептид. описанный в публикации РСТ № νΟ 94/00148) или мАт 5012.

Выявление антител осуществляли на планшетах. которые покрывали 10 мкг/мл пептидов 1а. 11а и Ша. р 195-212 или мАт 5012 в РВ8 в течение 2 ч. промывали и блокировали 1% овальбумином в РВ8 дополнительно в течение 2 ч. ЕБ18А продолжали как описано после блокирования в примере 2 международной публикации РСТ № 96/30057. используя поликлональное антитело козы против 1дО человека. конъюгированное с пероксидазой.

Как показано на фиг. 7. у пациентов с СКВ наблюдались значительно более высокие уровни антител. которые связывают либо пептид 1а (незаштрихованные квадраты). 11а (незаштрихованные ромбы). Ша (незаштрихованные кружки). либо мАт 5012 (незаштрихованные треугольники). по сравнению со здоровыми людьми в контроле (пептид 1а - здоровые = заштрихованные ромбы; пептид 11а - здоровые = перечеркнутые кружки; пептид Ша - здоровые = перевернутые незаштрихованные треугольники; 5012 здоровые = наполовину заштрихованные квадраты). Не наблюдали связывания ни при тестировании сывороток от пациентов. ни при тестировании сывороток в контроле на планшетах. покрытых несоответствующим пептидом р195-212 (р195-212 - СКВ = перечеркнутые квадраты; р195-212 - здоровые = наполовину заштрихованные ромбы). Результаты свидетельствуют о корреляции между целой молекулой антитела и основанными на СЭК пептидами по уровню титров антител.

Пример 11. Пролиферация РВЬ от пациентов с СКВ и здоровых людей в качестве контроля в присутствии мАт 16/6 Ιά человека и пептидов.

Лимфоциты периферической крови (РВЬ) выделяли из крови пациентов с СКВ или здоровых доноров в качестве контроля. используя градиент фикола. Затем РВЬ инкубировали в присутствии разных концентраций пептидов 1а. 11а или Ша или мАт 16/6 Ιά человека в течение 24 ч и в это время брали образцы для измерения ΙΕ-2. Анализ продолжали всего в течение 7 дней и ³Н-тимидин добавляли в последние 16 ч. Пролиферацию определяли. регистрируя количество радиоактивности. включенной в ДНК клеток.

Как видно в табл. 14. меньшая часть РВЬ. взятых от пациентов с СКВ. взаимодействовала с пептидами или с мАт 16/6 Ιά по сравнению со здоровыми донорами в контроле. Результаты выражены в процентах респондеров (34% на первой строке) и фактическом количестве пациентов (11 из 32: 11/32).

Сходные результаты получали в том случае. когда тестировали уровни ΙΕ-2. продуцируемого РВЬ в присутствии пептидов или мАт 16/6 Ιά. как показано в следующем примере.

Таблица 14 Пролиферация РВЬ от пациентов с СКВ и здоровых доноров в качестве контроля в присутствии мАт 16/6 Ιά и пептидов !а-Ша ΕΜΙ29.1

- 30 009123

Пример 12. Продуцирование » клетками РВЬ пациентов с СКВ и здоровых доноров в контроле в присутствии мАт 16/6 Ι6 человека и пептидов.

РВЬ выделяли из крови пациентов с СКВ или здоровых доноров в качестве контроля, используя градиент фикола, и инкубировали, как описано в примере 11. Образец объемом 50 мкл брали через 24 ч после начала анализа и инкубировали в присутствии чувствительных к >-2 клеток (СТЙО) в течение 24 ч, после этого добавляли ³Н-тимидин на 16 ч и планшеты собирали и считали на бета-счетчике.

Как и в табл. 14, в табл. 15 можно видеть, что меньшая часть РВЬ, взятых от пациентов с СКВ, реагировала на пептиды или мАт 16/6 Ι6 по сравнению со здоровыми донорами в контроле, таким образом свидетельствуя, что ответ на пептиды соответствует ответу Т-клеток пациента на патогенное аутоантитело человека.

Таблица 15 Продуцирование в РВЬ пациентов с СКВ и здоровых доноров в контроле в присутствии мАт 16/6 Ι6 и пептидов !а-Ша

Пример 13. Синтез пептидов 11С1Ж1 и НСОЕ3 человека.

НСОЕ1 (8ЕС) Ш N0: 6) и НСОЕ3 (8ЕЕ) Ш N0: 7) человека показаны ниже.

ΟΥΥ\8\IЕ^РРΟКΟΕΕ\IΟ (11С1Ж1) ΥΥСΑЕΟ^^ЕΟΟ\N^V^ΥΥΟМ^V (11С1Ж3)

Пептиды получали способами, хорошо известными в данной области, например химическим твердофазным синтезом или синтезом в растворе, используя автоматизированный синтезатор согласно протоколам производителя для способа на основе трет-бутилоксикарбонила (!-Вос), флуоренилметоксикарбонила (Бшос) или другой защитной группы альфа-аминокислот, по существу, как описано (см., например, Рер!1бек: 8уп!йек1к, 8!гис!иге апб АррИсайопк, еб. Ьу В. Оийе, Асабеш1с Ргекк, 1995; Рерйбе 8уп!йек1к Рго!осо1к, еб. Ьу М. Репшпд!оп апб В. Иипп, Нитапа Ргекк, 1994; 8сйпокег М. е! а1., Ы кйи пеиИ’аНхаЕоп т Воссйеш1к!гу койб рНаке рерйбе куп!йек1к. Еар1б, Ыдй у!е1б аккетЬ1у оГ б1£йси1! кециепсек. >!. б. Рго!ет Еек. 40: 180-193, 1992).

Пример 14. Пептиды 11С1Ж1 и 11С1Ж3 ингибируют пролиферативный ответ РВЬ пациентов с СКВ на мАт 16/6 Ι6 человека.

В исследовании принимали участие 62 пациента, 9 мужчин (14,5%) и 53 женщины (85,5%) с СКВ. Средний возраст при постановке диагноза составлял 32,95±12,92 (диапазон 12-61) года, и средний период наблюдения составлял 10,98±10,76 (диапазон 1-32) лет. Все пациенты соответствовали по меньшей мере 4 из пересмотренных диагностических критериев Американской коллегии ревматологии (АСЕ) для СКВ (Тап Е.М. е! а1., Аг!йгЩк ЕНеиш. 25: 1271-77 (1982)). Пациенты были набраны из трех медицинских центров Израиля (Кар1ап, ЕеНото!; кйПот, Те1 Ате; АкаГ-НагоГей, Е1кйоп Еехюп). Активность заболевания определяли согласно индексу активности волчанки 8Ι.Ε1)/\Ι (ВошЬагб1ег С. е! а1., Аг1йгШк Ейеиш. 35: 630-40 (1992)). Контрольную группу из 36 совпадающих по полу и возрасту контрольных добровольцев исследовали одновременно с пациентами СКВ. Исследование одобрено Комитетом по этике медицинского центра.

Было интересно исследовать, способны ли пептиды ЙСОЕ1 и ЙСОЕ3, которые основаны на СИЕ1 и СИЕ3 мАт 16/6 Ι6 человека, ингибировать специфичные пролиферативные ответы РВЬ пациентов с СКВ на мАт 16/6 Ι6 человека. С этой целью авторы сначала должны были идентифицировать пациентов, РВЬ которых могли быть стимулированы к пролиферации посредством мАт 16/6 Ι6 человека (респондеров).

Поэтому РВЬ 62 неотобранных пациентов с СКВ культивировали в присутствии 16/6 Ι6 человека и определяли их пролиферативные ответы и способность секретировать » РВЬ 24 из 62 (39%) и 23 из 55 (42%) пациентов с СКВ были выявлены в тесте как отвечающие (8Ι>2, диапазон 2-5,6) по пролиферации и секреции ΙΕ-2 (8Ι>2, диапазон 2-60), соответственно. Частота встречаемости респондеров в группе пациентов с СКВ была ниже, чем частота, наблюдаемая в группе здоровых доноров, которых тестировали в качестве контроля. Так, РВЬ 21 из 36 (58%) здоровых доноров отвечали пролиферацией на 16/6 Ι6. Степень пролиферации (уровни 8Ι) были сходными для пациентов с СКВ и здоровых доноров в контроле, которые отвечали на 16/6 Ι6. Однако, как показано на фиг. 8, оптимальный ответ на 16/6 Ι6 РВЬ контрольных доноров наблюдали при более высоких концентрациях 16/6 Ι6 по сравнению с пациентами с СКВ.

Невозможно было показать различия в соответствии с полом и возрастом пациентов с СКВ, которые отвечали на 16/6 Ι6, и группой пациентов, которые не отвечали. Однако пациенты, РВЬ которых про- 31 009123 лиферировали в ответ на 16/6 Ιά, болели более короткий период времени (в среднем, 9,78+8,36 по сравнению с 11,73+12,06 лет для респондеров и нереспондеров, соответственно; Р<0,036). В табл. 16 суммированы клинические характеристики групп пациентов с СКВ респондеров и нереспондеров на 16/6 Ιά. Как можно видеть в таблице, обе группы были сходны по большинству связанных с СКВ клинических проявлений. Оценка в баллах активности заболевания СКВ (8БЕОА[) и количество диагностических критериев СКВ также были сходны в двух группах. Однако отмечена более высокая частота неврологических (как эпилептических припадков, так и психозов) и гематологических поражений и более низкая частота поражений почек в группе пациентов респондеров по сравнению с группой нереспондеров. Однако, возможно, из-за небольшого количества пациентов в соответствующих подгруппах указанные выше различия не достигали статистической значимости. Кроме того, относительное меньшее количество пациентов респондеров определяли среди пациентов, которых лечили либо стероидами, либо цитотоксическими агентами во время исследования. Заслуживает внимания, что значимо большее количество пациентов, которые никогда не получали стероидов, отвечали на 16/6 Ιά по сравнению с группой нереспондеров (54% по сравнению с 21%; Р=0,023).

Заслуживает внимания, что эффективность основанных на СЭК пептидов в ингибировании пролиферативных ответов РВБ здоровых доноров на 16/6 Ιά была намного ниже, чем эффективность, наблюдаемая в случае РВБ пациентов с СКВ (не показано).

Таблица 16

Клиническая и лабораторная характеристика пациентов с СКВ

А: Диагностические критерии*
	Все пациенты	Респондеры	Нереспондеры
Количество пациентов (%)	62 (100)	24 (39)	38(61)
Сыпь на скулах	19/62 (30,1)	8/24 (33,3)	11/38 (29)
Дискоидная сыпь	9/26(15)	3/24(12,5)	6/38(16)
Фоточувствительность	21/62 (34)	9/24 (37,5)	12/38 (32)
Изъязвления слизистой оболочки	17/62 (27,4)	8/24 (33,3)	9/38 (23,7)
Артрит	46/62 (74,2)	19/24 (79,2)	27/38(71)
Серозит	14/62 (22,6)	5/24 (20,8)	9/38 (23,7)
Неврологические расстройства*	5/62 (8,1)	4/24(16,7)	1/38(2,7)
Почечные расстройства*	24/62 (38,8)	7/24 (29,2)	17/38 (44,8)
Гематологические расстройства*	44/62 (71)	19/24 (79,2)	25/38 (65,8)
ΑΝΑ	61/62 (98,4)	24/24(100)	37/38 (97,4)
Анти-днДНК	54/62 (87,1)	19/24 (79,2)	35/38 (92,1)
АРБА	35/62 (56,5)	12/24 (50,0)	23/38 (60,53)
В: Активность заболевания
Индекс 8БЕОА1	6,65+5,12	7,29+1,06	6,24+0,84
Количество диагностических критериев АСК	С ЛЛ-б1 ΊΟ 1у	С ^Лд_П ΊΊ	< ^Лд_П О
С: Текущее лечение
нпвс	17/62 (27,4)	6/24 (25)	11/38(29)
Противомалярийные средства	37/62 (59,7)	15/24 (62,5)	22/38 (57,9)
Стероиды*	33/62 (53,2)	11/24 (45,8)	22/38 (57,9)
Цитотоксические средства*	10/62(16,1)	2/24 (8,3)	8/38(21)

* Клинические поражения определяли согласно пересмотренным критериям АСК. Антиядерные антитела (А№А) и анти-днДНК-антитела определяли на клетках Нер2 и Сг11Ы01а 1исШае, соответственно. Антифосфолипидные антитела (АРБА) определяли в виде активности в одном или нескольких из следующих анализов: ложнопозитивный УОКБ, волчаночный антикоагулянт (БАС) или ЕЫ8А для антикардиолипиновых антител.

Противомалярийное средство, гидроксихлорохин, использовали в дозе 200-400 мг/сутки; лечение стероидами определяли в виде суточной дозы: 5 мг преднизона; в качестве цитотоксических средств

- 32 009123 использовали циклофосфамид (0,75-1,0 г/м²; ежемесячно) или азатиоприн (100-150 мг/сутки).

Параметры, в случае которых наблюдали тенденцию к различиям между группами пациентов с СКВ респондеров и нереспондеров.

Чтобы проверить способность пептидов ИС'ОРЗ и ИС0Р3 ингибировать пролиферативный ответ РВ1, пациентов с СКВ на мАт 16/6 1б человека, РВ1, (2х10⁵/лунку) пациентов с СКВ стимулировали ίη νίΐίο в трех повторах разными концентрациями (0,1-20 мкг/лунку) мАт 16/6 1б в отсутствие или в присутствии пептидов ИС'ОР'1 и ИС0Р3 (либо 50, либо 100 мкг/лунку). После инкубации в течение 6 дней в каждую лунку добавляли ³Н-тимидин (0,5 мкКи, 5 Ки/ммоль) еще на 18 ч инкубации. Затем клетки собирали и радиоактивность считали, используя β-счетчик. Результаты выражали в виде среднего счета в минуту (имп./мин) культур в трех повторах. Затем рассчитывали индексы стимуляции (отношение среднего значения имп./мин при оптимальной концентрации 16/6 1б к среднему значению имп./мин без 16/6 1б). Индекс стимуляции (81) >2 считали позитивным.

Обнаружено, что РВ1, 24 из 62 (39%) пациентов с СКВ пролиферируют в ответ на мАт 16/6 1б. Способность пептидов ИС'ОР'1 и ИСОР3 ингибировать пролиферативные ответы на целую молекулу аутоантитела 16/6 1б тестировали на РВЬ 19 пациентов с СКВ, являющихся респондерами.

В табл. 17 показаны результаты данных экспериментов. Ингибирование выше 50% пролиферативной способности считали позитивным. В таблице представлена самая высокая позитивная ингибирующая способность для каждого пептида. Можно видеть, что ИС'ОР'1 и ИСОР3 человека ингибировали пролиферацию РВЬ 16/19 (84,2%) и 15/19 (78,9%), соответственно, из 19 тестированных респондеров. Оба пептида ингибировали пролиферацию РВЬ 18/19 (95%) тестированных респондеров. В таблице можно видеть, что величины ингибирования были сходными для обоих пептидов. Таким образом, можно сделать вывод, что пептиды, основанные на СБК1 и СБК3 мАт 16/6 1б человека, являются эффективными ингибиторами пролиферации РВЬ пациентов с СКВ в ответ на мАт 16/6 1б.

Таблица 17 Ингибирование пролиферации РВВ пациентов с СКВ пептидами 11СОР1 и 11СОР3

Номер	Процент ингибирования
ИСБК1	НСБРЗ
1	62	<50
2	70	75
3	69	<50
4	<50	<50
5	88,5	87,5
б	80	80
7	76	70,4
8	58	56
9	69,5	65
10	68,2	71,8
11	<50	72
12	82	86
13	63	64
14	56	74
15	63	69
16	<50	68
17	70,5	77,8
18	51, 5	<50
19	63	60,8
Среднее±5Б	68,12±9,57	71,82±8,44

Пример 15. Специфичность ингибирующей способности 11СОР1 и 11СОР3.

Важно показать, что ингибирующее действие основанных на ИСОР пептидов является специфич

- 33 009123 ным по отношению к связанным с СКВ ответам. С этой целью пептиды ЙС0Я1 или ЙС0Я3 добавляли к культурам РВЬ пациентов с СКВ, которые стимулировали митогеном фитогемагглютинином (ФГА, 2 мкг/мл). Результаты такого эксперимента, осуществленного с РВЬ 1 пациента с СКВ, показаны на фиг. 9. Пептиды ЙС0Я1 и ЙС0Я3 не могли ингибировать пролиферативные ответы (выраженные в имп./мин) РВЬ на митоген ФГА, и пролиферативные ответы были сходным образом высокие в отсутствие (черные колонки) или в присутствии либо ЙС0Я1, либо ЙС0Я3.

В другом эксперименте культуры РВЬ пациентов с СКВ стимулировали мАт 16/6 1б человека и затем инкубировали с пептидами ЙСОЯ1 или ЙСОЯ3 человека или с пептидом Ша в качестве контроля. Результаты такого эксперимента, осуществленного с РВЬ 1 пациента с СКВ, показаны на фиг. 10. Как видно на фиг. 10, в то время, как оба пептида ЙСПЯ.1 и ЙСОЯ3, основанных на аутоантителе человека, эффективно ингибировали пролиферативные ответы РВЬ на мАт 16/6 1б человека, пептид шСОЯ3, основанный на СОЯ3 мышиного антитела (т.е. пептид Ша), не ингибировал пролиферацию.

В указанных экспериментах использовали два дополнительных контрольных пептида, а именно пептиды, синтезированные с порядком, обратным пептидам 1а и Ша, и результаты показаны на фиг. 11. Можно видеть, что два обратных пептида не могли существенно ингибировать пролиферативные ответы РВЬ пациентов с СКВ на мАт 16/6 1б человека в то время, как пептиды ЙСПЯ.1 и ЙСОЯ3 эффективно ингибировали пролиферацию, свидетельствуя о том, что ингибирование пролиферации пептидами, основанными на ЙСОЯ человека, являются специфичными для пептидов и для связанных с СКВ Т-клеточных ответов.

Пример 16. Понижающая регуляция секреции Ш-2 РВЬ пациентов с СКВ в присутствии пептидов 11С1Ж1 и 11С1Ж3.

Было интересно выявить, способны ли пептиды ЙСОЯ ингибировать секрецию Ш-2 клетками РВЬ пациентов с СКВ после стимуляции мАт 16/6 1б человека. Такое ингибирование также может свидетельствовать, что основанные на СЭК человека пептиды ингибируют пролиферативные ответы на мАт 16/6 16, по меньшей мере частично, посредством понижающей регуляции секреции Ш-2. С этой целью РВЬ пациентов с СКВ инкубировали с мАт 16/6 1б человека в отсутствие или в присутствии пептидов ЙСОЯ1 или ЙСОЯ3. Надосадки культур собирали после 48 ч инкубации.

Анализы для определения уровней Ш-2 в надосадках осуществляли, используя Ш-2 зависимую линию СТЬЬ. Коротко, клетки линии СТББ (2х10⁴/лунку) инкубировали в присутствии разных надосадков в течение 24 ч с последующим добавлением ³Н-тимидина дополнительно на период инкубации 18 ч. Затем клетки собирали и радиоактивности считали, используя β-счетчик. Результаты рассчитывали на основе рекомбинантного Ш-2 человека, используемого в качестве стандарта. Тестировали способность пептидов ингибировать секрецию Ш-2 клетками РВЬ 23 респондеров, стимулированных 16/6 1б человека. Результаты, суммированные в табл. 18, показывают, что ЙСОЯ1 и ЙСОЯ3 ингибировали секрецию Ш-2 клетками РВЬ 21/23 и 19/23 пациентов, соответственно. Ингибирование пролиферативных ответов РВЬ прямо коррелировало с ингибированием Ш-2 основанными на СЭЯ. пептидами. Таким образом, ингибирование секреции Ш-2 наблюдалось во всех случаях, когда определяли ингибирование пролиферации.

Результаты, полученные с РВЬ 1 пациента с СКВ, представленные на фиг. 12 (секреция Ш-2 выражена в пг/мл), показывают, что как ЙСПЯ.1, так и ЙСОЯ3 ингибировали 100% секреции Ш-2 клетками РВЬ пациентов с СКВ, запускаемой мАт 16/6 1б человека.

Таблица 18

Ингибирование секреции Ш-2 посредством ЙСПЯ.1 и 11С1Ж3

Пептид	Ингибирующая	Максимальное
активность*	ингибирование
	о о	О.
ПСБК1	91 (21/23)	84±31
НСБКЗ	83 (19/23)	78±34

* Секрецию Ш-2 в присутствии одного 16/6 1б считали равной 100%. Ингибирование на 50% или более считали значимым.

Пример 17. Повышающая регуляция секреции иммуносупрессирующего цитокина ТОР-β основанными на СЭЯ. пептидами.

При попытках пролить свет на механизмы, посредством которых основанные на СЭЯ. человека пептиды ингибируют пролиферативные ответы на моноклональное анти-ДНК-16/6 Ιά-антитело человека, определяли уровни иммуносупрессирующего цитокина ТОР-β в надосадках культур клеток. Обоснование указанных экспериментов основано на предварительных данных авторов о повышенных уровнях ТОР-β в культурах спленоцитов мышей с СКВ, либо индуцированной анти-ДНК 16/6 16-мАт человека, либо спонтанной {мыши (ΝΖβχΝΖ^)Ρ!}, после обработки пептидами, основанными на СЭЯ. мыши (Е11а!, Е. е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сь И.8.А., 98, 1148 (2001)). Повышение уровней ТОР-β коррелировало с

- 34 009123 ослаблением проявлений заболевания у обработанных мышей.

С этой целью извлекали надосадки из культур РВЬ разных пациентов с СКВ после 48-часовой инкубации с мАт 16/6 Ιό человека в отсутствие или в присутствии пептидов ЬСЭЯ1 или ЬСЭЯЗ. ТСЕ-β определяли в ЕЫ8А согласно инструкциям производителя. Коротко, планшеты Мах1когЬ ^ипс) покрывали рекомбинантной химерой ТСЕвкЯП/Ес человека (Я&Э 8ук!етк), разбавленной в РВ8 (100 нг/мл). После блокирования добавляли надосадки клеток. Через 18 ч инкубации добавляли регистрирующее биотинилированное антитело против ТСЕ-β человека (Я&Э 8ук!етк). В качестве раствора субстрата использовали цветной реагент ТМВ (Не11х П1адпокЕск) и активность фермента оценивали посредством считывающего устройства для ЕЫ8А МЯХ, используя фильтры 570 и 630 нм. Результаты суммированы в табл. 19.

Результаты на фиг. 13 показывают, что пептиды СЭЯ1 и ЬСЭЯЗ запускали значимую повышающую регуляцию секреции ТСЕ-β (выраженной в пг/мл) РВЬ одного типичного пациента с СКВ, которые были стимулированы патогенным мАт 16/6 Ι0 человека.

Таблица 19 Повышающая регуляция секреции ТСЕ-β при 16/6 Ιά-индуцированной стимуляции РВЬ пациентов с СКВ пептидами ЬСЭЯ1 и ЬСЭЯ3

Пептид	Повышающая регуляция ΤΟΡ-β, %	Максимальная повышающая регуляция, %
ЕСОК1	100 (19/19)	3051221
ЬСОВЗ	100 (19/19)	3381242

Секрецию ТСЕ-β в присутствии только 16/6 Ι0 отдельно (среднее 63625 пг/мл) считали равной 100%. Результаты выражены в виде секреции в процентах выше, чем в присутствии только 16/6 Ι0.

Пример 18. Активность ММР-9 (но не ММР-2) повышена в сыворотках пациентов с СКВ.

В данном примере авторы определяли уровни ММР-9 и ММР-2 в сыворотках 40 пациентов с СКВ, и авторы показали, что активность ММР-9, но не активность ММР-2, значимо повышена в сыворотках пациентов с СКВ по сравнению со здоровыми донорами в контроле. Высокая активность ММР-9 коррелировала с наличием дискоидной сыпи, феномена Рейно, пневмонита, изъязвлений слизистой оболочки и наличием антифосфолипидных антител (АРЬА). Кроме того, повышенные уровни ММР-9 коррелировали с активностью СКВ в группе пациентов мужского пола.

Материалы и способы

Пациенты.

пациентов, 32 женщины и 8 мужчин, с СКВ принимали участие в данном исследовании. У всех пациентов проявлялось по меньшей мере четыре из пересмотренных диагностических критерия Американской коллегии ревматизма (АСЯ) для диагноза СКВ (УтсЬек!ег, Я.1. 8ук1сш1с 1ирик егуЛетаЮкик раШодепеык. !п: Коортап, \\.,1., ей. ВипппдЬат. А1аЬата: УПНат апй ХУПктк, рр. 1361-91 (1996)). 25 совпадающих по полу и возрасту здоровых добровольцев служили в качестве контрольной группы в исследованиях автора. Средний возраст пациентов при постановке диагноза составлял 29±9,7 (диапазон 1548) лет, и средний период наблюдения составлял 11±10 (диапазон 1-32) лет. Активность заболевания определяли согласно индексу активности волчанки (ВотЬагй|ег, е! а1., 1992) и согласно индексу

ВГЬАО (Нау, Е.М. е! а1., О. 1. Мей. 86: 447-58 (1993)). Исследование было одобрено комитетом по этике медицинского центра Кар1ап, ЯеЬονο!, 1кгае1.

Измерение ММР-2 и ММР-9 с помощью наборов для анализа активностей.

Активности ММР-2 и ММР-9 измеряли, используя специальные наборы для анализа активностей ММР-2 или ММР-9 В1о!гак (АтегкНат РНагтасла Вю!есЬ ИК ЕтНей, ЦК), согласно инструкциям производителя. Сыворотки разбавляли 1:100 и 1:32 для определения активностей ММР-2 и ММР-9, соответственно. В каждом анализе добавляли соответствующие стандарты. Чтобы измерить общее количество ММР, осуществляли активацию проформы ММР, используя ацетат парааминофенилртути (АРМА).

Измерение активностей ММР-2 и ММР-9 зимографией в геле.

Активности ММР-2 и ММР-9 тестировали зимографией в желатине. Образец сыворотки объемом 5 мкл разделяли в 8% 8Э8-ПААГ-геле, полимеризованном с 1 мг/мл желатина. Гели промывали 1 раз в течение 30 мин в 2,5% тритоне Х-100, чтобы удалить 8Ώ8, и 1 раз в течение 30 мин в реакционном буфере, содержащем 50 мМ трис-НС1, 200 мМ №С1, 10 мМ СаС1₂ и 0,02% (мас./об.) Вгц 35 (рН 7,5). Реакционный буфер заменяли на свежий и гели инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Желатинолитическую активность визуализировали окрашиванием гелей 0,5% Кумасси бриллиантовым синим и анализировали количественно денситометрией.

Статистические анализы.

Данные оценивали, используя критерий хи-квадрат или точный критерий Фишера, непарный !-критерий и двусторонние Р-значения. Также использовали анализы Пирсона, Спирмана и многомерные анализы.

- 35 009123

Пример 18 (ί). Активность ММР-9, но не ММР-2, повышена при СКВ.

Как описано выше и в международной публикации РСТ № №0 02/067848, показано, что ММР-9 вовлечен в несколько аутоиммунных заболеваний, а также в моделях СКВ на животных. Соответственно, авторам было интересно исследовать, повышен ли ММР-9 также в сыворотках пациентов с СКВ. С этой целью авторы исследовали сыворотки 40 пациентов с СКВ и 25 здоровых доноров в качестве контролей с помощью гель-зимографии, при которой можно визуализировать активности и ММР-9, и ММР-2. Типичный гель показан на фиг. 14. Как можно видеть на данной фигуре, уровни ММР-9 повышены в сыворотках пациентов с СКВ по сравнению со здоровыми донорами в контроле. Денситометрический анализ зимограмм сывороток 40 пациентов с СКВ и 25 здоровых доноров в контроле показал, что средняя активность ММР-9 для пациентов с СКВ составляла 109±5,6 денситометрических единиц, а для здоровых доноров в контроле 76,5±4,2 денситометрических единиц (Р=0,0001). Значения активности выше 85 денситометрических единиц (среднее для здоровых доноров в контроле + 2 з.е.) считали высокими. Результаты показали высокие уровни активности ММР-9 у 68% пациентов с СКВ. Только 3% здоровых доноров в контроле имели высокую активность ММР-9 (Р=0,001). Денситометрический анализ уровней ММР-2 в тех же самых образцах сыворотки показал, что различия в активности ММР-2 между сыворотками пациентов с СКВ и здоровых доноров в контроле были незначимы. Так, определяли значения 109±7 и 123±5 (средние денситометрические единицы активности ± з.е.) для здоровых доноров в контроле и пациентов с СКВ, соответственно (Р=0,0531). Чтобы дополнительно количественно определить уровни активности ММР-9 и ММР-2 в сыворотке, авторы использовали наборы для анализа активности.

На фиг. 15 показано, что активность ММР-9 повышена в 3 раза в сыворотках пациентов с СКВ по сравнению с сыворотками здоровых доноров в контроле, и это повышение статистически значимо (Р=0,0302). В отличие от этого, различия в уровнях ММР-2 между двумя группами незначимы (Р=0,1254).

Так как авторы, а также другие исследователи (ЕЬШага, I. е! а1., Аш. 1. К1бпеу Όίδ. 32: 544-50 (1998); ЕЬШага, I. е! а1., ЫерЬгоп 83: 169 (1999)) выявили высокие уровни ММР-9 в сыворотках пациентов с хронической почечной недостаточностью, не связанной с волчанкой (например, при сахарном диабете, гипертонии), вероятно, вследствие удержания фермента, авторы анализировали корреляцию между уровнями ММР-9 и функцией почек в тестируемой группе пациентов с СКВ. Не обнаружено корреляции между уровнями креатинина и уровнями ММР-9 (г²=0,01), что свидетельствует о том, что повышенные уровни ММР-9 у пациентов с СКВ не являются результатом удерживания фермента вследствие повреждения почек.

Пример 18 (ίί). Корреляция активности ММР-9 с клиническими и лабораторными параметрами.

Повышение уровней активности ММР-9 в сыворотках пациентов с СКВ побудило авторов к поиску возможной корреляции между клиническими и лабораторными параметрами и уровнями ММР-9 в сыворотке. Статистический анализ (критерий хи-квадрат или точный критерий Фишера) осуществляли при исследовании нескольких пациентов с высокими и нормальными уровнями ММР-9 для каждого клинического проявления (табл. 20), а также принимая во внимание фактические средние уровни активности ММР-9 для пациентов с определенным клиническим симптомом или без него. Результаты были сходными в обоих анализах. Заслуживает внимания то, что в случае всех клинических симптомов процент пациентов с повышенными уровнями ММР-9 намного выше, чем в контрольной группе здоровых доноров. Уровни ММР-9 не коррелировали с полом, продолжительностью болезни или возрастом в начале болезни (Пирсон, Спирман).

В табл. 20 показаны клинические и лабораторные характеристики пациентов с СКВ в соответствии с их уровнями активности ММР-9 (ниже или равные контрольным уровням у здоровых доноров = нормальные). Высокие уровни ММР-9 значимо коррелировали с наличием феномена Рейно (Р=0,0138) и АРЬА (Р=0,041). Строгую корреляцию можно было наблюдать с пневмонитом, дискоидной сыпью, неврологическими расстройствами и изъязвлениями слизистой оболочки. Однако количество пациентов с последними проявлениями было слишком мало, чтобы провести статистический анализ. Многомерный анализ показал, что феномен Рейно и низкие уровни комплемента (С3, С4) положительно коррелируют с высокими уровнями ММР-9 (Р=0,0001 и 0,0137, соответственно). Напротив, фоточувствительность, артрит и гематологические нарушения отрицательно коррелируют с уровнями активности ММР-9 (Р=0,0381, 0,0014 и 0,0065, соответственно).

Таблица 20 Клиническая характеристика пациентов с СКВ с высокими и нормальными активностями ММР-9 в соответствии с их уровнями ММР-9

		Уровни ММР-9, %
Высокий	Нормальный
Количество пациентов, %	40 (100)	27 (68)	13 (32)
Фоточувствительность	13	8 (62)	5 (38)
Изъязвления слизистой оболочки	9	8 (89)	1 (11)

- 36 009123

Сыпь на скулах	9	7 (78)	2 (22)
Дискоидная сыпь	5	5 (100)	0 (0)
Феномен Рейно	8	8 (100)	0 (0)
Васкулит	18	14 (78)	4 (22)
Артрит	31	21 (68)	10 (32)
Серозит	9	7 (78)	2 (22)
Пневмонит	4	4 (100)	0 (0)
Неврологические расстройства	4	4 (100)	0 (0)
Почечное расстройство	16	11 (69)	5 (31)
Гематологические нарушения	29	18 (62)	11 (38)
АМ	40	27 (68)	13 (32)
Анти-днДНК	36	24 (67)	12 (33)
АРЬА	25	20 (80)	5 (20)
Низкий комплемент (С3. С4)	30	21 (70)	9 (30)

Клиническое поражение определяли согласно пересмотренным критериям АСК (УшсНеЦег. 1996). Антиядерные антитела (АКА) и анти-днДНК-антитела определяли. используя клетки Нер2 и ί.'ιϊ11ιίάί;·ι 1исШе. соответственно. Антифосфолипидные антитела (АРЬА) определяли по способности реагировать в одном или нескольких из следующих анализов: ложнопозитивная УЭК. волчаночный антикоагулянт (ЪАС) или ЕЫ8А для антикардиолипиновых антител.

Авторы также искали возможную корреляцию между 8ΕΕΟΛΙ и активностью ММР-9 у пациентов мужчин (фиг. 16А) и женщин (фиг. 16В). Интересно. что коэффициент корреляции был значимым и положительным для мужчин (г²=0.6333). но незначимым и отрицательным для женщин (г²=0.0571). Сходные результаты получали. используя систему оценки ВШАО. Так. положительный коэффициент корреляции между активностью ММР-9 и оценками в баллах ВШАО наблюдали для мужчин (г²=0.6442) и незначимый коэффициент для женщин.

Также интересно было определить. существует ли корреляция между использованием пациентами различных средств лечения и активностью ММР-9. Как видно в табл. 21 (А). не было значимой корреляции между текущим лечением пациентов и активностью ММР-9. Однако в том случае. если посмотреть на лечение пациентов в любой период времени в течение их болезни (табл. 21 (В)). то высокие уровни ММР-9 связаны с применением цитотоксических агентов (82%).

Таблица 21

Средства лечения пациентов с СКВ в соответствии с уровнями ММР-9

Общее количество \| пациентов	Уровни ММР-9. %
Высокий	Нормальный
А. Текущее лечение.
Цитотоксические средства	8	6 (75)	2 (25)
Стероиды	23	17 (74)	6 (26)
Противомалярийные средства	21	14 (67)	7 (33)
НПВС	7	5 (71)	2 (29)
В. Лечение на протяжении периода	наблюдения.
Цитотоксические средства	17	14 (82)	3 (18)
Стероиды	29	19 (66)	10 (34)
Противомалярийные средства	26	16 (62)	10 (38)
НПВС	18	12 (67)	6 (33)

Противомалярийное средство. гидроксихлорохин. использовали в дозе 200-400 мг/сутки. Лечение стероидами определяли в виде суточной дозы > мг преднизона. В качестве цитотоксических средств использовали циклофосфамид (0.5-1.0 г/м²; ежемесячно) или азатиоприн (100-150 мг/сутки).

Пример 18 (ш). Варьирование активности ММР-9 в образцах сыворотки. взятых от отдельных пациентов с СКВ в разных временных точках.

Так как активность заболевания варьирует с течением времени. авторы измеряли уровни активности ММР-9 и ММР-2 в сыворотке отдельных пациентов. у которых брали образцы в течение 4-6 лет наблюдения. Анализировали сыворотки 9 пациентов. взятые в разных временных точках. Уровни ММР-2 значимо не варьировали при сравнении пациентов и контрольных здоровых доноров. У 5 из 9 тестированных пациентов можно было наблюдать изменения активности ММР-9 в образцах сыворотки отдельных пациентов с течением времени. Результаты 2 типичных пациентов с СКВ показаны на фиг. 17А-В. Как можно видеть. активность ММР-9. но не активность ММР-2. менялась с течением времени у одних и тех же пациентов. Указанные изменения не были связаны с индексами активности заболевания. которые определяли либо по системе 8^Е^АI. либо по системе ВШАО. Изменения активности ММР-9 не выяв

- 37 009123 ляли в сыворотках 5 контрольных здоровых доноров, у которых брали образцы в разных временных точках (данные не показаны). У 4 других пациентов с СКВ не наблюдали значимых изменений активности ММР-9 или ММР-2 с течением времени, и уровни активности ММР-9 оставались либо высокими, либо низкими, в зависимости от конкретного пациента.

Обсуждение

Настоящее исследование впервые демонстрирует участие ММР-9 в СКВ человека. Авторы показывают, что активность ММР-9, но не ММР-2, значимо повышена в сыворотках 68% пациентов с СКВ по сравнению со здоровыми донорами в контроле. Высокие уровни ММР-9 коррелировали с феноменом Рейно, пневмонитом, неврологическими расстройствами, дискоидной сыпью и наличием АРЬА. Изменения активности ММР-9 наблюдали в сыворотке одного и того же пациента в разные периоды заболевания. Уровни активности ММР-9 не коррелировали с индексом активности заболевания (ЗЕ-ΕΟΛΙ. ВГБАС) у пациентов женского пола, но коррелировали с активностью СКВ в группе пациентов мужского пола.

Настоящее изобретение показывает, что уровни активности ММР-2 значимо не повышены в сыворотках пациентов с СКВ. Полученные результаты сравнимы с результатами, о которых сообщалось ранее Дискет, З. ί. Кйеита!о1. 26, 78 (1999)), что уровни ММР-2 не повышены при СКВ. Уровни ММР-2 были также конститутивными и неизменными при других патологических состояниях (подобных невриту зрительного нерва и множественному склерозу), при которых уровни ММР-9 были повышены относительно уровней у здоровых доноров в контроле (СцЪе1к, К. е! а1., 1. №иго1ттипо1. 41: 29-34 (1992); Раетеп, Ь. е! а1., Еиг. 1. №иго1. 1: 55-63 (1994)).

Предполагалось вовлечение дополнительного ММР, а именно ММР-3, в патогенез СКВ, так как он был значимо повышен в сыворотках пациентов с СКВ (Ко!а_рта, Ь. е! а1., С1т. Ехр. Кйеит. 16: 409-415 (1998)). Частота встречаемости пациентов с СКВ с повышенной активностью ММР-9 (68%), показанная в настоящем примере, сходна с частотой, сообщенной (Ко!а_рта е! а1., 1998) для высоких уровней ММР-3 у пациентов с СКВ (76%) и РА (82%). Кроме того, показано, что количество транскриптов ММР-3 значимо возрастает при прогрессировании нефрита у мышей (ЖВх^^^ ^акатита, Т. е! а1., С1т. Зс1. 85: 295301 (1993)).

Происхождение повышенных уровней ММР в сыворотках пациентов с СКВ не известно. Показано, что ММР-9 секретируется клетками периферической крови, такими как Т-клетки, нейтрофилы и макрофаги (для обзора см. Сое1хк ЕЛ. е! а1., ί. Iттиηо1. 156: 1-4 (1996)). Тот факт, что не было обнаружено корреляции между уровнями активности ММР-9 и количеством клеток периферической крови у пациентов, может свидетельствовать о том, что ММР-9 не секретировался иммунными клетками периферической крови, а, скорее, секретировался пораженными СКВ органами, подобными почкам или легким/плевре. Наблюдение, что все пациенты с СКВ с пневмонитом имели высокие уровни активности ММР-9, может свидетельствовать о том, что пораженное заболеванием легкое является источником высоких уровней ММР-9. Кроме того, связь между лечением цитостатиками, что означает тяжесть связанного с СКВ поражения органа, и высокими уровнями ММР-9 в сыворотках также может свидетельствовать в пользу мнения о том, что пораженные заболеванием органы являются источником активности ММР-9 у пациентов с СКВ. Однако еще существует возможность, что меньшее количество лимфоцитов периферической крови секретировало более высокие уровни активности ММР-9.

Показано, что ΤΝΡ-α и ΙΕ-1 играют важную роль в патогенезе СКВ как в случае заболевания человека (Цеап, С.З. е! а1., Апп. Кйеит. О1к. 59: 243-51 (2000)), так и моделях на мышах (Зеда1, К. е! а1., 1. Ιιηтипо1. 158: 3009-16 (1997); ТйеоД1орои1ок, А.К е! а1., Апп. Кйеит. Э|к. 58 (кирр1.): 149-55 (1999); Е11а! е! а1., 2001). В нескольких системах показано, что указанные цитокины индуцируют продукцию ММР-9 (Сиебех, Ь. е! а1., Сгб. Кеу. Опсодепек1к 7: 205-225 (1996)), и, таким образом, возможно, что индукция более поздних ММР является частью патогенного действия указанных цитокинов при СКВ. Сообщалось, что уровни ММР-9, которые секретируются спонтанно моноцитами периферической крови здоровых людей, не регулируются при воздействии ΤΝΡ-α и ЕЪ-1 β (Загеп, Р. е! а1., ί. Ттшипок 157: 4159-65 (1996)). Кроме того, ММР как Т-клеток, так и макрофагов способствуют секреции ΤΝΡ-α благодаря отщеплению связанной с мембранами формы (Сеаппд, АЛ.Н. е! а1., №11иге 370: 555-7 (1994)). Таким образом, данные примеры демонстрируют взаимное регуляторное влияние ММР на провоспалительные цитокины и наоборот. Однако тот факт, что в сыворотках некоторых из пациентов уровни активности ММР-9 оставались в пределах нормы в течение периода наблюдения в то время, как в сыворотках большинства пациентов измеряли высокие уровни активности ММР-9, может свидетельствовать об участии генетических факторов в регуляции последнего.

Представленные в данном описании результаты показывают, что ММР-9 может играть роль в патогенезе СКВ и что измерение уровней активности данной металлопротеиназы в плазме/сыворотке может дать важную информацию при наблюдении пациентов, которых лечат лекарственными средствами, которые влияют на активность ММР-9.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (ί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОЯ) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 И-антитела, или (ίί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОЯ) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей,

1. Фармацевтическая композиция, содержащая водный носитель, от 0,1 до 20 мг/мл композиции

- 38 009123 фармацевтически приемлемой соли

a) пептида. содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот. имеющих последовательность. соответствующую:

(ΐ) последовательности аминокислот. обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОК) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 И-антитела. или (ίί) последовательности аминокислот. обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОК) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела. которое индуцирует ответ. подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ). у мышей. или

b) пептида. содержащего следующие друг за другом аминокислоты. имеющие последовательность (1) ТОУУХ₁Х₂Х₃Х4Х5р8РЕК8ЬЕ^Ю (ЗЕ6 II) N0: 11).

где Х1 означает Ме!. А1а или Уа1; Х₂ означает 61η. Акр. 61и или Агд; Х₃ означает Тгр или А1а; Х₄ означает Уа1 или Зег и Х₅ означает Ьук. 61и или А1а;

(ίί) ЕЮТЗТ66Х₆Х₇Х₈Х₉Х₁₀Х₁₁Х₁₂КАКАТ (ЗЕр II) N0: 12).

где Х₆ и Х₇. каждый означает ТНг. Уа1 или А1а; Х₈ означает Туг или РНе; Х₉ означает Акп или Акр; Х₁₀означает 61η или 61и; Хп означает Ьук или 61и и Х₁₂ означает РНе или Туг;

(ш) УУСАКХ-Л Х А·ЯД)АХ-.\-8¥\\'6(')6З (ЗЕр II) N0: 13).

где Х1з означает РНе. ТНг или 61у; Х_м означает Ьеи. А1а или Зег; Х₁₅ означает Тгр или А1а; Х1₆ означает 61и или Ьук; Х_п означает Ме! или А1а и Х₁₈ означает Акр. Ьук или Зег;

(ίν) 6УN\ \; \;·\;;\;_;\;4ЗН6\;,\;6^Е№I6 (ЗЕР II) N0: 14).

где Х1₉ означает Ме! или А1а; Х₂₀ означает Акп. Акр или Агд; Х₂₁ означает Тгр или А1а; Х₂₂ означает Уа1 или Зег; Х₂₃ означает Ьук или 61и; Х₂₄ означает 61η или А1а; Х₂₅ означает Ьук или 61и и Х₂₆ означает Зег или А1а;

(ν) ΥΥСАК\₂₇X₂₈X₂₉Υ6X₃οXз1Xз₂6^Т^ (ЗЕр II) N0: 15).

где Х₂₇ означает Зег или РНе; Х₂₈ означает 61у или А1а; Х₂₉ означает Агд. А1а или 61и; Х₃₀ означает Акп или Акр; Х₃₁ означает Туг или РНе и Х₃₂ означает Тгр. Н1к или А1а;

(νί) ААЛЛУЗХУЕХЛЭХЛ’А.Х; СХДАУК., (ЗЕр II) N0: 16).

где Х₃₃ означает 61у или ТНг 61у; Х₃₄ означает Агд или Ьук; Х₃₅ означает Рго или Зег; Х₃₆ означает 61у или 61и; Х₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈ означает 61и. Ьеи или Зег;

(νίί) ΥΥСАК\₃₉^^X₄₀X₄₁X₄₂X₄₃X₄₄^У^ΥX₄56X₄₆^У (ЗЕр II) N0: 17).

где Х₃₉ означает 61у или РНе; Х₄₀ означает Агд или А1а; Х₄1 означает 61у или А1а; Х₄₂ означает 61у или А1а; Х₄₃ означает Тгр или А1а; Х₄₄ означает Акп или А1а; Х₄₅ означает Туг или Тгр; Х₄₆ означает Ме! или 61η;

(νίίί) ЕЗ6УУХУЗ (ЗЕР ГО N0: 8);

(ΐχ) ЕП\1НЗ6ЗТ]\Г¥КТЗЬКЗ (ЗЕр ГО N0: 9) или (χ) 61.1.К66\\'№)У1)УУУ6\П)У (ЗЕР ГО N0: 10). или

c) пептида. содержащего следующие друг за другом аминокислоты. имеющие любую последовательность из а) и Ь) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (а)(1). (а)(и) и (Ь)(1)-(Ь)(х). или

б) пептида. содержащего следующие друг за другом аминокислоты. имеющие последовательность. содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности. включенные в (а)(1). (а)(и) и (Ь)(1)(Ь)(х); и усилитель растворимости. выбранный из группы. состоящей из диметилацетамида. полиэтиленгликоля. полиоксилированного касторового масла. N-метил-2-пиррοлидинοна. 1-этенил-2-пирролидинона. сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и замещенного β-циклодекстрина.

в которой и пептид. и усилитель растворимости растворены в водном носителе; и при этом композиция имеет рН от 4 до 9.

2) пептида, содержащего аминокислоты, имеющие последовательность (1) ТС.УУХ-Х-ХЛХ.ОБРЕКБЕЕА' Ю (БЕО ΙΌ N0: 11), где Х1 означает Ме!, А1а или Уа1; Х₂ означает С1п, Акр, С1и или Агд; Х₃ означает Тгр или А1а; Х₄ означает Уа1 или Бег и Х₅ означает Ьук, С1и или А1а;

(ίί) ΕINΡБΤ66Χ₆Χ₇Χ₈Χ₉Χ₁₀Χ₁₁Χ₁₂КАКАΤ (БЕО ΙΌ N0: 12), где Х₆ и Х₇, каждый означает ТЬг, Уа1 или А1а; Х₈ означает Туг или РЬе; Х₉ означает Акп или Акр; Х_!0означает С1п или С1и; Х_п означает Ьук или С1и и Х₁₂ означает РЬе или Туг;

(ίίί) ¥¥САЯХ13Х14Х15Х16Р¥АХ1₇Х18¥—СРОБ (БЕО ΙΌ N0: 13), где Х1₃ означает РЬе, ТЬг или С1у; Х₁₄ означает Ьеи, А1а или Бег; Х₁₅ означает Тгр или А1а; Х_!6 означает С1и или Ьук; Х_!7 означает Ме! или А1а и Х₁₈ означает Акр, Ьук или Бег;

(ίν) ОУИХ19Х2оХ21Х22Х23Х248НОХ2зХ26ЬЕ—Ю (БЕО ΙΌ N0: 14), где Х1₉ означает Ме! или А1а; Х₂₀ означает Акп, Акр или Агд; Х_2! означает Тгр или А1а; Х₂₂ означает Уа1 или Бег; Х₂₃ означает Ьук или С1и; Х₂₄ означает С1п или А1а; Х₂₅ означает Ьук или С1и и Х₂₆ означает Бег или А1а;

(ν) ¥¥САЯХ₂₇Х₂₈Х₂₉¥6Х₃₀Х₃₁Х₃₂ОРТЬ (БЕО ΙΌ N0: 15), где Х₂₇ означает Бег или РЬе; Х₂₈ означает С1у или А1а; Х₂₉ означает Агд, А1а или С1и; Х₃₀ означает Акп или Акр; Х₃1 означает Туг или РЬе и Х₃₂ означает Тгр, Н1к или А1а;

(νί) Х33УУ—8—Х34рХ35РХ36Х37ОХ38Е—Ю (БЕО ΙΌ N0: 16), где Х₃₃ означает С1у или ТЬг С1у; Х₃₄ означает Агд или Ьук; Х₃₅ означает Рго или Бег; Х₃₆ означает С1у или С1и; Х₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈ означает С1и, Ьеи или Бег;

(νίί) ¥¥САЯХ₃₉ЕЬХ₄₀Х₄₁Х₄₂Х₄₃Х₄₄ОУО¥Х₄₅ОХ_4&ОУ (БЕО ΙΌ N0: 17), где Х₃₉ означает С1у или РЬе; Х₄₀ означает Агд или А1а; Х₄1 означает С1у или А1а; Х₄₂ означает С1у или А1а; Х₄₃ означает Тгр или А1а; Х₄₄ означает Акп или А1а; Х₄₅ означает Туг или Тгр; Х₄₆ означает Ме! или С1п;

(νίίί) РБСУУ-Б (БЕО ΙΌ N0: 8);

(ίχ) ΕINΗБ6БΤNΥКΤБ^КБ (БЕО ΙΌ N0: 9) или (χ) бЕЕЯбб—ХПУПУУУСМПУ (БЕО ΙΌ N0: 10), или

2. Фармацевтическая композиция по п.1. в которой пептид имеет последовательность. выбранную из группы. состоящей из

N№-64 61у Туг Туг Ме! 61п Тгр Уа1 Ьук 61п Зег Рго 61и Ьук Зег Ьеи 61и-Тгр Не 61у-С00Н (ЗЕр ГО N0: 1);

N№-6111 Не Акп Рго Зег ТНг 61у 61у ТНг ТНг Туг Акп 61п Ьук РНе Ьук А1а Ьук А1а ТНг-С00Н (ЗЕр ГО N0: 2);

N№№',1' Туг Сук А1а Агд РНе Ьеи Тгр 61и Рго Туг А1а Ме! Акр Туг Тгр 61у 61п 61у Зег-С00Н (ЗЕр ГО N0: 3);

N№-61}' Туг Акп Ме! Акп Тгр Уа1 Ьук 61п Зег Ηίκ 61у Ьук Зег Ьеи 61и Тгр Не 61у-С00Н (ЗЕр ГО N0: 4);

NΗ₂-Ту^ Туг Сук А1а Агд Зег 61у Агд Туг 61у Акп Туг Тгр 61у 61п ТНг Ьеи-С00Н (ЗЕр ГО N0: 5);

N№-61)' Туг Туг Тгр Зег Тгр Не Агд 61п Рго Рго 61у Ьук 61у 61и 61и Тгр Не 61у-С00Н (ЗЕр ГО N0: 6);

N№№',1' Туг Сук А1а Агд 61у Ьеи Ьеи Агд 61у 61у Тгр Акп Акр Уа1 Акр Туг Туг 61у Ме! Акр Уа1С00Н (ЗЕр ГО N0: 7);

]\1Н₂-Рйе Зег 61у Туг Туг Тгр Зег-С00Н (ЗЕр ГО N0: 8);

N№-6111 Не Акп Н1к Зег 61у Зег ТНг Акп Туг Ьук ТНг Зег Ьеи Ьук Зег-С00Н (ЗЕр ГО N0: 9) и

- 39 009123

ЫН₂-61у Ьеи Ьеи Агд С1у С1у Тгр Акп Акр Уа1 Акр Туг Туг Туг С1у Ме! Акр Уа1-С00Н (БЕО ΙΌ N0: 10).

3. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой пептид содержит следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность

Х^ХТ—Б—ЕХ^рХ^РХ^Ху₇ОХ₃₈Е\Ю (БЕО ΙΌ N0: 16), где Х₃з означает С1у или ТЬг С1у; Х₃₄ означает Агд или Ьук; Х₃₅ означает Рго или Бег; Х₃₆ означает С1у или С1и; Х₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈ означает С1и, Ьеи или Бег.

c) доведение рН раствора со стадии Ь) до растворения пептида в растворе; и

- 40 009123

б) при необходимости доведение рН раствора со стадии с) до рН 4-9, таким образом получая фармацевтическую композицию.

4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, в которой усилителем растворимости является замещенный β-циклодекстрин.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, в которой фармацевтически приемлемой солью является ацетатная соль, а замещенным β-циклодекстрином является гепта(сульфобутиловый эфир)-в-циклодекстрин.

6. Способ ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающий в себя введение человеку фармацевтической композиции по любому из пп.1-5 в количестве, эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

7. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп.1-5, включающий следующие стадии:

a) приготовление раствора диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, №метил-2-пирролидинона, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана или замещенного β-циклодекстрина в водном носителе с предварительно определенной концентрацией;

8. Лиофилизованная фармацевтическая композиция, содержащая от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли

a) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (ΐ) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (СОК.) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 1б-антитела, или (ίί) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (ί,'ΌΕ) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, или

b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность (1) ТОУУХ₁Х₂Х₃Х₄Х5р8РЕК8ЬЕУ1О (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11), где Х1 означает Ме!, А1а или Уа1; Х₂ означает Ο1η, Акр, С1и или Агд; Х₃ означает Тгр или А1а; Х₄ означает Уа1 или 8ег и Х₅ означает Ьук, С1и или А1а;

(ίί) ЕЮТ8ТССХ₆Х₇Х₈Х₉Х1₀ХцХ1₂КАКАТ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 12), где Х₆ и Х₇, каждый означает ТНг. Уа1 или А1а; Х₈ означает Туг или РНе; Х₉ означает Акп или Акр; Х₁₀означает С1п или С1и; Хц означает Ьук или С1и и Х₁₂ означает РНе или Туг;

(ίίί) У¥САКХ1₃Х14Х15Х16Р¥АХ17Х18¥УСР68 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 13), где Х1₃ означает РНе, ТНг или С1у; Х_!4 означает Ьеи, А1а или 8ег; Х₁₅ означает Тгр или А1а; Х_!6 означает С1и или Ьук; Х_п означает Ме! или А1а и Х₁₈ означает Акр, Ьук или 8ег;

(ίν) 6¥НХ1₉Х20Х21Х22Х23Х248Н6Х25Х26ЙЕУЮ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 14), где Х19 означает Ме! или А1а; Х₂₀ означает Акп, Акр или Агд; Х₂₁ означает Тгр или А1а; Х₂₂ означает Уа1 или 8ег; Х₂₃ означает Ьук или С1и; Х₂₄ означает С1п или А1а; Х₂₅ означает Ьук или С1и и Х₂₆ означает 8ег или А1а;

(ν) ¥¥САКХ₂₇Х₂₈Х₂₉¥6Х₃₀Х₃₁Х₃₂6РТЬ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 15), где Х₂₇ означает 8ег или РНе; Х₂₈ означает С1у или А1а; Х₂₉ означает Туг или РНе и Х₃₂ означает Тгр, Н1к или А1а;

(νί) Х33¥УУ8\Х34рХ35РХ36Х37ОХ38ЕУЮ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 16), где Х₃₃ означает 01у или ТНг 61у; Х₃4 означает Агд или Ьук; Х₃₅ означает Рго или 8ег; Х₃₆ означает С1у или С1и; Х₃₇ означает Ьук или Акр и Х₃₈означает С1и, Ьеи или 8ег;

(νίί) ¥¥САК.\_;.ЕЕ.\₄ ..\ .\ ·.\₄;.\₄Ό\Ί)¥.\ .(.ι.\₄.Ό¥ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 17), где Х₃₉ означает С1у или РНе; Х₄₀ означает Агд или А1а; Х₄1 означает С1у или А1а; Х₄₂ означает С1у или А1а; Х₄₃ означает Тгр или А1а; Х₄₄ означает Акп или А1а; Х₄₅ означает Туг или Тгр; Х₄₆ означает Ме! или С1п;

(νίίί) Е8С>¥¥\\'8 (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 8);

(ίχ) ЕINΗ8С8ТNΥКТ8^К8 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 9); или (χ) С11.1.КС1С1\\'\1)У1)¥¥¥С1\11)У (8ЕО Ш ΝΟ: 10), или

б) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (а)(1), (а)(и) и (Ь)(1)(Ь)(х); и усилитель растворимости, выбранный из группы, состоящей из диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, №метил-2-пирролидинона, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и замещенного β-циклодекстрина.

9. Способ лиофилизации фармацевтической композиции по любому из пп.1-5, включающий в себя стадии:

a) снижения температуры фармацевтической композиции до -40°С;

b) поддержания температуры при -40°С в течение предварительно определенного периода времени;

c) повышения температуры раствора до 20°С;

б) поддержания температуры при 20°С в течение предварительно определенного периода времени и

е) снижения давления и поддержание температуры при 20°С в течение предварительно определенного периода времени, таким образом лиофилизируя фармацевтическую композицию.

10. Способ по п.9, в котором стадию а) осуществляют в течение 2 ч;

стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч;

стадию б) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 5 ч и давление понижают до 10 мкбар.

- 41 009123

11. Способ лиофилизации фармацевтической композиции по любому из пп.1-5, включающий стадии:

a) снижения температуры фармацевтической композиции до -45°С;

b) поддержания температуры при -45°С в течение предварительно определенного периода времени;

c) повышениятемпературы раствора до -20°С;

ά) повышения температуры раствора до 25 °С и

е) поддержания температуры при 25°С в течение предварительно определенного периода времени, таким образом лиофилизируя фармацевтическую композицию.

12. Способ по п.11, в котором стадию а) осуществляют в течение 6 ч;

стадию Ь) осуществляют в течение 3 ч;

стадию ά) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 150 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 8 ч и при давлении 150 мкбар.